UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOLOGIA, XALAPA

E. E.: MICROBIOLOGA AMBIENTAL

MANUAL DE PRCTICAS

Acadmica: DRA. CELIA CECILIA ACOSTA HERNNDEZ

AGOSTO 2014

HORAS/SEMANA CRDITOS
3
3

INDICE
PRESENTACIN. __________________________________________________

NORMAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA ________________

MANEJO DE MATERIAL_____________________________________________

MATERIAL DE TRABAJO POR EQUIPO____________________ ____________

PRACTICA No. 1: __________________________________________________

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SLIDOS Y LQUIDOS

PRACTICAS No. 2: ______________________________________________

11

OBSERVACIN DE LA MORFOLOGA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS POR

TINCIN SIMPLE
PRACTICA No. 3: __________________________________________________

17

TRANSFERENCIA DE UNA COLONIA PARA DESARROLLO DE CULTIVOS PUROS

PRACTICA No. 4: ________________________________________________

17

TINCIN DE GRAM (Modificado por Hucker)

PRCTICA 5: _____________________________________________________

19

CONTEO BACTERIANO POR EL MTODO DE PLACA VACIADA

PRACTICA No. 6: __________________________________________________

22

ANLISIS BACTERIOLGICO: MTODO DEL NMERO MS PROBABLE (NMP).

PRACTICA No. 7: _________________________________________________

25

AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM
PRACTICA No. 8: _____________________________________________

27

RESISTENCIA BACTERIANA
PRACTICAS No. 9 y 10:_____________________________________________

29

ACCIN INHIBITORIA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO. _____________________________

31

BIBLIOGRAFA. ___________________________________________________

32

PRESENTACIN
ACOSTA-HERNNDEZ, C.C. 2014.
El Laboratorio Experimental de Microbiologa es complemento y parte fundamental de la
teora, es el espacio donde el estudiante aplica los conceptos revisados durante las horas
de clase terica.
El objetivo principal del Laboratorio Experimental es desarrollar en los estudiantes las
habilidades y aptitudes necesarias para el manejo, mantenimiento y reconocimiento de
cultivos bacterianos.
Para hacer ms efectivo el logro de este objetivo, y evitar en lo posible errores, es
recomendable tener una gua de trabajo que permita a los estudiantes anticiparse a las
actividades programadas para cada sesin.
El presente manual, pretende ser esta gua de trabajo, las prcticas aqu presentadas
guardan un orden de acuerdo con el programa terico y son una recopilacin selecta de
tcnicas bsicas para el sembrado, purificacin, tincin, reconocimiento de cultivos
bacterianos y conteo bacteriano, as como, algunas de las tcnicas ms comunes
utilizadas en la determinacin de resistencia de las bacterias a metales pesados y
sustancias txicas como insecticidas.

NORMAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1. Cada equipo deber presentarse al laboratorio con su material de trabajo y manual de
prcticas, de lo contrario no tendr derecho a participar en la sesin de laboratorio.
2. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente el guin para adquirir una
idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica.
3. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente en su bitcora de
laboratorio.
4. El uso de la bata es obligatorio para todo trabajo en el laboratorio experimental.
5. Fumar, comer o tomar cualquier alimento NO est permitido dentro del laboratorio
6.

Mantenga sus lpices, dedos y papeles fuera de la boca.

7.

No deben aplicarse cosmticos dentro del laboratorio.

8. Las mesas de trabajo deben limpiarse con desinfectante antes y despus de cada
sesin.
9. Todos los cultivos y materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en
bolsas de autoclave y proceder posteriormente a su esterilizacin.
10. No se debe limpiar ni desechar material sin antes preguntar al maestro.
11. Es indispensable lavarse las manos antes de salir del laboratorio.
12. Todos los cultivos deben marcarse con NOMBRE, NUMERO DE EQUIPO, GRUPO Y
FECHA DE SIEMBRA.
13. Los accidentes de laboratorio como son quemaduras, cortadas o derrames de un
medio de cultivo inoculado deben reportarse inmediatamente al maestro.
14. Las pipetas se cogern de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo
superior para regular la cada de lquido.

DE TODOS LOS ERRORES POSIBLES, LA FALTA DE REPORTAR CUALQUIER

ACCIDENTE AL MAESTRO, ES EL MAS SERIO.

MANEJO DE MATERIAL
1. Las cubetas para el espectrofotmetro, y los cubreobjetos y portaobjetos deben
cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.
2. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de
microorganismos, nunca deben abrirse en posicin vertical, sino lo ms
horizontalmente posible (inclinados) y para quitar el tapn se mantendrn inclinados
con una mano y se abrirn con la otra, que sostendr a su vez el asa. Una vez abierto,
se flamea por algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operacin una vez
realizada la siembra (el tapn nunca debe dejarse sobre la mesa).
3. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, stas
deben flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama; tambin debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfren, pudiendo enfriarse tambin en el borde de la placa de Petri que
contiene el medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, deben
flamearse nuevamente (vea figura).
4. Las varillas de vidrio tambin deben flamearse, para ello primero moje la varilla en
alcohol psela por la flama, retrela en cuanto se incendia y espere a que se apague la
flama y se enfre la varilla (vea figura)
5. Las cajas Petri que han sido sembradas deben colocarse en las cmaras de
incubacin de manera invertida
6. LOS CULTIVOS QUE SE ESTEN INCUBANDO DEBERAN SER REVISADOS A LAS
24 HRS. DE HABER SIDO SEMBRADOS PARA EVITAR SU ENVEJECIMIENTO O
MUERTE.

MATERIAL DE TRABAJO POR EQUIPO

GASA (10 SOBRES)
ALCOHOL 250 ML
AGUA DESTILADA 1LT.
ALGODN PLISADO (PAQUETE CHICO)
PAPEL REVOLUCIN (5 PLIEGOS)
MASKING TAPE DE 1.5 CM DE ANCHO
PLUMN INDELEBLE PUNTO FINO
TIJERAS
1 PINZAS DE PUNTA FINA
TELA PARA SECAR MATERIAL
ESCOBILLON
ESPONJA PARA LAVAR
JABON DE TOCADOR
DETERGENTE EN POLVO
CUBRE BOCAS
GUANTES DE LATEX
CERILLOS
ASA BACTERIOLOGICA (2)
1 CAJA DE PORTA OBJETOS Y 1 CAJA DE CUBRE OBJETOS
2 MECHEROS CON MANGUERA DE APROX 30 CM (2)
MATERIAL POR GRUPO
1 ROLLO DE PAPEL CELOPACK
1 ROLLO DE BOLSAS PLSTICAS DE TAMAO MEDIANO
BENZAL 1 LT
ESTE MATERIAL ES INDISPENSABLE PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO, EN
CASO DE NO TRAERLO, NO PODR ENTRAR A LA SESIN CORRESPONDIENTE.

PRACTICA No. 1
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS EN MEDIOS SLIDOS Y LQUIDOS

OBJETIVO

El estudiante aprender las tcnicas de dilucin, inoculacin por picadura cultivo

en placa y tubo de ensayo en medio lquido y slido .

INTRODUCCION
En la naturaleza los microorganismos se presentan como poblaciones mixtas que
conviven en un hbitat determinado. A partir de la toma de muestras de estas poblaciones
es factible obtener cultivos mixtos. Si se quiere estudiar solo una especie, es necesario
realizar aislamientos, que aseguren el obtener una cepa pura, es decir, un cultivo que
contiene una sola especie.
Para poder lograr esto, es necesario cumplir con ciertos requerimientos como son los
nutrientes necesarios, tales como, fuente de carbono, nitrgeno, minerales y factores de
crecimiento, condiciones ambientales apropiadas con son pH, temperatura, presin
osmtica y oxgeno atmosfrico, adems, de condiciones aspticas estrictas.
Para prcticas posteriores se requiere un cultivo puro, por lo que debemos manejar todo
de tal manera que no introduzcamos organismos no deseados.
MATERIAL
Material estril de la prctica
anterior. Muestra seleccionada para
sembrar. Asas bacteriolgicas
2 mecheros bunsen
1 gradilla
Estufa de incubacin.
METODO DE TRABAJO
1.- Preparar las diluciones de acuerdo a las instrucciones, para mayor comprensin vea la
figura 2
a) Aadir 1 ml. de la muestra a un tubo de ensayo que contenga 9 ml. de agua
-1
destilada estril (dilucin 10 ). Mezclar.
-1
b) Pasar 1ml. de la dilucin 10 a otro tubo conteniendo 9 ml. de agua estril (dilucin
-2
10 ). Mezclar. UTILICE OTRA PIPETA.
-2
c) Pasar 1ml. de la dilucin 10 al tercer tubo que contiene 9 ml. de agua estril
-3
(dilucin 10 ). Mezclar. COLOQUE LA TERCERA PIPETA DENTRO DEL TUBO

0.1ml

MUESTRA

0.1ml

10

-1

0.1ml

10

-2

0.1ml

0.1ml

-3 -4

10

10 10

-5

Figura 2. Mtodo de dilucin de una muestra

2.- Siembra por extensin en placa de agar tome una pipeta estril y pase 1 ml. de las
dilucin deseada a dos cajas petri con medio slido, distribuya homogneamente con
la varilla en forma de L. (ver Fig. 3a)
4.- Siembra por vaciado de placa: primero inocule 1 ml. de la dilucin deseada en una caja
vaca y estril posteriormente vaci medio fundido a temperatura media, para
homogenizar mezcle con movimientos suaves. Deje solidificar en una superficie plana
(ver Fig. 3b).

Figura 3. Siembra en caja Petri a) siembra por extensin; b) siembra por vaciado de placa
1. Siembra por estriado de placa: se toma una sola asada del material a inocular y se
disemina sobre la superficie del medio slido, de una manera suave sin escarbar en el
medio.
a) Estras escocesas: Primero dibuje estras en la mitad de la caja, gire su caja de
manera que el estriado quede de su lado derecho. Queme su asa, enfrela y
tocando el extremo superior del estriado, vuelva a estriar hasta cubrir un cuarto de
la caja, gire de nuevo su caja. Queme el asa, enfrela y vuelva a estriar hasta cubrir

el otro cuarto de la caja. SOLO TOME MUESTRA EN EL P`RIMER ESTRIADO.

(Figuras 4a y b)
b) Estriado por agotamiento: tome una asada de muestra y estre toda la caja (Figura
4a).

Siembra por estriado en medio slido.

Figura 4. Siembra por estriado en medio slido: a) Estras escocesas: b) estriado por
agotamiento
9

2.

Para siembra en medio lquido transfiera con una pipeta estril 1 ml. de la dilucin
deseada al tubo con medio lquido. Antes y despus de inocular se flamea la boca del
tubo.

3.

Siembra por picadura en tubo con medio slido: Flamee el asa, quite el tapn del tubo
con la mano que tiene el asa y flamee la boca del tubo. Tome una asada de la
muestra. Flamee la boca del tubo e introduzca el asa dentro del medio hasta
aproximadamente de profundidad. Saque el asa, flamee nuevamente la boca del
tubo y el tapn. Coloque el tapn en el tubo (Figura 5).

Figura 5.- Siembra por picadura en tubo con medio slido

4. Siembra por estra en medio slido inclinado: se lleva el asa (con muestra) hasta
donde empieza el declive del medio y se sube haciendo un movimiento de zig-zag
sobre la superficie dibujando as una serie de estras. Inocule slo una asada, en
caso de necesitar ms asadas inicie la siembra a partir de donde termino la anterior
(Figura 6).

Figura 6.- Siembra por estra en medio slido inclinado

9.- Selle las cajas con celopack, etiquete con nmero de equipo, grupo y dilucin. Incube
los medios a 37C por 48 hrs. DEDE REVIZAR LOS CULTIVOS CADA 24hrs. EN
CASO DE PRESENTAR CRECIMIENTO DEBE METERLOS AL REFRIGERADOR.
REPORTE
Investigar las ventajas y desventajas de cada tcnica de sembrado y en que casos
es ms apropiado utilizar cada una.
NO OLVIDE ETIQUETAR SU MATERIAL

10

PRACTICA No. 2
OBSERVACIN DE LA MORFOLOGIA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS POR
TINCIN SIMPLE
OBJETIVOS

El estudiante reconocer las principales caractersticas de la morfologa colonial utilizada en la

identificacin de cepas bacterianas.

INTRODUCCION
Una colonia es un grupo de bacterias formado por la reproduccin de un solo organismo
sobre un medio slido y generalmente visible a simple vista. Para la identificacin de las
colonias bacterianas se consideran algunas caractersticas fsicas como:
Tamao de las colonias: Es constante dentro de las especies y puede ir desde colonias
diminutas hasta varios milmetros.
Forma: Esta determinada por su borde y espesor.
Consistencia y textura: La consistencia puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con un asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma
filamentos o hilos mucosos cuando se separa del agar. La textura puede parecer granular
o amorfa. La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada
con muescas concntricas o quebradas.
Pigmentacin: En bacterias saprofitas las colonias aparecen rojas, amarillas,
anaranjadas, etc. El pigmento no se aprecia en clulas individuales ya que se debe a
grnulos intracelulares muy pequeos para verse con luz transmitida.
Turbidez: En cultivo de caldo la opacidad es ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Es un crecimiento casi continuo sobre el lquido.
Sedimento: Es un sedimento de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar.
MATERIAL
Cultivos de la prctica anterior
Microscopios de diseccin y ptico
2 mecheros
Asas bacteriolgicas
Portaobjetos
Cubreobjetos
Azul de metileno

11

METODO DE TRABAJO
1.- Observe las colonias bajo el microscopio y anote las caractersticas basndose en el
texto y en la figura 7.
2.- Para textura destape cuidadosamente las cajas y con una asa estril toque las
colonias.
NOTA: Ciertas caractersticas de las colonias ocurren de una manera uniforme, por lo que
se toman en cuenta para identificar bacterias en cultivos mixtos, pero para hacer un
estudio completo a nivel de especie es necesario hacer un estudio fisiolgico e
inmunolgico de estas colonias.

Figura 7.- Morfologa de las colonias bacterianas

OBSERVACIN DE BACTERIAS AL MICROSCOPIO
TINCION SIMPLE.
5. Coloque una asada de agua estril en un cubreobjetos estril.
6. Tome una asada de una colonia aislada y esprzala en la asada de agua que coloc en
el portaobjetos (Figura 8).
7. Fjelo al calor.
8. Cubra el frotis con azul de metileno y deje reposar 1min.
9. Lave con agua corriente suavemente y deje secar.
10.
Observe al microscopio con el objetivo de inmersin.
11.
Determine la forma de sus bacterias guindose con los esquemas de la figura 9.

12

Figura 8.- Preparacin de un frotis para observacin al microscopio.

Figura 9.- Formas bacterianas

REPORTE:
Elaborar una tabla con las caractersticas observadas de las diferentes colonias.
Realice esquemas de lo observado en el microscopio.

13

PRACTICA No. 3

TRANSFERENCIA DE UNA COLONIA PARA DESARROLLO DE CULTIVOS

PUROS. OBJETIVOS

El estudiante aprender la tcnica de aislamiento para la obtencin de cepas puras.

INTRODUCCION
El aislamiento y obtencin de cultivos puros posiblemente hayan sido las bases ms
importantes en el desarrollo de la Microbiologa. Los primeros trabajos en Microbiologa se
hicieron en unas condiciones experimentales que no permitan tener la certeza de que se
hubieran obtenido cultivos puros.
Las tcnicas para obtener cultivos puros fueron inicialmente desarrolladas por De Bary y
Brefeld para el estudio de hongos y consiguieron aislar clulas y cultivar hongos sobre
medios slidos. Pero estas tcnicas no eran adecuadas para el cultivo de bacterias.
El proceso de aislamiento consiste en disponer de la descendencia de un individuo (clula)
inmovilizada sobre la superficie de un medio slido y separada del resto de individuos
presentes en el cultivo mixto. Esta clula, en las condiciones de crecimiento adecuadas
dar lugar a una descendencia (clon) que resultar macroscpicamente visible y que se
llama colonia. Cada colonia contiene millones o miles de millones de clulas idnticas y
con el mismo origen y propiedades. Se puede demostrar que prcticamente cada colonia
procede de una sola clula o de un grupo de clulas del mismo tipo si el microorganismo
forma agregados. Por ello lo ms correcto es hablar de unidades formadoras de colonias
(UFC) al referirnos al origen de una colonia. Cada colonia representa una poblacin de
microorganismos procedentes de una sola clula, a partir de la cual se posee la seguridad
de obtener dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.
TCNICAS DE AISLAMIENTO
Tcnica de aislamiento por estra escocesa o agotamiento en placa
La siembra por estra escocesa es un mtodo cualitativo de aislamiento de
microorganismos por agotamiento en placa a partir de una muestra natural o de un cultivo
de laboratorio. Este mtodo est basado en arrastrar, mediante un asa de siembra, un
nmero cada vez ms pequeo de individuos.
Es un mtodo rpido y simple de agotamiento progresivo y continuo del inoculo sobre un
medio slido contenido en una placa de Petri. El objetivo es obtener, a partir de un
elevado nmero de bacterias, un nmero reducido de ellas distribuidas individualmente

14

sobre la superficie de la placa. Al incubar la placa, y dejar crecer las bacterias distribuidas
sobre ella, cada una de las bacterias originar una colonia.
Tcnica de aislamiento por banco de diluciones y recuento de clulas viables
El aislamiento de microorganismos mediante banco de diluciones es un mtodo tanto
cualitativo como cuantitativo. Es cualitativo porque permite diferenciar las diferentes
morfologas coloniales y tambin es cuantitativo porque permite conocer el nmero de
microorganismos que hay en una suspensin.
Consiste en realizar diluciones sucesivas de la muestra en condiciones de esterilidad, de
manera que se va reduciendo el nmero de microorganismos de la suspensin inicial, con
el objeto de sembrar despus cantidades conocidas de las diluciones en placas de Petri.
Evidentemente, el nmero de microorganismos en algunas de las diluciones ser tal que
al distribuir una parte de ella en una placa originar colonias separadas en un nmero
ptimo para su recuento. Las diluciones se realizan en tubos que contienen una disolucin
mineral isotnica (solucin Ringer 1/4) que mantiene la viabilidad de las clulas pero no
permite la divisin celular. De los tubos de las diluciones se siembra un volumen conocido,
0.01 0.1 ml (10 100 l), sobre una placa de Petri.
Conociendo el nmero de colonias (UFC), la cantidad sembrada y la dilucin
correspondiente, esta tcnica tambin permite evaluar el nmero de microorganismos
viables en la muestra original.
La tcnica que se emplear en esta prctica es la de estra escocesa o agotamiento en
placa
MATERIAL
Cultivos de la prctica anterior
2 Cajas petri con medio slido
3 Tubos de ensayo con medio slido inclinado
2 mecheros
Asas bacteriolgicas
METODO DE TRABAJO
1.- Examine las placas y seleccione una colonia aislada, marcando su posicin con un
crculo por el lado inferior de la caja de petri.
2.- Flamee el asa. Levante la tapa de la caja de petri y toque con el asa la colonia
seleccionada, verifique que el asa lleve parte de la colonia. Solo transfiera una mnima
parte de la colonia, de preferencia de la parte externa de la misma (Figura 10).
3.- Estre en otra caja petri con medio, empleando la tcnica de estra escocesa o
agotamiento en placa (Figura 10a y b).
4.- Despus de haber obtenido el inoculo, tome un tubo con medio inclinado y siembre por
estriado.
5.- Selle e incube a 37 C por 24 hrs.

15

b
Figura 10.- Aislamiento de una colonia a) estra por agotamiento en placa; b) estra
escocesa
PURIFICACION
1.- Observe los cultivos incubados, si no estn contaminados proceda a su purificacin de
la siguiente manera:
a) Prepare tubos de ensayo con medio slido inclinado.
b) Seleccione una colonia aislada del cultivo, con una asa toque la colonia y
proceda a sembrar por estriado en tubo inclinado. SOLO UNA (Figura 12).

c) Selle e incube a 37 C por 24 hrs.

d) Si observa crecimiento guarde el cultivo en refrigeracin a 6 C
aproximadamente para su uso en prcticas posteriores.

Figura 12. Purificacin de una colonia por siembra en tubo inclinado

REPORTE
Investigar la importancia de los cultivos puros.
Investigar si existe otra tcnica para obtenerlos.

16

PRACTICA No. 4
TINCION DE GRAM (Modificada por Hucker)
OBJETIVO

Los estudiantes conocern y aprendern una de las tinciones

diferenciales ms usadas en el

laboratorio, distinguiendo las bacterias gram+ y gram-.

INTRODUCCION.
La tincin de Gram utiliza cuatro reactivos: cristal violeta, yodo de gram, etanol al 95% y
safranina. Existen algunas modificaciones de la tincin original, sin embargo el principio
fundamental es el mismo para todas.
En primer lugar el cristal violeta, que es el colorante inicial, tie a todos los
microorganismos ya que es un colorante bsico, el yodo que es el siguiente, acta como
mordiente para incrementar la afinidad con la clula y el colorante inicial. El agente
decolorante es el etanol al 95%, el cual actuar sobre los microorganismos eliminando el
colorante inicial, sin embargo algunos organismos retienen este colorante, esto nos
permite distinguir dos grupos.
El colorante usado para contraste que es la safranina teir a los microorganismos que se
decoloraron. Las clulas que conservan el color inicial (cristal violeta) se conocen como
gram+ y las que son decoloradas y retienen la safranina sern las gram-.
El fundamento radica en la diferente
estructura de la pared celular de ambos
grupos: las bacterias Gram+ tienen una
gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gramtienen una capa de peptidoglicano ms
fina y una capa lipopolisacardica
externa. Tras la tincin con el primer
colorante (Cristal violeta) se efecta un
lavado con etanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram (-), mientras
que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las clulas permanecern
azules. Las clulas Gram (-) se teirn
despus con un colorante de contraste
(safranina)
para
que
puedan
observarse.

17

MATERIAL
Asa, mecheros
Cultivo de bacterias
Microscopio ptico
Pizeta
Portaobjetos y cubreobjetos estriles
Cristal violeta
Yodo de Gram
Etanol al 95%
Safranina
METODO DE TRABAJO.
1.- Prepare un frotis del cultivo. Deje secar y fije al calor.
2- Agregue una gota de cristal violeta y djelo por 1min.
3.- Enjuague con agua corriente suavemente y deje escurrir.
4.- Cubra el frotis con yodo de gram y deje reposar por 1min.
5.- Enjuague con agua corriente y deje escurrir.
6.- Decolore con etanol al 95%. Para esto incline el portaobjetos sobre una caja petri vaca
y aada goteando el etanol procurando que corra por todo el frotis. Para un frotis
delgado es suficiente con 10 o 20 segundos.
7.- Detenga la accin del decolorante lavando rpidamente con agua.
8.- Tia con safranina por 20 o 30 segundos, enjuague y deje secar al aire el frotis.
9.- Examine al microscopio con el objetivo de inmersin. Guiese por las fotos de la figura
13.
NOTA: Las bacterias se pueden fijar con calor, alcohol, acetona o formaldehido.

REPORTE
Esquematizar lo observado, diferenciando las paredes de
las gram+ y las gram-.
Investigar los fundamentos de la tincin de Gram.
Explicar los problemas que present esta tincin.
Figura 13. Esquema de tincin de gran y fotografas de bacterias Gram+ y Gram-

18

PRACTICA No. 5
CONTEO BACTERIANO POR EL MTODO DE PLACA VACIADA
OBJETIVO

El estudiante ser capaz de cuantificar el nmero de organismos presentes en un cultivo.

INTRODUCCION.
Existen varios mtodos para llevar a cabo el recuento de bacterias vivas en un
cultivo, sin embargo en la mayora de los mtodos lo que se busca es diluir el nmero de
microorganismos, de tal manera que no interacten entre s y se puedan contar
individualmente.
Los mtodos conocidos son: determinacin de peso seco, conteo directo al
microscopio, mtodo de placa vaciada, NMP, filtracin con membrana, turbidimetra,
conteo electrnico y asa calibrada.
METODO DE PLACA VACIADA.
Este mtodo se lleva a cabo inoculando en una caja de petri estril un volumen
dado de muestra, se mezcla con medio de cultivo fundido y fro y se deja solidificar. Cada
clula viva en el medio dar origen a una colonia visible. Se cuentan las colonias y se
estima el nmero de bacterias por milmetro o gramo de muestra. Este es uno de los
mtodos ms comnmente usados y de los ms exactos. Sin embargo se debe ser
cuidadoso para evitar errores por manipulacin durante la dilucin.
MATERIAL
10 ml de Muestra
2 Mecheros
4 Cajas petri estriles
3 Pipetas estriles de 1 ml
3 Tubos de ensayo estriles con 9 ml. de agua
Gradilla
METODO DE TRABAJO.
1.- Agite varias veces la muestra.
-1
-2,
-3
2.- Bajo condiciones aspticas realice las diluciones de la muestra 10 , 10 10 (Figura
14).
3.- En una caja de Petri vierta 1ml. de la muestra concentrada y adicione de 10 a 15 ml. de
medio fundido fro, mezcle con movimientos circulares suaves. EL MEDIO NO DEBE
TOCAR LA TAPA DE LA CAJA. Etiquete.
4.- En las otras tres cajas vierta 1ml. de cada dilucin (una dilucin para cada caja) y
adicione de 10 a 15 ml. de medio fundido fro, mezcle con movimientos circulares
suaves. EL MEDIO NO DEBE TOCAR LA TAPA DE LA CAJA. Etiquete.

19

5.- Deje solidificar en una superficie plana, selle e incube a 37 C observando a las 24 y 48
hrs.
7.- Cuando observe crecimiento bacteriano (mximo a las 48 hrs) cuente el nmero de
colonias en un contador de bacterias.

Figura 14. Dilucin de una muestra para conteo bacteriano, por

el mtodo de placa vaciada
CUENTA
Seleccione las placas en las que el nmero de colonias sea entre 30 y 300 (a veces se
realiza el conteo en placas de menos de 30 colonias). La cuenta se debe hacer por lo
menos en dos placas.
Multiplique el nmero de colonias contadas, llevando a cifras redondas, por la dilucin de
la muestra.

Ci = N x D x 10
Ci = Concentracin inicial (unidades: nmero de clulas / ml)
N = n de colonias
D = dilucin
Obtenga el promedio y este ser el resultado del nmero de bacterias por mililitro de agua
sin diluir por la temperatura de incubacin.
EJEMPLO:
-1
Si cuenta 159 colonias en la placa con dilucin 10 , el nmero de colonias por
-3
mililitro de agua sin diluir ser: 1.59 x 10
INTERPRETACION
El nmero mximo de bacterias permitidas para una agua inocua no debe ser mayor a 100
x ml. a 37 C. Los microorganismos que normalmente se encuentran en el agua se

20

desarrollan mejor a 20 C, los organismos coliformes a 37 C. Si la cuenta total de las dos

temperaturas es aproximada, es muy probable que haya bacterias de los desages. En las
cuentas habituales repetidas de una misma fuente tiene un valor definitivo la elevacin
brusca del nmero total de bacterias, lo cual indica una contaminacin sbita.
REPORTE
Numero de bacterias en cada dilucin
Numero de bacterias total en su muestra
Interprete sus datos

21

PRACTICA No. 6
ANLISIS BACTERIOLGICO: MTODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
OBJETIVO

El estudiante aplicar la prueba del NMP a un

cuerpo de agua, para determinar su estado
sanitario, desde el punto de vista bacteriolgico.

INTRODUCCIN.
Para determinar si una masa de agua puede ser utilizada o no con seguridad para
consumo humano (beber, preparar alimentos o aseo personal) es necesario hacer un
reconocimiento sanitario de la misma. Este reconocimiento incluye pruebas de laboratorio
tales como 1) examen microscpico; 2) anlisis fsico-qumico y 3) anlisis microbiolgico.
Este ltimo es indicador de la presencia de bacterias patgenas que se desarrollan
normalmente en el intestino del hombre y animales y su presencia en cuerpos de agua
representa un problema de contaminacin fecal y de salud.
Una de las principales tareas de la microbiologa es el desarrollo de mtodos de
laboratorio que puedan utilizarse para detectar los contaminantes microbiolgicos
presentes en el agua para consumo humano. En la prctica se emplean organismos
indicadores, el ms usual es el grupo de organismos coliformes. Dicho grupo est
definido en la bacteriologa del agua como toda bacteria aerbica y anaerbica facultativa,
gram negativa, no formadora de esporas, en forma de bastn, que fermentan lactosa con
formacin de gas en 48 horas a 35C.
De las bacterias formadoras de gas ms prolficas y fciles de cultivar es la Escherichia
coli (bacteria coliforme normalmente no patgena) cuya presencia constituye una prueba
segura para detectar contaminacin fecal potencialmente peligrosa originada por
microorganismos enteropatgenos tales como Shigella, Salmonella y algunas especies de
Klebsiella y Enterobacter (coliformes no fecales)
La prueba convencional es la del Nmero Ms Probable (NMP) la cual incluye una
reaccin en tres etapas; la primera es la Prueba presuntiva, en donde la formacin de gas
en caldo lactosa es indicadora de contaminacin por bacterias coliformes fecales y no
fecales; la segunda es la prueba confirmativa, para realizarla es necesario transferir los
cultivos positivos resultantes en lactosa al medio verde brillante bilis que inhibe el
crecimiento de todas las especies formadoras de gas a excepcin de los bacilos
coliformes y la tercera la prueba completa en la cual se demuestra que cultivos puros
aislados de colonias de tipo coliforme en las placas contienen bastones gram negativos no
formadoras de esporas que forman gas en caldo de lactosa
Para el recuento de coliformes se consultan las tablas donde se indica el nmero estima
de bacterias coliformes en 100 ml de agua, que corresponden a varias combinaciones de
resultados positivos y negativos en las cantidades utilizadas para los ensayos. Estas

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tablas son bsicamente las calculadas originalmente por McCrady con ciertas
correcciones debidas a clculos ms precisos de Swaroop.
El mtodo que se utilizar en esta prctica es el Mtodo Estndar de los EE:UU:, para el
cual se usan 15 tubos de fermentacin, conteniendo cada uno de ellos 20 ml de caldo
lactosado al 0.5%. Se siembran con 5 x 10 ml, 5 x 1 ml y 5 x 0.1 ml de la muestra de agua.
Se incuban a 35C y se examinan comprobando la formacin de gas tras 24 y 48 horas.
La presencia de gas en 48 horas es presunta evidencia de bacilos coliformes (Collins and
Lyne 1989)
MATERIAL
100 ml. de una muestra de agua
1 Pipeta estril de 10 ml.
2 Pipetas estriles de 1 ml.
18 Tubos de ensayo de 50 ml.
18 tubos Durham Caldo
lactosado (Merk)
Verde brillante bilis (Merk)
Gradilla, mecheros, asa bacteriolgica
MTODO DE TRABAJO
1.- Toma de muestra
Se tomar en una frasco de 100 ml previamente esterilizado en autoclave a 15 libras de
presin y 120C. El frasco se abrir solo en el momento de la toma de muestra. Todas las
muestras se transportaran en hielera al laboratorio para su siembra inmediata.
PRUEBA PRESUNTIVA
1.- Prepare el caldo lactosado y agregue 20 ml. a cada tubo.
2.- Coloque los tubos Durham invertidos dentro de los tubos con medio. NO DEBEN
FORMARSE BURBUJAS.
3.- Coloque los tapones a los tubos y esterilice a 15 libras durante 15 min.
4.- Cuando estn fros agregue la muestra de la siguiente forma.
Nmero de tubos Muestra ml.
3
10
3
1
3
0.1
En cada inoculacin debe utilizar una pipeta estril.
5.- Mezcle el contenido de los tubos agitando suavemente.
6.- Incube a 35 C por 24 hrs. y observe si hubo formacin de gas dentro de los tubos
Durham. En caso de que los resultados sean negativos incube por otras 24 hrs, revise
y anote la lectura.

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7.- Para la lectura de los tubos elabore una tabla con la posicin del tubo y la cantidad de
muestra inoculada, registrando positivo si se presenta formacin de gas o negativos si
no se presenta formacin de gas.
PRUEBA CONFIRMATIVA
1 Prepare tubos de fermentacin con 10 ml. de caldo verde bilis brillante (de la misma
forma que los tubos con lactosa) por cada tubo positivo de la prueba anterior.
2.- Aquellos tubos que resulten positivos deber resembrarlos en Verde Brillante bilis
transfiriendo 1 ml. a cada tubo.
3.- Incube a 35C durante 24 C y observe la formacin de gas, aquellos que resulten
positivos regstrelos de la misma forma que la prueba anterior.

Tabla 1. Nmero ms probable de bacterias

REPORTE
Consulte la tabla 1 y reporte el NMP.
Consulte los lmites permitidos por el Cdigo sanitario.
Clasifique su muestra de acuerdo al Cdigo Sanitario.

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PRACTICA No. 7
AISLAMIENTO DE RHIZOBIUM
OBJETIVO

El estudiante aprender a aislar una cepa de Rhizobium a partir de una planta nodulada.

INTRODUCCION
Las bacterias desempean un papel esencial en el ciclo biogeoqumico del nitrgeno,
puesto que en l intervienen algunas bacterias quimioautotrficas. El nitrgeno al
descomponerse se convierte principalmente en NH3 (nitrito). Este compuesto voltil es
estabilizado en el suelo mediante oxidacin a travs de la accin bacteriana nitrificante a
nitrato no voltil, el cual puede reducirse a compuestos orgnicos aminos por medio de las
plantas.
La fijacin biolgica de nitrgeno se efecta solo por las bacterias, de las cuales el grupo
ms importante es el gnero Rhizobium que infectan la raz de las plantas leguminosas y
conducen a las formaciones de ndulos simbiticos que fijan el nitrgeno.
MATERIAL
2 Tubos de ensayo chicos
3 Cajas de petri
2 pipetas de 1 ml.
Etanol al 70 %
Hidrxido de sodio
Rojo congo al 1%
Fosfato de potasio (K2HPO4)
Sulfato de Magnesio (MgSO4)
Cloruro de Sodio (NaCl)
Cloruro Frrico (FeCl3)

1 Macerador
potencimetro
Ndulos de leguminosa
Cloro al 10.2 %
Caldo nutritivo
Extracto de levadura
Manitol
Agar bacteriolgico
Agua estril

METODO DE TRABAJO
1.- Se preparan 1000 ml. de medio YEM de la siguiente manera:
a) Disuelva en 1000 ml. de caldo nutritivo los siguientes reactivos
REACTIVOS
CANTIDAD gr.
K2HPO4
0.5
MgSO4
0.3
NaCL
0.2
FeCl3
0.01
Extracto de levadura
0.5
Manitol
10
Agar
20
Colorante Rojo Congo al 0.25 %

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b)Regule el pH del Hidrxido de Sodio a 7, agregue el agar bacteriolgico

(7.5 gr.). Esterilice a 15 libras de presin por 15 min.
c) Diluya 0.7 gr de rojo congo en 30 ml. de agua destilada tibia, filtre con
papel filtro fino y esterilice a 10 libras de presin.
2.- Esterilice dos tubos con agua a 15 libras por 10 min.
3.- Esterilice el medio YEM y cuando est fro (no permita que solidifique) adale el rojo
congo y agitando suavemente.
4.- Vaci el medio a las cajas petri previamente esterilizadas y deje que solidifique.
5.- Corte los ndulos y lvelos quitando el exceso de tierra.
6.- Enjuguelos con etanol al 70% por 3 min.
7.- Sumrjalos por 5 min. en Cloro al 10.2%.
8.- Enjuguelos tres veces con agua estril, desechando el agua.
9.- Coloque los ndulos dentro de los tubos con agua y machquelos con macerador.
10.- Tome una muestra con el asa, capturando una pelcula, estri la caja de petri con el
medio YEM.
11.- Incube a 30 C por 24 hrs. y observe la formacin de colonias.
REPORTE
Investigue el ciclo biogeoqumico del nitrgeno y esquematizarlo.
Investigue la importancia de las bacterias nitrificadoras y relacinelo con el ciclo del
nitrgeno.

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PRCTICA No.8
RESISTENCIA BACTERIANA
OBJETIVO:
Los estudiantes aplicarn la tcnica de Concentracin mnima inhibitoria para determinar
la resistencia bacteria a la sustancia que elijan.
INTRODUCCIN.
La acumulacin de desechos, sobre todo en reas urbanas, genera la dispersin de gran
diversidad de compuestos en suelos, aguas superficiales y aire, con la consecuente
filtracin de los mismos hacia las aguas subterrneas: los acuferos que constituyen la
reserva de agua potable.
Podemos solucionar este problema con lo que llamamos remediacin. Para definir este
trmino podemos decir que es el uso intencional de procesos de degradacin qumicos o
biolgicos para eliminar sustancias contaminantes ambientales que han sido vertidas con
conocimiento o accidentalmente en el ambiente. Los procesos de remediacin pueden
efectuarse in situ, o sea en el mismo lugar en el que ha ocurrido el derrame, o bien ex situ,
separando la porcin contaminada y trasladndola a un reactor. Tal es el caso de
efluentes industriales o domiciliarios que se tratan previamente al vertido al medio
ambiente.
Las actividades industriales generan una contaminacin a gran escala en el medio
ambiente. En el caso de los suelos, pueden afectar a la fertilidad y/o el uso posterior de los
mismos, mientras que en el caso de los acuferos y aguas superficiales, pueden
comprometer seriamente el uso de este recurso como fuente de agua para consumo
humano. La remediacin de estos ambientes contaminados mediante el uso de mtodos
qumicos involucra procesos de costos excesivamente altos debido a la especificidad
requerida.
La aplicacin de mtodos de remediacin efectivos depende del conocimiento de los
factores hidrolgicos y geolgicos del sitio, la solubilidad y especiacin de las sustancias
contaminantes, los procesos de atenuacin e inmovilizacin y la medida en que puedan
dispersarse. La utilizacin de mtodos biolgicos para remediar un ambiente contaminado
(bioremediacin) ofrece una alta especificidad en la remocin, con flexibilidad operacional,
tanto en sistemas in situ como ex situ.
MATERIAL
3 tubos de ensaye con tapn estril, con 5 ml. De agua (p/ muestras de aceite).
1 tubo de ensaye con tapn (p/ caldo nutritivo).
8 cajas petri estriles, 4 pipetas estriles de 5ml, 1 pipeta estril de 1ml.
Muestra de aceite o solucin de algn contaminante (10ml.)
Caldo y medio nutritivo

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Mecheros, Gradilla, Asa bacteriolgica, 4 matraces erlenmeyer de 250ml.

MTODO DE TRABAJO:
1.
2.
3.
4.

Se envuelven pipetas y cajas petri y se dejan listas para la esterilizacin.

Se prepara el medio y caldo de cultivo.
Se vacan exactamente 20ml. de medio en cada matraz.
Se aaden 4ml de medio a 8 de los tubos de ensayo, al noveno se le agregan 5ml de
caldo nutritivo al dcimo 15 ml de agua y el ltimo se queda vaco.
5. Los matraces y tubos se taponan y cubren con capuchones de papel.
6. Todo el material se esteriliza como en prcticas anteriores.
7. Una vez estril el material, se esteriliza la mesa de trabajo y se prenden los mecheros,
mientras el material se enfra.
8. Dentro de la zona estril se abre el tubo que tiene el caldo nutritivo.
9. Se toma una asada de una colonia aislada con anterioridad en un tubo con medio de
cultivo inclinado (la colonia debe estar en la estufa a 37 para evitar un choque debido
a la diferencia de temperatura entre el caldo y el medio inclinado).
10. Inocular el caldo nutritivo e incubar por 24 hrs. A 37.
11. El resto del material se guarda en el refrigerador.
12. Al cabo de las 24 hrs. Sacar el material del refrigerador y poner a bao mara los
matraces y tubos con el medio.
13. Hacer los clculos necesarios para obtener las concentraciones a trabajar de los
elementos a estudiar, considerando el uso de la sal ms soluble disponible del metal
pesado. Considerar que la primera solucin se har en 10 ml de agua.
14. Dentro de la zona estril, abrir el tubo de ensaye vaco y poner la sal ya pesada, abrir
el tubo que contiene agua y pipetear 10 ml, agitar y preparar las concentraciones a
usar en los matraces segn los clculos hechos anteriormente.
15. Disuelto el medio de los tubos, sembrar en cada uno 0.1 ml del caldo nutritivo
inoculado.
16. Poner en las cajas 10ml. de medio de cultivo, 2 con la concentracin y el blanco,
pasando a cada caja aproximadamente la mitad del contenido de cada matraz.
Esperar a que solidifique.
17. Agregar el contenido de los tubos de ensaye, esperar a que solidifique, empaquetar e
incubar de 24 a 48 hrs. a 37C en espera de ver crecimiento de colonias.
18. Realizar el conteo bacteriano y aplicar la frmula de CMI para reportar los valores de
resistencia bacteriana a la sustancia probada.
% de res. O CMI= # de CSU/ml de conc. considerada + conc. de sust. Cont.
---------------------------------------------------------------------- X 100
# de CSU/ ml del blanco
REPORTE
CMI
Investigar el dao que causan el contamnate probado en el ambiente o la salud del
hombre.
Investigar si existen lmites permisibles de de esta sustancia en el ambiente
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PRACTICAS No. 9 Y 10
ACCION INHIBITORIA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
OBJETIVO:
El estudiante propondr una sustancia y observar su efecto como inhibidor del
crecimiento bacteriano.
INTRODUCCION
La influencia de los herbicidas sobre las actividades microbianas en el suelo ha sido
evaluada en aos reciente, utilizndose frecuentemente a los microorganismos
involucrados en el ciclo del nitrgeno, por su sensibilidad a los distintos contaminantes
ambientales.
Una de las razones por las cuales las bacterias del suelo pueden ser afectadas por los
herbicidas se debe a su carcter de organismos autotrficos y tambin porque ellas se
desarrollan principalmente sobre la superficie del suelo, donde la exposicin a los
herbicidas es ms probable.
El crecimiento de algunas bacterias es retardado por la aplicacin de los herbicidas ya que
tiene mayor inhibicin del crecimiento porque afecta la divisin celular; adems de un
marcado descenso en el crecimiento y la actividad metablica.
MATERIAL
2 discos de papel filtro del No. 4
10 frascos viales
1 pipeta de 1ml
2 Cajas de petri
1 Tubo de ensayo
Mecheros, asa
Papel aluminio
Caldo nutritivo
Medio nutritivo
Plomo a diferentes concentraciones
Alcohol
Alfileres, perforadora
Pinzas de diseccin
METODO DE TRABAJO
1.- Prepare los medios de cultivo.
2.- Haga 20 discos de papel filtro con una perforadora. Cada disco medir
aproximadamente 6 mm.
3.- Inserte los alfileres en el centro de los tapones de los frascos viales.

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4.- Inserte los discos en los alfileres, procurando que queden centrados. Tape los frascos
viales, (los discos deben quedar dentro de los frascos viales) envuelva los viales con
papel aluminio y selle perfectamente.
5.- Envuelva las cajas y pngale tapones a los tubos.
6.- Esterilice todo el material. Tambin las pinzas.
7.- Cuando enfre el medio nutritivo vacelo en las cajas Petri, pngalas en una superficie
plana y espere a que solidifique. Etiqutelas y gurdelas invertidas en el refrigerador.
8.- A los tubos de ensayo vaceles caldo base (aproximadamente 10 ml.) e inoclelos con
la cepa bacteriana. Incbelos por 24 hrs. a 37 C.
9.- Realice las siguientes diluciones con el herbicida elegido.
1:50, 1:25, 1:10, 1: 5
10.- Humedezca los discos con las diluciones del herbicida, cinco discos con cada
dilucin.
11.-. Inocule el cultivo en las cajas Petri con medio slido (Figura 15)
12.- Coloque los discos con herbicida en la superficie de las cajas utilizando las pinzas
estriles
14.- Incube a 35 C por 24 hrs. y observe el halo de inhibicin.
15.- Mida el dimetro de los halos de inhibicin incluyendo la medida del disco de papel.

Figura 15. Preparacin de la prueba inhibitoria por insecticidas

REPORTE
Investigar la accin de los herbicidas sobre las bacterias.
Reporte los dimetros de los halos de inhibicin.

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PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

CALDO LACTOSADO MARCA MERK: Disolver 13 gr. en 1 lit. de agua destilada .
BILIS VERDE BRILLANTE: Disolver 40 gr. en 1 lit. de agua destilada distribuyndose en
tubos de 10 ml. para muestras de 1 ml. o menos.
Si las muestras son de 10 ml. disolver 60 gr. en un litro y distribuir en porciones de
20 ml. Esterilizar a 15 lib. por 15 min.
AGAR BASE: Disolver 25.5 gr. en 1 lit. de agua destilada .
CALDO NUTRITIVO: Disolver los siguientes reactivos
AGUA DESTILADA (1000ML)
PEPTONA
EXTRACTO DE CARNE DE RES
EXTRACTO DE LEVADURA

.60 gr.
.15 gr.
.30 gr.

en 100 ml. de agua destilada.

Cs.10 ml.
0.06 gr.
0.15 gr.
0.03 gr.

ESTE MEDIO SE UTILIZA EN LAS PRACTICAS No. 7 Y 8.

AGAR SUAVE: Disolver 7.5 gr. de agar en 1 lit. de agua destilada.
PRACTICAS No. 12 Y13.
CALDO BASE: Disolver en 75 ml. de agua los siguientes reactivos:
PEPTONA
0.4 gr.
EXTRACTO DE CARNE DE RES
0.1 gr.
EXTRACTO DE LEVADURA
0.2 gr.
PUEDE SUSTITUIR AL CALDO LACTOSADO
DILUYENTES AGUA DE PEPTONA: Peptona al 1%
FENOLFTALEINA: Se disuelve 1 gr en 100ml de etanol al 95%. La solucin es incolora a
pH 8.3 y roja a pH 10.

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BIBLIOGRAFIA
Cancino Gonzlez A.1993.Manual de Prcticas del Laboratorio de Inmunologa.Fac.
Qumico Farmacetico.Universidad Veracruzana.Zona Xalapa.Tsis.
Collins C.H. y Patricia M. Lyne.1989.Mtodo Microbiolgicos.Quinta edicin.Editorial
Acribia S. A. Espaa.
Daz Resndiz Martha.1988. Manual de Prcticas de Micologa Mdica. Fac. de
Qumico Farmacetico. Universidad Veracruzana.Zona Xalapa.Tsis
Gavio,Jurez, Figueroa.1995.Tcnicas Selectas de Laboratorioy Campo en
Biologa.Edt. Limusa.Mxico.
Oppenheim I. 1974. Manual para Tcnicas de Laboratorio.Edt. Alhambra
Mexicana S.A. Mxico.
Mendoza Parissi M.1995.Microbiolga I. Trabajo Prctico-Educativo.Fac. de
Qumico Farmacetico.Universidad Varacruzana.Zona Xalapa.Tsis
Wisttreich G. and Lechtman M.1983.Prcticas de Laboratorio en Microbiologa.
Edt. Limusa. Mxico.S.A.

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