UNIVERSIDAD MAYOR, REAL Y PONTIFICIA DE

SAN FRANCISCO XAVIER DE CHUQUISACA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
CARRERA DE AGRONOMA TCNICO SUPERIOR

CULTIVO IN VITRO DE LA VID (Vitis silvestris) FASE 1 : ESTABLECIMIENTO,

EN EL LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE LA FACULTAD DE CIENCIAS
AGRARIAS (VILLA DEL CARMEN-YOTALA).
PASANTA DE GRADO PARA
OPTAR EL TITULO DE TCNICO
SUPERIOR EN AGRONOMA.

ALFREDO VIDALES CACERES

Sucre-Bolivia
2015
0

I.

INTRODUCCION

El termino cultivo in vitro de las plantas se aplica a todo cultivo bajo cristal en
medio asptico, sobre un medio nutritivo, en condiciones estriles, de plantas,
semillas, rganos, embriones, tejidos, clulas, ex plantes y protoplastos de plantas
superiores.
La tcnica del cultivo in vitro es gracias a una propiedad de las clulas vegetales
llamada totipotencia celular, que significa que toda clula vegetal viva con ncleo
capaz, cual fuera su especializacin del momento, de producir fielmente la planta
entera de la cual proviene. Cada clula posee entonces la totalidad del patrimonio
gentico de la planta.
Los beneficios que nos trae son la sanidad, obteniendo plantas libres de
enfermedad, otro beneficio uniformidad donde facilita la planificacin para el
manejo por el agricultor.
Otro punto que tenemos es mencionar, que tenemos el rejuvenecimiento y el
ultimo podra decirse clonar genotipos elites, seleccin de las plantas de la mejor
calidad.
La vid es propagada convencionalmente usando estacas de madera convencional
usando las estacas, ms conocida como acodos o estacas originarias de las
yemas, (36 a 46 cm de largo) recolectadas durante el invierno. Estas son
plantadas durante la primavera en contenedores, para posteriormente ser
trasplantadas a la via. Este es un proceso lento y limitado por estacionalidad para
la propagacin de nuevos cultivares y la introduccin de nuevas especies exticas.
Por esto, la micropropagacin en vid, ha ofrecido un gran potencial para su
multiplicacin en cuanto a rapidez y la posibilidad de guardar stock de cultivos
durante aos, sin la prdida del potencial de multiplicacin (THOMAS y
SCHIEFELBEIN, 2001).
1

La vid es originaria de Eurasia, es uno de los cultivos ms antiguos domesticados

que tienen historia con la humanidad y con una importancia econmica a nivel
mundial.
En Amrica fue introducida por jesuitas misioneros, donde fue muy importante el
cultivo de la vid para la iglesia, lo que significa que el vino fue una importante
herramienta para la celebracin de la misa o de la eucarista, tanto fue el recelo
del cultivo que cuando hubo la revolucin de la independencia los jesuitas o
representes de la iglesia catlica en entonces mando a quemar los viedos. Hasta
ahora podemos observar las cicatrices de las iglesias antiguas, donde era un
diario fabricar vinos y tomar un vino en la mesa, lo que se podra decir, es que los
que heredaron, optaron la costumbre fueron los Tarijeos.
En Bolivia existen cerca de 18 laboratorios inscritos en REDBIO, aunque segn
antecedentes el cultivo in vitro no pasa de los 25 aos. Estos laboratorios en su
mayora son aplicados al campo agrcola, para la conservacin de recursos
fitogenticos y generacin de plantas de alta calidad gentica y sanidad. Los
laboratorios se aglutinan en torno a la REDBIO Bolivia, misma que permite formar
parte de los 750 laboratorios vegetal inscrito en toda Latinoamrica y el Caribe.
Esta tcnica tiene sus inicios en 1986 con la unidad de produccin de semilla de
papa (CEPA) desde este momento empezaron a aparecer organizaciones de
fomento a la investigacin en cultivo de tejidos, llegando a equipar a las
universidades con este campo como las UMSS., UAGRM. , UMSA y PROINPA.
La mayora instituciones cumplen con funciones investigativas y acadmicas a
excepcin de instituciones que dependen del estado como INIAF y PROINPA
hacen investigacin y a la vez producen vitro plantas que genera ingresos, donde
cada institucin da prioridad a especies de la zona.
En la actualidad en Chuquisaca no se realiza el cultivo in vitro de esta especie,
mucho menos de esta variedad silvestri. A pesar de que se ha identificado dos
2

laboratorios de micropropagacion en la Facultad de Ciencias Agrarias una est

en el centro experimental de Villa Carmen-Yotala, este laboratorio est dedicada a
la actividad acadmica e investigacin y otra en la Carrera de Agronoma de la
zona de Qara Punku, esta ltima se encuentra en la etapa de equipamiento y la
primera actualmente funciona adems tienen plantas madres para la obtencin de
ex plantes.

II.

OBJETIVOS

II.1.

Objetivo general

Multiplicar a travs de tejidos vegetales primera fase, mediante el cultivo in vitro de

la vid (Vitis silvestris) en el laboratorio de biotecnologa de la Facultad de Ciencias
Agrarias (Villa del Carmen-Yotala).
II.2.

Objetivos especficos

Identificar la planta madre para la extraccin de los explantes.

Realizar la desinfeccin de los explantes.

Determinar el medio de cultivo.

Establecimiento del cultivo in vitro en el laboratorio.

III.

LOCALIZACION

El presente trabajo de pasanta se realiz en el laboratorio de Biotecnologa del

Centro Experimental de Villa Carmen Yotala, dependiente de la Universidad Mayor
Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca, Facultad de Ciencias
Agrarias, Carrera de Ingeniera Agronmica.
Ubicacin general en el departamento de Chuquisaca del Centro Experimental
Villa Carmen Yotala.

Ubicacin de la poblacin de Yotala

Ubicacin del Centro Experimental Yotala-Villa Carmen Laboratorio de

Biotecnologa de la Carrera de Ingeniera de Agronoma.

III.1.

Ubicacin geogrfica

Latitud Sur 19 0929

Longitud Oeste: 650525
Altitud: 2511 m.s.n.m.
III.2.

Limites

Al este:

Barri Totacoa

ALOeste:

Calle Bustillos

AL norte:

Rio Totacoa

Al Sur:

Avenida Nestor Paz Galarza

III.3.

Datos climatolgicos

Tomando en cuenta la clasificacin de Bolivia, por Thornthwite, donde identificaron

la zona como clima seco-sub-hmedo mesotermal.

Temperatura mxima media anual:

25,3 C

Temperatura mnima media anual:

5,8C

Temperatura general anual:

15,5C

Humedad relativa media anual:

47,5C

Precipitacin media anual:

528,9mm

III.3.1. Heladas
Los das con heladas ocurren generalmente en el invierno, en los meses de mayo
a agosto coincidiendo con los periodos secos. Sin embargo, la variabilidad en
frecuencia de las heladas entre aos es grande.

El registro de 27 aos del SENAMHI , muestra un promedio anual de 33,3 das de

heladas. Existe tambin variabilidad en el periodo de heladas, pueden ocurrir
durante el desarrollo de las plantas denominadas heladas tardas, las cuales, son
las ms perjudicadas.
III.3.2. Granizadas
Se tiene un registro de granizadas desde el ao 1975, haciendo un total de 27
granizadas en 27 aos, siendo en septiembre y octubre los meses de mayor
importancia con 6 y 5 granizadas respectivamente, este fenmeno causa graves
daos en las plantas. La variabilidad de granizadas es grande en su intensidad.
III.3.3. Vientos
Los vientos predominantes en el municipio de Villa Carmen tiene una direccin
noreste, alcanzando velocidades de 5 y 6 km/hora, en los meses de agosto a
noviembre, no producen daos de gran magnitud, sin embargo cuando estos se
producen en los meses de enero y marzo afecta seriamente el desarrollo de las
plantas.
III.4.

Vegetacin

La explotacin de los recursos naturales, tanto para la lea como para madera y el
mal manejo de estos recursos, ha contribuido al alto deterioro y la disminucin de
la vegetacin nativa de la zona.
La vegetacin de la zona se clasifica como matorral denso a ralo mayormente la
cobertura vegetal est constituida por las siguientes especies: Molle(Schimus
molle), churqui (Proposisferox), Jarca (Acacia visca), Tarco (Acacia uniflora),
Sauco (Zanthossyllum sp.), Sunchu (Vigueras sp.) y otros.

IV.
IV.1.

MATERIALES Y EQUIPOS
Material vegetal

El material vegetal tiene origen en Norteamrica es la variedad Vitis californiana

es exclusivo para porta injerto, un justificativo que en el lugar de propagacin, que
el 2011 se recogi de Camargo para unas pruebas de micropropagacion en el
laboratorio de biotecnologa de la Universidad San Francisco Xavier de
Chuquisaca desde este ao, hasta hoy se mantiene en ex sito la especie como
planta madre con el nombre de Vistis silvestris.
Para realizar el trabajo de

laboratorio se usaron yemas apicales, axilares y

laterales y nudos de la variedad Vitis silvestris. Con una desinfeccin diferente de

alcohol al 70% y cloruro al 2%.
IV.2.

Material qumico

Las sales, reguladores y vitaminas son requeridos por las plantas, esto depende
mucho de la especie que se cultivara, en especial la cantidad de vitamina y los
reguladores de crecimiento. Entre las sales esta los macro nutrientes(N, K, P, Ca,
Mg y S) y los micronutrientes (Fe, Mn, Zn, B, Cu, Mo), existentes en el laboratorio

Soluciones de Murashige y Skoog(1962)

Vitaminas: estimula el proceso de crecimiento.

Inositol: estimula el crecimiento y la divisin celular.

Hormonas: regula el crecimiento y desarrollo vegetal.

Auxinas: sirven para elongacin celular y la formacin de callos, as como el

cido indol actico (IAA) la cual es producida por la misma planta y las sintetiza
como cido indolbutirico (IBA).

Citoquininas: son reguladores y estimulan la divisin celular.

Sacarosa:se usa como fuente de carbono.

9

HCl: se usa para la correccin del pH en el medio de cultivo especialmente

para bajar el pH y (NaOH) para subir la misma.

Agente gelificante: sustancia que le proporciona consistencia al medio de

cultivo, como la carragenina.

IV.3.

Equipos

Cmara de flujo

Cmara de cultivo

Autoclave

Balanzas

pH metro

Microondas

Refrigerador

Cocina

Gas licuado.

IV.4.

Instrumentos

Probetas

Pipetas

Vasos de precipitacin

Mangos de bistur

Mechero bunsen de alcohol

Cajas Petri

Pinzas

Frascos de vidrio

Lminas de aluminio

Bandejas de plstico
10

IV.5.

Insumos

Yemas de la planta madre

Tierra vegetal

Arena

Cascarilla de arroz

Material de limpieza

Esponja

Detergente

Jaboncillo de tocador

Algodn

Secadores

Lavandina

Formol

Alcohol al 70% y 96%

Mandil y barbijo

IV.6.

Material de escritorio

Cuaderno de registro

Calculadora

Cmara fotogrfica

Computadora de escritorio

Hojas boom

Flash mmory

11

IV.7.

Descripcin de las reas del laboratorio de Biotecnologa

de la

Facultad de Ciencias Agrarias.

Oficina

rea de lavado y esterilizacin

rea de siembra

rea de crecimiento

Invernadero con cmara de enraizamiento.

12

V.

PROCEDIMIENTOS

5.1 Reconocimiento del rea de trabajo

Como primera actividad se desarroll el reconocimiento las reas de trabajo la
cual cuenta con: 1) rea sucia o rea de lavado de los ex plantes y preparacin de
medios. 2) rea de siembra, en la cmara de siembra 3) cmara de crecimiento o
desarrollo 4) oficina 5) invernadero o lugar de aclimatizacin de la vitro plantas.}

Oficina

Esta es el rea de recepcin de personal y registro para el trabajo en las

siguientes reas. En esta rea es donde realizamos, cambio de vestuario para el
trabajo en las siguientes reas como preparado de medio de cultivo la siembra
de la cmara flujo laminar.

rea sucia o desinfeccin del material vegetal

Es la parte donde desinfectamos el material vegetal, una vez pasado por la oficina
y determinado la especie a micro propagar y preparar medios, limpieza de los
frascos para distribuir medios.
Cuenta con un sector de lavandera, mesones de cermica para la preparacin de
los medios de cultivo, con sus respectivas balanzas (analtica y precisin),
refrigeracin, pH Metro y autoclave.

rea de diseccin o cmara de siembra

13

Donde se realiza el trabajo de transferencia de los explantes a los medios de

cultivo, donde cuenta con una cmara flujo laminar tipo horizontal (el cual expulsa
el aire de manera frontal de adentro hacia afuera)

rea de incubacin o crecimiento

En esta parte se encuentra los frascos con explantes en desarrollo, controlado con
un temporizador de luz, ya que las plantas requieren 16 horas luz, divididos en 2
periodos.

rea de aclimatizacin

Esta rea tiene una cmara de enraizamiento con nebulizador automtico cubierto
con agrofil, sustrato de cascarilla de arroz, adems cuenta con plantas
ornamentales las cuales son sacadas del laboratorio y otras de las prcticas que
se desarrolla en las materias de fruticultura y biotecnologa.
5.2.

Limpieza del laboratorio

Limpieza de reas del laboratorio

Para la realizacin de desinfeccin de las reas donde se llev a cabo el trabajo

de pasanta en el laboratorio de biotecnologa, primeramente se procedi a la
limpieza para posteriormente usar productos desinfectantes comerciales como el
hipoclorito de sodio al 1% (Lavandina),por un lapso de 3 a 20, que es lo ms
recomendable. Este proceso consisti en pasar con trapo hmedo con los
productos indicados el suelo y los mesones.

Limpieza de materiales del laboratorio

Primeramente una limpieza personal y con la indumentaria necesaria como

barbijo gorro, empezando por las manos usando jabn anti bacteria. Para
14

humedecer el

trapo se us hipoclorito al 2 %, donde comenzamos con los

materiales ms delicados y con uso de menos frecuencia como las pipetas tubos
de ensayo, cajas Petri y frascos de precipitacin. Y por ltimo los frascos donde
se distribuye los medios de cultivos.

Limpieza personal

Antes de empezar para el inicio de la micropropagacin el cual es desinfeccin

del ex plante fue necesario la limpieza de las manos y antebrazos con jabn
antibacterial. Antes de empezar la siembra asptica en la cmara flujo laminar,
cortarse las uas, no llevar ningn objeto en la mano como ser anillos, manillas
relojes, estos pueden ser una fuente de contaminacin.
A continuacin la fase 0 y la 1ra fase de la micropropagacion de la vid.
5.3. FASE 0: preparatoria
Esta fase consiste en la preparacin del material vegetal de campo o de vivero,
previo a la introduccin al laboratorio en o la cmara de siembra, donde se
selecciona la planta donde posteriormente se realiza la desinfeccin para eliminar
los microorganismos.
En esta la fase se realiz la seleccin de la planta madre, en base a su calidad y
atributos que lo definen como una planta de alta calidad gentica, lo que significa
que tiene tolerancia a ciertas enfermedades.
Es muy importan saber que el protocolo que se est desarrollando, muchas veces
funciona el cultivo del durazno as tambin los resultado siempre fue el mismo.
Indicando que antes de realizar la preparacin de los ex plantes, se prepar 2
medios de cultivo para comparar la adaptabilidad para el establecimiento.
15

5.3.1. Preparacin de medio de cultivo para vid (Vitis silvestris)

Para preparar el medio de cultivo se revis los cuadernos de registro y se
seleccion el ms acorde a las revisiones bibliogrficas.
Cuadro N 1
Soluciones Stock de Murashige y Skoog (1962)
Solucin stock

Sales

Concentracin

50x

NH4NO3

sol. Stock gr/250 ml

20,625

utilizarse 1 L
20 ml

100x

KNO3
MgSO47H2O

23,75
9,25

10 ml

MnSO4 4 H2O

0,5576

ZnSO4 7 H2O

0,2645-0,215

CuSO45 H2O
CaCl2 2 H2O

0,000625
11,00

Kl

0,02075

CaCl2 6 H2O
KH2 PO4

0,000625
11,00

H3BO

0,02075

NaMo O4 2 H2O
Fe SO4 7 H2O

0,000625
0,696

Na2 EDTA

0,932

100x

100x

100x

de Volumen q debe

10ml

10ml

10ml

En este cuadro se muestra la solucin madre. Estas soluciones contienen 100x de

la solucin final, para preparar 1 l del medio de cultivo estn en ml de cada stock,
la misma que se encuentra en una concentracin de 250 ml qu llegara a ser de
litro.
Una vez que identificamos la solucin madre se calcula con la regla de 3 simple
para preparar el medio de cultivo para la especie de vid como se muestra en los
16

siguiente cuadros 2 y 3 donde, seleccionamos reactivos para preparar 400 ml para

el medio 1 y 250 ml para el medio 2. De medio de cultivo M.S (Murashige &
Skoog) para vid
Cuadro N 2
Medio de cultivo protocolo 1, para la preparacin de 400 ml de medio de
cultivo para la Vitis Silvestris.
Concentracin
I
II
III
IV
V
VI
Vitaminas
Inositol
ADso4
Carragenina
Sacarosa
Ph

Cantidad (ml)
6
3
3
3
3
4
4
3
4 ml
3,2gr
3 % (3gr por 100ml)
5,3

Cuadro N3
Preparacin de 250 ml de medio de cultivo del protocolo 2 para a especie
Prunus adaptada a leosas en este caso para la especie Vitis Silvestris
Concentracin
I

Cantidad (ml)
5
17

II
III
IV
V
Vitaminas
IBA
Inositol
Carragenina
Sacarosa
BAP
Ph

2,5
2,5
2,5
2,5,
2,5
1,0
0,625
1,4
7,5gr
5
5,7

En este cuadro se muestra las cantidades de soluciones, esta concentracin es

para especies leosas en especfico para Prunus.

Primeramente se agreg a un vaso de precipitacin de 500 ml de capacidad

los 250 ml de agua destilada.

Seguidamente se agreg las sales minerales de las siguientes soluciones: I,

II, III, IV y 5 de Murashige y Skoog.

Se agreg las vitaminas correspondientes

Despus se agreg Inositol, de acuerdo del requerimiento del ex plante

Se coloc el BAP (bencialminopurina).

Despus se realiza el pesado de la sacarosa, hacindose uso de la balanza

analtica.

Luego se mide el pH para su correccin con la ayuda del pH metro.

El ajuste del pH se realiza aumentando o disminuyendo hasta llegar al 5.3

(MESA, 2001) se agrega gota a gota para bajar se agrega el clorhdrico
(HCl), en lquido para aumento hidrxido de sodio.

Una vez mezclado se agrega carragenina y se disuelve.

Para que se disuelva mejor la carragenina se calienta en microonda el

medio de cultivo hasta lograr un color transparente del medio, esto puede
variar en segundos, o minuto.

18

Luego se distribuye en francos con una altura de 1 cm, para la

esterilizacin.

5.3.2. Esterilizacin de los medios de cultivo

El proceso de la esterilizacin de los medios de cultivo tienen los siguientes pasos.
1) Se midi con una regla normal la altura de agua de la autoclave a 2,5 cm, para
evitar insipientes.
2) Purgado es el cambio de aire por vapor. Consisti en dejar salir todo el aire,
una seal de que sali el aire es cuando empieza a salir el vapor por la vlvula
de escape es ah donde se cerr para que empiece a subir la presin.
3) Presurizacin: es el aumento de la presin interna hasta llegar a 15bs/pulg 2.
4) Esterilizacin durante 20 min, para este punto se mantiene a 120 C. este con
el fin de que los microorganismos y todo agente contamnate se elimina a esta
temperatura. Otra recomendacin que indica es si pasa a ms los reactivos
pueden generar otras mesclan lo que dara como resultado la perdida de
reactivos.
5) Despresurizacin lenta: es el enfriamiento de la autoclave, para esto se dej
hasta el da siguiente para el momento de la siembra. No se toco nada del
auto clave, lo nico se apaga la cocina y la garrafa.

5.3.3. Extraccin del material vegetal

Se seleccion la planta madre en base a su calidad gentica y propiedades
sobresalientes para porta injertos, que la definen como una planta donante de alta
calidad gentica.

19

Debemos seleccionar la planta madre para la extraccin de explantes en este

caso es el vid californiana trada de Camargo el 2011 para unas pruebas de
micropropagacion con caractersticas peculiares, la cual se encuentra en el mismo
Centro o granja Villa Carmen- Yotala.
5.3.4. Preparacin de 100 ml hipoclorito y 500 ml de alcohol de solucin
para la desinfeccin de ex plantes.
Primeramente se realiz el preparado de desinfectante que es hipoclorito al 2% a
partir de la lavandina al 5.5 % y alcohol al 70 %
a) Para el hipoclorito se realiz la siguiente formula:
C1V1=C2V2
Dnde:
C1= concentracin original de la lavandina
V1= Volumen a utilizar de la lavandina
C2= concentracin a preparar
V2= volumen a preparar
5,5% * X =2% *100 ml
X=

200
5,5%
X=36,36 ml

Para prepara 100 ml de hipoclorito al 2 % se requiere 36,36 ml de hipoclorito +

63.63 de agua desinonizada
b) Preparacin de 500ml de alcohol al 70 % con una concentracin original
del 96 % usando la formula anterior tenemos lo siguiente:
20

96% * X =70% *500ml

X=

35000
96%

X=365ml de alcohol al 96%

365ml de alcohol al 96 % + 135ml de agua ionizada, para la preparacin de
500 ml de alcohol al 70 %.

CUADRO N4
Costos aproximados en la produccin de plantines in vitro para vid.
Descripcin
Material de gabinete

Unidad

Cantidad Precio unitario

Total

- Mandil y barbijo
Hormonas

-------

65

65

cc

25

12,4

310

BAP

21

IBA

cc

25

12,4

310

Agar

gr

10

3,5

35

Alcohol

lt

15

15

lt

16

- Agua destilada
Material de escritorio

Tubos

Pieza

50

0,5

25

Cajas Petri

Pieza

10

15

150

Probetas

Pieza

10

20

Bistur

Pieza

Pinzas

Pieza

15

45

Algodn

Pieza

- Papel estaado
Otros

Pieza

12

12

30

30

40

40
1078
107,8
1185,8

Agua

Luz
Sub total
Imprevistos 10 %
Total
-

Costos aproximados para la produccin de 100 plantines en un preparado de 1000

ml de medio de cultivo.

5.3.5. Desinfeccin de las yemas y nudos de la vid

Para la desinfeccin de los ex plantes o material vegetal, como primer paso:

Se remoja en agua con una gota de detergente, para eliminar la tierra o

insectos que pueda haber en el mismo. Este proceso duro 2 minutos y luego al
enjuagado por 3 veces.

Una vez lavado con abundante agua y detergente, pasamos al siguiente paso
es uno de los pasos ms importantes.
22

Remojar en alcohol al 70 %.

Para esto primero se investig por cuantos minutos se puede remojar el ex plante,
puede suceder que la especie no resiste mucho tiempo en alcohol, porque si se
tiene demasiado tiempo puede penetrar hasta el floema o meristemos y esto
puede ocasionar que la planta no brote.
Los explantes se sumergieron en frasco de vidrio con tapa, por 2 minutos esto
tiene que ser exacto para evitar la muerte del tejido vegetal, agitando para lograr
un remojo homogneo de todos los explantes, una vez que realizamos la
desinfeccin pasamos al siguiente paso.
5.3.6. Desinfeccin en hipoclorito al 2%.
Una vez remojado en alcohol, cambiamos los explantes a otro frasco con
hipoclorito al 2 %. Segn la informacin que obtuvimos no debemos tener ms de
20 min cual sea la especie, esto debe ser menos de 20 min. Por tal razn
probamos con 15 minutos para lograr la desinfeccin.
Antes de agitar para un remojo homogneo se agrega un adherente, el cual es
detergente ola, tapamos bien el frasco y agitamos de manera delicada durante
15 minutos, pero antes de cumplir los minutos indicados. Se ha limpiado la cmara
flujo laminar que en el punto siguiente se indica los pasos.
5.3.7. Lavado del ex plante en agua esterilizada
Previamente realizado la limpieza de la cmara flujo laminar, realizamos el
enjuague con agua esterilizada, 3 veces y 2 minutos para sacar el hipoclorito y
alcohol, para que no afecte en el desarrollo del tejido.
5.3.8. Desinfeccin de la cmara flujo laminar
23

Se prendi la luz ultravioleta una hora antes de trabajar o desinfectar, esto

con el fin de eliminar los microorganismos as evitar la contaminacin, adems
debe estar cerrado la cmara flujo laminar en este caso como no se cuenta
con una puerta se us plstico polietileno.

Se apaga la luz ultra violeta y se enciende la cmara flujo laminar.

Luego se procede a la desinfeccin, donde primeramente se debe lavar las

manos y antebrazo con agua y mucho jabn anti bacterias, posteriormente
con alcohol al 70 %., para realizar esa actividad tuvimos que contar con la
indumentaria como el gorro de laboratorio y barbijo para no contaminar el
interior.

Se realiz la limpieza del interior de la cmara de flujo laminar con algodn

empapado al 70%. Primeramente la parte frontal o filtro de la cmara,
seguidamente la parte superior las cuales son los ms importantes, luego los
laterales y por ltimo la base de la cmara, tomamos como prevencin de no
tocar los frascos q se encuentra adentro.

Los instrumentos son flameados en una llama de mechero de alcohol al

96%, para mantener la asepsia de cmara los instrumentos se flameo 3 veces.

Se hizo flamear la caja Petri y a una de ellas se puso los instrumentos

flameados, con la debida recomendacin que no se debe pasar las manos
sobre las cajas.

Flamear la boca del frasco que contienen los medios de cultivo, antes y
despus de introducir el ex plante.

Las incisiones se realizan en la otra parte de la caja Petri para dividirlos con
pinza y bistur.

Al momento de colocado el explante al medio de cultivo se tuvo mucho

cuidado de no exponer a contaminante como ser el no pasar por encima las
manos y flamear antes y antes de sellado del frasco.

24

luego se procedi a la etiquetacin o en este caso se marc en el frasco

la fecha de siembra con el fin de hacer un seguimiento del tiempo y nmero de
explantes axenicos.

Al terminar la siembra antes de apagar la cmara se debe colocar la tapa

(plstico de polietileno), para no dejar y no meter microorganismos para el da
siguiente da de trabajo.

Una vez concluido el trabajo se procedi a la limpieza y ordenar y lavado

de los frascos y otros materiales de uso para la siembra.

5.4.

FASE 1

Establecimiento del cultivo

Una vez que se procedi la fase 0 de la preparacin de los tejidos vegetales y

realizado la limpieza de la cmara flujo laminar se desarrolla en si lo que es el

establecimiento.
Como primer paso despus del enjuagado de los tejidos, se coloca el ex plante
en una caja Petri y se procede a aislar las partes que sobran en el tejido,

dentro de la cmara flujo laminar.

Una vez aislados los tejidos a cultivar son sembradas en tubos de ensayo,
para luego multiplicar a frascos de vidrio con una preparacin de medio

especial.
Luego de aislar la parte vegetal que nos importa se procedi a la siembra lo
cual consisti en sacar la tapa de los tubos de ensayo, cerca del mechero con
alcohol al 96 %, se flameo la boca para eliminar algn contaminante adherido
al tubo, usando la pinza se coloc al medio y antes de sellar con file se flamea

nuevamente.
Seguidamente se registr como medio 1, medio 2 y tipo de ex plante si es
yema o nudo luego se pone la fecha del da/mes/ao del establecimiento,

seguido de la especie o variedad y finalmente el nombre del operador.

Se observ durante 20 das el desarrollo de los ex plantes, para realizar
cambios desde el medio

incrementando la dosis de desinfeccin para

25

reducir la mortalidad de las plantas lo cual significa una prdida de recursos o

reactivos lo que es lo ms cuesta en el cultivo in vitro.

Una vez identificado los tubos con ex plantes muertas se las asla previo

registro del nmero que se est desechando.

Luego se precedi a la repeticin del proceso pero esta vez realizando algunos
cambios en el medio de cultivo y solo usando un medio.

6. Otras actividades y resultados

Establecimiento de durazno (Prunus prsica)
Como primer actividad de la pasanta se realiz el establecimiento de durazno, el
cual resulto no apto por la fecha por que los brotes ya estaban duros, entonces
para romper la dormancia de los brotes se puso al refrigerador durante 20 dias
aun asi no resulto, por esta razn se cambi al cultivo de vid.
Subcultivo de azucenas (Lilium sp)
La actividad se realiz en primer punto con la divisin de bulbillos de la azucena y
descartar las que estn oxidadas. Algo importante se logro es la desinfeccin de
los ex plantos al 1 % en hipoclorito de sodio y hubo resultados satisfactorios.

Amarilis (Hippeastrum sp)

El procedimiento es similar que las azucenas, solo que la diferencia es que no
resulto al 1 % de hipoclorito de los frascos contaminados en la mayor parte por
bacterias. Algunos frascos se quitaron lo oxidado con un bistur nmero 23 y
trasladar a otro frasco.
Subcultivo de rosas (Rosa spp.)

26

En esta especie se cultiv las partes que an estaban vivas se logr rescatar en
la actualidad tenemos 2 frascos para multiplicar. Esta especie lo nico que
presento es la presencia de fenoles el cual no afecta mucho.
Castaa ( Castanea sativa)
Esta especie fue realizado por un interno igual solo era la primera fase el
establecimiento de castao. Se preparado medio de cultivo en a WPM en base al
protocolo de establecimiento que realizo el interno, en este momento estn en
fase de multiplicacin siempre cuidando que no se pierda esta especie en el
laboratorio.

6.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos durante el trabajo de pasanta de 5 meses, fueron los

siguientes.
Efecto de la sobrevivencia fase 1
Cuadro N 5
Dosificacin y tiempo de inmersin en hipoclorito de sodio

27

Material

Fecha

de Concentracin Tiempo

de

vegetal

establecimient

de hipoclorito

desinfeccin

Primera
Segunda
Tercera

o
11-mayo
18-mayo
09-junio

1%
1.5%
2%

10
10
10

Grfico N 1
Efecto de hipoclorito de sodio en la desinfeccin de los explantes de la vid.

Esta prueba se desarroll para la obtencin de informacin el grado de

concentracin y el tiempo para evitar futuras contaminaciones o la eliminacin de
la totipotencia del tejido.
Grfico N 2
Porcentaje de ex plantes contaminados y porcentaje de ex plantes axenicos.

28

En el grfico N 2 se puede observar el porcentaje de ex plantes contaminados en

un 38% y 62% de ex plantes axenicos. No se present en forma representativa
hongos ni bacterias si no la prdida fue por la oxidacin y la produccin de fenoles
de la especie.

GRAFICO N 3
Evaluacin de 2 protocolos de micropropagacion de los medios de cultivo
29

Se desarroll una comparacin de 2 protocolos de cultivo, una que es de adafuel

que fue elaborado para Prunus prsica y la otra para vid, en una primera siembra
adafuel resulto efectiva pero con limitaciones de crecimiento o desarrollo de nudos
para su multiplicacin por lo cual tuvimos que modificar el protocolo 2 para la
obtencin de uno nuevo en base a otras pruebas la cual resulto ser eficiente.

7.

CONCLUSIONES

30

El cultivo in vitro o micropropagacion es un proceso largo, que requiere de un

tiempo mnimo de 1 ao a 2, por lo que se ha desarrollado el trabajo solo de la
primera fase , el cual es una de las ms complicadas y que requiere de
mucho tiempo y paciencia, por esta razn se tom solo la primera fase que es
el establecimiento.

Como primer punto se ha logrado obtener una eficiente desinfeccin de los

ex plantes con una inmersin en alcohol al 70 % durante 2 minutos, luego la
desinfeccin al 2 % de cloruro

durante 10 min. Segn la bibliografa

recomendada no debe pasar de los 20 minutos hasta ahora no

se ha

observado especies que resistan a ms de 20 a 25 min de inmersin.

Lo que se presento es la oxidacin una mortandad por este efecto, se ha

perdido en un porcentaje muy alto de las plantas.

Se ha probado 2 protocolos que se han desarrollado en el laboratorio por

anteriores internos y otro realizado en otros pases por los resultados
obtenidos en el ltimo establecimiento se opt por el protocolo 2 realizado.

El medio de cultivo segn Murashige es el que se us para preparar los

medios nutritivos.

El

protocolo de adafuel (Prunus prsica) se adapta a la mayora de las

leosas en este caso de la vid.

Y protocolo de Vid (Vitis vinfera)

En conclusin el protocolo 2 se adapta a la vid porque es un medio nutritivo

para leosa, los resultados del desarrollo no son los resultados esperados a
comparacin del medio de cultivo de vid.

8.

RECOMENDACIONES

31

Se recomienda realizar la desinfeccin de los nudos y yemas, en plantas

tiernas son las que ms resulta a adaptarse al medio, adems la desinfeccin
es ms efectiva.

Usar hipoclorito de sodio al 2 % con un tiempo de inmersin de 10 minutos en

tejidos de plantas tiernas.

Previo al uso de hipoclorito de sodio se recomienda alcohol al 70 % por 2

minutos.

Se recomienda cumplir todas las normas de asepsia, recomendadas para

evitar posibles contaminaciones, de esta forma lograr resultados satisfactorios
para los interesados.

Usar los equipos de seguridad personal, para el manipuleo de los reactivos y

tener precaucin al momento de pipetear.

Al momento de esterilizar, se debe tener cuidado en el uso del autoclave, lo

ms recomendable es la presencia de 2 personas en caso de algn
inconveniente, porque se maneja a temperatura altas 120C.

En el uso de la cmara flujo laminar, debemos tener en cuenta que la luz

ultravioleta no debemos exponer la vista, en el flameado de los instrumentos,
tener mucho cuidado porque se puede ocasionar algn incendio, se reitera la
presencia de un ayudante.

Probar otros medios y protocolos para la micropropagacion de esta especie.

32

9.

BIBLIOGRAFIA
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(Prunus amigdalus x Prunus prsica).Sucre , Bolivia. U.S.F.X

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Multiplicacin de plantas hortcolas.

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40 (3)

HARTMAN, H. y KESTER, D. (1987). Propagacion de plantas 2da Edicion

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aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales. En: cultivo de tejidos vegetales
aplicado a la produccin agrcola; Villegas, L. (Ed). Curso realizado en la
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manejo de plntulas In Vitro en la produccin de semilla de papa. Centro
Internacional de la Papa (CIP). Disponible en www.

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vinifera L.). Taller de Licenciatura. Ing. Agr. Quillota, Pontificia Universidad
Catlicade Valparaso. Facultad de Agronoma.

MORAN, P. (2004) Implementacin de tcnicas de aclimatizacin para plantas

micro propagadas de Vid (Vitis vinifera L.) y porta injerto de cerezo (Prunus
cerasus

P.

canescens)

Gisela

5.Quillota.

Disponible

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http://ucv.altavoz.net/prontus_unidacad/site/artic/20080123/pags/20080123110
221.html [visitado el 21-junio-2015]

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inmersin en el establecimiento de Dianthus caryophyllus L. in vitro. Tesis Ing.
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33

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VELIZ, L. (2001). Relacion de auxinas y citoquininas para el establecimiento y

proliferacin de brotes de 6 cultivares de camote (Ipomoea batata)
procedentes de la zona de rio chico. Tesis Ing. Agronmica. U.S.F.X. Sucre,
Bolivia.

34

ANEX
OS
35

ANEXO N 1: reas con que cuenta el laboratorio de biotecnologa de la

Carrera de Ingeniera Agronmica.

a) Oficina del laboratorio

b) rea sucia o de limpieza de los explantes y rea de esterilizacin

36

c) rea de siembra o limpia el cual cuenta con la cmara flujo laminar

vertical hechiza.

d) rea de incubacin o de crecimiento

37

e) rea de aclimatizacin

38

Esta rea est ubicada detrs del laboratorio de micropropagacion o cultivo in

vitro, como se observa tiene una cmara de enraizamiento.
ANEXO N 2: Preparacin de la fase 0: obtencin de los ex plantes

Una vez identificado la especie, se est extrayendo los brotes ms tiernos de la

especie vid (Vitis silvestris)
39

ANEXO N 3Lavado y desinfectado de los explantes con detergente

En esta fotografa se realiza el lavado para quitar las partculas del explante como
tierra y otros.

40

ANEXO N 4: Preparacin de medios de cultivo

ANEXO N 5: Esterilizacin de los medios de cultivo en autoclave

41

ANEXO N 6: Establecimiento in vitro

Enjuagado del explante con agua esterilizada para quitar el hipoclorito de sodio
durante 2 min con una repeticin de 3 veces.

Se realiza el enjuagado por tres repeticiones con agua esterilizada para eliminar el
hipoclorito de sodio y el alcohol. Cada etapa por 2 min.

42

ANEXO N 7: Transferencia del frasco de desinfeccin a la caja Petri para la

diseccin del explante

Una vez realizado el enjuagado con agua esterilizada, se transfiere los explantes
a las cajas Petri para su diseccin todo esto con mucho cuidado para evitar la
contaminacin.

43

ANEXO N 8: Diseccin del explante para la siembra en el medio de cultivo

Se desarrolla los cortes del explante, sobre todo eliminar las puntas porque son
las partes que estn quemadas y tambin es por donde absorben nutrientes.

ANEXO N 9: ex plantos muertas por oxidacin y contaminacin

44

Se puede observar explantes muertas por oxidacin y muy poca por

contaminacin.

ANEXO N 10: ex plantes sobrevivientes.

45

As quedan los explantes una vez establecido para, para proceder a la siguiente
etapa que es la multiplicacin se puede observar que hay nudos.

46

47