Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Facultad de Farmacia y Bioqumica

E. A. P. Farmacia y Bioqumica
5to ao - Noveno Semestre
Departamento Acadmico de Farmacologa,
Bromatologa y Toxicologa
Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal

Prctica N8:
Determinacin de
Txicos Orgnicos Fijos
INTEGRANTES:

Prctica 8

Benito Navarro, Aldo (12040001)

Goya Shimabukuro, Eri (12040091)
Huaman Fiestas, Susan Andrea (12040093)
Machaca Victorio, Merritt Bryan (12040071)
Rodrguez Cervantes, Lilian (00988426)
PROFESOR DE LA PRCTICA:
Mg. Jos Alfonso Apestegua
Q.F. Jos Llahuilla Quea
FECHA DE LA PRCTICA:
30/03/16 10 a.m.-3:00 pm

INTRODUCCIN

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

En consonancia con el desarrollo industrial y tcnico crece el nmero de
estas sustancias qumicas. Incluye este grupo los derivados de la destilacin
del petrleo y muchos hidrocarburos saturados, no saturados y aromticos;
alcohol metlico y etlico, ter, formol, hidrato de cloral y acetona; aminas
aromticas constituyentes de las anilinas; derivados clorados de los
hidrocarburos aromticos utilizados como insecticidas y combinaciones
orgnicas del fsforo; salicilatos, aspirina y fenacetina, tambin derivados
de hidrocarburos aromticos; disolventes de grasas, como el sulfuro y
tetracloruro de carbono; cloroformo y los cloruros y bromuros de metilo;
barbitricos; alcaloides obtenidos de plantas como morfina, codena,
cocana,

atropina,

papaverina,

curare,

estricnina,

nicotina,

quinina,

aconitina, ergotamina, etc.

Hoy en da las drogas de abuso han pasado a ser de un problema global que
afecta a muchos pases, obligando a las naciones a intensificar sus
esfuerzos por el control y regulacin de algunas drogas, es por ello que
como futuros investigadores en el presente informe vamos a identificar los
principales metabolitos producto de la biotransformacin de sustancias
txicas presentes en los fluidos y tejidos corporal. Para la identificacin de
estas sustancias previamente es necesario realizar una extraccin en un
disolvente orgnico ya sea en medio cido o alcalino de modo que nos
permita extraer la mayor cantidad y pureza de estos txicos. Dentro de
estos

compuestos

vamos

poder

encontrar

sustancias

como

las

benzodiacepinas, carbamacepina, fenotiazinas, anfetaminas, antidepresivos

tricclicos, alcaloides, plaguicidas organofosforados, barbitricos, salicilatos
y otros analgsicos antipirticos que hayan sido empleados como sustancias
de abuso por el paciente.
Dentro

de

estos

compuestos

se

encuentran:

Benzodiacepinas,

carbamacepina, fenotiazinas, butirofenonas, cannabinoles, anfetaminas,

antidepresivos tricclicos, cocana, estricnina, opiceos, otros alcaloides y los
principales metabolitos de todos ellos.
plaguicidas

organoclorados

Plaguicidas organofosforados,

piretriodes.

Cumarinas,

plaguicidas

carbmicos, glutetimida, hidantoinas, meprobamato, barbitricos, salicilatos

y otros analgsicos antipirticos y los principales metabolitos de todos ellos.

UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

MARCO TERICO
La investigacin toxicolgica es el conjunto de procesos analticos que tiene
por objeto el aislamiento, identificacin y determinacin cuantitativa de los
txicos, tanto en el vivo como en el cadver, con el fin de permitir el
diagnstico de la intoxicacin. (1)
Todos los frmacos entran en esta categora, as como las drogas de abuso,
los plaguicidas y una gran cantidad de sustancias utilizadas en sntesis
qumicas y en industria alimentaria. De las intoxicaciones con frmacos, la
que involucran a los psicofrmacos son las ms frecuentes, aunque tambin
son frecuentes las intoxicaciones con aspirina y paracetamol.
La mayora de las veces, la investigacin de la presencia de estos
compuestos en casos de sospecha de intoxicacin, requiere de la aplicacin
de dos tipos de mtodos:
a) Mtodos de aislamiento que separan al compuesto del resto de los
componentes de la muestra.
b) Mtodos de identificacin (y, en algunos casos, de cuantificacin).
Desde el punto de vista analtico, los txicos se dividen en:

Txicos
Txicos
Txicos
Txicos

voltiles
gaseosos
orgnicos fijos o extrables
inorgnicos o minerales

Analtica de los txicos no voltiles o Txicos Orgnicos Fijos (2)

Bajo la denominacin de Txicos Orgnicos Fijos (TOF) o no voltiles se
incluye una gran variedad de sustancias orgnicas, de inters toxicolgico,
que no pueden aislarse por destilacin de las matrices que los contienen,
sino que debe recurrirse a la accin de disolventes orgnicos (en medio
cido o alcalino) para su separacin y posterior identificacin. La mayora de
estos txicos sufren de profundos cambios metablicos en el organismo y,
en consecuencia, pueden aparecer en los fluidos o tejidos en su forma
UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

original o como productos de biotransformacin (metabolitos), libres o
conjugados

con

diferentes

compuestos

(cido

glucurnico,

sulfatos,

aminocidos, etc.). Las propiedades fisicoqumicas del toxico y sus

metabolitos pueden ser muy distintas, a veces incluso entre los metabolitos
de un mismo compuesto. Ello determina una excrecin caracterstica segn
los casos y la conveniencia de realizar la investigacin en una u otra matriz
(orina, sangre, bilis, etc.) Frecuentemente la especie que ser analizada est
presente en un tejido o un fluido biolgico, unido a protenas u otros
constituyentes celulares. En este caso, puede ser necesario separar el toxico
(el compuesto madre de sus metabolitos) del resto del componente de la
matriz, de modo de obtenerlo en cantidad y pureza suficientes para permitir
su identificacin y cuantificacin. Solo recientemente han surgido mtodos
disponibles que permiten la medida directa de algunos analitos sin la
separacin previa de su matriz. El analista toxicolgico ha experimentado un
crecimiento paulatino en el nmero de tcnicas a su disposicin. En la
actualidad la clsica metodologa convencional ha sido reemplazada por la
introduccin

de

mtodo

instrumentales

ms

sofisticados,

de

gran

sensibilidad y precisin, pero cuyo costo elevado limita su disponibilidad en

la mayora de los laboratorios de nuestro medio.
Los TOF tienen en comn el uso de metodologa similares para su
aislamiento, caracterizacin y cuantificacin.
INMUNOENSAYOS:

Existen

en

el

comercio

numerosos

tipos

de

inmunoensayos con aplicaciones en Toxicologa. En su mayora estn

diseados para el anlisis de muestras lquidas, como orina, agua y suero
debido a que estas matrices presentan poca cantidad de interferencias.
Estas muestras se emplean en forma directa, evitando por lo tanto el paso
previo de extraccin aislamiento de los analitos y logrando una reduccin
importantsima en el tiempo de obtencin de los resultados (10 minutos 1
hora). Los inmunoensayos se basan en la reaccin especifica que se
produce cuando un antgeno se enfrenta con un anticuerpo. La tcnica
tradicional consiste en mezclar un volumen de muestra conteniendo la
droga a ensayar, con una cantidad fija de un anticuerpo especfico
(monoclonal o policlonal), y una cantidad fija de la misma droga marcada
sintticamente con un radioistopo, una enzima activa o una sustancia
fluorescente. De este modo se establece una competencia entre la droga
UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

marcada (Droga*) y la presente en la muestra (Droga) por los sitios de unin
del anticuerpo. En forma simple se esquematiza esta competencia:
Droga* + Droga + Anticuerpo ----------------> Droga*-Anticuerpo +
Droga-Anticuerpo
La probabilidad de que una molcula marcada o sin marcar se una al
anticuerpo depende de su concentracin. Se requieren instrumentos
capaces de evaluar el punto final de la reaccin y comparar la respuesta del
test contra estndares conocidos. De acuerdo al tipo de marca es el mtodo
analtico de medida empleado. En algunos casos no puede diferenciarse a
seal producida por la droga marcada unida al anticuerpo y la droga
marcada libre, siendo necesario separarlas antes de efectuar la medida.
Estos ensayos se conocen como heterogneos, e involucran principalmente
a los radioinmunoensayos. Cuando esta separacin no es necesaria, porque
la seal producida por la droga marcada se diferencia si est libre o unida,
el ensayo se llama heterogneo.
TCNICAS CROMATOGRAFAS: La bsqueda de TOF mediante tcnicas
cromatografas, como TLC (Cromatografa en capa fina), HPTLC, HPLC, GC,
etc. Se caracteriza porque antes de aplicarles es necesario separar las
drogas de la matriz en la que se encuentran inmersas mediante alguna
tcnica de extraccin. En la prctica esto se logra siguiendo una serie de
pasos, como los que se describen a continuacin.
Preparacin de la muestra: es un paso crucial en los anlisis. Involucra la
homogenizacin de la muestra, ajustes de pH, pesaje, procedimientos de
hidrlisis (cida, bsica o enzimtica), precipitacin, centrifugacin, etc. De
modo tal que se facilite el aislamiento de la sustancia de inters.
Aislamiento del analito: se puede llevar a cabo mediante extraccin lquidoliquido (en tubos, en ampollas de decantacin o en columnas de tierra de
diatomeas) o extraccin en fase slida (columnas de SPE) de acuerdo a las
disponibilidades del laboratorio. En este paso se mueve el analito de su
matriz

original

para

obtenerlo

en

la

mayor

concentracin

posible,

estabilizarlo (ya que en su matriz original puede degradarse qumica o

enzimticamente) y eliminar interferencias.
Concentracin del extracto: el objetivo de este paso es colocar el analito en
el menor volumen posible para aumentar la sensibilidad del anlisis. Se
UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

deben usar condiciones controladas, idealmente una temperatura menor de
40C y corriente de nitrgeno. Durante las operaciones antes mencionadas
se debe tener sumo cuidado para evitar prdidas por volatilizacin,
oxidacin o absorcin en los precipitados, ya que frecuentemente los
productos a identificar estn presentes en cantidades menores del g/ ml.
Las prdidas por volatilizacin de sustancias bsicas como anfetaminas
pueden prevenirse cuidando la temperatura y salificando el extracto con
cido clorhdrico al 1 % en metanol.
Identificacin

del

analito:

existen

diferentes

niveles

de

complejidad

dependiendo de las tcnicas que se utilicen para su identificacin. As existe

un nivel primario que utiliza tcnicas como Cromatografa en Capa Delgada
(TLC), Espectrofotometra UV, adems de reacciones de coloracin para la
orientacin, etc. Un nivel secundario involucra tcnicas tales como la
Cromatografa de Gases (GC) y la Lquida de Alta Resolucin (HPLC) tanto
para Screening como para la determinacin de una droga en particular y un
nivel terciario que utiliza la Espectrometra de Masas acoplada a un a
Cromatografa separativa como la de Gases o Lquida de Alta Resolucin
(GC/MS o HPLC/MS).
Cuantificacin del analito: una vez identificado el analito la cuantificacin
del mismo se puede realizar por una tcnica directa, bien ajustada y
utilizando patrones de referencia puros para anlisis. Esta tcnica directa
generalmente es una tcnica cromatogrfica gas-lquido o lquido-lquido y
la espectrometra acoplada a estas dos anteriores. Cada uno de estos pasos
merece un captulo aparte dentro de la Toxicologa. Por ende, slo se
pretende citar sus caractersticas principales haciendo hincapi en los
detalles tcnicos ms relevantes. (3)

OBJETIVOS
Separar los diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en la
muestra problema utilizando el mtodo de Curry.

MATERIALES Y REACTIVOS

REACTIVOS
Cloroformo
Hidrxido de Amonio
cido Clorhdrico concentrado

UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

Hidrxido de Sodio 2,5 %
NaHCO3 5%

MATERIALES
Pera de Decantacin 250 mL
Probetas graduadas 50 mL
Papel indicador pH
Beaker de 100 mL
Pipetas graduadas 5 10 mL
Embudo de Vidrio
Pipetas pasteur

METODOLOGA
FUNDAMENTO (4)
Como norma general, los txicos se extraen con disolventes orgnicos.
Entre los ms frecuentes para una extraccin general se encuentran: ter
etlico, cloroformo, diclorometano, etc.
En este proceso es fundamental el pH del medio en el que se realiza la
extraccin, ya que el fundamento de la extraccin liquido-liquido consiste en
la diferente solubilidad que cada sustancia tiene en agua y/o disolventes
orgnicos en funcin del grado de disociacin que sufre en funcin del pH
del medio (sin olvidar el efecto de la mayor o menor liposolubilidad de
acuerdo al coeficiente de particin).
Los txicos en medio acuoso (como es el caso de las muestras biolgicas) se
comportan como cidos, bases o sustancias neutras.
El equilibrio fundamental de que hacemos uso en la extraccin con
disolventes es el siguiente:

UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

Las formas no ionizadas son ms solubles en disolventes orgnicos. Por
tanto, en cada caso tendremos que utilizar el pH idneo para que el txico
que buscamos se encuentre mayoritariamente en forma no ionizada.

En
el

caso de los txicos cidos, si consideramos un medio cido, implica una

elevada concentracin de H+, por lo que segn el principio de Le Chatelier,
la reaccin se desplazara para compensar dicho aumento hacia la
izquierda, es decir, hacia la formacin de AH, aumentando as la cantidad de
cido que est en forma no ionizada. La forma no ionizada es ms soluble
en disolventes orgnicos que la ionizada. Por lo que concluimos que los
cidos se extraen con disolventes orgnicos en medio cido.

En el caso de los txicos bsicos, si consideramos un medio alcalino, implica

una elevada concentracin de OH-, por lo que segn el principio de Le
Chatelier, la reaccin se desplazara hacia la izquierda para compensar ese
aumento, es decir, hacia la formacin de BOH aumentando as la cantidad
de base que est en forma no ionizada. La forma no ionizada es ms soluble
en disolvente orgnico que la ionizada. Por lo que concluimos que las bases
se extraen con disolvente orgnicos en medio alcalino.

UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

MTODO DE CURRY
5 mL 0 100 g (contenido: gstrico,
orina, sangre)
6 mL de Tunsgtato de sodio al 10%
9mL de cido sulfrico 2/3 N
5mL de agua destilada
1mL de hidrxido de sodio al 10%

BM por 15 minutos

Filtrar en caliente Sol.

Transparente
Extraer con 1/3
vol.Cloroformo
Agitar por 3 minutos
-rgano:
Fosforados
Clorados
Carbmicos
-Salicilatos
-Barbitricos
FASE ACUOSA
-Benzodiacepinas
FASE ETREA
-Cumarinas
-Sulfas
Agregar NH4OH 10% hasta
Evaporar a
-Digitlicos
pH 9,5
sequedad
-Marihuana
10 gts
-Txicos:
Cloroformo UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL 9
-cidos: Fuertes,
Dbiles
-Txicos neutros

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

Extraer con 1/3 vol.ter

Cromatograf
a

Residuo
acuoso

SS(MeOH:
Acetona)
1:1

FASE ETREA
Evaporar a
sequedad 10
gts Cloroformo

MTODO DE

-Alcaloides
Benzodiacepina
s
-Fenotiacinas

Evaporar a
sequedad 10
gts
Cloroformo
CURRY

Tox. c. Fuertes
(TAF)
Tox. c. Dbiles

Tox. Alcalinos (TA)

Fase acuosa
+ 50 mL
NaHCO3 5
%
Agitar 3-5

+ NH4 pH 9,5
+ Extraer 50
mL Cl3CH
Agitar 3-5
+ 50 mL
+ agitar
4-5

+ gts HCl pH
3
Agitar con

Evaporar

TAF

TAD
TN

+ 5 mL NaOH
2,5%
Agitar 3

TAD

UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

1
0

Prctica
N 8

Determinacin de Txicos Orgnicos Fijos

R4
TA

Fenotiaznicos
Benzodiacepina

Bibliografa

Evaporar

+ mL HCl pH
3
Extraer
Evapor

R1
TAF
Salicilato

Evaporar

Insectici

R2
TAD

R3
TN

1. Fernndez R. Marcha Toxicolgica de Urgencia. 1st ed. Mendoza :

Laboratorio de Toxicologa del Cuerpo Mdico Forense - Poder Judicial de
Mendoza; 2007.
2. Campbell K. Phenothiazine Derivatives in Urine: False Negative Results
with the Forrest Color Test (FPN), and a Method for Their Elimination. Clin
Chem. 1965 Oct; 11(10): p. 914-9.
3. Misiuk W, Kuzmicka L, Mielech K, Puzanowska-Tarasiewicz H. Examination
Barbitric
of iron (III) and hexacyanoferrate (III) ions as
reagentsfor the
spectrophotometric determination of promazine and perazine. Acta Pol
Pharm. 2001 Nov-Dec; 58(6): p. 421-5.
4. Trinder P. Rapid determination of salicylate in biological fluids. Biochem J.
1954 Jun; 57(2): p. 301-303.

UNMSM / FFYB / CTEDRA DE TOXICOLOGA Y QUMICA LEGAL

1
1