Pruebas para el diagnstico de HIV Conceptos bsicos

Introduccin
El Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, es una enfermedad infecciosa crnica
causada por el virus HIV y cofactores asociados, caracterizada por presentar una
deficiencia inmunolgica progresiva, irreversible con la expresin clnica de infecciones
oportunistas y/o tumoresEl virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) fue aislado e
identificado como el agente etiolgico de SIDA en 1983. Se conoce la existencia de dos
serotipos del HIV, el HIV-1 y HIV-2..

1. Indicaciones para el anlisis de HIV

No todos las personas deben realizarse la prueba para HIV, sino que debemos tener en
cuenta las personas de riesgo, condiciones clnicas de la infeccin y estimar la
proporcin de infecciones en la comunidad para orientar apropiadamente a aquellos que
ms lo necesiten. El anlisis realizado a personas que no estn en riesgo de adquirir la
infeccin disminuye el valor predictivo de una prueba positiva y es muy costoso para
los programas de Salud Pblica.
Las personas en riesgo de adquirir la infeccin por HIV incluyen, hombres con hbitos
homo bisexuales; usuarios actuales anteriores de drogas por va endovenosa;
varones o mujeres dedicados a la prostitucin; personas que mantienen contacto sexual
con individuos infectados; hemoflicos que hallan recibido factores de coagulacin antes
de 1985; hijos de madres con riesgo de infeccin por HIV; personas que forman parte
del equipo de salud y que tienen contacto con personas infectadas por ej. bioqumicos,
mdicos, enfermeros, extraccionistas, etc.. La orientacin y anlisis deber ser
recomendado a los individuos que admitan conductas riesgosas aquellas a las que les
fue detectado un posible riesgo de estar infectadas.
El anlisis para HIV es una herramienta til para estudiar a pacientes con evidencias
clnicas de laboratorio de infeccin por HIV y es una prctica necesaria antes de
comenzar con la teraputica. En muchos casos son frecuentes manifestaciones clnicas
que nos llevan a pensar en una posible infeccin como por ej. Tuberculosis, la cual se
agreg en 1993 como definicin de SIDA, es por ello que toda persona con
Tuberculosis pulmonar deber ser orientada y analizada para HIV.
El anlisis de HIV es particularmente importante para aquellas personas con algunas
Enfermedades de Transmisin Sexual (ETS) porque: practican conductas que pueden
transmitir o recibir HIV y la presencia de alguna ETS facilitan la entrada del HIV.
La inyeccin de drogas por va endovenosa, con el intercambio de jeringas y otros
accesorios, colocan a las personas en una situacin altamente riesgosa de transmisin
para HIV.

Mujeres en edad reproductiva que estn o han estado en una situacin de riesgo para la
infeccin debern ser orientadas y analizadas; esto incluye uso de drogas, prostitutas,
que hayan recibido transfusiones en 1978-1989, tuvieron relaciones con personas
infectadas o de riesgo.
De todas maneras la indicacin para realizar la prueba debe ser sugerida por el mdico y
siempre debe realizarse con el consentimiento del paciente.

2. Diagnstico del HIV-1 en adultos

Existen diferentes pruebas de laboratorio para el correcto diagnstico de la infeccin por
HIV-1 en adultos. Para la seleccin de algunas de ellas debemos tener en cuenta
criterios tales como sensibilidad, especificidad y valor predictivo. La sensibilidad
significa que un test detecta la menor cantidad posible de antgeno o anticuerpo, es decir
que se minimiza la posibilidad de obtener resultados falsos negativos, aunque es mayor
la probabilidad de obtener falsos positivos. La especificidad se refiere a la capacidad
que tiene la prueba seleccionada en detectar otro anticuerpo distinto al buscado, es decir
que es menos la posibilidad de falsos positivos, pero es mayor la cantidad de falsos
negativos. El valor predictivo es la probabilidad de identificar correctamente la
presencia o ausencia de infeccin.
Existen ms de 100 pruebas de laboratorio para la deteccin de anticuerpos anti-HIV-1,
y debemos aclarar que todas diagnostican infeccin por HIV-1 y no SIDA. Existen dos
niveles de pruebas serolgicas:
- NIVEL I : Pruebas de screening o tamizado
- NIVEL II : Pruebas suplementarias o confirmatorias

2.1 NIVEL I : Pruebas de screening o tamizado

Las pruebas encasilladas en esta categora en general son muy sensibles y reproducibles,
por lo tanto tenemos casi la plena seguridad de los resultados negativos. No existe un
test superior a otro y cada laboratorio debe seleccionarlo de acuerdo a sus necesidades,
y siempre deben estar aprobados por los organismos de control de calidad.
En la actualidad se sabe que existen dos virus que producen SIDA, HIV-1 y HIV-2,
aunque la distribucin geogrfica del segundo es limitada se lo aisl en distintos lugares
del mundo. Por lo tanto, la mayora de las kits comerciales detectan la presencia de
ambos virus.
Las primeras pruebas en aplicarse para la deteccin de anti-HIV fueron los
enzimoinmunoanlisis (ELISA). Son los ms utilizados por su facilidad de uso, se
prestan para analizar gran cantidad de muestras ya que son automatizables, y no
requieren uso de material radioactivo.

Existen otras tcnicas tales como la aglutinacin de partculas de ltex, de gelatina y

hemates y el Dot-Blot. Son ms sencillas que el ELISA, ms rpidas, no requieren
instrumentos de medida y son ideales para laboratorios con muy baja cantidad de
muestras.
Las primeras pruebas utilizadas y muchas de las que an se utilizan, usan como
antgeno lisados de partculas virales y se las conoce como de 1ra. Generacin. Con el
advenimiento de la Biologa Molecular se pudieron sintetizar antgenos recombinantes
y/o pptidos sintticos, haciendo de esta manera las tcnicas ms sensibles y especficas
(2da y 3ra Generacin).
En forma resumida nos referiremos a las tcnicas ms utilizadas.
ELISA
Es el mtodo ms difundido, su uso fue aprobado en 1985 para los servicios de
Hemoterapia o Bancos de Sangre. Tiene una sensibilidad y especificidad promedio del
99.5% y 99.8%, respectivamente. Se puede trabajar con distintos fluidos corporales
(suero, plasma, LCR, etc.).
El principio bsico de la reaccin consiste; en la mezcla del suero del paciente con un
antgeno (lisado viral,recombinate o sinttico) que est unido a un soporte slido. Si el
anticuerpo est presente se produce la unin antgeno-anticuerpo, luego se agrega un
conjugado que son anticuerpos dirigidos contra anticuerpos humanos o antgeno HIV,
los cuales estn unidos a una enzima. Estas enzimas son capaces de modificar al
sustrato en presencia de un cromgeno produciendo un producto coloreado que es
detectado visualmente o por un espectrofotmetro.
Existen en el mercado distintos tipos de ELISA:
- Indirecto: El suero del paciente se agrega a una fase slida que contiene el antgeno y
luego se agrega el conjugado y el sustrato. La intensidad de color ser proporcional a la
cantidad de anticuerpo presente en la muestra; en el caso de que no existiera el
anticuerpo no se producir reaccin de color.
- Competitivo: Este tipo de prueba se basa en que se agregan al mismo tiempo la
muestra del paciente y el anticuerpo anti-HIV conjugado, los cuales compiten con el
antgeno que esta presente en una fase slida. El anticuerpo que se encuentre en mayor
concentracin desplazar al otro por los sitios de unin, luego se le adiciona el sustrato
y se produce la reaccin de color. En este caso la intensidad de color ser inversamente
proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en el suero del paciente, es decir que
la presencia de color indica ausencia de anticuerpos en la muestra.
- De captura de antgeno: puede ser indirecto o competitivo, difiere en la etapa inicial de
fijacin del antgeno en la fase slida. Un anticuerpo monoclonal se encuentra pegado a
la fase slida, el cual captura el antgeno agregado posteriormente. Esto tiende a
disminuir la cantidad de sustancias contaminantes que se unen a la fase slida,
reduciendo de esta manera las uniones inespecficas. Luego se agrega el suero en
estudio el cual se une al antgeno y por ultimo se adiciona el conjugado y el sustrato. La

concentracin de anticuerpos presentes ser proporcional a la intensidad de color. Esta

pruebas son consideradas ms especficas que las indirectas.
- De captura de anticuerpos: difiere del anterior que en la fase slida tiene pegado
anticuerpos dirigidos contra las inmunoglobulinas humanas (IgG, IgA o IgM). De esta
forma podemos diagnosticar infeccin aguda cuando el anticuerpo encontrado es IgM.
- Con antgeno sandwich : Difiere del indirecto que en este caso el conjugado es un
antgeno unido a un cromgeno.
AGLUTINACION
Son pruebas que en general tienen buena sensibilidad, aunque su especificidad en
algunos casos fue cuestionada. Estos ensayos incorporan agentes portadores que son
partculas utilizadas para transportar el antgeno, los ms comnmente utilizados son:
hemates (hemoaglutinacin), partculas de latex (poliestirene), de gelatina o
microesferas. Estas partculas estn en suspensin y recubiertas (sensibilizadas) con el o
los antgenos del HIV (recombinantes y/o sintticos).
Los que se utilizan habitualmente son las partculas de gelatina, las cuales aglutinan en
presencia de de los anticuerpos presentes en la muestra del paciente, formando una red a
medida que se produce la reaccin antgeno-anticuerpo, visualizandose de esta manera
la aglutinacin. Son tcnicas simples, rpidas y reproducibles, cuya lectura se realiza
macroscpicamente o a travs de una lupa.
DOT BLOT O INMUNOBLOT
Es un ELISA rpido que utiliza como soporte slido papel de nitrocelulosa. El antgeno
(recombinante o sinttico), en general se adsorbe pasivamente (blotting) al soporte en
forma de gota (dot).
Actualmente existe otro ensayo el cual utiliza micropartculas recubiertas de antgeno
que son atrapadas dentro de la membrana. Estas micropartculas son microscpicas y
muy eficientes para transportar grandes cantidades de antgeno; la reaccin ocurre en las
micropartculas que luego se colectan en el papel para visualizar la reaccin coloreada.
Otro ensayo es el inmunocomb, que es un ELISA en fase slida, que usa como soporte
un peine, en donde se encuentra el antgeno HIV-1 y/o HIV-2.
Las pruebas de dot-blot son fciles de realizar, rpidas, la mayora arroja resultados en
pocos minutos , pero son muy costosas. En general se utilizan conjugados de antiinmunoglobulina ligados a una enzima que se fijan al anticuerpo del paciente. La
adicin de sustrato permite la visualizacin del color en el papel.
Otro ensayo utiliza como sustrato de color oro coloidal que se conjuga a una sustancia
llamada protena A. Esta protena tiene la capacidad de unirse a la inmunoglobulina
humana (anticuerpo del paciente), si la reaccin es positiva se visualiza
macroscpicamente como un crculo coloreado. Son tiles para bancos de sangre, salas
de autopsias, servicios de transplantes de rganos, aunque no se debe utilizar como
nica prueba de screening y no son tiles cuando se trata de un gran nmero de

muestras.

2.2 NIVEL II: Pruebas confirmatorias o suplementarias

En esta etapa se deben confirmar los resultados positivos de las pruebas de screening
debido a que estas no poseen un alto grado de especificidad y pueden dar resultados
falsos positivos. En general ante un resultado positivo por alguna de las pruebas del
Nivel I, se repite en otra muestra por otro mtodo distinto al utilizado y si la positividad
persiste se realiza una prueba confirmatoria. De todas maneras no siempre se logran
resultados concluyentes y se deben realizar pruebas adicionales para arribar a una
conclusin definitiva.
Describiremos bsicamente las ms utilizadas:
WESTERN BLOT (WB)
Es en la actualidad la ms aceptada. Fue desarrollada hace muchos aos y se la reconoce
como una tcnica muy especfica para detectar anticuerpos de muchos agentes
infecciosos. Su especificidad es alta debido a la separacin y concentracin de antgenos
virales. Es un ensayo cualitativo, utilizado in vitro para la deteccin de anticuerpos antiHIV en suero o plasma.
La prueba se basa en que, un lisado de protenas virales (previamente inactivadas) se
separan de acuerdo a su tamao por electroforesis en un gel de poliacrilamida en
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-Page). El SDS es un detergente que
desnaturaliza las protenas virales y las carga negativamente, de esta manera migran en
el gel por su peso molecular e independientemente de su carga. Las partculas ms
pequeas migran hacia el nodo (polo positivo) y las ms pesadas se quedan cerca del
ctodo (punto de siembra-polo negativo), de esta manera las protenas virales se separan
en bandas especficas de alta pureza. Luego se las transfiere elctricamente a una
membrana de nitrocelulosa respetando las posiciones originales de las bandas; la
membrana es lavada y bloqueada para disminuir las uniones inespecficas y por ltimo
se corta en tiras en las que se va a realizar el ensayo. Una vez terminado el proceso se
observan las siguientes protenas y glicoprotenas que desde el punto de siembra son:
gp160, gp120, p65, p55, p51, gp41, p31, p24, p17 y p15 (los nmeros indican peso
molecular en Kilodaltons).
Por ltimo las tiras se incuban con la muestra del paciente, siguiendo una tcnica similar
a un ELISA convencional. Se le agrega una inmunoglobulina anti-humana (anti-IgG)
conjugada con una enzima que en presencia de un sustrato se produce la formacin de
bandas coloreadas en la tira de reaccin.
La mayora de los WB utilizados son fabricados comercialmente en forma de Kits, son
sumamente sencillos y solo debemos agregar la muestra a analizar.
Una muestra es positiva para anticuerpos anti-HIV-1 si por lo menos se encuentran dos
de las siguientes bandas: p24, gp41 y go120/160 (segn normas de CDC).

Un resultado negativo es cuando no se observan bandas. Ms de un 15% de individuos

no infectados y que son negativos para las pruebas de screening pueden mostrar
reactividad a uno o ms antgenos; posiblemente debido a la presencia de anticuerpos,
no especficos para HIV, que reaccionen cruzadamente. El valor predictivo (VP) de esta
prueba usada como nico mtodo y en especial en grupos de baja seroprevalencia es del
28.6%. Pero cuando se utiliza junto con alguna prueba de screening, el VP aumenta al
99.5%.
Los resultados deben informarse como negativos, positivos o indeterminados.
Si una muestra resulta como indeterminada, no indica que el individuo este infectado,
quiere decir que no cumple con los criterios establecidos para definirla como positiva o
negativa. El patrn ms frecuentemente observado es la presencia de las bandas p17,
p24 o p55 o cualquier combinacin de las tres protenas, estos patrones generalmente se
observan en pacientes en el momento de la seroconversin. En estos casos la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS) recomienda: que se realice una nueva muestra
a las dos semanas y si a lo largo de seis meses resultan ser negativos o no muestren
incremento en la reactividad, la infeccin se descarta. Si en cambio el resultado es
positivo, quiere decir que el paciente se encontraba en el periodo de seroconversin.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
La IFI para HIV se desarrollo a fines de la dcada del 80. Se emplea en muchos
laboratorios como prueba confirmatoria, ya que es relativamente simple, ms econmica
y consume menos tiempo que el WB, pero requiere un microscpio de fluorescencia y
personal debidamente entrenado para interpretar los resultados.
El ensayo se basa en enfrentar la muestra con lneas celulares infectadas, las cuales se
encuentran improntadas en un vidrio. Como control de inespecificidad se utiliza clulas
no infectadas, en general en un mismo pocillo de reaccin, se realiza una mezcla de
75% de linfocitos infectados (H9) y 25% de no infectados (H9 IIIB). La reaccin
antgeno-anticuerpo se visualiza con el agregado de una anti-inmunoglobulina humana
marcada con isotiocianato de fluorescena, produciendose una emisin de luz la cual se
observa en un microscpio de epifluorescencia. Un resultado positivo (fluorescencia
verde dentro de la clula), indica la presencia de anticuerpos par HIV-1. Algunas
enfermedades autoinmunes pueden dar falsos positivos. Toda muestra negativa o
inespecfica debe confirmarse por WB.
INMUNOENSAYO LINEAL (LIA)
Son inmunoensayos desarrollados en la dcada del 90, similares al WB. Se usan
protenas virales recombinanres y/o sintticas, las cuales se aplican a un soporte de
nitrocelulosa (en forma pasiva). Slo poseen los siguientes antgenos virales gp41, p31,
p24 y p17. Incorpora, adems, un pptido sinttico (gp36) especfico para HIV-2, de
esta manera podemos analizar en la misma muestra los dos virus. El principio de la
tcnica es el de un ELISA indirecto para la deteccin de anticuerpos especficos.
La reactividad de la prueba se compara con controles, determinandose un score por
cruces.

RADIOINMUNOPRECIPITACION (RIPA)
Es una tcnica de investigacin, que requiere el uso de material radioactivo por lo que
esta limitada a ciertos laboratorios. Es muy sensible y especfica.
El principio de la tcnica se basa en la utilizacin de un aminocido marcado (cistena),
el cual se incorpora en un medio de cultivo de clulas infectadas por HIV. A medida que
el virus replica incorpora en sus protenas el aminocido marcado. Luego las clulas se
lisan y se solubilizan para luego agregar la muestra del paciente. Los inmunocomplejos
formados se precipitan y se realiza una corrida electrofortica en un gel de
poliacrilamida, para luego visualizarlos a travs de una autoradiografa. Detecta
protenas de envoltura gp160 y gp120, siendo una tcnica sensible ya que detecta
pequeas cantidades de anticuerpo y especfica por que estas protenas estn presentes
en casi todos los infectados despus de la seroconversin.
Pruebas en sangre y orina
La saliva y la orina son fludos biolgicos que tienen como ventaja su facilidad de
obtencin y que no requieren mtodos invasivos. Se sabe de hace tiempo que existen
anticuerpos presentes en saliva, pero las pruebas para detectarlo no fueron adoptadas
como rutina a causa de su baja sensibilidad, pero con el advenimiento del ELISA la
sensibilidad ha mejorado. Para el caso de la orina, estudios recientes indican que los
anticuerpos detectados corresponden a IgG intactas y no solo fragmentos. En general en
ambos ensayos slo se detectan el 92% de las infecciones verdaderas.
Muchas compaas estn tratando de desarrollar estas pruebas y puede ser que en poco
tiempo sean empleadas como de rutina.
Algorritmo de las pruebas
Es el orden de las sucesivas etapas que deben seguirse en el procedimiento diagnstico
y contemplan en general los niveles de screening y de confirmacin. Es importante que
tengamos en cuenta lo siguientes criterios: finalidad del estudio, sensibilidad y
especificidad de la prueba que se emplea y prevalencia de la poblacin en estudio.
Las pruebas de deteccin deben repetirse por duplicado en todas las muestras reactivas
iniciales. Con esta medida nos aseguramos de los errores tcnicos (por ej. errores de
manipulacin).
Todos los resultados repetidamente reactivos en la pruebas de screening deben ser
confirmados por una prueba de confirmacin aceptada.
La algorritmia ms comnmente utilizada para el diagnstico de la infeccin por HIV es
utilizar el ELISA, si es positivo repetidas veces, realizar un 2do ELISA mtodo rpido
basado en una preparacin del antgeno utilizado. Los individuos positivos para el 1er
ensayo y negativo para el segundo deben ser considerados negativos. Si ambas
metodologas son positivas deben analizarse por un mtodo de confirmacin tales como
WB; si este es negativo el paciente es negativo y si es indeterminado la muestra debe
repetirse a las dos semanas y continuar con el estudio por seis meses (OMS).

2.3 Pruebas suplementarias

Se indican en ocasiones especiales cuando los mtodos descriptos anteriormente no
resuelven un diagnstico en forma definitiva. Deben realizarse cuando:
- personas seronegativas que tuvieron contacto con seropositivos o que hayan estado en
contacto con material contaminado (por ej. punciones percutneas y/o contacto de las
membranas mucosas piel daadas de alguna manera).
- casos indeterminados.
- evaluacin de la enfermedad y/o tratamiento.
- confirmacin de la infeccin en nios nacidos de madres HIV seropositivas.
Las pruebas ms habitualmente usadas son las que a continuacin describiremos.

Deteccin de Antgeno p24

Es una prueba que en principio fue concebida para detectar la produccin de p24 en
sobrenadantes de cultivos.
Es de vital importancia entender en que momento se produce la antigenemia en un
paciente infectado, para no realizar pruebas innecesariamente.
El perodo de infeccin primaria en general abarca un total de 4-8 semanas, se los puede
dividir en dos etapas: la primera de diseminacin que abarca la primeras 2-3 semanas y
culmina con el pico de viremia y la segunda consiste en la produccin de anticuerpo
especfico junto con una adecuada respuesta inmune para tratar de eliminar el virus.
El procedimiento es semejante a la deteccin de anticuerpo, basado en un ELISA tipo
"sandwich"; la diferencia radica en que en vez de fijar un antgeno HIV a la fase slida
se fija un anticuerpo anti-HIV, y luego el antgeno p24 presente en la muestra es
capturado. Luego se agrega un conjugado que es un anti-HIV conjugado con una
enzima, para luego agregar el sustrato y producir la reaccin de color, la intensidad del
mismo es proporcional a la cantidad de antgeno presente.
De todas maneras una reaccin positiva debe confirmarse y el significado de la
presencia de antgenos virales en sangre u otros fludos biolgicos an no ha sido
establecida definitivamente y debe ser evaluada dentro de un contexto junto con otros
marcadores.
Existen diferentes mtodos de confirmacin:
- por neutralizacin: se basa en la reaccin de ELISA, sembrando cada muestra por
duplicado, en donde en uno de los pocillos se le agregan anticuerpos contra p24en

exceso, estos actan como bloqueantes de tal forma que la positividad de la reaccin se
confirma con una disminucin de la reactividad de la muestra. En el caso de la
deteccin de antgeno p24 la sensibilidad puede estar disminuda por la formacin de
inmunocomplejos in vivo; es probable que estos complejos antgeno-anticuerpo se
formen durante la seroconversin. Es por ello que se desarrollaron tcnicas de
disociacin e complejos.
- disociacin cida: se basa en la adicin de un cido a la muestra durante un periodo
estipulado de tiempo, y luego se realiza la tcnica habitual de ELISA. Otra forma es
precipitar los inmunocomplejos seguido de un tratamiento cido. Se han ensayado
diferentes variantes con resultados aceptables.
- disociacin alcalina: a diferencia del anterior se le agrega un lcali en ves de un cido,
los resultados son semejantes. De todas maneras un resultado positivo debe ser
confirmado por neutralizacin

Cultivo viral
No es una tcnica habitual para los laboratorios de rutina, ya que requieren de
equipamientos y niveles de seguridad con normas establecidas por la OMS y adems
contar con personal adiestrado para el aislamiento y manipulacin de muestras virales.
Es una tcnica altamente sensible y especfica, pero es muy costosa, laboriosa y
potencialmente peligrosa.
La principal fuente de virus son las clulas mononucleares presentes en sangre
perifrica, ya que el virus preferentemente replica en las clulas que expresan en su
superficie la molcula CD4.
La tcnica se basa bsicamente en enfrentar clulas mononucleares del paciente con
leucocitos de un banco de sangre, en presencia de un estimulante como IL-2 (estimula y
prolifera los linfocitos CD4+). Semanalmente se recogen los sobrenadantes del cultivo y
se determinada la produccin de antgeno p24, actividad de transcriptasa reversa o
inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales. Un cultivo se considera positivo
cuando en algunos de los sobrenadantes de cultivo diera positivo para algunas de las
determinaciones antes citadas; es negativo cuando al cabo de 28-30 das todas las
muestras dieron negativas. Un resultado negativo no descarta infeccin , ya que pueden
ocurrir falsos negativos.

Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

El genoma del virus HIV es un ARN, el cual cuando penetra a la clula se desprende de
su cpsula protica y a travs de la enzima transcriptasa reversa se transforma en ADN,
el cual penetra en el ncleo y se integra con el genoma de la clula huesped, formando
as el provirus. Una vez integrado el ADN viral es copiado para generar mltiples copias
de ARN que darn origen a las protenas virales y a nuevos genomas de ARN.

La PCR, es una tcnica de amplificacin gentica ampliamente difundida en medicina y

biologa molecular. Se desarrollo en 1985 y uno de sus principales campos de
amplificacin es el diagnstico de infeccin por HIV en pediatra. Se utiliza para
detectar cido nucleico viral despus de la amplificacin del ARN o ADN viral. Es una
tcnica extremadamente sensible por que nos permite detectar una sola copia de ADN
proviral, presente en una muestra. La PCR puede detectar infeccin antes que a
producccin de anticuerpos y a veces antes que el cultivo viral.
El proceso consta de una etapa de amplificacin en la cual a travs de oligonucletidos
sintticos (secuencias de cido nucleico del HIV conocidas como iniciadores) se
produce la deteccin de una zona especfica del HIV, para luego sintetizar cadenas de
ADN. Este proceso se realiza en presencia de una enzima llamada Taq-polimerasa y que
por medio de un Termociclador se producen la sntesis de millones de copias de ADN.
Los productos de PCR pueden ser detectados utilizando una sonda marcada con
enzimas, radioistopos, seales qumico luminosas o a travs de un gel de agarosa
coloreado con bromuro de etidio.
Es muy utilizada para: diagnosticar primo infeccin por el HIV-1 (perodo ventana),
resolucin de la infeccin en casos indeterminados, vigilar terapia antiretroviral,
diagnosticar infeccin por HIV en nios y diferenciar infeccin por HIV-1 y HIV-2
diferenciacin de subtipos.
No es una tcnica de confirmacin, ya que un resultado negativo no descarta infeccin y
un resultado positivo no indica infeccin ya que al ser un tcnica muy sensible puede
existir contaminacin con muestras positivas.

3. DIAGNOSTICO DE INFECCIN POR HIV EN PEDIATRIA

La transmisin del virus de HIV de la madre al nio constituye la principal causa de
SIDA en pediatra. Aproximadamente el 25% de los nio nacidos de madres
seropositivas, nacen infectados. Actualmente con el tratamiento preventivo con
zidovudina (protocolo 076) como profilaxis preventiva a mujeres embarazadas HIV-1
positivas desde la semana 14, seguido por un refuerzo endovenoso durante el parto, y al
nio durante las 6 primeras semanas de vida, se logra reducir la transmisin vertical a
un 8%.
Cuando se produce la infeccin en los nios es tema de una amplia discusin en el
mundo, y se sabe que puede ocurrir en tres momentos diferentes: intratero, durante el
parto o a travs de la leche materna, este ltimo caso en la actualidad ya no se produce
ya que se le impide el amamtamiento a toda madre HIV positiva.
La deteccin de la infeccin por HIV en pediatra es de vital importancia ya que el
mdico puede instaurar en forma temprana un teraputica adecuada. En los adultos el
criterio de infeccin se basa en la deteccin de anticuerpos del tipo IgG. En nios
menores de 18 meses
esta no puede ser utilizada ya que los anticuerpos del tipo IgG de la madre infectada

pueden atravesar placenta , y de esta manera un resultado positivo por las tcnicas antes
mencionadas no indica una infeccin por HIV. Esta persistencia de los anticuerpos
maternos se explicara por los altos ttulos observados y la larga vida media de los
mismos (28 das). Es por lo antes mencionado que el diagnstico de infeccin por HIV1 en pediatra debe realizarce por otros mtodos alternativos, a los cuales los
mencionaremos sintticamente.

3.1 Deteccin de Anticuerpos

Como comentamos anteriormente la presencia de anticuerpos de tipo IgG no significa
diagnstico de infeccin, su ausencia tampoco la descarta.
Los motivos por los cuales existe un retraso en la produccin de anticuerpos en los
nios responden a distintas causas:
- inmadurez del sistema inmunolgico
- deterioro de la funcin de los linfocitos B (responsables de la produccin de
anticuerpos)
- la cantidad de antgeno viral es tan importante que la formacin de inmunocomplejos
impide la deteccin de los anticuerpos
De todas maneras puede ser til, aunque costoso, el seguimiento del paciente con un
mismo ELISA y observar si a lo largo del tiempo se produce un incremento de los
valores de densidades pticas y/o aparicin de nuevas bandas en el WB.
La bsqueda de otros anticuerpos, producidos tempranamente en la respuesta inmune y
que no atraviesan la placenta (IgM, IgA), obtenidos por remocin de IgG seran de
utilidad para diagnosticar infeccin por HIV.
Ninguna de las tcnicas actualmente disponibles (algunas todava en etapa de
investigacin) para detectar anticuerpos de cualquier tipo (IgG, IgM e IgA) es lo
suficientemente adecuada para un correcto diagnstico. De hecho el CDC (Centers for
Disease Control) no lo incluye en el algoritmo diagnstico para la infeccin por HIV en
pediatra.
De todas maneras las tcnicas utilizadas para los adultos tambin pueden ser utilizadas
para los nios mayores de 18 meses.

3.2 Deteccin de virus y mtodos moleculares

Estos mtodos son utilizados cuando el nio a estudiar tiene una edad inferior a los 18
meses y habitualmente son recin nacidos, para de esta manera poder realizar el
diagnstico tempranamente.

Son tcnicas que nos permiten detectar la presencia del HIV; tales como antgeno p24,
cultivo viral y PCR. Estas metodologas ya fueron descriptas en la parte de pruebas
suplementarias en el diagnstico del HIV-1 en adultos (2.3)
La tcnica de antgeno p24 es probablemente la de menos utilidad por su baja
sensibilidad, la cual es del 90% a los 6 meses de vida.
La PCR es un mtodo altamente sensible que nos permite amplificar por lo menos 1
copia de ADN proviral. Pero cualquiera de las tcnicas de PCR que utilicemos, resulta
conveniente realizar la misma, al menos para dos de los genes que codifican para
distintos componentes virales (gag, pol y env), ya que podran existir resultados
discordantes.
El cultivo viral y la PCR son las tcnicas ms utilizadas, permitiendo detectar entre el
30-50% de los neonatos al nacer, y entre el 80-100% dentro del primer mes de vida.

3.3 Criterios diagnsticos

A- Nios menores de 18 meses, hijos de madres HIV positivas: resultados positivos en
dos determinaciones separadas (excluyendo sangre de cordon), de una o ms de las
siguientes pruebas: Cultivo de HIV, PCR o antgeno p24. Cuando se pueden realizar
cultivo viral y PCR, para por lo menos dos genes; un resultado positivo por ambos
mtodos y en una sola muestra, es diagnstico de infeccin por HIV. En un trabajo
publicado por nosotros pudimos establecer que si se realiza PCR para dos genes (por ej.
gag y env) en dos muestras diferentes y ambos dan positivos podemos concluir que el
nios esta infectado, logrando una sensibilidad del casi el 100%.
B- Nios mayores de 18 meses, nacidos de madre HIV positivas o infectados por otro
medio de contagio (hemoderivados, contacto sexual, etc.): anticuerpos anti-HIV
repetidamente positivos por ELISA y confirmados por test confirmatorio (por ej. WB), o
rena algunas de los criterios del punto A