Ps-graduao em Microbiologia

Os cocos GramPositivos
PROF. M.SC. MARCELE LOUISE T. ARRUDA

Introduo
Alta frequncia de isolamento em amostras clnicas
1 - Enterobactrias
2 - Cocos Gram-positivos

Achados clnicos comuns e incomuns

Cocos Gram-positivos
Disseminados na natureza
Isolados no ambiente
Habitantes comensais

Interpretao dos
resultados?
Manifestaes clnicas
aparentes

Tipo de infeco
Multiplicao local exotoxinas efeito sistmico
Multiplicao sistmica

Taxonomia antiga
Bergeys Manual of Systematic Bacteriology
Manual Bergey
1986 = Famlia Micrococaceae

Planococcus
Micrococcus
Stomatococcus
Staphylococcus

Hibridizao de DNA
Sequncia de RNAr 16S
Anlise quimiotaxnicas

MUITAS DIFERENAS = FAMLIAS DIFERENTES

Taxonomia atual
Planococcus
Ambiente marinho
Outro gnero

Micrococcus
1 a 1,8 m
Filo diferente do Staphylococcus (0,5 a 1,5 m)

Macrococcus
Novo gnero
No implicado em infeces humanas
Gnero diferente do Staphylococcus
Semelhante ao grupo de S. sciuri
Staphylococcus
oxidase +

Taxonomia atual
Stomatococcus
Antigo Stomatococcus mucilaginosus
Presente no trato respiratrio humano normal
transferido para o gnero Rothia
Rothia mucilagionosa
Rothia nasimurinum
Rothia dentocariosa

Cocos Gram-positivos
Bacilo corineforme

Estafilococos

Estafilococos
cachos de uva
Metabolicamente ativos
Patognicos
Produzem hemolisina
coagulase positivos
produo de vrias enzimas e toxinas extracelulares

Rpido desenvolvimento de cepas resistentes atbs

Problemas teraputicos difceis

Gnero
Ao menos 40 espcies
Importncia clnica
S.aureus coagulase positivos
S. epidermidis coagulase negativos
S. lugdunensis, S. warneri, S. hominis

S. saprophyticus

Os Estafilococos
S. aureus
S. epidermidis
S. saprophyticus
S. haemolyticus
S. warneii flora normal (1%); bacteremia (cateteres)
S. hominis flora normal; imunocomprometidos
S. simulans pele e uretra de mulheres sadias
S. lugdunensis rea ingnal humana
S. schleifieri

Subsp. schleifieri

Subsp.
novobiosepticum

Subsp. hominis

Subsp. coagulans - ces

S. capitis flora normal (testa, couro cabeludo), endocardite

S. auricularis meato acstico externo; infeces raras

Os Estafilococos
S. caprae cabra e leite de cabra, uso de catteres, infeces
sseas e articulares
S.cohnii
Subsp. cohnii

Subsp. Urealyticum - primatas

S. xylosus - primatas
S. saccharolyticum anaerbio, Peptococcus saccharolyticus
Espcies de importncia veterinria
S. intermedius ces, cavalos, gatos, demais animais infeco
cutnea, urinria, sseas e SNC; mordedura em humanos
S. hyicus bovinos e sunos
S. sciuri vrios animais humanos: endocardite

Caractersticas
Gnero Staphylococcus
Diversas espcies amostras clnicas humanas
Caractersticas
Cocos Gram-positivos
No formadores de esporos
Catalase-positivos
Colnias: clulas isoladas ou em pares, ttrades, cadeias curtas,
cachos de uva
Anaerbios facultativos
exceto S. aureus subsp. anaerobius e S. saccharolyticius
Anerbios e catalase negativa

Rpido desenvolvimento de cepas resistentes

Onde so encontrados?
Pele, mucosa
Humanos e animais
Associao especfica
Ex: S. capitis subesp. capitis
Pele e gl. sebceas (couro cabeludo, testa, pescoo)

Staphylococcus aureus
O estafilococos de maior importncia
Colonizao de 20 a 40% dos adultos
Narinas
Pregas cutneas
Axilas
Vagina

Infeces oportunistas
Fatores predisponentes
Defeito na quimiotaxia dos leuccitos
Leses cutneas
Presena de corpos estranhos
Infeco viral associada
Doenas crnicas
Administrao profiltica de antimicrobianos

Complicaes clnicas
Infeco primria de ferida cirrgica
Infeco sistmica associada

Pneumonia viral
Broncopneumonia estafiloccica

Bacteremia
Implantao em locais distantes
Endocardite, osteomielite, abcessos, meningite, peritonite

Fatores de virulncia
Polissacardeos capsulares
Exopolissacardeo
Impede fagocitose
aderncia clula hospedeira e material cirurgico

Presena de cpsula
Associao com patogenicidade e virulncia

Cerca de 11 sorotipos capsulares

Mais frequentes
Sorotipo 5
Associado resistncia microbiana

Sorotipo 8
Associado toxina do choque txico

Fatores de virulncia
Peptoglicano e cidos teicicos
Aderncia das clulas mucosas
Protenas de ligao
Fibronectina
Colgeno

Protena A
se liga regio FC das subclasses de IgG
Interfere na opsonizao e na ingesto dos microrganismos pelas
clulas polimorfonucleares

Fatores de virulncia
Enzimas
Catalase
Inativa perxido de hidrognio e radicais livres txicos no interior
das clulas fagocticas

Fator de agregao
Responsvel pela ligao fibrina e fibrinognio

Coagulase
Catalisa a converso de fibrinognio em fibrina
funo: recobrir as clulas bacteriana com fibrina
Clulas mais resistentes opsonizao e fagocitose

Fibrolisinas
Degradao dos cogulos de fibrina
Disseminao aos tecidos adjacentes

Fatores de virulncia- enzimas

Hialuronidase
Hidrolisa a matriz intercelular de mucopolissacardeos
dissemina microrganismos a tecidos adjacentes

Lipases
Disseminao tecidual
Cepas de furunculose crnica

Enzimas -lactamase
ao menos 3 tipos
Resistncia penicilina e ampicilina
Plasmdeos resistncia cruzada
Eritromicina e tetracilina
Transferncia a outras bactrias por transformao e transduo
(bacterofagos)

Fatores de virulncia
Hemolisinas
-hemolisina
Hemlise parcial
Efeitos letais
Clulas polimorfonucleares
Eritrcitos
Atividade dermonecrtica

-hemolisina
Hemlise total
Atua sobre vrias clulas
Atividade sobre esfingomielina da membrana
Maior atividade aps exposio das clulas ao frio

-hemolisina
Trs protenas que se conjungam com duas protenas Leucocidina de PantonValentine
Formando 6 tipos toxinas com atividade de lise de leuccitos

-hemolisina
Rompimento de clula ou formao de canais

Toxinas relacionadas
Toxinas estafiloccicas
Intoxicao alimentar
Sndrome da pele escaldada
Sndrome do choque txico

Toxinas estreptoccicas
Sndrome do choque estreptoccico

Tipos de toxinas
Esfoliativas ou toxinas epidermolticas
Composio
2 protenas ET-A e ET-B
cromossomal

plasmidial

Atividade: proteoltica
Alvo: matriz polissacardica da epiderme

Relacionadas sndrome da pele escaldada

Toxinas estafiloccica esfoliativa

Necrose epidrmica toxica
sndrome da pele escaldada
Formaes bolhosas em grandes reas do corpo
Alta frequncia em recm-nascidos e lactentes

Toxinas estafiloccicas
Superantgenos
enterotoxinas (A a D, H e I)
Toxina da Sndrome do Choque Txico TSST-1
Superantgeno estreptoccio

Caractersticas
Pirogenicidade
Superantigenicidade = proliferao de linfcitos
Capacidade de aumentar em 100.000 vezes os efeitos letais

Toxinas estafilcicas
Sndrome do choque txico
Doena multisistmica, febre alta, hipotenso, vmitos,
diarria, mialgias, alteraes no SNC, hiperemia conjuntiva,
lngua de framboesa
Letalidade de 50%

superantgenos

Sndrome do
choque txico
1 relato: 1978
associao com
tampes

Toxinas estafilcicas - enterotoxinas

Intoxicao alimentares
Toxina pr-formada no alimento
Caso tpico de intoxicao alimentar
PI curto
Sintomas brandos
TGI superior

Tipo de toxina
Enterotoxinas A a E; H e I
Termoestveis
Intoxicao alimentar estafiloccica
Aumento do peristaltismo
Mtodos
imumolgicos

Deteco de
toxinas

Sondas de ac.
nuclico

Deteco de
genes
estruturais

deteco

Patologias associadas S. aureus

Foliculite
Infeco benigna
Restrita aos stios dos folculos pilosos
Pequenas leses avermelhadas e dolorosas
No h sinais sistmicos

Furnculos
Leses elevadas, dolorosas e de consistncia firme

Patologias associadas S. aureus

Impetigo
infeco superficial em reas descobertas
Streptococcus -hemolticos
Staphylococcus aureus (80 a 90%)
Mculas vermelhas vesculas sanguinolentas ruptura
leses secas, crostas de cor mel, borda eritematosa

Hidradenite supurativa
Semelhante ao furnculo
obstruo e infeco de gl sudorparas
apcrinas
reas intertriginosas
Dor, edema, eritema

Patologias associadas S. aureus

Mastite
Infeco das mamas
Parto e lactao
Edema, tumefao e eritema
Abcessos superficiais X leses profundas

drenagem

antibioticoterapia

Patologias associadas S. aureus

Infeco de ferida
Ps-operatrio
Eritema, dor, drenagem sanguinolenta turva

Abordagem?
Profundidade de infeco?
Estado do hospedeiro?
Gravidade dos sintomas?
Presena de corpos estranhos?

Patologias associadas S. aureus

Bacteremia e endocardite
Foco
Outras infeces ou acesso do microrganismo corrente
sangunea?

Bacteremia
Febre, calafrios, tremores

Sinais mltiplos ou sutis

Trombocitopenia
Fatal
Insuficincia renal

Patologias associadas S. aureus

Meningite
Em decorrncia de
Bactermia
Traumatismo local
Implantes intratecais

Maior ocorrncia
Casos de imunodeficincia

Patologias associadas S. aureus

Pericardite
Via hematgena ou decorrente de lees locais
Sintomas
Dor torcica, atrito por frico, insuficincia cardaca/mediastinite

Infeces pulmonares
Via
Aspirao
Hematgena

Paciente idoso
Relacionada a complicaes de influenza

Secundrio a leses e assitencia ventilatria

Patologias associadas S. aureus

Osteomielite
Vias
Local
Hematgena
Crianas ossos longos
adultos 60% - coluna vertebral

Conduta
Aspirao e cultura

Osteomielite por prtese

Remoo e substituio do material implantado
Ampla exciso dos tecidos circundantes

Patologias associadas S. aureus

Artrite sptica
Crianas pr-puberais
Bacteremia em adultos
Aspirao da articulao, colorao de Gram e cultura

Piomiosite
Infeco de msculos esquelticos
Adjacncias do traumatismo

Conduta: aspirao e drenagem

Estafilococos
Coagulase-Negativos

Estafilococos coagulase-negativos
Anteriormente
Pouca importncia clnica

Atualmente
Importncia clnica crescente

Vrias espcies
Poucas relacionadas a humanos
Espcie mais importante
S. epidermidis

Staphylococcus epidermidis
Alta frequncia
Alta adeso superfcies
Biopelcula

Fatores de virulncia
PS/A
Adesina associada a polissacardeo capsular
Promove adeso
Protege os microrganismos de destruio fagoctica

PIA polysaccharide intercellular adhesin

operon cromossmico
Adeso e hemaglutinao

Staphylococcus epidermidis
Fatores de virulncia
Gene fbe
Inibe adeso do microrganismo ao fibrinognio imobilizado

Enzima modificadora de ac. Graxos

Inativa os ac. graxos bacteriostticos

Lipases
Colonizao da pele

Resistncia a antibiticos

Staphylococcus saprophyticus subesp.

saprophyticus
Infeco urinria
Mulheres jovens, sadias e sexualmente ativas

Relatos de presena em vacas saudveis

S. saprophyticus
subesp. bovis

S. saprophyticus subesp.
saprophyticus

Cistite por S. saprophyticus

2 agente mais frequente
1 - E. coli

Caractersticas
Presentes em quantidades inferiores a 100.000 UFC/mL
Disria, piria, hematria
Complicaes
Pielonefrite
41 86%

Tambm associado a instrumentos hospitalares

Sndrome uretral aguda
Homens e mulheres

Colonizao
Reto 40%
Uretra 30%
Colo do tero 10%
Colonizao no resulta necessariamente em patologia

S. saprophyticus
Fatores de virulncia
Produo de urease
Comum a outros patgenos urogenitais

Protena Ssp (Saprophyticus surface associated-protein)

Alta aderncia a clulas uroepiteliais

Hemaglutinina
Importante adesina

Infeco associadas a Staphylococcus

epidermidis e outros estafilococos
Infeco do trato urinrio
S. saprophyticus
Outros estafilococos coagulase negativos
Associados a cateteres

Osteomielite
Complicao de cirurgia

Endocardite
De valvas nativas
Estafilococos coagulase negativos que no S. epidermidis
S. lugdunensis

De prteses valvares
Estafilococos coagulase negativos
S. epidermidis
Formao de microabcessos
Incio incidioso

Infeco associadas a Staphylococcus

epidermidis e outros estafilococos
Infeco de cateteres
S. epidermidis

Bacteremia
Frequente em imunodeprimidos
Via
Dispositivos de acesso vascular

Micrococcus e Gneros Relacionados

Estreita relao com
Arthrobacter
Gnero corineforme Gram-positivo

Biota transitria da pele

Produzem pigmentos carotenides
Agentes oportunistas
Pneumonia, meningite, artrite sptica

Kytococcus sedentarius
Anteriormente Micrococcus
Ceratlise sulcada
Microrganismo hidrolisa a ceratina

Micrococcus e Gneros Relacionados

Rothia mucilaginosa
1978: 1 relato endocardite ps cateterismo
Vrios relatos
Relacionada a pacientes com neoplasias

Isolamento e
Diferenciao

Isolamento e Diferenciao
Estafilococos
Cocos Gram-positivos ou Gram-variveis
0,5 a 1,5 m
Alta semelhana com estreptococos, micrococcus e
peptostreptococcus
Resultado
Gram tpico: cocos Gram-positivos semelhantes a estafilococos

Isolamento de amostras clnicas

1 Etapa
Semadura em gar Sangue de Carneiro (ASC)
Crescimento
Staphylococcus - 24hs
Micrococcus 48hs
Teste de sensibilidade 72hs

Amostra muito contaminada?

Semear tambm em meios
CNA (Colistina- Ac. Nalidxico Columbia)
PEA (gar Fenil Etil-lcool)

Amostras nasais
gar manitol sais

Morfologia das colnias em ASC

ASC

Staphylococcus

* Crescimento rpido
*1 a 3 mm (S.aureus 4 a 6mm)
*semelhante a cultura mista
* Colnias lisas, butirceas, convexas e com
borda contnua
Incubao prolongada = -hemlise e
produo de pigmento

Micrococcus

* Crescimento lento
* 1 a 2 mm
* opacas, convexo-elevado,
contnua

borda

Staphylococcus spp

Aspectos das
colncias em gar
sangue
Micrococcus

Meios cromognicos
CHROMagar Staph aureus
Staphylococcus aureus
Cor malva

Maior sensibilidade

Meios cromognicos
gar S.aureus IB (bioMerieux)
S. aureus
Produz -glicosidase
Colnias verdes

Staphylococcus coag. Negativos

Azuis, brancas e beges

Teste de Catalase
GRAM POSITIVAS
Staphylococcus
CATALASE POSITIVA
Micrococcus
Streptococcus
Enterococcus
bactrias semelhantes a Streptococcus

Prova da Catalase
detecta presena da enzima citocromo oxidase

Prova da Catalase
S. aureus: catalase
+

Lmina de vidro

cultivo em
gar estoque

gota perxido de hidrognio 3%

Desenho esquemtico de procedimentos para a prova da catalase

Mtodos de diferenciao
Micrococcus X Staphylococcus
Vrios mtodos
escolha depende
Tcnico responsvel
Caracterstica do laboratrio

Fermentao da glicose
Mtodo de referncia para diferenciao de Micrococaceae
Aspecto limitante
Incubao prolongada

Teste O/F da Glicose e Manitol

S. aureus O/F glicose
e manitol positivo
incubao - 37C/5 dias

M
cultivo em caldo BHI

gar de Hugh-Leifson
G - glicose
M - manitol
nujol esterelizado

Desenho esquemtico de procedimentos para o testeO/F glicose e manitol

NEGATIVO

POSITIVO

Resultados possveis para prova da O/F Glicose

Manitol. Tubo esquerda com contedo amarelo
exemplifica resultado positivo. Tubo azul ao
centro exemplifica resultado negativo. Tubo
verde direita representa agar HughLeifson no inoculado.

Sensibilidade a lisostafina
Lisostafina
uma endopeptidase
Cliva pentapeptdeos presentes nas paredes de Staphylococcus
Clulas susceptveis lise
Mais sensveis: S.aureus, S. simulans, S. xylosus
Mais resistentes: S. saprophyticus, S.haemolyticus

Teste em tubo
Suspenso com Microrganismo + Soluo de lisostafina --incubao (35C/2hs) --- clarificao da suspenso = sensibilidade

Teste em placa
gar Muller-Hinton ---semeadura---disco de lisostafina--35C/24hs
Presena de halos = Staphylococcus
Sem halos = Micrococcus

Mtodos de diferenciao
Micrococcus X Staphylococcus
Sensibilidade a Furazolidona
Sensiblidade em disco
Staphylococcus: sensvel
Micrococcus: resistentes

Teste de Oxidase Modificada

Teste comercial: Microdase Test Disks
Papel de filtro impregnado com DMSO

Retira a colnia do meio e

fricciona no papel

Cor prpura = +

30 seg
Sem cor= neg=Staphylococcus

Mtodos de diferenciao
Micrococcus X Staphylococcus
Sensibilidade bacitracina
Procedimento disco/zona de inibio
Staphylococcus resistentes
Micrococcus - sensveis

Rotina mais rpida

1 Teste de Catalase
2 Teste de Oxidase Modificada
3 Teste de Furazolidona
4 Teste de Bacitracina

Identificao de Staphylococcus
aureus

Teste de Coagulase
GRAM POSITIVAS
Staphylococcus
COAGULASE POSITIVA
Micrococcus
= S. aureus
Streptococcus
Enterococcus
bactrias semelhantes a Streptococcus

Prova da Coagulase

Teste de Coagulase
Prova da Coagulase
Lmina
Tubo - Referncia

Procedimentos Alternativos
Aglutinao com ltex
partculas de ltex recobertas de plasma
Princpio: detecta fator de agregao e protena A (parede de
Staphylococcus). Ex: StaphAureux, SlidexStaph

Hemaglutinao passiva
Princpio: uso de eritrcitos de carneiro sensibilizados com fibrinognio.
Detecta fator de agregao
H controle negativo
Kits comerciais: Hemastaph

Evoluo
Incluir anticorpos monoclonais contra polissacardeos capsulares 5 e 8
Detecta S. aureus resistentes a meticilna

 Prova da Coagulase
0,3 mL

36C 1C/ 6 horas

cultivo em
caldo BHI

0,3 mL de plasma
de coelho

Desenho esquemtico de procedimentos para a prova da coagulase

Tubo com resultado de teste de coagulase negativa.

Observar a no formao de cogulo no fundo do tubo.

Tubo com resultado de teste de coagulase positiva.

Observar (seta branca) a presena de cogulo no fundo do tubo,
que no se desprende mesmo com a total inverso deste.

Leitura da prova da coagulase

Resultados possveis

Negativo
Fonte:www.hc-sc.gc.ca/.../microbio/images/tubes.gif

Provas
complementares

Coagulase incerta? Testes confirmatrios

S. aureus
termonuclease+

36C 1C/4 hs
Lmina de vidro com gar azul de
toluidina - DNA
cultivo em caldo BHI
banho-maria fervente/15 min
Figura 10 - Desenho esquemtico de procedimentos para a prova da presena
de termonuclease

Resultado da prova de Termonuclease. Observar halo rseo

indicando resultado positivo (crculo vermelho). Ausncia de halo
nos demais poos da lmina indica resultado negativo para a prova.

gar DNAse

Coagulase incerta? Testes confirmatrios

Fermentao do manitol
Teste em tubo
Teste em placa
Usar gar manitol sais
Alta concentrao de sais
inibe outros microrganimos

Identificao de Estafilococos
Coagulase-Negativos

Staphylococcus saprophyticus
Infeco urinria
Gram
Positivos

Morfologia das colnia

Redondas, lisas, de colorao branca a creme, sem hemlise

Testes bioqumicos
Catalase positvos
Coagulase negativos
Novobiocina R

Staphylococcus epidermidis
Relacionado a
Infeces nasocomiais, cateteres, endocardite

Gram
Positivo

Morfologia da colnia
Redondas, lisas, de colorao branca a creme, sem hemlise

Testes bioqumicos
Catalase positivos
Coagulase negativos
Novobiocina S

Consideraes finais

BOA
NOITE!!!!