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Facultad de Medicina
1. ENZIMAS DE RESTRICCIN
DEFINICION:
Las enzimas de restriccin, tambin conocidas como endonucleasas, son aquellas que
reconocen una secuencia entre 4-8 pb en DNAds. El sitio de reconocimiento se llama
sitio de restriccin, y la enzima rompe un enlace fosfodiester en la hebra de arriba y otro
enlace fosfodiester en la hebra complementaria.
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de protenas las
enzimas endonucleasas o enzimas de restriccin- que actan como tijeras
moleculares, cortando la doble cadena de ADN a travs del esqueleto de fosfatos sin
daar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a dichos microbilogos al
Nbel en 1978 y dio origen a la ingeniera gentica.
Las enzimas de restriccin permiten cortar el genoma de cualquier organismo en
pequeos fragmentos llamados fragmentos de restriccin. La coleccin de miles o
millones de estos fragmentos se llama biblioteca gnica.
Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrmicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).
Son extradas de organismos procariticos (bacterias), donde actan como un
mecanismo de defensa, para degradar material gentico extrao que entre en la clula.
Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre
el DNA extrao y el DNA propio. Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA
metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.
Este sistema es anlogo a
un sistema inmune, y le
permite distinguir a la
bacteria entre su propio
DNA y el DNA exgeno,
El trmino restriccin proviene del mecanismo de accin que cumplen estas enzimas
en las bacterias que las sintetizan. Cortan el ADN del virus que las parasitan
restringiendo la duplicacin del mismo.
Las enzimas de restriccin cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los extremos
cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras asimtricamente,
dejando los extremos de cada hebra de simples cadenas complementarias entre s. Por
otro lado, los extremos romos son generados cuando la enzima corta las dos hebras por
el mismo lugar, generando dos extremos doble cadena.
Estas molculas son indispensables para la ingeniera gentica, ya que producen
fragmentos que se pueden unir entre s fcilmente (con la ayuda de un pegamento
molecular: la enzima ligasa). Estas enzimas tienen la capacidad de reconocer una
secuencia determinada de nucletidos y extraerla del resto de la cadena. Esta secuencia,
que se denomina Restriction Fragment Lenght Polymophism o RLPM, puede volver a
colocarse con la ayuda de otra clase de enzimas, las ligasas. Anlogamente, la enzima
de restriccin se convierte en una "tijera de ADN", y la ligasa en el "pegamento". Por lo
tanto, es posible quitar un gen de la cadena principal y en su lugar colocar otro.
Figura 1.
Enzimas de restriccin. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de extremos.
En el primer caso, el corte genera nuclotidos de simple cadena llamados extremos
SEMINARIO: TCNICAS MOLECULARES DEL ADN
cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa. En
el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos
tambin pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los
extremos no son complementarios, la unin ser ms inespecfica.
Fragmentos de restriccin:
La longitud de los fragmentos de restriccin depende de los sitios de corte de la enzima.
Si ocurriese un cambio de bases en el sitio de corte, la enzima respectiva dejar de
reconocer a ste como tal, dando lugar a un corte en otro sector y por lo tanto se
originar un fragmento de restriccin de mayor longitud. Tambin hay que tener en
cuenta que un cambio en una base puede crear un sitio de corte en una zona donde
habitualmente no exista, dando lugar a la aparicin de un fragmento de restriccin de
menor
longitud.
depender
del
nmero
de
VNTR
existentes.
Como hay una gran cantidad de regiones VNTR y diferentes entre s, el patrn de
bandas resultante es exclusivo de cada individuo, dado que la probabilidad que se repita
en
dos
sujetos
diferentes
es
inferior
una
cada
cien
millones.
ENZIMA
SECUENCIA
Arthrobacter luteus
Alu I
AG
CT
TC GA
Escherichia coli RY13
Eco RI
AATTC
CTTAA G
Escherichia coli J62
Eco RV
GAT
ATC
CTA TAG
Klebsiella neumoniae
Kpn I
GGTAC
C CATGG
Nocardia otitis-caviarum
Not I
GC
GGCCGC
CG CCGG CG
Haemophilus aegyptus
Hae III
RGCGC
Y CGCGR
Haemophilus influenzae
Hinf I
ANTC
CTNA G
Aplicaciones:
El descubrimiento de las endonucleasas de restriccin ha permitido el desarrollo
vertiginoso de lo que se denomina tecnologa del DNA recombinante. Vamos sin
embargo a desarrollar brevemente algunos aspectos en los que la utilizacin de estas
enzimas tienen una aportacin especifica al campo de la biologa molecular.
Las enzimas de restricci6n han sido utilizadas para la construccin de los mapas
genticos de pequeos genomas como plsmidos, bacterifagos o virus.
Adems de este uso son imprescindibles para la caracterizacin de genes obtenidos por
tcnicas de DNA recombinante, como por ejemplo determinacin de exones e intrones
de un gen, zona de los promotores, secuencias adyacentes a los extremos 5', zonas de
poliadenilacin, y en general todo tipo de estudios de carcter estructural en los que es
imprescindible el desarrollo de mapas de restriccin.
dentro de la secuencia codificante del gen. Mediante digestin del DNA genmico con
las enzimas de restriccin para las que no existen sitios de reconocimiento en ese gen e
hibridacin con sondas de DNA para ello, podemos tener una aproximacin del nmero
de copias presentes en el genoma mediante la observacin del numero de bandas de
hibridacin obtenidas en el digerido del DNA genmico.
Este tipo de aproximacin se ha utilizado en el anlisis del numero de copias presentes
en el genoma humano para l interferan 1'5', as como para l numero de copias
presentes para la subunidad a de la gonadotropina corionica humana '14'.
Fragmentar DNA genmico para separacin de electroforesis y Southern Blot.
Generacin de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en Southerny
Northern blotting.
Medicina:
Existen una serie de enfermedades congnitas debidas a alteraciones en la estructura del
DNA. Estas alteraciones pueden ser detectadas utilizando endonucleasas de restriccin,
ya que una determinada alteracin puede originar o suprimir el sitio de reconocimiento
de una endonucleasa de restriccin determinada. Este hecho permite la deteccin de
enfermedades congnitas tanto en individuos afectados como en individuos portadores,
como, y lo que es ms importante, en DNA extrado de fibroblastos fetales mediante
amniocentesis o biopsia de vellosidades corionicas, permitiendo un diagnostico
prenatal.
La tcnica utilizada consiste en el anlisis de las variaciones en los tamaos de los
fragmentos de restriccin. o RFLPs (~restriction fragment length polymorphisms~). Se
basa en la obtencin de DNA de los individuos afectados por la enfermedad en estudio,
su digestin con una bacteria de diferentes enzimas de restriccin, separacin mediante
electroforesis, transferencia a nitrocelulosa e hibridaci6n con sondas de DNA
pertenecientes al gen en estudio o a un fragmento de DNA prximo a ese gen, para
evitar la posibilidad de separacin en los procesos de recombinacin meitica. Mediante
el anlisis del tamao de los distintos fragmentos de restriccin que producen
2. ADN LIGASA
DEFINICIN:
En 1967 la investigacin en varios laboratorios simultneamente llev al
descubrimiento de la ADN ligasa llamada tambin enzima de unin de polinucletidos.
ADN ligasa es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5 de una
cadena polinucleotdica y el extremo 3 de otra cadena polinucleotdica. Esta enzima
requiere de un grupo OH- libre en el 3`final de la cadena de ADN y un grupo fosfato en
el 5`final. La formacin de un enlace fosfodiester entre estos grupos es una reaccin
endergnica.
La ADN ligasa usada ms habitualmente es la T4 ADN ligasa, que requiere ATP como
cofactor.
La enzima, ADN ligasa, repara los millones de discontinuidades de ADN generadas
durante la vida normal de la clula, por ejemplo, acoplando los abundantes fragmentos
de ADN formados durante la copia del material gentico en la divisin celular; Participa
tambin en el mantenimiento de la actividad genmica y su actividad.
Las ADN ligasas son blancos atractivos para la quimioterapia del cncer y otras
enfermedades.
TIPOS:
En los mamferos se ha identificado 3 genes que codifican para el ADN ligasa: LIG1,
LIG2, LIG4. Estos tres genes codifican para cuatro ADN ligasas existentes, la ADN
ligasa II deriva del ADN ligasa III por medio de un mecanismo proteoltico. La ADN
ligasa 1 es especifica para replicacin de ADN y es la encargada de formar el enlace
fosfodiester entre los fragmentos de la cadena rezagada. Dos formas de ADN ligasa III
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3. ADN POLIMERASA
DEFINICIN:
La bsqueda de una enzima que sintetizase el ADN llevo al descubrimientos de la ADN
polimerasa por Arthur Kornberg y colaboradores. La ADN polimerasa es la principal
enzima de la replicacin. Partiendo de una cadena inicial o primer la ADN polimerasa
aade nucletidos complementarios a la cadena molde extendiendo la nueva cadena de
ADN en direccin 5- 3.
La ADN polimerasa es la enzima principal en el proceso de replicacin. Partiendo de una
cadena inicial o primer la ADN polimerasa es capaz de aadir nucletidos
complementarios a la cadena molde estableciendo enlaces fosfodister. La ADN
polimerasa slo puede catalizar el crecimiento de la cadena inicial en direccin 5'-3',
ensamblando los trifosfatos de desoxirribonuclesido en el ADN, sirviendo como patrn
una cadena simple de ADN. La ADN polimerasa tambin se encarga de la reparacin del
ADN asociada a la replicacin. sta que Constituye la piedra angular de la reaccin de la
polimerasa en cadena (PCR) que se utiliza para amplificar el ADN. El modelo de
sustitucin es altamente especfico.
(ribonucletido
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desoxiribonucletido) situados al final del cebador. Esta actividad es muy til para la
reaccin en cadena en tiempo real y en la tcnica del marcado de sondas denominada
translacin nick (nick translation). La otra actividad (3' 5') es la actividad
"proofreading", osea la correcin de errores. Esta actividad no existe en los procariotas
(bacterias), solamente en los eucariotas y archaea. Las polimerasas que poseen sta
actividad exonucleasas producen menos faltas pero son 10 veces ms lentas.
Las polimerasas se utilizan tambin para el secuencaje. Se considera que la actividad
exonucleasa 5' 3' destruye una parte de los cebadores y como tal se pueden encontrar
polimerasas desprovistas de stas actividades.
TIPOS:
Hay 5 ADN polimerasas diferentes bien caracterizadas, diferencindose en su localizacin,
actividad y sensibilidad a los inhibidores: alfa, beta, gamma, delta y psilon:
Las ADN polimerasas delta y epsilon:
Dirigen la replicacin de la cadena conductora o leading strand que es la cadena
que crece de 5' a 3' en mismo sentido que crece la nueva copia de ADN.
Estas dos ADN polimerasas funcionan durante la fase S del ciclo celular en las
clulas eucariontes. El ADN polimerasa delta es un heterodmero compuesto de
una subunidad P125 y otra P50, aunque es probable que en levaduras y mamferos
contengan una subunidad adicional con una masa aproximada de 50kDa. P 125 es
la subunidad cataltica tanto para la actividad de polimerasa como para la edicin
con actividad de exonucleasa 3`5`. LA polimerasa delta es necesaria para la
sntesis tanto de la cadena libre como de la cadena rezagada durante la replicacin.
La interaccin de las polimerasas delta y epsilon con el ADN ligasa I es diferente;
la presencia de esta enzima en la horquilla de replicacin reprime la accin de la
polimerasa delta y por el contrario, activa la polimerasa epsilon, de este modo ha
surgido que la replicacin de la cadena rezagada se debe a la polimerasa epsilon.
La ADN polimerasa epsilon parece que tambin est involucrada en un tipo de
reparacin del ADN. Adems, las ADN polimerasas gamma, delta y epsilon tienen
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actividad exonucleasa 3'5' y, por tanto, son capaces de eliminar los nucletidos
del extremo 3' que han sido incorporados incorrectamente en un proceso conocido
como correccin de pruebas.
La ADN polimerasa alfa:
Participa en el proceso de replicacin del ADN dirigiendo la replicacin de la
cadena retardada o lagging strand que es la cadena que crece de 3' a 5' que es el
sentido contrario al del crecimiento global de la nueva copia de ADN.
Una propiedad adicional enzimtica de la ADN polimerasa es su capacidad para
hidrolizar cadenas de ADN bajo ciertas condiciones.
La ADN polimerasa puede hidrolizar ADN progresivamente desde el extremo 3
-hidroxilo de una hebra de ADN. Los productos son mononucletidos. As pues,
la ADN polimerasa I es una exonucleasa 35. El nucletido eliminado debe
tener un termino 3-OH libre, y no puede ser parte de una doble hlice.
Experimentos con una variedad de polmeros sintticos han indicado que la
ADN polimerasa I siempre elimina residuos no aparentes de los extremos antes
de proseguir con la polimerizacin. No hay hidrlisis, si los trminos estn
convenientemente acoplados y estn presentes los precursores activados. La
polimerizacin evita la hidrlisis a partir del extremo 3`. La polimerizacin
generalmente no ocurre excepto si los pares de bases encajan en una doble
hlice. Sin embargo si se produce un error en esta etapa puede ser corregido
antes que sea incorporado al siguiente nucletido. En efecto, la ADN polimerasa
1 examina el resultado de cada polimerizacin que cataliza antes de la
incorporacin del siguiente nucletido. La ADN polimerasa 1 puede tambin
hidrolizar ADN a partir del extremo 5` de la cadena. Esta actividad de nucleasa
5`3` es muy diferente al de la exonucleasa 3`5`. Primero el enlace roto
puede estar en una regin de doble hlice. Segundo la rotura puede ocurrir en el
enlace fosfodiester Terminal o en un enlace a varios residuos de distancia del
Terminal 5`.
Tercero, la actividad de nucleasas 5`3` es intensificada por la sntesis
concomitante de ADN. Cuarto, el centro activo para la actividad de nucleasa
5`3` es completamente diferente de los centros activos de la polimerizacin y
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la
replicacin
del
ADN
mitocondrial.
ADN
polimerasa
Localizacin
(I)
(III)
(II)
nuclear
nuclear
nuclear
nuclear
mitocondrial
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Funcin
en
sntesis
cebar
sntesis ADN
reparacin
3-5
3-5
exonucleasa
exonucleasa
afidicolina
afidicolina
reparacin
replicacin
de ADN
otras
funciones
inhibidores
4.
afidicolina
desoxi-TTP
3-5
exonucleasa
desoxi-TTP
TRANSCRIPTASA INVERSA
DEFINICIN:
Durante muchos aos se crey que ese flujo de informacin gentica era unidireccional,
hasta tal punto que dicho supuesto constitua el llamado "dogma central" de la biologa
molecular. Sin embargo, hace algn tiempo, el descubrimiento de un grupo de
organismos capaces de invertir el sentido de este flujo conmovi los cimientos de este
dogma central. Estos organismos son un tipo de virus que se ha denominado Retrovirus.
La transcriptasa inversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo ADN-polimerasa, que
tiene como funcin sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN
monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripcin o transcripcin inversa. Esta
enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre obedece a que el proceso
normal de la transcripcin, la que se puede llamar "directa", codifica el ARN a partir de
la secuencia inicial de ADN, y no al revs. Una forma sencilla de sntesis de DNA de
doble cadena a partir de transcriptasa inversa o tambin llamada DNA polimerasa/RNA
dirigida sera partir de un cebador cola de poli-T que establecera bases
complementarias con la cola de poli-A del RNA transcrito de la hebra a sintetizar,
formndose as un hbrido RNA/DNA. Dicho hbrido podra separarse mediante
ribonucleasas, y posteriormente con la accin de una DNA-polimerasa y un nuevo
cebador, ser completada la hebra de DNA de doble cadena.
La enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos virus para invadir el
genoma de sus clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a partir de sus
ARN mensajeros
TRANSCRIPCIN REVERSA Y PCR (RT-PCR)
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1. CARACTERSTICAS:
Tcnica que consiste en la amplificacin in vitro de un fragmento de ADN
especfico, y que est presente en muy bajas cantidades en el material clnico a
investigar.
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2. TCNICAS:
La tcnica del PCR consiste bsicamente en la desnaturalizacin, alineacin o
hibridacin y la extensin o amplificacin, estos procesos se repiten continuamente.
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perfectamente
alinanos
cebador-molde.
La
temperatura
de
alineamiento es bajada de una forma gradual con cada ciclo. Una vez que las
copias de la secuencia diana han comenzado a acumularse durante los
primeros ciclos, el alineamiento a alta temperatura llega a ser mucho menos
crtico para la especificidad, como son los productos previos que forman el
molde principal.
Los productos improbablemente tendrn secuencias de alineamiento falso.
El beneficio de disminuir la temperatura de alineamiento es el incrementar la
probabilidad de una interaccin estable cebador-diana. El resultado es una
mejora en la produccin del producto especfico comparndolo con los
protocolos que utilizan alineamiento a una nica alta temperatura.
RT-PCR (Revese Transcription PCR): Utilizado para amplificar, aislar o
identificar una secuencia conocida de tejido RNA. La PCR es precedida por
una reaccin usando la transcriptasa inversa para convertir el RNA a cDNA
(ADN complementario).
3. APLICACIONES BSICAS:
Las aplicaciones de la PCR son mltiples, esta tcnica se desarrolla en diversos campos
como la biologa molecular, la gentica, medicina y otros.
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Por lo que se puede emplear en: diagnstico rpido de infecciones vricas, deteccin de
microorganismos en clulas infectadas o transformadas, determinacin de la relacin
gentica entre varios tipos de microorganismos similares, para correlacionar la
presencia de agentes virales o infecciosos en tejidos neoplsicos. La tcnica de PCR
tiene el potencial de realizar una rpida deteccin del DNA bacteriano en muestras de
sangre, y evita los contratiempos encontrados con los cultivos sanguneos en el
diagnstico de bacteriemia.
Entre las aplicaciones mdicas de la PCR, cabe destacar su aporte al desarrollo de
nuevas estrategias de diagnstico. Permite detectar agentes infecciosos como los virus
de las hepatitis B y C o regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV).
Ha sido aplicada, por ejemplo, para diagnosticar la presencia o ausencia de HIV en
recin nacidos de madres ceropositivas, pues la existencia de anticuerpos maternos
impide obtener resultados confiables, con los mtodos convencionales, durante el
primer ao de vida.
Tambin ha facilitado el diagnstico de enfermedades tales como las hemofilias A y B,
la distrofia muscular y la fibrosis qustica, e hizo posible reconocer mutaciones de genes
vinculadas con enfermedades oncolgicas.
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta de diagnostico:
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4. VENTAJAS Y LIMITACIONES:
4.1. Ventajas:
Rapidez
Especificidad
4.2. Limitaciones:
1. CARACTERSTICAS
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sonicacin enzimas de
restriccin.
2. TCNICAS
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de
secuencias
complementarias
de
cidos
nucleicos
3. APLICACIONES BSICAS
Las aplicaciones son:
Se utiliza para caracterizar ADN clonado.
mismos.
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4. VENTAJAS Y LIMITACIONES
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VENTAJAS
LIMITACIONES
Alta sensibilidad.
Alta especificidad.
Rapidez en el diagnstico
muestra
ser
estudiada
la
Con
frecuencia
se
usan
1. CARACTERSTICAS:
Northern blot o anlisis Northern (en alusin al nombre del cientfico inventor de esta
tcnica), es bsicamente una prueba para detectar las secuencias de ARNm que son
complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.
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permite
2. TCNICA O FUNDAMENTO
EL Northen Blot es un tcnica de deteccin de genes, para lograr este resultado se
siembra las muestras en un gel, realizamos una corrida electrofortica hasta lograr que
las molculas se separen por tamaos de manera tal que se puedan distinguir las
buscadas. Transferimos todo el ARN mensajero de un tipo determinado de tejido desde
un gel a una membrana de nylon o nitrocelulosa y por medio de la hibridacin de la
membrana, detectamos la presencia del ARN
nucleico que generalmente de ADN o ARN del gen que nos interesa.
Procederos a detallar cada etapa antes mencionada con mayor precisin:
EXTRACCIN DEL RNA
Las clulas o los tejidos se homogenizan en una solucin que contenga inhibidores
de las ARNasas(ribonucleasas), ya que estos van a impedir la degradacin del ARN
durante su aislamiento y almacenamiento.
Se aprovecha la circunstancia de que la mayor parte de los RNA mensajeros tienen
una cola de poli-A. El RNA celular total se pasa por una columna que contiene polidT unido a una fase slida. El RNA mensajero se une al poli-dT y queda retenido en
la fase slida, eludiendo el resto de RNA y posteriormente se elude el RNA
mensajero.
Despus de la separacin del ARN del ADN geonmico, el RNA purificado se
precipita con etanol durante el paso final de todos los procedimientos.
Debemos tener en cuenta para la realizacin satisfactoria de nuestro trabajo que las
soluciones acuosas de RNA deben almacenarse congeladas y que se asegure la
desnaturalizacin y por ende la obtencin de nuestro ARN intacto.
ELECTROFORESIS DEL RNA
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realizarse
por
capilaridad,
por
electroforesis
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Pre-hibridacin o bloqueo
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Hibridacin
La sonda marcada se aparea en solucin con su hebra complementaria,
inmovilizada en la membrana.
Condiciones:
Estas deben ser determinadas empricamente.
Los factores que afectan la hibridacin de cidos nucleicos.
La solucin de hibridacin presente en su infraestructura: 5x SSC,
3M NaCl, 0,3M Citrato de Na), 50% Formamida , 1% SDS, 5%
Denhardt
DNA heterlogo (ssDNA espermio de salmn).
La Temperatura debe ser optima para valga la redundancia
optimizar la velocidad de la hibridacin en presencia de
formamida: 15-20 C bajo el Tm
Lavados
Para remover la sonda que est unida en exceso de manera inespecfica pero
poco complementaria, esto se logra incubando la membrana en una solucin
que carece de sonda marcada y utilizando condiciones que minimizan la
hibridacin inespecfica, estrictez, una medida de la probabilidad de separar
dos hebras de cidos nucleicos.
VISUALIZACIN
El RNA puede ser visualizado capturando la radiacin ionizante por una emulsin
fotogrfica. La membrana es expuesta a un film por tiempos variables , el film es
revelado y analizado.
3. APLICACIONES BSICAS
Esta tcnica se ha aplicado en estudios de la modulacin de la sntesis de interleucina 6
en pacientes con artritis reumatoide
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4. VENTAJAS Y DESVENTAJAS
VENTAJAS
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http://aportes.educ.ar/biologia/nucleo-teorico/influencia-de-las-tic/tecnologiadel-adn-recombinante/como_cortar_y_pegar_el_adn_tij.php
http://allnatural.iespalomeras.net/manipulacion-adn/tecnicas-ingenieria.html
http://www.quimica.urv.es/~w3siiq/DALUMNES/97/siiq39/Endo.html
ADN Ligasa
http://genemol.org/biomolespa/Enzimas/las-ligasas.html
http://www.electronicafacil.net/ciencia/Article5216.html
http://allnatural.iespalomeras.net/manipulacion-adn/tecnicas-ingenieria.html
Adn Polimerasa
http://www.babylon.com/definition/ADN-polimerasa/Spanish
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/dna%20polimerasa.html
Lubert Stryer. Bioqumica. Editorial Reverte S.A. 1979. Espaa
Transcriptasa
http://danival.org/600%20microbio/7400notasvir/algunos/vir_algunos_retroviru.
html
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