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A SNTESE QUMICA DO DNA

A sntese qumica
do DNA
Um instrumento indispensvel
s manipulaes genticas
Introduo
Ii menos de 10 anos, a sntese qumica de DNA era
um domnio esotrico, apangio de alguns qumicos
especializados. Calculava-se, em 1975, que seriam necessrios 20 anos para sintetizar um gene de 100 nucleotdeos segundo um esquema optimizado por computador ( 1 ).
Actualmente possvel realizar este trabalho em poucas semanas: por exemplo ns sintetizmos recentemente um gene de 270 nucletidos em cerca de um ms
a partir de dinucletidos protegidos. Esta proeza tcnica ao alcance de um nmero crescente de laboratrios
s possvel graas ao desenvolvimento acelerado das
tcnicas de sntese qumica, catalisado pelo advento das
tcnicas da Engenharia Gentica. O alargamento contnuo do campo de aplicao dos fragmentos sintticos
de DNA, assim como o aspecto fundamental do estudo
estrutural de certas sequncias particulares, constituram estmulos poderosos para os qumicos orgnicos
cujos esforos conduziram ao ajustamento e ao aperfeioamento das tcnicas de sntese.
Apresentamos neste artigo um resumo geral da qumica
que est na base da sntese de DNA tal como ela praticada actualmente, e algumas das suas aplicaes.

Alfredo Cravador *

i) funcionalizao de um polmero insolvel

ii) fixao do primeiro desoxirribonucletido protegido da cadeia oligodesoxirribonucletida a sintetizar, sobre a funo do suporte slido
iii) clivagem da cadeia de DNA do suporte slido

1 Preparao dos blocos de base para a sntese

As substncias de base na sntese de DNA so os quatro desoxirribonucletidos: timidina, desoxicitidina, desoxiadenosina e desoxiguanosina; (obtidos por degradao de ADN de origem natural). (Esquema 1).
Esquema 1

o
HO

NH,

HO

OH
Timidind

OH

Desoxicitidina

I Princpios da sntese qumica de DNA

l/ N

HO

HO

A sntese qumica em soluo de um oligodesoxinucletido comporta as seguintes etapas:

OH

1 Preparao dos quatro desoxinucletidos: timidina, desoxicitidina, desoxiadenosina e desoxiguanosina

completamente protegidos. Estes so os blocos fundamentais para a sntese.
2 Desproteco selectiva de dois desoxinucletidos a
condensar, de maneira a libertar em cada um dos blocos unicamente as funes implicadas na formao da
ligao internucleotdica.
3 Condensao dos compostos assim gerados para
formar um dmero inteiramente protegido.

NH

Desoxiadenosina

OH

Desoxiguanosina

Na molcula desoxinucleosdica podem-se distinguir

trs centros que vo ser objecto de trs formaes distintas: as bases, as funes hidroxlicas em posio 5 '
e posio 3 '.
a) Proteco das funes aminas exocclicas

4 Extenso da cadeia de DNA repetindo as reaces

das etapas 2 e 3 at obteno de um oligodesoxirribonucletido completamente protegido.
5 Desproteco sequencial e controlada do oligodesoxirribonucletido.
6 Isolamento, purificao e caracterizao.

As bases que possuem funes aminas primrias (a timidina no possui) tm que ser protegidas.
Esta proteco permanente visto que o centro aminado no est implicado nas reaces de extenso oligomrica. Portanto os grupos protectores devem ser estveis ao longo de todas as etapas de sntese. No entanto
eles devem poder ser retirados no fim da sntese em
condies que preservem a integridade da molcula fi-

Quando a extenso da cadeia desoxirribonucleotdica

realizada em fase slida, so necessrias algumas etapas suplementares:

* Investigador no Laboratrio de Gentica Aplicada. Dpartement de Biologie Molculaire. Universit Libre de Bruxelles
Blgica.

22

A SNTESE QUMICA DO DNA

nal. Os grupos que, nas estratgias de sntese mais utilizadas, melhor satisfizeram estas condies, so o grupo benzolo para a desoxicitidina e a desoxiadenosina e
o grupo isobutanolo para a desoxiguanosina ( 2 ). A sua
introduo tem de ser selectiva a fim de no bloquear
os grupos hidroxlicos do ciclo desoxirribofuranosilo.
Estes grupo so objecto de uma proteco transitria
que pode ser especificamente removida aps acilao
dos grupos aminados ( 3 ) (Exemplo: esquema 2).

rando-se benefcio da sua selectividade pela posio 5 '

devido a factores estricos. (Exemplo: esquema 3).
Sequa.

CH,
o

OCH,

H
H

N
CI

_L

o
Ossoriadenosina

Esquema 2

HO

NH2

NH2

Si O
C I S i (CH , ),

OH

Si

Desoxicitidina

HO
NH 2 OH dil

OH

O
Si-^

Uma proteco suplementar original foi recentemente

introduzida por vrias equipas, destinada a proteger a
funo lactmica da desoxiguanosina, fonte de reaces secundrias durante as reaces de condensao e
de fosforilao ( 4 ).

OCH,

CH,

ONT CI

O grupo 4,4 '-dimetoxitritilo pode ser quantitativa e rapidamente retirado em condies de baixa acidez (Ex.:
cido dicloroactico, brometo de zinco) sem ruptura ou
com ruptura insignificante da ligao glicosdica; esta
reaco conduz formao do catio dimetoxitritilo de
cer laranja cuja absorvncia pode ser medida espectrofotometricamente. Esta medida particularmente til
na sntese em fase slida pois ela a nica indicao
da eficcia das reaces de condensao durante a
construo da cadeia oligonucleotdica.
/3) A fosforilao em posio 3 ' dos nucleosdeos protegidos nas bases e no grupo hidroxlico em 5 ' pode
conduzir, segundo a estratgia escolhida, a um bloco
completamente protegido, ou a uma espcie fosforilada
activa capaz de reagir directamente com outro bloco
desoxinucleotdico desprotegido em posio 5 ' para
formar a ligao internucleotdica.
Numerosos agentes de fosforilao tm sido utilizados
em sntese de oligodesoxirribonucleotdeos, sobretudo
na metodologia do fosfatotrister (Esquema 4).

0.17 0
MT 0

^,Nt

.._

b) Transformao dos grupos hidroxlicos

F.

q^a''''Y'ae

_.
'0T ! =m

Das funes hidroxlicas em posio 5 ' e 3 ' uma tem

de ser protegida por um grupo protector transitrio, a
outra fosforilada. A escolha do centro a fosforilar depende da estratgia adoptada.
A estratgia que consiste em fosforilar a posio 3 '
deu at agora os melhores resultados e tem sido utilizada nos mtodos gerais de fosfatotriester e de fosfitotrister.

a) A proteco do grupo hidroxlico em posio 5 '

tem de ser temporria. Ela tem de ser removida antes
de cada etapa de condensao durante a extenso da
cadeia desoxirribonucleotdica. O grupo protector deve
neste caso possuir as propriedades seguintes:
i) poder ser introduzido selectivamente em posio 5 '
deixando intacta a funo hidroxlica em posio 3 ';
ii) poder ser retirado em condies suaves que no
dem lugar a nenhuma reaco secundria;
iii) ser estvel em todas as etapas de sntese, de desproteco e de purificao que se seguem sua introduo;
i) eventualmente facilitar pela sua introduo a purificao dos intermedirios de sntese.
Entre outros grupos introduzidos com bons resultados
o 4,4 '-dimetoxitritilo um dos mais correctamente
adoptados ( 5 ). introduzido atravs do seu cloreto ti-

se ptoteqlCs
Oimetur}tritllo
alquilo, alquilo aWatltuldo ...
2_atilarilo
ltlo.ri lo, atilo subst iculao
trlasolo, oalbvotrlarolocloro ...

]`i

Um dos substituintes do tomo de fsforo protege de

maneira permanente o anio fosfato responsvel pelos
fracos rendimentos das reaces de condensao, assim
como das dificuldades crescentes de purificao e de
solubilidade com o comprimento dos oligmeros, surgidas na metodologia inicial dos fosfatodister ( 6 ).
O outro substituinte tem um papel de proteco temporria destinada a ser substituda pela ligao fosfato
internucleotdica.
O grupo protector permanente deve possuir uma estabilidade total durante as reaes de eliminao dos
grupos protectores temporrios e durante as reaces
de condensao. No deve interferir negativamente
com o rendimento e a eficcia destas ltimas. Ele tem
no entanto que ser retirado especificamente no fim da
sntese sem provocar a ruptura concorrente das ligaes internucleotdicas.

23

A SNTESE QUMICA DO DNA

O grupo protector transitrio deve ser suficientemente

estvel para permitir o isolamento, a purificao e a
estocagem dos blocos desoxinucleotdicos completamente protegidos. A sua eliminao deve ser especfica
e rpida em condies que preservem os grupos protectores permanentes e o grupo protector temporrio em
posio 5 '.
Os grupos ortoclorofenilo (R = o.C1C6I Ia com Y = 0)
permanente e o cianoetilo (R = CII2CI I2CN com Z = 0)
temporrio (ver esquema 4) so exemplos de grupos
muito utilizados na metodologia dos fosfatotrister ( 7 )
(Exemplo: esquema 5).
Esquema 5

DMTO
DMT
.

\ N

)4_P
I

mente por um lado a funo fosfato e por outro o grupo hidroxlico 5 ' das suas proteces temporrias. Por
exemplo, o grupo dimetoxitritilo retirado em condies cidas suaves e o grupo cianoetilo em condies
bsicas suaves.
3 Reaces de Condensao
A reaco de condensao necessita evidentemente da
formao de espcies activas capazes de reagir com
bons rendimentos sem formao de produtos secundrios.
A activao do fosfatodister frequentemente realizada pela aco conjugada de um cloreto de arilosulfonilo e de uma amina heterocclica, ou de uma sulfonamida preparada antecipadamente a partir deste tipo de
compostos ('D) (Esquema 7).

^
^^

OH

0- 13 -N

DMTO.

'N

NJ

Dp

e'

CI

1,4"t, ^

/y

PINTO

o-P

II

EI,N

M8NT

H 2O

P OCH,CH,CN

DMTO

o- P OCNplFN

DMTO

-ocN,CH,CN

0- P- H NEt,

o -P -oCH,CH,CN

II

CI

CI

O grupo protector permanente correntemente utilizado

na metodologia do fosfitotrister o radical metilo. O
terceiro substituinte do tomo do fsforo um grupo
azodialquilo introduzido em substituio de um tomo
de cloro, o qual confere uma reactividade particularmente forte ao intermedirio fosfocloridrito (utilizado
durante o desenvolvimento inicial do mtodo) ( 8 ) que o
torna instvel e de emprego pouco cmodo.
Os compostos diisopropilamino e morfolino-fosforoamidito possuem um bom compromisso de reactividade-estabilidade (Exemplo: esquema 6).

A activao dos fosforoamiditos realizada por um

agente de protonao, cido fraco (Ex.: o tetrazole
pKa = 4,9) que acelera a quebra do grupo dialquilamina e favorece o ataque pela funo hidroxlica que vai
estabelecer a ligao internucleotdica ("). No portanto possvel dentro desta metodologia eliminar o grupo dimetoxitritilo em presena do grupo fosforoamidito (Esquema 8).
Esquema B

DMTO

/7

DMTO

N N

\ll

Bp
H

O
CHP p 0

OR

CH,D - P -N-<
/I N
OCH,

DMTO

DMTO

O \ ap

.CI

mD

CI p

CH 2 O P N

CH2O-

O \^^

OCH,
OR

4 Construo da cadeia oligodesoxinucleotdica

MAT.

CH,

importante sublinhar que o sucesso da sntese qumica de DNA se baseia sobretudo na preparao destes
blocos de base, isto , na escolha dos diferentes grupos
protectores, no rendimento das diferentes reaces e na
pureza dos desoxinucletidos completamente protegidos.
2 Desproteco selectiva
Para poder condensar dois desoxinucletidos pelo mtodo do fosfato trister, necessrio libertar separada-

Na sntese em soluo e pela metodologia do fosfatotrister a extenso da cadeia polinucleotdica pode

fazer-se de maneira alternada no sentido 3 ' -' 5 ' ou
5 ' -*3 ' visto que se pode desproteger o grupo hidroxlico na extremidade 5 ' ou trifosfato na posio 3 ' do
oligmero em construo. Dois oligmeros podem
igualmente ser condensados um com o outro. Devido
sensibilidade dos fosforoamiditos s condies ligeiramente cidas, esta fl exibilidade prpria aos triesterfosfatos no se aplica ao mtodo do fosfitotrister que
no foi desenvolvido em soluo. A sntese em soluo
permite a deteco de reaces secundrias de maneira
mais directa que a sntese em fase slida. Ela permite a
identificao e a compreenso da origem dos produtos

A SNTESE QUMICA DO DNA

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parasitas e portanto possibilita a interveno sobre os

parmetros correctores (Esquema 9).

_II \,-

DOT

Bp

Bp

Bp

Bp

Esquema 9

lo \

II
OCE

C1Ph

C1Ph

DMT

oce

C1Ph

C1Ph

1. TCA
12. Sil ic a

Et 3 N

N
1. TCA 1 Et 3

2. Silica

Bp

P -OCE
ED

O\ D
CIPh

Bp

Bp

op

Bp

Bp

0I

CIPh
I.MSNT

C1Ph

2.Silica

C1Ph

C1Ph

CLPh C1Ph
1' MSNT
2. Silica
1

C1Ph

1) A reaco de desprotonao do grupo hidroxlico

em 5 ' do primeiro nuclesido (ou da cadeia em crescimento) fixo no polmero insolvel.
2) A reaco de condensao entre a funo hidroxlica libertada e a espcie nucleotdica introduzida em soluo e activada "in situ" no tomo de fsforo em posio 3 '.
Com o mtodo do fosfatotrister uma terceira reaco
de oxidao do fosfito em fosfato necessria. Uma
reaco suplementar por vezes efectuada. Ela visa o
bloqueamento da ligeira percentagem dos grupos hidroxlicos que no reagiram na reaco de condensao
a fim de os desactivar para as reaces ulteriores.
Os reagentes em excesso, os sub-produtos e os solventes das reaces e de lavagem so eliminados por simples filtrao do suporte slido (Esquema 11).
Esquema II

Bp

Bp

o
o
O
tl
II p " II
F NN -1- OCE DM^
1\ I

O
CIPh

O
C1Ph

O
u

II

II
-

C1Ph

o
P

\^ ' \

C1Ph

Bp

Bp

Bp

Bp

C1Ph

tlprsteao

OCE

repatitao

C1Ph

C1Ph

\ n\"

I 1. TCA
2. Silica

Et 3 N I

21 Wnaanaepeo

^-

MSNT
Silica

l31 omiaagaol

-O-C

m r

O
- (C

H,j, C i/ H-O

je)

O,rt aLetomitritlb
c(toaina o u tlmntne ou guanlnaprotegida ou timtna

Bp

Bp

Bp

p
DMT\

C1Ph

ON
C1Ph

1
O
C1Ph

Bp

C1Ph

Bp

O
II
P

I\
1

II

Bp

Bp

op

II
P

I \^

1\
0

C1Ph

C1Ph

C1Ph

II

_P
I

OCO

C1Ph

Bp = citosina ou adenina ou guanina protegida, ou timina.

C1Ph = 2 -clorofenol
DMT = Dimetoxitritilo
CI -noetilo
cia
TCA = aci do tricloroacetico
MINT = mesitilerosulfonil- 3 -nitrotriazolo

A extenso da cadeia de DNA em fase slida realiza-se

numa s6 direco (em geral 3 ' S ') a partir de um desoxirribonucleosdeo fixo por uma das funes hidroxlicas a um suporte slido. A fixao efectua-se em geral atravs da formao de uma ligao amdica entre
um 2 '-desoxi-3 '-succinilorribonuclesido e um polmero insolvel aminado (Q-NI12) ( 12 ) (Esquema 10).
quema 10

DMTO

DMTO

e
P H,NC
D C
OH

CH,
O

P polamero anaulOVel

ermPo protetor do fosfato

pm (mmrm 1clEUel
v

O isolamento do produto ligado ao polmero insolvel

por consequncia simples e rpido em relao aos
mtodos convencionais em soluo. O conjunto das
operaes presta-se bem automatizao.
Uma desvantagem da fase slida a cintica desfavorvel. Para conseguir reaces completas dentro de
tempos razoveis indispensvel utilizar excessos importantes de reagentes cuja pureza portanto crtica.
Traos de impurezas reactivas podem inibir completamente a reaco de condensao.
Em fase slida a acumulao de produtos indesejveis
inevitvel visto no haver purificao em nenhuma
etapa da extenso do fragmento de DNA. Uma maneira de minimizar este inconveniente consiste em utilizar
dmeros ou trmeros preparados em soluo, estratgia
que ns adoptmos e que diminui de um factor 2 ou 3
o nmero de reaces efectuadas no polmero insolvel.
O comprimento do fragmento de DNA que possvel
obter por sntese qumica depende evidentemente do
rendimento da etapa de condensao que tem que ser
mantido o mais alto possvel (90 a 95%) de maneira reprodutvel. Ns preparamos correntemente fragmentos
de 30 a 50 nucletidos pelos mtodos do fosfatotrister
e do fosfitotrister. Do ponto de vista das vantagens e
inconvenientes, os dois mtodos so presentemente
equivalentes.
5 Desproteco

p catoa.na ou eaenana ou guanine protegida ou tuina

O poliestirenodivinilbenzeno, a resina composta polidimetilacrilamida-kieselguhr, a slica, as esferas de vidro

de porosidade controlada, a celulose, o co-polmero teflo-poliestireno so exemplos de polmeros insolveis
correntemente utilizados.
A extenso da cadeia polinucleotdica em fase slida
consiste na repetio de um ciclo que compreende essencialmente:

A desproteco do fragmento de DNA uma operao

delicada que deve preservar a integridade do edifcio
molecular. Reaces incompletas ou uma degradao
parcial conduzem a uma mistura complexa de produtos.
A desproteco compe-se de 3 etapas distintas:

I) transformao dos grupos triesterfosfatos em diesterfosfatos;

A SNTESE QUMICA DO DNA

II) Desproteco das bases;

III) Desproteco da funo OII terminal em 5 '.
I) A desproteco dos grupos fosfatos uma fonte
possvel de ruptura internucleotdica. Esta pode ser minimizada utilizando reagentes selectivos antes de desproteger as bases.
Se a extenso da cadeia de DNA for realizada pelo mtodo do fosfatotrister em fase slida, a clivagem do
suporte insolvel efectua-se com o mesmo reagente de
desproteco dos grupos fosfatos clorofenilados, por
exemplo com o 2-nitrofenilcarbaldoximato de tetrametilguanidina. O grupo metilo utilizado com o mtodo
do fosfitotrister deslocado por ataque nucleoflico
pelo anio tiofenalato antes da clivagem. Esta efectuada em condies suaves.
II) As aminas exocclicas das bases so desaciladas por
amonlise a 50C. Este tratamento provoca uma ruptura, que no desprezvel, das ligaes fosfatos internucleotdicas quando o fosfato est na forma de trister; esta a razo pela qual se converte antecipadamente e selectivamente o fosfatotrister em fosfatodister.
III) O grupo protector da funo hidroxlica em posio 5 ' o ltimo a ser retirado (pelo cido actico
80% no caso do grupo dimetoxitritilo). conservado
at ao fim para impedir a formao de tristeres fosfricos cclicos que conduzem a estruturas oligodesoxirribonucletidicas com ligaes 5 ' ', durante as primeiras etapas de desproteco. Devido ao seu carcter
hidrfobo o grupo dimetoxitritilo protector da funo
5 'OH facilita o isolamento do produto por cromatografia de slica em fase inversa (Esquema 12).

25

ttico marcado numa extremidade, obtidos por digesto parcial com uma exonuclease ( 15 ). Este mtodo restringe-se a fragmentos de comprimento inferior a 20
nucleotidos.
II O campo das aplicaes

As aplicaes dos oligodesoxirribonucletidos de sequncia definida cobrem quase todos os aspectos da investigao que implicam a recombinao de DNA tanto no que diz respeito construo, identificao e
caracterizao de clones bacterianos particulares, como
manipulao do DNA clonado com o fim de modificar a sua estrutura.
Nos campos da determinao de sequncias de DNA,
do estudo das interreaces protena-DNA ou da anlise estrutural do DNA, os oligodesoxirribonucletidos
sintticos tm-se revelado uma arma extremamente til.
A coordenao das competncias e a conjugao dos
esforos conduziram no nosso laboratrio a alguns sucessos no domnio da Engenharia Gentica aplicada
medicina.
A sntese qumica de DNA de sequncia definida possibilitou a varredura (screening) de bancos de clones e o
isolamento de estirpes bacterianas como a alfa-!-antitripsina, a antitrombina III e a uroquinase ( 16 ) ( 17)
( 18 ) e a sntese total da sequncia de DNA que codifica
para a somatocrinina humana cuja introduo num vetor plasmdico ( 19 ) possibilitou a expresso deste factor
hormonal na bactria ( 2 ). Estes exemplos ilustram, de
maneira no exaustiva a importncia da qumica de
sntese dos cidos nucleicos em qualquer programa de
engenharia gentica: podemos prever, sem qualquer
dvida, que esta importncia continuar a aumentar
intensamente no futuro.
BIBLIOGRAFIA

^
lostates

PRAT,. ^

DY
0
A

0-

OH

OUT

On
Desprotscpso

ou train.

ji

OM

I
Q

6 Isolamento, purificao e caracterizao

Os mtodos de isolamento e de purificao correntemente utilizados so a cromatografia de DEAE-celulose, de Sefadex, de camada fina de slica, a cromatografia lquida a alta presso (IIPLC) com coluna de slica
de fase inversa ou de troca de caties e a electroforese
preparativa em poliacrilamida.
A caracterizao do produto isolado e marcado numa
das extremidades com um radioistopo pode ser efectuada pelo mtodo de sequenciao de DNA de Maxam e Gilbert ( 13 ). no entanto necessrio um reajustamento das condies das reaces aos fragmentos de
pequeno comprimento ( 14 ). Um outro mtodo conhecido pelo nome de "Wandering spot" baseia-se na anlise a duas dimenses (electroforese em acetato de celulose, seguida de cromatografia em camada fina de
DEAE-celulose) dos fragmentos de oligonucleotido sin-

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Bollen, Biochimie, 67, 829 (1985).
(20) Resultados no publicados.

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