Inno-Lia HCV Score

INNO-LIA* HCV Score
Manufactured by:
INNOGENETICS N.V.
Technologiepark 6
9052 Ghent
Belgium
+32-9 329 13 29
0459
Distributed by:
INNOGENETICS GmbH
Lembecker Strae 19
46359 Heiden (Westfalen)
Germany
+49-2867 99 07 0
INNOGENETICS s.a.r.l.
8, Rue du Marchal de Lattre-de-Tassigny
59800 Lille
France
+33-1 49 93 26 18
INNOGENETICS S.r.l
Via del Mare 36
00040 Pomezia (Roma)
Italy
+39-06 911 80 375
INNOGENETICS Diagnostica y Terapeutica

(IDT) S.A.
Calle Botnica 146
08908 Hospitalet de Llobregat (Barcelona)
Spain
+34-93 600 8000
Innogenetics 2004
INNOGENETICS N.V.
Technologiepark 6
9052 Ghent
Belgium
+32-9 329 13 29
25428 v0
2004-01-23
* INNO-LIA is a Trademark of Innogenetics N.V.
INNOGENETICS*
2
TABLE OF CONTENTS
Symbols used . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
English
Intended use . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7
Test principle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Reagents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Description, preparation for use and recommended storage
conditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8
Materials required but not provided . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
Safety and environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Specimen (collection and handling) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Remarks and precautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Test procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11
Directions for washing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Directions for incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
Automated test procedure: Auto-LIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
Results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Reading . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16
Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
Interpretation of the results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
Interpretation software: LiRAS for Infectious diseases . . . . . . .17
Limitations of the procedure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Test performance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Sensitivity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
Specificity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
Reproducibility . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Franais
But du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Principe du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20
Ractifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21
Description, prparation et conditions de conservation . . . . . . . .21
Materiel necessaire non fourni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
Consignes de scurit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22
Echantillons (recueil et manipulation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23
Remarques et prcautions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
Procdure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24
Directives de lavage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
Directives pour incubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
Procdure automatise: Auto-LIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Lecture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28
Validation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .29
*INNOGENETICS is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.
INNO-LIA HCV Score

Interprtation des rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Logiciel d'interprtation: LiRAS Maladies infectieuses . . . . . . .30
Limites du test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Performances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Sensibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31
Spcificit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
Reproductibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Deutsch
Beabsichtigter Verwendungszweck . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Funktionsweise des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34
Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit . . . . . . . .34
Zustzlich bentigte Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Sicherheitshinweise und Entsorgung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35
Herstellung der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36
Hinweise und Vorsichtmanahmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Arbeitsablauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37
Waschen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
Inkubation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Automatischer Arbeitsablauf: Auto-LIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40
Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Ablesen der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Validierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
Interpretation der Ergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
Interpretationssoftware: LiRAS fr Infektionskrankheiten . . . . .43
Einschrnkungen des Verfahrens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Leistungsfhigkeit des Tests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Sensitivitt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
Spezifitt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
Reproduzierbarkeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Italiano
Uso previsto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Principio del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
Reagenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione
raccomandate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47
Materiali richiesti ma non forniti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48
Sicurezza e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
Campioni (raccolta e trattamento) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49
Note e precauzioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
Procedura del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50
Indicazioni per il lavaggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
Indicazioni per l'incubazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52
Procedura automatica del test: Auto-LIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
INNOGENETICS
Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
Lettura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
Validazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .55
Interpretazione dei risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
Software di interpretazione: LiRAS per malattie infettive . . . . .56
Limiti della procedura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56
Performance del test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
Sensibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
Specificit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58
Riproducibilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Espaol
Finalidad de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Principio del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
Reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
Descripcin, preparacin para el uso y condiciones de
almacenamiento recomendadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
Materiales necesarios que no se suministran . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Seguridad y medio ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .61
Muestra (recogida y manejo) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62
Observaciones y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63
Procedimiento del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63
Instrucciones para el lavado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65
Instrucciones para la incubacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .66
Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LIA . . . . . . . . . . . . .66
Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Lectura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Validacin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .68
Interpretacin de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
Software de interpretacin: LiRAS para enfermedades
infecciosas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .69
Limitaciones del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
Eficacia del ensayo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
Sensibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .70
Especificidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
Reproducibilidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
Portugus
Utilizao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
Princpio do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
Reagentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
Descrio, preparao para utilizao e condies recomendadas
de conservao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .73
Material necessrio no fornecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74
Segurana e ambiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .75
Amostra (recolha e manuseamento) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76
INNO-LIA HCV Score

Limites e precaues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .76
Procedimento do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77
Instrues de lavagem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78
Instrues de incubao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .79
Procedimento de teste automatizado: Auto-LIA . . . . . . . . . . . . . . . .79
Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81
Leitura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81
Validao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81
Interpretao dos resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .82
Software de interpretao: LiRAS para doenas infecciosas . .83
Limites do procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
Desempenho do teste . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
Sensibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
Especificidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85
Reprodutibilidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85
Symbols used
Manufactured by
Fabriqu par
Hersteller
Prodotto da
Fabricante
Fabricado por
In vitro diagnostic medical device
Pour In vitro diagnostic
Hilfsmittel fr medizinische in-vitro-Diagnostik
Dispositivo medico-diagnostico in vitro
Material mdico para diagnstico in vitro
Dispositivo mdico de diagnstico in vitro
Lot number
Numro de lot
Chargennummer
Numero di lotto
Nmero de lote
Catalogue number
Rfrence catalogue
Katalognummer
Codice
Nmero del catlogo
Nmero de catlogo
INNOGENETICS
6
Use by
Utiliser jusqu'au
Verwenden bis
Utilizzare entro
Fecha de caducidad
Utilizado por
Consult instructions for use
Instructions d'emploi
Bedienungsanleitung lesen
Consultare le istruzioni per l'uso
Consulte las instrucciones de uso
Consultar instrues de utilizao
Biological risk
Risque biologique
Biologische Gefhrdung
Rischio biologico
Riesgo biolgico
Risco biolgico
Temperature limits
Temprature de stockage
Temperatur genau einhalten
Limiti di temperatura
Lmites de temperatura
Limites de temperatura
Contains sufficient for < X > tests
Conditionnement suffisant pour < X > tests
Inhalt ausreichend fr < X > Tests
Contenuto sufficiente per < X > test
Contiene suficientes reactivos para < X > ensayos
Contm reagente suficiente para < X > testes
Negative Control
Contrle ngatif
Negativkontrolle
Controllo negativo
Control negativo
Controlo negativo
Positive Control
Contrle positif
Positivkontrolle
Controllo positivo
Control positivo
Controlo positivo
INNO-LIA HCV Score

Strips
Bandelettes
Teststreifen
Strisce
Tiras
Sample Diluent
Diluant chantillon
Probenverdnner
Diluente del campione
Diluyente de la muestra
Diluente da amostra
Wash Solution 5x
Solution de lavage 5x
5x konzentrierte Waschlsung
Soluzione di lavaggio 5x
Solucin de lavado 5x
Soluo de lavagem 5x
Ready-to-use Conjugate
Conjugu prt l'emploi
Gebrauchsfertiges Konjugat
Coniugato pronto all'uso
Conjugado listo para usar
Conjugado pronto a utilizar
Ready-to-use Substrate BCIP/NBT
Substrat BCIP/NBT prt l'emploi
Gebrauchsfertiges BCIP/NBT-Substrat
Substrato BCIP/NBT pronto all'uso
Sustrato BCIP/NBT listo para usar
Substrato BCIP/NBT pronto a utilizar
Stop Solution
Solution d'arrt
Stopplsung
Soluzione di stop
Solucin de parada
Soluo de paragem
English
Intended use
The INNO-LIA HCV Score is a Line Immuno Assay (LIA), for the detection
of antibodies to human hepatitis C virus in human serum or plasma.
It is intended for use as a supplementary test on human serum or plasma
specimens found to be reactive using an anti-HCV screening procedure.
INNOGENETICS
Test principle
The INNO-LIA HCV Score is a 3rd generation line immunoassay which
incorporates HCV antigens derived from the core region, the E2 hypervariable
region (HVR), the NS3 helicase region, the NS4A, NS4B, and NS5A regions.
The antigens were coated as 6 discrete lines on a nylon strip with plastic
backing. In addition, four control lines are coated on each strip: streptavidin
control line, 3+ positive control (anti-human Ig), 1+ positive control (human IgG),
and the cut-off line (human IgG).
The INNO-LIA HCV Score is based on the principle of an enzyme
immunoassay. A test sample is incubated in a trough together with the LIA test
strip. If present in the sample, HCV antibodies will bind to the HCV antigen
lines on the strip. Subsequently, an affinity-purified alkaline phosphataselabelled goat anti-human IgG (H+L) conjugate is added and reacts with specific
HCV antigen/antibody complexes, if previously formed. Incubation with the
enzyme substrate produces a chestnut-like color, the intensity of which is
proportionate to the amount of HCV-specific antibody captured from the sample
on any given line (Fig. 1). Color development is stopped with sulfuric acid.
Reagents
Description, preparation for use and recommended storage conditions
-
If kept at 2 - 8C, opened or unopened, all reagents are stable until the
expiration date. Do not freeze reagents.
All reagents and the plastic tube containing the test strips must be brought
to room temperature (18 - 25C) approximately 30 minutes before use and
returned to the refrigerator (2 - 8C) immediately after use.
Alterations in the physical appearance of kit reagents may indicate
instability or deterioration.
After opening the original tube containing the strips, any unused strip
will be stable for 16 weeks if stored at 2 - 8C in the closed original tube
with desiccant.
Reagents supplied:
Component
Quantity
Ref.
Strips
20
57329 Containing 20 INNO-LIA HCV antigencoated test strips.
Description
Sample Diluent
30 ml
57304
Containing color-coded (green) phosphate

buffer containing sodium chloride,
detergent, bovine protein stabilizers and
0.3% chloroacetamide (CAA) as
preservative.
INNO-LIA HCV Score
Ready-to-use Conjugate
45 ml
57301 Containing color-coded (red) goat antihuman IgG labeled with alkaline
phosphatase in Tris buffer containing
bovine stabilizers, detergent and 0.01%
methylisothiazolone (MIT)/0.1% CAA as
preservative.
Negative Control
0.12 ml
57307 Containing basematrix of human origin

with 0.01% MIT/0.1% CAA as
preservative.
Positive Control
0.12 ml
57308 Containing inactivated human serum

positive for antibodies to HCV with
0.01% MIT/0.1% CAA as preservative.
Ready-to-use BCIP/NBT
Substrate
45 ml
57302 Containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

phosphate/nitroblue tetrazolium in
dimethyl formamide, with 0.01% MIT/
0.1% CAA as preservative.
Stop Solution
45 ml
57303 Containing 0.1 mol/l sulfuric acid.
Wash Solution
45 ml
57299 Containing color-coded (blue) Tris buffer

containing sodium chloride, detergent
and 0.02% bromo-nitro-dioxane as
preservative, to be diluted 5x in distilled
water. Diluted wash solution is stable for
2 weeks if kept at 2 - 8C.
Incubation tray
Adhesive sealers
With 11 troughs each.
Data reporting sheet
For storage of developed strips.
Reading card
For identification of reactive antigen lines.
Materials required but not provided

-
Distilled or deionized water.

Precision pipettes (with disposable tip) capable of delivering 10 l,
20 - 200 l, and 200 - 1000 l, respectively.
Orbital shaker or rocker (see Directions for incubation).
Vortex mixer or equivalent.
Graduated cylinders: 10, 25, 50 and 100 ml.
Tweezers for strip handling.
Timer.
Optional:
hot air fan (hair dryer) or dry incubator at 37C
a repetitive pipette together with disposable vials for the addition of

sulfuric acid, conjugate, substrate and wash solution
vacuum aspirator which contains 5% sodium hypochlorite solution

in a waste bottle.
INNOGENETICS
10
Safety and environment

-
Please refer to the safety data sheet and product labeling for
information on potentially hazardous components.
R43, S24-37
Irritant! (Xi) Avoid contact with skin. May cause sensitization by skin
contact. Wear suitable gloves.
Contains 2-Chloroacetamide: Sample Diluent, Ready-to-use Conjugate,
Ready-to-use BCIP/NBT Substrate and Negative Control.
-
Specimens, Positive and Negative Control should always be handled as

potentially infectious.
The Positive Control has been found to be negative for anti-HCV and
HbsAg. The Negative Control has been found to be negative for antiHIV-1/HIV-2, anti-HCV and HbsAg. No test method can offer complete
insurance that blood products will not transmit infectious agents.
Therefore, all blood components and biological materials should be
considered as being potentially infectious and should be handled as
such. Only adequately trained personnel should be permitted to perform
the test procedure. All blood components and biological materials should
be disposed of in accordance with established safety procedures.
Autoclave for at least 15 minutes at 121C.
Incinerate disposable material.
Mix liquid waste with sodium hypochlorite so that the final

concentration is 1% sodium hypochlorite. Allow to stand overnight
before disposal. CAUTION: Neutralize liquid waste that contains acid
before adding sodium hypochlorite.
Use of personal protective equipment is necessary: gloves and safety
spectacles when manipulating dangerous or infectious agents.
Waste should be handled according to the institution's waste disposal
guidelines. All federal, state, and local environmental regulations should
also be observed.
Do not aspirate the stop solution in a waste bottle, which contains
sodium hypochlorite.
Specimen (collection and handling)

-
The INNO-LIA HCV Score may be performed on human serum or

plasma collected in tubes containing citrate, heparin or EDTA as
anticoagulants.
Before storage, serum or plasma should be separated from blood clot
or blood cells by centrifugation.
11
-
INNO-LIA HCV Score

Store the specimens at 2 - 8C. For storage longer than one week,
freeze at -20C or lower.
Do not use heat-treated specimens.
Repeatedly (more than 3 times) frozen and thawed samples may
produce erroneous results.
Remarks and precautions

-
Do not use the kit beyond the expiration date.

Do not mix reagents with different lot numbers.
Make sure correct sample volume and washing times are used for
the test procedure needed.
Avoid microbial contamination of reagents.
Ensure that the samples and controls are homogeneous before use.
Do not touch the membrane of the strip. Always manipulate the strips
with the plastic backing.
Use a new pipette tip for each specimen.
Make sure that the test strips are placed in the troughs with their
membrane side facing upwards.
All incubation steps should be performed using an orbital shaker or
rocker (use rocker only for overnight sample incubation).
The shaking of the solutions over the strips is important in achieving
even line staining and maximum sensitivity. During shaking, the strip
surface should be completely submerged.
Cover the troughs with an adhesive sealer to avoid drying of the strips
during the overnight sample incubation.
Unused and developed strips should be kept away from strong light and
heat.
The kit should only be used by personnel trained in clinical laboratory
practices.
Re-use of strips or troughs will result in erroneous results.
Cutting strips will result in erroneous interpretation of the results.
Test procedure
Please read Remarks and precautions before performing the test.
-
16 hours sample incubation
1.
Use the required amount of test troughs, taking into account that for
each test run, a Positive and a Negative Control should be assayed.
Identify test troughs as controls and specimens, and place them in the tray.
Add 1 ml of Sample Diluent to each specimen test trough.
Add 10 l of the appropriate specimen or control to the appropriately
labelled trough.
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INNOGENETICS
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Remove the required amount of LIA test strips from their container, and
add one strip to each of the test troughs. The test strip is placed membrane
side upwards into the trough using tweezers.
THE STRIP MUST BE COMPLETELY SUBMERGED.
Cover the troughs with an adhesive sealer (see Remarks and precautions).
Incubate the samples by placing the tray on a shaker or rocker (see
Direction for incubation) and agitate OVERNIGHT (16 2 h) at room
temperature (18 - 25C).
NOTE:
Carefully remove the adhesive sealers to avoid cross-contamination.

Wash each test strip 3 times (5 minutes) with 1 ml Wash Solution
(see Directions for washing).
Add 1 ml of Conjugate Solution to each test trough.
Incubate with the conjugate by placing the test tray on the shaker or
rocker and agitate for 30 minutes at room temperature (18 - 25C).
Wash each test strip 3 times (5 minutes) with 1 ml Wash Solution
(See Directions for washing).
Add 1 ml of Substrate Solution to each test trough.
Incubate with the substrate by placing the test tray on the shaker or
rocker, and agitate for 30 minutes at room temperature (18 - 25C).
Aspirate liquid. Add 1 ml of Stop Solution to each trough.
Incubate with the stop solution by placing the test trough on the shaker or
rocker, and agitate for 10 - 30 minutes at room temperature (18 - 25C).
Aspirate Stop Solution.
Remove the strips from the test troughs and place them, membrane
side upwards, on absorbent paper using tweezers. As soon as the strips
have dried completely, results can be interpreted. To accelerate the drying
process, place strips in a dry incubator at 37C for 30 minutes or use a
hot air fan for 1 minute. Developed strips will retain their color if stored in
the dark.
2 and 3 hours sample incubation
For the "2 hours and 3 hours sample incubation" protocol the same 15 steps
as for the test procedure "16 hours sample incubation" will be followed, but
changes to steps 3 - 5 - 6 and 9 have to be taken into account. Sample
volume for specimens and controls will increase from 10 to 20 l (step 3) and
sample incubation time changes to 2 and 3 hours (step 5). Washing after
sample incubation changes for the 2 hours procedure to 3 times 10 minutes
and for the 3 hours procedure to 3 times 6 minutes (step 6); finally the second
washing is 3 times 3 minutes for the 2 and 3 hours sample incubation.
13
INNO-LIA HCV Score
Summary test procedures with highlighted differences (bold), given in

following table:
Sample Diluent
Specimen
Controls
LIA test strips
Washing
RTU* Conjugate
Washing
RTU* Substrate
Stop Solution
16 hours sample
incubation
2 hours sample
incubation
3 hours sample
incubation
1 ml
10 l
10 l
16 hours 2 hours
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
2 hours
1 ml/3 x 10 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
3 hours
1 ml/3 x 6 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
*RTU = Ready-to-use
Directions for washing

-
After overnight, 2 hours and 3 hours incubation, carefully remove the

adhesive plate sealer.
The liquid is aspirated from the trough with a pipette, preferentially
attached to a vacuum aspirator, which contains 5% sodium hypochlorite
solution in the waste bottle.
The tray is held at an angle to allow all liquid to flow to one side of the
trough (to the uncoated plastic backing part of each strip).
Add 1 ml of diluted wash solution to each trough and agitate for 1 minute
on a shaker or rocker.
Repeat these steps as many times as indicated in the assay procedure.
NOTE:
Do not allow the strips to dry between the washing steps.
Make sure not to damage the surface of the LIA test strips when
aspirating.
Make sure the entire strip is thoroughly washed by complete

submersion in the washing solution.
Adapt the speed of the shaker or rocker when necessary.
Directions for incubation

-
All the incubation steps (sample, conjugate, substrate, and sulfuric acid
incubation) and also the washing steps should be performed on a
shaker or rocker (use rocker only for overnight sample incubation).
During incubation and washing steps, the strip surface should be
completely submerged, with the membrane side facing upwards.
The shaker or rocker should allow a reciprocal (to- and- fro) motion of
the strips in the trough, and a movement of the liquid over the strips
without spilling over the trough.
INNOGENETICS
-
14
The speed generated by an orbital or longitudinal shaker or rocker is

critical in achieving even line staining and maximum sensitivity.
Recommendations for an orbital shaker:
diameter of the circular motion should be equal or superior to 13 mm
recommended speed for a 13 mm circular motion is 160 rpm
recommended speed for a 24 mm circular motion is 90 rpm.

Recommendations for a rocker:
the difference between highest and lowest point should not exceed 80 mm to
avoid spilling of liquid
recommended speed is 34 rpm.
Automated test procedure: Auto-LIA

The LIA test procedure can easily be automated using the Auto-LIA
automate. This instrument is a walk-away system with automated aspiration,
pipetting, and incubation. For more information on the Auto-LIA, please
contact Innogenetics or your local distributor.
Please read Remarks and precautions before performing the test.
Detailed Auto-LIA procedures
16 hours sample incubation Auto-LIA
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DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 l

INC 1 min, shake speed 4
PAUSE
WASH CH2 Stpos: 1 Endpos: end 1000 l
ASP
ASP
INC 30 min; shake speed 4
ASP
ASP
END
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-
INNO-LIA HCV Score

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PAUSE
ASP
ASP
ASP
ASP
END
CH1
CH2
CH4
CH5
CH6
=
=
=
=
=
Sample Diluent
Wash Solution
Conjugate
Stop Solution
Substrate
For the "3 hours sample incubation" protocol the same 27 steps as for the
test procedure "2 hours sample incubation" will be followed, but changes to
steps 4 - 6 - 8 and 10 have to be taken into account. Sample incubation time
changes to 180 minutes for the 3 hours procedure (step 4) and washing after
3 hours sample incubation changes to 3 times 6 minutes (steps 6 - 8 - 10).
INNOGENETICS
16
Results
Reading
The identity and location of the antigens and controls coated on the strip are
as follows:
I.D.n
Streptavidin
Level 3+, anti-human Ig, strong positive
Level 1+, human IgG, moderate positive
Level +/-, human IgG, weak positive
C1
C2
E2
NS3
NS4
HCV antigens
NS5
Figure 1:
INNO-LIA HCV Score test strip
The intensity of the reaction on the control lines on each strip is used to
assign the reactivity ratings for each antigen on that strip:
Intensity of antigen line reaction (R)
Lower than
Equal to
Higher than , but lower or equal to 1+
Higher than 1+ but lower than 3+
Equal to 3+
Higher than 3+
Rating
R<
R=
< R = 1+
1+ < R < 3+
R = 3+
R > 3+
1+
2+
3+
4+
A reactivity rating must be made separately for each strip. To facilitate the
interpretation, a reading card is enclosed. The alignment of the developed
strip with the 3+ control line on the reading card makes the identification of
the lines easier.
17
INNO-LIA HCV Score
Validation
Check the validity of the positive and the negative control strips and the
validity of the control levels on each strip before reading the test results.
Validation of the test run:
1. The positive control strip must show a reaction of at least 1+ on C1, C2,
NS3 and NS4 antigen line. The E2 and NS5 antigen line may show a
negative rating.
2. The negative control strip must show a negative rating (no reaction at
all or at least less than control level for all the HCV antigen lines).
Validation of a single strip:
1. The control levels 1+ and as well as the strong positive control level
3+ should be visible.
2. The intensity of the control level 3+ should be greater than that of level
1+ and the intensity of the level 1+ should be greater than that of level .
3. The control line for anti-streptavidin should have a negative rating.
NOTE:
The strip must be completely dried to avoid any misinterpretation

due to faintly visible bands appearing after addition of stop dilution.
Do not place paper on top of the strips as long as they are wet.
Weak control bands can be observed for samples containing high

IgG levels (above the normal IgG range).
Interpretation of the results
Extensive evaluations have shown that results may be interpreted as follows:
A sample is NEGATIVE for HCV antibodies:
if all HCV antigen lines have a negative reactivity rating
if only one HCV antigen line has a reactivity of , except when the
reactivity is observed for NS3.
A sample is POSITIVE for HCV antibodies:
if at least two HCV antigen lines have a reactivity of minimum or higher.
A sample is considered INDETERMINATE for HCV antibodies:
if one HCV antigen line has a reactivity rating of 1+ or higher
if the NS3 line reacts with a reactivity of or higher and all other antigen
lines are negative.
Interpretation software: LiRAS for Infectious diseases
The LiRAS for infectious diseases software is designed to assist with the
interpretation of the LIA results. Please contact your local distributor to obtain
the latest updated version.
INNOGENETICS
18
WARNING:
Do not use the automated interpretation without taking into account the
limitations of the procedure mentioned below.
Limitations of the procedure
-
The protocol provided must be strictly followed to obtain optimal

performance of the assay.
Samples with a single +/- reactivity or higher on NS3 can be indicative
for HCV seroconversion. They are therefore scored as indeterminate.
If an INDETERMINATE result is obtained, it is recommended to test an
additional patient sample after a few weeks.
A sample giving a positive reaction on the streptavidin control line may
give cross-reactions with other HCV antigens lines and can not be
determined as positive for HCV antibodies.
Anti-HCV antibodies may be undetectable in early infection.
In a hemodialyses setting antibodies may be undetectable.
The use of diluted samples may give erroneous results.
Parameters for assessing liver damage and HCV RNA positivity should
be further investigated in HCV antibody-positive subjects before initiating
treatment or invasive procedures.
Test performance
Sensitivity
Seroconversion panels/low-titer panels
The results of the INNO-LIA HCV Score using the Auto-LIA 2-hour
sample incubation procedure and the manual 16-hour sample incubation
procedure were obtained internally on 13 BBI seroconversion panels (PHV
904 till 916), on 2 BBI low titer panels (PHV103 and 204), and on the
SFTS94 panel. These results were compared with CHIRON RIBA HCV
3.0 SIA and INNO-LIA HCV Ab III update results.
INNO-LIA HCV Score using the 2-hour and the 16-hour sample incubation
procedure detected antibodies earlier than CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA in
7 panels, and 4 panels became positive at the same time. CHIRON RIBA
HCV 3.0 SIA detected antibodies earlier than INNO-LIA HCV Score using
both sample incubation procedures in one panel. One panel did not become
positive with any of these tests.
The INNO-LIA HCV Score using the 2-hour procedure detected antibodies
earlier than INNO-LIA HCV Ab III update in 2 panels, and the other 10 panels
became positive at the same time. Using the 16-hour procedure, 4 panels
became positive earlier than INNO-LIA HCV Ab III update, 7 panels became
positive at the same time, and one panel became positive later.
19
INNO-LIA HCV Score
On the 40 samples within the 2 BBI low-titer panels, 28 and 32 samples

were positive on INNO-LIA HCV Score using the 2-hour and 16-hour
sample incubation procedures, respectively. Thirty-five of these samples
were positive with CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA, while 34 were positive
using the INNO-LIA HCV Ab III update. All positive samples with
CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA or with INNO-LIA HCV HCV Ab III update
were positive or indeterminate using the INNO-LIA HCV Score.
On the 49 samples within the SFTS94 panel, 38, 41, and 40 samples scored
positive with INNO-LIA HCV Score using the 2-hour and the 16-hour sample
incubation procedures, and with INNO-LIA HCV Ab III update, respectively.
Thirty-one of these samples were found to be positive with the CHIRON
RIBA HCV 3.0 SIA.
HCV-positive samples
A total of 257 samples, originating from HCV-infected patients and found to be
positive on 2 screening assays and on INNO-LIA HCV Ab III update, were
analyzed internally on the INNO-LIA HCV Score using the Auto-LIA 2-hour
sample incubation procedure. All samples scored positive, with the exception of
a single sample which scored indeterminate, resulting in a sensitivity, upon
inclusion of the single indeterminate result, of 100% (257/257).
Different genotypes
The INNO-LIA HCV Score using the Auto-LIA 2-hour sample incubation
procedure was performed internally on 15 samples of genotype 1a, 15 of 1b,
15 of genotype 2, 15 of genotype 3a, 15 of genotype 4a, 5 of genotype 4 nona, and 5 of genotype 5. All samples scored positive, resulting in a sensitivity of
100% (85/85).
Specificity
Blood donors
A total of 400 blood donors found to be negative for HCV antibodies were
analyzed internally using the manual 16-hour sample incubation procedure.
After initial testing, 377 samples were scored negative, 22 samples scored
indeterminate, and one sample scored positive, resulting in an initial specificity of
94.3% (377/400). The initial positive blood sample scored negative after repeated
testing in duplicate, resulting in a specificity after re-testing of 94.5% (378/400).
Clinical samples
Two hundred five clinical samples were tested internally using the manual
16-hour sample incubation procedure. One hundred eighty-nine of them
scored negative, 11 were indeterminate, and 5 scored positive. Three of
these 5 samples scored negative after repeated testing in duplicate.
One of the other 2 samples scored positive after repeated testing on INNOLIA HCV Score and after testing on INNO-LIA HCV Ab III update, while
the other sample scored indeterminate on these assays. Both samples were
INNOGENETICS
20
negative on Ortho HCV 3.0 ELISA with Enhanced SAVe and on INNOTEST
HCV Ab IV. One of these 2 samples was tested on CHIRON RIBA HCV 3.0
SIA as well, and was found to be negative. For this sample set, an initial
specificity of 92.2% (189/205) was obtained, while specificity after repeated
testing was 93.7% (192/205).
Potentially interfering samples
One hundred thirty-seven potentially interfering samples were tested
internally using the manual 16-hour sample incubation procedure.
One hundred twenty-seven samples turned out to be negative, 9 were
indeterminate, and one scored positive. Upon repeated testing in duplicate,
this sample scored positive once, and then indeterminate, while a positive
result was obtained on INNO-LIA HCV Ab III Update. This sample was
found to be negative on Ortho HCV 3.0 ELISA with Enhanced SAVe, on
INNOTEST HCV Ab IV, and on CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA.
On this set of samples, a specificity of 92.7% (127/137) was obtained.
Reproducibility
Two experimenters tested a panel of 13 HCV-positive samples, as well as
one positive and one negative control on 3 different lots using the Auto-LIA
2-hour sample incubation procedure while a third experimenter tested this
panel on one of these lots. The use of different strip lots and performance by
different experimenters resulted in the same test outcome.
Franais
But du test
Le test INNO-LIA HCV Score est un test immunoenzymatique sur bandelette
= Line Immuno Assay (LIA) destin la dtection des anticorps dirigs contre le
virus de l'Hpatite C dans le srum ou le plasma humain. Ce test de validation
est destin tre utilis titre complmentaire, comme test plus spcifique, sur
des chantillons de srum ou de plasma humains qui se sont rvls positifs
dans le cadre d'une procdure de dpistage des anticorps anti-HCV.
Principe du test
INNO-LIA HCV Score est un test de 3me gnration de LIA qui utilise des
antignes HCV issus de la rgion Core, de la rgion hypervariable E2 (RHV),
de la rgion hlicase NS3 et des rgions NS4A, NS4B et NS5A.
Les antignes sont fixs sous forme de 6 fines bandes sur une bandelette
de nylon adhrant un support plastique. Par ailleurs, 4 bandes de contrle
sont fixes sur chaque bandelette: anti-streptavidine, Contrle Positif 3+
(anti-Ig humaines), Contrle Positif 1+ (IgG humaines), et la bande limite
(IgG humaines).
21
INNO-LIA HCV Score
Le test INNO-LIA HCV Score est bas sur le principe d'un test
immunoenzymatique. Un chantillon est incub dans un compartiment avec
une bandelette LIA. Les anticorps anti-HCV ventuellement prsents dans
l'chantillon vont se lier aux bandes d'antignes HCV fixes sur la
bandelette. Ensuite, un conjugu anti-IgG humaines (H+L) d'origine caprine
coupl la phosphatase alcaline est ajout et se fixe au complexe
antigne/anticorps prcdemment form. L'incubation avec le substrat de
l'enzyme produit une couleur marron dont l'intensit est proportionnelle la
quantit d'anticorps anti-HCV spcifiques lis aux bandes d'antignes.
Le dveloppement de la coloration est arrt par addition d'acide sulfurique.
Ractifs
Description, prparation et conditions de conservation
-
Maintenus 2 - 8C, tous les ractifs, ouverts ou ferms, y compris les

bandelettes, sont stables jusqu' la date de premption du kit.
Ne pas congeler les ractifs.
Ramener temprature ambiante (18 - 25C) tous les ractifs environ
30 minutes avant le dbut du test, puis les replacer 2 - 8C
immdiatement aprs utilisation.
Une altration de l'apparence physique des composants du kit peut
indiquer une instabilit ou une dtrioration.
Aprs premire ouverture du tube contenant les bandelettes, celles-ci,
non utilises seront stables pour une dure de 16 semaines conserves
dans ce tube d'origine avec le dessicant.
Ractifs fournis:
Composant
Quantit
Ref.
Bandelettes
20
57329 20 bandelettes INNO-LIA sensibilises

avec des antignes HCV.
Description
Diluant chantillon
30 ml
57304 Tampon phosphate code-color (vert)

contenant chlorure de sodium, dtergent,
stabilisateurs de protines bovines et 0.3%
chloroacetamide comme conservateur.
Conjugu prt l'emploi
45 ml
57301
Contrle ngatif
0.12 ml
57307 Contenant matrice d'origine humaine de

base et 0.01% MIT/0.1% CAA comme
conservateur.
Contrle positif
0.12 ml
57308 Srum humain inactiv contenant des

anticorps anti-HCV et 0.01% MIT/0.1%
CAA comme conservateur.
Anti-IgG humaine de chvre code colore

(rouge) marque la phosphatase alcaline
en tampon Tris contenant protines
stabilisatrices, dtergent et 0.01% MIT/
0.1% CAA comme conservateur.
22
INNOGENETICS
Substrat
BCIP/NBT prt l'emploi
45 ml
57302 5-bromo-4-chloro-3-idolyl phosphate/

nitrobleu tetrazolium en dimethyl
formamide avec 0.01% MIT/0.1% CAA
comme conservateur.
Solution d'arrt
45 ml
57303 Acide Sulfurique 0.1 mole/l
Solution de lavage
45 ml
57299 Tampon Tris code-color (bleu) contenant

chlorure de sodium, dtergent et bromonitro-dioxane 0.02% comme conservateur
diluer au 1/5 en eau distille avant
emploi. La Solution de Lavage dilue est
stable 2 semaines conserve 2 - 8C.
Plaque d'incubation
Adhsifs pour microplaque 5
11 compartiments chacune
Feuille de rsultats
Pour la conservation des bandelettes

dveloppes.
Carte de lecture
Pour l'identification des bandes antigne

ractives.
Materiel necessaire non fourni

-
Eau distille ou desionise.

Pipettes de prcision rglables (10 l, 20 - 200 l, 200 - 1000 l) avec
embouts jetables.
Agitateur (rotatif ou basculant). Voir Directives pour incubation.
Vortex ou quivalent.
Eprouvettes gradues (10, 25, 50, 100 ml).
Pince pour la manipulation des bandelettes.
Minuteur.
En option:
Sche cheveux ou incubateur sec 37C pour le schage des

bandelettes.
Pipette rptition avec rcipients jetables pour l'addition de l'acide

sulfurique, du conjugu, du substrat et de la solution de lavage.
Systme d'aspiration avec rcipient d'vacuation contenant une

solution hypochlorite de sodium 5%.
Consignes de scurit
-
Se rfrer aux fiches de scurit du fabricant et l'tiquetage du

produit pour toute information sur des composants potentiellement
dangereux.
23
INNO-LIA HCV Score
R43, S24-37
Irritant! (Xi) Eviter le contact avec la peau. Peut causer des irritations par
contact avec la peau. Porter des gants de protection.
Contient 2-chloroactamide: Diluant chantillon, Conjugu prt l'emploi,
Substrat BCIP/NBT prt l'emploi, Contrle ngatif et Contrle positif.
-
Les chantillons, le Contrle positif et le Contrle ngatif doivent toujours

tre manipuls comme potentiellement infectieux.
Le Contrle positif a t retrouv ngatif pour les anticorps HCV et
HbsAg. Le Contrle ngatif a t retrouv ngatif pour les anticorps
HIV-1/HIV-2, HCV et HbsAg. Aucune mthode de test peut offrir une
garantie absolue que les produits drivs du sang ne sont pas capables
de transmettre des agents infectieux.
Tout constituant driv du sang, ainsi que tout matriel biologique, doit donc
tre considr comme potentiellement infectieux et devra tre manipul
avec les prcautions d'usage. Seul le personnel qualifi doit tre autoris
raliser le test. Tous les drivs sanguins et matriels biologiques doivent
tre limins selon les procdures de scurit en vigueur:
Autoclave au moins 15 min 121C.
Incinration des matriels jetables.
Mlanger les dchets liquides avec de l'hypochlorite de sodium

une concentration finale d'environ 1%. Laisser en contact une nuit
avant l'vacuation. ATTENTION: Les liquides contenant de l'acide
doivent tre neutraliss avant ajout d'hypochlorite de sodium.
L'utilisation d'un quipement pour protection du personnel est ncessaire:
gants et crans lors de la manipulation d'agents dangereux ou infectieux.
Les dchets doivent tre limins selon le rglement du laboratoire, et la
rglementation en vigueur pour l'environnement doit tre suivie.
Ne pas aspirer et liminer la solution d'arrt dans le rcipient d'vacuation
contenant l'hypochlorite de sodium.
Echantillons (recueil et manipulation)

-
Raliser le test INNO-LIA HCV Score avec des chantillons de

srum ou de plasma humain prlev sur citrate, hparine ou EDTA.
Sparer le srum ou le plasma du caillot ou des cellules sanguines par
centrifugation avant conservation.
Conserver les chantillons entre 2 - 8C.Pour une conservation au-del
d'une semaine, congeler -20C ou plus bas.
Ne pas utiliser d'chantillons chauffs.
Des cycles de conglation/dconglation rpts (plus de 3) peuvent
entraner des rsultats errons.
INNOGENETICS
24
Remarques et prcautions
-
Ne pas utiliser au-del de la date de premption.

Ne pas mlanger les ractifs de n de lot diffrents.
S'assurer que le volume d'chantillon et les temps de lavage sont
corrects au regard de la procdure choisie.
Eviter toute contamination microbienne des ractifs.
S'assurer de l'homognit des chantillons et des contrles avant usage.
Ne pas toucher la bandelette en dehors de la partie plastifie.
Utiliser un embout neuf pour chaque chantillon.
Placer les bandelettes dans les compartiments face sensibilise oriente
vers le haut.
Toutes les tapes sont conduites sur un agitateur rotatif ou basculant.
(Rserver l'agitateur basculant uniquement l'tape d'incubation de
nuit de l'chantillon).
L'agitation des solutions par-dessus la bandelette est un paramtre
critique pour optimiser la sensibilit et homogniser la coloration.
La bandelette doit tre compltement immerge.
Couvrir les compartiments avec un adhsif pour microplaque afin d'viter
l'asschement des bandelettes durant l'tape d'incubation de nuit.
Tenir les bandelettes neuves ou dveloppes loignes de toute source
de lumire intense et de chaleur.
Utilisation par des professionnels.
Les bandelettes et les compartiments ne sont pas rutilisables.
Dcouper les bandelettes peut entraner l'interprtation errone des
rsultats.
Procdure
Lire Remarques et prcautions avant de dbuter le test.
-
Incubation des chantillons sur 16 heures
1.
Prendre la quantit requise de compartiments, tenant en compte que

pour chaque srie un contrle positif et ngatif doivent tre effectus.
Identifier chaque compartiment pour les contrles et les chantillons,
et les placer dans le support.
Ajouter 1 ml de Diluant chantillon chaque compartiment.
Ajouter 10 l d'chantillon ou de Contrle au compartiment identifi
appropri.
Retirer la quantit requise de bandelettes LIA de tube et placer une
bandelette par compartiment l'aide d'une pince ct membrane
orient vers le haut. LA BANDELETTE DOIT ETRE COMPLETEMENT
IMMERGEE.
2.
3.
4.
25
5.
6.
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10.
11.
12.
13.
14.
15.
INNO-LIA HCV Score

Recouvrir les compartiments d'un adhsif (voir Remarques et
prcautions). Incuber les chantillons sous agitation (voir Directives
pour incubation) pendant UNE NUIT (16 2 h) temprature ambiante
(18 - 25C). En plaant le support sur un agitateur (voir Directives pour
incubation) et agiter.
NOTE:
Retirez l'adhsif avec prcaution afin d'viter toute contamination

croise.
Laver chaque bandelette 3 fois (5 minutes) avec 1 ml de solution de
lavage (voir Directives de lavage).
Ajouter 1 ml de Conjugu chaque compartiment.
Incuber sous agitation pendant 30 minutes temprature ambiante
(18 - 25C).
Laver chaque bandelette 3 fois (5 minutes) avec 1 ml de solution de
lavage (voir Directives de lavage).
Ajouter 1 ml de Substrat chaque compartiment.
Incuber sous agitation pendant 30 minutes temprature ambiante
(18 - 25C).
Aspirer. Ajouter 1 ml de Solution d'arret chaque compartiment.
Incuber sous agitation pendant 10 - 30 minutes temprature ambiante
(18 - 25C).
Aspirer la Solution d'arret.
Retirer les bandelettes des compartiments l'aide d'une pince et les
placer sur du papier absorbant. Les rsultats peuvent tre interprts
ds que les bandelettes sont compltement sches. Afin d'acclrer le
processus de schage, placez les bandelettes dans un incubateur sec
37C pendant 30 minutes ou utiliser un sche-cheveux pendant
une minute. Les bandelettes dveloppes gardent leur coloration si
elles sont conserves l'obscurit.
Incubation des chantillons sur 2 heures ou 3 heures
Pour la procdure d'incubation des chantillons sur 2 ou 3 heures, on appliquera

les 15 tapes prcdemment dcrites dans Incubation des chantillons sur 16
heures en apportant des modifications aux tapes 3, 5, 6 et 9. Le volume des
chantillons et des Controles passe de 10 - 20 l (tape 3) et la dure
d'incubation des chantillons passe 2 ou 3 heures (tape 5).
L'tape de Lavage aprs l'incubation des chantillons passe 3 x 10 min pour la
procdure sur 2 heures et 3 x 6 min pour la procdure sur 3 heures (tape 6).
Enfin, la seconde tape de Lavage est 3 x 3 min pour les 2 procdures sur 2 et 3
heures.
26
INNOGENETICS
Un rsum des procdures mettant en vidence les diffrences (en gras)
est propos dans le tableau suivant:
Diluant chantillon
Echantillons
Controles
Bandelettes LIA
Lavage
Conjugu PAE*
Lavage
Substrat PAE*
Solution d'arrt
Incubation
des chantillons
sur 16 heures
Incubation
des chantillons
sur 2 heures
Incubation
des chantillons
sur 3 heures
1 ml
10 l
10 l
16 heures 2 heures
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
2 heures
1 ml/3 x 10 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
3 heures
1 ml/3 x 6 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
*PAE = Prt A l'Emploi
Directives de lavage
-
A l'issue de l'tape d'incubation des chantillons (nuit, 2 heures ou

3 heures), retirer l'adhsif de la plaque avec prcaution.
Aspirer le liquide de chaque compartiment de la plaque l'aide d'une
pipette, de prfrence branche sur une pompe vide et relie un
rcipient d'vacuation contenant de l'hypochlorite de sodium 5%.
Incliner la plaque et aspirer le liquide l'angle du compartiment (cot
extrmit plastique de la bandelette).
Ajouter 1 ml de Solution de lavage dilue chaque barquette et laisser
agiter 5 minutes sur un agitateur.
Rpter cette tape le nombre de fois indiqu dans la procdure.
NOTE:
Ne pas laisser les bandelettes s'asscher durant ces tapes.
Ne pas endommager la surface de la bandelette durant l'aspiration.
S'assurer que la bandelette est entirement lave par immersion

complte dans la solution.
Rajuster la vitesse de l'agitation si ncessaire.
Directives pour incubation

-
Toutes les tapes (Echantillons, Conjugu, Substrat, Solution d'arrt et

galement Lavage) doivent tre conduites sur un agitateur rotatif ou
basculant. (Rserver l'agitateur basculant uniquement l'tape
d'incubation de nuit de l'chantillon).
Au cours des phases de lavage et d'incubation, la surface de la
bandelette doit tre compltement immerge, face membrane
sensibilise oriente vers le haut.
L'agitateur doit permettre un mouvement rciproque de va-et-vient de la
bandelette dans le compartiment et du liquide par-dessus la bandelette
en vitant tout dbordement.
27
-
INNO-LIA HCV Score

La vitesse d'agitation gnre par l'agitateur orbital, linaire ou basculant
est un paramtre critique pour optimiser la sensibilit et homogniser la
coloration.
Recommandations pour un agitateur orbital:
le diamtre du mouvement circulaire doit tre gal ou suprieur 13 mm
la vitesse recommande, pour un mouvement circulaire de 13 mm, est de 160 rpm
La vitesse recommande, pour un mouvement circulaire de 24 mm, est de 90 rpm.

Recommandations pour un agitateur basculant:
la diffrence entre le point le plus haut et le point le plus bas ne doit pas
dpasser 80 mm afin d'viter tout dbordement du liquide
la vitesse recommande est de 34 rpm.
Procdure automatise: Auto-LIA

La procdure LIA se prte bien l'automatisation. L'Auto-LIA prend
totalement en charge les tapes d'aspiration, de pipetage et d'incubation.
Pour plus d'information et pour les programmes spcifiques sur Auto-LIA,
contacter Innogenetics ou votre distributeur.
Lire Remarques et prcautions avant de dbuter le test.
Procdure Auto-LIA dtaille
Programme Auto-LIA pour incubation des chantillons sur 16 heures
1.
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27.

PAUSE
ASP
ASP
ASP
ASP
END
INNOGENETICS
-
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25.
26.
27.

PAUSE
ASP
ASP
DISP CH6 Stpos: 1 Endpos : end 1000 l
ASP
DISP CH5 Stpos: 1 Endpos : end 1000 l
ASP
END
CH1
CH2
CH4
CH5
CH6
=
=
=
=
=
Diluant Echantillon
Solution de Lavage
Conjugu
Solution d'Arrt
Substrat
Pour la procdure d'incubation des chantillons sur 3 heures, on appliquera

les 27 tapes prcdemment dcrites dans Programme Auto-LIA pour
incubation des chantillons sur 2 heures en apportant des modifications
aux tapes 4, 6, 8 et 10. La dure d'incubation des chantillons passe
180 minutes pour la procdure en 3 heures (tape 4) et les lavages aprs
cette tape d'incubation de 3 heures passe 3 x 6 min (tapes 6 - 8 et 10).
Rsultats
Lecture
L'identit et la localisation des antignes et des contrles fixs sur la
bandelette sont les suivantes: voir Figure 1 page 16.
29
INNO-LIA HCV Score
Un score de ractivit est attribu aux bandes antigniques par comparaison

de leurs intensits avec celles des bandes contrles de chaque bandelette.
Intensit des bandes d'antigne (R)
Infrieur
Egale
Suprieure et infrieure ou gale 1+
Suprieure 1+ mais infrieure 3+
Egale 3+
Suprieure 3+
Score
R<
R=
< R = 1+
1+ < R < 3+
R = 3+
R > 3+
1+
2+
3+
4+
Le score de ractivit doit tre tabli sparment pour chaque bandelette.

Une carte de lecture est fournie pour faciliter l'interprtation.
L'alignement de la bandelette dveloppe avec la bande contrle 3+ de la
carte de lecture facilite l'identification des bandes.
Validation
Vrifier la validit des bandelettes de Contrles positif et ngatif ainsi que la
validit des Contrles de niveaux sur chaque bandelette avant d'interprter
les rsultats du test.
Validation de la srie:
1. La bandelette Contrle positif doit prsenter un score au moins gal
1+ pour les bandes C1, C2, NS3 et NS4. Les bandes NS5 et E2
peuvent tre ngatives.
2. Toutes les bandes d'antignes HCV de la bandelette Contrle ngatif
doivent tre ngatives (pas de ractivit du tout ou, au plus, ractivit
d'intensit infrieure au niveau de la bande contrle ).
Validation d'une bandelette:
1. Les bandes contrles dterminant les niveaux , 1+ et 3+ doivent tre
visibles sur toutes les bandelettes.
2. L'intensit de la bande contrle 3+ doit tre suprieure celle du
contrle 1+, elle-mme suprieure celle du niveau .
3. La bande contrle anti-streptavidine doit prsenter un score ngatif.
NOTE:
La bandelette doit tre compltement sche pour viter toute

erreur d'interprtation due l'apparition de bandes fantmes aprs
addition de Solution d'arrt.
Ne pas placer de papier par-dessus les bandelettes tant qu'elles ne

sont pas sches.
Des bandes contrles faiblement ractives peuvent tre observes

en prsence d'chantillons contenant de forts taux d'IgG (suprieurs
la limite haute normale).
INNOGENETICS
30
Interprtation des rsultats

De nombreuses valuations ont montr que les rsultats doivent tre
interprts de la faon suivante:
Un chantillon est considr NGATIF en anticorps anti-HCV:
si toutes les bandes antigniques HCV prsentent un score de ractivit
ngatif
si une seule bande antignique HCV prsente un score de ractivit ,
except si cette ractivit est observe pour la bande NS3.
Un chantillon est considr POSITIF en anticorps anti-HCV:
si au moins 2 bandes antigniques HCV prsentent un score de
ractivit gal ou suprieur.
Un chantillon est considr INDTERMIN en anticorps anti-HCV:
si une seule bande antignique HCV prsente un score de ractivit
gal 1+ ou suprieur
si la bande NS3 prsente un score de ractivit gal ou suprieur
et que toutes les autres bandes sont ngatives.
Logiciel d'interprtation: LiRAS Maladies infectieuses
Le logiciel LiRAS Maladies infectieuses est conu pour aider l'interprtation
des rsultats du LIA. Contacter votre distributeur pour obtenir sa dernire version.
ATTENTION:
Ne pas utiliser l'interprtation automatise sans tenir compte des limites
du test mentionnes ci-dessous.
Limites du test
-
Le protocole fourni doit tre strictement suivi afin d'obtenir des

performances optimales.
Une ractivit unique NS3 ou suprieure peut tre indicative d'une
sroconversion. De tels chantillons seront classs comme indtermins.
En cas de rsultat INDETERMINE, il est recommand de tester un
chantillon du mme patient prlev quelques semaines plus tard.
Un chantillon prsentant une ractivit de la bande contrle streptavidine
peut galement prsenter des ractivits croises avec les autres bandes
antigniques HCV et ne peut pas tre tiquet HCV positif.
Les anticorps anti-HCV peuvent tre indtectables durant la phase
prcoce de l'infection.
Les anticorps peuvent tre indtectables dans un contexte d'hmodialyse.
L'utilisation d'chantillons dilus peut conduire des rsultats errons.
31
-
INNO-LIA HCV Score

Des paramtres mesurant l'atteinte hpatique et l'ARN HCV devront
tre mis en uvre chez les sujets anti-HCV positifs avant toute
initiation de traitement ou procdures invasives.
Performances
Sensibilit
Panels de sroconversion/Panels de titres bas
Les rsultats ont t obtenus en interne avec INNO-LIA HCV Score sur
Auto-LIA-programme pour incubation des chantillons sur 2 heures- et en
technique manuelle avec incubation des chantillons sur 16 heures, vis vis
de 13 panels BBI de sroconversion (PHV904 916), de 2 panels BBI de titres
bas (PHV103 et 204) et du panel SFTS94. Ces rsultats ont t compars aux
rsultats obtenus avec CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA et avec INNO-LIA
HCV Ab III Update.
INNO-LIA HCV Score -procdure d'incubation 2 heures et 16 heuresa dtect les anticorps anti-HCV plus tt que RIBA 3.0 pour 7 panels. 4 panels
ont prsent une positivit en mme temps. CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA a
dtect les anticorps anti-HCV plus tt que INNO-LIA HCV Score (pour les
2 procdures d'incubation) pour 1 panel. Un panel n'a donn aucune ractivit
par aucun des 2 tests.
INNO-LIA HCV Score -procdure d'incubation sur 2 heures- a dtect les
anticorps anti-HCV plus tt que INNO-LIA HCV Ab III Update pour 2 panels,
10 autres panels devenant positifs par les 2 tests en mme temps.
Avec la procdure d'incubation sur 16 heures, 4 panels sont devenus positifs
plus tt qu'avec INNO-LIA HCV Ab III Update, 7 panels sont devenus
positifs en mme temps et 1 panel est devenu positif plus tard.
Des 40 chantillons des 2 panels BBI de titres bas, 28 et 32 chantillons
respectivement ont t positifs avec INNO-LIA HCV Score -procdure
d'incubation 2 heures et 16 heures-. 35 de ces chantillons taient positifs
avec CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA tandis que 34 l'taient avec INNO-LIA
HCV Ab III Update. Tous les chantillons positifs avec CHIRON RIBA HCV
3.0 SIA ou INNO-LIA HCV Ab III Update ont t trouvs positifs ou
indtermins avec INNO-LIA HCV Score.
Des 49 chantillons du panel SFTS94, 38, 41 et 40 respectivement ont t
positifs avec INNO-LIA HCV Score -procdure d'incubation 2 heures-, procdure d'incubation 16 heures- et INNO-LIA HCV Ab III Update. 31 de
ces chantillons ont t trouvs positifs avec CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA.
INNOGENETICS
32
Echantillons HCV positifs

257 chantillons provenant de patients atteints d'hpatite C trouvs positifs
avec deux tests de dpistage et avec INNO-LIA HCV Ab III Update ont t
analyss en interne en utilisant INNO-LIA HCV Score sur Auto-LIA programme d'incubation des chantillons sur 2 heures-. Tous les chantillons
ont t classs positifs l'exception d'un seul, class indtermin, rsultant en
une sensibilit, si l'on inclut l'unique rsultat indtermin, de 100% (257/257).
Gnotypes diffrents
Le test INNO-LIA HCV Score sur Auto-LIA -programme d'incubation des
chantillons sur 2 heures- a t effectu sur 15 chantillons de gnotype 1a,
15 chantillons de gnotype 1b, 15 chantillons de gnotype 2, 15 chantillons
de gnotype 3a, 15 chantillons de gnotype 4a, 5 chantillons de gnotype 4
non-a et 5 chantillons de gnotype 5. Tous les chantillons ont t correctement
identifis comme positifs rsultant en une sensibilit de 100% (85/85).
Spcificit
Donneurs de sang
400 chantillons de donneurs de sang trouvs HCV ngatifs ont t tests
en interne avec INNO-LIA HCV Score -procdure d'incubation 16 heuresen technique manuelle. A l'issue du test initial, 377 chantillons ont t
rendus ngatifs, 22 indtermins et 1 positif, rsultant en une spcificit
initiale de 94,3% (377/400).
A l'issue du test de rptabilit en duplicate, l'chantillon trouv initialement
positif a t finalement retrouv ngatif rsultant en une spcificit aprs
rptabilit de 94,5% (378/400).
Echantillons cliniques
205 chantillons cliniques ont t tests en interne avec INNO-LIA HCV
Score -procdure d'incubation 16 heuresen technique manuelle. 195 ont t
trouvs ngatifs, 11 indtermins et 5 positifs. 3 de ces 5 chantillons ont t
retrouvs ngatifs lors du test de rptabilit en duplicate. Parmi les 2 autres
chantillons, 1 a t retrouv positif lors du test de rptabilit en duplicate
avec INNO-LIA HCV Score et aprs test avec INNO-LIA HCV Ab III
Update tandis que l'autre a t retrouv indtermin avec ces 2 tests.
Chacun de ces 2 chantillons taient ngatifs avec Ortho HCV 3.0 ELISA with
Enhanced SAVe et INNOTEST HCV Ab IV. Un de ces chantillons a t
test avec CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA et trouv ngatif. Pour cette srie
d'chantillons, on a obtenu une spcificit initiale de 92,2% (189/205) et une
spcificit aprs rptabilit de 93,7% (192/205).
33
INNO-LIA HCV Score
Ractions croises potentielles

137 chantillons pouvant prsenter des ractivits croises ont t tests
en interne avec INNO-LIA HCV Score -procdure d'incubation 16 heuresen technique manuelle. 127 chantillons ont t trouvs ngatifs,
9 indtermins et 1 positif. Aprs test de rptabilit en duplicate cet
chantillon a t retrouv positif d'une part et indtermin d'autre part,
tandis qu'il tait trouv positif avec INNO-LIA HCV Ab III Update.
Cet chantillon a t trouv ngatif avec Ortho HCV 3.0 ELISA with
Enhanced SAVe, INNOTEST HCV Ab IV et CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA.
Pour cette srie d'chantillons, on a obtenu une spcificit de 92,7% (127/137).
Reproductibilit
2 exprimentateurs ont test un panel de 13 chantillons HCV positif ainsi qu'un
Contrle Ngatif et un Contrle Positif avec 3 lots diffrents de INNO-LIA HCV
Score, sur Auto-LIA-programme d'incubation des chantillons sur 2 heures-.
Un troisime exprimentateur a test ce panel sur un seul des lots.
Les diffrents lots de bandelette tests et interprts par diffrents manipulateurs
ont conduit aux mmes rsultats.
Deutsch
Beabsichtigter Verwendungszweck
INNO-LIA HCV Score ist ein Line-Immunblot-Assay (LIA) zur Besttigung
der Prsenz von Antikrpern gegen das humane Hepatitis-C-Virus in
humanem Serum oder Plasma. Der Test dient als Besttigungstest fr
Proben, die mit einem anti-HCV-Screeningtest als positiv befundet wurden.
Funktionsweise des Tests
INNO-LIA HCV Score ist ein Line-Immunoassay der dritten Generation.
Er verwendet HCV-Antigene aus der Core-Region, der hypervariablen Region E2
(HVR), der Helicase-Region NS3 und den Regionen NS4A, NS4B, und NS5A.
Die Antigene sind als 6 diskrete Banden auf einen Nylonstreifen mit
Kunststoffverstrkung aufgetragen. Zustzlich befinden sich auf jedem
Streifen 4 Kontrollbanden: eine Streptavidin-Kontrolle, eine Bande mit starker
3+-Positivkontrolle (anti-humanes Ig), eine Bande mit 1+-Positivkontrolle
(humanes IgG) und eine -Cutoff-Bande (humanes IgG).
Die Nachweistechnik des INNO-LIA HCV Score beruht auf dem Prinzip
eines Enzymimmunoassays. Die Probe wird zusammen mit dem LIATeststreifen in einer Wanne inkubiert. Wenn in der Probe HCV-Antikrper
vorhanden sind, binden diese an die HCV-Antigen-Banden auf dem
Teststreifen. Anschlieend wird ein affinittsgereinigtes Konjugat aus mit
alkalischer Phosphatase markiertem Ziege-anti-Human IgG (H+L)
zugegeben, das mit diesen spezifischen HCV Antigen-Antikrper-Komplexen
INNOGENETICS
34
reagiert, der sich gegebenenfalls zuvor gebildet hat. Bei Inkubation mit dem
Enzymsubstrat bildet sich eine kastanienbraune Farbe, deren Intensitt in jeder
Bande der HCV-spezifischen Antikrpermenge in der Probe proportional ist
(Abb. 1). Die Farbentwicklung wird durch Zugabe von Schwefelsure gestoppt.
Reagenzien
Beschreibung, Vorbereitung, Lagerung und Haltbarkeit
-
Bei einer Lagerung zwischen 2 - 8C sind alle Testreagenzien, ob nun

geffnet oder ungeffnet, bis zum auf der Verpackung angegebenen
Verfallsdatum haltbar. Die Reagenzien drfen nicht eingefroren oder
nach dem angegebenen Verfallsdatum verwendet werden.
Alle Reagenzien und der Beutel mit den Teststreifen mssen auf
Raumtemperatur (18 - 25C) gebracht werden, das heit, sie mssen
ca. 30 Min. vor Gebrauch aus dem Khlschrank entnommen werden
und anschlieend sofort wieder gekhlt (2 - 8C) werden.
Jede Vernderung des Aussehens von Kitbestandteilen kann bedeuten,
dass die entsprechende Komponente sich zersetzt hat und nicht weiter
verwendet werden kann.
Die Teststreifen mssen zusammen mit dem Trockenmittel in den
Originalgefen bleiben; fr die Lagerung mssen diese Gefe wieder
verschlossen werden. Unter diesen Bedingungen sind die Streifen bei
2 - 8C 16 Wochen haltbar.
Jede Packung enthlt:

Kitbestandteil
Menge
Ref.
Teststreifen
20
57329 20 mit INNO-LIA HCV Antigen Antigen

beschichtete Teststreifen.
Beschreibung
Probenverdnner
30 ml
57304
Farbkodierter (grn) Phosphatpuffer mit

Natriumchlorid, Detergens, Rinderprotein
als Stabilisator und 0,3% Chloracetamid
(CAA) als Konservierungsmittel.
Gebrauchsfertiges Konjugat 45 ml
57301 Farbkodiertes (rot), mit alkalischer

Phosphatase markiertes Ziege-antiHuman IgG in Trispuffer mit
Rinderprotein als Stabilisator, Detergens
und 0,01% Methylisothiazolon (MIT)/
0,1% Chloracetamid (CAA) als
Konservierungsmittel.
Negativkontrolle
57307
0.12 ml
Grundmatrix humanem Ursprungs mit

0,01% Methylisothiazolon (MIT)/
35
INNO-LIA HCV Score
Positivkontrolle
0.12 ml
57308 Inaktiviertes Humanserum mit

Antikrpern gegen HCV und 0,01%
MIT/0,1% Chloracetamid (CAA) als
Gebrauchsfertiges
BCIP/NBT-Substrat
45 ml
57302
Stopplsung
45 ml
57303 0,1 mol/l Schwefelsure.
Waschlsung
45 ml
57299
Farbkodierter (blau) Trispuffer mit

Natriumchlorid, Detergens und 0,02%
Bromnitrodioxan als Konservierungsmittel,
vor Verwendung 1% mit destilliertem
Wasser verdnnen. Die verdnnte
Waschlsung ist bei 2 - 8C 2 Wochen
stabil.
Inkubationswannen
Mit je 11 Teststreifen.
Klebefolien
Protokollbogen
Zur Aufbewahrung der entwickelten

Teststreifen.
Interpretationsvorlage
Zur Identifikation reaktiver

Antigenbanden.
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat/
Nitroblau-Tetrazolium in Dimethylformamid,
mit 0,01% Methylisothiazolon (MIT)/
Zustzlich bentigte Materialien

-
Destilliertes oder deionisiertes Wasser.

Przisionspipetten (mit Einmalspitzen) fr 10 l, 20 - 200 l und
200 - 1000 l.
Orbitalschttler oder Wippschttler (siehe Hinweise zur Inkubation).
Vortex-Mischer oder hnliches.
Graduierte Messzylinder (10 ml, 25 ml, 50 ml und 100 ml).
Laborwecker.
Pinzette zur Manipulation der Teststreifen.
Optional:
Heiluftventilator (Fn) oder Wrmeschrank (37C).
Repetierpipette und Einmalgefe fr Schwefelsure, Konjugat,

Substrat und Waschlsung.
Vakuumpumpensystem mit Abfallflasche, gefllt mit 5%-igem

Natriumhypochlorit.
Sicherheitshinweise und Entsorgung

-
Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenbltter des Herstellers und die

Produktkennzeichnung bezglich gefhrlicher Substanzen.
INNOGENETICS
36
R43, S24-37
Reizend! (Xi) Berhrung mit der Haut vermeiden. Sensibilisierung durch
Hautkontakt mglich. Geeignete Schutzhandschuhe tragen.
Gilt fr 2-Chloracetamid in Probenverdnner, BCIP/NBT Substrat,
Negativkontrolle und Positivkontrolle.
-
Die Proben, Positivkontrollen und Negativkontrollen mssen stets als

potentiell infektis behandelt werden.
Die Positivkontrolle wurde mit negativem Ergebnis auf Antikrper gegen
HCV und HbsAg berprft. Die Negativkontrolle wurde met negativem
Ergebnis auf HbsAg und Antikrper gegen HIV-1, HIV-2 und HCV
berprft. Mit keiner Testmethode kann absolute Sicherheit gewhrleistet
werden, dass aus menschlichem Blut gewonnene Produkte keine
infektisen Keime enthalten.
Der Kit darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personal
angewendet werden. Blut und biologische Materialien mssen in
bereinstimmung mit den entsprechenden Sicherheitsbestimmungen
entsorgt werden.
Mindestens 15 Minuten bei 121C autoklavieren.
Einwegmaterialien verbrennen.
Flssigabfall mit Natriumhypochlorit mischen. sodass die

Endkonzentration von Natriumhypochlorit bei etwa 1% liegt und vor
Entsorgung ber Nacht stehen lassen.
ACHTUNG: Surehaltigen Flssigabfall vor Zugabe von
Natriumhypochlorit neutralisieren.
Bei der Arbeit mit potentiell gefhrlichen oder infektisen Materialien
geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
Bei Beseitigung der Chemikalien sind die entsprechenden Gesetze bzw.
Verordnungen der EG-Mitgliedslnder, der Bundesrepublik Deutschland
und der Bundeslnder sowie hausinterne Vorschriften zu beachten.
Herstellung der Proben

-
HCV Score Test ist fr Proben aus humanem Serum

Der INNO-LIA
oder Plasma in Rhrchen mit Citrat, Heparin oder EDTA als Antikoagulans
geeignet.
Vor der Lagerung mssen die Proben zentrifugiert werden, um unlsliche
Bestandteile abzutrennen.
Proben bei 2 - 8C lagern. Sollen die Proben lnger als eine Woche
gelagert werden, mssen sie in Aliquots bei -20C eingefroren werden.
Keine hitzeinaktivierten Proben verwenden.
Wiederholtes (mehr als dreimaliges) Auftauen und Einfrieren der Proben
ist zu vermeiden.
37
INNO-LIA HCV Score
Hinweise und Vorsichtmanahmen

-
Verwenden Sie den Kit nicht nach berschreitung des Verfallsdatums.

Verwenden Sie keine Reagenzien aus Kits mit unterschiedlichen
Chargennummern.
Halten Sie die angegebenen Proben Volumina und Waschzeiten
genau ein.
Die Proben drfen nicht mikrobiell kontaminiert sein.
Vor der Verwendung mssen Proben und Kontrollen sorgfltig durchmischt
werden.
Streifen nicht auf der Membranseite, sondern nur auf der
kunststoffverstrkten Rckseite berhren. Berhren Sie die Streifen
nicht mit bloen Hnden; verwenden Sie eine saubere Pinzette.
Fr jede Probe eine neue Pipettenspitze verwenden.
Die Teststreifen mssen mit der membranbeschichteten Seite nach
oben in die Inkubationswanne gelegt werden.
Alle Inkubationsschritte mssen auf einem Orbitalschttler oder
Wippschttler durchgefhrt werden. Einen Wippschttler nur fr
Inkubationen ber Nacht verwenden.
Die Schttelamplitude ist ein entscheidender Faktor, um maximale
Empfindlichkeit und gleichmige Frbung zu erzielen. Dazu mssen
die Streifen vollstndig in die Lsungen eintauchen, und die Flssigkeit
muss sich gleichmig ber die Streifen hin- und herbewegen.
Versiegeln Sie die Inkubationswannen bei Inkubationen ber Nacht mit
einer Klebefolie, um Austrocknen zu vermeiden.
Unbenutzte und entwickelte Teststreifen sind hitze- und lichtempfindlich
und mssen deshalb khl und im Dunkeln aufbewahrt werden.
Der Kit darf nur von hinreichend ausgebildetem medizinischem Personal
angewendet werden.
Inkubationswannen und Teststreifen nicht wiederverwenden.
Teststreifen nicht zerschneiden. Eine richtige Interpretation der Ergebnisse
ist nur bei Verwendung vollstndiger Teststreifen mglich.
Arbeitsablauf
Machen Sie sich vor Testbeginn mit dem Kapitel Hinweise und
Vorsichtmanahmen vertraut.
-
Probeninkubation - 16 Stunden
1.
Bereiten Sie eine ausreichende Anzahl an Inkubationswannen vor.

Sie bentigen zustzlich zu den Wannen fr die Proben zwei weitere
Wannen fr Positiv- und Negativkontrolle.
Beschriften Sie die Wannen, und setzen Sie sie in den Halter ein.
Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Probenverdnner.
Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 10 l Probe oder Kontrolle.
2.
3.
INNOGENETICS
4.
5.
6.
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8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
38
Nehmen Sie fr jede Probe und jede Kontrolle je einen Teststreifen aus
dem Behlter. Legen Sie je einen Streifen in eine Inkubationswanne.
Die Teststreifen mssen mit der membranbeschichteten (markierten)
Seite nach oben in die Inkubationswanne gelegt werden. Sie drfen nur
mit einer Pinzette berhrt werden.
DIE STREIFEN MSSEN VOLLSTNDIG IN DIE FLSSIGKEIT
EINTAUCHEN.
Decken Sie die Inkubationswannen mit einem Klebestreifen ab (siehe
Kapitel Hinweise und Vorsichtmanahmen). Stellen Sie den Halter mit den
Inkubationswannen whrend der Inkubation auf einen Orbitalschttler
oder Wippschttler (siehe Kapitel Hinweise zur Inkubation) und schtteln
Sie BER NACHT (16 2 Std.) bei Raumtemperatur (18 - 25C).
HINWEIS:
Entfernen Sie die Klebefolie vorsichtig, um Kreuzkontamination zu

vermeiden.
Waschen Sie jeden Teststreifen dreimal (je 5 Minuten) mit 1 ml
Waschlsung (siehe Kapitel Waschanleitung).
Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Konjugatlsung.
Stellen Sie den Halter mit den Inkubationswannen whrend der
Konjugat-Inkubation auf einen Orbitalschttler oder Wippschttler und
inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 25C).
Waschen Sie jeden Teststreifen dreimal (je 5 Minuten) mit 1 ml
Waschlsung (siehe Kapitel Waschanleitung).
Pipettieren Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Substratlsung.
Stellen Sie den Halter mit den Inkubationswannen whrend der SubstratInkubation auf einen Orbitalschttler oder Wippschttler und inkubieren Sie
30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 25C).
Saugen Sie die Flssigkeit aus den Wannen ab. Pipettieren Sie in jede
Inkubationswanne 1 ml Stopplsung.
Stellen Sie den Halter mit den Inkubationswannen whrend der Inkubation
mit Stopplsung auf einen Orbitalschttler oder Wippschttler und
inkubieren Sie 10 - 30 Minuten bei Raumtemperatur (18 - 25C).
Saugen Sie die Stopplsung ab.
Nehmen Sie die Streifen mit einer Pinzette aus der Inkubationswanne
heraus, und legen Sie sie mit einer Pinzette mit der Membranseite nach
oben auf Fliepapier. Interpretieren Sie die Ergebnisse erst dann, wenn
die Streifen vollstndig getrocknet sind. Zum schnelleren Trocknen
knnen die Streifen 30 Minuten in einem Trockenschrank bei 37C oder
mit einem Fhn getrocknet werden. Bewahren Sie die entwickelten
Streifen im Dunkeln auf.
39
-
INNO-LIA HCV Score

Probeninkubation - 2 bzw. 3 Stunden
Es ist auch mglich, die Probeninkubation mit leichten nderungen in 2 oder

3 Stunden durchzufhren. Grundstzlich verluft die 2- bzw. 3-stndige
Probeninkubation genauso wie die 16-stndige Probeninkubation.
In folgenden Schritten mssen nderungen vorgenommen werden:
3 - Probenvolumen (auch Kontrollen): 20 l (statt 10 l).
5 - Inkubationszeit: 2 bzw. 3 Stunden (statt 16 Stunden).
6 - Waschen: dreimal je 10 Minuten [2 Stunden] bzw. 6 Minuten [3 Stunden]
(statt 5 Minuten).
9 - Waschen: dreimal je 3 Minuten (statt 5 Minuten).
Insgesamt werden bei den Inkubationen folgende Inkubationszeiten und
Volumina verwendet (Unterschiede sind fett gedruckt):
Probenverdnner
Proben
Kontrollen
Inkubationszeit
der Teststreifen
Waschen
Konjugat
Waschen
Substrat
Stopplsung
16 Stunden
Inkubationszeit
2 Stunden
Inkubationszeit
3 Stunden
Inkubationszeit
1 ml
10 l
10 l
16 2 Stunden
1 ml
20 l
20 l
2 Stunden
1 ml
20 l
20 l
3 Stunden
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml/3 x 10 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml/3 x 6 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
Waschen
-
Entfernen Sie nach der Inkubation die Klebefolie.

Saugen Sie die Flssigkeit in den Wannen mit einer Pipette ab, die
mglichst mit einer Vakuumpumpe verbunden ist. In der Abfallflasche
sollte sich 5%-ige Natriumhypochloritlsung befinden.
Halten Sie die Wanne schrg, sodass alle Flssigkeit auf eine Seite
fliet (und zwar zu der Seite, auf der sich die unbeschichtete
Kunststoffverstrkung der Streifen befindet).
Geben Sie in jede Inkubationswanne 1 ml Waschlsung, und schtteln
Sie die Wannen 1 Minute auf einem Orbitalschttler oder Wippschttler.
Wiederholen Sie diesen Schritt so oft, wie es in der Testvorschrift
angegeben ist.
HINWEIS:
Achten Sie darauf, dass die Streifen zwischen den einzelnen

Waschschritten nicht austrocknen.
Achten Sie darauf, dass Sie beim Absaugen der Flssigkeit nicht
die Oberflche der Streifen beschdigen.
Achten Sie darauf, dass der Streifen vollstndig in die Waschlsung

eintaucht. Nur so wird der Streifen optimal gewaschen.
INNOGENETICS
40
Stellen Sie ntigenfalls die Geschwindigkeit des Schttlers nach.
Inkubation
-
Alle Inkubationsschritte (Proben-, Konjugat-, Substrat- und

Schwefelsureinkubation) mssen auf einem Schttler durchgefhrt
werden. Fr die 16-Stunden-Inkubation muss ein Wippschttler
verwendet werden.
Whrend der Inkubations- und Waschschritte mssen die Teststreifen
vollstndig benetzt sein. Die Membranseite muss nach oben weisen.
Der Schttler muss eine Hin- und Herbewegung der Streifen in den
Testwannen ermglichen. Dabei muss sich die Flssigkeit ber die
Teststreifen hinweg bewegen, ohne aus den Wannen zu spritzen.
Die Geschwindigkeit des Schttlers ist entscheidend fr eine maximale
Sensitivitt und eine gleichmige Farbreaktion.
Empfohlene Einstellungen
Orbitalschttler:
Schwingungsdurchmesser: mindestens 13 mm
Empfohlene Geschwindigkeit: 160 Umin-1 bei einem

Schwingungsdurchmesser von 13 mm
Empfohlene Geschwindigkeit: 90 Umin-1 bei einem Schwingungsdurchmesser

von 24 mm.
Wippschttler:
Die Auslenkung des Wippschttlers sollte nicht mehr als 80 mm betragen, um

ein Verschtten der Flssigkeit zu vermeiden
Empfohlene Schttelgeschwindigkeit: 34 Umin-1.
Automatischer Arbeitsablauf: Auto-LIA

Die Testprozedur des INNO-LIA Tests ist hervorragend fr eine
Automatisierung geeignet. Daher wurde ein automatisches Analysengert,
das Auto-LIA, entwickelt, das in der Lage ist, die Arbeitschritte Aspirieren,
Pipettieren und Inkubation vollstndig zu automatisieren.
Das Auto-LIA kann ohne berwachung arbeiten.
Wenn Sie weitere Informationen ber das Auto-LiPA wnschen, setzen Sie
sich bitte mit der deutschen Niederlassung von Innogenetics in Verbindung.
Machen Sie sich vor Testbeginn mit dem Kapitel Hinweise und
Vorsichtmanahmen vertraut.
Ausfhrliche Auto-LIA Verfahren
Auto-LIA - 16 Stunden Inkubation
1.
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5.
6.

PAUSE
41
INNO-LIA HCV Score

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ASP
ASP
ASP
ASP
END

1.
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27.

PAUSE
ASP
ASP
ASP
ASP
END
42
INNOGENETICS
CH1
CH2
CH4
CH5
CH6
=
=
=
=
=
Probenverdnner
Waschlsung
Konjugat
Stopplsung
Substrat
Wird die Probeninkubation 3 Stunden durchgefhrt. mssen im Vergleich zur

2-Stunden-Inkubation in den folgenden Schritten nderungen vorgenommen
werden:
4Inkubationszeit: 3 Stunden (statt 2 Stunden).
6 + 8 + 10Waschen: dreimal je 6 Minuten.
Ergebnisse
Ablesen der Ergebnisse
Die Antigene und Kontrollen sind in folgender Reihenfolge auf den Streifen
aufgetragen: siehe Abbildung 1 Seite 16.
Die Farbintensitt der Kontrolllinien auf jedem Streifen wird mit den reaktiven
Banden verglichen. Dabei wird die Strke der Banden wie folgt beurteilt:
Reaktionsintensitt der Antigenbande (R)
Geringer als
R<
Genau
R=
Strker als , aber geringer als bzw. gleich 1+ < R = 1+
Strker als 1+, aber geringer als 3+
1+ < R < 3+
Genau 3+
R = 3+
Strker als 3+
R > 3+
Bewertung
1+
2+
3+
4+
Die Reaktivitt muss fr alle Teststreifen getrennt bewertet werden.

Zur Erleichterung der Interpretation ist dem Testkit eine Interpretationshilfe
beigefgt.
Zur einfacheren Identifikation der einzelnen Banden knnen die Teststreifen
an die 3+-Kontrollbande der Interpretationshilfe angelegt werden.
Validierung
Bevor der Test abgelesen wird, mssen die Validitt der positiven und negativen
Kontrollstreifen und die Reaktionen der Kontrollen auf den einzelnen Teststreifen
beurteilt werden.
Validierung des Test-Laufs:
1. Auf dem Positivkontrollstreifen mssen die Antigenbanden C1, C2, NS3
und NS4 mindestens eine Farbstrke von 1+ haben. Die Antigenbanden
E2 und NS5 knnen negativ sein.
43
2.
INNO-LIA HCV Score

Auf dem Negativkontrollstreifen drfen die Antigenbandennegativ sein,
d.h. keine Farbreaktion zeigen, die strker oder genau so stark wie die
der -Kontrolle ist.
Validierung eines einzelnen Streifens:

1. Die Kontrollen 1+, und die stark positive Kontrolle 3+ mssen sichtbar sein.
2. Die Intensitt der Kontrolle 3+ muss grer als die der Kontrolle 1+ sein,
und die Intensitt der Kontrolle 1+ muss grer als die der Kontrolle sein.
3. Die anti-Streptavidin-Bande muss negativ sein.
HINWEIS:
Die Teststreifen mssen vor der Interpretation vollstndig trocken

sein, um Fehlinterpretationen zu vermeiden, weil nach der Zugabe
von Stopplsung schwache Banden auftreten knnen.
Legen Sie kein Papier auf die Membranoberflche, solange sie

nicht vollstndig getrocknet ist.
Bei Proben mit IgG-Konzentrationen oberhalb des normalen

Bereichs knnen die Kontrollbanden schwach gefrbt sein.
Interpretation der Ergebnisse
Aufgrund umfangreicher Untersuchungen wurde die Interpretation der
Ergebnisse wie folgt festgelegt:
Eine Probe wird als NEGATIV fr HCV-Antikrper beurteilt:
wenn alle HCV-Antigenbanden negativ zu bewerten sind
wenn nur eine einzige HCV-Antigenbande eine Reaktivitt von aufweist,
es sei denn, dass es sich um die NS3-Bande handelt.
Eine Probe wird als POSITIV fr HCV-Antikrper beurteilt:
wenn mindestens zwei HCV-Antigenbanden eine Reaktivitt von
mindestens aufweisen.
Eine Probe wird als FRAGLICH beurteilt:
wenn eine HCV-Antigenbande eine Reaktivitt von 1+ oder grer aufweist.
wenn die NS3-Bande eine Reaktivitt von oder grer hat, whrend
alle anderen Antigenbanden ein negatives Ergebnis aufweisen.
Interpretationssoftware: LiRAS fr Infektionskrankheiten
Das LiRAS-Softwarepaket fr Infektionskrankheiten ist zur Untersttzung
der Interpretation der LIA-Ergebnisse bestimmt.
Um die jeweils aktuellste Version zu bestellen, setzen Sie sich bitte mit der
deutschen Niederlassung von Innogenetics in Verbindung.
INNOGENETICS
44
ACHTUNG:
Verwenden Sie nicht die automatisierte Interpretation ohne die unten
beschriebene Limitierung des Verfahrens zu beachten.
Einschrnkungen des Verfahrens
-
Um ein optimales Testergebnis zu erzielen, muss das beschriebene

Testprotokoll genau eingehalten werden.
Proben, bei denen lediglich die NS3-Bande eine Reaktivitt von oder
grer aufweist, knnen unter Umstnden eine HCV-Serokonversion
aufweisen. Sie sind daher als fraglich zu interpretieren.
Wenn das Testergebnis FRAGLICH ausfiel, wird eine erneute Testung
einer Probe des Patienten nach einigen Wochen empfohlen.
Eine Probe, bei der die Streptavidin-Kontrolllinie eine positive Reaktion
anzeigt, kann Kreuzreaktionen mit anderen HCV-Antigen-Banden
verursachen und kann daher nicht als HCV-positiv gewertet werden.
In frhen Phasen der Infektion sind Anti-HCV Antikrper mglicherweise
nicht nachweisbar.
Bei Hmodialysepatienten sind Anti-HCV Antikrper mglicherweise
nicht nachweisbar
Die Verwendung verdnnter Proben kann zu falschen Ergebnissen fhren.
Vor Einleitung einer Behandlung oder invasiver Manahmen sollten
Parameter zur Bewertung von Leberschden und das Vorhandensein
von HCV-RNA bestimmt werden.
Leistungsfhigkeit des Tests

Sensitivitt
Serokonversions- und Niedrigtiter-Panels
Intern mit dem Test INNO-LIA HCV Score gewonnene Ergebnisse mit AutoLIA, 2 Stunden Inkubationszeit, und dem manuellen Verfahren, 16 Stunden
Inkubationszeit, an 13 BBI-Serokonversions-Panels (PHV 904 - 916), 2 BBINiedrigtiter-Panels (PHV103 und 204) und dem SFTS94 Panel wurden mit
CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA und INNO-LIA HCV Ab III verglichen.
Mit der 2-Stunden- und der 16-Stunden-Methode wies INNO-LIA HCV
Score bei 7 Panels Antikrper frher als CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA
nach, whrend der Nachweis bei 4 Panels zur selben Zeit positiv wurde.
CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA wies bei einem Panel die die Antikrper
frher als INNO-LIA HCV Score, 2 Stunden und 16 Stunden, nach.
Bei einem Panel gelang mit keinem der beiden Tests ein Nachweis.
45
INNO-LIA HCV Score
Mit der 2-Stunden-Methode wies INNO-LIA HCV Score bei 2 Panels Antikrper
frher als INNO-LIA HCV Ab III update nach, whrend der Nachweis bei 10
Panels zur gleichen Zeit positiv wurde. Mit der 16-Stunden-Methode gelang der
Nachweis mit INNO-LIA HCV Score bei 4 Panels frher. Bei 7 Panels wurden
die Proben zur selben Zeit positiv, und bei einem Panel spter.
Die zwei 2 BBI-Niedrigtiter-Panels enthalten 40 Proben, von denen jeweils 28
bzw. 32 Proben mit INNO-LIA HCV Score, 2-Stunden- bzw.16-StundenMethode, als positiv befundet wurden. 35 dieser Proben wurden mit
CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA als positiv bestimmt, 34 wurden mit INNOLIA HCV Ab III update als positiv bestimmt. Alle Proben, die mit CHIRON
RIBA HCV 3.0 SIA oder INNO-LIA HCV HCV Ab III update als positiv
befundet wurden, waren mit INNO-LIA HCV Score positiv oder fraglich.
Von den 49 Proben des SFTS94-Panels waren 38 (INNO-LIA HCV Score,
2-Stunden-Inkubation), 41 (INNO-LIA HCV Score, 16-Stunden-Inkubation)
und 40 Proben (INNO-LIA HCV Ab III update) positiv. 31 dieser Proben
wurden mit CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA als positiv befundet.
HCV-positive Proben
Insgesamt wurden intern 257 Proben von HCV-infizierten Patienten, die
zuvor mit 2 Screening-Assays und INNO-LIA HCV Ab III update als positiv
befundet wurden, mit INNO-LIA HCV Score (Auto-LIA 2-StundenInkubation) untersucht. Bis auf eine fragliche Probe wurde alle Proben als
positiv befundet. Daraus ergibt sich bei Einschluss der fraglichen Probe eine
Sensitivitt von 100% (257/257).
Unterschiedliche Genotypen
Intern wurden folgende Genotypen mit INNO-LIA HCV Score (Auto-LIA
2-Stunden-Inkubation) untersucht: 1a (15 Proben), 1b (15 Proben), 2 (15
Proben), 3a (15 Proben), 4a (15 Proben), 4 non-a (5 Proben), 5 (5 Proben).
Bei allen Proben fiel das Ergebnis positiv aus. Daraus ergibt sich eine
Sensitivitt von 100% (85/85).
Spezifitt
Blutspender
400 als negativ bewertete Blutspenderproben wurden intern analysiert (manuell,
16-Stunden-Inkubation). Beim Ersttest waren 377 Proben negativ, 22 fraglich
und eine positiv. Daraus ergibt sich eine Spezifitt von 94,3% (377/400).
Bei einem Wiederholungstest (Doppelbestimmung) wurde die zuerst als positiv
ermittelte Probe negativ befundet; die Spezifitt lag nun bei 94,5% (378/400).
INNOGENETICS
46
Klinische Proben
205 klinische Proben wurden intern getestet (manuell, 16-Stunden-Inkubation),
davon 189 mit negativem, 11 mit fraglichem und 5 mit positivem Ergebnis.
3 der 5 positiven Proben wurden bei Neutestung als Doppelbestimmungen als
negativ befundet. Eine der zwei positiven Proben zeigte bei der
Wiederholungsbestimmung und auch bei INNO-LIA HCV Ab III update ein
positives Ergebnis. die andere Probe wurde mit beiden Tests als fraglich
befundet. Bei Ortho HCV 3.0 ELISA mit Enhanced SAVe und INNOTEST
HCV Ab IV war das Ergebnis negativ. Eine der beiden Proben wurde auch mit
CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA getestet, ebenfalls mit negativem Ergebnis.
Die aus dieser Probenreihe ermittelte Spezifitt liegt bei Ersttestung bei
92,2% (189/205) und im Wiederholungstest bei 93,7% (192/205).
Proben mit potentiell zu erwartenden Wechselwirkungen
137 Proben mit potentiell zu erwartenden Wechselwirkungen wurden intern
getestet (manuell, 16-Stunden-Inkubation): 127 Proben waren negativ, 9 fraglich,
1 Probe war positiv. Bei Neutestung als Doppelbestimmung wurde einmal ein
positives und einmal ein fragliches Ergebnis erhalten. Mit INNO-LIA HCV Ab III
Update wurde mit dieser Probe ein positives Ergebnis erhalten. Bei Testung mit
Ortho HCV 3.0 ELISA mit Enhanced SAVe, INNOTEST HCV Ab IV und
CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA war die Probe negativ.
Die aus dieser Probenreihe ermittelte Spezifitt liegt bei 92,7% (127/137).
Reproduzierbarkeit
Zwei Laboranten untersuchten ein Panel mit 13 HCV-positiven Proben
sowie drei verschiedene Chargen der Positiv- und Negativkontrolle mit AutoLIA, 2-Stunden Inkubation. Ein dritter Laborant testete das Panel mit einer
der Chargen. Trotz unterschiedlicher Chargen erhielten alle drei Laboranten
identische Ergebnisse.
Italiano
Uso previsto
INNO-LIA HCV Score un test immunoblot su striscia (Line Immuno Assay),
per la determinazione di anticorpi diretti contro il virus dell'epatite C umana in
siero o plasma umani. Il suo uso previsto come test supplementare su
campioni di siero o plasma umani trovati reattivi utilizzando una procedura di
screening per anti-HCV.
Principio del test
INNO-LIA HCV Score un immunoblot su striscia di 3 generazione che
incorpora antigeni HCV derivati dalla regione del core, dalla regione
ipervariabile E2 (HVR), dalla regione elicasi, dalle regioni NS3, NS4A,
NS4B, e NS5A.
47
INNO-LIA HCV Score
Gli antigeni sono stati immobilizzati in sei bande su strisce di nylon adese
ad un supporto plastico. In aggiunta sono fissate su ogni striscia quattro
bande di controllo: la banda di controllo della streptavidina, un controllo
positivo 3+ (anti-Ig umane), un controllo positivo 1+ (IgG umane), e una
banda cut-off (IgG umane).
INNO-LIA HCV Score basato sul principio di un test immunoenzimatico.
Un campione diluito incubato in una vaschetta insieme ad una striscia LIA.
Se presenti nel campione, gli anticorpi HCV si legheranno alle bande
antigeniche HCV presenti sulla striscia. Successivamente viene aggiunto un
coniugato, purificato per affinit, di fosfatasi alcalina legata ad anti IgG
umane di capra (H+L) che reagisce con i complessi specifici HCV antigene/
anticorpo, se precedentemente formati. L'incubazione con l'enzima substrato
produce un colore marrone, la cui intensit proporzionale alla quantit di
anticorpi HCV-specifici catturati dal campione su ogni banda specifica (Fig. 1).
Lo sviluppo del colore viene bloccato con acido solforico.
Reagenti
Descrizione, preparazione per l'uso e condizioni di conservazione
raccomandate
-
Se lasciati a 2 - 8C, tutti i reagenti, aperti o non aperti, sono stabili fino
alla data di scadenza. Non congelare i reagenti.
Tutti i reagenti e il tubo di plastica contenente le strisce devono essere
portati a temperatura ambiente (18 - 25C) approssimativamente
30 minuti prima dell'uso e riposti nel frigorifero (2 - 8C) immediatamente
dopo l'uso.
Alterazioni nell'aspetto fisico dei reagenti del kit possono indicare
instabilit o deterioramento.
Dopo l'apertura del tubo originale contenente le strisce, ogni striscia
inutilizzata sar stabile per 16 settimane se conservata a 2 - 8C nel
tubo originale chiuso con essiccante.
Reagenti forniti:
Componenti
Quantit
Rif.
Strisce
20
57329 Contenente 20 strisce INNO-LIA HCV

sensibilizzate.
Descrizione
30 ml
57304 Tampone fosfato colorato (verde)

contenente cloruro di sodio, detergenti,
proteine bovine stabilizzatrici e 0.3% di
cloroacetammide (CAA) come
conservante.
48
INNOGENETICS
45 ml
57301 Reattivo colorato (rosso) contenente

anti IgG umane di capra legate con
fosfatasi alcalina in tampone Tris,
proteine bovine stabilizzatrici, detergenti
e 0.01% di metilisotiazolone (MIT)/
0.1% CAA come conservante.
Controllo negativo
0.12 ml
57307 Contenente matrice di base di origine

umana con 0.01% MIT/0.1% CAA come
conservante.
Controllo positivo
0.12 ml
57308
Substrato BCIP/NBT
pronto all'uso
45 ml
57302 Contenente 5-bromo-4-cloro-3-indolil

fosfato/nitroblu di tetrazolio in dimetil
formammide, con 0.01% MIT/0.1% CAA
come conservante.
Contenente siero umano inattivato positivo

per anticorpi diretti contro HCV, con 0.01%
MIT/0.1% CAA come conservante.
Soluzione di stop
45 ml
57303 Contenente 0.1 mol/l di acido solforico.
Soluzione di lavaggio
45 ml
57299 Tampone Tris colorato (blu) contenente

cloruro di sodio, detergente e 0.02%
bromo-nitro-diossano come conservante,
da diluire 5x in acqua distillata.
La soluzione diluita stabile per
2 settimane se conservata a 2 - 8C.
Vassoio di incubazione
Pellicole adesive
Foglio di report dei dati
Per la conservazione delle strisce

sviluppate.
Carta di lettura
Per l'identificazione delle bande

antigeniche reattive.
Contenente 11 vaschette ciascuno.
Materiali richiesti ma non forniti

-
Acqua distillata o deionizzata.

Pipette di precisione (con puntali monouso) capaci di dispensare 10 l,
20 - 200 l, e 200 - 1000 l, rispettivamente.
Agitatore orbitale o basculante (vedi Indicazioni per l'incubazione).
Vortex o equivalente.
Cilindri graduati: 10, 25, 50 e 100 ml.
Pinzette per la manipolazione delle strisce.
Timer.
Opzionale:
riscaldatore ad aria (asciugacapelli) o incubatore a secco a 37C
pipetta a ripetizione e provette monouso per l'aggiunta di acido

solforico, coniugato, substrato e soluzione di lavaggio
aspiratore a vuoto che contenga ipoclorito di sodio al 5% nella

bottiglia di scarico.
49
INNO-LIA HCV Score
Sicurezza e ambiente
-
Si prega di fare riferimento alla scheda di sicurezza e alle etichette

sul prodotto per informazioni relative a composti potenzialmente
pericolosi.
R43, S24-37
Irritante! (Xi) Evitare il contatto con la pelle. Pu causare sensibilizzazione
per contatto con la pelle. Indossare guanti monouso.
Contiene 2-Cloroacetammide: Diluente del campione, Coniugato pronto
all'uso, Substrato pronto all'uso BCIP/NBT e Controllo negativo.
-
Campioni, Controllo positivo e Controllo negativo devono sempre

essere maneggiati come potenzialmente infetti.
Il Controllo positivo stato trovato negativo per anti-HCV e HbsAg.
Il Controlle negativo stato trovato negativo per anti-HIV-1/HIV-2,
anti-HCV e HbsAg. Nessun metodo di indagine pu offrire la completa
sicurezza che i prodotti derivati dal sangue non trasmettano agenti
infettanti.
Per questo motivo tutti i componenti del sangue e i materiali biologici
devono essere considerati come potenzialmente infetti e maneggiati
come tali. La procedura deve essere eseguita solo da personale
adeguatamente addestrato. Tutti i componenti del sangue e i materiali
biologici devono essere smaltiti in accordo con le procedure di
sicurezza standardizzate.
Autoclavare per almeno 15 minuti a 121C.
Incenerire il materiale monouso.
Miscelare i liquidi di scarico con ipoclorito di sodio in modo che la

concentrazione finale di sodio ipoclorito sia di 1%. Lasciare riposare
tutta la notte prima di smaltire. ATTENZIONE: Neutralizzare il liquido di
scarico che contiene acido prima di aggiungere ipoclorito di sodio.
E' necessario l'uso di dispositivi di protezione personale: guanti e
occhiali di sicurezza quando si manipolano agenti infetti o pericolosi.
I rifiuti devono essere smaltiti in accordo con le linee guida disposte
dalle istituzioni. Si osservino inoltre le leggi ambientali statali e locali.
Non scaricare la Soluzione di stop in flaconi che contengano ipoclorito
di sodio.
Campioni (raccolta e trattamento)

-
HCV Score pu essere eseguito su siero umano o plasma

INNO-LIA
conservato in provette contenenti citrato, eparina o EDTA come
anticoagulanti.
INNOGENETICS
-
50
Prima della conservazione il siero o il plasma devono essere separati

dai coaguli o dalle cellule del sangue mediante centrifugazione.
Conservare i campioni a 2 - 8C. Per conservazioni pi lunghe di una
settimana, congelare a -20C o temperature inferiori.
Non usare campioni trattati al calore.
Il congelamento e scongelamento ripetuto dei campioni (pi di 3 volte)
pu produrre risultati errati.
Note e precauzioni
-
Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza.

Non miscelare i reagenti con diversi numeri di lotto.
Assicurarsi che vengano usati volumi corretti di campione e
numeri corretti di lavaggio necessari per la procedura del test.
Evitare la contaminazione microbica dei reagenti.
Assicurarsi che i campioni e i controlli siano omogenei prima dell'utilizzo.
Non toccare la membrana della striscia. Manipolare sempre le strisce
tramite il supporto plastico.
Usare un nuovo puntale per ogni campione.
Assicurarsi che le strisce siano posizionate nelle vaschette con il lato
della membrana rivolto verso l'alto.
Tutti i passaggi di incubazione devono essere eseguiti utilizzando un
agitatore orbitale o basculante (utilizzare l'agitatore basculante solo per
l'incubazione overnight).
Ai fini del raggiungimento della colorazione delle bande e della massima
sensibilit importante il movimento delle soluzioni al di sopra delle
strisce. Durante l'agitazione la superficie della striscia deve essere
completamente immersa.
Coprire i vassoi con una pellicola adesiva per evitare che le strisce si
asciughino durante l'incubazione notturna.
Le strisce inutilizzate e sviluppate devono essere tenute lontano dalla
luce e dal calore.
Il kit deve essere utilizzato solo da personale addestrato alle pratiche di
laboratorio.
Il riutilizzo delle strisce o delle vaschette pu portare a risultati errati.
Tagliare le strisce pu portare a risultati errati.
Procedura del test

Leggere Note e precauzioni prima di eseguire il test.
-
Incubazione del campione per 16 ore
1.
Utilizzare la quantit richiesta di vaschette, tenendo presente che

devono essere aggiunti ad ogni seduta un Controllo positivo e un
Controllo negativo.
Identificare le vaschette come controlli e campioni, e porli nel vassoio.
51
INNO-LIA HCV Score
2.
3.
Aggiungere 1 ml di Diluente del campione ad ogni vaschetta.

Aggiungere 10 l di appropriato campione o controllo alla rispettiva
vaschetta siglata.
Rimuovere la quantit richiesta di strisce LIA dal loro contenitore,
e aggiungere una striscia ad ogni vaschetta del test. La striscia viene
posizionata nella vaschetta, utilizzando delle pinzette, con il lato
membrana rivolto verso l'alto.
LA STRISCIA DEVE ESSERE COMPLETAMENTE IMMERSA.
Coprire le vaschette con una pellicola adesiva (vedi Note e
precauzioni). Incubare i campioni ponendo il vassoio su un agitatore
orbitale o basculante (vedi Indicazioni per l'incubazione) e agitare
OVERNIGHT (16 2 h) a temperatura ambiente (18 - 25C).
NOTA:
Rimuovere con attenzione la pellicola adesiva per evitare crosscontaminazione.

Lavare ogni striscia 3 volte (5 minuti) con 1 ml di Soluzione di lavaggio
(vedi Indicazioni per il lavaggio).
Aggiungere 1 ml di Soluzione coniugato ad ogni vaschetta.
Incubare con il coniugato ponendo il vassoio su un agitatore orbitale o
basculante e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente (18 - 25C).
Lavare ogni striscia 3 volte (5 minuti) con 1 ml di Soluzione di lavaggio
(vedi Indicazioni per il lavaggio).
Aggiungere 1 ml di Soluzione substrato ad ogni vaschetta.
Incubare con il substrato ponendo il vassoio su di un agitatore orbitale o
basculante, e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente (18 - 25C).
Aspirare il liquido. Aggiungere 1 ml di Soluzione di stop ad ogni vaschetta.
Incubare con la soluzione di stop ponendo il vassoio su di un agitatore
orbitale o basculante e agitare per 10 - 30 minuti a temperatura ambiente
(18 - 25C).
Aspirare la Soluzione di stop.
Rimuovere le strisce dalle vaschette e porle, mediante l'aiuto di pinzette,
con la membrana rivolta verso l'alto su di un foglio di carta assorbente.
Appena le strisce si sono completamente asciugate, si possono
interpretare i risultati. Per accelerare il processo di asciugatura, porre le
strisce in un incubatore a secco a 37C per 30 minuti oppure utilizzare un
asciugacapelli per 1 minuto. Le strisce sviluppate manterranno il loro
colore se conservate al buio.
4.
5.
6.
7.
8.
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10.
11.
12.
13.
14.
15.
Incubazione del campione per 2 e 3 ore
Per il protocollo "incubazione del campione per 2 e 3 ore" viene seguita la

stessa procedura di 15 passaggi del protocollo "incubazione del campione per
16 ore", ma va tenuto presente che cambiano i passaggi 3 - 5 - 6 e 9. Il volume
dei campioni e dei controlli aumenta da 10 - 20 l (passaggio 3) e il tempo di
incubazione del campione cambia a 2 o 3 ore (passaggio 5). I lavaggi dopo
l'incubazione del campione cambiano, per la procedura di 2 ore a 3 volte per
52
INNOGENETICS
10 minuti, e per la procedura di 3 ore a 3 volte per 6 minuti (passaggio 6);
infine il secondo lavaggio di 3 volte per 3 minuti per l'incubazione del
campione di 2 e 3 ore.
Tabella con il sommario delle procedure del test e rilevazione delle differenze
(grassetto):
Incubazione del
Incubazione del Incubazione del
campione di 16 ore campione di 2 ore campione di 3 ore
1 ml
Campione
10 l
Controlli
10 l
Strisce LIA
16 ore 2 ore
Lavaggio
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
Lavaggio
1 ml/3 x 5 min
Substrato pronto all'uso
1 ml/30 min
Soluzione di Stop
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
2 ore
1 ml/3 x 10 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
3 ore
1 ml/3 x 6 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
Indicazioni per il lavaggio

-
Dopo incubazione overnight, di 2 ore o di 3 ore, rimuovere con attenzione

la pellicola adesiva.
Aspirare il liquido dalla vaschetta con una pipetta, preferibilmente
collegata ad un aspiratore a vuoto, che contenga nella bottiglia di
scarico una soluzione al 5% di ipoclorito di sodio.
Inclinare il vassoio per permettere a tutto il liquido di portarsi ad un
angolo della vaschetta (dal lato del supporto di plastica della striscia)
Aggiungere 1 ml di soluzione di lavaggio diluita ad ogni vaschetta e
agitare per 1 minuto su di un agitatore orbitale o basculante.
Ripetere questi passaggi tante volte quanto indicato nella procedura del test.
NOTA:
Non lasciare asciugare le strisce durante i passaggi di lavaggio.
Assicurarsi di non danneggiare la superficie delle strisce mentre si

aspira.
Assicurarsi che l'intera striscia sia ben lavata mediante completa

immersione nella soluzione di lavaggio.
Adattare la velocit dell'agitatore quando necessario.
Indicazioni per l'incubazione

-
Tutti i passaggi di incubazione (incubazione del campione, coniugato,

substrato e acido solforico) cos come i passaggi di lavaggio devono
essere eseguiti su un agitatore orbitale o basculante (utilizzare
l'agitatore basculante solo per l'incubazione overnight).
Durante l'incubazione e i passaggi di lavaggio, la superficie della striscia
deve essere completamente immersa, con il lato membrana rivolto verso
l'alto.
53
-
INNO-LIA HCV Score

Gli agitatori orbitali o basculanti devono permettere un movimento reciproco
(avanti e indietro) della striscia nella vaschetta, e il movimento del liquido
sulla striscia senza permettere la fuoriuscita del liquido dalla vaschetta.
La velocit generata dall'agitatore orbitale o basculante critica per il
raggiungimento della colorazione di ogni striscia e per il raggiungimento
della massima sensibilit.
Raccomandazioni per un agitatore orbitale:
Il diametro del movimento circolare deve essere uguale o superiore a 13 mm
La velocit raccomandata per un movimento circolare di 13 mm 160 rpm
La velocit raccomandata per un movimento circolare di 24 mm di 90 rpm.

Raccomandazioni per un agitatore basculante:
La differenza tra il punto pi alto e quello pi basso non deve superare gli 80 mm,
per evitare la fuoriuscita di liquido
La velocit raccomandata di 34 rpm.
Procedura automatica del test: Auto-LIA

La procedura LIA pu facilmente essere automatizzata utilizzando lo strumento
Auto-LIA. Questo strumento un sistema "walk-away" con aspirazione
automatica, dispensazione e incubazione. Per maggiori informazioni e
protocolli specifici su Auto-LIA, si prega di contattare il vostro distributore
locale Innogenetics.
Si prega di leggere il paragrafo Note e precauzioni prima di eseguire il test.
Procedura di Auto-LIA in dettaglio
Incubazione del campione di 16 ore su Auto-LIA
1.
2.
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23.

PAUSE
ASP
ASP
ASP
INNOGENETICS
24.
25.
26.
27.
54

ASP
END

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
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23.
24.
25.
26.
27.

PAUSE
ASP
ASP
ASP
ASP
END
CH1
CH2
CH4
CH5
CH6
=
=
=
=
=

Soluzione di lavaggio
Coniugato
Soluzione di stop
Substrato
Per il protocollo di "incubazione del campione di 3 ore" vengono eseguiti gli

stessi 27 passaggi per la procedura del test "incubazione del campione di
2 ore" eccetto per i cambiamenti dei passaggi 4 - 6 - 8 e 10. Il tempo di
incubazione del campione cambia a 180 minuti per la procedura di 3 ore
(passaggio 4) e il lavaggio dopo 3 ore di incubazione del campione cambia
a 3 volte per 6 minuti (passaggi 6 - 8 - 10).
55
INNO-LIA HCV Score
Risultati
Lettura
L'identit e la localizzazione degli antigeni e dei controlli immobilizzati sulla
striscia sono i seguenti: vedere Figura 1 pagina 16.
L'intensit della reazione sulle bande di controllo di ciascuna striscia viene
utilizzata per assegnare il valore di reattivit per ogni antigene su ogni striscia:
Intensit della reazione della banda antigenica (R)
Minore di
Uguale a
Maggiore di , ma minore o uguale a 1+
Maggiore di 1+ ma minore di 3+
Uguale a 3+
Maggiore di 3+
R<
R=
< R 1+
1+ < R < 3+
R = 3+
R > 3+
Valore
1+
2+
3+
4+
Il valore di reattivit deve essere fatto separatamente per ogni striscia.

Per facilitare l'interpretazione inclusa una carta di lettura.
L'allineamento della striscia sviluppata con la banda di controllo 3+ permette
pi facilmente l'identificazione delle bande.
Validazione
Controllare la validit delle strisce del controllo positivo e negativo e la validit
dei livelli di controllo su ogni striscia prima della lettura dei risultati del test.
Validazione della seduta:
1. La striscia del controllo positivo deve mostrare una reattivit di almeno
1+ sulle bande antigeniche C1, C2, NS3 e NS4. L'antigene E2 e NS5
possono mostrare un valore negativo.
2. La striscia di controllo negativo deve mostrare un valore negativo
(nessuna reazione o al di sotto del livello di controllo per tutte le
bande antigeniche HCV).
Validazione di una singola striscia:
1. I livelli di controllo 1+ e e la forte banda di controllo positiva 3+ devono
essere visibili.
2. L'intensit del valore di controllo 3+ deve essere maggiore di quella della
banda di valore 1+ e l'intensit del valore 1+ deve essere maggiore di
quella del livello .
3. La banda di controllo per anti-streptavidina deve avere valore negativo.
INNOGENETICS
56
NOTE:
La striscia deve essere completamente asciugata per evitare qualsiasi

erronea interpretazione dovuta a deboli bande che appaiono dopo
l'aggiunta della soluzione di stop.
Non porre carta sulla superficie della striscia fintanto che umida.
Deboli bande di controllo possono essere osservate per campioni che

contengono alti livelli di IgG (al di sopra del normale intervallo IgG).
Interpretazione dei risultati
Numerose valutazioni hanno mostrato che i risultati possono essere interpretati
come segue:
Un campione NEGATIVO per anticorpi anti-HCV:
se tutte le bande antigeniche HCV hanno un valore di reattivit negativo
se solo una delle bande antigeniche HCV mostra la reattivit , eccetto
quando la reattivit viene osservata per NS3.
Un campione POSITIVO per anticorpi anti-HCV:
se almeno due bande antigeniche HCV mostrano una reattivit minima
di o maggiore.
Un campione considerato INDETERMINATO per anticorpi anti-HCV:
se una banda antigenica HCV mostra una reattivit di 1+ o maggiore
se la banda NS3 reagisce con un valore o maggiore e tutte le altre
bande antigeniche sono negative.
Software di interpretazione: LiRAS per malattie infettive
Il software LiRAS per malattie infettive predisposto per il supporto
nell'interpretazione dei risultati LIA. Si prega di contattare il vostro distributore
locale per ottenere la versione aggiornata.
ATTENZIONE:
Non utilizzare l'interpretazione automatica senza prendere in considerazione
i limiti della procedura descritte nel paragrafo successivo.
Limiti della procedura
-
Il protocollo fornito deve essere scrupolosamente seguito per ottenere

un'ottima performance del test.
I campioni con una singola reattivit +/- o pi alta sull' NS3 possono
essere indicativi di una sieroconversione per HCV. Essi devono dunque
essere classificati come indeterminati.
Se si ottiene un risultato INDETERMINATO si raccomanda di testare un
ulteriore campione del paziente dopo qualche settimana.
57
-
INNO-LIA HCV Score

Un campione che mostri una reazione positiva sulla banda di controllo
della streptavidina pu causare cross-reazioni con altre bande antigeniche
HCV e non pu essere identificato come positivo per anticorpi anti-HCV.
Anticorpi anti-HCV possono non essere determinabili in infezioni precoci.
Nel caso di emodialisi gli anticorpi possono essere non rilevabili.
L'uso di campioni diluiti pu portare a risultati errati.
I parametri per l'individuazione del danno epatico e la ricerca di positivit
per HCV RNA devono essere successivamente investigati nei soggetti
anti-HCV positivi prima dell'inizio di un trattamento o di procedure invasive.
Performance del test

Sensibilit
Pannelli di sieroconversione/pannelli a basso titolo
I risultati di INNO-LIA HCV Score, utilizzando Auto-LIA con procedura di
incubazione di 2 ore e procedura manuale di incubazione di 16 ore sono
stati ottenuti internamente su 13 pannelli di sieroconversione BBI (da PHV
904 a 916), su 2 pannelli BBI a basso titolo (PHV103 e 204), e sul pannello
SFTS94. Questi risultati sono stati comparati con i risultati di CHIRON
RIBA HCV 3.0 SIA e INNO-LIA HCV Ab III update.
INNO-LIA HCV Score utilizzando procedure di incubazione del campione
di 2 ore e di 16 ore ha individuato positivit in anticipo rispetto a CHIRON
RIBA HCV 3.0 SIA in 7 pannelli, e 4 pannelli sono diventati positivi nello
stesso tempo. CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA ha individuato anticorpi prima
di INNO-LIA HCV Score, utilizzando entrambe le procedure di incubazione
del campione, in un pannello. Un pannello non ha mostrato positivit con
nessuno di questi test.
INNO-LIA HCV Score con procedura di incubazione di 2 ore ha individuato
anticorpi pi precocemente di INNO-LIA HCV Ab III update in 2 pannelli,
e gli altri 10 pannelli sono diventati positivi nello stesso tempo. Utilizzando la
procedura con incubazione di 16 ore, 4 pannelli sono stati rilevati positivi
prima che con INNO-LIA HCV Ab III update, 7 pannelli sono divenuti
positivi nello stesso tempo, e un pannello divenuto positivo pi tardi.
Su 40 campioni appartenenti a 2 pannelli BBI a basso titolo, 28 e 32 campioni
sono risultati positivi con INNO-LIA HCV Score utilizzando rispettivamente
la procedura di 2 e 16 ore di incubazione del campione. Trentacinque di questi
campioni sono risultati positivi con CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA, mentre 34
risultavano positivi utilizzando INNO-LIA HCV Ab III update. Tutti i campioni
positivi con CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA o con INNO-LIA HCV Ab III
update erano positivi o indeterminati utilizzando INNO-LIA HCV Score.
INNOGENETICS
58
Su 49 campioni appartenenti al pannello SFTS94, 38, 41, e 40 campioni

sono risultati positivi rispettivamente con INNO-LIA HCV Score usando
2 e 16 ore di incubazione del campione, e con INNO-LIA HCV Ab III update.
Trentuno di questi campioni sono risultati essere positivi con CHIRON RIBA
HCV 3.0 SIA.
Campioni HCV-positivi
Un totale di 257 campioni, originanti da pazienti HCV infetti e trovati essere
positivi a due test di screening e ad INNO-LIA HCV Ab III update, sono
stati analizzati internamente con INNO-LIA HCV Score utilizzando AutoLIA e la procedura di incubazione del campione di 2 ore. Tutti i campioni
sono risultati positivi ad eccezione di un singolo campione risultato
indeterminato, raggiungendo in tal modo una sensibilit, includendo il
singolo risultato indeterminato, del 100% (257/257).
Differenti genotipi
INNO-LIA HCV Score utilizzando Auto-LIA con procedura di incubazione
del campione di 2 ore stato eseguito internamente su 15 campioni di
genotipo 1a, 15 di 1b, 15 di genotipo 2, 15 di genotipo 3a, 15 di genotipo 4a,
5 di genotipo 4 non-a, e 5 di genotipo 5. Tutti i campioni sono risultati positivi,
dando una sensibilit del 100% (85/85).
Specificit
Donatori di sangue
Un totale di 400 donatori di sangue risultati negativi per anticorpi anti-HCV
stato analizzato internamente utilizzando la procedura manuale di incubazione
del campione di 16 ore. Dopo il test iniziale, 377 campioni sono risultati negativi,
22 campioni indeterminati, e un campione positivo, dando una specificit iniziale
di 94.3% (377/400). Il campione inizialmente risultato positivo, dopo un test
effettuato in doppio ha dato risultato negativo, portando ad una specificit dopo
ripetizione del 94.5% (378/400).
Campioni clinici
Duecentocinque campioni clinici sono stati testati internamente utilizzando la
procedura manuale, con incubazione del campione di 16 ore.
Centoottantanove di essi sono risultati negativi, 11 indeterminati, e 5 positivi.
Tre di questi 5 campioni sono risultati negativi dopo avere ripetuto il test in
duplicato. Uno degli altri 2 campioni risultato positivo dopo la ripetizione
del test con INNO-LIA HCV Score e dopo il test con INNO-LIA HCV Ab
III update, mentre l'altro campione risultato indeterminato su questi test.
Entrambi i campioni erano negativi con Ortho HCV 3.0 ELISA con
Enhanced SAVe e con INNOTEST HCV Ab IV. Uno di questi due
campioni stato testato con CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA, ed risultato
negativo. Per questo set di campioni, stata ottenuta una specificit iniziale
del 92.2% (189/205), mentre dopo la ripetizione del test del 93.7% (192/205).
59
INNO-LIA HCV Score
Campioni potenzialmente interferenti

Centotrentasette campioni potenzialmente interferenti sono stati testati
internamente utilizzando la procedura manuale di incubazione del campione di
16 ore. Centoventisette campioni sono risultati essere negativi, 9 indeterminati,
e uno positivo. Dopo avere ripetuto il test in duplicato, questo campione
risultato una volta positivo e poi indeterminato, mentre stato ottenuto un
risultato positivo con INNO-LIA HCV Ab III Update. Questo campione
risultato essere negativo con Ortho HCV 3.0 ELISA con Enhanced SAVe, con
INNOTEST HCV Ab IV, e con CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA. Su questo set
di campioni stata ottenuta una specificit del 92.7% (127/137).
Riproducibilit
Due sperimentatori hanno testato un pannello di 13 campioni anti-HCV positivi,
un controllo positivo e un controllo negativo, con 3 differenti lotti, utilizzando
Auto-LIA con procedura di incubazione del campione di 2 ore, mentre un
terzo sperimentatore ha testato questo pannello con uno di questi lotti.
L'uso di differenti lotti di strisce e la performance di diversi operatori ha portato
agli stessi risultati.
Espaol
Finalidad de uso
El INNO-LIA HCV Score es un inmunoensayo en tira (LIA) para la
deteccin de anticuerpos contra el virus de la hepatitis C humano en suero o
plasma humanos. Est destinado a utilizarse como un ensayo
complementario en muestras de suero o plasma humano que resultaron
reactivos utilizando un procedimiento de cribaje anti-VHC.
Principio del ensayo
El INNO-LIA HCV Score es un inmunoensayo en tira de 3a generacin que
incorpora antgenos de VHC derivados de la regin principal, de la regin
hipervariable (RHV) E2, de la regin helicasa NS3 y de las regiones NS4A,
NS4B y NS5A.
Se basa en una tira de nylon con soporte de plstico, recubierta con los
antgenos mencionados, en forma de 6 bandas. Adems, en cada tira hay
cuatro bandas de control: una banda de control de estreptavidina, control
positivo 3+ (anti-Ig humano), control positivo 1+ (IgG humano) y banda de
corte (IgG humano).
El INNO-LIA HCV Score est basado en el mismo principio que un
inmunoensayo enzimtico. Se incuba una muestra en una cubeta con la tira de
ensayo del LIA. Si estn presentes en la muestra, los anticuerpos anti-VHC se
unirn a las bandas de antgeno de la tira. Posteriormente, se aade un
conjugado (H+L) anti-IgG humano de cabra marcado con fosfatasa alcalina
INNOGENETICS
60
purificada, que reacciona con complejos antgeno-anticuerpo de VHC

especficos, siempre y cuando se hayan formado previamente. La incubacin
con el sustrato enzimtico produce una coloracin marrn oscuro, cuya
intensidad es proporcional a la cantidad de anticuerpo especfico de VHC
capturado en una banda determinada (Fig. 1). El revelado colorimtrico se
detiene con cido sulfrico.
Reactivos
Descripcin, preparacin para el uso y condiciones de almacenamiento
recomendadas
-
Si se mantienen a una temperatura de 2 - 8C, todos los reactivos,

abiertos o sin abrir, son estables hasta su fecha de caducidad.
No congele los reactivos.
Todos los reactivos, as como el tubo de plstico que contiene las tiras
de ensayo, deben sacarse de la nevera aproximadamente 30 minutos
antes de su uso para que alcancen la temperatura ambiente (18 - 30C);
tras su uso, deben devolverse inmediatamente al refrigerador (2 - 8C).
Las alteraciones de la apariencia fsica de los reactivos pueden ser
signos de inestabilidad o deterioro.
Una vez abierto el tubo original que contiene las tiras, las tiras que no se
hayan utilizado son estables durante 16 semanas si se almacenan a una
temperatura de 2 - 8C con desecante en el envase original cerrado.
Reactivos suministrados:
Componente
Cantidad
Ref.
Tiras
20
57329 Contiene 20 tiras reactivas INNO-LIA

recubiertas de antgeno de VHC.
Descripcin
30 ml
57304 Contiene tampn fosfato con cdigo de

color (verde) que contiene a su vez
cloruro sdico, detergente,
estabilizadores de protena bovina y
0,3% de cloroacetamida (CAA) como
conservante.
Conjugado listo
para usar
45 ml
57301
Control negativo
0,12 ml
57307 Contiene matriz base de origen

humanem con 0,01% de MIT/0,1% de
CAA como conservante.
Contiene anticuerpos de cabra

anti-IgG humano con cdigo de color
(rojo) marcado con fosfatasa alcalina
en tampn Tris que contiene a su vez
estabilizadores bovinos, detergente y
0,01% de metilisotiazolona (MIT)/0,1%
de CAA como conservante.
61
INNO-LIA HCV Score
Control positivo
0,12 ml
57308
Contiene suero humano inactivado

positivo para anticuerpos de VHC con
0,01% de MIT/0,1% de CAA como
conservante.
Sustrato BCIP/NBT
listo para usar
45 ml
57302 Contiene 5-bromo-4-cloro-3indoilfosfato/nitroazul de tetrazolio en

dimetilformamida, con 0,01% de
MIT/0,1% de CAA como conservante.
Solucin de parada
45 ml
57303 Contiene 0,1 mol/l de cido sulfrico.
Solucin de lavado
45 ml
57299
Bandeja de incubacin
Hojas adhesivas
Hoja de resultados
Para el almacenamiento de las tiras

reveladas.
Tarjeta de lectura
Para identificacin de las bandas de

antgeno reactivas.
Contiene tampn Tris con cdigo de

color (azul) que a su vez contiene
cloruro sdico, detergente y 0,02% de
bromo-nitro-dioxano como conservante,
y debe diluirse 5 veces en agua
destilada. La solucin de lavado diluida
es estable durante 2 semanas si se
mantiene a una temperatura de 2 - 8C.
Con 11 cubetas cada una.
Materiales necesarios que no se suministran

-
Agua destilada o desionizada.

Pipetas de precisin, con punta desechable, de una capacidad de 10 l,
20 - 200 l, y 200 - 1.000 l, respectivamente.
Agitador orbital (ver Instrucciones para la incubacin).
Agitador de tipo vrtex o equivalente.
Probetas graduadas: 10, 25, 50 y 100 ml.
Pinzas para la manipulacin de las tiras.
Cronmetro.
Opcional:
ventilador de aire caliente (secador de pelo) o estufa a 37C
una pipeta repetitiva con jeringas desechables para la adicin de

cido sulfrico, conjugado, sustrato y solucin de lavado
aspirador al vaco que contenga una solucin al 5% de hipoclorito

sdico en un frasco desechable.
Seguridad y medio ambiente

-
Consulte la hoja de datos de seguridad y la etiqueta del producto

para obtener informacin acerca de componentes potencialmente
peligrosos.
INNOGENETICS
62
R43, S24-37
Irritante (Xi) Evite el contacto con la piel. Puede causar sensibilizacin por
contacto con la piel. Utilice guantes apropiados.
Contiene 2-cloroacetamida: diluyente de la muestra, conjugado listo para
usar, sustrato BCIP/NBT listo para usar y control negativo.
-
Las muestras, el Control positivo y el Control negativo deben

manipularse siempre como productos potencialmente infecciosos.
El Control positivo ha dado negativo a anticuerpos anti-VHC y HbsAg.
El Control negativo ha dado negativo a anticuerpos anti-VIH-1/VIH-2,
anti-VHC y HbsAg. Ningn mtodo de ensayo puede ofrecer una
garanta absoluta de que la sangre y hemoderivados no transmitan
agentes infecciosos.
Por lo tanto, todos los componentes de la sangre y los materiales
biolgicos deben considerarse como potencialmente infecciosos y
manipularse como tales. El procedimiento del ensayo slo debe
llevarse a cabo por personal debidamente capacitado. Todos los
componentes sanguneos y los materiales biolgicos deben desecharse
segn los procedimientos de seguridad establecidos.
Esterilice en autoclave durante al menos 15 minutos a 121C.
Incinere el material desechable.
Mezcle los residuos lquidos con hipoclorito sdico de forma que la

concentracin final sea de 1% de hipoclorito sdico. Deje reposar
toda la noche antes de llevar a cabo su eliminacin.
PRECAUCIN: Neutralice los residuos lquidos que contengan cido
antes de aadir el hipoclorito sdico.
Es imprescindible el uso de equipo protector personal: lleve siempre
guantes y gafas de seguridad cuando manipule agentes peligrosos o
infecciosos.
Los residuos deben manipularse con arreglo a las normas de eliminacin
de residuos de la institucin. Asimismo, cumpla todas las normas
medioambientales nacionales, autonmicas y locales.
No tire la solucin de parada en un bidn de residuos que contenga
hipoclorito sdico.
Muestra (recogida y manejo)

-
HCV Score puede llevarse a cabo en suero o plasma

El INNO-LIA
humano recogido en tubos que contengan citrato, heparina o EDTA
como anticoagulantes.
Para poder almacenar el suero o el plasma, debe separarlos antes de los
cogulos sanguneos o las clulas sanguneas mediante centrifugacin.
63
-
INNO-LIA HCV Score

Almacene las muestras a una temperatura de 2 - 8C. Para almacenarlas
durante ms de una semana, conglelas en alcuotas a -20C o menos.
No utilice ninguna muestra tratada trmicamente.
Las muestras que se hayan congelado y descongelado en repetidas
ocasiones (ms de 3 veces) pueden producir resultados errneos.
Observaciones y precauciones
-
No utilice el kit despus de su fecha de caducidad.

No mezcle reactivos de diferente nmero de lote.
Asegrese de que se utilizan los volmenes de muestra y los tiempos
de lavado adecuados para el procedimiento de ensayo necesario.
Evite la contaminacin microbiana de los reactivos.
Asegrese de que las muestras y los controles estn homogeneizados
antes usarlos.
No toque la membrana de la tira. Sujete siempre las tiras por el soporte
de plstico.
Utilice una punta de pipeta nueva por cada muestra.
Asegrese de colocar las tiras de ensayo en las cubetas con las
membranas hacia arriba.
En todos los pasos de incubacin debe utilizarse un agitador orbital o
de balanceo (utilice el agitador de balanceo slo para las incubaciones
de muestras durante la noche).
Es importante agitar las soluciones por encima de las tiras para lograr
una tincin uniforme y la mxima sensibilidad. Mientras agite la solucin,
mantenga la superficie de la tira completamente sumergida.
Cubra las cubetas con la hoja adhesiva para evitar que las tiras se
sequen durante la incubacin de la muestra durante toda la noche.
Mantenga alejados de la luz y el calor fuertes las tiras reveladas que no
se utilicen.
El kit slo debe ser utilizado por personal experimentado en prcticas
de laboratorio clnico.
El uso repetido de las cubetas de ensayo puede provocar resultados
errneos.
Si recorta las tiras se puede producir una interpretacin errnea de los
resultados.
Procedimiento del ensayo

Antes de iniciar el ensayo, lea el apartado Observaciones y precauciones.
-
Incubacin de muestra durante 16 horas
1.
Utilice la cantidad necesaria de cubetas de ensayo, teniendo en cuenta

que para cada ensayo se debe utilizar un control positivo y un control
negativo.
INNOGENETICS
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64
Identifique las cubetas de ensayo como controles y muestras y colquelas

en la bandeja.
Aada 1 ml de Diluyente de muestra a cada cubeta de ensayo para
muestras.
Aada 10 l de la muestra o del control en la cubeta convenientemente
marcada.
Coja la cantidad necesaria de tiras de ensayo LIA, y aada una tira a
cada cubeta de ensayo. Coloque con las pinzas la tira de ensayo con la
membrana hacia arriba dentro de la cubeta.
LA TIRA DEBE QUEDAR TOTALMENTE SUMERGIDA.
Cubra las cubetas con la hoja adhesiva (ver apartado sobre
Observaciones y precauciones). Incube las muestras colocando la
bandeja en un agitador orbital o de balanceo (consulte el apartado
Instrucciones para la incubacin) DURANTE TODA LA NOCHE (16 2 h)
a temperatura ambiente (18 - 25C).
NOTA:
Retire los selladores adhesivos con cuidado a fin de evitar

contaminaciones cruzadas.
Lave cada tira de ensayo 3 veces (5 minutos) con 1 ml de solucin
de lavado (ver Instrucciones de lavado).
Aada 1 ml de solucin de conjugado a cada cubeta de ensayo.
Incube con el conjugado colocando la bandeja de ensayo en el agitador
durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 - 25C).
Lave cada tira de ensayo 3 veces (5 minutos) con 1 ml de solucin
de lavado (ver Instrucciones de lavado).
Aada 1 ml de solucin del sustrato a cada cubeta de ensayo.
Incube con el sustrato colocando la bandeja de ensayo en el agitador y
agite durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 - 25C).
Aspire el lquido. Aada 1 ml de solucin de parada a cada cubeta.
Incube con la solucin de parada colocando la cubeta de ensayo en el
agitador de 10 - 30 minutos a temperatura ambiente (18 - 25C).
Aspire la solucin de parada.
Retire las tiras de las cubetaes de ensayo y colquelas con la
membrana hacia arriba en papel absorbente con la ayuda de las pinzas.
Tan pronto como las tiras se hayan secado totalmente, se pueden leer
los resultados. Para acelerar el proceso de secado, coloque las tiras en
una estufa de 37C durante 30 minutos o utilice un secador de pelo
durante 1 minuto. Las tiras reveladas retienen su color si se almacenan
en condiciones de oscuridad.
65
-
INNO-LIA HCV Score

Incubacin de muestra durante 2 o 3 horas
Durante el protocolo de "incubacin de muestra durante 2 horas o 3 horas"

deben seguirse los mismos 15 pasos del protocolo de ensayo "incubacin de
muestra durante 16 horas", aunque deben tenerse en cuenta ciertos cambios
en los pasos 3, 5, 6 y 9. El volumen para las muestras y controles aumentar de
10 - 20 l (paso 3) y el tiempo de incubacin de la muestra cambia a 2 o 3 horas
(paso 5). El lavado que tiene lugar tras la incubacin de la muestra pasa a ser
de 3 veces 10 minutos para el protocolo de 2 horas y de 3 veces 6 minutos para
el protocolo de 3 horas (paso 6); finalmente, el segundo lavado es de 3 veces
3 minutos para los protocolos de incubacin de muestra durante 2 o 3 horas.
En la siguiente tabla se muestra el resumen de los procedimientos de
ensayo con las diferencias resaltadas (negrita):
Muestra
Controles
Tiras de ensayo LIA
Lavado
Conjugado LPU*
Lavado
Sustrato LPU*
Solucin de parada
Incubacin de
muestra durante
16 horas
Incubacin de
muestra durante
2 horas
Incubacin de
muestra durante
3 horas
1 ml
10 l
10 l
16 horas 2 horas
1 ml/3 x 5 min.
1 ml/30 min.
1 ml/3 x 5 min.
1 ml/30 min.
1 ml/10 - 30 min.
1 ml
20 l
20 l
2 horas
1 ml/3 x 10 min.
1 ml/30 min.
1 ml/3 x 3 min.
1 ml/30 min.
1 ml/10 - 30 min.
1 ml
20 l
20 l
3 horas
1 ml/3 x 6 min.
1 ml/30 min.
1 ml/3 x 3 min.
1 ml/30 min.
1 ml/10 - 30 min.
*LPU = listo para usar
Instrucciones para el lavado

-
Tras el proceso de incubacin de toda la noche, 2 horas o 3 horas, retire

con cuidado la hoja adhesiva.
Aspire el lquido de la cubeta con ayuda de una pipeta, preferiblemente
acoplada a un aspirador de vaco que contenga una solucin al 5% de
hipoclorito sdico en el bidn de residuos.
La bandeja se coloca en un ngulo que permita que todo el lquido
fluya hacia un lado de la cubeta (hacia la parte del soporte de plstico
recubierto de cada tira).
Aada 1 ml de solucin de lavado diluida a cada cubeta y agite durante
1 minuto en un agitador orbital o de balanceo.
Repita estos pasos tantas veces como se indique en el procedimiento
de ensayo.
NOTA:
No permita que las tiras se sequen entre las distintas fases de

lavado.
INNOGENETICS
66
Asegrese de que no se deteriore la superficie de las tiras de

ensayo LIA cuando realice la aspiracin.
Asegrese de lavar la tira sumergindola totalmente en la solucin
de lavado.
Modifique la velocidad de agitacin o balanceo cuando sea necesario.
Instrucciones para la incubacin

-
Todos los pasos de incubacin (de la muestra, del conjugado, del

sustrato y la incubacin con cido sulfrico), as como los pasos de
lavado, deben llevarse a cabo en un agitador orbital o de balanceo
(utilice el agitador de balanceo slo para las incubaciones de
muestras durante la noche).
Durante la incubacin y el lavado, la superficie de la tira debe quedar
completamente sumergida, con la membrana hacia arriba.
El agitador debe permitir el movimiento de vaivn de las tiras en la cubeta,
y del lquido por encima de las tiras sin que se derrame de la cubeta.
La velocidad que genera un agitador orbital o longitudinal es fundamental
para lograr una tincin uniforme en las bandas y la mxima sensibilidad.
Recomendaciones para el uso de un agitador orbital:
el dimetro del movimiento circular debe ser igual o superior a 13 mm
un movimiento circular de 13 mm a una velocidad recomendada de 160 rpm
un movimiento circular de 24 mm a una velocidad recomendada de 90 rpm.

Recomendaciones para el uso de un agitador de balanceo:
la diferencia entre el punto ms alto y el ms bajo no debe ser superior a 80 mm

para evitar el derrame del lquido
una velocidad recomendada de 34 rpm.
Procedimiento de ensayo automatizado: Auto-LIA

El ensayo LIA puede automatizarse fcilmente utilizando el aparato Auto-LIA.
Este instrumento es un sistema autnomo con aspiracin, pipeteado e
incubacin automatizados. Para ms informacin y para obtener los protocolos
especficos del Auto-LIA, rogamos contacte con Innogenetics o con su
distribuidor local.
Antes de iniciar el ensayo, lea el apartado Observaciones y precauciones.
Procedimientos detallados de inmunoensayo en lnea (LIA) automtico
Incubacin de muestra durante 16 horas con Auto-LIA
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INC 1 min., shake speed 4
PAUSE
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INNO-LIA HCV Score

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CH1
CH2
CH4
CH5
CH6

ASP
ASP
INC 30 min.; shake speed 4
ASP
ASP
END
=
=
=
=
=

PAUSE
ASP
ASP
INC 30 min.; shake speed 4
ASP
ASP
END
Solucin de lavado
Conjugado
Solucin de parada
Sustrato
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INNOGENETICS
-
Durante el protocolo de "incubacin de muestra durante 3 horas" deben

seguirse los mismos 27 pasos que en el protocolo de ensayo "incubacin de
muestra durante 2 horas", aunque deben tenerse en cuenta ciertos cambios en
los pasos 4, 6, 8 y 10. El tiempo de incubacin de la muestra pasa a ser de
180 minutos para el protocolo de 3 horas (paso 4) y el lavado tras la incubacin
de la muestra durante 3 horas pasa a ser de 3 veces 6 minutos (pasos 6 - 8 - 10).
Resultados
Lectura
La naturaleza y ubicacin de los antgenos y los controles de la tira se
establecen de la forma siguiente: ver Figura 1 pgina 16.
La intensidad de la reaccin de las bandas de control en cada tira se utiliza
para asignar los ndices de reactividad a cada antgeno presente en dicha tira:
Intensidad de la reaccin de las bandas de antgeno (R)
Inferior a
Igual a
Superior a , pero menor o igual a 1+
Mayor que 1+ pero menor que 3+
Igual a 3+
Mayor que 3+
R<
R=
< R = 1+
1+ < R < 3+
R = 3+
R > 3+
Puntuacin
1+
2+
3+
4+
La clasificacin de la reactividad debe hacerse para cada tira de forma separada.

Para facilitar la interpretacin, se adjunta una plantilla de identificacin.
Las bandas se identifican ms fcilmente si se alinea la tira revelada con la
banda de control 3+ de la plantilla de identificacin.
Validacin
Compruebe la validez de las tiras del control positivo y del control negativo
y la validez de los niveles de control de cada tira antes de realizar la lectura
de los resultados del ensayo.
Validacin del ensayo:
1. La tira de control positivo debe mostrar una reaccin de al menos 1+ en
las bandas de antgeno C1, C2, NS3 y NS4. Las bandas de antgeno E2
y NS5 pueden tener un valor negativo.
2. La tira del control negativo debe mostrar una puntuacin negativa
(ninguna reaccin o al menos menor que la del nivel de control para
todas las bandas de antgeno de VHC).
69
INNO-LIA HCV Score
Validacin de una tira individual:

1. Los niveles de control 1+ y as como el nivel del contro positivo fuerte
3+ deben ser visibles.
2. La intensidad del nivel del control 3+ debe ser superior a la del nivel 1+
y la intensidad del nivel 1+ debe ser superior a la del nivel .
3. La banda de control para la anti-estreptadivina debe tener una puntuacin
negativa.
NOTA:
La tira debe estar completamente seca para evitar cualquier posible

error de lectura debido a la aparicin de bandas apenas visibles
despus de aadir la solucin de parada.
No coloque papel sobre las tiras cuando estn hmedas.
Se pueden observar bandas de control dbiles para las muestras que

contengan altos niveles de IgG (por encima del rango normal de IgG).
Interpretacin de los resultados
La gran cantidad de evaluaciones realizadas demuestra que los resultados
se pueden interpretar de la forma siguiente:
Una muestra es NEGATIVA para anticuerpos anti-VHC:
si todas las bandas de antgeno de VHC tienen una puntuacin negativa
si nicamente una banda de antgeno de VHC tiene una intensidad de ,
excepto cuando se observa reactividad para el NS3.
Una muestra es POSITIVA para anticuerpos anti-VHC:
si al menos dos bandas de antgeno de VHC tienen una intensidad o
superior.
Una muestra se considera INDETERMINADA para anticuerpos anti-VHC:
si nicamente una banda de antgeno de VHC tiene una puntuacin 1+
o superior
si la banda NS3 reacciona con una intensidad o superior y todas las
dems bandas de antgeno son negativas.
Software de interpretacin: LiRAS para enfermedades infecciosas
El software LiRAS para enfermedades infecciosas ha sido diseado para
facilitar la interpretacin de los resultados del LIA. Rogamos contacte con
su distribuidor local para obtener la ltima versin actualizada.
ADVERTENCIA:
No utilice la interpretacin automatizada sin tener en cuenta las
limitaciones de los procedimientos especificados a continuacin.
INNOGENETICS
70
Limitaciones del procedimiento

-
Debe cumplirse al pie de la letra el protocolo indicado a fin de obtener

el rendimiento ptimo del ensayo.
Las muestras con una banda NS3 +/- o superior pueden indicar una
seroconversin para VHC. Por tanto, se las clasifica como indeterminadas.
En caso de que se obtenga un resultado INDETERMINADO, se
recomienda analizar otra muestra del paciente despus de algunas
semanas.
Una muestra con reaccin positiva en la banda de control de estreptavidina
puede dar reacciones cruzadas con otros antgenos de VHC y no puede
ser interpretada como positiva para anticuerpos de VHC.
En la fase temprana de la infeccin, es posible que no se detecten los
anticuerpos contra el VHC.
En el contexto de la hemodilisis los anticuerpos pueden ser indetectables.
La utilizacin de muestras diluidas puede producir resultados errneos.
Es necesario investigar con mayor profundidad los parmetros para
evaluar el deterioro del hgado y confirmar la positividad del ARN para
el VHC en sujetos anti-VHC positivos antes de iniciar el tratamiento o
los procedimientos invasivos.
Eficacia del ensayo

Sensibilidad
Paneles de seroconversin/paneles de bajo ttulo
Los resultados del INNO-LIA HCV Score, utilizando el protocolo de
incubacin de muestra durante 2 horas con Auto-LIA y el protocolo manual
de incubacin de muestra durante 16 horas, se obtuvieron internamente con
13 paneles de seroconversin BBI (PHV 904 a 916), 2 paneles de bajo ttulo
BBI (PHV103 y 204), y el panel SFTS94. Estos resultados se compararon
con los resultados del CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA y del INNO-LIA VHC
Ab III Update.
El INNO-LIA HCV Score, utilizando los protocolos de incubacin de
muestra durante 2 horas y 16 horas, detect los anticuerpos antes que el
CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA en 7 paneles, mientras que 4 paneles
resultaron positivos al mismo tiempo. El CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA
detect los anticuerpos antes que el INNO-LIA HCV Score cuando se
usaron ambos protocolos de incubacin de muestra en un panel. Un panel no
result positivo con ninguno de estos ensayos.
71
INNO-LIA HCV Score
El INNO-LIA HCV Score, utilizando el protocolo de 2 horas, detect los

anticuerpos antes que el INNO-LIA VHC Ab III Update en 2 paneles, y los
otros 10 paneles resultaron positivos al mismo tiempo. Utilizando el protocolo de
16 horas, 4 paneles resultaron positivos antes que con el INNO-LIA VHC Ab III
Update, 7 paneles resultaron positivos al mismo tiempo, y 1 panel result
positivo ms tarde.
De las 40 muestras de los 2 paneles de bajo ttulo BBI, 28 y 32 muestras
fueron positivas en el INNO-LIA HCV Score utilizando los protocolos de
incubacin de muestra durante 2 horas y 16 horas, respectivamente. 35 de
estas muestras fueron positivas con el CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA,
mientras que 34 fueron positivas utilizando el INNO-LIA VHC Ab III
Update. Todas las muestras positivas con el CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA
o con el INNO-LIA VHC Ab III Update, fueron positivas o indeterminadas
con el INNO-LIA HCV Score.
De las 49 muestras del panel SFTS94, 38 y 41 muestras resultaron positivas
con el INNO-LIA HCV Score utilizando los protocolos de incubacin de
muestra durante 2 horas y de 16 horas respectivamente, y 40 muestras
fueron positivas con el INNO-LIA VHC Ab III Update. 31 de estas muestras
resultaron positivas con el CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA.
Muestras VHC positivas
Se analizaron internamente en el INNO-LIA HCV Score un total de 257
muestras, procedentes de pacientes infectados con el VHC y que resultaron
positivas en 2 ensayos de muestreo y en el INNO-LIA VHC Ab III Update.
Para ello se utiliz el protocolo de incubacin de muestra durante 2 horas con
Auto-LIA. Todas las muestras resultaron positivas, a excepcin de una
nica muestra que se consider indeterminada, lo que supone una
sensibilidad del 100% (257/257), incluyendo el nico resultado indeterminado.
Diferentes genotipos
El INNO-LIA HCV Score, utilizando el protocolo de incubacin de muestra
durante 2 horas con Auto-LIA, fue realizado internamente sobre 15 muestras
de genotipo 1a, 15 de genotipo 1b, 15 de genotipo 2, 15 de genotipo 3a, 15 de
genotipo 4a, 5 de genotipo 4 no-a y 5 de genotipo 5. Todas las muestras
resultaron positivas, lo que supone una sensibilidad del 100% (85/85).
Especificidad
Donantes de sangre
Se analizaron internamente un total de 400 donantes de sangre
encontrados negativos frente a anticuerpos de VHC utilizando el protocolo
manual de incubacin de muestra durante 16 horas. Tras los ensayos
iniciales, 377 muestras fueron negativas, 22 muestras resultaron
indeterminadas y 1 muestra fue positiva, lo que supone una especificidad
inicial del 94,3% (377/400). La muestra de sangre inicialmente positiva
INNOGENETICS
72
result negativa tras la repeticin del ensayo por duplicado, lo que supone
una especificidad tras el nuevo ensayo del 94,5% (378/400).
Muestras clnicas
Se probaron internamente 205 muestras clnicas utilizando el protocolo de
incubacin de muestra durante 16 horas. De ellas, 189 fueron negativas,
11 fueron indeterminadas y 5 resultaron positivas. Tras la repeticin del
ensayo por duplicado, 3 de estas 5 muestras resultaron negativas. Una de las
otras 2 muestras result positiva tras la repeticin del ensayo en INNO-LIA
HCV Score y tras el ensayo en INNO-LIA VHC Ab III Update, mientras que
la otra muestra result indeterminada en estos ensayos. Ambas muestras
fueron negativas en el Ortho VHC 3.0 ELISA con Enhanced SAVe y en el
INNOTEST VHC Ab IV. Una de estas 2 muestras fue probada tambin en
el CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA y result negativa. Para este conjunto de
muestras se obtuvo una especificidad inicial del 92,2% (189/205), mientras
que la especificidad tras la repeticin del ensayo fue del 93,7% (192/205).
Muestras potencialmente interferentes
Se probaron internamente 137 muestras potencialmente interferentes
utilizando el protocolo de incubacin de muestra durante 16 horas. De ellas,
127 resultaron negativas, 9 fueron indeterminadas y 1 result positiva.
Tras la repeticin del ensayo por duplicado, esta muestra result positiva
una vez e indeterminada a continuacin, mientras que se obtuvo un
resultado positivo con el INNO-LIA VHC Ab III Update. Esta muestra
result negativa en el Ortho VHC 3.0 ELISA con Enhanced SAVe, en el
INNOTEST VHC Ab IV y en el CHIRON RIBA VHC 3.0 SIA. En este
conjunto de muestras se obtuvo una especificidad del 92,7% (127/137).
Reproducibilidad
Dos investigadores probaron un panel de 13 muestras VHC-positivas, as
como un control positivo y uno negativo, en 3 lotes diferentes utilizando el
protocolo de incubacin de muestra durante 2 horas con Auto-LIA.
Mientras tanto, un tercer investigador prob este panel en uno de estos
lotes. El uso de diferentes lotes de tiras y con ejecuciones por parte de
diferentes investigadores dieron lugar al mismo resultado de ensayo.
Portugus
Utilizao
O INNO-LIA HCV Score um imunoensaio em linha (LIA) para detectar
anticorpos para o vrus da hepatite C humana em soro ou plasma humano.
Deve ser utilizado como teste suplementar em amostras de soro ou plasma
humano que tenham sido reactivas com um procedimento de despiste anti-HIV.
73
INNO-LIA HCV Score
Princpio do teste
O INNO-LIA HCV Score um imunoensaio em linha de terceira gerao,
que incorpora antignios HCV derivados da regio nuclear, a regio E2
hipervarivel (HVR), a regio NS3 helicase, as regies NS4A, NS4B, e NS5A.
Os antignios esto impregnados em 6 bandas distintas numa tira de nylon
sobre um suporte de plstico. Alm disso, foram impregnadas quatro bandas de
controlo em cada tira: banda de controlo de streptavidina, banda de controlo
positivo 3+ (Ig anti-humana), banda de controlo positivo 1+ (IgG humana) e
banda cut-off (IgG humana).
O INNO-LIA HCV Score baseia-se no princpio de um imunoensaio
enzimtico. A amostra de teste incubada numa cavidade juntamente com a
tira de teste LIA. Se existirem na amostra, os anticorpos HCV ligam-se s
bandas de antignio de HCV da tira. Subsequentemente, adicionado um
conjugado de purificado de IgG anti-humana de cabra marcada com fosfatase
alcalina (H+L), que reage com complexos antignio/anticorpo especficos de
HCV, se formados previamente. A incubao com o substrato enzimtico
produz uma cor acastanhada, cuja intensidade proporcional quantidade
de anticorpo especfico de HCV capturada da amostra em cada uma das
bandas (Fig. 1). O desenvolvimento da cor parado com cido sulfrico.
Reagentes
Descrio, preparao para utilizao e condies recomendadas de
conservao
-
Todos os reagentes, abertos ou fechados, permanecem estveis at

data de validade, se os mantiver a uma temperatura entre 2 - 8C.
No congele os reagentes.
Todos os reagentes e o tubo de plstico com as tiras de teste devem
atingir a temperatura ambiente (de 18 - 25C) cerca de 30 minutos antes
da utilizao e ser recolocados no frio (de 2 - 8C) imediatamente aps a
utilizao.
Alteraes na aparncia fsica dos reagentes do kit podem indicar
instabilidade ou deteriorao.
Depois de abrir o tubo original com as tiras, qualquer tira no utilizada
permanece estvel durante 16 semanas, desde que conservada a uma
temperatura de 2 - 8C no tubo original fechado com dessecador.
74
INNOGENETICS
Reagentes fornecidos:
Componente
Quantidade Ref. Descrio
Tiras
20
57329 20 tiras de teste impregnadas de antignio

INNO-LIA HCV.
Diluente da amostra
30 ml
57304 Tampo de fosfato com cdigo de cores (verde)

com cloreto de sdio, detergente, estabilizadores
de protenas bovinas e 0,3% de clorocetamida
(CAA) como conservante.
Conjugado
pronto a utilizar
45 ml
57301 IgG anti-humana de cabra com cdigo

de cores (vermelho) marcada com fosfatase
alcalina em tampo Tris com estabilizadores
de protenas bovinas, detergente e 0,01% de
Controlo negativo
0,12 ml 57307 Matriz de base de origem humana com 0,01%

de MIT/0,1% de CAA como conservante.
Controlo positivo
0,12 ml 57308 Soro humano inactivo positivo para anticorpos

para HCV com 0,01% de MIT/0,1% de CAA
como conservante.
Substrato BCIP/NBT
pronto a utilizar
45 ml
57302 BCIP/NBT em dimetilformamida com 0,01% de

Soluo de paragem
45 ml
57303 0,1 mol/l de cido sulfrico.
Soluo de lavagem
45 ml
57299 Tampo Tris com cdigo de cores (azul) com

cloreto de sdio, detergente e 0,02% de
bromonitrodioxane como conservante, a diluir
5x em gua destilada. A soluo de lavagem
diluda permanece estvel durante 2 semanas,
se a mantiver a uma temperatura entre 2 - 8C.
Tabuleiro de teste
Selantes adesivos
Com 11 cavidades cada.
Folha de relatrio de dados 1
Para guardar fitas processadas.
Carto de leitura
Para identificar bandas de antignios

reactivos.
Material necessrio no fornecido

-
gua destilada ou desionizada.

Pipetas de preciso (com ponta descartvel), capazes de fornecerem
10 l, 20 - 200 l, e 200 - 1000 l, respectivamente.
Agitador orbital ou oscilador (ver Instrues de incubao).
Agitador de vrtice ou equivalente.
Provetas graduadas: 10, 25, 50 e 100 ml.
Pinas para manipulao das tiras.
Cronmetro.
Opcional:
ventoinha de ar quente (secador de cabelo) ou incubador seco a 37C.
75
INNO-LIA HCV Score
pipeta de repetio juntamente com frascos descartveis para a

adio de cido sulfrico, conjugado, substrato e soluo de lavagem.
aspirador de vcuo com uma soluo de 5% de hipoclorito de
sdio numa garrafa de resduos.
Segurana e ambiente
-
Consulte as folhas de dados de segurana e o rtulo do produto

para obter mais informaes sobre os componentes potencialmente
perigosos.
R43, S24-37
Irritante! (Xi) Evite o contacto com a pele. Pode causar sensibilizao por
contacto com a pele. Utilize luvas de proteco adequadas.
Contm 2-cloroacetamida: Diluente da amostra, conjugado pronto a
utilizar, substrato BCIP/NBT pronto a utilizar e controlo negativo.
-
As amostras e os Controlos negativos e positivos devero ser sempre

manuseados como sendo potencialmente infecciosos.
O Controlo positivo foi determinado como sendo negativo para anti-HCV
e HBsAg. O Controlo negativo foi determinado como sendo negativo
para anti-HIV-1/HIV-2, anti-HCV e HBsAg. Nenhum mtodo de teste
pode no entanto assegurar que os produtos sanguneos no podero
transmitir agentes infecciosos. As amostras devem sempre ser
manipuladas como potencialmente infecciosas.
Todos os componentes sanguneos e materiais biolgicos devem ser
considerados como sendo potencialmente infecciosos e devem ser
manipulados em conformidade. O procedimento de teste deve ser realizado
apenas por pessoal com a formao e as qualificaes adequadas. Todas
os componentes sanguneos e materiais biolgicos devem ser eliminados
em conformidade com os procedimentos de segurana estabelecidos.
Realize uma autoclavagem durante pelo menos 15 minutos a 121C.
Incinere o material descartvel.
Misture os resduos lquidos com hipoclorito de sdio para que a

concentrao final seja de 1% hipoclorito de sdio.
Deixe em repouso durante a noite antes de eliminar.
CUIDADO: Neutralize o lquido residual que contenha cido antes de
adicionar o hipoclorito de sdio.
Utilize equipamento de proteco pessoal: luvas e culos de segurana
quando manipular agentes perigosos ou infecciosos.
Os resduos devem ser manipulados de acordo com as directivas de
eliminao de resduos da instituio. Deve cumprir todos os
regulamentos ambientais, federais, locais e nacionais.
INNOGENETICS
-
76
No aspire a soluo de paragem de uma garrafa de resduos, que

contm hipoclorito de sdio.
Amostra (recolha e manuseamento)

-
O INNO-LIA HCV Score pode ser realizado em soro ou plasma

humano recolhido em tubos com citrato, heparina ou EDTA, como
anticoagulantes.
Antes da conservao, o soro ou o plasma devem ser separados do
cogulo ou das clulas sanguneas por centrifugao.
Conserve as amostras a uma temperatura entre 2 - 8C.
Para conservao superior a uma semana, congele a -20C ou inferior.
No utilize amostras tratadas pelo calor.
As amostras congeladas e descongeladas repetidamente (mais de 3 vezes)
podem produzir resultados incorrectos.
Limites e precaues
-
No utilize o kit para alm da data de validade.

No misture reagentes com nmeros de lote diferentes.
Certifique-se de que utiliza os tempos de lavagem e volume de
amostra correctos para o procedimento.
Evite a contaminao microbiana dos reagentes.
Certifique-se de que as amostras e os controlos so homogneos
antes da utilizao.
No toque na membrana da tira. Manipule sempre as tiras com o
suporte de plstico.
Utilize uma nova ponta de pipeta para cada amostra.
Certifique-se de que as tiras de teste so colocadas nas cavidades
com o lado da membrana virado para cima.
Todos os passos da incubao devem ser realizados com um agitador
orbital ou oscilador (utilize o oscilador apenas para a incubao nocturna).
A agitao das solues sobre as tiras importante para a obteno de
uma colorao uniforme das bandas e a mxima sensibilidade. A superfcie
da tira deve ficar completamente submersa durante a agitao.
Cubras as cavidades com um selante adesivo para evitar a secagem
das tiras durante a incubao nocturna da amostra.
As tiras no utilizadas ou processadas devem ser mantidas ao abrigo
de luz forte e do calor.
O kit deve apenas ser utilizado por pessoal treinado em prticas clnicas
de laboratrio.
A reutilizao de tiras ou cavidades conduz a resultados incorrectos.
As tiras cortadas conduzem a interpretaes de resultados incorrectas.
77
INNO-LIA HCV Score
Procedimento do teste
Leia atentamente Limites e precaues antes de realizar o teste.
-
incubao de amostra de 16 horas
1.
Utilize a quantidade necessria de cavidades de teste, tendo em

ateno que, para cada srie de testes, deve realizar um controlo
positivo e um controlo negativo.
Identifique as cavidades de teste como controlos e amostras e coloqueas no tabuleiro.
Adicione 1 ml de diluente da amostra a cada cavidade de teste com
amostra.
Adicione 10 l da amostra ou do controlo cavidade devidamente
rotulada.
Remova a quantidade necessria de tiras de teste LIA do recipiente e
coloque uma tira em cada uma das cavidades de teste. A tira de teste
colocada com o lado da membrana virado para cima na cavidade com
uma pina.
A TIRA DEVE FICAR COMPLETAMENTE SUBMERSA.
Cubra as cavidades com um selante adesivo (ver Limites e precaues).
Incube as amostras, colocando o tabuleiro num agitador ou oscilador (ver
Instrues de incubao), e agite DE UM DIA PARA O OUTRO (16 2 h)
temperatura ambiente (de 18 - 25C).
NOTA:
Remova cuidadosamente os selantes adesivos para evitar

contaminao cruzada.
Lave cada tira de teste 3 vezes (5 minutos) com 1 ml de soluo de
lavagem (ver Instrues de lavagem).
Adicione 1 ml de soluo de conjugado a cada cavidade de teste.
Incube com o conjugado, colocando o tabuleiro de teste no agitador ou
oscilador, e agite durante 30 minutos temperatura ambiente (de 18 - 25C).
Lave cada tira de teste 3 vezes (5 minutos) com 1 ml de soluo de
lavagem (ver Instrues de lavagem).
Adicione 1 ml de soluo de substrato a cada cavidade de teste.
Incube com o substrato, colocando o tabuleiro de teste no agitador ou
oscilador, e agite durante 30 minutos temperatura ambiente (de 18 - 25C).
Aspire o lquido. Adicione 1 ml de soluo de paragem a cada cavidade.
Incube com a soluo de paragem, colocando a cavidade teste no
agitador ou oscilador, e agite durante 10 - 30 minutos temperatura
ambiente (de 18 - 25C).
Aspire a soluo de paragem.
Retire as tiras das cavidades de teste e coloque-as, com o lado da
membrana virado para cima, sobre papel absorvente com uma pina.
Quando as tiras secarem completamente, pode interpretar os resultados.
Para acelerar o processo de secagem, coloque as tiras numa estufa a
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
78
INNOGENETICS
37C durante 30 minutos ou utilize uma ventoinha de ar quente durante

1 minuto. As tiras processadas mantm a cor desde que sejam
conservadas num local escuro.
-
incubao de amostra de 2 e 3 horas
O protocolo da "incubao de amostra de 2 e 3 horas" deve seguir os

15 passos do procedimento de teste da "incubao de amostra de 16 horas",
mas deve ter em conta as alteraes aos passos 3, 5, 6 e 9. O volume da
amostra para controlos e amostras aumenta de 10 para 20 l (passo 3) e o
tempo de incubao da amostra muda para 2 e 3 horas (passo 5). A lavagem
depois da incubao da amostra muda para o procedimento de 2 horas para
3 vezes 10 minutos e para o procedimento de 3 horas para 3 vezes 6 minutos
(passo 6); a segunda lavagem 3 vezes 3 minutos para a incubao de
amostra de 2 e 3 horas.
Resumo dos procedimentos de teste com as diferenas realadas (negrito)
fornecidas na tabela seguinte:
Diluente da amostra
Amostra
Controlos
Tiras de teste LIA
Lavagem
Conjugado RTU*
Lavagem
Substrato RTU*
Soluo de paragem
incubao
de amostra
de 16 horas
incubao
de amostra
de 2 horas
incubao
de amostra
de 3 horas
1 ml
10 l
10 l
16 horas 2 horas
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 5 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
2 horas
1 ml/3 x 10 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
1 ml
20 l
20 l
3 horas
1 ml/3 x 6 min
1 ml/30 min
1 ml/3 x 3 min
1 ml/30 min
1 ml/10 - 30 min
*RTU = Ready-to-use = pronto a utilizar
Instrues de lavagem
-
Depois da incubao nocturna, 2 e 3 horas, remova cuidadosamente o

selante adesivo.
O lquido aspirado da cavidade com uma pipeta, de preferncia
ligada a um aspirador de vcuo, que contm uma soluo a 5% de
hipoclorito de sdio, para uma garrafa de resduos.
O tabuleiro mantido num ngulo que permite que o lquido escorra
para um lado da cavidade (para a parte do suporte de plstico no
impregnada de cada tira).
Adicione 1 ml de soluo de lavagem diluda a cada cavidade e agite
num agitador ou oscilador durante 1 minuto.
Repita estes passos tantas vezes quantas as indicadas no procedimento
de teste.
79
INNO-LIA HCV Score

NOTA:
No permita que as tiras sequem entre os passos de lavagem.
Certifique-se de que no danifica a superfcie das tiras de teste

LIA durante a aspirao.
Certifique-se de que a tira foi cuidadosamente lavada por submerso

completa na soluo de lavagem.
Adapte a velocidade do agitador ou oscilador, quando necessrio.
Instrues de incubao
-
Todos os passos de incubao (amostra, conjugado, substrato e cido

sulfrico) e tambm os passos de lavagem devem ser realizados num
agitador ou oscilador (utilize o oscilador para a incubao de amostra
nocturna).
A superfcie da tira deve estar completamente submersa com o lado da
membrana virado para cima durante os passos de incubao e de
lavagem.
O agitador ou oscilador deve permitir um movimento recproco (de
vaivm) das tiras na cavidade e um movimento do lquido sobre as
tiras sem transbordar da cavidade.
A velocidade gerada por um agitador orbital ou longitudinal, ou por um
oscilador crtica para a obteno de uma linha de colorao homognea
e da sensibilidade mxima.
Recomendaes para um agitador orbital:
o dimetro do movimento circular deve ser igual ou superior a 13 mm
a velocidade recomendada para um movimento circular de 13mm de 160 rpm
a velocidade recomendada para um movimento circular de 24mm de 90 rpm.

Recomendaes para um oscilador:
a diferena entre o ponto mais alto e o mais baixo no deve exceder 80 mm

para evitar derrame do lquido
a velocidade recomendada de 34 rpm.
Procedimento de teste automatizado: Auto-LIA

O procedimento de teste LIA pode ser facilmente automatizado com o
Auto-LIA. Este instrumento um sistema de passagem com aspirao,
pipetagem e incubao automticas. Para mais informaes sobre o
Auto-LIA, contacte a Innogenetics ou o distribuidor local.
Leia atentamente Limites e precaues antes de realizar o teste.
Procedimentos detalhados do Auto-LIA:
incubao de amostra de 16 horas Auto-LIA
1.
2.
3.
4.
5.

INC 1 min, velocidade de agitao 4
PAUSE
INNOGENETICS
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
CH1
CH2
CH4
CH5
CH6
=
=
=
=
=

ASP
ASP
ASP
ASP
END
Diluente da amostra
Soluo de lavagem
Conjugado
Soluo de paragem
Substrato

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.

PAUSE
ASP
ASP
80
81
INNO-LIA HCV Score

23.
24.
25.
26.
27.
ASP
ASP
END
CH1
CH2
CH4
CH5
CH6
=
=
=
=
=
Diluente da amostra
Soluo de lavagem
Conjugado
Soluo de paragem
Substrato
O protocolo da "incubao de amostra de 3 horas" deve seguir os 27 passos

do procedimento de teste da "incubao de amostra de 2 horas", mas deve
ter em conta as alteraes aos passos 4, 6, 8 e 10. O tempo de incubao da
amostra muda para 180 minutos para o procedimento de 3 horas (passo 4) e
a lavagem depois da incubao de amostra de 3 horas muda para 3 vezes
6 minutos (passos 6 - 8 - 10).
Resultados
Leitura
A identidade e a localizao dos antignios e controlos impregnados na tira so:
ver Figura 1 pgina 16.
A intensidade da reaco nas linhas de controlo de cada tira utilizada para
estabelecer os ndices de reactividade para cada antignio naquela tira:
Intensidade da linha de reaco do antignio (R)
Menor que
Igual a
Maior que mas menor ou igual a 1+
Maior que 1+ mas menor que 3+
Igual a 3+
Maior que 3+
R<
R=
< R = 1+
1+ < R < 3+
R = 3+
R > 3+
ndice
1+
2+
3+
4+
Tem de realizar um ndice de reactividade independente para cada tira.

Para simplificar a interpretao, includo um carto de leitura.
O alinhamento da tira processada com a banda de controlo 3+ no carto de
leitura torna a identificao das linhas mais simples.
Validao
Verifique a validade das tiras de controlo positivo e negativo e a validade
dos nveis de controlo em cada tira antes de ler os resultados do teste.
INNOGENETICS
82
Validao do teste:
1. A fita de controlo positivo deve apresentar uma reaco de pelo menos
1+ na linha de antignio C1, C2, NS3 e NS4. A linha de antignios E2 e
NS5 pode apresentar um ndice negativo.
2. A tira de controlo negativo deve mostrar um ndice negativo (nenhuma
reaco ou, pelo menos, reaco inferior ao nvel de controlo para
todas as linhas de antignio HCV).
Validao de uma tira nica:
1. Os nveis de controlo 1+ e e o controlo fortemente positivo 3+ devem
ser visveis.
2. A intensidade do nvel de controlo 3+ deve ser maior que a do nvel 1+
e a intensidade do nvel 1+ deve ser maior do que a do nvel .
3. A linha de controlo para anti-streptavidina deve ter um ndice negativo.
NOTA:
A tira deve estar completamente seca para evitar qualquer m

interpretao derivada de bandas fracamente visveis que
aparecem depois da adio da soluo de paragem.
No coloque papel sobre as tiras enquanto estiverem hmidas.
As bandas de controlos fracas podem ser observadas para amostras

com elevados nveis de IgG (acima do intervalo IgG normal).
Interpretao dos resultados
Avaliaes extensivas mostraram que os resultados podem ser
interpretados da seguinte forma:
Uma amostra NEGATIVA para anticorpos HCV:
se todas as linhas de antignio HCV tiverem um ndice de reactividade
negativo
se s uma linha de antignio HCV tiver uma reactividade de , excepto
quando esta reactividade observada para NS3.
Uma amostra POSITIVA para anticorpos HCV:
se pelo menos duas linhas de antignio HCV tiverem uma reactividade
mnima de ou superior.
Uma amostra considerada INDETERMINADA para anticorpos HCV:
se uma linha de antignio HCV tiver um ndice de reactividade de 1+
ou superior
se a linha de NS3 reagir com uma reactividade de ou superior e
todas as outras linhas de antignio forem negativas.
83
INNO-LIA HCV Score
Software de interpretao: LiRAS para doenas infecciosas

O LiRAS para software de doenas infecciosas foi concebido para ajudar
na interpretao dos resultados da LIA. Para obter a verso actualizada
mais recente, contacte o distribuidor local.
AVISO:
No utilize a interpretao automatizada sem ter em conta a limitao
do procedimento mencionados em seguida.
Limites do procedimento
-
O protocolo fornecido deve ser rigorosamente seguido para obter um

desempenho ptimo do teste.
Amostras com uma nica reactividade +/- ou superior em NS3 podem
indicar seroconverso para HCV. No entanto, so classificadas como
indeterminadas.
Se obtiver um resultado INDETERMINADO, recomendamos que teste
uma amostra adicional do doente aps algumas semanas.
Uma amostra que d uma reaco positiva na linha de controlo de
streptavidina pode dar reaces cruzadas com outras linhas de antignio
HIV e no pode ser determinada como positiva para anticorpos HCV.
Os anticorpos anti-HCV podem ser indetectveis numa infeco recente.
Os anticorpos podem ser indetectveis numa definio de hemodilise.
A utilizao das amostras diludas pode dar resultados incorrectos.
Os parmetros para avaliar os danos do fgado e a positividade do
HCV RNA devem ser investigados em indivduos com anticorpos HCV
positivos antes de iniciar tratamento ou procedimentos invasivos.
Desempenho do teste
Sensibilidade
Painis de seroconverso/painis de baixo ttulo
Os resultados do INNO-LIA HCV Score com o procedimento de incubao
de amostra de 2 horas Auto-LIA e o procedimento manual de incubao de
amostra de 16 horas foram obtidos internamente em 13 painis
seroconverso BBI (PHV 904 - 916), 2 painis de baixo ttulo BBI (PHV103 e
204) e no painel SFTS94. Estes resultados foram com os resultados
actualizados do CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA e do INNO-LIA HCV Ab III.
O INNO-LIA HCV Score com o procedimento de incubao de amostra de
2 horas e 16 horas detectou anticorpos mais cedo do que o CHIRON RIBA
HCV 3.0 SIA em 7 painis e 4 painis ficaram positivos em simultneo.
O CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA detectou anticorpos mais cedo do que o
INNO-LIA HCV Score com ambos os procedimentos de incubao de
amostra num painel. Um painel no ficou positivo em nenhum destes testes.
INNOGENETICS
84
O INNO-LIA HCV Score com o procedimento de 2 horas detectou anticorpos

mais cedo do que o INNO-LIA HCV Ab III Update em 2 painis e os outros
10 painis ficaram positivos em simultneo. Com o procedimento de 16 horas,
4 painis ficaram positivos mais cedo do que no INNO-LIA HCV Ab III
Update, 7 painis ficaram positivos em simultneo e um painel ficou positivo
posteriormente.
Nas 40 amostras nos 2 painis de baixo ttulo BBI, 28 e 32 amostras foram
positivas no INNO-LIA HCV Score com os procedimentos de incubao de
amostras de 2 e 16 horas, respectivamente. Trinta cinco destas amostras
foram positivas com o CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA, enquanto 34 foram
positivas com o INNO-LIA HCV Ab III Update. Todas as amostras positivas
com o CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA ou o INNO-LIA HCV Ab III Update
foram positivas ou indeterminadas com o INNO-LIA HCV Score.
Nas 49 amostras no SFTS94, 38, 41 e 40 amostras foram positivas com o
INNO-LIA HCV Score com os procedimentos de incubao de amostras
de 2 e 16 horas e com o INNO-LIA HCV Ab III Update, respectivamente.
Trinta e uma destas amostras tiveram resultados positivos com o CHIRON
RIBA HCV 3.0 SIA.
Amostras HCV positivas
Um total de 257 amostras, originrias de doentes infectados com HCV e
com resultados positivos em 2 ensaios de despiste e no INNO-LIA HCV
Ab III Update, foram analisadas no INNO-LIA HCV Score com o
procedimento de incubao de amostra de 2 horas Auto-LIA. Todas as
amostras tiveram resultados positivos, excepto uma amostra com resultado
indeterminado, resultando numa sensibilidade, incluindo o resultado
indeterminado, de 100% (257/257).
Gentipos diferentes
O INNO-LIA HCV Score com o procedimentos de incubao de amostra
de 2 horas Auto-LIA foi realizado internamente em 15 amostras de
gentipo 1a, 15 de 1b, 15 de 2, 15 de 3a, 15 de 4a, 5 de 4 no a e 5 de 5.
Todas as amostras tiveram resultados positivos, resultando numa
sensibilidade de 100% (85/85).
85
INNO-LIA HCV Score
Especificidade
Dadores de sangue
Foram analisadas 400 amostras de dadores de sangue negativas para
anticorpos HCV internamente com procedimento manual de incubao de
amostras de 16 horas. Depois do teste inicial, 377 amostras foram negativas,
22 amostras indeterminadas e 1 amostra positiva, resultando numa
especificidade inicial de 94,3% (377/400). A amostra de sangue positiva
inicial teve um resultado negativo depois da repetio do teste em duplicado,
resultando numa especificidade depois do teste de 94,5% (378/400).
Amostras clnicas
Foram testadas duzentas e cinco amostras clnicas internamente com o
procedimento manual de incubao de amostra de 16 horas. Cento e
oitenta e nove amostras foram negativas, 11 indeterminadas e 5 positivas.
Trs destas 5 amostras tiveram resultados negativos depois da repetio do
teste em duplicado. Uma das outras 2 amostras positivas tiveram
resultados positivos depois da repetio do teste no INNO-LIA HCV
Score e no INNO-LIA HCV Ab III Update, enquanto a outra amostra teve
um resultado indeterminado nestes ensaios. Ambas as amostras foram
negativas no Ortho HCV 3.0 ELISA com Enhanced SAVe e no
INNOTEST HCV Ab IV. Uma destas 2 amostras foi testada no CHIRON
RIBA HCV 3.0 SIA e teve um resultado negativo. Para este conjunto de
amostras, foi obtida uma especificidade de 92,2% (189/205), enquanto a
especificidade depois da repetio do teste foi 93,7% (192/205).
Amostras potencialmente interferentes
Foram testadas cento e trinta e sete amostras potencialmente interferentes
internamente com o procedimento manual de incubao de amostra de
16 horas. Cento e vinte e sete amostras foram negativas, 9 indeterminadas
e 1 positiva. Depois de repetir o teste em duplicado, esta amostra teve um
resultado positivo e, em seguida, indeterminado, enquanto um resultado
positivo foi obtido no INNO-LIA HCV Ab III Update. Esta amostra teve um
resultado negativo no Ortho HCV 3.0 ELISA com Enhanced SAVe,
INNOTEST HCV Ab IV e no CHIRON RIBA HCV 3.0 SIA. Neste
conjunto de amostras, foi obtida uma especificidade de 92,7% (127/137).
Reprodutibilidade
Dois tcnicos testaram um painel de 13 amostras de HCV positivo, um
controlo positivo e um controlo negativo em 3 lotes diferentes com o
procedimento de incubao de amostra de 2 horas Auto-LIA enquanto um
terceiro tcnico experimentou este painel num destes lotes. A utilizao de
diferentes lotes de tiras e o desempenho de diferentes tcnicos resultaram
no mesmo resultado de teste.

Inno-Lia HCV Score

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Inno-Lia HCV Score

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INNO-LIA* HCV Score

INNOGENETICS Diagnostica y Terapeutica

*INNOGENETICS is a Registered Trademark of Innogenetics N.V.

INNO-LIA HCV Score

INNO-LIA HCV Score

INNO-LIA HCV Score

57329 Containing 20 INNO-LIA HCV antigencoated test strips.

Containing color-coded (green) phosphate

INNO-LIA HCV Score

57307 Containing basematrix of human origin

57308 Containing inactivated human serum

57302 Containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl

57303 Containing 0.1 mol/l sulfuric acid.

57299 Containing color-coded (blue) Tris buffer

With 11 troughs each.

Data reporting sheet

For storage of developed strips.

For identification of reactive antigen lines.

Materials required but not provided

Distilled or deionized water.

hot air fan (hair dryer) or dry incubator at 37C

a repetitive pipette together with disposable vials for the addition of

vacuum aspirator which contains 5% sodium hypochlorite solution

Safety and environment

Specimens, Positive and Negative Control should always be handled as

Autoclave for at least 15 minutes at 121C.

Incinerate disposable material.

Mix liquid waste with sodium hypochlorite so that the final

Specimen (collection and handling)

The INNO-LIA HCV Score may be performed on human serum or

INNO-LIA HCV Score

Remarks and precautions

Do not use the kit beyond the expiration date.

16 hours sample incubation

Carefully remove the adhesive sealers to avoid cross-contamination.

INNO-LIA HCV Score

Summary test procedures with highlighted differences (bold), given in

Directions for washing

After overnight, 2 hours and 3 hours incubation, carefully remove the

Do not allow the strips to dry between the washing steps.

Make sure the entire strip is thoroughly washed by complete

Adapt the speed of the shaker or rocker when necessary.

Directions for incubation

The speed generated by an orbital or longitudinal shaker or rocker is

diameter of the circular motion should be equal or superior to 13 mm

recommended speed for a 13 mm circular motion is 160 rpm

recommended speed for a 24 mm circular motion is 90 rpm.

recommended speed is 34 rpm.

Automated test procedure: Auto-LIA

DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 l

INNO-LIA HCV Score

DISP CH1 Stpos: 1 Endpos: end 1000 l

3 hours sample incubation Auto-LIA

INNO-LIA HCV Score test strip

INNO-LIA HCV Score

The strip must be completely dried to avoid any misinterpretation

Weak control bands can be observed for samples containing high

The protocol provided must be strictly followed to obtain optimal

INNO-LIA HCV Score

On the 40 samples within the 2 BBI low-titer panels, 28 and 32 samples

INNO-LIA HCV Score

Maintenus 2 - 8C, tous les ractifs, ouverts ou ferms, y compris les

57329 20 bandelettes INNO-LIA sensibilises