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Tesis de Licenciatura
Efecto in vitro del -caroteno natural obtenido a partir de
Dunaliella salina (Chlorophyta) sobre la lnea celular de cncer
MDA-MB-231
PRESENTA:
Ilhui Roco Gmez Pacheco
DIRECTOR:
Jorge Olmos Soto
Dedicatoria
Mi mam
Que nunca deja de sorprenderme con lo maravillosa que es.
Abuelita Lupita
Que siempre cuido y am a todos. Te llevo siempre conmigo.
Mi abuela Toa,
El amor de mis amores. Gracias por estar siempre a mi lado.
Javier y Andrs,
El regalo ms bonito que tuve por mis padres. Los adoro.
A mi ta Laura Lilan,
Porque las batallas ms grandes, solo se pueden ganar con amor a la vida.
Mi pap,
Y mis abuelos Sergio y Carlos
Por todo su cario.
Agradecimientos acadmicos
Al Dr. Jorge Olmos Soto por la direccin de esta tesis y por el apoyo brindado;
pero sobre todo, por aceptarme y darme la oportunidad de
aprender cosas
nuevas.
Al Dr. Jose Luis Ortiz Galindo y al Dr. No Daz Viloria, por la extensa revisin de
la tesis. Mil gracias por todo.
Al comit revisor tesis: Dr. Sergio Flores Ramrez, M.C. Marco Antonio Medina
Lpez, al Dr. No Daz Viloria y al Dr. Carlos Snchez Ortiz.
Agradecimientos personales
A mi mam, por todo su amor y todo el tiempo que me ha dedicado desde el da
en que nac. Muchas gracias por estar siempre a mi lado, en las buenas y en las
malas, por regaarme siempre que lo necesit, Por ensearme todo cuanto s.
A Jos Luis Ortiz Galindo, muchas gracias to por todo el cario, tiempo y apoyo,
que me has dado siempre, por ser parte de nuestra familia.
A mi ta Mara Elena Gmez Rojo, muchas gracias por todo tu cario, apoyo y
nimos. Te quiero mucho madrina.
ndice
Lista de figuras
Lista de cuadros
iiI
Lista de anexos
iii
Glosario
iv
Resumen
vi
1. Introduccin
2. Antecedentes
3. Justificacin
12
4. Hiptesis
12
5. Objetivo general
13
13
6. Materiales y Mtodos
14
7. Resultados
20
20
7.2 -Caroteno
21
26
26
8. Discusin
30
9. Conclusiones
34
10. Recomendaciones
35
11. Bibliografa
36
12. Anexos
41
Lista de figuras
Figura 1
Molcula de -caroteno.
Figura 2
Figura 3
100X.
Figura 4.
10
Figura 5.
11
salina
hasta
alcanzar
la
fase
estacionaria.
Figura 6
20
Figura 7
22
Figura 8
23
extracto
natural.
Figura 9
Figura 10
29
Figura 12
29
Figura 11
25
51
52
Figura 13
Variacin dentro del tratamiento de 24h con caroteno en la lnea celular MDA-MB-231.
Figura 14
54
Variacin dentro del tratamiento de 24h con caroteno en la lnea celular MDA-MB-231:
54
Variacin dentro del tratamiento de 24h con caroteno en la lnea celular HaCat: 1)Clulas
55
56
List
a de cuadros
ii
Lista de cuadros
Cuadro I
15
Cuadro II
18
Cuadro III
24
Lista de Anexos
Anexo I
Cultivo de D. salina.
41
Anexo II
46
Anexo III
48
Anexo IV
50
Anexo V
Resultados
programa R.
del
ANOVA
realizado
con
el
51
iii
Glosario
iv
Lnea celular continua: Son clulas de un tipo nico (humano, animal o vegetal),
que han sido sub-cultivadas a partir de un cultivo primario del cual derivan. Estas
clulas tienen alteraciones genticas que les dan la capacidad de proliferar
indefinidamente si se les brindan las condiciones ambientales y los nutrientes
esenciales para su mantenimiento (Langdon, 2004).
Resumen
vi
1 Introduccin
En los ocanos del mundo habita una gran diversidad de microorganismos
conformada
por
bacterias,
virus,
hongos,
protozoarios
algas.
Estos
microorganismos producen en conjunto, un reservorio natural de sustancias bioactivas, que son producto de su metabolismo primario y secundario. Estas
sustancias son muy novedosas, ya que tienen amplias aplicaciones en la industria
y en las ciencias de la salud (Ireland et al., 1993; Paniagua-Michel, 2009).
2 Antecedentes
2. 1 Los carotenoides
Los carotenoides son una familia de pigmentos de color amarillo- naranja o rojo
que proveen de un intenso color a muchas especies de organismos (Asker et al.,
2012). Estos pigmentos son los ms ampliamente distribuidos en la naturaleza, ya
que se les encuentra en las plantas, las bacterias, las algas, los hongos y los
animales; sin importar si se trata de especies marinas, terrestres o de agua dulce
(Mnguez-Mosquera et al., 2008; Venugopal, 2009). Hasta la fecha se han
descubierto ms de 700 carotenos distintos en la naturaleza (Asker et al., 2012),
entre ellos el -caroteno.
2. 1. 1 Funcin biolgica
En los organismos fotosintticos los carotenoides sirven como pigmentos
accesorios, ayudando a absorber la luz y transfiriendo la energa a la clorofila
(Asker et al., 2012). Otra funcin de los carotenoides en organismos fototrficos y
no-fototrficos, es la de proteger a las clulas contra daos en el ncleo causados
por la produccin de radicales libres, y que puedan originar mutaciones u otras
alteraciones genticas (Bendich y Olson, 1989).
En los miembros del reino animal incluyendo a los humanos, vacas, aves, peces y
algunos crustceos, los carotenoides no pueden ser sintetizados y tienen que ser
tienen
una
actividad
anticancergena,
ya
sea
como
agentes
2. 2 Dunaliella salina
2. 2. 1 Taxonoma
De acuerdo al ITIS (2003), la clasificacin de la especie es la siguiente:
Divisin
Chlorophyta
Clase
Chlorophyceae
Orden
Volvocales
Family
Dunaliellaceae
Gnero
Dunaliella
Especie
Los factores carcingenos pueden ser de tipo fsico, como la radiacin UV-A y UVB, los rayos X, y rayos Gama; qumico, debido a la presencia de epxidos,
nitrosaminas, hidrocarburos aromticos y minerales (As, Cr, Cd y Ni); biolgico, lo
que incluye a sustancias liberadas por parsitos, plantas, o microorganismos, o
que se encuentran en alimentos y medicinas (Flavonoides, taninos, Ochratoxina A,
caspacianina); y gentico (Baba, 2007). Los factores genticos pueden tener
distintos orgenes como son: mutaciones heredas en ciertos genes (genes BRCA1 y BRCA-2), la accin de algunos tipos de virus (Papilomavirus, herpesvirus y
adenovirus), y la liberacin de especies reactivas de Oxgeno ( 1O2 ) y otros
radicales libres (1OH, -NO) durante el metabolismo celular (Baba, 2007; Musolino
et al., 2007; Fiaschi y Chiaruggi, 2012).
2. 3. 1 Cncer de mama
El cncer de mama (CaMa) es causado cuando hay una proliferacin acelerada,
desordenada y no controlada de las clulas de los tejidos de la glndula mamaria,
y es causado por mutaciones que ocurren en los genes que actan normalmente
suprimiendo o estimulando la continuidad del ciclo celular (Rodrguez-Bandala,
2010).
De los tipos de cncer que existen, el CaMa junto con el cncer de prstata, son
de los ms agresivos, ya que hacen metstasis en los huesos y la mayora de los
pacientes mueren cuando esto sucede (Kowalski et al., 2003).
2. 4 Lneas celulares
10
HaCat
Es una lnea celular inmortal de queratinocitos humanos (QHA), cuyas clulas
conservan la capacidad de diferenciarse y crecer de forma semejante al tejido de
la piel humana (NHEQ) (Lehman, 1997). Debido a sus caractersticas las clulas
de esta lnea fueron empleadas como modelo, para ver el efecto del -caroteno en
clulas normales.
11
3 Justificacin
Muchos de los tratamientos contra el cncer en general y no solo de mama, son
altamente invasivos y poseen muchos efectos secundarios. Por ello encontrar
biomolculas de origen natural como el -caroteno producido por D. salina que
puedan actuar como agentes preventivos, o curativos en el tratamiento, ya sea
que inhiban la proliferacin celular descontrolada o puedan inducir la apoptosis de
las clulas neoplsicas, sin causar efectos tan dainos como la quimio o
radioterapia, an es una panacea en la lucha contra todos los tipos de cncer que
existen.
Por otro lado, hay estudios previos que indican que el -caroteno puede ser un
factor que predisponga a algunos tipos de cncer y otros que indican que tiene
una funcin preventiva. Este estudio puede ayudar a probar in vitro si esta
molcula: 1) Tiene un efecto en la supervivencia de las clulas de cncer de
mama y 2) Si su origen sinttico o natural causa alguna diferencia.
4 Hiptesis
12
5 Objetivo General
Demostrar el efecto que tendr el -caroteno de origen natural presente en un
extracto obtenido a partir de la microoalga D. salina en la supervivencia de la lnea
celular MDA-MB-231.
5. 1 Objetivos particulares
-Estandarizar una fase mvil que permita detectar y cuantificar por medio de
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), el -caroteno sinttico (comercial)
y de origen natural.
-Cuantificar el -caroteno natural presente en el extracto natural de D. salina.
-Evaluar el efecto del -caroteno natural y sinttico en la supervivencia de la lnea
celular MDA-MB-231.
-Evaluar si hay un efecto diferencial entre el -caroteno natural y sinttico en la
lnea celular HaCat.
-Observar si el tiempo de incubacin con ambos tratamientos con -caroteno,
tambin causa un efecto sobre ambas lneas celulares.
13
6 Materiales y Mtodos
6. 1 Dunaliella salina
La cepa de D. salina (UTEX LB2538) empleada para este estudio, proviene de un
lugar conocido como La Salina, localizada 35 km al norte de la ciudad de
Ensenada, B.C. (Contreras-Flores, 2005) y forma parte de la coleccin del
laboratorio de Microbiologa Molecular del Centro de Investigacin Cientfica y de
Educacin Superior de Ensenada, B. C. lugar en donde se realiz este trabajo.
14
En donde:
D= Densidad del cultivo en clulas/ml
C= Nmero de clulas en toda una cuadrcula de 1mm2
104= Factor de dilucin
(Voltolina-Lobina et al., 1989).
6. 1. 3. Induccin
Una vez que se logr la fase estacionaria del cultivo, se eligi al cultivo F como
control, mientras que el cultivo L fue tomado como experimental. Al cultivo
experimental (L) se le realizaron incrementos graduales de salinidad en el medio
nutritivo hasta llegar a una concentracin final de 3.0 M NaCl en el matraz y
adems se increment el flujo luminoso a 26 quanta m-2 seg-1 sin alterar la
temperatura. Al cultivo control F, no se le alteraron las condiciones iniciales. Esta
fase tuvo una duracin de 28 das.
Cuadro I. Incrementos en la concentracin de NaCl realizados en el cultivo L
Da de cultivo
NaCl adicionado
12
1.5 M
2.61 g
15
2.0 M
1.46 g
18
2.5 M
1.32 g
21
3.0 M
1.61 g
15
6. 2 Betacaroteno
En este estudio se emplearon dos fuentes de -caroteno: Una de origen natural
contenido en un extracto de D. salina obtenido con solventes orgnicos; cuya
elaboracin no se describe ampliamente por motivos de patente. El segundo tipo
fue -caroteno trans de origen sinttico, fabricado por la empresa Sigma.
6. 3. 1 Condiciones de crecimiento
Para su crecimiento, las lneas HaCat y MDA-MB-231 (ATTC HTB-26) fueron
sembradas en cajas de cultivo (Corning) con 7 ml
(GIBCO)
16
6. 3. 3. Curva de crecimiento
Para estimar la cantidad de clulas adecuada para realizar el ensayo con caroteno fue necesario obtener una curva de crecimiento basada en la
confluencia. Para esto se utiliz una placa de cultivo de 96 pozos (Corning), en
donde se colocaron en cada pozo, diferentes cantidades de clulas de MDA-MB231 (1000, 2000, 3000, 4000 y 5000) en 100 l de medio RPMI suplementado, las
cuales fueron incubadas durante 4 horas a una temperatura de 70C y una
atmsfera hmeda de CO2 al 4%. Transcurrido ese tiempo, a las clulas se les
realiz el arresto celular, para lo cual se les cambi el medio a RPMI sin
suplementar. Despus con ayuda de un microscopio invertido Axiovert Zeiss se
observ de forma visual la confluencia celular. De inmediato, las clulas
nuevamente fueron incubadas durante 20 horas bajo las mismas condiciones de
crecimiento. Al cabo de ese tiempo la confluencia fue revisada nuevamente.
17
cumpliera un tiempo previo al arresto celular (Cuadro II). El ensayo fue realizado
en multi-placas para cultivo celular de 96 pozos (Corning), en los que se
colocaron 5,000 clulas del linaje celular correspondiente, y a las que se les
aplicaron 100 l de cada uno de los dos tratamientos de -caroteno con sus
respectivas condiciones. Como control positivo se utiliz DMSO al 100% y como
control negativo medio RPMI sin suplementar. El ensayo se realiz en condiciones
de oscuridad, por triplicado para cada tratamiento y condicin, a 37C en una
atmsfera hmeda con 4% de CO2. Para medir el efecto del -caroteno de origen
natural y sinttico en la supervivencia celular, fue llevado a cabo el ensayo
colorimtrico de MTT, de acuerdo al mtodo de Pitones-Rubio y Olmos-Soto
(2010) (Ver Anexos III y IV).
Cuadro II. Esquema general del ensayo con -caroteno
Lnea celular
MDA-MB-231
HaCat
24 h
2. -caroteno sinttico
2h
24 h
-caroteno natural
-caroteno sinttico
2h
2h
24 h
24 h
18
19
7 Resultados
500000
400000
Cultivo F
300000
Cultivo L
200000
100000
0
1
12
Da de Cultivo
20
7.2 -caroteno
21
22
23
Fuente de
-caroteno
(g/l)
ES1
0.5
227.682
ES2
0.75
673.028
ES3
1.5
1759.24
ES4
3518
BN1
0.64
513.841
BN2
2.95
3511.8
BN3
4.21
5150.46
24
6000
y = 1298.6x - 322.26
R = 0.998
5000
Estndar
sinttico
4000
BN1
3000
BN2
2000
BN3
1000
0
0
25
MDA-MB-231
Clulas/ml
Confluencia 4h
Confluencia 20h
1000
10%
20%
2000
15-20%
35%
3000
20-25%
50%
4000
30-35%
65-70%
5000
40-45%
85-90%
26
1148.3 con un valor de P=4.45e-6 (P <0.05). Esto demostr que la diferencia fue
estadsticamente significativa entre tratamientos (Ver Figura 11 en Anexo 5). Al
comparar contra el control interno de la propia lnea celular MDA-MB-231 (control
negativo) nuevamente existi diferencia significativa. Adems la diferencia ms
grande se present en las clulas tratadas con -caroteno natural.
Por medio de una cuarta comparacin entre ambas lneas celulares (MDA-MB-231
y HaCat) tratadas con -caroteno (natural y sinttico) durante 24h, se tuvo una
F=55.526 con una P= 1.065e-6 (P<0.05); por lo que nuevamente se encontr una
diferencia estadsticamente significativa. Esto se puede observar con mayor
detenimiento en la Figura 13, en donde se ve una marcada diferencia entre grupos
y en el caso de MDA-MB-231 entre tratamientos.
7. 4. 2 Tratamiento de -caroteno: 24 horas
En las clulas de MDA-MB-231 que fueron sometidas al de -caroteno natural
durante 24h, hubo una supervivencia del 70.98%; mientras que al ser tratadas con
el de origen sinttico fue de un 96.74% (Figura 9). Al realizar el ANDEVA se obtuvo
una F=474.32 con un valor de P=2.63e-6 (P<0.05), por lo que existi una
diferencia entre ambos tratamientos (Ver figura 14 en Anexo V). Al comparar
nuevamente contra el control interno de la lnea celular, nuevamente existi
diferencia significativa, y la diferencia ms grande se present entre las clulas
MDA-MB-231 control interno y las tratadas con -caroteno natural, corroborando el
27
28
120
% Supervivencia
100
80
etacaroteno Natural
60
Betacaroteno Sinttico
40
Control
20
0
24 horas
2 horas
Figura 9. Resultados del ensayo de viabilidad celular realizado con -caroteno sobre
MDA-MB-231.
120
Supervivencia (%)
100
80
etacaroteno Natural
60
Betacaroteno Sinttico
40
Control
20
0
24 horas
2 horas
29
8 Discusin
Los resultados obtenidos en el ensayo mostraron un claro efecto del -caroteno de
origen natural sobre las clulas de cncer de mama MDA-MB-231, y que adems
fue significativamente mayor con respecto al efecto que caus el trans -caroteno
de origen sinttico. Con base en este resultado podramos platearnos la siguiente
pregunta: De qu forma puede interactuar la molcula de -caroteno con las
clulas cancergenas para causarles una disminucin de su supervivencia? Una
forma podra ser por medio de su actividad antioxidante (Dimitrov et al., 1988;
Bendich y Olson, 1989; Mnguez-Mosquera et al., 2008).
Las ROS tienen un papel importante durante el desarrollo del cncer, activando o
inhibiendo la actividad de distintos proto-oncogenes y genes supresores de
tumores. Un caso es el del oncogen Myc, que en presencia de ROS es sobreexpresado en las clulas de cncer. Myc es un regulador central del crecimiento
30
Por otro lado, Minguez-Mosquera (2008) adems de otros autores, mencionan que
los carotenoides pueden, tener una actividad anticancergena sin actuar como
antioxidantes; interactuando directamente con receptores celulares que se
encuentran embebidos en las membranas celulares (Bendich y Olson, 1989;
31
Lamson y Brignall, 1999; Heber y Lu, 2002. A su vez, esos receptores celulares
podran intervenir en la sealizacin para la progresin del ciclo celular, evitando la
proliferacin caracterstica del cncer (Heber y Lu, 2002). Si esto ocurri en el
ensayo realizado, uno de los receptores involucrados podran ser Cadherina-11 y
E-cadherina.
32
33
9 Conclusiones
-Fue posible inducir la -carotenognesis en D. salina por medio de estrs salino
bajo condiciones de laboratorio.
-El -caroteno obtenido a partir de D. salina tuvo in vitro una actividad negativa en
la supervivencia de las clulas cancergenas MDA-MB-231 en todos los
tratamientos.
-El -caroteno trans
34
10 Recomendaciones
-Optimizar las condiciones de cultivo y de estrs para D. salina.
-Obtener cultivos masivos de D. salina para lograr una mayor produccin de caroteno en menos tiempo.
-Confirmar el efecto del -caroteno producido naturalmente por D. salina en otras
lneas celulares de cncer.
-Estudiar los mecanismos mediante los cuales el -caroteno de origen natural
puede interactuar con las clulas de cncer..
-Estudiar las rutas metablicas que inducen la -carotenognesis en D. salina
desde un punto de vista gentico, con el fin de generar cepas superproductoras del pigmento.
35
Bibliografa
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CICESE. 60 pp.
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Estados Undos.640 pp.
World Cancer Report. 2008. World Health Organization. International Agency
for Research on Cancer. Francia. 508 pp.
40
ANEXO I
Cultivo de D. salina
a) Medio nutritivo
Cantidad
500 ml
500 ml
41
Cantidad
Concentracin final
12 ml
NaNO3
0.1955 g/l
2.3 mM
Na2HPO47H2O
0.9511 g/l
6.7 mM
NaCl
23 g/l
1M
1 ml
42
Cantidad
Concentracin
Concentracin
Solucin Stock
final
NaNO3
1 ml
880 M
NaH2PO4H2O
1 ml
36 M
1 ml
para F/2
NaCl
23 g/l
Solucin de Vitaminas
1 ml
1M
para F/2
43
Na2EDTA2H2O
0.75 g/l
2 mM
FeCl36H2O
0.097 g/l
0.36 mM
MnCl24H2O
0.041 g/l
0.21 mM
ZnCl2
0.005 g/l
0.037 mM
CoCl2
0.002 g/l
0.0084 mM
Na2MoO42 H 2O
0.004 gl
0.018 mM
Cantidad
Vitamina B12
44
Cantidad
Concentracin final
ZnSO47H2O
23 mg/500 ml
0.08 M
MnSO4H2O
152 mg/500 ml
0.9 M
Na2MoO42H 2O
7.3 mg/500 ml
0.03 M
CoSO47H2O
14 mg/500 ml
0.05 M
CuCl22H 2O
6.8 mg/500 ml
0.04 M
Fe(NH4)2(SO4)26H2O
4.6 mg/500 ml
11.7 M
Na2EDTA2H2O
4.4 mg/500 ml
11.6 M
Cantidad
Vitamina B12
Biotina
Tiamina
45
ANEXO II
Soluciones y medios empleados para el cultivo de las lneas celulares
a) Solucin PBS
Para preparar una solucin de PBS 10X se deben mezclar en 950 ml de agua
destilada, los componentes mostrados a continuacin:
Cuadro XII. Componentes del buffer PBS
Reactivo
NaCl
KCl
Na2HPO4
KH2PO4
Cantidad
8g
2g
17 mg
1.63 g
Posteriormente, se debe titular hasta llegar a pH 7.4 con HCl NaOH, llevar a 1L
con agua destilada y esterilizar a 15 lb de presin durante 30 minutos en
autoclave.
b) Verseno
Para preparar 60 ml, se debe pesar el EDTA y disolverlo en PBS estril en
constante agitacin.:
Cantidad
0.0228 g
60 ml
Una vez preparada la solucin, esta debe ser esterilizada por medio de un filtro
Millipore de 0.2 m.
46
Cantidad
45 ml
5 ml
500 l
47
Anexo III
Ensayo con -caroteno
a) Solucin -caroteno natural
Para preparar las soluciones de -caroteno natural:
1. Se mezclaron en un tubo falcon de 15 ml los componentes enumerados en la
siguiente tabla:
Cantidades
100 l
40 l
12 l
248 l
2.6 ml
3 ml
48
Reactivos
CH3Cl2
DMSO
-caroteno trans
EtOH
Medio RPMI-1640
Sin suplementar
Volumen final
Cantidades
50 l
20 l
18 mg
112 l
2800
3 ml
49
Anexo IV
Ensayo colorimtrico de MTT
25 mg
PBS estril
5 ml
50
ANEXO V
Resultados del ANOVA realizado con el programa R
1.
Comandos empleados en R, y resultados obtenidos en el tratamiento de 2
Horas con -caroteno para cada lnea celular
a) MDA
>y1=c(.249, .258, .264)
y>2=c(.107, .108, .109)
>y=c(y1,y2) >n=rep(3,2)
>group=rep(1:2,n)
>data=data.frame(y=y,group=factor(group))
>fit=lm(y ~ group,data)
>anova(fit)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.033302 0.033302 1148.3 4.524e-06 ***
Residuals 4 0.000116 0.000029
Signif. codes: 0 *** 0.001 ** 0.01 * 0.05 . 0.1 1
51
52
53
Figura 13. Variacin dentro de grupos con el tratamiento de 2h con caroteno: 1)MDA-MB-231 con BS 2)MDA-MB-231 con BN, 3)HaCat con BS,
4)HaCat con BN.
2.
54
c) Hacat
>y1=c(.246, .216, .228) >y2=c(.228, .216, .217)
Analysis of Variance Table
Response: y
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
group
1 0.00014017 0.00014017 1.0294 0.3677
Residuals 4 0.00054467 0.00013617
55
Figura 16. Variacin entre grupos con el tratamiento de 24h con caroteno. Clulas MDA-MB-231 con BS, 2) Clulas MDA-MB-231 con
BN, 3)Clulas HaCat con BS, 4) Clulas HaCat con BN
56