Ps-graduao em Microbiologia

Roteiro bsico de Aula Prtica

Professora: M.Sc. Marcele Louise Tadaieski Arruda
Assunto: Gram-positivos
1. Colorao de Gram
Materiais
Placa de Petri contendo crescimento bacteriano
Lminas para preparao do esfregao
Soluo salina
Ala de platina
Bico de bunsen
Bateria de corantes para o Gram
Procedimento
a) Preparao do esfregao
Limpar uma lmina de vidro (passar algodo embebido em lcool)
Quando se tratar de uma cultura em meio lquido, com uma ala de inoculao, tomar uma pequena
poro da cultura, observando as precaues de assepsia, e coloc-la sobre a lmina espalhando-a para
formar um esfregao fino e uniforme.
Quando a cultura for em meio slido, colocar uma gota de gua destilada sobre a lmina e com uma ala
de inoculao, colher uma pequena quantidade de crescimento bacteriano da superfcie do agar e suspendla na gota de gua destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregao fino.
Deixar a lmina secar temperatura ambiente;
Fixar na chama do Bico de Bunsen, cortando a chama por 3x.
b) Tcnica de colorao
Cobrir o esfregao bacteriano com cristal violeta, deixar um minuto e verter o corante na cuba.
Remover o excesso da soluo de cristal violeta da lmina, lavando-a levemente com gua corrente
(opcional).
Cobrir o esfregao com soluo de lugol, deixar por um minuto e retirar a seguir, lavando com um filete de
gua.
Descorar o esfregao usando uma soluo de lcool acetona, rapidamente (10 a 15 segundos).
Lavar com gua corrente, imediatamente.
Cobrir o esfregao com a Fucsina, deixar por 30 segundos e retirar
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 Lavar com gua corrente

Secar com papel absorvente
* observar a lamina: colocar uma gota de leo de imerso sobre o esfregao corado e observar a lamina no
microscpio, com objetiva de 100x.
Descreva o aspecto das bactrias que voc observou na colorao de Gram que voc acabou de observar no
microscpio
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2. Identificao de Cocos Gram-positivos
Os cocos Gram-positivos de importncia mdica esto classificados em estafilococos, micrococos,
estreptococos e enterococos. Diversas so as provas que vo diferenciar esses trs grupos e suas diferentes
espcies.
a. Prova da Catalase
Esta prova se presta a verificar a presena da enzima catalase que decompe H2O2 em gua e O2 e, desta
forma, distinguir os grupos estafilococos e estreptococos.
Materiais

Ala bacteriolgica
Lmina de vidro
gua oxigenada a 3%
Procedimento:
Com ala bacteriolgica, retirar uma colnia do meio de cultura (preferencialmente no retirar colnias
crescidas em gar sangue porque os fragmentos podem se misturar com as colnias e produzir um
resultado falso-positivo). Colocar a colnia sobre uma lmina de vidro e adicionar uma gota de H2O2 a 3%.
Leitura:
Observar a formao de bolhas.
Interpretao:

Formao de bolhas indica ser a famlia Microccocaceae (Ex.: Staphylococcus spp., Micrococcus spp.,
Planococcus spp., Stomatococcus spp.);

Sem formao de bolhas indica ser a famlia Streptococcacea (Ex.: Enterococcus spp.,
Streptococcus spp., Aerococcus spp., Gemella spp., Leuconostoc spp., Lactococcus spp.)
Qual foi o resultado observado na prova de catalase que voc realizou? E o que isso representa?
Em caso de resultado de catalase negativo, v para o item 2.2 deste relatrio
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2.1 Diferenciao entre Micrococcus e Staphylococcus

2.1.1. Prova da Coagulase
Esta prova pode ser realizada em tubo ou em lmina. Contudo, a prova em lmina pode no ser conclusiva.
Por este motivo, recomenda-se realizar o procedimento em tubo, sempre que possvel. Nesta aula prtica,
realizaremos tal procedimento em tubo.
Finalidade:
Verificar se o microrganismo produz coagulase (ou fator aglutinante) livre e ligada, que, reagindo com um
fator plasmtico, forma um complexo que atua no fibrinognio do plasma formando a fibrina.
Procedimento:

Colocar 0,5 mL de plasma em tubo de ensaio;

Adicionar uma alada de colnia diretamente no plasma de coelho com EDTA;
Incubar por 4 h a 352C em estufa ou banho-maria; caso no haja formao de cogulo, incubar por 24 h.
Leitura:
Formao de cogulo observada pela inclinao suave.
Interpretao:

Formao de cogulo inteira ou parcial, identifica Staphylococcus aureus;

No h formao de cogulo, identifica Staphylococcus coagulase negativa.
Qual foi o resultado observado na prova de coagulase que voc realizou? E o que isso representa?
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A prova da coagulase pode ser realizada com Kits comerciais, tais como StaphAureux, SlidexStaph e
Hemastaph, que so usados em substituio s provas de coagulase em tubo ou em lmina. A vantagem da
utilizao de kits comerciais o menor tempo para obteno dos resultados; porm o custo maior.
No caso da prova de coagulase ser inconclusiva, novos testes sero necessrios para diferenciar os
Staphylococcus aureus dos demais Staphylococcus coagulase negativos. Alguns exemplos de testes que
podem ser usados so:

gar DNAse
gar Manitol Sais
Na sua amostra, h necessidade de testes alternativos? Se a resposta for afirmativa, qual teste est
disponvel no laboratrio? Descreva-o brevemente.
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2.2 Cocos gram-positivos catalase negativos
Se o teste de catalase que voc realizou deu resultado negativo, voc trabalhando, provavelmente, com um
Streptococcus ou Enterococos. Sendo necessria a semeadura em gar Sangue.
Que tipo de hemlise observada na placa de gar Sangue com a qual voc est trabalhando?
Em caso de -hemlise, realize o teste da Optoquina roteiro suplementar 1
Em caso de -hemlise, os testes a serem realizados podem ser bastante diversos. Caso o laboratorista no
disponha de recursos variados e tenha acesso suspeita clnica de infeces causadas por -hemolticos do
grupo A (S. pyogenes); microrganismo relacionado a faringites, infeces cutneas superficiais (impetigo,
celulites, erisipela); o prximo teste a ser realizado o teste da Bacitracina. Contudo, se a suspeita for de
patologias relacionadas a -hemolticos do grupo B (S. agalactiae), realiza-se o teste CAMP.
Como muitas vezes o laboratorista no consegue (ou no pode) fazer inferncias clnicas, recomenda-se,
sempre que possvel, fazer um teste mltiplo, ou seja, numa mesma placa de Agar sangue, realiza-se os
testes da Bacitracina, o teste de CAMP e o teste do Sulfametoxazol Trimetoprim (SXT), numa mesma placa
de Agar sangue (roteiro suplementar 2)
Em caso de -hemlise (ausncia de hemlise), realize o teste PYR e Bile esculina (roteiro suplementar 3)