Produccin de plantas haploides a partir del

cultivo in vitro de anteras y granos de polen

de cucarda (Hibiscus rosa-sinensis)
Arboleda Mario, Boada Lissette, Salgado David
Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE
Sangolqu, Ecuador
maarboleda1@espe.edu.ec; laboada@espe.edu.ec; ldsalgado1@espe.edu.ec

Resumen
Palabras clave
Abstract
Key Words
I. Introduccin
Habiscus rosa-sinensis es un arbusto leoso en la base, perenne y muy ramificado con hojas
simples, alternas, dentadas y pecioladas. Posee flores solitarias con forma de embudo, son
pediceladas, actinomorfas y hermafroditas, tienen cinco ptalos de colores carmes, rosado,
blanco. Sus anteras son de color amarillo y sus estambres rojos, a la cucarda se la considera una
planta til desde el punto de vista ornamental por su facilidad de floracin y tambin se conoce
que posee propiedades medicinales, este arbusto es de clima tropical (Rueda, 2007).
El cultivo de anteras es una tcnica por medio de la cual es posible producir lneas homocigotas
a partir de poblaciones segregantes mediante el doblamiento cromosmico del polen haploide y
la regeneracin de plantas en un ciclo de cultivo in vitro. En contraste por los mtodos estndar
de fitomejoramiento normalmente se requieren seis generaciones de autofecundacin para
alcanzar la completa homocigosis en plantas autogamas (Castillo 2005).
Mediante esta tcnica, las anteras inmaduras que contienen polen en una etapa especfica de
desarrollo se colocan en medios donde el polen inmaduro se divide para formar embriones o
callo. Transferidos stos a medios de regeneracin, se forman plantas. En la mayora de los
casos se producen plantas haploides estriles, pero en algunas especies ocurre una duplicacin
espontnea de los cromosomas en las etapas de desarrollo del callo y de regeneracin de la
planta. Desde que Guha y Maheshwari lo descubrieron en 1964, el cultivo de anteras se ha
extendido a ms de 150 especies (Prez et al., 1998).

II.

Materiales y mtodos

Se recolect muestras de la planta madre Hibiscus rosa-sinensis ubicada en el campus de la

ESPE matriz en Sangolqu-Ecuador.
Las cucardas recolectadas fueron flores inmaduras, cerradas y sin marcas de marchitez,
oxidacin o presencia de insectos, se las transport en fundas ziploc hasta el laboratorio, para
evitar contaminacin con el ambiente.
Antes de entrar a cmara de siembra se realiz un desinfeccin de los pisos del rea de trabajo
con Kalipto, las cmaras de siembra se limpiaron con alcohol al 90% y los materiales como
mecheros de alcohol, juego de pinzas y bistur que fueron autoclavados con anterioridad, papel

toalla estril, frascos de medio, botellas de agua estril y vasos de precipitacin vacos fueron
rociados con alcohol al 70%.
En el rea de limpieza de explantes, a estos se enjuag minuciosamente con agua corriente para
retirar tierra, luego se coloc los explantes en un vaso de precipitacin con 500 mL de
detergente al 2% manteniendo la solucin en agitacin durante 15 minutos posteriormente se
realiz dos lavados con agua destilada y uno con agua estril hasta eliminar todo el detergente.
Seguidamente se someti a los explantes a una inmersin de 500 mL de hipoclorito de sodio al
2% ms tres gotas de Tween 20 durante 10 minutos en agitacin.
Siembra del material: Se llev los explantes a cmara de siembra previamente desinfectada y en
condiciones aspticas, en donde se realiz tres enjuagues con agua estril con un tiempo de
duracin de 5 minutos, terminado el proceso de desinfeccin se coloc los explantes sobre
servilletas estriles, se realizaron cortes con el bistur y pinzas previamente flameadas retirando
los ptalos de la flor y con el bisturs delicadamente se retiraron lo granos de polen.
Por ltimo se inocul los granos de polen en dos frascos de medio de cultivo de Murashinge &
Skoog enriquecido con 2.5mg/L de 2,4-D, se los almacen en luz ligera de 2000 lux con un
fotoperiodo de 14 horas y una temperatura de 28C.

III.

Resultados

Los resultados se observaron a los 7 das y como se denota en la figura 1 no present ningn
signo de contaminacin y ni de oxidacin, adems el explante haba aumentado de tamao y se
encontraba encorvado.

Figura 1. Resultados de siembra de polen frasco 1

Foto Tomada por: Anah Boada

Los resultados observados a los 7 das en la figura 2 se observ la presencia de races largas,
unas ms gruesas que otras, adems el explante haba aumentado de tamao y se encontraba
encorvado.

Figura 2. Resultados de siembra de polen frasco 2

Foto Tomada por: David Salgado
Tabla 1. Descripcin resultados.

Fecha de
Siembra:
18/07/2016

Frasco 1

Presencia
de
raicillas.

Frasco 2

Presencia
de
raicillas.

Frasco 3

Presencia
de
raicillas.

Caractersitica
s

Estructuras

IV.

25/07/2016

Contaminacin

Explante:
Habiscus rosasinensis

Fecha de evaluacin:

El polen se
encorv
y
aument de
tamao, su
colr se hizo
ms oscuro,
las raicillas
son largas y
gruesas.
El polen se
encorv
y
aument de
tamao, su
colr se hizo
ms oscuro,
las raicillas
son cortas y
delgadas.
El polen se
encorv
y
aument de
tamao, su
colr se hizo
ms oscuro,
las raicillas
son cortas y
delgadas.

Discusin

A fin de obtener callos en un medio de cultivo se enrique se el medio utilizando con una auxina
(Singh, 2002), en el presente trabajo se lo hizo con 2,4-D.
La metodologa que se utiliz para la desinfeccin extra a la comnmente realizada con
detergente e hipoclorito de sodio, fue la de exposicin directa al mechero a fin de esterilizar el

cultivo que rodea a las anteras y de esa formar evitar la contaminacin del explante y por ende
del medio (Gmez, 1998).
El cultivo in vitro de anteras requiere de una estadio especifico del polen, especficamente
etapas muy tempranas de la evolucin de este, todos los frascos presentaron brotes y pequeas
raicillas. Los resultados posibles a obtener en el cultivo de anteras es la callognesis cuando el
grano de polen produce un callo o embriognesis cuando se produce un embrin (Jong, 2012).
Para la induccin callos por medio de siembra de anteras y granos de polen en el caso de las
angiospermas es conveniente seleccionar botones florales inmaduros por lo cual los botones de
cucarda al momento de recolectarlos estaban cerrados y en el cultivo de los mismos se tienen
mejor respuesta en un medio cido a pH 5.8 y a 800 lux (Wernicke y Kohlenback, 1976). Los
medios de la prctica se encontraban a un pH de 5.7 5.8 y estos fueron almacenados en
estanteras cubiertas de la luz natural y a temperatura ambiente.
Lentini, Martnez y Roca (1993), expresan que los callos empiezan aparecer alrededor de los 20
das de cultivo y alcanzan una induccin masiva entre los 40 y 50 das, por lo que no se puede
concluir que en nuestros medios no se formarn callos.
El cultivo de anteras es una tcnica con ciertas limitaciones en donde solo ciertas plantas est
comprobado que puede formar lneas homocigticas (Llorente, 2002), por lo que no podemos
afirmar que los brotes obtenidos son de homocigticos.

V.

Recomendaciones

El desarrollo que tengan las anteras es fundamental para un crecimiento rpido de los brotes,
por lo que es necesario buscar botones florales a punto de abrirse, para asegurar el estado de
madurez de los explantes.

VI.

Conclusiones

El cultivo de anteras fue establecido sin asegurar que los brotes obtenidos son necesariamente
haploides, para verificar esta caracterstica es necesario constatar que el brote sea
reproductivamente inviable.
Basndose en las caractersticas del brote se puede sustentar que lo que se obtuvo fueron
embriones.

VII.

Cuestionario

Cmo puede usted determinar si las plantas son haploides o diploides?

En las plantas las dos fases nucleares reciben nombres diferentes: las formas haploides
desarrollada a partir de los gametos se denominan gametofito, y las diploides se denominan
esporofitos. Las plantas haploides contienen la mitad del material gentico necesario para dar
origen a una nueva planta, esta ser incapaz de reproducirse convirtindose en un hbrido,
entonces su esterilidad facilitar su distincin (Pliego & Barcel, 2001).

VIII.

Referencias
[1]

Castillo, A. (2005). Propagacin de plantas en cultivo in vitro. Unidad de

Biotecnologa. INIA.

[2]

Jong, M. & Leyser, O. 2012. Developmental Plasticity in Plants. Cold Spring Harb
Symp Quant Biol 2012 77: 63-73.

[3]

Llorente, B. 2002. Cultivo in vitro. [En lnea].

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2211/4_-_

[4]

Prez; Alvarado; Gmez. (1998). Propagacin y mejora gentica en Biotecnologa.

Cuba.
Pliego, F y Barcel. 2001. Morfognesis in vitro. En: Introduccin a la
Biotecnologa Vegetal. Mtodos y aplicaciones. Crdobas, Espaa. P 233-242.
Roca, W., & Mroginski, L. 1993. Cultivo de tejidos en la agricultura: Fundamentos y
aplicaciones. Cali: Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT.

[5]
[6]

Disponible

en:

[7]

Rueda, D. (2007). Botnica Sistemtica. Cuarta edicin. GLOB UBLI. Quito.

[8]

Singh IP (2002) Micropropagation in citrus. Agr. Rev. 23: 1-13.

[9]

Wernicke, W.C y Kohlenback, H. (1976). Investigations on liquid mdium as a

means of anther culture in Nicotiana. Z. Pflanzenphysiol