MÃ©todos de Laboratorio

Universidad Autnoma de Coahuila
de Investigacin en Alimentos
Facultad de Ciencias Qumicas
Departamento
Determinacin monosacridos por el

mtodo de Antrona
Toms Lpez Altunar

Laboratorio de Microbiologa. Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de
Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila,
Mxico.
Fundamento
La antrona forma un compuesto verde en medio cido fuerte (cido sulfrico)
con ciertos carbohidratos y sacridos, en especial con azcares y almidones. La
reaccin de la antrona en medio sulfrico produce un derivado del furano que
tiene su mximo de absorcin en 620 nm.
Reactivo antrona
El reactivo se prepara de la siguiente manera:
Aadir 340 mL de agua destilada

Agregar 660 mL de H2SO4 concentrado
Aadir 10 g de tiourea
Posteriormente agregar 0.5 g de antrona (cristalizado de etanol)
Nota: el reactivo es estable por 2 semanas almacenado a 4 C y la curva

estndar se realiza con glucosa.
Procedimiento
1.
2.
3.
4.
5.
Agregar 0.25 mL de muestra a analizar

Aadir 1.25 mL reactivo antrona
Someter a bao mara y dejar ebullir por 15 min
Dejar enfriar por 20-30 min en oscuridad
Medir a absorbancia a 575 nm.
Solucin de Glucosa: Disuelva 100 mg de glucosa seca y de buena calidad

en un litro de agua destilada. La solucin es estable por una semana si es
guardada en un frasco mbar y en refrigeracin. Esta solucin tiene una
concentracin de 100 mg/L de glucosa
Referencia
1
DIA-UADEC

Departamento
Kunerth W.H y Youngs. (1984). Modification of the Anthrone, Carbazole and

Orcinol Reactions for Quantitation of monosaccharides. Cereal chemistry.
61:4:344-349.
Determinacin de azucares totales por

el mtodo de fenol-sulfrico
Toms Lpez Altunar

Mxico.
Fundamento
El mtodo propuesto por Dubois et al., 1956 se fundamenta en que los
carbohidratos son particularmente sensibles a cidos fuertes y temperaturas
altas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones complejas toman lugar
empezando con una deshidratacin simple, si se contina con el calentamiento
y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que condensan
consigo mismo y con otros subproductos para producir compuestos coloridos
producto de la condensacin de los compuestos fenlicos y con heterociclos
con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms comn es con el
fenol
MATERIALES Y METODOS
Muestra hidrolizada (pulpa de caf)

Matraz de aforacin
Papel filtro
Fenol 5 %
Autoclave
Glucosa 500 ppm
Agua destilada
Vortex
Micropipetas
Tubos de ensayo 3*100 ml
H2SO4 concentrado
Espectrofotmetro
2
DIA-UADEC

Departamento
PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR AZUCARES TOTALES (DUBOIS,

1956)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
250 l de muestra hidrolizada

Aadir 250 l de fenol al 5 %
Agitar en vortex y dejar en bao de agua con hielo por 5 min
Aadir 1 mL (1000 l) de c. Sulfrico H 2SO4 concentrado
Agitar en vortex cuidadosamente y ebullir por 5 min
Enfriar a temperatura ambiente por 5 min
Leer en espectrofotmetro a una absorbancia de 480 nm
Nota: la curva de calibracin se realiza con glucosa

Referencias
Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A. y Smith F. (1956). Colorimetric
method for determination of sugars and related substances. Analytical
Chemistry. 28:3:350-356.
3
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin de azcares reductores

por el mtodo de Somogyi-Nelson
Adriana Carolina Flores Gallegos

Laboratorio de Biologa Molecular. Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de
Mxico.
Fundamento
El mtodo se basa en la capacidad que tienen los azcares reductores (como la
glucosa y la fructosa) de reducir ciertos iones metlicos, como el cobre, en un
medio alcalino y caliente. En el proceso, la muestra que contiene el azcar
reductor se calienta con la solucin alcalina de tartrato de cobre (reactivo de
Somogyi), y como resultado de la reaccin se forma xido cuproso. ste
reacciona con el arseno-molibdato (reactivo de Nelson) dando un compuesto
de color azul (azul de molibdeno) (Figura 1).
Cu2O
Arseno-Molibdato
Azul de molibdeno
Figura 1. Reaccin de azcares reductores con los reactivos de Somogyi y

Nelson
La intensidad del color azul obtenido es proporcional a la cantidad de azcar
reductor presente en la muestra de acuerdo a la ley de Lambert y Beer.
Reactivos
Reactivo de Somogyi
-
Reactivo A
Compuesto
Carbonato de sodio anhidro
Cantidad
(g/L)
25
4
DIA-UADEC

Departamento
(Na2CO3)
Sal de Rochelle (KaNaC4H4O6)
Bicarbonato
de
sodio
(NaHCO3)
Sulfato
de
sodio
25
20
anhidro
200
(Na2SO4)
En la mezcla de reaccin se incluye sulfato de sodio para minimizar la entrada
de oxgeno atmosfrico en la solucin, lo cual podra causar reoxidacin del
xido cuproso.
El reactivo se debe filtrar y almacenar a no menos de 20C, con el fin de evitar
la cristalizacin del sulfato de sodio.
Reactivo B
Compuesto
Cantidad
(100
mL)
Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O)

cido sulfrico (H2SO4)
15
1-2 gotas
El reactivo de Somogyi est compuesto por 25 partes de reactivo A y 1 parte

de reactivo B(la mezcla se realiza en el momento). El reactivo es estable hasta
por 1 ao
Reactivo de Nelson
25 g Molidato de amonio ((NH )6Mo O ) en 450
4
7 24
ml
21 ml de cido sulfrico (H SO ) concentrado
2 4
3 g Arsenato de sodio (Na HAsO 7 H O) en 25 ml
2
4
2
Mezclar e incubar a 37 C por 24 o 48 h
Almacenar en un frasco mbar o en un frasco cubierto con aluminio. El reactivo

es estable por 6 meses.
5
DIA-UADEC

Departamento
Figura 2. Desarrollo del compuesto cromognico a 37 C. Curva 1, tiempo 0;

Curva 2, 12 horas; Curva 3, 24 horas; Curva 4, 48 horas.
Procedimiento:
1 ml de la
muestra
Enfriar en bao
de hielo 20 min
Agregar 1 ml
reactivo
Somogyi
(25 partes
reactivo A, 1
parte reactivo B)
Agregar 1 ml
reactivo Nelson
Bao en
ebullicin por 20
min
Completar a 5
ml
Leer a 500 nm
Notas:
o
o
El blanco consiste en agua destilada.

La curva de calibracin debe realizarse con un estndar del azcar
reductor presente en la muestra (por ejemplo, glucosa) en una
concentracin de 1 mg/ml (1000 ppm)
6
DIA-UADEC

Departamento
Cuadro 1. Curva estndar glucosa
Solucin madre de
glucosa(L)
Agua
0
100
200
300
400
500
1000
900
800
700
600
500
destilada
(L)
Concentra
cin
(ppm
)
0
100
200
300
400
500
El mtodo es muy preciso para 0.01 mg de glucosa, galactosa y maltosa,

los mejores resultados se obtienen si no se excede una concentracin de
1 mg/ml.
o Si la DO es mayor a 1.0, las muestras deben ser diludas ya que la
linealidad de la absorbancia vs concenracin de puede ver afectada.
o El color es muy estable
o En el ensayo de Somogyi-Nelson, todas las sustancias con
propiedades oxidativas o reductoras pueden causar interferencia. Se
ha reportado que el cido ctrico causa interferencia en la
determinacin de azcares reductores.
o El mtodo no es apropiado para la determinacin de una mezcla
compleja de azcares reductores.
Referencias bibliogrficas:
Somogyi, M (1926) Notes onsugardetermination. Journal of Biological
Chemistry.
Nelson, N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi method for
the determination of glucose.Journal of Biological Chemistry.
7
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin analtica de azcares de

acuerdo a sus propiedades qumicas
Diana Beatriz Muiz Mrquez

Mxico.
Fundamento
El mtodo a continuacin descrito fundamenta su principio qumico en la
capacidad reductora de los grupos aldehdo y/o cetnicos libres de los
carbohidratos, ante una solucin cupro-alcalina, con la consiguiente oxidacin
de los azcares en el grupo carbonilo y en la funcin alcohol primario, dicha
reaccin se manifiesta en la precipitacin de cobre como xido cuproso. Tal
mtodo es aplicable a monosacridos, disacridos reductores y polisacridos
previamente hidrolizados.
Mtodo volumtrico de Lane y Eynon
En este mtodo el carbohidrato reductor se encuentra en solucin y con el se
reduce un volumen medido y constante de licor cupro-alcalino (reactivo de
Fehling-Soxhlet), en presencia de indicador azul de metileno.
Determinacin de azcares reductores
Reactivos
(ver anexo de preparacin de reactivos)
Solucin Fehling- Soxhlet A (F-SA)

Solucin Fehling- Soxhlet B (F-SB)
Agua destilada
Azul de metileno 1%
Subacetato o acetato de plomo 30%
Material y equipo
Bureta
Matraces erlenmeyer de 250 mL
Pipetas de 5 y 10 mL
Embudo
8
DIA-UADEC

Departamento
Papel filtro whatman no.9

Parrilla
Procedimiento
1.- Si la muestra es slida, disolver 2 g en un volumen conocido de agua
destilada y aforar a 100 250 mL. Para muestras lquidas, hacer una dilucin
1:1, dependiendo de la concentracin del carbohidrato en anlisis o bien
trabajar directamente con la muestra.
NOTA: Cuando la muestra sea colorida, como el caso de los refrescos, nctares,
concentrados de frutas, chocolates, jarabes, alimentos en polvo o si tiene
material suspendido, deber realizarse el siguiente proceso:
a
Una vez aforada la muestra se agregan unas gotas de subacetato de plomo. La

cantidad de gotas es en proporcin a la intensidad del color o de material
suspendido en la muestra. Cuanto ms oscura sea la muestra mayor cantidad
de clarificante necesitar (por ejemplo solucin con chocolate 4 o 5 gotas).
Recolectar el filtrado y titular cuanto antes, no se debe guardar por ms de una

hora.
2.- Llevar la solucin problema a una bureta y proceder como sigue:
En un matraz erlenmeyer agregar 5 mL de sln Fehling- Soxhlet A + 5 mL de sln

Fehling- Soxhlet B + 40 mL de agua destilada. Preparar por triplicado.
Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullicin.
Empezar la titulacin con la solucin problema y una vez que presente un

ligero cambio de coloracin la solucin del matraz, agregar una gota de azul de
metileno 1%. Continuar titulando hasta el vire a color rojo ladrillo con
precipitado. Se finaliza la titulacin hasta que desaparece totalmente el color
azul de la solucin y las burbujas son transparentes.
NOTA: La solucin del matraz deber permanecer en constante ebullicin
durante toda la titulacin sin exceder de 3 minutos, para evitar una
evaporacin considerable.
Tomar las lecturas de los mililitros gastados de titulante (promediar).

9
DIA-UADEC

Departamento
Calcular:
% AZCARES REDUCTORES = T
F-S
* Vol. de aforo
x 100
mL gastados * g de muestra
T F-S: ttulo de la solucin Fehling- Soxhlet
Determinacin de azcares no reductores

Este mtodo es aplicable a sacarosa, azcares hidrolizables, almidn y
dextrinas.
Reactivos
(ver anexo de preparacin de reactivos)
HCl concentrado
NaOH 4%
Solucin F-S A
Solucin F-S B
Agua destilada
Azul de metileno 1% (solucin acuosa)
Material y equipo
Refrigerante
Matraz baln fondo plano
Bureta
Matraces erlenmeyer de 250 ml.
Pipetas de 5 y 10 mL.
Parrilla
Procedimiento
A Hidrlisis por reflujo
1.- Si la muestra es slida, disolver 2 g en 50 mL de agua destilada. Para
muestras lquidas, hacer una dilucin 1:1 (completando 50 mL), dependiendo
de la concentracin del carbohidrato en anlisis.
10
DIA-UADEC

Departamento
2.- Pasar la muestra a un matraz baln fondo plano y acidificarla con 1mL de
HCl concentrado.
3.- Conectar el matraz al refrigerante e hidrolizar por 30 minutos (precalentar
la parrilla y mantener alta la temperatura durante los 30 minutos que dura la
hidrlisis).
4.- Enfriar el hidrolizado y neutralizar con 1mL aproximadamente de NaOH 4%.
5.- Aforar a 200 mL con agua destilada.
B) Hidrlisis por calor
1. Si la muestra es slida, disolver 2 g en 50 mL de agua destilada. Para
muestras lquidas, hacer una dilucin 1:1 (completando 50 mL), dependiendo
de la concentracin del carbohidrato en anlisis.
2.- Pasar la muestra a un matraz baln fondo plano y acidificarla con 1mL de
HCl concentrado.
3. Introducir el matraz con la muestra acidificada en una estufa a 45C durante
24 hrs.
4. Comprobar la hidrlisis de los polisacridos adicionando una gota de lugol. Si
ste adquiere una coloracin morada sobre la muestra, indica que la hidrlisis
se ha completado, si no es as, continuar el calentamiento por 3 horas ms.
NOTA: Cuando la muestra sea colorida, como el caso de los refrescos, nctares,
concentrados de frutas, chocolates, jarabes, alimentos en polvo o si tiene
material suspendido, deber realizarse el siguiente proceso:
c
Una vez aforada la muestra se agregan unas gotas de subacetato de plomo. La

cantidad de gotas es en proporcin a la intensidad del color o de material
suspendido en la muestra. Cuanto ms oscura sea la muestra mayor cantidad
de clarificante necesitar (por ejemplo solucin con chocolate 4 o 5 gotas).
Recolectar el filtrado y titular cuanto antes, no se debe guardar por ms de una

hora.
6.- Llevar la solucin problema a una bureta y proceder como sigue:
En un matraz Erlenmeyer agregar 5mL de solucin F-S A + 5 mL de solucin FS B + 40 mL de agua destilada. Preparar por triplicado.
11
DIA-UADEC

Departamento
Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullicin.
Empezar la titulacin con la solucin problema y una vez que presente un

metileno. Continuar titulando hasta el vire a color rojo ladrillo con precipitado.
Se finaliza la titulacin hasta que desaparece totalmente el color azul de la
solucin y las burbujas son transparentes. NOTA: La solucin del matraz deber
permanecer en constante ebullicin durante toda la titulacin sin exceder de 3
minutos, para evitar una evaporacin considerable.
Tomar las lecturas de los mililitros gastados de titulante (promediar).
Calcular:
% AZCARES NO REDUCTORES = T
F-S
* Vol. de aforo x 100
mL gastados * g de muestra
T
F-S
: ttulo de la solucin Fehling- Soxhlet
AZCARES TOTALES
% AZCARES TOTALES = % AZCARES
% AZCARES
NO REDUCTORES
REDUCTORES
Anexo: preparacin de reactivos

Reactivos Fehling Sohxlet
Sulfato de cobre pentahidratado

Tartrato de sodio y potasio
Hidrxido de sodio
Agua destilada
Azul de metileno 1% (solucin acuosa)
Solucin de dextrosa anhidra (0.01g/mL; preparar para 100 mL)
Material y equipo
Bureta
Matraces Erlenmeyer de 250 mL.
Pipetas de 5 y 10 mL.
Balanza
Matraces aforados de 500 mL
Procedimiento
12
DIA-UADEC

Departamento
1) Solucin A. Pesar exactamente 34.689 g de sulfato de cobre pentahidratado.

Disolver en 200 mL de agua destilada y calentar si es necesario. Aforar a
500mL.
2) Solucin B. Pesar exactamente 173 g de tartrato de sodio y potasio y 50 g de
hidrxido de sodio. Disolver por separado cada reactivo. Mezclar y aforar a 500
mL.
Estandarizacin de la solucin F-S
1) Medir 5 mL de solucin A y 5 mL de solucin B (utilizar pipeta limpia y seca
para medir cada reactivo), mezclarlos en matraz Erlenmeyer de 250 mL y diluir
con 40 mL de agua destilada.
2) Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullicin.
3) Aadir a una bureta la solucin de dextrosa anhidra 1%.
4) Empezar la titulacin con la solucin de dextrosa y una vez que presente un
metileno 1%. Continuar titulando hasta el vire a color rojo ladrillo con
precipitado. Se finaliza la titulacin hasta que desaparece totalmente el color
azul de la solucin y las burbujas son transparentes. NOTA: La solucin del
matraz deber permanecer en constante ebullicin durante toda la titulacin
sin exceder de 3 minutos, para evitar una evaporacin considerable.
5) Para obtener el ttulo del reactivo F-S, tomar en cuenta lo siguiente:
6)
Volumen de las soluciones A y B

Concentracin de la solucin patrn en g/mL.
Volumen de la solucin patrn empleada en la titulacin
Clculos:
T=VxC
T: ttulo expresado en dextrosa para 10 mL de reactivo F-S (5 mL de A+ 5 mL

de B).
V: volumen gastado del patrn.
C: concentracin del patrn en g/mL (0.01g/mL).
13
DIA-UADEC

Departamento
NOTA: El T F-S expresado para 10 mL del reactivo tiene las siguientes

equivalencias:
0.050 g de dextrosa anhidra

0.063 g de maltosa anhidra
0.075 g de lactosa anhidra
0.0475 g de sacarosa anhidra
Hidrxido de sodio 4%
Disolver 4 g de NaOH (lentejas) y aforar a 100 mL. Vaciar a un recipiente y
etiquetar (nombre, concentracin y fecha).
Azul de metileno 1%
Disolver 1 mL de reactivo azul de metileno en 100 mL de agua destilada (en
matraz aforado), mezclar, vaciar a un frasco con gotero y etiquetar (nombre,
concentracin y fecha).
Solucin patrn de dextrosa 1%
Pesar 1 g de dextrosa anhidra y aforar a 100 mL con agua destilada. Si se usa
dextrosa monohidratada pesar 1.1 g.
Solucin de subacetato de plomo (o acetato bsico de plomo) 30%.
Disolver 75 g de una u otra sal y aforar a 250 mL con agua destilada.
Referencia bibliogrfica
Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists.
(1990). Method AOAC 923.09, pp 1016.
14
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin de glucosamina (Mtodo

indirecto para determinar biomasa
fngica)
Jos Juan Buenrostro Figueroa

Mxico.
Introduccin
La
glucosamina
(C6H13NO5)
es
un
amino
azcar
que
se
encuentra
principalmente en el exoesqueleto de crustceos y artrpodos, formando parte

de la pared celular de hongos y muchos organismos, siendo el monosacrido
ms abundante y, por ende, su cuantificacin nos permite tener una
estimacin del crecimiento de microorganismos en un cultivo.
Fundamento
Para determinar el contenido de glucosamina, se requiere una hidrlisis para
liberarla de la pared celular, posteriormente se combina con la acetilacetona
formando
un
compuesto
pirrlico,
que
al
reaccionar
con
el
p-
dimetilaminobenzaldehdo (PDBA) forma un compuesto de color rojo a una

absorbancia de 530 nm.
Procedimiento
Para esta tcnica es necesario preparar las siguientes soluciones:
A. Solucin de acetilacetona. Disolver 1 mL de acetilacetona en 50 mL
de Na2CO3 0.5 N.
B. Reactivo de Erlich. Disolver 1.6 g de p-dimetilaminobenzaldehdo en
60 mL de sol. HCl-EtOH (1:1).
Nota: Calcular la cantidad de solucin a emplear de acuerdo al nmero de
muestras, ya que las soluciones deben ser frescas para evitar error en la
cuantificacin.
15
DIA-UADEC

Departamento
En el siguiente diagrama de flujo se describe primeramente el pretratamiento

de la muestra, mediante el cual se libera la glucosamina, y posteriormente la
reaccin con la solucin A y B para su cuantificacin.
Figura 1. Diagrama de flujo para la cuantificacin de glucosamina.

16
DIA-UADEC

Departamento
Nota: Se requiere determinar la glucosamina asociada al hongo, por lo cual se requiere

biomasa seca del mismo (100 mg) a los cuales se les somete al mismo procedimiento
descrito arriba. Por otra parte, se realiza una curva patrn de 0 a 200 g.mL-1 con
glucosamina como estndar.
Clculos
Para hacer los clculos correspondientes, se sustituye y en la ecuacin de la
recta por las absorbancias obtenidas de las muestras, el valor obtenido (mg/g
de glucosamina) se divide entre el valor de glucosamina asociada al hongo,
para obtener el contenido de biomasa (mg/g de muestra).
Bibliografa
Blix, G. 1948. The Determination of Hexosamines According to Elson and
Morgan. Acta Chemica Scandinavica 2, 467-473.
17
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin de protena soluble
Luis Vctor Rodrguez Durn

Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila. Saltillo, Coahuila, Mxico.
Fundamento
Esta es una tcnica espectrofotomtrica, que se basa en la formacin de una
coloracin caracterstica al acomplejarse las protenas solubles con el colorante
azul de Comassie. El colorante azul de Comassie G-250 existe en dos diferentes
formas: rojo y azul. La forma roja se convierte en azul mediante la unin del
pigmento a las protenas. El complejo protena-pigmento tiene un alto
coeficiente de extincin lo cual resulta en una alta sensibilidad para la
medicin de protena.
La unin del pigmento a la protena es un proceso rpido (alrededor de 2
minutos) y el complejo protena-pigmento permanece disperso en la solucin
durante un tiempo relativamente largo (1 hora, aproximadamente), esto hace
de la tcnica un procedimiento rpido y no requiere de un control estricto del
tiempo de reaccin.
Preparacin del reactivo
Se disuelven 100 mg del colorante Azul de Comassie G-250 en 50 mL de etanol
al 95 %. Se agregan 100 mL de cido fosfrico 85 % (p/v). La solucin se diluye
en agua destilada y se afora a 1 L. El reactivo debe protegerse de la luz y
filtrarse antes de su uso. Este reactivo es estable por al menos un mes a
temperatura ambiente.
Ensayo:
Se han descrito dos diferentes ensayos basados en el uso de este reactivo,
cada uno con diferente sensibilidad.
Ensayo estndar
18
DIA-UADEC

Departamento
En un tubo de ensaye se colocan 0.100 mL de muestra con una

concentracin de 100 a 1000 ppm de protena.
Se agregan 5 mL del reactivo de Bradford.
Agitar y reposar a temperatura ambiente.
Simultneamente se prepara un tubo blanco con 0.100 mL de agua (o el
buffer apropiado) y 5 mL de reactivo de Bradford.
Se mide la absorbancia a 595 nm del tubo muestra entre 2 minutos y 1
hora despus de realizada la reaccin contra el tubo blanco.
Micro-ensayo
En un tubo de ensaye se colocan 0.100 mL de muestra con una

concentracin de 10 a 100 ppm de protena.
Se agrega 1 mL del reactivo de Bradford,
Agitar y reposar a temperatura ambiente.
Simultneamente se prepara un tubo blanco con 0.100 mL de agua (o el
buffer apropiado) y 1 mL de reactivo de Bradford.
Se mide la absorbancia a 595 nm del tubo muestra entre 2 minutos y 1
hora despus de realizada la reaccin contra el tubo blanco.
Clculos
Para calcular la concentracin de protena en la muestra, se realiz una curva
patrn utilizando Albmina Srica Bovina (BSA) como estndar (Tablas 1 y 2).
Interferencias
Los nicos componentes que se ha encontrado que producen una interferencia
excesiva durante la reaccin son algunos detergentes en altas concentraciones
como: dodecil sulfato de sodio, Tritn X-100, y detergentes comerciales. Las
interferencias debidas a pequeas cantidades de detergente pueden ser
eliminadas usando los controles adecuados.
Referencia:
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry 72(1-2): 248-254.
19
DIA-UADEC

Departamento
Cuantificacin
de
polifenoles
hidrolizables por el mtodo de FolinCiocalteu
Jorge Enrique Wong Paz

Fundamento
El contenido de polifenoles totales puede ser determinado por medio de un
mtodo espectrofotomtrico con el reactivo de Folin Ciocalteu. Este mtodo se
basa en la presencia de los cidos fosfomolbdico y fosfotngstico en el
reactivo, los cuales se reducen al oxidar a los fenoles debido a la transferencia
de electrones a pH bsico, dando lugar a la formacin de compuestos
cromgenos como oxido de molibdeno y de tungsteno de coloracin azul-verde.
La concentracin producida es proporcional a la concentracin de polifenoles
presentes en la muestra.
Metodologa
Se colocan 800 L de la muestra en un tubo de ensaye.

Posteriormente 800 L del reactivo de Folin-Ciocalteu se agregan y
mezclan, dejndolos reaccionar por 5 min.
Despus de este tiempo, 800 L de carbonato de sodio (0.01 M) fueron
agregados y mezclados, con un nuevo periodo de reposo de 5 minutos.
Finalmente, la solucin fue diluida con 5 ml de agua destilada y su
absorbancia fue leda a 790 nm.
Referencia
Belmares, R., Garza, Y., Rodrguez, R., Contreras, J. C. y Aguilar, C. N. 2009.
Composition and fungal degradation of tannins present in semiarid plants.
Electronic Journal of Enviromental, Agricultural and Food Chemistry. 8, 4, 312318.
20
DIA-UADEC

Departamento
Ventura, J., Belmares, R., Aguilera, A., Gutirrez, G., Rodrguez, R. y Aguilar, C.
N. 2008. Fungal Biodegradation of Tannins from Creosote Bush (Larrea
tridentata) and Tar Bush (Flourensia cernua) for Gallec and Ellagic Acid
Production. Food Technology and Biotechnology. 46 (2) 213217.
21
DIA-UADEC

Departamento
Cuantificacin de taninos condensados

por la tcnica HCl-Butanol
Mara Isabel Reyes Arreozola

Fundamento
Esta
tcnica
permite
analizar
el
contenido
de
proantocianidinas
en
equivalentes de catequina un polifenol del tipo flavan 3-ol. Esta reaccin es

catalizada por un cido que depolimeriza los taninos condensados produciendo
antocianidinas rojas.
Notas importantes
Al usar este mtodo deben de considerarse las siguientes limitaciones
marcadas por Waterman y Mole (1994): La cantidad de agua presente en la
reaccin puede ser critica para la formacin y por tanto para la cuantificacin
de proantocianidinas (Waterman y Mole, 1994; Hagerman y Butler, 1994;
Dalzell y Kerven, 1998). La cantidad de agua recomendada es 6 % (Waterman y
Mole, 1994).
La fcil ruptura de los enlaces interflaventes por el cido es ampliamente
varable. El numer de grupos fenolicos en los anillos afecta la longitud de onda,
por ejemplo las cinidinas y delfidinas tienen una longitud de onda mxima en
545 y 557 nanmetros respectivamente.
La porcin de HCl-Butanol de 6:1 fue propuesta por Hagerman, 1998. Cuando la
porcin del reactivo es 4:1 o 6:1 sel desarrollo del color se ve incrementado
(Dalzell y Kerven, 1998). Otroo factor es la temperatura y el tiempo de reaccin
(Scalbert, 1992).
Material y reactivos
0.5 mL de muestra
3 mL HCl-Butanol
0.1 mL reactivo frrico
Tubos con tapa
22
DIA-UADEC

Departamento
Bao metablico
Agua
Espectrofotmetro
Preparacin de reactivos:
Reactivo frrico
Se agregan 20 mL de HCl concentrado, aforar a 100 mL con agua destilada
posteriormente se adicionan 2 g de reactivo sulfato frrico de amonio y se
almacena en un frasco mbar en refrigeracin (4 C) hasta su empleo.
20 mL HCl
concentrado
Aforar a 100 mL
H2O
Adicionar 2 g de
sulfato frrico de
amonio
Conservar en
frasco mbar 4 C
HCl-Butanol (10 %)
Se agregan 10 mL de HCl al 37 % y se afora a 100 mL con terbutanol.
10 mL HCl al 37 %
Aforar a 100 mL
terbutanol
Catequina (1.0 g/L)

23
DIA-UADEC

Departamento
Diluir 25 mg de catequina en agua y aforar a 25 mL posteriormente se almacena en

un frasco mbar en refrigeracin (4 C) hasta su uso.
Cuantificacin de taninos condensados por HCl butanol
En tubos de ensaye (16 x 150) se colocaron 0.5 mL de la muestra o el
estndar, sobre este se agregaron 3 mL de HCl/Butano (1:9) y 0.1 mL de
reactivo frrico. Los tubos se taparon, dentro de los tapones se colocaron
empaques, para evitar la evaporacin del butanol. Todos los tubos fueron
calentados por 1 hora en un bao metablico a 100 C. Una vez transcurrido el
tiempo, se dejaron enfriar y se ley la absorbancia en un espectrofotmetro
UV/visible a 460 nm. La cantidad de catequina en las muestras fue calculada
por medio de la ecuacin resultante de las lecturas de la curva patrn.
0.5 mL de
muestra
3 mL HCl terbutanol
(1:9)
Leer
espectrofotmetro
460 nm
Cerrar
tubos
0.1 mL
reactivo
frrico
Enfriar a
temperatura
ambiente
Calentar tubos
por 1 h (bao
metablico 100
C)
Curva patrn de catequina 1g/L

Catequina (mL)
0.0
0.25
0.5
0.75
1
Agua destilada (mL)

1
0.75
0.50
0.25
0.0
g/L
0.0
0.25
0.50
0.75
1.0
REFERENCIA BIBLIOGRFICA
Swain, T., and Hillis E. 1959. The phenolic constituentes of Prunus domestica.
The quantitative analysis af phenolic constituents. J. Sci. Food Agric. 10:63-68.
Ventura-Sobrevilla J. M. (2006). Tesis licenciatura. Biodegradacion de Taninos en
Extractos de Gobernadora (Larrea tridentata Cov.) y Hojasn (Fluorencia
24
DIA-UADEC

Departamento
cernua D. C.) mediante Fermentacin en Estado slido usando Aspergillus niger

PSH. Tesis Qumico Farmacutico Bilogo. Universidad Autnoma de Coahuila.
Cuantificacin de polifenoles
hidrolizables por el mtodo de FolinCiocalteu en microplaca
Jorge Enrique Wong Paz

Mxico.
Fundamento
El contenido de polifenoles totales puede ser determinado por medio de
un mtodo espectrofotomtrico con el reactivo de Folin Ciocalteu. Este
mtodo se basa en la presencia de los cidos fosfomolbdico y
fosfotngstico en el reactivo, los cuales se reducen al oxidar a los
fenoles debido a la transferencia de electrones a pH bsico, dando lugar
a la formacin de compuestos cromgenos como oxido de molibdeno y
de tungsteno de coloracin azul-verde. La concentracin producida es
proporcional a la concentracin de polifenoles presentes en la muestra.
Metodologa
Se colocan 20 L de la muestra (concentracin conocida) en un
pozo de la microplaca.
Posteriormente 20 L del reactivo de Folin-Ciocalteu se agregan y
mezclan, dejndolos reaccionar por 5 min.

Despus de este tiempo, 20 L de carbonato de sodio (0.01 M)
fueron agregados y mezclados, con un nuevo periodo de reaccin
de 5 minutos.
Finalmente, la solucin fue diluida con 125 L de agua destilada y
su absorbancia es leda a 790 nm en un lector de microplacas
(Epoch).
25
DIA-UADEC

Departamento
La concentracin de la muestra se obtiene en equivalentes de

cido glico por gramo de material por correlacin lineal de
acuerdo a una curva estndar de cido glico de 0-250 ppm
realizada con los mismos pasos antes descritos.
Notas:
En cada corrida se debe leer la absorbancia de un blanco y un

control, donde el blanco es slo agua milli Q y en el control se
colocan 20 L de agua milli Q en lugar de la muestra.

La absorbancia real de la muestra se obtiene restndole la
absorbancia del control.

Las cantidades empleadas en microplaca para esta tcnica
reducen 40 veces las cantidades empleadas en la tcnica original.
Referencia
Belmares, R., Garza, Y., Rodrguez, R., Contreras, J. C. y Aguilar, C. N.
2009. Composition and fungal degradation of tannins present in semiarid
plants. Electronic Journal of Enviromental, Agricultural and Food
Chemistry. 8, 4, 312-318.
Ventura, J., Belmares, R., Aguilera, A., Gutirrez, G., Rodrguez, R. y
Aguilar, C. N. 2008. Fungal Biodegradation of Tannins from Creosote
Bush (Larrea tridentata) and Tar Bush (Flourensia cernua) for Gallic and
Ellagic Acid Production. Food Technology and Biotechnology. 46 (2) 213
217.
26
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin espectrofotomtrica de
cido elgico
10
Leonardo Seplveda Torre

Mxico.
Fundamento
Esta tcnica se basa en la cuantificacin de cido elgico utilizando un
mtodo espectrofotomtrico. El cual, se basa en la formacin de una
quinona oxima producto de la nitrosilacin del cido elgico. El
mecanismo
de
reaccin
se
debe
una
substitucin
aromtica
electroflica por NaNO2, y la adicin de con la solucin de piridina para

formar al electrfilo in situ (Figura 1). Tiene un lmite de deteccin de 1
g de cido elgico.
27
DIA-UADEC

Departamento
Figura 1. La formacin del cido elgico de un elagitanino y reaccin de

cido elgico con el electrfilo NO+.
La hidrlisis de los elagitaninos produce cido hexahidroxidifnico
(HHDP), donde ocurre una lactonizacin espontnea para formar al cido
elgico. Los carbonos que no estn sustituidos en el cido elgico, son
susceptibles al ataque electroflico. Dos productos posibles pueden ser
formados, (A) una simple sustitucin del producto, (B) nitrosil dienona.
stos forman quinona oxima (C), cuando se ioniza se forma (D) producto
de A o B.
Ensayo
Se pesan 10 mg en caso de que la muestra sea slida. Se
pueden medir 250 L en caso de que la muestra sea lquida.

Se pasa la muestra a tubos Eppendorf limpios.
Se aade 1 mL de cido sulfrico (H2SO4) 2 N.
Se coloca en una estufa a 70 C por un perodo de 30 horas.
Esto con la finalidad de hidrolizar la muestra.

Se pasan por filtros Whatman No. 40.
Una vez filtrada la muestra, se colocan 9 mL de piridina en una
relacin 1:10. En esta seccin es conveniente contar con todas
28
DIA-UADEC

Departamento
las medidas de seguridad personal debido a la toxicidad del
reactivo.
Se pasa 1 mL a un tubo de ensaye.
Se colocan nuevamente 1.1 mL de piridina.
Se colocan en bao de hielo por 5 minutos.
Se aade 0.1 mL de cido clorhdrico (HCl) concentrado.
Se deja incubar a 30 C por 5 minutos.
Se aade 0.1 mL de nitrato de sodio (NaNO2) al 1 %.
Se lee en el espectrofotmetro a 538 nm. En este paso es
importante colocar en una cubeta de cuarzo debido a la
solucin corrosiva.
Se dejan incubar nuevamente a 30 C por 36 minutos.
Se toma la lectura a 538 nm. La diferencia entre la absorbancia
inicial y la absorbancia a los 36 minutos es proporcional a la
concentracin de cido elgico. La formula es: AE = Absf - Absi

AE cido elgico.
Absf Absorbancia final.
Absi Absorbancia inicial.
Curva propuesta
Concentrac Solucin madre
in
(L)
0
0
20
40
40
80
60
120
80
160
100
200
Volumen final = 1000 L
Piridina
(L)
1000
960
920
880
840
800
Observaciones
Se debe de tener mucho cuidado con el manejo de la piridina ya que es
un potente cancergeno y solucin txica. Se debe de trabajar toda la
tcnica con una mscara antigases. De debe de contar con una aeracin
adecuada.
29
DIA-UADEC

Departamento
Es una tcnica poco sensible, se debe de considerar con una cantidad

considerable de cido elgico en tu muestra para que funcione
correctamente.
La curva de calibracin se empieza a realizar a partir del punto nmero
7, estos tubos no son sometidos a previa hidrlisis. Es importante que se
maneje un control.
Referencia bibliogrfica
Wilson, T. C. and Hagerman, A. E. (1990). Quantitative determination of
ellagic acid. J. Agric Food Chem. 38, 1678-1683.
Cuantificacin de cido elgico por
11
metanlisis
Juan Alberto Ascacio Valds

Mxico.
Para llevar a cabo sta determinacin, se pesan 30 mg de material

vegetal seco y molido y se colocaron en tubos de ensaye con tapn de
rosca y empaque para evitar la evaporacin de los solventes utilizados
en sta tcnica.
30
DIA-UADEC

Departamento
Se adicionaron 1.5 mL de cido sulfrico metanlico (ste reactivo se

prepara adicionando 0.190 mL cido sulfrico concentrado por cada ml
de metanol que se requiera), la adicin de ste reactivo se llev a cabo
en un congelador a 20 C, despus los tubos cerrados hermticamente
se colocaron en una estufa de calentamiento por 30 horas a una
temperatura de 80 C, luego las muestras se destapan y se colocan de
nuevo en la estufa de calentamiento bajo las mismas condiciones, para
evaporar los solventes que se utilizaron para realizar la hidrlisis de las
muestras. Luego de que los solventes fueron evaporados a cada tubo se
le adicionaron 1.5 mL de agua y se pasan a tubos Eppendorf de 1.5 ml
de capacidad y se someten a centrifugacin a 6000 rpm por 30 minutos,
esto para eliminar los compuestos hidrosolubles presentes en las
muestras.
Despus
de
la
centrifugacin
de
las
muestras,
los
sobrenadantes son descartados y a los precipitados se les adicionaron

1.5 mL de etanol, luego las muestras se someten a vibracin snica por
20 minutos. Despus de ste protocolo de extraccin de cido elgico,
se toman 0.75 mL de cada muestra, se filtran por membranas de 0.45
m y se colocaron en viales de vidrio de 1.8 mL de capacidad y a cada
vial se les agrega 0.75 mL de etanol, el cual tambin se filtra por
membranas de 0.45 m para obtener as una dilucin 1:2 de cada
muestra en los viales que despus fueron analizados por cromatografa
lquida de alta resolucin (HPLC).
Para la cuantificacin de cido elgico se emple un espectrofotmetro
Cary Bio 50 de la marca Varian, y un aparato para HPLC de la marca
Varian con las siguientes condiciones de operacin:
Una columna Varian Persuit c18 5 m, 250 mm x 4.6mm, con un flujo de
1 mL/min, volumen de inyeccin de 10 L, 30 C de temperatura con las
siguientes condiciones para las fases mviles (% A = metanol, % B =
acetonitrilo, % C = cido actico 3 %):
31
DIA-UADEC

Departamento
Condiciones para el anlisis por HPLC.
Tiempo
(min)
Inicial
10
20
25
26
31
40
Referencia
Ascacio-Valds,
Flujo (1
mL/mi
n).
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
J.,
%A
%B
%C
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20
30
60
30
0
100
100
80
70
40
70
100
Aguilera-Carb,
A.,
Martnez-Hernndez,
J.L.,
Rodrguez-Herrera, R., Aguilar, C.N. (2010). Euphorbia antisyphilitica

residues as a new source of ellagic acid. Chemical Papers. 64: 528 532.
Cuantificacin de cido
Cromatografa
lquida
resolucin (HPLC)
12
glico
de
por
alta
Mnica Lizeth Chvez Gonzlez

Laboratorio de Fermentaciones. Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de
Mxico.
Preparacin de la curva de calibracin.

Para la cuantificacin de cido glico mediante HPLC es necesario
realizar primeramente
una curva de calibracin. Para lo cual se

32
DIA-UADEC

Departamento
emplear un estndar de cido glico. La solucin estndar ser

preparada con una concentracin de 500 ppm. A partir de sta solucin
se realizarn diluciones, tantas como las que el operador considere
necesarias para posteriormente interpolar sus resultados. Una vez
preparada las diluciones, sern microfiltradas por membrana de 0.45
m.
Preparacin de las muestras
Como cualquier otra muestra
HPLC,
deber
ser
que ser introducida en el equipo de
previamente
filtrada
(de
ser
necesario)
posteriormente microfiltrada empleando una membrana de 0.45 m. Lo

anterior con la finalidad de evitar la obstruccin de la columna y/o
conexiones dentro del equipo. Las muestras se depositarn en los viales
especiales para el equipo
Condiciones de operacin de HPLC:
Los viales que contienen tanto la curva de calibracin como las muestras
a analizar sern colocadas de manera ordenada en el carrusel del
equipo. Se verificar que la numeracin de la lista en el programa del
equipo corresponda con la del carrusel.
Las condiciones de uso del equipo son:
Columna Optisil ODS 5 m 250 mm x 4.6 mm.
Flujo de 1 mL/min.
Volumen de inyeccin de 10 L.
Temperatura ambiente.
Fases mviles a rgimen de gradientes

acetonitrilo, C= cido actico 3%).
(A= metanol, B=
Una vez analizadas las muestras, se obtendrn cromatogramas, en los

cules el tiempo de retencin del cido glico estar dado alrededor de
33
DIA-UADEC

Departamento
los 5.6 min. Se tomarn y medirn las reas bajo los picos a este tiempo
de retencin; tanto de la curva de calibracin como la de las muestras.
La cuantificacin del cido glico se llevar a cabo interpolando las
reas de las muestras con las de la concentracin conocida en una hoja
de Excel.
Referencia
Chvez-Gonzlez,
biodegradacin
M.L.
del
(2011).
cido
tnico.
Contribucin
Tesis
de
al
estudio
maestra.
de
la
Universidad
Autnoma de Coahuila.
13
Cuantificacin de glucosa, fructosa y

etanol por HPLC
Miguel ngel Medina Morales
34
DIA-UADEC

Departamento

Mxico.
Una de las alternativas para la deteccin y cuantificacin de etanol es el uso de

HPLC (High Performance Liquid Chromatography).
Materiales
HPLC
o
o
o
o
o
Detector con arreglo de diodos

Detector de ndice de refraccin (IR)
Columna Metacarb 67H Organic acids 300 x 6.5 mm
H2SO4 0.04 N (Fase mvil)
0.6 mL/min de flujo
Las muestras deben de ser colocadas en viales para HPLC previamente

filtradas por membranas de 0.45 o 0.2 m. La temperatura de la columna debe
de ser de 40 C y 35 C en el IR. El tiempo de anlisis de cada muestra es de
30 minutos. Las muestras a analizar deben de estar disueltas en la fase mvil
para evitar interferencias al momento de obtener los cromatogramas
correspondientes. Para cada uno de los analitos debe de prepararse una curva
de calibracin para ser integrada despus con las lecturas y realizar la
cuantificacin.
Referencia
Buenrostro-Figueroa. Aprovechamiento biotecnolgico del mango (Mangifera
indica L.). Tesis de Maestra. Universidad Autnoma de Coahuila. 94 pginas.
14
Determinacin de actividad tanasa por

el mtodo de rodanina metanlica
Luis Vctor Rodrguez Durn
35
DIA-UADEC

Departamento
Fundamento
El mtodo consiste en la medicin del cido glico liberado durante la reaccin
enzimtica, utilizando como sustrato para la tanasa un ster del cido glico
(metil-galato). La medicin del cido glico se basa en la formacin de un
cromforo entre dicho cido y la 2-tio-4- cetotiazolidina, tambin conocida
como rodanina (Fig. 1).
Figura 1. Reaccin catalizada por la tanasa y posterior reaccin del cido

glico con la rodanina
Reactivos
Para la cuantificacin de la actividad tanasa se requieren 5 soluciones:
Buffer de citratos 50 mM a pH 5.0

Metil-galato 0.01M en buffer de citratos (50 mM pH 5.0)
Rodanina 0.667% p/v en metanol
KOH 0.5 N
cido glico 100 ppm en buffer de citratos (50 mM pH 5.0)
*El metil-galato, el cido glico y la rodanina deben protegerse de la luz.

Ensayo
Las soluciones se pre-incubaron a 30 C durante 5 - 10 minutos. Se
etiquetaron tres tubos de ensaye como blanco, muestra y control, se colocaron
0.25 mL de metil-galato 0.01M en buffer de citratos 50 mM a pH 5.0. Al tubo
blanco se le aadieron 0.25 mL de buffer de citratos y al tubo muestra se le
agregaron 0.25 mL del extracto enzimtico, los tres tubos se incubaron 5
36
DIA-UADEC

minutos a 30 C.
Departamento
Despus de la incubacin, se adicionaron 0.3 mL
de
rodanina metanlica (0.667 % p/v), se incub a 30 C por 5 min, se agregaron

0.2 mL de hidrxido de potasio (0.5 N) y se incub otros 5 min. Se agrega el
extracto enzimtico al tubo control. Despus se agregaron 4 mL de agua
destilada, se agit el contenido de los tubos y se incubaron durante 10 minutos
a 30 C. Se ley la absorbancia a 520 nm en un espectrofotmetro. En la figura
2 se muestra un esquema de esta tcnica.
Clculos
Para cuantificar el cido glico liberado se rest la absorbancia del tubo
muestra a la absorbancia del tubo control (ecuacin 1) y se calcul la
concentracin a partir de una curva estndar de 0 a 100 ppm de A.G. en buffer
de citratos.
La unidad de actividad se defini como la cantidad de enzima necesaria para

liberar 1 mol de cido glico por min. Y se calcul con la ecuacin 2:
UI mgA.G.
L
L
5mL
0.25mL
1gA.G.
1000mgA.G.
1molA.G.
170.12 gA.G.
1106 molA.G.
1molA.G.
1
5 min
37
DIA-UADEC

Departamento
Figura 2. Esquema del ensayo enzimtico propuesto por Sharma et al. (2000)
Variantes
Esta tcnica ha sido modificada en mltiples ocasiones, a continuacin se
mencionan las principales:
El volumen se puede reducir para ahorrar reactivos y/o muestra o para

ajustar el volumen final de la reaccin a la capacidad de una microplaca.
Cuando la muestra se encuentra en un buffer de muy alta capacidad
amortiguadora (p. ej. proveniente de sistemas bifsicos acuosos), se
puede usar KOH de una concentracin hasta 5 N.
La temperatura, el pH y el tiempo de incubacin pueden ajustarse de
acuerdo a las caractersticas de la tanasa que se utiliza.
*Cualquier
modificacin
realizada
la
tcnica,
incluyendo
las
antes
mencionadas, debe reportarse como mtodo modificado y especificar dicha

modificacin.
Referencia
Sharma, S., Bhat, T. K. & Dawra, R. K. (2000). A spectrophotometric method for
assay of tannase using rhodanine. Analytical Biochemistry 279(1): 85-89.
38
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin de actividad elagitanasa
15
Reynaldo De La Cruz Quiroz

Mxico.
Materiales
Reactivos
Micropipetas de 100 l a 1000 l y

de 10 l a 50 l.
Puntillas de 1 ml y de 100 l
Tubos de ensaye o tubos eppendorff
Gradilla
Solucin madre del estndar de

cido elgico
Etanol absoluto
Buffer de citratos pH 5
Solucin de elagitaninos 1 mg/ml
Procedimiento
Se usaron dos controles, uno de sustrato (CS) y el otro de enzima (CE).
La mezcla de reaccin contena elagitaninos (1 mg/mL) + extracto enzimtico.
CS: 1 ml de elagitaninos (1 mg/ml) en buffer de citrato pH 5 (0.05 M) +
50
l de buffer de citratos.
CE: 1 ml de buffer de citratos pH 5 (0.05 M) + 50 l de extracto enzimtico.
Mezcla reaccin: 1 ml de elagitaninos (1 mg/ml) en buffer de citratos + 50 l
de extracto enzimtico.
Se deja reaccionar durante 10 min a una temperatura de 60 C en un

termobao.
La reaccin se detiene a los 10 min usando 1050 l Etanol absoluto y se

deja actuando por 10 min.
Sonicar las muestras por 15 min y filtrar con la ayuda de una pirinola con
un filtro millipore de 0.45 m en viales de vidrio.
Se colocan los viales en el equipo HPLC para ser inyectadas las muestras
y cuantificar el cido elgico (fase mvil de cido actico al 3 %).
Preparacin de solucin madre del estndar del cido elgico (AE)

5 mg de cido elgico + 10 ml de etanol
Solucin de AE a 500 ppm

39
DIA-UADEC

Departamento
A partir de la solucin madre preparar soluciones a 400, 300, 200, 100 y 0 ppm
de AE, para realizar una curva de calibracin.
Referencia
Mreles-Ramrez, M.C. 2008. Determinacin de las condiciones de reaccin de la
enzima elagitanasa obtenida por Aspergillus niger GH1 en cultivo en medio
slido. Tesis de licenciatura. Universidad Autnoma de Coahuila.
40
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin
16
de
actividad
endoglucanasa

Mxico.
Para realizar la deteccin de la accin responsable de la depolimerizacin de la

celulosa es necesario determinar tres actividades enzimticas, las cuales son:
actividad endoglucanasa, exo-glucanasa y -glucosidasa.
Determinacin de actividad endoglucanasa
En este caso se detecta la actividad de las enzimas responsables de la
hidrlisis de los enlaces -1,4 localizados en las regiones internas de la
molcula
de
celulosa,
contribuyendo
la
disminucin
del
grado
de
polimerizacin.
Metodologa
Material
Tubos de ensaye (13 x 100)
Carboximetil celulosa a 500 ppm (Sustrato)
Buffer de ACCNa 0.1 M a pH 4.8
Bao mara a 50 C
Reactivos para determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson)
Procedimiento
Blanco de sustrato (BS):
En un tubo de ensaye colocar 200 L de buffer mas 50 L de extracto
enzimtico
Blanco de enzima (BE):
En un tubo de ensaye colocar 200 L de sustrato ms 50 L de buffer.
Mezcla de reaccin (MR):
41
DIA-UADEC

Departamento
En un tubo de ensaye colocar 200 L de sustrato ms 50 L de extracto

enzimtico.
Cada tubo se coloca en bao mara durante 10 minutos y se detiene la reaccin
mediante ebullicin en bao mara durante 5 minutos.
A cada tubo se le miden azcares reductores. Cada una de las determinaciones
debe realizarse por triplicado o de acuerdo a las muestras que se tengan. Los
tubos pueden ser incubados simultneamente.
Referencia
Ghose, T.K. (1987). Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem. 59:
257 268.
42
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin
17
de
actividad
exoglucanasa

Mxico.

hidrlisis de los enlaces -1,4 localizados en las regiones externas de la
molcula
de
celulosa,
contribuyendo
la
disminucin
del
grado
de
polimerizacin.
Metodologa
Material
Tiras de papel filtro Whatman #1 de 1 cm x 6 cm (Sustrato)
Bao mara a 50 C
Reactivos para determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson).
Procedimiento
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan 50 L de extracto
enzimtico
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan una tira de papel
filtro
En un tubo de ensaye colocar 1 mL de buffer y se colocan una tira de papel
filtro. Se adicionan 50 L de extracto enzimtico.
43
DIA-UADEC

Departamento
Cada tubo se coloca en bao mara durante 1 h y se detiene la reaccin

Referencia
Ghose, T.K. (1987). Measurement of cellulase activities. Pure & Appl. Chem. 59:
257 268.
44
DIA-UADEC

Determinacin
18
Departamento
de
actividad
glucosidasa

Mxico.

hidrlisis de los enlaces -1,4 localizados en la celobiosa liberada por efecto de
la accin de la exoglucanasa. La hidrlisis de la celobiosa libera glucosa como
producto para finalizar la hidrlisis de la celulosa.
Metodologa
Material
p-NPG 9 mM (Sustrato)
Na2CO3 0.1 M
Buffer de AAANa 0.2 M a pH 4.6
Bao mara a 50 C
Reactivos para determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson).
Procedimiento
En un tubo se colocan 800 L de buffer

Se agregan 100 L de sustrato
A la mezcla se adicionan 100 L de extracto enzimtico

agregando 100 L de Na2CO3 0.1 M.
45
DIA-UADEC

Departamento
Referencia
Vattem, D y Shetty, K. (2002). Solid-state production of phenolic antioxidants
from cranberry pomace by Rhizopus oligosporus. Food biotechnology. 16: 189
210.
46
DIA-UADEC

Departamento
Determinacin de actividad xilanasa
19

Mxico.
La actividad xilanasa es la responsable de la degradacin de los xilanos

contenidos en la molcula de hemicelulosa
Metodologa
Material
Xilanos a 500 ppm (Sustrato)
Bao mara a 50 C
Reactivos para determinacin de azcares reductores (Somogyi-Nelson)
Procedimiento
En un tubo de ensaye colocar 200 L de buffer mas 50 L de extracto
enzimtico
En un tubo de ensaye colocar 200 L de sustrato ms 50 L de buffer.
En un tubo de ensaye colocar 200 L de sustrato ms 50 L de extracto
enzimtico.
47
DIA-UADEC

Departamento

Referencia
Ghose, T.K., Bisaria, V.S. (1987). Measurement of hemicellulase activities. Part
1: Xilanasas. Pure & Appl. Chem. 59: 1739 1752.
48
DIA-UADEC

20
Departamento
Tcnica para medir reduccin de ABTS

Norma Paola Melndez Rentera

Fundamento
El radical 2,2-azino bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) (ABTS) posee coloracin
azul, cuando encuentra un H + con el cual complementar su estructura pierde la
coloracin. El cambio de coloracin es lo que permite cuantificar el poder
antioxidante de la sustancia colocada como muestra. Para la formacin del
radical ABTS es necesaria la presencia de persulfato de potasio.
Tcnica:
Preparar una solucin de ABTS 7 mM y mezclar con una solucin de

K2S2O8 hasta que este ultimo tenga una concentracin de 2.45 mM.
Ambas soluciones son en agua.

Dejarlos reposar en oscuridad por 12 h a temperatura ambiente.
Para muestras de alimentos y fenoles diluir con etanol, hasta obtener
una absorbancia de 0.7 0.02.

Utilizar etanol como blanco de lectura y ABTS-etanol como absorbancia
control.
La longitud de onda para determinar absorbancia es de 734 nm.
49
DIA-UADEC

Departamento
Aadir a la cubeta de reaccin 1 mL de solucin etanlica de ABTS y 10
L de muestra. Dejar reaccionar 1 min y leer la absorbancia.

Para reportar resultados y graficar los datos, pueden emplearse las
relaciones de abs Vs concentracin (curva de calibracin) expresados
como equivalentes del estndar o bien el porcentaje de reduccin del
radical que se calcula con la siguiente frmula:
reducci n de ABTS=
( AC A m )
AC
100
Donde AC es la absorbancia control (ABTS-etanol) y A m es la absorbancia de la

muestra.
Recomendaciones:
El radical en etanol es estable 2 das a temperatura ambiente y en oscuridad.
Referencia: Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., RiceEvans C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation
decolorization assay. Free radical biology & medicine. 26: 1231-1237.
50
DIA-UADEC

21
Departamento
Tcnica para medir reduccin de DPPH


Fundamento
El radical 2,2-difenil-1-picril-hidracil (DPPH) posee coloracin morada, cuando
encuentra un H+ con el cual complementar su estructura pierde la coloracin.
El cambio de coloracin es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de
la sustancia colocada como muestra.
Tcnica:
Preparar el radical a una concentracin de 60 M, en solucin
metanlica.
Determinar la longitud de onda de absorbancia del radical, mediante un
barrido en el rango visible.

Emplear como blanco de lectura solo metanol y como absorbancia
control la de la solucin DPPH-metanol.

Aadir a la cubeta de reaccin 2900 L de solucin metanlica de DPPH
y 100 L de muestra. Cuantificar el cambio de absorbancia de manera
cintica. Si es necesario deben hacerse diluciones de la muestra, donde
la reaccin de neutralizacin del radical sea paulatina.

Definir el tiempo en el cual el valor de la absorbancia permanece
constante. Tomar este valor para hacer las reacciones a tiempo final.
Si las muestras son extractos de plantas, expresar los resultados como
equivalentes de DPPH/ g de material, utilizando el nmero de Avogadro
para su clculo. Basndose en la concentracin de la solucin del radical
y la cantidad de solucin que reaccion con la muestra.
51
DIA-UADEC

Departamento
Para graficar los datos, pueden emplearse tambin las relaciones de Abs
Vs concentracin (curva de calibracin) o bien el porcentaje de reduccin
del radical que se calcula con la siguiente frmula:
reducci n de DPPH =
( A C Am )
AC
100
Donde AC es la absorbancia control (DPPH-metanol) y A m es la absorbancia de

la muestra.
Recomendaciones:
Los solventes empleados para la disolucin del DPPH pueden ser
metanol o etanol.
La concentracin a la cual se prepara la solucin del radical puede variar
de 50 a 100 M, pero siempre debe tener absorbancia menor a 1.

La cubeta de reaccin puede ser plstico, siempre y cuando este ltimo
no reaccione con los solventes empleados para disolver el radical. Debe
tener 1 cm de ancho, para cumplir la Ley de Lambert-Beer.

La relacin de las cantidades de muestra y radical en solucin, debe ser
1:1. Se pueden modificar estos valores, pero esto influye en la
sensibilidad de la tcnica.
La longitud de onda de absorcin del DPPH vara entre 515 y 520 nm,
por eso debe determinarse la mejor para el equipo en el cual se trabaje.

El tiempo general de la reaccin a punto final suele ser de 30 min, pero
hay reacciones que ocurren en tiempo ms corto (5 min) o incluso
algunas que tardan ms (horas).
Referencia
Molyneux P. (2004). The use of the stable free radical diphenylpicryl-hydrazyl
(DPPH) for estimating antioxidant activity. Songklanakarin J. Sci. Technol. 26 (2):
211-219.
52
DIA-UADEC

22
Departamento
Tcnica para medir reduccin de DPPH

en microplaca

Fundamento
El radical 2,2-difenil-1-picril-hidracil (DPPH) posee coloracin morada, cuando
encuentra un H+ con el cual complementar su estructura pierde la coloracin.
El cambio de coloracin es lo que permite cuantificar el poder antioxidante de
la sustancia colocada como muestra.
Tcnica:
Preparar el radical a una concentracin de 60 M, en solucin
metanlica.
Determinar la longitud de onda de absorbancia del radical, mediante un
barrido en el rango visible. Se puede usar el procedimiento espectro
DPPH del software Gen 5.

Emplear como blanco de lectura solo metanol y como absorbancia
control la de la solucin DPPH-metanol.

Colocar en la microplaca las muestras del blanco.
Colocar en la microplaca 193 L de solucin DPPH-metanol y 7 L de la
muestra a analizar. Tapar con un papel aluminio para evitar el contacto
directo con la luz mientras se llenan los pocillos con DPPH y muestras.
Cuantificar el cambio de absorbancia de manera cintica. Si es necesario
deben hacerse diluciones de la muestra, donde la reaccin de
neutralizacin del radical sea paulatina. El nombre del programa en el
Epoch es DPPH cintica.
53
DIA-UADEC

Departamento
Definir el tiempo en el cual el valor de la absorbancia permanece
constante. Tomar este valor para hacer las reacciones a tiempo final.
Modificar el tiempo de lectura del programa DPPH punto final del
software Gen 5.
Si las muestras son extractos de plantas, expresar los resultados como
equivalentes de DPPH/ g de material, utilizando el nmero de Avogadro
para su clculo. Basndose en la concentracin de la solucin del radical
y la cantidad de solucin que reaccion con la muestra.

Para graficar los datos, pueden emplearse tambin las relaciones de Abs
Vs concentracin (curva de calibracin) o bien el porcentaje de reduccin
del radical que se calcula con la siguiente frmula:
reducci n de DPPH =
( A C Am )
AC
100
Donde AC es la absorbancia control (DPPH-metanol) y A m es la absorbancia de

la muestra.
Recomendaciones:
Los solventes empleados para la disolucin del DPPH pueden ser
metanol o etanol.
La concentracin a la cual se prepara la solucin del radical puede variar
de 50 a 100 M, pero siempre debe tener absorbancia menor a 1.

La relacin de las cantidades de muestra y radical en solucin, debe ser
1:1. Se pueden modificar estos valores, pero esto influye en la
sensibilidad de la tcnica.
La longitud de onda de absorcin del DPPH vara entre 515 y 520 nm,
por eso debe determinarse la mejor para el equipo en el cual se trabaje.
Para el Epoch la longitud de onda puede ser de 514-518 nm.

El tiempo general de la reaccin a punto final suele ser de 30 min, pero
hay reacciones que ocurren en tiempo ms corto (5 min) o incluso
algunas que tardan ms (horas).

Si se incuba fuera del equipo la reaccin debe taparse la placa con papel
aluminio para evitar al mximo el contacto con la luz.
54
DIA-UADEC

Referencia:
Departamento
Molyneux P. (2004). The use of the stable free radical
diphenylpicryl-hydrazyl
(DPPH)
for
estimating
antioxidant
activity.
Songklanakarin J. Sci. Technol. 26 (2): 211-219.
55
DIA-UADEC

23
Departamento
Evaluacin
electroqumica
actividad anti-radicalaria
de
la
Dulce Abril Flores Maltos

Fundamento
Esta tcnica consiste en la evaluacin del potencial rdox de los compuestos
antioxidantes mediante la aplicacin de un barrido de potencial, siendo posible
cuantificar la respuesta dada en valores de corriente.La voltamperometra
cclica (VC) y voltamperometra diferencial de pulsos (VDP) se realiza en un
potenciostato/galvanostato, la celda electroqumica debe constar de tres
electrodos:
electrodo
de
trabajo
(carbn
vtreo,
platino,
oro,
etc.),
contraelectrodo y un electrodo plata-cloruro plata (Ag/AgCl) como referencia a

los potenciales. Antes de los ensayos se realiza un barrido de rutina usando
voltamperometra cclica para la reaccin de Fe 3+/Fe2+ para la caracterizacin
del electrodo de trabajo.
Procedimiento
Las soluciones deben analizarse inmediatamente despus de la preparacin,
para la caracterizacin electroqumica del electrodo se utiliza la voltametra
cclica, mientras que la evaluacin electroqumica del poder antioxidante se
evala por VDP en un intervalo de potencial de -50 a 900 mV.
Para las mediciones voltamperomtricas se utiliza un potenciostato, desde el
cual se controla el barrido de potencial entre el electrodo de referencia y el
electrodo de trabajo. Al mismo tiempo se mide la corriente elctrica generada
entre el electrodo de trabajo y el contra-electrodo, debida al movimiento de
cargas elctricas en la interfase electrodo-solucin. El potenciostato conectado
a una computadora se control con el programa del equipo y se utilizaron
diferentes protocolos de medicin.
Referencia
56
DIA-UADEC

Departamento
Flores-Maltos, D.A. (2010). Desarrollo de un microelectrodo para la evaluacin

del poder antioxidante total del extracto de damiana. Tesis de Maestra.
Universidad Autnoma de Coahuila.
24
Secado de muestras y determinacin

de materia seca total
Romeo Rojas Molina
Laboratorio de Tecnologa de Alimentos. Departamento de Investigacin en Alimentos.

Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de Coahuila. 25280. Saltillo,
Coahuila, Mxico.
Introduccin
La humedad es una de las determinaciones ms importantes y
ampliamente usadas en el control y procesamiento de muestras. En
alimentos, influye en las estructura, apariencia y gusto de los productos,
determina
su
susceptibilidad
al
deterioro
(fsico,
qumico
microbiolgico) y permite determinar adulteraciones. La determinacin

de humedad puede ser el anlisis ms importante llevado a cabo en un
producto alimentario pero es posible que sea el anlisis del que se
obtienen resultados poco exactos y precisos. Este valor analtico es de
gran importancia econmica para un fabricante de alimentos, ya que el
agua es un llenador barato, as:
El contenido de humedad es un factor de calidad en la conservacin
de algunos productos, ya que afecta la estabilidad de: frutas y
vegetales deshidratados, leches deshidratadas; huevo en polvo, papas
deshidratadas y especias.
La determinacin de humedad se utiliza como factor de calidad de:
jaleas y ates, para evitar la cristalizacin del azcar; jarabes
azucarados, cereales preparados - convencionales (4-8%); inflados (78%).
Se utiliza una reduccin de humedad por conveniencia en el empaque
y/o embarque de: leches concentradas, endulzantes; productos
57
DIA-UADEC

Departamento
deshidratados (stos son muy difciles de empacar si poseen un alto

contenido de humedad; jugos de frutas concentradas.
El contenido de humedad se especifica a menudo en estndares de
identidad, as, el queso cheddar debe tener <39% de humedad; para
harinas enriquecidas el contenido de humedad deber ser <15%; en
las carnes procesadas por lo comn se especifica el porcentaje de
agua aadida.
Todos los clculos de valor nutricional requieren del conocimiento
previo del contenido de humedad.
Los datos sobre contenido de humedad se utilizan para expresar los
resultados de otras determinaciones analticas en una base uniforme
(por ejemplo, con base en el peso seco).
El contenido de humedad de los alimentos vara enormemente y es un
constituyente principal en la mayora de los productos alimenticios.
La forma de preparar la muestra para este anlisis quiz sea la fuente
de error potencial ms grande, as que se deben tomar precauciones
para minimizar las prdidas o ganancias de agua inadvertidas que
ocurren durante estos pasos.
Obviamente, cualquier exposicin de la
muestra a la atmsfera abierta debe ser tan breve como sea posible. Se
debe minimizar cualquier probabilidad de calentamiento de la muestra
mientras se muele.
Fundamento y alcance
La materia seca que permanece en el alimento posterior a la remocin
del agua se conoce como slidos totales. Es por eso que este mtodo se
basa en la determinacin gravimtrica de la prdida de masa, de la
muestra desecada hasta peso constante en estufa.
El mtodo es aplicable en muestras slidas, lquidas, pastosas no
susceptibles a degradacin al ser sometidos a temperaturas superiores
58
DIA-UADEC

Departamento
a 100 C. Este mtodo es inadecuado para muestras ricas en sustancias

voltiles distintas al agua.
Secado de muestras
1. Cortar la muestra en trozos de 1 cm aproximadamente.
2. Pesar la charola con la muestra cortada.
3. Registrar el peso hmedo y colocar la charola dentro de la estufa a
una temperatura de 55-60 C por 24 h.
4. Sacar la muestra de la estufa y enfriar a temperatura ambiente
por 3 min.
5. Pesar nuevamente la charola con muestra seca.
6. Registrar el peso.
Clculos
MSP=
Peso de muestra seca

x 100
Peso de muestra humeda
100 MSP= Humedad
Determinacin de materia seca total (Mtodo indirecto por

secado en estufa, CAA; 13.21, 1989)
1. Sacar un crisol de porcelana de la estufa, utilizando unas pinzas,
poner a peso constante e identificarlo con el nmero que se
encuentra en este.
2. Colocar el crisol en un desecador para que se enfre por un tiempo
de 15-20 min.
3. Pesar en balanza analtica.
4. Por separado, pesar 2 g de muestra seca sobre un papel limpio.
5. Poner la muestra en el crisol y meterla a la estufa por 24 h (arriba
de 100 C).
6. Sacar muestra y enfriar por 15-20 min en desecador.
7. Pesar.
CALCULOS
59
DIA-UADEC

MST =
Departamento
Peso crisol con muestra secaPeso de crisol solo

x 100
g de muestra
H =100 MST
NOTA: Realizar la determinacin por triplicado y la diferencia no debe

ser superior al 5 % del promedio.
Referencia
Instituto Nacional de Normalizacin, NCh 841 of 78.
Official Methods of Analysis. A.O.A.C. 15 th Edition 1990
25
Determinacin de cenizas
Romeo Rojas Molina

Coahuila, Mxico.
Introduccin
La determinacin de cenizas es tambin conocida como el anlisis de
residuos inorgnicos que quedan despus de la ignicin u oxidacin
completa de la materia orgnica de un alimento. Es esencial el
conocimiento bsico de las caractersticas de varios mtodos para
analizar cenizas as como el equipo para llevarlo a cabo para garantizar
resultados confiables. Para esto, existen tres tipos de anlisis de cenizas:
cenizas en seco para la mayora de las muestras de alimentos; cenizas
hmedas (por oxidacin) para muestras con alto contenido de grasa
(carnes y productos crnicos) como mtodo de preparacin de la
muestra para anlisis elemental y anlisis simple de cenizas de plasma
en seco a baja temperatura para la preparacin de muestras cuando se
llevan a cabo anlisis de voltiles elementales.
60
DIA-UADEC

Departamento
La tcnica que se describir a continuacin es la de cenizas en seco, la

cual consiste en quemar la muestra al aire y posteriormente en una
mufla para eliminar todo el material orgnico. La ceniza remanente es el
residuo inorgnico y la medicin de la ceniza total es til en el anlisis
de alimentos, ya que se pueden determinar diversos minerales
contenidos en la muestra.
Materiales, reactivos y/o equipos
Muestra seca
Crisoles
Balanza analtica
Parrilla de calentamiento
Mufla
Desecador
Pinzas
Procedimiento
1. Poner a peso constante (100 C/24 h) un crisol o cpsula de
porcelana por cada muestra que se va a analizar.
2. Enfriar el crisol por 15-20 min en desecador, pesar (anotar el peso
exacto) y colocar 1 2 g de muestra seca dentro del crisol.
3. Pre-incinerar
en
un
mechero
parrilla
elctrica,
baja
temperatura para evitar salpicaduras hasta que deje de sacar

humo.
4. Pasar a la mufla a 600 C por 2-3 h.
5. Sacar de la mufla y enfriar 15-20 min en desecador.
6. Pesar en la balanza que se utiliz inicialmente (anotar peso
exacto).
Clculos
C=
Peso del crisol con cenizasPeso del crisol solo

x 100
g de muestra
61
DIA-UADEC

Departamento
NOTAS
No poner cinta a los crisoles para identificarlos. Usar el nmero
impreso en el crisol por el fabricante.

Una forma rpida de poner a peso constante los crisoles es
meterlos por 15 min a la mufla a una temperatura de 550-600 C y
enfriar en desecador por 15-20 min (no cerrar completamente el
desecador ya que el calor de los crisoles puede provocar que la
tapa se proyecte y se rompa).
Referencia
AOAC. 1980.
Official Methods of Analysis.
Association of Official
Analytical Chemists. Washington, D.C.

Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruits and Vegetable Products.
McGraw-Hill.
26
Determinacin de lpidos (Mtodo de

Soxhlet )
Ismael Menera Lpez
Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad

Autnoma de Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, Mxico.
FUNDAMENTO
La muestra seca se extrae con algn disolvente (hexano, ter etlico, ter de
petrleo) posteriormente se determina el extracto seco por diferencia de peso,
del que se elimina el disolvente).
MATERIAL Y EQUIPO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Extractor soxleth (sifn, refrigerante, manta de calentamiento)

Cartucho poroso de celulosa o papel filtro
Parilla elctrica, o manta de calentamiento
Regulador de voltaje
Estufa de secado a 100 103C
Balanza analtica
62
DIA-UADEC

Departamento
7. Disolvente
METODOLOGA
Colocar de 2 5 g en papel filtro de muestra o en un cartucho de celulosa de
poro mediano, el cual se coloca en el
anterior del sifn de un aparato de
extraccin Soxleth. Sacar un matraz redondo plano, boca esmerilada de la

estufa que este a peso constante, enfriar por 30 minutos y pesar, adicionar el
disolvente (ter etlico, ter de petrleo o hexano) hasta la mitad del matraz,
acoplar el refrigerante del depsito soxleth. Extraer por un periodo de 4-5
horas, al finalizar la extraccin colocar
a peso constante nuevamente el
matraz bola fondo plano en la estufa a 100 103C por 24 horas, transcurrido
el tiempo, sacar, enfriar y pesar.
Clculos:
%G = m2 m1
m
x 100
Donde:
%G = Porcentaje de extracto etreo.
m1 = Matraz a peso constante (g).
m2 = Matraz con extracto etreo (g).
m= Peso de la muestra (g).
Referencias
AOAC. Official Methods of Analysis. AOAC. International.1990. 15th Edition,
Association of Official Analytical Chemists. Washington, D.C.
63
DIA-UADEC

27
Departamento
Determinacin de fibra cruda

Emilio Ochoa Reyes

Coahuila, Mxico.
Introduccin
La fibra cruda es el residuo orgnico combustible e insoluble que queda
despus de que la muestra se ha tratado con una solucin acida y otra
alcalina diluida hirviendo, este tratamiento proporciona la fibra cruda,
que consiste principalmente del contenido de celulosa, lignina y
hemicelulosa. La pared celular de clulas vegetales, contiene la mayor
parte del material resistente a las enzimas del tracto gastrointestinal de
los mamferos. Aunque este material pueda digerirse parcialmente por la
microflora intestinal raramente la digestin es total.
64
DIA-UADEC

Departamento
La fibra tambin proporciona propiedades fsicas a los alimentos, y

generalmente baja la densidad calrica de los alimentos. La fibra est
compuesta de fibra insoluble (celulosa, hemicelulosa, lignina y almidon
resistente) y fibra soluble (inulina, pectinas y mucilagos).
La pared celular de las clulas vegetales, contiene la mayor parte del
material resistente a las enzimas del tracto gastrointestinal de los
mamferos. Aunque este material pueda digerirse parcialmente por la
microflora intestinal, raramente la digestin es total.
La fibra tambin le da las propiedades fsicas a los alimentos, y
generalmente baja la densidad calrica de los alimentos.
Para determinar la cantidad de fibra cruda el material debe estar
desengrasado, y se hace reaccionar con cidos y lcalis en caliente; el
residuo se seca y se calcina, la diferencia de pesos entre los residuos
seco y calcinado corresponde a la fibra cruda.
Metodologa
1.
2.
3.
4.
Pesar 2 g de muestra sin grasa.

Poner la muestra en un vaso Berzelius
Agregar 100 mL de solucin de cido sulfrico 0.225 N.
Conectar al aparato de reflujo por un periodo de 30 min contados a
partir de cuando empiece a hervir, al hervir bajar la temperatura, para
que se mantenga en ebullicin suave.

5. Transcurrido el tiempo secar y filtrar a travs de tela de lino y lavar con 3
porciones de 100 mL de agua destilada caliente y hacer prueba de papel
tornasol para verificar presencia de cido.
6. Pasar la fibra (residuo que quedo en la tela de lino) al vaso Berzelius con
100 mL de solucin de hidrxido de sodio 0.313 N y conectar al aparato
de reflujo por 30 min.
65
DIA-UADEC

Departamento
7. Transcurrido el tiempo sacar y filtrar a travs de lino y lavar con 3

porciones de agua destilada caliente y hacer prueba de papel tornasol
para verificar si hay presencia de reaccin alcalina.
8. Escurrir el exceso de agua presionando la tela de lino.
9. Sacar la tela del lino del embudo, extender y retirar la fibra con una
esptula
depositarla
en
un
crisol
de
porcelana,
previamente
identificado.
10.Poner a peso constante en la estufa a 100-103 C por 12 h.
11.Sacar de la estufa, enfriar (a peso constante en desecador) y pesar.
12.Pre-incinerar la muestra en parrilla y meter en la mufla a 550-600 C por
2-3 h.
13.Sacar, enfriar (a peso constante en desecador) y pesar
14.Calcular.
Clculos
%FC=
peso crisolcon fibra seca pe so crisol fibra cenizas

x 100
g de muestra
Referencia
28
Determinacin
de
nitrgeno
por
el
mtodo Kjeldahl
Miguel ngel Medina Morales1 y Romeo Rojas Molina2

Laboratorio de Microbiologa1. Laboratorio de Tecnologa de Alimentos2. Departamento de
Investigacin en Alimentos. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad Autnoma de
Coahuila. 25280. Saltillo, Coahuila, Mxico.
Introduccin
En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos
de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de
catalizadores.
amonio.
El nitrgeno orgnico total es convertido en sulfato de
La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila
posteriormente en una solucin de cido brico. Los aniones del borato

66
DIA-UADEC

Departamento
as formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se convierte en el

nitrgeno de la muestra.
El resultado del anlisis representa el
contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin

proviene de componentes no proticos.
Fuentes de error
Constituyen fuentes de error en este mtodo son: la inclusin de
nitrgeno no protico como parte de la protena; la prdida de nitrgeno
durante la digestin, la digestin incompleta de la muestra.
Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se aaden
al cido (para elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una
descomposicin por calor y la consecuente prdida de amonaco.
Generalmente se recomiendan temperaturas de digestin de 370-410C.
Tambin puede ocurrir prdida de nitrgeno si se utiliza demasiado
selenio o la temperatura de la digestin no se controla cuidadosamente;
las condiciones son an ms crticas que con el cobre o el mercurio
cuando se usan como catalizadores.
Reacciones llevadas a cabo en el mtodo de Kjeldahl

DIGESTIN
(1) n - C -NH2 + mH2SO4
protena
catalizadores
calor
CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN
(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH
2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (cido brico)
borato)
2NH 3 + Na2SO4+
NH 4 + H2BO3-
(in
67
DIA-UADEC

Departamento
TITULACIN
El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con
HCl estandarizado:
H2BO3- + H+
(4)
H3BO3
MATERIAL
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
3
1
1
1
matraz de digestin Kjeldahl con capacidad de 125 ml.

matraz de Erlenmeyer de 10 ml.
matraz volumtrico de 100 ml.
mechero de Bunsen.
pinzas (nueces).
soporte universal
pipeta de 5 ml.
pipeta de 10 ml.
frasco gotero de 25 ml.
frasco lmbar con capacidad de 1 litro.
piseta grande con agua destilada.
microbureta.
cuerpos de ebullicin.
par de guantes de asbesto.
pinzas largas.
embudo de cristal chico o mediano.
EQUIPO
Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).
1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo).
REACTIVOS
Verde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%.

Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%.
cido brico al 2%.
cido clorhdrico 0.01N (solucin valorada).
Hidrxido de sodio al 30%.
cido sulfrico concentrado.
Mezcla catalizadora para la digestin: 2.5 g de dixido de selenio
+ 100 g de sulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre
68
DIA-UADEC

Departamento
pentahidratado (proporcionada por la coordinacin de

laboratorios).
MTODO
ELABORACION DE REACTIVOS
1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde de

bromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol
al 95%. Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la
solucin de rojo de metilo en un frasco gotero.
2.- cido Brico al 2%.- Disuelva 10 g de cido brico (en cristales) en
500 ml. de agua destilada hirviendo.
transfiera
la
solucin
un
frasco
Despus de que se enfre

tapado.
Se
conserva
indefinidamente.
3.- cido Clorhdrico 0.01N.- Prepare un litro y valrela con una solucin
de NaOH de la misma normalidad.
4.- Hidrxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidrxido de
sodio en 350 ml. de agua destilada. Almacene la solucin en un
frasco mbar con tapn de vidrio.
5.- H2SO4 concentrado.
6.- Catalizadores para la Digestin.- Mezcle 2.5g de dixido de selenio
(SeO2), 100g de sulfato de potasio (K 2SO4) y 20 g de sulfato de
cobre pentahidratado (CuSO4 . 5H2O).
69
DIA-UADEC

Departamento
PROCEDIMIENTO
Digestin
1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de microKjeldahl cuidando que la muestra no se adhiera a las pardes o al
cuello del matraz.
2.- Aada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullicin y aproximadamente
1.0 g de mezcla catalizadora.
3.- Someta a digestin la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo
una campana de extraccin, con el matraz ligeramente inclinado
usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida
que procede la digestin, rotando los matraces de vez en cuando
para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestin
terminar cuando el color de la muestra sea azl-verde claro. El
proceso tomar aproximadamente 90 minutos.
4.- Enfre el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al
solidificarse la muestra.
5.-
Aada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra

digerida. Mezcle y permtale enfriarse.
Destilacin
6.- Encienda la unidad destiladora.
7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilacin a aproximadamente 5
ml. por minuto
8.- Abra la llave del agua para tener H 2O circulando por el refrigerante
todo el tiempo.
9.- Aada la muestra a la cmara de ebullicin por medio de un embudo
(para recuperar las perlas de ebullicin) y enjuague el matraz con
aproximadamente 5ml. de H2O destilada.
70
DIA-UADEC

Departamento
10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de cido brico y 2 gotas de

indicador bajo la salida de destilacin.
11.-
Aada aproximadamente 10 ml. de la solucin de NaOH a la

cmara de ebullicin LENTAMENTE.
tornar oscura (azl-gris o caf oscuro).
La mezcla digerida se
Si no cambia de color
aada ms NaOH.
12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.
13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos).
El
destilado estar listo para ser titulado cuando se torna verde en el

matraz receptor.
14.-
Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora

enjuagando la cmara de ebullicin varias veces con agua
destilada. Cada vez que se aada agua destilada hasta llenar la
copita superior de la unidad destiladora para el enjuague deje que
sta hierva primero. Luego abra la llave de la parte que permite
salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. Una vez
vaca la parte en donde se procesa la muestra asegrese de que
est bien vaca. Si queda todava un poco de agua en el fondo
permita que hierva para que se vaya toda hacia esa segunda parte
de la unidad destiladora.
El matraz estar listo para recibir la
segunda cantidad de agua destilada para lavar la unidad

destiladora. Esta operacin se repite al menos unas 4 veces.
NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que
conduce la muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada
(en posicin horizontal) durante el procesamiento de la muestra.
Slo se abre cuando se enjuaga el destilador.
71
DIA-UADEC

Departamento
Titulacin
15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto
final de la titulacin.
Comprese este color con el del blanco.
Cada
equivalente del HCl usado corresponde a un equivalente de NH 3 o a un

equivalente de N en la muestra original. El peso del N en mg est dado
por miliequivalentes del cido X 14 (el peso equivalente del N).
Recuperacin del amonaco

Una posible fuente de variacin en este mtodo es la prdida del gas
amonaco o una falla en atrapar el amonaco en el cido brico. Esto
puede ocurrir en diferentes pasos del proceso. Una tcnica para buscar
la recuperacin del amonaco consiste en destilar cantidades conocidas
de amonaco lquido y titularlo con HCl. Se obtendr otra vez el color
prpura en el cido brico.
Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solucin de
sulfato de amonio.
Aada 5, 10 15 ml (mediante una pipeta) de
solucin de sulfato de amonio a la cmara de ebullicin de la unidad

destiladora.
Enjuguela despus con agua destilada y, si es posible,
desionizada. Coloque inmediatamente la punta de la unidad destiladora

en 10 ml de cido brico + indicador. Colecte aproximadamente 20 ml.
de destilado.
Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl
empleados y calcule el peso del nitrgeno en el (NH4)2SO4.
Clculos
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
% N = NHCl x Volumen de cido corregido x 14 g N x 100
g de muestra
mol
72
DIA-UADEC

Departamento
en donde:
NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml.
Volumen del cido corregido = (ml. del cido estandarizado para la
muestra) - (ml. de cido estandarizado para el blanco).
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de
protena cruda. El porcentaje de N en protena para el harina de
trigo es de 18% y su factor de conversin es de 5.70.
Referencia
A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists.
Methods of Analysis. Washington, D.C.
Official
73
DIA-UADEC

Departamento
Extraccin de ADN (mtodo de CTAB)
29
Mariana Delgado Garca

Mxico.
La extraccin de ADN por la tcnica de CTAB fue propuesta por Doyle y Doyle
(1987). Este mtodo es apropiado para le extraccin y purificacin del ADN de
plantas, productos alimenticios, cepas fngicas, y es utilizado para la
eliminacin de polisacridos y componentes polifenlicos, que afectan la
pureza del ADN, por lo tanto la calidad de este.
La tcnica consta de tres pasos. El primero consta de una lisis de la pared
celular. La muestra se trata con un buffer que contiene EDTA, Tris/HCl y CTAB,
de esta manera se eliminan los lpidos y las protenas de la pared celular. El
CTAB tiene la funcin de capturar los lpidos y as, liberar el ADN. El EDTA es un
componente quelante, que con otros metales se enlaza al Mg el cual es un
cofactor de las ADNasas, por lo que al unirse el Mg con el EDTA se reduce la
actividad de estas enzimas. El Tris/HCl da a la solucin un pH adecuado para el
ADN no se dae.
La extraccin total de ADN, se realiza utilizando una solucin de cloroformoalcohol isoamlico el cual facilita la eliminacin de polisacridos,
protenas, etc.
Extraccin:
En este paso, los polisacridos, compuestos fenlicos, protenas y otros lisados
celulares son disueltos en una solucin acuosa, separados del CTAB y
complejos cidos nucleicos. La eliminacin de polisacridos as como de
compuestos fenlicos es particularmente importante, por su capacidad de
inhibir un gran nmero de reacciones enzimticas. Normalmente la fase acuosa
se forma en la parte superior, sin embargo, si la fase acuosa es densa, por la
concentracin de sal (0.5M), se forma en la parte inferior. En suma, los cidos
74
DIA-UADEC

Departamento
nucleicos en la fase orgnica tienden a partirse si el pH de la solucin acuosa

no ha sido adecuadamente equilibrado de un valor de pH de 7.8-8.0, de ser
necesaria la extraccin con cloroformo se realiza dos o tres veces para as
remover completamente las impurezas de la capa acuosa.
La ltima etapa que es la precipitacin, se separan los cidos nucleicos del
detergente, para lo cual la solucin acuosa se trata primero con una solucin
de precipitacin compuesta por una mezcla de CTAB y NaCl en concentracin
elevada. Una alta concentracin salina es necesaria para que se forme un
precipitado de cidos nucleicos. Puede ser preferible emplear acetato de sodio
en lugar de NaCl por su capacidad tampn. En estas condiciones, el
detergente, que es ms soluble en alcohol que en agua, puede eliminarse por
lavado, mientras que los cidos nucleicos precipitan. El posterior tratamiento
con etanol al 70 % permite una mayor purificacin o elucin de los cidos
nucleicos de la sal residual.
Protocolo:
1. Pesar 0.1g de material a extraer y se envuelve en papel aluminio
etiquetado previamente.
2. Colocar las muestra dentro del termo de nitrgeno lquido por 10 +/- 2
minutos.
3. Inmediatamente despus macerar la muestra a polvo fino con un
mortero esterilizado y congelado previamente.
NOTA: A partir de este momento se requiere utilizar guantes de ltex y bata
de manga larga.
4. Transferir el tejido macerado a un tubo de 1.5ml previamente
esterilizado y etiquetado. Agregar 1ml de buffer de extraccin CTAB ms
20l de albmina srica bovina al 20%.
5. Mezclar con un paso en vortex ligero. Sumergir el tubo en bao mara a
55C por 20 minutos.
6. Centrifugar en la ultracentrfuga a 12,000rpm por 5 minutos. Obtener
con
micropipeta
(cuidando
utilizar
puntillas
estriles),
el
lquido
75
DIA-UADEC

Departamento
sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo de 1.5ml previamente

esterilizado y etiquetado.
7. Agregar el mismo volumen de cloroformo: alcohol isoamlico (24:1) al
tubo con el sobrenadante.
8. Mezclar por inversiones suaves durante 1-2 minutos. Centrifugar en la
ultracentrfuga por 10 minutos a 12,000rpm.
NOTA: de manera opcional se puede obtener el lquido sobrenadante y volver a
mezclarse con un volumen equivalente de cloroformo: alcohol isoamlico
24:1 para volverse a lavar. Seguir el paso 8 y continuar con el siguiente
paso.
9. Transferir a otro tubo estril de 1.5ml la fase acuosa (fase superior de la
solucin). Agregar 50l de acetato de amonio 7.5M ms 800l de etanol
fro al 96%.
10.
Mezclar por inversiones suaves. Colocar en un congelador por 60
minutos.
11.
Centrifugar
12,000rpm
por
minutos
descartar
el
sobrenadante.
12.
Lavar la pastilla adherida al tubo (que es el ADN) dos veces con
etanol al 70% (v/v) mezclado cada vez por inversin suave. Colocar el
tubo destapado en posicin invertida hasta que el olor a etanol
desaparezca.
13.
Resuspender el ADN con 80l de NaOH 8mM.
Refrigerar las
muestras.
NOTA: A partir de esta etapa las muestras deben permanecer refrigeradas
Referencia.
Doyle J.J, Doyle J.L (1987) A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bull 19:11-15
76
DIA-UADEC

Departamento
Ensayo in vitro de actividad antifngica
30
Miguel ngel De Len Zapata

Laboratorio de Fermentaciones. Departamento de Investigacin en Alimentos. Facultad de
Mxico.
El presente ensayo es para determinar el porcentaje de crecimiento,

porcentaje de inhibicin y el impacto del proceso biotecnolgico de
fermentacin fngica de plantas para la obtencin de extractos
vegetales con actividad antifngica contra hongos fitopatgenos.
METODOLOGIA
En el presente ensayo se evalan hongos fitopatgenos, los cuales se
activan en agar papa dextrosa y se incuban a una temperatura de 30 C
durante cinco das. Para la conservacin fngica se utiliza un sistema
77
DIA-UADEC

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crioprotector a base de una solucin leche:glicerol (9:1). Para este

ensayo se utilizan cajas petri, las cuales contienen el agar PDA slido, en
ste caso se evala el extracto liofilizado sin fermentar y el fermentado
a las diferentes concentraciones que se deseen evaluar.
Se colocan 200 L de la solucin crioprotectora con el hongo sobre el
agar y se extiende uniformemente con una varilla de vidrio estril. Se
humedecen por completo crculos de papel filtro Whatman de 2 cm de
dimetro en el extracto sin fermentar y el fermentado a las diferentes
concentraciones y se colocan en cada una de las cajas previamente
identificadas.
Posteriormente se llevan a incubacin a una temperatura de 30 C
durante 48 horas realizando observaciones peridicas cada 24 horas. Se
mide el dimetro en milmetros de la zona del crecimiento del hongo en
cuatro direcciones tomando como resultado el valor promedio de estas
mediciones.
Este ensayo se realiza por triplicado, la determinacin del porcentaje de
crecimiento y el porcentaje de inhibicin del hongo por el extracto
vegetal liofilizado obtenido con material vegetal fermentado, evaluado
en sus respectivas concentraciones se muestra en las ecuaciones 2 y 3.
Growth ( )=
Diameter of fungal growth

100
Diameter of ne gatvie control
Inhibition ( )=100 of Growth
(2)
(3)
Para medir el impacto del proceso biotecnolgico de fermentacin

fngica del extracto vegetal liofilizado, se defini una constante de la
78
DIA-UADEC

Departamento
potenciacin de la capacidad antifngica contra hongos fitopatgenos,

que se calcul segn la ecuacin 4.
P AF=
AF EF
AF ENF
(4)
Donde PAF = Potenciacin de la actividad antifngica por la aplicacin

del proceso de fermentacin; AFEF = Inhibicin del extracto fermentado
(%) y AFENF = Inhibicin del extracto sin fermentar (%).
El clculo de PAF (potenciacin de la actividad antifngica por la

aplicacin del proceso de fermentacin), se determina al considerar que
el efecto de inhibicin en el crecimiento fngico es similar con ambos o
ms extractos, por lo que se procede a dividir el % de inhibicin de
ambos extractos, dando un valor cercano a 1 o inclusive 1, lo que nos
indica una perspectiva muy general del efecto de potenciacin de la
actividad antifngica durante el proceso de fermentacin del extracto.
Tomando el valor 1 como el valor central, a partir del cual se interpreta
la concentracin en la que se obtiene el mayor efecto potencial de la
actividad inhibitoria en el crecimiento de hongos fitopatgenos.
EJEMPLO DE GRFICA:
79
DIA-UADEC

Departamento
1.8
1.6
1.4
1.2
1
PAF 0.8
0.6
0.4
0.2
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Concentracion (ppm )
Eje Y: Concentracin de extractos en ppm

Eje X: PAF (potenciacin de la actividad antifngica por la aplicacin del
proceso de fermentacin)
Referencia
Formulacin y aplicacin de una cubierta comestible a base de cera de
candelilla con la adicin de un extracto acuoso de Fluorensia cernua. Tesis de
Maestra. Universidad Autnoma de Coahuila
31
Conteo de esporas usando cmara de

80
DIA-UADEC

Departamento
Neubauer
Juan Alberto Ascacio Valds
Para estandarizar procesos biolgicos frecuentemente es necesario conocer los

parmetros a manipular. Uno de estos parmetros es la cantidad de clulas
microbianas. Parte del control del proceso radica en definir la cantidad de
clulas microbianas (bacterias o esporas fngicas). Una de las alternativas para
inocular se describe de la siguiente manera.
Se prepara una solucin de Tween 80 al 0.01% (a 100 mL de agua

destilada se le agrega una gota de Tween 80 y se agita levemente)
La solucin de Tween 80 se esteriliza a 121 C por 15 minutos
Se agregan 30 mL de Tween 80 0.01% estril al matraz con el inoculo
propagado
Agitacin en parrilla por 15 minutos, empleando una mosca magntica
Se toma una alcuota de esta mezcla y se prepara una dilucin de
solucin de esporas en agua destilada (dilucin 1:20)
A partir de esta dilucin se toma una alcuota con micropipeta y se llena
la camarilla de Neubauer (aproximadamente 20 L).
Se coloca la camarilla de Neubauer en el microscopio con el objetivo 10x
y se enfoca el campo visual de manera que se observen 5 cuadros con
25 cuadros cada uno.
Se cambia el objetivo a 40x y se enfoca el cuadro central y se cuentan
las esporas que se encuentres enmarcadas en 13 de los 25 cuadros que
tiene el cuadro principal (se recomienda un conteo de 13 cuadros en
forma de z).
Se obtiene el promedio de esporas contadas en los 13 cuadros y se
aplica la siguiente frmula para obtener la cantidad de esporas/mL:
(Promedio cel/cuadro) (25) (1 x 104) (20) = nmero de esporas/mL
Posteriormente se determina la cantidad de esporas necesarias para la

fermentacin.
Se procede a realizar el clculo del inculo deseado usando el promedio
de las esporas mediante una regla de tres simple.
81
DIA-UADEC

MÃ©todos de Laboratorio

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Universidad Autnoma de Coahuila

Determinacin monosacridos por el

Toms Lpez Altunar

Aadir 340 mL de agua destilada

Nota: el reactivo es estable por 2 semanas almacenado a 4 C y la curva

Agregar 0.25 mL de muestra a analizar

Solucin de Glucosa: Disuelva 100 mg de glucosa seca y de buena calidad

Universidad Autnoma de Coahuila

Kunerth W.H y Youngs. (1984). Modification of the Anthrone, Carbazole and

Determinacin de azucares totales por

Toms Lpez Altunar

Muestra hidrolizada (pulpa de caf)

Universidad Autnoma de Coahuila

PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR AZUCARES TOTALES (DUBOIS,

250 l de muestra hidrolizada

Nota: la curva de calibracin se realiza con glucosa

Universidad Autnoma de Coahuila

Determinacin de azcares reductores

Adriana Carolina Flores Gallegos

Figura 1. Reaccin de azcares reductores con los reactivos de Somogyi y

Universidad Autnoma de Coahuila

Sulfato de cobre (CuSO4 5H2O)

El reactivo de Somogyi est compuesto por 25 partes de reactivo A y 1 parte

Almacenar en un frasco mbar o en un frasco cubierto con aluminio. El reactivo

Universidad Autnoma de Coahuila

Figura 2. Desarrollo del compuesto cromognico a 37 C. Curva 1, tiempo 0;

El blanco consiste en agua destilada.

Universidad Autnoma de Coahuila

Cuadro 1. Curva estndar glucosa

El mtodo es muy preciso para 0.01 mg de glucosa, galactosa y maltosa,

Universidad Autnoma de Coahuila

Determinacin analtica de azcares de

Diana Beatriz Muiz Mrquez

Solucin Fehling- Soxhlet A (F-SA)

Universidad Autnoma de Coahuila

Papel filtro whatman no.9

Una vez aforada la muestra se agregan unas gotas de subacetato de plomo. La

Recolectar el filtrado y titular cuanto antes, no se debe guardar por ms de una

En un matraz erlenmeyer agregar 5 mL de sln Fehling- Soxhlet A + 5 mL de sln

Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullicin.

Empezar la titulacin con la solucin problema y una vez que presente un

Tomar las lecturas de los mililitros gastados de titulante (promediar).

Universidad Autnoma de Coahuila

Determinacin de azcares no reductores

Universidad Autnoma de Coahuila

Una vez aforada la muestra se agregan unas gotas de subacetato de plomo. La

Recolectar el filtrado y titular cuanto antes, no se debe guardar por ms de una

Universidad Autnoma de Coahuila

Poner el matraz en la parrilla caliente y esperar la ebullicin.

Empezar la titulacin con la solucin problema y una vez que presente un

Tomar las lecturas de los mililitros gastados de titulante (promediar).

* Vol. de aforo x 100

: ttulo de la solucin Fehling- Soxhlet

Anexo: preparacin de reactivos

Sulfato de cobre pentahidratado

Universidad Autnoma de Coahuila

1) Solucin A. Pesar exactamente 34.689 g de sulfato de cobre pentahidratado.

Volumen de las soluciones A y B

T: ttulo expresado en dextrosa para 10 mL de reactivo F-S (5 mL de A+ 5 mL

Universidad Autnoma de Coahuila

NOTA: El T F-S expresado para 10 mL del reactivo tiene las siguientes

0.050 g de dextrosa anhidra

Universidad Autnoma de Coahuila