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Tecnologa del ADN recombinante

PCR

Juan Alejandro Neira PhD.

Definicin
La reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) es una
tcnica que permite replicar
entre cientos de miles y
millones de veces, en el
transcurrir de pocas horas e in
vitro, pequeas cantidades de
ADN.

PCR
El aislamiento de grandes cantidades de segmentos especficos de
ADN puede ser realizado utilizando varias tcnicas, una de las cuales
es la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La PCR est basada en una reaccin de sntesis de DNA


llevada a cabo in vitro por la enzima Taq Polimerasa, una
polimerasa de DNA resistente a la temperatura.

Componentes de la reaccin:

El tampn (buffer)
Los nucletidos (dNTPs)
Los cebadores (primers)
El ADN (muestra)
La polimerasa (taq Polimerasa)

La polimerasa Taq.

Es un tipo de ADN polimerasa termoestable, nombrada


de esta forma debido a que es producida por la bacteria
Thermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fue
aislada en el ao 1968 por Thomas D. Brock1 A
menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (o
simplemente como "Taq"), y es frecuentemente
utilizada en las tcnicas de PCR, un mtodo que se
utiliza para amplificar secuencias cortas de ADN.

Qu componentes son necesarios para la PCR?

Proceso de la PCR
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede
resumir de la siguiente forma: partiendo de un ADN
molde, una enzima, la ADN Polimerasa incorpora
nucletidos complementarios a partir de la zona de
doble cadena originada por la unin de los cebadores
al molde.
El proceso se da en tres fases: Desnaturalizacin,
hibridacin y elongacin.

Parmetros de la reaccin:

Temperaturas en cada parte del ciclo


Duracin de cada parte del ciclo
Velocidad de enfriamiento y calentamiento
Nmero de ciclos

En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la tcnica de


reaccin en cadena de la polimerasa, o PCR.

Esta tcnica ha invadido de tal forma la Biologa Molecular,


que hoy en da es muy difcil imaginar esta ciencia sin ella.
En 1989, Science seleccion el PCR como el principal
desarrollo cientfico, y la Taq polimerasa como la molcula del
ao.
En 1993, Kary Mullis recibi por este descubrimiento el
Premio Nobel de Qumica.

Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya


no es una limitacin en la investigacin en Biologa
Molecular, ni en los procedimientos de diagnstico
basados en el estudio del ADN.

El nmero de aplicaciones de esta tcnica parecen


infinitas, y continan creciendo sin parar.

Una de sus posibles aplicaciones se centra en la


secuenciacin del ADN de muestras biolgicas.

Etapas
Desnaturalizacin
Alineamiento/Unin del cebador
Extensin/Elongacin
de la
cadena
Elongacin Final

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En donde se lleva a cabo la reaccin?

TERMOCICLADOR

30 ciclos repetitivos conformados


cada uno de tres pasos.

Consisten en un bloque que


puede ser programado para
calentarse y enfriarse
rpidamente en determinados
tiempos

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Desnaturalizacin
Dos pequeos fragmentos de ADN, tpicamente de 10 pares
de bases, llamados primers, son sintetizados a travs de otra
tcnica.
Esos primers son pequeos fragmentos de ADN que son
complementarios a cada una de las extremidades de la
secuencia de ADN de inters.
En un tubo de reaccin son adicionados los primers,
nucletidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina,
guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especial
resistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la
sntesis de ADN.
La mezcla es calentada a 95C lo que provoca la
separacin de las dos cadenas de ADN.

Desnaturalizacin
Ocurre cuando las dos cadenas de ADN se separen. Se lleva
a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94C. La re
naturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya.

Alineamiento(anillamiento)
Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55C, temperatura en
la cual los primers se unirn a las regiones complementarias de
las molculas de ADN que estn separadas.

En este momento, dentro del tubo de reaccin, todo el ADN


est en forma de cadena simple, menos las dos pequeas
regiones en las cuales los primers de 20 pares de bases se
ligarn a los dos lados de la secuencia de ADN.

Alargamiento (polimerizacin)
La temperatura se eleva entonces hasta 72C y la Taq
polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando
por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los
primers se uni al molde de la muestra de ADN. La Taq
polimerasa promueve la sntesis de ADN apenas en la regin
de doble cadena.
La sntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20
nucletidos por segundo, y en un minuto es sintetizada una
nueva copia del fragmento que se quiere analizar.

Qu se ha obtenido tras un ciclo de


PCR?
nicamente una copia de un pequeo
fragmento del ADN molde.

El tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su


cantidad original se encuentra disponible para ser
nuevamente replicado en un segundo ciclo.

Cuntos fragmentos se generan


durante la reaccin de PCR?
Al final del proceso se obtiene aproximadamente una
cantidad de fragmento igual al producto de la cantidad
inicial de ADN molde por 2n, siendo n el nmero de
ciclos.
Como dato para apreciar la cantidad de copias que se
generan, en el ciclo 20 se ha multiplicado por ms de un
milln la cantidad inicial de ADN molde.

Repeticin del ciclo


La reaccin entonces es nuevamente calentada a 95C
causando nuevamente la separacin de todo el ADN
en las cadenas simples.

Al final del primer ciclo hay dos cadenas de la


molcula original de ADN mas dos copias de la
regin de inters.

La temperatura es disminuida de nuevo a 55C y


ahora los primers se irn a unir a los cuatro sitios
en las dos copias nuevas y tambin en la molcula
original de ADN. LA temperatura del ciclo es
nuevamente elevada a 72C y se multiplican
entonces las cuatro cadenas individualizadas.

Estos ciclos son repetidos varias veces, tpicamente 30 veces,


en un aparato llamado termociclador.
Al final de 30 ciclos de amplificacin existen
aproximadamente un milln de copias del segmento de ADN
de inters por cada molcula molde original de la muestra
inicial. Es as que podemos seleccionar un fragmento
especfico dentro de todo el ADN.

Cmo se prepara?

1. Primero se prepara la mezcla de reaccin (en cantidad


suficiente para todas las muestras) que contenga todos
los componentes de la PCR, a excepcin del ADN
molde.
2. Una vez preparados los tubos de reaccin se
introducen en el termociclador.

1. Primero se prepara la mezcla de reaccin (en


cantidad suficiente para todas las muestras) que
contenga todos los componentes de la PCR, a
excepcin del ADN molde.
2. Una vez preparados los tubos de reaccin se
introducen en el termociclador.

VENTAJAS
Tcnica especfica, sino tambin muy sensible, pues en principio
para practicarla bastara una sola molcula, por ejemplo, del
genoma humano ~6 picogramos.
Puede usar como substrato para la reaccin al ADN, sin tener que
purificarlo de su fuente natural, y es comn emplear productos
biolgicos diversos. Muchas veces basta una simple ebullicin de la
muestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN,
dejndolo listo para la reaccin.

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(Rodrguez I y cols., 2004)

Se puede prescindir del uso de radioistopos, los cuales eran


indispensables antes de su invencion (Rodrguez I, 2004)
Proporciona muchas alternativas ms rpidas y menos
costosas para muchas aplicaciones de la clonacin, en
particular para los organismos en los que se conoce la
secuencia completa del genoma .
Puede producirse enteramente in vitro, sin el uso de clulas.

Con est tcnica se puede seleccionar una secuencia


especifica de nucletidos para replicarse en forma selectiva y
rpida en grandes cantidades a partir de cualquier muestra
que las contenga (Alberts y cols., 2006).
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DESVENTAJAS

Debido a que los cebadores tienen que sintetizarse qumicamente, la PCR


solo puede utilizarse solo para clonar ADN con secuencias de comienzo y
de terminacin conocidas.

APLICACIONES
PREDIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
AMPLIFICACIN DE REGIONES HIPERVARIABLES
INVESTIGACIONES FORENSES
APLICACIONES EN ESTUDIOS EVOLUTIVOS

DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES

INVESTIGACIONES

FORENSES

APLICACIONES

EN
ESTUDIOS EVOLUTIVOS

Mediante

la PCR se pueden amplificar genes


de organismos ya extinguidos, como del
mamut, o restos antiguos humanos. Se pueden
comparar estos genes con los genes
semejantes de organismos actuales y poder
reconstruir rboles filogenticos.
El PCR tambin se ha utilizado para conseguir
el mapa del genoma humano.

Huella digital gentica


Es una tcnica forense que permite identificar a una persona
comparando su DNA con el de una muestra obtenida, por
ejemplo, de la escena de un crimen.
Como la muestra puede ser muy escasa, la PCR permite
aumentar la cantidad de DNA amplificando ciertos segmentos
polimrficos (variables en la poblacin), para luego separarlos
mediante electroforesis, lo que se conoce como DNA
fingerprint o huella digital.

HUELLA DIGITAL

Test de Paternidad
Amplificando por PCR fragmentos polimrficos de
DNA de la madre, del nio y de l o los presuntos
padres, y separndolo mediante electroforesis, se
puede visualizar una serie de segmentos que tiene el
nio, que debe compartir con la madre y padre
biolgicos.

Deteccin de Enfermedades
Hereditarias
Cada gen en estudio puede ser amplificado fcilmente
por PCR, con los partidores adecuados, y luego ser
secuenciado, para as determinar si un individuo
porta alguna mutacin que explica la presencia de
una enfermedad o su aparicin en el futuro, la que
puede ser heredada a sus hijos.

Comparacin de la expresin gnica


Al introducir una modificacin en la PCR clsica se puede
estimar la cantidad de mRNA de un gen determinado en ciertas
condiciones experimentales.
Al extraer el RNA total de una clula y con el uso de la
transcriptasa inversa, se puede producir un DNA
complementario (cDNA) de todos los mRNA o de alguno en
particular. Con este cDNA se puede hacer una PCR para
amplificarlo y facilitar su cuantificacin. Esto se conoce como
RT-PCR y permite estimar cuanto se expresa uno o varios
genes en una clula en una condicin de cultivo determinada.

COMPARACION DE LA EXPRESION
GENICA

*Imgenes editadas
digitalmente

Clonamiento de Genes
La PCR es habitualmente usada para amplificar un
determinado gen o un mRNA (representado por un cDNA),
que puede introducirse en un vector y luego en un organismo,
que al duplicarse tambin duplicar el gen que nos interesa.
As podemos tener una cantidad suficiente de un gen o cDNA,
por ejemplo, para secuenciarlo o producir a gran escala la
protena que este gen codifica.

Mutagnesis
Con variaciones en la secuencia de los partidores, se
puede producir un segmento de DNA que presente
diferencia en una o mas bases respecto al DNA
original. As se puede alterar una protena para
estudiar o anular su funcin. Esta mutacin puede ser
en un sitio determinado de un gen (sitio dirigida) o en
un lugar al azar de un gen o genoma.

Anlisis de DNA antiguo


Con la PCR se puede analizar DNA que tiene miles
de aos de antigedad, lo que ha permitido estudiar
muestras obtenidas desde momias y de restos de
animales extintos, como algunos ejemplos.

Genotipificacion de polimorfismos
Mediante el uso de la PCR se puede determinar el genotipo de
un individuo para un polimorfismo dado, como un
microsatlite o un SNP (single nucleotide polymorphism).
En este ltimo caso necesitamos dos partidores para un mismo
extremo del segmento, los cuales varan en slo una base en el
extremo 3', lo que generar una amplificacin alelo-especfica,
de acuerdo al alelo del SNP que tenga el individuo en estudio.
Estos polimorfismos son muy tiles para estudios
poblacionales y para relacionar un gen o una regin
cromosmica con una enfermedad, ya sea mediante estudios
de asociacin o ligamiento.