UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E

MUCURI

CTIA DA CRUZ SANTOS

DESENVOLVIMENTO DE PLATAFORMAS ELETROQUMICAS

FUNCIONALIZADAS COM CIDO POLI(4-AMINOBENZICO)
APLICADAS EM BIOSSENSORES

DIAMANTINA MG
2014

CTIA DA CRUZ SANTOS

DESENVOLVIMENTO DE PLATAFORMAS ELETROQUMICAS

FUNCIONALIZADAS COM CIDO POLI(4-AMINOBENZICO)
APLICADAS EM BIOSSENSORES

Dissertao apresentada ao Programa de PsGraduao em Qumica, da Universidade Federal

dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como parte
das exigncias para obteno do ttulo de Mestre
em Qumica.
rea de Concentrao: Qumica Analtica
Orientador: Prof. Dr. Lucas Franco Ferreira UFVJM

DIAMANTINA MG
UFVJM
2014

DEDICATRIA

A Deus,
porque dEle e por Ele,
para Ele so todas as coisas...
Aos meus pais,
Fenilza e Carleno,
com quem compartilho esta conquista,
obrigada pelo amor incondicional, constante apoio,
dedicao, compreenso e confiana.
s minhas queridas irms,
Cssia e Carla,
pela amizade sincera,
companheirismo e torcida.
Aos demais familiares,
pelo incentivo e
por torcerem por mim!

AGRADECIMENTOS
Agradeo a Deus,
Meu porto seguro, por ser refgio e fortaleza em todos os momentos, pelo cuidado em todo o
tempo e por essa vitria em minha vida. Sem Ti eu nada poderia!
Aos meus pais,
Pelo amor proporcionado, por toda dedicao em buscar sempre o melhor para a minha vida.
Pelos conselhos dados, ensinamentos e pela compreenso em todos os momentos. Amo vocs
pra sempre!
s minhas irms,
Por torcerem sempre por mim, pelos momentos maravilhosos proporcionados durante as
frias em casa e pela fora nos momentos de dificuldade, tristeza e solido. Eu amo vocs!
Ao Gustavo,
Pelo apoio, incentivo, pacincia, compreenso e por me ouvir sempre que precisei... sua
companhia enche a minha vida de alegria! Obrigada por estar ao meu lado sempre!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Lucas Franco Ferreira,
Pela sua indispensvel orientao, pelo profissionalismo, carter, pacincia, pela confiana
depositada e, sobretudo por sua disponibilidade durante todas as etapas de realizao deste
trabalho e por tantos ensinamentos que contriburam para o desenvolvimento do mesmo.
Enfim, agradeo pela oportunidade de construir conhecimentos fundamentais para a minha
vida acadmica, por acreditar em mim e pela amizade e dedicao proporcionadas.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Moreira Verly,
Pelas amostras de peptdeo concedidas, pela excelente colaborao, pacincia e disposio
demonstradas durante a execuo deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Leonardo Morais da Silva,
Pela colaborao, esclarecimento das questes de espectroscopia de impedncia
eletroqumica, referentes a este trabalho e sugestes que contriburam para a melhoria e
aprimoramento do trabalho desenvolvido.
A todos os professores do Departamento de Qumica,
Pelos ensinamentos transmitidos que contriburam para a minha formao e pelas
contribuies significativas no decorrer deste trabalho.
Ao Grupo de Eletroqumica e Nanotecnologia Aplicada (GENAp),
Em especial ao Filipe Cruz, companheiro de trabalho, sou muito grata pela sua colaborao
em permitir-me acompanh-lo no incio da pesquisa para que a execuo deste trabalho fosse
possvel.
minha amiga Ftima,
Pelo companheirismo, convivncia, pelas risadas e conversas. E Isabel Torres, pela amizade,
motivao e companhia nas madrugadas de estudo e resoluo das enormes provas. Obrigada
por serem minhas amigas em todos os instantes!

Ao Ricardo Correa,
Que se tornou um amigo querido, obrigada pelo apoio, pelos momentos de alegria e
descontrao no laboratrio. E pela disponibilidade em me ajudar sempre que foi necessrio.
Ao meu amigo, Fernando Mota,
Pela demonstrao de amizade, pelos momentos de conversa e companhia no laboratrio e
pelas resolues das provas por telefone... rs!
minha amiga de repblica, Mariana Reis,
Pela tima convivncia, pelas palavras de nimo, conversas e pelos bons momentos
compartilhados.
Aos amigos de laboratrio,
Delton, Dilton, Ismael, Alexandre Xavier, Aline Nogueira, Maria Fernanda, Neiviane, Jussara
e Joo Gabriel.
A todos os amigos que estiveram comigo desde a graduao e colegas do mestrado, pelos
momentos felizes proporcionados, pelas risadas e pelo apoio nas disciplinas.
Aos amigos da Igreja Batista Central de Diamantina e da IBPC de Taiobeiras, pela amizade e
comunho.
Aos membros da banca que aceitaram participar e contribuir para o aprimoramento deste
trabalho.
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de nvel Superior (CAPES) pela bolsa
concedida.
UFVJM, pela oportunidade de realizao deste trabalho e pelos anos de formao
profissional.
A todos que sempre estiveram ao meu lado torcendo pelo sucesso deste trabalho,
Muito obrigada!

"Haver dias sem respostas, noites longas tambm, mas o regente de

todas as coisas compe uma nova cano no silncio.
(Bianca Toledo)

Que a sua felicidade esteja no Senhor! Ele lhe dar o que o seu corao
deseja!
(Salmos 37.4)

i
RESUMO
Neste trabalho foi investigada a eletropolimerizao do cido 4-aminobenzico (4-ABA), visando sua
aplicao como plataforma funcionalizada para imobilizao de biomolculas, para o desenvolvimento
de sensores biolgicos. Foi utilizado o monmero 4-ABA, e por meio deste a eletrogerao foi
conduzida sobre a superfcie do eletrodo de grafite (EG), utilizando-se as tcnicas de voltametria
cclica (VC) e cronoamperometria (CA), onde nesta, foi investigado o tempo de eletrodeposio.
Associado a este estudo, foi investigado a imobilizao de pequenos fragmentos de DNA
(oligonucleotdeos), observando a atuao da plataforma funcionalizada na resposta do biossensor em
relao deteco dos oligonucleotdeos, bem como avaliao do reconhecimento do evento de
hibridizao, com o alvo complementar. Para a VC, os EG foram modificados com 100 ciclos
consecutivos de potencial, em velocidade de varredura de 50 mV/s, na faixa de potencial de +0,00 a
+1,20 V, enquanto que na CA, os EG foram modificados nos potenciais de +0,95 V; +1,05 V e +1,15
V, onde tempo de polimerizao foi investigado em 4800 segundos e 2400 segundos. Observou-se que
dentre os trs potenciais pr-estabelecidos, o que apresentou maior eletroatividade, foi no eletrodo
modificado +1,05 V, seguido dos potenciais de +1,15 V e +0,95 V, respectivamente. Para o filme
formado em +0,95 V, h um ligeiro aumento da corrente na atividade do par redox, sendo tambm
observado que um maior deslocamento de potencial e corrente, ocorreu para o eletrodo modificado em
+1,05 V seguido do potencial +1,15 V. A atividade eletroqumica dos filmes polimricos
praticamente da mesma magnitude quando a eletropolimerizao por CA, ocorre a 4800 segundos e
2400 segundos. O eletrodo que apresentou as melhores respostas para imobilizao e deteco das
bases pricas, guanina e adenina, foi o eletrodo modificado por VC, seguido do eletrodo modificado
no potencial de +1,05 V, uma vez que mostrou-se maiores amplitudes nos valores de corrente de pico
andica (Ipa) dentre os potenciais constantes. Os filmes formados a 2400 segundos apresentam menor
sensibilidade para a imobilizao e deteco da guanina, biomarcador. Medidas de espectroscopia de
impedncia eletroqumica (EIE) mostraram maior resistncia transferncia de carga (Rtc) para o
eletrodo modificado no potencial +1,05 V, seguido do eletrodo modificado por VC. Imagens de
microscopia eletrnica de varredura (MEV) mostraram que em todos os casos no h total
recobrimento da superfcie do EG. Para o poli(4-ABA) eletropolimerizado por VC, as imagens de
MEV mostraram morfologia completamente distinta, pois se observa uma maior cobertura da
superfcie do grafite, quando comparado aos filmes polimricos formados por CA. ntido que para
os filmes formados a 4800 segundos, h maior presena de material depositada para a plataforma
desenvolvida em +1,05 V. A plataforma Poli(4-ABA)/EG mostrou-se eficiente e sensvel para a
imobilizao do oligonucleotdeo (poliGA), bem como a deteco do evento de hibridizao com o
oligonucleotdeo complementar (poliCT). A ssDNA apresentou melhor afinidade pelo azul de metileno
(AM) devido aos pares de bases da guanina presentes na sonda, comparada a dsDNA, onde a formao
do hbrido diminui o acesso de intercalao do azul de metileno (AM) s bases guanina, enquanto que
a resposta eletroqumica do brometo de etdio (BE) foi melhor observada na dsDNA. Estudos da
imobilizao do peptdeo DD K, com o alvo especfico (fosfolipdeo POPC), e o alvo no especfico
(fosfolipdeo POPC + colesterol), mostraram-se bastante promissores. A imobilizao do peptdeo
sobre o poli(4-ABA) no gerou grandes alteraes no perfil dos espectros de EIE. Foi possvel
observar uma semelhana entre os diagramas de Bode para as medidas da sonda e da sonda + alvo
especfico devido forte interao existente entre peptdeo/LUVs sem colesterol. Contudo, para o
eletrodo contendo a sonda + alvo no especfico (LUVs com colesterol), o espectro foi alterado. Tais
resultados indicam promissora aplicao da plataforma desenvolvida no reconhecimento de alvos
biolgicos, bem como o desenvolvimento de biossensores.
Palavras-chave: cido 4-aminobenzico, eletropolimerizao, filmes polimricos, DNA, peptdeo,
medidas de impedncia.

ii
ABSTRACT
The electropolymerization of 4-aminobenzoic acid (4-ABA) on graphite electrodes (GE) was
investigated for the development of electrochemically functionalized platforms applied in the
immobilization of biomolecules. The electrogeneration of 4-ABA was carried out in
perchloric acid solutions using cyclic voltammetry (CV) and chronoamperometry (CA)
techniques. In the case of CV studies, the GEs were modified by applying 100 consecutive
potential cycles, while in the case of CA studies the electrodes were modified at different
potentials (E/V vs. Ag/AgCl): +0.95, +1.05 and +1.15. The modified GEs were characterized
using CV and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) techniques in HClO4 solutions
in the presence and absence of the ferricyanide/ferrocyanide redox couple (redox probe).
Scanning electron microscopy (SEM) was used for morphological characterization. In case of
CA, the best electrochemical activities for the electropolymerization reaction were verified at
+1.05 V > +1.15 V > +0.95 V. The poly(4-ABA) platforms were investigated for the
immobilization and direct detection of purine bases (adenine and guanine), where the higher
values of the anodic peak current (Ip,a) were observed for the transducers electroformed using
CV. For immobilization of oligonucleotides poly(GA) and recognition of hybridization event
with the complementary target poly(CT), methylene blue (MB) and ethidium bromide (EB)
were used as indicator and intercalator, respectively. MB was reduced at 0.26 V resulting in
the cathodic peak current (Ip,c) for the ssDNA, while in the case of EB the oxidation was
observed at +0.58 V thus resulting in the higher values of Ip,a for the dsDNA. The platforms
were also evaluated for immobilization of the DD K peptide, whose antibacterial activity and
biological recognition were verified using the complementary (phospholipid 1- palmitoyl - 2 oleoyl phosphatidylcholine - POPC) and non-complementary (phospholipid POPC +
cholesterol) targets. The recognition mechanism was monitored using impedance
measurements, where it was verified a good interaction of the peptide DD K with the POPC
mimetic membrane. In addition, the interaction was affected by the presence of cholesterol,
thus revealing that the use of poly(4-ABA) platforms is very promising for the development
of biosensors.
Keywords: 4-aminobenzoic acid; electropolymerization; polymeric films; DNA; peptide;
impedance measurements.

iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema representativo de um biossensor. ............................................................... 4
Figura 2: Esquema representativo das quatro principais tcnicas de imobilizao de
biomolculas. (a) adsoro fsica, (b) ligao covalente, (c) ocluso, (d) ligao cruzada. ..... 10
Figura 3: Estrutura qumica do 4-ABA. .................................................................................. 12
Figura 4: Potenciostato/Galvanostato da AUTOLAB PGSTAT 128N, utilizado para as
medidas eletroqumicas. ........................................................................................................... 19
Figura 5: Clula eletroqumica utilizada nos experimentos de eletropolimerizao. ............. 20
Figura 6: Microscpio de Bancada da Hitachi High Technologies modelo TM-3000............ 20
Figura 7: Ultrapurificador de gua PURELAB Classic DI (ELGA) utilizado para
ultrapurificao da gua utilizada nos experimentos. ............................................................... 21
Figura 8: Representao esquemtica das etapas de preparao dos lipossomas. .................. 24
Figura 9: Procedimento de preparao dos eletrodos de grafite. ............................................ 25
Figura 10: VC do eletrodo de grafite no modificado em: (A) soluo K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6
5,00 mM contendo KCl 0,10 M e (B) soluo HClO4 0,50 M. = 100 mV/s. ....................... 32
Figura 11: VC em soluo 2,50 mM de 4-ABA sobre eletrodo de grafite. Eletrlito suporte:
HClO4 0,50 M. v = 50 mV/s. .................................................................................................... 34
Figura 12: VCs consecutivos do eletrodo de grafite em soluo de 0,50 M de cido
perclrico. Nmero de ciclos = 10; v = 50 mV/s. ..................................................................... 34
Figura 13: VCs consecutivos do eletrodo de grafite em soluo de 2,50 mM de 4-ABA.
Eletrlito suporte: HClO4 0,50 M. Nmero de ciclos = 100; v = 50 mV/s. Sendo: () 1o ciclo
de potencial. As setas indicam o sentido da corrente. .............................................................. 35
Figura 14: VC do eletrodo de Poli(4-ABA)/EG aps eletropolimerizao, somente em
soluo de HClO4 0,50 M, para a remoo do monmero residual. Sendo: () 1o ciclo de
potencial e (----) 2o ciclo de potencial. v = 100 mV/s. ............................................................. 37
Figura 15: VC obtido aps a eletropolimerizao, somente em soluo de cido perclrico

iv
0,50 M, na ausncia do monmero, para os eletrodos de grafite: (---) eletrodo no-modificado
e () modificado com poli(4-ABA). v = 100 mV/s. ............................................................... 37
Figura 16: VCs obtidos para medidas das propriedades de troca aninica dos eletrodos de
grafite em soluo aquosa de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,0 mM contendo KCl 0,10 M: (---)
eletrodo no-modificado e () modificado com poli(4-ABA). v = 100 mV/s. ....................... 38
Figura 17: VCs obtidos para medidas das propriedades de troca aninica dos eletrodos de
grafite em soluo de KCl 0,10 M: (---) EG e () poli(4-ABA)/EG. v = 100 mV/s. ............. 39
Figura 18: Cronoamperogramas obtidos para eletropolimerizao dos EG em soluo de 2,50
mM de 4-ABA. Eletrlito suporte: HClO4 0,50 M. Potenciais aplicados: () +0,95 V, ()
+1,05 V, () +1,15 V. Tempo: 4800 s. ..................................................................................... 41
Figura 19: Cronoamperogramas obtidos a partir da eletropolimerizao dos EG em soluo
de 2,50 mM de 4-ABA. Eletrlito suporte: HClO4 0,50 M. Potenciais aplicados: () +0,95 V,
() +1,05 V, () +1,15 V. Tempo: 2400 s. ............................................................................. 42
Figura 20: VCs dos eletrodos modificados em soluo de cido perclrico 0,50 M. Sendo:
() poli(4-ABA)/EG +0,95 V, () poli(4-ABA)/EG +1,05 V, () poli(4-ABA)/EG +1,15 V
e (---) EG. v = 100 mV/s. Onde (A) Tempo: 4800 s e (B) Tempo: 2400 s. .............................. 43
Figura 21: VCs obtidos para medidas das propriedades de troca aninica para os eletrodos de
grafite em soluo aquosa de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,0 mM contendo KCl 0,10 M. Sendo:
() poli(4-ABA)/EG +0,95 V, () poli(4-ABA)/EG +1,05 V, () poli(4-ABA)/EG +1,15 V
e (---) EG. v = 100 mV/s. Onde (A) Tempo: 4800 s e (B) Tempo: 2400 s. .............................. 44
Figura 22: Diagramas de Nyquist (A) e Bode (B) dos espectros de impedncia eletroqumica
do EG e poli(4-ABA)/EG, obtidos em soluo de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo
KCl 0,10 M. Sendo: () +0,95 V, () +1,05 V, () +1,15 V e () VC. Epa = 0,24 V;
Amplitude 10 mV; Intervalo de Frequncia: 106 a 10-2 Hz. As linhas slidas representam o
ajuste dos dados experimentais a um circuito equivalente. ...................................................... 47
Figura 23: Circuito equivalente proposto para a simulao dos dados experimentais das
medidas de EIE. ........................................................................................................................ 48
Figura 24: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V;
(C) +1,15 V e (D) VC. Ampliao de 100x. ............................................................................. 51
Figura 25: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V;
(C) +1,15 V e (D) VC. Ampliao de 200x. ............................................................................. 51

v
Figura 26: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V;
(C) +1,15 V e (D) VC. Ampliao de 500x. ............................................................................. 52
Figura 27: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V;
(C) +1,15 V e (D) VC. Ampliao de 1000x. ........................................................................... 52
Figura 28: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V;
(C) +1,15 V e (D) VC. Ampliao de 2000x. ........................................................................... 53
Figura 29: VPDs obtidos para a oxidao direta das bases adenina e guanina imobilizadas
sobre os Poli(4-ABA)/EG, obtidos em: () +0,95 V, () +1,05 V, () +1,15 V e () VC.
Tempo de deposio por CA: 4800 s. Nmero de ciclos: 100 ciclos. Eletrlito: tampo acetato
0,10 M em pH 4,50. .................................................................................................................. 55
Figura 30: VPDs obtidos para a oxidao direta das bases adenina e guanina imobilizadas
sobre os Poli(4-ABA)/EG, obtidos em: () +0,95 V, () +1,05 V, () +1,15 V. Tempo de
deposio por CA: 2400 s. Eletrlito: tampo acetato 0,10 M em pH 4,50. ............................ 56
Figura 31: VPDs obtidos para: (---) EG e () poli(4-ABA)/EG contendo 20 L de AM 5,0 x
10-4 M. Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso:
0,20 s; Altura do Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroAM = 5 minutos. .................. 59
Figura 32: VPDs obtidos para: () ssDNA e () dsDNA contendo 20 L de AM 5,0 x 10-4
M. Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso: 0,20 s;
Altura do Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroAM = 5 minutos. Eletrodos
modificados com poli(4-ABA) por VC (100 ciclos de varredura). .......................................... 60
Figura 33: VPDs obtidos para: (---) EG e () Poli(4-ABA)/EG contendo 20 L de BE 5,0 x
10-4 M. Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso:
0,20 s; Altura do Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroBE = 5 minutos.................... 62
Figura 34: VPDs obtidos para: () ssDNA e () dsDNA contendo 20 L de BE 5,0 x 10-4
M. Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso: 0,20 s;
Altura do Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroBE = 5 minutos. Eletrodos
modificados com poli(4-ABA) por VC. ................................................................................... 63
Figura 35: Diagramas de Nyquist () e Bode (+) dos espectros de impedncia eletroqumica
do poli(4-ABA)/EG, sendo (A) e (A1) obtidos em soluo de KCl 1,0 M e (B), (B1) obtidos
em soluo de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo KCl 1,0 M. Epa = 0,26 V; Amplitude
10 mV; Intervalo de Frequncia: 106 a 10-2 Hz. ....................................................................... 66

vi
Figura 36: Representao esquemtica do processo de imobilizao para os eletrodos
modificados com poli(4-ABA). Sendo (1) poli(4-ABA)/EG, (2) poli(4-ABA)/EG + Sonda, (3)
poli(4-ABA)/EG + Sonda + Alvo Especfico e (4) poli(4-ABA)/EG + Sonda + Alvo No
Especfico. ................................................................................................................................ 68
Figura 37: Diagramas de Nyquist (A) e Bode (B) dos espectros de impedncia eletroqumica
do Poli(4-ABA)/EG, obtidos em soluo de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo KCl
1,0 M. Sendo: () sonda, () sonda + alvo especfico e () sonda + alvo no especfico. Epa =
+0,26 V; Amplitude 10 mV; Intervalo de Frequncia: 106 a 10-2 Hz. ...................................... 69

vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Parmetros obtidos a partir dos resultados de simulao de EIE para os EG e poli(4ABA)/EG eletropolimerizados em funo da tcnica eletroqumica. ...................................... 49
Tabela 2: Valores de Ipa obtidos para deteco de guanina e adenina imobilizadas sobre
Poli(4-ABA)/EG, obtidos por VC e CA (4800 s). .................................................................... 55
Tabela 3: Valores de Ipa obtidos para deteco de guanina e adenina imobilizadas sobre
poli(4-ABA)/EG, obtidos por VC e CA (2400 s). .................................................................... 57

viii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4-ABA cido 4-aminobenzico
A adenina
AM azul de metileno
BE brometo de etdio
C capacitncia
CA cronoamperometria
CD dicrosmo circular, do ingls circular dichroism
Cdl capacitncia da dupla camada
CLAE cromatografia lquida de alta eficincia
DD K dermadistinctina K
DNA cido desoxirribonuclico
DPC dodecilfosfocolina, do ingls dodecylphosphocholine
dsDNA dupla fita de DNA (hbrido)
EA eletrodo auxiliar
EDX energia dispersiva de raios-X
EFC elemento de fase constante
EG eletrodo de grafite
Poli(4-ABA)/EG eletrodo de grafite modificado com filme polimrico de poli(4-ABA)
EIE - espectroscopia de impedncia eletroqumica
Ep potencial de pico
ER eletrodo de referncia
ET eletrodo de trabalho
Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonila
G guanina
Ip corrente de pico
ITC calorimetria de titulao isotrmica, do ingls isothermal titration calorimetry
LUVs vesculas grandes unilamelares, do ingls large unilamellar vesicles
MEV microscopia eletrnica de varredura
min minutos
mL mililitros
MLVs vesculas multi-lamelares, do ingls multi lamellar vesicles

ix
mV/s milivolts por segundo
OCP potencial de circuito aberto, do ingls open circuit potential
PABA cido para-aminobenzico
pb pares de base
PC polmeros condutores
PCR reao em cadeia da polimerase, do ingls polymerase chain reaction
Poli(4-ABA) polmero derivado do cido 4-aminobenzico
poliCT citosina e timina monofosfato
poliGA guanosina e adenosina monofosfato
poliGA:CT hibridao poliGA com poliCT
POPC 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilcolina
POPG 1-palmitoil-2-oleoil-fosfatidilglicerol
R resistncia
RMN ressonncia magntica nuclear
RNA cido ribonuclico
s segundos
SPFS sntese de peptdeos em fase slida
ssDNA simples fita de DNA
Tris tris-hidroxiaminometilmetano
IUPAC Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada, do ingls International Union of
Pure and Applied Chemistry
V - volts
VC voltametria cclica/voltamograma cclico
VPD voltametria de pulso diferencial/voltamograma de pulso diferencial
Z componente real de impedncia (resistiva)
Z componente imaginria de impedncia (capacitiva)
W impedncia de Warburg
- micro
velocidade de varredura

SUMRIO
RESUMO.................................................................................................................................... i
ABSTRACT .............................................................................................................................. ii
LISTA DE FIGURAS ..............................................................................................................iii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................. vii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...........................................................................viii
1. INTRODUO .................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 2
2.1. Objetivo geral ................................................................................................................... 2
2.2. Objetivos especficos........................................................................................................ 2
3. REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................ 4
3.1. Biossensores ..................................................................................................................... 4
3.1.1. Transdutores ............................................................................................................... 5
3.1.2. Receptores .................................................................................................................. 7
3.1.3. Tcnicas de imobilizao ........................................................................................... 7
3.2. Polmeros condutores aplicados em biossensores .......................................................... 10
3.3. cido 4-aminobenzico ................................................................................................. 12
3.4. Genossensores ................................................................................................................ 14
3.5. Biossensores micobiolgicos ......................................................................................... 15
4. METODOLOGIA ............................................................................................................... 19
4.1. Instrumentao e equipamentos ..................................................................................... 19
4.2. Preparo das solues ...................................................................................................... 21
4.3. Procedimento experimental ............................................................................................ 25
4.3.1. Preparao e construo dos eletrodos de trabalho ................................................. 25
4.3.2. Eletropolimerizao do 4-ABA ............................................................................... 26
4.3.3. Propriedades de troca inica do poli(4-ABA) ......................................................... 27
4.3.4. Medidas de espectroscopia de impedncia eletroqumica ....................................... 27
4.3.5. Medidas de microscopia eletrnica de varredura .................................................... 27
4.3.6. Imobilizao e deteco das bases pricas guanina e adenina ................................ 28
4.3.7. Procedimento de construo do genossensor ........................................................... 28
4.3.8. Procedimento de construo do biossensor microbiolgico .................................... 29
5. RESULTADOS E DISCUSSES ...................................................................................... 31
5.1. Condicionamento dos eletrodos de grafite ..................................................................... 31
5.2. Eletropolimerizao do 4-ABA por voltametria cclica ................................................. 33
5.2.1. Comportamento eletroqumico dos filmes de poli(4-ABA) .................................... 36

5.2.2. Propriedades de transferncia de carga dos filmes de poli(4-ABA) ........................ 38

5.3. Investigao da eletropolimerizao do 4-ABA por cronoamperometria ...................... 40
5.3.1. Eletropolimerizao do 4-ABA por cronoamperometria a 4800 segundos ............. 40
5.3.2. Eletropolimerizao do 4-ABA por cronoamperometria a 2400 segundos ............. 41
5.3.3. Avaliao das propriedades eletroqumicas dos filmes de poli(4-ABA) ................. 42
5.4. Medidas de espectroscopia de impedncia eletroqumica.............................................. 46
5.5. Anlises da microscopia eletrnica de varredura ........................................................... 50
5.6. Imobilizao e deteco de guanina e adenina ............................................................... 54
5.7. Aplicao das plataformas de poli(4-ABA) em genossensores ..................................... 57
5.7.1. Imobilizao e deteco de oligonucleotdeos sobre EG/4-ABA, utilizando-se azul
de metileno como indicador ............................................................................................... 58
5.7.2. Deteco de oligonucleotdeos utilizando-se brometo de etdio.............................. 61
5.8. Aplicao das plataformas de poli(4-ABA) em biossensores microbiolgicos ............. 64
5.8.1 Resposta da espectroscopia de impedncia eletroqumica em polmeros condutores
........................................................................................................................................... 64
5.8.2 Avaliao do poli(4-ABA) na imobilizao e deteco impedimtrica do peptdeo
dermadistinctina K (DD K)................................................................................................ 67
6. CONCLUSO E PERSPECTIVAS .................................................................................. 73
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ............................................................................. 75
APNDICE A.......................................................................................................................... 84
Tcnicas eletroanalticas ....................................................................................................... 84
Voltametria cclica ............................................................................................................. 85
Voltametria de pulso diferencial ........................................................................................ 87
Cronoamperometria ........................................................................................................... 87
Espectroscopia de impedncia eletroqumica .................................................................... 89
Microscopia eletrnica de varredura ..................................................................................... 90

1. INTRODUO
A busca por melhorias na qualidade de vida, seja na rea clnica ou de meio ambiente,
tem motivado pesquisadores em toda parte do mundo. O interesse no desenvolvimento e na
explorao de dispositivos analticos para a quantificao e deteco de espcies qumicas
conduziu ao surgimento dos biossensores, os quais podem monitorar analitos ligados sade,
alimentos e meio ambiente, contribuindo desta forma, para melhorar a qualidade de vida da
sociedade. Assim, os biossensores tm sido muito utilizados para aplicaes clnicas, dentre
outras, devido s diversas vantagens que estes dispositivos apresentam, como simplicidade de
manuseio, fcil confeco, rpida resposta, alm de possuir elevada sensibilidade e
especificidade, serem portteis e com potencial de aplicao para os mais diversos fins. Alm
disso, podem possibilitar o diagnstico de um paciente no prprio local de atendimento, pois
apresentam grande potencial para a miniaturizao do sistema sem a necessidade de utilizao
de equipamentos de grande porte.
Nos ltimos anos, o desenvolvimento de biossensores tem crescido rapidamente,
devido s vrias potencialidades apresentadas por estes dispositivos. Esta crescente
aplicabilidade est diretamente associada ao avano das pesquisas relacionadas ao estudo e
obteno de polmeros condutores. Assim, eletrodos quimicamente modificados com
polmeros condutores apresentam-se como uma alternativa para o monitoramento de vrias
substncias em tempo real. Sendo que, este desenvolvimento tecnolgico constitui um campo
bastante explorado atualmente.
Polmeros condutores funcionalizados permitem a modificao da superfcie de
eletrodos para diversas aplicaes, dentre elas, a incorporao de biomolculas. Eles tm
atrado muito interesse como matriz apropriada para biomolculas, fornecem boa deteco e
rpida resposta do sistema em estudo, tornando-o mais seletivo e sensvel o trasdutor, alm de
aumentar a eficincia da fixao e estabilizao das biomolculas. Alm disso, aumentam a
velocidade, sensibilidade e versatilidade dos biossensores em vrias aplicaes, como o
diagnstico de doenas e monitoramento ambiental. Devido a isto, filmes polmeros derivados
de monmeros funcinalizados, tm sido bastante explorados e utilizados na confeco de
diversos tipos de biossensores.
Os polmeros condutores so muito diversificados, porque podem ser formados por
alguns tipos de monmeros em superfcies de diferentes eletrodos, sendo ento utilizados para
a determinao de diversos analitos.

2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral

Eletropolimerizar filmes polimricos derivados do cido 4-aminobenzico (4-ABA),

sobre eletrodos de grafite e caracterizar o material formando por meio de tcnicas
eletroqumicas, para utilizao deste material como transdutor na construo de dispositivos
para deteco de bases nitrogenadas, oligonucleotdeos e peptdeos, os quais visam contribuir
para o desenvolvimento dos biossensores que possam ser utilizados na deteco em tempo
real, destes analitos.
2.2. Objetivos especficos
Eletropolimerizar o cido 4-aminobenzico sobre eletrodos de grafite utilizando-se as
tcnicas de voltametria cclica e cronoamperometria;
Comparar e caracterizar os filmes polimricos formados atravs das tcnicas de
voltametria cclica e cronoamperometria;
Analisar e investigar as propriedades eletroqumicas do poli(4-ABA) utilizando-se a
tcnica de espectroscopia de impedncia eletroqumica;
Otimizar os parmetros de eletropolimerizao;
Avaliar a estabilidade eletroqumica do poli(4-ABA);
Avaliar as propriedades de superfcie das plataformas desenvolvidas;
Caracterizar a morfologia dos eletrodos de grafite modificados pela tcnica de
microscopia eletrnica de varredura;
Avaliar as plataformas de poli(4-ABA) na imobilizao de biomolculas;
Avaliar a utilizao das plataformas funcionalizadas para imobilizao das bases
nitrogenadas adenina e guanina,
Avaliar a utilizao das plataformas funcionalizadas para imobilizao de
oligonucleotdeos;
Avaliar a resposta do genossensor com deteco direta e indireta, nesta ltima,
utilizando-se intercaladores eletroativos como o azul de metileno e o brometo de
etdio, para deteco e reconhecimento dos eventos de hibridizao dos
oligonucleotdeos;

Avaliar por espectroscopia de impedncia eletroqumica a utilizao da plataforma na

imobilizao de peptdeos e seu reconhecimento com alvos especficos e no
especficos;
Desenvolver um sistema de deteco eletroqumica de baixo custo, alta
reprodutibilidade e sensibilidade, rpida resposta de anlise, portabilidade e com boa
afinidade do componente biolgico com a plataforma de poli(4-ABA).

3. REVISO BIBLIOGRFICA
3.1. Biossensores

O desenvolvimento de sensores com caractersticas importantes como alta

sensibilidade, seletividade e estabilidade uma rea de grande crescimento e interesse dentro
da qumica analtica. Tal interesse deve-se possibilidade de aplicao destes em anlises dos
mais diversos tipos de amostras tais como ambiental, clnica e industrial1.
Na rea de bioanaltica, um dos desafios a deteco rpida e simultnea de vrios
compostos de diferentes fontes, a partir de amostras clnicas, alimentcias e ambientais2. Este
fato impulsiona cada vez mais, a busca por estudos mais elaborados visando facilitar
diagnsticos clnicos3. Uma forma de se alcanar um sensor com estas caractersticas a
modificao de eletrodos slidos, que permite o desenvolvimento dos mais variados tipos de
sensores1.
Segundo a Unio Internacional de Qumica Pura e Aplicada (IUPAC)4, um biossensor
um dispositivo que capaz de fornecer uma informao analtica especfica ou quantitativa
pelo uso de um elemento de reconhecimento biolgico (camada de reconhecimento) em
contato direto com o elemento de transduo5. Na Figura 1, apresentado o esquema
ilustrativo de um biossesnor.

Figura 1: Esquema representativo de um biossensor.

Assim, um biossensor combina a especificidade de um componente biolgico ativo

para o analito de interesse e a sensibilidade de um transdutor para converter o sinal biolgico
em um sinal quantificvel; por exemplo, um sinal eltrico, que proporcional concentrao
do analito em questo e mensurvel atravs de um sistema de deteco especfico6.
O uso do material biolgico adequado (receptor bioqumico) na construo de
biossensores para um determinado analito de interesse, resulta em sensores altamente
seletivos e sensveis e pode apresentar diversas vantagens em relao aos eletrodos
convencionais, tais como: aumento da sensibilidade, seletividade e estabilidade, diminuio
do limite de deteco do procedimento, baixo custo e facilidade na construo, resposta
rpida, potencial para miniaturizao e construo de equipamentos simples e portteis7.
Desde 1962, quando o primeiro biossensor foi construdo para a deteco de glicose8,
vrios pesquisadores de todo o mundo tem trabalhado nessa nova rea da cincia. O prprio
biossensor de glicose at hoje motivo de estudos9,10, com mais de 40 tipos de dispositivos no
mercado. Este fato mostra a evoluo dos sistemas e da constante busca por melhoria nas
deteces, no s nas reas mdicas, como o controle de diabete por monitoramento de
glicose e outras doenas, mas tambm no monitoramento e controle de frmacos, alimentos e
do meio ambiente. Dentre os diversos tipos de biossensores, o transdutor, o receptor (camada
de reconhecimento) e o modo de interao entre ambos so a chave para a construo destes
dispositivos11. Portanto, o transdutor e o receptor so as principais etapas do processo de
deteco em biossensores12.
3.1.1. Transdutores
A eletroqumica uma rea de grande interesse e tem sido muito utilizada como
sistema para a construo de biossensores, devido diversidade de tcnicas e materiais que
podem ser utilizados como transdutores, aliadas a facilidade de construo e de mensurao.
Eletrodos de diversos materiais tais como: platina, ouro, carbono grafite, carbono vtreo e
pasta de carbono, dentre outros so os mais utilizados na construo e desenvolvimento destes
dispositivos. Alm disso, os sistemas eletroqumicos podem ser miniaturizados, atravs da
utilizao

de

eletrodos

impressos

(screen-printed),

para

tornarem-se

utilizados

comercialmente, umz vez que estes sistemas apresentam baixo custo, fcil manuseio, alm da
mnima quantidade de amostra utilizvel, porm, mantendo a alta sensibilidade necessria11.
O transdutor pode variar em sua forma e funo, para adequar-se a medida de
interesse. O transdutor o elemento que recebe as perturbaes do processo biocataltico -

geradas pela interao receptor-analito e converte-as em um sinal mensurvel (fsico ou

qumico) que pode ser eletronicamente visualizado, amplificado e armazenado13. O tipo de
transduo de sinal est diretamente relacionado caracterstica fsica ou qumica do produto
gerado pelo componente biolgico14,15.
O sistema de transduo deve ser adequado ao sensor de acordo com a natureza da
interao bioqumica com as espcies de interesse16. Assim, de acordo com o princpio de
energia envolvida na transduo, os tipos de transdutores so classificados basicamente desta
forma: eletroqumicos, dentre eles os amperomtricos (que convertem o sinal biolgico em
corrente eltrica), os potenciomtricos (convertem o sinal biolgico em um potencial eltrico)
e os condutimtricos (que alteram a condutividade eltrica do substrato); impedimtricos
(quando se detecta a variao da impedncia no eletrodo); calorimtricos (alteram a entalpia
de reao do substrato); acsticos ou piezeltricos (relaciona a oscilao da frequncia de
cristais piezeltricos com variaes na massa); pticos (provocam um desvio no caminho
ptico ou variao de absorbncia relacionada com a presena do analito) e os termomtricos
(a deteco do analito gera uma variao de temperatura)3,17.
Os transdutores eletroqumicos se destacam na construo de biossensores18,19, pois os
transdutores amperomtricos e potenciomtricos apresentam maior sensibilidade, facilidade
de construo e estabilidade, alm disso, so relativamente simples e esto em um estgio
mais avanado de pesquisa em relao aos outros transdutores citados. Estes fatores somados
justificam a busca por biossensores versteis, de baixo custo e com uma seletividade
especfica a partir da utilizao de polmeros condutores como camada ativa3.
As deteces podem ser realizadas com base nas propriedades eletroqumicas das
biomolculas. A presena de grupamentos oxidveis nas estruturas biolgicas pode ser
detectada por medidas de corrente e carga. Estas podem ser oxidadas ou reduzidas utilizando
voltametrias de pulso, na qual uma faixa de potencial aplicada e a corrente medida
proporcionalmente concentrao do analito em questo20. Ento, conhecendo-se o sistema,
pode-se realizar uma amperometria, na qual h a aplicao de um potencial fixo e a medida de
corrente realizada diretamente em funo do tempo, esse tipo de biossensor um dos mais
encontrados e utilizados como transdutores eletroqumicos21. A presena de pares redox, ou
seja, substncias que apresentam simultaneamente potenciais de oxidao e reduo podem
ser trabalhadas por voltametria cclica, na qual, assim como nas voltametrias de pulso, uma
faixa de potencial aplicada, porm, como um ciclo, tanto andico quanto catdico. Isso
permite a avaliao das regies redox das biomolculas. Assim, aps este estudo,
reconhecendo o potencial redox da biomolcula, pode-se realizar uma voltametria de onda

quadrada. Nesta, o sinal de reduo invertido e somado ao de oxidao, ampliando o sinal e

possibilitando uma deteco mais sensvel. Biossensores voltamtricos tambm so comuns
na literatura22. Dentre os mtodos voltamtricos em eletroqumica, destacam-se a voltametria
cclica e voltametria de pulso diferencial. A primeira, dentre outras funes, utilizada para a
modificao dos eletrodos de trabalho com polmeros e sua caracterizao, enquanto que a
segunda utilizada na construo de sensores. As tcnicas citadas aqui esto descritas
detalhadamente no Apndice A.
3.1.2. Receptores
O receptor uma biomolcula ou um biocomponente, um elemento biologicamente
ativo que interage de forma especfica com o analito. Desta forma, considerado
biocomponente todo o elemento vivo ou derivado de um agente vivo capaz de ser imobilizado
em contato ntimo com a superfcie de um sensor, de forma a reconhecer determinada espcie
de interesse quantitativo, ou seja, o elemento de reconhecimento biolgico deve ser sensvel a
um analito de interesse. Essas biomolculas, as quais atuam como agentes de reconhecimento
podem ser tecidos, clulas, anticorpos, antgenos, enzimas, fragmentos de DNA, bicamadas
lipdicas, monocamadas fosfolipdicas e outras21.
Os biossensores podem ser divididos basicamente em duas classes: os catalticos, que
utilizam enzimas imobilizadas e os de afinidade, que utilizam anticorpos, DNA ou peptdeos,
como molculas de bioreconhecimento15.
A imobilizao das biomolculas a etapa mais importante na construo de um
biossensor, uma vez que a atividade do componente imobilizado deve ser mantida ao
maximo. Entende-se por imobilizao o mtodo pelo qual o componente biolgico liga-se ao
sensor, mantendo suas propriedades biolgicas naturais23. Para a realizao deste
procedimento existem algumas tcnicas de imobilizao, que esto descritas a seguir.
3.1.3. Tcnicas de imobilizao
A etapa mais importante para o desenvolvimento de um biossensor a imobilizao da
camada de reconhecimento ao transdutor. Em um biossensor a biomolcula incorporada
atribui um alto grau de seletividade, porm vulnervel a condies extremas do meio, tais
como temperatura, pH e fora inica24.
Desta forma, vrios mtodos de imobilizao de biomolculas tm sido usados para o

desenvolvimento de um biossensor, assim, existe uma grande variedade de procedimentos nos

quais as imobilizaes podem ocorrer. A imobilizao dos componentes de reconhecimento
sobre a superfcie modificada representa o fator determinante para o bom funcionamento do
biossensor25.

As tcnicas mais utilizadas para imobilizao e desenvolvimento de biossensores

especficos so classificadas em fsicas e qumicas, dentre as fsicas tm-se como exemplos a
adsoro fsica e a ocluso (entrapment). Dentre as qumicas tm-se as ligaes covalentes e
as ligaes cruzadas (cross-linking)12. Estas tcnicas esto descritas a seguir.
Adsoro fsica: esta tcnica retm a biomolcula que se deseja imobilizar nas
proximidades da superfcie do transdutor, atravs de interaes fsicas entre a
biomolcula e a matriz, que pode ser polimrica26. Essas interaes podem ser do tipo
Van der Waals ou eletrosttica, dipolo-dipolo ou por ligaes de hidrognio27 quando a
biomolcula interage com a matriz por meio de seus domnios hidrofbicos, ou ainda,
pode permanecer armadilhada aos poros da matriz polimrica. As vantagens da
imobilizao por adsoro que, no h a necessidade da presena de reagentes para a
imobilizao, alm disto, a matriz pode ser regenerada, j que no ocorre nenhuma
modificao do componente biolgico, que propicia a mxima reteno da atividade
biomolecular3. uma tcnica simples, rpida e de baixo custo, entretanto, apresenta
baixa estabilidade, as foras de ligao so susceptveis mudana de pH, temperatura
e fora inica do meio28,29.
Ocluso: esta tcnica utilizada quando o componente biolgico preparado em
conjunto com o produto de modificao da superfcie do eletrodo, deixando assim as
biomolculas aprisionadas. Um exemplo disso a preparao de filmes polimricos
em solues contendo biomolculas, onde estas ficam presas dentro da matriz do
polmero, durante a polimerizao. Na adio, o aprisionamento ocorre sem reao
qumica que possa afetar a atividade do material. A vantagem da polimerizao
eletroqumica que o filme pode ser preparado facilmente em um rpido
procedimento, alm da possibilidade de eletrogerar um polmero cobrindo parte da
superfcie de um eletrodo de geometria complexa, apresentando um baixo custo, alm
de ser um procedimento simples. Como desvantagem, esta tcnica apresenta uma alta
barreira de difuso e a perda da atividade biomolecular pela formao de radicais
livres3,29.

Ligao covalente: efetuada atravs da ligao entre grupos funcionais da molcula

biolgica de interesse, e uma matriz de suporte. Como matriz de suporte comum usar
filmes polimricos, os quais podem ser eletropolimerizados sob condies (solvente
orgnico, altos valores de potenciais para o processo de polimerizao) que
normalmente causariam danos s biomolculas. Alm disso, a ligao covalente entre
a biomolcula e o polmero funcionalizado pode ser feita em soluo tampo aquosa
contendo aditivos e estabilizadores, os quais preservam a atividade cataltica e,ou as
propriedades de reconhecimento das biomolculas. Esta tcnica apresenta como
vantagem a baixa resistncia difusional, ao passo que a desvantagem vem do fato de
que a matriz de suporte no regenervel, o que pode provocar a perda da
atividade3,29.
Ligao cruzada: baseia-se na imobilizao como resultado da reao do componente
biolgico com um agente bifuncional em que se formam as ligaes covalentes
intermoleculares. A escolha do agente de cross-linking feita, de acordo com os
grupos funcionais presentes na biomolcula sendo, no entanto, a escolha final
realizada de maneira emprica. Portanto, esta tcnica requer o uso de agentes
bifuncionais, tal como o glutaraldedo, que contm grupos reativos terminais
especficos que iro reagir com grupos funcionais como as aminas de algumas
biomolculas a imobilizar, ou agentes multifuncionais, como hexametileno diisocianato, para imobilizao da biomolcula em vrios tipos de suportes slidos30. Ao
usar esta tcnica necessrio que haja preocupao com a acessibilidade ao
componente bioativo. A vantagem de seu uso que a perda da atividade do
componente biolgico mnima, e o custo envolvido relativamente moderado. A
desvantagem deste procedimento a formao de barreiras de difuso, que pode
provocar tempos de resposta maiores para o biossensor3,31.
A resposta das biomolculas imobilizadas depende de alguns fatores como: rea
superficial, porosidade, carter hidroflico da matriz imobilizada, condies de reao e
metodologia escolhida para a imobilizao. As principais tcnicas de imobilizao esto

representadas esquematicamente na Figura 2.

10

Figura 2: Esquema representativo das quatro principais tcnicas de imobilizao de biomolculas. (a)
adsoro fsica, (b) ligao covalente, (c) ocluso, (d) ligao cruzada.

As tcnicas de imobilizao tm sido estudadas de diferentes maneiras na rea de

desenvolvimento dos biossensores. Quanto maior a facilidade do procedimento de
imobilizao, maior a chance de sucesso no funcionamento destes dispositivos. Uma
alternativa para a melhoria de uma tcnica de imobilizao a modificao da superfcie do
transdutor com polmeros condutores que apresentem em suas estruturas grupos funcionais
que possam interagir com grupos especficos das biomolculas. Nos ltimos anos, os
polmeros condutores tm atrado muito interesse como uma matriz apropriada das
biomolculas, pois a utilizao de superfcies funcionalizadas permite aumentar a velocidade,
sensibilidade e a versatilidade dos biossensores.
3.2. Polmeros condutores aplicados em biossensores
Polmeros so compostos com elevada massa molar, formados pela repetio de um
grande nmero de unidades qumicas, justificando a origem de sua nomenclatura (do grego
poli muitos; meros partes). A elevada massa molar caracteriza os polmeros como
macromolculas. Existem polmeros orgnicos e inorgnicos, sendo os primeiros os mais
estudados e mais importantes comercialmente. As substncias que do origem aos polmeros
por reao qumica (reao de polimerizao) so chamadas de monmeros (do grego mono

11

uma; meros parte). Os polmeros podem ser formados por apenas uma espcie de
monmero (homopolmeros) ou por espcies diferentes (copolmeros), e podem ser de origem
natural ou sinttica32.
Desde a dcada de 60, conhecido que molculas orgnicas que apresentam duplas
ligaes conjugadas podem exibir propriedades semicondutoras. Inicialmente, os polmeros
foram utilizados como isolantes eltricos at que, em 1977, Shirakawa e colaboradores33
demonstraram a existncia de propriedades semicondutoras e metlicas para o poliacetileno
dopado (intrinsecamente um isolante)1. A partir de ento uma nova classe de polmeros surgiu,
sendo chamados de polmeros condutores.
Os polmeros condutores apresentam um potencial tecnolgico muito amplo, pois
alm da condutividade eltrica, existem vrias outras propriedades, as quais viabilizam um
vasto campo de aplicaes para estes materiais34. Portanto, a utilizao de materiais
polimricos eletroativos para recobrir a superfcie de eletrodos foi um passo importante no
desenvolvimento de eletrodos modificados, devido s potenciais vantagens associadas a estes
materiais35.
A pesquisa na rea de polmeros condutores para aplicaes biomdicas teve uma
grande expanso com a descoberta nos anos 80, de que estes materiais so compatveis com
muitas molculas biolgicas36. Alm disso, os polmeros condutores apresentam vantagens
como baixo custo, so fceis de sintetizar e possuem propriedades bastante versteis. Quanto
sntese, ainda h uma vantagem adicional visto que podem ser precisamente sintetizados e
depositados na forma de filmes finos sobre a superfcie de um eletrodo, podendo estar
diretamente em contato com biomolculas37.
Levando em considerao todas as vantagens descritas acima, um dos grandes avanos
proporcionados pela descoberta dos polmeros condutores foi o aprimoramento dos
biossensores. Os polmeros condutores, por serem biocompatveis, auxiliam tanto na
imobilizao do elemento sensvel na superfcie do biossensor quanto na converso do sinal
biolgico em sinal eltrico, a partir das suas propriedades condutoras37. So utilizados
tambm, para aumentar a estabilidade, velocidade e sensibilidade em diversas aplicaes38,39.
Como apresentado na literatura, h diversas formas de imobilizao de biomolculas e
todas elas podem usar como suporte um polmero condutor, proporcionando boa faixa de
deteco e rpida resposta, j que a reao redox ocorre no interior da matriz do polmero38.
Ao mesmo tempo em que o polmero condutor atua como suporte para a imobilizao de
biomolculas, ele est atuando tambm como transdutor, auxiliando no transporte de cargas
eltricas39. Desta forma, a utilizao de polmeros condutores possibilita a criao de

12

biossensores simples, de rpida resposta, estveis, fceis de produzir, podem ser

miniaturizados e possuem grande potencial de aplicao j que os mais diversos
biocomponentes (clulas, protenas, enzimas, anticorpos e etc.) podem ser imobilizados junto
ao polmero para a deteco de analitos que variam desde a glicose at fragmentos de DNA17.
Os monmeros utilizados para a eletrossntese de polmeros condutores so
geralmente compostos aromticos. Isto devido facilidade com que esses compostos podem
ser oxidados a ctions-radicais relativamente estveis durante a eletropolimerizao40. Desta
forma,

filmes

polimricos

derivados

de

monmeros

aromticos

funcionalizados,

eletrodepositados em eletrodos condutores tm sido uma das principais atividades de pesquisa

na rea da eletroanaltica nos ltimos anos.
3.3. cido 4-aminobenzico
O monmero cido 4-aminobenzico (4-ABA), tambm conhecido como cido paraaminobenzico ou PABA, um composto com frmula molecular C7H7NO2. caracterizado
por tratar-se de um p cristalino de cor branca, inodoro e ligeiramente solvel em gua. O 4ABA um material eletroquimicamente ativo, a sua molcula consiste de um anel benzeno
ligado a dois grupos funcionais, uma amina (-NH2) e uma carboxila (-COOH), com valores de
pKa de 2,50 e 4,87. Sua estrutura qumica est representada na Figura 3.

Figura 3: Estrutura qumica do 4-ABA.

A utilizao do 4-ABA para o desenvolvimento deste estudo deve-se ao fato do

monmero possuir grupos funcionais que podem interagir com as biomolculas, formando
ligaes com estas, garantindo assim maior estabilidade para o componente biolgico
imobilizado, e consequentemente maior sensibilidade para o sistema em estudo. Geralmente
os grupos funcionais presentes no monmero so preservados aps a eletropolimerizao,

13

portanto, eletrodos modificados com estes filmes encontram-se funcionalizados e isso

favorece a interao com materiais biolgicos, o que justifica o interesse no estudo destes
materiais com aplicao na construo e desenvolvimento dos biossensores eletroqumicos.
Monmeros eletroquimicamente polimerizveis, apresentam potenciais de oxidao
relativamente baixos, suscetveis a reaes de substituio eletroflica28 e decrscimo no
potencial de oxidao no decorrer das reaes de acoplamento, o que favorece o crescimento
das cadeias17,41.
O 4-ABA um monmero pouco reportado na literatura, apesar disso, um
monmero que utilizado em diferentes aplicaes. Ele contm em sua estrutura o tomo de
N, rico em eltrons e alta densidade eletrnica do grupo carboxila, sendo fcil de ser
polimerizado em eletrodo de carbono vtreo pela tcnica de voltametria cclica. Jin e
colaboradores42 utilizaram eletrodo modificado com poli(4-ABA) para investigar um modelo
experimental de Parkinson em animais pela determinao sensvel de dopamina, atravs da
tcnica de cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE). Huang e colaboradores43
utilizando esse mesmo sistema desenvolveram um sensor eletroqumico conveniente e
sensvel, para a determinao do triptofano em amostras farmacuticas, enquanto que Liu e
colaboradores44 determinaram melanina em produtos lcteos. O teor de buformina
(medicamento que trata a diabetes) foi determinado em produtos farmacuticos,
comercialmente disponveis na forma de comprimidos, por Jin e colaboradores45.
Kotkar e Srivastava46 estudaram o comportamento voltamtrico do cido 4aminobenzico, sobre eletrodo de pasta de carbono, e em eletrodos modificados com
compostos macrocclicos. Enquanto que Silva e Pezza47 desenvolveram um mtodo analtico
para a determinao do cido 4-aminobenzico em formulaes farmacuticas via anlise por
injeo em fluxo com deteco espectrofotomtrica.
Yuzhong Zhang e colaboradores48 fabricaram um biossensor eletroqumico de DNA,
estvel e reprodutvel, para a deteco de DNA alvo. O 4-ABA foi eletropolimerizado sobre a
superfcie de um eletrodo de carbono vtreo modificado com nanotubos de carbono de paredes
mltiplas com grupos carboxila (MWCNTs) por voltametria cclica. Nanopartculas de ouro
(AuNPs) foram subsequentemente introduzidas na superfcie do filme composto de PABAMWNTs atravs da deposio eletroqumica, a voltametria de pulso diferencial foi utilizada
para monitorar o evento de hibridizao do DNA atravs da medida da adriamicina
intercalada.
Neste trabalho, avaliou-se a utilizao do 4-ABA para o desenvolvimento de
plataformas eletroqumicas para aplicao em dois tipos de biossensores: genossensores e

14

biossensores microbiolgicos. Para melhor compreenso do mecanismo de funcionamento

destes dispositivos, realizou-se uma abordagem mais especfica a qual ser descrita abaixo.
3.4. Genossensores

Existem vrios tipos de biossensores, um exemplo deles so os genossensores,

conhecidos como biossensores de DNA. Estes dispositivos altamente seletivos resultam das
propriedades especficas de interao das bases nitrogenadas presentes na molcula de DNA.
So constitudos de oligonucleotdeos, produtos de PCR (Polymerase Chain Reaction) ou
fragmentos de DNA imobilizados na superfcie de um transdutor49.
Os genossensores baseiam-se na imobilizao de fragmentos de DNA ou
oligonucleotdeos. Mtodos diretos e indiretos so usados para deteco da imobilizao de
sonda e alvo sobre a matriz. A chamada fita simples (ssDNA), aps interao com o alvo
complementar regenera a dupla fita (dsDNA), num processo denominado de hibridizao.
Este sinal pode ser detectado de forma direta, atravs da oxidao das bases nitrogenadas
presentes no DNA, ou de forma indireta, por meio de intercaladores/indicadores, como o azul
de metileno (AM) e o brometo de etdio (BE), dentre outros50,51.
possvel detectar significativamente os eventos de hibridizao atravs da deteco
indireta do AM e do BE. O AM interage atravs de interaes eletrostticas, intercalao
direta na dupla fita ou pelas ligaes preferenciais s bases nitrogenadas guanina livres
presentes na fita simples52,53. A utilizao do AM para detectar hibridizao do DNA
baseada na baixa afinidade do AM com a dsDNA quando comparada a ssDNA. Tem sido
demonstrado que o AM se liga especificamente a base purina guanina53,54. Desta forma, o
sinal de baixa intensidade de corrente que observado aps o evento de hibridizao,
devido baixa interao do AM com a dsDNA, devido formao do hbrido que diminui o
acesso de intercalao do AM s bases guanina. Por outro lado, o BE apresenta melhor
interao com a dupla fita do DNA (dsDNA). Isso se deve ao efeito intercalante do BE sobre
o DNA nativo11, ou seja, hibridizado, onde ele pode se acomodar mais facilmente entre os
pares de bases da estrutura, sendo deste modo promissor na deteco indireta.
Os genossensores podem detectar a presena de genes especficos ou genes mutantes
associados a doenas humanas hereditrias55. A identificao de genes associados com
doenas e com seus estgios so reas de pesquisa intensa na comunidade cientfica do
mundo, e esta atividade de extrema necessidade56. As diversas mutaes responsveis por
desordens herdadas so conhecidas e este conhecimento vem aumentando firmemente em

15

todo o mundo. Decifrar a estrutura, a organizao e a sequncia de molculas de cidos

nuclicos, como tambm, aplicaes importantes em diversos campos como diagnstico
clnico, pesquisas e desenvolvimento de novas drogas, terapia gnica, tecnologia de
alimentos, cincias ambientais, forensis, etc28. Alm disso, os biossensores de hibridizao de
DNA oferecem a promessa considervel para obter a informao sequncia-especfica de
forma mais rpida e barata, alm de um diagnstico simples de doenas genticas e
infecciosas, comparada aos ensaios tradicionais de hibridizao57, uma proposta oportuna,
interessante e atual28.
Diante deste contexto, genossensores tm sido muito utilizados na rea de
eletroanaltica para investigaes e diagnsticos genticos49, pois nos ltimos anos, o nmero
de doenas terminais cresceu muito, e h pouco sucesso na deteco nos estgios iniciais
destas doenas, sendo ento necessrio um diagnstico que possa detectar a doena em fase
precoce, para que esta apresente grandes possibilidades de cura. Diante disso, torna-se
interessante o surgimento de propostas de deteco, baseadas no desenvolvimento de novas
plataformas diagnsticas que tenham como caractersticas a especificidade, sensibilidade,
baixo custo e rapidez na anlise. Como os genossensores apresentam estas caractersticas, eles
podem atuar na deteco de vrias doenas. Portanto, prope-se a desenvolver plataformas
eletroqumicas para genossensores e atravs de estudos posteriores utilizar-se no futuro estes
dispositivos para aplicaes clnicas, como a deteco de doenas de forma rpida e precisa
pela imobilizao de sequencias genticas especificas.
3.5. Biossensores micobiolgicos
Peptdeos ou polipeptdeos so macromolculas constitudas por uma cadeia
(polmero) linear e especfica de mais de dez aminocidos. So membros de uma classe de
compostos ligados entre si por ligaes peptdicas, formando estruturas lineares, ramificadas
ou cclicas. Por exemplo, o glucagon e a insulina, dois hormnios, incluem-se nesta diviso.
As protenas tambm so chamadas de polipeptdeos, por que os aminocidos que as compe
so unidos por ligaes peptdicas, uma ligao peptdica a unio do grupo amino (-NH2) de
um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido, atravs da formao de
uma amida58.
Atualmente descrita uma grande variedade de organismos vivos capazes de produzir
molculas de peptdeos que atuam na primeira linha de suas defesas. Tais molculas podem
ser sintetizadas constantemente pelo organismo ou somente aps uma leso ou infeco,

16

tendo-se revelado responsveis pelo sistema imune inato com amplo espectro de atividade
biolgica. Embora o estudo seja relativamente recente, milhares destas molculas j foram
isoladas e tiveram suas atividades biolgicas comprovadas. Destas, a grande maioria
apresenta atividade antimicrobiana, de grande importncia no sistema de defesa do
organismo9.
Assim, a cincia moderna est procura de novos compostos antimicrobianos para
evitar infeces persistentes, porque quimioterapias clssicas tm sido ineficazes nessas
infeces. Substncias naturais de toxinas animais so o novo foco de estudo, como
potenciais peptdeos antimicrobianos. Muitos organismos empregam substncias qumicas
ativas como, por exemplo, aminas, derivados de esterides, alcalides e peptdeos para se
defender de predadores e de microrganismos patognicos. Dentre essas substncias qumicas,
destacam-se os peptdeos que podem ser encontrados em uma vasta variedade de organismos,
incluindo bactrias, fungos, plantas, insetos, peixes, anfbios, aracndeos e mamferos. A
grande maioria destes peptdeos apresenta propriedade antimicrobiana cujo mecanismo de
ao no depende da interao com um receptor especfico, tornando-os opes alternativas
aos antibiticos disponveis comercialmente. Entretanto, o mecanismo pelo qual peptdeos
exercem sua atividade antimicrobiana ainda no completamente definido, assim muitos
estudos so necessrios para uma maior compreenso do modo de ao destas molculas em
clulas bacterianas. Desta forma, vrios mecanismos tm sido propostos para descrever a
interao entre peptdeos e bicamadas lipdicas59.
Diferentemente dos mecanismos de ao de antibiticos clssicos, que se baseiam em
inibies enzimticas, sendo relativamente lentos, peptdeos antimicrobianos interagem na
superfcie de clulas bacterianas. Alguns estudos com anfbios demonstram que a secreo de
peptdeos antimicrobianos aumenta com a exposio destes animais a microrganismos e
patgenos, atuando como uma barreira inicial a estes organismos60.
O peptdeo antimicrobiano dermadistinctina K (DD K) isolado das glndulas da
espcie Phyllomedusa distincta, anuro encontrado na Floresta Atlntica61, pertencente classe
das dermaseptinas, que consistem em molculas catinicas de 28 a 34 resduos, capazes de
permeabilizar membranas bacterianas62.
Este peptdeo constitudo de 33 resduos de aminocidos, cuja sequncia descrita
como: GLWSK IKAAG KEAAK AAAKA AGKAA LNAVS EAV, apresentando baixa
atividade hemoltica62 e um amplo espectro de atividades contra alguns microorganismos
patognicos63. O DD K apresenta uma hlice anfiptica do resduo Lys-7 at a extremidade Cterminal, uma molcula de carter catinico e relativamente pequena64. O carter catinico

17

ocorre devido presena de excesso de resduos de lisina (K) que constituem o peptdeo.
Muitos modelos mostram que o carter catinico determinante para a atrao inicial de
peptdeos antimicrobianos superfcie das membranas de bactrias e de outros
microrganismos, os quais apresentam uma superfcie eletricamente negativa devido aos
grupamentos fosfato dos fosfolipdeos60.
O DD K um peptdeo -helicoidal que ataca a biomembrana de bactrias, em vez da
membrana da clula humana. O conhecimento do mecanismo de ao de peptdeos
importante para conceber uma nova gerao de antibiticos. Portanto, o interesse no estudo
das atividades antimicrobianas apresentadas por peptdeos isolados da secreo cutnea de
anuros surgiu aps o isolamento e a purificao do peptdeo bombinin, da r Bombina
variegata65. Desde ento, vrios peptdeos tm sido sequenciados e sintetizados59.
Desta forma, embora uma vasta diversidade de sequncias peptdicas tenha sido
identificada, as quais se diferem em composio de aminocidos, tamanho da cadeia e
estrutura, muitas destas molculas apresentam propriedades fsico-qumicas comuns, como a
tendncia de adotarem uma estrutura helicoidal anfiptica quando interagem com membranas
fosfolipdicas. Atualmente vrios modelos indicam que o mecanismo de ao de peptdeos
antimicrobianos ocorre pela combinao de efeitos hidrofbicos e eletrostticos. Estes
peptdeos carregados positivamente so atrados pela superfcie aninica das membranas
bacterianas, onde sofrem mudanas conformacionais adotando uma estrutura anfiptica60.
A anfipaticidade caracterizada pela separao de uma face hidrofbica e de uma
hidroflica, normalmente carregada positivamente, e ocorre em estruturas -helicoidais de
peptdeos antimicrobianos lineares. O carter anfiptico pode ser formado com uma sequncia
peridica de resduos polares e apolares em um intervalo entre trs a quatro resduos de
aminocidos. Dessa forma, as cadeias laterais polares e apolares dos resduos de aminocidos
posicionam-se adequadamente para uma separao em faces opostas.
Mesmo que o mecanismo pelo qual os peptdeos exercem sua atividade antimicrobiana
ainda no seja completamente definido, vrias propostas tm sido descritas para a interao
entre peptdeos e bicamadas lipdicas, que compem as paredes celulares bacterianas. A
bicamada um tipo de agregado que pode ser formado pela adio de fosfolipdeos em
soluo aquosa. Neste caso, duas camadas de fosfolipdeos unem-se formando uma bicamada
com superfcie superior e inferior hidroflicas e com o interior composto por uma poro
hidrofbica59.
Este tipo de agregado forma-se quando a seo transversal da poro hidroflica
similar da poro hidrofbica, como ocorre em molculas de 1-palmitoil-2-oleoil-

18

fosfatidilcolina (POPC). Entretanto, a regio hidrofbica permanece ainda em contato com a

gua e este tipo de agregado tende a se reorganizar rapidamente, formando estruturas
denominadas de vesculas ou lipossomas que possuem maiores estabilidades termodinmicas.
Nesta estruturao, as cadeias hidrofbicas dos fosfolipdeos encontram-se completamente
isoladas das molculas de gua, assim, a anfipaticidade de DD K favorece a interao com a
bicamada e, consequentemente, a dessolvatao da face hidrofbica, ou seja, resultando em
uma maior dessolvatao do sistema, permitindo sua insero na bicamada59.
Na literatura est reportado que as preferncias conformacionais de DD K foram
estudadas por espectroscopia de dicrosmo circular (CD) na presena de ambientes mimticos
de membranas, como lipossomas de palmitoiloleoil-fosfatidilcolina (POPC) e de palmitoiloleoil-fosfatidilglicerol (POPG). Os resultados mostraram que o DD K apresenta uma
estrutura randmica em meio aquoso, porm ao se associar membrana adota uma
conformao helicoidal. Assim, a estrutura tridimensional de DD K foi estudada na presena
de micelas de dodecifosfocolina (DPC) por espectroscopia bidimensional de ressonncia
magntica nuclear (RMN) em soluo. Os resultados mostraram uma conformao -hlice
anfiptica a partir do stimo resduo e que se estende at a regio C-terminal64. Atualmente,
uma variedade de tcnicas fsico-qumicas e biofsicas vem sendo desenvolvida e mesmo
adaptada para o estudo da interao destes meios mimticos de membranas bacterianas e
peptdeos antimicrobianos59.
Neste sentido, prope-se neste trabalho a imobilizao do peptdeo DD K sobre
plataformas funcionalizadas com poli(4-ABA), com deteco impedimtrica do alvo
complementar (POPC), bem como realizao de estudos para avaliar o efeito do colesterol na
interao do peptdeo DD K com membranas fosfolipdicas. Estes estudos contribuem ainda
para explicar a baixa atividade hemoltica do peptdeo, que em grande parte, se deve
presena do colesterol em clulas eucariotas, j em clulas bacterianas ele apresenta bons
resultados, o que significa que, posteriormente, possvel sua aplicao em frmacos.

19

4. METODOLOGIA
4.1. Instrumentao e equipamentos
Todas as medidas eletroqumicas foram realizadas em um Potenciostato/Galvanostato
da AUTOLAB modelo PGSTAT 128N (Eco Chemie, www.metrohm.com.br), apresentado na
Figura 4, acoplado a um computador contendo o software NOVA 1.9 e o mdulo FRA32M.

Figura 4: Potenciostato/Galvanostato da AUTOLAB PGSTAT 128N, utilizado para as medidas

eletroqumicas.

Os experimentos eletroqumicos para gerao e caracterizao dos filmes polimricos

(eletropolimerizao), foram conduzidos em uma clula eletroqumica com capacidade de
100,0 mL.
Os eletrodos foram inseridos na clula por entradas presentes em uma cobertura de
Teflon, conforme apresentado na Figura 5, enquanto que todos os experimentos de deteco
das biomolculas foram realizados em clula eletroqumica de um compartimento, com
capacidade total de 1,0 mL.
Os potenciais foram referidos a um eletrodo de Ag/AgCl (KCl 3,0 M). Como eletrodos
de trabalho foram utilizados discos de grafite com rea geomtrica de 29,7 mm 2 e como
eletrodo auxiliar foi usado placa de platina.

20

Figura 5: Clula eletroqumica utilizada nos experimentos de eletropolimerizao.

A anlise morfolgica da superfcie dos eletrodos, modificados com os filmes polimricos,

foi realizada atravs da tcnica de microscopia eletrnica de varredura (MEV) a partir de um
microscpio de bancada apresentado na Figura 6.

Figura 6: Microscpio de Bancada da Hitachi High Technologies modelo TM-3000.

A gua destilada foi ultrapurificada atravs do Ultrapurificador de gua PURELAB

Classic DI (ELGA), conforme mostrado na Figura 7.

21

Figura 7: Ultrapurificador de gua PURELAB Classic DI (ELGA) utilizado para ultrapurificao da

gua utilizada nos experimentos.

4.2. Preparo das solues

Na realizao dos trabalhos experimentais, os reagentes empregados foram de grau
analtico e as solues aquosas foram preparadas utilizando-se gua deionizada.
Todas as solues utilizadas no procedimento de eletropolimerizao, bem como as de
anlise de caracterizao e deteco, foram preparadas imediatamente antes de cada
procedimento, e desoxigenadas com N2 por cerca de 20 minutos, antes do uso.
Segue-se descrito abaixo, o procedimento de preparo para cada soluo utilizada.
Soluo de cido Perclrico (0,50 M): pipetou-se 43,20 mL de cido perclrico (HClO4)
concentrado (Vetec, 70%), transferiu-se o volume para um balo volumtrico de 1,0 L e
aferiu-se o menisco com gua deionizada.

Soluo de Ferro/Ferricianeto de Potssio (5,00 mM; contendo 0,10 M de KCl): pesou-se

0,1646 g de ferricianeto de potssio [K3Fe(CN)6] (Sigma-Aldrich, 99%); 0,2112 g de
ferrocianeto de potssio triidratado [K4Fe(CN)6.3H2O] (Sigma-Aldrich, 99%) e 0,7455 g de
cloreto de potssio (KCl) (Vetec, 99%), As massas foram transferidas para um balo
volumtrico de 100,0 mL e o volume completado com gua deionizada.

22

Soluo de 4-ABA (2,50 mM): pesou-se 0,0346 g de cido 4-aminobenzico (4-ABA) (Alfa
Aesar, 99%), transferiu-se para um balo de 100,0 mL e o volume foi ajustado com soluo
aquosa de cido perclrico (HClO4) 0,50 M.

Soluo de NaOH (0,10 M): pesou-se 0,4000 g de hidrxido de sdio (NaOH) (Vetec, 99%),
transferiu-se a massa para um balo volumtrico de 100,0 mL, sendo o volume completado
com gua deionizada.
Soluo de Guanina e Adenina (20 mM): pesou-se 0,00302 g de guanina (C5H5N5O)
(Sigma-Aldrich, 99%) juntamente com 0,00270 g de adenina (C5H5N5) (Sigma-Aldrich, 99%)
e transferiu-se para um eppendorf, sendo o volume ajustado para 1,0 mL com soluo aquosa
de NaOH 0,10 M.

Soluo Tampo Acetato (0,10 M; pH 4,50): pipetou-se 2,860 mL de cido actico (C2H4O2)
(Vetec, 99%) e pesou-se 6,804 g de acetato de sdio triidratado (CH3COONa.3H2O) (Isofar,
99%). Os reagentes foram transferidos para um balo volumtrico de 500,00 mL e o volume
ajustado com gua deionizada. Antes de completar o volume desejado, o pH da soluo foi
ajustado para 4,50 com soluo de HCl ou NaOH 0,10 M.

Soluo Tampo Fosfato (0,10 M; pH 7,40): pesou-se 13,40 g de fosfato de sdio dibsico
(Na2HPO4) (Reagen, 99%) e 5,99 g de fosfato de sdio monobsico (NaH2PO4) (Vetec, 99%).
As massas foram transferidas para um balo volumtrico de 500,0 mL e o volume ajustado
com gua deionizada. Antes de completar o volume desejado, o pH da soluo foi ajustado
para 7,40 com soluo de NaOH 0,10 M.

Soluo Tampo Tris-HCl (0,10 M; pH 8,0): pesou-se 1,2120 g de Tris-HCl (Tris Buffer
AR) e transferiu-se para um balo de 100,0 mL, sendo o volume completado com gua
deionizada. Antes de completar o volume desejado, o pH da soluo foi ajustado para 8,00
com soluo de HCl 0,10 M.
Soluo PoliGA (63,0 M): os oligonucleotdeos sintticos de poliGA foram obtidos como
p liofilizados da Invitrogen, contendo a seguinte sequncia com 16 pares de base: 5GGGGGGGGAAAAAAAA-3. De acordo com o nmero de mols rotulado no frasco, o

23

volume foi ajustado com soluo tampo Fosfato 0,10 M, pH 7,40 at a concentrao
desejada. Esta soluo foi denominada como sonda.
Soluo PoliCT (126,0 M): os oligonucleotdeos sintticos de poliCT foram obtidos como
p liofilizados da Invitrogen, contendo a seguinte sequncia com 16 pares de base: 5CCCCCCCCTTTTTTTT-3. De acordo com o nmero de mols rotulado no frasco, o volume
foi ajustado com soluo tampo Fosfato 0,10 M, pH 7,40 at a concentrao desejada. Esta
soluo foi denominada como alvo, sendo sua concentrao 2x maior do que a concentrao
da sonda para garantir total hibridizao com a sonda.
Soluo de Azul de Metileno (5,00 x 10-4 M, contendo 20 mM de NaCl): pesou-se 0,0019 g
de azul de metileno (C16H18N3ClS) (Vetec, 98-103%); 0,0117 g de cloreto de sdio (NaCl)
(Vetec, 99%). As massas foram transferidas para um balo volumtrico de 10,0 mL e o
volume completado com gua deionizada.
Soluo de Brometo de Etdio (5,00 x 10-4 M, contendo 20 mM de NaCl): pesou-se 0,0020 g
de brometo de etdio (C21H20BrN3) (Vetec, 97%); 0,0117 g de cloreto de sdio (NaCl) (Vetec,
99%). As massas foram transferidas para um balo volumtrico de 10,0 mL e o volume
completado com gua deionizada.
Soluo de Peptdeo DD K (6,03 x 10-4 M): pesou-se 0,0190 g da amostra de peptdeo
dermadistinctina K (DD K) sintetizado e transferiu-se para um tubo de plstico, sendo o
volume ajustado para 1,0 mL com soluo tampo Tris-HCl 0,10 M, pH 8,0. Esta soluo foi
denominada como sonda.
Soluo Fosfolipdica de POPC (2,04 x 10-2 M) Obteno de lipossomas: Os lipossomas
fluidos foram preparados a partir de 1-palmitoil-2-oleil-fosfatidilcolina (POPC) em soluo
tampo. Para a realizao deste procedimento, pesou-se 0,0155 g de fosfolipdeo POPC,
transferiu-se para um tubo de plstico e solubilizou-se em 1 mL de clorofrmio (Vetec, 99%).
Colocou-se a soluo em um evaporador rotatrio (RPM Fisatom) at a completa secagem do
clorofrmio a uma temperatura de 60 C. Em seguida, o volume foi ajustado para 1,0 mL com
soluo tampo Tris-HCl 0,10 M, pH 8,0; a soluo foi colocada em um agitador magntico,
em seguida em um ultrassom (Unique) por 5 minutos para a completa solubilizao da
amostra, repetiu-se esta ltima parte 3 vezes. Esta soluo foi denominada como alvo

24

especfico.
Soluo Fosfolipdica de POPC (2,04 x 10-2 M) + Colesterol 43% - Obteno de
lipossomas: Em uma primeira etapa, um filme lipdico foi preparado por meio da
solubilizao dos lipdeos em clorofrmio e evaporao do solvente orgnico a 60 C, com
auxlio de um evaporador rotatrio, este procedimento est descrito acima. O lipossoma
contendo colesterol 43% em mol foi preparado adicionando-se 0,0155 g de colesterol durante
a solubilizao do fosfolipdeo em clorofrmio. O filme lipdico (bicamada lipdica) foi ento
hidratado com soluo tampo Tris-HCl 0,10 M, pH 8,0; utilizando-se um evaporador
rotatrio (RPM Fisatom) at a completa secagem do clorofrmio, para a formao de
vesculas multilamelares (MLVs) a partir das quais foram obtidas vesculas unilamelares
grandes (LUVs), por ultrasonicao de MLVs com o auxlio de um ultrassom do tipo sonda
(Unique). Esta soluo foi denominada como alvo no especfico.
A Figura 8 apresenta uma representao esquemtica das etapas de preparao dos
lipossomas descritos acima.

Figura 8: Representao esquemtica das etapas de preparao dos lipossomas.

25

4.3. Procedimento experimental

4.3.1. Preparao e construo dos eletrodos de trabalho
A Figura 9 apresenta as imagens das etapas de preparao dos eletrodos de grafite a
serem utilizados na eletropolimerizao do 4-ABA.

Figura 9: Procedimento de preparao dos eletrodos de grafite.

Inicialmente, barras de grafite (100 x 0,6 mm) (A), obtidas da Alfa Aesar (99,9999%),
foram cortadas em tamanhos menores para a construo dos eletrodos (B), neste processo
utilizou-se micro retfica e a espessura do grafite obtida foi de 1-2 mm (C).
Em seguida, o grafite foi colado sobre bases de lato revestidas de teflon (D-F), neste
processo utilizou-se cola de prata (CW2460) para diminuir a resistncia entre o grafite e o
lato (G). Aps o perodo de 1 hora utilizou-se cola Araldite 90 minutos para preencher os
espaos vazios entre o grafite e o teflon, isolando assim o lato e a cola de prata para evitar
possveis interferncias dos mesmos (H).

26

Posteriormente, os eletrodos foram lixados em lixa dgua MIRKA nmeros 200,

1500 e 2000 sucessivamente, para a remoo do excesso de Araldite e garantir o polimento
da superfcie do eletrodo (I-J).
Assim, o polimento final foi realizado com suspenso aquosa de alumina 0,30 m
(Micropolish A, Buehler), ento o eletrodo foi limpo em gua sob banho de ultrassom
(Unique) por 10 minutos, enxaguado com gua destilada em abundncia e seco com N2 ultra
puro.
Por fim, estes eletrodos de grafite foram conectados ao suporte de base condutor (KL), para utilizao e aps as medidas, os mesmos eram desmontados da base de teflon, e o
processo de preparo dos mesmos era reiniciado para o preparo de novos eletrodos.
4.3.2. Eletropolimerizao do 4-ABA
Antes do procedimento de eletropolimerizao do 4-ABA, os eletrodos de grafite
foram analisados em soluo de cido perclrico e em soluo de ferrocianeto/ferricianeto de
potssio, com o objetivo de verificar a eletroatividade dos mesmos. Neste procedimento os
eletrodos de grafite foram ciclados, sucessivamente com 3 ciclos de potencial, na faixa de
potencial de +0,00 a +1,20 V em soluo de HClO4.
Posteriormente, os eletrodos foram lavados com gua deionizada, secos sob fluxo de
N2 e analisados em soluo de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6, numa faixa de potencial de 0,25 a
+0,80 V. Os voltamogramas cclicos foram registrados para posterior anlise.
A eletropolimerizao foi realizada atravs das tcnicas eletroqumicas de voltametria
cclica e cronoamperometria. Utilizando-se a tcnica de voltametria cclica foram realizados
100 ciclos de potencial com velocidade de varredura de 50 mV/s, na faixa de potencial de
+0,00 a +1,20 V. Na cronoamperometria, os eletrodos foram modificados em trs potenciais
constantes: 0,95 V; 1,05 V e 1,15 V, utilizando-se os tempos de polimerizao de 4800
segundos e 2400 segundos.
A soluo monomrica de 4-ABA na concentrao de 2,50 mM em soluo aquosa de
HClO4 0,50 M. Aps a eletropolimerizao, os eletrodos contendo os filmes polimricos de
poli(4-ABA), foram lavados com gua deionizada em abundncia e secos sob fluxo de N2.
Posteriormente, os eletrodos modificados foram analisados em soluo contendo
somente o eletrlito suporte (HClO4 0,50 M) para verificao da adsoro do polmero, bem
como sua atividade eletroqumica, e 5 ciclos de potencial foram realizados na mesma faixa de
eletropolimerizao, para a remoo do monmero residual.

27

Anlises para investigar o comportamento eletroqumico do eletrodo de grafite

modificado

com

poli(4-ABA)

tambm

foram

conduzidas

em

soluo

de

K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6, na faixa de potencial de 0,25 a +0,80 V e em soluo de HClO4 na

faixa de +0,00 a +0,80 V.

4.3.3. Propriedades de troca inica do poli(4-ABA)

As propriedades de troca inica para os eletrodos de grafite (EG) e para os eletrodos

de grafite modificados com 4-ABA [Poli(4-ABA)/EG] foram investigadas pelo estudo da
reao de transferncia eletrnica na superfcie dos eletrodos modificadas, utilizando-se o par
redox denominado ferrocianeto/ferricianeto de potssio.
Medidas por voltametria cclica foram conduzidas em soluo aquosa 5,0 mM de
K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6], contendo KCl 0,10 M, na faixa de potencial de -0,25 a +0,80 V.
Estudos tambm foram conduzidos somente em soluo do eletrlito suporte (KCl 0,10 M),
na mesma regio de potencial utilizada na investigao do par redox, a fim de verificar a
contribuio da eletroatividade do filme polimrico no processo de transferncia eletrnica do
par redox utilizado.
4.3.4. Medidas de espectroscopia de impedncia eletroqumica
Os espectros de impedncia eletroqumica dos eletrodos de grafite modificados com
poli(4-ABA), e posteriormente imobilizados com oligonucleotdeos, bem como com os
peptdeos foram obtidos em soluo aquosa 5,0 mM de K4[Fe(CN)6]/K3[Fe(CN)6] contendo
KCl 0,1 M. A soluo de anlise foi desoxigenada com nitrognio ultra puro por cerca de 30
minutos. O intervalo de frequncia investigado foi de 106 a 10-2 Hz.
A amplitude de excitao senoidal foi de 10 mV, tendo o potencial de circuito aberto
(OCP) aplicado de +0,24 V, a fim de se investigar e analisar as propriedades eltricas
superficiais dos eletrodos.
O ajuste dos resultados experimentais a um circuito equivalente apropriado, quando
necessrio, foi realizado com software provido pelo equipamento.
4.3.5. Medidas de microscopia eletrnica de varredura
A morfologia dos filmes de poli(4-ABA) foi avaliada a partir de imagens obtidas pela

28

tcnica de Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) utilizando-se um Microscpio de

Bancada da Hitachi High Technologies, modelo TM-3000. As amostras foram submetidas a
ampliaes variadas e anlises da rugosidade dos filmes bem como de suas principais
caractersticas foram processadas e analisadas atravs dos softwares providos pelo
equipamento.
4.3.6. Imobilizao e deteco das bases pricas guanina e adenina

Antes da realizao do procedimento de imobilizao e deteco das biomolculas,

registros da linha base foram obtidos em soluo tampo acetato at estabilizao da mesma
para os eletrodos modificados. Para este procedimento, utilizou-se a tcnica de voltametria de
pulso diferencial (VPD), sendo realizados 15 voltamogramas. Aps o procedimento, o
eletrodo foi retirado da soluo tampo e seco imediatamente com fluxo de N2.
A imobilizao das bases pricas foi realizada por adsoro da soluo contendo
Guanina e Adenina 20 mM, diretamente sobre esta superfcie. Utilizou-se cerca de 20 L da
soluo de Guanina e Adenina (soluo contendo as duas bases), sendo este volume suficiente
para cobrir toda a rea do eletrodo de trabalho. Aps este procedimento, o eletrodo foi
mantido por 20 minutos em um dessecador. Aps este perodo o eletrodo foi lavado em
soluo de tampo acetato por 6 segundos sob agitao constante, para a remoo de
adsores no especficas e seco com N2.
Medidas de deteco direta da oxidao das bases Guanina e Adenina foram realizadas
em tampo acetato pH 4,50 na faixa de potencial de +0,00 a +1,40 V, utilizando-se VPD. Os
parmetros de VPD utilizados foram: amplitude: 25 mV; perodo do pulso: 0,20 s; velocidade
de varredura: 20 mV/s.
4.3.7. Procedimento de construo do genossensor
Antes do procedimento de imobilizao das biomolculas obteve-se a linha base do
sistema contendo apenas os Poli(4-ABA)/EG, para isso os eletrodos de Poli(4-ABA)/EG
foram colocados em contato com a soluo tampo fosfato por cerca de 20 minutos. Este
procedimento garante maior estabilizao da linha base para as medidas, devido
estabilizao do filme polimrico neste meio. Posteriormente, registros da linha base foram
obtidos at estabilizao da mesma, utilizando-se VPD, para isso foram utilizados cerca de 15
voltamogramas. Aps o procedimento, o eletrodo foi retirado da soluo tampo e seco

29

imediatamente com fluxo de N2 ultra puro.

A imobilizao da sonda (poliGA) foi realizada por adsoro de 20 L da soluo de
poliGA diretamente sobre a superfcie do eletrodo, sendo este volume suficiente para cobrir a
rea do eletrodo de trabalho. O eletrodo foi mantido em uma estufa a 42 C at a evaporao
da soluo de poliGA, cerca de 20 minutos. Aps este perodo o eletrodo foi lavado em
soluo tampo fosfato por 6 segundos, sob agitao constante, para remoo de adsores
no especficas e seco com N2 ultra puro.
O procedimento de hibridizao foi realizado adicionando-se a soluo alvo (20 L de
poliCT), sobre a superfcie do eletrodo j contendo a sonda (poliGA), mantendo-se o eletrodo
a 42 C por 20 minutos. Novamente realizou-se a lavagem em tampo fosfato por 6 segundos,
e posterior secagem com N2.
Quando utilizados os intercaladores, AM ou BE, 20 L da soluo deste, foram
colocados em contato com a superfcie dos eletrodos ssDNA/Poli(4-ABA)/EG e
dsDNA/Poli(4-ABA)/EG por 5 minutos, sendo ento lavados em tampo fosfato por 6
segundos, e secos com N2. A deteco indireta do evento de hibridizao foi ento conduzida
pelo monitoramento da eletroatividade do intercalador. Para o AM utilizou-se a reduo na
faixa de potencial de +0,40 a -0,80 V e para o BE a oxidao na faixa de potencial de +0,30 a
+0,90 V. Os parmetros de VPD utilizados para ambos os intercaladores foram: amplitude: 25
mV; perodo do pulso: 0,20 s; altura do pulso: 0,06 s; velocidade de varredura: 20 mV/s.
4.3.8. Procedimento de construo do biossensor microbiolgico
Para os estudos de molculas biolgicas como os peptdeos, necessrio sintetiz-las,
j que boa parte das suas fontes naturais apresenta baixa concentrao destes compostos,
dificultando o isolamento em quantidades suficientes para anlises.
A amostra do peptdeo DD K foi sintetizada manualmente em fase slida no
laboratrio LASEB/UFVJM, de acordo com a metodologia padro de sntese de peptdeo em
fase slida (SPFS), via estratgia Fmoc66. Empregou-se a resina Tenta Gel-SRAM (Iris
Biotech, Marktredwitz, Alemanha) com grau de substituio 0,27 mmol/g, fornecendo o
peptdeo amidado como produto final. Neste trabalho, foi estudado o peptdeo antimicrobiano
dermadistinctina K (DD K) isolado previamente da pele do anfbio Phyllomedusa distincta62.

O efeito do colesterol na interao do peptdeo sinttico DD K com lipossoma de 1-palmitoil2-oleil-fosfatidilcolina (POPC) foi investigado.

30

4.3.8.1. Imobilizao e deteco das biomolculas

A estabilizao dos eletrodos na soluo de medida foi realizada com o mesmo

procedimento utilizado na imobilizao dos oligonucleotdeos. Porm, nos ensaios de
imobilizao e deteco do biossensor foi utilizado o tampo tris-HCl pH 8,0.
Depois de registrados os VPDs da estabilizao da linha base dos Poli(4-ABA)/EG, a
sonda (peptdeo DD K) foi imobilizada sobre a superfcie funcionalizada. Para este
procedimento, 20 L da soluo de peptdeo DD K foram colocados sobre a superfcie do
eletrodo, e o mesmo foi mantido temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, o
eletrodo foi lavado em soluo tampo tris-HCl por 6 segundos e seco com N2.
Posteriormente, realizou-se a imobilizao do alvo especfico (fosfolipdeo POPC) e
do alvo no especfico (fosfolipdeo POPC + colesterol 43%), onde 20 L de cada soluo
foram adicionados sobre a superfcie do eletrodo contendo a sonda por um perodo de 20
minutos temperatura ambiente. Os biossensores foram lavados por 6 segundos em soluo
tampo tris-HCl e secos com N2 ultra puro.
Medidas de EIE foram realizadas para deteco da superfcie dos eletrodos contendo a
sonda, sonda/alvo especfico e sonda/alvo no especfico. Os parmetros experimentais
utilizados foram os mesmos utilizados nas medidas de EIE para o Poli(4-ABA)/EG, descrita
no item 4.3.4.

31

5. RESULTADOS E DISCUSSES
Filmes

polimricos

derivados

do

cido

4-aminobenzico

(4-ABA)

foram

eletropolimerizados sobre eletrodos de grafite, sendo investidos juntamente com sua

utilizao no estudo de imobilizaes de bases nitrogenadas de DNA, oligonucleotdeos e
peptdeos. Estes filmes apresentaram estabilidade e interaes com os materiais biolgicos
utilizados. Alm disso, o poli(4-ABA) mostrou-se como um polmero de grande possibilidade
e potencial para ser utilizado como matriz pra a construo de biossensores.
As tcnicas utilizadas neste trabalho para a obteno dos filmes polimricos foram
eletroqumicas, conduzidas em meio aquoso. Para a anlise e caracterizao dos eletrodos
modificados, e avaliao dos biossensores, foram utilizadas tcnicas como: voltametria cclica
(VC), cronoamperometria (CA), voltametria de pulso diferencial (VPD) e espectroscopia de
impedncia eletroqumica (EIE).

Anlises

complementares

foram

realizadas

com

o intuito de caracterizar

morfologicamente o polmero depositado sobre o eletrodo, utilizando-se a microscopia

eletrnica de varredura (MEV).
Todos os resultados obtidos encontram-se descritos e discutidos a seguir.
5.1. Condicionamento dos eletrodos de grafite
As condies experimentais necessrias para se obter resultados confiveis dependem
da reprodutibilidade dos sistemas. Para isso, os eletrodos de grafite devem apresentar
respostas semelhantes para serem utilizados nos experimentos, bem como para efeitos de
comparao nos estudos de anlise qumica e reprodutibilidade.
Desta forma, antes do procedimento de eletropolimerizao, os eletrodos de grafite
foram selecionados e condicionados para o uso. No parmetro referido como seleo, os
eletrodos de grafite foram avaliados utilizando-se soluo aquosa do par redox
K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,0 mM contendo KCl 0,10 M como eletrlito suporte. A escolha deste
par redox se deve ao fato do mesmo apresentar comportamento eletroqumico muito bem
conhecido e definido, sendo considerado, portanto como um padro eletroqumico67. Os perfis
dos

voltamogramas

cclicos

padro,

para

eletropolimerizao, so mostrados na Figura 10A.

os

eletrodos

serem

utilizados

na

32

800

0.28 V

600

Corrente / A

400
200
0
-200
-400
-600
0.16 V

-800
-0.3

0.0

0.3

0.6

0.9

Potencial / V

600

500

Corrente / A

400
300
200
100
0
-100
-200
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Potencial / V

Figura 10: VC do eletrodo de grafite no modificado em: (A) soluo K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00
mM contendo KCl 0,10 M e (B) soluo HClO4 0,50 M. = 100 mV/s.

As medidas realizadas em soluo contendo o par redox ferrocianeto/ferricianeto de

potssio foram utilizadas como um indicativo da qualidade de resposta eletroqumica do
eletrodo. Na Figura 10A pode-se observar que o eletrodo de grafite mostra um
comportamento padro (E = 120 mV) para o par redox. As reas eletroquimicamente ativas
dos eletrodos de grafite so os parmetros analisados j que a concentrao das espcies em
soluo, seus coeficientes de difuso e a velocidade de varredura no se alteram ao se medir
um eletrodo contra o outro. A diferena de potencial entre os picos andico e catdico,
prxima de 100 mV, e razo das correntes de pico andica e catdica (Ipa/Ipc) prxima do
valor unitrio, permitem dizer que os eletrodos apresentam reprodutibilidade da superfcie

33

para realizao dos experimentos eletroqumicos.

Aps este procedimento, os eletrodos tambm foram avaliados em soluo do
eletrlito suporte. A medida realizada em cido perclrico permite observar a presena ou
ausncia de interferentes eletroativos na superfcie do eletrodo, na faixa de estudo utilizada
para a eletropolimerizao. Portanto, os eletrodos foram submetidos a sucessivos ciclos de
varredura de potencial (cerca de 3 ciclos) na regio de +0,00 a +1,20 V em soluo de HClO4,
o que tambm pode garantir uma limpeza eletroqumica na superfcie do eletrodo, para
melhor utilizao no processo de eletropolimerizao. O perfil desejado e que foi utilizado em
todos os estudos reportados neste trabalho apresentado na Figura 10B, onde tomou-se como
referncia, a utilizao de eletrodos que apresentavam valores de corrente inferiores a 50 A,
obtidos na faixa de +0,00 a +1,00 V, e valores mximos de corrente em 520 A para os
potenciais acima de +1,00 V.
Desta forma, quando os eletrodos consentiam aos critrios descritos acima, estes eram
utilizados para o procedimento de eletropolimerizao. Aqueles eletrodos que no satisfaziam
qualquer uma das condies acima eram descartados e desmontados.
5.2. Eletropolimerizao do 4-ABA por voltametria cclica
Aps a seleo dos eletrodos adequados para utilizao, foi realizada a investigao da
regio de atividade eletroqumica do 4-ABA. Desta forma, investigaes preliminares sobre o
comportamento eletroqumico do cido 4-aminobenzico foram realizadas por VC, sobre
eletrodos de grafite utilizando-se cido perclrico como eletrlito suporte.

A Figura 11 mostra o voltamograma cclico referente ao primeiro ciclo de varredura

do 4-ABA. Uma onda de oxidao eletroqumica do 4-ABA pode ser observada em cerca de
+0,88 V. Um processo catdico observado em potencial de retorno por volta de +0,50 V, o
qual pode ser atribudo reduo do material adsorvido na superfcie do eletrodo. Isto
afirmado devido ao crescimento das correntes de pico de tais processos com sucessivos ciclos
de varredura de potencial. Tal discusso ser apresentada mais adiante, neste trabalho.

34

400

Corrente A

300

0.88 V

200
100
0
-100

0.50 V

-200
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Potencial / V

Figura 11: VC em soluo 2,50 mM de 4-ABA sobre eletrodo de grafite. Eletrlito suporte: HClO4
0,50 M. v = 50 mV/s.

A eletropolimerizao do 4-ABA, para formao dos filmes polimricos, foi ento

realizada por sucessivos ciclos de potencial, na mesma faixa de potencial apresentada no
voltamograma cclico da Figura 11.
A Figura 12 mostra o comportamento eletroqumico do EG, contendo 10 ciclos de
varredura de potencial, em soluo de cido perclrico 0,50 M, na ausncia do monmero.

350
300

Corrente / A

250
200
150
100
50
0
-50
-100
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Potencial / V

Figura 12: VCs consecutivos do eletrodo de grafite em soluo de 0,50 M de cido perclrico.
Nmero de ciclos = 10; v = 50 mV/s.

35

Na Figura 12 pode-se perceber uma baixa atividade eletroqumica quando se submete

o eletrodo de grafite a consecutivos ciclos de potencial, na faixa de +0,00 a +1,20 V, somente
no eletrlito suporte. Observa-se apenas um pequeno aumento da corrente capacitiva, sendo
que as correntes residuais ficaram abaixo de 50 A.

Aps a avaliao do parmetro descrito acima, a eletropolimerizao do monmero

em concentrao de 2,50 mM foi realizada utilizando-se 100 ciclos de potencial na faixa de
+0,00 a +1,20 V, em soluo de cido perclrico 0,50 M, como eletrlito suporte. A
velocidade de varredura foi mantida em 50 mV/s.
Os VCs referentes aos sucessivos ciclos de potencial do 4-ABA para o eletrodo
modificado com 100 ciclos de potencial podem ser vistos na Figura 13.
400

II

Corrente / A

200

-200

-400
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Potencial / V

Figura 13: VCs consecutivos do eletrodo de grafite em soluo de 2,50 mM de 4-ABA. Eletrlito
suporte: HClO4 0,50 M. Nmero de ciclos = 100; v = 50 mV/s. Sendo: () 1o ciclo de potencial. As
setas indicam o sentido da corrente.

Pode-se observar que o 4-ABA oxida-se de forma irreversvel, e dois picos andicos (I
e II) podem ser vistos sem correspondentes processos catdicos na varredura inversa. Os
picos I e II aparecem como ondas bem separadas para potenciais mais positivos, indicando,
neste caso, um processo de oxidao mais favorvel. Para o 4-ABA, o pico de oxidao I
observado em cerca de +0,88 V, enquanto que o segundo processo de oxidao
(correspondente ao pico II) se desenvolve com um potencial mais positivo, em cerca de +1,05
V. H formao de ctions-radicais altamente reativos na regio do pico I, necessrios para
iniciar a polimerizao do 4-ABA, enquanto que o pico II est relacionado com o
acompanhamento de reaes de oxidao aps o pico I. Portanto, os dois picos andicos (em
vez de um nico pico de oxidao) observados nos voltamogramas cclicos do 4-ABA,

36

indicam claramente um processo de oxidao mais fcil. Tambm evidente que medida
que se aumenta o nmero de ciclos de potencial h um decrscimo nos valores da corrente de
pico andica (Ipa). Isto implica no consumo de monmero prximo a superfcie do eletrodo,
para a formao e deposio do material polimrico derivado do 4-ABA.
A Figura 13 ainda mostra que, no primeiro ciclo de potencial, j se observa o
aparecimento de uma onda de reduo, que aps o segundo ciclo se converte em duas em
+0,41 e +0,50 V, potencial referente ao 100o ciclo. medida que se realiza os sucessivos
ciclos de potencial, os respectivos processos de oxidao correspondentes aparecem em +0,46
e +0,52 V. O processo redox mostra um aumento nos valores de corrente, com os sucessivos
ciclos de potencial, portanto, isto indica a formao e adsoro de um material eletroativo
sobre o eletrodo de grafite.
5.2.1. Comportamento eletroqumico dos filmes de poli(4-ABA)

Aps o procedimento de eletropolimerizao, os EG modificados com filmes

polimricos [poli(4-ABA)/EG], foram submetidos a ciclos de potencial na mesma faixa da
eletropolimerizao apresentada na Figura 13, em soluo somente do eletrlito suporte. Este
procedimento visa remoo do monmero residual que pode ter sido aprisionado
durante o processo de modificao eletroqumica.
A Figura 14 exibe dois ciclos de varredura de potencial obtido para o eletrodo
modificado com poli(4-ABA), somente em soluo do eletrlito suporte, aps o procedimento
de eletropolimerizao. Os VCs foram obtidos aps o eletrodo de grafite modificado com
poli(4-ABA) ter sido retirado da soluo monomrica, lavado em gua com abundncia e seco
sob fluxo de N2.
No primeiro ciclo de potencial observa-se uma forte intensidade de Ipa a +0,88 V, que
praticamente desaparece aps o segundo ciclo de varredura de potencial, ficando evidente o
processo de oxidao referente ao monmero. Este monmero residual pode ter sido
adsorvido durante a eletropolimerizao. As intensidades de corrente relacionadas aos
processos de atividade eletroqumica do filme se tornam praticamente constantes aps a
segunda varredura. Este procedimento de limpeza de monmero residual um fator
importante para se eliminar possveis interferncias de atividades eletroqumicas relacionadas
a este processo em anlises subsequentes.

37

A modificao do eletrodo de grafite confirmada quando se compara os perfis

eletroqumicos do EG e poli(4-ABA)/EG em soluo do eletrlito suporte (cido perclrico)
(Figura 15) e em soluo de ferrocianeto/ferricianeto de potssio (Figura 16).
800
600

1 Ciclo

400

Corrente / A

2 Ciclo

200
0
-200
-400
-600
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

Potencial / V

Figura 14: VC do eletrodo de poli(4-ABA)/EG aps eletropolimerizao, somente em soluo de

HClO4 0,50 M, para a remoo do monmero residual. Sendo: () 1o ciclo de potencial e (----) 2o
ciclo de potencial. v = 100 mV/s.

0.59 V

Corrente / A

800

400

-400
0.51 V

-800
0.0

0.3

0.6

0.9

Potencial / V

Figura 15: VC obtido aps a eletropolimerizao, somente em soluo de cido perclrico 0,50 M, na
ausncia do monmero, para os eletrodos de grafite: (---) eletrodo no-modificado e () modificado
com poli(4-ABA). v = 100 mV/s.

A Figura 15 mostra a regio de atividade eletroqumica do eletrodo modificado com

poli(4-ABA), comparado a do eletrodo no-modificado, em soluo do eletrlito suporte,
HClO4 0,50 M. Atravs da Figura 15, pode-se comprovar que houve uma alterao na

38

resposta eletroqumica do eletrodo de grafite aps o procedimento de eletropolimerizao,

sendo avaliada para o eletrodo modificado uma alta eletroatividade do material adsorvido em
cerca de +0,59/+0,51 V. Isto implica que o material eletropolimerizado fica adsorvido sobre a
superfcie do eletrodo e apresenta uma atividade redox, uma vez que esta atividade est na
mesma regio observada na Figura 13.
5.2.2. Propriedades de transferncia de carga dos filmes de poli(4-ABA)

Para investigar as propriedades cinticas de transporte de troca inica dos filmes

polimricos de poli(4-ABA), voltamogramas cclicos foram registrados em soluo aquosa
contendo sonda redox aninica, denominada ferrocianeto/ferricianeto de potssio. Os VCs
obtidos esto apresentados na Figura 16.

900

0.31 V

Corrente / A

600

0.28 V

300
0
-300
0.16 V

-600
0.14 V

-900
-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Potencial / V

Figura 16: VCs obtidos para medidas das propriedades de troca aninica dos eletrodos de grafite em
soluo aquosa de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,0 mM contendo KCl 0,10 M: (---) eletrodo nomodificado e () modificado com poli(4-ABA). v = 100 mV/s.

Quando uma substncia eletroativa adsorvida na superfcie de um eletrodo, as

propriedades de transferncia eletrnica do sistema so afetadas. A capacidade no bloqueio de
eletrodos modificados no processo de transferncia eletrnica tem sido usualmente avaliada
no estudo das reaes redox utilizando-se o complexo de ferrocianeto/ferricianeto de potssio
como sonda redox de investigao68.
A natureza das interaes do poli(4-ABA) com a sonda redox fornece importantes
informaes sobre a prpria estrutura do material polimrico. Isto devido s interaes

39

eletrostticas que podem existir entre a sonda redox e o polmero, permitindo predizer um
conhecimento prvio das propriedades eltricas do poli(4-ABA). A voltametria cclica uma
importante tcnica para investigar as propriedades de bloqueio do filme de poli(4-ABA)
utilizando a difuso do par redox como sonda.
Como pode se observar na Figura 16, o EG mostra um comportamento eletroqumico
com E = 120 mV, para o par redox aninico. Em contraste, para o eletrodo de grafite
contendo o poli(4-ABA) observado um E = 170 mV, indicando que o perfil voltamtrico
do par redox afetado pela presena do poli(4-ABA) na superfcie do eletrodo. Alm disso,
foram observados valores maiores de Ipa e Ipc quando compara-se ambos os perfis
voltamtricos, alm de um deslocamento no potencial de pico de oxidao, para potenciais
mais positivos o que indica a modificao na superfcie do eletrodo de grafite.
A Figura 17 apresenta o comportamento eletroqumico do EG e Poli(4-ABA)/EG, em
soluo de KCl 0,10 M.

400

0.28 V

Corrente / A

200

-200
0.24 V

-400

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Potencial / V

Figura 17: VCs obtidos para medidas das propriedades de troca aninica dos eletrodos de grafite em
soluo de KCl 0,10 M: (---) EG e () poli(4-ABA)/EG. v = 100 mV/s.

Tal observao importante de se relatar, pois conforme observado na Figura 15, o

filme polimrico apresenta eletroatividade, e esta pode ser influenciada pelo eletrlito suporte.
Na Figura 16, pode-se observar que h um comportamento de bloqueio imperfeito para o
poli(4-ABA)/EG, ou seja, no h um bloqueio total na transferncia eletrnica do par redox
ferrocianeto/ferricianeto de potssio. Desta forma, na Figura 17, o filme polimrico apresenta
eletroatividade na mesma regio observada na Figura 16, pode-se afirmar ento que, nos VCs

40

obtidos na sonda redox h contribuio de ambos os processos (filme polimrico + sonda

redox).
Desta forma, pela Figura 17, evidente que o filme polimrico apresenta um
comportamento redox quando imerso somente em soluo de KCl 0,10 M na mesma regio
do par Fe2+/Fe3+. Isto evidencia que o VC da Figura 17 apresenta uma contribuio do filme
polimrico. Assim, claramente observado que para o eletrodo modificado, o filme
polimrico apresenta eletroatividade na soluo do eletrlito suporte, apresentando um pico
de oxidao em +0,28 V e outro de reduo em +0,24 V (E = 40 mV). J para o eletrodo de
grafite no-modificado, nenhuma atividade eletroqumica observada. Esta eletroatividade do
poli(4-ABA) em soluo do eletrlito suporte aproximadamente na mesma regio do par
redox ferrocianeto/ferricianeto de potssio como pode ser visto na Figura 16.
5.3. Investigao da eletropolimerizao do 4-ABA por cronoamperometria

A eletropolimerizao do 4-ABA tambm foi conduzida por Cronoamperometria para

fins de comparao com a VC. Na CA se aplica um potencial, pr-estabelecido, onde ocorrem
as reaes de oxidao e/ou reduo das espcies em soluo sobre os eletrodos. Nesta, tanto
o tempo de polimerizao como o potencial aplicado so parmetros que podem ser
controlados.
5.3.1. Eletropolimerizao do 4-ABA por cronoamperometria a 4800 segundos

A eletropolimerizao do 4-ABA por CA foi avaliada para fins de comparao com a

eletropolimerizao realizada por VC. Desta forma, para manter-se a comparao, a
eletropolimerizao a potencial constante foi avaliada durante 4800 segundos, partindo deste
tempo, uma vez que o tempo necessrio para a realizao dos 100 ciclos consecutivos de
potencial, aplicados na voltametria cclica.
Para a obteno do poli(4-ABA), utilizando-se a tcnica de CA, a eletropolimerizao
foi realizada em trs potenciais distintos. A escolha destes potenciais ocorreu a partir do
potencial de +1,05 V, que o potencial correspondente ao 2 pico andico do 4-ABA quando
eletropolimerizado por VC, o qual est relacionado com o acompanhamento de reaes de
oxidao aps o 1 pico. Este potencial est registrado no segundo voltamograma cclico
observado na Figura 13. Sobre este potencial, variou-se 10 mV, assim os trs potenciais
estabelecidos para serem aplicados tcnica de CA foram: +0,95 V; +1,05 V e +1,15 V.

41

Os cronoamperogramas registrados para estes trs potenciais, para fins de

eletropolimerizao do 4-ABA, so mostrados na Figura 18. A eletropolimerizao do
monmero foi realizada na mesma concentrao realizada por VC (2,50 mM de 4-ABA), o
tempo da eletropolimerizao para os trs potenciais foi mantido em 4800 segundos.

160

Corrente / A

120

80

40

0
0

1000

2000

3000

4000

5000

Tempo / s

Figura 18: Cronoamperogramas obtidos para eletropolimerizao dos EG em soluo de 2,50 mM de

4-ABA. Eletrlito suporte: HClO4 0,50 M. Potenciais aplicados: () +0,95 V, () +1,05 V, ()
+1,15 V. Tempo: 4800 s.

Na Figura 18, pode-se observar que dentre os trs potenciais pr-estabelecidos, o que
apresenta maior intensidade de corrente o potencial de +1,05 V, ou seja, apresenta maior
quantidade de carga depositada sobre a superfcie do eletrodo, uma vez que a carga
proporcional quantidade de material e resposta eletroqumica na superfcie do eletrodo,
seguido dos potenciais de +1,15 V e +0,95 V, respectivamente.
5.3.2. Eletropolimerizao do 4-ABA por cronoamperometria a 2400 segundos

Visando realizar uma otimizao no processo de eletropolimerizao e compar-lo ao

de VC, realizou-se a variao do tempo de eletropolimerizao por CA. Desta forma, o tempo
de eletropolimerizao investigado foi reduzido pela metade, ou seja para 2400 segundos,
para fins de verificar se haveria alteraes nas respostas obtidas.
A Figura 19 apresenta os cronoamperogramas obtidos para a eletropolimerizao do 4ABA nos potenciais +0,95 V; +1,05 V e +1,15 V, durante 2400 segundos.

42

160

Corrente A

120

80

40

500

1000

1500

2000

2500

Tempo / s

Figura 19: Cronoamperogramas obtidos a partir da eletropolimerizao dos EG em soluo de 2,50

mM de 4-ABA. Eletrlito suporte: HClO4 0,50 M. Potenciais aplicados: () +0,95 V, () +1,05 V,
() +1,15 V. Tempo: 2400 s.

Para a obteno do poli(4-ABA), foram utilizadas as mesmas condies descritas no

item 5.3.1, alterando-se apenas o tempo de eletrodeposio, fixando-se este em 2400
segundos. Pode-se observar que dentre os trs potenciais pr-estabelecidos, o que apresenta
maior intensidade de corrente utilizando-se o tempo de 2400 segundos tambm o potencial
de +1,05 V, como ocorre para o tempo de 4800 segundos, seguido dos potenciais de +1,15 V e
+0,95 V, respectivamente.
5.3.3. Avaliao das propriedades eletroqumicas dos filmes de poli(4-ABA)

A Figura 20 mostra a regio de atividade eletroqumica dos eletrodos modificados com

poli(4-ABA) comparados aos dos eletrodos no-modificados, somente em soluo do
eletrlito suporte HClO4 0,50 M, para as eletropolimerizaes realizadas nos trs potenciais
constantes e nos tempos de 4800 segundos e 2400 segundos.

43

800

600

Corrente / A

400
200
0
-200
-400
-600
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Potencial / V

800

600

Corrente / A

400
200
0
-200
-400
-600
0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

Potencial / V

Figura 20: VCs dos eletrodos modificados em soluo de cido perclrico 0,50 M. Sendo: ()
poli(4-ABA)/EG +0,95 V, () poli(4-ABA)/EG +1,05 V, () poli(4-ABA)/EG +1,15 V e (---) EG. v
= 100 mV/s. Onde (A) Tempo: 4800 s e (B) Tempo: 2400 s.

A modificao do eletrodo de grafite confirmada quando se compara os perfis

eletroqumicos do EG e poli(4-ABA)/EG em soluo do eletrlito suporte HClO4 (Figura 15),
e em soluo de ferrocianeto/ferricianeto de potssio (Figura 21).

44

900

Corrente / A

600
300
0
-300
-600
-900
-0.3

0.0

0.3

0.6

0.9

0.6

0.9

Potencial / V

900

Corrente / A

600
300
0
-300
-600
-900
-0.3

0.0

0.3

Potencial / V

Figura 21: VCs obtidos para medidas das propriedades de troca aninica para os eletrodos de grafite
em soluo aquosa de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,0 mM contendo KCl 0,10 M. Sendo: () poli(4ABA)/EG +0,95 V, () poli(4-ABA)/EG +1,05 V, () poli(4-ABA)/EG +1,15 V e (---) EG. v = 100
mV/s. Onde (A) Tempo: 4800 s e (B) Tempo: 2400 s.

Atravs da Figura 20 pode-se comprovar que houve uma alterao na resposta

eletroqumica do eletrodo de grafite aps o procedimento de eletropolimerizao, tanto para o
tempo de 4800 segundos quanto para o de 2400 segundos, sendo avaliada para os eletrodos
modificados uma alta eletroatividade do material adsorvido. Isto implica que o material
eletropolimerizado fica adsorvido sobre a superfcie do eletrodo.

45

Investigaes do comportamento eletroqumico dos eletrodos modificados tambm

foram efetuadas em soluo aquosa contendo K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM e KCl 0,10 M
como

eletrlito

suporte.

Alteraes

nos

perfis

de

oxirreduo

do

par

redox

ferrocianeto/ferricianeto de potssio podem fornecer importantes informaes a respeito do

material depositado sobre a superfcie do eletrodo.
Para a investigao das propriedades cinticas de transporte de troca inica dos filmes
polimricos de poli(4-ABA), eletropolimerizados a 2400 segundos e compar-los aos obtidos
em 4800 segundos, voltamogramas cclicos foram registrados em soluo aquosa contendo a
sonda redox aninica ferrocianeto/ferricianeto de potssio.
Na Figura 21 observou-se os VCs dos eletrodos no-modificados e dos eletrodos
modificados com poli(4-ABA) em soluo de ferrocianeto/ferricianeto de potssio 5,0 mM,
contendo KCl 0,10 M como eletrlito suporte, para as eletropolimerizaes realizadas nos trs
potenciais constantes e nos tempos de 4800 segundos e 2400 segundos.
Atravs da Figura 21 pode-se observar que para os filmes formados no potencial +0,95
V, h um ligeiro aumento da corrente na atividade do par redox, sendo observado tambm que
um maior deslocamento de potencial ocorreu para os potenciais +1,05 V e +1,15 V. Maiores
influncias no potencial de pico da sonda redox, bem como na corrente, ocorreram para os
eletrodos modificados no potencial +1,05 V, seguido do potencial +1,15 V, sugerindo que
uma maior quantidade do filme polimrico foi adsorvida nestas plataformas, e consequente
maior atividade eletroativa de influncia na sonda redox.
Verifica-se que o aumento na atividade eletroqumica frente ao par redox
ferrocianeto/ferricianeto de potssio, pode estar associado maior quantidade de material
depositado sobre a superfcie do eletrodo. O que faz com que a eletroatividade do filme
polimrico seja somada a do par redox, conforme j previamente discutido no item 5.2.2.
Por fim, observa-se que os VCs registrados na Figura 21A e 21B so muito
semelhantes. Isto indica que, a atividade eletroqumica dos filmes polimricos praticamente
da mesma magnitude quando a eletropolimerizao por CA ocorre a 4800 segundos e 2400
segundos. Portanto, conclui-se que, uma vez que a atividade eletroqumica dos filmes
polimricos no sofre alteraes em funo do tempo de eletrodeposio, vivel realizar a
eletropolimerizao por CA utilizando o tempo menor de 2400 segundos, o que minimiza
custo de operao bem como tempo de produo das plataformas funcionalizadas. Contudo,
deve ser observada a resposta da plataforma frente imobilizao de biomolculas, e isto ser
discutido mais frente.
Atravs dos resultados obtidos at ento, fica evidente que as tcnicas de VC e CA so

46

eficientes no processo de eletropolimerizao do monmero 4-ABA, assim, pela aplicao

destas tcnicas, comprovou-se a modificao na superfcie dos eletrodos, confirmada pelas
alteraes na resposta eletroqumica do eletrodo de grafite aps o procedimento de
eletropolimerizao, ou seja, pela observao da eletroatividade eletroqumica dos eletrodos
de EG contendo os filmes polimricos derivados do 4-ABA.
5.4. Medidas de espectroscopia de impedncia eletroqumica

A espectroscopia de impedncia eletroqumica (EIE) uma das tcnicas mais

poderosas e sensveis para investigao das propriedades eltricas da superfcie de eletrodos
modificados69. A EIE permite a obteno de informaes dos diferentes processos
eletroqumicos interfaciais e suas constantes de tempo, sendo possvel associar estes
processos a componentes eltricos como resistores, capacitores ou indutores, tal que o
entendimento do comportamento eltrico do sistema como um todo seja possibilitado.
Medidas de EIE foram realizadas para melhor compreenso das propriedades eltricas
dos filmes de poli(4-ABA) para os eletrodos modificados nos potenciais de +0,95V; +1,05V e
+1,15V, durante o tempo de 4800 segundos. Estas medidas foram comparadas com os estudos
do eletrodo modificado com poli(4-ABA) atravs da tcnica de VC.
A Figura 22 exibe os espectros de impedncia eletroqumica, conhecidos como
diagramas do plano complexo (Nyquist) e de Bode dos eletrodos EG e poli(4-ABA)/EG. O
Diagrama de Nyquist (grfico de Z vs. Z) muito utilizado, sendo uma poderosa
ferramenta para mensurar a resistncia transferncia de carga em reaes eletroqumicas69.
Todas as medidas foram obtidas no potencial de circuito aberto (OCP), sendo este
estipulado em +0,24 V, em soluo de ferrocianeto/ferricianeto de potssio. Em soluo da
sonda redox, nesta regio de potencial de +0.24 V, a corrente faradica com contribuies
dos processos redox do filme e do par redox Fe2+/Fe3+, conforme j previamente discutido no
item 5.2.2.

47

1400

1200

800
600

200

150

400

-Z'' / ohm

-Z'' / ohm

1000

100

50

200

0
0

50

100

150

200

Z' / ohm

200

400

600

800

1000

1200

1400

Z' / ohm

70

- ngulo Fase / Grau

60
50
40
30
20
10
0
-2

-1

log (f)

Figura 22: Diagramas de Nyquist (A) e Bode (B) dos espectros de impedncia eletroqumica do EG e
poli(4-ABA)/EG, obtidos em soluo de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo KCl 0,10 M.
Sendo: () +0,95 V, () +1,05 V, () +1,15 V e () VC. Epa = 0,24 V; Amplitude 10 mV;
Intervalo de Frequncia: 106 a 10-2 Hz. As linhas slidas representam o ajuste dos dados experimentais
a um circuito equivalente.

Para todos os eletrodos investigados observa-se que os sistemas apresentam dois

semicrculos, um na regio de altas frequncias e outro na regio de baixas frequncias, como
fica evidente pelas duas constantes de tempo observadas no diagrama de Bode (Figura 22B).
Na regio de altas frequncias o semicrculo muito discreto para o filme polimrico formado
no potencial 0,95 V, isto indica baixa eficincia no processo de eletropolimerizao para este
potencial, cujo material apresenta um aspecto menos condutor conforme discutido no item
5.2.2.

48

O comportamento de impedncia verificado em regies de baixas frequncias

caracterizado pelas propriedades intrnsecas da interface polmero/soluo (por exemplo,
dupla camada eltrica), em conjunto com a difuso pelo transporte de massa da sonda redox
na camada de difuso, que representado geralmente por o elemento de difuso de Warburg
(W).
Os dados experimentais obtidos pelas medidas de EIE da Figura 22 foram simulados
pelo ajuste de uma verso modificada do circuito de Randles, a fim de se obter o
comportamento eletroqumico do filme polimrico em adio ao processo de difuso. Os
elementos do circuito foram: Rs a resistncia hmica descompensada exibida pela soluo
do eletrlito, Rct e Rf so as resistncias associadas transferncia de carga que ocorre na
interface eletrodo/soluo e a resistncia hmica da estrutura do filme, respectivamente. A Qdl
o elemento de constante de fase que descreve o comportamento de pseudocapacitncia da
dupla camada elctrica e Qf o elemento de constante de fase que representa a
pseudocapacitncia do filme polimrico. O processo de difuso foi descrito pelo elemento
Warburg (W). Assim, o melhor circuito proposto e utilizado na simulao, o representado
por Rs(RctQd1)(Qf[RfW]), de acordo com a representao de Boukamp, mostrado
esquematicamente na Figura 23.

Figura 23: Circuito equivalente proposto para a simulao dos dados experimentais das medidas de
EIE.

Os parmetros numricos obtidos pela simulao dos dados experimentais, utilizandose o circuito equivalente mostrado na Figura 23, esto apresentados na Tabela 1.
Como pode ser observado, os valores da resistncia hmica total so consideradas
praticamente constantes ( 42 - 48 cm2) para as eletropolimerizaes obtidas nos diferentes
eletrodos. Por outro lado, a resistncia a transferncia de carga (Rct), fortemente influenciada
pelas condies de electropolimerizao, sendo que as resistncias mais baixas e mais altas,
foram verificadas para poli(4-ABA)/EG formados por CA a +0,95V e +1,05 V,
respectivamente. Um alto valor de Rct tambm foi verificado para o filme eletrosintetizado por
VC, quando comparado aos formados por CA em +0,95 V e +1,15V.

49

Tabela 1: Parmetros obtidos a partir dos resultados de simulao de EIE para os EG e poli(4ABA)/EG eletropolimerizados em funo da tcnica eletroqumica.

CA/+0,95 V

CA/+1,05 V

CA/+1,15 V

VC

Rs / cm2

47,5

46,4

42,8

46,1

Rct/ cm2

91,3

157,3

77,2

104,6

Qd1/m1 sn cm2

11,8

3,85

1,71

1,92

ndl

0,35

0,48

0,58

0,56

Rf/k cm2

0,20

1,39

3,53

2,26

Qf /m1 sn cm2

18,5

6,67

7,31

7,87

nf

1,00

0,95

0,67

0,96

W/m1 s0.5 cm2

7,64

8,76

2,76

2,94

2 103

1,00

5,47

3,52

1,48

Parmetro

Uma vez que a Rct medida no potencial de equilbrio do eletrodo verificado para a
sonda redox, de fato uma medida indireta da densidade de corrente de troca (Io = RT/nFRct)
para a reao redox de esfera externa, na interface eletrodo modificado/soluo, os resultados
experimentais apresentados na Tabela 1, indicam que as propriedades eletrnicas intrnsecas
dos filmes polimricos so afetadas pelas condies de electropolimerizao.
De acordo com os resultados anteriormente obtidos por VC, a ocorrncia de uma
difuso (W), acompanhada por uma transferncia de carga (Rct) caracteriza um
comportamento quase-reversvel exibida pela reao no eletrodo de esfera externa que ocorre
na interface polmero/soluo. Como pode ser visto, o transporte de massa ligeiramente
afetado pelas condies de eletropolimerizao, sendo a maior resistncia transferncia de
massa, verificada para o filme polimrico eletroformado por CA em +1,05 V. Os pequenos
valores de W indicam que a difuso linear semi-infinita, ocorre em um meio no restrito, isto
, estes resultados indicam que a superfcie do filme polimrico mais plana do que porosa.
Os valores de Rf foram afetadas pelas condies de eletropolimerizao. Assim,
assumindo que a resistividade intrnseca dos filmes polimricos, sintetizados em diferentes
condies, no uma funo da espessura do filme, pode ser proposto que a espessura
relativa da pelcula de polmero para as diferentes condies foram +1,15 V > VC > +1,05 V
> +0,95 V.
Portanto, de acordo com os estudos de EIS a espessura dos filmes pode ser controlada
usando diferentes potenciais, no caso de CA, ou pelo uso de diferentes ciclos de potencial, no

50

caso de VC. A anlise dos valores de Qf (nf = 0,671,00), o que caracteriza um

comportamento capacitivo, revela uma boa consistncia interna com os outros parmetros de
impedncia. O valor mais elevado Qf foi verificado para o filme polmerico que exibiu a
menor Rf (CA: +0,95 V), ou seja, do ponto de vista terico a resistncia do filme uma
funo linear da espessura do filme, enquanto a capacitancia do filme uma funo inversa da
espessura.
O valor de chi-quadrado refletido como uma medida estatstica que diz em que
medida os valores observados se desviam do valor esperado. um teste no paramtrico, ou
seja, no depende dos parmetros populacionais, como mdia e varincia. O princpio bsico
deste mtodo comparar propores, isto , as possveis divergncias entre as frequncias
observadas e esperadas para certo evento. Portanto, os circuitos apresentaram razoveis
valores de chi-quadrado (2), na ordem de 10-3, o sistema ento estvel com o tempo e
apresenta um bom ajuste dos dados experimentais, apoiando um baixo erro estatstico na
simulao dos dados experimentais.
Assim, os resultados encontrados nos estudos de EIE mostraram a eficincia desta
tcnica para a caracterizao de superfcies modificadas atravs da avaliao simples de um
processo que envolve a transferncia de carga de uma espcie eletroativa sobre a superfcie do
eletrodo.
5.5. Anlises da microscopia eletrnica de varredura

Foram realizadas anlises da morfologia para todos os eletrodos de grafite

modificados. Tais anlises foram realizadas por microscopia eletrnica de varredura (MEV),
com ampliaes de 100x, 200x, 500x, 1000x e 2000x para cada eletrodo.
Nas Figuras 24 a 28, so apresentadas as imagens referentes a todas as ampliaes
realizadas, respectivamente, para os eletrodos modificados na seguinte ordem: +0,95 V; +1,05
V; +1,15 V para as eletropolimerizaes utilizando a CA, conduzidas a 4800 segundos em
comparao aos eletrodos modificados por VC.

51

Figura 24: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V; (C) +1,15 V e (D)
VC. Ampliao de 100x.

Figura 25: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V; (C) +1,15 V e (D)
VC. Ampliao de 200x.

52

Figura 26: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V; (C) +1,15 V e (D)
VC. Ampliao de 500x.

Figura 27: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V; (C) +1,15 V e (D)
VC. Ampliao de 1000x.

53

Figura 28: Imagens de MEV para Poli(4-ABA)/EG obtidos em: (A) +0,95 V; (B) +1,05 V; (C) +1,15
V e (D) VC. Ampliao de 2000x.

As imagens obtidas por MEV mostram que em todos os casos no h total

recobrimento da superfcie do grafite, superfcie essa caracterizada pela presena intensa de
imperfeies. Nas Figuras 24-28 evidente a diferena nas propriedades morfolgicas dos
filmes obtidos por VC e CA. Contudo, para os filmes formados durante o tempo de 4800
segundos, observa-se uma maior presena de material depositado para a plataforma
desenvolvida em +1,05 V (Figura 30) quando comparado aos demais potenciais. Para os
eletrodos obtidos por VC evidente a diferena de morfologia apresentada, sendo que nestes
visivelmente observada uma maior quantidade de material depositado.
Desta forma, pode-se observar claramente o efeito da tcnica de eletropolimerizao
bem como do potencial na eletrogerao, na morfologia dos filmes polimricos. Isto
demonstra que o melhor potencial, o qual gera um material polimrico mais eletroativo
derivado do 4-ABA por CA no tempo de 4800 segundos, o potencial de 1,05 V, sobre a
superfcie do eletrodo de grafite. Neste potencial, maiores intensidades na atividade
eletroqumica, bem como maior quantidade de material depositado so observadas.
Observa-se tambm, que o eletrodo modificado por VC, apresenta uma morfologia
completamente distinta dos demais eletrodos, pois se observa uma maior cobertura da
superfcie do grafite. Conclui-se ento que as imagens obtidas por MEV corroboram com os

54

resultados de caracterizao eletroqumica do Poli(4-ABA)/EG, apresentados e discutidos

anteriormente.
5.6. Imobilizao e deteco de guanina e adenina

A deteco direta dos processos de imobilizao baseada nos stios de oxidao das
bases nitrogenadas presentes ao longo de uma sequncia de DNA. bem conhecido que
dentre as bases do DNA, a guanina utilizada como biomarcador usual para biossensores por
apresentar o menor potencial de oxidao entre as demais bases.
A tcnica eletroqumica utilizada nestes estudos foi a voltametria de pulso diferencial
(VPD). Esta tcnica foi escolhida por ser uma tcnica que apresenta maior sensibilidade do
que a voltametria cclica e, at mesmo, do que a voltametria de pulso normal, se tratando de
eletrodos slidos como os EG utilizados neste trabalho. Essa diferena de sensibilidade ocorre
especialmente quando compostos orgnicos esto envolvidos nos processos eletroqumicos.
Como estes conduzem frequentemente adsoro no eletrodo, possvel que uma tcnica
diferencial discrimine os efeitos que so mais ou menos constantes antes e depois da
aplicao do pulso70.
A Figura 29 mostra os picos de oxidao da adenina e da guanina obtidos por
voltametria de pulso diferencial (VPD) para os eletrodos de grafite modificados com poli(4ABA) formados por VC e CA a partir dos trs potenciais estudados anteriormente, os quais
so: 0,95 V; 1,05 V e 1,15 V, durante 4800 segundos e por VC com 100 ciclos consecutivos
de potencial.
Observa-se diferentes valores de corrente de pico andica (Ipa) para todos os eletrodos
modificados. A oxidao da guanina ocorre em cerca de +0,83 V para os trs eletrodos
modificados a potencial constante, enquanto que para o eletrodo modificado por VC, a
oxidao da guanina pode ser observada no potencial +0,81 V. J a oxidao da adenina
ocorre em cerca de +1,15 V para os trs eletrodos modificados a potencial constante e em
cerca de +1,13 V para o eletrodo modificado por VC. Como pode ser observado, h um
pequeno deslocamento dos potenciais de oxidao das bases pricas analisadas para os
eletrodos modificados por CA.

55

140

(G)

120

(A)

Corrente / A

100
80
60
40
20
0
0.6

0.8

1.0

1.2

Potencial / V

Figura 29: VPDs obtidos para a oxidao direta das bases adenina e guanina imobilizadas sobre os
Poli(4-ABA)/EG, obtidos em: () +0,95 V, () +1,05 V, () +1,15 V e () VC. Tempo de
deposio por CA: 4800 s. Nmero de ciclos: 100 ciclos. Eletrlito: tampo acetato 0,10 M em pH
4,50.

Na Figura 29 verifica-se que maiores amplitudes na corrente de pico andica foram

obtidas para o eletrodo modificado por VC. Enquanto que para os eletrodos modificados por
CA, maiores amplitudes na corrente de pico andica (Ipa) foram obtidas para o potencial 1,05
V, seguido dos potenciais 1,15 V e 0,95 V, respectivamente.
A Tabela 2 apresenta as amplitudes referentes s correntes de pico andicas, obtidas
para a deteco de cada base nitrogenada imobilizada sobre os eletrodos de poli(4-ABA)/EG,
modificados por VC e por CA (4800 segundos).
Tabela 2: Valores de Ipa obtidos para deteco de guanina e adenina imobilizadas sobre Poli(4ABA)/EG, obtidos por VC e CA (4800 s).
Ipa / Eletrodo

Corrente de oxidao da Guanina (A)

0,95 V
48,95

1,05 V
84,17

1,15 V
59,15

VC
129,80

Corrente de oxidao da Adenina (A)

45,24

86,71

68,54

108,90

Na Tabela 2 pode-se observar que quando a modificao do EG realizada por VC, a

quantidade das bases pricas imobilizadas na superfcie do eletrodo maior. Quando se
compara os eletrodos modificados por CA, o EG modificado no potencial de 1,05 V se
mostrou mais eficiente, em cerca do dobro de corrente registrada para a deteco das bases
purinas, frente aos demais potencias. Tais resultados esto de acordo com as anlises

56

anteriores e mostram a tcnica de VC como mais eficiente tanto para a gerao do poli(4ABA) como tambm para imobilizao e deteco das bases purinas, adenina e guanina.
Na Figura 30, pode-se observar a resposta eletroqumica das bases pricas, quando
imobilizadas sobre plataformas de poli(4-ABA), eletrogeradas a potencial constante durante
2400 segundos.
140

(A)
(G)

120

Corrente / A

100
80
60
40
20
0
0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

Potencial / V

Figura 30: VPDs obtidos para a oxidao direta das bases adenina e guanina imobilizadas sobre os
Poli(4-ABA)/EG, obtidos em: () +0,95 V, () +1,05 V, () +1,15 V. Tempo de deposio por CA:
2400 s. Eletrlito: tampo acetato 0,10 M em pH 4,50.

Como observado nos VCs formados por CA durante o tempo de 4800 segundos,
verifica-se que maiores amplitudes na corrente de pico andica foram obtidas para o eletrodo
modificado por VC.
Na Figura 30 pode-se verificar que as amplitudes na corrente de pico andica (Ipa) para
a deteco da guanina foram praticamente constantes para os eletrodos preparados a 2400
segundos e inferiores quando comparados aos eletrodos preparados a 4800 segundos (ver
Figura 29). Contudo, para a deteco da adenina, maiores amplitudes na Ipa foram observadas,
quando comparados aos VCs da Figura 29, para o eletrodo preparado a 1,05 V. Isto indica que
a caracterstica do material biolgico pode influenciar diretamente na escolha da plataforma
funcionalizada, tendo-se este parmetro como fator fundamental para investigao da
sensibilidade do biossensor.
A oxidao da guanina ocorre em cerca de +0,83 V e da adenina em cerca de +1,15 V,
para os trs eletrodos modificados a potencial constante, assim como foi observado para os
eletrodos modificados durante o tempo de 4800 segundos. Enquanto que para o eletrodo

57

modificado por VC, a oxidao da guanina ocorre em cerca de +0,87 V e da adenina em cerca
de +1,21 V. Desta forma, pode-se afirmar que para os eletrodos modificados a potencial
constante no houve deslocamento no potencial de oxidao das bases em funo do tempo de
eletrodeposio.
A Tabela 3 apresenta as amplitudes referentes s correntes de pico andicas (Ipa) de
cada base nitrogenada estudada, para os eletrodos modificados por CA, no tempo de 2400
segundos.
Tabela 3: Valores de Ipa obtidos para deteco de guanina e adenina imobilizadas sobre poli(4ABA)/EG, obtidos por VC e CA (2400 s).
Ipa / Eletrodo

Corrente de oxidao da Guanina (A)

+0,95 V
56,83

+1,05 V
60,40

+1,15 V
68,15

VC
113,70

Corrente de oxidao da Adenina (A)

50,29

108,33

100,85

123,90

Como para todos os eletrodos investigados, condies como: quantidade de guanina e

adenina imobilizadas, concentrao das bases nitrogenadas e tempo de imobilizao foram as
mesmas, conclui-se que a caracterstica da plataforma influencia diretamente na imobilizao
e deteco da biomolcula, ou seja, quando compara-se os resultados das Tabelas 2 e 3,
observado que a guanina melhor detectada em filmes formados por CA com 4800 segundos
e a adenina teve maior sensibilidade para as plataformas desenvolvidas a 2400 segundos,
exceto para o eletrodo preparado em +0,95 V.
Desta forma, como a VC mostrou-se de modo geral, mais eficiente na imobilizao
das biomolculas, todos os eletrodos que foram utilizados na imobilizao de
oligonucleotdeos, bem como de peptdeos e seus recombinantes, foram conduzidas somente
com eletrodos modificados por VC.
5.7. Aplicao das plataformas de poli(4-ABA) em genossensores
A imobilizao das biomolculas a etapa mais importante na construo de um
biossensor, garantindo sensibilidade, seletividade e estabilidade ao mesmo. O objetivo de
qualquer metodologia de imobilizao reter a mxima atividade da biomolcula na
superfcie do transdutor25.
Os genossensores podem utilizar de interaes covalentes de oligonucleotdeos com as
cadeias polimricas, minimizando efeitos de lixiviao das sondas, sendo que as mudanas
decorrentes da hibridizao podem ser detectadas, utilizando-se mtodos eletroqumicos de

58

deteco direta das bases nitrogenadas componentes do DNA ou via indireta, utilizando-se
intercaladores de duplas fitas do DNA. Assim, este sistema vivel e interessante, visto que
simplifica a construo do sensor e no requer elaboradas snteses para a funcionalizao de
polmeros condutores71.
Investigaes foram conduzidas utilizando-se os filmes polimricos derivados do
cido 4-aminobenzico (4-ABA), obtidos por VC, como plataformas para a imobilizao de
oligonucleotdeo (poliGA), bem como a imobilizao e deteco do evento de hibridizao
com o alvo complementar (poliCT). Os resultados experimentais, para verificao da
viabilidade do processo de imobilizao e hibridizao foram obtidos por meio de voltametria
de pulso diferencial, utilizando-se a deteco indireta pelo uso de agentes intercaladores como
o AM e BE, uma vez que, conforme apresentado nas Figuras 29 e 30 os potenciais para
deteco direta destas bases so altos, e podem trazer efeitos indesejveis no processo de
deteco, como oxidao de outras espcies que apresentam um processo redox em potenciais
inferiores em relao s bases purinas.
5.7.1. Imobilizao e deteco de oligonucleotdeos sobre EG/4-ABA, utilizando-se azul de
metileno como indicador
No processo de imobilizao de oligonucleotdeos, necessrio que as plataformas
utilizadas sejam reprodutveis, estveis e seletivas. Isso importante para o desenvolvimento
de dispositivos simples para deteco de alvos complementares. Para esse tipo de aplicao, a
transduo eletroqumica da superfcie de hibridizao apresenta uma perspectiva atrativa em
termos de rapidez na anlise, instrumentao simples, custo e possibilidade de miniaturizao.
Vrios intercaladores tm sido utilizados em biossensores de hibridizao de DNA, sendo um
deles o azul de metileno.
A adsoro do azul de metileno foi previamente investigada sobre os eletrodos EG e
Poli(4-ABA)/EG. A Figura 31 mostra o voltamograma de pulso diferencial obtido para os
eletrodos EG e Poli(4-ABA)/EG modificado por VC, aps 5 minutos em contato com 20 L
de AM 5,0 x 10-4 M.

59

100

Corrente / A

0
-100
-200

-0.22 V

-300
-400
-0.26 V

-500
-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

Potencial / V

Figura 31: VPDs obtidos para: (---) EG e () poli(4-ABA)/EG contendo 20 L de AM 5,0 x 10-4 M.
Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso: 0,20 s; Altura do
Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroAM = 5 minutos.

Na Figura 31 observa-se que nas mesmas condies de imobilizao o AM apresenta

uma grande afinidade pela superfcie do eletrodo modificado [poli(4-ABA)/EG]. O aumento
de 200% no valor de corrente observado pode estar relacionado caracterstica aninica do
filme de poli(4-ABA). Isso causaria a atrao eletrosttica entre o polmero e o AM, ficando
este adsorvido na superfcie do poli(4-ABA)/EG e resultando no aumento nos valores de
corrente de pico catdica (Ipc). Observa-se tambm um deslocamento de potencial em cerca de
40 mV para potenciais mais andicos, o que est relacionado com a atuao do poli(4-ABA)
no processo de transferncia eletrnica.
Deste modo, a deteco de hibridizao foi acompanhada pela reduo do AM, onde a
eletroatividade deste composto leva interpretao da forma hbrida da sonda.
bem conhecido que o AM tem uma alta afinidade pela base nitrogenada guanina.
Desta forma, possvel fazer o reconhecimento do evento de hibridizao, uma vez que
quando o oligonucleotdeo est hibridizado, o acesso s bases guanina pelo AM diminudo,
resultando assim numa menor quantidade deste composto na superfcie do biossensor, com
consequente queda na corrente monitorada. Sendo assim, pela diferena entre a quantidade de
AM detectado, possvel reconhecer o evento de hibridizao.
A Figura 32 apresenta a deteco da sonda e sonda/alvo imobilizados sobre o poli(4ABA)/EG, contendo o AM como agente intercalador.

60

100

Corrente / A

0
-100
-200
-0.26 V

-300
-400
-0.8

-0.26 V

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

0.4

Potencial / V

Figura 32: VPDs obtidos para: () ssDNA e () dsDNA contendo 20 L de AM 5,0 x 10-4 M.
Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso: 0,20 s; Altura do
Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroAM = 5 minutos. Eletrodos modificados com poli(4ABA) por VC (100 ciclos de varredura).

As mudanas nas correntes de pico para o AM foram obtidas para cada etapa de
preparao do sensor. Deste modo, a superfcie do sensor foi colocada em contato com
soluo do AM por 5 minutos, no qual ocorre interao do AM com as bases de guanina na
sonda (ssDNA) ou intercala entre pares de guanina-citosina na dupla fita (dsDNA), aps a
hibridizao. O tempo de 5 minutos foi baseado em estudos reportados na literatura. A
superfcie aps a adsoro lavada rapidamente por cerca de 6 segundos, para eliminar
qualquer excesso de AM. As medidas de VPDs foram realizadas em vez de VC para melhorar
a sensibilidade do processo de deteco. Assim os VPDs foram obtidos em soluo tampo
fosfato livre de AM, a fim de garantir que o sinal medido representasse apenas a superfcie do
complexo DNA-AM.
A diminuio no acesso as bases guanina para a interao com AM, aps a
hibridizao da sonda de poliGA com o alvo complementar (poliCT) promove um decrscimo
nos sinais voltamtricos de reduo do AM. Este decrscimo na corrente do AM aps a
hibridizao mostrado pelo VPD da Figura 32.
A Figura 32 indica a presena de um pico voltamtrico bem definido para a reduo do
AM adsorvido sobre os eletrodos de grafite modificado com poli(4-ABA), contendo a sonda e
o hbrido em aproximadamente -0,26 V.
A intensidade de Ipc atribuda interao do AM com os resduos de guanina da

61

ssDNA. A magnitude do pico desta forma reflete na extenso da interao do AM com a

ssDNA e a dsDNA. Aps exposio da interface com o alvo, o qual contm a
complementao da sonda, uma diminuio na corrente de reduo resultante da adsoro do
AM em cerca de 22,5% obtida. Esta diminuio na corrente reflete em grande diferena na
afinidade do AM aos pares de bases da guanina presentes na sonda, causada pela formao do
hbrido que diminui o acesso de intercalao s bases guanina. Esta diminuio atribuda
inibio pelo efeito estrico dos grupos reduzveis do AM intercalados entre a dupla hlice do
DNA.
Conclui-se que este procedimento obtido para a eletropolimerizao por VC para a
obteno do genossensor, mostrou-se eficiente para a deteco do evento de hibridizao e
promissor para a incorporao de fragmentos de DNA que sejam especficos.
5.7.2. Deteco de oligonucleotdeos utilizando-se brometo de etdio

Mtodos diretos e indiretos so usados para a deteco da imobilizao de sonda e

alvo sobre uma matriz. Este sinal pode ser detectado por meio de intercaladores como o
brometo de etdio (BE).
Mesmo com as grandes promessas do uso de biossensores pticos, muitos autores tm
usado mtodos eletroqumicos para estudar as interaes de molculas pequenas como o
DNA72,73, incluindo o BE74 devido praticidade e facilidade do mtodo. O BE apresenta
eletroatividade, sendo oxidado em torno de +0,70 V (versus eletrodo de calomelano saturado).
Esta propriedade, juntamente com a interao das duplas fitas do DNA, torna o sistema
potencial para a construo de genossensores, baseados na deteco indireta da hibridizao
atravs da oxidao de BE11.
A adsoro do brometo de etdio foi previamente investigada sobre os eletrodos EG e
Poli(4-ABA)/EG. A Figura 33 mostra o voltamograma de pulso diferencial obtido para os
eletrodos EG e Poli(4-ABA)/EG modificado por VC, aps 5 minutos em contato com 20 L
de BE 5,0 x 10-4 M.

62

150

0.58 V

Corrente / A

100

0.60 V

50

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Potencial / V

Figura 33: VPDs obtidos para: (---) EG e () poli(4-ABA)/EG contendo 20 L de BE 5,0 x 10-4 M.
Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso: 0,20 s; Altura do
Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroBE = 5 minutos.

Na Figura 33 observa-se um aumento nos valores de Ipa para o poli(4-ABA)/EG, isto

sugere que h uma interao entre o brometo de etdio e a plataforma de poli(4-ABA). Esta
interao principalmente eletrosttica, devido ao aumento observado nos valores de
corrente. A diferena entre esse sistema e do eletrodo de grafite o fato de que o grafite no
possui stios de ligao para a imobilizao de biomolculas e essas so eliminadas nas etapas
de lavagem. Um deslocamento 20 mV tambm pode ser observado, resultando no
deslocamento para potenciais menos catdicos.
A VPD foi utilizada neste trabalho devido ser uma tcnica muito sensvel. Os
parmetros eletroqumicos da VPD para a deteco do BE sobre os eletrodos de grafite foram
otimizados sendo ento aplicados ao eletrodo modificado. Considerando-se a seletividade e
sensibilidade, a varredura foi realizada de +0,30 a +0,90 V, 20 mV/s, 25 mV de amplitude de
pulso e 60 ms de altura do pulso, sendo utilizados para deteco do BE quando em contato
com ssDNA e dsDNA, sobre eletrodos de grafite modificados com poli(4-ABA).
O BE foi imobilizado sobre ssDNA e dsDNA para se observar a intercalao do
mesmo ao sistema dsDNA/BE no poli(4-ABA)/EG. A deteco do alvo complementar foi
realizada pela medida da corrente de pico andica do BE. Os VPDs para o ssDNA e dsDNA
aps contato com o intercalador so mostrados na Figura 34.

63

200
0.57 V
0.58 V

Corrente / A

150

100

50

0
0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Potencial / V

Figura 34: VPDs obtidos para: () ssDNA e () dsDNA contendo 20 L de BE 5,0 x 10-4 M.
Eletrlito: Tampo fosfato 0,10 M, pH 7,40. Amplitude: 25 mV; Perodo do Pulso: 0,20 s; Altura do
Pulso: 0,06 s; = 20 mV/s. Tempo de adsoroBE = 5 minutos. Eletrodos modificados com poli(4ABA) por VC.

Na Figura 34, possvel detectar significativamente os eventos de hibridizao atravs

da deteco indireta de BE. As diferenas entre os sinais de corrente so devido s diferentes
formas com que as biomolculas interagem com o BE. Na presena apenas da sonda, ssDNA,
o sinal da corrente de pico andica mais baixo do que com o alvo, dsDNA. Isso se deve ao
efeito intercalante do BE sobre o DNA nativo, ou seja, hibridizado, onde ele pode se
acomodar mais facilmente entre os pares de bases da estrutura. Desta forma possvel realizar
a deteco.
Ao contrrio do AM o BE apresenta uma melhor interao com a dupla fita do DNA.
Quando o poliGA (ssDNA) foi colocado em contato com 0,126 mM do alvo complementar
(poliCT), e o sistema foi incubado por 20 minutos a 42 C, ocorre a formao do hbrido.
Aps este perodo o eletrodo foi lavado em tampo fosfato e seco em N2. Aps isso, 5,0 x 10-4
M de BE foi colocado sobre o eletrodo por 5 minutos e tambm lavado. A corrente de
oxidao resultante da adsoro do BE foi cerca de 187 A, cerca de 16% maior que a do
ssDNA/Poli(4-ABA)/EG. Isto considervel porque o valor da Ipa derivado das ligaes do
BE dsDNA na superfcie do eletrodo.
Conclui-se que o genossensor possui resposta eletroqumica para o alvo complementar
proposto no trabalho. Portanto, tais resultados so promissores no desenvolvimento e
aprimoramento destas plataformas funcionalizadas para genossensores, que so uma forte

64

promessa para um rpido, barato e simples diagnstico de doenas genticas.

5.8. Aplicao das plataformas de poli(4-ABA) em biossensores microbiolgicos
Um segundo mecanismo de aplicao das plataformas de poli(4-ABA), foi a utilizao
das mesmas na construo de um biossensor com deteco impedimtrica contendo peptdeos
imobilizados. Neste tpico, esto apresentados os resultados do estudo realizado para avaliar
o efeito do colesterol na interao do peptdeo DD K com membranas fosfolipdicas.
5.8.1 Resposta da espectroscopia de impedncia eletroqumica em polmeros condutores

Vrios tipos de biossensores com deteco por medidas de EIE tm sido

desenvolvidos e descritos na literatura. Tais sensores so baseados nas mudanas das
propriedades eltricas resultantes da interao sonda/alvo sobre a superfcie dos eletrodos.
Estes sistemas contm duas unidades funcionais bsicas: um receptor e um transdutor. As
aplicaes destes no monitoramento e controle ambiental, indstria de alimentos,
farmacutica e clnica tm possibilitado anlises com monitoramento contnuo e in vivo em
tempo real75.
A EIE tem adquirido grande importncia, pois uma tcnica capaz de avaliar
processos interfaciais e superficiais, uma vez que estes processos so de fundamental
importncia no entendimento dos mecanismos de interao entre o sistema de reconhecimento
e o analito. Alm de possibilitar a obteno de grande nmero de informaes a partir de um
nico experimento. As medidas de EIE so realizadas variando-se os valores de altas
frequncias para baixas frequncias, desta forma, a EIE permite a obteno de informaes
dos diferentes processos eletroqumicos e suas constantes de tempo.
O conceito de impedncia, originalmente introduzido para descrever a resposta de
sistemas compostos por capacitncias, resistncias e indutncias, estendeu-se aos sistemas
eletroqumicos, uma vez que inmeros processos podem contribuir para a relao entre a
corrente e o potencial do sistema. Assim, a partir das medidas da impedncia e ngulo de fase
possvel avaliar processos como transporte de carga, condutividade de filmes, capacitncia
da dupla camada, entre outros.
Desta forma, a aplicao da EIE tem se estendido investigao de propriedades
condutoras de polmeros, pois a investigao de mecanismos de transferncia de carga em
filmes modificados com biomolculas tem sido realizada mediante avaliao do

65

comportamento da impedncia do sistema em funo da frequncia de excitao. Estas

investigaes tm o propsito de indicar as relaes entre as alteraes no polmero e as
interaes resultantes da bioafinidade entre o receptor e o analito. Assim, a EIE pode gerar
informaes sobre as propriedades condutoras dos sistemas desenvolvidos75.
Antes do processo de imobilizao e para comparao dos resultados obtidos,
realizou-se medidas de EIE dos eletrodos Poli(4-ABA)/EG em soluo somente do eletrlito
suporte, KCl 1,0 M e na presena da sonda redox, soluo de ferrocianeto/ferricianeto de
potssio contendo KCl 1,0 M, conforme grficos apresentadas na Figura 35, que mostra os
espectros de impedncia eletroqumica, denominados diagramas do plano complexo (Nyquist)
e de Bode. As medidas foram obtidas no OCP, sendo este de 0,26 V.
Nos diagramas da Figura 35 pode-se observar a variao de magnitude para os
espectros em estudo do filme polimrico na presena da sonda redox e na soluo de KCl.
Nas Figuras 35A e 35A1, pode-se verificar a influncia do eletrlito suporte na
interface polmero/soluo, regio da dupla camada eltrica (DCE), e na condutividade do
polmero, pois na presena do eletrlito suporte, a transferncia de carga ocorre somente
dentro do polmero, ou seja, a reao ocorre entre o polmero e a soluo do eletrlito suporte.
A condutividade intrnseca produzida a partir da formao de cargas transportadoras
atravs da estrutura conjugada ao longo da cadeia polimrica. A oxidao do polmero
provoca o surgimento de estados eletrnicos localizados e os chamados plarons e biplarons
so formados.
Desta forma, na interface eletrodo/polmero/eletrlito, a transferncia de carga
acontece de diferentes formas. No eletrodo a condutividade eletrnica, h a transferncia de
eltrons na interface eletrodo/polmero. No filme polimrico, a condutividade eletrnica
mista, pois ocorre atravs dos eltrons e dos plarons presentes no polmero. J no eletrlito, a
condutividade inica na interface polmero/soluo, h a entrada de ons da soluo para o
polmero.

66

250

90

A1

80

200

70
60
Graus

-Z'' / ohm

150

100

50
40
30

50

20
10

0
0

50

100

150

200

250

-2

-1

Z' / ohm

350

Logf

60

300

B1

50

250
Graus

-Z'' / ohm

40

200
150
100

30
20

50
10

0
0

50

100

150

200

250

Z' / ohm

300

350

-2

-1

1
Logf

Figura 35: Diagramas de Nyquist () e Bode (+) dos espectros de impedncia eletroqumica do
poli(4-ABA)/EG, sendo (A) e (A1) obtidos em soluo de KCl 1,0 M e (B), (B1) obtidos em soluo
de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo KCl 1,0 M. Epa = 0,26 V; Amplitude 10 mV; Intervalo
de Frequncia: 106 a 10-2 Hz.

Na Figura 35A, com ausncia da sonda redox, observa-se que a condutividade dentro
do polmero influenciada pelos ons [Cl-], o eletrodo bloqueado, com formao de uma
barreira reflectiva, pois neste caso, o polmero condutor est em eletrlito suporte puro, h
esgotamento (saturao) das espcies eletroativas, ou seja, h o bloqueio completo da
difuso na interface polmero/soluo.
Nas Figuras 35B e 35B1, observa-se que na presena da sonda redox, os espectros de
impedncia mudam-se em relao aos espectros somente no eletrlito suporte, h a formao
de uma barreira transmissiva, onde existe transferncia de carga na interface
polmero/soluo. Verifica-se ainda na Figura 35B1 a ocorrncia de uma constante de tempo
adicional, caracterstica da formao de uma nova interface ou propriedades eletrnicas muito
diferenciadas.

67

5.8.2 Avaliao do poli(4-ABA) na imobilizao e deteco impedimtrica do peptdeo

dermadistinctina K (DD K)
O peptdeo DD K foi imobilizado sobre a superfcie do eletrodo modificado com
poli(4-ABA), estudou-se a sua interao

com o fosfolipdeo 1-palmitoil-2-oleil-

fosfatidilcolina (POPC) e, posteriormente, investigou-se o efeito do colesterol na interao do

peptdeo DD K com lipossomas de POPC, ou seja, o seu efeito na ligao de DD K com
vesculas unilamelares grandes (LUVs de 100 nm).
Para isto foram preparadas LUVs sem colesterol e LUVs com colesterol, sendo 43%
em mol de colesterol a concentrao empregada na composio das LUVs, de forma a
aproximar-se da razo molar colesterol/fosfolipdeos tpica de clulas de eritrcitos (0,84)76.
A Figura 36 mostra a representao esquemtica deste processo.
A deteco dos sistemas investigados descritos anteriormente foi realizada por EIE.
Tal tcnica foi escolhida devido a todas as suas caractersticas citadas anteriormente, bem
como por no se apresentar como uma anlise destrutiva, mas que tambm fornece
informaes bastante relevantes e sensveis das propriedades eltricas contidas na interface
eletrodo/soluo.
Na Figura 37, pode-se observar os espectros de impedncia eletroqumica, conhecidos
como diagramas do plano complexo (Nyquist) e de Bode, resultantes da imobilizao do
peptdeo, conforme ilustrado na Figura 36.
Foi imobilizado nos eletrodos contendo o poli(4-ABA) o peptdeo DD K e o
reconhecimento biolgico foi feito com o alvo complementar e no complementar. Em outras
palavras, a sonda, peptdeo DD K, o alvo especfico (fosfolipdeo POPC), e o alvo no
especfico (fosfolipdeo POPC + colesterol).
Todas as medidas foram obtidas no OCP, potencial este registrado em +0,26 V, em
soluo de ferrocianeto/ferricianeto de potssio contendo KCl 1,0 M, numa frequncia de 100
kHz a 10 mHz e amplitude de 10 mV. Em soluo da sonda redox, nesta regio de potencial
de +0,26 V, a corrente faradica com contribuies do par redox Fe2+/Fe3+, conforme j
previamente discutido no item 5.2.2.

68

Figura 36: Representao esquemtica do processo de imobilizao para os eletrodos modificados

com poli(4-ABA). Sendo (1) poli(4-ABA)/EG, (2) poli(4-ABA)/EG + Sonda, (3) poli(4-ABA)/EG +
Sonda + Alvo Especfico e (4) poli(4-ABA)/EG + Sonda + Alvo No Especfico.

Conforme observado na Figura 37B, para os trs sistemas investigados evidente o

aparecimento de dois semicrculos, um em regies de altas frequncias e outro em regies de
baixa frequncia. Verifica-se que a presena do peptdeo (Figura 37A) imobilizado sobre o
polmero, no ocasiona em grandes variaes no perfil do espectro de EIE quando comparado
ao espectro do poli(4-ABA) mostrado na Figura 35B.

69

350

300

200

50

40

150

30
-Z'' / ohm

-Z'' / ohm

250

100

20

10

50
0

10

20

30

40

50

Z' / ohm

50

100

150

200

250

300

350

Z' / ohm

80

70

Graus

60
50
40
30
20
10
0

-2

-1

Log (f)

Figura 37: Diagramas de Nyquist (A) e Bode (B) dos espectros de impedncia eletroqumica do
Poli(4-ABA)/EG, obtidos em soluo de K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6 5,00 mM contendo KCl 1,0 M. Sendo:
() sonda, () sonda + alvo especfico e () sonda + alvo no especfico. Epa = +0,26 V; Amplitude 10
mV; Intervalo de Frequncia: 106 a 10-2 Hz.

Portanto, pode-se inferir que h uma forte interao na interface polmero/peptdeo, de

modo que no se observa a ocorrncia de uma constante de tempo adicional, caracterstica da
formao de uma nova interface ou propriedades eletrnicas muito diferenciadas.
O peptdeo DD K foi depositado na superfcie do eletrodo por adsoro, pois a
plataforma funcionalizada com o filme polimrico, o poli(4-ABA), apresenta um carter
aninico, o que permite a sua ligao com a face hidroflica do peptdeo, a qual possui cargas
positivas. Atualmente, vrios modelos indicam que o mecanismo de ao de peptdeos

70

antimicrobianos ocorre pela combinao de efeitos hidrofbicos e eletrostticos. Portanto, o

peptdeo mantm as regies hidrofbicas ligadas regio apolar da membrana enquanto as
regies hidroflicas ficam expostas para facilitar o fluxo livre de ons e molculas pequenas
atravs da bicamada lipdica. Estes peptdeos carregados positivamente so atrados pela
superfcie aninica das membranas fosfolipdicas.
O DD K um peptdeo anfiptico, sendo assim, a anfipaticidade uma caracterstica
fundamental para a interao do peptdeo com membranas fosfolipdicas. Portanto, essa
estrutura anfiptica do peptdeo favorece a interao com as LUVs, e essa forte interao faz
com que ocorra uma fragmentao dessas membranas77, de forma que os lipossomas
permanecem no meio, mas no mais como uma vescula, e sim de forma desorganizada.
Desta forma, pode-se observar que h uma semelhana entre os diagramas de Bode
para as medidas da sonda e da sonda + alvo especfico (Figura 37B), pois a interao que
ocorre na interface peptdeo/LUVs to forte que destri as LUVs, por isso no h alterao
nos resultados para essas medidas. J no caso do eletrodo contendo a sonda + alvo no
especfico (LUVs com colesterol), o diagrama apresenta um perfil diferenciado, pois o
resultado totalmente alterado em relao sonda. Neste caso, h uma interao na interface
peptdeo/LUVs com colesterol, porm, essa interao fraca, de forma que no causa a
destruio das LUVs, devido presena do colesterol nas LUVs, que diminui a interao na
interface.
Isso pode ser comprovado por estudos realizados por ITC, citados na literatura, que
descrevem a interao do peptdeo DD K com as vesculas unilamelares (LUVs) sem
colesterol. Estes estudos mostraram que o peptdeo DD K capaz de incorporar-se em LUVs
sem colesterol, levando a um aumento significativo do tamanho da vescula, porm no em
LUVs com alta concentrao de colesterol, ou seja, a ligao de DD K com vesculas
unilamelares significativamente afetada pelo colesterol77. Tais dados contribuem para
explicar a baixa atividade hemoltica do peptdeo, que em grande parte, se deve presena do
colesterol em clulas eucariotas. J em clulas bacterianas, ausentes de colesterol, a atividade
hemoltica do peptdeo DD K alta, desta forma, ele apresenta atividade antibacteriana
significativa.
Verly e colaboradores77 realizaram estudos termodinmicos da interao do peptdeo
com membranas fosfolipdicas utilizando a tcnica de calorimetria de titulao isotrmica
(ITC), uma das tcnicas mais empregadas para descrio termodinmica de diferentes
sistemas biomoleculares. Ela permite o estudo em ambientes muito similares ao de
membranas biolgicas, como vesculas de bicamadas fosfolipdicas, possibilitando uma

71

completa descrio termodinmica do sistema com a obteno de parmetros termodinmicos

como H, G e S, que podem resultar em informaes como constantes de interao (K)
ou, at mesmo, fornecer evidncias sobre o mecanismo de interao do sistema em estudo59.
O efeito do colesterol nas interaes entre DD K e LUVs foi analisado por ITC, o qual
mostrou que o colesterol reduz a constante de interao do DD K com as LUVs, pois sem a
presena do colesterol, foi encontrado um valor muito alto para a constante de interao,
indicando uma interao significativa entre as espcies no sistema. Os dados de ITC ainda
mostraram que ambos componentes entlpico e entrpico favorecem a ligao peptdeo-LUVs
sem colesterol. Finalmente, o valor negativo da variao de energia livre de Gibbs mostra um
processo espontneo na ligao de DD K com LUVs sem colesterol. Dados de RMN64 em
micelas de dodecilfosfocolina (DPC) mostraram que DD K apresenta uma hlice anfiptica do
resduo Lys-7 at a extremidade C-terminal, com o resduo de triptofano direcionado para a
regio hidrofbica das micelas. Esses arranjos estruturais colaboram para explicar a alta
contribuio do componente entrpico encontrado na interao do DD K com as LUVs. Isto
porque a anfipaticidade do DD K favorece a interao com a bicamada e, consequentemente,
a dessolvatao da face hidrofbica, permitindo sua insero na bicamada, e uma razo
importante para uma contribuio entrpica elevada, resultante da desorganizao das LUVs
devido interao com o peptdeo.
Atravs das medidas de EIE utilizando-se o par redox ferro/ferricianeto de potssio
como sonda de deteco, demonstrou-se que a plataforma eletroqumica funcionalizada com o
poli(4-ABA), apresentou-se eficaz na imobilizao bem como na sensibilidade de deteco da
interao da sonda com o alvo especfico. Foi possvel comprovar que a interao do peptdeo
DD K com as membranas mimticas de 1-palmitol-2-oleil-fosfatidilcolina (POPC) afetada
pela presena de colesterol. Assim, os estudos de construo do biossensor com deteco
impedimtrica mostraram resultados satisfatrios, a EIE, podendo ser, portanto, uma
ferramenta utilizada com sucesso para a investigao do processo de interao do peptdeo
DD K com lipossomas. Alm disso, no foi reportado na literatura estudos da interao e
deteco

de

peptdeos

com

membranas

fosfolipdicas,

utilizando-se

plataformas

eletroqumicas bem como plataformas funcionalizadas com filmes polimricos.

A especificidade do biossensor impedimtrico foi avaliada, atravs da variao da
fora inica do meio. Assim, a diminuio e o aumento na concentrao (KCl 0,10 M) do
eletrlito suporte em cerca de 10x mostraram resultados completamente diferentes para os
sistemas investigados. Os espectros de impedncia eletroqumica, obtidos nas mesmas
condies que os das Figuras 35 e 37, alterando somente a concentrao do eletrlito suporte,

72

KCl para 0,01 M e para 1,0 M esto em fase de estudo e so apenas resultados preliminares.
Como propostas futuras tm-se a utilizao de outras tcnicas para anlise de
caracterizao sobre a estrutura do material estudado. Alm disso, promover a otimizao dos
parmetros do biossensor impedimtrico proposto no sentido de garantir melhor desempenho
do mesmo nas medidas de reconhecimento biolgico.

73

6. CONCLUSO E PERSPECTIVAS
A proposta deste trabalho foi contribuir na rea do desenvolvimento de sensores
eletroqumicos, pela investigao da utilizao de plataformas eletroqumicas funcionalizadas
com filmes polimricos aplicadas a biossensores.
Foram desenvolvidos eletrodos modificados com filmes polimricos derivados do
cido 4-aminobenzico (4-ABA), com posterior aplicao na imobilizao de biomolculas
para a produo de biossensores eletroqumicos, visando contribuir para o desenvolvimento
de sensores biolgicos que possam ser utilizados na deteco em tempo real de amostras que
possam ser de interesse clnico, biolgico e/ou ambiental.
Realizou-se a eletropolimerizao do cido 4-aminobenzico sobre eletrodos de
grafite, utilizando-se as tcnicas de VC e CA. A eletropolimerizao foi realizada em meio de
cido perclrico, onde foi possvel observar a deposio do poli(4-ABA), sendo que este
material apresentou atividade eletroqumica, caracterizada pela presena de dois pares redox
eletroativos.
Verificou-se que a VC apresentou melhores resultados e se mostrou mais eficiente em
todas as anlises realizadas comparada com a CA. Comparou-se tambm o tempo de
eletropolimerizao para a CA e concluiu-se que o perfil eletroqumico obtido foi semelhante
para os filmes eletropolimerizados no tempo de 4800 segundos e 2400 segundos. Maiores
quantidades de filme polimrico foram obtidas no potencial constante de 1,05 V, o que foi
comprovado pelos resultados de MEV e EIE, pois atravs das medidas de espectroscopia de
impedncia eletroqumica verificou-se uma maior resistncia transferncia de carga para o
eletrodo modificado no potencial 1,05 V, seguido do eletrodo modificado por VC.
Alm de uma semelhana entre os perfis eletroqumicos, concluiu-se que os filmes
eletropolimerizados por CA no potencial constante de 1,05 V so mais promissores para a
imobilizao das bases pricas adenina e guanina, precursoras na deteco de genossensores,
pois estes apresentaram uma melhor resposta na imobilizao destas bases nitrogenadas.
Assim, o eletrodo de grafite modificado com poli(4-ABA) se mostrou uma eficiente
plataforma para a imobilizao e deteco das bases nitrogenadas.
Por meio dos estudos realizados com a eletropolimerizao do 4-ABA sobre eletrodos
de grafite, bem como da incorporao de biomolculas sobre a matriz de poli(4-ABA), podese concluir que a plataforma poli(4-ABA)/EG se mostrou bastante promissora para o
desenvolvimento de genossensores.
Desta forma, o eletrodo de grafite modificado com poli(4-ABA) foi eficiente para a

74

imobilizao do oligonucleotdeo (poliGA), bem como a deteco de hibridizao com o

oligonucleotdeo complementar (poliCT). Quando os intercaladores azul de metileno e
brometo de etdio foram utilizados, estes apresentaram resultados satisfatrios para o
reconhecimento dos processos de hibridizao. A ssDNA apresentou melhor afinidade pelo
AM enquanto que a resposta eletroqumica do BE foi melhor observada na dsDNA.
Foi possvel observar melhorias significativas para os eletrodos modificados, tanto na
imobilizao como na deteco dos oligonucleotdeos, em relao aos eletrodos no
modificados. O reconhecimento da hibridizao pode ser avaliado pelas duas metodologias
propostas (deteco indireta do AM e BE). Tais resultados so promissores no
desenvolvimento e aprimoramento destas plataformas funcionalizadas para genossensores.
Foram avaliados estudos pela imobilizao do peptdeo DD K, com o alvo especfico
(fosfolipdeo POPC), e o alvo no especfico (fosfolipdeo POPC + colesterol). Para os trs
sistemas investigados foi evidente o aparecimento de dois semicrculos, um em regies de
altas frequncias e outro em regies de baixa frequncia. A imobilizao do peptdeo no
gerou grandes alteraes no perfil dos espectros de EIE, quando comparados aos espectros
somente da plataforma funcionalizada, o que leva a indicao que houve uma forte interao
na interface polmero/peptdeo. Foi possvel observar uma semelhana entre os diagramas de
Bode para as medidas da sonda e da sonda + alvo especfico, devido forte interao
existente entre peptdeo/LUVs sem colesterol, que destri as LUVs. Contudo, para o eletrodo
contendo a sonda + alvo no especfico (LUVs com colesterol), o diagrama de Bode
apresentou um perfil diferenciado, pois o resultado totalmente alterado em relao sonda.
Como perspectiva tem-se o estudo da imobilizao de fragmentos de DNA contendo
32 e/ou 64 pares de bases, com posterior deteco com o respectivo alvo complementar, para
a construo de sensores biolgicos, bem como a utilizao de agentes intercaladores (AM e
BE) para o reconhecimento do evento de hibridizao, bem como investigar outros peptdeos
e agentes de reconhecimento, alm da otimizao dos procedimentos de imobilizao e
deteco. De modo geral, muito estudo ainda pode ser realizado para otimizar os parmetros
dos biossensores propostos, garantindo-se assim melhor desempenho dos mesmos nas
medidas de reconhecimento biolgico.

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84

APNDICE A
Tcnicas eletroanalticas
A eletroqumica moderna tem sido empregada como uma ferramenta poderosa para
estudar processos tecnolgicos em uma variedade de campos de pesquisa, incluindo
biotecnologia, eletrnica e cincia dos materiais. Dos muitos mtodos eletroqumicos
disponveis, a voltametria, nas suas diversas formas, talvez a tcnica mais verstil e efetiva
para estudar sistemas redox, alm de ser bastante til em eletroanlise78.
Nas ltimas dcadas, os mtodos eletroanalticos tm sido propostos como alternativas
viveis e promissoras. Eles tm despertado grande interesse devido ao seu baixo custo e,
principalmente, por possibilitar o uso de eletrodos quimicamente modificados. Estes eletrodos
podem promover uma maior sensibilidade, aplicabilidade e estabilidade para o sistema em
estudo, frente aos eletrodos no modificados79,80.
Quando as tcnicas eletroqumicas foram desenvolvidas, eram baseadas em eletrodos
de trabalho de mercrio. Como o mercrio um metal lquido, os sistemas utilizavam
medidas em gotas e o eletrodo era conhecido como eletrodo gotejante de mercrio. Surgia a
polarografia, por utilizar mercrio como eletrodo de trabalho. Com o passar do tempo novos
eletrodos surgiram pela necessidade de trabalho em regies de potencial diferentes da qual o
mercrio atuava. Eletrodos slidos de platina, ouro e carbono vtreo, grafite so atualmente os
mais importantes e usuais11.
A caracterizao da superfcie de um eletrodo de extrema importncia, a fim de se
compreender suas estruturas e composio, proporcionando resultados mais eficientes. Sendo
assim, a compreenso da estrutura bsica da matria tem se apresentado como um desafio ao
longo do tempo, o que permite com que se compreendam as suas propriedades81. As tcnicas
eletroqumicas so bastante utilizadas para se detectar substncias de interesse por serem
relativamente simples e rpidas e por permitir uma anlise mais detalhada das reaes
envolvidas entre substrato-elemento biolgico. Como exemplos destas tcnicas podem ser
citados, a voltametria cclica, voltametrias de pulso, cronoamperometria e espectroscopia de
impedncia eletroqumica. Para uma melhor compreenso da morfologia e topografia dos
polmeros usados como matriz utilizada a tcnica de microscopia eletrnica de varredura
(MEV)3.
Na literatura, os biossensores voltamtricos so muito comuns22. Dentre os mtodos
voltamtricos em eletroqumica, destacam-se a voltametria cclica e voltametria de pulso

85

diferencial. A voltametria cclica, dentre outras funes, muito utilizada para a modificao
dos eletrodos de trabalho com polmeros e sua caracterizao.
Voltametria cclica
A voltametria uma tcnica onde as informaes quantitativas e qualitativas de uma
espcie qumica so obtidas a partir do registro de curvas de potencial versus corrente, feitas
durante uma eletrlise da espcie qumica em questo contida em uma clula eletroqumica11.
uma das tcnicas voltamtricas mais usadas para o estudo de espcies eletroativas em
soluo ou imobilizadas nos eletrodos, que fornece informaes importantes do sistema
redox1,82.
Dentre os mtodos conhecidos para estudar os processos de eletrodo, os de varredura
de potencial so provavelmente os mais usados70. A voltametria cclica mostra-se
particularmente eficiente quando se deseja conhecer a eletroatividade de compostos
(especialmente molculas biolgicas), investigar reaes qumicas acopladas e estudar
superfcies de eletrodos. A tcnica tambm fornece informaes a respeito da reversibilidade
eletroqumica de um sistema, que est associada troca rpida de eltrons entre as espcies
redox e o eletrodo78.
O estudo dos mecanismos de reao em soluo possibilita detectar intermedirios
eletroativos tanto para reaes relativamente lentas como as rpidas1. Consiste na medida das
correntes geradas em funo de uma dada programao de potenciais imposta a um eletrodo.
Os mtodos de varredura de potencial consistem na aplicao de um potencial ao eletrodo de
trabalho variando continuamente com o tempo o que conduz ocorrncia de reaes de
oxidao ou reduo de espcies eletroativas na soluo.
As curvas corrente-potencial, conhecidas por voltamogramas, so obtidas pela
variao gradual do potencial aplicado a um eletrodo de trabalho imerso em uma clula
eletroqumica contendo a soluo de interesse, frente a um eletrodo de referncia estvel e um
eletrodo auxiliar. A forma da perturbao do eletrodo, pela aplicao de diferentes
programaes de potenciais, define a natureza da tcnica voltamtrica1.
A voltametria cclica, apesar de nem sempre fornecer resultados com elevada
sensibilidade, permite que se obtenha rapidamente informaes sobre um sistema
eletroqumico, umas das tcnicas mais utilizadas para adquirir informaes qualitativas
sobre os processos eletroqumicos29.
A causa de sua menor sensibilidade (comparada com outras tcnicas voltamtricas) a

86

variao contnua do potencial aplicado. Ao ser variado o potencial, gera-se corrente

capacitiva, que vai se somar corrente faradica. Em baixas concentraes de analito, a
contribuio da corrente capacitiva se torna significativa e como no pode ser distinguida da
faradica, inviabiliza a anlise29.
Um voltamograma cclico indica em que regio de potencial determinada reao redox
(compostos eletroativos) ir ocorrer. A tcnica tambm fornece outras informaes a respeito
de um sistema, como: o nmero de eltrons envolvidos no processo e se ocorre formao de
espcies intermedirias, etc. Para utilizao das tcnicas voltamtricas, necessita-se de um
potenciostato ou galvanostato29.
O eletrodo mais importante, onde ocorre a reao de interesse, o de trabalho, que
pode ser constitudo de diferentes materiais, dentre os quais, as vrias formas de carbono
(carbono vtreo, piroltico, diamante, nanotubos e p de grafite) e os metais nobres (ouro,
platina), que apresentam faixa de trabalho mais ampla. Metais menos nobres (cobre, nquel,
cobalto) e outros podem ser utilizados para determinadas aplicaes. O eletrodo auxiliar
(construdo geralmente por material inerte, na maioria das vezes platina) deve ter rea
superior do eletrodo de trabalho e tem a funo de fornecer a corrente necessria para
sustentar a reao. O eletrodo de referncia tem o papel de monitorar o potencial aplicado
pelo eletrodo de trabalho. Dessa forma, o ER no pode sofrer alteraes de potencial
resultantes do fluxo de corrente. Nos potenciostatos modernos, a elevada resistncia do
circuito evita um fluxo de corrente significativo atravs do eletrodo de referncia e a
consequente alterao de seu potencial29.
Na forma de aplicao do potencial na voltametria cclica, o potencial varrido
linearmente com o tempo no eletrodo de trabalho, em uma soluo sem agitao. Dependendo
da informao desejada, simples ou mltiplos ciclos podem ser utilizados29.
Os processos redox que acontecem no ET so representados pelos principais
parmetros em um voltamograma cclico, que so o potencial de pico andico (Epa) e catdico
(Epc), e a corrente de pico andica (Ipa) e catdica (Ipc). Para uma reao reversvel de
eletrodo, as correntes de pico andico e catdico so aproximadamente iguais em valor
absoluto, mas de sinais opostos, e a diferena entre os picos de potenciais para um sistema
reversvel 0,0592/n, onde n o nmero de eltrons envolvidos na semi-reao70,83.
Entre as vrias aplicaes da tcnica de voltametria cclica, sua utilizao nos estudos
envolvendo polmeros condutores de grande importncia, fornecendo vrios parmetros
relacionados aos estgios de crescimento, na elucidao do mecanismo redox, alm de
proporcionar um excelente controle sobre a qualidade dos polmeros1,84.

87

Assim, a voltametria cclica uma ferramenta para estudos fundamentais e de

diagnstico, que fornece informaes qualitativas sobre

mecanismos de reaes

eletroqumicas e identificao de espcies presentes em soluo. No entanto, para um estudo

quantitativo necessrio empregar tcnicas mais sensveis como, por exemplo, as tcnicas de
voltametria de pulso ou de onda quadrada. A voltametria de pulso diferencial muito utilizada
na construo de biossensores1.
Voltametria de pulso diferencial
As voltametrias de pulso diferencial geralmente so mais sensveis do que a
voltametria cclica, e sensibilidade ainda melhores do que as obtidas por voltametria de pulso
normal podem ser obtidas com a voltametria de pulso diferencial. Esta tcnica apresenta
diferenas com a de pulso normal, tais como o potencial de base aplicado no ser constante.
Ao invs disso, muda em pequenos incrementos, a altura do pulso de apenas 10 a 100 mV.
Um nvel constante em respeito ao potencial de base mantido e duas correntes so
amostradas. Uma imediatamente antes do pulso e outra antes do fim do pulso e o experimento
obtido como uma diferena entre as duas contra o potencial. O nome da tcnica devido ao
processo de diferenas entre as duas correntes. O melhoramento da tcnica vem, novamente,
da maior reduo da contribuio da corrente capacitiva. Os melhoramentos na tcnica
fornecem sensitividades em magnitude melhores do que a voltametria de pulso normal.
Limites de deteco menores que 10-8 mol dm-3 podem ser alcanados. Esses baixos valores
so de interesse, dentre outras aplicaes, para deteces de biomolculas em sensores
biolgicos, cuja finalidade a anlise de amostras em concentraes baixas para identificao
de pequenas quantidades de contaminantes em solo, gua e alimentos ou diagnstico em
estgios iniciais de doenas85.
Cronoamperometria
Outra tcnica voltamtrica bastante utilizada para estudar reaes de eletrodo e suas
velocidades a cronoamperometria. Neste sentido, esta tcnica normalmente empregada
para complementar a voltametria cclica na anlise de mecanismos eletroqumicos. A
cronoamperometria se baseia na aplicao de um nico degrau de potencial, produzindo-se
uma corrente que decai rapidamente com o tempo78.
A cronoamperometria se constitui em uma tcnica vastamente utilizada em

88

eletroanlise, principalmente em aplicaes tpicas envolvendo titulaes amperomtricas,

sensores amperomtricos e clulas em fluxo. Medidas amperomtricas so muito teis para
avaliar biossensores29.
Uma grande vantagem da cronoamperometria que, comparada com a voltametria
cclica para a quantificao de baixas concentraes de analito, pelo fato de ser uma tcnica
conduzida a potencial constante, a corrente residual obtida apresenta valores muito baixos29.
Uma vez que o potencial do eletrodo mantido em um nico valor fixo, a corrente capacitiva
(resultante do carregamento da dupla camada eltrica do eletrodo) torna-se constante,
virtualmente igual a zero. Isso confere tcnica maior sensibilidade, em relao voltametria
baseada na varredura de potenciais78.
A deteco amperomtrica baseia-se na medida de uma corrente (i) a um potencial (E)
fixo aplicado, ou seja, um sensor amperomtrico mantido num potencial constante. A
deteco amperomtrica a potencial constante utiliza instrumentao simples e de baixo custo,
razo pela qual foi a mais explorada em sistemas para a determinao de uma grande
variedade de compostos eletroativos29.
Uma das limitaes desta tcnica a baixa seletividade. Se a anlise realizada em
potenciais extremos (positivos ou negativos), promove-se a oxidao ou a reduo de todas as
espcies que so eletroativas em potenciais abaixo do valor estabelecido. Portanto,
aconselhvel empregar valores mnimos de potencial78.
Outra limitao associada deteco amperomtrica est na estabilidade do sinal
eletroqumico, quando determinados compostos so analisados, comprometendo a
repetibilidade da corrente eletroqumica (sinal eletroqumico) e a reprodutibilidade dos
resultados da anlise. A estabilidade do sinal eletroqumico governada pela taxa de
transferncia de carga (eltron) entre o eletrodo e a espcie eletroativa (presente na interface
eletrodo-soluo) que, por sua vez, depende das condies da superfcie do eletrodo. A
superfcie do eletrodo pode ser modificada durante a anlise, dependendo do tipo de composto
que est envolvido no processo eletroqumico. Ou seja, quando a espcie eletroativa ou o
produto formado na reao de eletrodo ou ambos so adsorvidos na superfcie do eletrodo de
modo irreversvel ou quase-irreversvel, ocorre a contaminao ou a passivao do eletrodo. A
passivao ou a contaminao da superfcie do eletrodo pode afetar a taxa de transferncia de
carga entre o eletrodo e o analito, como tambm pode produzir sinais eletroqumicos devido
aos produtos adsorvidos, que interferem no sinal desejado29.
Os sensores amperomtricos se baseiam em reaes de oxidao e reduo, que
envolvem um determinado analito para medio de suas concentraes. Estas reaes geram

89

um fluxo de corrente entre os eletrodos, a qual, dentro de certas condies, proporcional

concentrao do analito que se deseja mensurar. O controle deliberado da reatividade
eletrodo/soluo um dos objetivos bsicos da eletroqumica, e tais conhecimentos tambm
so muito relevantes nas reas de eletrocatlise, eletroanlise e corroso, entre outras. Para
propostas analticas, sensores obtidos a partir de diversos substratos metlicos so aplicados
na determinao de vrias substncias de interesse29.
A presena de biomolculas sobre a superfcie de um eletrodo condutor proporciona
uma alterao de valores fsicos entre eletrodo e soluo de medida, como resistncia,
capacitncia e indutncia que sero proporcionais concentrao do analito. Dependendo do
tipo de material estudado sobre a superfcie, pode-se escolher a soluo de interesse que seja
adequada para se obter essas medidas. Isso normalmente realizado atravs de
Espectroscopia de Impedncia Eletroqumica86.
Espectroscopia de impedncia eletroqumica
A espectroscopia de impedncia eletroqumica (EIE) uma das tcnicas mais
poderosas e sensveis para investigao das propriedades eltricas da superfcie de eletrodos
modificados. Nos dispositivos impedimtricos, medidas diretas das propriedades eltricas da
superfcie so monitoradas. A EIE mede a resposta (corrente e sua fase) de um sistema
eletroqumico a um potencial de oscilao aplicado em diferentes frequncias sobre um
potencial d.c.69,87.
O princpio da tcnica consiste em aplicar uma perturbao senoidal de tenso ao
sistema, de pequena amplitude e de frequncia , gerando assim uma corrente AC provocada
por um potencial descrito como Esen (t), que, de acordo com a Lei de Ohm, origina a
impedncia, Z = [nEsen(t)]/i. E possvel perturbar o sistema usando diferentes valores de
frequncia, pois a onda de potencial senoidal. Uma vez que a perturbao no sistema sob
investigao de pequena amplitude, possvel empregar a tcnica para a anlise de etapas
de um mecanismo reacional88. A obteno de informaes a partir dos dados de impedncia
eletroqumica pode ser conduzida mediante a utilizao de diferentes modelos de medida,
como circuitos equivalentes ou modelos matemticos. Assim, tem-se um dos modos mais
utilizados para apresentar as medidas de impedncia, atravs do grfico de Nyquist, no qual se
pode observar os valores da parte imaginria da impedncia (Z) em funo dos valores da
parte real (Z).
Um diagrama de Nyquist ideal apresenta um semicrculo na regio de altas

90

frequncias e uma variao linear em mdias e baixas frequncias. Na regio de altas

frequncias, o efeito da relaxao de transferncia de carga mostrado atravs de um
semicrculo, do qual se pode obter os valores de Rs (resistncia do eletrlito e eletrodo), Rtc
(resistncia transferncia de carga) e Cdl (capacitncia da dupla camada eltrica)11.
Para o tratamento dos dados experimentais de impedncia, atribudo aos resultados
um circuito equivalente, que possa simular a resposta AC do sistema eletroqumico. Os
componentes do circuito podem ser: resistores que simulam o comportamento resistivo do
eletrodo, eletrlito e polmero; capacitores que simulam o comportamento capacitivo das
interfaces eletrodo/polmero e polmero/eletrlito; linhas de transmisso que simulam a
impedncia de difuso inica, tambm conhecida como impedncia de Warburg (W);
elementos de fase constante (EFC) e elementos de difuso (T)89.
Microscopia eletrnica de varredura
Em muitos campos da Qumica, Cincia dos Materiais, Geologia e Biologia, um
conhecimento especfico sobre a natureza das superfcies de slidos de grande importncia.
Assim, para se realizar uma anlise mais completa dos materiais, necessrio que se faa uma
anlise da imagem de sua superfcie, que nos d informaes a respeito de suas propriedades,
bem como de sua microestrutura e defeitos3.
Desta forma, uma das tcnicas mais empregadas para a caracterizao de materiais a
microscopia eletrnica de varredura (MEV). Essa tcnica permite estudar as caractersticas
morfolgicas e topogrficas de diferentes superfcies2, produzindo imagens de alta resoluo,
sem a perda de nitidez. A preparao de amostra e a obteno das imagens so relativamente
simples, o que faz esta tcnica ser uma das tcnicas mais utilizadas em pesquisas com
materiais90. A MEV se apresenta como a tcnica mais adequada para uma anlise mais
detalhada de morfologia, pois se podem alcanar aumentos superiores ao da microscopia
ptica. Em anlises de materiais, o aumento da ordem de 10.000 vezes ou superior3.
O microscpio eletrnico de varredura um dos mais versteis instrumentos
disponveis para a observao e anlise das caractersticas microestruturais, fornecendo
rapidamente informaes sobre a morfologia e identificao de elementos qumicos de uma
amostra slida. A principal funo de qualquer microscpio tornar visvel ao olho humano o
que for muito pequeno para tal. Ele possui as caractersticas essenciais necessrias a um
microscpio de alta resoluo. Como resultado tem-se que os aparelhos modernos permitem
aumentos de 300.000 vezes ou mais, para a maior parte de materiais slidos, conservando a

91

profundidade de campo compatvel com a observao de superfcies rugosas91.

Uma caracterstica importante do microscpio eletrnico de varredura a aparncia
tridimensional da imagem das amostras, resultado direto da grande profundidade de campo.
Permite, tambm, o exame em pequenos aumentos e com grande profundidade de foco, o que
extremamente til, pois a imagem eletrnica complementa a informao dada pela imagem
ptica91.
O MEV tem seu potencial ainda mais desenvolvido com a adaptao na cmara da amostra de
detectores de raios-X permitindo a realizao de anlise qumica na amostra em observao.
Atravs da captao pelos detectores e da anlise dos raios-X caractersticos emitidos pela
amostra, resultado da interao dos eltrons primrios com a superfcie, possvel obter
informaes qualitativas e quantitativas da composio da amostra na regio submicromtrica
de incidncia do feixe de eltrons. Este procedimento facilita a identificao de precipitados e
mesmo de variaes de composio qumica dentro de um gro. Atualmente quase todos os
microscpios eletrnicos de varredura so equipados com detectores de raios-X, sendo que
devido confiabilidade e principalmente devido facilidade de operao, a grande maioria
faz uso do detector de energia dispersiva (EDX)92.