ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Maestra en Ciencias en Biomedicina
Molecular

Creacin de perfiles genmicos mediante microarreglos

Alumna: Maritza Tatiana Velsquez T

Mxico, 1 Julio 2016

 Los microRNA (miRNA ) son pequeos RNA no codificantes de aproximadamente

(19-25 nt) que se expresan en el ncleo de clulas eucariotas.
Son originados a partir de la transcripcin de genes que se encuentran en
regiones intergnicas(entre los genes) o intragnicas (en los intrones de genes)
Pueden regular la expresin de genes a nivel
post-transcripcional bloqueando la traduccin o
induciendo la degradacin del RNAm unindose
a su regin 3` no traducida (UTR)
complementaria.

Antiguo descubrimiento de los MicroRNAs: desarrollos recientes interesantes

Los microARN fueron descritos por primera vez en 1993, sin embargo el
trmino miARN fue el primero utilizado en 2001 en tres artculos de la
Ciencia.
Chalfie et al; 1981, descubren genes heterocrnicos capaces de
controlar la temporizacin de los eventos especficos del desarrollo
post-embrionario en C.elegans.
Ambros y Gary Ruvkun; 1993, en dos estudios independientes
describen por primera vez el primer miRNA (lin-4) y su habilidad para
regular la expresin de genes heterocrnicos C. elegans.
Reinhart et al; 2000, aislan el Segundo miRNA (let-7)
Hoy en da, ms de 1.400 miRNAs se han descrito en los seres
humanos, que constituye del 1 al 3 % de los genes en el genoma
humano.

Biognesis miRNAs

La enzima ARN Pol II genera transcrito primario

largo (pri-miRNA)
Escindido por Drosha (endonucleasa, tipo RNAsa
III)
Establece un extremo del miRNA pre-miRNA:
Sufren escisin 60-110 nt
Pre-miRNA son trasportados al citoplasma va
exportina
Son procesados por complejo enzimtico Dicer
en complejos de doble cadena entre 19-25
ribonucletidos
El complejo RISC (Complejo de silenciamiento
inducido por ARN) sirve de gua hasta el RNAm
afn
Pareamiento completo: entre RNAm y miRNA:
RISC a travs protena Ago degrada el RNAm
Pareamiento parcial: RISC induce inhibicin del
proceso de traduccin de protena

Biognesis miRNAs

Regula la expresin de ms de
70% de todos los genes que
codifican protenas
pueden actuar como genes
supresores de tumores y
oncogenes (oncomiRs)

Silenciamiento de
genes en plantas y
animales

MiRNA

MicroRNA
Transduccin de seales

Proliferacin y
diferenciacin celular

Regula diversos
procesos biolgicos:
desarrollo embrionario y
tisular (hematopoyesis y
desarrollo neural)

Apoptosis

Participacin de MiRNAs procesos biolgicos de Eucariotas

miR-181

Linaje hematopoytico clulas B

miR-15a y miR-16-1

Supervivencia de clulas B

miR-125b y let-7

Control de la proliferacin celular

miR-430

Diseo cerebral

miR-375

Clulas pancreticas secretoras de insulina

miR-143

Desarrollo de adipocitos

MiRNAs y enfermedades humanas

Tienen un papel importante en enfermedades humanas?
Segn estudios realizados los
microRNAs estn
implicados en el desarrollo de la mayora de los diferentes
tipos de cncer, actan a travs de conocidos oncogenes y
genes supresores (Esquela-Kerscher & Snack, 2006; Blenkiron &
Miska,2007).

En otros casos, es el propio oncogn o el gen supresor (al

ser un factor de transcripcin) el que induce la expresin
de un microRNA: c-Myc , Tp53.

Se ha demostrado la implicacin de microRNAs en los

procesos de invasin y metstasis en cncer de mama (Ma
et al., 2007; Tavazoie et al., 2008).

MicroRNAs inducidos por oncogenes o genes supresores

El clster miR-17-92, es altamente expresado en linfomas malignos
que tienen regin amplificada del cromosoma 13q31-32, que en
conjunto con c-Myc que acelera el desarrollo del tumor en un modelo
linfoma de clulas B de ratn.

Evidencias recientes indica que los miRNAs pueden actuar como

supresores de tumores y oncogenes.
Por lo tanto, las terapias gnicas que utilizan
miRNAs podran ser un mtodo eficaz para
bloquear la progresin del tumor.
Ejemplo: miRNAs como let-7, que se ha
demostrado que regulan negativamente los
oncogenes Ras, y miR-15 y miR-16, que regulan
negativamente BCL2.
Son candidatos prometedores para el tratamiento
del cncer.

Perfiles genmicos miRNA por Microarreglos

Qu es un Microarreglo?
Es un conjunto ordenado de genes en una
superficie pequea (10.000 individuos por cm2).
Pueden ser de vidrio, plsticos o de silicona
Se utilizan para analizar y monitorear la
expresin de genes
Permite analizar o estudiar al mismo tiempo la
expresin y comportamiento de todos los genes
de un mismo organismo
Es una tcnica sensible
Fcil de realizar y rpida
Es costoso
Los resultados son un poco difciles de
interpretar

Tipos de Microarreglos
ADNcs ligados
al linfoma

Microarreglos de DNAc
Microarreglos de oligonucletidos
Microarrglos de protenas
Microarreglos de tejidos

Linfochip

Hay algunos microarreglos estndares para su uso

en la investigacin del cncer, Linfochip.

Otros arreglos contienen cadenas de

conocidas como polimorfismos de nucletido

Los ADNcs contienen

variaciones genticas

ADN
SNPochip
Los ADNcs ligados
a metstasis

Los investigadores tambin pueden crear sus

propios microarreglos utilizando cualquier gen de
interes (o fragmentos de gen)
Metastochip

Etapas
El trabajo con microarreglos podemos
dividirlo en cuatro etapas:
1. Seleccin del tipo de microarreglo y de las
secuencias que se colocarn en el
soporte.
2. Obtencin de la muestra biolgica.
2.1 Purificacin del DNA o RNA

3. Amplificacin del material gentico (PCR).

3.1 Marcaje de la muestra problema.
4. Hibridacin del microarreglo.
4.1 Captura de resultados.
4.2 Anlisis de resultados

Significado biolgico de los perfiles MiRNAs

Despus de muchos estudios, se han observado caractersticas comunes
en la regulacin de tumores humanos.
1. Expresin de perfiles de miRNAs clasifican cada tipo de cncer
humano
2. Los genes miRNA comunes son expresados diferencialmente en
varios tipos de cncer, lo que sugiere vas de regulacin comunes
alteradas.
3. Onco miRNAs y miRNAs supresores pueden representar 2 diferentes
versiones del mismo gen microRNA con respecto al mecanismo
especifico de inactivacin o el tipo de tejido donde ocurre.

Permite
diferenciar
clulas
malignas de
clulas sanas.
Localizacin
de los genes
en regiones
asociadas al
cncer.

Iniciacin y
desarrollo de
cncer
humano

miRNAs
Dx, estado,
progresin,
pronostico y
respuesta al
tratamiento.

Mecanismos
epigenticos

Alteracin de
las protenas
de la
maquinaria de
procesamiento

HIBRIDACIN GENMICA COMPARATIVA (CGH)

Es un mtodo de anlisis molecular citogentico descubierto en 1992, cuyo
objetivo es dar a conocer alteraciones numricas, perdidas o ganancias, del
material genmico.
CGH en metafase : Consiste en el
marcaje diferencial de los cromosomas en
metafase de nuestra muestra y de un
control (por ejemplo un individuo sano).
Los coeficientes de fluorescencia a lo
largo de la longitud de los cromosomas
proporcionan
una
representacin
citogentica del ADN relativa a la
variacin del nmero de copias.

Ensayo Hibridacin Genmica Comparativa Mirnas (aCGH)

Alta significancia de asociacin entre la localizacin del miRNA y la aberracin
genmica o cromosmica.
Es un mtodo molecular citogentico para anlisis de cambios en el numero de
copias del DNA generalmente de clulas tumorales.

En este caso, un array de

oligonucletidos o de
cromosomas artificiales
bacterianos (BAC) se utiliza
para la hibridacin en lugar de
cromosomas en metafase de
tcnica CGH convencional.

Significado biolgico de la investigacin con CGH

Si la localizacin de los miRNA es
relevante en la tumorognesis se
podran identificar alteraciones
estructurales y funcionales en
diferentes tipos de canceres.

Expresin anormal de miRNA es la

principal patogenia del cncer.

Anomalas
cromosmicas
no
aleatorias y otros tipos de eventos
genticos y epigenticos podran
contribuir a la inhibicin o
potenciacin de los miRNA.

Resumen