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6/4/2016
Gentica Molecular
DESNATURALIZACIN
HIBRIDACIN
/ ANNELING
EXTENSIN
Universidad de Morn
5 - PCR
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Polimerasas
Enzimas que forman polmeros de nucletidos
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El
El
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Holoenzima:
Forma completa y activa de una enzima con mltiples subunidades.
Combinacin de una apoenzima con su cofactor, requerido para que
la enzima funcione correctamente.
Adenina
Guanina
Citosina
Timina
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Su funcin es sintetizar
hebras de ADN
complementarias a cada
una de las hebras del
templado (ya sea ADN,
ADNc o ARN) en la regin
delimitada por los
primers, agregando
nucletidos a partir del
extremo 3 de cada
cebador.
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inters.
>>> Si el C+ no es amplificado significa que la reaccin en cadena de la
polimerasa no se llev a cabo.
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4,4 l x 8 = 35,2l
2,5 l x 8 = 20 l
Primer forward:
1,0 l x 8 = 8 l
Primer reverse:
1,0 l x 8 = 8 l
dNTPs:
0,5 l x 8 = 4,0 l
0,1 l x 8 = 0,8 l
9,5 l
Templado:
3,0 l
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1)
40 ciclos de:
2)
a.
b.
c.
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95 C x 5 minutos
95 C x 1 minuto
53 C x 1 minuto
72 C x 1 minuto
3)
Elongacin final:
72 C x 10 minutos
4)
Mantencin:
4 C x
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Temperatura de annealing:
Todos los cebadores de una misma reaccin deben tener una Tm similar;
si se diferencian en ms de 5 C, al menos uno de ellos debe ser
rediseado
Especificidad:
Si se baja uno o dos grados la temperatura de annealing del ciclado
se facilitar el pegado, pero pueden obtenerse productos inespecficos.
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Aumentar:
Temperatura de annealing
Disminuir:
Temperatura de annealing
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Se
Usa
El
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Mix:
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