MATERIALES Y METODOS

MATERIAL
MATERIAL BIOLOGICO
a) oregano (Origanum vulgare)
la planta fue adquirida de un viviero en la ciudad de Tacna, de ella se
obtuvo 30 explamtes nodales.
b) Menta ( Mentha sp.)
La planta fue adquirida en un vivero de la ciudad de Tacna, de ella se
obtuvo 20 explantes nodales.
material de laboratorio
a) Medio de cultivo:
Oregano: se realizo 3 medios de cultivo diferentes ( cuadro 02)
Menta: solo se preparo un medio 8cuadro 03)
b) Reactivos:
Hipoclorito de sodio (comercial)
Alcohol de 70 y 96
Fungicida agricola benomyl
HCL 0.1 N
Na2OH 0.1 N
Tween 20
Acido ctrico
Acido ascrbico
c) Equipos:
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Estufa
Balanza analtica
Ph-metro
d) Material de vidrio
Placa Petri de 70x10 mm y 200x15 mm
Matraces Erlenmeyer 250 ml, 500ml y 1000 ml.
Vaso de precipitado de 50 ml y 100 ml
Balones de 1000 ml y 2000 ml
Pipetas de 1ml, 5ml y 10 ml
Tubos de ensayo de 15x125 mm
Fiolas de 500 ml y 1000ml
Mechero
Baguetas
e) Otros:
Pizeta
Tapas de polipropileno
Cinta parafilm
Pinzas
Bistur
Tijeras

Gradillas
Esptula
Mandil, guantes y mascarilla
Mtodo
Consisti en 5 etapas, las cuales se describirn a continuacin
ETAPA A: limpieza y posterior desinfeccin de los diferentes materiales a utilizar
Todo el material de vidrio y plstico se remojo en una solucin detergente
(comercial) durante 15 minutos, luego se procedi al lavado de las mismas con
la ayuda de escobilla
El material de metal se desinfecto con alcohol de 70 con la ayuda de un
algodn
ETAPA B: preparacin de los medios de cultivo
Componentes y preparacin de las soluciones STOCK del medio MS (anexo
01,03)
ETAPA C:esterilizacin
CALOR HUMEDO
Con la ayuda del autclave se esterilizo todos los tubos de ensayo con tapa
conteniendo el medio de cultivo, tambin el agua destilada contenida en
matraces pequeos y magentas.
Se introdujo todos los materiales dentro de la autoclave, luego se procedio al
cierre de la tapa, ajustando los bulones en pares opuestos.
Se procedio con el encendico, dejando abierta la espita permitiendo el
desplazamiento de aire contenido en el interior, cuando se observe la salida de
vapor de agua la espita debe ser cerrada.
Luego de 15 minutos a 15lb de presin a una temperatura constante de 121C
se procede al apagado de la autoclave.
Esperar que la presin y temperatura baje para abrir la tapa de la autoclave.
CALOR SECO
Todos los materiales de vidrio (placas Petri, probeta y bagueta), metal (bistur)
y papel filtro (solucin antioxidantes) se envolvieron en papel luego fueron
introducidos dentro de la estufa.
Se esterilizaron a 180C por 2 horas.

ETAP D: preparacin de cmara de flujo laminar

Previo al encendido a la cmara de flujo laminar se limpi el piso del cuarto con
una solucin de leja, y el desinfectando de la cmara con un algodn
empapado en alcohol de 70.
El encendido debe darse por lo menos media hora antes del inicio del cultivo in
vitro.
Los materiales esterilizados son colocados dentro de la cmara
ETAPA E: cultivo in vitro
El procedimiento fue el mismo para ambos explantes (oregano y menta).
FASE 0: seleccin y preparacin de la planta madre
Se seleccion los explantes que presentaban apariencia sana, con presencia de
hojas jvenes y yemas cerradas.
A los explantes seleccionados se les extrajo las hojas con la yuda de un bistur
desinfectado, para su posterior desinfeccin.
Los explantes se colocaron en una placa Petri y luego se procedio a lavarlos
con agua.
FASE 1: desinf3eccion de las yemas de la planta
Para la desinfeccin de los explantes, se preparo dos bateras de desinfeccin.
Cuadro 04: bateras de desinfeccin de explantes nodales para cultivo in vitro

solucion
fungicida
(benomil
ppm)

primera
desinfecci
on
tiempo

segunda
desinfeccio
n
tiempo

1 15 min

agua destilada
5min
esteril

5min

alcohol 70

5 seg

3 seg

agua destilada
5min
esteril
lejia 20% +
tween
20 5min
(2gotas)
agua destilada
esteril ( por lo
5min
menos
3
enjuagues)
Fuente : Elaboracion propia

5min
5min

5min

La primera desinfeccin va seguida

de la segunda, cada solucin se
encontraba en un envase de vidrio.
Durante el paso del explante por
cada
solucin,
fue
agitada
cuidadosamente con una bagueta,
durante el tiempo de desinfeccin.
FASE 1.5: inmersin en solucin
antioxidante

Para la introduccin del oregano era necesario este paso, debido que en
condiciones in vitro casi la totalidad de explantes tienden a oxidarse.
En 100 ml. De agua destilada esteril se agrego0.01 de acido ascrbico y 0.015
g de acido ctrico.
Con la ayuda de un papel esteril se procede al filtrado respectivo.
Los explantes sern introducidos, luego enjuagados con agua destilada esteril,
el tiempo depender con el inico de la introduccin del explante en el tubo.
FASE2:introduccin del material seleccionado in vitro
Los explantes nodales que previamente fueron desinfectados, con la ayuda de
una pinza y bistur desinfectado se procede a cortar las partes del explante que
se encuentra muy daadas.
Se retira la tapa del tubo que contiene el medio de cultivo , y cuidadosamente
evitando que choque con las paredes del tubo, se introduce el explante.
Se coloca la tapa,para luego colocar el tubo en la gradilla.
Cuando se haya introducido todos los explantes se procede a colocar las cinta
parafilm alrededor de la tapa para evitar la contaminacin.
Rotulado de los tubos: nombre del explante, numero de explante, fecha de
introduccin y composicin del medio.
FASE3: incubacion en cuarto de cultivo
Los tubos fueron trasladados al cuarto de cultivo, el cual presentaba las
siguientes caractersticas:
Temperatura: 81-19C
Humedad: 62-63%
Fuente de luz: fluorescente
Fotoperiodo: 16 horas
PARAMETROS DE EVALUACION
Periodo para la evaluacin: cada 7 dias desde la introduccin en cultivo
invirtro.
Numero de hojas
Numero de brotes

Color del borde

9=Verde oscuro
7=verde con manchas oscuras
5=verde
3=verde claro
1=verde amarillento
Longitud de brotes(cm)
Porcentaje de sobrevivencia
Porcentaje de contaminacin
Porcentaje de oxidacin
Porcentaje de vitrificacin
Material y mtodo
Material vegetal
Se utilizo como material vegetal explantes introducidos de oergano del bonco
del germoplasma..