Comercializadora de Lcteos y

Derivados S.A. de C.V.

PROCEDIMIENTO
Ttulo:

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1 de 4

Determinacin de Antibiticos.
Prueba del Delvotest P
No. de Rev.
Fecha de revisin:
Primera
Mayo 2008

Departamento:
Aseguramiento de Calidad
Clave:
TZ-ACC-003-FQ
Fecha de elaboracin:
Enero 2005

1. FUNDAMENTO.Los residuos de antibiticos en la leche son indeseables desde el punto de vista de las
consideraciones sanitarias y por razones tcnicas ganaderas.
Se basa en la inhibicin del desarrollo de Bacillus Stearothermophillus var. Calidolactis por
la accin de los antibiticos. Este microorganismo se ha elegido por su alta sensibilidad a la
mayora de los antibiticos y especialmente a la penicilina.
Las esporas que contiene el medio, se han tratado de tal forma, que en condiciones favorables
puede lograrse el mximo crecimiento. Cuando se aaden sustancias nutritivas y la temperatura se
aumente a 63-65 C en el bao mara, los bacilos se desarrollan rpidamente con produccin de
cido, a las 2 horas se habr producido cido en cantidad suficiente para virar el indicador de pH
de prpura a amarillo. Si la muestra de leche agregada contiene residuos de antibiticos en
concentracin suficientemente alta, stos inhibirn el desarrollo del microorganismo tras difundirse
en el medio; en este caso, no se formar cido y el color del indicador permanecer prpura.
El microorganismo es sensible a niveles de 0.003 UI/ml de penicilina, frenndose su
desarrollo a niveles de 0.006 UI/ml el crecimiento se impedir totalmente.
Aunque la prueba est diseada para la determinacin de residuos de penicilina, otros
antibiticos a concentraciones determinadas darn tambin resultados positivos (Ver anexo 1).
Esta prueba se utiliza comnmente como mtodo de inspeccin de leche en: Australia,
Canad, Irlanda, Francia, Nueva Zelanda, Suiza, Sudfrica, Estados Unidos y Portugal.
2. ALCANCE.Leche fresca
3. MATERIALES Y EQUIPO.

Kit Delvotest P (Gist-Brocades N V)

Pinzas
Bao mara a 64 1 C
Gradilla o recipiente adecuado (para introducir en el bao Mara)

4. REACTIVOS.N/A
Elabor:

Revis:

Autoriz:

Aseguramiento de Calidad

L. Q. Ma. Concepcin Elizalde

Jefe Aseguramiento de Calidad

Ing. Diana Tovar G.

Coordinador HACCP

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Determinacin de Antibiticos.
Prueba del Delvotest P
No. de Rev.
Fecha de revisin:
Primera
Mayo 2008

Departamento:
Aseguramiento de Calidad
Clave:
TZ-ACC-003-FQ
Fecha de elaboracin:
Enero 2005

5. PROCEDIMIENTO.5.1.

Determinacin de antibitico
5.1.1.Para cada muestra de leche, utilizar una ampolleta (Nota 1). Romper el cuello de la
ampolleta y colocar una tableta nutritiva en la ampolleta utilizando pinzas (utilizar una
ampolleta para cada muestra de leche).
5.1.2.Colocar una pipeta toma muestras seca en la jeringa dosificadora. Oprimir por completo
el mbolo de la jeringa y sumergir el extremo de la pipeta en la muestra de leche (aprox. 1
cm de profundidad).
5.1.3.Dejar que el mbolo retorne a su posicin lentamente; con este proceso de toma 0.1 ml de
leche.
5.1.4.Depositar la muestra en la ampolleta. Es necesario utilizar una pipeta desechable por cada
muestra. Colocar el soporte con las ampolletas en un bao mara a 64 C.
5.1.5.El nivel del lquido de la muestra debe estar aproximadamente cm por debajo del nivel
del agua, de modo que la ampolleta no flote. La temperatura del agua deber controlarse
al mismo nivel que el del lquido de las ampolletas.
5.1.6.Incubar a 64 1 C por 2 horas.
5.1.7.Observar inmediatamente la coloracin del medio al terminar el perodo de incubacin.

5.2.

Interpretacin de resultados
2.1.1. Una coloracin amarilla de todo el medio slido, indica resultado negativo. Una
coloracin prpura de todo el medio slido, indica un resultado positivo.
2.1.2. En ocasiones puede observarse una coloracin en parte amarilla y en parte prpura del
medio slido, esto se debe al lmite de deteccin de la prueba que se ubica en 0.003 UI/ml
de penicilina, por tanto, entre 0.004 y 0.005 UI/ml se pueden encontrar coloraciones parte
amarillas y parte prpuras. El vire franco del indicador se detectar a niveles de 0.006
UI/ml en adelante (Notas 5 y 6).

5.3.

Consideraciones especiales
5.3.1. La determinacin es muy sensible, por lo que antes de realizar la prueba hay que:

Evitar la contaminacin con antibiticos o desinfectantes de fuentes externas.

Lavarse y enjuagarse las manos cuidadosamente.

5.3.2. Las variaciones en las temperaturas pueden influir en el crecimiento del bacilo, afectando
la duracin de la prueba, as por ejemplo, incubar a 57 C requiere aproximadamente 4
horas; a 59 C 3 horas; a 68 C 3 horas y a 70 C 4 horas.
5.3.3. Los resultados de la prueba deben leerse inmediatamente despus de sacar las muestras
del bao mara, 30 minutos despus de enfriarse stas, los colores pueden cambiar
ligeramente. Esto ocurre especialmente con muestras cuya coloracin es solo parcial.

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5.3.4. Un resultado positivo solo indica la presencia de determinadas concentraciones de

sustancias inhibidoras. Los restos de penicilina o de ampicilina pueden identificarse
empleando penicilinaza, enzima que inactiva a estas penicilinas. Se aade penicilinaza a
parte de la muestra de leche. Mantener a 20 C por un perodo defino de tiempo (una
unidad de penicilinaza a 20 C inactiva aproximadamente 0.02 UI de penicilina en la
leche en 15 minutos), de tal manera que se inactive toda la penicilina presente. Volver a
repetir la prueba; un resultado negativo en la muestra que dio positivo antes de tratarla, es
confirmativo de la presencia de penicilina o ampicilina. Hay que tener en cuenta, que las
penicilinas semi-sintticas como la cloxacilina y nafcilina son prcticamente insensibles a
la penicilinaza y no pueden identificarse de esta forma.
5.3.5.Existen posibles bajas de que la prueba d resultados incorrectos, por ejemplo: por la
presencia de sustancias inhibidoras en la leche o en el medio slido.
5.3.6.Con muestras de leche de animales al final de la lactancia aumenta la posibilidad de
interferentes, con frecuencia se tratar de leche con elevado contenido microbiano. Esto
puede eliminarse por ebullicin de la leche. Otro mtodo til, es variando la colocacin de
muestra y pastilla: se pone primero la leche en la ampolleta, al cabo de 15 minutos a
temperatura ambiente, se retira la muestra (con pipeta Pasteur) y se aade el comprimido
nutritivo. Se efecta la incubacin normal y la lectura de resultados. Otra posibilidad, es
la presencia de leche con pH cido (aproximadamente 6.0), la cual dar coloracin
amarilla del medio slido, incluso sin conocimiento de Bacillus Stearothermophillus. En
este caso, neutralizar primero hasta pH 6.7.
5.3.7.Es conveniente hacer un blanco, utilizando agua destilada en lugar de leche. El medio
debe virar amarillo.
6. CALCULOS.N/A
7. REFERENCIAS.

Gist-Brocades NV Industrial Products Div.

Pruebas de Difusin Estndar para la determinacin de Residuos de Antibioticos.
Product Bulletin Dte. -0.2/82. 03 Sp. 03

Internacional Dairy Federation Bulletin.

Antibiotic Residues in Milk
Document 157. 1983.

ANEXO

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Sensibilidad de la prueba a otros antibiticos empleados en el tratamiento de la mastitis.

ANTIBITICO
Penicilina

CONCENTRACIN MNIMA
DETECTABLE
(Tonos prpuros al medio)
0.003 UI

CONCENTRACIN MNIMA
APRECIABLE
(Color prpura en todo el medio)
0.004 UI

Cloxacilina

0.020 g

0.025 g

Tafcilina

0.007 g

0.010 g

Ampicilina

0.003 g

0.003 g

Tetraciclina

0.15 g

0.20 g

0.20 g

0.30 g

0.25 g

0.30 g

8 g

10 g

5 g

8 g

2 g

10 g

18

Oxitetraciclina
Clortetraciclina
Cloranfenicol
Estreptomicina
Neomicina
Kanamicina
Bacitracina

0.07 g

0.10 g

Rifamicina

1.25 g

1.75 g

Espiramicina

0.02 g

0.05 g

Eritromicina

0.2