XVIII ENCUENTRO DE JVENES INVESTIGADORES DE LA UNL

3 y 4 de setiembre de 2014, SANTA FE.

OBTENCIN DE UN FRAGMENTO DE ANTICUERPO RECOMBINANTE scFv

anti-rhFSH, A PARTIR DE UN HIBRIDOMA
Aguilar, Ma. Fernanda

1*

1. Estudiante de Licenciatura en Biotecnologa

Laboratorio de Cultivos Celulares. Facultad de Bioqumica y Ciencias Biolgicas.
*fernandaaguilar74@gmail.com

rea temtica: Ciencias Biolgicas

Sub-rea: Biotecnologa
Grupo: X
INTRODUCCIN
La necesidad de obtener elevados niveles de expresin de una determinada protena,
de una forma econmicamente rentable, en poco tiempo y que no requiera de
modificaciones postraduccionales, ha llevado a la generacin de nuevas formas proteicas
recombinantes, capaces de ser expresadas de modo fcil, rpido y en condiciones de cultivo
prcticas y econmicas, utilizando clulas procariotas.
La hormona folculo estimulante humana (hFSH) es una glicoprotena heterodimrica
de 34 kDa, formada por dos subunidades y , unidas mediante interacciones de tipo no
covalente (DAntonio, 1999). Existen varias isoformas con diferentes modificaciones
postraduccionales, que actan en diferentes momentos con distintos efectos fisiolgicos
(Padmanabhal, 1992). Comienza a sintetizarse en la adolescencia, por el lbulo anterior de
la glndula hipfisis y juega un rol importante en la regulacin y mantenimiento de los
procesos reproductivos en la mujer y en el hombre. Por lo tanto, cuando se encuentra en
bajas concentraciones, debido a una disminucin en su sntesis o secrecin, genera
problemas de infertilidad, que pueden ser revertidos mediante la administracin de hFSH.
Actualmente, se produce hFSH recombinante (rhFSH) a partir de lneas celulares
estables, obtenidas mediante transfeccin de clulas CHO (del ingls, Chinese Hamster
Ovary) (De Leeuw, 1996). El proceso de purificacin de esta protena recombinante se
realiza mediante cromatografa de inmunoafinidad basada en las interacciones especficas
entre esta hormona y anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-rhFSH (ligando) inmovilizados
en la matriz.
En nuestro laboratorio se han obtenido 3 lneas celulares, a partir de la tecnologa de
hibridomas, productoras de mAbs anti-rhFSH con capacidad de reconocimiento especfico
de la molcula rhFSH. Estos anticuerpos se han evaluado como ligando en cromatografas
de inmunoafinidad obtenindose excelentes resultados (Brgi, 2009).
En general la produccin de mAbs resulta dificultosa, costosa, demanda mucho
tiempo, e implica el empleo de animales de experimentacin o suplementos de origen
animal, los cuales involucran gran cantidad de contaminantes que requieren procesos
adicionales de purificacin para demostrar su ausencia en productos de inters teraputico
para humanos. Por esta razn, una alternativa para salvar los mencionados obstculos, es
la obtencin, mediante ingeniera gentica, de un fragmento de anticuerpo del tipo scFv (del
ingls, single-chain variable fragment), formado por la unin covalente de las regiones
variables de las cadenas pesada (VH) y liviana (VL) (del correspondiente mAb) mediante un
pptido linker que le confiere la flexibilidad necesaria para orientar correctamente ambos
dominios, sin afectar la estabilidad de interaccin del par VH-VL con el correspondiente

ligando (Holliger y Hudson, 2005), y siendo expresado como una nica cadena proteica. De
este modo, los fragmentos scFv poseen menor tamao y pueden ser expresados en clulas
procariotas, lo que abarata los costos y tiempos de produccin. Adems, elimina el empleo
de animales de experimentacin o, bien, de suplementos de origen animal.
OBJETIVO
En funcin de la problemtica planteada, el objetivo general del presente trabajo
consiste en la obtencin de un fragmento de anticuerpo de cadena nica, scFv, a partir de
un hibridoma murino productor de un mAb anti-rhFSH, lo que ofrece grandes ventajas de
produccin y permite optimizar el proceso de purificacin de la hormona recombinante,
producida en el sobrenadante de lneas celulares estables.
METODOLOGA
Construccin de un pool de secuencias VH y VL a partir de ARN mensajero del
hibridoma productor del mAb P1E4, anti-rhFSH.
Mediante el empleo del reactivo comercial TRIzol Reagent (Invitrogen) se extrajo
ARN total a partir del hibridoma productor del mAb P1E4. Luego, por RT (del ingls, reverse
transcription), utilizando los primers antisense kappa18 y gamma1 (Caldas y col. 2000), se
gener el ADN copia correspondiente a los transcriptos VH y VL del mAb anti-rhFSH. El
ADN copia se utiliz como molde en una serie de amplificaciones por PCR (reaccin en
cadena de la polimerasa), cuyos primers sense y antisense constituyen una biblioteca
diseada para amplificar las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y liviana (VL) de
anticuerpos murinos (Coloma y col., 1991; Zhou y col., 1994). La misma est constituida por
11 primers VH 5, 9 primers VL 5, 1 VH 3 (gamma1) y otro VL 3 (kappa18). La
amplificacin por PCR se realiz en 30 ciclos, cada uno de 94 C durante 1 minuto, 48 o 55
C (VH o VL, respectivamente) durante 30 segundos, y 68C durante 1 minuto. Las
secuencias correspondientes a VH y VL fueron purificadas y clonadas en el vector pCR2.1
TOPO (Invitrogen) y se transformaron clulas competentes E. coli Top10. Las respectivas
transformaciones fueron chequeadas mediante colony-PCR empleando los primers
universales T7 y M13R. Los fragmentos obtenidos fueron analizados en geles de agarosa al
2% (p/v) y los clones fueron seleccionados en funcin del tamao deseado. Posteriormente,
se prepar ADN plasmdico de cada uno estos clones seleccionados y se envi a la
compaa Macrogen para su secuenciamiento.
Identificacin de las secuencias VH y VL
A partir del resultado de las reacciones de secuenciacin se realiz un anlisis
bioinformtico. Primero se agruparon las secuencias segn su homologa, utilizando para
ello el programa Vector NTI Advance ContigExpress. Luego se realiz una bsqueda de
secuencias de protenas que presenten similitud con el resultado de la traduccin de la
secuencias nucleotdicas de inters (BLASTX). De este modo, se logr seleccionar aquellas
secuencias que codifican protenas con identidad por regiones VH y VL, segn corresponda.
Finalmente, se analizaron las secuencias aminoacdicas correspondientes y se identificaron
las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), mediante las reglas
propuestas por la base de datos Abysis (www.bioinf.org.uk/abs/).
Construccin y clonado del fragmento de ADN codificante del scFv anti rhFSH.

Una vez definidas las secuencias VH y VL correspondientes al mAb P1E4, se

disearon 6 primers especficos para la construccin del scFv y el clonado del mismo en el
vector pET22b (Novagen). Este vector incorpora en la protena de inters, el pptido seal
pelB, que la direcciona al espacio periplsmico de las clulas, y una etiqueta constituida por
6 residuos de histidina, en el extremo C-terminal de las mismas. Se agregaron sitios de
restriccin en los primers 5 VH y 3 VL, mientras que en los 4 oligos restantes se anexaron
las secuencias correspondientes para permitir el solapamiento de los 3 fragmentos (VH,
linker y VL) mediante la tcnica de PCR-overlapping. La secuencia del linker se obtuvo a
partir del scFv anti-rhIFN-2b generado con anterioridad en nuestro laboratorio.
En un primer paso se amplificaron por PCR las tres secuencias VH, VL y linker.
Posteriormente, se procedi a solapar los fragmentos VH y linker, cuyas secuencias 3 y 5
son complementarias, respectivamente. De esta forma, primero se obtuvo el fragmento
[VH-linker] y luego, repitiendo dicho procedimiento con los primers correspondientes, el
fragmento [VH-linker-VL], el cual constituye el scFv. Para el clonado, se realiz una
digestin con enzimas de restriccin NcoI/HindIII, tanto del fragmento como del vector
pET22b, y se procedi a la ligacin y transformacin de clulas competentes E.coli Top10.
Los clones positivos fueron identificados mediante la amplificacin del fragmento VH-linker
por colony-PCR. Posteriormente, se prepar ADN plasmdico de estos clones y se digiri
con enzimas de restriccin para corroborar la identidad de los mismos.
RESULTADOS
Construccin del pool de secuencias VH-VL
A partir de la amplificacin del ADN copia,
mediante la utilizacin del set de primers
diseados para tal fin, se obtuvieron fragmentos
de ADN de entre 250pb y 500pb (Fig.1).
Mediante el clonado y transformacin de clulas
competentes E. Coli Top10, se construy el pool
de
secuencias
VH-VL
anti-rhFSH.
Se
identificaron ms de 150 clones positivos por
colony-PCR, de los cuales se seleccionaron 64
correspondientes a VH y 29 a VL. Se prepar
ADN plasmdico y se envi el material para su
secuenciamiento.

Fig. 1: Electroforesis en gel de agarosa del

ADN copia amplificado por PCR utilizando el
primer 3 kappa18y los 9 primers VL 5
(lneas 1-9). Lnea M: Marcador de tamao
molecular

Identificacin de las secuencias VH y VL

A partir del anlisis bioinformtico de las secuencias obtenidas, se logr, por un lado,
descartar varios clones cuyas secuencias resultaron homlogas a otras protenas, y por el
otro, agrupar aquellas con elevado grado de homologa a secuencias de inmunoglobulinas
murinas, en 10 grupos: 5 grupos VH y 5 grupos VL. Mediante la traduccin y el alineamiento
de estos grupos se definieron 2 secuencias consenso VH (VH016 y VH058) y dos VL
(VL088 y VL101). Sin embargo, slo se logr la identificacin de los 3 CDRs en las
secuencias VH016, VH058 y VL088. La comparacin de las 4 secuencias con las
secuencias VH y VL publicadas por Ding et al. en su artculo del 2010, permiti identificar la
secuencia VL101 como un transcripto kappa aberrante derivado del propio hibridoma y la
secuencia VH058 como otra secuencia aberrante con un 99% de homologa a transcriptos

VH no funcionales. Mientras que, por otro lado, posibilit corroborar la identidad de las
secuencias VH016 y VL088.
Construccin del scFv y clonado en el vector pET22b
Se construyeron 4 fragmentos scFv anti-rhFSH, producto de la combinatoria de las 4
secuencias identificadas anteriormente (Fig.2): VH016-linker-VL088, VH016-linker-VL101,
VH058-linker-088 Y VH058-linker-VL101: con el fin de comparar su capacidad de unin a la
hormona y, finalmente, descartar las dos secuencias aberrantes. Estos fragmentos fueron
clonados en los sitios
NcoI/HindIII
del vector
pET22b. Luego de la
transformacin de clulas
E.coli Top10, los clones
positivos fueron digeridos
con
las
enzimas
de
restriccin
BglII/XhoI, Fig. 2: Electroforesis en gel de agarosa de los productos finales del
liberando un fragmento de solapamiento de los fragmentos VH, VL y linker para la construccin
aproximadamente 940pb. de los 4 scFv anti-rhFSH correspondientes. Lnea M: Marcador de
tamaomolecular.

CONCLUSIONES
En el transcurso de este trabajo se logr aislar las secuencias codificantes de las
regiones VH y VL del mAb P1E4 anti-rhFSH. Adems, se consigui diferenciar secuencias
aberrantes correspondientes a cada una de estas regiones. Se construyeron fragmentos de
anticuerpo scFv con las secuencias aisladas mediante la tcnica de PCR-overlapping.
Como perspectiva de trabajo, estos fragmentos scFv sern expresados en
citoplasma y en espacio periplsmico de las clulas E. coli SHuffle T7 pLys (NEB) y BL21
Rosetta (Novagen), respectivamente. Sern evaluados por su capacidad de reconocer
rhFSH, mediante la tcnica de ELISA especfico indirecto. Posteriormente sern purificados,
mediante cromatografa de afinidad a iones metlicos (IMAC), para ser utilizados como
ligando en una cromatografa de inmunoafinidad para la purificacin de dicha hormona.
BIBLIOGRAFA
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