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Cdigo:

Gua de Laboratorio
METABOLISMO

Versin:

MC-2012-08-21

04

Pgina:

1 de
Fecha de Emisin:

Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS

Marzo Julio 2016


Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano

Programa 3647- 3661


Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez

Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

ENZIMAS II
CINETICA ENZIMATICA DE LA FOSFATASA ALCALINA

Para estudiar la cintica enzimtica se debe determinar el efecto de la concentracin inicial de


sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la cantidad de enzima constante. La
velocidad de una reaccin enzimtica toma una forma hiperblica en funcin de la concentracin de
sustrato. Bajo condiciones de saturacin la velocidad de la reaccin es mxima (Vmax) y cuanto
mayor sea la capacidad cataltica de la enzima ms rpido el complejo enzima -sustrato se
trasformaran en producto y enzima libre.
Las reacciones catalizadas por las enzimas se clasifican de acuerdo a la dependencia de la velocidad
de la reaccin con respect a la concentracin de sustrato en:
Reaccin de orden cero:, a concentraciones elevadas de sustrato, la velocidad de reaccin es
prcticamente constante, tendiendo asintticamente a un valor de velocidad mxima, es decir la
velocidad de formacin del producto es independiente de la concentracin de sustrato.
Reaccin de primer orden: a concentraciones de sustrato bajas, la velocidad de la reaccin
aumenta proporcionalmente con la concentracin de sustrato.
Reaccin de segundo orden: es aquella en la que la velocidad de formacin del producto depende
de la concentracin de dos sustratos (como en una reaccin de condensacin) o del cuadrado de la
concentracin de un nico sustrato (reaccin de dimerizacin).
La concentracin de sustrato que produce la mitad de la Vmax es denominada Km, puede
determinarse experimentalmente al graficar la Velocidad inicial (Vi) en funcin de la concentracin de
sustrato. La Km puede ser calculada a partir de la Ecuacin de Michaelis -Menten y se expresa como
una concentracin molar.
Ecuacin de Michaelis y Menten :

Vi =

V max [S ]
Km + [S ]

Frecuentemente se emplean dos transformaciones lineales de la ecuacin para un clculo ms


aproximado de los valores de Km y Vmax. En la representacin de Linerweaver-Burk, o dobles
recprocos, los datos cinticos (Vi y [S]) se llevan a una grfica de 1/v vs 1/[S], de tal forma que se
obtenga una lnea recta cuyo corte en el eje y corresponde a 1/Vmax, y la interseccin con el eje x

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MC-2012-08-21

Gua de Laboratorio
METABOLISMO

04

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1 de
Fecha de Emisin:

Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS

Marzo Julio 2016

Programa 3647- 3661

Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano

Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez

Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

corresponde a -1/Km. Una alternativa que se puede utilizar para hallar la Vmax y Km de una enzima
es la Ecuacin de Eadie Hoftsee.
OBJETIVO GENERAL

Comprender los conceptos bsicos de la cintica enzimtica utilizando un modelo con


fosfatasa alcalina

Objetivos Especficos:
1. Determinar la Km y la Vmax de la Fosfatasa Alcalina utilizando la ecuacin de de Linerweaver
Burk.
2. Identificar el tipo de inhibicin efectuada por el fosfato inorgnico y citrato de sodio sobre la
actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina.
3. Evaluar el efecto del Cl2Mg sobre la actividad enzimtica de la Fosfatasa Alcalina.
PROCEDIMIENTO
1. EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO.
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
Prepare los tubos tal como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
Preincube los tubos a 37 C 3minutos.
Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.

SOLUCION

TUBO (ml)
2
3

Blanco

Agua Destilada

2.7

1.35

1.3

Buffer pH 9.6

0.3

1.5

pNFP 1 mM

------

Enzima FAL

0.1

Absorbancia

1.2

1.1

0.8

1.5

1.5

1.5

1.5

0.05

0.1

0.2

0.30

0.60

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

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Dr. Adalberto Snchez

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Dr. Jos Ma. Satizabal

Con los resultados de esta prueba realice una grfica de velocidad Vs. Concentracin de sustrato.
Para calcular la velocidad es necesario conocer la concentracin de producto formado en cada tubo.
Esto se logra extrapolando las absorbancias obtenidas en la grfica de absorbancia vs
concentracin de p-nitrofenol (pNF) dibujada en la prctica de colorimetra. La concentracin de
pNF se divide por el tiempo en minutos y se obtiene la velocidad de la reaccin para cada tubo.

[ pNF ]
V=

3 min

Para la calcular la concentracin de sustrato para cada tubo utilice la frmula:

VI CI = VF CF
1) Calcule la Km y la velocidad mxima para esta Enzima. Anexe sus clculos de manera clara en
una hoja de papel cuadriculado.
Km=

Vmax=

2) Explique cmo es la afinidad de la enzima por el pNFP.


2. EFECTO DEL FOSFATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
Prepare los tubos l como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
Preincube los tubos a 37 C 3 minutos.
Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.
TUBO (ml)

SOLUCION

Blanco

Agua Destilada

2.7

1.5

0.4

0.1

0.3

Buffer pH 9.6

0.3

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Fosfato 0.1 M

------

0.3

0.60

0.3

pNFP 1 mM

------

0.7

0.7

0.7

2.1

2.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

Enzima
Absorbancia

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04

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1 de
Fecha de Emisin:

Ttulo: FACULTAD DE SALUD DPTO. DE CIENCIAS FISIOLGICAS

Marzo Julio 2016

Programa 3647- 3661

Elaborado por:
Profesional: Lic. Martha Solrzano

Revisado por:
Dr. Adalberto Snchez

Aprobado por:
Dr. Jos Ma. Satizabal

1) Con los resultados anteriores explique qu tipo de inhibicin se presenta con la adicin del fosfato.
2) Mencione cuntos tipo de Fosfatasas hay en suero y cul es su valor normal?
3) Cual es la especificidad como biomarcador de la Fosfatasa Alcalina para el Diagnostico de
enfermedades:
4. EFECTO DEL MAGNESIO Y EL CITRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Marque el tubo blanco y los tubos del 1-5 con cinta de enmascarar.
Prepare los tubos tal como se indica en la tabla exceptuando la adicin de la enzima.
Calibre el equipo con el Blanco a 405 nm.
Preincube los tubos a 37 C 3 minutos.
Agregue el extracto enzimtico y mezcle por 5 segundos.
Incube los tubos a 37 C durante 3 minutos y lea inmediatamente la absorbancia a 405nm.

TUBO (ml)
SOLUCION

Blanco

Agua Destilada

2.7

0.8

0.6

0.7

0.4

Buffer pH 9.6

0.3

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

pNFP 1 mM

------

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

Cl2Mg 0.1M

------

-------

0.2

0.4

------

0.4

Citrato de Sodio
0.2M

-------

------

-----

-------

0.3

0.2

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

Enzima
Absorbancia

1) Qu efecto tiene el Magnesio sobre la actividad de la Fosfatasa Alcalina? Porque?


2)

Qu efecto tuvo el Citrato de Sodio sobre la reaccin enzimtica?. Porque?