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MaraAlfaroLarraya

EfectodelosprobiticosBifidobacteriumbifidumyLactobacillusgasseri
sobrelasaccionesdelaquercetinaencultivoscelularesdecncerdecolon

UniversidadPblicadeNavarra
DepartamentodeCienciasdelMedioNatural

MemoriapresentadaporDa.MaraAlfaroLarrayaparaoptaralgradodeDoctorporla
UniversidadPblicadeNavarra.

Pamplona,Octubrede2013

Fdo.DoaMaraAlfaroLarraya


Don Florencio Marzo Prez, Catedrtico de Universidad en el rea de Zoologa (Biologa,
Fisiologa y Nutricin Animal) de la Universidad Pblica de Navarra y Don Ignacio Jos Enco
Martinez, Profesor Titular de Universidad en el rea de Bioqumica y Biologa Molecular de la
UniversidadPblicadeNavarra,

Hacenconstar:

que Da. Mara Alfaro Larraya, Licenciada en Biologa por la Universidad de Navarra, ha
realizado bajo su direccin el trabajo de Tesis Doctoral que lleva como ttulo Efecto de los
probiticosBifidobacteriumbifidumyLactobacillusgasserisobrelasaccionesdelaquercetinaen
cultivos celulares de cncer de colon en los Departamentos de Ciencias del Medio Natural y
Ciencias de la Salud de la Universidad Pblica de Navarra. Revisada la presente memoria,
expresansuautorizacinparalapresentacindelamismayqueseasometidaadefensaanteel
Tribunalcorrespondienteparaoptaralgradodedoctor.

Dr.D.FlorencioMarzoPrez

EnPamplona,a25deOctubrede2013

Dr.D.IgnacioJosEncoMartinez

Financiacin:

La realizacin de esta Tesis se ha llevado a cabo en el Laboratorio de biologa, fisiologa y


nutricinanimaldelaUniversidadPblicadeNavarraenelmarcodelproyectodelMinisteriode
Educacin y Ciencia, MODULACION NUTRICIONAL DEL CANCER DE COLON MEDIANTE UNA
BEBIDA LACTEA ENRIQUECIDA CON UN SIMBIOTICO (AGL200610296C0201). Durante la
realizacin de este trabajo Da. Mara Alfaro Larraya ha disfrutado de una Beca para la
FormacindeTecnlogosdelDepartamentodeInnovacin,EmpresayEmpleodelGobiernode
NavarrayunContratodeAyudanteenlaUniversidadPblicadeNavarra.

Bueno,hallegadoelmomentodespusdetodosestosaosdedarlas

GRACIAS.Aunque

amuchosdevosotrosyaoshedicholomuchoquemehabisayudadoalolargodeestetiempo.

En primer lugar, dar las gracias a la Universidad Pblica de Navarra y al Departamento de


Ciencias del Medio Natural, por permitirme realizar esta Tesis y en especial al Dr. Florencio
Marzo porque realmente me dio la oportunidad de comenzar un camino en el mundo de la
investigacin en algo que el llamaba probiticos y flavonoides y que yo muy atentamente
escuchaba.Estofuehaceya7aos,parecementira,verdad?.SiempreestaragradecidaalDr.
FlorencioMarzoporconfiarenmi,gracias.

Atodosmiscompaerosquecompartieronelinicioenelcamino delainvestigacin:Patri,
JaioeIvn.Buenoquevoyadecirdevosotr@s;mamijaiorealmentefuistelaprimerapersona
enensearmeacomomovermeenunlaboratorio,asquemuchasgracias.Patri,haypatri,patri,
cuantashorasdelaboratorioycervecitashemoscompartidojuntasyrealmentecomprobque
en los momentos difciles tambin estabas ah, que no eras una simple compaera de trabajo,
gracias.UffffIvn,llegatumomento,bueno,aunqueenmuchassituacionessomoscomoelperro
yelgato,realmentehassidomiapoyo,miayudaenmuchsimosmomentosyalolargodeestos
aos he conseguido sacarte de tu mundo paralelo, aunque fuese por unos da y pudimos
disfrutardedoscongresosmaravillosos,quesiempresequedarnenmirecuerdo,gracias.

AldepartamentodeCienciasdelaSaludyenespecialalDr.IgnacioEncio,porsuapoyo,su
comprensin y porque cuando llamaba a tu puerta siempre estaba dispuesto a ayudarme,
gracias.

Chic@sdeCienciasdelaSalud;bueno,voyaempezarporpartes,porquerealmentesoisuna
partemuyimportantedemividatantodentrocomofueradellabo.Todocomenzundaqueel
Dr. Florencio Marzo me coment que llamase a un nmero de telfono y que me pusiese en
contactoconuntalJonCelay,ahestabayoconunpostitconelnmerodetelfonoypocoms.
La verdad no apostaba mucho por l, pero todo cambi desde el momento que descolgu ese
telfono. Gracias Jon, porque creo que no eres consciente de todo lo que me has ayudado. Yo
venadeunmundoderatoncillosyesodecultivoscelulares,Citometra.notenaniideayla
verdad, me sorprendiste mucho, ya que siempre estabas dispuesto ayudarme con una sonrisa,
gracias. Como he comentado todo cambi a partir de esa llamada, empec a conocer a un
montndegente.Misrubias,IdoiayMirjamischicasderisas,lloros,juergasgraciasporestar
ah.IrantzuS,MJos,Ronces,Ainara,IrantzuL,EstheryDanigraciasporvuestroapoyoycomo

no, por alegrar esas veladas tan divertidas que hemos pasado y espero que el da que esto
terminelocelebremosportodoloalto.Bueno,esperonotenerqueapuntarosenlalistanegra.

Nerea, aunque has sido una de las ltimas en llegar a mi vida, no por eso eres menos
importante,midiseadoragrfica,graciasportuayudayapoyo.

TeacherManu,graciasporaguantarme,porquerealmentesqueenalgunosmomentosme
hubierasmatado,peroaunas,ahestabascadasemanaparaayudarmeconelingls,gracias.

Amisamigasyprimos:Josune,Mara,Gabri,misamigasdeArguedas,Rosa,Sandra,gracias
por estar ah por darme vuestro apoyo durante todos estos aos y espero que sigis. Rizos,
Primo,graciasporcompartirconmigomomentostanespeciales.

Amiabuela,porsusrezosyapoyo.

Hermana,quetevoyadecir,quedesdelos6aosestsformandopartedemivida,yaunque
enmuchosmomentosnoteloexprese,eresmispreocupaciones,misalegras,micompaerade
caitas.QueerestodoparamyesperoquesigassindoloSIEMPRE,gracias.

Por ltimo a mis padres, que por supuesto SIN ELLOS nada de esto hubiera sido posible,
graciasporapoyarmeenTODO,tantoenlosmomentosbuenoscomomalos,tantocuandotena
razncomocuandonolatena,porquesiemprehabisrespetadomisdecisionessinimponerme
las vuestras, por todos esos viajes maravillosos que me habis brindado, en definitiva gracias
porcompartirconmigoelcaminodelavida.

Amispadres
Amihermana

ABREVIATURAS


AICAR

AKT

AMPK

Apaf1

APC

APN

AXIN

Bax

Bcl2

Bid

Activador de la protena activada por monofosfato de adenina (de 5' adenosine


monophosphateactivatedproteinkinase)

ProteinaquinasaB(ProteinKinaseB)
Quinasaactivapormonofosfatodeadenina(deAMPactivatedproteinkinase)
Factor activador de proteasas apoptticas 1 (de apoptotic Peptidase Activating
Factor1)

GensupresordetumoresAPC(deAdenomatosuspolyposiscoli)

AminopeptidasaN(deAminopeptidaseN)

Axina

ProtenaXasociadaaBcl2(deBcl2associatedXprotein)

LinfomadeclulasB/leucemia2(Bcelllymphoma2)

BSA

CDKI

CDK

CIP/KIP

Jun

COX2

CTNNB1

DMEM/F12

DMSO

DPPIV

DTT

EDTA

FasL

FRA1

GLUT

InteraccindeldominioBH3agonistadelamuerte(deBH3InteractingDomain
DeathAgonist)
Suerobovinofetal
Inhibidor de Quinasas dependientes de ciclinas (de cyclindependent kinase
inhibitor)
Quinasadependientedeciclinas(deCyclinDependantProteinKinase)
(deCDKinteractingprotein/Kinaseinhibitpryprotein)
OncogenJun(deJunoncogene)
Ciclooxigenasa2(deCyclooxygenase2)
Gendelabetacatenina(decatenin(cadherinassociatedproteinbeta1))
(deDulbecco'sModifiedEagleMedium:NutrientMixtureF12)
DimetilSulfxido(deDimethylSulfoxide)
DipeptidilpeptidasaIV(deDipeptidilpeptidaseIV)
Ditiotreitol
cidoetilendiaminotetraactico(deEthylenediaminetetraaceticacid)
SuperfamiliaTNFmiembro6
Portenaquinasa(deKinesinlikeprotenaFRA1)
Transportadordeglucosa(deglucosetransporter)


GSK3

KRAS

MAPKs

MLH1

MSH2

MSH6

mTOR

MTT

MUC1

MYC

NFKB

PEPT1

SGLT1

TNF

TP53

TRAIL

TSC2

Protenaglucgenosintasaquinasa3(deGlycogenSynthasekinase)
ProtenaRas(deKirstenratsarcomaviraloncogenehomolog)

Proteinas quinasas activadas por mitgenos (de Mitogenactivated protein


kinases)
ProtenadelsistemareparadordelDNA(demutLhomolog1)
ProtenadelsistemareparadordelDNA(demutShomolog2)
ProtenadelsistemareparadordelDNA(demutShomolog6)
Protenaquinasaserina/treonina(deSerine/threonineproteinkinase)
Bromuro de 3(4,5dimetiltiazol2iol)2,5difeniltetrazol
Dimethylthiazol2YI)2,5DiphenyltetrazoliumBromide)

(de

3(4,5

Mucina1(demucin1)
Protooncogenes(demyelocytomatosisencogen)
FactornuclearkB(deNuclearFactorkB)
Transportador de peptidos 1 (de Peptide transporter 1, solote carrier family 15
member1)
Cotransportadordesodioyglucose(deSodiumglucosecotransporter1)
Factordenecrosistumoral(deTumorNecrosisFactor)
Gendelaprotenatumoralp53(deTumorproteinp53)
LigandodeapoptosisinducidaporelreceptordeTNF(deTNFrelated
ApoptosisInducingLigand)
Protenatuberna(detuberoussclerosisprotena2)

NDICEGENERAL

ndice

INTRODUCCIN

1.TRACTOGASTROINTESTINAL
1.1Caractersticasgeneralesdelintestinogrueso
1.2Digestinyabsorcindehidratosdecarbonoyprotenas
1.3Patologasasociadasalintestinogrueso

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4.PROBITICOS
4.1Mecanismosdeaccin
4.1.1Accionesenprocesosinfecciosos
4.1.2Accionesenprocesosmetablicos
4.1.3Efectossobreenfermedadesinflamatoriasintestinales
4.1.4Papelsobreelcncercolorrectal
4.1.5Accincombinadadelosprobiticos

5.APOPTOSIS
5.1Lascaspasasysufuncinenlaapoptosis
5.2Vasdeinduccindeapoptosis

6.CICLOCELULAR
6.1Fasesdelciclo
6.2Regulacindelciclocelular
6.3VaAMPKdeproliferacinysupervivenciacelular

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1.DISEOEXPERIMENTAL
2.CULTIVOCELULARDELNEASHT29YCACO.2
2.1Descripcindelneascelularesdeadenocarcinomadecolon
2.2Mantenimientodeloscultivoscelulares
2.2Protocolodesubcultivo

3.PREPARACINDELAQUERCETINAYLOSPROBITICOSENESTUDIO
3.1Preparacindelaquercetina
3.2Preparacindelosprobiticos

2.CNCERCOLORRECTAL
2.1Caractersticasgeneralesdelcncercolorrectal
2.2Genticamoleculardelcncercolorrectal
2.3Estadificacin
2.4Factoresderiesgo

3.FLAVONOIDES
3.1Estructuraqumica
3.2Tiposdeflavonoides
3.3Efectosbiolgicos
3.4Quercetina

OBJETIVOS

MATERIALYMTODOS

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49

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50
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52
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ndice

4. ANLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA EN CLULAS DE


ADENOCARCINOMADECOLON
4.1Determinacindelaactividadsacarasa
4.2DeterminacindelaactividadaminopeptidasaNydipeptidilpeptidasaIV
5.ESTUDIOSDEPROLIFERACINYMUERTECELULAR
5.1 Determinacin de la actividad citotxica de la quercetina y las cepas
probiticasenlaslneascelularesHT29yCaco.2
5.2Determinacindeapoptosisencultivoscelulares
5.3Anlisisdelefectodelinhibidordecaspasas ZVADFMKsobrelamuerte
celularinducidaporlostratamientos
5.4AnlisisdelaactividadCaspasa3

6.ANLISISDELCICLOCELULAR
7.CUANTIFICACINYEXPRESINDEPROTENAS
7.1CuantificacindeprotenasporelmtodoBradford
7.2ExpresindeprotenasmediantelatcnicadeWesternblot
7.2.1DeterminacindetransportadoresdemembranaPEPT1ySGLT1
7.2.2DeterminacindelasprotenaspAMPK,Bcl2,Bax,p53yp21

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8.ANLISISESTADSTICO

RESULTADOS

1.ACTIVIDADENZIMTICAYTRANSPORTADORESDEMEMBRANA

2.ANLISISDELAACTIVIDADCITOTXICA

3.APOPTSIS
3.1Determinacindeapoptosis
3.2Ensayosdeinhibicindeapoptosis
3.3Actividadcaspasa3

4.ANLISISDELCICLOCELULAR

5. EXPRESIN DE PROTENAS IMPLICADAS EN LA APOPTOSIS Y CICLO


CELULAR
5.1LaquercetinaylascepasprobiticasmodificanlaexpresindeBcl2yBax
5.2LaquercetinaylascepasprobiticasaumentanlafosforilacindelaAMPK
5.3Laquercetinaylascepasprobiticasaumentanlaexpresindep53yp21

DISCUSIN

1. SINRGIA DE LA ACCIN DE LA QUERCETINA Y B.BIFIDUM O L.GASSERI


SOBREELTRANSPORTEDENUTRIENTESALINTERIORDELACLULA

2.MODULACINDELAPROLIFERACINCELULAR

3.INDUCCINDEAPOPTOSISYCICLOCELULAR

4.ACTIVACINDEAMPK

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

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INTRODUCCIN

Introduccin

1. TRACTOGASTROINTESTINAL

1.1 CARACTERSTICASGENERALESDELINTESTINOGRUESO

Elintestinogruesoeslapartefinaldeltubodigestivo.Seextiendedesdeelleonhastaelano,
ytieneunalongitudaproximadade1,5m.Enlsedistinguentrespartes:ciego,colonyrecto.El
ciego normalmente se sita en la fosa ilaca derecha. En el colon, que continua al ciego, se
pueden diferenciar cuatro partes: el colon ascendente, que alcanza hasta la cara visceral del
hgado,elcolontransverso,quesedirigecasitransversalmentedederechaaizquierdahastael
extremoinferiordelbazo,elcolondescendente,quedesciendeverticalmentehastalafosailaca
izquierda y el colon sigmoide, que discurre describiendo sinuosidades de forma y extensin
variable.Acontinuacindelcolonsigmoidesedisponeelrecto,queeselsegmentofinaldeltubo
digestivo.1

La funcin principal de la regin inferior del tracto gastrointestinal, es decir la parte


pertenecientealcolonyrecto,eslareabsorcindeionesyagua.Lasclulasdelepiteliocolnico
juegan un papel fundamental en este proceso. La pared del colon, est formada por diferentes
capas: mucosa, submucosa, muscular, subserosa y serosa. Una de las caractersticas que
diferencia elepiteliocolnicodelintestinodelgadoeslapocarepresentacineneste tejidode
clulasenteroendocrinas,suabundanciaenclulasmucosecretorasylaausenciadeclulasde
Panethquenicamentesepuedenlocalizarenelcolonascendente.2

El epitelio de la mucosa del colon es un epitelio simple formado por un gran nmero de
invaginaciones hacia el interior de la lmina propia, denominadas criptas de Lieberkhn. Este
epitelio se remueva cada 34 das aproximadamente, lo que supone un proceso constante de
regeneracindelasclulasqueconstituyenlascriptas.Lasclulasabsortivasoenterocticasson,
juntoconlasclulascaliciformes,lasmsabundantesenelepiteliocolnico.Estnpolarizadasy
se caracterizan por la presencia en la membrana apical de microvellosidades que forman un
borde en cepillo en el que se localizan diferentes hidrolasas (Tabla 1) como la sacarasa
isomaltasa,lalactasa,laaminopeptidasaN,ladipeptidilpeptidasaIVylafosfatasaalcalina.Estas
enzimas son utilizadas con frecuencia como marcadores moleculares propios de este tipo de
clulas.3

Introduccin

Tabla 1. Enzimas intestinales del borde en cepillo. Cuadro adaptado del libro Fisiologa Humana,
Stuartirafox,McGrawHill,2003.

Enzimasintestinalesdelbordeencepillounidasalamembranacelular

Disacaridasa

Sacarasa

Digierelasacarosaaglucosayfructosa

Maltasa

Digierelamaltosaaglucosa

Lactasa

Digierelalactosaaglucosaygalactosa

Peptidasa

Aminopeptidasa
Produceaminocidoslibres

Enteroquinasas
Activalatripsina

Fosfatasa

Ca2+,Mg2+,ATPasa
Interfierenenlaabsorcindelcalcioalimenticio

Fosfatasaalcalina
Eliminagruposfosfatodelasmolculasorgnicas

1.2 DIGESTINYABSORCINDEHIDRATOSDECABONOYPROTENAS

Las enzimas intestinales juegan un papel muy importante en la digestin y absorcin de


hidratos de carbono y protenas. El almidn y el glucgeno son los hidratos de carbono
complejos que podemos digerir. La amilasa es la enzima encargada de degradar sus largas
cadenas de glucosa convirtindolas en otras ms cortas y en el disacrido maltosa. Los
disacridosdeladieta,incluidalamaltosa,sonhidrolizados porlasdisacaridasasdelbordeen
cepillo intestinal (maltasa, sacarasa, y lactasa) (Tabla 1). La glucosa, galactosa y fructosa as
producidassonloscompuestosfinalmenteabsorbidosenelduodenoyenlapartesuperiordel
yeyunoenelintestinodelgado.4

Enelprocesodetransportedeglucosaatravsdelasmembranascelularesparticipandos
familias de protenas transportadoras: la familia de transportadores de glucosa asociados a
sodio (SGLT) y la de protenas facilitadoras de transporte de glucosa (GLUT). Los
transportadores de la familia GLUT, que se expresan en todos los tejidos, forman el primer
mecanismo de entrada de glucosa en las clulas. Hasta la fecha se han identificado 14. Todos
ellossonglicoprotenasdeentre45y55kDadetamao,quedeacuerdoconsusecuencia,lugar
de expresin y caractersticas funcionales (especificidad por el sustrato, Km y respuesta a
bloqueantesespecficoscomolaforskolina)sehandivididoentressubfamilias:transportadores
GLUTdeclaseI(GLUT1,GLUT2,GLUT3,GLUT4yGLUT14),declaseII(GLUT5,GLUT7,GLUT9y
GLUT11) y de clase III (GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12 y HMIT). A su vez, la familia SGLT
incluye a los transportadores intestinales y renales de glucosa (SGLT1, SGLT2 y SGLT3) junto
conlostransportadoresdeinositol(SGLT4),deyodo(SGLT5)ydemultivitaminas(SGLT6).5
4

Introduccin

Enlaabsorcinintestinaldeglucosa,galactosayfructosa(Fig.1)seutilizantransportadores
idnticos a los localizados en el tbulo proximal renal. As, mientras la fructosa se moviliza a
travsdelamembranaapicalpordifusinfacilitadaatravsdeltransportadorGLUT5yatravs
delamembranabasolateralpordifusinfacilitadaatravsdeltransportadorGLUT25,laglucosa
y la galactosa se transportan en contra de gradiente de concentracin, en un proceso de
simporte con Na+. El gradiente electroqumico de Na+, mantenido por la Na+/K+ATPasa que
bombeaelNa+atravsdelamembranabasolateral5,impulsaelproceso.

MembranaBasolateral

MembranaApical

Figura1.Transportedeglucosaatravsdelepiteliointestinal.AdaptadadeCastrejn,2007.

Introduccin

Los transportadores de la familia SGLT constan de 14 dominios transmembrana, tienen un


sitiodeglicosilacinentrelosdominios6y7ysusextremos aminoycarboxiloterminalesson
extracelulares.Introducenenlasclulas2ionesdeNa +pormolculadehexosa.Eltransportede
Na+sellevaacaboenunareginprximaalextremoamino.LainteraccinconelNa+promueve
uncambioconformacionalenlaprotenaqueaumentasuafinidadporlahexosa,queentraenla
clula por una regin cercana al extremo carboxilo. SGLT1 es el miembro principal de esta
familia.Codificadoporungenlocalizadoenelcromosoma22,seexpresaprincipalmenteenel
intestino delgado, corazn y rin. Su deficiencia congnita provoca el sndrome de mala
absorcindeglucosaygalactosa.Estaenfermedad,autosmicarecesiva,quesemanifiestayaen
lasprimerassemanasdevida,provocacuadrosdiarreicosseveros.5

Lasenzimasqueparticipanenladigestindeprotenassepuedenclasificarendosgrupos
caractersticos, l de endopeptidasas, tambin llamadas proteasas, y l de exopeptidasas. Las
endopeptidasasrompenlosenlacespeptdicosenelinteriordelacadenadeaminocidosydan
lugarafragmentospeptdicosmspequeos.Pertenecenaestegrupoenzimascomolapepsina,
latripsinaylaquimiotripsina.4 Lasexopeptidasasliberanaminocidosapartirdelospptidos.
Las ms importantes son las aminopeptidasas y las dos isozimas de la carboxipeptidasa
secretadas por el pncreas. La digestin (Tabla 1) se inicia en el estmago por accin de las
pepsinas,enparticularlaAylaC.Juntoconlaprotelisisllevadaacaboporlaspepsinas,laalta
acidezdelestmagotambinfavorecelahidrlisisdelasprotenasantesdequeestasalcancen
el intestino para su posterior absorcin. En el lumen intestinal las endopeptidasas, prin
cipalmente la tripsina, elastasa y quimiotripsina junto con exopeptidasas como las
carboxipeptidasas A y B, dan lugar a pptidos de dos a seis residuos aminoacdicos as como
aminocidoslibres.4

Laabsorcindeaminocidostienelugarpormediodesistemastransportadoresespecficos
para determinados grupos de aminocidos (Fig. 2). Se emplea el trmino sistema para hacer
referencia al hecho de que se hayan identificado actividades transportadoras con funciones
similares en distintos tipos celulares6. En la membrana apical del epitelio intestinal se han
descrito un sistema transportador para aminocidos neutros cuya deficiencia produce
enfermedad de Hartnup (sistema B0,tambin denominado B0AT1, producto del gen SLC6A19),
un sistema transportador para aminocidos cidos cuya deficiencia produce aminoaciduria
dicarboxlica(sistemaXAG, tambindenominadoEAAT3,productodelgenSLC1A1),unsistema
transportador para aminocidos neutros acoplado a Na+ (sistema ASC, tambin denominado
ASCT2,productodelgenSLC1A5),unsistematransportadorparaaminocidosbsicosycistena
cuya deficiencia produce cistinuria (sistema b0,+, formado por el heterodmero rBAT/b0,+AT,

Introduccin

productos de los genes SLC3A1 y SLC7A9 respectivamente) y un sistema transportador para


iminoaminocidos, aminocidos pequeos y aminocidos acoplado a H+ cuya deficiencia
produceiminoglicinuria(sistemaPAT,tambindenominadoPAT1,productodelgenSLC36A1).
A su vez, en la membrana basolateral se han descrito un sistema transportador para
aminocidos neutros excepto prolina (sistema L, formado por el heterodmero 4F2hc/LAT2,
productos de los genes SLC3A2 y SLC7A8 respectivamente), un sistema transportador para
aminocidos neutros acoplado a H+ (sistema A, tambin denominado SNAT2, producto del gen
SLC38A2),unsistematransportadorparaaminocidosbsicoscuyadeficienciaproducelisinuria
(sistema y+L, formado por el heterodmero de 4F2hc, producto del gen SCL3A2, con y+LAT1 o
y+LAT2,productosdelosgenesSLC7A7ySLC7A6respectivamente)yunsistematransportador
para aminocidos aromticos cuya deficiencia produce el sndrome del paal azul (sistema T,
tambinllamadoTAT1,productodelgenSLC16A10).

Laabsorcindelospptidos,queestcondicionadaporsubajapermeabilidadatravsde
las membranas biolgicas debido a su estructura hidroflica y tamao molecular, tiene lugar a
travsdediferentessistemasdetransporteenlosquerepercutenlasdiferenciasmetablicasy
variacionesanatmicas,fisiolgicasybioqumicasquesepresentanenlasdiferentespartesdel
tractogastrointestinal.Elpasodedipptidosytripptidosatravsdelamembranaapicaldelas
clulas del epitelio intestinal por medio PEPT1 constituye la principal forma de captacin de
aminocidos. PEPT1 tiene capacidad para absorber, de forma activa, los alrededor de 400
dipptidosy8000tripptidosdistintosdeladieta.Laabsorcindelosdipptidosytripptidos
se realiza junto con la de H+, de modo que PEPT1 emplea un gradiente electroqumico de H+
como fuerzadetransporte.ElintercambiadorNa+/H+mantieneelgradienteelectroqumicode
H+ y la Na+/K+ATPasa proporciona la energa (Fig. 3). Diferentes sistemas transportadores de
aminocidos y pptidos facilitan a continuacin la salida de estos compuestos desde el
enterocitohastaeltorrentecircundante.7,8

Introduccin

Figura 2. Transporte de pptidos a travs de la membrana. A) Transporte de pptidos mediante el


transportador PEPT1, B) Transporte pasivo sin consumo de energa, C) Transporte a travs de los
espaciosintercelulares.AdaptadadeGilbert,2008.

ElgenquecodificaPEPT1,ubicadoenelcromosoma13q33q34,sedenominaSLC15A1y
pertenecealafamiliaSLC15detransportadoresdemembrana.LaprotenaPEPT1estformada
por 708 aminocidos y reconoce a los pptidos en funcin de su carga elctrica. Aunque tiene
unabajaafinidadporlospptidos,sucapacidaddetransporteeselevada9.PEPT1seexpresaen
las clulas epiteliales intestinales y renales. El nivel de expresin de PEPT1 en el epitelio
intestinal aumenta con la cantidad de protena en la dieta y se ha descrito que diversas
hormonas,comolainsulinaylaleptina,inducensuexpresin.LaexpresindePEPT1tambin
se ha detectado a niveles reducidos en el colon y el epitelio ductal biliar. Diferentes estudios,
tanto en roedores como en humanos, han mostrado que en el caso del colon la expresin de
PEPT1 se reduce al colon distal10. Adems se ha descrito que en condiciones patolgicas de
inflamacin de la mucosa colnica, como sucede en la enfermedad de Crohn y el cncer
colorrectal,laexpresindePEPT1estaincrementada.11

Introduccin

MembranaApical

MembranaBasolateral

Figura3.Transportedeaminocidosatravsdelepiteliointestinal.AdaptadadeAdibi,2003.

JuntoconelsistemadetransporteactivomediadoporPEPT1,lospptidostambinpueden
absorberse mediante difusin pasiva, bien a travs de las uniones intercelulares (va
paracelular), bien por endocitosis mediada por pptidos penetradores capaces de transportar
otrassustancias.Estoimplicaelmovimientodepptidosdebajopesomolecularafavordeun
gradiente de concentracin sin consumo de energa ni sistema de transporte o portador
especfico(Fig.2).12

Porltimo,caberesaltarquesehaobservadoquelosprocesosdedigestinydetransporte
deazcaresypptidospuedensermoduladosmedianteladietainclusoenaquellascondiciones
patolgicasdeinflamacinenlasqueestosprocesosestnmodificados12.Laingestadegalacto
oligosacridos, por ejemplo, est relacionada con un incremento en la actividad sacarasa en
ratonesBALB/cyencultivosdeclulasdeadenocarcinomadecolonCaco.213,mientrasqueel
tratamientodecultivosdeclulasCaco.2conquercetina50Mdurante72horasincrementala
actividadfosfatasaalcalinaylaactividaddipeptidilpeptidasaenestasclulas.14

Introduccin

1.3PATOLOGASASOCIADASALINTESTINOGRUESO

Entrelasenfermedadesasociadasalintestinogruesoqueafectanalaregindecolonyrecto
destacan:15

La colitis isqumica, que es una enfermedad producida por una disminucin de la


circulacin sangunea en el colon. Puede producirse por dificultades en la circulacin
sangunea en todo el cuerpo o por disminucin slo en los vasos del colon. Aparece
generalmente en personas de edad avanzada, es ms frecuente en mujeres y suele ir
asociadaconotrosfactoresderiesgocardiovascular.

La colitis ulcerosa una enfermedad inflamatoria crnica del intestino de causa


desconocida que afecta generalmente al recto y al colon. Es frecuente en personas
jvenesaunquepuedeaparecertambinencualquierotraedad.16

La enfermedad de Crohn, que se desarrolla en la zona del ano y del recto a partir de
lesionestalescomoreplieguescutneos,fisuras,fstulasyabscesos.Lafrecuenciaconla
queaparecenestaslesiones,quevaraentreel1545%,esmayorcuandoafectaalcolon
en vez de al intestino delgado. Estas lesiones suelen ir acompaadas de sntomas
intestinales.16

Los divertculos, que son herniaciones de la mucosa de la pared del colon que salen a
travsdesucapamusculardandolugarapequeasdilatacionesenlapareddelintestino
grueso.El95%delosdivertculossedetectanenelsigma,porcindelcolonanterioral
recto.

Los plipos de colon, que son prominencias de tejido que sobresalen hacia la luz del
colon.Seconsideraneltamaoyelnmerodeplipos;cuandosteessuperiora100se
habladepoliposis.16

El cncer colorrectal, que es el tumor maligno formado por clulas de la mucosa del
intestino grueso y de sus glndulas. La mayora de los cnceres colorrectales aparecen
sobre un plipo existente en la mucosa del colon que por circunstancias diversas
evolucionaatumormaligno.

10

Introduccin

2. CNCERCOLORRECTAL

Las clulas del cuerpo se dividen de forma regular con el objetivo de reemplazar a las ya
envejecidasomuertasymanteneraslaintegridadyelcorrectofuncionamientodelorganismo.
El proceso de divisin est estrictamente regulado. Cuando los mecanismos de control de la
divisin estn alterados en una clula, sta y sus descendientes inician una divisin
incontrolada,queconeltiempodarlugarauntumorondulo.Cuandolasclulasqueforman
el tumor no poseen la capacidad de invadir y destruir otros rganos el tumor se considera
benigno. Pero cuando las clulas adems de crecer sin control sufren nuevas alteraciones y
adquieren la capacidad de invadir tejidos y rganos adyacentes, y por tanto de trasladarse y
proliferarenotraspartesdelorganismo,eltumoresuntumormalignoocncer.17

El cncer es una de las principales causas de mortalidad y su nmero de casos est


aumentando en todo el mundo. Se prev que a nivel mundial, la mortalidad por cncer
aumentarun45%entre2007y2030debidoenpartealcrecimientodemogrficoyenparteal
envejecimiento de la poblacin. En la mayor parte de los pases desarrollados el cncer es la
segundacausaprincipaldemortalidaddespusdelasenfermedadescardiovasculares,ysegn
datosepidemiolgicosseempieza a verestatendenciaenel mundo menosdesarrolladocomo
AmricadelSuryAsia.18Algunostiposdecncer,comolosdeprstata,mamaycolon,sonms
frecuentes en los pases desarrollados. Otros tipos de cncer, como los de hgado, estmago y
cuellouterino,sonmsfrecuentesenlospasesendesarrollo.18

Laaparicindecncersehaasociadoavariosfactoresderiesgorelacionadosconelestilode
vida,19comoelconsumodetabaco,lasdietasricasengrasas,elconsumoexcesivodealcohol,el
excesodepeso,lainactividadfsica,laexposicinacarcingenosolaexposicinaradiaciones
ultravioletas o ionizantes. Una alimentacin saludable, acompaada de ejercicio fsico puede
prevenir hasta un tercio de los casos de cncer:20 la actividad fsica, un peso adecuado y una
ingestadiariadefrutasyverdurasfrescasreducen,porejemplo,elriesgodedesarrollarcncer
de mama, de colon, de cavidad bucal, de pulmn y de cuello uterino, mientras que en las
sociedades en las que se consumen ms alimentos salados o conservados en vinagre la
incidenciadecncergstricoesmselevada.Elenvejecimientoyalgunasinfecciones,comola
delvirusdelahepatitisBoladelvirusdelpapilomahumano,sonotrosfactoresimportantesen
laaparicindelcncer.Laincidenciadeestaenfermedadaumentamuchsimoconlaedad,muy

11

Introduccin

probablementeporquesevanacumulandofactoresderiesgodedeterminadostiposdecnceral
tiempoquelosmecanismosdereparacincelularpierdeneficaciaconlaedad.

2.1CARACTERSTICASGENERALESDELCNCERCOLORECTAL
Sedenominacncercolorrectalalqueseoriginaenelcolonoelrecto.Lapareddelcolony

delrectoestcompuestaporvariascapas(mucosa,submucosa,muscular,subserosayserosa).
Elcncercolorrectalseoriginaenlamsinternaypuedecreceratravsdealgunasodetodas
lasdemscapas.Enlamayoradeloscasossudesarrolloseproducelentamente,durantevarios
aos.Habitualmente,antesdequeseorigineseformauncrecimientodetejido(tumoroplipo
nocanceroso)enelrevestimientodelcolonodelrecto.Estospliposinicialmentesonbenignos
ytansloun510%semalignizan.21Laprobabilidaddetransformarseencncerdependedela
clase de plipo. As, mientras que los plipos inflamatorios y los plipos hiperplsicos por lo
general no son precancerosos, los plipos adenomatosos son afecciones precancerosas. Como
resultado, ms del 95% de los cnceres colorrectales son adenocarcinomas que se desarrollan
enlasglndulasdelamucosa.Elrestocomprendeotrostiposdetumoresmenoscomunesque
tambin pueden comenzar en el colon o el recto e incluye tumores carcinoides, tumores del
estromagastrointestinal,linfomasysarcomas.

Elcncercolorrectalsupone,aproximadamente,el1015%detodosloscnceresexistentes.
Enlospasesoccidentalesocupa,conunmillndecasosnuevoscadaao,elsegundolugaren
incidenciatraselcncerdepulmnenelhombreyldemamaenlamujer.Suedadmediade
aparicin es de unos 69 aos y, aunque tambin puede aparecer en personas ms jvenes, la
mayora de los pacientes tienen ms de 50 aos en el momento del diagnstico. Afecta a
hombresymujerescasiporigual,21del5%al10%deloscasossonhereditariosyelrestoson
espordicos.

2.2GENTICAMOLECULARDELCNCERCOLORECTAL
Losdossndromeshereditariosmscomunesasociadosconloscncerescolorrectalessonla

poliposis familiar adenomatosa (familial adenomatous polyposis, FAP) y el cncer colorrectal


hereditario no asociado con poliposis (hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC).
Aproximadamenteun1%deloscncerescolorrectalessedebenalaFAP.LaspersonasconFAP
presentandesdelaadolescenciacientosomilesdepliposenelcolonyelrectoy,porlogeneral,

12

Introduccin

el cncer surge en uno o ms de estos plipos entre los 20 y los 40 aos. Los estudios
moleculareshanrelacionadolaFAPconalteracionesconprdidadefuncinenelgenAPC.22,23
Lapresenciadetumoresdetejidosblandos,tumoresseosyampulomasasociadosalosplipos
delcoloncaracterizanaunasubclasedelaFAPconocidacomosndromedeGardner,mientras
quela aparicindetumoresmalignosdelsistemanerviosocentralacompaando alosplipos
defineelsndromedeTurcot.

ElHNPCC,tambinconocidocomosndromede Lynch,representaalrededordel3%al5%
de todos los cnceres colorrectales. El HNPCC es causado por mutaciones en diversos genes
implicadosenlareparacindelDNAcomoMLH1,MSH2,MSH6,PMS1oPMS2.ComolaFAP,este
sndrome tambin se presenta cuando las personas son relativamente jvenes y aunque las
personas con HNPCC tienen pocos plipos el riesgo de que contraigan cncer colorrectal en el
transcurso de su vida es elevado. Adems, las mujeres con esta afeccin tambin tienen un
riesgomuyaltodepadecercncerdeendometrio.OtroscnceresasociadosconelHNPCCson
losdeovario,estmago,intestinodelgado,pncreas,rin,encfalo,urteryvasbiliares.

Elcncercolorrectalespordicorepresentalamayorproporcindecasosyensudesarrollo
noexisteimplicacingenticahereditaria.SegnelmodelopropuestoporFearonyVogelstein
en 1990,24 el cncer colorrectal espordico se produce como consecuencia de una mutacin
somticaenclulasdelacriptaintestinal.Enlamayoradelaslesionesquepodemosencontrar
enelcolonseobservanmutacionesdegenessupresoresdetumores,siendoelgenAPClque
aparece mutado con mayor frecuencia.22La mutacin somtica se localiza en el extremo 5 del
exn 15 del gen, una regin implicada en la interaccin con la catenina, una protena de
adhesincrticaparaelestablecimientoymantenimientodecapasepiteliales.

La interaccin con la catenina y la glucgeno sintetasa quinasa GSK3 es una de las


interacciones ms estudiadas del gen APC. Estas protenas son componentes de la va de
sealizacin Wnt. La va de sealizacin Wnt juega un papel importante en la renovacin y
desarrollodelepiteliocolnicoysudesregulacinesunodelosprincipalesfactoresimplicados
en la carcinognesis del colon:25,26 en el 90% de los tumores colorrectales se observan
alteraciones en la regulacin de la va Wnt27 y en el 85% de los casos de cncer colorrectal
espordico, as como en los casos de FAP, se observan alteraciones en el gen APC.22
NormalmenteAPCformauncomplejojuntoconlaGSK3ylacateninaenelcitoplasmadelas
clulas. En estas condiciones se produce una fosforilacin de la catenina que da lugar a su
degradacinporubiquitinacin.LasmutacionesdelgenAPCimpidensuuninconlacatenina

13

Introduccin

y permiten que sta quede libre en el citoplasma y se transloque al ncleo. En el ncleo la


catenina enlaza con factores de transcripcin de las familias Tcf y Lef. El factor de clulas T 4
(Tcf4), uno de los miembros de la familia Tcf, se expresa en el epitelio colnico y activa la
transcripcindegenesrelacionadosconlaproliferacincelular,comolosdecMyc,cJun,Fra1
olaciclinaD1,slocuandoestunidoalacatenina.Poresoseaceptaquelasmutacionesen
APCpromuevenlacarcinognesiscolorrectalalimpedirladegradacindelacatenina.28Enlos
casosenlosquenoestafectadoelgenAPC,losgenesquesevenafectadosenmayormedida
son l de la catenina (CTNNB1) y l de la axina (AXIN).29 Las principales mutaciones
encontradasenCTNNB1selocalizanenlosresiduossusceptiblesdefosforilacinporGSK3.

Otrosgenesimplicadosenlacarcinognesisdelcncercolorrectalyqueestnrelacionados
con el paso de plipo a adenoma, son KRAS y TP53. El paso de plipo a adenoma se produce
como consecuencia del incremento en la proliferacin celular derivado de la activacin de
oncogenes,comoKRAS,unidoalainhibicindegenessupresoresdetumores,comoTP53.De
hecho, en el proceso de carcinognesis la mutacin de APC suele ir seguida de inactivacin de
p53 mientras que en condiciones normales el aumento de catenina se correlaciona con un
incrementoenlaexpresindep53,alparecerporinhibicindesudegradacinproteoltica,que
actacomomecanismocompensadorypreventivodelaformacindetumores.30

2.3ESTADIFICACIN

LaestadificacindelcncercolorrectalempleaelsistemaTNM,enlquelaletraTdescribe
cuantohacrecidoeltumorprimario hacialapareddelintestinoyreas adyacentes,laletraN
describe la extensin de la propagacin a los ganglios adyacentes y la letra M indica si se ha
producidometstasis.Estasletrasseacompaanademsdeunnmerocomprendidoentreel0
yel4,queindicalagravedadenordenascendente,odelaletrax,queindicaqueelestadodel
tumor no puede ser evaluado por falta de informacin. Una vez que se han determinado las
categorasT,NyMestainformacinsecombinaenunprocesodeagrupamientoporetapasque
distinguelossiguientesestadios(Fig.5):31

Estadio 0 (Tis, N0, M0): El tumor se encuentra en su etapa ms temprana y se localiza


sloenlacapainterna(mucosa)delcolonodelrecto.Enestaetapaelcncercolorrectal
tambinseconocecomocarcinomainsitu.

14

Introduccin

EstadioI(T1T2,N0,M0):Eltumorhacrecidoatravsdelaparedinteriordelcolono
recto hasta las capas submucosa (T1) o muscular (T2), pero no se ha propagado a
ganglioslinfticosadyacentesniareasdistantes.

Estadio II (T3T4aT4b, N0, M0): El tumor ha crecido a travs de la pared del colon o
recto. Es posible que haya invadido tejido cercano, pero no se ha diseminado a los
ganglios linfticos. En funcin del grado de penetracin se distinguen los subtipos IIA
(T3),IIB(T4a)yIIC(T4b).

EstadioIII(T1T2 T3T4a,N1N2aN2b,M0):Eltumorhacrecidoatravsdelapared
interiordelcolonorectohastalascapassubmucosa(T1),muscular(T2)oexternasdel
colonodelrecto(T3),oatravsdelperitoneovisceral(T4a).Ademssehapropagadoa
ganglioslinfticoscercanos(N1entre1y3ganglios,N2aentre4y6gangliosyN2ba7o
ms ganglios) pero no a partes distantes. En funcin del grado de penetracin se
distinguenlossubtiposIIIA,IIIByIIIC.

Estadio IV: si se ha diseminado a uno (subtipo IVA) o ms (subtipo IVB) rganos


distantes.

Cncerrecurrente:sitraseltratamientoeltumorsereproduceenelcolon,enelrectoo
enotraspartesdelcuerpo.

Figura5.Diferentesgradosdedesarrollodepliposenlamucosadelcolon.AdaptadadeNational
CancerInstituteattheNationalInstituteofHealth.Winslow,2005

15

Introduccin

2.4FACTORESDERIESGO

Entre los factores de riesgo que inciden en el desarrollo del cncer colorrectal se pueden
considerar:32

Laedad,yaquemsdel90%deloscncerescolorrectalessediagnosticandespusdelos
50aos.

Losantecedentesfamiliaresypersonalesdepoliposisodecncerdecolon.

Los antecedentes de enfermedad inflamatoria intestinal, como enfermedad de Crohn o


colitisulcerosa.

Laactividadfsica,yaquellevarunavidasedentariaaumentaelriesgodepadecercncer
decolon.

El consumo de tabaco o alcohol, que facilitan el desarrollo de plipos en la mucosa del


colon.

La alimentacin, ya que el cncer de colon suele ir asociado a dietas ricas en grasas


animales y pobres en fibra y existen evidencias que indican que una dieta equilibrada,
ricaenvegetalesyfibradisminuyeelriesgodepadecercncercolorrectal.33,34Estudios
recientesmuestranquealgunosdeloscompuestosqueadquirimosatravsdeladieta,
como los flavonoides, los oligosacridos o la fibra intervienen en procesos como la
proliferacin celular, la apoptosis y la sntesis de protenas relacionadas con la
carcinognesis por lo que contribuyen a la prevencin del cncer y a un mejor
pronstico.35

3.FLAVONOIDES

Los flavonoides forman parte del grupo de los polifenoles. Son pigmentos naturales
presentesenlosvegetalesqueprotegenalorganismodeldaoproducidoporagentesoxidantes
como la polucin ambiental, los rayos ultravioleta o las sustancias qumicas presentes en los
alimentos.

16

Introduccin

LosflavonoidesfuerondescubiertosporelpremioNobelSzentGyrgy,queen1930aislde
lacscaradellimnunasustancia,lacitrina,queregulabalapermeabilidaddeloscapilares.Los
flavonoidessedenominaronenunprincipiovitaminaP,porsucaractersticadepermeabilidad,
y tambin vitamina C2, porque se observ que algunos flavonoides posean propiedades
similaresalavitaminaC.Dichasclasificacionesdelosflavonoidesnopudieronserconfirmadasy
ambasdenominacionesseabandonaronen1950.36

3.1ESTRUCTURAQUMICA

Losflavonoidessoncompuestosdebajopeso molecularqueposeenuna estructuracomn


dedifenilpirano(C6C3C6),formadapordosanillosdefenilo(anillosAyB)unidosatravsde
unanillodepirano(anilloC)(figura8).LostomosdecarbonoenlosanillosCyAsenumeran
del2al8,ylosdelanilloBdesdeel2al6.37

Losflavonoidesrenentrescaractersticasestructuralesimportantesparasufuncin:38

LapresenciaenelanilloBdelaestructuracatecoluOdihidroxi.

Lapresenciadeundobleenlaceenposicin2,3

Lapresenciadegruposhidroxiloenlasposiciones3y5

Deentrelosprincipalesflavonoides,lacatequinapresentaslolacaractersticadeposeerun
dobleenlaceenposicin2,3yladiosmetinaposeesolamentelaestructuracatecoluOdihidroxi
enelanilloB.Laquercetinasinembargoposeelastres.

3.2TIPOSDEFLAVONOIDES

Los flavonoides se encuentran en frutas, verduras, flores y semillas. Tambin se pueden


obtener a partir del vino, cerveza, t verde y t negro y aparecen en algunas plantas como
arndanos,ginkgobilobaocardomariano.39 Enestoscasos,sesuelensituarprincipalmenteen
las hojas y en el exterior de las plantas apareciendo en pequeas cantidades solamente en las
partes de la planta por encima de la superficie del suelo. Una excepcin a esta norma son los
tubrculosdecebollaquecontienengrancantidaddequercetina4Dglucsido.40Debidoasu
abundancia los flavonoides son fcilmente adquiribles a travs de la dieta, bien de forma
habitualbienpormediodesuplementosnutricionales.

17

Introduccin

El grupo de los flavonoides es muy amplio y diverso y en l se pueden identificar ms de


5.000compuestosdiferentes.Losmsdestacadosoestudiadosson(Fig.6):41

Citroflavonoides como la quercetina, hesperidina, rutina, naranjina y limoneno. La


quercetina es de color amarilloverdoso y est presente en cebollas, manzanas,
brcoles, cerveza y uvas. La hesperidina se encuentra en los hollejos de las naranjas y
limones. La naranjina es la responsable del sabor amargo de frutas como la naranja, el
limnylatoronja.Ellimonenoestpresenteenloslimones.

Isoflavonoides como la genistena y la daidzeina, Se encuentran en alimentos que


contienensoja.

Proantocianidinas,queseencuentranpresentesenlassemillasdeuvayenextractosde
cortezadelpinomarino.

Antocianidinas,quesonresponsablesdeloscoloresrojoyrojoazuladodelascerezas.

cidoelgico,queseencuentraenfrutascomolauvayenverduras.

Catequinas,comolaepigallocatequina,queseencuentraneneltverdeytnegro.

Kaemferol,presenteenpuerros,rbanos,remolacharojayendibias.

18

Introduccin

Figura6.Tiposyobtencindeflavonoides.AdaptadadeWeng,2012.

19

Introduccin

3.3EFECTOSBIOLGICOS

Los efectos biolgicos de los flavonoides se evalan a partir de su biodisponibilidad,


dependiente de su estructura qumica y sus mecanismos de absorcin, distribucin y
eliminacin. La quercetina y la catequina constituyen un buen ejemplo de la diferencia de
biodisponibilidadquepodemosencontrarentredosflavonoides:laquercetinaexperimentauna
mayor metilacin en plasma que la catequina, y adems los metabolitos de la catequina son
glucuronidados mientras que los metabolitos de la quercetina son tambin sulfatados. Estos
aspectos afectan a la solubilidad de los metabolitos en los fluidos orgnicos y son en parte
responsablesdelavadeeliminacindeambosflavonoides.42

Elintersdelosflavonoideshaidocreciendoconelpasodelosaosdebidoasusmltiplesy
variadas propiedades. En un principio, se describi su poder como agentes antioxidantes,
capaces de eliminar radicales libres e incluso capaces de evitar su formacin mediante la
quelacin de metales de transicin. Posteriormente, se descubrieron sus efectos como agentes
prooxidantes,capacesdeprovocardaooxidativo,yenlaactualidadseaceptaquelaactividad
prooxidantepodraser degran ayudaencasos comolosde las clulascancerosas, enlasque
podran inducir apoptosis. Tambin se sabe que los flavonoides no slo actan como pro
oxidantes,antioxidantesoquelantesdemetalesdetransicin,sinoquetambinsoncapacesde
actuarcomomoduladoresdediversasrutasdesealizacincelular,activndolasoinhibindolas
43. Cierto tipo de flavonoles como la quercetina, la miricetina, y el kaempferol, tienen efectos

antimutagnicos. Este efecto parece estar asociado con la presencia de un doble enlace en
posicin 23 y de un grupo 3OH en la molcula del flavonoide. Por el contrario, la actividad
cancergenadeestoscompuestosresideenlosintermediariosquinnicos,generadosdurantela
oxidacindelosflavonoides,queinteraccionanconlasmolculasdeDNA.Estasquinonas,porsu
carcter electrfilo, son muy reactivas y pueden participar en la produccin de radicales
superxidosyperxidos,loqueexplicarasuspropiedadesmutagnicasycancergenas.43

20

Introduccin

3.4QUERCETINA

Laquercetina(Fig.7)esunodelosflavonoidesmsfrecuentesennuestradieta.Presenteen
alimentoscomolacebolla,elt,lamanzana,elbrcolioelvinotintoesunodelosflavonoides
ms estudiado.44 La quercetina posee acciones biolgicas como antioxidante, antiinflamatorio,
antiarterioesclertico y antimutagnico. Tambin se ha descrito que modula la actividad de
enzimas intestinales y transportadores de azcares y aminocidos en lneas celulares de
adenocarcinomadecolon,enlasqueincrementalaactividadenzimticadelafosfatasaalcalinay
ladipeptidilpeptidasaIV.14Durantelosltimosaossehancomenzadoaanalizarsusacciones
frente a diferentes tipos de cncer con resultados prometedores que demuestran su poder
antiinvasivo.45

Figura7.Estructuradelaquercetina

Enratonessehaobservadoquelaquercetinaescapazdedisminuirlaaparicindetumores
hepticosenestadiosiniciales dedesarrollo.Esteefectoestasociadoaaumentostantoenlos
niveles de glutatin (GSH) como en la actividad de enzimas antioxidantes como la catalasa, la
superxido dismutasa o la glutatin peroxidada.46 En clulas HepG2 (clulas humanas de
hepatocarcinoma)laquercetinatambininducelaexpresindelaglutatinperoxidasayeleva
los niveles intracelulares de glutatin.47,48 Ya que estos cambios, tambin inducidos por otros
polifenoles como la rutina, previenen el estrs oxidativo de las clulas, la actividad
anticancergenadelaquercetinaamenudoserelacionaconsuefectoantioxidante.49

Laquercetina,comootrospolifenolesdeladieta,puedeactuartambin,enfuncindeltipo
celular,deladosisodeltiempodeexposicin,comoprooxidante,yaqueestimulalaproduccin
de especies reactivas de oxigeno (ROS). Como consecuencia tiene capacidad para inducir

21

Introduccin

apoptosisydarlugaralaprevencinodisminucindeldesarrollotumoralendiferentestiposde
cncer.EnclulasMDAMB468decncerdemama50yH661deadenocarinomapulmonar,por
ejemplo,laquercetinainduceapoptosismedianteunincrementodelosnivelesintracelularesde
ROS que conduce a la formacin de H2O2.51 Tambin se ha descrito que la quercetina tiene
capacidadparainducirapoptosis,deformadependientedeladosis,endiversaslneascelulares
cancergenasenlasquesedetectanalteracionesenlafragmentacindelDNA,52,53activacinde
protenasproapoptticascomoBax,54,53disminucindeprotenasantiapoptticascomoBclxLy
Bcl253,activacindelascaspasas3,7,y9yliberacindelcitocromoc.55,56

En relacin al efecto de la quercetina sobre los procesos de proliferacin, supervivencia y


muerte celular, se ha descrito que este efecto est estrechamente relacionado con la
concentracin utilizada en el tratamiento: concentraciones bajas de quercetina dan lugar a
mecanismos de supervivencia mediante la activacin de MAPKs (Protenas quinasas activadas
por mitgenos)57 y el incremento en los niveles de fosforilacin de pAKT.58 Sin embargo,
concentracionesaltasdequercetina,ejercenunefectoproapoptticomediantelaactivacinde
caspasasyladisminucinenlosnivelesdefosforilacindeAKTyERKs(Quinasasreguladaspor
seales extracelulares).55,59 Estas modificaciones en la proliferacin celular suelen aparecer
asociadas a cambios en el ciclo celular. As, la quercetina inhibe la proliferacin e induce una
paradadelciclocelularenfaseG0/G1,SyG2/MenclulasdeadenocarcinomadecolonHT2960y
enclulasdeleucemia(MOLT4)61yreducelainflamacindelamucosadelcolonatravsdela
inhibicin de COX.2 en ratones inducidos con azoximetano .62 Tambin se ha descrito que la
quercetinareducelaproliferacincelularalamitadenclulasLoVodecncerdecolonyMCF7
de cncer de mama, en las que induce una parada del ciclo celular en G2 /M tras 24 horas de
tratamiento.63Enlaactualidadsondiversoslosgruposqueestnanalizandosilaadministracin
conjuntadevariospolifenolespuedetenerunefectomayorsobrelaproliferacincelularquesu
administracinporseparado.Enestesentidosehaobservadoquelaquercetinaactademodo
sinrgicoconelresveratrolenlainduccindeapoptosisenclulassanguneasdepacientescon
leucemia61 y sobre la proliferacin celular y activacin de caspasa 3 en clulas de cncer de
colon.64 Como consecuencia de todas estas acciones, se ha sugerido que existe una relacin
directa entre una dieta rica en quercetina y el riesgo de padecer cncer de colon, cncer de
estmago,65,66enfermedadesneurodegenerativas67yenfermedadescardiovasculares.68

22

Introduccin

4.PROBITICOS

El aparato digestivo del hombre est colonizado por diversas especies bacterianas, donde
existenmsde400especiesdiferentes.69Msdelamitaddelpesodelamateriaqueestenel
colon corresponde a clulas bacterianas. El estmago contiene una pequea cantidad de
bacterias, aproximadamente 103 ufc/mL de jugo gstrico, mientras que la concentracin
bacteriana aumenta a lo largo del intestino hasta llegar a una concentracin final de 1012
bacterias/genelcolon.Lasbacteriasqueformanladenominadamicrofloraintestinalnosuelen
tenerefectosnocivosysehademostradoquealgunasdeestascepasexistentesenlamicrobiota
sonnecesariasparamantenerelbuenfuncionamientodesuhusped.70

Los probiticos se definen como microorganismos vivos que cuando se administran en


cantidades adecuadas tienen un efecto beneficioso en la salud del hospedador. Estos
microorganismosdebenestarcorrectamenteidentificados,carecerdefactoresdevirulenciayde
la capacidad de producir metabolitos indeseables, deben ser tolerantes a las condiciones del
entorno donde ejercen el beneficio y su funcionalidad probitica debe haberse verificado en
ensayos con humanos. Entre las caractersticas ms importantes que deben cumplir se
encuentrasuviabilidadeneltractodigestivo,yaquecuandosoningeridosdebensobreviviral
paso por el mismo y mantener su capacidad para interaccionar con el epitelio o la microbiota
intestinal.71 Para poder evaluar su eficacia en la salud humana se requiere su identificacin a
niveldecepa,yaquelosefectossaludablesdemostradosparaunacepamicrobianaespecficano
sonextrapolablesaotrascepasdelamismaespecie.72Enlamayoradeloscasoslosprobiticos
sonbacteriasgrampositivasqueseclasificanfundamentalmenteendosgneros:Lactobacillusy
Bifidobacterium.73,74Latabla2recogealgunasdelasespeciesidentificadas.

23

Introduccin

Tabla2.Diferentescepasprobiticas.AdaptadadeHolzapfel,2001

4.1MECANISMOSDEACCIN

La integridad del epitelio intestinal juega un papel muy importante en los mecanismos de
defensa ya que protege al organismo de las agresiones. Una lesin o prdida de la barrera
intestinalpuededesencadenareldesarrollodediferentestiposdeenfermedadesinflamatorias
intestinalesydealgunasenfermedadesautoinmunes.Algunascepasdeprobiticossoncapaces
decontribuiralmantenimientocorrectodelabarreraintestinal,ascomodepreveniryreparar
losdaosocasionadosenlamucosaintestinal.Comoresultadolosprobiticosejercenacciones
sobrelainmunidadinnatayadquiridayprotegenalhospedador frenteainfecciones,procesos
deinflamacinintestinalcrnica75yotrotipodeenfermedadescomoelcncer.73

Los probiticos ejercen sus acciones a distintos niveles: interaccionan con la microbiota
intestinal ya existente, mejoran la funcin de integridad de la barrera intestinal y modulan la
respuestainmune(Fig.8).76Lascepasprobiticasmodulanlamicrobiotaintestinalinhibiendo
lacolonizacindeltractogastrointestinalporpatgenosyfavoreciendolapresenciadegrupos
microbianos, como Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus, considerados como
beneficiososdentrodelamicrobiotaintestinal. 77 Enlamodulacinintervienelaproduccinpor
partedelosprobiticosdesustanciasantimicrobianas,bacteriocinasycidosgrasosdecadena
corta.Almismotiempo,lasclulasepitelialesylasdelsistemainmuneinnatoposeenreceptores

24

Introduccin

celulares capaces de diferenciar entre la microbiota comensal y la patgena y de inducir la


sntesisdediferentesmediadorescomocitoquinasymolculasdeadhesin.78

Figura8.Mecanismosdeaccindelosprobiticos.Produccindesustanciasantimicrobianas,funcin
de barrera intestinal, activacin del sistema inmune, competicin por sitios de unin y produccin de
nuevosnutrientesomolculasbioactivas.

4.1.1 Accindelosprobiticosenprocesosinfecciosos

Alguna cepas probiticas como S. boulardii, L. casei y L. rhamnosus han demostrado poseer
un papel importante en el tratamiento de la diarrea infecciosa infantil, sobre todo en
gastroenteritisviralesyendiarreasasociadasaltratamientoconantibiticos79,80.Tambinseha
observadoquelacombinacindecepasdeB.infantis,L.acidophilusyB.bifidumreduceelriesgo
deincidenciadeenterocolitisnecrotizanteenneonatosprematurosyreducesumortalidad.81

25

Introduccin

4.1.2 Accionesdelosprobiticosenprocesosmetablicos

Losprobiticospuedenintervenirendiferentesprocesosmetablicosquetienenlugarenel
organismo,bienmediantesuaccinanivelenzimtico,bienactuandosobrelapropiaactividad
metablica del individuo. En el metabolismo de carbohidratos, por ejemplo, tienen un papel
destacado ya que los cidos grasos de cadena corta producto de su degradacin, como el
propinico o el butrico, poseen capacidad antiinflamatoria, estimulan la proliferacin y
diferenciacincelulardelepitelioymedianenlaresistenciaalainsulinayladiabetes.82Adems
sehademostradoquelossntomasdeintoleranciaalalactosasemanifiestanenmenormedida
cuandoseconsumeyogurquecuandoseconsumeleche.Esteefectosehaatribuidoalascepas
probiticasS.thermophilusyL.delbrueckiiquesuelenestarpresentesenelcultivodelyogury
favorecen la digestin de la lactosa al liberar la actividad galactosidasa en el intestino
delgado.83 Por otro lado, la fermentacin de las protenas por parte de la microbiota del
intestino puede dar lugar a metabolitos txicos, entre los que se incluyen amoniaco, aminas,
fenoles, tioles e ndoles, y se ha demostrado que algunas cepas probiticas como L. casei y B.
breve disminuyen significativamente el nivel de pcresol excretado, un biomarcador empleado
enlainsuficienciarenalcrnica.84Porltimo,enrelacinalmetabolismodeloslpidos,algunos
estudios con animales han mostrado que el consumo de probiticos disminuye el nivel de
colesterolsricoylaconcentracindelafraccinLDLcolesterolenplasma.85

4.1.3 Efecto de los probiticos sobre las enfermedades inflamatorias


intestinales

Los daos producidos en la funcin de barrera de la mucosa intestinal dan lugar a

enfermedades como la colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Estas enfermedades se


caracterizan por presentar periodos de recurrencia y de remisin de los sntomas y por su
evolucinacronificarse.SehadescritoquelacepaE.coliNissle1917contribuyealaremisinde
los sntomas en la colitis ulcerosa, y tambin que la combinacin de probiticos con
fructooligosacridosyeltratamientocombinadoconvariosprobiticosresultaneficacesfrente
aestetipodeenfermedades.86Sinembargo,aunqueenpacientesconenfermedaddeCrohnse
han realizado estudios con combinaciones de B. breve, B. longum y L. casei con
inmunomoduladores y corticosteroides, en la actualidad an no hay evidencias suficientes de
que los probiticos acten sobre la enfermedad de Crohn ya que ninguna de las cepas

26

Introduccin

probiticasclnicamenteevaluadashademostradoeficienciaen elmantenimientoeneltiempo
delossntomas.87,88

4.1.4 Papeldelosprobiticossobreelcncercolorrectal

Se ha observado que los probiticos pueden jugar un papel preventivo en el desarrollo de


cncer colorrectal. Entre los diferentes mecanismos propuestos mediante los cuales los
probiticosejerceransuefectobeneficiososeencuentranlamodificacindelaspoblacionesde
bacterias presentes en la microbiota intestinal con disminucin de la poblacin de bacterias
patgenas y aumento de la de bacterias beneficiosas, la modulacin de la respuesta inmune a
nivel gastrointestinal y la produccin de molculas bioactivas por fermentacin de nutrientes
adquiridos a travs de la dieta, como fibra, prebiticos y polifenoles.89 Es destacable la
produccindecidosgrasosdecadenacorta,talescomoacetato,propionatoybutirato,yaque
se ha sugerido que estos compuestos modifican la expresin de genes relacionados con la
induccin de apoptosis y regulacin del ciclo celular. 89 Por este motivo, puesto que en un alto
porcentaje de tumores se observa una desregulacin del ciclo celular como consecuencia de
alteraciones epigenticas que podran ser reversibles, la modificacin o modulacin de la
microbiota intestinal mediante el uso de probiticos se ha propuesto como un posible
mecanismodeprevencindelcncercolorrectal.89

Se ha descrito que algunos probiticos como B. adolescentis, B. lactis, B.bifidum o B. breve


intervienen en el proceso de adhesin en lneas celulares de adenocarcinoma de colon, como
Caco.2yHT29,yenprocesosinflamatorioscomolacolitisulcerosa.90Tambinsehadescrito
que L. reuteri secreta factores capaces de inducir apoptosis en clulas de leucemia mieloide.
Estas cepas induciran la apoptosis de las clulas mediante la activacin del factor de
transcripcin NFkB y la regulacin de la expresin de protenas antiproliferativas y
antiapoptticas.91Porltimo,otrosprobiticoscomoB.longumoL.gasseriafectanaldesarrollo
delcncercolorrectalinducidocondimetilhidracinaenratones,enlosqueestimulanelsistema
inmunedandolugaraunaumentoenlaproliferacindemacrfagosquesecorrelacionaconuna
disminucinenlaproliferacindelasclulasdelamucosaporbloqueodelciclocelularenfase
S.92

27

Introduccin

4.1.5 Accincombinadadeprobiticos

Enlaactualidadsesabequeelefectodelosprobiticosesmayorcuandoseadministrande
formaconjuntaconotrascepasprobiticas,conprebiticos,comoalgunoscarbohidratos,ocon
polifenoles.93Porejemplo,lacombinacindeunfructooligosacridocomolainulinaconcepas
de L. rhamnosus y B. lactis aumenta el nmero de cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus
existentesenlamicrobiotaintestinalydisminuyelapoblacindeC.perfringens,dandolugara
unamenorincidenciadepatologasdeltractogastrointestinal.94Asuvez,lacombinacindeun
extractodearndanosconB.infantis,oconunamezcladeL.crispatus,L.gasseriyL.plantarum,
produce un aumento en el peso de ratas Wistar y en l de su contenido fecal, que adems
contieneunamenorcantidaddeenterobacterias.Comoconsecuenciadeestaobservacinlos
cambios en la microbiota intestinal se han asociados con una mejora en los procesos de
fermentacinyabsorcinintestinalenmodelosderatasWistar.95

Tambin se ha observado que las modificaciones en la microbiota intestinal (colonizacin


porbacteriasbeneficiosas,disminucindelainflamacindelamucosadelcolonyproduccinde
compuestos anticancergenos) van acompaadas en muchas ocasiones de alteraciones en la
actividad de diferentes disacaridasas intestinales, tales como la sacarasa, la lactasa o la
isomaltasa.96,94Comoejemplopodemoscitarquesehadescritoquelaalimentacinderatascon
dietas suplementadas con un combinado de inulina y cepas probiticas como L. acidophilus, L.
bulgaricus, B. bifidum, B. longum y S. thermophilus, incrementa la actividad de dichas enzimas
traseltratamiento.97

Por ltimo, se ha demostrado que la alimentacin con la combinacin de B. lactis y un


extracto de carbohidratos no digeribles reduce el nmero de lesiones preneoplsicas en ratas.
Sinembargo,estareduccinnoseobservacuandosealimentanlosanimalessolamenteconel
probitico,loqueindicaunaaccinsinrgicaentreelextractodecarbohidratosnodigeribleyla
cepaB.lactis.98

28

Introduccin

5.APOPTOSIS

En todos los organismos multicelulares adultos debe existir un equilibrio entre la


proliferacinymuertedelasclulas,conelobjetivodemanteneruntamaoconstante.Cuando
este equilibrio se altera se desencadenan situaciones patolgicas como el cncer, en l que la
proliferacin de las clulas se encuentra aumentada, o las enfermedades degenerativas, en las
que los procesos de muerte celular estn incrementados. Por lo tanto, la muerte celular
programada es parte de los procesos fisiolgicos que son necesarios para el correcto
funcionamientodelorganismo.99Atendiendoasuscaractersticasmorfolgicassedistinguenal
menos4tiposdemuertecelular:necrosis,apoptosis,autofagiaycatstrofemittica.100

Kerr, Wyllie y Currie101 describieron en 1972 una forma de muerte celular sin inflamacin
asociadaalaquedenominaronapoptosis,queeradiferentedel procesodemuertecelularcon
inflamacin asociada conocido hasta entonces y que se denominaba necrosis99. Los cambios
estructuralesmsdestacadosenlamuerteporapoptosisson(Fig.9):102

Lasclulassevuelvenredondeadasydisminuyendetamao(picnosis).

Seproduceunaretraccindelospseudpodos.

Lacromatinasecondensaysedegradanlosncleos(cariorresis)

En la superficie de la clula aparecen unas invaginaciones a modo de burbujas


(blebbing)aunquelamembranasemantieneintegrahastaelfinaldelprocesoylos
orgnulosnocambiandetamao.

Lasclulasserompenenfragmentos,dandolugaraloscuerposapoptticos.

In vivo los cuerpos apoptticos son fagocitados por macrfagos que segregan
citoquinasqueinhibenlainflamacin.

Con frecuencia los trminos apoptosis y muerte celular programada se han empleado
indistintamente. Debe tenerse en cuenta, sin embargo, que apoptosis y muerte celular
programada no son estrictamente sinnimos, ya que la muerte celular programada puede
ocurrirenausenciadeloscambiosestructuralestpicosdelaapoptosis.100

29

Introduccin

Loscambiosmsdestacadosenlamuertepornecrosisson(Fig9):103

Lacapacidaddelamembranaparacontrolarelpasodelosionesyaguaestaalterada,
porlotantolasclulasganantamao(oncosis)ysusorgnulossehinchan.

Las membranas de las clulas se rompen y su contenido se vierte al espacio


intercelular.

Seproducelainflamacindelostejidosadyacentesalasclulas.

La muerte celular por autofagia se caracteriza morfolgicamente porque ocurre sin


condensacin de la cromatina pero con secuestro del material citoplasmtico en vacuolas
(autofagosomas)quesefusionan conloslisosomasparaformarautolisosomascuyo contenido
se degrada.100 La vacuolizacin del citoplasma es por tanto la caracterstica principal de este
tipodemuertecelularprogramada.

Lacatstrofemitticaesuntipodemuertecelularqueseproducecomoconsecuenciadela
segregacinanormaldecromosomasofragmentosdecromosomasdurantelametafase,loque
provocaalteracionesmorfolgicascomolamicronucleacinymultinucleacindelasclulas.100

Figura9.Caractersticasmorfolgicasdelamuertecelularpornecrosisyapoptosis.Adaptadade
www.retina.umh.es

30

Introduccin

5.1LASCASPASASYSUFUNCINENLAAPOPTOSIS

Las caspasas son enzimas proteolticas pertenecientes a la familia de las cistenproteasas


involucradas en la apoptosis y activacin de citoquinas proinflamatorias. Estas enzimas, que
atacanasusprotenasdianacortndolasensecuenciasespecficasquecontienenunresiduode
aspartato, son claves en la traduccin y ejecucin de la seal apopttica inducida por una
diversidad de estmulos.104 En situaciones normales son sintetizadas como precursores
inactivos,procaspasas,quenecesitansercortadasparasuactivacin.Lasprocaspasascontienen
tres dominios estructurales que se separan por digestin proteoltica: uno Nterminal y otros
dosquedanorigenalassubunidadesgrande(p20)ypequea(p10)delacaspasaactiva.105De
acuerdoconlaestructuradelprodominioNterminalsedistinguendosclasesdeprocaspasas:106
lasprocaspasasdeclaseIoiniciadoras,quecontienenunprodominiogrande,ylasdeclaseIIo
efectoras,conelprodominiopequeooausente.Lasprocaspasas1,2,8,9y10pertenecenala
claseIylasprocaspasas3,6y7alaclaseII.LosprodominiosNterminalesdelascaspasasde
claseIcontienenmotivosdereclutamientodecaspasas(CARD)oefectoresdemuerte(DED)a
travsdelosqueinteraccionanconreceptoresdemuerte,comoenelcasodelacaspasa8,ocon
protenas reguladoras, como APAF1 en el caso de la caspasa 9. 107 Como resultado de estas
interacciones se produce la activacin de las caspasas iniciadoras, que a su vez activan por
digestin proteoltica las caspasas efectoras.108 Las caspasas efectoras tienen como sustrato a
numerosasprotenasentrelasqueseencuentranICAD,uninhibidordelanucleasaresponsable
de la fragmentacin del DNA en la apoptosis, lamininas de la envoltura nuclear, protenas del
citoesqueletoeinhibidoresdeapoptosisdelafamiliaBcl2,porloquesuactivacinconduceala
condensacin de la cromatina, a la fragmentacin del DNA cromosmico, a la fragmentacin
nuclearydeorgnuloscitoplasmticosyalaformacindecuerposapoptticos.109

5.2VASDEINDUCCINDEAPOPTOSIS

Existendosvasprincipalesporlascualesseactivalaapoptosis:

Vaintrnsecaomitocondrial:Estavaesactivadaporsealesprocedentesdelinteriorde
la clula, como el estrs oxidativo o el dao en el DNA inducido por radiaciones o agentes
qumicos. Estas seales del interior de la clula inician un proceso de muerte celular
programadaquecomienzaconlasalidadelcitocromocdelamitocondria.110Enelcitoplasmael

31

Introduccin

citocromo c enlaza con Apaf1 y la caspasa 9 formando el apoptosoma. La formacin de este


complejo activa a la caspasa 9, que a su vez activa a las caspasas 3, 6 y 7 dando lugar a la
apoptosis110 (Fig 12). La familia de protenas Bcl2 regula la permeabilidad de la membrana
mitocondrial y, por tanto, la salida del citocromo c. Esta familia est formada por varios
miembros,algunosantiapoptticoscomoBcl2yBclXLyotrosproapotticoscomoBax,BclXs
oBid.Estasprotenas,quepromuevenoinhibenlaliberacindelcitocromoc,puedenrealizar
susfuncionesdeformaconjuntaoindependiente.

Va extrnseca o receptores de muerte: La activacin de la va apopttica extrnseca se


llevaacaboporlaunindeunligandodelafamiliadelosfactoresdenecrosistumoral(TNF)a
unodelosreceptoresdemuerteenlasuperficiecelular.EnlafamiliaTNFpodemosencontrar
hasta 19 ligandos diferentes, entre los que podemos destacar el propio TNF, FasL y TRAIL.
Los receptores de estas molculas son protenas transmembrana que tras la unin con su
ligando trimerizan. La trimerizacin del receptor permite el reclutamiento, a travs de su
porcinintracelular,deuncomplejoproteicoquecontieneprotenasadaptadorasquecontienen
dominios de muerte. Estas protenas adaptadoras permiten la unin sobre el complejo de las
caspasas 8 y 10. Como resultado estas caspasas se activan y pueden a su vez activar a otras
caspasasefectoras.111Juntoconsucapacidadparaactivaraotrascaspasasefectoras,lacaspasa
8puedetambininducirlarupturadeBiddandolugaralaformatruncadadeBid(tBid).Esta
forma truncada interacta con otros miembros de la familia Bcl2 e induce la liberacin del
citocromoc desdela mitocondria,conectandoaslava extrnsecaconlaintrnsecadurante el
procesodeinduccindeapoptosis(Fig10).111

32

Introduccin

Figura10.Vaintrnsecayvaextrnsecadelaapoptosis.AdaptadadeMom,2006112

6.CICLOCELULAR

El ciclo celular es la secuencia cclica de procesos que ocurren en la vida de una clula
eucariotaqueconservalacapacidaddedividirse.Esportantoelmecanismoatravsdelcuallos
seres vivos se reproducen. En los organismos unicelulares la divisin celular implica una
verdaderareproduccin,yaquea partirdeunaclulamadrese obtienendosclulashijasque
maduran y se convierten en dos individuos distintos. En los organismos multicelulares se
requierenmuchosmsciclosdedivisincelularparaeldesarrollodeunindividuo.Adems,en
los organismos pluricelulares la divisin celular tambin es necesaria para reemplazar las
clulas perdidas por desgaste, mal funcionamiento o por muerte celular programada. Es
importantesealarqueenlasclulassomticas,lasclulasgeneradassongentica,estructuraly
funcionalmente idnticas tanto a la clula materna como entre s, a menos que hayan sufrido
mutaciones. Las clulas nuevas heredan un duplicado exacto de la informacin gentica de la
clula materna. Para que esto suceda es necesario que la clula lleve a cabo una serie de
procesoscitoplasmticosynucleares.113

33

Introduccin

6.1FASESDELCICLO
Durante el transcurso del ciclo celular, cuya duracin vara entre los diferentes tipos de
clulaseucariotas,puedendistinguirsedosgrandesperiodos:unodedivisin,tambinllamado
fase M, y otro de interfase, que es el periodo de tiempo que transcurre entre dos divisiones.
Durante la interfase la clula crece en tamao y duplica su contenido en DNA y protenas,
preparndoseparalasiguientedivisin.Sesubdivideentresperodos:G1,queeselintervalode
tiempoquetranscurreentreelfinaldelafaseMyeliniciodelasntesisdeDNA,S,desntesisde
DNA, y G2, que es el periodo que transcurre entre el final de la replicacin y el inicio de la
divisin.Duranteladivisintienenlugarladivisinnuclear,omitosis,enlaqueseproducela
separacindeloscromosomashomlogospreviamentereplicados,yladivisindelcitoplasma,o
citocinesis,endosclulashijas.Traslacitocinesisdeladivisinanterior,unavezenG1,lanueva
clulaespequeayposeepocoATPcomoconsecuenciadelgastoexperimentadoenladivisin
anterior,porloqueenesteperiodolasclulascrecen,sintetizanprotenasyacumulanATP.Al
final de esta etapa existe un punto de control, conocido como punto de restriccin (punto R o
Start), en l que las clulas pueden detener su crecimiento hasta que se encuentran en
condicionesdepasaralasiguientefase.Enesteestadiolasclulaspuedensalirdelciclocelulary
entrarunestadodequiescencia,denominadoG0,enlquepuedenpasartodasuvidaydelque
slo ocasionalmente salen para proseguir el ciclo celular. Superado el punto de restriccin
comienzalafaseS,enlaqueseduplicaelmaterialgentico.Dadoqueelprocesodesntesisde
DNA consume una gran cantidad de energa, una vez finalizada la replicacin la clula entra
nuevamente en un proceso de crecimiento y adquisicin de ATP, la fase G2, observndose
cambios en la estructura celular que indican el comienzo de la divisin celular. Esta fase, que
finalizacuandoloscromosomascomienzanacondensarsealiniciodelamitosis,contieneotro
punto de control conocido como punto de control G2M. Puede decirse por tanto que la
formacindelosdosgenomasduranteelciclocelularseproduceanivel moleculardurantela
fase S de sntesis del DNA y a nivel celular durante la mitosis. Para asegurar el correcto
funcionamientodelciclocelular,esdecir,quecadanuevaclulahijarecibaungenomacompleto,
tanto el inicio y progresin de la fase S como la mitosis deben ser controladas de forma muy
precisa.114

34

Introduccin

6.2REGULACINDELCICLOCELULAR
Elsistemadecontroldelciclocelularestformadoporciclinasyquinasasdependientesde
ciclinas (CDKs). La familia de las CDKs incluye 26 genes (CDK1CDK10, CDK11A, CDK11B,
CDK12CDK20yCDKL1CDKL5).TodaslasCDKssonserintreoninquinasascuyaactivacinse
ha relacionado en algunos casos con el control del ciclo celular, y en otros con l de la
transcripcin, de la diferenciacin o de la apoptosis. Excepto en el caso de las CDKLs que son
independientes de ciclina, su actividad se regula mediante su unin a ciclinas: mientras que la
uninconlasciclinasactivaalasCDKs115einiciaunacascadadefosforilacionesqueimpulsael
ciclocelular,116,117enausenciadeciclinalasCDKssoninactivas.
Lasciclinassonprotenassintetizadasdurantelainterfaseyeliminadasalfinaldelamitosis
de cada ciclo celular. Actan como reguladores de la actividad enzimtica de las CDKs y su
concentracinvavariandoalolargodelasdiferentesfasesdelciclocelular.118,119Haydescritos
4 grandes tipos de ciclinas que se unen a las CDKs y actan en las diferentes fases del ciclo
celular:ciclinasdetipoD(D1,D2,D3),queactanenlafaseG1delciclocelular,ciclinasdetipoE
(E1,E2),queactan alfinaldelafase G1yen elprogresoG1/S,ciclinasdetipoA(A1,A2),que
actan enlafaseS yprincipiodela faseG2,yciclinasdetipoB(B1,B2),queactan enlafase
G2120.LasciclinasseunenpreferentementeaunaodosCDKsconcretas(Fig14).Lasciclinasde
tipoDseunenaCDK4yCDK6,lasciclinasdetipoEseunenaCDK2,lasciclinasdetipoAseunen
a CDK2 y CDK1 y las ciclinas de tipo B a se unen CDK1. El aumento o disminucin de de los
nivelesdeciclinasesportantoeldeterminanteprincipaldelaactividaddelasCDKsduranteel
progresodelciclocelular.

35

Introduccin

Figura14.Regulacindelciclocelularmediadoporquinasasdependientesdeciclinas.Adaptadade
sciencewatch.com.Malumbres2010.

Ademsdeserreguladamediantesuuninconciclinas,laactividaddelasCDKstambines
regulada mediantesuunincon otrasprotenas:losinhibidoresdequinasasdependientesde
ciclinas (CDKIs). Los CDKIs son protenas inhibidoras de las CDKs implicadas en la parada del
ciclo celular en respuesta a seales antiproliferativas, como la ausencia de factores de
crecimiento,lascitoquinasoeldaoenelDNA.HaydosfamiliasdeCDKIs:lafamiliaCIP/KIPy
lafamiliaINK4.121

LafamiliaCIP/KIPincluyetresprotenasestructuralmenterelacionadasentres:p21,p27y
p57.SusmiembrosinhibenlaactividadquinasadeloscomplejosCDK2/ciclinaE,CDK4/ciclina
D,CDK6/ciclinaD,CDK2/ciclinaAyCDK1/ciclinaB.122Laprotenap21bloqueaelciclocelular
en G1/S, unindose a los complejos CDK4/ciclina D y CDK2/ciclina E. Esta parada del ciclo
celularpermitealaclularepararelDNAdaadoantesdereplicarse.Laprotenap21tieneun
papel esencial en respuesta a diferentes situaciones de estrs celular y se incrementa en estas
situaciones, especialmente tras el dao en el DNA, ya que su sntesis est regulada por la
protenasupresoradetumoresp53,123cuyaactividadaumentacuandoelDNAestadaado.124
Porotroladolaprotenap27regulasealesinhibidorasdelcrecimientoylaprotenap57tiene
una ruta de expresin tejidoespecfica, lo que indica su papel especializado en el control del
ciclocelular.123
36

Introduccin

LafamiliaINK4estformadaporcincoprotenas:p14,p15,p16,p18yp19.Adiferenciade
lasprotenasdelafamiliaCIP/KIP,queseunenacomplejosCDK/ciclina,lafamiliaINK4seune
sloaCDKenelsitiodeunindelasciclinaseinhibenaCDK4yCDK6,implicadasenelcontrol
delciclocelularenlafaseG1.125

6.3VAAMPKDEPROLIFERACINYSUPERVIVENCIACELULAR

La protena AMPK forma parte de la subfamilia de protenaquinasas activadas por


AMP/SNF1. Sus efectos ms estudiados son la inhibicin de rutas anablicas, la activacin de
rutascatablicas,laparadadelciclocelularylainduccindeapoptosis.Debidoaestosefectosse
hapropuestoalaAMPKcomomarcadormetablico.

La AMPK es un complejo heterotrimrico que consta de una subunidad cataltica y dos


subunidades reguladoras y . Existen dos isoformas conocidas de las subunidades y ,
mientrasquedelasehandescritotres.Debidoalasdistintascombinacionesdelasisoformas
se han descrito 12 complejos distintos que presentan diferencias en su actividad, regulacin y
localizacin celular.126,127 La AMPK se activa en situaciones que incrementan la relacin
AMP/ATP, como la hipoxia, los choques trmicos, el ejercicio y los niveles bajos de glucosa.
Desde un punto de vista molecular la AMPK se activa alostricamente por unin con AMP. Su
fosforilacin por diferentes quinasas tambin incrementa su actividad.128 La activacin de la
AMPK regula distintos procesos metablicos en la clula (Fig12), entre los que se incluyen la
sntesisdeprotenasyelmetabolismodelaglucosaydelos cidosgrasos.Laactivacindela
AMPKenclulastumoralessuprimeelcrecimientotumoral,mientrasquesuprdidafomentala
progresin del tumor. Este fenmeno se debe, al menos en parte, a la regulacin de las vas
metablicascelulares,129yaquelaAMPKinhibelagluclisisaerbicaylasntesisdeprotenas.
Adems,traslaincubacindelasclulastumoralesconAICAR,unactivadordelaAMPK,sehan
detectado alteraciones en SGLT1 que estn relacionadas con la expresin de la AMPK.130 Por
otrolado,laproliferacinyelciclocelularestnampliamenterelacionadosconelmetabolismo
de protenas. Se ha propuesto que la activacin de la AMPK inhibe la sntesis de protenas,
necesariaparalaproliferacinyelprogresodelciclocelular,porquedisminuyelaactividadde
mTOR131atravsdesusaccionessobreTSC2yRaptor.132,133Susefectossobreelciclotambin
son debidos a su capacidad para fosforilar a p53 en la Ser15. En condiciones normales p53 es
ubiquitinadoydegradadorpidamente,perocuandosefosforilaincrementasuestabilidad.Ello

37

Introduccin

conllevaunaumentodelosnivelesdep21CIP1conparadadelciclocelular134,135y/oinduccinde
apoptosismediantelaregulacindedistintosgenesdelafamiliaBcl2.136

Figura12.ActivacindelaAMPKprotenaquinasaencncer.AdaptadadeWang,2009

38

OBJETIVOS

Objetivos

Laalimentacinylanutricin,juntoconlaactividadfsica,seencuentranentrelosfactores
msdeterminantesparaeldesarrollodeenfermedadescomoelcncercolorrectal,92queenun
90%deloscasosestasociadoaunadietaaltaengrasasybajaenfibra.17Losalimentosadems
de aportar nutrientes, contienen una serie de sustancias no nutritivas, conocidas como
fotoqumicos,137 que no son consideradas esenciales para la salud humana, pero que pueden
tener un efecto importante en el desarrollo de enfermedades.138 Entre los fitoqumicos ms
estudiadosseencuentra laquercetina,unflavonoidequedisminuyelaproliferacincelularen
cultivos de clulas de cncer de colon HT29 con bloqueo del ciclo celular e induccin de
apoptosisdependientedep53,efectosqueseproducencomoconsecuenciadelafosforilacinde
laAMPKensusubunidad.139,140

Los probiticos son bacterias grampositivas que se clasifican fundamentalmente en dos


gneros: Lactobacillus y Bifidobacterium.73 Entre los retos principales de la investigacin con
probiticos se encuentran la determinacin de los mecanismos responsables de su eficacia, la
definicin de las diferentes cepas probiticas con efectos beneficiosos96 y el anlisis de su
posible sinergia con compuestos fotoqumicos.141 Por ello en este trabajo nos proponemos
analizarelefectodelosprobiticosB.bifidum142yL.gasseri,92ysuposiblesinergiaconldela
quercetina, sobre la viabilidad celular y la absorcin y transporte de azcares y pptidos en
clulashumanasdeadenocarcinomadecolon.Esteobjetivogeneralsedesglosaenlossiguientes
objetivosespecficos:

1. Analizar el efecto de la quercetina, de los probiticos B. bifidum y L. gasseri y de las


combinacionesdequercetinayprobiticossobrelaactividaddeenzimasconactividad
glucosidasa, como la sacarasa, o peptidasa, como la aminopeptidasa N y la
dipeptidilpeptidasaIV,encultivosdeclulashumanasdeadenocarcinomadecolonHT
29yCaco.2.
2. Analizar el efecto de la quercetina, de los probiticos B. bifidum y L. gasseri y de las
combinaciones de quercetina y probiticos sobre la expresin del transportador de
azcaresSGLT1ydeltransportadordepptidosPEPT1encultivosdeclulashumanas
deadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2.
3. Analizar el posible efecto citotxico de los probiticos B. bifidum y L. gasseri y de sus
combinaciones con quercetina en cultivos de clulas humanas de adenocarcinoma de
colonHT29yCaco.2.

43

Objetivos

4. AnalizarelefectodelosprobiticosB.bifidumyL.gasseriydesuscombinacionescon
quercetina sobre la apoptosis, el ciclo celular y la expresin de protenas relacionadas
conlacarcinognesisencultivosdeclulashumanasdeadenocarcinomadecolonHT29
yCaco.2.

44

MATERIALYMTODOS

Material y mtodos

1. DISEOEXPERIMENTAL
Como se ha comentado con anterioridad, este estudio pretenda analizar el efecto que
ejercen dos cepas de bacterias lcticas, B. bifidum y L. gasseri, complementadas y sin
complementar con quercetina en clulas de adenocarcinoma de colon y comparar este efecto
conldelaquercetinaenlasmismasclulas.Todoslosparmetroscuyaposiblemodificacin
se pretenda analizar estn relacionados con la viabilidad celular y entre ellos se incluyen la
capacidaddeproliferar,lacapacidaddetransportarnutrientesalinteriordelaclula,eltipode
muerte celular inducida por los tratamientos, el efecto sobre el ciclo celular y, por ltimo, el
efectosobrelaexpresindealgunasprotenasrelacionadasconelcontroldelcicloylamuerte
delasclulas.

Como modelo para llevar a cabo los experimentos se escogieron dos lneas celulares
humanasde adenocarcinomadecolon,HT29yCaco.2.Lascaractersticasprincipalesdeestas
doslneascelulares,quetienendiferentegradodediferenciacin,sedescribenenelapartado
2.1 de la seccin Material y Mtodos. Durante el periodo de experimentacin los cultivos
celularessemantuvieronenfasedecrecimientoexponencial,enfrascosdecultivode75cm2de
superficie, con medio de cultivo DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%
(Material y Mtodos, apartado 2.2). Para garantizar el crecimiento exponencial las clulas se
subcultivaroncadavezqueloscultivosalcanzabanel80%deconfluencia(MaterialyMtodos,
apartado2.3).

Losensayosdeproliferacincelularsellevaronacaboenplacasde96pocillosyelrestode
losexperimentosserealizaronenfrascosdecultivode25cm 2oenplacasde6pocillos.Durante
los tratamientos experimentales, de 24 horas de duracin, el medio de cultivo, DMEM/F12
suplementado con suero bovino fetal, se sustituy por DMEM/F12 suplementado con ITS
(Material y Mtodos, apartado 2.2). En todos los experimentos se sembraron seis grupos de
clulas:unodeclulassintratar(clulascontrol),unodeclulastratadasconquercetina,unode
clulastratadasconB.bifidum,unodeclulastratadasconL.gasseri,unodeclulastratadascon
B.bifidum complementado con quercetina y otro de clulas tratadas con L. gasseri
complementado con quercetina. Trascurridas las 24 h de tratamiento se realizaron las
determinacionesapropiadasentodosycadaunodelosgruposdecultivo.

Paravalorarelefectodelostratamientosenlaproliferacin celularseanalizlacapacidad
delasclulasparareducirMTT(MaterialyMtodos,apartado5.1).Paravalorarlacapacidadde

49

Material y mtodos

transportar nutrientes al interior de la clula se determinaron en los cultivos las actividades


sacarasa (Material y Mtodos, apartado 4.1), dipeptidildipeptidasa IV y aminopeptidasa N
(MaterialyMtodos,apartado4.2)yelniveldeexpresindelostransportadoresdedipptidos
PEPT1ydeglcidosdependientedesodioSGLT1.Laestimacindelosnivelesdeexpresinde
los transportadores se realiz por western blot (Material y Mtodos, apartado 7.2.1). Para
analizar si los tratamientos inducan la muerte de las clulas en los cultivos se cuantific,
medianteTUNEL,eltantoporcientodeclulasapoptticaspresentesenloscultivos(Materialy
Mtodos, apartado 5.2), mientras que para valorar la posible participacin de caspasas en el
proceso de muerte celular se repiti la cuantificacin en presencia del inhibidor universal de
caspasasZVADFMK(MaterialyMtodos,apartado5.3).Tambinsedeterminenloscultivos,
por fluorimtra, la actividad caspasa 3 (Material y Mtodos, apartado 5.4). Para analizar el
efectodelostratamientossobreelciclocelularsedetermineltantoporcientodeclulasquese
encontraban en cada una de las fases del ciclo celular. Esta determinacin se realiz
cuantificando,porcitometradeflujoconIodurodePropidio,elcontenidoenADNdelasclulas
(MaterialyMtodos,apartado6).Finalmente,paraprofundizarenelefectodelostratamientos
sobreelciclocelularysobreelmecanismodeinduccindemuertecelularsedeterminaronpor
westernblotlosnivelesintracelularesdelasprotenaspAMPK,p53,p21,Bcl2yBax(Material
yMtodos,apartado7.2.2)

2. CULTIVOCELULARDELNEASHT29YCACO.2
2.1 Descripcindelneascelularesdeadenocarcinomadecolon

EnestetrabajoseutilizaronlaslneascelularestumoralesdeadenocarcinomadecolonHT
29yCaco.2.EstaslneascelularesseobtuvierondelaAmericanTypeCultureCollection(ATCC),y
fueronsuministradasporLGCStandardsS.L.U.(Barcelona,Espaa).

Fogh y Trempe en 1975 establecieron las lneas celulares de adenocarcinoma de colon


humano HT29 y Caco.2.143 Las clulas HT29 forman cultivos heterogneos que contienen
subpoblaciones de clulas con diferente grado de diferenciacin. En condiciones estndar de
cultivo, la poblacin de clulas HT29 contiene ms de un 95% de clulas morfolgicamente
indiferenciadas. Durante su crecimiento estas clulas se apilan formando multicapas sin
polarizacin ni expresin de los marcadores de diferenciacin, caractersticos de las clulas
adultas del epitelio intestinal. Sin embargo, el resto de la poblacin (510%) desarrolla

50

Material y mtodos

caractersticas de clulas diferenciadas que expresan enzimas tales como la aminopeptidasa N


(APN),ladipeptidilpeptidasaIV(DPPIV),laglicoprotenademembranaMUC1yotrasmucinas.
LasclulasHT29presentanmutacionesenlosgenesAPC(Adenomatouspolyposiscoli)yTP53
(gensupresordetumores),conlaconsiguiente alteracindesusfuncionesyamplificacindel
protooncognMYC.144

A nivel morfolgico, las clulas Caco.2 presentan propiedades de diferenciacin in vitro


similaresalaspoblacionesderivadasdelasclulasHT29diferenciadas.Cuandoseencuentran
enfasedecrecimiento,prximaalaconfluencia,dejandeproliferarydesarrollanunamonocapa
declulaspolarizadasconunfenotipoabsortivo.Enestascondicionesdestacalapresenciadeun
bordeencepillo,mejordefinidoqueeldelaspoblacionesdiferenciadasdeHT29,enlquese
detectan niveles reducidos de lactasa y elevados de sacarasaisomaltasa, aminopeptidasa y
dipeptidilpeptidasa IV o fosfatasa alcalina.145 Las clulas Caco.2, como las clulas HT29,
tambinpresentanmutacionesenlosgenesAPCyTP53.

2.2 Mantenimientodeloscultivoscelulares

Elcultivodelasclulasserealizenfrascosde75cm2(Nunc,ThermoScientific,IL,EE.UU.)y
en estufa a 37C de temperatura con una atmosfera con un 5% de CO2 y un 96% de humedad
relativa.LoscultivossemantuvieronenDulbecco'sModifiedEagleMedium:NutrientMixtureF
12(DMEM/F12)(Invitrogen,Carlsbad,CA,EE.UU.)suplementadoconsuerobovinofetalal10%
(Invitrogen),Lglutamina2mMypenicilina/estreptomicinaal1%(LonzaBiologicsIns,EE.UU.).
Previamente a su utilizacin el suero bovino fetal (SFB) se descomplement por incubacin a
56C durante 30 minutos. Para mantener el crecimiento exponencial y el cultivo en monocapa
los medios se sustituyeron cada 48 horas y las clulas se subcultivaron por tripsinizacin al
alcanzarel80%deconfluencia.

Durantelostratamientosexperimentalesconquercetina,conlosprobiticos,B.bifidumoL.
gasseri,oconlacombinacindelaquercetinaylosprobiticos,elmediodecultivosesustituy
por DMEM/F12 sin suero bovino fetal, que se suplement con 0,01mg/mL de transferrina,
0,01mg/mLdeinsulina,0,01g/mLdeselenio(ITS),piruvatosdicoal2%yLglutamina2mM
(LonzaBiologicsIns,EE.UU.).146

51

Material y mtodos

2.3 Protocolodesubcultivo

Elmantenimientodelossubcultivossellevacaboportripsinizacin.Conestefin:

UnavezquelasclulasHT29oCaco.2alcanzaronel80%deconfluenciaenelfrascode
cultivo,seretirelmediodecultivoporaspiracinconunapipetaPasteuryselavaron
lasclulascon10mLdePBS.

Seaadieronalfrasco3mLdeunasolucindetripsina(0,05TrypsinEDTA(1X),Gibco
bylifeTechnologiesInvitrogen)yseincubaronlasclulasdurante5minutosa37C,con
un5%deCO2yun96%dehumedadrelativa.

Traslaincubacinconlatripsinaseaadieron7mLdemedioDMEM/F12suplementado
consuerobovinofetalal10%,conelfindeinactivarlaaccindelatripsina.

SetransfirilasuspensincelularatubostipoFalconde15mLyserecogieronlasclulas
porcentrifugacina300gdurante5minutos.

Una vez obtenido el precipitado celular se resuspendi en 4mL de medio DMEM/F12


suplementadoconsuerobovinofetalal10%ysecontaronlasclulasenunacmarade
Neubauer.

3. PREPARACIN DE LA QUERCETINA Y LOS PROBITICOS EN


ESTUDIO

3.1 Preparacindelaquercetina

El flavonoide quercetina (3, 3, 4, 5, 7pentahidroxiflavona dihidratada, > 99% pureza) se


obtuvodellaboratorioSigmaAldrichQumica,S.A.(Alcobendas,Madrid,Espaa).

Laquercetinasedisolviinicialmenteendimetilsulfxido(DMSO)(SigmaAldrichQumica,
S.A)aunaconcentracinde0,1M.Lasolucinobtenidaseesterilizporfiltracinatravsdeun
filtro de 0,22 micras (Milipore Ibrica S.A.U, Espaa). A partir de sta solucin de stock, se
prepararon diluciones seriadas (103, 104, 5x104 ,105, 106 y 107M) en el medio de cultivo
DMEM/F12 sin suplementar. Estas disoluciones se almacenaron a 20 C hasta su posterior
utilizacin.

52

Material y mtodos

3.2 Preparacindelosprobiticos

Los probiticos B. bifidum CECT 870 y L. gasseri CECT 4479 se obtuvieron de la Coleccin
EspaoladeCultivosTipo(CECT),(Valencia).

LacepaL.gasserisecrecienagar MRSlquido(ScharlauChemieS.A)a 37Cdurante48


horas.Loscultivosde B.bifidumtambinsecrecieronenagarMRSlquidoa37Cdurante 48
horasperomantenindolosenunaatmsferaconun5%deCO2yun96%dehumedadrelativa.
Posteriormentelasbacteriasserecogieronporcentrifugacina1200gdurante10minutos,se
lavaroncon5mLdePBSyseresuspendieronenmediodecultivoDMEM/F12sinsuplementar.
Lasuspensinbacterianasecuantificporespectrofotometradeluzvisible(600nm,UV1630
UVVisible Spectrophotometer de Shimazu Kyoto, Japn) de acuerdo a una curva estndar
previamentepreparada(McFarland).147

4. ANLISIS DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA EN CLULAS DE


ADENOCARCINOMADECOLON

4.1 Determinacindelaactividadsacarasa

LadeterminacindelaactividadsacarasaserealizenextractosdeclulasHT29yCaco.2.
LadeterminacinsellevacabosegnelmtodoGODPAPdescritoporDahlqvisten1964.148
Estemtodosebasaenlamedidadelacantidaddeglucosaliberadaapartirdelahidrlisisdel
disacridosacarosapor laaccindelcomplejoenzimticosacarasaisomaltasalocalizadoenel
borde en cepillo del enterocito. La cuantificacin de la glucosa se realiza siguiendo
espectrofotomtricamente a una longitud de onda de 500 nm la oxidacin de la glucosa por
mediodelaenzimaglucosaoxidasa(GlucoseGLUCPAP,RandoxLaboratoriesLTD)(Fig.13).

53

Material y mtodos

GOD

2 GLUCOSA
2H2O+2O2

2 cido glucnico

2H2O2
4 H2O

FENOL

QUINONEIMINA

4- Aminofenazona
POD

Figura13.DescripcindelmtodoGODPAP.Estemtodoconstadedosreaccionescatalizadasporla
glucosaoxidasayunaperoxidada.

El anlisis de la actividad sacarasa se llev a cabo de acuerdo con el siguiente


procedimiento:

SeincubaronlasclulasHT29oCaco.2enDMEM/F12suplementadoconITS,piruvato
sdico al 2% y Lglutamina 2mM, en placas de 6 pocillos, a una concentracin de 106
clulasporpocillo,durante24horas.

Traslas24horasseaadieronalmediodecultivolaquercetina,aconcentracin100M,
los probiticos, a una concentracin de 107 ufc/mL o la combinacin de quercetina y
probiticosysecontinulaincubacindurante24horas.

Trascurridaslas24horasdetratamiento,lasclulasselavaroncon1mLdePBS.

Despus de lavar las clulas con PBS se aadieron 500 L de Passive Lysis Buffer (1x)
(Promega Corporation, U.S.A) a cada pocillo y se continu la incubacin durante 15
minutosconagitacin(20rpm,VibromixTehtnica)atemperaturaambienteconelfinde
soltarylisarlasclulasHT29yCaco.2delasuperficiedelospocillos.

Tras la incubacin con el tampn de lisis, se centrifug la suspensin celular a 300 g,


durante5minutosa4C.

Traslacentrifugacin,serecogieronlossobrenadantesdelasclulasysecuantificla
concentracin de protena. La cuantificacin de protena se realiz por el mtodo
Bradford(Apartado7.1).

Las muestras se almacenaron a 80C hasta el posterior anlisis de la actividad


enzimticadelasacarasa.

Lasmuestrassedescongelaronenhieloduranteaproximadamente15minutos.

54

Material y mtodos

UnavezdescongeladaslasmuestrasdelasclulasHT29yCaco.2,seincubaron100L
de la muestra de las clulas HT29 o Caco.2 con 100 L del tampn disacrido (56mM
sacarosa)durante1horaa37C.

Tras la incubacin con el tampn disacrido se aadi 1mL del reactivo GODPAP y se
continulaincubacindurante15minutosa37C.

Finalmente,yunaveztranscurridalaincubacinconelreactivoGODPAP,sepasala
lecturadelasmuestrasconunespectrofotmetroaunalongituddeondade500nm(UV
1630UVVisibleSpectrophotometerdeShimazuKyoto,Japn).

Losvaloresobtenidosseexpresaroncomoactividadespecificadelaenzimasacarasaenlas
clulas HT29 y Caco.2, tras el tratamiento con quercetina, o con los probiticos, o con la
combinacindelaquercetinaylosprobiticos.

4.2 Determinacin de la actividad de la aminopeptidasa N y la


dipeptidilpeptidasaIV

La determinacin de la actividad enzimtica de la aminopeptidasa N y de la


dipeptidilpeptidasaIV,enzimasancladasenlamembranadebordeencepillodelosenterocitos,
se basa en la cuantificacin por fluorimetra de la naftilamida, que se libera al hidrolizar las
dipeptidasassussustratosespecficos(Fig.14).149

Lalanilnaftilamida

AMINOPEPTIDASAN

naftilamida

excitacin:340nm

emisin:410nm

DIPEPTIDILPEPTIDASAIV

Lglicilpropilnaftilamida

naftilamida
excitacin:340nm

emisin:410nm

Figura14.DeterminacindelasactividadesaminopeptidasaNydipeptidilpeptidasaIV.

55

Material y mtodos

La determinacin de la actividad de las dipeptidasas se llev a cabo mediante el siguiente


procedimiento:

SeincubaronlasclulasHT29oCaco.2aunaconcentracinde 106 clulasporpocillo,


enplacasde6pocillosdurante24horas.

Traslaincubacindurante24horassepasoaincubarlasclulasconlaquercetinaauna
concentracinde100M,oconlosprobiticosaunaconcentracinde107ufc/mLocon
la combinacin de la quercetina y los probiticos en placas de 6 pocillos durante 24
horas.

Trascurridas 24 horas, de accin de los diferentes tratamientos, las clulas se lavaron


con1mLdePBS.

Despus de lavar las clulas con PBS se aadi 500 L de Passive Lysis Buffer (1x)
(Promega Corporation, USA) a cada pocillo y se continu la incubacin durante 15
minutosconagitacin(20rpm,VibromixTehtnica)atemperaturaambienteconelfinde
soltarylisarlasclulasHT29yCaco.2delasuperficiedelospocillos.

Tras la incubacin con el tampn de lisis, se centrifug la suspensin celular a 300 g,


durante5minutosa4C.

Traslacentrifugacin,serecogieronlossobrenadantesdelasclulasysecuantificla
concentracin de protenas. La cuantificacin de protena se realiz por el mtodo
Bradford(Apartado7.1).

Se almacenaron a 80C hasta el posterior anlisis en los estudios de la actividad


enzimticadelaaminopeptidasaNyladipeptidilpeptidasaIV.

Lasmuestrassedescongelaronenhieloduranteaproximadamente15minutos.

Los sustratos Lalanilnaftilamida y Lglicilprolil naftilamida (SigmaAldrich


Qumica,S.A.)sediluyeron,aunaconcentracinde3,6mM,endimetilformamidaal40%
y se almacenaron a 20 C hasta el posterior anlisis de la actividad de las enzimas
aminopeptidasaNydipeptidilpeptidasaIV.

Unavezdescongeladoslosextractoscelulares,seincubaron100Ldecadaunodelos
sustratos descritos anteriormente con 100 L de tampn fosfato (0,5 M de fosfato
potsicodicidoy0,5Mdefosfatopotsicomonocido)durante5minutosa37C.

Transcurridoestetiemposeaadieron100LdelextractocelulardelasclulasHT29o
Caco.2 que previamente haba sido descongelado en hielo y se continu la incubacin
durante30minutosa37C.

Finalmenteseaadieron1,5mLdelasolucindeStopglicina(50mMglicina),sedejaron
enfriar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente y se leyeron en un

56

Material y mtodos

fluormetro a una longitud de onda de 340nm de excitacin y 410mm de emisin


(Spectofluorophotometerrf1501,shimadzu).

Los valores obtenidos se expresaron como actividad especfica de las enzimas


aminopeptidasaNydipeptidilpeptidasaIVenclulasHT29yCaco.2.

5. ESTUDIOSDEPROLIFERACINYMUERTECELULAR

5.1 Determinacin de la actividad citotxica de la quercetina y las cepas


probiticasenlaslneascelularesHT29yCaco.2

Laactividadcitotxicadelaquercetinaydelosprobiticosseanalizatravsdeunensayo
colorimtrico in vitro basado en la reduccin del MTT (3(4,5dimetil2tiazolil)2,5
difeniltetrazoilo))(SigmaAldrichQumica,S.A.)porlaenzimasuccinatodeshidrogenasa.Eneste
ensayo, las clulas metablicamente activas reducen el MTT, de color amarillo en solucin, a
formazn, compuesto insoluble que precipita en forma de cristales de color azul oscuro. La
cantidaddeformaznformadoenlareaccinpuedecuantificarseporespectrofotometra,loque
permiteestimarelnmerodeclulasvivaspresentesenloscultivosdeHT29yCaco.2.

La viabilidad de las clulas HT29 y Caco.2 se estim comparando el crecimiento de las


clulassintratar(control)ytratadasconquercetinaoconlosprobiticosoconlaquercetinaen
combinacinconlosprobiticosconrespectoalnmerodeclulassembradasinicialmente.Los
ensayos se realizaron en placa de 96 pocillos de fondo plano, a una concentracin de 10.000
clulasporpocilloenelcasodelalneacelularHT29y20.000clulasporpocilloenelcasode
la lnea celular Caco.2. Los ensayos se realizaron en un volumen final de 200 L (100 L
suspensincelular,20Ldelcompuestoenestudioy80Ldemediodecultivosuplementado).
Se incubaron ambas lneas celulares en presencia de concentraciones crecientes de quercetina
(104, 5x105, 105, 106, 107 y 108 M), o de probiticos B. bifidum o L. gasseri (106 , 5x106, 107,
5x107 y108 ufc/mL,medidasporespectrofotometra)odeunamezcladeambos(107 ufc/mLde
B. bifidum o L. gasseri con concentraciones crecientes, 104, 5x105, 105, 106, 107 y 108 M de
quercetina). A las clulas no tratadas (control) se les aadi el vehculo en el que se haba
disuelto la quercetina (DMSO 1mL/L). En todos los experimentos se sembr una placa con
clulassintratarcomocontroldetiempocero(placaT0).Lasplacasseincubaronenlaestufaa
37C, 5% CO2 y un 96% de humedad relativa durante 24 horas. Trascurrido el tiempo de

57

Material y mtodos

incubacinseaadieron50LdeMTT(2mg/mLenPBS)porpocilloylasplacasseincubaron
durante 4 horas adicionales. Transcurrido este tiempo se retir el medio por aspiracin, se
aadieron150LdeDMSOporpocilloysemidilaabsorbanciaaunalongituddeondade550
nmenunlectordeELISABioKineticsTeader(BIOTEK,Winooski,VT,EE.UU.),sustrayendoel
valorobtenidoa630nmparareducirelruidodefondo(Fig.15).

Figura 15. Esquema representativo de un ensayo de citotoxicidad. Las imgenes muestran los
diferentes pasos que se llevaron a cabo para realizar el anlisis de citotoxicidad de la quercetina, los
probiticosolamezcladelaquercetinaylosprobiticos.

Los datos, normalizados respecto a su control en cada experimento, se obtuvieron de al


menos tres experimentos independientes realizados por cuadruplicado. Los resultados se
expresancomoporcentajedecrecimiento(MediaSEM)ysecalcularonapartirdelosdatosde
absorbanciadeacuerdoalsiguienteclculo:

[(AA0/(ACA0)]x100,cuandoAA0

[(AA0)/A0]x100,cuandoA<A0

donde:

A=absorbanciadelasclulastratadasconloscompuestos

A0=absorbanciaatiempocero

AC=absorbanciadelasclulassintratar(Control)
58

Material y mtodos

Losparmetrosdecitotoxicidadseobtuvieronporextrapolacinencurvasdosis/respuesta
yseexpresancomoGI50(concentracinqueinhibeenun50%elcrecimientodelasclulas),TGI
(concentracin que inhibe totalmente el crecimiento de las clulas) y LD50 (concentracin que
disminuyeenun50%elnmerodeclulasiniciales).

5.2

Determinacindeapoptosisencultivoscelulares

El nivel de apoptosis en los cultivos de las lneas celulares HT29 y Caco.2 se determin
medianteelsistemaApoDirectTM(BDPharmingen).EstesistemasebasaenlatcnicadeTUNEL.
La tcnica de TUNEL tiene como fundamento la incorporacin de un oligonucletido marcado
con fluorescencia en los extremos de las cadenas de DNA en una reaccin catalizada por la
transferasaterminal(TdT).Estatcnicapermitecuantificarelporcentajedeclulasapoptticas
enuncultivoyaquelaactivacindeendonucleasasduranteelprogramaapoptticoprovocala
degradacindelacromatinaylafragmentacindelDNA.ConelsistemaApoDirectTM seemplea
unmtododeunsolopasoparamarcarlasroturasdelDNAcondUTPsunidosalfluorocromo
isocianatodefluorescena(FITC).Posteriormentesedetectanlasclulasapoptticasmediante
citometradeflujo.

Figura16.FundamentodelkitApoDirectTM.EstemtodosebasaenelmarcajedefragmentosdeDNA
conFITCdUTP.

59

Material y mtodos

Lacapacidaddelaquercetina,olosprobiticosolacombinacindequercetinayprobiticos
parainducirapoptosisenclulasdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2sedetermintras
24 horas de tratamiento con quercetina, o con los probiticos o con la mezcla con
concentraciones de 100M de quercetina y 107 ufc/mL de cada uno de los probiticos por
separado.

Tras los tratamientos, las clulas se tripsinizaron (Apartado 2.3) y se recogieron por
centrifugacin. Posteriormente las clulas se incubaron con paraformaldehido (SigmaAldrich
Qumica, S.A.) al 1% (p/v) en PBS de pH 7,4 (DPBS, Gibco), a una concentracin de 1x106
clulas/mLdurante30minutosa0C.

Tras la incubacin de las clulas con el paraformaldehido, las clulas se recogieron por
centrifugacindurante5minutosa300gyselavarondosvecescon5mLdePBSysevolvieron
arecogerlasclulasporcentrifugacindurante5minutosa300g.

Finalmente, las clulas recogidas por centrifugacin se fijaron en etanol al 70% a una
concentracinde1x106clulas/mLa0Cdurante30minutosysealmacenarona20Chastasu
posterioranlisis.

Para el marcado de las clulas stas se mantuvieron en hielo y se recogieron por


centrifugacin durante 5 minutos a 300 g para eliminar el etanol residual. Tras realizar dos
lavadoscon1mLdeWashBuffer,serecogieronlasclulasporcentrifugacina300gdurante5
minutos.

Lasclulasseincubaronconlasolucindemarcado,quecontienelaenzimaTdT,FITCdUTP
ytampndereaccin,duranteunahoraenunincubadora37C.Acontinuacinselesaadi1
mL de la solucin de aclarado Rinse Buffer y se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos. Este
proceso se repiti tras retirar el sobrenadante por aspiracin. Por ltimo, el precipitado se
resuspendi en 0,5 mL de solucin de yoduro de propidio/RNasa y se incub 30 minutos en
oscuridadatemperaturaambiente.

Las clulas marcadas se analizaron en un citmetro de flujo EPICSXL4CLR (Beckman


Coulter,Miami,Florida,EE.UU.),equipadoconunlserdeargn(488nm).Lafluorescenciadel
FITCsedetectaunalongituddeondade520nm.Elcalibrado delcitmetrosecomproben
cadaexperimentoutilizandoFlowCheckFluorospheres(BeckmanCoulter).Losdatosenescala

60

Material y mtodos

logartmica, obtenidos a partir de 10.000 clulas por muestra, se analizaron con el programa
informticoEXPO32ADC(BeckmanCoulter,Miami,Florida,EE.UU.).

Losresultadosseexpresancomotantoporcientodeclulasapoptticasenelcultivotrasel
tratamiento con la quercetina, o con los probiticos o con la combinacin de quercetina y
probiticos. Para el clculo de los resultados se realizaron como mnimo 3 experimentos
independientesporduplicado.

5.3

Anlisis del efecto del inhibidor de caspasas ZVADFMK sobre las

muertecelularinducidaporlostratamientos

Con el fin de analizar si la capacidad de la quercetina, o de los probiticos B. bifidum y L.


gasseriodelacombinacindequercetinayprobiticosparainducirapoptosiseradependiente
delaactivacindecaspasas,lasclulasfueronpreincubadasdurante1horaconZVADFMK(BD
Pharmingen),uninhibidoruniversaldecaspasasdeamplioespectroqueinhibelaaccindelas
caspasas mediante unin irreversible al sitio cataltico de estas proteasas y por lo tanto
inhibicin de la apoptosis. La concentracin utilizada del inhibidor fue de 20 M. Tras la
preincubacin,lasclulassetrataronconquercetina100M,ocon107ufc/mLdeprobiticoo
con la mezcla de ambos (quercetina 100 M y probitico 107 ufc/mL) durante 24 horas.
Transcurridas las 24 horas las clulas se analizaron con el sistema ApoDirectTM tal y como se
describeenelapartadoanterior.

5.4 AnlisisdelaactividadCaspasa3

Ladeterminacindelaactividaddelacaspasa3serealizconelkitApoAlertCaspaseAssay
Plates (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA). Este kit contiene el tetrapptido DEVD, sustrato
especficodelacaspasa3unidoaunfluorocromoinmovilizado enlospocillosdeunaplacade
96 pocillos. Cuando el lisado celular que contiene la caspasa 3 activa se aplica a los diferentes
pocillos, sta degrada el tetrapptido liberando el fluorocromo, que se puede detectar con un
lectordeplacasdefluorescenciaestndaraunalongituddeondade460nm.

Losanlisisserealizarontraseltratamientodelasclulasconlaquercetinaaconcentracin
100M,oconlosprobiticosaconcentracin107ufc/mLoconlamezcladeambos(quercetina
100Myprobitico107ufc/mL)durante24horas.

61

Material y mtodos

Acontinuacinsedescribebrevementeelprocedimiento:

Una vez transcurrido el tiempo de incubacin con la quercetina, o los probiticos o la


combinacindequercetinayprobiticos,lasclulassetripsinizaron(Apartado2.3)yse
contaron.

Sesepararon2x105 clulas/pocilloylasuspensincelularsecentrifuga300ga4C
durante5minutos.

Seretirelsobrenadante,seresuspendielprecipitadocelularen50Ldesolucinde
lisis1xyseincubdurante10minutosa0C.

Unaveztranscurridoeltiempodeincubacinsecentrifuglasuspensincelulara300g
a 4 C durante 5 minutos y se transfiri el sobrenadante a tubos tipo eppendorf
preenfriadosymantenidosenhielohastasuposteriorutilizacin.

Seaadieron50LdelReactionBuffer/DTTacadapocillodeunaplacade96pocillosy
seincublaplacadurante5minutosenunincubadora37C.

Tras la incubacin de la placa con el Reaction Buffer/DTT, se aadieron 50 L de las


muestras celulares que estaban mantenidas en hielo, a cada uno de los pocillos y se
continulaincubacindurante2horasa37C.

Finalmente, se midi la fluorescencia emitida por los extractos celulares en un


fluormetroFLUOROSKANASCENTFL(ThermoLabsystems,Waltham,MA).Longitudde
ondadeexcitacinutilizadafue380nmyladeemisinfuede460nm).

62

Material y mtodos

Induccindeapoptosisenclulas

Activacindecaspasa3

excitacin:380nm

Lisadoscelulares

AMC
DEVDAMC

emisin:460nm

DEVD

Figura17.Esquemadelanlisisdedeteccindecaspasa3activa.Semuestranlospasosarealizar
paraelanlisisdelacaspasa3ysuposteriorlecturaenunfluormetro.

6. ANLISISDELCICLOCELULAR

ElanlisisdelciclocelularsellevacaboconelsistemaApoDirectTM.Estesistemacontiene
elfluorocromoyodurodepropidio.Estefluorocromo,queemitefluorescenciaa623nm,seune
alDNAtotalyproporcionainformacinsobreelcontenidoenDNAdelasclulas,porlotanto
sobreelporcentajedeclulasdelcultivoqueseencuentranencadaunadelasdiferentesfases
delciclocelular.

Encadaexperimentoseanalizaron20.000clulasquehabansidopreviamentefijadascon
paraformaldehidoymarcadasconiodurodepropidio,talcomosedescribeenelapartado4.1.La
fluorescenciaemitidaporeliodurodepropidiosedetectconuncitmetrodeflujoEPICSXL
4CLR(BeckmanCoulter,Miami,Florida,EE.UU.),equipadoconunlserdeargn(488nm)yse
registr en forma de histogramas. Los datos obtenidos se analizaron con el programa
informticoEXPO32ADC(BeckmanCoulter,Miami,Florida,EE.UU.).Losresultadosseexpresan
entantoporcientodeclulasencadaunadelasfasesdelciclo.Paraelclculodelosresultados
serealizaroncomomnimo3experimentosindependientesporduplicado.

63

Material y mtodos

Figura18.Fasesdelciclocelular,enrelacinalacantidaddeDNA.AdaptadodeMolecularBiologyof
thecell,4thEdition.

7. CUANTIFICACINYEXPRESINDEPROTENAS

7.1CuantificacindeprotenasporelmtododeBradford

Para determinar la cantidad de protena en los extractos celulares se utiliz el mtodo de


cuantificacindeprotenaBioRadProteinAssay(BioRadLaboratoriesInc)basadoenelmtodo
colorimtrico de Bradford. En este mtodo se emplea un colorante hidrofbico que tiene un
color pardo y que al unirse a la protena, origina un color azul intenso que se puede medir
fcilmente. Para determinar la concentracin de protena total presente en una muestra se
requierelapreparacindeunacurvadecalibradoempleandounaprotenapatrn.Paraobtener
la recta patrn se emplearon soluciones de concentracin conocida de seroalbmina bovina
(BSA),preparadasapartirdeunasolucinpatrndeconcentracinconocida(2mg/mL)(Pierce,
ThermoScientific).Acontinuacinsemezclaron20Ldelosestndaresdeseroalbmina,o20
L de los extractos celulares en los que se quera determinar la protena, con 200 L del
colorante (diluido 1/5 en agua destilada). La reaccin colorimtrica se determin en un
espectrofotmetroaunalongituddeondade595nm.

64

Material y mtodos

7.2 ExpresindeprotenasmediantelatcnicadeWesternblot

Enestetrabajosehaanalizadopor westernblotlaexpresindeltransportadordeglcidos
dependientedesodioSGLT1,deltransportadordedipptidosPEPT1ydedistintasprotenas
implicadasenlainduccindeapoptosisyelcontroldelciclocelular(pAMPK,Bcl2,Bax,p53y
p21). El western blot permite identificar, cuantificar y localizar protenas en funcin de su
capacidadparaenlazarconanticuerposespecficos.Latcnicaconstadeunaprimerafaseenla
quelasprotenasseseparanenungeldepoliacrilamidayposteriormentesetransfierenauna
membrana de nitrocelulosa. En una segunda etapa la membrana se incuba con un anticuerpo
especficoquereconocelaprotenadeinters.LosanticuerposutilizadosserecogenenlaTabla
3.

7.2.1 DeterminacindetransportadoresdemembranaPEPT1ySGLT1

Se incubaron las clulas HT29 y Caco.2 a una concentracin de 106 clulas por pocillo
conlaquercetina,olosprobiticoolacombinacindelaquercetinaylosprobiticosen
placasde6pocillosdurante24horas.

Traslaincubacinlasclulasselavaroncon1mLdePBS.

Traseltratamientoylavadodelasclulas,seaadieron 500Lde PassiveLysisBuffer


(1x)(PromegaCorporation,U.S.A)acadapocilloyseincublaplacadurante15minutos
enagitacin(20rpm,VibromixTehtnica).

DespusdelaincubacinconeltampndePassiveLysisBufferserecogilasuspensin
celularysecentrifuga300ga4Cdurante5minutos.

Se recogieron los sobrenadantes y se determin la concentracin de protena por el


mtododeBradford(Apartado7.1).

Sealmacenarona80Chastasuposterioranlisis.

Losextractoscelulares,unavezdescongelados,sesepararonporelectroforesisengeles
depoliacrilamidaal10%,cargando12gdelextractocelular.Laelectroforesisselleva
cabo a 20mA y 100V durante los primeros 30 minutos y 60mA y 200V durante los
siguientes30minutos,medianteelsistemaMiniPROTEAN3ElectrophoresisCell(Bio
Rad).

Una vez terminada la electroforesis las protenas se transfirieron del gel de


poliacrilamidaamembranasdenitrocelulosa.Laelectrotransferenciaserealizdurante
1horaa400mAy100V,medianteelsistemaMiniTransBlotCell(BioRad).

65

Material y mtodos

Acontinuacin,conelfindeevitarunionesinespecficasdelosanticuerpos,sebloque
la membrana por incubacin con una solucin de leche desnatada al 1% en solucin
TBSTween(1x).

Traslaincubacindebloqueo,lasmembranasselavaron2vecesdurante5minutoscon
TBSTween(1x).

Posteriormente se incubaron las membranas a 4 C con agitacin (20 rpm, Vibromix


Tehtnica)durante16horasconelanticuerpoprimarioPEPT1(H235)oSGLT1(H235)
diluido1:200ensolucinTBSTween(1x).

Traslaincubacin,lasmembranasselavarontresveces,unavezdurante10minutosy2
vecesdurante5minutos,conTBSTween(1x)conagitacin(20rpm,VibromixTehtnica).

Una vez realizados los lavados, las membranas se incubaron con la solucin de
anticuerposecundarioperoxidadogoatantirabbitIgG.HRP(dilucin1:2000)durante1
horaconagitacin(20rpm,VibromixTehtnica)(Tabla3).

Tras la incubacin con el anticuerpo secundario, se repitieron los lavados citados


anteriormente y se detectaron las protenas por un mtodo quimioluminiscente
(Amersham ECL Primer Western Blotting Detection Reagent, Amersham GE Healthcare,
UK), dejando en contacto la membrana de nitrocelulosa con el reactivo durante 1
minutos. Posteriormente se exponen las membranas en pelculas de radiografa
(Hyperfilm TM MP,AmershamGEHealthcare,UK).Traslaexposicindelasmembranas
con las pelculas radiogrficas se revelaron en una mquina de revelado Curix 60
(AGFA).

7.2.2 DeterminacindelasprotenaspAMPK,Bcl2,Bax,p53yp21

Se incubaron las clulas HT29 y Caco.2 a una concentracin de 106 clulas por pocillo
conlaquercetina,olosprobiticoolacombinacindelaquercetinaylosprobiticosen
placasde6pocillosdurante24horas

Tras los tratamientos las clulas se tripsinizaron (Apartado 2.3) y se recogieron por
centrifugacina300gdurante5minutos.

Losprecipitadoscelularesseresuspendieronen500LdetampndelisisRIPA(Sigma
Aldrich Qumica, S.A) suplementado con un cctel de inhibidor de proteasas (Protease
inhibitorcocktail,SigmaAldrichQumica,S.A),seaadi1mLdelinhibidordeproteasas
por cada 10 mL del tampn de lisis RIPA, posteriormente se incubaron durante 30
minutosenhielo.

66

Material y mtodos

Traslalisislasuspensincelularsecentrifuga300gy4Cdurante5minutos.

Se recogieron los sobrenadantes y posteriormente se determin la concentracin de


protenaporelmtododeBradford(Apartado7.1).

Sealmacenarona80Chastasuposterioranlisis.

Losextractoscelularessedescongelaronenhieloyunavezdescongelados,sesepararon
porelectroforesisengelesdepoliacrilamidaal10%.Secarg 12gdecadaunodelos
extractoscelularesenelgeldepoliacrilamida.Laelectroforesissellevacaboa20mAy
100V durante los primeros 30 minutos y 60mA y 200V durante los siguientes 30
minutos,medianteelsistemaMiniPROTEAN3ElectrophoresisCell(BioRad).

Una vez finalizada la electroforesis las protenas se transfirieron del gel de


poliacrilamida

membranas

de

nitrocelulosa

(BioRad).

Se

realiz

la

electrotransferenciadurante1horaa400mA y100V,medianteelsistemaMiniTrans
BlotCell(BioRad).

Acontinuacin,conelfindeevitarunionesinespecficasdelosanticuerpos,sebloque
lamembranaporincubacinconunasolucindelechedesnatadaal1%ensolucinTBS
Tween(1x)paralosanticuerposBcl2,Bax,p53yp21yconunasolucindealbminaal
5 % (Albumin, Bovine, SigmaAldrich Qumica, S.) en solucin TBSTween (1x) para el
anticuerpopAMPK,durante1horaconagitacin(20rpm,VibromixTehtnica).

Traslaincubacindebloqueo,lasmembranasselavaron2vecesdurante5minutoscon
TBSTween(1x).

Posteriormenteseincubaronlasmembranasconelanticuerpoprimario(pAMPK1/2
(Thr 172), Bax ( 21), Bcl2 (N19), p21 (C19) o p53 (FL393)) diluido 1:200 en
solucinTBSTween(1x),a4Cconagitacin(20rpm,VibromixTehtnica)durante16
horas.Tabla3

Traslaincubacin,lasmembranasselavarontresvecesconagitacin(20rpm,Vibromix
Tehtnica).Unavezdurante10minutosy2vecesdurante5minutosconTBSTween(1x)
para los anticuerpos Bax ( 21), Bcl2 (N19), p21 (C19), p53 (FL393), y una vez
durante10minutosy2vecesdurante5minutosconTBSTween(5x)paraelanticuerpo
pAMPK.

Unavezrealizadosloslavadoscitadosanteriormente,lasmembranasseincubaroncon
la solucin de anticuerpo secundario goat antirabbit IgG.HRP peroxidado (dilucin
1:2000;(Tabla3)durante1horaconagitacin(20rpm,VibromixTehtnica).

Tras la incubacin con el anticuerpo secundario, se repitieron los lavados citados


anteriormente y se detectaron las protenas por un mtodo quimioluminiscente
(Amersham ECL Primer Western Blotting Detection Reagent, Amersham GE Healthcare,
UK), dejando en contacto la membrana de nitrocelulosa con el reactivo durante 1
67

Material y mtodos

minutos. Posteriormente se exponen las membranas en pelculas de radiografa


(Hyperfilm TM MP,AmershamGEHealthcare,UK).Traslaexposicindelasmembranas
con las pelculas radiogrficas se revelaron en una mquina de revelado Curix 60
(AGFA).

Se cuantific la intensidad de la banda de las diferentes protenas mediante el programa


QuantityOne(BioRad).Losdatosseobtuvieronapartirdelacuantificacinportriplicadodeal
menos3membranasdistintasprocedentesde3experimentosindependientes.Paracorregirlas
posibles diferencias en la cantidad de protena entre muestras se emple la Actina
(anticuerpo BActin (PA121167) diluido 1:500) como control de carga. Los valores obtenidos
para cada protena en estudio se expresan de forma relativa con respecto a la cantidad de
Actina.

Tabla3.AnticuerposempleadosparaWesternblot

Primarios

Secundario

Anticuerpos

Especie

Casa
comercial

PEPT1(H235)

Conejo

SantaCruz

SGLT1(H85)

Conejo

SantaCruz

pAMPK1/2(Thr172)

Conejo

SantaCruz

Bax(21)

Conejo

SantaCruz

Bcl2(N19)

Conejo

SantaCruz

P21(C19)

Conejo

SantaCruz

P53(FL393)

Conejo

SantaCruz

actina(PA121167).

Conejo

Thermo

GoatantirabbitIgG.HRP

Conejo

SantaCruz

68

Material y mtodos

8. ANLISISESTADSTICO

El anlisis estadstico se realiz con el programa SPSS 19.00 para Windows (IBM SPSS
StatisticsforWindows,versin19.00Armonk,NY:IBMCorp.).Elestudiodeladistribucinde
las muestras se realiz mediante las pruebas de normalidad de ShapiroWilks y Kolmogorov
Smirnov. Las diferencias estadsticas entre las muestras en cada experimento se analizaron
mediante el test para comparaciones mltiples de KruskalWallis, seguido de las pruebas a
posteriori U de MannWhitney. Las diferencias entre grupos se consideraron estadsticamente
significativas a un nivel de P<0.05.

69

RESULTADOS

Resultados

1.ACTIVIDADENZIMTICAYTRANSPORTADORESDEMEMBRANA

La actividad enzimtica y el transporte de azcares, aminocidos y pptidos estn

modificados en el desarrollo del cncer colorrectal debido al proceso de proliferacin,


diferenciacineinflamacinqueseproduceenelintestino.Laexpresin deltransportadorde
glucosa SGLT1150 y del transportador de dipptidos o tripptidos PEPT1, 151 por ejemplo,
incrementaenelcncercolorrectal.Estasalteracioneseneltransportedeglucosaydepptidos
suelen estar asociadas con alteraciones en la actividad enzimtica intestinal de disacaridasas,
comolasacarasa,opeptidasas,comolaaminopeptidasaNyladipeptidilpeptidasaIV.152,153

Considerando estos antecedentes, decidimos analizar si el tratamiento con quercetina, con


los probiticos B. bifidum o L. gasseri o con la combinacin de la quercetina y los probiticos
modificaba la actividad de estas enzimas, o la expresin de los transportadores de membrana
PEPT1 y SGLT1, en lneas celulares de adenocarcinoma de colon. Con este fin se trataron
cultivos de las lneas celulares HT29 y Caco.2 con quercetina 100 M, con 107 ufc/mL de B.
bifidum o L. gasseri o con la combinacin de quercetina 100 M y 107 ufc/mL del probitico
durante24horas,yposteriormentesedeterminlaactividadsacarasa,dipeptidilpeptidasaIVy
aminopeptidasa N y la expresin de los transportadores PEPT1 y SGLT1 en los cultivos. La
determinacindelaactividadenzimticadelasacarasasellevacaboporelmtodoGODPAP.
LadeterminacindelaactividaddelaaminopeptidasaNydeladipeptidilpeptidasaIVselleva
cabo mediante la cuantificacin por fluorimetra de la naftilamida liberada tras la hidrlisis
por las dipeptidasas de la Lalanilnaftilamida y la Lglicilpropilnaftilamida
respectivamente. La expresin de los transportadores de membrana PEPT1 y SGLT 1 se
determinoporwesternblotconanticuerposespecficos.Losresultadosobtenidossemuestran
enlasFiguras19a23.

ComoseobservaenlaFigura19,eltratamientoconquercetina100Maumentalaactividad
sacarasaenambaslneascelulares,tantoenpresenciacomoenausenciadelosprobiticos.Sin
embargo,losprobiticosporsimismosnotienenefectosobrelaactividadsacarasaenninguna
de las dos lneas celulares. Por otro lado, no se encontraron diferencias significativas en la
actividad sacarasa entre los cultivos tratados con quercetina 100 M y los tratados con la
combinacindequercetinayprobiticos(Fig.19).EstosresultadossugierenqueB.bifidumyL.
gasserinomodificanlaactividadsacarasaencultivosdelneas celularesdeadenocarcinomade
colon.

73

Resultados

Figura 19. La quercetina aumenta la actividad sacarasa en clulas HT29 y Caco.2. Las clulas se
cultivarondurante24horasenausencia(control)opresenciadequercetina100M,107ufc/mLdelos
probiticosB.bifidumoL.gasseri,olamezcladequercetinayprobitico.Tras24horasdeincubacinse
lisaronlasclulasysedeterminlaactividadenzimticamedianteelmtodoGODPAP.Losresultadosse
expresan como media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferenciassignificativasconrespectoalosdelasclulascontrol(p0,05).

74

Resultados

LaFigura20muestralosresultadosdelaactividadenzimtica delaaminopeptidasaNtras
los tratamientos. En la Figura 20 se manifiesta que el tratamiento con quercetina 100 M
durante 24 horas disminuye la actividad aminopeptidasa N en ambas lneas celulares. Sin
embargo, el tratamiento con las cepas probiticas no tiene efecto sobre dicha actividad. El
tratamientocombinadoconlaquercetinaylascepasB.bifidumoL.gasseritambinmuestraque
los probiticos no modifican el efecto de la quercetina sobre la actividad enzimtica
aminopeptidasaNenloscultivoscelulares(Fig20).

Figura20.LaquercetinadisminuyelaactividadaminopeptidasaNenclulasHT29yCaco.2.Las
clulas se cultivaron en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, de 107 ufc/mL de los
probiticosB.bifidumoL.gasseri odelamezcladequercetinayprobitico.Tras24horasdeincubacin
selisaronlasclulasysedeterminlaactividadenzimticaenlosextractoscelulares.Losresultadosse
expresan como media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferenciassignificativasconrespectoalosdelasclulascontrol(p0,05).

75

Resultados

La Figura 21 muestra los resultados obtenidos cuando se determin la actividad


dipeptidilpeptidasaIVtraslostratamientos.Secomprobqueeltratamientoconquercetina100
M disminuye la actividad dipeptidilpeptidasa IV en ambas lneas celulares. Sin embargo, el
tratamiento de los cultivos de clulas HT29 y Caco.2 con las cepas probiticas B. bifidum o L.
gasseri no modific dicha actividad. Tampoco se observaron diferencias significativas en la
actividaddipeptidilpeptidasaIV entrelasclulas tratadasconquercetina ylasclulastratadas
conlacombinacindequercetinayprobiticos,loqueindicaqueenlascondicionesdenuestro
trabajolosprobiticosnoafectanalaaccindelaquercetinasobredichaactividad.

Figura21.LaquercetinadisminuyelaactividaddipeptidilpeptidasaIVenclulasHT29yCaco.2.
Las clulas se cultivaron en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, de 10 7 ufc/mL de los
probiticosB.bifidumoL.gasseri odelamezcladequercetinayprobitico.Tras24horasdeincubacin
selisaronlasclulasysedeterminlaactividadenzimticaenlosextractoscelulares.Losresultadosse
expresan como media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferenciassignificativasconrespectoalosdelasclulascontrol(p0,05).

76

Resultados

Tras analizar el efecto de la quercetina y de los probiticos sobre la actividad sacarasa,


aminopeptidasaNydipeptidilpeptidasaIV,secontinuconelestudiodelosposiblesefectosdel
tratamiento en la expresin de los transportadores presentes en la membrana intestinal. Con
estefinloscultivosdeclulasHT29yCaco.2setrataronconquercetina100M,con107ufc/ml
delascepasprobiticasB.bifidumoL.gasserioconlacombinacindequercetina100Mylos
probiticosdurante24horas.Transcurridaslas24horasdetratamiento,selisaronlasclulasy
se determin la expresin de los transportadores de membrana PEPT1 y SGLT1 en los
extractos celulares. La determinacin se llev a cabo por western blot empleando los
anticuerpos especficos PEPT1 (H235) y SGLT1 (H85). Con el fin de corregir las posibles
diferenciasenlacantidaddeprotenaentremuestras,losresultadosobtenidos,quesemuestran
en las Figuras 22 y 23, se expresan de forma relativa con respecto a la cantidad de Actina
(anticuerpoActin(PA121167)),protenaconstitutivaempleadacomocontroldecarga.

La Figura 22 muestra que el tratamiento con quercetina 100 M disminuye


aproximadamenteun40%laexpresindeltransportadordemembranaPEPT1enambaslneas
celulares. Por otro lado, tambin muestra que los probiticos, aunque no tienen efecto por si
mismossobrelaexpresindePEPT1enningunadelasdoslneascelulares,potencianelefecto
de la quercetina, ya que existen diferencias significativas en la expresin de PEPT1 entre los
cultivostratadossloconquercetina100Mylostratadosconlacombinacindequercetinay
lacepaprobiticaL.gasserienambaslneascelulares.

77

Resultados

A)

B)

Figura 22. Los probiticos B. bifidum y L. gasseri aumentan el efecto de la quercetina sobre la
expresin del transportador PEPT1 en clulas HT29 y Caco.2. La expresin de PEPT1 en clulas
tratadasdurante24horasenausencia(control)opresenciadequercetina100M,de107ufc/mLdelos
probiticosodelamezcladequercetinayprobiticosedeterminmediantewesternblot.Losresultados,
normalizadosconrespectoalosdelaactina,seexpresandeformarelativatomandocomo1losdelas
clulas control. Los resultados se representan como media SEM de 3 experimentos independientes
realizadosportriplicado.*indicadiferenciassignificativas conrespectoalosdelasclulascontrol(p
0,05). # indica diferencias significativas con respecto a los de las clulas tratadas con quercetina (p
0,05).

78

Resultados

LaFigura23muestralosresultadosrespectoalaexpresindeltransportadordemembrana
SGLT1 tras los tratamientos. La Figura muestra que el tratamiento con quercetina 100 M
redujo aproximadamente un 40% la expresin de SGLT1 en las dos lneas celulares. Tambin
pone de manifiesto que los probiticos, aunque no tienen efecto por si mismos sobre la
expresindeSGLT1enningunadelasdoslneascelulares,potencianelefectodelaquercetina,
ya que existen diferencias significativas en la expresin de SGLT1 entre los cultivos tratados
slo con quercetina 100 M y los tratados con la combinacin de quercetina y probiticos en
ambaslneascelulares.Adems,esteefectoesmsacusadoenloscultivosdeclulasCaco.2yen
los tratamientos combinados en los que se emplea L. gasseri, lo que sugiere que depende del
tipocelularylacepaprobiticaempleados.

79

Resultados

A)

B)

Figura 23. Los probiticos B. bifidum y L. gasseri aumentan el efecto de la quercetina sobre la
expresin del transportador SGLT1 en clulas HT29 y Caco.2. La expresin de SGLT1 en clulas
tratadasdurante24horasenausencia(control)opresenciadequercetina100M,de107ufc/mLdelos
probiticosodelamezcladequercetinayprobiticosedeterminmediantewesternblot.Losresultados,
normalizadosconrespectoalosdelaactina,seexpresandeformarelativatomandocomo1losdelas
clulas control. Los resultados se representan como media SEM de 3 experimentos independientes
realizadosportriplicado.*indicadiferenciassignificativas conrespectoalosdelasclulascontrol(p
0,05). # indica diferencias significativas con respecto a los de las clulas tratadas con quercetina (p
0,05).

80

Resultados

2.ANLISISDELAACTIVIDADCITOTXICA

Enlaactualidadseestnllevandoacabonumerososestudioscientficosrelacionadosconla
posible actividad anticancergena de compuestos no nutricionales tambin llamados
fitoqumicos.Estegrupodecompuestos,quepuedenllegaraprevenireldesarrollodelcncer,es
muy amplio e incluye flavonoides como la quercetina. La quercetina es un componente
importantedeladietahumanayaqueestpresenteenalimentosdeorigenvegetal,porloque
hallegadoinclusoadespertarintersdesdeelpuntodevistanutricional.Enlosltimosaos,se
hanatribuidoalaquercetinaefectosbeneficiososfrentealdesarrollodediversasenfermedades
asociadas al estrs oxidativo como el cncer y las enfermedades cardiovasculares y
neurodegenerativas.154 Debido a sus posibles efectos sobre la proliferacin celular, en este
trabajohemosqueridoanalizarelefectocitotxicodelaquercetina,delosprobiticosB.bifidum
oL.gasseriydesuscombinacionesenlaslneascelularesdeadenocarcinomadecolonHT29y
Caco.2. Los anlisis se han llevado a cabo mediante el ensayo colorimtrico del MTT. La
actividad citotxica se determin a 6 concentraciones diferentes de quercetina y a 5
concentraciones diferentes de los probiticos. En el caso de la combinacin de quercetina y
probiticos se emplearon mezclas formadas por 107 ufc/ml de probiticos y cada una de las
diferentes concentraciones de quercetina. Los resultados se obtuvieron a partir de 3
experimentos independientes realizados por cuadruplicado para cada una de las
concentraciones.Losresultadosobtenidosserepresentanencurvasdedosisrespuesta(Fig.24)
apartirdelascualesseobtuvieronporextrapolacinlosparmetroscitotxicos(Tabla4)GI50
(concentracin del compuesto que provoca la inhibicin del 50% de las clulas), TGI
(concentracin del compuesto que provoca la inhibicin total del crecimiento) y LC50
(concentracindelcompuestoquereduceenun50%elnmerodeclulasiniciales).

81

Resultados

Figura24.Laquercetina,losprobiticosB.bifidumoL.gasseriolacombinacindequercetinaylos
probiticostienenactividadcitotxicaenclulasHT29yCaco.2.A)SupervivenciadelasclulasHT29
tras el tratamiento durante 24 horas con las diferentes concentraciones de B. bifidum o L. gasseri B)
SupervivenciadelasclulasCaco.2traseltratamientodurante24horasconlasdiferentesconcentraciones
deB.bifidumoL.gasseri,C)SupervivenciadelasclulasHT29traseltratamientodurante24horasconlas
diferentesconcentracionesdequercetinay107ufc/mLB.bifidumoL.gasseri,D)Supervivenciadelasclulas
Caco.2 tras el tratamiento durante 24 horas con las diferentes concentraciones quercetina y 107 ufc/mL B.
bifidumoL.gasseri. Laactividadcitotxicaseanalizmedianteunensayocolorimtricoinvitrobasadoenla
reduccindelMTT.LosdatossepresentancomolamediaSEMdealmenos3experimentosindependientes
porcuadruplicado.

82

Resultados

Las Figuras 24C y 24D muestran que el tratamiento con quercetina 100 M redujo la
supervivencia celular aproximadamente un 40% con respecto a la de las clulas sin tratar
(clulascontrol)enambaslneascelulares.LaFigura24Bmuestraasuvezqueeltratamiento
con 107 ufc/mL de B. bifidum redujo aproximadamente un 33% la supervivencia celular en
cultivosdeclulasCaco.2,mientrasqueeltratamientocon107ufc/mLdeL.gasserilaredujoun
49%. La Figura 24A muestra que el tratamiento con 107 ufc/mL de B. bifidum no modifica la
supervivenciacelularencultivosdeclulasHT29,mientrasqueeltratamientocon107ufc/mL
L. gasseri slo la reduce ligeramente. Las Figuras 24C y 24D tambin muestran que cuando se
tratanloscultivoscelularesconcombinacionesdedistintasconcentracionesdequercetinay107
ufc/ml de probiticos el efecto de la quercetina sobre la supervivencia celular se potenci en
ambaslneascelulares,conreduccionesdelcrecimientocelularqueenelcasodelacombinacin
dequercetinaylacepaL.gasserisesitanentornoal50%enclulasHT29ysonprcticamente
completasenclulasCaco.2.Especialmenteinteresanteeselresultadoqueseobtuvoenclulas
Caco.2conlacombinacindequercetina100My107ufc/mldeB.bifidum,yaqueenestecaso
seobservinclusounareduccinenelnmeroinicialdeclulas.Parafacilitarlainterpretacin
deesteresultado,serepresentanenlaFigura 25losporcentajesdecrecimientodeclulassin
tratar(control)ytratadasconquercetina100M,con10 7ufc/mldeB.bifidumoL.gasseriocon
lacombinacindequercetina100My107ufc/mldeB.bifidumoL.gasseri.Enlafigurasetoma
comoreferenciaelcrecimientodelasclulascontrol(100%decrecimiento).

83

Resultados

Tabla4.Parmetroscitotxicosdelaquercetinaylosprobiticosenclulasdeadenocarcinoma
de colon. GI50; concentracin del compuesto que inhibe en un 50% el crecimiento de las clulas. TGI;
concentracindelcompuestoqueinhibeporcompletoelcrecimientodelasclulas.LC50;concentracin
delcompuestoquereduceenun50%elnmerodeclulasiniciales.Lasconcentracionesseexpresanen
ufc/mlenelcasodeB.bifidumyL.gasseriycomoconcentracinMenelcasodelaquercetina.

Estosresultados,juntoconlosparmetrosdecitotoxicidadrecogidosenlaTabla4,ponende

manifiestoquelaquercetinareducelaviabilidadcelularenlneascelularesdeadenocarcinoma
de colon y que esta reduccin es mayor cuando la quercetina se aplica junto con una cepa
probitica. Los resultados tambin indican que la sensibilidad al tratamiento depende del tipo
celularydelacepaprobiticaempleada.Engeneral,podemosafirmarquelasclulasCaco.2son
mssensiblesaltratamientoquelasclulasHT29yquelainduccinporlacepaprobiticadel
efecto de la quercetina sobre la viabilidad celular es ms potente en el caso de B. bfidum en
clulasCaco.2yenelcasodeL.gasserienclulasHT29.

84

Resultados

Figura25.LosprobiticosB.bifidumyL.gasseri(107ufc/mL)potencianelefectodelaquercetina
(100 M) sobre el crecimiento celular en cultivos de clulas HT29 y Caco.2. Los resultados se
expresan como la media SEM de 3 experimentos independientes realizados por cuadruplicado. * indica
diferencias significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias
significativasconrespectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

85

Resultados

3.APOPTOSIS

3.1DeterminacindeApoptosis
En todos los organismos multicelulares adultos debe existir un equilibrio entre la
proliferacinymuertedelasclulasqueloformanconelfindemanteneruntamaoconstante
155.Debidoalaimportanciadelamuertecelularprogramadaoapoptosis,enlaactualidadhayun

elevadonmerodeestudiosenlaliteraturacientficaenlosqueseanalizalarelacinentrela
capacidad proliferativa de los tumores y el fenmeno apopttico. En todos ellos se demuestra
queexisteunacorrelacinentreapoptosisyproliferacin,tantoentejidossanoscomoentejidos
tumorales. As, una mayor tasa de proliferacin se ha asociado con un peor pronstico y una
peorrespuestaalostratamientos.Elporcentajebasaldeclulasapoptticasolacapacidadde
inducirlamuertedelas clulastumoralesporla accindediversostratamientostambinhan
demostradotenerunpapelmuyimportanteenelpronsticodeltumoryenlaposiblerespuesta
al tratamiento.156 Por ello se analiz si el efecto de la quercetina y los probiticos sobre la
viabilidadcelulardetectadoenlosensayosdecitotoxicidadestabarelacionadoconlacapacidad
para inducir apoptosis. Con este fin se trataron durante 24 horas cultivos de clulas HT29 y
Caco.2conquercetina100M,con107ufc/mLdeB.bifidumoL.gasserioconlacombinacinde
quercetina y los probiticos y tras los tratamientos se determin el porcentaje de clulas
apoptticasenloscultivos.Lasdeterminacionessellevaronacabomediantecitometradeflujo
porelmtodoTUNEL,empleandoelsistemaApoDirectkit(BectonDickinson).LasFiguras26y
27recogenlosresultadosobtenidos.

ComoseobservaenlasFiguras26y27,laproporcindeclulasapoptticasenloscultivos
tratadosconquercetina100M(12,35%enelcasodelalneacelularHT29y11,77%enelcaso
delalneacelularCaco.2)esmayorqueenloscultivosdeclulasnotratados(6,14%enelcaso
delalneacelularHT29y5,15%enelcasodelalneacelularCaco.2).Losresultadosmuestran
tambinquelosprobiticosporsimismosnomodificaronsignificativamentelaproporcinde
clulas apoptticas en los cultivos de la lnea celular HT29 y que slo el tratamiento con 107
ufc/ml de L. gasseri increment ligeramente el porcentaje de clulas apoptticas en la lnea
celular Caco.2. Por otro lado, se muestra que el efecto de la quercetina se potenci cuando las
clulas se trataron junto a los probiticos (Fig. 26). Este efecto es mayor en la lnea celular
Caco.2,enlaquelleganaalcanzarseporcentajesdeclulasapoptticasdehastaun17,28%en
lasclulastratadasconlacombinacindequercetinaylacepaprobiticaL.gasseriyun30,28%
enlasclulastratadasconlacombinacindequercetinaylacepaprobiticaB.bifidum.

86

Resultados

A)

B)

Figura26.LaquercetinainduceapoptosisenlalneacelularHT29.Lasclulasseincubarondurante
24 horas en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, 107 ufc/mL de los probiticos o la
mezcladeambos.LadeterminacindelaapoptosissellevacaboporelmtodoTUNEL.A)Resultadode
unexperimentorepresentativo;B)Porcentajedeclulasapoptticastraseltratamiento.Losresultadosse
expresan como la media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferencias significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias
significativasconrespectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

87

Resultados

A)

B)

Figura27.LaquercetinainduceapoptosisenlalneacelularCaco.2.Lasclulasseincubarondurante
24 horas en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, 107 ufc/mL de los probiticos o la
mezcladeambos.LadeterminacindelaapoptosissellevacaboporelmtodoTUNEL.A)Resultadode
unexperimentorepresentativo;B)Porcentajedeclulasapoptticastraseltratamiento.Losresultadosse
expresan como la media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferencias significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias
significativasconrespectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

88

Resultados

Estos resultados indican que la quercetina induce muerte celular por apoptosis en cultivos

declulasdeadenocarcinomadecolonyquelosprobiticosB.bifidumyL.gasseripotencianla
capacidaddelaquercetinaparainducirapoptosisenloscultivos.

3.2.Ensayosdeinhibicindeapoptosis
Laformamscomndegenerarapoptosisenlamayoradelasclulaseslavamitocondrial.
Esteprocesosecaracterizaporunaumentoenlapermeabilidaddelamembranamitocondrial.
La prdida de la integridad mitocondrial, uno de los eventos ms caractersticos que ocurren
durantelaapoptosis,permitelasalidadelcitocromocdelamitocondriaysuincorporacinenel
apoptosoma,loqueconducealaactivacindecaspasasylamuertedelaclula.157Paraanalizar
si el proceso de muerte celular por apoptosis inducido por la quercetina y los probiticos en
clulas de adenocarcinoma de colon era dependiente de la activacin de caspasas tratamos
durante24horasconquercetina100M,con107ufc/mldeprobiticosoconlacombinacinde
quercetina y probitico clulas HT29 y Caco.2 preincubadas durante 1 hora con el inhibidor
general de caspasas ZVADFMK. Transcurridas las 24 horas de tratamiento se determin el
porcentaje de clulas apoptticas en los cultivos por citometra de flujo empleando el sistema
ApoDirectkit.LosvaloresqueseobtuvieronserepresentanenlaFigura28.

Como se observa en la Figura 28, el inhibidor de caspasas ZVADFMK suprime, al menos


parcialmente, la apoptosis inducida por la quercetina, los probiticos o la combinacin de la
quercetinaylosprobiticosenambaslneascelulares.Esteresultadoconfirmaladependencia,
almenosenparte,delaactivacindecaspasasenelprocesodemuertecelularinducidoporla
quercetinaypotenciadoporlosprobiticosenlneascelularesdeadenocarcinomadecolon.

89

Resultados

Figura28.ElinhibidordecaspasasZVADFMKrevierteelefectodelaquercetinaenclulasHT.29y
Caco.2. Se determin el porcentaje de clulas apoptticas en cultivos de clulas HT29 o Caco.2 pre
incubadas en presencia o ausencia ZVADFMK 20 M durante 1 hora y tratadas durante 24 horas con
quercetina 100 M, 107 ufc/mL de los probiticos o con la combinacin de quercetina y probitico. Los
resultadoscorrespondenalamediaSDde3experimentosindependientesrealizadosporduplicado.*
indica diferencias significativas con respectoa losde las clulascontrol (p 0,05). ** indicadiferencias
significativasconrespectoalosdelasclulastratadassloconquercetina(p0,05).#indicadiferencias
significativasconrespectoalasclulastratadasconinhibidor.

90

Resultados

3.3ActividadCaspasa3

YaqueelinhibidordecaspasasZVADFMKinhibielprocesodemuertecelularinducidopor
laquercetinaylosprobiticosencultivoscelularesdelaslneasHT29yCaco.2,seprocedia
estudiar si estas sustancias inducan la actividad caspasa 3 en estas clulas. Con este fin, se
tratarondurante24horascultivoscelularesdelaslneasHT29yCaco.2conquercetina100M,
con 107 ufc/ml de los probiticos o con la combinacin de ambos. Tras las 24 horas de
tratamientoselisaronlasclulasysedeterminlaactividadcaspasa3enlosextractoscelulares.
Los anlisis se realizaron por fluorimetra empleando el kit ApoAlert Caspase Assay Plates, que
contieneeltetrapptidoDEVD,sustratoespecficodelacaspasa3,unidoaunfluorocromo.Los
resultadosobtenidossemuestranenlaFigura29.Seobservquetantolaquercetinacomolos
probiticos y las combinaciones de quercetina y probiticos aumentaron ligeramente la
actividad caspasa 3 en los extractos celulares. Sin embargo este aumento no result
estadsticamentesignificativo, loquepodradeberse,almenosenparte a lavariabilidadentre
experimentosyelreducidonmerodelosmismos.

91

Resultados

Figura29.Eltratamientoconlaquercetinanomodificalaactividaddelacaspasa3enlaslneas
celularesHT29yCaco.2.Lasclulasseincubarondurante24horasenausencia(control)opresenciade
quercetina100M,107ufc/mLdelosprobiticosolamezcladeambos.Ladeterminacindelaactividad
de la caspasa 3 se realiz con el kit ApoAlert Caspase Assay Plates. Los resultados se expresan como la
mediaSDde3experimentosindependientesrealizadosporduplicado.*indicadiferenciassignificativas
conrespectoalosdelasclulascontrol(p0,05).

4.ANLISISDELCICLOCELULAR

El ciclo celular es un fenmeno universal, presente en el crecimiento y desarrollo de todos


losseresvivosyeselprocesoporelcuallasclulassereproducen.Susetapasmsimportantes
sonelprocesodereplicacindelmaterialhereditariodurantelafasedesntesis,llamadafaseS,
y el reparto de los cromosomas replicados durante la mitosis. Existen mecanismos de control
pararegularestosprocesosyrepararlosposibleserroresdurantesuejecucin.Losmecanismos
moleculares se encuentran muy conservados, existiendo procesos similares desde organismos
unicelulareshastalosvertebradossuperioresyelhombre.Laexactitudconlaquesellevaacabo
esteprocesohagarantizadolasupervivenciadelosorganismos,mientrasquelaprdidadeesta

92

Resultados

exactitudaumentalainestabilidadgenmica,unfactorimportanteeneldesarrollodelcncer.114
Estos hechos nos indujeron a estudiar si la quercetina, los probiticos o sus combinaciones
tenan efectos sobre la distribucin de las clulas entre las distintas fases del ciclo celular en
cultivos de lneas de adenocarcinoma de colon. Con este fin se incubaron las clulas HT29 y
Caco.2conquercetina100M,con107ufc/mLdeB.bifidumoL.gasserioconlacombinacinde
ambosdurante 24 horasy acontinuacinsedeterminelcontenido en DNAdelas clulas.La
determinacinsellevacaboporcitometradeflujoconiodurodepropidiomedianteelempleo
del Kit ApoDirect. De este modo se puede determinar la cantidad de DNA en cada clula
individual y calcular el porcentaje de clulas que se encuentran en cada una de las diferentes
fasesdelciclocelular(SubG1,G0/G1,SyG2/M).Losresultadosobtenidossemuestranenlas
Figuras30y31.Paraelclculodelosresultadosserealizaron3experimentosindependientes
porduplicado.

Comocabeesperardecompuestosconcapacidadparainducirapoptosis,lasFiguras30y31
muestran que el tratamiento durante 24 horas con quercetina 100 M incrementa de modo
significativoelporcentajedeclulassubdiploidesenambaslneascelulares.As,lapoblacinde
clulas SubG1 aumenta desde el 4,97 % en las clulas control hasta el 8,79% en las clulas
tratadasenloscultivosdelalneaHT29(Fig.30),ydesdeel5,18%enlasclulascontrolhasta
el7,95%enlasclulastratadasenloscultivosdelalneaCaco.2(Fig.31).Aesteaumentoenel
porcentaje de clulas SubG1 le acompaa, en ambas lneas celulares, una disminucin del
porcentaje de clulas en fase G0/G1 y un aumento del porcentaje de clulas en fase S y fase
G2/M.As,elporcentajedeclulasenfaseG0/G1enloscultivosdelalneaHT29pasadesdeel
67% en las clulas control hasta el 52,4% en las clulas tratadas, y en los cultivos de la lnea
Caco.2 desde el 64% en las clulas control hasta el 57% en las clulas tratadas. A su vez, el
porcentajedeclulasenfaseSpasadel15,5%enlasclulascontrolhastael22,4%enlasclulas
tratadasenloscultivosdelalneaHT29ydel18,5%enlasclulascontrolhastael23,1%enlas
clulastratadasenloscultivosdelalneaCaco.2yelporcentajedeclulasenfaseG2/Mpasadel
13,2%enlasclulascontrolhastael17,3%enlasclulastratadasenloscultivosdelalneaHT
29.Esteresultadoindicaqueeltratamientoconquercetinaprovocunbloqueodelciclocelular
enfaseG2/M.

Por otra parte, las figuras tambin muestran que los tratamientos con los probiticos B.
bifidumoL.gasserinomodificaronelporcentajedeclulassubdiploidesenningunadelasdos
lneas celulares, y slo provocaron un pequeo aumento en el porcentaje de clulas en fase
G2/M que se correlaciona con un descenso en el porcentaje de clulas en fase G0/G1. Este
resultado, confirma que el tratamiento de las clulas con los probiticos durante 24 horas no

93

Resultados

provoca la muerte de las clulas, aunque sugiere la existencia de un bloqueo del ciclo celular
coherenteconsuefectoinhibidorsobrelaproliferacincelular(Fig.24).

Por ltimo, las Figuras 30 y 31 tambin muestran que el tratamiento combinado con la
quercetinaylosprobiticosprovoclosmismosefectos,aunquedeformamsmanifiesta,queel
tratamiento con quercetina. De hecho, existen diferencias estadsticamente significativas entre
lasclulastratadasconlacombinacindequercetinayprobiticosylasclulastratadasslocon
quercetina.As,enloscultivosdelalneaCaco.2lapoblacindeclulasSubG1aumentadesdeel
7,95% en las clulas tratadas con quercetina hasta el 18,4% en las clulas tratadas con la
combinacin de quercetina y B.bifidum, aunque no se encontraron diferencias significativas
entre estas poblaciones de clulas en los tratamientos con la combinacin de quercetina y L.
gasseri (Fig. 30). A este aumento en el porcentaje de clulas SubG1 le acompa, una
disminucindelporcentajedeclulasenfaseG0/G1yenfaseSyunaumentoenfaseG2/M.As,
el porcentaje de clulas en fase G0/G1 disminuy desde el 57% en las clulas tratadas con
quercetina hasta el 47,5% en las clulas tratadas con la combinacin de quercetina y la cepa
B.bifidumyhastael52%conlacepa L.gasseri,mientrasqueelporcentajedeclulasenfaseS
disminuy del 23,1% en las clulas tratadas con quercetina hasta el 18,4% en las clulas
tratadas con la combinacin de quercetina y la cepa B.bifidum y no encontramos diferencias
significativasconlacombinacindequercetinaylacepaL.gasseri.Porltimo,elporcentajede
clulasenfaseG2/Mpasadel12,4%enlasclulastratadasconquercetinahastael16%tantoen
las clulas tratadas con la combinacin de quercetina y B.bifidum como en las tratadas con la
combinacin de quercetina y L. gasseri. Respecto a la lnea celular HT29, en la Figura 31 se
observa que, como en el caso de la lnea Caco.2, los probiticos aumentaron el efecto de la
quercetina, aunque por hacerlo de forma ms moderada las diferencias no llegan a ser
estadsticamentesignificativas.

94

Resultados

A)

B)

Figura 30. La quercetina modifica la distribucin de las clulas HT29en las diferentes fases del
ciclocelular.Lasclulasseincubarondurante24horasenausencia(control)opresenciadequercetina
100 M, 107 ufc/mL de los probiticos o la mezcla de ambos. A) Resultado de un experimento
representativo,B)Porcentajedeclulasencadafasedelciclocelulartraseltratamiento.Losresultados
se expresan como la media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferencias significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias
significativasconrespectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

95

Resultados

A)

B)

Figura 31. La quercetinamodifica la distribucinde las celularCaco.2en las diferentes fases del
ciclocelular.Lasclulasseincubarondurante24horasenausencia(control)opresenciadequercetina
100 M, 107 ufc/mL de los probiticos o la mezcla de ambos. A) Resultado de un experimento
representativo,B)Porcentajedeclulasencadafasedelciclocelulartraseltratamiento.Losresultadosse
expresan como la media SD de 3 experimentos independientes realizados por duplicado. * indica
diferencias significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias
significativasconrespectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

96

Resultados

5.EXPRESINDEPROTENASIMPLICADASENLAREGULACINDELA
APOPTOSISYCICLOCELULAR

Para analizar con mayor detalle el mecanismo molecular por el que la quercetina y los

probiticosbloqueanelciclocelulareinducenlamuertedelasclulasseanalizelefectodelos
tratamientos sobre la expresin de diversas protenas habitualmente relacionadas con estos
procesos, como AMPK, p53, p21, Bcl2 y Bax. Con este fin se compararon los patrones de
expresin de estas protenas en cultivos de clulas de adenocarcinoma de colon sin tratar o
tratadasdurante24horasconquercetina100M,con107ufc/mldeB.bifidumoL.gasseriocon
una mezcla de ambos. La expresin de las protenas se determin por western blot con
anticuerposespecficos.Losresultadosqueseobtuvieronsedetallanacontinuacin.

5.1LaquercetinaylascepasprobiticasmodificanlaexpresindeBcl2yBax

Las protenas de la familia Bcl2 juegan un papel muy importante en la regulacin de la


apoptosis.EntreellasseencuentranprotenasinductorasdelaapoptosiscomoBaxyprotenas
inhibidorasdelaapoptosiscomoBcl2.158Conelfindeanalizarsilostratamientosmodificanla
expresindeBcl2yBaxseincubaronlasclulasHT29yCaco.2conquercetina100M,con
107 ufc/mLdelascepasprobiticasB.bifidumoL.gasserioconlacombinacindequercetinay
probiticos durante 24 horas. Transcurridas 24 horas se lisaron las clulas y se analiz la
expresindeBcl2yBaxenlosextractoscelulares.Lacuantificacinsellevacaboporwestern
blot de forma relativa por comparacin con la de la protena constitutiva actina. En las
determinaciones se emplearon los anticuerpos Bcl2 (N19), especfico de Bcl2, Bax (21),
especficodeBaxyactina(PA121167),especficodelaactina.Losresultadosobtenidosse
muestranenlasFiguras32y33.

EnlaFigura32seobservaqueeltratamientoconquercetinaredujoenun70%laexpresin
deBcl2enclulasHT29yenun50%enclulasCaco.2.Seobservatambinquelosprobiticos
noafectaronalaexpresindeBcl2enningunadelasdoslneascelulares,exceptoenelcasode
lacepaL.gasseriyHT29enlqueseprodujounadisminucindel30%enlaexpresindeBcl
2. Por otra parte el tratamiento combinado con quercetina y los probiticos disminuy la
expresindeBcl2enmayorproporcinqueeltratamientoconquercetinasolo.Esteefectoes
msacusadoenelcasodelacombinacindequercetinayL.gasseri,quereducelaexpresinde
Bcl2enun80%enclulasHT29yCaco.2.Sinembargo,eltratamientoconlacombinacinde

97

Resultados

quercetinayB.bifidumenclulasHT29noprodujodiferenciassignificativasenlaexpresinde
Bcl2 con respecto a la detectada en las clulas tratadas slo con quercetina. Estos resultados
ponendemanifiestoquelosprobiticospotencianelefectodelaquercetinasobrelaexpresin
deBcl2enlneascelularesdeadenocarcinomadecolon,aunqueesteefectoesdependientede
lacepaprobiticaylalneacelular.

98

Resultados

A)

HT29

B)

Caco.2

Figura32.LaquercetinadisminuyelaexpresindeBcl.2enlaslneascelularesHT29yCaco.2.Se
determin mediante westernblot la expresin de Bcl2 en clulas HT29 (A) o Caco.2 (B) incubadas
durante 24 horas en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, de 107 ufc/mL de los
probiticos o de la mezcla de ambos. Los resultados, normalizados con respecto a los de la actina, se
expresandeformarelativatomandocomo1losdelasclulascontrol.Losresultadosserepresentancomo
media SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. * indica diferencias
significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias significativas con
respectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

99

Resultados

LosresultadosdeltratamientoconquercetinarepresentadosenlaFigura33muestranque
la expresin de Bax aument en un 70% en clulas HT29 y en un 97% en clulas Caco.2.
TambinmuestraqueeltratamientoconlosprobiticosaumentlaexpresindeBaxenlalnea
celularCaco.2,enlaqueseprodujounaumentodel40%enelcasodeltratamientoconlacepaB.
bifidumydel70%enelcasodeltratamientoconL.gasseri.Sinembargo,enlalneacelularHT
29esteaumentosloseobservconlacepa L.gasseri(46%deaumento).Lafiguratambin
muestraqueeltratamientocombinadoconquercetinayB.bifidumaumentlaexpresindeBax
enmayormedidaqueeltratamientoconquercetinasolaenambaslneascelulares(increment
en3veceslaexpresindeBaxenCaco.2yHT29).Estosresultadosindicanquelosprobiticos
potencian el efecto de la quercetina sobre la expresin de Bax en lneas celulares de
adenocarcinoma de colon, si bien este efecto es dependiente de la lnea celular y la cepa
probitica,queesmsefectivasisetratadeB.bifidumquesisetratadeL.gasseri.

100

Resultados

A)

HT29

B)

Caco.2

Figura 33. La quercetina aumenta la expresin de Bax en las lneas celulares HT29 y Caco.2. Se
determin mediante westernblot la expresin de Bax en clulas HT29 (A) o Caco.2 (B) incubadas
durante 24 horas en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, de 107 ufc/mL de los
probiticos o de la mezcla de ambos. Los resultados, normalizados con respecto a los de la actina, se
expresandeformarelativatomandocomo1losdelasclulascontrol.Losresultadosserepresentancomo
media SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. * indica diferencias
significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias significativas con
respectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

101

Resultados

5.2 La quercetina y las cepas probiticas aumentan la fosforilacin de la


AMPK

LaprotenaquinasaAMPKformapartedelasubfamiliadeprotenasquinasasactivadaspor
AMP/SNF1. Esta protenaquinasa, que se activa por fosforilacin, interviene en procesos
diversos entre los que se incluyen la activacin de rutas catablicas, la inhibicin de rutas
anablicas,laparadadelciclocelularylainduccindeapoptosis.Portodoestosehapropuesto
quelaAMPKactacomomarcadormetablicoeinhibidordelacarcinognesis.159

Conel findeanalizarsilostratamientosdecultivoscelulares deadenocarcinomadecolon


conquercetina,probiticososuscombinacionesmodificanlacantidaddeAMPKfosforiladaen
loscultivos,seincubaronlasclulasHT29yCaco.2conquercetina100M,con107 ufc/mLde
las cepas probiticas B. bifidum o L. gasseri o con la combinacin de quercetina y probiticos
durante 24 horas. Tras 24 horas, se lisaron las clulas y se cuantific la cantidad de AMPK
fosforiladaenlosextractoscelulares.Lacuantificacinsellevacaboporwesternblotdeforma
relativaporcomparacinconladelaprotenaconstitutivaactina.Enlasdeterminacionesse
emplearon los anticuerpos pAMPK1/2 (Thr 172), especfico de la forma fosforilada de la
AMPK en la treonina 172, y actina (PA121167), especfico de la actina. Los resultados
obtenidossemuestranenlaFigura34.

Como puede observarse en la Figura 34, el tratamiento con quercetina aumenta 3 veces la
cantidad de AMPK fosforilada en clulas HT29 y 2 veces en clulas Caco.2 (Fig. 34). Los
resultados tambin ponen de manifiesto que los probiticos no modificaron la cantidad de
AMPK fosforilada en la lnea celular Caco.2. Sin embargo, en la lnea celular HT29 indujeron
unaumentoenlafosforilacindeAMPK,del40%enelcasodeB.bifidumydel70%enldeL.
gasseri. Del mismo modo los tratamientos combinados con quercetina y los probiticos
incrementaron los niveles de la pAMPK en comparacin con el tratamiento con quercetina
slo.As,encultivosdelalneacelularHT29lafosforilacindeAMPKaumenthasta4veces
enelcasodeltratamientoconquercetinaylacepa B.bifidumymsde4vecesconlacepa L.
gasseri, mientras que en cultivos de la lnea celular Caco.2 aument 3 veces con ambos
tratamientos combinados de quercetina y probitico. Estos resultados indican que los
probiticos potencian el efecto de la quercetina sobre la fosforilacin del AMPK en lneas
celularesdeadenocarcinomadecolon.

102

Resultados

A)

HT29

B)

Caco.2

Figura34.LaquercetinaaumentalaexpresindeAMPKenlaslneascelularesHT29yCaco.2.Se
determin mediante westernblot la expresin de AMPK en clulas HT29 A) o Caco.2 B) incubadas
durante 24 horas en ausencia (control) o presencia de quercetina 100 M, de 107 ufc/mL de los
probiticos o de la mezcla de ambos. Los resultados, normalizados con respecto a los de la actina, se
expresandeformarelativatomandocomo1losdelasclulascontrol.Losresultadosserepresentancomo
media SEM de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. * indica diferencias
significativas con respecto a los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias significativas con
respectoalosdelasclulastratadasconquercetina(p0,05).

103

Resultados

5.3Laquercetinaylascepasprobiticasaumentanlaexpresindep53yp21

Laprotenap21esuninhibidordequinasasdependientesdeciclinas,yporlotantofunciona
comounreguladordelciclocelular,ejerciendounpapelprimordialenelcontroldelatransicin
G1/S. La expresin de esta protena est estrechamente regulada por la protena supresora de
tumores p53, por lo que el control del ciclo celular en G1 es dependiente de p53 y las clulas
detienenelciclocelularcomorespuestaaunestmuloestresante.160LaslneascelularesHT29y
Caco.2 de adenocarcinoma de colon poseen una forma mutada del gen p53, por lo que su
actividadenestasclulasesreducida.143

Con el fin de analizar si los tratamientos de cultivos de clulas HT29 o Caco.2 con
quercetina, probiticos o sus combinaciones modifican la expresin de p53 y p21 en estas
clulas,seincubaronclulasHT29yCaco.2conquercetina100M,con107ufc/mLdelascepas
probiticasB.bifidumoL.gasserioconlacombinacindequercetinayprobiticosdurante24
horas.Transcurridaslas24horasselisaronlasclulasyseanalizlaexpresindep53yp21en
losextractoscelulares.Lacuantificacinsellevacaboporwesternblotdeformarelativapor
comparacinconladelaprotenaconstitutivaactina.Enlasdeterminacionesseemplearonlos
anticuerpos P53 (FL393), especfico de p53, P21 (C19), especfico de p21 y actina (PA1
21167),especficodelaactina.LosresultadosobtenidossemuestranenlasFiguras35y36.

Los resultados representados en la Figura 35 muestran que el tratamiento con quercetina


aumenten2veceslaexpresindep53enclulasHT29yCaco.2.Tambinmuestranquelos
probiticosnoafectaronalaexpresindep53enningunadelasdoslneascelulares,mientras
quelostratamientoscombinadosconquercetinaylosprobiticosaumentaronlaexpresinde
p53 ms que el tratamiento con quercetina. Este efecto es ms acusado en el caso de la
combinacin de quercetina y L. gasseri, que aument la expresin de p53 en 3 veces tanto en
clulas HT29 como Caco.2. Sin embargo, con la combinacin de quercetina y B. bifidum este
aumento slo se detect en clulas HT29, mientras que en el caso de clulas Caco.2 no se
observaron diferencias significativas en la expresin de p53 con respecto a los de las clulas
tratadassloconquercetina.Estosresultadosindicanquelosprobiticospotencianelefectode
laquercetinasobrelaexpresindep53enlneascelularesdeadenocarcinomadecolondemodo
dependientedelacepaprobiticaylalneacelularutilizada.

104

Resultados

A)

HT29

B)

Caco.2

Figura 35. La quercetina aumenta la expresin de p53 en las lneas celulares HT29 y Caco.2. Se
determinmediantewesternblotlaexpresindep53enclulasHT29A)oCaco.2B)incubadasdurante
24horasenausencia(control)opresenciadequercetina100M,de107ufc/mLdelosprobiticosodela
mezcla de ambos. Los resultados, normalizados con respecto a los de la actina, se expresan de forma
relativatomandocomo1losdelasclulascontrol.LosresultadosserepresentancomomediaSEMde3
experimentos independientes realizadospor triplicado. * indica diferencias significativasconrespectoa
los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias significativas con respecto a los de las clulas
tratadasconquercetina(p0,05).

105

Resultados

Los resultados expresados en la Figura 36 muestran que el tratamiento con quercetina


aument2veceslaexpresindep21enclulasHT29yCaco.2(Fig.36).Tambinmuestraque
los probiticos afectaron a la expresin de p21 en la lnea HT29, en la que se produjo un
aumentodeun40%enelcasodelacepaB.bifidumydeun60%enelcasodelacepaL.gasseri,
aunque no lo hicieron en la lnea celular Caco.2. Los resultados tambin muestran que el
tratamientocombinadoconquercetinaylosprobiticosaument laexpresindep21msque
eltratamientoconquercetinasola.Esteefectoesmsacusadoenelcasodeltratamientoconla
combinacindequercetinay L.gasseriqueaumentlaexpresindep214veces.Sinembargo
con la combinacin de quercetina y B. bifidum este efecto si se detecta en las clulas HT29,
mientras que en el caso de las clulas Caco.2 no se observaron diferencias significativas en la
expresin de p21 con respecto a las clulas tratadas slo con quercetina. Estos resultados
revelan que los probiticos potencian el efecto de la quercetina sobre la expresin de p21 en
lneascelularesdeadenocarcinomadecolonaunqueseadependientedelacepaprobiticayla
lneacelularutilizada.

106

Resultados

A)

HT29

B)

Caco.2

Figura 36. La quercetina aumenta la expresin de p21 en las lneas celulares HT29 y Caco.2. Se
determinmediantewesternblotlaexpresindep21enclulasHT29A)oCaco.2B)incubadasdurante
24horasenausencia(control)opresenciadequercetina100M,de107ufc/mLdelosprobiticosodela
mezcla de ambos. Los resultados, normalizados con respecto a los de la actina, se expresan de forma
relativatomandocomo1losdelasclulascontrol.LosresultadosserepresentancomomediaSEMde3
experimentos independientes realizadospor triplicado. * indica diferencias significativasconrespectoa
los de las clulas control (p 0,05). # indica diferencias significativas con respecto a los de las clulas
tratadasconquercetina(p0,05).

107

DISCUSIN

Discusin

Desdehacevariasdcadassehanrealizadonumerososestudioscientficosrelacionadoscon
la posible actividad de los compuestos no nutricionales que forman parte de nuestra dieta, ya
que se ha sugerido que estos compuestos pueden llegar a prevenir el desarrollo de
enfermedades como el cncer. Este grupo de molculas, conocidas como fitoqumicos, es muy
heterogneo e incluye vitaminas, polifenoles, cidos fenlicos, compuestos sulfurados y
fitoalexinas.161,162 Se encuentran fundamentalmente en frutas y verduras. Debido a su
abundanciaenladieta,laquercetinaesunodelosfitoqumicosquemsintershandespertado.
Medianteunadietaricaenquercetinasepuedellegaraalcanzarunaconcentracinenplasmade
quercetinaydesusmetabolitos secundariosdehasta8mol/L, ysehadescritoqueunadieta
ricaenquercetinaestasociadaconunmenorriesgodedesarrollarcncer.163

Entrelostemasdeinvestigacinde mayoractualidadseencuentraelanlisisdelaposible
sinergia entre probiticos y fitoqumicos como la fibra, los oligosacridos o los flavonoides. La
fermentacin de estos compuestos por cepas probiticas, principalmente de los gneros
Bifidobacterium y Lactobacillus, origina nuevas molculas bioactivas con caractersticas
antitumorales. Entre estos metabolitos secundarios obtenidos por fermentacin destacan los
cidosbutrico,propinicoyactico,compuestosqueactanenlareduccindelainflamacin
gastrointestinal,164 la modulacin de la actividad enzimtica intestinal,165 la reduccin de
adenomasenlamucosacolnica,166lamodulacindelaproliferacinydiferenciacincelular 98
ylamejoradeltrnsitointestinal.95Todasestasevidenciassugierenquelaquercetinaescapaz
deactuaradiferentesniveleseneldesarrollodelcnceryquelosprobiticospodranmodificar
sus acciones al llevar a cabo procesos de fermentacin que originaran nuevas molculas
bioactivasconposibleactividadanticancergena.

1. SINRGIA EN LA ACCIN DE LA QUERCETINA Y B. BIFIDUM O L. GASSERI


SOBREELTRANSPORTEDENUTRIENTESALINTERIORDELACLULA

Laglucosaeselprincipalmonosacridoqueproporcionaenergaalasclulasdelorganismo.
Esto hace que el transporte de glucosa al interior de la clula constituya un proceso esencial
paraelmetabolismoenergticoy,enconsecuencia,paralosprocesosquemantienenlavida.En
elserhumanolosmonoscaridosdeladietaseabsorbenprincipalmenteenelintestinodelgado.
En su absorcin intervienen transportadores de glucosa dependientes de sodio de la familia
SGLT y tambin protenas de la familia de facilitadores de glucosa GLUT. Ya que las clulas

111

Discusin

tumoralesrequierenunmayoraportedelosnutrientes,principalmenteglucosayaminocidos,
necesarios para el desarrollo y la vascularizacin del tejido tumoral, y por tanto para su
proliferacin y diferenciacin, el metabolismo de la glucosa resulta de gran importancia en el
desarrollodelcncercolorrectal.Porellonopuedeextraarquesehayasugeridoque,juntocon
elreceptordelfactordecrecimientoepitelial(EGFR),eltransportadordeglucosaSGLT1,que
sesobreexpresadurantelacarcinognesis,podraserunbuenmarcadorparaeldiagnsticodel
cncercolorrectal.150,167EstaalteracinenlaexpresindeSGLT1podraserdebidaalamayor
demandadeglucosaporpartede lasclulastumoralespara producirenerga(Fig38),resulta
interesantequeenestetrabajo hayamosdetectadoqueeltratamientodecultivosdelaslneas
celularesdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2conquercetina100Mdurante24horas
(Fig23)disminuyesuexpresin,indicandoquelaquercetinareducelasnecesidadesenergticas
delasclulasysugiriendo,portanto,quedisminuyesucapacidadproliferativa.Tambinresulta
interesanteque,adiferenciadelaquercetina,laexposicindelasclulasalascepasprobiticas
B.bifidumoL.gasserinomodificaralosnivelesdeexpresindeSGLT1enloscultivos,peroque
el tratamiento de las clulas HT29 y Caco.2 con la combinacin de quercetina 100 M y 107
ufc/mLdeB.bifidumoL.gasseridisminuyeraelniveldeexpresindeSGLT1enloscultivosms
queeltratamientoconlaquercetinasola.Estosresultadosindicanquelascepasprobiticasno
afectanporsimismasalaexpresindeSGLT1peropotencianelefectodelaquercetinasobre
lamisma.Encualquiercasohayqueresaltarqueesteefectofuemsacusadoenloscultivosde
clulasCaco.2yenlostratamientoscombinadosenqueseempleL.gasseri,loquesugiereque
lasinergiaentreelflavonoideyelprobiticodependedelalneacelularylacepaprobitica.

Sehadescritoquelosreceptoresdelfactordecrecimientoepitelial(EGFR)sesobreexpresan
en el cncer de colon y que su sobreexpresin se correlaciona con estados avanzados de la
enfermedadeindiferenciaciondelasclulastumorales. 168Algunosestudioshanmostradoque
enclulasdeadenocarcinomadecolonHT29estosreceptoressonmoduladosporflavonoides
como la quercetina, por lo que se ha llegado a sugerir que las acciones de la quercetina en el
cncercolorrectalpodranestarrelacionadasconsucapacidad parasuprimirlaactivacinpor
fosforilacindeEGFR.169Adems,lainhibicindelafosforilacindeEGFRenclulasHT29se
asociaconregulacindelaactividaddeMAPKscomoERK1yERK2 .169Porelloesposiblequela
regulacin del transporte de glucosa se produzca mediante interacciones protenaprotena
entreeltransportadorSGLT1yelreceptorEGFR.Estainteraccin,queesindependientedela
actividadtirosinaquinasadeEGFR,conduciraalaestabilizacindeSGLT1eincrementarala
actividaddetransportedeglucosaatravsdelamembrana.Portanto,puestoquelainteraccin
del dominio extracelular del EGFR con el transportador de glucosa SGLT1 conduce a la
sobreexpresin de SGLT1 en procesos como el cncer de colon en los que la demanda de
112

Discusin

glucosaporpartedelasclulasesmayor,lasupresinporquercetinadelaactivacindeEGFR
es una posible explicacin para la disminucin de la expresin de SGLT1 inducida por la
quercetina.

Tambinsehasugeridoquelasaccionesdelaquercetinaenclulasdeadenocarcinomade
colon podran deberse a sus efectos sobre la AMPK, cuya fosforilacin, y por tanto activacin,
induce.170 En este sentido, es importante tener en cuenta que se ha descrito que en clulas
Caco.2 la expresin de esta protena se correlaciona de modo inverso con la actividad
transportadora de glucosa170,171 y, tambin, que en este trabajo hemos confirmado que la
quercetinainducelafosforilacindelasubunidaddelaAMPK(Fig34)yquelosprobiticosB.
bifidumyL.gasseriactandemodosinrgicoconlaquercetinaenloqueaestafosforilacinse
refiere. Nuestros resultados sugieren por tanto que la activacin de la va de sealizacin
mediadaporlaAMPKeslacausadelarepresindelaexpresindeSGLT1porquercetina.

Las modificaciones en el transporte de monosacridos como la glucosa suelen estar


asociadasfrecuentementeconalteracionesenlaactividaddeenzimasintestinalesconactividad
disacaridasa,comolasacarasa,lamaltasaolalactasa.Laactividaddeestasenzimas,encargadas
dellevaracabolahidrlisisdelosdisacridos,estmodificadaduranteeldesarrollodelcncer,
por lo que pueden ser utilizadas como marcadores de diferenciacin celular. De hecho, se ha
sugeridoqueexisteunarelacinentreelgradodediferenciacindelasclulasyelincremento
enlaactividaddeciertasdisacaridasaspresentesenlamembranadelbordeencepillo,queenel
cncer, debido al grado de indiferenciacin de las clulas, es muy baja.152 Por este motivo
convieneresaltarqueenelpresentetrabajohemosdetectadoqueeltratamientodecultivosde
laslneascelularesdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2conquercetina100Mdurante
24horasincrementalaactividadsacarasaenloscultivos.Estosugierequeeltratamientoafecta
algradodediferenciacindelasclulas.Enelmismosentido,otrosautoreshanencontradoque
unadietasuplementadaenun5%conungalactooligosacridoincrementalaactividadsacarasa
encultivosdelalneacelularCaco.2deadenocarcinomadecolon13ytambinsehademostrado
que esta misma dieta incrementa la actividad sacarasa en ratones BALB/c con respecto a
ratonesquenohansidoalimentadosconelgalactooligosacrido.13

Porotrolado,otrostrabajostambinhandescritoquedosisaltasdeinulinaencombinacin
con varias cepas probiticas como L. acidophilus, L. bulgaricus, B. bifidum, B. longum o S.
thermophilusproducencambiosenlamicrobiotaintestinalderatas,dandolugaraunaumento
delapoblacindebacteriasbeneficiosasenelintestinoquesecorrelacionaconunaumentoen
laactividadenzimticasacarasa,isomaltasa,lipasaylactasatraseltratamiento.97Sinembargo
113

Discusin

losresultadosobtenidosenestetrabajomuestranqueeltratamientodeloscultivosdeclulas
HT29yCaco.2conB.bifidumoL.gasserinomodificalaactividadsacarasaenloscultivos.Ms
an,eltratamientodeloscultivosconlacombinacindequercetina100My107 ufc/mLdeB.
bifidumoL.gasseritampocoafectaalaaccindelaquercetinasobreestaactividadenzimtica.
Estos resultados indican por tanto que estas dos cepas probiticas ni tienen efecto sobre la
actividad sacarasa en lneas celulares de adenocarcinoma de colon, ni afectan a la accin de la
quercetinasobreestaactividad.Endefinitiva,nuestrosresultadossugierenqueelaumentoen
laactividadsacarasayladisminucinenlaexpresindeSGLT1inducidosporlaquercetinaen
los cultivos de clulas HT29 y Caco.2, y potenciados por los probiticos en el caso del
transportador, podran ser debidos a que tras el tratamiento las clulas presentan un mayor
gradodediferenciacinyunamenorcapacidaddeproliferacin.152

Juntoconeltransportedemonosacridos,otrofactorimportanteeneldesarrollodelcncer
colorrectaleseltransportedepptidosatravsdelepiteliointestinal.Aunqueexistendiferentes
rutasatravsdelascualeslospptidospuedenserabsorbidos,eltamaodelospptidosysu
hidrofobicidad son factores fundamentales que influyen en el tipo de transporte seleccionado:
pasivo,atravsdelasunionescelularesoactivo.172Losoligopptidosproducidosporaccinde
las enzimas gstricas y pancreticas durante el proceso de digestin de protenas son
hidrolizados adicionalmente por endopeptidasas de la membrana intestinal, lo que da lugar a
dipptidos y tripptidos que pueden ser captados de forma activa mediante el transportador
PEPT1.173EsteprocesodeabsorcinactivamediadoporPEPT1seproduceconconsumodeun
gradiente electroqumico transmembrana y constituye la forma principal de captacin de
pptidos.174,7DurantelosltimosaossehadescritoquelaexpresindePEPT1,yportantoel
transporte de oligopptidos a travs del epitelio intestinal, est incrementada en patologas
comoelcncerolasenfermedadesinflamatoriasintestinales.Sehasugeridoqueesteaumento
podra ser debido bien a la inflamacin del intestino provocada por la enfermedad, bien al
incremento en la demanda de pptidos por parte de las clulas, derivado de su alta tasa de
proliferacin.10 Por eso resulta interesante que en este trabajo hayamos detectado que el
tratamientodecultivosdelaslneascelularesdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2con
quercetina100Mdurante24horas(Fig22)disminuyelaexpresindePEPT1enloscultivos,
loquenuevamentesugierequelaquercetinadisminuyelacapacidadproliferativadelasclulas.

Nuestros resultados tambin muestran que, a diferencia del tratamiento con quercetina, el
tratamiento de las clulas HT29 y Caco.2 con las cepas probiticas B. bifidum o L. gasseri no
modificalosnivelesdeexpresindePEPT1enloscultivos.Sinembargo,eltratamientoconla
combinacin de quercetina 100 M y 107 ufc/mL de L. gasseri, pero no con la combinacin de
114

Discusin

quercetina 100 M y 107 ufc/mL de B. bifidum, los disminuye ms que el tratamiento con la
quercetinasola.Estosresultadosindicanquelascepasprobiticasnoafectanporsimismasala
expresin de PEPT1, pero potencian el efecto de la quercetina sobre la misma. En cualquier
casohayqueresaltarqueesteefectoesmsacusadoenloscultivosdeclulasCaco.2yconla
combinacindequercetinayL.gasseri,loqueconfirmaquelasinergiaentreelflavonoideyel
probitico depende de la lnea celular y de la cepa probitica empleadas. Tampoco podemos
olvidar que las acciones de la quercetina y los probiticos en clulas de adenocarcinoma de
colonpodrandeberseasusefectossobrelaAMPK,cuyafosforilacinyactivacininducen(Fig
34), ya que la activacin de la AMPK inhibe la sntesis de protenas porque disminuye la
actividaddemTOR.131Enelmismosentido,diversostrabajosconteoflavinashanmostradoque
laactivacindelaAMPKporfosforilacindesusubunidadinhibelaexpresindePEPT1,y
por tanto la captacin de pptidos, en cultivos de clulas Caco.2.175 Este mismo resultado
tambin se ha observado tras el tratamiento de clulas Caco.2 con AICAR, un inductor de la
activacindeAMPK.176

Loscambioseneltransportedepptidospodranestarasociadasconmodificacionesenla
actividad de enzimas intestinales con actividad peptidasa, como la aminopeptidasa N y la
dipeptidilpeptidasaIV.177 Poresoresultainteresantequedemodorecientesehayaobservado
que el tratamiento con un extracto de uva es capaz de disminuir la actividad de la
dipeptidilpeptidasaIVenanimalessanos,enanimalesalimentadosconunadietaricaengrasasy
enclulasCaco.2,yquediversosestudiostantoinvivocomoinvitrohayanpuestodemanifiesto
el efecto de la curcumina sobre la actividad de la aminopeptidasa N. A pesar de ello en la
actualidadnoexistenevidenciasclarasdelosmecanismosdeaccindelosflavonoidessobrela
actividad enzimtica de la aminopeptidasa N y dipeptidilpeptidasa IV.153 Por eso resulta
prometedor que en este trabajo hayamos observado que el tratamiento de cultivos de clulas
HT29 y Caco.2 durante 24 horas con quercetina 100 M disminuye estas actividades en los
cultivosyaque,comohemoscomentadoanteriormenteconrespectoalaactividadsacarasa,este
resultado indica que tras el tratamiento las clulas presentan una menor capacidad de
proliferacin. Nuestros resultados tambin muestran que el tratamiento de los cultivos de
clulasHT29yCaco.2conB.bifidumoL.gasserinomodificalasactividadesaminopeptidasaNy
dipeptidilpeptidasaIVenloscultivosyqueeltratamientodeloscultivosconlacombinacinde
quercetina 100 M y 107 ufc/mL de B. bifidum o L. gasseri tampoco afecta a la accin de la
quercetinasobreestasactividadesenzimticas.Estosresultadosindicanportantoqueestasdos
cepasprobiticasnitienenefectosobrelasactividadesaminopeptidasaNydipeptidilpeptidasa
IVenlneascelularesdeadenocarcinomadecolon,niafectanalaaccindelaquercetinasobre
estasactividades.
115

Discusin

2. MODULACINDELAPROLIFERACINCELULAR

La proliferacin descontrolada de las clulas tumorales es uno de los aspectos a tener en


cuentaenelcncerdecolon,yaqueactivalasntesisdecidosnucleicosyaumentalademanda
energtica de las clulas. Debido a ello durante los ltimos aos se han llevado a cabo
numerososestudiosenlosquesehaanalizado,ycomprobado,laactividadantiproliferativadela
quercetina frente a lneas celulares tumorales, entre las que se incluyen diversas lneas de
glioma,178decncerdepulmn,55depncreas,56demelanoma,54dehematoma179ydecolon.140
Por eso no debe extraar que en este trabajo hayamos observado que a concentraciones
comprendidasentre0,01y100Mlaquercetinasehayacomportadocomounagentecitosttico
que,aunquenodisminuyeelnmeroinicialdeclulas,reducelaproliferacincelularencultivos
declulasdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2.Lainduccindeapoptosis(Fig.26y27)
yelbloqueodelciclocelular(Fig.30y31)queseproducencomoconsecuenciadelaactivacin
dep53mediadaporlaquercetina(Fig.35)sonunaposibleexplicacinparaestaobservacin.

Elpapeldelosprobiticosenlaproliferacincelular,conresultadosquevaranenfuncin
de la cepa probitica y el tipo celular, tambin ha comenzado a analizarse durante los ltimos
aos.180 En este trabajo mostramos que, como en el caso de la quercetina, el tratamiento de
cultivosdeclulasHT29oCaco.2con107 ufc/mLdeB.bifidumoL.gasserireduceligeramente,
aunque con pequeas diferencias entre ambas lneas celulares y cepas probiticas, el
crecimiento celular en los cultivos (Fig. 24). Ms interesante que este dato, que indica que
ambas cepas probiticas poseen una pequea capacidad citosttica, resulta el hecho de que la
administracin combinada de quercetina y probitico llegue a suprimir por completo el
crecimientocelular,einclusoareducirelnmeroinicialdeclulasenloscultivos.Estasinergia
entrelasactividadescitostticasdequercetinayprobiticos,queesmsacusadaenloscultivos
declulasCaco.2yenlostratamientoscon B.Bifidum,seacompaaconunmayoraumentoen
losnivelesdeapoptosis(Fig.27)yenlosnivelesdeexpresindep53enloscultivos(Fig.35)
que el observado en los tratamientos con el flavonoide solo. La actividad citotxica de las
combinaciones de quercetina y B.Bifidum o L. gasseri, y la induccin de muerte celular con
activacindep53queprovocanestascombinaciones,sugierequepodranutilizarsenoslocon
fines preventivos, sino quiz tambin con fines teraputicos, lo que obligar a hacer estudios
adicionalessobresuefectividadymecanismosdeaccintantoinvitrocomoinvivo.

116

Discusin

3.INDUCCINDEAPOPTOSISYCICLOCELULAR

Elefectodelaquercetinasobrelosprocesosdeproliferacin,supervivenciaymuertecelular
dependedelaconcentracinutilizada:concentracioneselevadasdequercetinatienenunefecto
proapottico,55,59mientrasqueaconcentracionesreducidaslaquercetinaactivamecanismosde
supervivencia.57,58Confrecuencialasmodificacionesenlaproliferacincelularseproducencon
cambiosenelciclocelular,loqueenelcasodelaquercetinaestbiendocumentado.Asseha
descritoquelaquercetinabloquea,enfuncindeltipocelular,elcicloenfaseG0/G1,SoG2/M.60,
61, 63 De acuerdo con resultados descritos previamente por otros autores140 en este trabajo

hemos observado que el tratamiento de clulas de adenocarcinoma de colon HT29 con


quercetina100Mdurante24horasinducelaexpresindelosgenesTP53yCDKN1A(Fig.35y
36).Cabeaadirqueenestetrabajotambinhemosobservadoelmismoresultadoencultivos
declulasCaco.2(Fig.35y36),porloqueposiblementesteseaunefectogeneralizableaotras
lneascelularesdeadenocarcinoma decolon.Elgensupresordetumores TP53estlocalizado
enelbrazocortodelcromosoma17ycodificaunafosfoprotenanuclearde53Kdqueledasu
nombre.Laprotenap53esunfactorclaveenelbalanceentrelasupervivenciaymuertedelas
clulas en respuesta al dao en el DNA,124 ya que regula las transiciones G0/S y G2/M.181 El
bloqueo del ciclo celular en estos puntos de control depende de la capacidad de p53 para
inducir,entreotras,laexpresindelgenCDKN1A,182cuyoproducto,laprotenap21CIP1,reprime
a su vez la transcripcin de otras protenas necesarias para la progresin del ciclo del ciclo
celular,comoCDK1olaciclinaB1.181Juntoconestosdatos,tampocopodemosolvidarqueseha
descritoquelaprdidadelafuncindep53seacompaadela prdida,almenosparcial,dela
capacidad para bloquear la transicin G1/S, mientras que su capacidad para bloquear la
transicinG2/Mdependedesucapacidadparainducirlatranscripcindep21CIP1.183Poresono
debeextraarque,juntoconlosaumentosenlaexpresindep53yp21CIP1,enestetrabajose
hayaobservadoqueeltratamientodecultivosdeclulasHT29yCaco.2conquercetina100M
bloquea el ciclo en fase G2/M (Fig. 30 y 31), ya que estos dos tipos celulares expresan formas
mutadas de p53 con capacidad funcional reducida.143,144 Este resultado difiere, al menos en
parte, del descrito por Kim y colaboradores en clulas HT29, 140 ya que tras 48 horas de
tratamiento de las clulas con quercetina 100 M estos autores observaron, junto con los
aumentos en la expresin de p53 y p21CIP1, un bloqueo del ciclo en fase G1/S. El diferente
tiempo de tratamiento y las distintas formas de analizar la viabilidad de las clulas y la
distribucin del ciclo celular en los cultivos, mtodo TUNEL en nuestro caso y marcaje con
AnexinaVyyodurodepropidioenelsuyo,sondosposiblesexplicacionesparaestadiferencia.

117

Discusin

De forma coherente con lo observado en el caso de la quercetina, nuestros resultados


tambinmuestranqueeltratamientodeloscultivosdeclulas HT29yCaco.2con107ufc/mL
deB.bifidumoL.gasseriinducelaexpresindep21CIP1(Fig.36),bloqueaelciclocelularenfase
G2/M (Fig. 30 y 31) y reduce la proliferacin celular (Fig. 25). Adems, puesto que en este
trabajo no hemos detectado modificaciones en los niveles de expresin de p53 en los cultivos
tras los tratamientos con B. bifidum o L. gasseri (Fig. 35), nuestros datos sugieren que la
actividadcitostticadelosprobiticospodraderivardesucapacidadparainducirlaexpresin
dep21CIP1 deformadirecta.Todavamsinteresantequeestedatoresultaqueeltratamientode
los cultivos con las combinaciones de quercetina y probiticos aumente la expresin de p53 y
p21CIP1ms que eltratamientoconlaquercetinasola(Fig. 35y36), yaque estasinergia enla
accindequercetinayprobiticossobrelaexpresindep53yp21CIP1conduceaunbloqueodel
ciclo celular en fase G2/M an ms manifiesto (Fig. 30 y 31). Este bloqueo en fase G2/M se
acompaa,especialmenteenclulasCaco.2yeneltratamientoconlacombinacindequercetina
yB.Bifidum,conunaelevacinenelporcentajedeclulassubdiploides,quesecorrelacionacon
suactividadcitotxicayconfirmalacapacidaddeestacombinacinparainducirlamuertedelas
clulas.

Debidoasuimportancia,laapoptosisesunodelosprocesoscelularesmsestudiados.155El
programa apopttico puede iniciarse bien por la va extrnseca, o de receptores de muerte,156
bienporlavaintrnseca.184Lavaextrnsecaactivadirectamentealacaspasa8. 111Laprdida
de la integridad de la membrana mitocondrial y la subsiguiente liberacin del citocromo c y
formacindelapotosomaconactivacindelacaspasa9soneventosclaveeneliniciodelava
intrnseca.110 La caspasas iniciadoras 8 y 9 activan a su vez a caspasas efectoras, como las
caspasas 3, 6 y 7, dando lugar a la apoptosis.110 La familia de protenas Bcl2 regula la
permeabilidad de la membrana mitocondrial. Esta familia est formada por protenas
proapoptticas,comoBax,Bak,BadyBid,yantiapoptticas,comoBclXL,Mcl1oelpropioBcl
2.158 Poresoresultainteresantequeenestetrabajohayamosobservadoqueeltratamientode
cultivosdeclulasdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2conquercetina100Mdurante
24horasaumentalaexpresindeBax(Fig.33),reduceladeBcl2(Fig.32)einduceapoptosis
en los cultivos (Fig. 26 y 27). Ya que en la relacin Bax/Bcl2 facilita la apertura del poro
mitocondrial,yportantolaliberacindeprotenasmitocondrialesconactivacindelacaspasa9
ymuertecelular,esteresultadosugierequelainduccindeapoptosismediadaporlaquercetina
enloscultivosseproduceporlavamitocondrial.Quesehayadescritoquelaquercetinainduce
apoptosis con activacin de la va mitocondrial en clulas BGC823 de cncer gstrico163 y en
clulasHeLadecncercervical,53queotrosflavonoides,comolacurcumina,induzcanapoptosis

118

Discusin

con activacin de protenas apoptticas como Bax e inhibicin de protenas antiapoptticas


comoBclXL,185oquelaadministracincombinadadevariospolifenolescomolaquercetinayel
cido elgico induzca apoptosis y modifique la distribucin del ciclo celular en clulas
sanguneas de pacientes con leucemia61 apoya esta idea. La induccin por quercetina de la
expresindep53(Fig.35)esotrodatoadicionalquecorroboraestaidea,yaquep53contribuye
alapermeabilizacindeladelamembranaexternadelamitocondriatantodemododirecto,al
formarcomplejosconBcl2yBclXLqueinhibensuactividadprotectora,186comoindirecto,al
inducirlatranscripcindeBax.187Porltimo,apesardequeenlascondicionesdeestetrabajo
nohayamospodidodetectarunincrementoestadsticamentesignificativoenlaactividaddela
caspasa 3, el hecho de que el pretratamiento de los cultivos con zVADfmk, un inhibidor
universal de caspasas, suprima el proceso de muerte celular inducido por la quercetina en los
cultivos(Fig.28)tambincorroboraestahiptesis,yaquelascaspasasjueganunpapelcrucial
en la ejecucin del programa de muerte celular iniciado con la prdida de la integridad de la
membranamitocondrial.

Losresultadosobtenidoseneste trabajotambin muestranque eltratamientodecultivos


de clulas HT29 o Caco.2 con las combinaciones de quercetina 100 M y 107 ufc/mL de B.
bifidumoL.gasseridurante24horasdisminuyelaexpresineBcl2(Fig.32),aumentaladeBax
(Fig.33)yp53(Fig.35)eincrementalaproporcindeclulasapoptticasenloscultivosms
queeltratamientoconlaquercetinasola(Fig.26y27).Ademsesteresultadoseproducesin
que los probiticos afecten por si mismos a la expresin de p53 (Fig. 35) o Bcl2 (Fig. 32), ni
modifiquen la proporcin de clulas apoptticas en los cultivos (Fig. 26 y 27) a pesar de que
incrementan la expresin de Bax (Fig. 33). En resumen, podemos decir que la quercetina en
combinacin con B. bifidum o L. gasseri induce apoptosis en las lneas celulares de
adenocarcinoma de colon HT29 y Caco.2 y que este efecto implica la activacin de molculas
clave de la ruta apopttica mitocondrial, as como la modulacin a lo largo del tiempo de
diferentessealesrelacionadasconlasvasdeproliferacinyviabilidadcelular.

119

Discusin

4.ACTIVACINDEAMPK

El crecimiento y el ciclo celular, estn estrechamente relacionados con el metabolismo de


protenas.LafuncindelaAMPKenelcontroldelmetabolismodeprotenasyciclocelularest
relacionada, por un lado con la regulacin de la sntesis y degradacin de protenas mediante
regulacin de la va TSC2/TOR y por otro, con la regulacin del supresor tumoral p53 y los
inhibidores de ciclinas dependientes de quinasas p21 y p27. 159,134 Cuando la AMPK se activa,
acta sobre p53 y la fosforila en la Ser15 incrementando su estabilidad. Ello conlleva un
aumento de los niveles celulares de p21CIP1 e induce una parada en el ciclo y/o la muerte
celular.188,189Laprotenap53juegaunpapelimportanteenelmantenimientodelaintegridad
delgenomadebidoaquelaprdidapormutacindelafuncindep53permitelasupervivencia
de elementos celulares genticamente daados que conducen a una transformacin celular
tumoral.Asimismolainhibicindelciclocelulartambinseharelacionadoconlainhibicinde
mTOR mediada por AMPK.190 Por eso es interesante que en este trabajo hayamos detectado
que el tratamiento de cultivos de clulas HT29 o Caco.2 con quercetina 100 M induce la
activacin de la AMPK por fosforilacin de su subunidad (Fig. 34), y tambin que esta
activacin se acompae con una disminucin en el grado de proliferacin de los cultivos, una
disminucinenlaexpresindelostransportadoresdeazcaresSGLT1ypptidosPEPT1yun
aumentoenlaexpresindep53(Fig.35)ydesusgenesdianap21CIP1(Fig36)yBax(Fig.33),ya
queesteresultadosugierequetodaslasaccionesdelaquercetinasobrelaproliferacin,elciclo
celularylaapoptosisseproducencomoconsecuenciadesuefectosobrelaAMPKyapunta,por
tanto, la posibilidad de que la AMPK sea una nueva diana terapetica en el tratamiento del
cncerdecolon.EsteresultadoestodavamsinteresantesiconsideramosqueB.bifidumyL.
gasseriinducentambinlafosforilacindelaAMPK,almenosenlalneacelularHT29,yque
estafosforilacinseproducedeformamuchomsacentuadacuandosetratanloscultivoscon
las combinaciones de quercetina y probitico, ya que este resultado sugiere que las
combinaciones de quercetina y probiticos podran utilizarse con fines preventivos y/o
teraputicosfrentealdesarrollodecncercolorrectal.

En definitiva, nuestros resultados muestran que los probiticos B. bifidum y L. gasseri


potencian las acciones de la quercetina mediante la activacin de la va de sealizacin de la
AMPKporfosforilacin desusubunidad.Esta activacinprovocacambiostanto metablicos
como celulares que se resumen grficamente en la figura 37. Los cambios metablicos
relacionados con la disminucin de la proliferacin celular, y por tanto de la necesidades
energticas y de aminocidos, se manifiestan con un descenso en la expresin de los
transportadores de azucares SGLT1 y pptidos PEPT1. Los cambios celulares incluyen el

120

Discusin

bloqueo en el ciclo celular y la induccin de apoptosis y se manifiestan con aumentos en la


expresindep53,p21CIP1ycambiosenlarelacinBax/Bcl2.Portodoello,yaunquehayque
prestarespecialatencinalaconcentracindequercetinayaltipodecepaprobiticaempleada,
y a pesar de que se requieren numerosas investigaciones que contribuyan a aclarar el
mecanismodeaccindelosprobiticos,podemosafirmarquelaquercetinaensinergiaconuna
cepaprebiticacomoB.bifidumoL.gasseripodraconsiderarseunpotencialagentepreventivo
yteraputicoeneldesarrollodelcncercolorrectal.

Figura37.EfectodelosprobiticosB.bifudumyL.gasserisobrelasaccionesdelaquercetinaencultivos
delneascelularesHT29yCaco.2deadenocarcinomadecolon.

121

CONCLUSIONES

Conclusiones

DelosresultadosobtenidosenelpresentetrabajoEfectodelosprobiticosBifidobacterium
bifidumyLactobacillusgasserisobrelasaccionesdelaquercetinaencultivosdelneascelulares
HT29yCaco.2decncerdecolonseobtienenlassiguientesconclusiones:

Actividadenzimticaytransporteatravsdelamembranaintestinal
1. LaquercetinaaumentalaactividadsacarasaydisminuyelaactividadaminopeptidasaN
ydipeptildipetidasaIVencultivosdeclulashumanasdeadenocarcinomadecolonHT
29yCaco.2.B.bifidumyL.gasserinomodificandichasactividadesytampocoafectanala
accindelaquercetinasobrelasmismas.

2. La quercetina disminuye la expresin del transportador de azucares SGLT1 y del


transportadordepptidosPEPT1encultivosdeclulashumanasdeadenocarcinomade
colonHT29yCaco.2.B.bifidumyL.gasseri,aunquenomodificanporsimismosdichas
expresiones,potencianelefectorepresordelaquercetinasobrelasmismas.

Proliferacincelular
3. La quercetina, B. bifidum o L. gasseri disminuyen la proliferacin en cultivos de clulas
humanas de adenocarcinoma de colon HT29 y Caco.2. Esta disminucin es mayor
cuandolaquercetinaylascepasprobiticasseadministrandeformaconjunta,aunquela
sensibilidaddeloscultivosaltratamientovaraconeltipocelularylacepaprobitica
empleada.

Apoptosis
4. B.bifidumyL.gasseripotencianlacapacidaddelaquercetinaparainducirapoptosisde
modo dependiente de la activacin de caspasas en cultivos de clulas humanas de
adenocarcinoma de colon HT29 y Caco.2. La induccin de apoptosis mediada por la
quercetinaseproduceporlavamitocondrialyaqueeltratamientodeloscultivoscon
estecompuestodisminuyelaexpresindeBcl2yaumentaladeBax.Adems, B.bifidum
yL.gasseripotencianelefectodelaquercetinasobrelaexpresindeBcl2yBax.

Ciclocelular
5. El tratamiento de cultivos de clulas humanas de adenocarcinoma de colon HT29 y
Caco.2 con quercetina, B. bifidum o L. gasseri bloquea el ciclo celular en fase G2/M. El
tratamiento de los cultivos con la combinacin de quercetina y probitico provoca el
mismoefecto,aunquedeformamsmanifiestaquelostratamientosporseparado.

125

Conclusiones

6. Elbloqueodelciclocelularinducidoporlaquercetinaencultivosdeclulashumanasde
adenocarcinoma de colon se produce con aumentos en la expresin de p53 y p21. B.
bifidumyL.gasserinoafectanalaexpresindep53enestoscultivos,aunqueinducenla
expresindep21ypotencianelefectodelaquercetinasobrelaexpresindep53yp21.

AMPK
7. Laquercetina,B.bifidumoL.gasseriinducenlafosforilacindelaAMPKencultivosde
clulashumanasdeadenocarcinomadecolonHT29yCaco.2,aunqueenelcasodelos
probiticos este efecto depende del tipo celular. A pesar de ello, B. bifidum y L. gasseri
incrementanelefectodelaquercetinasobrelafosforilacindelaAMPKenambostipos
celulares.

CONCLUSINFINAL

LosresultadosobtenidosenestetrabajomuestranquelascepasprobiticasB.bifidumyL.
gasseriaumentanlacapacidaddelaquercetinaparainducirlafosforilacindelasubunidadde
laAMPKenclulasdeadenocarcinadecolon.PuestoquelaAMPKesunsensormetablicocuya
activacin por fosforilacin reduce la capacidad proliferativa de las clulas ya que bloquea el
ciclo celular, induce apoptosis e inhibe la sntesis de protenas y la gluclisis aerbica, estos
resultados sugieren que las combinaciones de quercetina y B. bifidum o L. gasseri podran
utilizarse con fines preventivos y/o teraputicos frente al desarrollo de cncer colorrectal. A
pesar de ello es preciso recalcar que nuestros resultados tambin indican que los efectos
observados son ms o menos acusados en funcin del tipo celular y de la cepa probitica
empleados, lo que pone de manifiesto la necesidad de seguir analizando las acciones de la
quercetinaencombinacinconstasuotrascepasprobiticas.

126

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