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Entwicklung und Validierung einer Multimethode zur

Bestimmung von Antibiotikarckstnden in Milch und


Wasser mittels LC-MS/MS

Masterarbeit
im Master-Studiengang Lebensmitteltechnologie/Food Science and
Technology der Beuth Hochschule fr Technik Berlin
- University of Applied Sciences zur Erlangung des akademischen Grades eines
Master of Science (M. Sc.)
vorgelegt von
Shafira Nur Octavia, B. Sc.
im September 2014

angefertigt im
Institut fr Getreideverarbeitung GmbH
Abteilung Analytik/Testlabor

1. Gutachter: Prof. Dr. Monika Springer


2. Gutachter: Dr. Gerd Huschek
Projektbetreuerin: Silvia Aguil-Losa

Eidesstattliche Erklrung

Eidesstattliche Erklrung
Ich versichere, dass ich diese Arbeit selbststndig verfasst und keine anderen als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

Berlin, den 1. September 2014

Shafira Nur Octavia

Danksagung

Danksagung
Diese Arbeit mchte ich zum Anlass nehmen, einigen Personen meinen Dank
auszusprechen, die mich bei dieser Masterarbeit untersttzt und begleitet haben. In
erste Linie danke ich Frau Prof. Dr. Monika Springer sowie Herrn Dr. Gerd Huschek
von der Firma IGV (Institut fr Getreideverarbeitung) GmbH fr dieses interessante
Thema sowie fr die Untersttzung und Hilfe bei der Erstellung der vorliegenden
Masterarbeit. Von ihnen erhielt ich Anregungen und sie waren immer bereit,
umgehend auf meine Fragen einzugehen.
Speziell bei Frau Silvia Aguil-Losa von der Firma IGV GmbH mchte ich fr die
vielen gemeinsamen Stunden im Bro und im Labor sowie fr die tatkrftige
Untersttzung, zahlreiche Anregungen und Hilfe bei den praktischen Versuchen
insbesondere beim Erfahren der LC-MS/MS bedanken.
Ein herzliches Dankeschn auch an Olga Worster und Jurgenal Fatichin, die mir bei
der schriftlichen Korrektur dieser Arbeit geholfen haben.
Des Weiteren danke ich den Mitarbeitern des Prflabors des IGV GmbH fr Ihre
Untersttzung und gute Zusammenarbeit whrend der praktischen Versuche.
Zu guter Letzt mchte ich meinen lieben Eltern in Indonesien, meiner Schwester
Shofiana Octari und Hariz Adenan fr ihre unendliche Motivation und Untersttzung
danken.

ii

Abstract

Abstract
Many classes of antibiotics are widely administrated to food-producing animals for
the purpose of prevention and treatment of several diseases. This can result in
residues in several dairy products such as milk, which is highly consumed over the
world. Additionally, the residual antibiotics from both human and animal uses can
also enter the environment via various pathways, including wastewater effluent
discharge, runoff from land to which agricultural or human waste has been applied,
and leaching. Furthermore, antibiotics in the aquatic environment may persist and be
transported to reservoirs supplying source water to drinking water treatment plants.
Those described situations can be problematic because antibiotics residues can
provoke allergic reactions in some hypersensitive individuals. Different studies also
indicate that low-level doses of antibiotics for long periods could result in bacteria
resistance. On the other hand, the residues in milk can also slow or destroy the
growth of the fermentation of bacteria during the production of milk products.
In order to ensure human food safety, the European Union has set maximum residue
limits (MRLs) in milk for some antibiotics, although for some antibiotics it is indicated
that they cannot be used in animals from which milk is produced for human
consumption. For water, there are no national as well as international regulations but
its necessary to distill the existing health information such as ADI etc.
In this masters thesis, a selective method was developed to analyze several
antibiotics in milk and drinking water by high pressure liquid chromatography coupled
to mass spectrometry in a single analytical run after a solid phase extraction. The
selected antibiotics include two beta-lactames, four macrolides, one sulphonamide,
one diamino-pyrimidine derivate, two tetracyclines and one amphenicol.
The extraction procedure for milk, consisting of an extraction of the sample with
acetonitrile:water:acetic acid (10:90:0,1, v/v) with supernatant clean-up using polymer
SPE-cartridge BEKOlut LEOX was performed. Using the same SPE-cartridge,
another SPE method for drinking water sample preparation was also developed prior
to chromatographic analysis.

iii

Abstract

Chromatographic conditions were developed in order to obtain a fast separation in 13


minutes by use of HPLC column Kinetex-C18. The antibiotics were detected by
electrospray ionization in positive as well as in negative ion mode with multiple
reactions monitoring (MRM).
The developed method for milk was validated by adapting the Commission Decision
2002/EC/657 in terms of linearity, trueness, precision and stability with the exception
for CC and CC, which were replaced by LOD and LOQ in this thesis. With the
exception of recoveries to determine trueness, all parameters have acceptable
values and are in agreement with the criteria of Commission Decision 2002/657/EG.
Six of the analyzed antibiotics in milk did not reach the recovery criteria of the
Commission Decision (the criteria depends on concentration), but the recovery
criteria of IGV test lab between 70 120 % is fulfilled from all analytes in both low
and high concentration levels except azithromycin (55,5 % and 60,5 %) and
chloramphenicol (129 % and 145 %).
The developed method for drinking water could not deliver any recovery of
tetracyclines group (tetracycline and doxycycline). However, the recoveries of other
antibiotics groups, except sulfamethoxazole (recovery of 123 %), lied in acceptable
range between 70 120 %.

iv

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
Eidesstattliche Erklrung ......................................................................................................... i
Danksagung ........................................................................................................................... ii
Abstract ................................................................................................................................. iii
Abbildungsverzeichnis .......................................................................................................... vii
Tabellenverzeichnis ............................................................................................................... ix
Abkrzungsverzeichnis........................................................................................................... x
1.

2.

Einleitung ....................................................................................................................... 1
1.1

Problemstellung ...................................................................................................... 1

1.2

Zielsetzung .............................................................................................................. 2

Theoretischer Teil........................................................................................................... 4
2.1

2.1.1

Einleitung ......................................................................................................... 4

2.1.2

Untersuchte Antibiotika .................................................................................... 5

2.1.3

Chemische Eigenschaften und Stabilitt untersuchter Antibiotika..................... 9

2.2

Antibiotikarckstnde .............................................................................................12

2.2.1

Antibiotikarckstnde in Milch .........................................................................12

2.2.2

Antibiotikarckstnde in Wasser .....................................................................13

2.2.3

Risiken und Auswirkungen ..............................................................................14

2.3

Rechtliche Rahmenbedingungen............................................................................15

2.3.1

Gesetzlich festgelegte Rckstandshchstmengen ..........................................15

2.3.2

ADI-Werte (Acceptable Daily Intake) ...............................................................17

2.3.3

Kriterien der analytischen Methoden ...............................................................18

2.4

Analytik von Antibiotika ..........................................................................................18

2.4.1

Solid-Phase-Extraktion ....................................................................................19

2.4.2

LC-MS/MS-Technik .........................................................................................21

2.5
3.

Antibiotika ............................................................................................................... 4

Methodenvalidierung ..............................................................................................24

Material und Methoden ..................................................................................................29


3.1

Gerte und sonstige Materialien .............................................................................29

3.2

Chemikalien und Reagenzien .................................................................................29

3.2.1

Lsungsmittel ..................................................................................................29

3.2.2

Chemikalien und Reagenzien ..........................................................................29

3.2.3

Lsungen ........................................................................................................30

3.2.4

Standardlsungen ...........................................................................................30

3.2.5

Kalibrierreihe ...................................................................................................32

3.3

Extraktion und Aufreinigung mittels SPE ................................................................33

3.3.1

Milchprobe ......................................................................................................33

3.3.2

Wasserprobe ...................................................................................................34
v

Inhaltsverzeichnis

4.

3.4

LC-MS/MS Parameter ............................................................................................35

3.5

Validierung der Methode ........................................................................................36

3.5.1

Selektivitt und Spezifitt ................................................................................36

3.5.2

Arbeitsbereich .................................................................................................37

3.5.3

Linearitt .........................................................................................................37

3.5.4

Nachweis- und Bestimmungsgrenze ...............................................................37

3.5.5

Przision .........................................................................................................38

3.5.6

Richtigkeit/Wiederfindung ................................................................................39

3.5.7

Stabilitt ..........................................................................................................39

3.5.8

Matrix-Effekte ..................................................................................................39

Ergebnisse und Diskussion ...........................................................................................40


4.1

Entwicklung von LC-MS/MS-Methode ....................................................................40

4.2

Betimmung der Arbeitsbereiche .............................................................................43

4.3

Entwicklung der Extraktionsmethode fr Milch .......................................................46

4.3.1

Methodenauswahl und Optimierung ................................................................46

4.3.2

Vergleich der SPE-Sule .................................................................................49

4.4

Entwicklung der Extraktionsmethode fr Wasser ....................................................51

4.5

Validierung der Methode ........................................................................................53

4.5.1

Selektivitt (Spezifizitt) ..................................................................................53

4.5.2

Kalibrierbereich ...............................................................................................55

4.5.3

Linearitt .........................................................................................................56

4.5.4

Nachweis- und Bestimmungsgrenze ...............................................................57

4.5.5

Przision .........................................................................................................58

4.5.6

Richtigkeit/Wiederfindung ................................................................................61

4.5.7

Stabilitt ..........................................................................................................64

4.5.8

Matrix-Effekte ..................................................................................................65

5.

Zusammenfassung ........................................................................................................67

6.

Literaturverzeichnis .......................................................................................................69

7.

Anhang ..........................................................................................................................75
7.1

Formeln ..................................................................................................................75

7.2

Chromatogramme ..................................................................................................78

7.3

Kalibriergeraden (Milch) .........................................................................................84

7.4

Kalibriergeraden (Wasser)......................................................................................87

7.5

Matrix-Effekte (Milch) .............................................................................................90

7.6

Ergebnisse der Methodenentwicklung ....................................................................92

vi

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Chemische Struktur von Penicillin G und Ceftiofur ............................................ 5
Abbildung 2: Chemische Struktur von Tetracyclin und Doxycyclin ......................................... 6
Abbildung 3: Chemische Struktur von Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin, Tylosin .. 7
Abbildung 4: Chemische Struktur von Trimethoprim .............................................................. 8
Abbildung 5: Chemische Struktur von Sulfamethoxazol ......................................................... 9
Abbildung 6: Chemische Struktur von Chloramphenicol ........................................................ 9
Abbildung 7: Eintragspfade fr Arzneimittel in die aquatische Umwelt ..................................13
Abbildung 8: SPE-Gert mit Vakuum und SPE-Kartuschen unterschiedlicher Formate ........20
Abbildung 9: Prinzip der SPE-Methode ................................................................................21
Abbildung 10: Aufbauprinzip eines HPLC-Systems ..............................................................22
Abbildung 11: Octadecylsilan (ODS, C18) ............................................................................23
Abbildung 12: Schematische Darstellung der ESI-Ionisierung ..............................................24
Abbildung 13 XIC aller Analyten mit Fusion-RP in positivem Ionisierungsmodus..................41
Abbildung 14: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Fusion-RP ....................................42
Abbildung 15: XIC aller Analyten mit Kinetex C18 in positivem Ionisierungsmodus ............42
Abbildung 16: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Kinetex C18 ...............................42
Abbildung 17: Vergleich verschiedener Methoden ................................................................47
Abbildung 18: Wiederfindung untersuchter Antibiotika mit verschiedenen SPE-Sulen ........50
Abbildung 19: Vergleich der SPE-Sulen LEOX und LEOX Plus fr Wasserextraktion.........52
Abbildung 20: TIC Blank-Probe in positiver Ionisierung ........................................................53
Abbildung 21: TIC Blank-Probe in negativer Ionisierung .......................................................54
Abbildung 22: XIC Tetracyclin in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und im
Lsemittelstandard 1*MRL (c) ..............................................................................................54
Abbildung 23: XIC Penicillin G in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und im
Lsemittelstandard 1*MRL (c) ..............................................................................................55
Abbildung 24: RSDr und RSDwR bei niedrigem Konzentrationniveau ....................................60
Abbildung 25: RSDr und RSDwR bei mittlerem Konzentrationniveau .....................................61
Abbildung 26: RSDr und RSDwR bei hohem Konzentrationniveau .........................................61
Abbildung 27: Stabilittstest der Wirkstoffe in Milchmatrix mittels LC-MS/MS .......................64
Abbildung 28: Messwerte von Trimethoprim in Matrix- und Lsemittel .................................65
Abbildung 29: Messwerte von Tetracyclin in Matrix und Lsemittel ......................................65
Abbildung 30: Messwerte von Tylosin in Matrix- und Lsemittel ...........................................65
Abbildung 31: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Azithromycin K5 (20 g/L) ................................78
Abbildung 32: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Ceftiofur K4 (100 g/L) .....................................78
Abbildung 33: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Chloramphenicol K5 (4,5 g/L) .........................79
Abbildung 34: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Clarithromycin K4 (15 g/L) ..............................79
Abbildung 35: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Doxycyclin K5 (20 g/L) ...................................80
vii

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 36: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Erythromycin K4 (40 g/L) ................................80
Abbildung 37: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Penicillin G K4 (4 g/L) ....................................81
Abbildung 38: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Sulfamethoxazol K5 (20 g/L) ..........................81
Abbildung 39: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tetracyclin K4 (100 g/L) .................................82
Abbildung 40: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Trimethoprim K4 (50 g/L)................................82
Abbildung 41: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tylosin K5 (75 g/L) .........................................83
Abbildung 42: Kalibriergerade von Azithromycin (Milch) .......................................................84
Abbildung 43: Kalibriergerade von Ceftiofur (Milch) ..............................................................84
Abbildung 44: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Milch) .................................................84
Abbildung 45: Kalibriergerade von Clarithromycin (Milch) .....................................................84
Abbildung 46: Kalibriergerade von Doxycyclin (Milch) ..........................................................85
Abbildung 47: Kalibriergerade von Erythromycin (Milch) .......................................................85
Abbildung 48: Kalibriergerade von Penicillin G (Milch)..........................................................85
Abbildung 49: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Milch) .................................................85
Abbildung 50: Kalibriergerade von Tetracyclin (Milch) ..........................................................86
Abbildung 51: Kalibriergerade von Trimethoprim (Milch) ......................................................86
Abbildung 52: Kalibriergerade von Tylosin (Milch) ................................................................86
Abbildung 53: Kalibriergerade von Azithromycin (Wasser) ...................................................87
Abbildung 54: Kalibriergerade von Ceftiofur (Wasser) ..........................................................87
Abbildung 55: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Wasser) .............................................87
Abbildung 56: Kalibriergerade von Clarithromycin (Wasser) .................................................88
Abbildung 57: Kalibriergerade von Erythromycin (Wasser) ...................................................88
Abbildung 58: Kalibriergerade von Penicillin G (Wasser) ......................................................88
Abbildung 59: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Wasser) .............................................88
Abbildung 60: Kalibriergerade von Trimethoprim (Wasser) ...................................................89
Abbildung 61: Kalibriergerade von Tylosin (Wasser) ............................................................89
Abbildung 62: Vergleich der Messwerte von Azithromycin in Lsemittel- und in Matrix.........90
Abbildung 63: Vergleich der Messwerte von Ceftiofur in Lsemittel- und in Matrix ...............90
Abbildung 64: Vergleich der Messwerte von Chloramphenicol in Lsemittel- und in Matrix ..90
Abbildung 65: Vergleich der Messwerte von Clarithromycin in Lsemittel- und in Matrix ......90
Abbildung 66: Vergleich der Messwerte von Doxycylin in Lsemittel- und in Matrix ..............90
Abbildung 67: Vergleich der Messwerte von Erythromycin in Lsemittel- und in Matrix ........90
Abbildung 68: Vergleich der Messwerte von Penicillin G in Lsemittel- und in Matrix ...........91
Abbildung 69: Vergleich der Messwerte von Sulfamethoxazol in Lsemittel- und in Matrix ...91
Abbildung 70: Vergleich der Messwerte von Tetracyclin in Lsemittel- und in Matrix ............91
Abbildung 71: Vergleich der Messwerte von Trimethoprim in Lsemittel- und in Matrix ........91
Abbildung 72: Vergleich der Messwerte von Tylosin in Lsemittel- und in Matrix..................91
Abbildung 73: Double-Peak bei Makroliden mit PSM-Gradient .............................................92
viii

Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: pK-Werte untersuchter Antibiotika ........................................................................11
Tabelle 2: Festgelegte Rckstandshchstmengen in Milch in g/kg nach der Verordnung
(EG) Nr. 37/2010 ..................................................................................................................16
Tabelle 3: Aktuelle vorhandene ADI-Werte verschiedener Antibiotika nach JECFA sowie
nach CVMP/EMEA in g/kg KG............................................................................................17
Tabelle 4: Standardsubstanzen fr die Validierung ..............................................................31
Tabelle 5: Herstellung der Standardmix fr Milch .................................................................32
Tabelle 6: Herstellung der Standardmix fr Wasser ..............................................................32
Tabelle 7: Herstellung der Kalibrierreihe fr Milch ................................................................32
Tabelle 8: Herstellung der Kalibrierreihe fr Wasser .............................................................33
Tabelle 9: LC-Konfiguration ..................................................................................................35
Tabelle 10: Gradientzusammensetzung fr die LC ...............................................................35
Tabelle 11: MS/MS-Konfiguration .........................................................................................36
Tabelle 12: MRM-bergange der einzelnen Analyten...........................................................36
Tabelle 13: Zudotiertes Volumina der Antibiotikastandard-Mix und Analyt-Endkonzentration
in den Proben .......................................................................................................................38
Tabelle 14: Arbeitsbereich fr Milch in g/kg und Relationskoeffizient jeweiliger
Kalibriergeraden ...................................................................................................................45
Tabelle 15: Arbeitsbereich fr Wasser in ng/L und Relationskoeffizient jeweiliger
Kalibriergeraden ...................................................................................................................45
Tabelle 16: Vergleich verschiedener Extraktionsmethoden zur Antibiotikauntersuchung
mittels SPE...........................................................................................................................48
Tabelle 17: Linearitt der Kalibrierfunktionen einzelner Wirkstoffe nach Mandel F-Test und
Bestimmtheitsma R2 ...........................................................................................................56
Tabelle 18: Nachweis- und Bestimmungsgrenze nach DIN 32645 .......................................57
Tabelle 19: Wiederholprzision RSDr und Laborprzision RSDwR in % .................................59
Tabelle 20: Wiederfindungsrate in % bei niedrigen Konzentrationen ....................................62
Tabelle 21: Wiederfindungsrate in % bei hohen Konzentrationen .........................................62
Tabelle 22: WFR Milchextraktion in % - Methodenvergleich (n=3) ........................................92
Tabelle 23: WFR Milchextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3) ...................................93
Tabelle 24: WFR Wasserextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3) ...............................93

ix

Abkrzungsverzeichnis

Abkrzungsverzeichnis
a

Achsenabschnitt

Irrtumwahrscheinlichkeit

ACN

Acetonitril

AM

Azithromycin

amu

Atomare Masseneinheit (atomic mass unit)

APCI

Chemische Ionisation unter Atmosphrendruck (atmospheric pressure


chemical ionization)

API

Ionisation unter Atmosphrendruck (atmospheric pressure ionization)

Steigung

Massenkonzentration

BG

Bestimmungsgrenze

Konzentration

CAP

Chloramphenicol

CC

Entscheidungsgrenze (decision limit)

CC

Nachweisvermgen (detection capability)

CE

Kollisionsenergie (collision energy)

CEFT

Ceftiofur

CM

Clarithromycin

CV

Cone Voltage

CVMP

Committee for Veterinary Medicinal Products

CXP

Zellausgangsspannung (cell exit potential)

DC

Doxycyclin

EG

Europische Gemeinschaft

EI

Elektronenstoionisation

EM

Erythromycin

EMEA

Europische Arzneimittelagentur (European Agency for the Evaluation


of Medicinal Products)

ESI

Elektrospray-Ionisation

EU

Europische Union

EWG

Europische Wirtschaftsgemeinschaft

Extr.

Extrakt

Faktor

Abkrzungsverzeichnis

FAO

Food and Agriculture Organization

GefstoffV

Gefahrstoffverordnung

HPLC

Hochleistungsflssigkeitschromatographie

ISTD

Interner Standard

JECFA

Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives

kg

Kilogramm

Konz.

Konzentration

Liter

LC

Flssigchromatographie (liquid chromatography)

Mikrogramm

Masse

ml

Milliliter

m/z

Masse zu Ladung - Verhltnis

max.

maximal

MeOH

Methanol

min

Minute

MRL

maximale Rckstandshchstmengen (maximum residue limits)

MRM

multiple reaction monitoring

MS

Massenspektrometrie / Massenspektrometer

MS/MS

Tandem-Massenspektrometrie / -Massenspektrometer

MW

Mittelwert

ni

Anzahl Bestimmungen an einer Probe, Anzahl der Proben

NWG

Nachweisgrenze

n.n.

nicht nachweisbar

p.a.

zur Analyse (pro analysis)

ng

Nanogramm

Wahrscheinlichkeit

PE

Polyethylen

Pen G

Penicillin G

ppm

parts per million (1:106)

ppb

parts per billion (1:109)

ppt

parts per trillion (1:1012)

Q1

Quadrupol 1

q2

Quadrupol 2 (Kollisionszelle)
xi

Abkrzungsverzeichnis

Q3

Quadrupol 3

R2

Bestimmtheitsma

RL

Richtlinie

RP

Umkehrphase (reversed phase)

rpm

Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RSD

relative Standardabweichung (relative standard deviation)

RSDr

Wiederholprzision (repeatability)

RSDwR

Laborprzision (within-laboratory reproducibility)

RT

Retentionszeit (retention time)

SD

Standardabweichung (standard deviation)

SMTX

Sulfamethoxazol

SPE

Festphasenextraktion (solid phase extraction)

STD

Standard

Zeit (time)

TC

Tetracyclin

TCA

Trichloressigsure

TIC

total ion current chromatogram

TMP

Trimethoprim

TYL

Tylosin

Umdrehung

UV

ultraviolet

Volumen

v/v

Volumen pro Volumen (volume per volume)

VE

voll entsalzt

VK

Variationskoeffizient

WFR

Wiederfindungsrate

WHO

World Health Organization

XIC

Extracted-ion chromatogram

Ladung eines Ions

xii

Einleitung

1.

Einleitung

1.1

Problemstellung

Im Vergleich zu den anderen pharmazeutischen Wirkstoffgruppen wie Hormone,


Analgetika, Vitamine u. v. m. werden Antibiotika mit 70 % am hufigsten in der
Veterinrmedizin eingesetzt, um Krankheiten vorzubeugen und kranke Tiere zu
behandeln. Vor allem werden Antibiotika der Klassen Tetracycline, Sulfonamide,
Aminoglykoside, -Lactame sowie Makrolide verschrieben [RDER, 2007].
Lebensmittel, die von behandelten Tieren stammen wie z. B. Milch, knnen daher
Antibiotikarckstnde

enthalten.

Laut

BVL

Jahresbericht

zum

Nationalen

Rckstandskontrollplan im Jahr 2012 wurde Penicillin G (Benzylpenicillin) in einer


von 404 untersuchten Milchproben mit einem Gehalt von 10,9 g/kg nachgewiesen,
wobei der zugelassene Rckstandshchstgehalt 4 g/kg betrgt [BVL, 2012].
Auch in den Ausscheidungen behandelter Tiere sind Antibiotikarckstnde
nachweisbar. Durch das Ausbringen von Glle und Mist knnen diese Rckstnde
auf Oberflchengewsser gelangen, welche fr die Herstellung von Trinkwasser
verwendet und/oder von den Pflanzen aufgenommen werden. Es ist somit
auszuschlieen, dass der Transfer dieser Wirkstoffe in pflanzliche Lebensmittel
generell

mglich

ist.

Nach

einer

Literaturstudie

des

Bundesinstitutes

fr

Risikobewertung (BfR) wurden in 13 verschiedenen pflanzlichen Matrizen positive


Befunde von 22 pharmakologischen Wirkstoffen oberhalb der jeweiligen analytischen
Bestimmungsgrenzen nachgewiesen, wobei es sich bei dem Groteil der Wirkstoffe
um Antibiotika handelt [BFR, 2011].
Antibiotikarckstnde

knnen

problematisch

sein,

da

diese

das

Fermentationswachstum von Mikroorganismen verlangsamen oder zerstren sowie


allergische Reaktionen bei berempfindlichen Menschen hervorrufen knnen.
Verschiedene Studien haben auch gezeigt, dass diese Low-Level-Dosen von
Antibiotika ber lngere Zeit zu Bakterienresistenzen fhren [MARTNEZ-HUELAMO et
al., 2009].

Einleitung

Aus der tierischen und menschlichen Sicht sind eine verantwortungsvolle


Verwendung von Antibiotika in Tieren sowie die dafr innerhalb der Europischen
Union durchgefhrten berwachungsprogramme von groer Bedeutung. Im Hinblick
auf den Nachweis von Antibiotika in Milch und Milchprodukten sowohl fr die
Qualittskontrolle als auch fr regulatorische Zwecke, kommt ein umfangreiches Feld
von

Analysenmethoden

mit

mikrobiologischen

Testverfahren,

(schnellen)

immunchemischen Tests oder instrumentellen Methoden (d. h. LC-MS/MS) zum


Einsatz. Jede Analysenmethode hat ihre eigene Strke und Einschrnkungen.
Im nchsten Kapitel wird der Einsatz von Antibiotika in Tieren, gefolgt mit einer
Vorstellung der geregelten Rckstandshchstmengen gem der Verordnung (EG)
Nr. 37/2010, sowie die fr die Antibiotikaanalyse verwendete Methode mit den
Anforderungen der EU bezglich der Analyse von Tierarzneimittelrckstnden
gem der Kommissionsentscheidung Nr. 2002/657/EG, die die Kriterien fr die
Durchfhrung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen zur
Umsetzung der Richtlinie 96/23/EC ber Manahmen zur Kontrolle bestimmter Stoffe
und ihrer Rckstnde in lebenden Tieren und tierischen Erzeugnissen definiert,
beschrieben.

1.2

Zielsetzung

In der Verordnung (EG) Nr. 37/2010 sind fr Antibiotika Hchstmengen (MRLs)


festgesetzt. Somit sollte eine sichere Kontrolle fr diese Wirkstoffe durch eine
validierte, leistungsfhige analytische Methode gewhrleistet werden.
Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, eine LC-MS/MS-Multimethode fr die
Bestimmung von elf Antibiotika aus sechs verschiedenen Wirkstoff-Gruppen: Lactame (Penicillin G und Ceftiofur), Makrolide (Azithromycin, Clarithromycin,
Erythromycin und Tylosin), Tetracyline (Tetracyclin, Doxycyclin), Sulfamethoxazol,
Trimethoprim und Chloramphenicol in Milch sowie in Trinkwasser zu entwickeln.
Diese Multimethode soll in der Lage sein, diese Wirkstoffe gleichzeitig zu extrahieren
und dann simultan in einem chromatographischen Lauf massenspektrometrisch zu
besttigen und zu quantifizieren.

Einleitung

Ein weiteres Ziel war, die entwickelte Methode fr Milch zu validieren. Die
Validierung sollte den gesetzlichen Anforderungen der Kommissionsentscheidung
2002/657/EG entsprechen. Die Umsetzung erfolgte mit dem Programm VALISTAT,
angepasst durch GTFCh. Als Validierungsparameter werden Selektivitt (Spezifitt),
Arbeitsbereich, Linearitt, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Przision, Richtigkeit,
Stabilitt und Matrix-Effekte untersucht.

Theoretischer Teil

2.

Theoretischer Teil

2.1

Antibiotika

2.1.1 Einleitung
Antibiotika

werden

von

Pilzen

oder

Bakterien

produziert.

Durch

seine

bakteriostatische oder bakterizide Wirkung kann Antibiotika das Wachstum von


Bakterien hemmen oder diese abtten [LSCHER, 2010].
Nach GRFE werden Antibiotika nach Herkunft, biologischer Wirkung, chemischer
Struktur, Biosyntheseweg sowie Wirkmechanismus klassifiziert [GRFE, 1992]. In der
vorliegenden

Arbeit

ist

zur

Entwicklung

einer

analytischen

Methode

zur

Untersuchung von Antibiotika die Klassifizierung nach chemischer Struktur von


groer Bedeutung. Von KROKER et al. (Veterinrmedizinische Fakultt, Freie
Universitt Berlin) wird eine Klassifizierung nach chemischer Struktur in 13 Gruppen
genannt [KROKER et al., 2002]:
1.

Beta-Lactame

2.

Aminoglykoside

3.

Tetracycline

4.

Makrolide

5.

Lincosamide

6.

Polypeptidantibiotika

7.

Amphenicole

8.

Pleuromutiline

9.

Sulfonamide

10. Trimethoprim
11. Nitrofurane
12. Nitroimidazole
13. 4-Chinolone (Gyrasehemmer)

Theoretischer Teil

Die meisten Antibiotika sind amphotere und polare Substanzen [RDER, 2007]. In
dieser Arbeit werden jedoch nur die sechs zu untersuchenden Antibiotikagruppen
ber ihre chemischen Strukturen und Eigenschaften diskutiert.
2.1.2 Untersuchte Antibiotika
2.1.2.1

-Lactame

Charakteristisch fr alle -Lactam-Antibiotika ist der viergliedrige -Lactam-Ring


[CLARK, 2006]. Zu -Lactam-Antibiotika gehren zwei Untergruppen Penicilline (aus
6-Aminopenicillansure) und Cephalosporine (aus 7-Aminocephalosporansure),
[MARTNEZ-HUELAMO et al., 2009], die in der Veterinrmedizin hauptschlich
eingesetzt werden [QUANDT, 2006].
In dieser Arbeit werden zwei Wirkstoffe dieser Familie untersucht, und zwar Penicillin
G (Benzylpenicillin) als Vertreter der Penicilline und Ceftiofur aus der Untergruppe
Cephalosporine.

Abbildung 1: Chemische Struktur von Penicillin G und Ceftiofur nach KROKER et al.
[2002]

2.1.2.2

Tetracycline

Das fr alle Tetracycline charakteristische viergliedrige Ringsystem (sog. Tetracen)


hat zur Namensgebung dieser Antibiotikagruppe gefhrt [ALTHAUS et al., 2013]. An
die vier linear kondensierten 6er-Ringe sind verschiedene funktionelle Gruppen

Theoretischer Teil

angehngt. Fr Tetracycline gilt eine hohe Affinitt zu zwei- und dreiwertigen


Kationen (Ca2+, Mg2+, Fe3+) unter der Bildung von nicht resorbierbaren
Chelatkomplexen. Tetracycline sind typische Vertreter von Breitbandantibiotika
[SATTELBERGER et al., 2005]. Nach einer Studie der FEDESA (European Federation
of Animal Health) in 1997 waren Tetracycline in der EU mit 66 % die am hufigsten
eingesetzten Veterinrantibiotika [STEINBERG et al., 2003]. In dieser Arbeit werden
zwei Mitglieder dieser Gruppe untersucht, und zwar Tetracyclin und Doxycyclin. Ihre
chemischen Strukturen werden nach KROKER et al. in der folgenden Abbildung
dargestellt.

Abbildung 2: Chemische Struktur von Tetracyclin und Doxycyclin nach KROKER et al.
[2002]

2.1.2.3

Makrolide

Nach der Studie der FEDESA im Jahr 1997 stellen die Makrolide mit 12 % die nach
den

Tetracyclinen

am

hufigsten

genutzte

Antibiotika-Gruppe

in

der

Veterinrmedizin dar [STEINBERG et al., 2003].


Makrolide bestehen aus einem 14- bis 16-gliedrigen Laktonring, wonach diese
Klasse in drei Untergruppen unterteilt wird. An ein bis drei Stellen ist der Laktonring
an glykosidisch gebundenen Amino- oder Neutralzuckern gebunden. Dadurch
erhalten Makrolide einen basischen Charakter und sind im sauren Milieu sehr
instabil. [FREY, 2007]

Theoretischer Teil

Erythromycin ist der erste Vertreter der Makrolid-Antibiotika und wurde 1952 aus
Streptomyces erythreus isoliert [QUANDT, 2006]. Mittlerweile werden Makrolide
ausgehend von dieser Grundstruktur halb- oder vollsynthetisch hergestellt.
Zustzlich ist Ester- und Salzbildung mglich [KROKER et al., 2002].
In der Veterinrmedizin werden Makrolide wie Erythromycin und Tylosin
beispielsweise zur Therapie von Atemwegserkrankungen angewendet, wobei
Azithromycin und Clarithromycin in der Humanmedizin zum Einsatz kommen [FREY,
2007].
In der folgenden Abbildung werden die chemischen Strukturen der in dieser Arbeit
vier zu untersuchenden Makrolid-Antibiotika gezeigt.

Abbildung 3: Chemische Struktur von Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin,


Tylosin nach KROKER et al. [2002] und OGACH [2006]

Theoretischer Teil

2.1.2.4

Trimethoprim

Trimethoprim ist ein Derivat des 2,4-Diaminopyrimidins. Es handelt sich hierbei um


einen Antimetaboliten des Folsurestoffwechsels [QUANDT, 2006].
In der Veterinrmedizin wird Trimethoprim hufig in Kombination mit Sulfonamiden
eingesetzt [QUANDT, 2006]. Durch die Kombination verschiedener Sulfonamide mit
Trimethoprim kann eine Potenzierung der Solfonamideffekte und damit eine
Steigerung der antimikrobiellen Wirksamkeit dieser Substanzen erreicht werden
[KROKER et al., 2002].

Abbildung 4: Chemische Struktur von Trimethoprim [www.sigmaaldrich.com]

2.1.2.5

Sulfonamide

Damals waren Sulfonamide die wichtigsten Antibiotika, bevor Penicillin eingefhrt


wurde. Die Bezeichnung Sulfonamid wird in der organischen Chemie fr alle Amide
aromatischer Sulfonsuren verwendet. Sie werden rein synthetisch aus dem
Grundgerst Sulfanilamid hergestellt. [QUANDT, 2006]
Laut der FEDESA-Studie im Jahr 1997 kamen in der Veterinrmedizin europaweit
nur 2,1 % Sulfonamide einschlielich Trimethoprim zum Einsatz. Zu den in der
Veterinrmedizin hufig eingesetzten Sulfonamiden gehrt auch der Wirkstoff
Sulfamethoxazol, welcher in der vorliegenden Arbeit untersucht werden soll.
Die chemische Struktur von Sulfamethoxazol wird in der folgenden Abbildung
dargestellt.

Theoretischer Teil

Abbildung 5: Chemische Struktur von Sulfamethoxazol nach KROKER et al. [2002]

2.1.2.6

Amphenicole

Amphenicole ist eine Antibiotikagruppe mit einer Phenylpropanoide-Struktur. Der


bekannteste Stoff dieser Gruppe ist Chloramphenicol [STEINBERG et al., 2003]. Im
Molekl findet man zwei fr Naturstoffe ungewhnliche Gruppen: eine aromatische
Nitrogruppe und einen Dichloroacetamido-Rest. Innerhalb der EU ist seit 1994 die
Anwendung von Chloramphenicol bei lebensmittelliefernden Tieren verboten
[BALTES

UND

MATISSEK, 2011]. Jedoch gab es trotz des Verbots noch ein Zeichen,

dass dieser Stoff immer noch eingesetzt wurde. Nach der Durchfhrung des
nationalen Rckstandskontrollplans im Erzeugerbetrieb wurden im Jahr 1999
positive Befunde in vier von 878 Proben beim Kalb, zwei von 1215 Proben beim
Mastrind und einer von 181 Proben bei Khen nachgewiesen [STEINBERG et al.,
2003].

Abbildung 6: Chemische Struktur von Chloramphenicol [www.gbiosciences.com]

2.1.3 Chemische Eigenschaften und Stabilitt untersuchter Antibiotika


Die

Entwicklung

einer

praktikablen

Analysenmethode,

welche

gleichzeitig

verschiedene Antibiotika analysieren kann, ist durch unterschiedliche physikalische

Theoretischer Teil

und chemische Eigenschaften einzelner Antibiotika eine groe Herausforderung.


Beispielsweise haben Antibiotika einen breiten Umfang von pKs-Werten, z. B. 7,5 9
bei Makroliden, 3 4, 7 8 und 9 10 bei Tetracyclinen. Daher ist es wichtig, ein
richtiges

Gleichgewicht

von

analytischen

Bedingungen,

insbesondere

der

physikalisch-chemischen Eigenschaften zu bercksichtigen und zu definieren. Dazu


zhlen die Lslichkeit, pK-Werte, chemische und thermische Stabilitt sowie die
Polaritt. [WANG et al., 2012]
-Lactame sind empfindlich gegenber Suren und Basen und diese Empfindlichkeit
variiert je nach Seitenkette. Im sauren Milieu des Magens sind sie stabil [ALTHAUS et
al., 2005]. Bei einer monobasischen Verbindung wie Penicillin G liegt die maximale
Stabilitt im pH-Bereich 6 7 [W ANG et al., 2012].
Makroliden sind einfache und lipophile makrocyclischen Lactone, die in Wasser
wenig lslich, aber in organischen Lsungsmitteln gut lslich sind. Im Allgemeinen
sind neutrale oder leicht basische Bedingungen gewhlt, um Makrolide zu
extrahieren. Somit wird der Abbau von einigen Mitgliedern dieser Gruppe, wie
Erythromycin, das in einer sauren Umgebung abgebaut werden kann, vermieden.
[W ANG et al., 2012]
Tetracycline knnen unter extremen pH-Werten mit starken Suren sowie Basen
durch Epimerisierung (im Bereich pH 2 6), Dehydrierung, Isomerisierung und
andere Prozesse abgebaut werden [HU Berlin].
Ein pH-Wert von 4 wurde am hufigsten fr die Extraktion von Tetracyclinen aus
verschiedenen Matrizen gewhlt. Es gibt eine Tendenz der Tetracycline zur Bildung
von Chelatkomplexen mit Metallionen, welche mit Matrixkompenenten binden und zu
Problemen bei der Analyse fhren knnen. [WANG et al., 2012]
Chloramphenicol ist eine hochpolare, stabile Verbindung, welche in der Regel sich
unter neutralen Bedingungen in wssrigen Pufferlsungen und/oder polaren
organischen Lsungsmitteln extrahieren lsst [W ANG et al., 2012].
Die genaueren pK-Werte der untersuchten Antibiotika sind in der Tabelle 1 zu finden.

10

Theoretischer Teil
Tabelle 1: pK-Werte untersuchter Antibiotika [WANG et al., 2012]

Antibiotikaklasse
Beta-Lactame

Makroliden

Wirkstoff
Penicillin G

2,7

Ceftiofur

n/a

Azithromycin

8,7
9,5

Clarithromycin

8,99

Erythromycin

8,6

Tylosin

7,7

Tetracyclin

3,3
7,7
9,7

Doxycyclin

3,2
7,6
8,9
11,5

Sulfamethoxazol

5,6

Tetracyclinen

Sulfonamide

pK-Werte

DiaminopyrimidinTrimethoprim
derivate

6,6

Amphenicol

n/a

Chloramphenicol

11

Theoretischer Teil

2.2

Antibiotikarckstnde

2.2.1 Antibiotikarckstnde in Milch


Milchproduzierende Khe, die mit Antibiotika behandelt werden, produzieren Milch,
die Antibiotikarckstnde enthlt. Daher sollten behandelte Khe fr einen
bestimmten Zeitraum von der Milchversorgung ausgeschlossen werden, um
sicherzustellen, dass die Antibiotikarckstnde in ihrer Milch nicht mehr bleiben.
Management-Fehler nach medikamentser Behandlung von Khen sind also der
Hauptgrund, der Antibiotikarckstnde in Milch verursacht [KNAPPSTEIN et. al., 2004].
Es gibt viele Wege fr das Entstehen von Antibiotikarckstnden in Milch. Dabei wird
zwischen

sekretorischer

und

postsekretorischer

Kontamination

der

Milch

unterschieden.
Unter sekretorischer Kontamination wird das Gelangen von Antibiotika ber den
Stoffwechsel des Tieres in die Milch verstanden. Sie ist u. a. abhngig von der
Resorption, Fettlslichkeit und

Persistenz in den verschiedenen Organsystemen

[TPEL, 2004]. Als die hufigste Ursache ist es, dass die Wartezeit nach
Antibiotikabehandlung unabsichtlich nicht eingehalten wurde: z. B. keine richtige
Kennzeichnung, so dass dies zu Verwechslungen fhrt [BAUMGARTNER, 2008]. Bei
unsachgemer Anwendung von Arzneimitteln, wie z. B. berdosierung kann es
ebenfalls zu einer Kontamination kommen, da Wartezeiten nur fr die jeweilige
zugelassene Anwendungsart und Dosierung gelten.
Auch die Ftterung von Antibiotika-haltigem Futter fhrt zu Antibiotikarckstnden in
Milch [TPEL, 2004].
Jedoch erfolgt die Kontamination der Tankmilch in ber 50 % der Flle erst nach
dem Melken (postsekretorische Kontamination). Als Ursache dafr sind u. a. falsche
Melkreihenfolge (d. h. die behandelten Khe werden nicht zuerst gemolken),
kontaminiertes Melkgeschirr, ungengende Zwischenreinigung von Leitungen bzw.
Oberflche oder Kontamination von Antibiotika ber Melkpersonal (kontaminierte
Hnde). [BREMUS, 2012]

12

Theoretischer Teil

2.2.2 Antibiotikarckstnde in Wasser


Veterinrantibiotika knnen in erster Linie auf landwirtschaftlich genutzte Bden
gelangen [RDER, 2007], whrend Humanpharmazeutika im Gegensatz dazu nach
therapeutischer Anwendung von Medikamenten, aber auch durch unsachgeme
Entsorgung unverbrauchter Arzneimittel ber die Toilette in kommunale Abwsser
gelangen knnen [RNNEFAHRT et al., 2012].
Wirkstoffe, die in der Klranlage ungengend zurckgehalten oder abgebaut werden,
knnen

in

Oberflchengewsser,

vor

allem

in

Flsse,

bergehen.

Trinkwasserbrunnen, die sich in unmittelbarer Nhe zu Flssen befinden, knnen


einen erheblichen Anteil von Wasser aus diesen Gewssern frdern (sogenanntes
Uferfiltrat). Das Wasser wird zwar filtriert und biologisch gereinigt, aber es ist
mglich,

dass

Wirkstoffe

aus

den

Oberflchengewssern

bis

in

die

Trinkwasserbrunnen gelangen. [LFU BAYERN, 2010]

Abbildung 7: Eintragspfade fr Arzneimittel in die aquatische Umwelt [TRK, 2007]

13

Theoretischer Teil

Laut der Publikation des Umweltbundesamtes aus dem Jahr 2011 wurden
deutschlandweit 51 Einzelwirkstoffe im Trinkwasser untersucht, wobei 23 davon
positiv waren [BERGMANN et al., 2011]. In einem Risiko-Untersuchungsprogramm des
bayerischen Landesamtes fr Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL) im Jahr
2007 waren in fnf der insgesamt 84 untersuchten Trinkwasserproben, die aus
oberflchenwasserbeeinflussten Wasserversorgungsanlagen in Bayern stammen,
Rckstnde von Sulfamethoxazol mit Konzentrationen zwischen 0,019 und 0,056
g/L feststellbar. [LFU BAYERN, 2010]
Jedoch gibt es fr Arzneimittel weder national noch international gesetzlich
festgelegte Trinkwasser-Grenzwerte. Gem 6 Abs. 1 TrinkwV 2001 drfen im
Wasser fr den menschlichen Gebrauch chemische Stoffe, also auch Arzneistoffe,
nicht in gesundheitsschdlichen Konzentrationen enthalten sein [TRINKWV, 2001].
Deshalb ist es notwendig, eine Aussage ber gesundheitliche Wirkung mit Hilfe der
ADI-Werte oder anderer gesundheitlicher Leitwerte z. B. aus anderen Institutionen zu
bilden.

2.2.3 Risiken und Auswirkungen


Durch

die

Konsumption

Lebensmittelprodukten,

die

von
mit

Milch

und

Milchprodukten

Antibiotikarckstnden

sowie

kontaminiert

anderen
sind,

ist

insbesondere bei berempfindlichen Menschen die Auslsung von Allergien als


bedeutsames toxikologisches Risiko anzusehen. Bis heute gelten noch die Lactam-Antibiotika, vor allem Penicilline, als die Hauptursache fr die allergischen
Reaktionen [TORRES et. al., 2003]. Darber hinaus werden allergische Reaktionen
auf Tetracyclinen und Makroliden nach dem Konsum von Lebensmitteln, die mit
Antibiotikarckstnden belastet sind, berichtet [W OODWARD, 1991].
Reaktionen auf die Aufnahme von Antibiotika knnen sofort oder spter kommen,
wobei als mgliche klinische Symptome z. B. mehr oder weniger schwere
Hautreaktionen, aber auch anaphylaktischer Schock sein knnen [WOODWARD, 1991;
BLANCA et. al. 2002].

14

Theoretischer Teil

Ein weiteres Risiko ist das zunehmende Auftreten bakterieller Resistenzen. So wird
eine Therapie von Patienten, die mit antibiotikaresistenten Bakterien infiziert worden
sind,

sehr

schwierig

und

sogar

unmglich.

Laut

Schtzungen

der

Weltgesundheitsorganisation (WHO) ist jhrlich etwa ein Drittel aller Todesflle auf
Infektionen zurckzufhren. Die Aufnahme von bereits resistenten Bakterien ber
tierische Lebensmittel oder der Austausch von Resistenzgenen zwischen nicht
pathogenen Bakterien und Krankheitserreger stellen groe Risiken dar. Die zwischen
Mensch und Tier bertragbaren Krankheiten (Zoonosen) sind wegen ihrer schlechten
Therapierbarkeit ein besonderes Risiko, wie zum Beispiel Darminfektionen durch
Salmonellen. [MICHEL, 2010]
Hinsichtlich der Milchverarbeitungsbetriebe gibt es technologische Probleme bzw.
Risiken, die durch kontaminierte Milch hervorgerufen werden knnen. Die
Rckstnde in der kontaminierten Milch knnen die fr Fermentation bentigten
Milchsurebakterien abtten, so dass dies zu Verlusten bei der Herstellung von
fermentierten Milchprodukten wie Joghurt, Kse, Butter und Sauermilcherzeugnissen
fhren kann [QUANDT, 2006].

2.3

Rechtliche Rahmenbedingungen

2.3.1 Gesetzlich festgelegte Rckstandshchstmengen


Die Rckstandsfreiheit von Milch wird schon seit langem gefordert. Im LMBG
(Lebensmittel- und Bedarfsgegenstndegesetz) in der Fassung von 1974, wird aus
Grnden

des Verbraucherschutzes die weitgehende

Rckstandsfreiheit von

Lebensmitteln gefordert. Da eine absolute Rckstandsfreiheit unter Bercksichtigung


der Mglichkeiten der modernen Rckstandsanalytik bei behandelten Tieren kaum
erreicht werden kann, muss bei der Beurteilung zwischen akzeptablen und nicht
akzeptablen Rckstnden unterschieden werden.
Im Jahr 1990 wurden in der Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 sog. MRL-Werte
(Maximum Residue Limit bzw. Rckstandshchstmengen) definiert [HEESCHEN,
2010]. Nach ber 20 Jahren wurde diese Verordnung 2009 durch die EURckstandshchstmengen-Verordnung VO (EG) Nr. 470/2009 ersetzt, die seit

15

Theoretischer Teil

Februar 2010 durch die Verordnung (EU) Nr. 37/2010 ergnzt wird. In dieser
Verordnung sind alle MRL-Werte pharmazeutisch wirksamer Substanzen, welche in
der Verordnung (EG) Nr. 470/2009 zugelassen sind, je nach Art der tierischen
Lebensmittelprodukte geregelt.
Tabelle 2: Festgelegte Rckstandshchstmengen in Milch in g/kg nach der
Verordnung (EG) Nr. 37/2010

Wirkstoff

MRL in Milch
[g/kg]

Benzylpenicillin (Penicillin G)

Antibiotikaklasse

Beta-Lactame

Ceftiofur

100

Azithromycin

Clarithromycin

Erythromycin

40

Tylosin

50

Tetracyclin

100

Doxycyclin

Sulfonamide

Sulfamethoxazol

Diaminopyrimidin

Trimethoprim

Amphenicol

Chloramphenicol

Makroliden

Tetracyclinen

50
nicht zugelassen

Die MRL-Werte sind aus den Anhngen der ehemaligen VO 2377/90 beibehalten,
jedoch in neuer Sortierung aufgefhrt. Unterschieden wird in zulssige Stoffe
(Tabelle 1 der Verordnung) und verbotene Stoffe (Tabelle 2 der Verordnung).
Diese

Regelungen

werden

auch

im

LFGB

(Lebensmittel-

und

Futtermittelgesetzbuch), 10, aufgegriffen. Demnach ist es verboten, tierische


Lebensmittel

in

den

Verkehr

zu

bringen,

wenn

Tierarzneimittel

mit

Anwendungsverbot eingesetzt wurden, Hchstmengen berschritten wurden oder


festgelegte Wartezeiten nicht eingehalten wurden.
Demzufolge wird ein Antibiotika-haltiges Produkt bei berschreitung des jeweiligen
MRL-Werts (also konzentrationsabhngig) unter lebensmittelrechtlichen Aspekten als
nicht verkehrsfhig beurteilt.

16

Theoretischer Teil

2.3.2 ADI-Werte (Acceptable Daily Intake)


Bei der Festlegung von Rckstandshchstmengen bzw. MRL fr Antibiotika wird sog.
mikrobiologischer ADI-Wert (Acceptable Daily Intake) verwendet [EMEA/CVMP,
2002].

Zum

Beispiel

Rckstandshchstmengen

fr

Trinkwasserprobe,

vorhanden

sind,

wobei

knnen

keine

zur

festgelegten

Beurteilung

des

regelmigen tglichen Trinkwassergebrauchs ADI-Werte verwendet werden. Der


ADI-Wert wird in der Einheit mg pro Kilogramm Krpergewicht [mg/kg KG]
angegeben.
In der folgenden Tabelle werden vorhandene ADI-Werte in g/kg KG/Tag fr die
untersuchten Wirkstoffe nach dem Expertengremium der JECFA (Joint FAO/WHO
Expert Committee of Food Additives) sowie nach CVMP (Committee for Medicinal
Products for Veterinary Use)/EMEA (European Medicines Agency) dargestellt.
Tabelle 3: Aktuelle vorhandene ADI-Werte verschiedener Antibiotika nach JECFA
sowie nach CVMP/EMEA in g/kg KG [http://www.ema.europa.eu/ema/],
[http://apps.who.int/food-additives-contaminants-jecfa-database/]

ADI [g/kg KG/Tag]


nach JECFA

ADI [g/kg KG/Tag]


nach CVMP/EMEA

Ceftiofur

50

Penicillin G

30

Erythromycin

0,7

Tylosin

30

Tetracyclin

30

Doxycyclin

Trimethoprim

4,2

Wirkstoff

17

Theoretischer Teil

Sollte kein ADI-Wert fr den untersuchten Wirkstoff vorhanden sein, kann aus den
verfgbaren

toxikologischen

Daten

von

verschiedenen

Institutionen

ein

gesundheitlicher Leitwert fr Trinkwasser abgeleitet werden. Wenn die gefundenen


Konzentrationen unter dem Leitwert liegen, kann ausgeschlossen werden, dass vom
lebenslangen tglichen Gebrauch des Trinkwassers eine Gesundheitsschdigung
ausgeht. Die Anforderung des 6 Abs. 1 der TrinkwV 2001 ist dann erfllt. [LFU
BAYERN, 2010 ]
2.3.3 Kriterien der analytischen Methoden
Die

Kommissionsentscheidung

2002/657/EG

definiert

die

Kriterien

fr

die

Durchfhrung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen sowie die
allgemeinen Anforderungen hinsichtlich Probenbehandlung, Analysendurchfhrung
sowie Interpretation der Ergebnisse. Das Dokument legt zudem Leistungskriterien fr
Screening- und Besttigungsmethoden fr alle Tierarzneimittelrckstnde gem
Richtlinie 96/23/EG. Fr die quantitative Bestimmung werden in diesem Dokument
die Durchfhrung der Validierung sowie die Anforderungen an die Validierung
beschrieben.
In

der

Komissionsentscheidung

2003/181/EG

werden

die

gefrderten

Mindestleistungsgrenzen (Minimum Required Performance Limit, MRPL) fr


verbotene Stoffe bzw. Stoffe, fr die keine zulssigen Grenzwerte festgesetzt worden
sind, fr einige Wirkstoffe definiert. Zum Beispiel wird fr Chloramphenicol ein MRPLWert von 0,3 g/kg festgelegt.

2.4
In

Analytik von Antibiotika


der

modernen

instrumentellen

Analytik

kommt

die

Kopplung

von

Hochleistungsflssigkeitschromatographie an einen Massenspektometer immer


strker zum Einsatz. Diese Methode ist besonders durch die Empfindlichkeit und den
geringen Zeitaufwand fr die Routineanalytik sehr gut geeignet. Auch die Analytik
von Antibiotikarckstnden in Lebensmitteln wurde in den letzten Jahren in sehr
vielen Untersuchungen fast ausschlielich mit LC-MS/MS-Technik durchgefhrt. In
dieser

Masterarbeit

wurde

eine

LC-MS/MS-Multimethode

mit

18

Theoretischer Teil

Elektronensprayionisierung

(ESI)

fr

die

quantitative

Bestimmung

von

elf

verschiedenen Antibiotika aus sechs verschiedenen Familien entwickelt und validiert.


Neben der LC-Trennung, der ESI-Ionisierung und der massenspektrometrischen
Detektion hat vor allem auch die Probenaufbereitung einen entscheidenden Einfluss
auf

die

Leistung

der

Festphasenextraktion

Gesamtmethode.

(Solid

Phase

In

diesem

Extraction,

Fall

SPE)

bietet
als

sich

die

zuverlssige

Extraktionsmethode an, wobei in der Regel organische Stoffe auf polymeren


funktionalisierten Adsorbermaterialien bis in den tiefen ng/l-Bereich quantifiziert
werden knnen [SINGER et al., 2009].
Eine Analysenmethode bestehend aus SPE, LC und MS/MS bietet damit im Prinzip
die Mglichkeit, sowohl eine Identifizierung als auch Quantifizierung von Antibiotika
im tiefen Spurenbereich durchzufhren.

2.4.1 Solid-Phase-Extraktion
Die Probenvorbereitung beeinflusst den spteren Analysenschritt mittels LC-MS/MS
und ist daher sehr wichtig fr eindeutige Identifikation und Quantifizierung von
untersuchten Analyten.
Wegen der Komplexitt von Lebensmittelmatrizen sowie der in Lebensmitteln
vorhandenen Kontaminanten ist eine Analyse von Analytverbindungen in sehr
geringem Konzentrationsbereich (ppb bis ppt) fast nur nach Pre-Konzentrierung- und
Aufreinigungsschritten mglich. Somit sind die Analyten besser fr Trennung und
Detektion geeignet. In bioanalytischen Methoden werden oft Flssig-FlssigExtraktion (Liquid-Liquid Extraction, LLE) und Festphasenextraktion (Solid Phase
Extraction, SPE) zur Probenvorbereitung verwendet [TRK, 2007, WANG et al., 2012].
In der vorliegenden Arbeit wird die letztere Methode angewendet.
SPE ist derzeit die wichtigste Methode zur Probenaufreinigung und hat langsam LLE
ersetzt. Die Vorteile liegen im Vergleich zur Flssig-Flssig-Extraktionen u. a. in dem
geringeren

Lsemittelverbrauch,

der

geringen

Probenmenge,

den

hheren

Anreicherungsfaktoren und dem geringeren Zeitaufwand [FRITZ UND MACKA, 2000].

19

Theoretischer Teil

Abbildung 8: SPE-Gert mit Vakuum und SPE-Kartuschen unterschiedlicher Formate


[UNIVERSITAT JAUME I, 2013/2014]

SPE wird vor allem zur Aufreinigung flssiger Proben verwendet und kann halbflchtige oder nicht-flchtige Analyte extrahieren. Zudem dient SPE auch zur
Probenkonzentrierung, z. B. von festen Proben zu Lsungen.
Die Auswahl an Sorbentien ist der wichtigste Faktor in SPE, da dies wichtige
Parameter wie Selektivitt, Affinitt und Kapazitt beeinflussen kann. Die Auswahl
hngt vor allem von den Analyten und ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften
ab, welche deren Wechselwirkung mit dem verwendeten Sorbent definieren. Die
Arten von SPE-Sorbentien variieren von chemisch gebundenen Kieselsuren, z. B.
C8 und C18 organische Gruppen, bis graphitisiertem Karbon, Ionenaustauscher und
polymeren Verbindungen. [W ANG et al., 2012]
In der SPE kommen ausschlielich Sorbentien aus Silika und Polymer oft zum
Einsatz. Fr die Anreicherung verschiedener Antibiotika aus verschiedenen
biologischen Matrices werden meistens Polymermaterialien oder hnliche KoPolymere verwendet [TRK, 2007]. In der vorliegenden Arbeit wird Sorbent aus
Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymere (PS-DVB) verwendet.
Polymeres Sorbent ist im Vergleich zu Silika-Sorbent in breitem pH-Bereich stabiler.
Auerdem enthlt Silika-Sorbent Silanol, welches an einigen Verbindungen, z. B.
Tetracycline, irreversibel binden kann. [W ANG et al., 2012]

20

Theoretischer Teil

SPE

besteht

normalerweise

aus

drei Schritten,

und

zwar

Konditionieren,

Probenladung und Elution. Ein Aufreinigungsschritt resultiert so, indem strende


bzw. nicht relevante Matrixkomponente wie z. B. Salze nicht extrahiert, und/oder
diese vor dem Elution bei dem Waschschritt von dem Sorbent entfernt werden
knnen.

Abbildung 9: Prinzip der SPE-Methode [UNIVERSITAT JAUME I, 2013/2014]

2.4.2 LC-MS/MS-Technik
In verschiedenen Literaturen hat sich die Kopplung der Flssigchromatographie an
einen

Massenspektrometer

(LC-MS/MS)

aufgrund

der

guten

Selektivitt,

Schnelligkeit und Nachweisempfindlichkeit sowie der breiten Erfassbarkeit von


polaren und unpolaren Analyten bei Analysen von verschiedenen Antibiotika als
zuverlssige Methode herausgestellt. Fr die Kopplung kommt ausschlielich die
Ionisierung

bei

Atmosphrendruck

(Atmospheric

Pressure

Ionization,

API)

einschlielich der Elektrospray Ionisation (ESI) und der Ionisierung unter


atmosphrischem Druck (APCI), die sich fr die Analyse vieler umweltrelevanter
Verbindungen bis zu einem m/z-Verhltnis von 4000 amu, von ionischen
Verbindungen bis hin zu PAKs eignet [LBCKE, 2004].
2.4.2.1

Flssigchromatographie

Die Flssigchromatographie (Liquid Chromatography, LC) dient zur Auftrennung von


Stoffen aufgrund ihrer chemischen Struktur. Dabei wird die untersuchende Substanz
zusammen mit dem Laufmittel oder sogenanntes Eluent durch die Trennsule

21

Theoretischer Teil

gepumpt, welche die stationre Phase enthlt. Die heutzutage am hufigste, auch in
der

vorliegenden

Arbeit

eingesetzte

Hochleistungsflssigkeitschromatographie

Art
(High

der

LC

Performance

ist

die
Liquid

Chromatography, HPLC).

Abbildung 10: Aufbauprinzip eines HPLC-Systems [UNIVERSITAT JAUME I, 2013/2014]

Es gibt auch viele Varianten der LC, welche von dem Trennprinzip zu unterscheiden
sind. In den Literaturen bestehen die meisten Methoden zur Untersuchung von
Antibiotika aus flssigkeitschromatographischen Trennungen mit RP-18-Phasen.
In der vorliegenden Arbeit wird daher nur auf die Umkehrphasen-HPLC (Reversed
Phase Liquid Chromatography, RP-LC) eingegangen, wobei das Trennprinzip in
der Verteilung (und Adsorption) liegt. Hierbei sind organische stationre Phasen (z.
B. Alkylketten) an Kieselgelpartikel oder an ein Polymer gebunden, weshalb die
stationre Phase sich im Gegensatz zu den Normalphasen-HPLC (Normal Phase
Liquid Chromatography, NP-LC) unpolar bzw. hydrophob verhlt [ETH ZRICH]. Der
Trennmechanismus basiert auf Van-der-Waals-Krften. Je hnlicher der Analyt der
Kohlenwasserstoffkette der Phase ist, umso grer sind seine Wechselwirkungen mit
der Sule [UNIVERSITT W IEN]. Mit zunehmender Kettenlnge werden die Phasen
unpolarer. Fr die LC-MS/MS von Antiobiotikaanalytik werden Octadecyl- bzw. C18Ketten als Trgermaterial eingesetzt.

22

Theoretischer Teil

Abbildung 11: Octadecylsilan (ODS, C18) [CHEMGAPEDIA]

Die meistgeigneten Lsungsmittel fr die RP-LC sind polare Lsungsmittel wie


Wasser, Methanol und Acetonitril, die sich aufgrund ihrer Oberflchenspannung und
Dielektrizittskonstanten gut fr die Elektronensprayionisierung eignen [CACH

ET AL.,

2001]. So lassen sich in polaren Lsungsmitteln lsliche Substanzen trennen, was


auf

die

meisten

fr

biologische,

medizinische,

pharmazeutische

und

umweltanalytische anwendungsrelevanten Molekle zutrifft [MATISSEK et al., 1992].


2.4.2.2

Tandenmassenspektrometrie (MS/MS)

Die Massenspektrometrie ist ein Verfahren, welches Ionen aufgrund ihres


unterschiedlichen Masse-zu-Ladungs-Verhltnis (m/z) trennt [OHLS, 2010]. Ein
Massenspektrometer besteht im Prinzip aus einem Interface zur Ionenerzeugung,
einem Analysator zur Ionenauftrennung und einem Detektor.
Es gibt verschiedene Ionisierungstechniken, die zum Einsatz finden:

Elektrospray-Ionisation (Electrospray Ionization, ESI)

Ionisierung unter atmosphrischem Druck (Atmospheric Pressure Chemical


Ionization, APCI)

Matrix-untersttzte

Laser-Desorption/Ionisation

(Matrix-Assisted

Laser

Desorption Ionization, MALDI)

Chemische Ionisierung (Chemical Ionization, CI)

Elektronenstoionisation (Electrion Ionization, EI)

Die in dieser Arbeit verwendete Ionisierungstechnik ESI ist eine schonende, sanfte
Ionisierungsmethode, wobei nur geringe bis keine Fragmentierungen entstehen
[GALENSA et al., 1995].
ESI ist eine Zerstubungsmethode, bei der Ionen unter Verwendung von
Hochspannung und bei atmosphrischem Druck direkt aus der flssigen Phase in die
Gasphase berfhrt werden [HO et al., 2003]. Hierbei werden Ionen durch eine
Coulomb-Explosion (Zerfall) erzeugt [MEYER, 2009].

23

Theoretischer Teil

Abbildung 12: Schematische Darstellung der ESI-Ionisierung


[http://penyfan.ugent.be/labo/joelv/Esquire.html]

Zum Auftrennen der Ionen knnen verschiedene Massenanalysatoren eingesetzt


werden. Heute finden z. B. Quadrupole, Ion Trap, Orbitrap und Time-of-Flight
Analysatoren

breite

Anwendung.

In

der

vorliegenden

Arbeit

wurden

Massenanalysatoren mit Triple-Quadrupolen verwendet.


Ein Triple-Quadrupol besteht aus vier gleich groen Metallstben, die in einem
Quadrat angeordnet sind. An die jeweiligen Stbe werden eine positive bzw.
negative Gleichspannung und gleichzeitig Wechselspannung angelegt, so dass die
jeweils gegenberliegenden Stbe die gleiche Polaritt der Gleichspannung und die
gleiche Phase der Wechselspannung haben [LEHMANN, 1996]. Dadurch knnen nur
Ionen mit einem bestimmten m/z-Verhltnis auf einer stabilen Flugbahn den
Quadrupol passieren und den Detektor erreichen [BUDZIKIEWICZ et al., 2003]. Ionen
mit einem anderen m/z-Verhltnis haben somit nicht stabile Flugbahnen und werden
auf die Stbe prallen, so dass sie nicht mit detektiert werden.

2.5

Methodenvalidierung

Fr eine zuverlssige quantitative Bestimmung ist es sehr wichtig, eine geeignete


Prfmethode

zu

verwenden.

Diese

Eignung

ist

im

Rahmen

einer

Methodenvalidierung zu verifizieren und zu dokumentieren.

24

Theoretischer Teil

Fr die Validierung von quantitativen Besttigungsmethoden sollten die EU-weit


geltenden Anforderungen im Sinne der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG
umgesetzt werden. Entsprechend der Entscheidung kann in dieser Arbeit die
Validierung nach dem herkmmlichen Validierungsansatz durchgefhrt werden.
Die gem der Kommissionsentscheidung zu validierten Prfparameter wie
Spezifitt, Kalibrierkurve (einschlielich Arbeitsbereich und Linearitt), Przision,
laborinterne

Reproduzierbarkeit,

Richtigkeit

(Wiederfindung),

Nachweis-

und

Bestimmungsgrenze, sowie Stabilitt wurden mit VALISTAT (Prfkriterien nach


GTFCh, Gesellschaft fr Toxikologische und Forensische Chemie) ausgewertet.
Zustzlich werden in dieser Arbeit noch die Matrix-Effekte geprft.
Selektivitt (Spezifizitt)
Eine

selektive

Methode

interessierenden

erfasst

Wirkstoffe,

direkt

interpretierbare

wohingegen

eine

Ergebnisse

spezifische

fr

Methode

alle
direkt

interpretierbare Ergebnisse fr einen Wirkstoffe erfasst, whrend andere Wirkstoffe


sich gegenseitig stren knnen. Die Selektivitt kann geprft werden, indem die
Richtigkeit der Methode mit einem Standard, der alle denkbaren Matrixkomponente
enthlt, geprft und vergleicht wird und/oder die Analysen- und Messbedingungen
systematisch variiert werden. [KROMIDAS, 2011]
Arbeitsbereich
Zur

Festlegung

des

Arbeits-

bzw.

Kalibrierbereiches

werden

die

Rckstandshchstmengen bercksichtigt, um zu schtzen, wie hoch der Analytgehalt


in

der

Probe

sein

knnte.

Auerdem

sollten

auch

die

angeforderten

Mindestleistungsgrenzen (MRPL) nach 2003/181/EG bercksichtigt werden (s.


2.3.3). Die intern festgelegte MRPL liegen bei IGV Prflabor bei 0,1*MRL, wobei alle
Kalibrierpunkte quidistant verteilt werden sollen.
Die Anzahl der Konzentrationsniveaus und der Messungen pro Konzentration sollte
sich auf die gesetzlichen Anforderungen beziehen. Im Dokument 2002/657/EG
werden mindestens fnf Konzentrationsniveaus einschlielich Nullpunkt empfohlen.
Fr jedes Niveau sollte nach Richtlinie der GTFCh der Messwert mindestens 6-mal
unter Wiederholbedingungen gemessen werden.

25

Theoretischer Teil

Linearitt
Die Linearitt einer analytischen Methode ist ihre Fhigkeit, innerhalb eines
gegebenen Bereiches Testergebnisse zu liefern, die direkt proportional zur
Konzentration (Menge des Analyten in der Probe) sind. Mit dem Mandel-F-Test
(Signifikanzniveau: 99 %) wird berprft, ob quadratische Regression eine signifikant
bessere Anpassung als lineare hervorruft. Ist keine Signifikanz gegeben, kann eine
lineare Anpassung verwendet werden [GTFCh, 2009].
Nachweis- und Bestimmungsgrenze
Bei einer Validierung werden zwei unterschiedliche analytische Grenzen bestimmt.
Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LOD) wird fr die qualitative Bestimmung
benutzt, das heit es wird geprft, ob der Wirkstoff in der Probe berhaupt
vorhanden ist. Fr eine quantitative Bestimmung wurde die Bestimmungsgrenze
(Limit of Quantitation, LOQ) bentigt.
Wenn das Analyseergebnis unterhalb der Nachweisgrenze liegt, wird es als nicht
nachweisbar deklariert. Zwischen Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze ist eine
quantitative Aussage noch nicht mglich. Erst wenn die Analysenwerte grer als die
Bestimmungsgrenze sind, darf eine quantitative Aussage getroffen werden.
In der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG werden die LOD und LOQ mit
Entscheidungsgrenze CC und Nachweisvermgen CC ersetzt. In der vorliegenden
Arbeit werden jedoch lediglich LOD und LOQ bestimmt.
Przision
Unter Przision wird der Grad der Streuung der einzelnen Werte um den Mittelwert
verstanden und ist somit ein Ma fr die zuflligen Fehler. Przision wird
normalerweise als Unprzision ausgedruckt und als Standardabweichung (SD)
bzw. relative Standardabweichung (RSD) berechnet. In der Praxis knnen
unterschiedliche Przisionsarten bestimmt werden. Unter Wiederholprzision wird
die Przision verstanden, welche unter Wiederholbedingungen innerhalb kurzer
Zeitabstnde erhalten wird, d. h. unabhngige Ergebnisse mit demselben Verfahren,
Material (Probe), Bearbeiter, Gerten und innerhalb desselben Labors werden

26

Theoretischer Teil

erhalten. Zudem steht die Laborprzision, welche unabhngige Messergebnisse


desselben Materials, innerhalb eines Labors bei bewusster nderung eines
Parameters (z. B. Bearbeiter, Gert, Zeit) liefert. Eine bliche Variante ist die
Bestimmung der tagesverschiedenen Laborprzision, wobei eine Probe an mehreren
aufeinander folgenden Tagen untersucht wird. [KROMIDAS, 2011]
Richtigkeit/Wiederfindung
Richtigkeit

und

Przision

werden

unter

dem

Oberbegriff

Genauigkeit

zusammengefasst. Unter Richtigkeit wird der Ma fr die Abweichung des


Mittelwertes vom richtigen Wert, dem Soll- bzw. wahrer-Wert aufgrund eines
systematischen Fehlers (Bias), verstanden. [KROMIDAS, 2011]
Die berprfung von Richtigkeit kann anhand von Referenzmaterialien erfolgen.
Sollte ein solches Referenzmaterial nicht vorhanden sein, kann die Richtigkeit mittels
Wiederfindung durch Aufstocken einer Leermatrix bestimmt werden [2002/657/EG].
Stabilitt/Robustheit
Die Untersuchung der Stabilitt von Probenlsungen hat einen Einfluss auf die
Verfahrensstabilitt und somit auch auf die Robustheit der Methode. Da die Stabilitt
eines Analyten vom Zeitpunkt der Probenahme bis zum Ende der Analyse
gewhrleistet sein sollte. Hier sind sowohl die Stabilitt von Standardlsungen als
auch von Probenlsungen z. B. durch lange Standzeiten auf dem Autosampler, von
Bedeutung.
Robustheit ist laut 2002/657/EG die Anflligkeit einer Methode gegenber
nderungen in den Versuchsbedingungen. Zur Untersuchung der Robustheit knnen
auer der Prfung auf Stabilitt die Variationen der Versuchsbedingungen z. B. pHWert, Temperatur sowie die berprfung der Anwendbarkeit (Wechsel von
Anwender, Gert) sein [KROMIDAS, 2011].
Matrix-Effekte
In der Routineanalytik ist es blich mit einer Lsungsmittelkalibrierung zu arbeiten,
da die Matrixgewinnung zur Verwendung einer Matrixkalibrierung relativ aufwndig

27

Theoretischer Teil

ist. Jedoch knnen das Vorhandensein von Matrix in der Probenmesslsung und
somit die darin enthaltenen nicht-Zielanalyten oder andere strende Substanzen zu
einer Vernderung des Messsignals fhren und damit die Quantifizierung
verflschen. Obwohl die LC-MS/MS Analyte trotz Anwesenheit von Matrix hoch
selektiv messen kann, knnen Matrixeffekte sowohl zu Signalschwankungen (ion
suppression) als auch zu Signalerhhungen (ion enhancement) fhren [BECKER,
2005]. Aus diesen Grnden ist es notwendig zu prfen, dass zwischen
Lsungsmittel- und Matrixkalibrierung keine signifikanten Unterschiede bestehen.

28

Material und Methoden

3.

Material und Methoden

3.1

Gerte und sonstige Materialien

3.1.1 Kolbenhubpipetten mit Pipettenspitzen 1-10 l, 10-100 l, 100-1000 l und 22,5 ml


3.1.2 15-ml-Polypropylen-Einmal-Zentrifugenrhrchen, mit Schraubverschluss
3.1.3 Zentrifuge 5430R (Eppendorf)
3.1.4 Vortexmischer
3.1.5 pH-Meter
3.1.6 Vials (1,5 ml)
3.1.7 SPE-Gert Agilent Technologies mit Vakuum
3.1.8 SPE-Sule BEKOlut LEOX, 3 ml, 200 mg
3.1.9 LC-MS/MS Gert API 4000 QTRAP (Fa. Applied Biosystems mit HPLC
Anlage der Fa. Dionex)
3.1.10 HPLC Sule Kinetex C18 (Fa. Phenomenex)

3.2

Chemikalien und Reagenzien

Soweit nicht anders angegeben, wurden analysenreine Chemikalien verwendet. Die


Lsungsmittel waren von hoher Reinheit und fr das LC-MS/MS geeignet.
3.2.1 Lsungsmittel
3.2.1.1

Methanol LC-MS Chromasolv (Fa: Fluka, CAS: 47-56-1)

3.2.1.2

Acetonitril LC-MS Th.Geyer (Fa: J.T. Baker, CAS: 75-05-8)

3.2.1.3

3-fach destilliertes Wasser LC-MS

3.2.2 Chemikalien und Reagenzien


3.2.2.1

Isopropanol fr LC-MS (Fa: Chemsolute, CAS: 67-63-0)

3.2.2.2

Ameisensure 99 100 % (Th.Geyer, Fa: Chemsolute, CAS: 64-18-6)

3.2.2.3

Essigsure 99 100 %

29

Material und Methoden

3.2.3 Lsungen
3.2.3.1

Extraktionsmittel, Acetonitril:Wasser:Essigsure (10:90:0,1)


100 ml Acetonitril (4.2.1.2) werden mit 900 ml Wasser (3.2.1.3)
gemischt und anschlieend mit 1 ml Essigsure (99 100 %ig)
(3.2.2.3) versetzt.

3.2.3.2

Mobile-Phase-Lsung, Methanol:Wasser (90:10, v/v)


100 ml Wasser (3.2.1.3) werden mit 900 ml Methanol (3.2.1.1)
vermischt.

3.2.3.3

Laufmittel A, 0,1 % Ameisensure in Wasser:


1 ml Ameisensure (99 100 %ig) (3.2.2.2) werden mit Wasser
(3.2.1.3) auf 1000 ml verdnnt.

3.2.3.4

Laufmittel B, 0,1 % Ameisensure in Methanol


1 ml Ameisensure (99 100 %ig) (3.2.2.2) werden mit Methanol
(3.2.1.1) auf 1000 ml verdnnt.

3.2.3.5

Kolbensplung fr das LC-MS/MS-Gert


10 ml Isopropanol (3.2.2.1) werden mit 190 ml Wasser (3.2.1.3)
vermischt.

3.2.4 Standardlsungen
Zur Herstellung von Standard- und Kalibrierlsungen wurden reine Standards der
Wirkstoffe von der Firma Neochema bezogen. Die Standards wurden in 5 ml
Flaschen geliefert und waren in Acetonitril (MeCN) gelst. Sie wurden bei -18C im
Tiefkhlschrank aufbewahrt. Als interner Standard (ISTD) wurden isotopenmarkierte
Standards Trimethoprim-13C3 (ISTD_pos) sowie Bezafibrate-D4 (ISTD_neg) aus
Universitt Bonn verwendet. Die verwendeten Standardsubstanzen sind in Tabelle 4
aufgelistet.

30

Material und Methoden


Tabelle 4: Standardsubstanzen fr die Validierung

Arzneistoff

CAS-Nr.

Konzentration [g/ml]

Azithromycin

83905-01-5

100,00

Chloramphenicol

56-75-7

100,00

Ceftiofur

80370-57-6

100,00

Ciproflaxacin

85721-33-1

100,00

Clarithromycin

81103-11-9

100,00

Doxycyclin-monohydrat

17086-28-1

100,00

Erythromycin

114-07-8

100,00

Penicillin G-Ka

113-98-4

100,00

Sulfamethoxazol

723-46-6

100,00

Tetracyclin-HCl

64-75-5

100,00

Trimethoprim

738-70-5

100,00

Tylosin-tartrat

74610-55-2

100,00

Trimethoprim-13C3

1189970-95-3

100,00

Bezafibrate-D4

1189452-53-6

100,00

Fr die Matrix-basierte Kalibrierreihe fr Milch sowie zum Aufstocken der Milchprobe


fr Wiederfindungsexperimente wurde ein Mix aus allen Antibiotikastandards
hergestellt. Hierfr wurden die Standardsubstanzen mit MeOH, welches auch als
mobile Phase fr die sptere Messung mit LC-MS/MS diente, je nach Antibiotika auf
eine Endkonzentration von 0,06 g/ml 0,08 g/ml, 0,2 g/ml, 0,8 g/ml, 1 g/ml und 2
g/ml (siehe Tabelle 5) hergestellt. Fr Wasseranalyse wurde ein Mix mit einer
Endkonzentration von 25 g/L hergestellt (siehe Tabelle 6).
Von den internen Standards wurde jeweils eine Standardlsung hergestellt. Diese
Standardlsung wurde sowohl fr die Matrix-Kalibrierung (nur bei Milchanalyse) als
auch fr die Dotierung der Matrix am Beginn der Extraktion verwendet. Fr
Milchanalyse wurden 100 l des ISTD Trimethoprim-13C3 Standards (100 g/ml) bzw.
10 l des ISTD Bezafibrate-D4 Standards (100 g/ml) mit Methanol auf 10 ml
aufgefllt. Dies entspricht einer Konzentration von 1 g/ml (ISTD_pos) bzw. 0,1 g/ml
(ISTD_neg). Fr Wasseranalyse wurden jeweils 50 l des ISTD Standards mit
Methanol auf 10 ml aufgefllt. Dies entspricht einer Konzentration von je 50 g/L
(siehe Tabelle 6).
31

Material und Methoden


Tabelle 5: Herstellung der Standardmix fr Milch

Vol. aus 100 g/ml


Standard (l)

Endkonz.
(g/ml)

Endvolumen
(ml)

CEFT, TC

200

10

TYL, TMP

100

10

EM

0,8

80

10

AZI, CM, DC, SMTX

0,2

20

10

PEN G

0,08

10

CAP

0,06

10

ISTD_pos

100

10

ISTD_neg

0,1

10

10

Tabelle 6: Herstellung der Standardmix fr Wasser

Endkonz.
(g/L)

Vol. aus 100 g/ml


Standard (l)

Endvolumen
(ml)

Alle Analyten

25

2,5

10

ISTD_pos

50

10

ISTD_neg

50

10

3.2.5 Kalibrierreihe
In Tabelle 7 und 8 sind die Konzentrationen der einzelnen Kalibrierpunkte fr Milchbzw. Wasseranalyse aufgelistet. Als Lsemittel fr die Kalibrierlsungen fr
Wasseranalyse wurde eine Mischung von 90:10 Methanol:Wasser (3.2.3.2)
verwendet.
Tabelle 7: Herstellung der Kalibrierreihe fr Milch

K0

K1

K2

K3

K4

K5

0,1*MRL

0,5*MRL

0,75*MRL

1,0*MRL

1,5*MRL

V Standards-Mix in l

25

50

75

100

V ISTD pos (1 g/ml) in


l

15

15

15

15

15

15

V ISTD neg (0,1 g/ml)


in l

20

20

20

20

20

20

Matrix in l

965

960

940

915

890

865
32

Material und Methoden

Endkonzentration in
g/L:
CEFT, TC

10

50

75

100

150

TYL, TMP

25

37,5

50

75

EM

20

30

40

60

AZI*, CM*, DC*, SMTX*

10

15

20

PEN G

0,4

CAP*

0,3

1,5

2,25

4,5

ISTD_pos

15

15

15

15

15

15

ISTD_neg
*Wirkstoffe ohne MRL

Tabelle 8: Herstellung der Kalibrierreihe fr Wasser

K0

K1

K2

K3

K4

K5

V Standards-Mix in l

12

V ISTD pos (50 g/L) in


l

V ISTD neg (50 g/L) in


l

996

995

994

992

988

984

0,025

0,05

0,1

0,2

0,3

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

0,1

Lsemittel in l
Endkonzentration in
g/L:
Alle Analyten
ISTD_pos und ISTD_neg

3.3

Extraktion und Aufreinigung mittels SPE

In den folgenden Punkten 3.3.1 und 3.3.2 werden die optimierten Methoden (EndMethoden) fr die Analyse von Antibiotikarckstnden in Milch und Wasser
beschrieben. Die beiden Methoden basieren auf SPE-Applikationen der Firma
BEKOlut, die im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurden.
3.3.1 Milchprobe
2,0 0,002 g Milch wurden in ein leeres 15 ml Falkon-Rhrchen eingewogen.
Danach wurden die ISTDs (bzw. auch der Antibiotikastandardmix zur Untersuchung
33

Material und Methoden

der Wiederfindung) zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Minute mit Hilfe des
Vortexmischers homogenisiert und dann 10 Minuten stehen gelassen. 5 ml
Extraktionsmittel (3.2.3.1) wurden in die Milch zugegeben und das Gemisch wurde
15 Sekunden krftig von Hand geschttelt und dann wieder bei Raumtemperatur
stehen gelassen. In dieser Zeit erfolgte bereits eine Phasentrennung. Danach wurde
das Gemisch fr 15 Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Der berstand wurde nach dem
Zentrifugieren in ein neues 15 ml Falkon-Rhrchen berfhrt und fr 10 Minute
wieder bei 4000 g und zentrifugiert.
Die SPE-Kartusche wurde mit jeweils 3 ml Methanol (3.2.1.1) und Extraktionsmittel
(3.2.3.1) konditioniert. Es ist wichtig, dass die Kartusche nach dem Konditionieren
nicht trocken laufen gelassen wird. Danach wurde der Probenberstand direkt in die
Kartusche mit einer Flussrate von ca. 0,5 ml/min zugegeben. Anschlieend wurde
die Kartusche mit 3 ml Wasser (3.2.1.3) gewaschen und dann 15 Minuten unter
Stickstoffstrom getrocknet.
Nach dem Trocknen wurden 3 ml Methanol zur Elution in die Kartusche gegeben.
Das Eluat wurde bei 45 C unter Stickstoffstrom bis zur Trockne eingeengt und dann
mit 1 ml Methanol:Wasser (90:10, v/v) gelst, mit Hilfe des Vortexmischers
homogenisiert und in ein Vial zur LC-MS/MS berfhrt.
3.3.2 Wasserprobe
2,0 0,002 g Wasser wurden in ein leeres 15 ml Falkon-Rhrchen eingewogen.
Danach wurden die ISTDs (bzw. auch der Antibiotikastandardmix zur Untersuchung
der Wiederfindung) zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Minute mit Hilfe des
Vortexmischers homogenisiert und dann 10 Minute stehen gelassen.
Die SPE-Kartusche wurde mit jeweils 3 ml Methanol (3.2.1.1) und Wasser (3.2.1.3)
konditioniert. Es ist wichtig, dass die Kartusche nach dem Konditionieren nicht
trocken laufen gelassen wird. Danach wurde die Probe direkt in die Kartusche mit
einer Flussrate von ca. 0,5 ml/min zugegeben. Anschlieend wurde die Kartusche
mit 3 ml Wasser (3.2.1.3) gewaschen und dann 20 Minuten unter Stickstoffstrom
getrocknet.
Nach dem Trocknen wurden 3 ml Methanol zur Elution in die Kartusche gegeben. Im
Anschluss wurde das Eluat bei 45 C unter Stickstoffstrom bis zur Trockne eingeengt
34

Material und Methoden

und dann mit 1 ml Methanol:Wasser (90:10, v/v) (3.2.3.2) gelst, mit Hilfe des
Vortexmischers homogenisiert und in ein Vial zur LC-MS/MS berfhrt.

3.4

LC-MS/MS Parameter

Die Untersuchungen zur Bestimmung von Antibiotikarckstnden wurden mit einer


HPLC-Anlage der Firma Dionex und einem LC-MS/MS Gert API 4000 QTRAP der
Firma Applied Biosystems mit folgender Konfiguration gemessen:
Tabelle 9: LC-Konfiguration

LC-Konfiguration
HPLC-Sule

Kinetex C18 2,6 m, 50 x 2.1 mm, 100 A

Injektion

10 l

Flussrate

0,5 ml/min

Sulentemperatur

40 C

Das HPLC-System wurde in folgendem Gradienten gefahren:


Tabelle 10: Gradientenzusammensetzung fr die LC

RT [min]

Flow [ml/min]

%A

%B

0,4

95

0,4

95

3,0

0,4

95

10,0

0,4

95

10,1

0,4

98

13,0

0,4

98

35

Material und Methoden


Tabelle 11: MS/MS-Konfiguration

Detektoreinstellungen
Ionisationsquelle

Turbospray Ionisierung (TSI); Positiv- sowie Negativ-Mode

Temperatur

475 C

Angelegte Hochspannung 5000 V


Curtain Gas (CUR)

35

Collision Gas (CAD)

Medium

Gas 1 (GS1)/Gas 2 (GS2) 60/60


Interface Heater

On

Tabelle 12: MRM-bergange der einzelnen Analyten

Analyte

RT
[min]

Q1

Q3

DP
[V]

EP
[V]

CE
[V]

CXP
[V]

Azithromycin
Ceftiofur
Chloramphenicol*
Clarithromycin
Doxycyclin
Erythromycin
Penicillin G*
Sulfamethoxazol
Tetracyclin
Trimethoprim
Tylosin
ISTD_pos
ISTD_neg

3,04
3,21
3,60
3,67
2,53
3,50
4,41
2,67
2,52
2,39
3,47
2,39
5,12

749,5
524
320,9
748,5
445,2
734,6
333
254
445,2
291
916
294
364,1

591,5/72,0
241,2/125,1
152,0/257,0
158,1/590,3
428,1/98,1
158,1/83,0
191,7/73,8
156,0/92,0
410,0/154,1
230,0/261,0
174,0/156,0
231,1/123,1
278,1/157,8

171
91
70
116
86
96
70
55
61
110
60
126
70

10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10

41/117
25/87
20/20
41/29
25/65
45/97
16/40
27/36
27/39
25/25
54/65
33/35
24/42

18/12
16/6
10/10
8/16
12/4
8/14
11/11
15/15
10/8
15/15
15/15
14/6
5/1

*Penicillin G und Chloramphenicol werden in negativer ESI-Ionisierung gemessen

3.5

Validierung der Methode

3.5.1 Selektivitt und Spezifitt


Zur Bestimmung der Selektivitt und Spezifitt wurden 3 Leerwert-Proben (Matrix
ohne Dotierung) analysiert und auf strende Interferenzen geprft. Selektivitt und
Spezifitt

sind

gegeben,

wenn

keine

strenden

Interferenzen

im

36

Material und Methoden

Untersuchungsspektrum vorhanden sind, so dass alle Wirkstoffe fehlerfrei bestimmt


werden knnen.

3.5.2 Arbeitsbereich
Der

Arbeitsbereich

Kalibrierstandards

wurde

durch

einschlielich

eine

achtfache

Nullpunkt,

deren

Bestimmung

von

Konzentrationen

um

sechs
den

Grenzwert liegen, unter Wiederholbedingungen ermittelt. Die Kalibrierlsungen


wurden durch Aufstocken extrahierter Leermatrix hergestellt. Als Messwert wurde
das area ratio (Verhltnis zwischen Peakflche Analyt und Peakflche ISTD)
gebildet. Aus der 8-fachen Bestimmung wurden jeweils die Mittelwerte bestimmt und
gegen die Sollkonzentration einzelner Kalibrierpunkte aufgetragen.

3.5.3 Linearitt
Die berprfung der Kalibrierung auf Linearitt erfolgte mittels Anpassungstest
(Linearittstest) nach Mandel (Signifikanzniveau: 99 %). Der Mandel-F-Test
vergleicht die Reststandardabweichungen der linearen und der quadratischen
Kalibrierfunktion. Es wird demnach geprft ob die quadratische Regression eine
signifikant bessere Anpassung ergibt als die lineare Regression. Linearitt ist
gegeben, wenn die berechnete Prfgre PW kleiner ist als der entsprechende
Tabellenwert aus der F-Tabelle (Formel s. Anhang 7.1).

3.5.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenze


Die Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erfolgte in der vorliegenden
Arbeit nach der DIN 32645 ber die indirekte Methode. Bei der indirekten Methode
wird die Kalibriergerade ber die Messwertachse extrapoliert. Da zur Bestimmung
der analytischen Grenzen Matrix-Kalibrierung eingesetzt werden soll, knnen die
Messwerte des Arbeitsbereiches verwendet werden. Es wurde eine Messreihe aus
dem Arbeitsbereich ausgesucht, die die Anforderungen nach der DIN 32645 an
Linearitt erfllte und frei von Ausreiern war.
Fr die Ermittlung der Nachweisgrenze wurde das erste Qualifier Ion herangezogen,
wobei fr die Ermittlung der Bestimmungsgrenze das Target Ion herangezogen
wurde. Die Berechnung erfolgt mit einer relativen Ergebnisunsicherheit von 33,33 %
37

Material und Methoden

und auf einem Signifikanzniveau von 90 % fr Nachweisgrenze und 99 % fr


Bestimmungsgrenze (Formel s. Anhang 7.1).

3.5.5 Przision
Die Przision wurde auf drei verschiedenen Konzentrationsniveaus (niedrig, mittel,
hoch) bestimmt. Hier wurden die Konzentrationen 0,5*MRL, 1,0*MRL und 1,5*MRL
bzw. Konzentrationen der Kalibrierpunkte K2, K4 und K5 ausgewhlt. Hierfr wurde
an acht aufeinander folgenden Tagen jeweils eine Probe eingewogen, mit der
jeweiligen Konzentration des Antibiotikamixes dotiert, extrahiert und mit einer
dreifachen-Bestimmung

gemessen.

Aus

diesen

Daten

wurden

sowohl

die

Wiederholprzision RSDR als auch die Laborprzision RSDwR ermittelt (Formel s.


Anhang 7.1).
Die Auswertung erfolgte ber erstellte Kalibriergeraden der einzelnen Wirkstoffe
wobei mit Hilfe der area ratios und der Soll-Konzentrationen (g/L) bzw. unter
Bercksichtigung der Dichte der Milchprobe von 1,2198 g/ml die Konzentration der
Wirkstoffe in g/kg berechnet wurde.
Tabelle 13: Zudotiertes Volumina
Endkonzentration in den Proben

der

Antibiotikastandard-Mix

und

Analyt-

K2

K4

K5

0,5*MRL

1,0*MRL

1,5*MRL

V Standards-Mix in l

40

80

120

V ISTD pos (1 g/ml) in l

20

20

20

V ISTD neg (0,1 g/ml) in l

32

32

32

CEFT, TC

50

100

150

TYL, TMP

25

50

75

EM

20

40

60

AZI, CM, DC, SMTX

10

15

PEN G

1,5

4,5

Endkonzentration in g/L:

CAP

38

Material und Methoden

3.5.6 Richtigkeit/Wiederfindung
Die Richtigkeit wurde in Form der Wiederfindung bestimmt. Hierzu wurden sechs
Leermatrix-Proben eingewogen und mit zwei Konzentrationen des AntibiotikaStandardmix dotiert. Hier wurden die Konzentrationen 0,5*MRL und 1,0*MRL bzw.
Konzentrationen der Kalibrierpunkte K2 und K4 ausgewhlt (siehe Tabelle 13). Die
Proben wurden extrahiert und anschlieend mit LC-MS/MS gemessen.
Die Berechnung zur Bestimmung der Wiederfindung erfolgte ber den Vergleich
zwischen der ermittelten area ratios der Proben (Mittelwert) und dem der
tagesaktuellen Kalibrierreihe der Matrix-Kalibrierung. Die Wiederfindung wird in %
angegeben.
Zudem wurde aus den sechs Messwerten die RSD in % ermittelt. Eventuell muss ein
Messwert aus der Berechnung gestrichen werden, wenn er nach Grubbs-Test als
Ausreier identifiziert wurde.

3.5.7 Stabilitt
Zur berprfung der Stabilitt einer Probenlsung wurden aufgearbeitete (dotierte
und extrahierte) Milchproben eingewogen und nach unterschiedlichen Standzeiten im
Tiefkhlschrank bei -18 C gemessen. Die Messsignale werden miteinander
verglichen.

3.5.8 Matrix-Effekte
Zur berprfung von Matrix-Effekten erfolgte ein Vergleich der Messsignale aus
Lsungsmittel- und Matrix-Kalibrierung mit mindestens fnf Konzentrationsniveaus.

39

Ergebnisse und Diskussion

4.

Ergebnisse und Diskussion

4.1

Entwicklung von LC-MS/MS-Methode

Fr die Bestimmung von verschiedenen Antibiotika kamen ausschlielich ReversedPhase HPLC-Sulen zum Einsatz. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die
Bestimmung

nach

Optimierung

der

chromatographischen

und

massenspektrometrischen Bedingungen auf einer 50 x 2.1 mm Kinetex C18 HPLCSule und Elektrosprayionisation mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer.
Bei der Auswahl der HPLC-Sulen wurden viele Parameter bercksichtigt. Zur
Trennung niedermolekularer Substanzen mit Molekulargewicht kleiner als 3000 wie
Antibiotika sind Sulen mit lngeren C-Ketten (C18) gut geeignet. Die C18-Sule
kann zudem maximale Retention fr polar bis unpolare Molekle erzielen.

Fr

niedermolekulare Substanzen reicht eine Porengre von 100 . Eine kleine


Partikelgre von 2,6 m dient zur schnellen Analyse und hheren Auflsung. Mit
dieser Partikelgre wird eine kurze Sule bentigt und der Lsungsmittelverbrauch
wird somit geringer. [AGILENT TECHNOLOGIES, 2009]
Passend zu der unpolaren C18-Sule wurde hier mit polaren mobilen Phasen, und
zwar Wasser und Methanol, gearbeitet. Die Zusammensetzung der mobilen Phasen,
einschlielich Pufferlsungen oder zustzlichen Suren bzw. Basen zur pHEinstellung, sind bei LC-MS/MS fr eine optimale sptere Ionisierung, Ionenstabilitt
und chromatographische Trennung von Analyten wichtig [W ANG ET AL., 2012]. Fr die
Methodenentwicklung der meisten Matrizen, einschlielich Basen und typischen
schwachen Suren, wird ein pH-Wert zwischen 2 4 empfohlen [AGILENT
TECHNOLOGIES, 2009]. In dieser Arbeit enthlt die jeweilige mobile Phase 0,1 %
Ameisensure.
Die im IGV Prflabor bestehende LC-MS/MS Methode fr Antibiotikaanalyse
verwendete die HPLC-Sule Fusion-RP. Jedoch gab es nach mehreren Versuchen
unter Verwendung dieser Sule keine idealen Peakformen der meisten Analyten.
Daher wurde eine alternative Sule ausgesucht und die Auswahl lag an Kinetex-18,
welche

bereits

Applikationen

fr

Multiklassen-Antibiotikauntersuchung

in

verschiedenen Matrices einschlielich Milch besitzen. Die beiden Sulen besitzen


40

Ergebnisse und Diskussion

C18-Kette, wobei Fusion-RP neben der C18-Kette eine polar eingebettete


funktionelle Gruppe in der stationren Phase besitzt. Der Hauptunterschied liegt
jedoch in dem Partikelaufbau, wobei Kinetex-C18 anders als die vollprose FusionRP-Sule aus einem unporsen Kern und einer porsen Hlle besteht, deren Dicke
verringert wird. Somit werden Trennungen bei hoher Geschwindigkeit und Auflsung
ohne den unerwnschten hohen Rckdruck ermglicht. Darber hinaus wird der
Diffussionsweg der Analyt-Molekle durch die verringerte Dicke begrenzt. Dies fhrt
somit zur Minimierung des Stofftransportwiderstandes und der Peakverbreiterung.
In Abbildung 13 werden Gesamtchromatogramme aller untersuchten Analyten, die
mit Fusion-RP getrennt wurden, abgebildet. Dabei knnen festgestellt werden, dass
mit Kinetex-C18 (Abbildung 15) eine bessere Identifizierung und bessere
Peakformen erzielt wurden. In Abbildung 14 und 16 werden die Peaks von
Trimethoprim und Tetracyclin mit beiden Sulen verglichen.

Abbildung 13: XIC aller Analyten mit Fusion-RP in positivem Ionisierungsmodus

41

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 14: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Fusion-RP

Abbildung 15: XIC aller Analyten mit Kinetex C18 in positivem Ionisierungsmodus

Abbildung 16: XIC von Trimethoprim und Tetracyclin mit Kinetex C18

42

Ergebnisse und Diskussion

Das Ziel der in dieser Arbeit entwickelten LC-MS/MS-Multimethode war es, mehrere
Antibiotika

verschiedener

massenspektrometrisch

Klassen

zu

in

besttigen

einem
und

zu

chromatographischen
quantifizieren.

Damit

Lauf
das

Identtifizierungskonzept der EU erfllt werden kann, mssen insgesamt 30


Massenspuren (2 fr jede Substanz) im MRM-Modus gemessen werden. Die
detaillierten MS/MS-Messbedingungen und die MRM-bergange sind im Kapitel 3
Tabelle 11 und 12 zusammengefasst.
Das HPLC Profil begann mit 98 % Eluent A (Wasser mit 0,1 % Ameisensure)
gefolgt von einem Gradienten. Der bestehende Gradient wurde zuvor optimiert, da
bei allen Makroliden Double-Peaks festgestellt wurden (siehe Anhang 7.6 Abbildung
73). Das Eluent B (0,1 %ige Ameisensure in Methanol) wurde dann statt 2 Minuten
fr 7 Minuten zugegeben. Mit diesem Gradienten sind keine Double-Peaks mehr bei
Makroliden feststellbar.
Zwei verschiedene Injektionsvolumen von 5 l und 10 l wurden zudem ausprobiert
und es wurde festgestellt, dass eine bessere Auflsung mit Injektionsvolumen von 10
l erzielt wurde.
Bei der LC-MS-Methodenentwicklung mit einer Elektrosprayquelle zeigte sich, dass
Penicillin G sowie Chloramphenicol im negativen Ionisationsmodus (ESI-) und die
anderen

Wirkstoffe

mit

ESI+

gemessen

werden

knnen.

Die

jeweiligen

Chromatogramme der untersuchten Antibiotika mit der optimierten LC-MS/MSMethode sind im Anhang 7.2 zu finden.

4.2

Bestimmung der Arbeitsbereiche

Bei der Entwicklung einer Multimethode ist die Festlegung des analytischen
Arbeitsbereiches vor allem fr die Matrix Milch herausfordernd. Es wre fr eine
Multimethode insbesondere in der Routineanalytik sehr optimal, die Kalibriergeraden
aller Analyten mglichst in einer Kalibrierreihe zu erhalten.
Der MRL in Milch oder die bei der Methodenvalidierung angeforderte Konzentration
kann fr verschiedene Antibiotika unterschiedlich sein. Der zur Quantifizierung
angeforderte analytische Bereich basiert normalerweise auf den MRLs jeweiliger
Antibiotika, MRPL (Mindestleistungsgrenze) oder anderer zur Methodenvalidierung
43

Ergebnisse und Diskussion

angeforderten Konzentration. Zudem wird auch beim IGV-Prflabor angefordert,


dass jede Kalibrierreihe eine Mindestkonzentration von 1/10 des MRLs besitzen
muss.
Es knnte nicht praktikabel sein, alle zu untersuchenden Antibiotika in einem
gleichen und linearen analytischen Bereich zu validieren. Zum Beispiel hat
Chloramphenicol eine Mindestleistungsgrenze von 0,3 g/kg, wobei Tetracyclin und
Ceftiofur MRL von 100 g/kg und Penicillin G 4 g/kg in Milch haben.
Es wurden in dieser Arbeit einige Arbeitsbereiche ausprobiert. Am Anfang wurde mit
zwei separaten Kalibrierreihen gearbeitet und dann nach einigen Versuchen wurde
diese auf eine Kalibrierreihe optimiert. Dabei sind Antibiotika, die Grenzwerte in Milch
haben, auf einen Arbeitsbereich von 0, 0,1*MRL, 0.5*MRL, 0,75*MRL, 1.0*MRL,
1.5*MRL festgelegt worden. Fr Chloramphenicol wurde ein Arbeitsbereich von 0,3
bis 4,5 g/kg festgelegt. Fr alle anderen Antibiotika, bei denen keine Grenzwerte
festgelegt worden sind, wurden im Konzentrationsbereich von 0 bis 15 g/kg
validiert.
In den folgenden Tabellen sind die Arbeitsbereiche und die dazugehrigen
Relationskoeffizienten dargestellt.
Bei Wasser sind fr Antibiotikarckstnde keine Grenzwerte festgelegt worden.
Jedoch soll fr Wasser ein mglichst niedriger Konzentrationsbereich gewhlt
werden, da es sich um Spurenanalytik bzw. Umweltkontamination handelt. In dieser
Arbeit wurden alle Analyten in gleichen ppt-Konzentrationen von 25 300 ng/L
analysiert.

44

Ergebnisse und Diskussion


Tabelle 14: Arbeitsbereich fr Milch in g/kg und Relationskoeffizient jeweiliger
Kalibriergeraden [Kalibriergeraden s. Anhang 7.3]

Arbeitsbereich [g/L]

Rel. Koeffizient [R2]

Azithromycin

0 15

0,999

Ceftiofur

0 150

0,998

Chloramphenicol

0 4,5

0,998

Clarithromycin

0 15

0,999

Doxycyclin

0 15

0,997

Erythromycin

0 60

0,999

Penicillin G

06

0,999

Sulfamethoxazol

0 15

0,997

Tetracyclin

0 150

0,998

Trimethoprim

0 75

0,999

Tylosin

0 75

0,999

Analyt

Tabelle 15: Arbeitsbereich fr Wasser in ng/L und Relationskoeffizient jeweiliger


Kalibriergeraden [Kalibriergeraden s. Anhang 7.3]

Arbeitsbereich [ng/L]

Rel. Koeffizient [R2]

Azithromycin

0 300

0,998

Ceftiofur

0 300

0,998

Chloramphenicol

0 300

0,999

Clarithromycin

0 300

0,998

Erythromycin

0 300

0,998

Penicillin G

0 300

0,998

Sulfamethoxazol

0 300

0,999

Trimethoprim

0 300

0,999

Tylosin

0 300

0,998

Analyt

45

Ergebnisse und Diskussion

4.3

Entwicklung der Extraktionsmethode fr Milch

4.3.1 Methodenauswahl und Optimierung


Nach einer Literaturrecherche wurden verschiedene Methoden nach Ziel-Analyten,
Ausrstungen sowie Chemikalien- und Zeitaufwand verglichen. Es wurden zunchst
drei Methoden als Vergleichsversuche ausgewhlt. Die detaillierten Informationen
der jeweiligen Methoden werden in Tabelle 16 zusammengefasst.
Die erste Methode (Methode 1, M1) basiert auf einer Applikation der Firma BEKOlut
und wurde ursprnglich zur Untersuchung von Cephalosporinen in Milch entwickelt.
Die Methode musste jedoch wegen der Verwendung geringeren Sulenvolumen von
3 ml statt 6 ml zuerst optimiert werden, indem die Mengen der Proben von 5 g auf 2
g und der Extraktions- sowie Lsungsmittel je um die Hlfte reduziert wurden. Nach
dem 1. Zentrifugieren (15 min bei 4000 rpm) wurde der berstand aufgenommen
und wieder fr 10 min zentrifugiert. Ein anderer optimierte Parameter war die
Temperatur bei der Endtrocknung, welche von 55 C auf 45 C verringert wurde. Um
die Wiederfindungsraten von Penicillin G und Ceftiofur zu verbessern, wurde die
Methode wieder optimiert, indem nur reines Methanol (ohne 2 %ige Essigsure) als
SPE-Elutionsmittel verwendet wurde. Nach einem erneuten, spteren Versuch
wurden bessere WFR von diesen beiden Analyten nachgewiesen. Alle genderten
bzw. optimierten Parameter der M1 sind in der Tabelle 16 aufgelistet.
In diesem Punkt werden die Ergebnisse der optimierten M1, M2 und M3 verglichen.
Die optimierte M1 zeigte die meistakzeptablen Wiederfindungsraten der untersuchten
Analyten im Vergleich zu den anderen beiden Methoden. Lediglich Ceftiofur liegt, mit
68 %, knapp unterhalb der im IGV geltenden Toleranzgrenze von 70 bis 120 %.
Die zweite Methode (Methode 2, M2) nach MARTNEZ-HUELAMO et al. [2009]
wurde

eigentlich

fr Penicilline

entwickelt,

wurde

jedoch wegen

geringen

Materialaufwands als Auswahl in dieser Arbeit durchgefhrt. Bei dieser Methode


wurde Phosphatpuffer (pH 10) als Extraktionsmittel genutzt, wobei sich einen EndpH-Wert von 8 in der Milchprobe ergibt. Die Methode kann aber keine Tetracycline
nachweisen. Eine akzeptable Wiederfindungsrate mit dieser Methode wurde nur bei
Chloramphenicol mit 110 %, Penicillin G mit 106 % und Trimethoprim mit 84 %

46

Ergebnisse und Diskussion

nachgewiesen. Bis auf Azithromycin mit WFR 126 % liegen die anderen
untersuchten Analyten unterhalb der Toleranzgrenze von 70 %.
Bei der dritten Methode (Methode 3, M3) nach BOHM et al. [2009] wurde McIllvainePuffer (pH 4) als Extraktionsmittel verwendet. Davor wurde die Milchprobe mit 20
%iger TCA-Lsung zur Proteinfllung zugegeben. Die Ergebnisse zeigten WFR
hher als 120 % bei Chloramphenicol (127 %), Azithromycin (126 %) und
Erythromycin (135 %). Akzeptable WFR sind bei Tetracyclin (102 %), Doxycyclin
(104 %), Trimethoprim (78 %) und Sulfamethoxazol (83 %) vorhanden. Die anderen
Analyten liegen unterhalb Toleranzgrenze.
Anhand der Ergebnisse wurde die optimierte M1 zur Milchextraktion ausgewhlt und
die genaue Durchfhrung der fertigen Methode wurde im Punkt 3.3.1 als EndMethode beschrieben. Die Abbildung 17 stellt die Wiederfindungsraten der jeweiligen
Wirkstoffe mit der optimierten M1, M2 und M3 dar. Die genaueren Ergebnisse sind
im Anhang 7.6 Tabelle 22 zu finden.
Vergleich der Methoden zur Milchextraktion und Aufreinigung
mittels SPE
150
125

WFR in %

100
75

M1, optimiert

50

M2
25

M3

Abbildung 17: Vergleich verschiedener Methoden


(Versuchskonditionen s. Tabelle 16; n=3)

47

Ergebnisse und Diskussion


Tabelle 16: Vergleichstabelle verschiedener Extraktionsmethoden zur Antibiotikaanalyse mittels SPE
Methode 1
Fa. BEKOlut

MILCH
Probenmenge

Methode 1
Fa. BEKOlut
(optimiert)

Methode 3
nach Bohm et al.

Methode 2
nach Martnez-Huelamo et
al.

5g

2g

2g

2g

ACN:H2O:Essigsure
(10:90:0,1)

ACN:H2O:Essigsure
(10:90:0,1)

0.1 M Phosphatpuffer pH 10

McIlvaine-Puffer pH 4 und
20%iger TCA-Lsung

5 ml

0,5 ml

10 ml

MeOH und Extraktionsmittel

MeOH, H2O, 0.1 M


Phosphatpuffer pH 10

MeOH und H2O

je 3 ml

je 1 ml

je 3 ml

Lsungsmittel H2O

H2O

H2O

H2O

Menge 6 ml

3 ml

3 ml

3 ml

MeOH

MeOH

MeOH

3 ml

2 ml

3 ml

45 C

45 C

45 C

Extraktion
Extraktionsmittel

Menge 10 ml
SPE
Konditionieren
Lsungsmittel

MeOH und Extraktionsmittel

Menge je 6 ml
Waschen

Elution
Lsungsmittel

MeOH mit 2 %iger


Essigsure

Wie viel? 2x 3 ml
Endtrocknung

55 C

48

Ergebnisse und Diskussion

4.3.2 Vergleich der SPE-Sule


Die Auswahl einer richtigen, geeigneten SPE-Sule ist der entscheidende Schritt bei
der Entwicklung einer SPE-Methode. Es wurden verschiedene in den Literaturen
beschriebenen SPE-Sorbentien studiert, um eine maximale Wiederfindung und einen
effizienten Aufreinigungsschritt zu erzielen. Die Sulenauswahl zur Analyse von
Antibiotika liegt an polymeren SPE-Sorbentien.
Verschiedene polymerbasierte SPE-Sulen der Firma BEKOlut: BEKOlut SCL, LEOX
HLB (mit hydrophil-hydrophobem Gleichgewicht), LEOX Plus und LEOX wurden in
Extraktionsversuchen getestet und verglichen. Im Prinzip sind alle getesteten Sulen
sowohl fr polare als auch fr unpolare Analyten geeignet und haben die gleiche pHStabilitt von 1 14.
Zum Sulenvergleich wurde die SPE-Methode nach Applikationen der Firma
BEKOlut (M1) durchgefhrt.
LEOX hat mit einem Toleranzbereich von 70 120 % die beste Wiederfindungsrate
der meisten untersuchten Analyten erzielt. Lediglich lag die WFR von Azithromycin
mit 122 % knapp ber dem Toleranzbereich und Ceftiofur lag mit 31 % weit unter
dem Toleranzbereich.
Mit LEOX HLB konnte nur bei Azithromycin eine akzeptable Wiederfindung von 101
% nachgewiesen werden. Die WFR von Tetracyclinen-Gruppe lag weit ber dem
Toleranzbereich. Bei allen anderen Antibiotika ergab sich eine WFR von weniger als
70 %.
Die Sule LEOX SCL hat WFR (>120 %) bei Chloramphenicol gezeigt. Eine
akzeptable WFR kann nur bei Trimethoprim mit 80 % nachgewiesen werden. Die
anderen Analyten unterschreiten die untere Toleranzgrenze.
LEOX Plus hat im Allgemein die schlechteste Wiederfindung bei allen Analyten. Es
gab keinen einzigen Analyten, dessen WFR im akzeptablen Bereich lag. Vor allem
bei Tetracyclinen und Makroliden wurde eine WFR von <5 % nachgewiesen.
Die Wiederfindungsrate des jeweiligen Analyten wird in der Abbildung 18 dargestellt.
Die genaueren Ergebnisse sind im Anhang 7.6 Tabelle 23 zu finden.
49

Ergebnisse und Diskussion

Vergleich der SPE-Sulen fr Milchextraktion

140,0
120,0

WFR in %

100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0

SCL
HLB
Leox Plus
Leox

Abbildung 18: Wiederfindung untersuchter Antibiotika mit verschiedenen SPE-Sulen


(Versuchskonditionen s. Tabelle 16 Methode 1 optimiert; n=3)

50

Ergebnisse und Diskussion

4.4

Entwicklung der Extraktionsmethode fr Wasser

Fr Antibiotikarckstnde in Trinkwasser gibt es weder national noch international


gesetzlich festgelegte Hchstmengen. Die meisten Untersuchungen stellen lediglich
die maximal nachweisbaren Gehalte an Antibiotikarckstnden dar.
Die ausgewhlte Methode basiert auf einer Applikation der Firma BEKOlut. Die
Methode wurde ursprnglich fr Abwasser entwickelt und wurde deshalb in dieser
Arbeit fr Trinkwasser etwas modifiziert. Die Methode basiert so wie bei Milch auch
auf einer Aufreinigung und Pre-Konzentrierung mittels SPE (Methode siehe Punkt
3.3.2 Wasseruntersuchung). Die Elution erfolgte laut ursprnglicher Methode in zwei
Fraktionen, und zwar in Methanol und in Methanol:Ameisensure (100+1). Jedoch
wurden in Methanol:Ameisensure nur sehr geringe Peakintensitten bei fast allen
Analyten, im Vergleich zu Methanol-Fraktion, nachgewiesen und die WFR der
Analyten in dieser Fraktion liegen alle auerhalb des Toleranzbereiches. Aus diesem
Grund wird die Elution in der End-Methode (Punkt 3.3.2) nur mit Methanol
beschrieben.
Ein Vergleich von SPE-Sulen zwischen LEOX und LEOX Plus wurde durchgefhrt,
da diese beiden polymeren Sulen laut Hersteller gut fr wssrige Matrix geeignet
sind.
In Abbildung 19 wird die Wiederfindung der untersuchten Antibiotika mit LEOX und
LEOX Plus dargestellt. Die Ergebnisse zeigten mit LEOX bessere WFR bei den
meisten Analyten. Die WFR untersuchter Analyten liegen mit LEOX, bis auf
Sulfamethoxazol, im bei IGV-Prflabor geltenden Toleranzbereich (70 120 %). Die
WFR von Sulfamethoxazol liegt mit 123 % knapp ber dem Toleranzbereich. Mit
LEOX Plus unterschreiten Beta Lactame (Ceftiofur und Penicillin G) Makroliden
(Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin und Tylosin) die Toleranzgrenze.
Trimethoprim liegt bei WFR >120 %. Lediglich liegen Sulfamethoxazol mit 103 % und
Chloramphenicol mit 119 % innerhalb der Toleranzgrenzen.
Die Tetracycline (Tetracyclin und Doxycyclin) konnten mit der entwickelten Methode
sowohl mit LEOX als auch mit LEOX Plus nicht erfasst werden. Es wird vermutet,
dass Tetracycline durch ihre irreversible Adsorption an SPE-Material mittels SPE
nicht extrahierbar sind. Die Zugabe von EDTA-Lsung in die Wasserprobe knnte
51

Ergebnisse und Diskussion

eine SPE-Extraktion von Tetracyclinen ermglichen [HIRSCH et al., 1998] und kann in
der Zukunft getestet werden.
Die genaueren Ergebnisse sind im Anhang 7.6 Tabelle 24 zusammengefasst.
Vergleich der SPE-Sulen fr Wasserextraktion
140,0
120,0

WFR in %

100,0
80,0
60,0

Leox
Leox Plus

40,0
20,0
0,0

Abbildung 19: Vergleich der SPE-Sulen LEOX und LEOX Plus fr Wasserextraktion
(2 g Wasserprobe; SPE-Kondition: Konditionieren mit 3 ml H2O, Waschen mit 3 ml H2O, Elution mit 3
ml MeOH; Endtrocknung bei 45 C; n=3)

52

Ergebnisse und Diskussion

4.5

Validierung der Methode

Die Validierung der gesamten Analysenmethode fr Milch wurde durchgefhrt.


Hierbei

wurden

Kalibrierbereich,

Untersuchungen
Linearitt,

zu

Nachweis-

Selektivitt
und

(Spezifitt),

Arbeits-

Bestimmungsgrenzen,

bzw.

Przision

einschlielich Wiederhol- und Laborprzision, Richtigkeit, Stabilitt und MatrixEffekte durchgefhrt.

4.5.1 Selektivitt (Spezifizitt)


Fr den Nachweis der Selektivitt wurden drei Blank-Proben der Matrix Milch mit LCMS/MS gemessen. Diese Blank-Proben drfen keine strenden Interferenzen
aufweisen, so dass die Wirkstoffe eindeutig identifiziert werden knnen. Zudem muss
garantiert werden, dass die einzelnen Wirkstoffe untereinander eindeutig identifiziert
werden knnen.
In Abbildung 20 und 21 ist das TIC (Total Ion Chromatogramm) einer Blank-Probe in
positivem sowie negativem Ionisierungsmodus abgebildet. Anhand des TIC der
Blank-Probe in positiv wurden zwar Peaks mit hohen Intensitten in den Minuten
4.36 und 5.09 erkannt, aber keiner der untersuchten Analyten hat diese
Retentionszeiten. Die Retentionszeiten sind im Kapitel 3 Tabelle 12 (MRMbergnge der einzelnen Analyten) zu finden.

Abbildung 20: TIC Blank-Probe in positiver Ionisierung

53

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 21: TIC Blank-Probe in negativer Ionisierung

In der Blank-Probe erscheinen bis auf Penicillin G weder in positiv noch in negativ
Peaks zur gleichen RT und mit gleichem m/z Verhltnis mit den untersuchten
Analyten. In den Abbildungen 22 und 23 sind die XIC (Extracted Ion
Chromatogramme) z. B. von Tetracyclin und Penicillin G, verglichen in der BlankProbe, dotierter Milchprobe (1*MRL) und in der Standardlsung (1*MRL) dargestellt.

Abbildung 22: XIC Tetracyclin in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und
im Lsemittelstandard 1*MRL (c)
54

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 23: XIC Penicillin G in Blank-Probe (a), dotierter Milchprobe 1*MRL (b) und
im Lsemittelstandard 1*MRL (c)

Aus der Abbildung 23 kann einen Peak mit hnlicher RT und m/z wie Penicillin G in
der Blank-Probe beobachtet werden. Der berechnete Leerwert von diesem Peak liegt
jedoch unterhalb der Nachweisgrenze, die nach DIN 32645 berechnet wurde. Da
eine qualitative Aussage erst oberhalb der Nachweisgrenze und eine quantitative
Aussage

erst oberhalb

der Bestimmungsgrenze

zulssig

ist,

kann

davon

ausgegangen werden, dass die Peaks in den Blank-Proben keinen strenden


Einfluss auf die Messung haben. Die jeweiligen XIC der untersuchten Analyten mit
jeweiliger Retentionszeit sind im Anhang 7.2 zu finden.

4.5.2 Kalibrierbereich
Fr

eine

quantitative

Bestimmung

der

Antibiotikarckstnde

mssen

die

Analysengerte mit den jeweiligen Wirkstoffen kalibriert werden. Bei der Auswahl des
Kalibrierbereiches

wurden

Mindestleistungsgrenzen

die

MRLs

der Wirkstoffe

sowie

bercksichtigt

die
und

erforderlichen
auf

eine

relativ

gleichmige Verteilung der Kalibrierpunkte geachtet, wie im Punkt 4.2. bereits


diskutiert werden.
55

Ergebnisse und Diskussion

Die Kalibriergeraden sowie die ermittelten Kalibrierfunktionen sind im Anhang 7.3


dargestellt. Jeder Kalibrierpunkt wurde 8-mal gemessen und mittels Grubbs-Test auf
Ausreier geprft. Es wurden bei allen Kalibrierpunkten von allen Analyten keine
Ausreier festgestellt. Die Linearitt wurde nach Mandel-Test geprft und die
Ergebnisse werden im Punkt 4.5.3 diskutiert.
Der ermittelte Kalibrierbereich kann zur Quantifizierung verwendet werden, da die
berechneten Bestimmungsgrenzen bei allen untersuchten Analyten ber dem
niedrigsten Kalibrierpunkt liegen (siehe Punkt 4.5.4 Tabelle 18). Messwerte, die
unterhalb der Bestimmungsgrenze liegen, drfen nicht zur Quantifizierung verwendet
werden, da sie die erforderliche Ergebnissicherheit nicht aufweisen knnen [NEITZEL,
2003].

4.5.3 Linearitt
Die berprfung des Kalibrierbereiches auf Linearitt erfolgte mit Hilfe des MandelF-Tests. Aus den Daten der Kalibrierung wurde das Bestimmtheitsma R berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 zusammengefasst.
Tabelle 17: Linearitt der Kalibrierfunktionen einzelner Wirkstoffe nach Mandel F-Test
und Bestimmtheitsma R2

Target Ion

Qualifier Ion

Linearitt
nach Mandel
F-Test

Bestimmtheitsma R2

Linearitt
nach Mandel
F-Test

Bestimmtheitsma R2

Azithromycin

ja

0,999

ja

1,000

Ceftiofur

ja

0,998

ja

0,996

Chloramphenicol

ja

0,998

ja

1,000

Clarithromycin

ja

0,999

ja

0,998

Doxycyclin

ja

0,997

ja

0,992

Erythromycin

ja

0,999

ja

0,994

Penicillin G

ja

0,999

ja

0,992

Sulfamethoxazol

ja

0,997

ja

0,994

Tetracyclin

ja

0,998

ja

0,996

Trimethoprim

ja

0,999

ja

1,000

Tylosin

ja

0,999

ja

0,996

Analyt

56

Ergebnisse und Diskussion

Anhand der Tabelle konnte festgestellt werden, dass die Kalibriergerade des Target
Ions bei allen Analyten mit einer 99 %-igen Signifikanz linear ist. Diese wird mit den
berechneten Bestimmtheitsmaen besttigt, die zwischen 0,997 und 0,999 liegen.
Fr die Kalibriergeraden mit den Qualifier Ionen ist eine Linearitt mit 90 %-igen
Signifikanz ebenfalls vorhanden. Die Bestimmtheitsmae wurden zwischen 0,992
und 1,000 bestimmt.

4.5.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenze


Die Nachweis- (LOD) und Bestimmungsgrenze (LOQ) wurden in der vorliegenden
Arbeit

nach

DIN

32645

ber

die

indirekte

Methode

mit

einer

relativen

Ergebnisunsicherheit von 33,3 % ermittelt (Berechnungsformel siehe Anhang 7.1).


Die Berechnung der Nachweisgrenze erfolgte mit dem Qualifier-Ion mit einer
Signifikanz von 90 %. Die Berechnung der Bestimmungsgrenze erfolgte mit dem
Target Ion bei einer Signifikanz von 99 %. Die ermittelten Nachweis- und
Bestimmungsgrenzen sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 18: Nachweis- und Bestimmungsgrenze nach DIN 32645

Nachweisgrenze
Signifikanz 90%
[g/kg]

Bestimmungsgrenze
Signifikanz 99%
[g/kg]

MRL
[g/kg]

Azithromycin

0,38

2,99

Ceftiofur

6,91

40,37

100

Chloramphenicol

0,09

0,60

0,3*

Clarithromycin

0,58

2,51

Doxycyclin

0,97

4,88

Erythromycin

3,64

16,88

40

Penicillin G

0,41

2,90

Sulfamethoxazol

0,84

4,98

Tetracyclin

6,80

43,06

100

Trimethoprim

1,28

14,51

50

Tylosin

6,20

17,48

50

Analyt

*Festgelegte MRPL (Mindestleistungsgrenze)

57

Ergebnisse und Diskussion

In der zur Berechnung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze verwendeten Matrixbasierten Kalibrierreihe des Target- sowie Qualifier-Ions war kein Ausreier
feststellbar. Bei allen Kalibrierreihen war eine Linearitt vorhanden. Somit knnen die
ermittelten Nachweis- und Bestimmungsgrenzen besttigt werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die ermittelten Nachweisgrenzen fr Stoffe ohne
gesetzlich festgelegten MRL bzw. MRPL zwischen 0,38 und 0,97 g/kg liegen. Bei
Chloramphenicol wird eine Nachweisgrenze von 0,09 g/kg ermittelt und somit erfllt
es die festgelegte Mindestleistungsgrenze nach der Kommissionsentscheidung
2003/181/EG von 0,3 g/kg.
Fr Stoffe mit MRL von 40 100 g/kg werden Nachweisgrenzen zwischen 1,28 und
6,9 g/kg nachgewiesen. Fr Penicillin wird eine Nachweisgrenze von 0,41 g/kg
bzw. ca. 1/10 des festgelegten MRLs bestimmt.
Bei allen Wirkstoffen, fr die Grenzwerte festgelegt worden sind, werden
Bestimmungsgrenzen auf dem 99 % Signifikanzniveau ermittelt, die alle unterhalb
des

gesetzlichen

Grenzwertes

liegen.

Die

Bestimmungsgrenze

ist

von

entscheidender Bedeutung bei der Beurteilung von Rckstnden in realen Proben.


Laut den ermittelten Ergebnissen kann die Aussage getroffen werden, dass die
Methode empfindlich ist. Die Verwendung der Matrix-basierten Kalibrierreihen bei der
Berechnung, fhrt zudem zu realistischeren Werten in Bezug auf die realen Proben.

4.5.5 Przision
Die Messungen zur Przision erfolgten bei niedriger, mittlerer und hoher
Konzentration in Relation zum Konzentrationsbereich der Wirkstoffe. Als Ma fr die
Przision wird die relative Standardabweichung (RSD) in % bestimmt. Aus den
ermittelten Daten wurden sowohl die Wiederholprzision (RSDr) als auch die
Laborprzision (RSDwR) berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 dargestellt.

58

Ergebnisse und Diskussion


Tabelle 19: Wiederholprzision RSDr und Laborprzision RSDwR in %

Analyt

Azithromycin

Ceftiofur

Chloramphenicol

Clarithromycin

Doxycyclin

Erythromycin

Penicillin G

Sulfamethoxazol

Tetracyclin

Trimethoprim

Tylosin

Dotierte Konz.
[g/L]

Wiederholprzision
RSDr [%]

Laborprzision
RSDwR [%]

5,1

34,7

10

8,9

25,5

15

4,2

28,9

50

4,3

11,2

100

3,4

7,7

150

2,8

9,3

1,5

5,5

10,5

4,0

12,6

4,5

2,9

11,9

2,3

7,3

10

3,8

10,0

15

2,0

9,9

1,7

6,9

10

3,6

8,4

15

2,4

7,9

25

3,1

6,3

40

2,5

8,9

60

2,4

6,9

4,3

6,1

3,9

13,9

2,5

3,4

3,6

10,9

10

2,7

14,9

15

3,1

6,5

50

2,5

8,4

100

4,1

12,1

150

3,8

11,1

25

2,4

5,8

50

1,5

6,7

75

1,4

4,7

25

5,1

10,6

50

6,1

8,2

78

2,8

12,7

59

Ergebnisse und Diskussion

Die Wiederholprzision RSDr sollte laut der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG


bei jeder Konzentration 20% betragen. Bei allen Konzentrationen kann sogar eine
RSDr <10% nachgewiesen werden.
Die Laborprzision ist jedoch weniger reproduzierbar als die Wiederholprzision, da
sie grere RSD auf jedem Konzentrationsniveau liefert. Trotzdem erfllen alle
Wirkstoffe bis auf Azithromycin bei allen Konzentrationen das Kriterium der
Kommissionsentscheidung mit einer RSDwR 20 % fr Konzentrationen von 10 bis
100 g/kg und einer RSDwR 15 % fr Konzentrationen >100 g/kg. Bei
Azithromycin berschreiten die ermittelten RSDwR bei allen Konzentrationen die
zulssige Grenze.
Insgesamt kann aber die Aussage getroffen werden, dass die entwickelte Methode
eine przise Methode ist. Die Przision ist unter anderem wichtig zur Besttigung der
Bestimmungsgrenzen, da diese nur Gltigkeit haben, wenn sie mit einer definierten
Przision (RSD 20%) nachgewiesen werden. Da lediglich die Wiederholprzision
im Rahmen der Validierung bestimmt werden soll und die Laborprzision aus Daten
der

fortlaufenden

Qualittskontrolle

bestimmt

werden

knnen,

wird

davon

ausgegangen, dass zur Besttigung der Bestimmungsgrenze die Ergebnisse der


Wiederholprzision gengen. Auf dieser Grundlage liegen fr alle Wirkstoffe gute
Przisionsdaten im Bereich der Bestimmungsgrenzen vor.
In den folgenden Abbildungen wird die Verteilung der ermittelten Wiederhol- und
Laborprzisionen bei jeweiligen Konzentrationsniveaus grafisch dargestellt.
RSDr und RSDwR bei niedrigen Konzentrationen

Anzahl der Analyten

12
10
8
6

RSDr

RSDwR

2
0
0 - 10 %

10 - 20 %

>20 %

RSD in %

Abbildung 24: RSDr und RSDwR bei niedrigem Konzentrationniveau (0,5*MRL)


60

Ergebnisse und Diskussion

RSDr und RSDwR bei mittleren Konzentrationen

Anzahl der Analyten

12
10
8
6

RSDr

RSDwR

2
0
0 - 10 %

10 - 20 %

>20 %

RSD in %

Abbildung 25: RSDr und RSDwR bei mittlerem Konzentrationniveau (1*MRL)


RSDr und RSDwR bei hohen Konzentrationen

Anzahl der Analyten

12
10
8
6

RSDr

RSDwR

2
0
0 - 10 %

10 - 20 %

>20 %

RSD in %

Abbildung 26: RSDr und RSDwR bei hohem Konzentrationniveau (1,5*MRL)

4.5.6 Richtigkeit/Wiederfindung
Die Richtigkeit wurde in dieser Arbeit durch die Bestimmung der Wiederfindung auf
einem

niedrigen

und

einem

hohen

Konzentrationsniveau

des

jeweiligen

Kalibrierbereiches der einzelnen Analyten nachgewiesen. Die durchschnittlichen


Wiederfindungsraten (WFR) und die dazugehrigen relativen Standardabweichungen
sind in der Tabelle 20 und 21 zusammengefasst.

61

Ergebnisse und Diskussion


Tabelle 20: Wiederfindungsrate in % bei niedrigen Konzentrationen (rotmarkierte
Zahlen liegen auerhalb der Grenzen nach 2002/657/EG ) (n=3)

Dotierte
Konz.
[g/L]

Akzeptabler
Bereich laut
2002/657/EG
[%]

WFR
[%]

RSD
[%]

Azithromycin

70 110

55,4

14,1

Ceftiofur

50

80 110

70,0

7,0

Chloramphenicol

1,5

70 110

129,3

9,4

Clarithromycin

70 110

98,8

13,7

Doxycyclin

70 110

99,7

5,7

Erythromycin

20

80 110

92,7

15,6

Penicillin G

70 110

120,9

4,0

Sulfamethoxazol

70 110

83,6

5,8

Tetracyclin

50

80 110

94,7

8,7

Trimethoprim

25

80 110

99,9

7,6

Tylosin

25

80 110

72,3

6,7

Analyt

Tabelle 21: Wiederfindungsrate in % bei hohen Konzentrationen (rotmarkierte Zahlen


liegen auerhalb der Grenzen nach 2002/657/EG ) (n=3)

Dotierte
Konz.
[g/L]

Akzeptabler
Bereich laut
2002/657/EG
[%]

WFR
[%]

RSD
[%]

Azithromycin

10

80 110

60,5

10,4

Ceftiofur

100

80 110

79,8

4,8

Chloramphenicol

70 110

145,1

20,4

Clarithromycin

10

80 110

106,0

9,6

Doxycyclin

10

80 110

112,1

6,1

Erythromycin

40

80 110

102,2

10,1

Penicillin G

70 110

110,9

4,7

Sulfamethoxazol

10

80 110

108,5

11,8

Tetracyclin

100

80 110

118,6

11,8

Trimethoprim

50

80 110

105,4

4,5

Tylosin

50

80 110

82,7

7,1

Analyt

Anhand der Kommissionsentscheidung 2002/657/EG ist der Toleranzbereich fr die


Wiederfindung nach Massenanteil geregelt. Fr einen Massenanteil >1 g/kg bis 10
62

Ergebnisse und Diskussion

g/kg wird ein Toleranzbereich von 70 110 % festgelegt, fr einen Massenanteil


10 g/kg 80 110 %. Dieses Kriterium kann bei niedrigen Konzentrationen an
Azithromycin, Ceftiofur, Chloramphenicol, Penicillin G und Tylosin nicht erfllt
werden. Bei hohen Konzentrationen liegen Azithromycin und Chloramphenicol
deutlich auerhalb der festgelegten Toleranzgrenzen, wobei Ceftiofur, Doxycyclin
und Penicillin G die Grenzwerte knapp unter- bzw. berschreiten.
Im IGV-Prflabor wird bei beliebigen Konzentrationen ein Toleranzbereich fr eine
Wiederfindungsrate von 70 120 % angefordert. Mit diesem Kriterium liegen die
Wirkstoffe Azithromycin und Chloramphenicol bei beiden Konzentrationen deutlich
auerhalb der Grenzen, wobei die Wiederfindungsrate von Azithromycin <70 % und
von Chloramphenicol >120 % betragen. Penicillin G liegt bei niedriger Konzentration
mit 120,9 % sehr knapp ber dem unteren Grenzen.
Ein Grund fr die niedrige Wiederfindungsrate von Azithromycin knnte darin liegen,
dass dieser Wirkstoff nicht vollstndig extrahiert wurde, was auch die hnlichen
Wiederfindungsraten von 55,5 % bei niedriger Konzentration und 60,5 % bei hoher
Konzentration besttigen. Eine andere Mglichkeit knnte auch durch das
Vorhandensein von Suren im Extraktionsmittel in dem potentiellen Abbau von
Azithromycin bestehen, da einige Makroliden im sauren Milieu abgebaut werden
knnen. Bei ausreichenden konstanten Wiederfindungsraten kann das Ergebnis bei
der Quantifizierung im Prinzip mit einem Korrekturfaktor korrigiert werden.
Bei Chloramphenicol knnte es hnlich wie bei Azithromycin sein, dass dieser
Wirkstoff nicht vollstndig in das Lsungsmittel bergeht. Eine weitere Mglichkeit
besteht in der potentiellen Hydrolisierung von Chloramphenicol bei pH <7 in
wssriger Lsung (in diesem Fall das verwendete Extraktionsmittel, das 90 % aus
Wasser besteht) [HU Berlin].

63

Ergebnisse und Diskussion

4.5.7 Stabilitt
Die Stabilitt der Analyten im Probenextrakt wurde untersucht. Die Lsungen wurden
nach Probenaufbereitung direkt mittels LC-MS/MS analysiert und im Tiefkhlschrank
(-18 C) gelagert. Nach unterschiedlichen Standzeiten (3, 7 und 14 Tage) wurde die
Lsung wieder gemessen und die Messsignale verglichen. In der folgenden
Abbildung sind die Ergebnisse grafisch dargestellt.

Stabilitt der Wirkstoffe in Matrix


2,000

1,800

1,600

Azithromycin

1,400

Ceftiofur
Chloramphenicol

Area ratio

1,200

Clarithromycin
Doxycyclin
1,000

Erythromycin
Penicillin G

0,800

Sulfamethoxazol
Tetracyclin
Trimethoprim

0,600

Tylosin
0,400

0,200

0,000
18.07.

21.07.

25.07.

01.08.

Abbildung 27: Stabilittstest der Wirkstoffe in Milchmatrix mittels LC-MS/MS

Die meisten Wirkstoffe zeigten bis zu 14 Tage gute Stabilitt bei -18 C. Dennoch
wurde bei Tetracyclin und Ceftiofur festgestellt, dass diese Wirkstoffe innerhalb der
angegebenen

Standzeiten

abgebaut

haben.

Sollte

der

Probenextrakt

bei

Raumtemperatur aufbewahrt werden, wre eine starke Senkung der WFR von
Antibiotika mit hoher Wahrscheinlichkeit mglich.

64

Ergebnisse und Diskussion

4.5.8 Matrix-Effekte
Die berprfung auf das Vorhandensein von Matrix Effekten erfolgte durch den
Vergleich der Messwerte der einzelnen Wirkstoffe in Lsemittel und in Matrix. Die
Messwerte in der Matrix (vertikale Achse) wurden gegen die Messwerte im
Lsemittel

(horizontale

Achse)

aufgetragen.

Als

Messwert

diente

das

Flchenverhltnis der Wirkstoffe zum ISTD (area ratio). Eine Signalverstrkung liegt
vor, wenn der Messwert in der Matrix hher ist als im Lsemittel wie bei Tetracyclin
(Abbildung 29). Im umgekehrten Fall erfolgt eine Signalunterdrckung wie bei Tylosin
(Abbildung 30). Lediglich bei Trimethoprim wird weder eine Signalverstrkung noch
eine Signalunterdrckung erwiesen (Abbildung 28).

Abbildung
28:
Messwerte
von
Trimethoprim in Matrix- und Lsemittel

Abbildung
29:
Messwerte
von
Tetracyclin in Matrix und Lsemittel

Abbildung 30: Messwerte von Tylosin in


Matrix- und Lsemittel

65

Ergebnisse und Diskussion

Aufgrund dieser Ergebnisse soll die Quantifizierung mittels Matrix-Kalibrierung


erfolgen. Das Ausma der Matrix Effekte ist von Analyt zu Analyt unterschiedlich
stark ausgeprgt, wobei der strkste Matrixeffekt in dieser Arbeit bei Tetracyclin zu
beobachten ist. Die Darstellung der Matrix-Effekte anderer untersuchten Antibiotika
ist im Anhang zu finden.
Es gibt verschiedene Mglichkeiten, die Matrix-Effekte verursachen knnen. Vor
allem ist die Probenvorbereitung als eine Ursache anzusehen. Matrixbestandteile,
die die sptere Ionisierung beeinflussen knnen, knnen dabei mitextrahiert und
teilweise durch SPE nicht vollstndig entfernt werden. Verschiedene Manahmen zur
Reduzierung von Matrix-Effekten knnen z. B. ein verbessertes Clean-Up Verfahren
oder die Verdnnung des Endextraktes vor LC-MS/MS-Messung sein. [STAHNKE,
2012]

66

Zusammenfassung

5.

Zusammenfassung

Viele Klassen von Antibiotika werden hufig zur Vorbeugung und Behandlung von
verschiedenen Krankheiten von lebensmittelliefernden Tieren verwendet. Dies kann
zu Rckstnden in einigen Lebensmittelprodukten wie Milch fhren. Zustzlich
knnen Antibiotikarckstnde aus Menschen und Tieren ber verschiedene Wege in
Oberflchengewsser

gelangen,

dort

verbleiben

diese

und

knnen

zu

Trinkwasseraufbereitungsanlagen transportiert werden. Diese Situationen knnen


problematisch

sein,

da

Antibiotikarckstnde

allergische

Reaktionen

bei

berempfindlichen Menschen hervorrufen knnen. Auerdem zeigten verschiedene


Studien, dass Low-Level-Dosen von Antibiotika ber einen lngeren Zeitraum zu
Bakterienresistenzen fhren knnen. Andererseits knnen die Rckstnde in Milch
das Wachstum der Fermentation von Bakterien whrend der Herstellung von
Milchprodukten verlangsamen oder zerstren.
Um die menschliche Lebensmittelsicherheit zu gewhrleisten, hat die Europische
Union Rckstandshchstmengen (MRL) in Milch fr einige Antibiotika festgelegt. Fr
Trinkwasser gibt es jedoch weder nationale noch internationale Regelungen, aber es
ist notwendig, Gesundheitsinformationen wie ADI-Werte abzuleiten.
In

dieser

Masterarbeit

Antibiotikarckstnden

wurde
in

eine
Milch

Methode
und

Hochleistungsflssigkeitschromatographie

zur

Untersuchung

Trinkwasser

gekoppelt

mit

von
mittels
der

Tandemmassspektrometrie nach Extraktions- und Aufreinigungsschritten mittels SPE


entwickelt. Zu den ausgewhlten Antibiotika gehren zwei Beta-Lactame, vier
Makrolide, ein Sulfonamid, ein Diamino-pyrimidin-Derivat, zwei Tetracycline und ein
Amphenicol.
Eine SPE-Methode zur Probenaufbereitung von Milch wurde optimiert, indem die
Milchprobe nach Zugabe von Extraktionsmittel aus Acetonitril:Wasser:Essigsure
(10:90:0,1, v/v) in eine Phasentrennung kommt und ein Aufreinigungsschritt des
klaren berstandes durch Verwendung von Polymer-SPE-Kartusche BEKOlut
LEOX erfolgte. Zunchst wurde die Kartusche mit Methanol und Extraktionsmittel
konditioniert, bevor der Probenberstand in die Kartusche zugegeben wurde.
Danach wurde die Kartusche mit Wasser gewaschen, unter Stickstoffstrom
getrocknet und anschlieend mit Methanol eluiert.
67

Zusammenfassung

Durch Verwendung der gleichen SPE-Kartusche wurde eine weitere SPE-Methode


zur Trinkwasserprobenaufbereitung optimiert, wobei der Unterschied zur Milchprobe
darin besteht, dass das Konditionieren der SPE-Kartusche mit Methanol und Wasser
erfolgte und die Trinkwasserprobe direkt ohne Phasentrennung bzw. ohne vorherige
Zugabe von Extraktionsmittel in die Kartusche aufgegeben wurde. Die Wasch- und
Elutionsschritte entsprechen der Methode fr Milch.
Die Chromatographiesule Kinetex-C18 der Firma Phenomenex wurde ausgewhlt.
Als mobile Phase wurde 0,1 %ige Ameisensure in Wasser sowie Methanol
verwendet.

Ein

Gradientenprogramm

bestehend

aus

Zeit

und

Eluentenzusammensetzung wurde ebenfalls in dieser Arbeit optimiert. Die Antibiotika


wurden

durch

Elektrospray-Ionisation

im positiven

als

auch

im

negativen

Ionenmodus im Multiple Reaction Monitoring (MRM) Mode nachgewiesen.


Die entwickelte Methode fr Milch wurde validiert. Die Validierung bezieht sich auf
die Kriterien nach Kommissionsentscheidung 2002/657/EG

und wurde mit

VALISTAT-Software nach Prfkriterien der GTFCh angepasst und ausgewertet. Die


validierten Prfparameter waren Arbeits- bzw. Kalibrierbereich, Linearitt, Nachweisund Bestimmungsgrenze (als Ersatz von CC und CC), Przision einschlielich
Wiederhol-

und

Laborprzision,

Richtigkeit/Wiederfindung,

Matrixeffekte

und

Stabilitt. Die ermittelten Ergebnisse erfllen bis auf die Richtigkeit das Kriterium der
Kommissionsentscheidung. Je fnf Antibiotika bei jedem Konzentrationsniveau
erreichen die von der Kommissionsentscheidung festgelegten Kriterien fr WFR
nicht, wobei die Kriterien nach Massenanteil (g/kg) geregelt sind. Jedoch lagen
diese WFR bei allen Analyten bis auf Azithromycin (55,5 % bzw. 60,5 %) und
Chloramphenicol (129 % und 145 %) innerhalb des im IGV Prflabor geltenden
Toleranzbereiches von 70 120 %.
Mit der fr Trinkwasser entwickelten Methode konnten keine WFR fr Tetracycline
(Tetracyclin und Doxycyclin) bestimmt werden. Eine mgliche Ursache hierfr knnte
die irreversible Adsorption der Tetracycline an das SPE-Material sein. Eine Zugabe
von EDTA-Lsung in die Wasserprobe zum Nachweis von Tetracyclinen knnte in
weiteren Versuchen getestet werden. Die WFR aller untersuchten Analyten lag bis
auf Sulfamethoxazol (WFR 123 %) im Toleranzbereich.

68

Literaturverzeichnis

6.

Literaturverzeichnis

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74

Anhang

7.

Anhang

7.1

Formeln

Ausreier-Test nach Grubbs

Prfgre (mit dem Tabellenwert aus der Grubbs-Tabelle verglichen)


ausreierverdchtiger Wert
Mittelwert
Standardabweichung
Prfung auf Linearitt nach Mandel

Differenz der Abweichungsvarianzen


Reststandardabweichung der linearen Funktion
Reststandardabweichung der quadratischen Funktion
Anzahl der Messungen, d. h. Anzahl der Konzentrationen, bei Doppeloder Dreifachbestimmung Anzahl der Mittelwerte
Anschlieend wird der Prfwert berechnet:

Prfwert (mit dem Tabellenwert aus der F-Tabelle verglichen)


Prfung auf Varianzhomogenitt

Prfgre (mit dem Tabellenwert aus der F-Tabelle verglichen)

75

Anhang

Bestimmung auf Nachweis- und Bestimmungsgrenze nach DIN 32645

Nachweisgrenze nach DIN 32645


Bestimmungsgrenze nach DIN 32645
Verfahrensstandardabweichung
relative Ergebnisunsicherheit
Quantil der t-Verteilung
Wahrscheinlichkeit fr Fehler 1. Art
Anzahl der Wiederholbestimmungen je Konzentration
Anzahl der Kalibrierpunkte
Mittelwert aller Gehaltsgren
Summe der Abweichungsquadrate
Berechnung der Konzentration

Konzentration in g/L
Area ratio Analyt/ISTD in der Probe
Ordinatenabschnitt der Kalibriergerade
Steigung der Kalibriergerade

Gehalt in g/kg

Milch

Dichte von Milch 1,2198 g/ml (n=3)

76

Anhang

Berechnung der Wiederhol- und Laborprzision

Wiederholprzision
tagesverschiedene Laborprzision
Wiederholvarianz
Varianz zwischen den Tagen
Mittelwert aller Bestimmungen
Bestimmung der Wiederfindung

Mittelwert Area ratios in der Probe


Mittelwert Area ratios in Matrixkalibrierung

77

Anhang

7.2

Chromatogramme

Dotierte Milchprobe

Abbildung 31: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Azithromycin K5 (20 g/L)

Abbildung 32: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Ceftiofur K4 (100 g/L)

78

Anhang

Abbildung 33: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Chloramphenicol K5 (4,5 g/L)

Abbildung 34: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Clarithromycin K4 (15 g/L)

79

Anhang

Abbildung 35: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Doxycyclin K5 (20 g/L)

Abbildung 36: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Erythromycin K4 (40 g/L)

80

Anhang

Abbildung 37: XIC ISTD_neg (15 g/L) und Penicillin G K4 (4 g/L)

Abbildung 38: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Sulfamethoxazol K5 (20 g/L)

81

Anhang

Abbildung 39: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tetracyclin K4 (100 g/L)

Abbildung 40: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Trimethoprim K4 (50 g/L)

82

Anhang

Abbildung 41: XIC ISTD_pos (15 g/L) und Tylosin K5 (75 g/L)

83

Anhang

7.3

Kalibriergeraden (Milch)
Azithromycin

Chloramphenicol

0,12

0,2

0,16

0,08

Area ratio

Area ratio

0,1

y = 0,0072x + 0,0003
R = 0,9991

0,06
0,04
0,02

0,12
y = 0,0383x - 0,0006
R = 0,9981

0,08
0,04
0

0
0

10

15

20

-0,04

Konzentration in g/kg

Abbildung 42: Kalibriergerade von Azithromycin (Milch)

Abbildung 44: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Milch)

Clarithromycin

2,5

1,6

1,2

1,5

Area ratio

Area ratio

Konzentration in g/kg

Ceftiofur

y = 0,0123x + 0,0108
R = 0,9982

0,8

0,4

y = 0,1303x - 0,0091
R = 0,9993

1
0,5
0

50

100

150

Konzentration in g/kg

Abbildung 43: Kalibriergerade von Ceftiofur (Milch)

200
-0,5

10

15

20

Konzentration in g/kg

Abbildung 45: Kalibriergerade von Clarithromycin (Milch)

84

Anhang

Doxycylin

Penicillin G

0,3
0,2

Area ratio

Area ratio

0,4

y = 0,019x + 0,0018
R = 0,9974

0,1

0
0

10

15

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

20

y = 0,1123x + 0,0049
R = 0,9989

Abbildung 46: Kalibriergerade von Doxycyclin (Milch)

Abbildung 48: Kalibriergerade von Penicillin G (Milch)

Erythromycin

Sulfamethoxazol

0,7

0,6

0,5

y = 0,093x - 0,0104
R = 0,9986

3
2
1

0,4

y = 0,0389x + 0,0078
R = 0,9973

0,3
0,2
0,1

0
-1

Konzentration in g/kg

Area ratio

Area ratio

Konzentration in g/kg

0
0

10

20

30

40

50

60

70

Konzentration in g/kg

Abbildung 47: Kalibriergerade von Erythromycin (Milch)

10

15

20

Konzentration in g/kg

Abbildung 49: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Milch)

85

Anhang

Tylosin

0,25

2,5

0,2

Area ratio

Area ratio

Tetracyclin

2
1,5

y = 0,0187x + 0,0128
R = 0,9979

0,15
y = 0,0029x + 0,001
R = 0,9987

0,1
0,05

0,5

0
0

50

100

150

200

20

40

60

80

Konzentration in g/kg

Konzentration in g/kg

Abbildung 50: Kalibriergerade von Tetracyclin (Milch)

Abbildung 52: Kalibriergerade von Tylosin (Milch)

Trimethoprim
0,7

Area ratio

0,6
0,5
0,4

y = 0,008x + 0,004
R = 0,9991

0,3
0,2
0,1
0
0

20

40

60

80

Konzentration in g/kg

Abbildung 51: Kalibriergerade von Trimethoprim (Milch)

86

Anhang

7.4

Kalibriergeraden (Wasser)
Azithromycin

Ceftiofur

0,5

0,4

0,3

Area ratio

Area ratio

0,4
y = 1,4396x + 0,0084
R = 0,9981

0,2

0,3
y = 1,0877x + 0,0012
R = 0,9977

0,2
0,1

0,1
0
0

0
0

0,1

0,2

0,3

0,05

0,4

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzentration in ng/ml

Konzentration in ng/ml

Abbildung 54: Kalibriergerade von Ceftiofur (Wasser)

Abbildung 53: Kalibriergerade von Azithromycin (Wasser)

Chloramphenicol
0,25

Area ratio

0,2
0,15

y = 0,6302x + 0,0084
R = 0,9986

0,1
0,05
0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzentration in ng/ml

Abbildung 55: Kalibriergerade von Chloramphenicol (Wasser)

87

Anhang

Clarithromycin

Penicillin G

10

6
y = 27,88x + 0,2507
R = 0,9979

4
2

Area ratio

Area ratio

0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0

y = 2,2214x + 0,0091
R = 0,9985

Konzentration in ng/ml

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzenration in ng/ml

Abbildung 56: Kalibriergerade von Clarithromycin (Wasser)

Abbildung 58: Kalibriergerade von Penicillin G (Wasser)

Erythromycin

Sulfamethoxazol

2,5

Area ratio

Area ratio

4
y = 19,446x + 0,1914
R = 0,9976

3
2
1

1,5

y = 6,1412x + 0,1058
R = 0,999

1
0,5

0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzentration in ng/ml

0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzentration in ng/ml

Abbildung 57: Kalibriergerade von Erythromycin (Wasser)


Abbildung 59: Kalibriergerade von Sulfamethoxazol (Wasser)

88

Anhang

Trimethoprim
0,7

Area ratio

0,6
0,5
y = 2,1007x + 0,0358
R = 0,9994

0,4
0,3
0,2
0,1
0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzentration in ng/ml

Abbildung 60: Kalibriergerade von Trimethoprim (Wasser)

Tylosin
0,3

Area ratio

0,25
0,2
y = 0,7663x + 0,0084
R = 0,9985

0,15
0,1
0,05
0
0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

Konzentration in ng/ml

Abbildung 61: Kalibriergerade von Tylosin (Wasser)

89

Anhang

7.5

Matrix-Effekte (Milch)

Abbildung 62: Vergleich der Messwerte von


Azithromycin in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 65: Vergleich der Messwerte von


Clarithromycin in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 63: Vergleich der Messwerte von


Ceftiofur in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 66: Vergleich der Messwerte von


Doxycylin in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 64: Vergleich der Messwerte von


Chloramphenicol in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 67: Vergleich der Messwerte von


Erythromycin in Lsemittel- und in Matrix

90

Anhang

Abbildung 68: Vergleich der Messwerte von


Penicillin G in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 71: Vergleich der Messwerte von


Trimethoprim in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 69: Vergleich der Messwerte von


Sulfamethoxazol in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 72: Vergleich der Messwerte von


Tylosin in Lsemittel- und in Matrix

Abbildung 70: Vergleich der Messwerte von


Tetracyclin in Lsemittel- und in Matrix

91

Anhang

7.6

Ergebnisse der Methodenentwicklung

Abbildung 73: Double-Peak bei Makroliden mit altem Gradient (mit neuem Gradient: s.
Anhang 7.2)
Tabelle 22: WFR Milchextraktion in % - Methodenvergleich (n=3)

Methode 1

Methode 2

Methode 3

Wirkstoff

WFR-MW
[%]

Azithromycin

70,4

18,0

126

19,6

125,6

12,4

68

2,2

57,2

10,4

58,2

11,7

111,9

13,7

109,5

15,0

126,7

12,1

Clarithromycin

122

10,7

11,2

1,6

62,8

7,6

Doxycyclin

90,4

8,4

3,9

0,3

124,4

9,2

Erythromycin

78,8

6,4

67

11,4

134,5

4,1

112,7

7,5

106,4

12,1

64,7

10,5

Sulfamethoxazole

84,2

5,5

69,2

13,5

82,9

5,6

Tetracyclin

83,9

8,6

3,4

3,0

122,3

11,0

101,3

0,6

83,7

4,0

78,3

3,1

97,9

3,2

35,5

8,2

51

4,9

Ceftiofur
Chloramphenicol

Penicillin G

Trimethoprim
Tylosin

SD
[%]

WFR-MW
[%]

SD
[%]

WFR-MW
[%]

SD
[%]

92

Anhang
Tabelle 23: WFR Milchextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3)

SCL
Wirkstoff

WFRMW
[%]

HLB
WFRMW
[%]

SD
[%]

Leox Plus
WFRMW
[%]

SD
[%]

SD
[%]

Leox
WFRMW
[%]

SD
[%]

Azithromycin

23,0

15,1

67,0

12,7

1,6

21,3

65,0

15,6

Ceftiofur

65,0

8,1

45,3

6,3

7,6

15,6

70,9

2,3

135,0

5,6 134,0

2,4

41,0

10,3

121,0

3,8

Clarithromycin

21,0

3,8 110,0

8,2

0,5

16,3

122,0

4,8

Doxycylin

88,8

71,0

7,3

2,4

21,4

72,0

7,3

Erythromycin

36,4

3,4 116,2

4,6

0,2

6,3

81,7

2,9

Penicillin G

51,0

9,8

65,0

6,8

2,1

17,4

112,0

4,7

Sulfamethoxazole

40,0

12,7

56,5

10,7

32,1

8,6

71,2

7,3

Tetracyclin

80,2

11,4

68,0

2,6

1,6

17,1

88,4

6,2

Trimethoprim

79,7

7,1

72,9

3,8

52,1

9,2

106,1

4,4

Tylosin

69,0

4,4

73,8

4,5

1,1

5,8

102,0

8,2

Chloramphenicol

10,6

Tabelle 24: WFR Wasserextraktion in % - Vergleich SPE-Sulen (n=3)

LEOX
Wirkstoff
Azithromycin

WFR-MW
[%]

LEOX Plus
SD
[%]

WFR-MW
[%]

SD
[%]

84,7

10,5

50,4

2,6

Ceftiofur

104,7

8,5

25,9

3,9

Chloramphenicol

108,6

5,6

119,0

10,9

Clarithromycin

102,8

25,9

16,6

n.n.

n.n.

106,7

3,6

15,2

7,1

80

2,8

62,1

13,8

123,1

9,7

103,0

11,4

n.n.

n.n.

103,2

4,3

125,0

5,6

86,9

11,2

52,9

15,3

Doxycyclin
Erythromycin
Penicillin G
Sulfamethoxazol
Tetracyclin
Trimethoprim
Tylosin

93