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MUTAGENESIS DE UN FRAGMENTO DE DNA CLONADO

La produccin, aislamiento y anlisis de mutantes ha sido una de las vas que ms ha


contribuido al desarrollo de la Gentica. En el principio, el aislamiento de un fenotipo
mutante era el origen de una investigacin dirigida a definir su comportamiento
gentico. Posteriormente se ha ido imponiendo la experimentacin inversa: primero se
genera en el DNA una modificacin previamente diseada, para luego analizar su efecto
en la actividad molecular o celular (fenotipo).
Estos mtodos se engloban dentro de la llamada mutagenesis dirigida y se han
impuesto como herramienta insustituible para el trabajo de ingeniera gentica, con la
aplicacin en todos los campos de la biologa molecular.
Las dos grandes vas de aplicacin general de esta tecnologa son:
-

El estudio de relaciones estructura-funcin en secuencia de DNA, mediante el


estudio de mutantes en sitios concretos.
La produccin de protenas nuevas con estructura (y quiz funcin) diferente a
la original, por sustitucin de alguno o algunos de sus residuos de aminocidos,
lo que ha dado cuerpo a la denominada ingeniera de protenas.

Los mtodos actuales para lograr la modificacin dirigida de una regin de un DNA son
muy numerosos y variados.

1.1.

MUTAGENESIS SIMPLE DIRIGIDA SOBRE UN FRAGMENTO DE DNA CLONADO.

Las mutaciones ms sencillas de incorporar a un fragmento de DNA clonado son


pequeas deleciones, inserciones o sustituciones de piezas cortas fcilmente
manejables. Dependiendo de la regin que se desea modificar, el proceso puede ser
muy sencillo o muy complicado.
La presencia de dos nicos sitios para una enzima en la regin a modificar puede ser
igualmente til para el proceso. Tras la digestin y purificacin del fragmento.
Sin embargo, en la mayora de las ocasiones, la situacin se aleja bastante de los
casos simples, lo que ha obligado al desarrollo de mtodos de uso ms general.

1.2.

MUTAGENESIS DIRIGIDA POR OLIGONUCLEOTIDOS

Este procedimiento permite aadir, eliminar o sustituir uno o vario nucletidos en un


fragmento de ADN clonado de secuencia conocida, generando mutaciones especficas,
en sitios especficos definidos a priori por el experimentador, gracias a su precisin
este mtodo puede usarse para:
-

Modificar posiciones puntuales de ciertas secuencias, para la eliminacin o


creacin de sitios de restriccin (por ejemplo, para la construccin de vectores).
Sustituir codones de secuencias codificadoras por otros que codifiquen el
mismo aminocido pero que sean de uso ms frecuente en la clula donde se
busca la expresin de una protena.
Alterar codones especficos de secuencias codificadoras, con el objetivo de que
produzcan protenas mutantes previamente diseadas.
Producir cambios definidos en regiones reguladoras, con el fin de estudiar o
alterar sus efectos.

Se trata de una herramienta muy potente y verstil para la modificacin puntual del
ADN, que permite la incorporacin de prcticamente cualquier cambio que se desee
sobre una pieza clonada de DNA. El principio de la tcnica consiste en el empleo de un
oligonucletido portador de la modificacin deseada, que resulta elongado al actuar
como cebador para la lectura de una hebra molde por parte de DNA polimerasa; existen
dos versiones de esta estrategia:
-

Versin in vivo que se sustenta en el empleo de vectores de DNA


monocateriano.
Versin in vitro que se basa en la PCR.

La primera es una va ya clsica que est siendo ya desplazada por la rapidez y


sencillez de la elongacin in vitro por PCR, aun que esta tiene el inconveniente de
incorporar ms errores en la lectura del molde.

1.2.1. ETAPAS DEL PROCEDIMIENTO:


a) Preparacin del DNA que se pretende modificar, en forma monocateriana.
El procedimiento requiere que la regin donde se ha de generar la mutacion se
encuentre en forma de monohebra.
Es muy conveniente que el fragmento clonado sea lo ms corto posible ya que:
- Los insertos grandes pueden ser bastante insestables en vectores con ssDNA y
sufrir deleciones espontaneas.
- La probabilidad de que el oligonucletido director de la mutagenesis forme
hibrido con regiones distintas a la prevista aumenta con el tamao del inserto.
- Tras la mutagenesis, es necesario confirmar que el proceso ha tenido lugar
nicamente en el punto esperado y no en otro, por lo que es necesario analizar
la secuencia de todo el fragmento clonado.
Por ello, aunque la pieza de ADN donde luego hayan de verse los efectos de la
mutacin sea de un tamao considerable, convierte clonar y aislar un corto
fragmento de restriccin que incluya el sitio a mutagenizar. Posteriormente, la
regin mutada ser incluida en el ADN funcional sustituyendo al fragmento
nativo.
b) Diseo del oligonucletido mutagenico.
El fragmento de ssDNA que dirige el proceso actuando como cebador y
conteniendo la mutacion deseada (sustitucin, insercin o delecion) debe
cumplir ciertos requisitos para asegurar el xito del experimento:
- Debe ser complementario a la hebra de DNA clonada y suficientemente largo
para que se asocie de manera especfica con la secuencia deseada.
- No debe contener secuencias palindromicas ni repetidas, para evitar que
formen estructuras secundarias internas que la haran perder eficacia como
cebador.
- No debe tener secuencia complementaria a otras zonas de inserto ni del vector.
La seleccin del oligonucletido depende del tipo de mutacion que se pretenda
introducir:
o

Si el objeto es una mutacion puntual que afecta a un nico nucletido, el


cebador mutagenico deber tener entre 17 y 19 nt y llevar la alteracin
en el centro.
Si lo que se desea es una mutacion que afecte a dos nucletidos o
ms, el oligonucletido mutagenico ideal debera tener entre 12 y 15 nt
perfectamente complementarios al molde en cada costado de la regin

no complementaria, con una longitud total de 25 unidades como


mnimo.
En general cuanto mayor es el nmero de pares de bases implicado en la
mutacion que se pretende, menor es la eficacia en la formacin del hibrido.
c) Hibridacin y extensin in vitro del cebador.
El cebador se aade en un gran exceso molar a la disolucin del ssDNA molde
que contiene la regin a mutagenizar; tras la elevacin de la temperatura, la
mezcla se deja enfriar lentamente para permitir la formacin de los hbridos.
d) Transfeccion de clulas de E. coli y anlisis de mutantes.
El resultado de la reaccin de extensin del cebador es utilizado directamente
para su transferencia (transfeccion) a un hospedador bacteriano apropiado.
e) Recuperacin del fragmento mutado y sustitucin del nativo en el DNA
funcional.
1.2.2. EFICACIA DEL METODO
La eficacia del proceso global depende de factores:
-

1.3.

La eliminacin de molculas residuales de ssDNA molde original que no hayan


sido copiadas y que, cuando transfecten al cultivo hospedador, se incorporan al
ciclo replicativo y reducen el rendimiento en fogos mutantes. Se consigue por
sedimentacin en gradiente, electroforesis, tratamiento con una nucleasa
especfica de ssDNA o filtracin a travs de nitrocelulosa (que retiene el
ssDNA).
La anulacin de los sistemas reparadores del hospedador, que reconocen sitios
no perfectamente complementarios en un dsDNA y los repara actuando sobre la
hebra no metilada, preferentemente.
La posibilidad de suprimir el crecimiento de los fagos no mutantes, lo que
permitira un gran enriquecimiento en los mutantes; como la utilizacin de
estirpes dut ung de E. coli y el marcaje del DNA mutante con derivados
tiofosforilados.

MUTAGENESIS DIRIGIDA MEDIANTE PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa, o PCR. Entre sus mltiples e importantes


aplicaciones, resulta ser un mtodo muy potente para la generacin de mutaciones
dirigidas por un oligonucletido.
Utilizando un oligonucletido que incorpore la alteracin deseada como uno de los dos
cebadores de la reaccin y trabajando sobre una molcula monocaretiana, se consigue
la amplificacin de la secuencia mutada. La mutagenesis basada en la PCR tiene
algunas limitaciones, la enzima utilizada para la amplificacin (normalmente la
polimerasa taq) produce una tasa de errores bastante alta.

1.4.

SUPRESION DE MUTACION AMBAR

Las mutaciones mbar consisten en la aparicin de un codn stop UGA en la secuencia


del RNA mensajero.
La ventaja de este sistema es que permite el aislamiento de diferentes protenas
mutantes a partir de un solo experimento de mutagenesis in vitro. Su limitacin es que

no existen todas las cepas supresoras necesarias para lograr la sustitucin del codn
mbar por los 20 aminocidos posibles.

1.5.

CONSTRUCCIN DE UN CONJUNTO PROGRESIVO DE MUTANTES DE DELECION

La mutagenesis dirigida es un arma insustituible para la incorporacin de


modificaciones puntuales sobre una secuencia conocida, pero para otras aplicaciones
puede resultar un mtodo lento y costoso.
El esquema genera: el plsmido recombinante que porta la regin que se desea acortar
empieza por ser abierto; a continuacin, esta forma lineal es dirigida a distintos
tiempos con diferentes actividades nucleasicas para producir las deleciones
progresivas; finalmente, las molculas acortadas son recircularizadas y clonadas.
La diferencia fundamental entre las distintas recetas es las nucleasas que emplean:
-

1.6.

Nucleasa Bal31: contiene una fuerte actividad exonucleolitica que degrada un


dsDNA por sus extremos 3
DNasa I: acta en presencia de cationes Mg +2 o Co2+, corta las dos hebras de
un dsDNA por puntos enfrentados o casi enfrentados.
Exonucleasa III: cataliza la degradacin de los extremos de un dsDNA pero solo
por los terminales 3 y siempre que estn desfosforilados.

MUTAGENESIS POR INSERCION ALEATORIA DE UN LINKER

Esta estrategia implica dos pasos fundamentales:


-

La produccin de un conjunto de molculas lineales por rotura bicateriano de un


DNA circular por sitios ms o menos aleatorios.
La recircularizacion de esas molculas en presencia de un oligonucletido
bicateriano portador de una diana de restriccin (linker) que resultara insertado
en distintas posiciones al azar del recombinante original.

La incorporacin del linker, es decir, la mutagenesis propiamente dicha se consigue,


una vez purificadas las molculas lineales, se mezclan con piezas oligonucletidos
sintticas que tienen en su interior una diana de restriccin no presente en el resto del
DNA del recombinante (un linker), se incuban con DNA-ligasa y el resultado se utiliza
para transformar clulas E. coli. Entre los clones obtenidos, la posicin aproximada del
linker se determina mediante restriccin del DNA plasmidico.

1.7.

MUTAGENESIS AL AZAR

Una forma rpida de aislar mutantes, eso s, siempre que se pueda disponer de algn
mtodo de seleccin. Una de sus aplicaciones ms atractivas es la construccin de
una coleccin de protenas mutantes que permita la evolucin de sus relaciones
estructura-funcin.

1.8.

UN CASO REAL: UNA ENZIMA DESTINADA A SER MODIFICADA

Aunque son ya muchas las enzimas en las que se han estudiado los efectos de la
mutagenesis sobre su estructura y funcionalidad, posiblemente es la subtilisina una de

las que con mayor empeo se ha mutagenizado. Las razones de esto hay que
buscarlas en el hecho de que se trata de una enzima de gran inters industrial puesto
que se encuentra como aditivo en muchos detergentes. Las subtilisinas son protenas
homologas de unos 27.500Da producidas por distintos microorganismos que
pertenecen a la familia de las serin-proteasas y presentan una estructura constituida
por un solo dominio.
Se puede decir que s que se trata de una casa paradigmtico para realizar estudios
de mutagensis no solo desde el punto de vista de la investigacin bsica, sino tambin
con fines comerciales. Muchos de los estudios de mutagenesis se han encaminado a
mejorar la estabilidad para su uso en los detergentes desde varios puntos de vista,
como por ejemplo la resistencia a la oxidacin, a la inactivacin trmica y a los lcalis.