Ana Tereza Barufi Franco PDF

UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE
PROGRAMA DE PS GRADUAO STRICTU SENSU
ANA TEREZA BARUFI FRANCO
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTNCIA SOBRE CLULAS

ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS LESO POR VENENO DA
SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA.
SO PAULO
2013
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTNCIA SOBRE CLULAS ENDOTELIAIS tEND SUBMETIDAS LESO POR
VENENO DA SERPENTE BOTHROPOIDES JARARACA
UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO - UNINOVE

PROGRAMA DE PS GRADUAO STRICTU SENSU
ANA TEREZA BARUFI FRANCO
EFEITO DO LASER DE BAIXA POTNCIA SOBRE CLULAS ENDOTELIAIS

tEND
SUBMETIDAS
LESO
POR
VENENO
DA
SERPENTE
BOTHROPOIDES JARARACA.
Dissertao de mestrado apresentada ao Programa

de Ps-Graduao em Medicina da
Universidade Nove de Julho, como requisito
para obteno do ttulo de Mestre em Medicina.
Orientador: Prof. Dra. Stella Regina Zamuner.
SO PAULO
2013
Se enxerguei mais longe, foi porque estava sobre os ombros de gigantes.

(Isaac Newton).
Por que o homem quer subir a montanha mais alta do mundo?

Ora, a resposta a mais simples possvel, porque ela est l.
O desafio uma virtude inerente ao ser humano.
Foi assim que me senti diante da proposta de realizar este trabalho.
Como algo totalmente novo, abracei esse repto, com o doce sabor de aventura
e de fascinao, diante s novas sendas abertas por essa jornada atravs das
fronteiras do conhecimento e da habilidade humana.
DEDICATRIA
Deus, pela minha vida e pela paz e fora nos momentos

em que me encontrei incapaz de prosseguir.
Dedico esta tese s pessoas mais importantes para mim,
minha amada me Maria Teresinha, e ao meu amado pai Walter,
principais responsveis pela minha vida e a quem devo meu
carter e disciplina ao trabalho; e ao meu querido namorado
Eduardo, sempre paciente e generoso em meus momentos de muito
estudo e ausncia.
Ofereo este trabalho em memria do meu av Antonio, que
sempre me guiou ao sucesso e sempre confiou em minha
capacidade e que agora se encontra junto a Deus.
Esta
dedicatria
se
estende
tambm
minha
amiga,
professora e orientadora Dr. Stella Regina Zamuner. A esta devo

a confiana em minha capacidade como pesquisadora, alm da
pacincia e tranquilidade para me transmitir os ensinamentos da
pesquisa.
AGRADECIMENTOS
Universidade Nove de Julho, que aceitou me receber no

programa de Mestrado e acreditou no meu profissionalismo;
PROSUP/CAPES, pela bolsa de estudos;
professora Silvia Fernanda Zamuner, que muito me auxiliou
nos experimentos e na melhor compreenso de nossos questionamentos;
s minhas queridas alunas Luciana e Aline, que muito me
ajudaram desde o incio e me ensinaram toda a base cientfica que hoje
eu possuo. E tambm pelos momentos alegres, de compreenso e
amizade.
s minhas irms, Carolina, Ana Olvia e Malu pelo apoio.
Aos meus sobrinhos, Maria Eduarda e Antonio, pelos momentos
alegres e de distrao.
Aos demais familiares que sempre me incentivaram e torceram
pela minha vitria.
Aos amigos de Mestrado, de modo especial Vera, Elis, Beatriz,
Fernanda, Gabriela e Vincius pelo apoio sincero e pela agradvel
companhia.
E a todas as pessoas que direta ou indiretamente colaboraram
para o sucesso deste trabalho.
RESUMO
As serpentes do gnero Bothrops e Bothropoides so as responsveis
pelo maior nmero de acidentes ofdicos no Brasil, apresentando efeitos
sistmicos graves, alm de induzirem um quadro fisiopatolgico caracterizado
por reaes locais como edema, mionecrose, dor e hemorragia. A utilizao do
soro antibotrpico desempenha a funo de neutralizar a maior quantidade
possvel do veneno circulante, minimizando assim seus efeitos sistmicos,
porm sua ao no se estende as manifestaes locais. A laserterapia de
baixa potncia uma alternativa de tratamento em situaes de leso local,
devido a seus efeitos biolgicos, sendo considerado um recurso bioestimulante
em tecidos. O objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do laser de baixa
potncia vermelho- comprimento de onda de 660 nm; e o laser infravermelhocomprimento de onda 780 nm, em monocamada de clulas endoteliais
submetidos leso por veneno de Bothropoides jararaca. Os resultados
obtidos mostraram que o veneno, afetou a integridade das monocamadas de
clulas endoteliais em todas as concentraes analisada (5, 10, 12,5, 25 e
50L/mL) em todos os perodos de tempo analisados. Para avaliao do efeito
protetor do laser, a dose usada de 4 J/cm2 reduziu o descolamento de clulas
endoteliais melhorando assim a integridade celular. Esse efeito foi observado
nos comprimentos de onda de 660 nm nos tempos de 60 e 120 min, o mesmo
efeito no foi observado com o comprimento de onda 780 nm. Desta forma,
este
estudo
permitiu
entender melhor os efeitos fisiopatolgicos
do
envenenamento botrpico, bem como contribuiu para a melhor compreenso

dos efeitos do laser de baixa potncia e, eventualmente, favorecer medidas
teraputicas mais eficientes e/ou complementares.
Palavras chaves: endotlio, Bothropoides jararaca, laser de baixa potncia.
ABSTRACT
The Bothropoides and Bothrops gender are responsible for the largest
number of snakebites in Brazil, presenting serious systemic effects that induce
pathophysiological alterations characterized by local reactions such as edema ,
myonecrosis, pain and hemohrrage. The antivenom is used to neutralize the
greatest possible amount of circulating venom, minimizing its systemic effects.
But its action does not extend to local manifestations. The low level laser
therapy is an alternative treatment in situations of local lesions due to its
biological effects, and is considered a biostimulate resource to the tissues . The
aim of this study was to analyze the effect of low power laser -red wavelength of
660 nm, and the infrared laser- wavelength 780 nm, in endothelial cells
submitted to injury by Bothropoides jararaca venom. The results showed that
the snake venom affected the integrity of endothelial, in all concentrations (1, 5,
10, 12,5, 25 and 50 g/mL); and affected the viability of endothelial cell in 10
g/ mL at all time periods analyzed . To evaluate the protective effect of the
laser, the dose of 4 J/cm2 reduced the detachment of endothelial cells by
improving cellular integrity . This effect was observed in a wavelength of 660 nm
at 60 and 120 minutes. The same effect was not observed with the wavelength
of 780 nm. So, the present study allowed us to better understand the
pathophysiological effects of Bothropoides venom, and contributed to a better
understanding of the effects of low power laser and eventually facilitate
therapeutic measures more efficient and / or complementary.
Keywords : endothelium , Bothropoides jararaca, low level laser
NDICE
Contedo
Pgina
Resumo
1.Introduo
06
1.1.Acidentes ofdicos e epidemiologia
06
1.2.Mecanismos de ao do veneno botrpico
08
1.3.A serpente Bothropoides jararaca
09
2.Consideraes gerais sobre o endotlio vascular

2.1.O veneno botrpico e as clulas endoteliais
14
16
3.Soroterapia
17
4. Terapia com laser de baixa potncia
20
4.1. LBP e acidentes ofdicos
21
4.2. Laser e clulas em cultura
22
5. Objetivos
24
5.1. Geral
24
5.2. Especficos
24
6. Material e Mtodos
25
6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj)
25
6.2. Clulas endoteliais (CE)
25
6.3. Cultivo Celular
25
6.4. Irradiao laser de baixa potncia
26
6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT)
28
6.6.
29
Ensaio para a avaliao da integridade da monocamada de clulas
endoteliais Descolamento Celular

6.7. Anlise da liberao da lactato desidrogenase (LDH)
29
7. Anlise estatstica
31
8. Resultados e Discusso
32
8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de clulas
32
endoteliais tEND
8.2. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de clulas
34
endoteliais tEND
8.3. Efeito da exposio do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potncia
36
na integridade das clulas endoteliais tEND.

8.4. Efeito da exposio do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa Potncia
na viabilidade das clulas endoteliais tEND.
38
8.5. Efeito do Laser de Baixa Potncia 660 nm na integridade de clulas
40
endoteliais submetidas leso por veneno B. jararaca.

8.6. Efeito do Laser de Baixa Potncia 780 nm na integridade de clulas
42

8.7. Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 660 nm na viabilidade de clulas
8.8. Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 780 nm na viabilidade de clulas
8.9. Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 660 nm na liberao da enzima
Lactato Desidrogenase (LDH) de clulas endoteliais submetidas leso por
veneno B. jararaca.
8. 10. Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 780 nm na liberao da enzima
Lactato Desidrogenase (LDH) de clulas endoteliais submetidas leso por
veneno B. jararaca.
44
46
48
50
9.Discusso
52
10. Consideraes Finais
59
11. Referncias Bibliogrficas
60
1. INTRODUO
1.1.
Acidentes ofdicos e epidemiologia
Acidente ofdico ou ofidismo o quadro de envenenamento decorrente

da inoculao de toxinas atravs do aparelho inoculador de serpentes. Devido
ao grande nmero de casos, os acidentes causados por serpentes
peonhentas constituem, ainda, um problema de Sade Pblica em regies
tropicais do mundo (Chippaux, 1998; Moura da Silva, 2012).
No Brasil, o primeiro estudo epidemiolgico de acidentes ofdicos foi
realizado por Vital Brasil em 1901, quando levantou o nmero de bitos por
picadas de serpentes peonhentas no Estado de So Paulo, registrando um
nmero considervel de bitos por acidentes ofdicos desde 1900 (Bochner et
al, 2003), devido ao agravamento do quadro aps o envenenamento, conforme
Tabela 1.
As serpentes responsveis pelo maior nmero de acidentes ofdicos na
Amrica Latina pertencem ao gnero Bothrops e Bothopoides, da famlia
Viperidae (Moura da Silva, 2012), e por esse motivo, esse gnero constitui o
grupo mais importante, com mais de 60 espcies em todo o territrio e pode
ser encontrada em ambientes diversos. Segundo registros das ocorrncias
anuais, as serpentes do gnero Bothrops e Bothropoides so responsveis por
mais de 90% dos acidentes ofdicos no Brasil (Chippaux, 1998; Moura da Silva,
2012), sendo que a maior frequncia desses acidentes envolve a serpente
Bothropoides jararaca (Nishijima et al, 2009).
Tabela 1. Acidentes ofdicos e suas respectivas gravidade
Extrado de: Extrado de: Ministrio da Sade- Acidentes ofdicos

http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/gve_7ed_web_atual_aap.pdf
Com relao ao gnero Bothrops e Botropoides, os acidentes

causados por essas serpentes no apresentam alta letalidade (0,31 %), porm
devido
alta
incidncia,
so
consideradas
de
grande
importncia
epidemiolgica no pas (Manual de diagnstico e tratamentos de acidentes por

animais peonhentos, 1999), conforme exemplificado na figura.
Figura 1 Acidentes ofdicos ocorridos no Brasil.
1.2.
Mecanismo de ao do envenenamento botrpico
Os venenos ofdicos constituem uma mistura complexa de protenas e

outros compostos, com as mais diversas propriedades biolgicas. Acredita-se
que os seus efeitos resultem da somatria dos efeitos isolados dos vrios
componentes, com atividades biolgicas distintas ou sinrgicas (Takeya et al.,
1990; Zychar et al., 2010; Bruserund, 2013).
O envenenamento pela espcie Bothrops e Bothropoides leva a
manifestaes sistmicas e locais, as quais incluem desde dor e edema
insuficincia renal e choque hipovolmico (Warrell, 1996; Doin-Silva, et al.,
2009; Milani Junior, et al., 1997; Carneiro, et al., 2002; Zychar et al., 2010;
Bruserund, 2013).
Dentre as manifestaes aps o envenenamento, aquelas locais se
evidenciam nas primeiras horas aps a picada com a presena de edema, dor
e equimose na regio da picada, que progride ao longo do membro acometido.
8
Alm disso, as marcas nem sempre so visveis no momento da picada, assim

como o sangramento nos pontos de inoculao das presas. Bolhas com
contedo seroso ou serohemorrgico podem surgir na evoluo e dar origem
necrose cutnea. As principais complicaes locais so decorrentes da
necrose e da infeco secundria que podem levar amputao e/ou dficit
funcional do membro (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).
As manifestaes sistmicas so evidenciadas por sangramentos em
pele e mucosas (gengivorragia, equimoses distncia do local da picada);
hematria, hematmese e hemorragia em outras cavidades podem determinar
risco ao paciente. A hipotenso, tambm presente, pode ser decorrente de
sequestro de lquido no membro picado ou hipovolemia consequente a
sangramentos, que podem contribuir para a instalao de insuficincia renal
aguda (Chippaux, 1998; Warrell, 1996).
1.3 A serpente Bothropoides jararaca (B. jararaca)

A serpente Botropoides jararaca anteriormente classificada como
Botrhops jararaca apresenta porte mdio, podendo atingir at 1,5 m, com
presena de escamas superiores fortemente quilhadas. As espcies desse
gnero so encontradas em todo o Brasil e tambm nas regies adjacentes ao
Paraguai e Argentina (Barraviera, 1993), conforme figura 2 abaixo:
Maior prevalncia B. jararaca
Figura 2 Distribuio geogrfica da B. jararaca

extrada de:www.cobrasbrasileiras.com.br
O veneno da serpente B. jararaca consiste de uma mistura complexa

de vrias classes de toxinas, sendo que a maior parte consititui-se de
metaloproteinases (Moura-da-Silva, et al., 2012). Diferentemente de outros
venenos botrpicos, o veneno de B. jararaca apresenta concentraes muito
baixas de fosfolipase A2 e/ou miotoxinas; outra classe de protease presente no
veneno de B. jararaca so as serinoproteases, as quais so capazes de induzir
a liberao de bradidinina (Moura da Silva et al, 2012).
Nesse sentido, o gnero B.jararaca possui veneno com maior atividade
proteoltica em comparao aos demais venenos, sendo demonstrado por
estudos que a hemorragia consiste na maior atividade txica do veneno de
jararaca (Nishijima et al., 2009; Teixeira et al., 2005; Baldo et al., 2010; Mourada-Silva, et al., 2012).
10
A literatura sugere que metaloproteinases do veneno da serpente

(SVMPs) so responsveis pela hemorragia local no envenenamento ofdico
(Baramova et al., 1989; Kamiguti, 1996; Nishijima et al., 2009; Teixeira et al.,
2005; Baldo et al., 2010; Moura-da-Silva, et al., 2012).
Ainda, as SVMPs
possuem efeito citotxico sobre as clulas endoteliais, atuando principalmente

no sistema homeosttico (Nishijima et al, 2009).
Assim, a patogenicidade envolvida no envenenamento por B. jararaca
inclui a
leso de vasos da microcirculao,
atravs da ao das
metaloproteinases do veneno ofdico, as quais pertencem uma subfamlia de

enzimas Zn2+-dependentes (Teixeira et al, 2005; Nishijima et al, 2009; Brenes
et al., 2010; Domingos et al, 2013). A leso dos vasos ocorre quando h
inoculao do veneno, que contm dentre outros componentes, SVMPs,
astacinas e serralisinas, classficadas conforme a figura 03, e que agem na
matriz celular por possurem elevada afinidade com a mesma (Teixeira et al,
2005; Baldo et al, 2010), desencadeando os efeitos miotxicos
11
Figura 3: Classificao das Metaloproteinases de venenos.
Extrado de Fox et al., 2008

Dados da literatura indicam que as SVMPs atuam sobre protenas da
matriz extracelular, com diferentes especifidades. Considerando que as
protenas presentes na matriz so importantes para manter a integridade
estrutural e funcional do endotlio, foi proposto que a degradao dos seus
componentes pelas metaloproteinases de venenos poderia ser o principal
mecanismo envolvido na produo de hemorragia, atravs da protelise da
membrana basal, permitindo a formao de fendas intercelulares, culminando
com a sada de hemcias (Baramova et al,1989; Teixeira et al, 2005; Nishijima
et al, 2009; Baldo et al, 2010).
Ainda, a literatura demonstra que as SVMPs hemorrgicas, com
elevado peso molecular, que so constitudas por domnios semelhantes de
disintegrina e domnios ricos de cistena, so mais ativas na induo
hemorragia em comparao enzimas que abrangem apenas o domnio de
metaloproteinases (Teixeira et al, 2005; Brenes et al., 2010). Ademais, a
12
atividade hemorrgica tem sido associada, tambm, com a atividade

proteoltica (Teixeira et al, 2005), as quais promovem degradao estrutural e
funcional presente na mionecrose (Baldo et al, 2010).
Diante disso, as clulas endoteliais tm sido estudadas como
potenciais alvos das toxinas hemorrgicas (Baldo et al, 2010) sendo que o
principal mecanismo de adeso de clulas endoteliais pode ser interrompido
pela presena de SVMPs, utilizando de mecanismos dependentes ou
independentes de sua atividade proteoltica. Tanto as SVMPs hemorrgicas
quanto as no hemorrgicas demonstraram interferir nos componentes
envolvidos na adeso entre as clulas endoteliais e as protenas presentes na
matriz extracelular, culminando na morte celular por apoptose (Teixeira et al,
2005).
Em
estudos experimentais,
as
SVMPs
hemorrgicas
no-
hemorrgicas so capazes de induzir comparvel taxas de apoptose em

clulas endoteliais, e o aparecimento da hemorragia induzida pelas SVMPs
ocorre muito mais cedo do que a induo de apoptose de clulas endoteliais in
vitro. (Baldo et al, 2010).
Dentre as SVMPs presentes no veneno de B. jararaca, entre as
isoladas, a jararagina a que tem sido melhor estudada e pertence ao grupo PIIIb, uma MMP hemorrgica, e atua promovendo o influxo leucocitrio e pode
estimular diretamente a expresso de mRNA dos genes TNF, IL-1 e IL-6, por
macrfagos licitados (Teixeira et al, 2005), o que sugere que os macrfagos
constituem de alvos importante do mecanismo envolvido na ao decorrente
das SVMPs no processo inflamatrio (Teixeira et al, 2005; Baldo et al, 2010).
A jararagina foi a primeira SVMPs isolada do veneno da B. jararaca e
foi caracterizada por completo sua estrutura primria, mostrando que atua
13
diretamente nos vasos sanguneos endoteliais e sub-endoteliais, na matriz

proteica, plaquetas, coagulao, fatores como Fator de von Willebrand (vWF) e
fibrinognio. Ainda, atua sobre os receptores da superfcie das clulas e sobre
os fibroblastos, clulas epiteliais e inflamatrias, sendo capaz de promover a
degradao da fibrina e aumento da fibrinlise devido ao aumento da atividade
ativadora do plasminognio tecidual e inativao do inibidor de 2 plasmina,
alm de interferir na funo plaquetria atravs da inibio de colgeno e na
agregao de plaquetas induzida por ristocetina (Moura-da-Silva et al., 2012).
Ademais, Baldo et al. (2010), buscou comparar os efeitos hemorrgicos
imediatos entre a SVMPs BnP1, extrada da B. neuwiedi, pertencente ao grupo
P-Ia e, portanto, considerada de baixo potencial hemorrgico, e a jararagina, na
pele de camundongos. Esse estudo teve por objetivo avaliar as alteraes
provocadas entre as SVMPs. A jararagina foi capaz de produzir um efeito
hemorrgico intenso, enquanto que mesmo as doses mais elevadas de BnP1
no foi capaz de produzir efeito comparvel. Ainda, este trabalho mostrou que
a jararagina causa leso hemorrgica na hipoderme dos animais, indicando
degradao massiva de colgeno fibrilar e que a jararagina foi localizada
prximo aos pequenos vasos sanguneos. (Baldo et al, 2010).
2. CONSIDERAES GERAIS SOBRE O ENDOTLIO VASCULAR

O endotlio vascular constitudo por uma camada contnua de clulas
clulas endoteliais - que revestem o lmen dos vasos e separam o sangue
dos tecidos. A sua integridade funcional e estrutural fundamental para a
manuteno da homeostasia e da funo circulatria (Carvalho, 1996).
14
As clulas endoteliais de um modo geral so alongadas, poligonais e

dotadas de ampla superfcie. A parte luminal est continuamente exposta s
clulas circulantes e aos componentes plasmticos. A poro oposta,
abluminal, est em contato com a matriz extracelular e tecidos adjacentes, que
por meio de integrinas, liga-se a lamina basal. Esta constituda por vrios
tipos de colgenos (tipo IV, V e VII), laminina, sulfato de heparan e de
condroitina,
proteoglicanos,
entactina,
nidognio
sialoglicoprotenas,
associados fribonectina. Dado o alto teor de colgeno, a lmina basal pode

ser digerida por colagenases (Carvalho et al., 1996).
O endotlio alm da sua funo como membrana semipermevel,
considerado um tecido metabolicamente ativo. Por sua capacidade de sintetizar
e secretar inmeras substncias exerce vrias funes fisiolgicas: a) no
metabolismo de substncias vasoativas, por conter enzimas que transformam a
angiotensina I em angiotensina II e inativam a noradrenalina, serotonina e
bradicinina; b) na hemostasia, por meio da produo de substncias
coagulantes
(fator
de
Von
Willebrand;
inibidor
de
plaminognio)
anticoagulantes, como a prostaciclina (PGI2) c) na produo de antgenos dos

grupos A e B, fibronectina, colgenos d) na modulao do tnus vascular, por
sua capacidade de produzir e liberar fatores relaxantes da musculatura lisa dos
vasos, como o xido ntrico (NO) (Moncada, et al., 1988; Moncada et al., 1991).
Por outro lado as clulas endoteliais sofrem alteraes de estrutura,
funo e propriedades metablicas, em resposta a fatores de crescimento,
substncias vasoativas e citocinas, que variam de acordo com o tecido em que
se localizam (Thuillez, 2005). Desse modo, o endotlio ativado afeta o
15
crescimento do msculo liso, por sua capacidade de gerar diversos fatores de

crescimento que induzem espessamento da parede dos vasos e favorecem o
desenvolvimento de doenas cardiovasculares (Carvalho et al., 1996).
Em sntese, o endotlio, em condies fisiolgicas, desempenham papel
protetor do sistema cardiovascular, liberando substncias que modulam a
contrao do msculo liso vascular, a sua proliferao, a adeso e agregao
plaquetria e controlam a hemostasia. Portanto, em condies de disfuno ou
leso desse tecido, h repercusso sobre a estrutura vascular, tecido adjacente
e, por fim, sobre o sistema cardiovascular.
2.1. O veneno botrpico e as clulas endoteliais

Os
venenos
as
toxinas
hemorrgicas
isoladas
afetam,
principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ownby, 1990;

Borkow et al., 1993). Lomonte et al. (1994) demonstraram que os vasos da
microcirculao perdem a sua integridade em 4 a 6 minutos aps exposio ao
veneno de Bothrops asper. Este efeito foi atribudo, em parte, protelise da
membrana basal dos vasos pelo veneno, levando sada de eritrcitos por
processo ainda no esclarecido. Adicionalmente, os venenos hemorrgicos, de
modo geral, causam uma srie de alteraes morfolgicas e degenerativas em
clulas endoteliais, que progridem at a formao de fendas intercelulares,
permitindo a sada de hemcias (Ownby, 1990; Lomonte et al, 1994). Estes
dados sugerem uma ao direta principalmente das SVMPS, importante para o
desenvolvimento da hemorragia.
16
Ainda, a mionecrose local uma consequncia comum nos

envenenamentos causados pelas serpentes do gnero Bothropoides. H
evidncias de que a mionecrose causada por uma famlia de protenas
denominadas miotoxinas, componentes dos venenos botrpicos, as quais
possuem caractersticas de fosfolipases A2 (PLA2) e atuam diretamente sobre a
membrana da clula muscular, por se ligarem e alterarem a membrana
plasmtica (Gutierrz et al., 1984; Brenes et al., 1987).
Essas miotoxinas
induzem dano tecidual proeminente, de forma que, as alteraes morfolgicas

so observadas a partir de 15 minutos de sua injeo (Gutierrz & Lomonte,
1995). A miotoxicidade pode, ainda, ser consequncia da isquemia dos vasos
da microcirculao e de artrias intramusculares (Gutierrz et al., 1984;
Queirz & Petta, 1984). Neste sentido, um mecanismo adicional envolvido na
atividade das SVMPs hemorrgicas poderia estar relacionado com o acmulo
dessas SVMPs prximo de vasos capilares, atravs das propriedades adesivas
de domnios no catalticos promovendo a hidrlise dos componentes da
membrana basal e o rompimento dos vasos sanguneos. Este mecanismo tem
sido sugerido, mas at o momento no h evidncias experimentais de que
isso ocorre in vivo (Baldo et al, 2010). Ainda, foi demonstrado que a BaP1, uma
SVMP isolada do veneno de B. asper, causa morte celular por apoptose em
clula endotelial mas que aparentemente as clulas endoteliais sofrem outros
tipos de morte celular, o que gera efeitos citotxicos (Brenes et al., 2010).
3. SOROTERAPIA
Devido eficincia dos antivenenos, os coeficientes de letalidade,
decorrentes do envenenamento botrpico, tm revelado tendncia decrescente
17
ao longo do tempo. No entanto, a eficincia do tratamento do envenenamento

botrpico baseada no tempo de adminstrao do antiveneno especfico
(Hansson et al., 2013). Estudos experimentais tm sugerido que existe uma
significante, embora parcial, neutralizao da hemorragia, edema e mionecrose
apenas
quando
antiveneno
administrado
rapidamente
aps
envenenamento (Battelino et al., 2003; Domingos et al, 2013). Neste sentido,

Camey et al (2002), estudaram o efeito farmacolgico do veneno de cinco
espcies botrpicas brasileiras: B. atrox, B. leucurus, B. erythromelas, B.
jararaca e B. jararacussu, e verificaram que o antiveneno foi efetivo na
neutralizao sistmica da atividade txica de todos os venenos testados.
Porm, os efeitos locais no so neutralizados pelo uso de antiveneno e os
mecanismos envolvidos nesta falta de proteo, at o momento, no foi
esclarecido.
Assim, a neutralizao dos efeitos txicos sistmicos obtida, mas a
neutralizao dos danos no tecido local, normalmente no ocorre. Portanto, a
busca de inibidores e/ou neutralizadores complementares soroterapia para
reduo dos efeitos locais causados pelo veneno se reveste de importncia
(Nishijima et al, 2009).
No Brasil, tem sido crescente o interesse em investigar terapias
coadjuvantes soroterapia j existente, embora ainda que insipientes, j
existem estudos que combinam o uso da soroterapia aplicao de extratos de
plantas medicinais e substncias sintticas (Biondo et al., 2003; Cavalcante et
al., 2007).
Nesse sentido, Domingos et al (2013) tem descrito o composto de 1,2,3triazis como uma classe com destaque e presente no sistema heterocclico de
18
azoto de cinco membros, que apresenta diferentes perfis farmacolgicos, tais

como atividade antiplaquetria, anticoagulante, antiviral, antimicrobiana, entre
outras funes e, foi demonstrado que tal composto foi capaz de inibir a
hemlise causada por veneno de B. jararaca (50 ug/ml) e L. Muta (15 ug/ml). A
inibio foi superior a 50% contra ambos os venenos.
Igualmente, Faioli et al (2013), concluiu que os extratos de esponjas
marinhas so capazes de inibir os efeitos in vivo, como hemorragia e edema e
os efeitos in vitro, como a coagulao, atividade proteoltica e hemoltica,
desencadeados pela inoculao dos venenos de serpentes de B. jararaca e L.
muta. Tambm verificaram que a administrao de veneno de B. jararaca foi
letal para camundongos aps duas horas e apenas extratos das esponjas
marinhas, como A. fulva , A. viridis , ou P. citrina, foram capazes de aumentar
as taxas de sobrevivncia dos animais (Faioli et al, 2013), provavelmente pela
capacidade de neutralizao dos efeitos sistmicos. Isso ocorreu devido ao fato
de que os extratos de esponja foram capazes de inibir a hemlise induzida
pelos venenos (Domingos et al, 2013; Faioli et al, 2013; Zychar et al, 2010).
Nishijima et al (2009) descreveu que os extratos vegetais contm uma
grande diversidade de compostos qumicos contendo uma grande variedade de
atividades farmacolgicas e buscou avaliar o potencial efeito anti-hemorrgico
de extratos vegetais e flavonides obtidas a partir de vegetais como Mouriri
pusa, Byrsonima crassa, Davilla elliptica e Quina do Cerrado. Os resultados
sugerem que os extratos metanlicos e flavonides de Mouriri pusa e Davilla
elliptica exerceram grande capacidade de neutralizar totalmente veneno contra
a atividade hemorrgica do veneno de B. jararaca, provavelmente por conter
substncias ricas em flavonides, que serviram como quelantes das SVMPs
19
presente no veneno, sugerindo modelos para a concepo de novas molculas

para melhorar o tratamento atual preconizado para o envenenamento.
Entretanto, qualquer que seja a abordagem teraputica at hoje
disponvel, esta tem se mostrado ineficaz na neutralizao dos efeitos locais
produzidos pelo veneno botrpico, os quais so de evoluo rpida e intensa.
Por esses motivos, a procura por abordagens alternativas s usualmente
empregadas tem sido motivo de interesse e se constituem em medidas
extremamente relevantes para neutralizao e/ou diminuio dos efeitos
degenerativos, bem como a acelerao do processo regenerativo. Outra
possibilidade que comea a ser implementada a utilizao de laserterapia.
4. TERAPIA COM LASER DE BAIXA POTNCIA

A palavra laser uma sigla que corresponde Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation, a qual significa Amplificao da Luz por
Emisso Estimulada por Radiao (Maluf, et al., 2006; Lins et al., 2010).
A ao do laser consiste na absoro da luz pelos tecidos, resultando
em modificaes no metabolismo celular. Quando o laser aplicado nos
tecidos a luz absorvida por fotorreceptores localizados nas clulas, sendo
capaz de modular as reaes bioqumicas especficas dentro da clula e
estimular uma srie de reaes em cadeia mitocondrial, resultando em sntese
de ATP (Dortbudak, 2000; Stein, et al.,2005; Rnno et al.,2011).
A radiao laser, tambm denominada de terapia fotodinmica pode
influenciar as clulas individualmente atravs da energia emitida pelo laser e
absorvida pelas clulas (Hawkins-Evans, 2008; Szymanskj et al., 2013.). As
20
estruturas celulares possivelmente envolvidas nesses mecanismos so as

mitocndrias, as quais fornecem energia para as clulas, e que possuem uma
srie de enzimas que participam nas reaes redox que ocorrem na cadeia
respiratria, e que possivelmente constituem o principal mecanismo envolvido
nas reaes metablicas que ocorrem em uma clula (Szymanskj et al., 2013.).
Adicionalmente, a terapia a laser de baixa potncia (LBP) considerada
como um recurso bioestimulante em tecidos, por meio de seus efeitos
biolgicos, tais como analgsicos, antiinflamatrios e cicatrizantes (Lins, et al.,
2010).
Irradiao por laser de baixa potncia so amplamente utilizados no
tratamento de doenas crnicas e tambm como terapia de reabilitao
(Vladimirov, 2012). O laser vermelho e infravermelho pode ser usado in vitro
para estimular a funo das clulas, por promover um aumento no nmero de
clulas, e estimular a sntese de RNA, promovendo tambm a diferenciao
das clulas (Firestone et al, 2012; Dortbudak, 2000).
Khanna et al (1999), examinaram a influncia de radiao laser de HeNe (632,8 nm) sobre o proliferao celular e sobre fatores angiognicos de
VEGF e secreo de TGF- por cardiomicitos. Os resultados desse estudo in
vitro mostram aumentos estatisticamente significativos na proliferao celular
com potncia de 5 W/cm2 e tempo de radiao de 15 e 20 minutos em
comparao com o grupo de controle. A expresso de VEGF e TGF-
aumentou significativamente quando expostos a 10, 15 e 20 minutos de
radiao com LBP.
Igualmente, o efeito estimulante do LBP tem sido amplamante estudado
sobre proliferao de clulas endoteliais humanas, alm do aumento nos nveis
21
de VEGF e TGF- de secreo (Arany et al, 2007; Hakki et al, 2012; Kipshidze
et al, 2001). As concluses dos estudos demonstram claramente a capacidade
da irradiao com o LBP para modular a expresso do gene e a liberao de
fatores de crescimento e citocinas a partir de clulas em cultura (Khanna et al,
1999).
4.1.
LBP e acidentes ofdicos
At o momento, poucos trabalhos foram publicados utilizando o LBP

para a avaliao do efeito local causado por veneno ofdico. Dourado, et al.,
estudou o efeito da irradiao laser Ga-As (Arseneto de Galium), em
mionecrose, induzida pelo veneno de serpente Bothrops moojeni.
autores
observaram
que
tratamento
com
esse
laser
Esses
diminuiu
consideravelmente a mionecrose, inibindo a habilidade do veneno de desfazer

a integridade da membrana plasmtica (Dourado et al., 2003).
Ainda, Barbosa, et al., demonstraram a eficcia do LBP na resposta
inflamatria local aps leso por veneno de Bothrops jararacussu no msculo
gastrocnmio de ratos, onde foram submetidos laserterapia combinada com
antiveneno, resultando em diminuio de edema e reduo do influxo
leucocitrio aps a leso (Barbosa et al., 2008).
Doin-Silva, et al. (2009),
utilizaram a aplicao do LBP, no msculo tibial anterior de ratos 60 minutos

aps a administrao do veneno de B. jararacussu, e observaram que houve
diminuio na concentrao de creatina quinase e reduo das reas de
mionecrose do msculo.
Ademais, dados do nosso grupo tambm demonstram uma reduo
significativa de mionecrose induzida por veneno de B. jararacussu e as
22
miotoxinas BThtx I e II, aps tratamento utilizando LBP, (Barbosa, et al., 2009;
Barbosa, et al., 2010). Alm disso, demonstramos que o LBP reduz a
hemorragia e dor induzidas pelo veneno de B. moojeni (Nadur-Andrade, 2012,
2013). Estes dados sugerem o LBP como uma ferramenta teraputica eficaz
para o tratamento local em casos de envenenamento botrpico.
4.2.
Laser e clulas em cultura
Ao correlacionar a utilizao do LBP em clulas de cultura, Alghamdi, et

al., (2011), corrobora que o LBP foi capaz de causar aumento no nmero de
clulas, sntese de DNA e RNA e aumento na taxa de ATP em clulas-tronco e
em outras linhagens celular. Ainda, foi sugerido utilizar o valor da densidade de
energia entre 0.5 a 4.0 J/cm2 e um espectro visvel entre 600 e 900 nm de LBP
demonstrando ser teis para melhorar a proliferao celular (Alghamdi, et al.,
2011).
A aplicao do LBP Arseneto de Glio Alumnio em osteoblastos
cultivados em disco de Titnio, utilizando o comprimento de onda de 780 nm e
dose de 3 J/cm2 , demonstrou estimular a diferenciao osteoblstica (Petri, et
a.,l 2010). O uso desta tcnica teraputica demonstrou ser tambm eficaz no
crescimento de clulas epiteliais de rim de macaco cultivado em situao de
carncia nutricional (2% de SFB), quando aplicadas irradiaes repetidas de
LBP (InGaAlP) (Eduardo, et al., 2007).
Por tais motivos, determinar parmetros como comprimento de onda,
densidade de energia, potncia e tempo de aplicao do laser importante
para se obter uma resposta celular adequada ao tratamento. Hawkins et al.
(2006), tambm relataram que a aplicao do LBP apresentou um efeito
23
estimulante na resposta celular de fibroblastos alterados, resultando no

aumento de migrao celular, viabilidade e proliferao celular e atividade de
ATP.
24
5. OBJETIVOS
5.1.
Geral
Analisar a influncia da laserterapia de baixa potncia sobre clulas

endoteliais tEnd, aps leso com o veneno de Bothropoides jararaca.
5.2.
Especficos
Atravs de ensaios in vitro, foram avaliados os efeitos da irradiao laser

de baixa potncia sobre clulas endoteliais submetidas aos efeitos do veneno de
Bothropoides jararaca quanto a:
I- Viabilidade das clulas (MTT);
II- Integridade;
III- Liberao de marcador de leso celular (LDH)
25
6. MATERIAL E MTODOS
Este estudo foi realizado no laboratrio de cultivo celular do curso de
Mestrado em Medicina da Universidade Nove de Julho (UNINOVE).
6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj): Os venenos

utilizado foram extrados de vrios exemplares adultos de serpentes B.
jararaca, provenientes do Instituto Butantan. Os venenos foram reunidos em
um mesmo tubo, homogeneizados, submetidos liofilizao e mantidos a
- 20oC at o momento de sua utilizao.
6.2. Clulas endoteliais (CE): Utilizou-se clulas endoteliais murinas

(hibridomas) da linhagem tEnd (thimic endothelium), gentilmente cedidas pelo
Dr. Bruno Lomonte, do Instituto Clodomiro Picado, da Universidade da Costa
Rica, Costa Rica.
6.3. Cultivo Celular: As CE obtidas foram cultivadas em frascos de

poliestireno de 25 cm (COSTAR), contendo 5 mL de meio de cultura DMEM
(SIGMA), suplementado com soro fetal bovino (SFB) 10%, gentamicina (40
g/mL) e L-glutamina (2 mM/L) e mantidas em incubadora, em atmosfera de
5% C02, a 37C. O meio de cultura foi trocado a cada 24 horas e as clulas
foram, ento, subcultivadas. Para tanto, o meio de cultura DMEM foi aspirado
com pipeta Pasteur e as clulas lavadas com 2 mL de uma soluo salina
balanceada (PBS). Em seguida, 2 mL de uma soluo de tripsina 0.05%/
EDTA 0.02% foram adicionados ao frasco de cultura, o qual retornou estufa
de cultura (5% CO2), a 37C, por um perodo de at 5 minutos. Decorrido esse
26
perodo, as clulas foram observadas ao microscpio de luz invertida (Carl

Zeiss), para a verificao do destacamento das mesmas. Em seguida, as
clulas, tripsinizadas e homogeneizadas, foram colocadas em um tubo de 50
mL (COSTAR) e centrifugadas a 1200 x g, por 5 minutos. O sobrenadante foi
descartado e as CE foram ressuspendidas em meio DMEM/SFB. A partir da,
as clulas foram semeadas em frascos de cultura de 75 cm com meio
DMEM/SFB, previamente ambientalizado na estufa de cultura.
6.4. Condies de tratamento: Os experimentos foram realizados em

um ambiente com obscuridade parcial para no sofrer interferncia da luz
externa. A cultura de clulas endoteliais foram divididas em oito grupos,
conforme tabela abaixo:
Tabela 03- Grupos experimentais e aplicabilidade
NOME
Grupo 1
GRUPOS CELULARES
Controle
TRATAMENTO
Clulas + meio de cultura
DMEM
Grupo 2
Clulas + LBP
Clulas + 660nm
Grupo 3
Clulas + LBP
Clulas + 780nm
Grupo 4
Veneno
Clulas + Veneno Bj
Grupo 5
Veneno irradiado
Veneno irradiado 660nm

+ clulas
Grupo 6
Veneno irradiado
Veneno irradiado 780nm

+ clulas
Grupo 7
Grupo 8
Clulas + Veneno
Clulas + veneno- tratadas
+ Laser
com laser 660nm
Clulas + Veneno
Clulas + veneno- tratadas
+ Laser
com laser 780nm
27
Conforme supracitado, os grupos 1, 2 e 3 foram avaliados como

controle. Para avaliao do efeito do veneno sobre as clulas endoteliais
tEND, foram divididos os grupos 4, em que somente o veneno foi adicionado
s clulas; grupo 5 e 6, em que o veneno foi previamente irradiado a 660nm e
a 780nm, respectivamente, e posteriormente adicionado s clulas, sem
tratamento posterior; no grupo 7 e 8, o veneno sem irradiao foi adicionado
s clulas e as mesmas foram tratadas com o laser a 660nm e a 780nm,
respectivamente.
A cultura foi irradiada imediatamente aps a adio do veneno na
cultura, e foi aplicada, no poo, de forma pontual inferior, de modo a atingir a
monocamada de clulas endoteliais, conforme a figura:
6.4. Irradiao com laser de baixa potncia: Utilizou-se o Laser da

marca DMC modelo Twin Laser, com comprimento de onda de 660 nm,
potncia de 70 mW (densidade de potncia de 105 W/cm2), rea do feixe de
0,028cm2, e, comprimento de onda de 780 nm, potncia de 40 mW
(densidade de potncia de 0,60 W/cm2), rea do feixe de 0,028cm2, em meio
28
ativo de Arseneto de Glio e Alumnio (AsGaAI), com densidade de energia

de 4 joules/cm2 e tempo de 10 segundos, conforme resumo na tabela abaixo:
Tabela 2- Protocolo para aplicao do laser

vemelho e infra-vermelho
Equipamento: Twin Laser
Parmetros
Laser Vermelho
Laser Infra-vermelho
Comprimento de onda (nm)
660
780
Densidade de energia(J/cm2)
Energia total (J)
1,3
Potncia (mW)
70
20
Densidade de Potncia
105
90
rea irradiada (cm 2)
0,3
0,3
rea do feixe (cm2)
0,028
0,028
Modo de aplicao
Pontual
Pontual
Tempo de irradiao (s)
10
10
(W/cm2)
6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT): Aps a incubao das clulas

(1X104cel/poo) com o veneno nas respectivas concentraes (5, 10, 12,5, 25
e 50 g/mL), em meio de cultura (controle), e posteriormente irradiadas e
incubadas por 30, 60 e 120 minutos, foram avaliadas a viabilidade celular pelo
mtodo MTT. As clulas foram lavadas com 200 l de PBS 1X. Em seguida,
foram adicionados 50 l de MTT (0,5 ug/ml em tampo) (3-[4,5-Dimethylthiazol2yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide; Thiazolyl blue SIGMA) e incubadas por
3h a 37C. Terminado o tempo de incubao, a soluo foi removida
cuidadosamente e foram adicionados 100 l de isopropanol para ressuspender
e solubilizar o precipitado. Por fim, ser realizada a leitura da absorbncia a
29
620nm com auxilio de um leitor de placas (2020, Anthos, Eugendorf, ustria)

(Mosmann, 1983).
Aps a determinao da curva dose-resposta, o repetiu-se o mtodo de
viabilidade celular (MTT), utilizando-se a dose de 10l/mL, em grupos divididos
conforme a Tabela 03.
6.6.
Ensaio para a avaliao da integridade da monocamada de
clulas endoteliais Descolamento Celular: As clulas endoteliais foram

plaqueadas 1x104 cel/poo em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas
para adeso celular. Aps esse perodo as clulas receberam o veneno nas
concentraes supracitadas, em meio de cultura (controle) e imediatamente
foram irradiadas com laser, em seguida as clulas foram incubadas por 30, 60
e 120 minutos. Aps cada perodo de incubao, os sobrenadantes das
culturas foram retirados e as monocamadas lavadas com 100 l de PBS 1X.
Em seguida, foram adicionados 40L de cristal violeta (0,5%) em cido actico
(30%) por poo. Decorridos 15 minutos, as placas foram lavadas e colocadas
para secar. A seguir, 100L de metanol absoluto (MERCK) foram adicionados
em cada poo e a leitura da densidade ptica (D.O.) foi realizada em leitor de
ELISA a 620 nm. A leso causada foi definida como a porcentagem de
descolamento celular, observada na monocamada submetida ao do
veneno em relao monocamada endotelial no estimulada pelos mesmos.
6.7. Anlise da liberao da lactato desidrogenase (LDH): A atividade

enzimtica da LDH, presente no sobrenadante das culturas, foi tomada como
parmetro de leso celular (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999; Zhao et al,
30
2013; Wang et al, 2013). Aps cada perodo de incubao, descritos no item
6.5, o sobrenadante foi retirado e centrifugado a 200 x g, por 6 minutos. A
seguir, 20 L do sobrenadante foram adicionados a outras placas de cultura de
96 poos, acompanhados da adio de 130 L do substrato/poo, em tampo
fosfato contendo: NaCl 200mM, NADH 0,2 mM, piruvato 1,6 mM/poo. Foi feita
ento, a leitura da D.O., a 340 nm, no intervalo de tempo entre 0 e 10 minutos.
Os resultados foram expressos pelo decrscimo da D.O., resultante da
oxidao do NADH, na presena de piruvato, em relao ao tempo zero.
31
7. ANLISE ESTATSTICA:
Os resultados obtidos foram expressos como mdia desvio padro da
mdia e analisados estatisticamente pelo teste t de Student ou Anlise de
Varincia (ANOVA), complementado por testes de significncia apropriados.
Os dados foram analisados com auxlio do software GraphPad Prism
5.0, considerando que nos experimentos curva dose-resposta adeso,
viabilidade e descolamento celular foi utilizado o ps teste Dunnet e a
significncia estatstica aceitvel quando p 0,05.
Foram realizados trs experimentos independentes e todas as amostras
foram feitas em triplicata.
32
8. RESULTADOS
8.1.
Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de clulas

endoteliais tEND
A capacidade do VBj em afetar a integridade das monocamadas das

clulas endoteliais tEND, em cultura, foi avaliada pelo descolamento das
monocamadas, aps sua incubao com a tEND, por 30, 60 e 120 minutos, em
diferentes concentraes (5, 10, 12,5, 25 e 50 g/mL) em comparao s
monocamadas contendo apenas meio de cultura (controle). Na concentrao
de 5 g/mL, o veneno causou um descolamento da ordem de 32 %, aos 120
minutos; nos demais perodos de tempo, no houve alterao da integridade
das monocamadas. Nas concentraes de 10, 12,5, 25 e 50 g/mL, o veneno
foi capaz de causar descolamento das monocamadas em todos os perodos de
tempo analisados. No tempo de 120 min as concentraes de 25 e 50 g/mL
causaram um descolamento das monocamadas, que foi estatisticamente
significante, das concentraes 5, 10 e 12,5 g/mL (Fig. 4).
33
Descolamento celular (%)
100
80
60
*
40
20
0
10
12,5
25
50
100
80
60
*#
*
40
10
12,5
20
0
VBj (g/mL)
25
50
VBj (g/mL)
30 min
60 min
100
* # * #
80
60
40
10
20
0
12,5
25
50
VBj (g/mL)
120 min
Figura 4. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de clulas endoteliais

tEND. Clulas endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48
horas para adeso celular. Aps esse perodo, foi adicionado veneno nas concentraes de 5,
10, 25 e 50 g/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos.
A integridade celular foi determinada pelo mtodo Cristal Violeta. Cada valor representa a
mdia EPM de trs experimentos independentes. Anova *p<0,05 vs controle; #p<0,05 vs 5
g/mL; p< 0,05 vs 10 g/mL ; p< 0,5 vs 12,5 g/mL .
34
8.2.
Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de clulas

endoteliais tEND
A viabilidade celular foi avaliada aos 30, 60 e 120 minutos aps a

incubao das clulas tEND com o veneno, em diferentes concentraes (5,
10, 12,5, 25 e 50 g/mL) ou meio de cultura (controle). Os resultados
demonstraram a diminuio estatisticamente significativa na integridade celular
em todas as concentraes (5, 10, 12,5, 25 e 50 g/mL) e nos perodos de
tempo de 60 e 120 minutos, quando comparado com o grupo controle No
tempo de 30 min no houve alterao na viabilidade das clulas quando
incubadas com o veneno. No houve diferena estatstica da viabilidade celular
entre as concentraes estudadas, no tempo de 60 min. Aos 120 min, as
concentraes de 10, 12,5, 25 e 50 g/mL causaram a diminuio na
viabilidade celular em comparao com a concentrao de 5 g/mL (Fig. 5).
35
120
Viabilidade Celular (%)
Viabilidade celular (%)
120
100
80
60
40
20
0
10
12,5
25
100
60
12,5
25
50
40
20
0
50
80
10
VBj (g/mL)
VBj (g/mL)
60 min
30 min
120
100
80
*#
60
*#
*#
40
*#
20
0
10
12,5
25
50
VBj (g/mL)
120 min
Figura 5. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na viabilidade de clulas endoteliais tEND

Clulas endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas
para adeso celular. Aps esse perodo, foi adicionado veneno nas concentraes de 5, 10, 25
e 50 g/mL ou somente meio de cultura (controle) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A
viabilidade celular foi determinada pelo mtodo MTT. Cada valor representa a mdia EPM de
trs experimentos independentes, Anova, *p<0,05 vs controle, # p<0,05 vs 5 g/mL.
36
8.3.
Efeito da exposio do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa

Potncia na integridade das clulas endoteliais tEND.
Para o estudo da ao do laser de baixa potncia, foi escolhida a dose

de 10 g/mL de VBj. Esta foi a concentrao o qual causou um efeito na
integridade e viabilidade das clulas sem ser mximo, sendo que um eventual
efeito do LBP pode ser verificado.
Para avaliar se a irradiao LBP seria capaz de modificar componentes
do veneno, o veneno foi irradiado antes de ser incubado com a tEND. Para
isso, tambm utilizou-se como grupo controle, clulas irradiadas a 660 e
780nm, sem receber inoculao de veneno.
Os experimentos demonstraram que no houve diferena estatstica no
grupo incubado com o veneno e o grupo veneno irradiado, em ambos os
comprimentos de onda, sugerindo que a irradiao no afeta as molculas do
veneno (Fig. 6).
37
100
80
60
40
20
0
laser 660 nm
laser 780 nm
+
Controle
+
-
100
80
60
40
20
0
laser 660 nm
laser 780 nm
VBj (10 g/mL)
+
-
+
-
VBj (10 g/mL)
Controle
30 min
60 min
100
80
60
40
20
0
laser 660 nm
laser 780 nm
+
Controle
+
-
VBj (10 g/mL)

120 min
Figura 6. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado sobre a integridade de clulas

endoteliais. Clulas endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poos e
incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse perodo o veneno foi
previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660 nm e 780 nm e,
posteriormente, foi adicionado clulas tEND na concentrao de 10 g/mL ou somente
meio de cultura (controle) e clulas com meio de cultura irradiadas nos mesmo
comprimentos de onda e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O descolamento celular foi
determinado pelo mtodo Cristal Violeta. Cada valor representa a mdia EPM de trs
experimentos independentes, Anova, *p<0,05 em relao ao controle.
38
8.4.
Efeito da exposio do veneno de B. jararaca ao Laser de Baixa

Potncia na viabilidade das clulas endoteliais tEND.
Da mesma maneira que avaliou-se a viabilidade das clulas com o

veneno irradiado antes de ser incubado com as mesmas, tambm avaliamos se
o veneno irradiado modificaria a viabilidade das clulas tEND. Para isso,
tambm utilizou-se como grupo controle, clulas irradiadas a 660 e 780nm,
sem receber inoculao de veneno.
Os resultados demonstraram a diminuio estatisticamente significativa
na viabilidade celular aps exposio das clulas endoteliais tEND ao VBj
irradiado, em ambos os comprimentos de onda (660nm e 780nm), que no foi
diferente da viabilidade causada pelo veneno sem irradiao, mais uma vez
demonstrando que a irradiao no afeta as molculas do veneno (Fig 7).
39
120
120
100
80
60
40
20
0
Laser 660 nm
Laser 780 nm
+
-
+
-
100
80
60
40
Laser 660 nm
Laser 780 nm
+
-
VBj (10 g/mL)
Controle
+
-
20
VBj (10 g/mL)
Controle
30 min
60 min
120
100
80
60
40
+
-
20
0
Laser 660 nm
Laser 780 nm
+
-
VBj (10 g/mL)
Controle
120 min
Figura 7. Efeito do veneno B. jararaca (VBj) irradiado na viabilidade de clulas endoteliais. Clulas
endoteliais tEND foram plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular.
Aps esse perodo o veneno foi previamente irradiado nos comprimentos de onda de 660nm e 780nm e,
posteriormente, foi adicionado clulas tEND na concentrao de 10 g/mL ou somente meio de cultura
(controle) e clulas com meio de cultura irradiadas nos mesmo comprimentos de onda incubadas por 30,
60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo mtodo MTT. C: controle; L: laser de baixa
potncia; V: veneno; VI: veneno irradiado. Cada valor representa a mdia EPM de trs experimentos
independentes, Anova Dunnet *p<0,01.
40
8.5.
Efeito do Laser de Baixa Potncia 660 nm na integridade de

clulas endoteliais submetidas leso por veneno B. jararaca.
Para a avaliao do efeito de LBP na integridade das monocamadas de

clulas, o mesmo foi aplicado diretamente na tEND, no comprimento de onda
vermelho de 660 nm, imediatamente aps a adio do veneno. Nos grupos
experimentais utilizando o LBP no comprimento de onda 660 nm, verificamos
que no houve diferena significativa na integridade celular no tempo de 30
min. No entanto, a aplicao do LBP causou uma reduo no descolamento
celular na ordem de 20% e 18%, nos tempos de 60 e 120 min,
respectivamente, quando comparado com o grupo veneno (Fig 8).
41
100
100
80
60
40
20
0
C + LBP
80
60
*
40
*#
20
0
V + LBP
C + LBP
(10 g/mL)
V + LBP
(10 g/mL)
30 min
60 min
100
80
60
*#
40
20
0
C + LBP
V + LBP
(10 g/mL)
120 min
Figura 8. Efeito do laser de baixa potncia (LBP) 660 nm na integridade de clulas

endoteliais submetidas leso por veneno de B. jararaca. Clulas endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse
perodo foi adicionado o veneno (10 g/mL), as clulas foram imediatamente irradiadas com
LBP usando densidade de energia (4 J/cm 2) no comprimento de 660 nm e foram incubadas por
30, 60 e 120 minutos. A integridade celular foi determinada pelo mtodo Cristal violeta. C:
controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potncia. Cada valor representa a mdia EPM de
trs experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 VS controle; #P<0,05 vs veneno.
42
8.6.
Efeito do Laser de Baixa Potncia 780 nm na integridade de

clulas endoteliais submetidas leso por veneno B. jararaca.
Para a avaliao do efeito de LBP na integridade das monocamadas de

clulas, o mesmo foi aplicado diretamente nas clulas tEND, no comprimento
de onda infravermelho de 780 nm, imediatamente aps a adio do veneno.
Nos grupos experimentais utilizando o LBP, verificamos que no houve
diferena significativa na integridade celular em nenhum dos tempos testados
aps a aplicao do LBP 780 nm infravermelho, quando comparado com o
grupo veneno (Fig 9).
43
100
100
80
60
40
20
0
80
60
40
20
0
C + LBP
V + LBP
C + LBP
V + LBP
(10 g/mL)
(10 g/mL)
60 min
30 min
100
80
60
40
20
0
C + LBP
V + LBP
(10 g/mL)
120 min
Figura 9. Efeito do laser de baixa potncia (LBP) 780 nm na integridade de clulas

endoteliais submetidas leso por veneno de B. jararaca. Clulas endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse
perodo foi adicionado o veneno (10 g/mL), as clulas foram imediatamente irradiadas com
LBP no comprimento de 780 nm e foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A integridade
celular foi determinada pelo mtodo Cristal violeta. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa
potncia. Cada valor representa a mdia EPM de trs experimentos independentes, Anova. *
p< 0,05 comparado ao grupo controle.
44
8.7.
Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 660 nm na viabilidade

de
clulas
endoteliais
submetidas
leso
por
veneno
B. jararaca.
Para a avaliao do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de

clulas, o mesmo foi aplicado diretamente nas clulas tEND, imediatamente
aps a adio do veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de
60 % na viabilidade celular no perodo de 60 minutos aps a aplicao do LBP,
com comprimento de onda de 660 nm (luz vermelha). O mesmo efeito no foi
observado nos tempos de 30 e 120 min (fig. 10).
45
120
120
100
80
60
40
20
0
C + LBP
100
80
60
40
20
0
V + LBP
C + LBP
(10 g/mL)
V + LBP
(10 g/mL)
30 min
60 min
120
100
80
60
40
20
0
C + LBP
V + LBP
(10 g/mL)
120 min
Figura 10. Efeito do laser de baixa potncia (LBP) 660 nm na viabilidade de clulas endoteliais
submetidas leso por veneno de B. jararaca. Clulas endoteliais tEND foram plaqueadas em
placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse perodo foi adicionado o
VBj (10 g/mL), as clulas foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e
foram incubadas por 30, 60 e 120 min. A viabilidade celular foi determinada pelo mtodo MTT. C:
controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potncia. Cada valor representa a mdia EPM de trs
experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.
46
8.8.
Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 780 nm na viabilidade

de clulas endoteliais submetidas leso por veneno B.
jararaca.
Para a avaliao do efeito de LBP na viabilidade das monocamadas de clulas,

o mesmo foi aplicado diretamente nas clulas tEND, imediatamente aps a adio do
veneno. Nossos resultados demonstraram um aumento de 51 % na viabilidade celular
no perodo de 60 minutos aps a aplicao do LBP, com comprimento de onda de
780 nm (luz infravermelho). O mesmo efeito no foi observado nos tempos de 30 e
120 min (fig.11).
47
120
100
80
60
40
20
0
C + LBP
V + LBP
120
100
80
60
40
20
0
(10 g/mL)
C + LBP
V + LBP
(10 g/mL)
30 min
60 min
120
100
80
60
*
*
40
20
0
C + LBP
V + LBP
(10 g/mL)
120 min
Figura 11. Efeito do laser de baixa potncia (LBP) 780 nm na viabilidade de clulas endoteliais
submetidas leso por veneno de B. jararaca. Clulas endoteliais tEND foram plaqueadas em
placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse perodo foi adicionado o
veneno (10 g/mL), as clulas foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 780 nm e
foram incubadas por 30, 60 e 120 minutos. A viabilidade celular foi determinada pelo mtodo MTT. C:
controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potncia. Cada valor representa a mdia EPM de trs
experimentos independentes, Anova. * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs ao veneno.
48
8.9.
Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 660 nm na liberao da

enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de clulas endoteliais
submetidas leso por veneno B. jararaca.
A perda da integridade da membrana aps incubao com veneno e

tratamento com laser foi monitorado pela anlise da liberao no meio de cultura da
enzima citoplasmtica LDH. As clulas que receberam o veneno apresentaram
aumento nos nveis de LDH no sobrenadante, nos tempos de 30 e 60 min, comparado
ao grupo que recebeu somente meio de cultura (controle). O LBP 660 nm (luz
vermelho) foi capaz de promover uma reduo na liberao de LDH de 33% e 49 %
aos 60 e 120 min, respectivamente. O mesmo efeito significativo no foi observado no
tempo de 30 min neste comprimento de onda. (fig. 12).
49
1.5
1.5
LDH (D.O.)
LDH (D.O.)
*
1.0
0.5
0.0
C + LBP
V + LBP
1.0
0.5
0.0
C + LBP
10 g/mL
V + LBP
10 g/mL
30 min
60 min
1.5
LDH (D.O.)
*
1.0
#
0.5
0.0
C + LBP
V + LBP
10 g/mL
120 min
Figura 12: Efeito do laser de baixa potncia (LBP) 660 nm na liberao de LDH de clulas
endoteliais submetidas a leso por veneno de B. jararaca. Clulas endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse perodo
o veneno foi adicionado na concentrao de 10 g/mL ou somente meio de cultura (controle) as clulas
foram imediatamente irradiadas com LBI no comprimento de 660 nm e foram incubadas por 30, 60 e
120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberao de Lactato Desidrogensase (LDH) foi
determinada pela liberao de NADH. C: controle; V: veneno; LBP: laser de baixa potncia. Cada
valor representa a mdia EPM de trs experimentos independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05
vs veneno.
50
8.10. Efeito do Laser de Baixa Potncia (LBP) 780 nm na liberao da

enzima Lactato Desidrogenase (LDH) de clulas endoteliais
submetidas leso por veneno B. jararaca.
Da mesma forma, avaliamos a perda da integridade da membrana aps

incubao com veneno e tratamento com laser pela anlise da liberao no
meio de cultura da enzima citoplasmtica LDH. As clulas que receberam o
veneno apresentaram aumento nos nveis de LDH no sobrenadante, nos
tempos de 30 e 60 min, comparado ao grupo que recebeu somente meio de
cultura (controle). O LBP 780 nm (luz infravermelho) foi capaz de promover
uma reduo na liberao de LDH de 28% e 54 % aos 60 e 120 min,
respectivamente (fig. 15). O mesmo efeito estatisticamente significativo no
foi observado no tempo de 30 min no comprimento de onda de 780 nm (fig.
13).
51
1.5
1.5
LDH (D.O.)
LDH (D.O.)
*
1.0
0.5
0.0
C + LBI
1.0
0.5
0.0
V + LBI
C + LBI
10 g/mL
V + LBI
10 g/mL
30 min
60 min
1.5
LDH (D.O.)
*
1.0
#
0.5
0.0
C + LBI
V + LBI
10 g/mL
120 min
Figura 13. Efeito do laser de baixa potncia (LBP) 780 nm na liberao de LDH de clulas
endoteliais submetidas a leso por veneno de B. jararaca. Clulas endoteliais tEND foram
plaqueadas em placas de 96 poos e incubadas por 48 horas para adeso celular. Aps esse perodo
o veneno (10 g/mL) foi adicionado cultura de clulas e foram imediatamente irradiadas com o LBI
780 (infravermelho) e incubadas por 30, 60 e 120 minutos. O sobrenadante foi recolhido e a liberao
de Lactato Desidrogensase (LDH) foi determinada pela liberao de NADH. C: controle; V: veneno;
LBP: laser de baixa potncia. Cada valor representa a mdia EPM de trs experimentos
independentes, * p< 0,05 vs controle; # p< 0.05 vs veneno.
52
9. DISCUSSO
Apesar da eficincia da soroterapia em neutralizar os efeitos sistmicos
causados pelos venenos botrpicos, as reaes locais causadas por esses
venenos so apenas parcialmente ou no so neutralizadas por esse
tratamento. Isso ocorre pelo fato das manifestaes locais ocorrerem
rapidamente aps a picada e o soro no ser capaz de reverter s leses j
estabelecidas ou desencadeadas (Rosenfeld, 1971). O fato da soroterapia ser
pouco eficaz no tratamento das reaes locais induzidas por venenos
botrpicos estimula a procura de tratamentos complementares que possibilitem
a melhora deste quadro. Assim, este trabalho visou o melhor entendimento da
aplicao do laser de baixa potncia, em clulas endoteliais, aps leso pelo
veneno de Bothropoides jararaca.
Estudos sugerem que os venenos e toxinas hemorrgicas isoladas
afetam, principalmente, a integridade de vasos de pequeno calibre (Ohsaka,
1979; Ownby, 1990; Borkow et al., 1993). Este efeito foi atribudo protelise
da membrana basal dos vasos, levando a sada de eritrcitos. Considerando
que as SVMPs de veneno de serpente so responsveis por hemorragia local,
pelo menos nove delas foram isoladas a partir do veneno B. jararaca
(Mandelbaum et al., 1976; Maruyama et al., 1992, Maruyama et al., 1993 e
Paine et al, 1992), e concluiu-se que as toxinas hemorrgicas causam uma
srie de alteraes morfolgicas e degenerativas em clulas endoteliais que
progridem para formao de fendas intercelulares permitindo a sada de
hemcias (Ownby, 1990, Lomonte et al., 1994).
Ainda, estudos revelam uma diferena significativa na produo de
hemorragia pelas SVMPs in vivo, comparado aos estudos com cultura de
53
clulas endoteliais, uma vez que o descolamento foi observado somente in vitro
(Gutirrez et al., 2005). Neste estudo buscou-se compreender, inicialmente, os
efeitos do veneno de B. jararaca sobre a integridade e viabilidade de clulas
endoteliais.
Os efeitos do veneno de B. jararaca na integridade e viabilidade de
clulas endoteliais tEND in vitro. Os resultados obtidos mostraram que o
veneno, afetou a integridade das monocamadas de clulas endoteliais nas
concentraes a partir de 10 L/mL em todos os perodos de tempo analisados.
O efeito mximo ocorreu aos 120 minutos de incubao. Resultados similares
foram demonstrados a capacidade do B. jararaca em causar descolamento de
clulas com concentraes maiores que 10 L/mL (Gallagher et al., 2003).
Tambm Nishijima et al. (2009), em um estudo in vivo, buscou
determinar a dose ideal capaz de induzir a hemorragia aps administrao do
veneno de B. jararaca e concluiu que dose de 8,1 g foi ideal capaz de alterar a
homeostase dos vasos sanguneos. Adicionalmente, a BaH-1, uma SVMPs
isolada do veneno de B. asper, com potente atividade hemorrgica, causa um
descolamento moderado de clulas endoteliais murinas (Lomonte et. al., 1994).
Ainda, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a viabilidade
celular, para melhor compreender a ao do veneno sobre a integridade do
endotlio. Para tanto, avaliou-se a citotoxicidade pela atividade metablica
mitocondrial (mtodo MTT). Os resultados obtidos mostraram que o veneno
reduziu a viabilidade celular em todas as concentraes nos tempo de 60 e 120
min aps a incubao com o veneno, alterando a viabilidade das clulas
endoteliais e sugerindo que o descolamento das monocamadas pode estar
54
relacionado citotoxicidade do veneno, provavelmente por agir nas molculas

de adeso.
A literatura tem sugerido que a terapia com LBP uma alternativa eficaz
para o tratamento de acidentes causados por serpentes devido a sua
capacidade de diminuir a inflamao, hemorragia e mionecrose aps
envenenamento botrpico experimental (Dourado et al., 2003; Barbosa et al.,
2009; Nadur- Andrade et al., 2012). No entanto, os mecanismos biolgicos
envolvidos na proteo local pela irradiao laser contra a ao local do
veneno botrpico ainda no so compreendidos.
Neste
estudo,
investigou-se
alguns
mecanismos
envolvidos
na
capacidade da terapia LBP em proteger clulas endoteliais contra o veneno da

serpente B. jararaca. O efeito da terapia com LBP na citotoxicidade causada
pelo veneno foi avaliada usando o laser na densidade de energia de 4 J/cm 2
em dois comprimentos de onda, um vermelho no comprimento de onda 660 nm
e infravermelho no comprimento 780 nm, aps a adio do veneno nas clulas
endoteliais tEND.
A dose do laser escolhida foi baseada na literatura mostrando, em
cultura celular, um efeito benfico do laser vermelho e infravermelho em doses
baixas 3 ou 5 J/cm2. Neste mesmo estudo, os autores demonstraram que em
doses altas (16 J/cm2) pode apresentar efeito prejudicial (Huang et al., 2009;
Kim et al, 2011).
Com o intuito de verificar se o laser seria capaz de alterar os
componentes do veneno e assim diminuir sua citotoxicidade, o veneno foi
irradiado usando os mesmos parmetros do laser usado para irradiar as clulas
endoteliais tEnd. O veneno B. jararaca irradiado mostrou o mesmo efeito
55
citotxico quando comparado ao veneno no irradiado. Este resultado indica

que a irradiao laser no modificou os componentes do veneno. Resultado
semelhante foi encontrado por Barbosa et al., (2008), usando um modelo in
vivo no qual o veneno irradiado causou o mesmo nvel de edema muscular
quando comparado ao veneno no irradiado.
Os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a dose usada de
4 J/cm2 reduziu o descolamento de clulas endoteliais melhorando assim a
integridade celular. Esse efeito foi observado nos comprimentos de onda de
660 nm nos tempos de 60 e 120 min. Porm, o mesmo efeito no foi observado
com o comprimento de onda 780 nm, sugerindo atuao do laser na matriz
extracelular e assim, protegendo a clula contra os efeitos deletrios do
veneno.
Isso porque, conforme Szymanska et al, 2013, a radiao com LBP pode
influenciar as clulas atravs da absoro da energia emitida pelos
fotorreceptores localizados no interior das clulas. Sugere-se que, dentre tais
fotorreceptores, as mitocndrias, que fornecem energia para as clulas, contm
uma srie de enzimas que participam nas reaes redox da cadeia respiratria,
tornando-se o principal mecanismo das reaes metablicas ocorridas em uma
clula, alm do citocromo c oxidase e superxido dismutase- NADH, que
demonstraram alterao aps emisso de ftons, alterando o nvel de oxidao
e alterando a fluncia dos eltrons de uma molcula, capazes de aumentar a
sntese de DNA e RNA (Karu, 1999; Szymanska et al, 2013) .
Ainda, os resultados obtidos em nosso estudo mostraram que a
concentrao usada de 4 J/cm2 reduziu a citotoxicidade, avaliada pelo mtodo
MTT, em clulas endoteliais no perodo de 60 min aps a adio do veneno,
56
tanto com o laser vermelho como o infravermelho, no tendo efeito em outros

perodos avaliados. Essa diferena encontrada entre o laser vermelho e
infravermelho pode estar relacionada com a penetrao da luz no tecido (El
Sayed et al., 1990; Tacon et al., 2011; Kim et al, 2011; Colombo et al, 2013)
uma vez que j foi demonstrado que o laser vermelho penetra mais no tecido
que o laser infravermelho.
Adicionalmente, investigou-se a capacidade do veneno em afetar a
viabilidade celular, pela liberao da lactato desidrogenase pelas clulas
endoteliais, uma enzima citoplasmtica estvel, utilizada como parmetro de
leso e/ou morte celular, quando presente no sobrenadante de culturas de
clulas (Thomas, et al., 1993; Yildiz, et al., 1999). Os resultados demonstraram
que o LBP causou uma reduo da liberao de LDH nos tempos de 60 e 120
min pelas clulas endoteliais aps a incubao com o veneno. Essa
discrepncia nos testes avaliados para determinar a citotoxicidade poder estar
relacionada a maior sensibilidade do mtodo LDH.
Convm ressaltar que, esta diferena curiosa, pois estudos anteriores
de nosso laboratrio demonstram um efeito protetor do LBP em clulas
musculares in vitro, avaliado tanto pelo mtodo MTT como pela liberao de
LDH em todos os perodos de tempo avaliados (dados enviados a publicao).
A dose do laser utilizada foi a mesma utilizada para as clulas musculares,
possvel que a dose utilizada no seja a ideal para a proteo em clulas
endoteliais. No entanto, Szymanska et al (2013), avaliou clulas endoteliais in
vitro, utilizando LBP nos comprimentos de onda vermelho e infravermelho e
concluram que a utilizao do comprimento de onda de 635 nm (com
densidade de potncia de 1,875 W/cm2) estava associado com um aumento
57
estatisticamente significativo na proliferao das clulas endoteliais. Ainda, a

utilizao das densidade de energia de 2, 4 e 8 J/cm2 promoveram aumentos
significativos na proliferao, sendo que de 4 J/cm2 foi a que mais significativa
em relao a proliferao celular, sugerindo que a densitometria utilizada no
nosso trabalho adequada para se utilizar em clulas endoteliais.
Alm disso, os efeitos diretos ou indiretos da interferncia do laser
visvel vermelho e infravermelho com os componentes mitocondriais da cadeia
respiratria parte do sinal de transduo (Tiphlova et al, 1989; Karu et al,
1993; Lubart et al, 1996; Kim et al, 2011). Nesse sentido, estudos de Kipshidze
et al, 2001; Agaiby et al, 2000, abordaram a possvel induo de fatores prangiognicos pela exposio ao laser. At o momento, tais fatores tm sido
detectados imediatamente aps a irradiao do laser, e apenas em cultura de
outras linhagens celulares que no as clulas endoteliais.
Bouma et al. (1996), demonstraram melhora na regulao da secreo
espontnea de clulas endoteliais humanas, avaliada pela liberao de
citocinas, como interleucina (IL) -6 e IL-8 aps a radiao pulsada de laser
infravermelho. sugerindo efeito direto na estimulao na proliferao das
clulas endoteliais (Schindl et al, 2003).
Em nosso estudo no avaliamos a proliferao celular, no entanto a
reduo da hemorragia observada em estudo in vivo do nosso laboratrio
(Nadur-Andrade et al, 2012) e proteo da mionecrose (Barbosa et al., 2008)
sugere que a proteo observada pelo LBP nas clulas endoteliais pode estar
relacionada a uma melhora da proliferao celular e consequente diminuio
da mionecrose.
58
10. CONSIDERAES FINAIS

Em sntese, podemos concluir que o LBP 660nm e 780 nm reduziram
a citotoxicidade em clulas endoteliais; tornando-se capaz de exercer um
efeito protetor nas clulas endoteliais tEND, com reduo estatisticamente
significativa na liberao de LDH e aumento na viabilidade celular,
sugerindo que os efeitos observados podem ser explicados pela possvel
ao do LBP na proliferao celular, conforme tabela abaixo:
Ainda, podemos concluir que o veneno de B. jararaca citotxico para

clulas endoteliais e que o uso do laser de baixa potncia, neste modelo
experimental, foi capaz de proteger a clula endotelial contra a ao do veneno
da serpente B. jararaca.
Tambm, as perspectivas futuras para a utilizao em sade do laser de
baixa potncia sugerem a delimitao correta de parmetros, tais como
densidade, energia, frequncia, potncia e rea de aplicao. Com uma ampla
extenso de abordagem a, terapia com LBP, tm se tornado crescente no
cenrio mundial e de modo mais importante, a combinao da utilizao
apropriada do LBP, associado um complemento com outras abordagens
teraputicas, pode proporcionar melhores resultados clnicos e funcionais ao
paciente, e com menor perodo de tratamento.
59
11. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Agaiby, A. D.; Ghali, L. R.; Wilson, R.; Dyson, M. Laser modulation of

angiogenic factor production by T-lymphocytes. Lasers Surg Med 2000; 26:
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60
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Por que o homem quer subir a montanha mais alta do mundo?

Deus, pela minha vida e pela paz e fora nos momentos

professora e orientadora Dr. Stella Regina Zamuner. A esta devo

Universidade Nove de Julho, que aceitou me receber no

entender melhor os efeitos fisiopatolgicos

envenenamento botrpico, bem como contribuiu para a melhor compreenso

Palavras chaves: endotlio, Bothropoides jararaca, laser de baixa potncia.

Keywords : endothelium , Bothropoides jararaca, low level laser

1.1.Acidentes ofdicos e epidemiologia

1.2.Mecanismos de ao do veneno botrpico

1.3.A serpente Bothropoides jararaca

2.Consideraes gerais sobre o endotlio vascular

4. Terapia com laser de baixa potncia

4.1. LBP e acidentes ofdicos

4.2. Laser e clulas em cultura

6.1. Veneno de serpente Bothropoides jararaca (VBj)

6.2. Clulas endoteliais (CE)

6.3. Cultivo Celular

6.4. Irradiao laser de baixa potncia

6.5. Ensaio de viabilidade celular (MTT)

Ensaio para a avaliao da integridade da monocamada de clulas

endoteliais Descolamento Celular

8.1. Efeito do veneno de B. jararaca (VBj) na integridade de clulas

na integridade das clulas endoteliais tEND.

8.5. Efeito do Laser de Baixa Potncia 660 nm na integridade de clulas

endoteliais submetidas leso por veneno B. jararaca.

endoteliais submetidas leso por veneno B. jararaca.

10. Consideraes Finais

11. Referncias Bibliogrficas

Acidentes ofdicos e epidemiologia

Acidente ofdico ou ofidismo o quadro de envenenamento decorrente

Tabela 1. Acidentes ofdicos e suas respectivas gravidade

Extrado de: Extrado de: Ministrio da Sade- Acidentes ofdicos

Com relao ao gnero Bothrops e Botropoides, os acidentes

epidemiolgica no pas (Manual de diagnstico e tratamentos de acidentes por

Figura 1 Acidentes ofdicos ocorridos no Brasil.

Mecanismo de ao do envenenamento botrpico

Os venenos ofdicos constituem uma mistura complexa de protenas e

Alm disso, as marcas nem sempre so visveis no momento da picada, assim

1.3 A serpente Bothropoides jararaca (B. jararaca)

Maior prevalncia B. jararaca

Figura 2 Distribuio geogrfica da B. jararaca

O veneno da serpente B. jararaca consiste de uma mistura complexa

A literatura sugere que metaloproteinases do veneno da serpente

possuem efeito citotxico sobre as clulas endoteliais, atuando principalmente

leso de vasos da microcirculao,

metaloproteinases do veneno ofdico, as quais pertencem uma subfamlia de

Figura 3: Classificao das Metaloproteinases de venenos.

Extrado de Fox et al., 2008

atividade hemorrgica tem sido associada, tambm, com a atividade

hemorrgicas so capazes de induzir comparvel taxas de apoptose em

diretamente nos vasos sanguneos endoteliais e sub-endoteliais, na matriz

2. CONSIDERAES GERAIS SOBRE O ENDOTLIO VASCULAR

As clulas endoteliais de um modo geral so alongadas, poligonais e