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GENERALIDADES DE

VIROLOGIA
Bioq. Cristina Lema

Qu es un virus?

Virus

Son parsitos intracelulares obligatorios, no


pueden sintetizar ATP ni protenas independientemente
de la celula.

Los virus no son seres celulares.

El genoma viral puede ser ARN o ADN, pero no ambos.

Los virus poseen una cpside protica y algunos una


envoltura.

Los componentes virales se ensamblan y no se replican


por division.

Son seres vivos?

Porqu es importante el
estudio de los virus?

Importancia biolgica. Todos los seres vivos del


planeta tienen virus que los parasitan.
Importancia clnica. Son los causantes de
numerosas enfermedades.
Son importantes herramientas en investigacin.
Utilizando virus se ha avanzado en la Biologa
Molecular, conocimiento de genes, de mecanismos
de replicacin, trascripcin, c. nucleicos, etc.

Tamao

1 m= 0,000000001 nm
Aprox: 20 a 250 nm

Componentes del virin

Genoma viral

DNA:
- doble cadena - lineal (Herpesvirus, Adenovirus)
- circular (Papilomavirus, Poliomavirus)
- simple cadena

- lineal (Parvovirus)
- circular (v. bacterianos)

RNA: mayora simple cadena y lineal


- genoma fragmentado o segmentado
Ej. Virus de la gripe (sc) Orthomixoviridae.
- doble cadena (Reovirus)

Polaridad del ARN

ARN Polaridad (+): codifica como ARNm,


se traduce a protena.

ARN Polaridad (-): debe pasar a ARN (+)


para poder traducirse a protena
Polaridad mixta o bisentido: arenavirus

Cpside

Es una estructura que rodea y protege al


genoma vrico y est formado por protenas
codificadas por genes del virus.
Estas protenas que forman la cpside se
denominan protmeros.
Simetra es la forma que adopta un virus en
el espacio, esta dada por la estructura de la
Nucleocpside.

Simetra Helicoidal

Desnudo
Ej: mosaico del tabaco

Envuelto
Ej: Ortomixovirus

Nucleocpside cilndrica que puede


extendida o enrrollada sobre si misma.

estar

Simetra Icosadrica

Envuelto
Ej: Herpesvirus

Desnudo
Ej: Adenovirus

Son icosaedros regulares,


triangulares, 12 aristas.

de

20

caras

Binaria y Compleja

Complejo
Binaria

Cabeza icosadrica
y cola helicoidal.

Nucleocpside helicoidal o
icosadrica recubierta por una
envoltura laxa. Ovoides,
esfricos o pleomorficos

Envoltura

Es una capa membranosa que rodea la nucleocpside de


diferentes virus. Esta envoltura tiene estructura de
membrana, con bicapa lipdica con protenas:
Los lpidos de la envoltura proceden de las membranas
de la celula hospedadora.
Las protenas estan codificadas por genes del virus
- Glicoprotenas: tiene unidos azucares. Sobresalen de
la membrana. Espculas o peplmeros.

Fn: Unin a clula hospedadora


Actividad enzimtica

Protenas

Constituyen del 50 al 90% de la partcula viral


Estructurales: estan presentes en el virin en una
proporcin importante y mantienen la estructura del
mismo.
Superficie: constituyen los capsmeros y peplmeros
(proyecciones de la envoltura, glicoprotenas, ej:
Hemaglutinina y Neuraminidasa)
Internas: ubicadas en la cara interna de la envoltura,
entre capas de capsmeros, en el centro del virin.
No Estructurales: enzimas requeridas para el ciclo
de replicacin, que se sintetizan en la fase temprana
de la replicacin.

Clasificacin viral: Criterios


1.

Genoma: tipo de cido nuclico y caractersticas del


mismo

2.

Tamao del virin

3.

Cpside (simetra)

4.

Envoltura: presencia o ausencia

5.

Genmica: secuencia nucleotdica

Clasificacin Baltimore

Clasificacin ICTV

El Comit Internacional de Taxonoma de Virus (ICTV):


La estructura general de la taxonoma es la siguiente (2012)
Taxn

Terminacin

Orden

-virales

Familia

-viridae

96

Subfamilia

-virinae

22

Gnero

-virus

420

Especie

virus

2618

Los rdenes son: caudovirales, herpesvirales, ligamenvirales,


mononegavirales, nidovirales, picornavirales y tymovirales.
El comit no distingue formalmente entre subespecies, cepas y
aislamientos.

Clasificacin ICTV

El ICTV estableci la base de datos de virus


universal de la ICTV (ICTVdB), disponible en
internet.

http://www.phene.cpmc.columbia.edu/index.
htm

http://www.ictvonline.org/index.

Etapas de la replicacin viral I


1.

Iniciacin:
a) Adsorcin: es la unin especfica de la protena viral de
superficie con el receptor de la membrana celular.
b) Penetracin: Endocitosis mediada por receptor (EMR), o fusion
c) Desnudamiento: del genoma viral. Citoplasma o en los poros
de la membrana nuclear.

2.

Expresin y replicacin del genoma:


Genomas virales poseen diferentes estrategias de multiplicacin
viral.
ARNm viral. Sntesis de protenas virales.
a) Protenas que interfieren con el metabolismo celular
b) Polimerasas: sntesis de cidos nuclicos virales
c) Estructurales: formaran la estructura de los viriones

Etapas de la replicacin viral II


3.

Ensamble, maduracin y egreso de la


clula infectada
a) Intracelular:
- en el citoplasma celular
- ncleo celular
b) Ensamble es simultneo al egreso de la clula.
- Membrana citoplasmtica
- virus emergen por brotacin.
- lisis celular
c) Ensamble en el ncleo celular: herpesvirus.

Herpesvirus
DNA, envuelto

Picornavirus: RNA (+) desnudo

Curva de crecimiento de un nico ciclo de


multiplicacin viral

Patogenia viral

Virus

o Husped

Inoculo inicial

-Carga gentica (Factores de


resistencia)

Puerta de entrada

-Edad

Estructura gentica y
antignica del virus

-Sexo

Modulacin de la respuesta del


husped

-Estado de salud

-Embarazo

Virulencia vs atenuacin

Tropismo

Clula SUCEPTIBLE y PERMISIVA


La relacin virus husped es especfica: dada
por la unin de protenas virales a receptores de la
membrana celular.
Virus afecta a una especie: humanos, ej, Sarampin
Virus que producen zoonosis: Rabia
Virus que afectan un tejido: hepatotropos,
neurotropos
Virus que afectan muchos tejidos pantotropos, ej:
sarampin.

Patogenia de las infecciones virales


Estados:
1. Infeccin inicial del husped: el virus se
adsorbe a clulas susceptibles y luego
penetra en el tejido. Puertas de entrada.
2.

Diseminacin de la infeccin: multiplicacin


y diseminacin local a travs del cuerpo.

3.

Eliminacin de virus al exterior. Relacionado


con la transmisin viral.

Puertas de entrada
Organo

Virus

Mecanismo

Piel

Rabia

Mordedura por perros y zorros

Arbo=Fiebre amarilla

Picadura de artrpodos (Aedes


aegypty)

HBV, HVC, HIV, EBV,


CMV

Transfusiones, inyecciones

Papiloma

Verruga en piel

Tracto respiratorio Influenza,


Parainflueza,
Sarampin

Va aerea, intensidad de las


secreciones por boca o nariz,
contaminacin manos, etc

Orofaringe y
tracto entrico

EV, Rotavirus, ADV 40


y 41

Contaminacin fecal-oral

Tracto genitourinario

ADV 11y21, BK, HSV1y2, HIV,


HBV,Papiloma

Relaciones sexuales, canal de parto

Va conjuntival

ADV 8, EV 70

Contacto con objetos contaminados

Vas de diseminacin

Transmisin de virus al exterior del


organismo

1.
2.

3.
4.
5.

Liberacin viral de la clula, salida del husped,


transporte a travs del medio ambiente en forma viable y
entrada apropiada a un nuevo husped susceptible.
Factores que intervienen:
Cantidad de virus.
Estabilidad viral en el medio ambiente
Presencia de vectores transmisores
Disponibilidad de huspedes susceptibles
Constitucin gentica del virus y el husped

Fuentes de transmisin: secreciones respiratorias,


saliva, heces, orina, secreciones genitales, leche,
sangre o piel.

Tipos de
infecciones
virales

Efecto de agentes fisicoqumicos


sobre los virus I

Determinar la viabilidad de muestras clnicas


para el diagnstico virolgico.

La conservacin de vacunas virales a virus vivo.

Estimar la infectividad a temperatura ambiente.

Decontaminar materiales.

Efectuar un tratamiento adecuado para el agua


potable.

Efecto de agentes fisicoqumicos


sobre los virus II

Temperatura: los virus son lbiles al calor. En general se


inactivan 1 hs a 60C.
pH y medio inico: mejor conservacin en medios
isotnicos y pH fisiolgico. Excepcin: enterovirus
estables a pH 3.
Radiaciones: UV y ionizantes (rayos X y gamma)
inactivan a los virus por su accin sobre el genoma viral.

Solventes lpidos: los virus envueltos son sensibles a


ter, cloroformo, sales biliares, detergentes aninicos. Los
virus desnudos son resistentes a los solventes lipdicos.
Ej. Enterovirus.

DIAGNSTICO VIROLGICO

Para qu sirve?

Diagnstico individual en un caso clnico.

Intervencin teraputica: tratamiento especfico.

Para definir un pronstico en la evolucin del paciente

Indicar la necesidad de una vacunacin.

Vigilancia epidemiolgica: incidencia de enfermedades,


cepas circulantes de virus.
Para adoptar medidas de salud pblica en la
comunidad.

Calidad de la Muestra

La calidad del diagnstico virolgico est


condicionado por la calidad de la muestra.
Tipo de muestra: depende de la patologa y el virus
Tiempo de toma de muestra: dentro de los 7 das de

iniciado el cuadro clnico, para serologa tambin a los 14


o 21 das.

Calidad: -Viabilidad viral


- Integridad genoma viral
- Presencia de inhibidores
- Biopsias del lugar del foco

Cantidad: 0,5 ul

Tiempo y condiciones de transporte

- PCR 100-200 ul
- Cultivo 200 ul

Tipos de muestras
Manifestaciones

Agentes

Muestras

Infeccin del SNC

EV, HSV, Rabia, Sarampin,


Arbovirus

LCR, orina, sangre

Infeccin
respiratoria baja

Influenza, Parainfluenza, Sincicial


respiratorio, ADV

ANF

Infeccin
respiratoria alta

Rinovirus, Adenovirus, EV,


Reovirus

H. Nasal, H. Farngeo,
ANF, heces

Piel y mucosas

Viruela, Varicela, HSV, EV

H. Farngeo, raspado
base vescula

Exantma

Rubela

Sangre heparinizada,
LCR, H. Farngeo

Conjuntivitis

HSV, Adenovirus, EV70

H. Ocular

Sistmica

CMV, Adenovirus, CAV-B

Orina, sangre, H.
Farngeo, LCR

Diarrea infantil

Rotavirus

Materia fecal

Hepatitis, SIDA

HAV, HBV, HIV

Suero

Recoleccin y Conservacin
Muestra

Recoleccin

Suero, sangre entera,


plasma, leucocitos

3-10 ml, tubo estril

Hisopados

Tubo con medio de


transporte

Fluidos

Tubo estril

Biopsias y necropsias

Tubo estril con medio de


transporte

LCR

Tubo estril

Materia Fecal

4 grs, frasco limpio

Conservar en fro (4C). Evitar el congelamiento y


descongelamiento. Procesar en forma inmediata.

Curvas de deteccin de virus y Ac

Mtodos de Diagnstico Directos

1.

Detectan la presencia de virus en muestras


clnicas.
Deteccin del virus como agente infeccioso:
Aislamiento viral

2.

Deteccin de partcula viral: Microscopa


electrnica

3.

Antgenos virales: IF, IP, EIA

4.

Genomas virales: PCR, rtPCR. Mtodos


moleculares

Aislamiento Viral

Es el mtodo de diagnstico clsico.

Es un sistema de amplificacin, que incrementa


la cantidad de virus presente en la muestra.
Producto: virus viable.
La cepa aislada puede conservarse. Permite la
posterior caracterizacin del virus.

Permite la deteccin de diferentes agentes


virales, incluso aquellos no sospechados
inicialmente.

Tipo de cultivo

Lnea celular

Virus

Primario

Rin de mono

Influenza, Parainfluenza, EV

Rin de conejo

HSV

Rin de embrin
humano

ADV, EV

Diploide

Fibroblastos

HSV, CMV, VZV, ADV, RSV,


PAR, BK, Rinovirus

Continuos

Hep-2

ADV, HSV, PAR, RSV,


Parainfluenza y EV (algunos)

A549

HSV, ADV, EV

MDCK

Influenza

Vero

HSV, VZV, PAR

Rd

Polio, Echo, CAV

L20b

Poliovirus

Efecto Citoptico (ECP)


ECP: es el cambio morfolgico producido
en las clulas infectadas que puede
visualizarse microscpicamente.
Cuerpos de inclusin
Clulas multinucleadas
Sinsicios celulares
Vacuolizacin citoplasmtica

ECP HSV

Fibroblastos normales

Foco en Vero

Fibroblastos infectados con HSV

IFI HSV

Desventajas

Baja sensibilidad

Deben utilizarse combinaciones de lneas celulares.

Siempre requiere confirmacin.

Existen virus que son difciles de aislar (CAV) son de


lento crecimiento (CMV).

Demora de resultados: 6 7 das hasta 14 das o ms.

Laboriosa, personal altamente entrenado, infraestructura


especial de laboratorio.

Se debe trabajar en condiciones de esterilidad (cabina con


flujo de aire laminar).

Microscopa electrnica

Visualizacin directa de partculas virales en muestras


Rpido
No requiere virus viable
Procedimiento abierto
Costo y el mantenimiento del microscopio electrnico es
complejo
Sensibilidad: relacionada con la alta concentracin de
partculas virales (105 a 106/L)
Usos: - Muestras de materia fecal en gastroenteritis
virales. Ej: Rotaviruses, Adenovirus 40 y 41, Norovirus
y Astroviruses.
- Lquido de ampollas: HSV, Poxvirus, Ebola
- tejidos fijados obtenidos por biopsia o autopsia
- identificacin de virus en cultivos celular

Fotografa electrnica de virus


entricos
ADENOVIRUS

ROTAVIRUS

HERPESVIRUS

ENTEROVIRUS

Mtodos: Inmunoflorescencia
1.

Inmunofluorescencia
(IF): isotiocianato de
fluorescena (FITC)
- Directa: Fcil de usar,
conjugacin de cada Ac
antiviral

- Indirecta:Ms sensible
y ms verstil.
- Microscopio de
fluorescencia (luz UV)

Mtodos: ELISA
3. Enzima Inmunoensayo

Formato de anticuerpos doble sandwich


Cambio de color indica presencia de antgeno del virus

Propiedades deteccin Ag

Verstil

En fase slida o lquida.

Integridad de la muestra no es tan importante, ventajoso


para transporte de muestra prolongado.

Aplicacin a muestras diversas

Posibilidades de automatizacin.

Instrumentos de laboratorio estn disponibles que puede


realizar EIA para detectar tanto antgenos o anticuerpos.

Aplicaciones de deteccin de Ag
Muestra

Virus

Respiratorias
(ANF, HF, H Nasal, BAL)

Respiratorio sincicial
Influenza A,B
Parainfluenza 1,3
Adenovirus
Parotidtis

Piel o hisopado mucosa

HSV, VZV

Conjuntiva o hisopado cornea

HSV, ADV

Sangre

CMV (pp65)
HBV (Ag superficie)
HIV (p24)

Materia Fecal

Rotavirus
Adenovirus (entrico)

Genoma virales: el blanco para


mtodos moleculares

PCR: Reaccion en cadena de la Polimerasa

Amplificacin enzimtica in vitro de un fragmento de ADN


ARN en forma exponencial.

Proceso repetitivo de ciclos


Cada paso se produce a una temperatura determinada

Formatos de PCR

RT-PCR: Virus RNA:


- Retrotranscripcin: ARN a ADNc

(37 o 42 C)

Nested: reaccin de PCR anidada. Mayor


sensibilidad.
Mltiplex PCR: permite la deteccin de diferentes
virus en una nica reaccin. Los fragmentos
amplificados deben tener tamaos diferentes.

Etapas de la PCR

Ventajas de la PCR

Rpida: resultados en el da
Elevada sensibilidad y especificidad
No requiere la viabilidad del virus

Desventajas de la PCR
RNA es fcilmente degradable
Inhibicin de la reaccin (falsos
negativos)
Contaminacin (falsos positivos)

PCR Multiple Virus Neurotrpos

Blancos amplificados: DNA polimerasa (HSV) y 5NCR (EV)


Sensibilidad: - HSV, EBV: 1-5 molculas
- VZV: 5-50 molculas
- CMV, HHV6: 50-100 molculas
- EV: 0.01 0.001 TCDI50

PCR en Tiempo Real

PCR: procesos de amplificacin y deteccin


ocurren en forma simultnea.
Deteccin: mide fluorescencia emitida, la cual es
proporcional al ADN sintetizado.
Sistemas fluorescentes:
Agentes intercalantes: SYBER Green I
Sondas especficas marcadas con fluorocromos:
Taq Man

TAQ MAN

Amplification Plot

Caractersticas de PCR Tiempo Real

Deteccin en tiempo real del producto amplificado.


Sistema de amplificacin y deteccin integrados.
Bajo riesgo de contaminacin, sin manipulacion postamplificacin
Cuantitativa
Rpida
Reproducible
Altamente especfica: iniciadores y sonda
No utiliza Bromuro de Etidio
Fcil de automatizar
Sensibilidad similar a Nested-PCR
Reactivo dependiente
Costo

Secuenciacin genmica viral

Secuenciacin nucleotdica a partir de productos de PCR


Deteccin de resistencia a los antivirales en VIH (plasma) y
CMV
Identificacin de serotipos: EV
Deteccin de cepas mutantes: cepas derivadas de la vacuna
Sabin con capacidad patognica.

Deteccin de cepas recombinantes

Aplicaciones epidemiolgicos

Relaciones filogenticas
84 BAlp167-ARG04
56

Mza159-ARG04

30

BAm717-ARG03
Mza162-ARG04

17

BAm715-ARG03
Mza143-ARG04
8

Mza124-ARG04

31
61

Mza152-ARG04
BA22-ARG04

25

BA107-ARG04
BAc29-ARG04

237

B2 2006 y Brote 2003-2004

31

BAsm91-04

26

Mza130-ARG04
79 BA334-ARG04

36

Chaco343-ARG04
Tu296-ARG04

97

74 Tu283-ARG04
47

Cba286-ARG04
Cba314-ARG04

72

Cba1551-ARG06

75

Cba182-ARG04

42

Cba275-ARG04

92
59

Chaco69-ARG04
76 BAz549-ARG03

TF59-ARG04
37

BAz551-ARG03

99

99

48

BAz499-ARG03

82

BAz500-ARG03

B1 Zarate 2003 y TF

CapFed55-ARG01
BA13-ARG03
SF40-ARG03

88

BAta1261-ARG06

75

Chaco61-ARG07

99
99
44

B3 2003 2006-07

BA173-ARG03

73

Mis116-ARG04
Mza147-ARG04

ER108-ARG01

99

A2 2001 y Brote 2003-2004

SF187-ARG03
91
76
99

68

SF49-ARG03
Mza305-ARG98
Mza311-ARG98
373-ARG97

Ch341-ARG98
99 62
Ch345-ARG98

A1 1997 y Brote 1998

89 Ch336-ARG98
47 Ch337-ARG98
25 Ch339-ARG98

BastianniVP1

0.02

Mtodos de Diagnstico Indirectos

Serologa: deteccin de anticuerpos


antivirales en el suero del paciente.

especficos

Conversin serolgica: aparicin o aumento de 4 o


ms veces del ttulo de Ac entre 2 muestras pareadas
de suero, fase aguda y convalesciente (14 a 21 das).
IgG.

Presencia de IgM especfica: en una sola muestra de


perodo agudo o convalescencia temprana

ELISA, RIA, Western Blot

Serologa: Curva de deteccin de Ac

Diagnstico serolgico se basa en la cintica de la


respuesta de Ac a la infeccin viral.

Aplicacin de la serologa
Infeccin aguda

Estado inmune

Epstein-Barr

Varicela Zoster

Citomegalovirus (S. Mononucleosis)

Herpesvirus

Hepatitis viruses (A-B)

Citomegalovirus

Paperas

Epstein Barr

Rubola

Paperas

Parotiditis

Rubola

Parvovirus B19

Parotiditis

Encefalitis virus

Parvovirus B19

Rabia

Hepatitis viruses (A-B)

Fiebre Hemorrgica
Dengue
HIV
HTLV-1/2

Bibliografa

Fields Virology 5 edicin. Lippincott


Willams-Wilkins
www.who/int/es
www.paho.org
www.cdc.gov
www.msal.gov.ar
www.anlis.gov.ar