UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE

MEXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORESZARAGOZA

BIOQUIMICA CELULAR Y DE LOS

Extraccin,
TEJIDOS I
purificacin,
cuantificacin de
ADN humano.
Grupo: 2451
Profesor: Rosalba Cervantes
Equipo 6

Mendoza Soto Vctor

Ramrez Aguilar Alonso Leonel
Vega Rivas Juan Ignacio

Objetivos

Analizar el fundamento de la extraccin de ADN

Extraer el ADN de una muestra utilizando el equipo de reactivos Wizard
genomic DNA purification
Cuantificar el ADN de una muestra por el mtodo espectofotometrico
utilizando un biofotometro.
Determinar la pureza de ADN extrado
Realizar la electroforesis del ADN extraido y cuantificado.

Resultados
Extraccin y purificacion de ADN
Paso del mtodo
efectuado
Lisis celular

Lisis nuclear

Separacin de protenas
del ADN

Precipitacin de ADN

Observaciones en cambios fsicos de la muestra

de ADN
Durante este paso se separ al ADN del resto de la
celular, por medio de un rompimiento de las clulas
del plasma sanguneo.. Al agregar el reactivo de lisis
celular, incubar y centrifugar, se pudo observar la
formacin de una pequea pastilla blanca al fondo
de la muestra con mucho sobrenadante de por
medio el cual se deshecho.
El propsito de este paso fue aislar la molcula de
ADN del nucleo que la contenia, para asi poder
purificarse de manera adecuada el ADN. Al aadir el
reactivo de lisis nuclear, agitar y resuspender la
pastilla, se pudo observar la formacin de una
disolucin transparente muy viscosa.
Durante este paso se agrego el reactivo de lisis de
protenas y se agito vigorosamente por 20 segundos
con el propsito de separar al ADN de las protenas
con las que se encontraba.
Durante este paso se dio la precipitacin del ADN
utilizando isopropanol como agente precipitador
(debido a que el ADN es insoluble en grupo alcohol y
llevando a la centrifuga, se form un precipitado
blanco al cual se le coloco etanol y se decant
posteriormente. Se formaron pequeas hebras
blancas de ADN que sedimentaron al cabo de unos
segundos

Cuantificacin de ADN
Para la cuantificacin de ADN, se realiz una dilucin 1:30 de la muestra obtenida
y se ley posteriormente en el biofotometro obteniendo los siguientes resultados.
Cantidad de ADN: 53.9 ug/mL
Absorbancia a 230 nm: 1.104
Absorbancia a 280 nm: 0.982
Absorbancia a 260 nm: 1.079
Coeficiente 260/280: 1.10
Coeficiente 260/230: 0.98

Efecto hipercromico.
Otra forma de medir la pureza obtenida de ADN es mediante el efecto
hipercromico, el cual consisti en someter la muestra de ADN a altas temperaturas
para su desnaturalizacin, para asi, esperar un incremento en la absorbancia al
leer en el biofotometro., lo que indica la desnaturalizacin de ADN.

Absorbancia a 260 nm: 1.33 (aumento un 23.26%)

Concentracion ADN: 6.6 ug/mL (disminuyo)

Electroforesis de ADN
Lamentablemente no se pudieron obtener datos de esta prueba, debido a que la
electroforesis empleada en clase fracaso rotundamente.

Anlisis de los resultados

Extraccion y purificacin de ADN

La extraccin y purificacin de ADN es un mtodo preestablecido el cual tiene

como objetivo separar la molcula de ADN del resto de la clula para su posterior
anlisis cualitativo y cuantitativo.
Este mtodo se caracteriza por 4 etapas principales: lisis celular, lisis nuclear,
separacin del ADN de las protenas, y precipitacin del ADN
Durante la lisis celular se da un rompimiento de la clula, la cual abre paso a la
futura purificacin de la molecula de ADN. Una vez efectuada la lisis celular la
membrana celular puede romperse, mecnicamente, qumicamente o por alguna
combinacin de los dos. Para realizar la lisis qumica, las clulas se suspenden en
una solucin que contiene detergentes y otros reactivos que interfieren con los
enlaces qumicos que sostienen las protenas de las membranas juntas. Esto
resulta en la rotura de la membrana y la liberacin de los componentes
intracelulares. Posteriormente se abre paso a la lisis nuclear. En este paso, la
molcula de ADN de asla del ncleo que es el lugar en donde se encuentra en las
clulas eucariontes. Esta lisis es posible gracias al reactivo de lisis celular y a una
accin mecnica (agitacin) la cual tiene por objeto afectar los enlaces que
mantienen unidos a los componentes del nucleo.
Mas tarde tienen lugar la separacin proteica y la precipitacin del ADN, la cual es
posible gracias a las propiedades del ADN como su insolubilidad en alcohol,
formando un precipitado y de esta forma obtener la muestra lo mas pura posible.

Cuantificacion de ADN

La cuantificacin de ADN es posible gracias a un aparato denominado

biofotometro, el cual mide la absorbancia que tiene el ADN a la longitud de onda
en la cual la molecula tiene un grado mximo de absorbancia(260 nm) y
posteriormente arroja los resultados en ug/mL. En el caso de la muestra obtenida
se obtuvo una concentracin de ADN de 53.9 ug/mL lo que sugiere una gran
cantidad de muestra obtenida.
Posteriormente, para verificar el porcentaje de absorbancia de ADN, se miden las
absorbancias a 280 y 230 nm, ya que a estas longitudes de onda, las protenas y
los polisacridos que se encuentran en el ADN tienen un mximo de absorbancia.
Los resultados obtenidos arrojaron una absorbancia a 260 nm de 1.079, a 280 nm
de 0.982 nm y a 230 nm de 1.104

La pureza de la molecula puede medirse por el de la absorbancia medida a 260

nm entre la absorbancia medida a 280 nm, siendo los valores optimos en tre 1.7-2.
En el caso de esta muestra, el valor obtenido fue de 1.1, lo que implica que la
muestra de ADN no se encuentra completamente aislada y contiene restos de
protenas por lo que se recomienda repetir el experimento. Este resultado puede
deberse a la ejecucin de una mala lisis quimica (celular o nuclear), o a una mala
lisis fsica (agitacin), la cual se efectuo sin tanta vigorosidad como sugera el
experimento.

Efecto hipercromico

Cuando la molecula de ADN es sometida a altas temperaturas, esta se

desnaturaliza, es decir, pierde sus propiedades fundamentales que la caracterizan.
La doble hebra de la que esta hecha el ADN, al desnaturalizarse colapsa y se
separa en sus dos hebras complementarias formando conformaciones al azar, lo
que origina un cambio cualitativo y cuantitativo. La viscosidad que caracterizaba a
la disolucin de ADN desaparece y esto se ve traducido en una disminucin de la
concentracin. De igual modo, la absorbancia del ADN a 260 nm aumenta debido
a una desnaturalizacion de las bases que conforman el ADN. En los resultados de
esta prctica puede notarse que al desnaturalizar la muestra ocurrio un aumento
en la absorbancia a 260 nm y una disminucin de la concentracin.

Electroforesis de ADN

Debido a que la electroforesis fracaso no puede efectuarse un anlisis de

resultados optimo. Solo cabe mencionar que la electroforesis es un mtodo de
separacin de los componentes de una mezcla, debido a la aplicacin de un
campo elctrico, arrastrando los componentes a diferente velocidad debido al
tamao de estos y a su carga neta. Tambien puede mencionarse que la
elecroforesis pudo haber fallado a causa de alguno de los siguientes problemas:
una mala preparacin de la cmara de la electroforesis, una mala aplicacin de la
muestra en la cmara o incluso pudo deberse a alguno de los reactivos empleados
durante la preparacin de la cmara.
Conclusiones
Los objetivos de esta practica no fueron cumplidos del todo, ya que la extraccin y
purificacin de ADN se llevo a cabo utilizando el mtodo de Wizard, aunque no se
obtuvo el rendimiento deseado en la purificacin de la molecula obteniendo un
coeficiente entre las absorbancias 260-280 algo bajo, aunque la prueba de efecto
hipercromico se realizo satisfactoriamente. El objetivo que no se cumpli fue la
realizacin de la electroforesis, ya que por los motivos antes expuestos fracaso.

Bibliografia

Campbell MK Farrell SO, Bioquimica, 6 edicin, Mexico DF: Cengage

Learning, 2010
Gonzalez Moran MG, Tecnicas de laboratorio en biologa celular y
molecular, Mexico, Facultad de ciencias, UNAM,AGT Editos S:A,2008
Jimenez L. Merchant H. Biologia celular y molecular, Mexico, Pearson,
Educacion, 2003