Introduo

A Dengue uma doena infecciosa aguda causada por quatro sorotipos

antigenicamente distintos do vrus da dengue (DENV 1-4), todos pertencentes famlia
Flaviviridae e ao gnero Flavivirus, o qual rene 53 espcies de vrus [1, 2]. A dengue
transmitida pelo mosquito do gnero Aedes, principalmente o Aedes aegypti. A doena
causa aproximadamente 21.000 mortes por ano, e cerca de mais de 390 milhes de
pessoas esto infectadas com o vrus em mais de 100 pases do mundo [2, 3]. Dados da
Organizao Mundial de Sade mostram que existem mais de trs bilhes de pessoas
em situao de risco para contrair a doena [4], sendo que a maioria das mortes
causadas pela infeco por dengue ocorre aps a evoluo da dengue em febre
hemorrgica da dengue e sndrome de choque da dengue [5].
O RNA genmico do vrus apresenta trs protenas estruturais (C, prM e E) e
sete protenas no estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5). Sua
traduo gera uma poliprotena, a qual clivada por proteases do vrus e da clula
hospedeira, e a interao do RNA no complexo de replicao [6].
Aps a infeco do DENV na clula hospedeira e traduo do RNA genmico a
poliprotena formada clivada pela NS3, que utiliza o segmento hidrofbico de 40
resduos da protena transmembranar NS2B como cofator essencial para a atividade. A
NS3 uma poliprotena multifuncional composta por um domnio helicase e um
domnio protease onde, o domnio protease est na regio N-terminal e o helicase na Cterminal [5, 6].
A serina protease viral NS3/NS2B um alvo atrativo para o desenvolvimento de
novas terapias contra DENV e outras infeces flavivirais, tal como a Febre do Nilo
Ocidental e a Febre Amarela. Devido ao seu papel no processamento ps-traduo da
poliprotena viral, a NS3/NS2B essencial para o ciclo de vida e mecanismo de
replicao viral. Portanto, a inibio desta enzima torna-se necessria para interferir
com a replicao do vrus nas clulas hospedeiras humanas [1].
A NS3 uma serino protease do tipo tripsina com uma trade cataltica
constituda de His51, Asp75 e Ser135. Embora a trade esteja inteiramente constituda
dentro dos substios da NS3, a protease funcional requer a presena do cofator NS2B
[7]. A regio hidrofbica da NS2B importante para a ativao da NS3 protease in vivo,
j que reaes que contm a NS3 protease sem o cofator so incapazes de promover
atividade [8].
Apesar de sua alta incidncia, severidade e impacto econmico, atualmente no

h nenhuma vacina ou medicamento especfico contra DENV, apenas so tratados os

sintomas, o que torna necessria a busca por um frmaco capaz tratar a doena. Desta
forma, o bloqueio da atividade NS3/NS2B serino protease proporciona um modo eficaz
para projetar pequenas molculas teraputicas contra esse vrus.
O desenvolvimento de pequenas molculas inibidoras de protease viral de
considervel interesse para o tratamento de doenas flaviviral emergentes como dengue
[1, 9]. Pequenas molculas anlogas de nucleosdeos, anticorpos e inibidores peptdicos
foram direcionadas a inibir a replicao do DENV (???). Inibidores peptdicos so
considerados como uma classe de agentes teraputicos com diversas propriedades
qumicas e atividades biolgicas. Embora uma vantagem desses inibidores est no fato
de terem menos toxidez comparado com compostos sintticos. Assim, eles so
utilizados contra diversas doenas, tais como infeces virais e doenas no infecciosas
como o cncer [10].
As estruturas derivadas da acrilamida so pequenas molculas peptdicas que
apresentam uma poro aril e uma dupla ligao que so responsveis pela alta
densidade eletrnica desses compostos, alm de terem uma notvel afinidade e uma
comprovada inibio contra a protease da DENV [11].
Assim, neste estudo foi realizado um ensaio virtual com os inibidores derivados
da acrilamida para a inibio da enzima NS3/NS2B serino protease do vrus da dengue
de forma a avaliar a inibio destas molculas na enzima da DENV. Atravs do
programa Castp e da docagem molecular foi possvel caracterizar as interaes do stio
ativo da enzima com diferentes programas. Posteriormente, foi aplicada uma anlise
consensual no resultado do ensaio virtual, anlise de interao e valores de Ki, para
selecionar estruturas mais promissoras em inibir a enzima, sendo estas selecionadas para
estudos de dinmica molecular. Pelos resultados da dinmica obtidos verifica-se que a
estabilidade dos compostos atravs do grfico da Raiz do Desvio Quadrado Mdio
(RMSD) e as interaes de resduos de aminocidos da estrutura, no complexo receptorligante no meio biolgico.

Mtodos
CASTp
Como a NS3/NS2 serino protease no possui ligante cristalografico que permite
a identificao imediata do stio ativo da enzima, com isso, para prev possiveis stios
de ligao e dos resduos importantes da protena foi usado o servidor on-line CASTp

[12].

Docagem Molecular
A docagem molecular um mtodo utilizado para predizer o modo de ligao de
pequenas molculas na cavidade de interao de macromolculas, sendo capaz de
determinar as mudanas de conformao do ligante por meio de interao no alvo de
modo a formar um complexo receptor-ligante [13]. O processo de docagem compreende
duas etapas principais: o algoritmo de busca e a funo de pontuao, que esto
relacionadas predio do posicionamento (conformao e orientao) no interior da
enzima, alm de avaliao da afinidade de ligao [14-16]. Esta ferramenta
comumente empregada para selecionar estruturas promissoras para a avaliao
experimental por meio de procedimento de uma triagem virtual [13].
Os clculos de docagem molecular foram realizados com o modelo
cristalogrfico da enzima NS3/NS2B serino protease, recuperada do PDB com o cdigo
2FOM, utilizando os programas DOCK 6.5 [17], que usa o algoritmo incremental para a
realizao dos clculos; Molegro Virtual Docker (MVD 5.0) [18], que emprega o
algoritmo gentico com predio de cavidades e o AutoDock Vina (Vina 1.1.1) [19], que
utiliza o algoritmo gentico. Como a enzima de dengue no possui ligante
cristalogrfico o uso de diferentes programas de docagem molecular contribuem para
localizao do stio ativo da enzima [20]. Todas as simulaes utilizaram o cofator
NS2B que necessrio para a ativao da NS3 serino protease [5].
Para a realizao da docagem no programa DOCK 6.5 [17], a todos os ligantes
foram adicionados tomos de hidrognio e calculadas as cargas pelo mtodo AM1-BCC
[21] no programa Chimera [22]. Para o alvo, usando o programa dms [23], foi gerada
uma superfcie molecular de Connolly [24], e o mdulo SPHGEN [25] foi usado para
criar as esferas complementares superfcie da protena em um raio de 8 do ligante.
Em seguida, o mdulo grid [26] do programa DOCK 6.5 foi usado para gerar uma caixa
tridimensional localizada sobre o stio ativo da enzima com o tamanho de 60 para
englobar as esferas selecionadas. Finalizada a etapa de preparao do stio e dos
ligantes, iniciou-se a docagem flexvel e subsequente minimizao dos ligantes no stio
ativo da enzima, a qual foi mantida rgida.
No programa MVD 5.0 [18] o alvo e os ligantes foram preparados atravs do
mdulo de preparao padro do MVD. Para cada complexo, foram adicionados tomos
de hidrognio e as cargas atmicas parciais padres do programa. Os clculos de

docagem foram efetuados atravs da funo de pontuao MolDock, com uma

resoluo de grade de 0,3 . A regio do sito ativo da enzima foi definida como uma
regio esfrica de 15 , abrangendo todos os resduos de aminocidos do stio ativo, e
com os valores das coordenadas x = 19,60, y = 44,81 e z = -3,14. Para cada complexo,
foram executados 10 clculos, gerando 10 conformaes com o algoritmo MolDock
optimizer [27].
No programa Vina 1.1.1 [19], foram adicionados tomos de hidrognio e
calculadas as cargas pelo mtodo AM1-BCC para todos os ligantes. Ao alvo foram
adicionados tomos de hidrognio e as cargas a todos os tomos polares. O receptor foi
docado como parcialmente rgido e o ligante como flexvel. A grade de energia utilizada
consiste em pr-calcular as contribuies energticas do receptor, pela avaliao das
interaes de van Der Waals e eletrostticas entre os tomos do ligante e do receptor, em
uma grade de pontos, que so lidas durante a avaliao do complexo ligante-receptor
[28]. Essa caixa cbica de 60 foi centrada no ligante cristalogrfico usado como
referncia, e os valores de coordenadas do centro x = 19,575, y = 43,851 e z = -2,448.
Para cada complexo, foram executados 10 clculos, gerando 10 conformaes.
As energias obtidas da docagem molecular foram pontuadas usando o mtodo do
escalonamento [29] e com as dez estruturas mais bem pontuadas foram feitas as anlises
das interaes e dos valores da constante de inibio [1]. Posteriormente, foram
selecionadas trs estruturas para serem submetidas dinmica molecular na livraria
computacional fDynamo [30].

Dinmica Molecular
A Dinmica Molecular (DM) uma ferramenta computacional usada na
Qumica Medicinal para o planejamento de frmacos [31]. A DM uma extenso da
Mecnica Molecular, onde o comportamento dinmico de um sistema molecular
simulado atravs da integrao numrica das equaes de movimento e fornece
informaes sobre o comportamento dinmico microscpico, dependente do tempo e
dos tomos individuais que compem o sistema [31]. Esta tcnica tem sido usada
extensivamente para auxiliar o planejamento de novos ligantes de um alvo teraputico
[31].
O mtodo hbrido QM/MM utiliza a possibilidade de se tratar sistemas
biomoleculares bastantes extensos e calcular a sua energia a um baixo custo
computacional (mtodos MM), aliados a capacidade de resolver problemas de reaes

enzimticas, transferncia de carga ou de excitao eletrnica e energia do sistema

(protena/inibidor) (mtodos QM), permitindo a modelagem de sistemas biomoleculares
a um esforo computacional razovel para fornecer preciso necessria aos clculos
[32].
Como os valores padro de pKa dos grupos ionizveis podem ser deslocado na
protenas, uma atribuio dos estados de protonao a pH 7 de todos esses resduos
foram estimados utilizando clculos de pKa usando o servidor PropKa [28, 33]. Aps
diferentes anlises foram selecionados trs compostos, no qual foram submetidos a DM
usando o mtodo hbrido QMM/MM, onde os tomos de hidrognio foram adicionados
a cada estrutura usando a biblioteca fDynamo e ao receptor foram feitos clculos usando
algoritmos de otimizao (steepest descent, gradiente conjugado e L-BFGS-B) [30].
Durante este processo, para evitar uma desnaturao da estrutura da protena todos os
tomos pesados na protena e o inibidor foram contidos usando um cartesiano
harmnico do tipo guarda-chuva com uma constante de fora de 1000 kJ mol-1 A-2[28,
34]
O inibidor foi colocado dentro do stio ativo enzimtico com as coordenadas
cartesianas e a enzima otimizada e complexada com cada ligante foi colocado em uma
caixa cbica de gua pr-equilibrada (80 x 80 x 80) , usando o inibidor como o centro
geomtrico, essas molculas de gua foram relaxadas usando os mesmos algoritmos de
otimizao [30, 35]. Depois, foram calculados 100 ps de simulao no mtodo hbrido
QM/MM Langevin-Verlet a 300 K em um conjunto termodinmico cannico (NVT)
usados para equilibrar o modelo [35, 36] .
Foram calculados 10 ns de DM para equilibrar cada sistema, utilizados o
mesmo mtodo hbrido QM/MM; os resduos de aminocidos na regio da QM que
incluem His51, Ser135 e Asp75 foram descritos usando o Hamiltoniano semiemprico
AM1[35], e para descrever o resto da protena e o solvente foi usado o campo de fora
OPLS-AA [37] e TIP3P [38] , respectivamente implantado na biblioteca fDynamo.

Resultado e Discusso

Inicialmente os valores de energia da docagem molecular das 86 estruturas

obtidas da literatura, foram escalonadas [29] e ranqueadas para cada programa, este
procedimento utilizado para minimizar possveis erros, tal como a seleo de falsos
positivos [39]. Aps isso, as 10 estruturas mais bem pontuadas foram selecionadas e

submetidas a uma segunda anlise consensual levando em considerao as interaes

por resduo e os valores de Ki, essas anlises possibilitaram a seleo de trs estruturas
que foram submetidas a dinmica molecular na livraria computacional fDynamo [30]
(Tabela 1).
A enzima NS3/NS2B serino protease do vrus da dengue apresenta um stio
cataltico composto de quatro substios (S1, S1, S2 e S3) [5], os trs compostos
selecionados para a dinmica molecular fizeram interao com os quatro substios,
porm as interaes mais frequentes e significativas foram feitas com resduos de
aminocidos polares, como Ser135, His51 e Asp75, que fazem parte dos substios S1 e
S2 e formam a trade cataltica [7].

Tabela 1: Estruturas selecionadas aps a docagem molecular, seus valores de energia e a

constante de inibio para a enzima NS3/NS2B serino protease
Energia
(kJ/mol)

Estrutura
Vina

17

-7,70

MVD

-93,33

Ranque
final

Ki
(M)

Interaes
com resduos de aminocidos

Dock

Vina

MVD

Dock

-42,26

23,0

Ser135,
His51,
Asp75,
Gly151

Asp167

Asn152

Thr120,
Asn167

Ile165,
Val147

Gly153

Asn167

2,20

25

-8,20

-98,97

-38,27

2,24

46,6

His51,
Gly153,
Try150,
Phe130

68

-8,00

-95,71

-38,12

2,12

36,8

Ser135,
His51

Atravs do programa Ligplot+ [40] verificou-se as interaes das trs estruturas

selecionadas aps a anlise consensual com o receptor. As interaes, hidrofbicas e por
ligao de hidrognio, do ligante com os resduos de aminocidos so importantes para
a estabilidade do ligante no stio da enzima [40].
O ligante 17, no programa AutoDock Vina, apresentou ligaes de hidrognio
com os resduos de aminocidos Ser135, His51, Asp75 e Gly151, importantes para a
inibio da enzima, j que os resduos Ser135, His51 e Asp75 fazem parte da trade

cataltica da enzima [7]. No substio S2 esto os resduos de aminocido Asp75 e

Gly151, e o substio S1 encontram-se os resduos de His51 e Ser135.
O ligante 25, no programa AutoDock Vina, faz interao por ligao de
hidrognio com a Gly153 que esta no substio S3 e a His51 que faz parte da trade
cataltica e com os resduos Tyr150 e Phe130 que fazem parte do substio S1 da NS3
[41].
As interaes, por ligao de hidrognio, presentes no composto 68 com os
resduos de Ser135 e His51 no programa AutoDock Vina. A presena de uma ligao de
hidrognio da His51 com o Asp75 necessria para estabilidade da histidina protonada
[42], j o programa Molegro Virtual Docker apresentou uma interao com a Gly153.
As principais interaes hidrofbicas se mostraram semelhantes para cada
ligante independente do programa de docagem. No programa Autodock Vina as
principais interaes foram com Gly153, Phe130, Ser131, Ser135, Gly151, Tyr150. No
programa MVD, Lys73, Lys74, Thr120, Asn152, Asp75, Gly153 foram as principais
interaes e para o programa Dock as principais interaes foram com Lys73, Asn167,
Val147, Ile165, Lys74, Asn152.
Em geral, o sistema aromtico com um grupo receptor de eltrons resulta em
baixa atividade, enquanto que os grupos doadores de eltrons com substituintes hidroxi
ou amina melhoram a atividade, observadas para derivados que apresentam hidroxila na
posio para em um benzeno, como a estrutura 25, esses inibidores apresentam as
melhores atividades contra proteases do DENV. Os substios S1 e S2 so mais
importantes para o reconhecimento molecular em proteases do vrus. Com a docagem
molecular foi possvel observar que a poro arilo interagiu com o substio S1 da
enzima da dengue, provavelmente combinado com uma interao do nitrilo e a serina
cataltica. Um sistema aromtico com elevada densidade de eltrons necessria para
uma eficaz interao com o alvo [1].
Inibidores peptdeos so utilizados para inibir as serino proteases, nos derivados
da acrilamida, o grupo nitrila pode agir como um nucleofilo para a serina cataltica para
induzir uma interao dipolo-dipolo ou para criar uma ligao covalente reversvel entre
inibidor e protease [1].
O mapa do potencial eletrosttico dos ligantes selecionados (Figura 2) apresenta
as regies mais nucleoflicas (potencial eletrosttico negativo) so mostrados em
vermelho, enquanto que as regies mais eletroflicas (potencial eletrosttico positivo)
so mostradas em azul. As regies nucleofilicas de todos os ligantes so onde esto

presentes os tomos de nitrognio e oxignio, local que ocorreram as interaes por

ligao de hidrognio da enzima com os ligantes.

Figura 2: Mapa do potencial eletrosttico obtidos do programa Molden dos ligantes 17,
25 e 68, respectivamente

Isso pode ser observado, j que todos os ligantes fizeram interao com as
regies nucleofilicas presentes na poro amida da estrutura. O carbono da carbonila da
ligao peptdica dos inibidores peptidicos atacado pelo nucleofilo (serina ativada), o
oxianion inicia uma reao de eliminao que cliva a ligao peptidica, liberando o
novo N-terminal da protena, protonado pela His51 como pode ser observado no
resultado de docagem no programa Autodock Vina. Outras regies inibidoras
importantes so capazes de formar e estabilizar as interaes no covalentes com o stio
ativo da enzima.
Depois de 10000 ps de simulao de DM com o hbrido QM / MM, a anlise da
estrutura foi realizada sobre o complexo enzima-inibidor por meio da comparao dos
dados de RMSD.

Figura 3: Grficos de RMSD da simulao de dinmica molecular para trs ligantes

Um dos mtodos utilizados para avaliar a estabilidade de uma simulao DM a

RMSD onde se observa o comportamento do sistema durante um tempo de simulao
de 10000 ps gerado pela trajetria [43]. Atravs da Figura 3, a simulao das trs
estruturas durante este perodo de tempo mostrou boa estabilidade e um desvio pouco
significativo das estruturas. Consequentemente, as estruturas obtiveram certa
estabilidade ao fim do tempo de simulao, mostradas no grfico de RMSD. Com um
sistema estvel possvel obter os resduos de aminocidos que fizeram interaes com
esses compostos possibilitando a estabilizao do sistema.
Na Figura 4, a decomposio de energia de interao por resduo para os
inibidores 17, 25 e 68 foi obtida para analisar a interao dos inibidores com a protena
aps um tempo de 10000 ps [44].

Figura 4: Grficos de interao por resduos aps o tempo de 10000 ps de simulao de

dinmica molecular para trs ligantes

(A)

(B)

(C)
Os resultados da anlise de decomposio de energia de interao por resduo
para os inibidores 17, 25 e 68 mostram que esses inibidores complexados a enzima
interagem fortemente com os resduos presentes na ala flexvel [45] da NS3/NS2B
serino protease do vrus da dengue, Ser34, Trp50, Lys73, Lys74 e Gly151, sendo a
Lys74 fortemente repulsiva.
As proteases sernicas em geral apresentam um stio ativo circundado por duas
alas flexveis em forma de um bolso que permite o acesso de substratos ou inibidores
com formas complementares[46]. A conformao da ala de inibio complementar ao
stio ativo da enzima a ser inibida permite uma ligao bastante forte entre a enzima e o
inibidor [46, 47].
O tomo de Lys74 poderia ser responsvel elevada atividade de inibio. Uma
vez que Lys74 est diretamente ligada a Asp75, a formao de uma ligao de
hidrognio entre Lys74 e o inibidor poderia induzir uma mudana conformacional do
Asp75, em particular, ou da regio da trade cataltica, em geral. Isso, provavelmente,
poderia interromper a transferncia de eltrons necessria para a ligao do substrato
com o stio ativo, portanto, afetando a atividade da protease. A interao entre os
ligantes com resduo de Lys73 pode contribuir diretamente para a mudana

conformacional do stio ativo, porm de uma forma menos intensa que o resduo de
Lys74 [48].
As interaes atrativas de energia de interao entre os ligantes e a protena
foram identificadas para os resduos de Ser34 (Figura 3A), Ser127 (Figura 3C) e Ser131
(Figuras 3A e 3B) so importantes para estabilidade do inibidor no stio alostrico da
enzima. J a interao com o resduo de Gly151 (Figuras 3A, 3B e 3C) corrobora com
os resultados da literatura e com os resultados obtidos na docagem molecular.
A serina protease do vrus da dengue apressenta outros locais de ligao alm do
stio ativo da enzima. Afim de identific-las foi utilizado o servidor on-line CASTp
[12]. Nas cavidades identificadas na Figura 1 foram observados as regies do stio ativo
e do stio alstrico da proteina.
Figura 1: Cavidades para a enzima NS3/NS2B serino protease do vrus da
dengue obtidas no servidor on-line CASTp

O stio ativo da enzima e a regio da docagem molecular pode ser identificada

pela cavidade em rosa (Figura 1), nessa cavidade est presente a trade cataltica da
NS3/NS2B serino protease [15], a maioria das interaes hidrofbicas presentes na
docagem molecular foi feita com resduos presentes na regio em verde onde esto
presentes os resultados da dinmica molecular. Essa regio com maior rea e volume foi
onde os ligantes permaneceram aps a estabilizao do sistema no tempo de 10ns de
DM, j que a maioria dos resduos de aminocidos aos quais os ligantes fizeram
interao est presente nesta cavidade, stio alostrico.

Concluso
As molculas derivadas da acrilamida usadas neste estudo, atravs da docagem
molecular confirmaram as informaes presentes na literatura, onde houve a
conservao de resduos importantes para a inibio da enzima, como a trade cataltica
His51, Ser135, Asp75. Atravs dessa anlise os trs compostos que apresentaram os
maiores valores de energia, constante de inibio e interaes foram submetidos
dinmica molecular. Atravs da dinmica molecular da estrutura do receptor-ligante, os
trs ligantes, 17, 25 e 68, selecionados para inibir a enzima NS3/NS2B serino protease
do vrus da dengue, atravs do grfico de RMSD, com o tempo de simulao de 10000
ps mostraram que os sistemas esto estveis. A decomposio de energia de interao
por resduo para os inibidores 17, 25 e 68, mostrou que os trs ligantes fizeram
interao com Ser34, Trp50, Lys74 e Gly151, sendo a Lys74 fortemente repulsiva. Essa
interao repulsiva indica que a inibio ocorre em um possvel stio alostrico da
enzima. Atravs desses resduos foi possvel observar que, por se tratar de uma serino
protease a ala flexvel da enzima fez interao com todas as estruturas, j que, em
geral, esse tipo de enzima apresenta um stio ativo circundado por duas alas flexveis
em forma de um bolso que permite o acesso de substratos, isso mostra a potencialidade
desses compostos para a inibio do vrus da dengue.

Resumo
A dengue uma doena infecciosa aguda transmitida pelo mosquito do gnero Aedes, sendo que
as reas de maior incidncia no mundo so regies tropicais e subtropicais. No h tratamentos
especficos, apenas so tratados os sintomas. A enzima NS3/NS2B serino protease (cdigo
PDB: 2FOM) essencial para o ciclo de vida do vrus, por isso um alvo promissor para o
desenvolvimento de frmacos contra a dengue. Derivados da acrilamida apresentam um grupo
aril e uma dupla ligao que so importantes para a interao da enzima do vrus da dengue.
Assim, derivados da acrilamida que apresentam valores de Ki foram submetidos docagem
molecular utilizando os programas Autodock Vina 1.1.1, Molegro Virtual Docker 5.0 e Dock
6.3. Atravs dos resultados da energia de docagem e interao no programa Ligplot+ e dos
valores da constante de inibio, foi possvel observar que os ligantes mais bem pontuados
fizeram interao de hidrognio com os resduos His51, Ser135, Asp75, Gly151 e Gly153,
sendo estas ligaes responsveis pela estabilizao dos ligantes no sitio da enzima. A partir

desses resultados, trs ligantes foram selecionados para a simulao da dinmica molecular
QM/MM, onde se observou atravs do grfico do RMSD que os ligantes tendem a estabilizao
no stio da enzima e atravs da decomposio de energia de interao por resduo foi

observada os principais resduos que fizeram interao na DM, e a importncia da ala

flexvel presente na protease.
Palavras-chave: Dengue. Acrilamida.

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Figura 1: Fonte: http://sts.bioengr.uic.edu/castp/calculation.php