AO DE LA PROMOCIN DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y

COMPROMISO CLIMATICO
UNIVERSIDAD JOSE CARLOS MARIATEGUI
FACULDAD DE INGENIERAS
CARRERA: ING. AMBIENTAL

PROYECTO DE INVESTIGACIN
CUANTIFICACIONDE DE PROTEINAS Y EL USO DEL

ESPECTROFOTOMETRO
PRESENTADO POR:
Layme Choque Marco Antonio
IV CICLO
MOQUEGUA- PERU

2015
1

INDICE
TITULOPAG 3
INTRODUCCIONPAG4
DEDICATORIA.....PAG7
CUANTIFICACION DE PROT....PAG8
METODO DE BIURET...PAG10
METODO DE BRADFORD...PAG12
METODO DE LOWRY..PAG 14
USO DEL ESPECTROFOTOMETROPAG16
BIBLIOGRAFIA..PAG20

TITULO:
CUANTIFICACION DE PROTEINAS Y EL
USO DEL ESPECTOFOTOMETRO

INTRODUCCION
Las protenas son materiales que se desempean el mayor
nmero de las funciones de las clulas de todos los seres
vivos. Forman parte de su estructura bsica de los tejidos y
desempean funciones metablicas y reguladoras tambin son
seres vivos que definen la identidad de cada ser vivo, ya que
son la base de la estructura del cdigo gentico ADN y de
los sistemas de reconocimiento de organismos extraos en
el sistemainmunolgico.
Las protenas son biomolculas formadas por cadenas lineales
de aminocidos. El nombre protena proviene de la palabra
griega ("proteios"), que significa "primario" o del dios Proteo,
por la cantidad de formas que pueden tomar.
Por sus propiedades fsico-qumicas, las protenas se pueden
clasificar en protenas simples (holoproteidos), que por
hidrlisis dan solo aminocidos o sus derivados; protenas
conjugadas
aminocidos

(heteroproteidos),
acompaados

de

que

por

hidrlisis

sustancias

diversas,

dan
y

protenas derivadas, sustancias formadas por desnaturalizacin

y desdoblamiento de las anteriores. Las protenas son
indispensables para la vida, sobre todo por su funcin plstica
(constituyen

el

80%

del

protoplasma

deshidratado

de

toda clula), pero tambin por sus funciones biorreguladora

(forma parte de las enzimas) y de defensa (los anticuerpos son

protenas).
Las protenas desempean un papel fundamental para la vida y
son las biomolculas ms verstiles y ms diversas. Son
imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan
una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que
destacan:

Estructural. Esta es la funcin ms importante de una

protena (Ej: colgeno),

Inmunolgica (anticuerpos),

Enzimtica (Ej: sacarasa y pepsina),

Contrctil (actina y miosina).

Homeosttica: colaboran en el mantenimiento del pH (ya

que actan como un tampn qumico),

Transduccin de seales (Ej: rodopsina)

Protectora o defensiva (Ej: trombina y fibringeno)

Las protenas estn formadas por aminocidos los cuales a su

vez estn formados por enlaces peptdicos para formar
esfingocinas.
Las protenas de todos los seres vivos estn determinadas
mayoritariamente por su gentica (con excepcin de algunos
pptidos antimicrobianos de sntesis no ribosomal), es decir,
la informacin gentica

determina

en

gran

medida

protenas tiene una clula, un tejido y un organismo.

qu

DEDICATORIA
A Dios que me ha dado la vida y me otorgo la
necesaria sabidura para poder concluir con eficiencia
y xito.
A mis Padres por estar ah cuando ms los necesite;
en especial a mi madre por su ayuda y constante
cooperacin.
A mis compaeros por apoyarme y aconsejarme.

CUANTIFICACIN DE PROTENAS

La determinacin de protenas que se realizar en el TP se har por dos

mtodos: el de Lowry.

Mtodo de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el

mismo est basado en el cambio de color del colorante Coomassie
brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de
protenas. Este compuesto interacciona con aminocidos bsicos
(especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las
protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante
desde 465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad
del Azul Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con
colores diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando

el colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia

de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).

Figura 1:Estructura qumica del colorante Coomassie brilliant blue

Fuente: (Bergt et al, 2008)

Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo

La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos

basicos y aromticos.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin
lo cual es imprescindible para aumentar la sensibilidad en la
medicin de protenas.
La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el
complejo permanece estable durante un tiempo relativamente

largo, una hora. Haciendo de este un proceso muy rpido, y que no

requiere un tiempo crtico para el ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible)
y es adaptable a la automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto
sodio como potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras
sustancias que interfieren en el ensayo son los agentes
fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la utilizacin de
buffers). Los nicos componentes encontrados que dan una
excesiva

interferencia

en

el

color

del

ensayo,

son

altas

concentraciones de detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.

Mtodo de Lowry: (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin

cuantitativa de las protenas.
Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces
peptdicos de las protenas y se reduce a Cu +. El Cu+ as como los grupos
R de Tirosina, Triptofano y Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin.
Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se
reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reaccin ocurre en
medio cido.
Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo:
cidos fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los
reductores de Cu (por ej.: mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) sern
interferentes

de

la

reaccin.

Las

protenas

producirn

distintas

intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido de Tyr

y Trp.

10

Figura02: mtodo de Lowry (1951)

Fuente:

Cambell (2006)

CUANTIFICACIN DE PROTENAS, MTODO DE BIURET.

Las protenas ocupan un lugar de mxima importancia entre las molculas

constituyentes de los seres vivos (biomolculas). Prcticamente todos los
procesos biolgicos dependen de la presencia o la actividad de este tipo
de molculas (Berg et al, 2008).

Determinar la concentracin de protenas en una muestra biolgica es

una tcnica de rutina bsica cuando se aborda un esquema de

11

purificacin de una protena concreta, cuando se quiere conocer la

actividad especfica de una preparacin enzimtica, para el diagnstico de
enfermedades, as como para muchos otros propsitos. Existen diferentes
mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en
el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que
tienen las protenas de unir ciertos colorantes (Segal, 2005).

La reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la

formacin de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que
poseen ms de un enlace peptidico, como las proteinas (Cambell et al,
2006):

Figura3:Reaccin de Biuret.
Fuente: Segal(2005)

La curva de patrn es un mtodo de qumica analtica empleado para

medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin
con una serie de elementos de concentracin conocida. Se basa en la

12

existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible

(por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la
variable a determinar (la concentracin). Para ello, se efectan diluciones
de unas muestras de contenido conocido y se produce su lectura y el
consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione
ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y,
mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se
obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la
muestra puede cuantificarse y, empleando la curva patrn, se puede
interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin
(Harris, 2003)

USO DEL ESPECTROFOTOMETRO

Un espectrofotmetro es un dispositivo utilizado para medir la luz a una
longitud de onda determinada. Est compuesto por dos partes: un
espectrmetro y un fotmetro. El espectrmetro proporciona luz a una
longitud de onda especfica. El fotmetro mide la intensidad de la luz.
Mediante el clculo de la cantidad de luz que una solucin es capaz de
absorber y la aplicacin de la ley de Beer, el espectrofotmetro puede
determinar la concentracin de una solucin con color.

Partes del espectrofotometro:

1.

Chasis

2.

Porta cubeta

3.

Selector de filtro

4.

Selector de modo

5.

.Ajuste grueso
13

6.

Selector de longitud de onda

7.

Indicador de longitud de onda

8.

Pantalla

Fuente de luz: ilumina la muestra, generalmente son lmparas de

tungsteno o de xenn.
Monocromador: asla las radiaciones de longitud de onda deseada. Se
usa para obtener luz monocromtica.
Fotodetectores: percibe la seal de mltiples longitudes de onda (hasta
16) simultneamente.
Cuidados:
a)Coloque el instrumento en un lugar en donde no est sujeto a
vibraciones, calor excesivo, humedad o luz directa.
b)Proteja el instrumento del polvo. Nunca toque las superficies pticas
tales como lentes y filtros. Siga las instrucciones que da el fabricante para
la limpieza de tales componentes.
c)Permita

que

el

instrumento

se

caliente

antes

de

hacer

algn procedimiento.
d)Se debe hacer un chequeo peridico(cada semana) de la calibracin de
la longitud de onda, cuando se sospeche que ha variado, con el Tubo de
Didimium.
e)Verifique el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y
cuando vare la longitud de onda.
f)Asegrese de que las cubetas estn limpias y libres de ralladuras y
huellas digitales. Esto debe hacerse cada vez que va a usarse.

14

Espectrofotmetro de Flinn
1.
Enchufa y enciende el espectrofotmetro. Haz funcionar elequipo de cinco
a diez minutos para permitir que se caliente.
2.
Busca la perilla de longitud de onda que se encuentra al lado del
compartimento de la muestra y grala para establecer la longitud de onda.

Gira la rueda de filtros para seleccionar el filtro correspondiente. Utiliza el

violeta para longitudes de onda entre 300 y 375 nm, el azul para
longitudes de onda entre 375 y 520 nm, el amarillo para longitudes de
onda entre 520 y 740 nm, y el rojo para longitudes de onda de 740 a ms
de 900 nm.
3.
Pulsa el botn de modo que se encuentra al frente del espectrofotmetro
para seleccionar el modo que muestra simultneamente porcentajes de
transmitancia y absorbancia.
4.
Abre el compartimento de la muestra para asegurarte de que est vaco y
luego cirralo. Gira el dial que se encuentra al frente a la izquierda para
establecer el porcentaje de transmitancia en cero por ciento.

15

5.
Colcate los guantes y limpia una cubeta con una toallita de laboratorio
para asegurar que est limpia y reducir el riesgo de resultados errneos.
Llena tres cuartas partes de la cubeta con el solvente, colcala en el
compartimento de la muestra y cierra la puerta.
6.
Gira el dial frontal derecho hasta que se lea 100 por ciento T.
7.
Quita la cubeta con el solvente, sustityela por una cubeta con la muestra
y cierra el compartimento.
8.
Mira el medidor para determinar la lectura y antala en tus registros.
Espectrofotmetro 20/20D
1.
Enchufa y enciende el espectrofotmetro. Deja que se caliente durante 15
minutos. Esto es necesario para que el equipo funcione correctamente.
2.
Ajusta a la longitud de onda deseada con la perilla que se encuentra al
lado del compartimento de la muestra.

16

Revisa el compartimento de la muestra para asegurarte de que est vaco

y cerrado. Ajusta la perilla de control de cero girndola hasta que la
lectura sea cero, esta se encuentra ubicada al frente a la izquierda del
espectrofotmetro.
3.
Colcate los guantes y limpia una cubeta testigo con una toallita de
laboratorio. Insrtala en el compartimento de la muestra y cierra la puerta.
4.
Ajusta la perilla de control de luz que est ubicada al frente a la derecha
del espectrofotmetro girndola hasta que la lectura sea 100. Retira la
cubeta testigo e inserta una cubeta con la muestra. Anota el valor que se
lee en el medidor.
Espectrofotmetro Educator
1.
Enchufa y enciende el espectrofotmetro. Deja que se caliente durante 15
minutos.

Pulsa el selector de porcentaje T/A para seleccionar el modo de

porcentaje de transmitancia o porcentaje de absorbancia. Localiza el dial
de longitud de onda que se encuentra al lado del compartimento de la
muestra y colcalo a la longitud de onda deseada.
2.

17

Colcate los guantes y limpia una cubeta con una toallita de laboratorio
para limpiarla y eliminar las posibles huellas dactilares. Inserta en el
compartimento de muestra la cubeta limpia y llena con solvente y cierra la
puerta.
3.
Ajusta el dial que se encuentra al frente a la derecha al 100 por ciento, si
se encuentra en el modo porcentaje de transmitancia, o al 0 por ciento, si
est en modo Absorbancia.
4.
Sustituye la cubeta con solvente por una con la muestra. Anota el valor
que se muestra en el espectrofotmetro.
Spectronic 401
1.
Comprueba el compartimento de la muestra para asegurarte de que est
vaco y que las puertas de acceso de los compartimentos como la de los
tubos de ensayo no estn abiertas. Pulsa el botn de encendido que est
ubicado en la parte posterior del espectrofotmetro para encenderlo.
Espera 10 minutos para permitir que el equipo se caliente.
2.
Digita la longitud de onda deseada en el teclado y pulsa la tecla "ir a".

Colcate

los

guantes

limpia

la

cubeta

con

solucin

testigo

cuidadosamente con una toallita de laboratorio para eliminar cualquier

18

residuo o huellas dactilares. Inserta la cubeta con solucin testigo en el

compartimento de la muestra, alinea la cara lisa de la cubeta para que
quede frente a la parte frontal del equipo.
3.
Localiza el botn de "cero automtico" en el teclado del espectrofotmetro
y presinalo.
4.

Reemplaza la cubeta de solucin testigo por una cubeta de la

muestra que se ha limpiado con una toallita de laboratorio. Anota la
absorbancia que se lee en la pantalla.

Figura04: Espectrofotrometro
Fuente:

espectrofotometria.htm

19

Figura05: Partes del espectrofotmetro

Fuente: espectrofotometro-unicom-optics-uv

20

BIBLIOGRAFIA

Berg, J.M.; John. (2008). Bioqumica. Barcelona:

Revert.
Segal, C. (2005). ) Manual de prcticas de biologa
molecular de la clula. Barcelona: publidisia.
Cambell, P.N.; Smith, A.d.; Peters, T.J. (2006).
Bioqumica
molecular

ilustrada:
en

Masson.
Harris, D.C.

la

era

(2003).

bioqumica

biologa

posgen-mica.

Espaa.:

Quantitative

chemical

analysis. San Francisco: Freeman.

21