LABORATORIO N 04

EXTRACCIN DE ADN VEGETAL. Mtodo de Madriz et al 2005.

Diana Amzquita Mesa. Cd: 201222620
Alexandra Balaguera A. cd.: 201220391
Judy Guevara. Cd. 2012
Universidad pedaggica y tecnolgica de Colombia
Ingeniera Agronmica
alexa10_8@yahoo.es
RESUMEN
1. INTRODUCCIN
Existe gran variedad de protocolos eficientes y convencionales que permiten la
extraccin de ADN cada uno con funciones distintas de acuerdo al protocolo
utilizado, enumeraremos las sustancias utilizadas en el desarrollo e la prctica con sus
respectivas funciones: El Buffer utilizado en las extracciones de ADn tiene como
funcin general la extraccin del ADN de los tejidos, participando en el rompimiento
de la membrana celular el SDS, la eliminacin de enzimas y la posterior inhibicin de
la accin de estas (EDTA)y la eliminacin de glicoprotenas para obtener un ADN
ms puro (NaCl); La ribonucleasa A participa en la eliminacin de ARN mediante
la digestin del ARN, el isopropanol posee la funcin de eliminar las protenas por
desnaturalizacin, la concentracin del ADN se logra mediante la precipitacin de
este con etanol en presencia de cationes monovalentes que inducen a un cambio
estructural del ADN que causa la agregacin y precipitacin del mismo, para la
eliminacin del fenol se usan sales (acetato de amonio).
2. MATERIALES Y MTODOS
Se tomaron 500 mg de tejido fresco y joven de hojas de Phaseolus vulgaris en tubos
de 2 ml que se maceraron cuidadosa y perfectamente a los que se adicionaron 900 l
de Buffer de extraccin (200mM NaCl, 25 mM EDTA pH 8 y 0,5% SDS) y se
llevaron a incubacin por 45 minutos a 65C; seguido de esto se le aadieron a la
mezcla 0,5 l de ribonucleasa A (10 mg/ml) y mezclada por inversin;
posteriormente se llev nuevamente a incubacin a 37C por 15 minutos y luego se
dej enfriar a temperatura ambiente. Se agregaron 400 l de acetato de potasio 5 M y
se mezcl por inmersin; seguidamente, se centrifug a 13200 rpm por 4 minutos y
se recogi el sobrenadante resultado de este en un tubo de 1,5 l. A esta mezcla se
aadieron 600 l de isopropanol frio y mezclados nuevamente por inmersin; se
descart el sobrenadante y se aadieron 600 l de etanol de 70% al botn que qued
mezclando bien por inversin que luego fue llevado a centrifugacin a 13200 rpm
durante un minuto, nuevamente se descart el sobrenadante, se sac el botn y
resuspendi el ADN en 100 l de buffer TE (100mM Tris-HCl pH 8 y 0,1 mM de
EDTA) finalmente se almacen el ADN extrado a -20C.
3. RESULTADOS
Los cambios fsicos a lo largo de la mezcla no se observaron hasta la realizacin de
las centrifugaciones en la primera, aparecieron dos fases de la mezcla, la superior de
coloracin verde clara, lquida, la inferior verde oscura y slida, como adherida al

tubo en donde estaba contenida; al sacar el sobrenadante qued en el tubo la sustancia

que se someti nuevamente a centrifugacin, luego de se hicieron visibles tres fases
con coloraciones de tonos ms claros y la sustancia de la parte inferior ms escasa.

Figura 1. Matarial vegetal (hojas de

frjol), sin nervadura central.

Figura 2. Material vegetal (hojas de

frjol) triturado con buffer.

Figura 5. Muestra sometida a

centrifugacin 3200 r.p.m., por 4
minutos.

Figura 6. Sobrendante recogido de la

centrifucacion y extracto sobrante.

Figura 3. Muestra sometida a

incubacin 65C.

Figura 7. Sobrenadante con

insopropanol mezclado por inversion.

Figura 4. Muestra sometidas a

incubacin 37C.

Figura 8. Muestra de ADN precipitada.

4. ANALISIS DE RESULTADOS
Tris: (hidroximetil amino metano) Es un tampn biolgico. Su principal funcin es
mantener el pH de la solucin estable (7.0 8.0).
EDTA: (Etilen diamino tetra actico) Es un agente quelante. Se encarga de remover
iones de magnesio que son esenciales para preservar l estructura de la envoltura
celular.
Etanol, Isopropanol: Alcoholes. En presencia de sales (temperatura de
aproximadamente 20 C ) precipita ADN, reduciendo la constante dielctrica del
solvente.
Ribonucleasas) que son enzimas que cortan las secuencias de ARN para su posterior
degradacin.
Para retirar las protenas y la mayora de los polisacridos, se agrega una sal como
acetato de potasio frio. Por centrifugacin se separan tejidos, membranas,
polisacridos y protenas de los acidos nucleicos, los cuales quedan en el
sobrenadante.
SDS (Dodecil sulfato de sodio) es un detergente aninico que acta como agente
solubilizante de protenas y de componentes de tejidos y membranas.
ACETATO DE POTASIO (C2 H3 KO2) precipita protenas.
Los agentes quelantes se emplean para proteger el ADN de la accin de enzimas
nucleasas; ellos capturan iones magnesio y no permiten que acten como cofactores
de las nucleasas. Las concentraciones de NaCl se emplean para prevenir la
contaminacin de la muestra con polisacridos que afectan la pureza del ADN.
Se agrega un detergente aninico como el SDS, que solubiliza protenas, tejidos y
membranas, evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los
desechos o restos celulares.
CONCLUSIONES
La aplicacin de diferentes tcnicas empleadas en biologa molecular para el anlisis
del genoma, dependen en gran medida de la habilidad para extraer el ADN, como en
las medidas de los volmenes.
Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composicin de la pared celular, la
cual dificulta el acceso al interior para la extraccin de todo su contenido, incluyendo
el ADN.
BIBLIOGRAFIA
Rogers S.O., Bendish A.J., EXTRACCION OF DNA FROM PLANT TISSUES.
Plant Molecular Biology Manual. A6:1-10.Kluwer Academic Publishers, Belgium,
1988.

http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art32.pdf