Sie sind auf Seite 1von 9

5 - PCR

6/4/2016

Gentica Molecular Ctedra 2016


Universidad de Morn

Amplificar un fragmento de ADN o ADNc de inters


para su posterior estudio
(amplificar = hacer millones de copias)

Retrotranscribir el ARN a ADNc para facilitar su


manipulacin y poder amplificarlo

Tres etapas principales:

Desarrollada por primera vez en 1985 por Kary Mullis (Premio


Nobel de Qumica, 1993)
Reproduce las condiciones en las que se replica el ADN en la
naturaleza
Se parte de una muestra de ADN o ADNc purificado denominado
templado.
Se basa en ciclos cortos de temperatura
Es especfica (genera un nico producto por par de primers)
Es muy sensible (en teora basta con partir de una nica copia
del fragmento original para que se produzca la amplificacin)

Gentica Molecular

DESNATURALIZACIN
HIBRIDACIN

/ ANNELING

EXTENSIN

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Enzimas capaces de replicar, transcribir

La amplificacin es exponencial, y el nmero de


copias presentes en el producto final (amplicn) se
define como 2n, siendo n = nmero de ciclos.
Ej.:
Ciclo 2: 22 = 4 copias
Ciclo 5: 25 = 32 copias
Ciclo 10: 210 = 1024 copias
Ciclo 36: 236 = 68 BILLONES de copias!

o retrotranscribir cidos nucleicos

Polimerasas
Enzimas que forman polmeros de nucletidos

Inicialmente era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo


ya que no soportaban los cambios de temperatura (a 95 C toda protena
se desnaturaliza).

En la actualidad se emplean polimerasas termoestables, extradas de


microorganismos adaptados a vivir a temperaturas restrictivas para la
mayora de los seres vivos.

Los microorganismos de los que provienen son generalmente arqueas,


bacterias o retrovirus:

Thermus aquaticus (ADN polimerasa Taq)

Pyrococcus furiosus (ADN polimerasa Pfu)

Thermococcus litoralis (ADN polimerasa Vent)

Thermus thermophilus (ADN polimerasa Tth. No distingue entre


moldes de ADN o de ARN, por lo que se utiliza como transcriptasa
reversa).

A veces se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con


otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

Gentica Molecular

Procesividad = capacidad de procesamiento.

Es la capacidad de una enzima o del complejo enzimtico de llevar a cabo


mltiples ciclos catalticos de forma progresiva sin disociarse de su sustrato
polimrico.

Es una medida de la eficacia de la enzima (procesividad alta, media o baja).

Se define como el nmero de nucletidos aadidos en promedio cada vez que


la enzima se asocia con el cebador y la hebra plantilla (la procesividad vara
desde unos pocos nucletidos hasta ms de 50.000 nucletidos aadidos por
complejo de asociacin).

No se debe confundir este concepto con el de velocidad de una enzima


(promedio de nucletidos que una ADN polimerasa es capaz de aadir por
segundo o por minuto al hidroxilo del extremo 3 del cebador).
8

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Sabiendo que los cidos nucleicos se desnaturalizan a cierta


temperatura, y que sus cadenas se separan quedando accesibles para
la replicacin, se puede someter a los mismos a un ciclado de
temperatura que repita una y otra vez estas condiciones, de modo de
obtener mltiples rplicas.

Adems, los primers tienen a su vez un rango de temperatura


especfico para unirse al ADN, y lo mismo las polimerasas para
extender la hebra de ADN sintetizada.

De esta manera, programando las temperaturas adecuadas es posible


dirigir los pasos de la replicacin.

Termociclador (establecer ciclado)


Microplacas, capilares o tubos de pared fina, que
favorecen una buena conductividad trmica.
Buffer
Agua MilliQ
Sales de magnesio
dNTPs
Primers (al menos un forward y un reverse si es doble
cadena)
Polimerasa
Templado (incluir controles!)

11

Gentica Molecular

10

El

buffer mantiene el pH ptimo para que la


enzima acte.

El

agua completa el volumen para que todos


los reactivos queden en la concentracin
adecuada para funcionar.

12

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Holoenzima:
Forma completa y activa de una enzima con mltiples subunidades.
Combinacin de una apoenzima con su cofactor, requerido para que
la enzima funcione correctamente.

Para las ADN polimerasas, el cofactor es el in magnesio; sin l, esta


enzima es slo una apoenzima y pierde su funcin.

Son la materia prima para la sntesis del ADN; nucletidos


trifosfato en igual proporcin para cada una de las 4 bases
tradicionales que lo constituyen:

Adenina
Guanina

Los iones de magnesio estimulan a la enzima ADN Polimerasa para que


incorpore los dNTPs y se produzca as la sntesis de la nueva hebra de
ADN

Citosina
Timina

13

Tambin llamados cebadores o iniciadores, son oligonucletidos


complementarios a una hebra de ADN.

Son secuencias cortas, normalmente de 18 a 24 nucletidos.

En la doble cadena deben situarse enfrentados ya que delimitan la


zona de ADN a amplificar.

Permiten que la ADN polimerasa inicie la reaccin: ninguna


polimerasa conocida es capaz de comenzar una cadena de novo; slo
puede aadir un nucletido en un grupo 3'-OH ya existente (en este
caso, el del cebador).

15

Gentica Molecular

14

Su funcin es sintetizar
hebras de ADN
complementarias a cada
una de las hebras del
templado (ya sea ADN,
ADNc o ARN) en la regin
delimitada por los
primers, agregando
nucletidos a partir del
extremo 3 de cada
cebador.

16

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

C+: templado del que se tiene la seguridad de que contiene el fragmento de

Guantes, barbijo, mesada limpia con NaOH 0,1 N

Gradilla y juego de pipetas EXCLUSIVAS para mix de PCR

Tips con filtro y libres de DNAsas y RNAsas

Microplacas, capilares o tubos para PCR (pared delgada) estriles y


libres de ADNasas y ARNasas

No se hace en el flujo laminar: se deben evitar las corrientes de aire

No mezclar reactivos con templado en el mismo hielo: todo cido


nucleico contaminante puede transformarse en un amplicn. El
mismo llevar a tener que desechar todos los reactivos.

inters.
>>> Si el C+ no es amplificado significa que la reaccin en cadena de la
polimerasa no se llev a cabo.

C-: muestra fehacientemente negativa para el fragmento de inters (puede


ser material gentico o agua).
>>> Si se detecta algn producto de amplificacin en el C- significa que al menos
uno de los reactivos de la mix est contaminado con cidos nucleicos.

17

Siempre se calcula el volumen de mix a preparar considerando al


menos tres tubos ms de la cantidad de muestras: uno para el C+,
otro para el C- y otro para compensar el error de las pipetas.
La mix para todos los tubos se prepara primero en uno solo,
aadiendo los reactivos en orden de volumen descendente.

Por ltimo se aade la enzima, que se debe pipetear


directamente del freezer o en su defecto mantenerla en hielo.

a) Se distribuye la mix entre todos los tubos y recin entonces


se agrega el templado a cada tubo.

18

Mix de Vf = 12,5 l por tubo. Para 5 muestras (= 8 tubos):


H2O MilliQ (c.s.p. 12,5 l):

4,4 l x 8 = 35,2l

Buffer verde (Promega):

2,5 l x 8 = 20 l

Primer forward:

1,0 l x 8 = 8 l

Primer reverse:

1,0 l x 8 = 8 l

dNTPs:

0,5 l x 8 = 4,0 l

Taq polimerasa (Promega):

0,1 l x 8 = 0,8 l
9,5 l

Templado:

3,0 l

b) Se agrega a cada tubo el templado, y luego se agrega la mix


a cada uno.
19

Gentica Molecular

20

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Desnaturalizacin del templado:

1)

Contiene ms de un par de primers, con lo cual, se obtendr


ms de un producto al final de la reaccin (pero siempre
especficos).

40 ciclos de:

2)
a.

b.
c.

Ej.: PCR diferenciales

21

95 C x 5 minutos

Desnaturalizacin de templado y amplicones:


Annealing (pegado de primers):
Elongacin:

95 C x 1 minuto
53 C x 1 minuto
72 C x 1 minuto

3)

Elongacin final:

72 C x 10 minutos

4)

Mantencin:

4 C x

22

La temperatura y tiempo necesarios para que la desnaturalizacin del


ADN se produzca dependen directamente de la proporcin C+G.

Genomas con un alto porcentaje de C+G ( 40-60%): en ocasiones se hace


necesario el uso de aditivos, ya que el ADN molde forma potentes estructuras
secundarias que pueden provocar que la polimerasa se detenga. Adems puede
ocasionar una ineficiente separacin de las cadenas.

Cuanto mayor es el contenido en G+C de una molcula, mayor cantidad


de energa ser necesario suministrar a esa doble hlice para separar
sus hebras.

# La betamina reduce la cantidad de energa requerida para separar las


cadenas del ADN molde.

A > contenido en C+G, > tiempo y temperatura de fusin

Ej.: un genoma con un bajo porcentaje de G+C ( 20%) se desnaturaliza


a 94 C durante 4 segundos; uno con un porcentaje ms alto puede
necesitar 1 minuto a 96 C.

23

Gentica Molecular

# El dimetilsulfxido (DMSO) y la formamida interfieren en la formacin de


enlaces de hidrgeno entre ambas cadenas.
# Tambin se pueden usar detergentes como el Tween 20, Laureth 12 (0.1%) o
Tritn 100X, que ayudan a estabilizar la enzima.

Renaturalizacin: sucede naturalmente al disminuir la


temperatura, por complementariedad de bases

24

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Temperatura de annealing:
Todos los cebadores de una misma reaccin deben tener una Tm similar;
si se diferencian en ms de 5 C, al menos uno de ellos debe ser
rediseado

Es el momento de la sntesis, y su duracin depende del tipo


de polimerasa utilizada y de la longitud del/de los
fragmento/s a amplificar.

Especificidad:
Si se baja uno o dos grados la temperatura de annealing del ciclado
se facilitar el pegado, pero pueden obtenerse productos inespecficos.

Ej.: Taq polimerasa aade alrededor de 2000 nucletidos por


minuto (es rpida), mientras que Pfu tan slo 500.

Al aumentar la temperatura de annealing del ciclado se aumenta la


especificidad.

Gentica Molecular

25

26

27

28

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Con primers especficos


Disminuir:
Mg++
[dNTPs]
Largo de los ciclos
Nmero de ciclos
Concentracin de primers

Con primers degenerados


Aumentar:
Mg++
[dNTPs]
Largo de los ciclos
Nmero de ciclos
Concentracin de primers

Aumentar:
Temperatura de annealing

Disminuir:
Temperatura de annealing

Corrida en gel con soluciones amortiguadoras (TAE, TPE, TBE):


proporcionan un medio abundante de iones que permite la conductividad
elctrica. La movilidad electrofortica depende en gran parte de la
fuerza inica y el pH del buffer.
Una vez visualizado el producto en el gel, se puede cortar la banda,
purificar y secuenciar.
La secuencia de los cebadores puede incluir en el extremo 5 sitios de
corte para enzimas de restriccin, si el propsito es un posterior clonado
del fragmento.

29

Si se est haciendo diagnstico o se van a publicar los


resultados, siempre conviene confirmarlos con algn otro
mtodo paralelo (ej.: por inmunofluorescencia, cultivo celular,
etc.).

El cultivo es uno de los mtodos ms utilizados: cuando se


trabaja con bacterias, porque existen medios especficos para
identificarlas; cuando se trata de virus, muchos son citopticos y
se puede visualizar el efecto en la monocapa de clulas
infectadas.

31

Gentica Molecular

30

PCR de punto final: algunos modelos usan tubos


de 0.2 ml, otros tubos de 0.6 ml, otros
microplacas y otros tienen todas esas opciones
juntas.

Algunos tienen un solo bloque y otros traen


varios, que pueden operar todos al mismo tiempo
realizando cada uno un ciclado diferente.
Se debe leer detalladamente el manual antes
de utilizarlo, para aprovechar al mximo las
prestaciones del equipo.

32

Universidad de Morn

5 - PCR

6/4/2016

Nested (anidada): muy especfica. El producto de una amplificacin es


utilizado como molde para realizar una 2da. amplificacin con cebadores
que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada.

PCR in situ: en secciones histolgicas o clulas. La deteccin se realiza


mediante hibridacin in situ.

PCR multiplex: permite amplificar simultneamente distintos segmentos


de ADN utilizando menos cantidad de templado y de reactivos.

Real time o q-PCR (en tiempo real): permite cuantificar la cantidad de


ADN o ARN presentes en la muestra original. La deteccin se realiza por
medio de fluorocromos no especficos (como el SYBR Green) o de sondas
especficas.

RT-PCR (transcripcin reversa o retrotranscripcin): a partir de ARN se


obtiene ADNc.

PCR en tiempo real: el equipo debe ir acompaado del


software y utiliza un sistema de capilares.

33

Se

realiza en el mismo termociclador que cualquier PCR

Usa

El

34

como templado ARN purificado

producto de amplificacin es ADNc

Mix:

utilizan transcriptasas reversas extradas de retrovirus y RNAsin para


evitar que se degrade el ARN
Ciclado:

no tiene ciclos de desnaturalizacin y renaturalizacin ya que el


templado es monocatenario. Simplemente se mantiene la temperatura de
trabajo de la enzima que es termolbil- durante aproximadamente una hora
(por ej.: 42 C).
Luego

se realiza una PCR para amplificar la cadena complementaria al ADNc


obtenido.
35

Gentica Molecular

Universidad de Morn

Das könnte Ihnen auch gefallen