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EDICIÓN: 17.03.03

Walter Ivens H.
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ÍNDICE
Página
A Elementos del microscopio.......................................................................... 3-9
B Sistema óptico……………………………………………………………………. 9 -27
C Contrate de fases………………………………………………………………… 28 - 30
D Contrate según Hoffman ………………………………………………………. 31 - 32
E Contraste según Nomarski ……………………………………………………. 33 - 36
F Métodos combinados…………………………………………………………… 37 - 38
G Microscopía de polarización…………………………………………………… 39 - 44
H Mediciones con el microscopio……………………………………………….. 45 - 46
I Microfotografía tradicional…………………………………………………….. 47 - 54
J Microfotografía digital…………………………………………………………… 55 - 56
K Fluorescencia…………………………………………………………………….. 57 - 75
L Microscopía confocal…………………………………………………………… 76 - 79
M Varios y cuidados del microscopio…………………………………………... 80 - 83

Estos apuntes de microscoía solo pretenden dar una información básica sobre el tema y es evidente que
temas como Contraste de Fases, Nomarski, Polarización, Fluorescencia y Microscopía Confocal merecen
una explicación mucho mas detallada, pero ese no es el objetivo de estos ap untes.
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BASES DE LA MICROSCOPÍA
(Walter Ivens H.)

1.1 Los elementos que configuran un microscopio son los siguientes:

1.) Estativo y su Base.
2.) Fuente de luz.
3.) Platina o mesa Porta-Preparado.
4.) Revólver porta Lente-Objetivo.
5.) Tubo de observació
6.) Sistema óptico compuesto por : - Los Lentes-Objetivos
- Los Lentes-Oculares
- Condensador
- Lente de campo
- Lentes colectores y auxiliares

FIGURA Nº1

Lampara
halógena
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1.1.1 EL ESTATIVO Y SU BASE

El estativo (base o pedestal) del microscopio es el componente central al que se le agregan
todas las demás partes. De su tamaño, solidez y peso depende la estabilidad y la ausencia de
vibraciones en el microscopio.

Incluido en la construcción del estativo se alojan los sistemas de enfoque macrométrico y

micrométrico, así como también la ampolleta (fuente de luz) o el acople para una lampara externa.
Igualmente en la base del estativo se ubican algunos lentes y diafragmas que controlan el haz de luz.
Es normal que el fabricante ubique también en la base del estativo un transformador de 220V a
6V, 0 a 12V, y un sistema de control de la intensidad de la luz (voltaje variable).
El componente más complejo en el estativo es el sistema de enfoque que actúa sobre la
platina, salvo en los microscopios del tipo invertido en los cuales actúa sobre el revolver porta-
objetivos.
En el sistema de enfoque el control macrométrico desplaza la platina en forma gruesa y el
control micrométrico produce un desplazamiento fino de la platina. Estos sistemas se componen
básicamente de varios engranajes, piñones, ruedas, y ejes de bronce, teflón o acero que requieren de
cierta mantención periódica o al menos de limpieza y lubricación cada 2 años.
El enfoque micrométrico tiene generalmente grabado en su control externo (perilla) una escala
micrométrica, la que permite hacer mediciones de profundidad en el preparado. Al usar lentes-
objetivos de un alto aumento (por lo tanto de poca profundidad de foco) es posible enfocar un punto
“superior” del objeto observado y luego, actuando sobre el enfoque fino, se procede a enfocar un
punto “inferior” del mismo objeto. La diferencia en la posición de la escala micrométrica en el tambor
indica cuantas micras de distancia hay entre los dos puntos enfocados.
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1.1.2 FUENTE DE LUZ

La fuente de luz, tanto en microscopia diascópica como episcópica, es generalmente en base a

ampolletas de filamento como las halógenas o tungsteno, pudiendo ser también en base a ampolletas
de arco eléctrico como las de Mercurio o Xenón.
La ampolleta más usada actualmente es la halógena con potencias de 20, 50 y 100 watts.
Para microscopía de Fluorescencia se usa la ampolleta de Mercurio de 100 y de 200 watts, para
obtener mejores resultados (ver capitulo fluorescencia). Las ampolletas y sus porta-lámparas pueden
ser del tipo "pre-centrada", sin embargo, el porta-lámpara puede disponer de un sistema de centraje
de la ampolleta.
En el primer caso el usuario no puede centrar la ampolleta ya que viene centrado el sistema
por fábrica y no se puede modificar. En el segundo caso el usuario debe centrar y controlar el centraie
con unos tornillos de centraje disponibles para tal fin en el porta-lámpara.

Muchas veces, especialmente en las lámparas del tipo externas, se dispone además de un
lente colector desplazable, el cual permite enfocar el filamento o arco de las lámparas en los oculares,
facilitando así el correcto centraje y distribución de la luz.

1.1.3 LA PLATINA PORTA-PREPARADOS

Esta mesa generalmente de forma cuadrada (salvo en los microscopios de polarización en los
cuales es redonda) lleva y fija el porta-objeto en su posición para la observación del preparado. Esta
es controlada en sus movimientos verticales por el sistema de enfoque macro-micro-métrico (salvo en
el microscopio invertido) Los desplazamientos horizontales en sus ejes X-Y son controlados por un
comando ubicado a un costado de la platina que se encuentra generalmente en una posición cómoda
a la mano del operador. Para volver a reubicar algún punto seleccionado en el preparado observado,
la platina dispone de escalas micrométricas para el eje X y para el eje Y.

Bajo la platina se ubica el condensador de apertura, el cual se desplaza junto con ella en sus
movimientos verticales (salvo en los microscopios invertidos). Muchos microscopios permiten
desplazar el condensador en forma independiente a la platina.
En los microscopios para estudiantes o los del tipo más simple para laboratorio, la fábrica
puede entregar el porta-condensador sin sistema de desplazamiento vertical propio, para así evitar su
mal uso, ya que generalmente el condensador se debe usar solamente en su posición más alta
(cercana al preparado).

En el porta-condensador o en el condensador mismo hay un sistema de centraje (dos tornillos),

con los cuales debe alinearse cuidadosamente el sistema óptico para obtener una iluminación perfecta
y aprovechar al máximo las características de los lentes-objetivos (más detalles en el capítulo sobre
el centraje del microscopio)

1.1.4 REVÓLVER O NUEZ PORTA-OBJETIVO

Este disco giratorio, permite tener permanentemente colocados en el microscopio varios
lentes-objetivos y seleccionar el necesario girando simplemente dicho disco o revolver.
Su construcción debe ser muy precisa, ya que debe mantenerse centrado el sistema óptico al
cambiar de un lente a otro. Ciertos revólveres, especialmente los microscopios de polarización, tienen
un sistema individual de centraje para cada lente-objetivo.
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1.1.5 EL TUBO DE OBSERVACIÓN:

Hay una cierta variedad de tubos de diferente complejidad, dependiendo de su aplicación y
comodidad de uso.
Se pueden clasificar como sigue:
a)Tubo Monocular - Simple y Elemental
b)Tubo Binocular -.Normal, no compensado
- TipoSEIDENTOPF(no necesita compensación)
c) Tubo Trinocular -.Compensado
-.Tipo SEIDENTOPF (ambos con desvío de luz/imagen "0 o
100%” u otra relación al observador o a la película).
Todos los tubos anteriores se pueden fabricar con inclinación ergonométrica para mayor comodidad
del observador.

?? El Tubo Monocular es un tubo de observación para un ojo y actualmente sólo se usa en

microscopios de precio muy económico. Fuera de ser incómodo, el observar con un ojo no le
permite a algunas personas ver todos los detalles, tanto de definición como de color, debido a que
los ojos pueden tener diferentes capacidades o rendimiento, y el usar sólo uno de ellos es una
limitante.

?? El Tubo Binocular más simple divide el rayo de luz/imagen en dos por medio de prismas o espejos,
dirigiendo éstos un rayo a cada uno de los dos lentes-oculares. Debido a las distancias
intrapupilares diferentes de las personas, se debe poder ajustar la distancia entre los dos oculares
mediante un desplazamiento lateral de estos (entre 68mm y 80mm). Esto incide a su vez, en un
trayecto mas largo o más corto del haz de luz-imagen. La importancia de lo anterior es crítica en
el tubo trinocular fotográfico/TV, debido a la ventaja de obtener foco simultáneo en la película y en
los ojos del observador (ver explicación en "tubos trinoculares").
Posibles diferencias de dioptrías entre los dos ojos del observador, hacen necesario que al
menos uno de los dos porta-oculares o el ocular mismo, disponga de un sistema que permita
compensar dichas diferencias de dioptrías. Generalmente el tubo o el ocular dispone de un anillo
giratorio de enfoque, permitiendo asi tener foco simultáneo en ambos ojos.

?? El Tubo Binocular o Trinocular SEINDENTOPF es un tubo cuya distancia intrapupilar se ajusta

colapsando mas o menos este tubo, el cual gira sobre su eje central paralelo en forma similar al
sistema de los anteojos larga-vista (o prismáticos). En este tipo de construcción no hay variación
en el recorrido del haz de luz/imagen hasta los oculares, por este motivo el sistema es muy usado
en los tubos trinoculares fotográficos.
?? El tubo Binocular o Trinocular compensado es similar al tubo binocular normal, pero corrige la
distancia recorrida por el haz de luz /imagen (al separar o juntar los oculares) mediante un sistema
mecánico que se desplaza simultáneamente y a una distancia idéntica a la de los dos porta-
oculares en su eje paralelo, manteniendo así en forma constante una misma distancia total.
(ver figuras 2 y 3)
?? En los Tubos Trinoculares Fotográficos/TV, es especialmente importante un sistema de largo de
haz de luz/imagen constante, ya que solo así el fabricante puede diseñar un sistema que produzca
siempre un foco simultáneo en la película como también en los ojos del observador y por lo tanto
un manejo más cómodo. Sin embargo, normalmente los sistemas fotográficos traen además, un
telescopio u ocular de control y enfoque, con el cual se tiene la certeza de que al observar en
dicho telescopio/ocular foco, hay efectivamente también foco sobre la película.
Nikon usa tubos trinoculares con el sistema SEIDENTOPF, por lo cual no hay necesidad
de compensación del largo del haz de luz/imagen. Otros fabricantes usan el tubo compensador el
cual también subsana el problema.
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FIGURA Nº2
FIGURA No. 3
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Todos los Tubos Trinoculares deben tener un sistema que permita enviar la luz, ya sea a los oculares
del observador o a la cámara fotográfica o TV. Igualmente hay sistemas que desvían cierto porcentaje
de la luz al observador y otro porcentaje simultáneamente a la película.
Es importante que Ud. elija el tipo de tubo que mejor se adapte a su trabajo ya que cada
uno de ellos tiene ciertas ventajas o desventajas.

Él acople óptico entre el Tubo Trinocular y el sistema fotográfico es logrado generalmente

mediante un ocular de proyección o lente "Relay", ubicado en la salida del Tubo Monocular.
Ultimamente Nikon opta por no usar lente de acople alguno y obtiene el foco con una distancia
física precisa desde el lente-objetivo hasta la película.
Si se usa un ocular de proyección o lente "Relay", se tiene la posibilidad de modificar el
aumento final sobre la película o pantalla de televisión, de acuerdo al aumento propio de dicho
lente ocular.

?? El tubo Binocular (Trinocular) Ergonométrico es una construcción que permite ajustar el ángulo de
observación para el usuario, y así proporcionar una mayor comodidad (ángulo generalmente
o o
variable entre unos 35 a 45 de inclinación).

NOTA: Hay que tener en cuenta, que algunas fábricas tratan de intercalar la menor cantidad de óptica
entre el lente-objetivo y la película o cámara de TV, a fin de evitar demasiadas superficies de vidrio y/o
espejos, sobre las cuales podría depositarse pelusas o polvo lo que afectaría la limpieza (calidad) de
la imagen fotografiada.

1.2 SISTEMA ÓPTICO DEL MICROSCOPIO

Los Lentes-Objetivos

Son el principal elemento de todo microscopio, de su calidad depende un gran porcentaje de

la calidad final del sistema. La calidad de un lente-objetivo se determina principalmente por su poder
de resolución, contraste, corrección cromática, curvatura de campo, amplitud de campo y
reproducibilidad de colores. Adicionalmente hay que considerar en su elección la distancia de trabajo
y elementos de construcción como la protección retráctil en los objetivos de 40x o más, corrección
para cubre-objeto, diafragma ajustable (especialmente para campo oscuro) y también el medio de
inmersión que necesita usar como por ejemplo: aceite de inmersión, glicerina, agua, aire u otro.

Consideraciones adicionales para microscopía especializada como Fase Contrastada,

Fluorescencia, Nomarski, DIC, polarización y otras, se trataran en capítulos dedicados especialmente
a dichos temas.

1.2.1 PODER DE DEFINICIÓN (RESOLUCIÓN)

Es la capacidad del lente/objetivo de definir o resolver dos puntos como tales, a una mínima
distancia entre ellos este poder de resolución lo determina la llamada "apertura numérica" del objetivo
y la longitud de onda de la luz involucrada.

La fórmula Nº1 es la siguiente:

Resolución : 0,61 x Longitud de Onda

Apertura Numérica
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Para saber la apertura numérica la fórmula Nº2 es:

"A.N.": = I.R. x Angulo sin 0

A.N. = Apertura Numérica

I.R. = Índice de Refracción
Sin 0 = 50% del Ángulo entre preparado y objetivo

En otras palabras mientras más luz indirecta, refractada y difractada puede captar el
objetivo, mayor es su A.N. o su poder de resolución.

También podemos decir que para una misma distancia focal (distancia de trabajo
objetivo/preparado), mientras mayor el diámetro del lente frontal mayor es la A.N. del objetivo o su
poder de resolución.(Ver figura Nº5)

FIGURA Nº4

En Fig. No. 4 se observa que con un índice de refracción igual al del vidrio, el haz de luz sigue una
trayectoria recta, contrariamente a lo que sucede por ejemplo con el aire, en el cual el haz de luz se
refracta al pasar del vidrio al aire. El vidrio tiene un índice de refracción aproximado 1,525 y el aire
tiene un índice de refracción de 1,00, por lo tanto se trata de igualar el índice de refracción del vidrio
con el de un medio de inmersión.
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FIGURA Nº5

Menor Apertura Numérica Mayor Apertura Numérica

= Menor Resolución = Mayor Resolución

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1.2.2 ABERRACIÓN CROMÁTICA

Debido a que el microscopio trabaja con el espectro visible de luz (luz blanca), cada longitud
de onda o color que la compone es refractada en ángulos diferentes por la óptica del sistema, esto
conlleva a que los puntos de foco para los diferentes colores caigan en planos diferentes, salvo que el
fabricante logre corregir su sistema óptico de tal forma, que evite esta Aberración Cromática.
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1.2.3 ABERRACIÓN ESFÉRICA

Los rayos de luz recorren distancias diferentes dentro de los lentes, y debido a la forma de
estos se hace difícil una adecuada corrección en la parte periférica o en los bordes. Este problema se
conoce con el nombre Aberración Esférica.
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FIGURAS Nº6 - 7 - 8
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1.2.4 CURVATURA DE CAMPO

Este problema se aprecia frecuentemente en los lentes/objetivos de un aumento de 40x

y más. Al observar el preparado podemos enfocar solamente el centro de este o solamente su
periferia. No es posible enfocar todo el campo visual en un mismo punto de enfoque. Lo anterior
también se debe a problemas de comportamiento óptico de la luz dentro del sistema. Hay objetivos
especialmente corregidos para subsanar este problema, estos objetivos, llamados "planos" (pl), son
de compleja construcción y de alto costo. El nombre plano proviene de que su punto de foco se logra
en un solo plano, lo permite observar todo el campo en un punto focal simultáneo (ver figura Nº10)

1.3 DENOMINACIÓN DE LOS LENTES/OBJETIVOS

Objetivos Acromáticos. Son aquellos en los cuales el fabricante ha corregido la aberración cromática
axial (o parte central de lente), especialmente para los colores rojo y azul. La resolución y contraste
son excelentes en su parte central, por lo que esta óptica es apta para observaciones en general.

Objetivos Apocromáticos. Son aquellos en los cuales el fabricante ha corregido la aberración

cromática para todo el espectro visible, rojo, azul, violeta usando vidrio fluorita de muy baja dispersión.
En estos lentes se ha corregido al máximo todas las aberraciones, logrando una resolución y
reproducibilidad de color excelente.

Objetivos Plan-Acromáticos y Plan-Apocromáticos. En ellos el fabricante ha corregido además la

curvatura de campo.

Otros Lentes/Objetivos. De fase contrastada, de polarización, para fluorescencia, se describen en

los capítulos especializados

1.3.1 LOS LENTES OCULARES

Los lentes objetivos crean una imagen real en el plano focal del ocular (a1-b1), el ocular a su
vez crea una imagen virtual (a2-b2) a una distancia de aproximadamente unos 25 cm del ojo del
observador (ver figura 9).

Los oculares tienen un aumento propio que puede ser de 5x, l0x, l5x, 20x, 25x u otro,
dependiendo esto del fabricante. El aumento más usado es el de 10x debido a que un aumento
mayor del ocular no contribuye a ver más detalles en el preparado, solamente produce una imagen
más aumentada pero no mas definida. Esto se debe a que el mejor poder de resolución sólo puede
llegar a distinguir hasta un máximo de 200 nm (0,0002mm), ya que la longitud de onda de los rayos
luminosos no permite sobrepasar ese mínimo. Por ese motivo, en la fórmula de definición (ver fórmula
1 antes) se observa la importancia que tiene la longitud de onda en el poder de resolución del sistema
al plantear "Long.onda / por Apert. Numer."

Los oculares (en el caso de Nikon), también cumplen una importante función de corrección
final compensatoria de la imagen entregada por los lentes/objetivos, obteniendo así una máxima
calidad en la imagen final.
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FIGURA Nº9
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FIGURA Nº10
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Los oculares se clasifican según el diámetro del campo visual que logran captar y son: de
campo normal, de campo ampliado, de gran campo y de ultra gran campo. Además hay oculares
especiales como los de acople al sistema fotográfico o de TV, llamados oculares de proyección o
lentes “Relay”. Hay oculares de enfoque fotográfico también llamados telescopios de enfoque, los
oculares de centraje para fase contrastada, y otros.

1.3.2 CONDENSADOR

Los condensadores son necesarios para obtener una adecuada iluminación del preparado,
lograr que se concentre la mayor cantidad de luz disponible y que ésta sea uniforme.
El condensador tiene gran ingerencia en la resolución, contraste, profundidad de foco y en el
brillo de la imagen. Su construcción incluye un diafragma ajustable llamado "diafragma de apertura",
con su uso se controla precisamente la resolución, el contraste y la profundidad de foco en la imagen.
Sin embargo, esto se produce en forma dependiente, es decir, querer mejorar la resolución afecta el
contraste y viceversa, como vemos en el siguiente esquema:

Resolución Contraste Prof. de Foco Brillo

Diafragma Abierto Alta Bajo Menor Alto
Diafragma Cerrado Baja Alto Mayor Bajo

Como recomendación estándar, se sugiere usar el diafragma de apertura del condensador a

un 70% de la apertura del lente/objetivo en uso. Si bien esto reduce el poder de resolución del
objetivo, mejora notablemente el contraste y la profundidad de foco. El condensador tiene una escala
de apertura marcada que sirve de guía. Dependerá también del preparado mismo, la mejor posición
del diafragma de apertura, según como se observe la imagen al variar lentamente el diámetro del
diafragma.

En caso de usar un objetivo de 100x con alta A.N. (1,30 a 1,40), deberá usarse también un
condensador de alta apertura. En observaciones críticas debe aplicarse aceite de inmersión entre el
lente frontal del condensador y el porta-preparado. Además de la inmersión usual a aplicar entre el
preparado (o cubre-objeto) y el objetivo, hay que hacer doble inmersión para obtener un máximo
rendimiento del sistema.

Campo Claro

A continuación se muestran tres condensadores típicos de la fabrica Nikon para campo

claro:

Tipo ABBE con A.N. 1,25 para trabajos generales en inmersión de aceite al
usar con objetivo 100x
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Tipo de lente frontal abatible con A.N. 0,90 para microfotografía y trabajos
generales.
Uso en seco al usar objetivo 100x.

Tipo Acromático con A.N. 1,35 para observaciones críticas con alta
resolución en inmersión de aceite al usar con objetivo de 100x.

NOTA: Al usar aceite entre condensador y porta-preparado, se debe asegurar que el aceite no
contenga burbujas de aire.

1.3.3- CONDENSADOR DE CAMPO OSCURO (CAMPO OSCURO CON ILUMINACIÓN

TRANSMITIDA "DÍA")

En la técnica de campo oscuro se procura que la luz de iluminación no llegue directamente al

observador, es decir que se usa únicamente la luz que se refracta en el preparado, por tal razón,
cambia su trayectoria. Este cambio de trayectoria hace que los rayos puedan penetrar por el objetivo
del microscopio, formar imagen y ser observada.

Al observar un preparado con la técnica de campo oscuro, éste se observa en total oscuridad
o penumbra. Dentro de dicho campo destacan con luz propia, todos aquellos objetos que difractaron
la luz.

Para la técnica de Campo Oscuro se construyen dos condensadores diferentes, uno a usar
con bajos aumentos y otro con alto aumentos con objetivo de inmersión de 100x.

Para eliminar posibles rayos no difractados que puedan haber penetrado al objetivo, no
permitiendo así un campo realmente oscuro, se les incorpora a los objetivos de 100x un diafragma, el
cual al ser cerrado parcialmente detiene esos rayos no difractados mejorando la calidad del campo
oscuro.

En las técnicas de Epifluorescencia (iluminación con luz incidente), también se trabaja en

campo oscuro, pero su obtención es algo diferente al método descrito aquí (ver microscopía de
fluorescencia capítulo K.

En la figura Nº11 se muestran los rayos de un condensador especial (condensador de campo

oscuro), los que son enviados en forma oblicua o diagonal hacia el preparado, de tal forma que si
siguen su trayectoria recta no penetran al objetivo del microscopio, pero aquellos rayos que tocan el
preparado se quiebran, siempre que el objeto tenga una refracción diferente al medio en el cual se
encuentra. Parte de ellos entran al objetivo y forman luego la imagen.
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FIGURA Nº11

Los medios de inmersión más usados, según aplicación, facilidad de limpieza y manejo son:
Aceite de inmersión estándar, Aceite de Cedro libre de fluorescencia propia, Glicerina y Agua. El
índice de refracción del medio de inmersión es determinante ya que incide en la refracción del haz de
luz.

Lentes Auxiliares y Filtros

Finalmente mencionamos que en el paso óptico de la luz desde la ampolleta hasta el

condensador, los fabricantes intercalan lentes colectores o lentillas para controlar la adecuada
conducción del haz de luz, para enfocar la lámpara y así poder centrarla fácilmente. También se
suministra normalmente uno o más filtros para efectos especiales, ya sea en la observación o en la
fotografía. La aplicación y uso se describe en capítulos posteriores.

1.4 ILUMINACIÓN SEGÚN KÖEHLER

Actualmente las principales fábricas de microscopios han adoptado como sistema de
iluminación el método llamado "Iluminación según Köehler". en la figura Nº12 está esquematizado y
debe considerarse que:

?? La imagen del diafragma de campo debe formarse en el preparado, es decir, ajustar condensador.

?? La imagen del filamento (o arco) de la ampolleta debe formarse en el diafragma de apertura del
condensador, es decir, ajustar lámpara correctamente.

?? El diafragma de apertura y el diafragma de campo trabajan en forma independiente. Su función

fue descrita en páginas anteriores.

?? Puede ser que el diafragma de campo y el diafragma de apertura deban ser levemente re –
centrados y ajustados cada vez que se cambia el lente/objetivo.
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1.4.1 Centraje del Condensador

a) Enfoque un preparado usando el objetivo de 10x.

b) Cierre algo el diafragma de campo, luego enfoque su imagen desplazando el condensador

hacia arriba o abajo.

c) Centre ahora dicha imagen usando los tornillos de centraje del condensador.

d) Abra el diafragma de campo hasta que la totalidad de este sea iluminada (el diafragma debe
desaparecer del campo visual).

1.4.2 Centraje de la Lámpara

a) Coloque un filtro neutro o un papel blanco sobre el lente de campo, luego observe y centre la
lámpara. Si dispone de un filtro especial de centraje, enfoque en él el filamento o arco de la
lámpara, desplazándola hacia delante y atrás, enfocando con el lente colector de la lámpara.

b) Controle observando a través del microscopio.

1.4.3 Ajuste la distancia intrapupilar y compense posibles diferencias de dioptrías de su vista

a) Junte o separe los oculares en el tubo hasta que vea un solo campo visual.

c) Posicione el objetivo de 40X, enfoque el preparado sólo con su ojo izquierdo, usando el
enfoque macro/micrométrico. Luego usando su ojo derecho, reenfoque el preparado pero
ahora solamente girando el anillo de ajuste de dioptrías del ocular derecho (no se debe mover
el sistema de enfoque micrométrico). De este modo se debe obtener foco simultaneo para
ambos ojos. En caso de duda, repita la operación. Este ajuste (compensación) de posibles
diferencias de dioptrías entre los ojos, es desde luego una operación individual diferente para
cada observador.
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Fotografía de diatomea. Este preparado es muy útil para comprobar la resolución de

un objetivo (lente)
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FIGURA Nº12
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OPTICA INFINITA :

En un sistema de la llamada “óptica infinita” la fábrica diseña el paso óptico desde el objetivo hasta la
entrada al tubo de observación (binocular o trinocular) de tal forma que los rayos recorran un camino
paralelo el cual facilita la intercalación de elementos ópticos como ser analizadores, módulos iterme-
dios, divisores de rayos,etc.
La imagen siguiente ilustra dicho paso óptico paralelo y su recorrido mas largo .
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1.5 SISTEMA DE CONTRASTE DE FASES

(O Modificación de Amplitud por Desplazamiento de Fases).

Antes de explicar de como se logra hacer visible un objeto mediante la técnica de contraste
de fases, se debe tener en cuenta que el ojo percibe solamente diferencias de intensidad (brillo) de la
luz, es decir, una mayor o menor amplitud de la onda provocada por una mayor o menor absorción de
la luz al atravesar el preparado. También el ojo percibe las diferencias de longitud de onda dentro de
cierto rango de luz visible, es decir, de los colores. El ojo no percibe diferencias de fases en las ondas
de luz.

La técnica de fase contrastada se usa precisamente para observar los objetos que
prácticamente no tienen coloración ni presentan mayores contrastes, situación que se da muchas
veces en preparados vivos e imposibles de teñir. Con ésta técnica se logra modificar la amplitud de
las ondas que atraviesan el objeto, con relación a las ondas que atraviesan el medio dentro del cual
este se encuentra, logrando así producir una imagen visible.
En un preparado teñido la onda que lo atraviesa a él y al medio que rodea al preparado,
afecta la amplitud de la onda (de acuerdo a la teoría de Abbé), dando origen a ondas de diferente
amplitud, lo que hace visible la imagen por diferencia de amplitud (brillo o intensidad) encontrado en el
objeto.

En las siguientes figuras se ilustra y describe las diversas situaciones. La figura "A"
corresponde a una imagen normal de microscopía en campo claro, visible por diferencias de amplitud.
Normalmente el rayo (onda), al cruzar un objeto lo suficientemente denso, es absorbido parcialmente y
pierde energía. Contrariamente, el rayo que no pasó por el objeto no fue afectado y mantiene su
intensidad. El ojo percibe ésta diferencia de amplitud entre las ondas y así puede ver la imagen.

En la figura "B" se muestra lo que pasa con un preparado el cual no presenta diferencias
significativas de absorción ni diferencias de color, en éste caso es posible que la técnica de contraste
de fase sí permita ver una imagen. Mediante un condensador con iluminación anular se logran
separar los rayos que no son difractados por el objeto en el preparado, de aquellos que sí son
difractados al cruzar un objeto del preparado. Luego el anillo de fase, ubicado en el lente de salida del
objetivo, desplaza la onda de la luz no difractada (directa) en un cuarto de onda con respecto a los
rayos difractados produciéndose ahora una diferencia de amplitud entre la luz directa y la difractada,
haciéndose, por tal motivo, visible al ojo. El anillo de fase es diseñado de tal forma que también rebaje
la intensidad de la luz directa para asemejarla a la intensidad de la luz difractada y así obtener una
mejor imagen.
En la página 30 se observa como se logra la iluminación anular y como es el recorrido de la
luz hasta formar la imagen intermedia. Una iluminación circular del condensador, atraviesa el
preparado y cae sobre el anillo de fase, ubicado en la parte posterior del objetivo. Este anillo de fase
desplaza en ¼ de onda (lambda) la luz, atenuando al mismo tiempo su intensidad (rayo amarillo en la
ilustración). La luz difractada (rayo naranja en la ilustración), también llega al plano de la imagen
intermedia y prácticamente no es afectado por el anillo de fases. Como se explica en el párrafo
anterior, así se produce en éste plano una imagen visible.
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Fig. “B” Esquema del desplazamiento de onda en ¼ lambda

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1.6 SISTEMA DE MODULACIÓN DE CONTRASTE SEGÚN HOFFMAN

El sistema de modulación de contraste según Hoffman, da una imagen de relieve estable que
bien se puede comparar con la microscopía de fase interferencial (DIC), descrita mas adelante pero a
diferencia de ésta se puede observar el preparado dentro de un recipiente plástico, debido a que el
sistema no requiere que su iluminación sea polarizada.

El sistema de modulación Hoffman lo conforman tres componentes: un modulador (ubicado

en la parte focal trasera del objetivo "HMC"), un diafragma de ranura (ubicado dentro del módulo
"HMC") y un polarizador opcional (el cual puede ser colocado en la unidad de iluminación diascópica).
Note que en caso de usar el polarizador se hace solamente para modificar el contraste de la imagen.

Principios de la Modulación de Contraste

Debido a que ojos, cámaras y películas, perciben sólo diferencias en la intensidad de la luz o
diferencias de color, ellos no pueden ver o percibir células o bacterias incoloras o transparentes.
Estos objetos incoloros/transparentes son llamados "objetos de fase" debido a que ellos solamente
afectan y desplazan la fase de la luz cuando ésta los traspasa.

Los objetos de fase podrían hacerse visibles si los teñimos, pero habría que privarlos de vida.
Para poder observarlos en su estado viviente se ha desarrollado:

1.) La fase contrastada ( ya descrita)

2.) El sistema de modulación de contraste según Hoffman.
3.) El contraste de interferencia diferencial.

En la microscopía de modulación de contraste Hoffman se usa el mismo sistema óptico que

en microscopía normal, pero se le adicionan partes o piezas que convierten la luz, que atraviesa los
especímenes transparentes, en luz que presentará una variación de intensidad. Estas partes
adicionales modulan la amplitud de aquella luz que pasó por el espécimen, cambiando así la
intensidad de la luz y por lo tanto haciéndola visible.

Pensemos ahora que la luz pasa por un preparado de fase y debido a que este objeto de
fase tiene un índice de refracción diferente al del material que lo rodea la luz va ser refractada en sus
bordes, (ver figura Nº13 donde se muestra la luz refractada en un objeto ). trapezoidal).

En la Fig. 13 vemos el principio general de la modulación de contraste. Se observa ahí un diafragma

de ranura en la apertura del condensador, y un modulador dentro del objetivo "HMC". Este modulador
es un filtro de densidad ubicado en la pupila de salida del objetivo "HMC". Este divide la pupila de
salida en tres regiones: oscura, semi-oscura y transparente.
Si no hay nada sobre la superficie del objeto, la luz atraviesa la región "semi-oscura" del modulador y
aparece semi-oscura (gris). Pero si la luz es difractada por un objeto de fase, ella pasa, ya sea por la
parte "oscura" o por la parte "transparente" del modulador dependiendo de la diferencia en su ángulo
de refracción, así la luz aparece oscura o brillante, de acuerdo a la región del preparado que atravesó,
y el objeto de fase se hace visible.
 31
En la microscopía de modulación de contraste la imagen aparece en relieve como en la
microscopía "DIC" pero la resolución puede ser algo inferior. Lo notable es que no hay influencia de
doble refracción, lo cual permite observar un espécimen con doble refracción
Algunas ventajas del sistema "Hoffman" son:

?? Imágenes tridimensionales son posibles.

?? No tiene "efecto - halo".
?? El contraste se puede variar.
?? Ideal cuando se deben usar recipientes plásticos (cultivos).
?? Aplicaciones en: Biología Celular, Botánica, Histología, Hematología, Neurología,
Genética.

Figura 13

(tipo ranura)
 32

1.7 CONTRASTE DIFERENCIAL DE INERFERENCIA "NOMARSKI"

El contraste diferencial de interferencia (=DIC), se obtiene con un montaje óptico especial en

el microscopio, que permite observar "objetos de fase", es decir, preparados incoloros los que no
afectan la amplitud de las ondas que los atraviesan, por lo que no son visibles.

Las características principales se resumen como sigue:

?? Permite observar desde estructuras muy finas hasta estructuras gruesas.

?? No presenta halos (como es el caso de fase contrastada).
?? Diferencias de fases hasta varios Lambda son observables.
?? Permite un grosor óptico favorable: 2 Lambda o menos.
?? Son posibles observaciones de incluso de 0,5 mm (sección del preparado).
?? La profundidad de foco es de 2 a 3 veces mayor que en contraste de fase convencional.
?? Se pueden observar también preparados teñidos.
?? Se puede variar el contraste desplazando el prisma Birefringente Nomarski.
?? Permite detectar gradientes en el preparado hasta 15°.

El equipamiento óptico especial que debe poseer el microscopio para la técnica "DIC" es:

?? Fuente de luz poderosa, 100 o 200 watts luz mercurio o luz halógena de 100 watt o más.
?? Filtro polarizador y Filtro analizador
?? Los prismas Nomarski (wollastone)
?? Set de objetivos especiales DIC para luz polarizada (libres de tensiones)
?? Platina giratoria (opcional recomendado).

Principio del Microscopio "DIC"

El microscopio genera un contraste de imagen, usando dos haces de luz polarizada,

levemente separadas entre sí, que oscilan en forma perpendicular el uno con respecto del otro. La
configuración óptica es tal, que éstos haces atraviesan el preparado, separados sólo por una distancia
que es inferior al poder de resolución del sistema óptico. El contraste se produce en las regiones
donde el objeto (preparado) presenta una gradiente en su índice de refracción, debido a que una
gradiente en el índice de refracción produce una diferencia de fase entre los dos haces de luz
polarizada. Los dos haces de luz son recombinados por el objetivo, el segundo prisma birefringente
Nomarski (wollastone) formando un solo haz. La diferencia de fases entre éstos dos haces genera
cambios en la intensidad de la luz.

Paso óptico de un sistema "DIC" de luz transmitida (ver figura Nº14).

El haz de luz que emerge a través del diafragma de campo desde la base del microscopio,
pasa por un filtro polarizador, luego pasa por el primer prisma Nomarski, dentro del cual es dividido en
dos haces de luz polarizada que vibran uno con respecto al otro en un plano de 90° (ver figura Nº16).
Luego un condensador dirige estos dos haces en forma paralela separados sólo por una mínima
distancia a través del preparado. Dentro de éste las dos ondas son afectadas por, la gradiente propia
del mismo y/o por la gradiente entre el preparado y su medio.
 33

El objetivo del microscopio capta los dos haces y los dirige al segundo prisma Nomarski, de
tal forma que los haces son recombinados dentro del prisma y emergen de él como un solo rayo con
una diferencia de fases. Luego atraviesa un filtro pol-analizador y forma la imagen intermedia. El filtro
analizador está orientado en 90° con respecto al filtro de polarización, de manera que produce la
extinción de la luz de iluminación.

Esto significa que está orientado en 45° respecto del plano de oscilación de cada una de las
ondas entrantes, lo que asegura igual intensidad de ambos rayos o haces de luz (ver figura Nº15).

La separación de los dos rayos polarizados "O" y "E" es de las siguientes magnitudes:
?? Para un objetivo de 16x/0,32 Es de 1,30 ? m
?? Para un objetivo de 100x/1.25 Es de 1,25 ? m

La imagen intermedia se forma por una doble imagen producida por los dos rayos. Sin
embargo, ésta doble imagen no se aprecia como tal, debido a que su separación no sobrepasa el
poder de resolución del objetivo. En la figura Nº17 se puede observar el desplazamiento.

La imagen "DIC" es notablemente diferente a una imagen de fase contrastada, en el sentido

que posee un fuerte relieve o una apariencia pseudo-tridimensional. Esta imagen también da la
impresión que se están viendo detalles en la superficie del preparado, pero ésta impresión es falsa en
la mayoría de los preparados biológicos.

La manera de variar la distancia del paso óptico es desplazando el prisma Nomarski y

manteniendo su posición en 90° con relación al eje óptico.

En otro sistema similar (Smith), se intercala un compensador "Desenarmont", el que es usado

para controlar y variar el retardo de fases entre una onda (haz) con respecto a la otra, en vez de
desplazar el prisma Nomarski, como se describió anteriormente.

Nota: El prisma birefringente Wollastone modificado (el eje óptico de su cristal está inclinado) se llama
Nomarski. Tiene la ventaja de sacar la figura de interferencia del prisma y así usar objetivos de
mayor poder.
 34

FIGURA Nº14
 35

FIGURA Nº15

FIGURA No16

FIGURA Nº17
 36

1.8 MÉTODOS COMBINADOS DE OBSERVACIÓN:

Combinación de Epi-Fluorescencia (ver ese capítulo) con DIC o fase contrastada

Preparados de rápido desvanecimiento durante la observación son a veces problemas

insalvables en la fluorescencia. En estos casos un método de observación muy efectivo es usar una
combinación con DIC/Nomarski, o con fase contrastada. De este modo se puede primero buscar,
mirar y luego posicionar el objeto usando ya sea DIC o fase, para luego pasar a la excitación con la
fluorescencia episcópica, esto permite observar y microfotografiar con más calma, sin estar
preocupado por un desvanecimiento rápido. Más aún, observaciones con "DIC" o fase, le dan la
oportunidad de una revisión morfológica en todo el espécimen, pudiendo así confirmar la ubicación de
la parte iluminada del espécimen (ver figura Nº18).
Observación Simultánea de Epi-Fluorescencia y DIC

En éste caso se usan la epi-fluorescencia y la iluminación con DIC/Diascópica al mismo

tiempo, para así observar una imagen combinada con ambas técnicas. Al observar sólo con
fluorescencia es dificultoso detectar donde está el área que emite la fluorescencia, o saber como es la
estructura fina del área donde se esta produciendo la emisión. La observación combinada es una
efectiva ayuda para llevar a cabo la observación morfológica de todo el preparado y al mismo tiempo
ver la existencia de fluorescencia (ver figura Nº19).
Observaciones simultáneas de epi-fluorescencia y fase contrastada son igualmente posibles y
útiles.

FIGURA Nº18
 37

FIGURA Nº19
 38

1.9 MICROSCOPÍA DE POLARIZACIÓN

Se puede obtener luz polarizada a partir de luz no polarizada, filtrándola por transmisión o
lográndola por reflexión, esto sucede cuando la luz se refleja sobre una superficie plana y lisa.

Por transmisión, que es el caso que nos interesa, en una fuente de luz como lo es la
ampolleta del microscopio, en el haz de luz que ella emite sus ondas luminosas son transversales a la
dirección (eje) de propagación de dicho haz. Es decir, estas ondas oscilan en todos los planos
perpendiculares a la dirección de propagación de la luz, por lo tanto esta luz no esta polarizada.

Con un "Prisma de Nicol" (o filtro Nicol), se pueden eliminar o absorber todas las vibraciones,
dejando pasar sólo las vibraciones de uno de los planos de oscilación (plano de polarización). Un
elemento de polarización "Nicol" deja pasar como luz polarizada alrededor de un 32% de la luz
incidente. La luz que emerge del prisma o filtro Nicol es luz polarizada, es decir vibra en un solo
plano.

Al intercalar en el haz de luz un segundo filtro polarizador, éste recibe en microscopía el

nombre de analizador, su giro permite orientarlo de tal forma que la luz polarizada del primer filtro,
puede pasar casi totalmente, solo parcialmente o no puede pasar, según la orientación del analizador
con respecto al polarizador (ver figura Nº21).

En un microscopio de polarización se intercala generalmente el filtro de polarización entre la

fuente de luz y el condensador (siempre antes del preparado), el segundo filtro (analizador) se
intercala entre el objetivo y los oculares de observación, generalmente en el tubo bino- o trinocular. Al
girar el filtro analizador o el polarizador se controla y varía el plano de polarización y por lo tanto
también la relación entre el polarizador y el analizador.

Otros elementos que pueden intercalarse en el haz de un microscopio de polarización son:

platina giratoria con divisiones en 360°, cuña de cuarzo, analizador Sernamont, placa de yeso de ¼
Lambda, lente de Bertrand, y también para ciertos trabajos cristalográficos se usa una platina
universal "de Fedro". Más adelante se detalla la función de cada uno de éstos elementos.

Un microscopio de polarización debe usar óptica libre de tensiones especialmente en sus

objetivos. El fabricante identifica dichos objetivos con la palabra "POL" o "DIC". El revólver, en el cual
se montan los objetivo, debe permitir centrar exactamente cada objetivo en su eje óptico.

Normalmente se usa el analizador con respecto al polarizador, en posición cruzada, así sus
direcciones de vibración son perpendiculares entre sí, por lo tanto si en el campo de observación no
hay algún espécimen, éste permanece oscuro (negro), pero en las partes donde si hay un elemento
que interfiere con el haz de luz polarizada, éste aparecerá luminoso y generalmente coloreado sobre
el fondo oscuro. Los elementos o materiales que permanecen oscuros no interactúan con la luz
polarizada y son llamados "isotrópicos", éstos tienen un solo índice de refracción. Son substancias
isotrópicas por ejemplo los líquidos (excepto los cristales líquidos), las fusiones, polímeros no
orientados, vidrio sin tensiones, minerales y productos químicos del sistema cúbico de cristales como
por ejemplo la sal de mesa. Las substancias que interactúan y aparecen luminosas y coloreadas en
alguna orientación entre los polarizadores cruzados son llamados "anisotrópicos". Estas substancias
desvían la luz generalmente en dos índices de refracción principales, por ejemplo, polímeros
orientados, fusiones orgánicas enfriadas, vidrio con tensiones, todos los minerales y químicos en el
sistema de cristales hexagonales, tetragonales, orthombicos, monoclínico, trigonal.
 39
En el campo biomédico los elementos que presentan anisotropía son por ejemplo, el pelo,
dientes, esmalte, huesos, uñas, fibras musculares en contracción. El beneficio de la polarización es
por lo tanto el de poder diferenciar entre especímenes transparentes isotópicos y anisotrópicos.

Otro efecto producido con el método de polarización, es el de los colores de interferencia,

estos colores son intrínsecos al material anisotrópico y son determinados tanto por el grosor del
material como por su grado de anisotropía o birrefringencia. La birrefringencia está relacionada a la
diferencia numérica entre los índices principales de refracción. La birrefringencia de una substancia,
no puede cambiarse sin cambiar la substancia, pero sí se puede modificar generalmente el grosor y la
substancia anisotrópica puede variar su color (controlando su grosor), el color mismo proviene del
retardo de uno de los componentes de la luz polarizada a través de la substancia cristalina.

La formación de colores no es como la de un espectro continuo, más bien son colores de

interferencia que se forman en una secuencia definida, de acuerdo a la diferencia del paso del haz de
luz a través del material birrefringente (podemos observar efectos similares al descrito al mirar una
burbuja de jabón o una mancha de aceite sobre el agua).

Los colores están en una secuencia característica llamada serie "Newton", estos están
formados en "ordenes" los cuales, en caso de materiales birrefringentes, deben ser interpretados de
acuerdo al grosor del material y a su birrefringencia (n2-n1).

Los llamados compensadores y las placas de tinte, son placas delgadas de material
birrefringente, como el cuarzo, la mica, y el yeso, las que están cortadas en una dirección
cristalográfica determinada, de tal manera que la dirección de sus componentes de vibración, rápida y
lenta, sean conocidos. Estas placas son insertadas en el paso óptico del microscopio y así se retarda
la luz en una longitud de onda fija, o en una longitud de onda variable pero conocida.

Los colores exhibidos por las substancias anisotrópicas pueden variarse de dos formas con el
uso de éstos compensadores, dependiendo si el cristal está en posición aditiva o sustractiva con
respecto al compensador. Estos compensadores también son útiles en la detección de substancias
con una birrefringencia pobre (el color de fondo puede cambiar de negro (oscuro) a gris o a rojo-
magenta al usar un compensador).

Lente Bertrand

Lente auxiliar que se inserta por sobre el objetivo, para llevar la imagen del plano focal
posterior del objetivo al plano focal frontal del ocular, posibilitando así observar la pupila de salida sin
tener que remover el ocular al estar usando la iluminación según Koehler (ver figura Nº20
Se usa como ayuda cuando se necesita observar figuras de interferencia permitiendo la
observación conoscópica.

La imagen (figura Nº22) conoscópica, es la imagen de interferencia del preparado, la cual

difiere dependiendo de si son cristales uniaxiales o biaxiales, como también de la dirección del corte
de dichos cristales con relación a ejes cristalográficos u ópticos. En las figuras de la página 43 se
pueden observar una variedad de posibles imágenes de interferencia las cuales dependen del grado
de birrefringencia, de si son cristales uniaxiales o biaxiales, de la dirección del corte, etc.

Placa de tinte de ¼ ? (yeso): Produce retardo de onda en ¼ de Lambda.

Compensador Sénarmont : Permite medir el retardo de onda con una precisión de 1

Lambda (?).

Cuña de Cuarzo : Permite medir en forma burda el retardo de onda en un

rango entre 1? a 6?.
 40

Nota: Para observaciones biológicas muchas veces es suficiente disponer solamente de un filtro
polarizador y otro analizador, sin más accesorios o complementos.

FIGURA Nº20
 41

FIGURA Nº21
 42

FIGURA Nº
 43

ROCA LUNAR

Acido Sulfosalicilico
 44

1.10 MICROMETRO DE OCULAR (MEDICIONES CON EL MICROSCOPIO)

Para poder medir un espécimen con el microscopio es necesario conocer el aumento exacto
con el cual se está observando el preparado. La fórmula de multiplicar el aumento del objetivo por el
aumento del ocular y posiblemente también por algún aumento intermedio alojado en el tubo del
microscopio, no da suficiente exactitud para realizar una medición precisa. Básicamente esto sucede
debido a que el aumento indicado tanto en los objetivos como en los oculares y posibles lentillas
intermedias es solo aproximado.

Método de calibración o determinación exacta del aumento:

Hay que disponer de un ocular micrométrico o ocluar con disco micrométrico. Este disco es
insertado en un ocular el cual debe ser enfocable, es decir, que permita enfocar nítidamente al disco
que se ha insertado en él. Además hay que disponer de una reglilla micrométrica de mesa
(preparado) la cual debe ser de precisión y generalmente se suministra una reglilla de 2mm. divididos
en 200 partes o de 1mm. dividido en 100 partes. Esta reglilla se coloca en el microscopio como si
fuese un preparado y luego se observa con el objetivo a usar y con el ocular micrométrico. Ambas
imágenes se sobreponen y deben ser alineadas girando el ocular (ver figura Nº23)
De la observación podemos desprender a cuantas centésimas de milímetros (o micras)
corresponde cada división de la reglilla ocular. Desde luego esto va a variar según el aumento del
microscopio usado en ésta observación.
La ilustración muestra, como ejemplo, que en éste caso 45,8 divisiones de la reglilla de mesa
corresponden a 100 divisiones de la reglilla ocular. Como sabemos que cada división de la reglilla de
mesa es, en éste caso, de 0,01mm (reglilla de 1mm dividida en 100 partes) resulta que cada división
de la reglilla ocular corresponde a: 0,00458mm (4,58µ)

45,8 x 0,01
100 mm

Finalmente se reemplaza la reglilla de la mesa por el preparado (objeto) a medir. Sabiendo

ahora a cuanto corresponde cada división de la reglilla ocular, podemos efectuar la medición exacta.
Esta determinación basta hacerla una vez con su microscopio y anotarse la calibración para
cada lente-objetivo. Obviamente usando siempre el mismo ocular con su retículo.

Mediciones en profundidad dentro del preparado:

Estas se realizan generalmente solo con altos aumentos usando el tambor micrométrico que
tiene el sistema de enfoque fino de su microscopio al enfocar puntos en el preparado que están a
diferentes profundidades o distancias del objetivo (ver figura Nº23).
 45

FIGURA Nº 23
 46

BASES DE LA MICROFOTOGRAFÍA (con película)

Walter Ivens H.

Los componentes básicos en la microfotografía (sobre película) son:

1.) La película fotográfica: (color negativa o color diapositiva)

(blanco y negro negativa)
2.) La cámara fotográfica (diferentes tipos)
3.) El fotómetro o exposímetro (generalmente es parte integrante del sistema)
4.) El microscopio básico con tubo trinocular y fuente de luz.
5.) La óptica (condensador, lente objetivo, ocular acople, filtros.
6.) El revelado fotográfico y el laboratorio fotográfico.

2.1 LA PELÍCULA FOTOGRÁFICA

Generalmente se usa película en color para micro-fotografía y se recurre a película blanco y

negro sólo para casos especiales.
En la película de color se debe distinguir la película color negativa y la color diapositiva. El
color negativo presenta un negativo en colores irreales o inversos es decir los colores no
corresponden a los colores de la muestra y solo al ser copiados o ampliados a papel fotográfico color,
este último muestra los colores reales o aproximadamente reales que presentaba el preparado (por
nueva inversión de colores).
La película color-negativa se usa si se desea obtener una copia o ampliación en papel color y
la película color diapositiva se usa si se quiere obtener una diapositiva para ser proyectada sobre una
pantalla o telón.
Las películas difieren entre sí por su sensibilidad a la luz y por su respuesta al color de la luz
usada para iluminar el preparado.
En relación con su sensibilidad a la luz, las películas se clasifican por valores, los cuales se
expresan en “ISO”, “ASA” o “DIN”. Siendo “ISO” actualmente la denominación internacional. Asa es
la clasificación norteamericana y DIN es la clasificación alemana. Una película puede tener por
ejemplo: 50, 100, 200, 400 ISO u otras sensibilidades a la luz. Si el valor “ISO” es el doble de otro,
significa que la sensibilidad de la película es también el doble, o sea, necesita la mitad de la luz
(exposición) que la otra película.
Hay que tener en cuenta que a menor sensibilidad de la película, mayor es su resolución o
nitidez (menor grano) y a mayor sensibilidad mayor es el tamaño de grano por lo tanto tiene menor
nitidez. Igualmente que a mayor sensibilidad de la película esta presenta menor contraste de colores
y viceversa, a menor sensibilidad, presenta un mayor contraste de colores.

Con relación a su respuesta de color a la luz, las películas pueden ser fabricadas para “luz
día”, “luz artificial” o “luz infrarroja”. La película “luz día” esta balanceada en su respuesta de color
para la luz de sol en un día levemente nublado. Dicha luz es luz blanca la cual contiene todo el
espectro de colores en ciertas proporciones lo cual hace ver los colores de las cosas tal como
estamos acostumbrados desde siempre. Esa composición de color se llama temperatura de color de
aproximadamente 5.400ºK (Kelvin) en el caso “luz día”.
 47

La luz emitida por una ampolleta de casa, por una ampolleta de tungsteno o wolfragmio de un
microscopio antiguo, es nominada “luz artificial” y su composición de colores contiene una mayor
cantidad de rojo lo cual significa una luz más rojiza a la vista. La temperatura de color de esta luz es
de aproximadamente de 3.600ºK. Sí se toma una fotografía con película de luz día iluminando el
preparado con luz artificial, la fotografía presentará una coloración amarilla/rojiza. A su vez, sí se
toma una fotografía con película para luz artificial, iluminando con luz de sol, la fotografía presentará
colores azulinos.
La película infrarroja es para objetos que emiten radiación infrarroja (generalmente calor).

2.2 LA CÁMARA FOTOGRÁFICA O SISTEMA MICROFOTOGRÁFICO

Una cámara fotográfica tradicional consta siempre de un lente-objetivo y de una caja

(cámara) porta-película. En toda cámara fotográfica se regula la cantidad de luz necesaria para la
sensibilidad de la película elegida, mediante el control del tiempo o lapso durante el cual la luz llega a
la película (obturador) y mediante el control del diámetro del haz de luz que llega a la película
(diafragma).
El obturador es una puerta que permanecerá mas o menos tiempo abierta al paso de la luz y
el diafragma es un control anular que puede ser abierto o cerrado para dejar pasar un haz de luz de
mayor o menor diámetro, generalmente el tiempo de exposición y el valor del diafragma a usar es
indicado por un fotómetro o exposímetro. Dicho fotómetro mide la luz disponible y, sabiendo la
sensibilidad de la película, indica que valores de diafragma y obturador son convenientes de usar en
cada caso. Ahora bien, una cámara o sistema microfotográfico es en su concepto básico muy similar
al de una cámara fotográfica normal siendo en el microscopio reemplazado el lente de la cámara por
el objetivo y ocular del microscopio y el diafragma es determinado por el sistema óptico del
microscopio, especialmente por el objetivo y el ocular en uso como por la configuración óptica y física
interna del microscopio entre el objetivo y la película.

2.3 FOTÓMETRO (EXPOSÍMETRO)

La cantidad de luz en el microscopio es dada por su fuente de luz y su regulación en

intensidad lumínica es controlada por el voltaje aplicado a ella. La luz emitida por la lámpara es
controlada por uno o dos diafragmas del microscopio (el diafragma de campo y el diafragma de
apertura) y por posibles filtros que se puedan intercalar.
Una vez que la luz ha cruzado por los diafragmas, filtros, lentes condensador, objetivo y
ocular, es medida por el fotómetro antes de llegar a la película. De esta manera cualquier variación en
la cantidad de luz en su trayecto hasta la película es correctamente cuantificada por el fotómetro,
dando así el tiempo de exposición correcto en cada caso.

2.4 LA CALIDAD Y CUALIDAD DE LUZ

Usada en el microscopio se refiere a su temperatura de color, es decir a su composición

espectral. Como disponemos de una fuente de "luz artificial" y se trabaja generalmente con película
"luz día" debemos lograr que la luz artificial del microscopio sea lo más semejante a la "luz día". Esto
se obtiene igualando su temperatura de color en los 5.600ºK.
 48

FIGURA Nº24
 49

La correcta elección de la fuente de luz, la aplicación del voltaje que indica la fábrica para que la
ampolleta emita una temperatura de color más cercana a la de luz día y con una corrección final
mediante un filtro, generalmente azul pálido o de interferencia producen el resultado deseado. En los
manuales de uso para microfotografía los fabricantes indican que para un determinado microscopio y
película, se utilice un cierto voltaje y un filtro de características indicadas . Si se respetan dichas
indicaciones y sí el posterior revelado de la película es bien realizado, los colores obtenidos son muy
reales.
Los tiempos de exposición en microfotografía pueden variar normalmente entre 1/100 de
segundo a varios minutos de exposición (10 o más minutos). Tiempos muy comunes en preparados
histológicos observados en campo claro pueden ubicarse alrededor de 1/4, 1/2, 1 o 2 segundos. En
preparados de fluorescencia y campo oscuro (ultramicroscopía) los tiempos pueden ser de varios
minutos.

Los sistemas automáticos de microfotografía facilitan bastante el trabajo ya que miden y

controlan el tiempo de exposición automáticamente y luego de tomar la fotografía hacen avanzar la
película en forma motorizada, dejando inmediatamente preparado el sistema para la próxima
fotografía. Algunos sistemas permiten además medir la luz en dos áreas diferentes: en un caso se
mide la luz de toda el área a fotografiar y en el otro caso se mide la luz de solo una reducida parte del
preparado, la que realmente más pueda interesar (medición spot).
Los sistemas microfotográficos automáticos son pequeños microprocesadores, los que
indican en su "display" el tiempo que durará la toma o el tiempo que permanece abierto el obturador.
Esto incluso se puede observar en forma previa a la toma misma. Además indican si se produce
alguna falla en el proceso o cuando se han completado todas las tomas y desde luego permiten usar
películas de diferentes sensibilidades.

2.5 EL MICROSCOPIO PARA MICROFOTOGRAFÍA

El microscopio a usar en microfotografía debe tener una base sólida y un sistema de

iluminación adecuado (generalmente Koehler), la ampolleta en lo posible debe ser del tipo halógeno
(iodo) o de mercurio o xenón en caso de fluorescencia. Además es necesario equipar el microscopio
con un tubo de observación/fotográfico trinocular, el cual permita la fácil y segura instalación de un
sistema microfotográfico.
Para obtener el máximo rendimiento óptico del microscopio en la observación y en
microfotografía es esencial, el correcto y total centraje de su sistema óptico.

2.6 LA ÓPTICA

La calidad de la microfotografía depende escencialmente de la calidad óptica de todos los

componentes del microscopio, pero especialmente de la calidad de sus lentes/objetivos, los cuales
deben tener una buena resolución (alta apertura numérica) una buena corrección cromática y
proporcionar un campo lo más plano posible.
El acople óptico entre microscopio y cámara fotográfica debe ser el indicado por fábrica,
generalmente mediante un ocular (telescopio) de acople el cual proporciona el foco preciso sobre la
película y participa en la determinación del aumento final sobre ella.
Los filtros de color a usar en microfotografía color deben ser solamente los recomendados por fábrica
para compensar la temperatura de color.
 50

Los filtros llamados neutros o grises no afectan el color de la luz e influyen exclusivamente
sobre la cantidad de luz. Es decir los filtros neutros permiten bajar la intensidad de la luz sin afectar
su temperatura de color.

2.7 EL REVELADO FOTOGRÁFICO:

Este es realizado generalmente en los laboratorios especializados. Se recomienda elegir bien

y/o probar con cual laboratorio se obtienen los mejores resultados y el menor maltrato a los negativos
y ampliaciones en papel . Es conveniente tratar de trabajar siempre con la misma película (marca,
tipo, sensibilidad) y con un mismo laboratorio, si este trabaja satisfactoriamente.

2.8 MANEJO DE LA MICROFOTOGRAFÍA:

Desde luego el usuario debe dominar el centraje del sistema óptico, lámpara y condensador
tal como se necesita para la observación a través del microscopio. Una vez realizado dicho centraje
(ver "bases de la microscopía") deberá enfocar correctamente en el sistema microfotográfico.
Observando a través del telescopio de enfoque se ven en el centro una cruz de doble raya y un
circulo. Sin importar el enfoque del preparado mismo, se debe proceder a mirar con un ojo, luego
girar el ocular del telescopio hasta distinguir nítidamente las rayas de la cruz y el círculo. Luego,
observando siempre con el mismo ojo se enfoca el preparado, pero usando el sistema de enfoque
macro y micrométrico del microscopio. Procediendo así se tiene la seguridad que su preparado esta
en foco sobre la película. Es posible que al observar luego a través del tubo binocular este no
muestre un enfoque exacto de la imagen pero no se deberá retocar el control del foco ya que en
microfotografía es la imagen observada en el telescopio de enfoque la que prevalece y debe
respetarse. Para obtener coincidencia de foco en el tubo binocular/trinocular podrá girarse el sistema
de enfoque de los oculares (siempre que sean de tal tipo) hasta que se vea nítido el preparado con
ambos ojos en el mismo punto de enfoque que observábamos en el sistema microfotográfico.
El campo que se fotografía es desde luego rectangular de acuerdo a la forma y tamaño del
negativo usado y por lo tanto su área es menor a la observada en los oculares (que proporcionan un
campo circular) por tal motivo el telescopio de enfoque muestra unas demarcaciones que delimitan el
campo que será fotografiado ya sea para película de 35mm o para Polaroid.
También se puede disponer de un ocular normal para el tubo binocular al cual se le inserta
una placa que muestra el encuadre de la fotografía.

En la siguiente ilustración se observa una cámara fotográfica montada en un microscopio en el cual se

usa la luz transmitida e incidente a la vez.
51
 52

2.9 RESUMEN Y SECUENCIA PARA MICROFOTOGRAFIAR

1) Ubicar su microscopio sobre una mesa firme y sólida para evitar vibraciones que pueden afectar la
nitidez de la imagen.
2) Revisar que todas las piezas del microscopio estén firmemente acopladas entre sí y que el sistema
óptico este totalmente limpio.
3) Encender la fuente de luz, a intensidad cómoda para el observador.
4) Centrar todo el sistema óptico del microscopio, lámpara, ajustar el diafragma de campo, ajuste del
condensador y apertura del diafragma. (Ver "bases de la microscopía").
5) Ajustar el telescopio de enfoque del sistema microfotográfico con uno de los ojos del observador
(Ver nítido cruz y circulo).
6) Seleccionar y colocar el filtro de color (o interferencia) recomendado por fabrica.
7) Colocación y enfoque del preparado respetando lo descrito más arriba. (Ver nota al pie)
8) Ubicar la parte del preparado de tal forma que se encuentre dentro de las demarcaciones
indicadas en el telescopio de enfoque.
9) Llevar la intensidad de la luz al valor indicado por la fabrica para microfotografía.
10) En caso de que la luz sea demasiado intensa, se recomienda usar filtros neutros grises (en caso
dado sirve también un trozo de papel blanco que se coloca sobre el haz de luz que emerge de la
base del microscopio).
11) Disparar el sistema fotográfico.

Desde luego previamente se debió cargar la cámara con la película adecuada, generalmente color de
100 ISO (ASA) e indicarle al sistema microfotográfico el tipo de película que se está usando.

Nota: En bajos aumentos (objetivos 2x y 4x) pueden presentarse problemas de foco en la foto debido
a la acomodación del ojo del observador (especialmente en gente joven). Con cierta práctica y
tratando de enfocar en forma rápida, se puede evitar dicha acomodación del ojo. También es
posible usar una lupa de enfoque adicional que evita el problema.
 53

INFORMACIÓN ÓPTICA PARA CÁMARA DE 35mm.

(MICROSCOPIOS BIOLÓGICOS Nikon años 80/98)

Objetivos Apertura Resolución Lente de Aumento total Profundidad Campo de

numérica NA e(um) proyección o ß(X) de foco PFT* observación
acople (X) F (mm)
2.5 10 4.3
4x 0.13 2.10 4 16 16.3 2.7
5 20 2.2
Objetivo Plan acromático

2.5 25 1.7
10x 0.30 0.90 4 40 3.1 1.1
5 50 0.9
2.5 50 0.87
20x 0.50 0.55 4 80 1.1 0.54
5 100 0.43
2.5 100 0.43
40x 0.70 0.40 4 160 0.6 0.27
5 200 0.22
100x 2.5 250 0.17
(Oil) 1.25 0.22 4 400 0.3 0.11
5 500 0.09
2.5 10 4.3
4x 0.20 1.40 4 16 6.9 2.7
Objetivo Plan apocromático

5 20 2.2
2.5 25 1.7
10x 0.45 0.60 4 40 1.4 1.1
5 50 0.9
2.5 50 0.87
20x 0.75 0.40 4 80 0.5 0.54
5 100 0.43
2.5 100 0.43
40x 0.95 0.30 4 160 0.3 0.27
5 200 0.22
100x 2.5 250 0.17
(Oil) 1.40 0.20 4 400 0.2 0.11
5 500 0.09
*PFP: Profundidad de foco en el plano de la película
 54

FOTOGRAFÍA DIGITAL
Walter Ivens H.

La fotografía digital o electrónica tiene ahora en la microscopía una gran importancia al incrementarse
su calidad en la imagen en comparación con los inicios de ésta técnica digital, por lo cual es
necesarios conocer hoy bien sus características, ventajas y desventajas.
Una fotografía digital es una imagen que se obtiene en forma electrónica y ya no por medio de
películas a base de granos de plata sobre celuloide las que una vez “tomadas” deben ser reveladas.
Una cámara digital capta una imagen transformándola en señales eléctricas y almacenado éstas en
tarjetas o chips de memoria . Estas señales eléctricas se descargan luego ya sea a una computadora,
un monitor o un televisor para poder ser observadas.
Un tratamiento con programas de computación especiales (como Photoshop) permite posteriormente
modificar, mejorar o insertar datos adicionales en la imagen original obtenida.
La calidad de la imagen digital puede alcanzar hoy ya prácticamente la misma calidad a la que se
obtiene con una película fotográfica tradicional, siempre que se conozcan los principios básicos que
determinan dicha calidad en una imagen digital y como manejarlas en la computadora.
La nitidez de una imagen digital depende por una parte de la cantidad de puntos que forman dicha
imagen (los así llamados “pixeles”), mientras mas pixeles forman una imagen digital de un tamaño
determinado, mas nítida será dicha imagen.
Si una cantidad determinada de pixeles forma cierta imagen esta aparecerá mas nítida mientras
menor sea el área sobre la cual se distribuyen esa cantidad de pixeles y viceversa la imagen
aparecerá menos nítida mientras mayor sea el área sobre la cual se distribuyó esa cantidad
determinada de pixeles.
La nitidez de la imagen también dependerá del tamaño de cada pixel, mientras mas chico cada pixel
mejor es la nitidez de la imagen ya que ésta se formará con puntos mas pequeños. Sin embargo hay
que considerar que mientras mas chicos los pixeles menor es la sensibilidad a la luz y viceversa
mientras mas grande los pixeles mayor es la sensibilidad a la luz de la cámara fotográfica digital. Hay
una similitud con la película tradicional la cual, a mayor sensibilidad, tiene una menor nitidez debido a
que sus granos de plata que forman la imagen son de mayor tamaño.
Además un pixel mas grande, si bien da una mayor sensibilidad a la luz, desmejora la imagen, ya que
se produce un mayor "ruido electrónico" en la cámara. La información sobre el color depende de la
“profundidad" en los planos de los pixeles, los llamados “Bit”, es decir si representamos los pixeles
como un punto los bit son “los puntos” que están “debajo" de los pixeles o los que forman un pixel ,
mostrados aquí en cubitos: (8 Bits son 1 Byte)
Mientras mas bits tenga cada pixel mejor es la información de color de la que va disponer la imagen
pero el peso de la imagen será también afectada por la cantidad de informacion registrada ya sea en
blanco y negro (grises) o en color .

Desde luego tiene una importancia muy significativa en la resolución o nitidéz de la fotografía digital la
resolución que proporciona el sistema óptico del microscopio. Especialmente el objetivo es
determinannte ya que mientras mayor sea su apertura numérica (A.N.) mejor será su poder de
definición. Así podemos decir que una alta calidad del objetivo con un muy buen sistema óptico del
microscopio mas la mayor cantidad de pixeles de la cámara digital y el menor tamaño de éstos
pixeles mejor será la nitidéz obtenida en la fotografía.
Una buena cámara digital debe tener una gran cantidad de pixeles, éstos deben ser del menor tamaño
la cámara debe tener una alta sensibilidad a la luz y no debe producir mucho ruido de fondo.
(electrones excitados por otros factores que no son la luz recibida).
 55

Hay diferentes programas computacionales que permiten capturar y manejar las imágenes digitales,
en un sentido de modificación, color, recorte, tamaño, etc. , uno de esos programas es el llamado
“Photoshop” . Hay también otro tipo de programas, los cuales si tienen una finalidad totalmente
diferente, son los programas técnicos de ANÁLISIS DE IMAGEN los cuales partiendo de una imagen
digital en la computadora, permiten un sinnúmero de cálculos, conteos, promedios y análisis etc. etc.
de la imagen. Programas muy conocidos de este tipo son los programas de MEDIA CYBERNETICS.

Es muy importante saber elegir la resolución con la cual va a trabajar una imagen en su computadora
ya que mientras mas resolución Ud. demanda mas grande es el archivo y mas lento es el manejar y
procesar la imagen. Por ejemplo una imagen de 200 pixeles por pulgada es 4 veces mas grande que
una imagen similar de 100 pixeles por pulgada.
El saber cuanta resolución es necesaria va depender del objetivo y destino final que desea a darle a
la imagen obtenida, es decir de la resolución requerida en la pantalla, o en la impresora.

Para obtener una aceptable resolución la cámara que Ud. elija debe tener en lo posible mas de
1.300.000. pixeles, es decir debe tener por ejemplo no menos de 1300 x 1.000 pixeles (ancho x alto
de la imagen original) En relación a los bits ojalá su computadora permita 8 , 18 o 24 bits por pixel.
(24bits=16 millones de posibles valores de color.)

Otro punto importante en una cámara digital es su sensibilidad a la luz, especialmente si se trabaja
en fluorescencia, (poca luz disponible) ya que en éste último caso la cámara debe tener una
sensibilidad equivalente a 200 hasta 400 ISO o más y debe tener un bajo ruido de fondo y muchas
veces son necesarias camaras especializadas de alto costo.
Las camaras digitales se adaptan al tubo trinocular o incluso binocular del microscopio, haciendo falta
para eso el acople óptico y/o mecánico respectivo. (en forma similar a la fotografía tradicional con
película) Nikon, por ejemplo, dispone de una cámara digital semi-profesional la cual cumple con los
requerimientos normales de resolución, color, velocidad de exposición (sensibilidad) conexión a
computadora y conexión a monitor o TV disponiendo desde luego también de la adaptación para los
microscopios Nikon y posiblemente para otras marcas.
 56

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA.
Walter Ivens H.

3.0 ¿QUÉ ES FLUORESCENCIA?

Es la emisión de luz de una substancia sometida a la estimulación de: Luz, calor o actividad
química. Este fenómeno ocurre cuando la aplicación de un estímulo, provoca que los electrones de
una substancia puedan pasar a un nivel de mayor energía (estado de excitación) el cual es seguido
por la entrega de la energía sobrante en forma de luz cuando los electrones vuelven a su estado
original (o básico).
Además de lo mencionado anteriormente, hay otros estímulos que pueden dar pie a una
luminiscencia , esto estímulos pueden ser : Emisiones radioactivas, rayos-x, fricción, sonido y varios
otros mediadores, originando termoluminicencia, luminicencia de rayos-x y triboluminicencia.)
La luminiscencia estimulada por luz es conocida con el nombre de fotoluminiscencia y este
fenómeno a su vez se divide en dos tipos: Fluorescencia y fosforescencia de acuerdo a su
mecanismo de emisión de luz.

Fotoluminiscencia: - Fluorescencia
- Fosforescencia

La diferencia entre fluorescencia y fosforescencia se define usualmente diciendo que la

fluorescencia se caracteriza por la cesación instantánea de emisión de luz cuando se interrumpe la luz
de excitación, mientras que la fosforescencia persiste por un periodo limitado de tiempo, después que
se interrumpió la luz de excitación.

En términos prácticos podemos decir:

Fluorescencia es un fenómeno en el cual una substancia
absorbe luz Ultravioleta o visible (de longitud de onda corta) y emite a su vez luz visible de una
longitud de onda más larga que la de la luz de excitación. Como este fenómeno de emisión no es
acompañado de una radiación térmica, esta luminiscencia se conoce como de luz fría.
 57

3.1 CARACTERÍSTICAS DE LA FLUORESCENCIA

La fluorescencia posee varias características especiales de las cuales las siguientes son
particularmente interesantes en la microscopía de fluorescencia.

1.) La substancia tiene que absorber luz para emitir fluorescencia.

2.) El largo de onda de la fluorescencia (Yem) es generalmente más largo que el largo de onda de la
luz excitadora (Yex) ley de Stoke

yem > yex

(yem: Emisión)
(yex : Excitación)

Mientras más larga sea la longitud de onda, más baja es la energía de la luz. Por lo tanto la
energía de la fluorescencia es mas baja que la luz absorbida.

3.) La intensidad de la fluorescencia es generalmente mucho más baja que la de la luz de excitación.
(la relación k es del orden de 10-3 a 10-5
4.) La fluorescencia se irradia en forma esférica desde la substancia emisora, independientemente de
la dirección de la luz excitadora.

5.) La fluorescencia se desvanece.

6.) La intensidad "F" de la fluorescencia es proporcional a la intensidad “I0” de la luz excitadora, a la

densidad "C" del espécimen y a la eficiencia de la fluorescencia (producto cuántico) k.

F I0Ck

7.) Cada substancia posee un espectro de fluorescencia característico.

Luz de excitación no absorbida

Luz de excitación Substancia
Fluorescencia

8.) El espectro de absorción y el espectro de fluorescencia están relacionados como imágenes

reflejadas.

9.) La luz de fluorescencia está polarizada en grado variable.

 58

3.2 APLICACIONES:

Las aplicaciones especiales y ventajas que proporciona la fluorescencia pueden ser resumidas como
sigue:

1) Aplicación en preparados autofluorescentes.

2) Observación selectiva de substancias especificas en partes o porciones del preparado.
3) Aplicación en objetos no visibles debido al poder de resolución de los microscopios
ópticos pero que pueden ser detectados mediante la fluorescencia.
4) En varios tipos de información que están contenidos en la fluorescencia y por lo tanto
adicionalmente a los exámenes convencionales se pueden realizar otro tipo exámenes
detectando esta información.

1. El preparado o muestra autofluorescente:

Un microscopio de flourescencia detecta la fluorescencia emitida por la muestra misma o por una
muestra marcada con un fluorocromo. La luz de iluminación (excitación) no está involucrada en la
formación de la imagen. En este sentido la microscopía de fluorescencia difiere de la microscopía
normal en la cual la imagen es formada por la luz de iluminación.

2. Las substancias específicas como organelos celulares, proteínas, anticuerpos, DNA, RNA, etc. y
partes específicas de la muestra pueden ser observadas selectivamente. Los métodos de tinción
permiten la marcación selectiva de las substancias establecidas en la muestra y por tal razón la
detección u observación puede ser circunscrita a substancias elegidas. En general las técnicas de
fluorescencia en anticuerpos son altamente específicas lo cual aumentan las ventajas de la
microscopía de fluorescencia.

3. Los objetos no visibles debido al poder de resolución de un microscopio óptico pueden ser
detectados con fluorescencia. El diámetro de una sola molécula de DNA está en orden de 2nm, lo
cual es 1/100 del detalle más fino que puede ser apenas distinguido por el poder de resolución de
un lente-objetivo (el lente distingue alrededor de 200nm) sin embargo sí una molécula de DNA es
marcada con un fluorocromo, entonces puede ser observada con el microscopio de fluoresencia.
Mas aún, también un virus cuyas dimensiones son bastante más pequeñas que la resolución de un
microscopio óptico, pueden ser detectadas con un microscopio de fluorescencia si es que las
diferentes moléculas de fluorescencia están enlazadas con el virus.

Resumiendo, objetos bastante más pequeños que la limitación del poder de resolución de los
lentes ópticos pueden ser distinguidos siempre que su emisión de luz sea lo suficientemente
intensa.

4. Varios tipos de información están contenidos en la luz fluorescente por lo cual se pueden practicar
diferentes tipos de análisis. Se obtiene la siguiente información:

?? Intensidad de la fluorescencia.
?? Espectro de excitación
?? Espectro de fluorescencia y polarización
?? Mediciones para análisis cuantitativo y cualitativo
 59

3.3 PRINCIPIOS Y COMPONENTES BÁSICOS DEL MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA

El microscopio de fluorescencia se basa en dos principios esenciales:

?? Solamente la porción del espectro de onda que induce a emisión de luz en forma más eficiente, es
extraída (filtrada) y dirigida a la muestra.
?? Solamente la porción de la fluorescencia que es necesaria observar es extraída (filtrada) con el
propósito de formar la imagen para la observación y fotografía.

Desde luego la correcta selección de la longitud de onda es esencial en un microscopio de

fluorescencia y basado en estos principios, el sistema de luz y filtros juega un rol principal.

A. La fuente de luz emite en varias longitudes de onda desde el ultravioleta hasta el infrarrojo.

B. El filtro de excitación transmite selectivamente solo aquella luz (longitud de onda) que es necesaria
para inducir a la fluorescencia del preparado, principalmente en el rango de longitud de onda corta
(UV) y detiene la luz que no se desea usar para la excitación.

C. Un preparado (espécimen) que flourece como respuesta a una luz incidente generalmente es un
preparado marcado con fluorocromos.

D. El filtro barrera corta la luz de excitación que no fue absorbida por la muestra dejando pasar solo y
selectivamente la luz de la fluorescencia. De esta luz de fluorescencia se puede filtrar una
longitud de onda más específica si así fuese necesario.

Los 4 principios mencionados son indispensables en un microscopio de fluorescencia y deben

ser considerados al seleccionar un microscopio.

3.4 REQUERIMIENTOS PARA UN MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA:

?? El campo oscuro:

Como generalmente la fluorescencia es extraordinariamente débil en comparación con la luz

de excitación, el contraste de la imagen se deteriora si no se separa completamente la luz de
excitación de la luz fluorescente y luego se descarta la luz de excitación (técnica de campo
oscuro).

?? Luz de alta intensidad y de onda corta (UV):

En general es necesario una luz de excitación cercana al UV y/o visible para poder inducir la
fluorescencia y además que sea de alta intensidad para poder obtener una fluorescencia
aceptable.
 60

?? Sistema de filtros:

Cada una de las substancias fluorescentes tiene sus características especiales de absorción
y emisión por lo cual debe disponerse de un sistema de filtros adecuados dependiendo esto de
los objetos que van a ser observados.

?? Medidas de protección:

Debido a que los rayos UV son dañinos al ojo humano deben tomarse medidas apropiadas
de protección. También hay que cuidar que el sistema óptico usado sea lo suficientemente
permeable a los rayos ultravioletas (permita su paso) y que este sistema u óptica no emita
fluorescencia propia (fluorescensia en la misma óptica).

?? Desvanecimiento de la fluorescencia:

El desvanecimiento de la fluorescencia en el preparado causa dificultades al observar y/o

fotografiar por lo cual hay que evitar una irradiación innecesaria del preparado cuando no se está
observando. Esto se logra con un obturador o con un filtro ND que se interpone entre la fuente de
luz y el preparado.

3.5 FUENTE DE LUZ

Como ya hemos mencionado antes, la fuente de luz en un microscopio de fluorescencia debe

emitir una alta cantidad de luz en el rango cercano ultravioleta. Generalmente se usan lámparas de
mercurio porque cumplen con estas condiciones. En casos especiales se pueden usar lámparas de
xenón o halógenas.

1.) Lámparas de mercurio de alta presión:

Una lámpara de mercurio de alta presión es un tipo de lámpara de descarga eléctrica la cual
contiene una pequeña cantidad de gas inerte y mercurio, sellado, dentro de un bulbo de vidrio de
cuarzo.
Como se muestra en la figura Nº25, este tipo de lámpara irradia una línea intensa en el
espectro proveniente del mercurio como también un espectro continuo de una intensidad bastante
pareja que se extiende desde el ultravioleta por el visible hasta el infrarrojo.
En fluorescencia, la luz usada para la excitación de la muestra, es principalmente la más
intensa del rango de 365 a 546nm lo que implica lógicamente una utilización eficiente de la energía
irradiada por este tipo de lámpara (véase capitulo referente a métodos de excitación).
La potencia de salida de las lámparas de mercurio de alta presión usada generalmente en los
microscopios de fluorescencia es de 50, 100 o 200 watts. Los componentes emisores de luz en estas
lamparas difieren en tamaño y luminosidad (ver tabla 2) y se debe elegir la lampara adecuada de
acuerdo a las condiciones del sistema de iluminación. En general se usa la lampara de 100 watt en
los microscopios de epi-fluorescencia.
 61

Lámpara de xenón:

La lámpara de xenón es una lámpara de descarga, que a diferencia a la lámpara de mercurio

de alta presión, posee un espectro continuo que se extiende desde el ultravioleta hasta el cercano
infrarrojo y el cual muestra características particulares parecidas a la luz natural en el rango visible.
Consecuentemente las lámparas de xenón son usadas básicamente como fuentes de luz para
mediciones del espectro de excitación.
Las lámparas de xenón también son consideradas como fuente de luz para microfluorometría debido a
su virtud de alta estabilidad lumínica, comparada con la lámpara de mercurio de alta presión como
también al factor que su distribución de energía emitida en el rango UV es continua.

Debido a que ambas lámparas, la de mercurio y la de xenón funcionan por descarga eléctrica,
deben ser encendidas con alto voltaje y requieren por lo tanto una fuente de poder especial.

2.) Lámparas halógenas:

Son lámparas incandescentes que emplean filamentos de tungsteno similares a los de las
lámparas usadas en los microscopios convencionales. Las lámparas de halógeno pueden ser usadas
para microscopía de fluorescencia siempre y cuando la luz de excitación no tenga que ser UV
(excitación B o G) y que además no se requiera una luminosidad especialmente alta comparada con
las lámparas de descarga. La lámpara de halógeno es de fácil manejo y relativamente económica.

3.6 FILTROS

Como mencionamos anteriormente, en la microscopía de fluorescencia solamente la parte

necesaria de luz para excitar es usada en la iluminación y además solamente la fluorescencia emitida
por la muestra es usada para la observación. Por esta razón los filtros que transmiten ciertos rangos
de longitud de onda y cortan otros tienen una función muy importante.
Los filtros usados en los microscopios de fluorescencia son los filtros de vidrio coloreado y los
filtros de interferencia. Las características necesarias son obtenidas mediante una apropiada
combinación de estos dos tipos de filtros.

- Filtros de vidrio coloreados:

Estos tipos de filtro son fabricados añadiendo pigmentos al vidrio que transmiten la
longitud de onda específica por absorción selectiva. La variedad de los filtros de vidrio coloreado,
incluye filtros de paso de banda y filtros de corte. Los filtros de vidrio coloreado son relativamente
económicos pero su curva de transmisión es bastante pobre y la base de la curva es también
ancha por lo cual estos filtros no permiten la selección de una banda estrecha.
 62

FIGURA Nº25
63
 64

- Filtros de interferencia:

Estos filtros son necesarios para obtener bandas de transmisión y reflexión de una
longitud de onda específica debido a la interferencia que se produce al hacer uso de las múltiples
reflexiones entre delgadas y transparentes capas de "Coating" (recubrimiento) que tienen
diferentes índices de refracción. Estos filtros se fabrican usando las técnicas de evaporación al
vacío.
Los filtros de interferencia son relativamente caros pero tienen características ópticas
que no se pueden obtener con filtros de vidrio coloreado y así han contribuido a una notable
mejoría en la selección de la longitud de onda lo cual es una característica necesaria en la
microscopía de fluorescencia.

El espejo dicroico usado en la fluorescencia episcópica también es similar a un de filtro

de interferencia. Este elemento cumple una función fundamental en la epi-fluorescencia y debido a sus
características es posible la iluminación episcopica y la observación de la fluorescencia en los
sistemas actuales los cuales en la práctica reemplazaron a la dia-fluorescencia. En efecto, el espejo
dicroico refleja (desvía) la luz que proviene de la fuente de iluminación, en 90° y la envía hacia el
preparado, pero la luz fluorescente del preparado al incidir a su vez sobre el espejo dicroico no es
desviada y lo traspasa (ver figura Nº25)

Filtros de interferencia: - Filtros de excitación y algunos filtros de barrera

(particularmente para excitación "B") los cuales
requieran una curva de transmisión estrecha.

Filtros coloreados de vidrio - Filtros de barrera (filtros de cort

El esquema óptico de un microscopio de epifluorescencia:

La luz emitida por la lámpara de mercurio pasa a través del filtro de excitación para
seleccionar la longitud de onda requerida para la excitación de la substancia fluorescente. Luego la
luz es reflejada en 90° grados para pasar por el objetivo (lente) el cual trabaja en este caso también
como condensador finalmente esta luz cae sobre el espécimen (muestra) como luz excitadora. Ahora
parte de la fluorescencia emitida, en forma esférica por el espécimen, pasa a través del mismo
objetivo (lente) el espejo dicroico no refleja la luz con una longitud de onda mayor a la de la luz
excitadora. El filtro barrera corta luego toda luz excitadora no absorbida por el espécimen
(preparado). Así la luz de fondo de excitación es bloqueada y solo se observa la luz fluorescente.
(Ver figuras 26 y 27).
 65
FIGURA Nº26
 66

SISTEMA DE FILTROS

Una de las mayores ventajas de la fluorescencia episcopica es la posibilidad de poder

seleccionar la longitud de onda con las características necesarias mediante tres tipos de filtros.

1.) Separación de la luz de excitación y la fluorescencia mediante el espejo dicroico. Un espejo

dicroico es una especie de filtro de interferencia y cuando es posicionado en 45° al eje óptico la
longitud de onda más corta, es reflejada y la longitud de onda más larga lo atraviesa. En otras
palabras este filtro muestra una alta reflexión con las longitudes de onda para excitación y
muestra una alta transmisión a la longitud de onda de la fluorescencia por lo tanto separa la luz de
excitación de la luz de fluorescencia. Esta es la mayor ventaja del sistema de epifluorescencia.
Una gran ventaja del espejo dicroico es también que permite una alta eficiencia en la
selección de la fluorescencia ya que la luz de excitación alcanza al preparado casi sin atenuación
y la luz fluorescente también es transmitida sin una apreciable perdida de intensidad de manera
que la eficiencia resultante es mayor al 80% permitiendo así utilizar una fluorescencia débil con
una perdida mínima de luz.

2.) Función del filtro de barrera:

A pesar que la separación de la luz de excitación y la fluorescencia es buena con la

combinación del filtro de excitación y del espejo dicroico, en realidad no es tan así y se requiere
adicionalmente un filtro de barrera cerca de los oculares. La razón es que una parte de la luz de
excitación es reflejada en el lente (objetivo) y en la superficie del preparado.

Gran parte de la luz de excitación es reflejada hacia el espécimen por el espejo dicroico
pero una parte de la longitud de onda de la luz de excitación cae en el rango de transmisión del
espejo dicroico.
El filtro de barrera es necesario para cortar completamente la luz de excitación no
deseada y es también posible de seleccionar un rango de longitud de onda específica de la
fluorescencia si fuese necesario.

El grado al cual se pueda llegar en oscurecer el campo circundante a lo fluorescente es

determinado en el microscopio por las características de su sistema de filtros. Eso significa que si
el sistema de filtros no es completo y adecuado entonces la luz de excitación se escurre y el
campo oscuro se aclara y consecuentemente la fluorescencia específica del preparado no puede
ser observada adecuadamente.
El sistema y conjunto de filtros deben ser considerados en forma muy estricta y exacta
en la epifluorescencia.
 67

3.7 LENTES/OBJETIVOS

En la epifluorescencia los objetivos (lentes) trabajan también como condensador, la luz

de excitación ilumina al espécimen pasando a través del lente objetivo. Como consecuencia hay que
tener consideraciones especiales para la luz ultravioleta:

- Debe haber una alta transmisión de luz UV y visible.

- Los lentes objetivos no deben emitir fluorescencia propia (autofluorescencia)
- Los lentes objetivos no deben causar solarización.**

Las condiciones mencionadas son satisfechas por la serie de lentes "flúor” (secos o aceite),
los lentes UV-F (glicerina) y los lentes flúor-DL (flúor/fase, secos/aceite). Los lentes flúor "DL" son
esencialmente lentes flúor con un anillo de fase agregado permitiendo así ambas cosas, fluorescencia
episcópica y observaciones en contraste de fase con el mismo lente objetivo.
Debido a que la intensidad de la luz de fluorescencia es muy débil, los lentes objetivos deben
ser preferentemente tan brillantes como sea posible, es decir deben tener una apertura numérica alta.

Para fluorescencia excitada por radiación visible, por ejemplo los métodos V, B y G, bastan
lentes objetivos normales como plan acromático y plan apocromático aumentando la brillantez de la
imagen de fluorescencia con una apertura numérica alta (NA) también los lentes acromáticos ofrecen
un resultado suficiente.

** (Solarización: es un término aplicado a cambios químicos como coloración o cambios de color en el

vidrio los cuales son inducidos por la irradiación de luz u otras. La solarización conduce a efectos
indeseados como una menor transmisión de luz.

La brillantez de la imagen en los microscopios de epifluorescencia:

1) La brillantez del campo de iluminación (Ic) es proporcional al cuadrado de la A.N. (NA) del lente
objetivo:

Ic = (A.N.) 2

2) La brillantez de la imagen fluorescente Ic es directamente proporcional a la cuarta potencia de la

A.N. (NA) e inversamente proporcional al cuadrado del aumento.

Ic = (A.N.) 4 /A2 (A = Aumento)

Así para un mismo aumento de un lente objetivo, la brillantez del campo de iluminación y de la imagen
fluorescente, crece con la “AN” del lente objetivo. Generalmente mientras más alto es el aumento más
brillante es el campo de iluminación. La brillantez de la imagen es determinada por ambos, la “AN” y el
aumento.
Los factores indicados muestran que una mayor AN del lente objetivo es muy importante para
obtener imágenes de fluorescencia más brillantes.
 68

3.8 OTROS FACTORES

3.8.1 Fuente de luz para microscopio de epifluorescencia.

En epifluorescencia se pueden usar fuentes de luz cuyo arco de descarga puede ser
relativamente reducido. En general se usa lámpara de mercurio de alta presión con una potencia de
50watt o de100watt, pero últimamente prevalece más la de 100watt.

3.8.2 Filtros y obturadores.

Filtros neutrales (ND) o un obturador deben ser usados para evitar el desvanecimiento de la
fluorescencia al ser irradiado el preparado por tiempos más largos y no estar observándolo. El
desvanecimiento depende y varía según el tipo de preparado y la intensidad de la luz excitadora.

3.8.3 Factor de transmitancia a la luz UV en vidrio normal.

La transmitancia del vidrio normal empeora abruptamente en el rango de luz UV por lo tanto
hay que tener consideraciones especiales para todo el sistema óptico, usando vidrio especial al excitar
con luz UV.

3.8.4 Control de iluminación.

Debido a que se emplea la iluminación "Koehler" en el sistema de iluminación episcopica, al

usar eficientemente el diafragma de apertura y el diafragma de campo, se puede controlar el área del
campo de iluminación y se puede ajustar la brillantez (en algunos modelos de microscopios no hay
disponible un diafragma de apertura).

3.8.5 Inmersión.

La glicerina es uno de los líquidos de inmersión usados para la fluorescencia con objetivos
100x puesto que:

(a) La glicerina tiene menos autofluorescencia que el aceite de inmersión normal.

(b) Puede ser limpiada fácilmente con agua.
(c) Tiene la viscosidad apropiada.
(d) Es usada a menudo como medio de montaje en preparados de fluorescencia.
Sin embargo hay que tener cuidado ya que la glicerina es hidroscópica y esta sometida a un cambio
gradual de su calidad (más autofluorescencia).
La glicerina se usa principalmente en la observación de cromosomas. Hay también un aceite
de inmersión especial disponible que no es flluorescente y no presenta problemas de higroscopía. Se
fabrican (Nikon) lentes objetivos para ambos sistemas de inmersión en glicerina o aceite debiendo
especificarse cual sistema se elige.

3.8.6 Métodos de excitación:

En los microscopios de fluorescencia el método de excitación es realizado y controlado por la

combinación de tres elementos:

?? El filtro de excitación,
?? El espejo dicroico y
?? Filtro barrera.
 69

Según la combinación de estos filtros se dispone de sistemas para UV, V, BV, B, B2 y UG. Estas
designaciones están de acuerdo a la longitud de onda principal de excitación. Por ejemplo UV se
refiere al uso de luz ultravioleta, V se refiere a luz violeta, BV se refiere a luz azul-violeta, B y B2 se
refieren a luz azul y UG se refiere a luz verde.

3.8.6.1 Excitación UV.

Longitud de onda principal: 365nm (rango 330-380nm) es la longitud de onda apropiada para
la observación de autofluorescencia de células o tejido no marcados (teñidos) o para la observación
simultanea de una fluorescencia específica teñida y otra autofluorescencia.

3.8.6.2 Excitación B-1.

Longitud de onda principal: 380 a 490nm, este método de excitación emplea un filtro de
interferencia junto con las crestas (peaks) de 405nm y 436nm, transmite los 490nm que es absorbida
con alta eficiencia en “fitc" (isotiocianato de fluoresceína), además posee una banda secundaria de
transmisión en el rango de 650nm a 700nm. Este método muy usado en fluorescencia específica,
como auramina y acridina naranja o en técnicas de anticuerpos fluorescentes (Fitc).

3.8.6.3 Excitación B-2.

Longitud de onda principal 490nm (460nm a 490nm) al método de excitación B-1 descrito
antes se le agrega un filtro auxiliar "Y-46" el que corta la emisión entre 405nm y 360nm estrechando
así la banda de excitación y dando una imagen clara, libre de autoflourescencia. Esta técnica es
aplicable en observaciones en las cuales se usan las técnicas de anticuerpos fluorescentes (Fitc).

3.8.6.4 Filtro auxiliar BG-35.

Este filtro corta la banda de transmisión secundaria (650nm---) del filtro de interferencia "B".
Este filtro se usa para eliminar el fondo rojizo que aparece con el método de excitación "B".

CELULAS PULMONARES, MITOSIS

 70

3.9 CAMPO DE APLICACIÓN DE LA MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Hay variados campos de aplicación en biología, medicina e industria. Los principales son:

?? Biología: Zoología, botánica, microbiología.

?? Medicina: Medicina legal, (patología, anatomía, neurología, fisiología, inmunología, etc.)
?? Farmacia, química, bioquímica.
?? Investigación e inspección en el campo industrial (fabricación de circuitos integrados)

Los microscopios de fluorescencia tienen una posición especial, básicamente por su técnica
específica y por su alta sensibilidad. Su aplicación en varios campos como en exámenes clínicos se
debe a su capacidad especial no encontrada en los microscopios normales ni en los microscopios
electrónicos.

3.10 MÉTODOS DE OBSERVACIÓN:

1. Por autofluorescencia (sin tinción)

2. Por fluorescencia secundaria (tinción química)
3. Por fluorescencia con técnica de anticuerpos (basado en la tinción inmunológica).

1. Observación por autofluorescencia:

Se observa la fluorescencia emitida por el espécimen mismo (fluorescencia propia o primaria

= autofluorescencia). Algunos pocos especímenes del área médica o biológica como células, tejidos,
cultivos, etc. emiten autofluorescencia pero en la mayoría de los casos se siguen los métodos "2" y
"3". La identificación de la substancia es posible usando espectrofotometría en el espectro de
fluorescencia emitido por la substancia o del espectro de excitación.

Aplicación: Identificación de vitamina, estudio de neurotransmisores, clorofila y porfirina. Resistencia

residual en tarjetas de circuitos integrados, detección e identificación de contaminantes orgánicos en
el campo industrial.

2. Observación por fluorescencia secundaria (método de tinción química).

En este método se observa fluorescencia secundaria generada por el fluorocromo al teñir

substancias no-fluorescentes (proteínas, carbohidratos) con fluorocromos. Debido a que la tinción de
un objeto es hecha en forma selectiva con fluorocromos, podemos observar el objeto claramente
segregado de los tejidos o células.

Aplicación: Naranja/acridina + ácido nucleico, auramina, bacilo tubérculo, mostaza de quinacrina +

cromosoma, etc.

3. Técnica de anticuerpos fluorescentes (basado en tinción inmunológica)

Aplicando el fenómeno de que antígeno y anticuerpos reaccionan diferentemente, podemos detectar
la existencia de reacciones específicas (o existencia de antígenos). Con la marcación de
fluorescencia al conducir una reacción antígeno/anticuerpo entre anticuerpos marcados
preliminarmente con fluorocromo (fluorescencia marcada con anticuerpos, anticuerpos marcados
(rotulados) y antígeno en el espécimen). La mayor cantidad de fluorescencia en microscopía se hace
usando la técnica de anticuerpos fluorescentes.
 71

3.11 FLUOROCROMOS TÍPICOS Y SUS MÉTODOS DE OBSERVACIÓN

Preparado Fluorescente Método Máxima Máxima

de excitación (nm) fluorescencia
excitación (nm)
Vitamina "A" Autofluorescencia 325 - 345 470 - 490
Vitamina "B6" Autofluorescencia 356 432
Hoechst 33258 Cromosoma UV 350 490
Dans Anticuerpo fluorescente 350 - 375 530
Dapi Cromosoma (banda-C) 340 488

Fura 2 Ca Conjugado 335 512

Libre UV 362 505
Indol Ca Conjugado 355 410
Libre / 485

Catecolamina Autofluorescencia 410 (405 - 415) 480 (475 - 485)

Serotonina 5 HT Autofluorescencia V 390 (385 - 400) 530 (520 - 540)
Tetracicrina Tinción del hueso y diente 390 560

Quinacrina Cromosoma(Banda-Q) 420 500

Mostaza Cromosoma (Banda-Q) BV 450 500
quinacrina (QM)
Primulina Celulosa 410 560
Mitramicina Cromosoma (Banda-R) 450 570

"Fitc" Anticuerpo fluorescente 495 525

Naranja de DNA 460 530
acridina (AO)
RNA 460 650
Auramina "O" Bacilo tuberculo B 470 557
Eosina Patología, histología 527 580
Corifosfina "O" Linfocitos 460 575
Clorofila Autofluorescencia 520 650 - 660

"Tritc" Anticuerpo fluorescente 555 580

Rodamina B-200 Anticuerpo fluorescente 568 597
Rojo de texas Anticuerpo fluorescente 596 615
Bromuro de etidio DNA G 520 605
Yoduro de DNA 535 615
propidio (PI)
Reacción Parosanilina 550 650
"Fuelgen" con
Rojo tiasina R Proteína 510 680
Ácido de fucsina Hueso 540 630

Nota: pueden haber variaciones en las longitudes de onda según literatura.

 72

FILTROS PARA FLUORESCENCIA

Tipo Filtro: Long. Onda: Características: Aplicación:

=== ======= ========== ================================= ================
UV-2A EX 330-380 Cubo de filtro standard " UV. " Dapi
DM 400 Hoechst 33285/33342
BA 420 Amca
Cascade blue
U

UV–2E/C* EX-340-380 Para "DAPI" cortando "FITC" (verde) y

(DAPI) DM - 400 "TRICT" (rojo)
BA 435 - 485 De capa fina para señal/ruido alto
Filtro barrera para corte verde y rojo

UV – 1A EX - 365/10 D De banda estrecha - solo 365nm línea "i" del

DM - 400 espectro de mercurio.
BA- 400 De banda estrecha minimiza
autofluorescencia y foto-coloración

UV – 2B EX - 330-380 Fondo más oscuro que en UV-2ª

DM 400
BA 435
=== ======= ========== ================================= =================
EX 380-420 Cubo de filtos standard para "V." Catecolamina
VA- 2A DM 430 Serotonina
BA 450 Tetraciclina

EX 405/10 De banda estrecha - solo 450nm línea "H"

v V – 1A DM 430 del espectro del mercurio.
BA 435 De banda estrecha minimiza
autofluorescencia y foto – coloración.

EX 380 - 420 Fondo más oscuro que en "V –2ª"

V – 2B DM 430
BA 460
=== ======= ========== ================================= =================
EX 400 - 440 Cubo de filtros standard para "B.V." Quinacrina
BV – 2A DM 455 Mostaza de quinacrina
BA 470 (cm)
B Tioflavina
EX 435/10 De banda estrecha - solo 435nm línea "g" Acriflavina
BV – 1A EX 455 del espectro del mercurio.
BX 470 De banda estrecha, minimiza
autofluorescencia y foto-coloración.
V
EX 400-440 Fondo más oscuro que en " B.V.-2A"
BV – 2B DM 455
BA 480
=== ======= ========== ================================= =================
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B – 3A EX-420-490 De banda ancha - solo recomendado para Fitc

DM 505 Iluminación halógena. Naranja acridina
Auramina o
BA 520 Corisfosfina o
Bodipy
Fluo - 3
Dio
EX 450 -490 Cubo de filtros standard para " b "
B – 2A DM 505 Para Fitc + tinción contadora (Tritc, PI)
BA 520

B – 2E/C* EX 465 - 495 De capa fina para señal/ruido alto.

(Fitc) DM 505 Para Fitc (verde) cortando rojo rodamina
BA 515 - 555 Filtro barrera para corte del rojo.
B
EX 470 - 490 Rango excitación más angosto que "B-2A"
B – 1A DM 505 Para Fitc + tinción contadora (Tritc, PI)
BA 520

EX 450 - 490 Similar a "Fitc"

B – 2E DM 505 Para Fitc (verde) cortando rojo rodamina.
BA 520 - 560 Filtro barrera para cortar el rojo.

EX 470 - 490 De capa gruesa para "Fitc"

B – 1E DM 505 Filtro barrera para corte del rojo.
BA 520 - 560
=== ======= ========== ================================ ==============
EX 510 - 560 Cubo de filtros standard para "G" Tritc
G – 2A DM 575 Rodamina b -200
Propidio yoduro
BA 590 R-ficoeritrin
B-ficoeritrin
Di
Bromuro de etidio

EX 546/10 De banda estrecha - solo 546nm línea "E"

G - 1A DM 575 del espectro del mercurio .
BA 580 Banda estrecha minimiza autofluorescencia
y foto-coloración.

EX 540/25 Para Tritc (rodamina)

G – 2E/C* DM 565 De capa fina para señal/ruido alto
G (Tritc) BA 605/55 Filtro barrera para corte de rojos sobre
643nm.

EX 546/10 De banda estrecha – solo 546 nm linea " e"

G-1B DM 575 del espectro del mercurio.
BA 590 Banda estrecha minimiza auto-
fluorescencia y foto-coloración.

EX 510-560 Barrera de 610 nm da un fondo más oscuro

G-2B DM 575 y una profunda emisión roja.
BA 610
==== ======= ========== ================================ =================
Y – 2E/C* EX 540-580 Para rojo texas Rojo texas*
Y (rojo DM 595 De capa fina para señal/ruido alto
texas) BA 600-680 Barrera para corte del rojo sobre 660nm
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FILTROS DE MULTIBANDAS

FILTRO ABREVIACIÓN REACTIVO

F–R Fitc
Rodamina

Dual F–T Fitc

Rojo de texas

D–F Dapi
Fitc
======= ================== ============================ =============

Dapi
D-F–R Fitc
Rodamina
Triple
Dapi
D-F–T Fitc
Rojo de texas
======= ================== ============================ =============

Filtro GFP:
=======

Filtro Longitud de onda Característica Aplicación

GFP (R) EX 480/40 Tipo de paso largo para mutantes GFP

–LP DM 505 de desplazamiento al rojo
BA 510

EX 480/40 Tipo de paso largo para mutantes de GFP

GFP (R) DM 505 Desplazamiento al rojo.
-BP BA 535/50

======= ================== ============================ =============

 75

MICROSCOPÍA CONFOCAL
Walter Ivens H.

La microscopa confocal tiene su principal aplicación en la observación de células vivas o cortes

relativamente gruesos . Como una célula viva tiene cierto grosor y no podemos aplicar cortes con un
micrótomo (0,5 micras), sucede que en los aumentos altos si bien el objetivo enfoca solo un plano de
la imagen (punto focal) esta imagen es afectada por por los otros planos de la imagen que están fuera
de foco y producen por lo tanto interferencias. Para estudiar un objeto con un sistema confocal se
captan imágenes en distintos planos focales (secciones ópticas) y mediante un sistema computacional
adecuado es posible realizar la reconstrucción tridimensional de la imagen y no hay puntos que en
una microscopía normal estarían fuera de foco y afectando la imagen. El “confocal” es epecialmente
ventajoso en observaciones con fluorescencia ya que además de de eliminar las regiones fuera de
foco además ilumina en cada momento solamente una región pequeñísima de la muestra evitando así
el efecto de “blanqueado” que se produce en la muestra con fluorocromos .

Como obtenemos un solo plano focal y eliminamos la interferencia de los otros planos o puntos
focales???

Los esquemas siguientes nos facilitan la explicación del sistema óptico desarollado para tal efecto.
Podemos observar que en el objeto tridimensional (por lo tanto de varios planos focales) toda la luz
es refractada por el lente pero solo la luz que procede de un plano (el que esta en foco) cae dentro de
un finísimo agujero (pinhole) dando asi lugar a una imagen nítida y perfectamente definida de todas
las estructuras ubicadas en ese plano y sin interferencia de la luz procedente de las demás partes del
objeto. Es evidente que con este tratamiento se pierde una gran cantidad de luz por lo cual deben
usarse potentes fuentes como ser el (los) rayo laser con el cual se estimula los fluorocromos . Como el
area iluminada es muy pequeña es necesario hacer un barrido de la muestra y las multiples
“recepciones” de la estimulación son captadas y reconstruidas en el computador en imágenes
tridimensionales de gran calidad.
En el microscopio confocal coexisten tres fuentes de luz: La lámpara de luz visible normal. Ella nos
permite ubicar nuestras muestras en campo claro y/o en contraste de fases.
La lámpara de vapor de mercurio para las
posteriores observaciones de fluorescencia con el sistema confocal.
El laser (o los laser ) es generalmente de
argón-kripton (da tres líneas de salida) o el laser de emisión ultravioleta, pero hoy hay en el mercado
varios tipos de laser que se usan según la aplicación:

UV Argon (351 nm)

Violeta Helio-Cadmio (442 nm)
Argon Multi-Linea (457 nm – 488 nm – 514 nm)
Azul Argon (488 nm)
Verde Helio-Neon (543 nm)
Amarillo Kripton (568 nm)
Rojo Helio-Neon (633 nm)
Infra-Rojo (IR) (750 nm)
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INTESTINO DE RATÓN

FLUORECENCIA NORMAL FLUORESCENCIA CONFOCAL

Un microscopio Confocal lo integran básicamente de los siguientes componentes:

??El cabezal de “Scanner”

??La fuente LASER
??El cabezal fotomultiplicador
??El computador
??El microscopio (con óptica Plan apo o Plan Fluor)
??Otros: filtros, motor, etc.
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VARIOS

Referencias de algunos valores:

Los espectros de ondas se ubican así:

?? Onda TV en aprox. 100cms

?? Onda de radar 10cms
?? Onda infrarroja 850nm A 2000nm (8.000 Ä a 1 nm)
?? Onda visible 300nm A 780nm (3.800 Ä a 7.800 Ä)
?? Onda ultravioleta 160 nm A 380nm
?? Onda rayos-x 100 Ä a 10-4 Ä

Ejemplos de equivalencias:

400 nm = 4.000 ä = 0,4 µ = 0,0004 mm

nm = nanometro Ä = Amstrong µ = micra (micrón) mµ = milimicra

====================================================================

micra µ (micrón o micromilímetro) = 0,001mm. 1 Ä = 0,0000001 mm.

1 A = 0,0001 micra µ

nanometro nm. = 0,001 µ = 10 Ä

Velocidad de la luz: 300.000 Km./seg. (en el vacío) aproximadamente 200.000 Km/seg en el vidrio.

ESPECTRO VISIBLE
?? 400 - 435 nm. Violeta complementario: Amarillo verde
?? 435 - 480 nm. Azul Amarillo
?? 480 - 500 nm. Azul-verde Rojo
?? 500 - 560 nm. Verde Púrpura
?? 560 - 580 nm. Amarillo-verde Violeta
?? 580 - 595 nm. Amarillo Azul
?? 595 - 650 nm. Naranja Verde - azul
?? 650 - 750 nm. Rojo Azul-verde

Resolución máxima posible en microscopio óptico: 0,0002 mm (=200 nm) con luz visible.
2 nm. Con luz ultravioleta.
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Mantención elemental básica de un microscopio:

Limpieza del microscopio:

Si la suciedad es muy liviana usar solo pincel pelo de camello.

Partes del microscopio que sean pintadas o plásticas: usar paño siliconado no usar solventes
orgánicos como ether, alcohol o diluyentes. No usar xilol.

Partes del microscopio no pintadas: en caso que tengan grasa o manchas usar alcohol puro (methil o
ethil alcohol).

Objetivos, oculares, lentes y prismas (salvo el objetivo de 100x inmersión): usar alcohol puro.

Objetivo 100 x de inmersión: solo Xilol.

NOTA: Información proporcionada por la fábrica Nikon la cual no es necesariamente válida para otras
marcas de microscopios
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FIGURA Nº28
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APUNTES EN BORRADOR:

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