HPLC

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE QUMICA
DESARROLLO DE UN MTODO DE CUANTIFICACIN DE

AZITROMICINA EN FORMULACIN FARMACUTICA POR
CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
Trabajo Especial De Grado
Valencia, Julio de 2016

AUTOR: Luis E. Lpez P.

TUTOR ACADMICO: Dra. Ygmar Jimnez
TUTOR EMPRESARIAL: Dr. Jos Prez
Valencia, Julio de 2016
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTOS
Julio, 2016

RESUMEN
Se desarroll y se valid un mtodo analtico para la cuantificacin de

azitromicina en suspensin por cromatografa lquida de alta eficiencia (fase
reversa) en una empresa farmacutica. La fase mvil consiste en una mezcla de
acetonitrilo, buffer de fosfato 30mM (pH 6,7) y metanol en proporcin (10:15:75
v/v); la deteccin se realiz a una longitud de onda de 210 nm emplendose un
detector de fotodiodos en serie. En cuanto al parmetro de validacin linealidad,
se obtuvo en el intervalo 70-130% (con respecto a la concentracin declarada,
200mg/5mL) un coeficiente de correlacin de 0,997 y un estadstico de DurbinWatson de 0,8595 (mayor que p=0,05), con esto se determina que el mtodo es
lineal. Se verific la robustez del mtodo mediante la aplicacin de un diseo de
experimentos factorial 23 (variables estudiadas: pH de la fase mvil, volumen de
inyeccin y longitud de onda). Tambin se evalo la exactitud (100,3 % de
recuperacin), precisin y reproducibilidad (coeficientes de variacin de 2,6 y
2,1 % respectivamente). Se concluy que el mtodo desarrollado satisface los
requerimientos establecidos en el protocolo interno de validacin de la empresa,
siendo ste idneo para la cuantificacin de azitromicina.

Julio, 2016

ABSTRACT
It was developed and an analytical method for the quantification of

azithromycin suspension was validated liquid chromatography high efficiency
(reverse phase) in a pharmaceutical company. The mobile phase consists of a
mixture of acetonitrile, 30 mM phosphate buffer (pH 6,7) and methanol in a ratio
(10:15:75 v / v); detection was at a wavelength of 210 nm being used photodiode
array detector with. As to parameter validation linearity was obtained in the
range 70-130% (relative to the reported concentration, 200mg / 5mL) a
correlation coefficient 0.997 and Durbin-Watson statistic of 0.8595 (greater than
p = 0.05), with this it is determined that the method is linear. The robustness of
the method was verified by applying a factorial design experiments 23 (studied
variables: pH of the mobile phase and injection volume wavelength). Also was
evaluated the accuracy (100.3% recovery), and reproducibility (coefficients of
variation of 2.6% and 2.1% respectively). It was concluded that the developed
method satisfies the requirements established in the internal protocol validation
of the company, it is suitable for quantification of azithromycin.
INDICE GENERAL
Dedicatoriaiii
Agradecimientos...iv
Resumen....v
uCaplot1. EL PROBLEMA..............................................................................................................
1.3. Planteamiento y justificacin del problema............................................................
1.4. Objetivo general......................................................................................................
1.4.1. Objetivos especficos.......................................................................................
1.4. Factibilidad y alcance.............................................................................................
1.5. Antecedentes...........................................................................................................
1.5.1. L. Miguel, C. Barbas (2003)............................................................................
1.5.2. Fuad Al-Rimawi y Maher Kharoaf (2010).......................................................
1.5.3. Gryssette Daher (2013)....................................................................................
uCaplot2. Marco terico...................................................................................................................
2.3. Cromatografa lquida de alta eficiencia.................................................................
2.4. Validacin de un mtodo cromatogrfico...............................................................
2.5. Parmetros necesarios para una validacin............................................................
2.5.1. Especificidad....................................................................................................
2.5.2. Linealidad y rango de trabajo.........................................................................
2.5.3. Exactitud.........................................................................................................
2.5.4. Precisin.........................................................................................................
2.5.5. Robustez.........................................................................................................
2.5.6. Estabilidad de soluciones...............................................................................
2.6. Parmetros necesarios para el estudio de la adecuabilidad...................................
2.6.1. Nmero de platos tericos (N).......................................................................

2.6.2. Resolucin
Rs ...........................................................................................
2.6.3. Factor de asimetra
As ..............................................................................
2.6.4. Factor de capacidad (k)..................................................................................

2.7. Suspensin de azitromicina 200mg/5mL..............................................................
uCaplot3. Marco metodolgico.......................................................................................................
3.3. Esquema general de la metodologa.....................................................................
3.4. Equipos y reactivos...............................................................................................
3.4.1. Equipos...........................................................................................................
3.4.2. Reactivos........................................................................................................
3.5. Etapa (1): Ajuste del mtodo................................................................................
3.5.1. Condiciones cromatogrficas.........................................................................
3.5.2. Tratamiento de la muestra..............................................................................
3.5.3. Adecuabilidad.................................................................................................
3.6. Etapa (2): Determinacin de los parmetros de validacin..................................
3.6.1. Determinacin de la especificidad.................................................................
3.6.2. Determinacin de la linealidad.......................................................................
3.6.3. Determinacin de la exactitud........................................................................
3.6.4. Determinacin de la precisin........................................................................
3.6.5. Evaluacin de la robustez...............................................................................
uCaplot4. Resultados y discusin...................................................................................................
4.1. Adecuabilidad.......................................................................................................
4.2. Especifididad........................................................................................................
4.3. Linealidad E INTERVALO...................................................................................
4.4. Precisin................................................................................................................
4.5. Estabilidad DE SOLUCIONES............................................................................
4.6. Exactitud...............................................................................................................
4.7. Robustez................................................................................................................
uCaplot5. Conclusiones..................................................................................................................
Recomendaciones............................................................................................................
Apndice..........................................................................................................................
Bibliografa consultada....................................................................................................
INDICE DE TABLAS
Tabla 2.1. Coeficientes de variacin porcentual esperados en funcin a la
concentracin del analito..........................................................................................
Tabla 2.2. Propiedades fsico qumicas de la azitromicina..............................................
Tabla 3.1. Esquema metodolgico del ensayo de especificidad......................................
Tabla 3.2. Esquema metodolgico del ensayo de linealidad...........................................
Tabla 3.3. Esquema metodolgico del ensayo de exactitud, repetibilidad y
estabilidad de soluciones..........................................................................................
Tabla 3.4. Esquema metodolgico del ensayo precisin intermedia..............................
Tabla 3.5. Factores y niveles a emplear en la evaluacin de la robustez.........................
Tabla 4.1. Parmetros cromatogrficos obtenidos para la determinacin de
azitromicina mediante el mtodo propuesto............................................................
Tabla 4.2. Mejores condiciones cromatogrficas obtenidas para la determinacin
de azitromicina mediante cromatografa lquida de alta eficiencia..........................
Tabla 4.3. ngulos de pureza del pico cromatogrfico de azitromicina sometida a
diferentes condiciones de degradacin.....................................................................
azitromicina sometida a diferentes condiciones de degradacin.............................
Tabla 4.5. Estudio de la linealidad del mtodo para la determinacin de
azitromicina mediante cromatografa lquida de alta eficiencia..............................
Tabla 4.6. Repetibilidad y precisin intermedia del mtodo de determinacin de
10
Tabla 4.7. Estudio de la estabilidad de soluciones de azitromicina.................................

Tabla 4.8. Estudio de la exactitud del mtodo para la determinacin de
Tabla 4.9. Concentraciones de azitromicina obtenidas al aplicar el diseo de
experimentos para evaluar la robustez del mtodo..................................................
Tabla A.1. Concentracin relativa de azitromicina obtenida durante el ensayo de
precisin intermedia y repetibilidad.........................................................................
Tabla A.2. Precisin del sistema para cada experimento en el ensayo de robustez,
reas y alturas del pico cromatogrfico....................................................................
Tabla A.3. Porcentaje de recuperacin durante el ensayo de estabilidad de
soluciones.................................................................................................................
Tabla A.4 precisin del sistema en el ensayo de adecuabilidad, reas y alturas del
pico cromatogrfico.................................................................................................
11
INDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Informacin espectral..........................................................................7
Figura 2.2. Comparacin espectral de dos componentes.......................................9
Figura 2.3. Grfico de vectores para dos espectros..............................................10
Figura 2.4. Trompeta de horwitz..........................................................................14
Figura 2.5. Azitromicina......................................................................................19
Figura 2.6. Eritromicina.......................................................................................19
Figura 3.1. Metodologa general..........................................................................21
Figura 3.2. Preparacin de estndar y muestra....................................................23
Figura 4.1. Cromatograma del estndar de trabajo secundario azitromicina.......32
Figura 4.3. Cromatograma de la acetona.............................................................33
Figura 4.4. Cromatograma del diluyente..............................................................34
Figura 4.5. Cromatrograma de la azitromicina luego de ser sometida a
degradacin trmica......................................................................................38
Figura 4.6. Cromatograma del placebo sometido a degradacin cida................39
Figura 4.7. Cromatograma del placebo sometido a degradacin bsica..............39
Figura 4.8. Cromatograma del placebo sometido a degradacin reductiva.........40
Figura 4.9. Cromatograma del placebo sometido a degradacin oxidativa.........40
Figura 4.10. Cromatograma del placebo sometido a degradacin trmica..........41
Figura 4.11. Cromatograma del placebo..............................................................41
Figura 4.12. Cromatograma de la fase mvil.......................................................42
12
Figura 4.13. Grfica del modelo ajustado para la determinacin de azitromicina

por cromatografa lquida de alta eficiencia.................................................44
Figura 4.14. Diagrama de pareto de los efectos...................................................51
Figura A.1. Cromatograma tpico del producto azitromicina 200mg/5ml...........58
13
Captulo 1. EL PROBLEMA
1.3. Planteamiento y justificacin del problema
Laboratorios Elmor S.A. es una empresa qumico farmacutica dedicada
al diseo, manufactura y comercializacin de frmacos dedicados al tratamiento
y prevencin de enfermedades. Entre sus principales productos se encuentran:
tabletas, cpsulas sobres para administracin oral, soluciones inyectables,
jarabes, caramelos, vulos, cremas y supositorios. Laboratorios Elmor S.A.
pertenece a un mercado delicado, y debe garantizar un impacto positivo de sus
productos farmacuticos sobre la salud humana a travs de las Buenas Prcticas
de Manufactura y parmetros de calidad altamente rigurosos.
Entre su amplio catlogo de productos, la empresa ha desarrollado la
suspensin
de azitromicina 200 mg/5 mL un polvo para suspensin oral
indicado en el tratamiento de infecciones de pulmn, amgdalas, odo, piel y

uretra en nios(Azitromicina 200mg/5mL, 2015). Actualmente la estimacin del
principio activo es realizada en el departamento de control de calidad de forma
microbiolgica, es decir, las muestras y estndares son sembrados en placas de
agar y son analizados luego de un lapso de 16 horas. Esto representa un efecto
significativo y negativo en cuanto a costos, tiempo de respuesta y eficiencia
analtica.
Los mtodos de cuantificacin por cromatografa lquida han estado en
constante desarrollo durante los ltimos aos para la determinacin de principios
activos en productos farmacuticos, siendo uno de los ms empleados, sobre
todo cuando se trata de determinaciones en mezclas complejas, debido a que los
componentes de la muestra son separados antes de ser cuantificados. As pues, es
posible y necesario desarrollar un mtodo por cromatografa lquida de alta
eficiencia (HPLC por sus siglas en ingles High Performance Liquid
Cromatography) capaz de cuantificar azitromicina en la suspensin 200 mg/5
mL, evalundose la confiabilidad del mismo mediante ciertos parmetros de

validacin (selectividad, linealidad, exactitud, precisin y robustez); teniendo
como ventaja principal reduccin de costos, menor tiempo de respuesta y mayor
eficiencia en comparacin con el mtodo microbiolgico.
1.4. Objetivo General
Desarrollar un mtodo analtico para el anlisis de azitromicina
suspensin por cromatografa lquida de alta eficiencia en un laboratorio de
control de calidad de una empresa farmacutica.
1.4.1. Objetivos especficos
1. Ajustar las condiciones experimentales del mtodo, estableciendo el
procedimiento de trabajo.
2. Establecer los parmetros analticos de validacin y sus criterios de
aceptabilidad.
3. Validar el mtodo analtico para el anlisis de azitromicina.
4. Evaluar los resultados obtenidos en la validacin del mtodo analtico.
1.4. Factibilidad y alcance
El presente trabajo est
dirigido a determinar los parmetros de
validacin especificados en la Farmacopeia de los Estados Unidos de Amrica

(USP por sus siglas en ingls, United States Pharmacopeia)(Farmacopeia de los
Estados Unidos de Amrica 35, 2011) y en la Conferencia Internacional de
Armonizacin (ICH por sus siglas en ingls, International Conference on
Harmonisation) (INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION,
2005).
Especificidad
Linealidad
Exactitud
Precisin
Robustez
Estabilidad de soluciones
Respecto a la precisin, se determinar nicamente la repetibilidad y la

precisin intermedia (distintos das y distinto analista dentro del mismo
laboratorio), dejando por fuera la reproducibilidad que requiere el apoyo de otros
laboratorios de ensayo con los que no fue posible contar para este trabajo.
La especificidad es otro punto limitado. Segn la USP (Farmacopeia de
los Estados Unidos de Amrica 35, 2011) es necesario determinar la separacin
de principios activos, componentes de la matriz, impurezas y productos de
degradacin, sin embargo, este trabajo se va a limitar a componentes de la matriz
del medicamento y principio activo, dejando de lado los posibles productos de
degradacin e impurezas debido al alto costo que requiere adquirirlos.
Por ltimo, no fue posible contar con un patrn primario del principio
activo y componentes de la matriz, sin embargo se dispona de patrones
secundarios con concentraciones certificadas por cada proveedor.
3
Antecedentes
1.4.2. L. Miguel, C. Barbas (2003)

Desarrollaron y validaron un mtodo por cromatografa lquida de alta
eficiencia para el anlisis de impurezas y activo en azitromicina tabletas. Para
esta tcnica emplearon un detector UV a una longitud de onda de 210 nm, una
columna Phenomenex Synergi MAX-RP de 250 mm con temperatura de 50 C,
un gradiente de elucin lineal compuesto por un modificador orgnico y buffer
de fosfato de pH 7,0. El pH empleado por estos autores es el que se ajust
durante la preparacin del buffer de fosfato, el cual a su vez formar parte de la
fase mvil y el diluyente.
1.4.3. Fuad Al-Rimawi y Maher Kharoaf (2010)
Desarrollaron y validaron (segn las pautas de la ICH) un mtodo por
cromatografa lquida de alta eficiencia (en fase reversa) para el anlisis de
azitromicina en materia prima, cpsulas y suspensin. Para sta tcnica
emplearon un detector UV a una longitud de onda de 210 nm, una columna

Purospher STAR RP 18 250 mm con temperatura de 50 C, un flujo de elucin de
2 mL/min y, una fase mvil de composicin constante (elucin isocrtica) 20:80
en buffer de fosfato y metanol respectivamente. Los parmetros cromatogrficos
empleados para este trabajo son los que se utilizaron, como punto de partida,
para el desarrollo del mtodo y posterior validacin.
1.4.4. Gryssette Daher (2013)
Desarroll y valid un mtodo para el anlisis de ibuprofeno tabletas por
cromatografa lquida de ultra desempeo en un laboratorio de control de calidad
de una empresa farmacutica. El esquema general de la metodologa utilizada
por este autor (contemplada en un protocolo interno de validacin de la empresa)
es la que se aplic para el desarrollo y validacin del mtodo analtico.
Captulo 2. MARCO TERICO

2.3.
Cromatografa lquida de alta eficiencia.

La cromatografa de lquidos de alta eficiencia ( HPLC por sus siglas en
ingles, High Performance Liquid Cromatography) es una tcnica analtica

empleada en la separacin, identificacin y cuantificacin de compuestos
especficos en mezclas complejas. sta, ha sido empleada en laboratorios en todo
el mundo en los ltimos 30 aos. Uno de los principales impulsores del
crecimiento de esta tcnica ha sido la evolucin de los materiales de empaque
usados para realizar la separacin.
El principio de esta evolucin se ve gobernado por la ecuacin de Van
Deemter, que es una frmula emprica que describe la relacin entre la velocidad
lineal (tasa de flujo) y la altura de platos (HETP o eficiencia de la columna).
Segn esta ecuacin el tamao de partculas es una de las variables ms
importantes. La curva de Van Deemter puede ser usada para investigar el
desempeo cromatogrfico (Allanson, Biddlecombe, Jones, & Pleasance, 1998)
2.4. Validacin de un Mtodo Cromatogrfico
La USP (USP, 2011) define la validacin de un procedimiento analtico
como el proceso que establece, mediante estudios de laboratorio, que las
caractersticas de desempeo del procedimiento cumplen los requisitos para las
aplicaciones analticas previstas.
En general, se establece que el laboratorio debe validar:
1. Mtodos no normalizados: corresponden a mtodos desarrollados por
el laboratorio o mtodos nuevos (ejemplo: publicado en revista
cientfica), o bien, a mtodos que tradicionalmente se han utilizado en
el laboratorio pero que no estn normalizados.
2. Mtodo normalizado con una modificacin significativa.
1.1. Parmetros necesarios para una validacin

2.4.1. Especificidad
Es la capacidad de evaluar inequvocamente el analito en presencia de
componentes que puede esperarse estn presentes. Normalmente este podra
incluir impurezas, sustancias de degradacin, entre otros. La especificidad
designa muchas veces el grado de afectacin de los resultados del anlisis de
muestras con adicin de impurezas, productos de degradacin, sustancias
qumicas afines o componentes placebo en comparacin con los resultados
analticos obtenidos en muestras sin sustancias agregadas.
La especificidad puede considerarse con respecto a:
1. Mtodos Cualitativos
Habilidad de seleccionar o distinguir entre dos sustancias de estructura
qumica similar o relacionada.
2. Mtodos cuantitativos
Impurezas disponibles: el mtodo debe demostrar que la respuesta debida
al frmaco no es afectada por la presencia de otros componentes (impurezas), y
que el tiempo de retencin correspondiente al frmaco con impurezas
disponibles, debe corresponder con el tiempo de retencin del frmaco sin
impurezas. El pico es considerado puro si el ngulo de pureza es menor al
umbral de pureza, esto es indicativo que no hay diferencia significativa entre los
espectros detectados en la punta del pico con la del espectro de la base del pico.
Para esto se enriquece el producto con cantidades apropiadas de impurezas
comercialmente disponibles y se evala la recuperacin del frmaco junto a su
pureza espectral. (Van Deemter, Zuiderweg, & Klinkenberg, 1956)
Impurezas no disponibles: el mtodo debe ser capaz de presentar
respuesta selectiva para el frmaco en presencia de cada una de las impurezas
generadas durante el proceso de degradacin, mediante la comparacin a la

muestra en estado basal. Adems, el tiempo de retencin correspondiente al
analito en las soluciones sometidas a degradacin, debe corresponder con el
tiempo de retencin debido al analito presente en las soluciones sin degradar.
Las muestras deben ser expuestas a condiciones de estrs: luz UV,
temperatura, humedad, oxidacin e hidrlisis bsica y cida. Se debe demostrar
igualmente la pureza espectral a travs del umbral de pureza y el ngulo de
pureza (Van Deemter, Zuiderweg, & Klinkenberg, 1956)
1.3.1.1. Anlisis espectral
El anlisis espectral permite procesar datos espectrales adquiridos a partir
del detector de fotodiodos o del detector de fluorescencia. El anlisis espectral
aade una tercera dimensin a los datos analticos cuando se utiliza junto con
datos cromatogrficos, ver Figura 2.1
(Familiarizacin con el mdulo de
espectros , 2013)
Figura 2.1. Informacin espectral. Adaptado de Familiarizacin con el modulo de

espectros, p.8, por Agilent Technologies. 2013, Waldbronn: Copyright Agilent Technologies,
Inc. 1994-2012, 2013.
El detector de diodos permite adquirir espectros continuamente; debido a

que adquiere todas las longitudes de onda simultneamente, y a su vez no existe
prdida de sensibilidad durante la adquisicin de espectros (Familiarizacin con

el mdulo de espectros , 2013)
2.4.1.1. La comparacin de espectros de absorbancia
Como se mencion anteriormente entre las principales ventajas que ofrece el
detector Waters HPLC ePda, se encuentra la comparacin con la biblioteca o
base de datos del sistema y la evaluacin de la pureza de los picos para obtener
una mayor seguridad en la identificacin de los compuestos. Esto permite
realizar un anlisis espectral ms detallado. En este sentido cuando se
mide en condiciones de disolvente y pH especficos, la forma de un espectro
de absorbancia caracteriza los compuestos. La variacin de absorbancia en el
rango de UV/Visible que ocurre a diferentes longitudes de onda produce una
forma espectral nica. (Acquity UPLC Photodiode Array el Detector, 2009)
El sistema HPLC/PDA realiza la comparacin de espectros a travs de la
representacin de dichos espectros como vectores, empleando como herramienta
un algoritmo de contraste espectral, utilizndolos para cuantificar las diferencias
en las formas de los espectros, convirtiendo los espectros de lnea base
corregidos a vectores y luego compara estos ltimos. (Acquity UPLC Photodiode
Array el Detector, 2009)
Para la obtencin de estos vectores, el algoritmo de contraste espectral,
determina la relacin de absorbancia de los compuestos (sus espectros) a
comparar, a mltiples longitudes de onda a partir de un vector en un espacio
vectorial de dimensin n, donde n es el nmero de longitudes de onda del
espectro. Dichos vectores espectrales se comparan matemticamente para
calcular el ngulo de contraste espectral entre los mismos. (Acquity UPLC
Photodiode Array el Detector, 2009)
Los
vectores
espectrales
tienen
Photodiode Array el Detector, 2009):
dos
propiedades(Acquity
UPLC
1. Longitud: proporcional a la concentracin de analito.

2. Direccin: determinada por la absorbancia relativa de la sustancia
analizada en todas las longitudes de onda (su espectro de absorcin). La
direccin es independiente de la concentracin para los picos que tienen
menos de 1,0 AU en toda la gama de longitud de onda recogido.
El vector de direccin contribuye a la identificacin de un compuesto,
ya que la direccin es una funcin del espectro de absorbancia de los
compuestos (Acquity UPLC Photodiode Array el Detector, 2009). Para entender
el principio vector, considere dos vectores, en la Figura 2.3, que se basan en los
espectros representados en la Figura 2.2. Esta figura muestra los espectros de
absorbancia para dos componentes, A y B. La relacin de la absorbancia
a 245 nm y a la de 257 nm es de aproximadamente 2,2 para el compuesto A
y 0,7 para el compuesto B. Observe que esta comparacin de una simple
relacin
de absorbancia de un par de longitud de onda ofrece poca
informacin acerca de un compuesto. Para ms informacin, se deben

comparar las relaciones de mltiples pares de longitud de onda (Acquity UPLC
Photodiode Array el Detector, 2009)
Figura 2.2. Comparacin espectral de dos componentes. Adaptado de Acquity UPLC

Photodiode Array e Detector, p.76, por Waters. Copyright Waters Corporation 2007-2009.
Figura 2.3. Grfico de vectores para dos espectros. Adaptado de Acquity UPLC Photodiode
Array e Detector, p.78, por Waters. Copyright Waters Corporation 2007-2009.
En la Figura 2.3, los ejes reflejan las unidades de absorbancia de las dos
longitudes de onda utilizadas para calcular la relacin de absorbancia de la figura
anterior. La cabeza del vector para el compuesto A se encuentra en la
interseccin de los valores de absorbancia (para el compuesto A), en las dos
longitudes de onda representadas por cada eje. El vector restante se deriva de
manera similar a partir del espectro de compuesto B (Acquity UPLC Photodiode
Array el Detector, 2009)
Los puntos del vector del compuesto B estn en una direccin diferente
que la del compuesto A. Expresado por el ngulo de contraste espectral, esta
diferencia refleja la diferencia entre los espectros.
Un ngulo de contraste espectral puede variar de 0 a 90 . Un ngulo de
contraste espectral acercndose 0 indica poca diferencia de forma entre los
espectros de comparacin. La coincidencia de un espectro a si mismo produce un
ngulo de contraste espectral de exactamente 0 . El ngulo de contraste
espectral mximo, 90 , indica que los dos espectros no se superponen en
cualquier longitud de onda. (Acquity UPLC Photodiode Array el Detector, 2009)
10
2.4.2. Linealidad y rango de trabajo

Caractersticas de un mtodo de anlisis que dentro de determinado rango
posibilita obtener, directamente o a travs de una conversin matemtica
exactamente definida, resultados que estn en relacin proporcional a la
concentracin de la sustancia de anlisis contenida en la muestra. Es la
correlacin entre el contenido del analito y la respuesta que se produce en el
sistema de deteccin (Farmacopeia de los Estados Unidos de Amrica 35, 2011).
Se puede determinar el rango lineal mediante un grfico de concentracin
versus respuesta, conocido como funcin de respuesta. Se recomienda abarcar
valores cercanos a cero y valores superiores al lmite mximo permitido o al
valor de inters. Luego de realizar el grfico se puede observar el
comportamiento de la curva y establecer el rango lineal, y con ste, la curva de
calibracin (Concentracin versus Respuesta). Evalundose los estimadores de
regresin lineal (pendiente, punto de corte y coeficiente de correlacin)
Se puede realizar una evaluacin de la curva de calibracin global
(construida con ms de una curva de calibracin de las mismas caractersticas)
mediante un estadstico t-Student como un mejor indicador del modelo lineal
(Duffau, y otros, 2010)
2.4.3. Exactitud
La Exactitud de un mtodo de anlisis o de una medicin, indica el grado
de conformidad entre el valor verdadero convencional o valor de referencia
aceptado y el valor obtenido en el anlisis (Salazar, 1999)
Un diseo habitual emplea, al menos 3 concentraciones del analito,
preparadas por triplicado, comprendidas dentro del rango de linealidad del
sistema: en general se estudian concentraciones correspondientes al 50-80, 100 y
120-150 % del valor aceptado. El anlisis se realiza mediante un estadstico tStudent segn la Ecuacin 2.1 (Salazar, 1999)
11
t ob=
[ 100 R ]
DSR n
[Ec 2.1]
Siendo
la recuperacin promedio porcentual y
desviacin estndar relativa. Los valores de
t ob
DSR
la
se comparan con los tabulados
para el intervalo de confianza requerido con n-1 grados de libertad. Si

t ob<t tabulado
no existe diferencia significativa con el 100 % de recuperacin.
Resulta conveniente graficar masa hallada versus masa agregada,

rectificando por el mtodo de mnimos cuadrados. La pendiente deber ser
unitaria y la ordenada al origen deber pasar por cero (estimando los parmetros
de regresin, en general con p=0.05) (Quattorcchi, Andrizzi, & Laba, 1992)
2.4.4. Precisin
La precisin de un mtodo de anlisis expresa el grado de concordancia
de los resultados analticos individuales cuando el procedimiento se aplica
repetidamente en varios anlisis de una muestra homognea. La precisin vara
segn la concentracin de la sustancia a cuantificar (ver Tabla 2.1) (Arvesa & O,
2001). La precisin comprende repetibilidad y precisin intermedia del mtodo
analtico bajo las condiciones normales de operacin.
2.4.4.1. Repetibilidad
Es la precisin de un mtodo analtico expresada como la concordancia
obtenida entre determinaciones independientes realizadas bajo las mismas
condiciones (analista, tiempo, equipo y laboratorio). Es la precisin dentro de un
laboratorio, es decir, la precisin que un analista alcanza trabajando en un mismo
equipo durante un intervalo de tiempo corto. Se determina mediante el anlisis
12
mltiple (n6) de una muestra homognea y el clculo de la desviacin estndar,

que es la medida para la precisin del mtodo (Arvesa & O, 2001)
2.4.4.2. Precisin intermedia
Expresa la concordancia obtenida de las siguientes variaciones dentro de
un mismo laboratorio: diferentes das, diferentes analistas, diferentes equipos,
entre otros.
Tabla 2.1. Coeficientes de variacin porcentual esperados en funcin a la
concentracin del analito
%
100
10
1
0,1
0,01
0,001
0,0001
0,00001
0,000001
0,0000001
Analito
Fraccin
1
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
Otra Unid.
100%
10%
1%
0,1%
100ppm
10ppm
1ppm
100ppb
10ppb
1ppb
%CV
%CV
Repetibilidad
1,3
1,9
2,7
3,7
5,3
7,3
11
15
21
30
Reproducibilidad
2
3
4
6
8
11
16
22
32
45
Extrados de Guidelines for Standard Method Performance Requirements (Appendix F:

Guidelines for Standard Method, 2012)
Los valores de la Tabla 2.1 provienen de los estudios realizados por W.

Horwitz, a travs de la ecuacin obtenida a partir de un estudio estadstico. En
este, Horwitz, despus de reunir una serie de datos estadsticos provenientes de
estudios inter-laboratorios, observ que el coeficiente de variacin de los valores
medios dados por los diferentes laboratorios aumentaban a medida que disminua
la concentracin del analito, comportndose como se muestra la Figura 2.4,
conocida como trompeta de Horwitz (Thompson, 2004)
13
Figura 2.4. Trompeta de Horwitz (extrado de Validacin de mtodos y determinacin de

incertidumbre del instituto de Salud Pblica de Chile(Thompson, 2004))
La ecuacin de Horwitz se define como sigue (Thompson, 2004):

%C V H =2
[1 ( 0.5 logC ) ]
[Ec 2.2]
Convenientemente, el valor de C es equivalente a la concentracin del
analito cuando es expresado en g/mL. La constante de Horwitz se utiliza para
determinar criterios de aceptacin de precisin, donde se puede establecer una
reproducibilidad aceptable cuando el %CV es menor al %CVH y una repetibilidad
aceptable cuando el %CV calculado es menor a una fraccin del %CVH segn la
AOAC International(Appendix F: Guidelines for Standard Method, 2012)
2.4.5. Robustez
La robustez de un mtodo de anlisis es la medida que caracteriza su
capacidad de permanecer inafectado por pequeas variaciones en los parmetros
(condiciones de operacin).
14
Con el objetivo de evaluar la robustez del mtodo, esto es el efecto

individual y de interaccin de varios factores (pH de la fase mvil, volumen de
inyeccin, longitud de onda, entre otros) sobre la variable respuesta (rea y altura
del pico cromatogrfico), se puede aplicar un diseo de experimentos con arreglo
factorial
2k (k factores, todos con dos niveles de prueba). Esta herramienta
permite obtener una matriz de diseo de puntos experimentales o tratamientos

considerando todas las combinaciones posibles, obtenindose resultados que
permiten identificar efectos estadsticamente significativos (Pulido & Salazar,
2008)
2.4.6.
Estabilidad de soluciones
La validacin debe contener informacin sobre la estabilidad de los
estndares y muestras preparadas. Este es un parmetro importante a considerar

para definir el plan de trabajo en tiempos de anlisis extendido, por ejemplo:
cuando quedan el fin de semana muestras corriendo en un muestreador
automtico, las pruebas la estabilidad de las preparaciones debe ser confirmada
para que este tiempo de trabajo sea ejecutado con la seguridad que los resultados
sean reproducibles en el tiempo transcurrido. Lo mismo ocurre para las
inyecciones en el cromatografo, se deben establecer las condiciones de
almacenamiento de las preparaciones (Jerkovitch, Mellors, & Jorgenson, 2003)
En general, la medicin se hace comparando patrones recin preparados
de concentracin conocida con patrones similares almacenados durante
diferentes perodos de tiempo y en condiciones distintas. Para ello se plantean las
siguientes hiptesis:
H o : x = y (hiptesis nula)
H a : x y ( hiptesis alternativa)
15
Si cada proceso sigue una distribucin normal y son independientes entre

ellos, el estadstico de prueba adecuado para probar la hiptesis de igualdad de
medias ( x = y ) esta dado por:
t 0=
Y
X
1 1
S p
+
nx n y
[Ec 2.3]
Donde
X y Y
son los promedios de los ensayos X y Y. Por su parte,
nx y ny
son los
puntos experimentales en cada ensayo.
El cual sigue una distribucin T de Student con

S p2
libertad, donde
n x + n y 2
grados de
es un estimador de la varianza muestral comn,
suponiendo que dichas varianzas desconocidas sean iguales, y se calcula como:

2
Sp =
( n x 1 ) S 2x + ( n y 1 ) S 2y
n x +n y 2
[Ec 2.4]
2
Con S x
y Sy
la hiptesis nula si
las varianzas de los datos de cada proceso. Se rechaza
|t 0|>t /2
donde
de la distribucin T de Student con
t /2
es el punto /2 de la cola derecha
n x + n y 2
Salazar, 2008)
16
grados de libertad (Pulido &
2.5. Parmetros necesarios para el estudio de la adecuabilidad

Segn protocolo de validacin CCQ-VA-025 ao 2015 la adecuabilidad
es la medida que expresa el equilibrio que existe entre las condiciones
cromatogrficas y del entorno que permiten la cuantificacin del analito, y
garantiza que no exista una variacin significativa con el factor de respuesta,
rea y altura de los picos del cromatograma. A continuacin se describen
brevemente los parmetros necesarios para el estudio de la adecuabilidad:
2.5.1. Nmero de platos tericos (N)
Es una medida de la eficiencia de la columna. Para un pico Gaussiano, es
calculada de la siguiente manera (Farmacopeia de los Estados Unidos de
Amrica 35, 2011)
tr
W
( )
N=16
[Ec 2.5]
Donde
tr
es el tiempo de retencin del analito, y
es el ancho de
la base del pico obtenida extrapolando las lneas relativamente rectas del pico
hasta la lnea base. El valor de
depende de la naturaleza de la molcula as
como las condiciones de operacin, como el flujo, y temperatura de la fase

mvil, la calidad del empaque de la fase estacionaria, la uniformidad del
empaque a travs de la columna.
R
2.5.2. Resolucin ( s )
La resolucin es la separacin de dos componentes en una mezcla,
calculada como sigue (Farmacopeia de los Estados Unidos de Amrica 35, 2011)
17
Rs =
2( t r 2t r 1 )
( W 1+ W 2 )
[Ec 2.6]
Donde
tr2
componentes,
W1
y
y
t r1
W2
son los tiempos de retencin de los dos

corresponden a los anchos de cada pico obtenidos
mediante la extrapolacin de las lneas relativamente rectas del pico a la lnea

base.
A
2.5.3. Factor de Asimetra ( s )
El factor de asimetra de un pico es calculado como sigue (Farmacopeia
de los Estados Unidos de Amrica 35, 2011)
As=
W 0.05
2f
[Ec 2.7]
Donde
W 0.05
es el ancho del pico al 5% de altura y
es la distancia
desde el mximo del borde delante del pico, la distancia es medida a un 5% por
encima de la altura desde la base del pico.
2.5.4. Factor de capacidad (k)
El factor de capacidad k es un valor prctico que expresa el grado de
interaccin del analito con la columna:
k=
t r t o
to
[Ec 2.8]
18
Donde
tr
es el tiempo de retencin del analito y
to
el tiempo de
retencin de un compuesto poco retenido. Idealmente, los valores de k varan

entre 1 (poca interaccin) y 10 (gran interaccin). Valores superiores a 10
significan que el tiempo de retencin de anlisis es muy largo y probablemente la
resolucin no es adecuada debido a que la difusin molecular provoca
ensanchamiento de bandas (Regnault, 2005)
2.6. Suspensin de azitromicina 200mg/5mL
La suspensin de azitromicina (200 mg/5 mL) es un polvo para
suspensin oral indicado para tratar infecciones de los pulmones, amgdalas,
odo, piel y uretra en nios (Azitromicina 200mg/5mL, 2015), cuyo principio
activo es azitromicina.
La azitromicina es un azlido, una subclase de antibiticos macrlidos, de
administracin oral. La azitromicina (Figura 2.5) es un derivado de la
eritromicina (Figura 2.6), sin embargo, difiere qumicamente de la eritromicina
en un tomo de nitrgeno metil sustituido que es incorporado en el anillo de
lactona. Su frmula molecular es C38H72N2O12, y su peso molecular es 749 g/mol
(Miguel & Barbas, 2003). La azitromicina en su forma dihidratada es un polvo
cristalino blanco con una frmula molecular C38H76N2O14 de peso molecular 785
g/mol (ver Tabla 2.2)
19
Figura 2.5. Azitromicina (Miguel y Barbas, 2003).
Figura 2.6. Eritromicina (Miguel y Barbas, 2003).
Tabla 2.2. Propiedades fsico qumicas de la azitromicina

Caractersticas generales
Polvo cristalino blanquecino de apariencia

uniforme
Nombre comercial
Azitromicina dihidrato
20
Nombre qumico
9-deoxo-9-aza-9-homoeritromicina A
dihidrato
Frmula molecular
C38 H 76 N 2 O14
Masa Molecular
785 g/mol
pKa
8,48
Punto de fusin
125 C
Solubilidad en agua a pH=7,4, 37C
39 mg/mL
(ZITHROMAX, 2014)
21
Captulo 3. MARCO METODOLGICO

3.3. Esquema General de la metodologa
A continuacin, en la Figura 3.1 se presenta un esquema general que
resume la metodologa general separada en dos etapas:
ETAPA (1):
AJUSTE DEL
MTODO
ETAPA (2):
DETERMINACI
N DE
PARMETROS
DE
VALIDACIN
Condiciones
cromatogrficas
Tratamiento de la
muestra
Adecuabilidad
Especificidad
Exactitud, precisin,
linealidad
Robustez
Figura 3.7. Metodologa General

3.4. Equipos y reactivos
3.4.1. Equipos
El principal equipo a utilizar, un HPLC Alliance 2696 Waters, consta de
una bomba cuaternaria marca Waters, un sistema de inyeccin automtica marca
Waters, un horno para columna, una columna X-BRIDGE C-18 de 4,6*250mm y
un tamao de partcula de 5 m y un detector con arreglo de fotodiodos marca
22
Waters 2696. Adicionalmente se utilizar una balanza analtica AND de precisin

0,0001g, un pHmetro ThermoOrion modelo 420A+ y un computador de
escritorio conectado al equipo HPLC mediante el Software Empower (en su
versin nmero dos). Todos estos con la calificacin en vigencia.
3.4.2. Reactivos
Para la preparacin de patrones de validacin, se utilizaran patrones de
pureza certificada del principio activo azitromicina (marca: Shanghai Modern
Pharmaceutical Co; Ltd. Lote: P14098. Concentracin: 97,5%). Adicionalmente,
se emplearn muestras de grado tcnico en la elaboracin de la solucin
PLACEBO (la cual contiene todos los ingredientes de la muestra con excepcin
del principio activo).
Para la aplicacin y evaluacin del mtodo se utilizar agua desionizada
(Conductividad < 1,5S/cm), metanol grado HPLC (Proveedor: Fermont),
fosfato de potasio dibsico y monobsico (Proveedor: Merck).
3.5. ETAPA (1): Ajuste del mtodo
3.5.1. Condiciones cromatogrficas
Se ajustaron las siguientes condiciones cromatogrficas (Fuad & Maher,
2010):
Fase Mvil: Buffer de fosfato (30mM) de pH 6,7 y metanol (20 : 80)

Tipo de elucin: Isocrtica
Deteccin: Detector UV en serie (210 nm)
Flujo: 1,0 mL/min
Columna: Empaque C18 de 250mm
El resto de las condiciones cromatogrficas dependi de la respuesta

obtenida al momento de ajustar el mtodo al producto
23
3.5.2. Tratamiento de la muestra

En la Figura 3.2 se presenta el esquema seguido en la preparacin de los
estndares y de la muestra:
Estndar,
Azitromic
ina
Pesar 50mg y
disolver en 50mL
de fase mvil.
Llevar a
ultrasonido por
5min, filtrar por
micro filtro de
0,45m en un
vial y llevar al
HPLC
Muestra,
suspensin
de
azitromicina
200mg/5mL
Tomar una
alcuota de
2,5mL en 200mL
de fase mvil.
Filtrar el
sobrenadante
por micro filtro
de 0,45m en un
vial y llevar al
HPLC
Agitar durante
30min
mecnicamente
y centrifugar por
20min
Figura 3.8. Preparacin de estndar y muestra.

3.5.3. Adecuabilidad
Se evalu inyectndose por quintuplicado la solucin del patrn
secundario azitromicina.
Criterios de aceptacin segn protocolo de validacin CCQ-VA-025, ao
2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015):
Platos tericos 2000

Desviacin estndar relativa (RSD) 2,0
Factor de asimetra 2,0
24
3.6. ETAPA (2): Determinacin de los parmetros de validacin

3.6.1. Determinacin de la especificidad
Se determin la especificidad del mtodo para el principio activo
empleando la prueba de pureza de pico cromatogrfico con deteccin UV en
serie. Se obtuvo cromatogramas en 3D (absorbancia vs tiempo vs longitud de
onda) de una muestra del patrn PLACEBO CARGADO al 100% y se
determin la pureza del pico de inters. As como tambin la especificidad de
estndares y placebos degradados. En la Tabla 3.1 se muestra en detalle el
esquema metodolgico empleado.
Solucin
Conc del
muestra
activo (%)*
Placebo
0
(0 mg/mL)
Dilucin
2,5mL en 200
mL de fase
mvil
50mg en
Principio
100 (1mg/mL) 50mL de fase
activo
mvil
Placebo
cargado
100
(1mg/mL)
2,5mL en
200mL de
fase mvil
Degradacin
cida
Bsica
Oxidativa
Reductiva
Trmica
Acida
Bsica
Oxidativa
Reductiva
Trmica
No aplica
Criterio de aceptacin**
Angulo de pureza menor

que el lmite de pureza
Angulo de pureza menor que
el lmite de pureza. Adems de
cumplir con lo establecido en
la seccin 3.5.3.
Angulo de pureza menor

que el lmite de pureza
Tabla 3.3. Esquema metodolgico del ensayo de especificidad.

* Concentracin relativa con respecto al valor declarado para el principio activo.
**Criterio de aceptacin segn protocolo de validacin CCQ-VA-025 ao 2015 (Duque, Lara, &
Perez, 2015)
La Resolucin debe ser mayor igual que 1,5
Nota: el lmite de pureza no tiene un valor especfico, el criterio de aceptacin es que este sea
mayor que el ngulo de pureza nicamente
25
3.6.2. Determinacin de la linealidad

Se determin la linealidad del mtodo en el intervalo que va desde 70%
hasta 130% del valor declarado del principio activo. Para esto, se aplic el
mtodo a los siete patrones de estndar preparados en ese rango de
concentraciones. En la Tabla 3.2 se muestra en detalle el esquema metodolgico
empleado.
Tabla 3.4. Esquema metodolgico del ensayo de linealidad.
Soluci
Conc del
activo*
muestra
(%)
70
80
90
Principio
activo
100
110
120
130
Inyeccin
Dilucin
Rplicas
por
rplica
35mg/50mL de
fase mvil
40mg/50mL de
fase mvil
45mg/50mL de
1. Existe una correlacin

lineal significativa
(r20,99)
fase mvil
50mg/50mL de
fase mvil
55mg/50mL de
fase mvil
60mg/50mL de
2. La varianza es
constante para todas las
concentraciones.
3. Distribucin aleatoria
de los
fase mvil
65mg/50mL de
fase mvil
residuos(coeficiente de
Durbin Watson > 0.05)
* Concentracin relativa con respecto al valor declarado para el principio activo

Perez, 2015)
3.6.3. Determinacin de la exactitud

Se determin la concentracin del principio activo aplicando el mtodo
tres veces a patrones PLACEBOS CARGADOS preparados a tres niveles de
concentracin (dos en los extremos de la linealidad y el 100% de la misma), para
26
un total de 9 determinaciones, cada una inyectada por triplicado al equipo HPLC

(Ver Tabla 3.3).
3.6.4. Determinacin de la precisin
Se determin la precisin del mtodo en funcin a dos variables:
3.6.4.1. Repetibilidad
Se determin la repetibilidad del mtodo para el principio activo en
trminos del coeficiente de variacin aplicando el mtodo seis veces a patrones
PLACEBOS CARGADOS a una concentracin del 100% de lo declarado. Se
evalu nuevamente las soluciones en un perodo de 24 y 48 horas para el anlisis
de estabilidad (Ver Tabla 3.3).
3.6.4.2. Precisin intermedia
Se determin la precisin intermedia del mtodo para el principio activo
dentro del laboratorio en trminos del coeficiente de variacin aplicando el
mtodo seis veces a patrones PLACEBOS CARGADOS a una concentracin
del 100% de lo declarado, por analistas, das y equipos distintos. En la Tabla 3.4
se muestra en detalle el esquema metodolgico empleado.
27
Tabla 3.5. Esquema metodolgico del ensayo de exactitud, repetibilidad y

estabilidad de soluciones.
Parmetro
Exactitud
Repetibilidad
Solucin
muestra
Placebo
cargado
Placebo
Estabilidad de
cargado
Placebo
soluciones (24 h)
Estabilidad de
cargado
Placebo
soluciones (48 h)
cargado
Con
c
Rplicas
(%)*
Inyeccin
Criterio de
Prueba
por rplica
aceptacin**
estadstica
70
% recobro
100
130
3
3
1
1
(98,0-102,0)%
100
CV2,0%
100
100
t-Student
CV2,0%
Prueba F y
t-Student
%D 2,0% con
respecto al
t-Student
%R

Perez, 2015)
%D: Porcentaje de diferencia con respecto al porcentaje de recuperacin promedio
obtenido en el ensayo de repetibilidad
CV: Coeficiente de variacin
28
( %R)
Tabla 3.6. Esquema metodolgico del ensayo precisin intermedia.

Analista
Solucin
Conc
Rplica
Criterio de
Prueba
(Equipo)
A
muestra
Placebo
(%)*
(inyeccin)
estadstica
(HPLC 3)
B
cargado
Placebo
100
3 (1)
aceptacin**
%D 3,0% con
(HPLC 2)
cargado
100
3 (1)
Placebo
(HPLC 1)
cargado
respecto al
%R
obtenido en la
100
3 (1)
t-Student,
Fisher
repetibilidad
CV2,0%

Perez, 2015)
%D: Porcentaje de diferencia con respecto al porcentaje de recuperacin promedio
( %R)
obtenido en el ensayo de repetibilidad

3.6.5. Evaluacin de la robustez

Para lograr la determinacin de la robustez del mtodo analtico se
emple el resultado de las muestras utilizadas en el ensayo de repetibilidad
(considerndolos como resultados iniciales sin modificacin).
Seguidamente, se aplic las modificaciones previamente descritas (pH del
buffer, longitud de onda y volumen de inyeccin) y se continu con su anlisis.
Verificndose a su vez si el mtodo tolera las modificaciones realizadas, en base
a los criterios de aceptacin establecidos.
Los cambios o modificaciones evaluadas y la magnitud de los mismos,
dentro de la robustez del mtodo, fueron realizados a travs de una herramienta
estadstica: el diseo de experimentos. Logrando as, una mejor forma de evaluar
cada modificacin y de obtener resultados con mayor veracidad. En este sentido
29
se emple un diseo de experimento factorial 23 para evaluar la robustez del

mtodo con respecto a los factores y niveles siguientes (ver Tabla 3.5)
Tabla 3.7. Factores y niveles empleados en la evaluacin de la robustez.
Factor
Volumen de
Nivel
Criterio de aceptacin
20
18
pH
6,7
6,8
Longitud de onda
210
212
inyeccin L
System suitability: idoneidad del sistema, precisin del sistema
30
Verificar efectos significativos

en el ANOVA (diagrama de
Pareto) y el system suitability
Captulo 4. RESULTADOS Y DISCUSIN

3
ADECUABILIDAD
La eleccin del tipo de empaque y polaridad de los solventes a emplear
fue determinante para lograr una separacin cromatogrfica eficiente, siendo

funcin de la naturaleza del analito, como se explic en el punto 2.7. Se
demostr experimentalmente que la configuracin qumica descrita, hace de la
azitromicina una molcula soluble en metanol y acetonitrilo, y poco soluble en
agua. Por consiguiente, se emple la modalidad fase reversa (Gua de
seleccin de columnas Agilent Zorbax para HPLC, 2007)
Se observ que la presencia de acetonitrilo en la fase mvil, en baja
proporcin, disminuy la presin del sistema cromatogrfico de 2500 psi a 1800
psi aproximadamente, teniendo un impacto positivo sobre la vida til de la
columna X-Bridge C-18 empleada. Por esta razn, se integr a la fase mvil en
una relacin porcentual del 10 %
La azitromicina es una base dbil, con un valor de pKa igual a 8,48 (ver
Tabla 2.2). En funcin a esto, en cromatografa de fase reversa, el pH de la fase
mvil puede producir cambios en la selectividad y capacidad de retencin de los
compuestos ionizables. Es decir, un pH por encima del valor de pKa produce una
retencin mayor de la azitromicina (Columnas de HPLC Xbridge, 2008). Sin
embargo, a un pH de 6,7 se obtuvo un factor de capacidad de 1,5, siendo este
ideal para el desarrollo de un mtodo cromatogrfico (Quattorcchi, Andrizzi, &
Laba, 1992).
Para el desarrollo del mtodo cromatogrfico se emple un detector con
arreglo de diodos, el cual trabaja en la regin UV (200-400 nm). En este sentido,
teniendo como premisa una longitud de onda de trabajo de 210nm, fue necesario
emplear solventes transparentes a esta para evitar una seal de fondo que
31
impida la medicin del analito eludo. Esta transparencia se evalu por la

longitud de onda de corte
( c ) , es decir, la longitud de onda a la cual la
absorbancia del solvente, en una cubeta de 1 cm de paso ptico, es igual a 1

unidad de absorbancia empleando aire como referencia. El metanol
( c =205 nm)
y el acetonitrilo
( c =190 nm)
tienen una longitud de onda
de corte menor a la de trabajo, son transparentes a esta, y es la razn por la cual

fueron empleados. Del mismo modo, los fosfatos son muy usados en
cromatografa de fase reversa como sales de sodio o potasio debido a su baja
absorcin UV an a longitudes de onda cortas (Quattorcchi, Andrizzi, & Laba,
1992).
En la Figura 4.1 se muestra el cromatograma de un patrn de
azitromicina y en la Tabla 4.1 los parmetros cromatogrficos obtenidos a partir
del cromatograma. En dicha tabla se evidencia que los parmetros
cromatogrficos del pico obtenido cumplen con la exigencia del protocolo de
validacin CCQ-VA-025 ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015).
En cuanto a la asimetra de pico, se ha venido considerando que el
sistema cromatogrfico se comporta como un operador gaussiano, ensanchando
la banda cromatogrfica hacia una distribucin normal segn va pasando a travs
de la columna. Para los picos gaussianos, el factor de asimetra es igual a 1
(ideal), lo cual es infrecuente experimentalmente. En general, no deben aceptarse
picos que presenten un valor mayor a 2, tomado al 5% de altura (Quattorcchi,
Andrizzi, & Laba, 1992). En este sentido, se obtuvo un factor de asimetra de
1,2, apropiado para el desarrollo y posterior validacin del mtodo
cromatogrfico, evitndose as errores de cuantificacin por indefinicin de los
lmites del pico durante el proceso de integracin protocolo de validacin CCQVA-025 ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015)
32
Figura 4.9. Cromatograma del estndar de trabajo secundario Azitromicina. Fase mvil:
metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15 v/v), flujo 1,0ml/min, volumen
de inyeccin 20L. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro interno y
tamao de partcula 5m. Deteccin UV: 210nm
Tabla 4.8. Parmetros Cromatogrficos obtenidos para la determinacin de

azitromicina mediante el mtodo propuesto
Parmetro Cromatogrfico
Resultados
Asimetra
1,2
2,0
Platos Tericos
9580
>2000
Factor de Capacidad
1,5
(1-10)
Coeficiente de variacin
Area: 0,9
Altura: 0,8
2,0%
Perez, 2015)
Por su parte, la eficiencia de una columna cromatogrfica y por lo tanto

su poder separativo se mide en funcin de su nmero de platos tericos
(Quattorcchi, Andrizzi, & Laba, 1992), a mayor nmero de platos mayor es la
eficiencia. Se obtuvo en promedio 9580 platos tericos, cumpliendo con el
criterio de aceptacin establecido por el protocolo de validacin CCQ-VA-025
33
ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015), garantizndose una separacin

cromatogrfica de alta eficiencia.
El factor de capacidad
K'
obtenido fue 1,5 (ver Tabla 4.1), valor
apropiado para una separacin cromatogrfica segn protocolo de validacin

CCQ-VA-025 ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015). La velocidad de
migracin del analito fue descrita en trminos experimentales segn la Ecuacin
2.8; para ello se inyect acetona, la cual tiene en su estructura molecular un
enlace C=O muy polar y pares de electrones no enlazantes en el tomo de
oxgeno, garantizndose una interaccin prcticamente nula con la fase
estacionaria apolar. Por consiguiente, eluye de la columna sin retenerse
significativamente y su deteccin a 265nm (Kenneth, 1981) permiti obtener su
tiempo de elucin
t
( 0) segn el cromatograma de la Figura 4.2, el cual fue
de 3,15 minutos aproximadamente.
Figura 4.10. Cromatograma de la acetona (pico 1). Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer

de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l.
Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro y tamao de partcula 5m.
Deteccin UV: 210nm.
34
El cromatograma de la Figura 4.2 muestra un pico posterior al de la

acetona (pico nmero 1). Vale destacar que la magnitud del mismo es baja en
comparacin con el pico del analito azitromicina. Sin embargo, se investig
inicialmente por inyeccin del diluyente nicamente, obtenindose el
cromatograma de la Figura 4.3. Este cromatograma evidencia el mismo pico
observado en el cromatograma de la Figura 4.2. Razn por la cual se asevera la
posible contaminacin de algunos de los reactivos utilizados (metanol,
acetonitrilo y sales de fosfato) o en su defecto, contaminacin del material
empleado durante la preparacin del diluyente y fase mvil.
Figura 4.11. Cromatograma del diluyente. Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato

30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna XBridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin
UV:210 nm
El coeficiente de variacin referente al rea y altura del pico

cromatogrfico (ver Figura 4.1) fue de 0,8 y 0,9 respectivamente. Estos
resultados satisfacen el criterio de aceptacin establecido en el protocolo de
validacin CCQ-VA-025 ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015). Se concluye
que el sistema cromatogrfico es preciso.
35
La Tabla 4.2 muestra las condiciones empleadas durante la validacin del

mtodo cromatogrfico.
Tabla
4.9.
Mejores
condiciones
cromatogrficas
obtenidas
para
la
determinacin de azitromicina mediante cromatografa lquida de alta

eficiencia.
Longitud de onda
210 nm
Flujo
1,0mL/min
Volumen de inyeccin
20L
Columna
X-Bridge C-18 (250mm de largo, 4,6mm

de dimetro y tamao de partcula 5m)
Tiempo total del cromatograma
10 minutos
36
4.3. ESPECIFIDIDAD
Se degrad el analito y placebo por separados (ver Tabla 3.1 del
Captulo 3) para evaluar la especificidad del mtodo Cromatogrfico;
investigndose la existencia de coelucin de algn producto de degradacin o
excipiente con el analito. Para ello, se realiz el anlisis que integra la
informacin obtenida a diferentes longitudes de onda, adems del tiempo y la
absorbancia. Segn la Tabla 4.3, los resultados indican que el ngulo de pureza
(purity angle) se mantiene inferior al ngulo lmite (angle thershold), lo cual
implica que el pico del analito es espectralmente puro segn protocolo de
validacin CCQ-VA-025, ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015)
Tabla 4.10. ngulos de pureza del pico cromatogrfico de azitromicina sometida
a diferentes condiciones de degradacin
Degradacin
Angulo de pureza
Angulo Lmite (Angle Thershold)
cida
(Purity angle)
1,1
Bsica
0,5
0,7
Reductiva
0,6
0,8
Oxidativa
NC
NC
Trmica
0,4
0,6
1,4
NC: No cuantific
Placebo cargado; Angulo de pureza 1,1, Angulo lmite 1,5
La Tabla 4.4 muestra que el tiempo de retencin se mantuvo

aproximadamente constante; los platos tericos son superiores a 2000 y el factor
de asimetra se mantuvo por debajo de 2,0. Estos resultados satisfacen los
criterios establecidos en la Seccin 3.5.3 del Captulo 3, es decir, la
caracterstica de los picos cromatogrficos es adecuada.
37

azitromicina sometida a diferentes condiciones de degradacin
tr
Degradacin
cida
Bsica
Reductiva
Oxidativa
Trmica
Inyeccin
Factor de
Platos tericos
(min)
7,523
Asimetra
1,1
7044,7
7,464
1,2
7429,2
1
2
7,562
7,417
1,1
1,2
7225,1
8240,4
7,561
1,1
7254,8
7,461
1,2
8014,1
NC
NC
NC
NC
NC
NC
7,191
1,2
9021,4
7,191
1,2
9021,4
NC (no cuantific)
El cromatograma de la Figura 4.4 evidencia un pico, cuyo tiempo de

retencin es 6,46 minutos, de magnitud apreciable. Se determin la resolucin
cromatogrfica (R=2,8) con respecto al pico del analito (
tr
7,191minutos).
Este resultado satisface los criterios establecidos en la Tabla 3.1 (Resolucin

mayor igual que 1,5)
38
Figura 4.12. Cromatrograma de la azitromicina luego de ser sometida a degradacin trmica.

50-60C. Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo
1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de
dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
Por otra parte, los cromatogramas de las Figuras 4.5-4.11 corresponden a

las degradaciones hechas sobre el placebo, placebo sin degradar, fase mvil y
diluyente. En este punto, segn protocolo de validacin CCQ-VA-025 ao 2015
(Duque, Lara, & Perez, 2015), un mtodo es selectivo cuando no existe elucin
de algn compuesto (degradacin, impureza o excipiente) en el tiempo de
retencin promedio del analito a la longitud de onda de trabajo (210nm). De
igual modo, el software del equipo HPLC emplea la informacin adquirida
(tiempo de retencin del estndar de trabajo secundario azitromicina inyectado
en el cromatografo) para identificar el pico del analito en los cromatogramas
obtenidos. Cualquier compuesto distinto al analito, que eluya cerca de este
tiempo de retencin, el programa del equipo lo identificar falsamente como
azitromicina. En este sentido, no se detect picos cromatogrficos en el intervalo
de elucin del analito; lo cual implica una especificidad apropiada del mtodo
cromatogrfico. Se investig la presencia de algn compuesto (degradacin,
impureza o excipiente) cuya interaccin sea mayor con la fase estacionaria, razn
por la cual adems el tiempo de los cromatogramas es de 30 minutos, excepto los
correspondientes a la fase mvil y diluyente.
39
Figura 4.13. Cromatograma del placebo sometido a degradacin cida. 5mL HCl 0.5N. Fase
mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min,
volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro y
tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
Figura 4.14. Cromatograma del placebo sometido a degradacin bsica. 5mL NaOH 0.5N.
Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo
1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de
dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
40
Figura 4.15. Cromatograma del placebo sometido a degradacin reductiva. 5ml HCl
0.5N+5mLNaOH 0.5N+Zinc. Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH
6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18,
250mm de largo, 4,6mm de dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
Figura 4.16. Cromatograma del placebo sometido a degradacin oxidativa. 5mL de perxido
de Hidrgeno. Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v),
flujo 1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm
de dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
41
Figura 4.17. Cromatograma del placebo sometido a degradacin trmica. 50-60C. Fase
mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min,
volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro y
tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
Figura 4.18. Cromatograma del placebo. Fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato

30mM de pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna XBridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin
UV:210 nm
42
Figura 4.19. Cromatograma de la fase mvil: metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de

pH 6,7 (75:10:15v/v), flujo 1,0mL/min, volumen de inyeccin 20l. Columna X-Bridge C-18,
250mm de largo, 4,6mm de dimetro y tamao de partcula 5m. Deteccin UV:210 nm
El cromatograma correspondiente al placebo (Figura 4.10) evidencia que
los excipientes eluyen aproximadamente en el tiempo
t
( 0) de la acetona, es
decir, no son retenidos significativamente por la columna. Adems, el

cromatograma de la fase mvil (Figura 4.11) evidencia una seal poco
significativa, cuya contribucin es debida a la seal de fondo o ruido.
Los resultados obtenidos evidencian que el mtodo es selectivo para el
anlisis del analito (suspensin de azitromicina 200mg/5mL) sometido a
condiciones aceleradas de degradacin segn protocolo de validacin CCQ-VA025 ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015). Adems, el mtodo es capaz de
generar resultados selectivos referidos a indicadores de estabilidad, muestras
sometidas a 30 y 40C y humedad relativa 75%, en intervalos de tiempo
determinados.
Rimawi et al (Fuad & Maher, 2010) determinaron azitromicina mediante
cromatografa lquida de alta eficiencia y evaluaron la especificidad solamente
mediante anlisis de parmetros cromatogrficos, esto implica la no deteccin de
43
coelucin de otro componente distinto al analito. Por su parte, la especificidad

del mtodo cromatogrfico desarrollado se evalu integrando los resultados
obtenidos en la regin UV, evalundose correctamente la especificidad.
En contraparte, Rimawi et al (Fuad & Maher, 2010) no incluyen en ste
parmetro de validacin degradaciones forzadas del placebo, siendo ste mtodo
posiblemente inapropiado para generar resultados indicadores de estabilidad.
Adicionalmente, no incluyen el cromatograma de la fase mvil; lo cual es
indispensable en el anlisis de la absorbancia de fondo (Photodiode Detector:
Peak Purity II; Peak Purity Plot, 1996)
4.4. LINEALIDAD E INTERVALO DE TRABAJO

La linealidad se refiere a la proporcionalidad entre la concentracin de
analito y su respuesta. Esta se llev a cabo a travs de la metodologa mostrada
en la Seccin 3.6.2 del Captulo 3, en donde se realizan tres mediciones de cada
solucin en un mismo da. Los resultados se muestran en la Tabla 4.5
Tabla 4.12. Estudio de la linealidad del mtodo para la determinacin de
azitromicina mediante cromatografa lquida de alta eficiencia.
Coeficiente de correlacin
0,9968
Coeficiente de correlacin
ajustado
99,3283%
Estadstico Durbin-Watson
0,8595
La Tabla 4.5 evidencia que el coeficiente de correlacin obtenido es

mayor que 0,99, indicando una relacin relativamente fuerte entre las variables y,
un coeficiente de correlacin ajustado que explica el 99,3283% de la variabilidad
en la seal. En la Figura 4.12 se presenta la grfica del modelo ajustado para la
determinacin de azitromicina por cromatografa lquida de alta eficiencia, la
cual indica que los puntos experimentales se aproximan muy bien a la tendencia
lineal.
44
El estadstico de Durbin-Watson prueba los residuos para determinar si

hay alguna correlacin significativa basada en el orden en que se presentaron en
su archivo de datos. Dado que el valor-P es mayor o igual que 0,05, no hay
indicacin de una posible correlacin serial con un nivel de confianza del 95,0%
Estos resultados satisfacen los criterios establecidos en la Tabla 3.2 del
Captulo 3. Se concluye que el mtodo desarrollado es lineal en el intervalo de
concentraciones relativas (con respecto al valor declarado) que va desde el 70%
al 130%, la varianza es constante para todas las concentraciones y la distribucin
de los residuos es aleatoria.
Grfica del Modelo Ajustado
Area de pico = 41761.3 + 1.4882E6*Concentracion
(X 100000.)
20
Area de pico
18
16
14
12
10
0.7
0.9
1.1
1.3
1.5
Concentracion
Figura 4.20. Grfica del modelo ajustado para la determinacin de azitromicina por
cromatografa lquida de alta eficiencia.
El valor del coeficiente de correlacin obtenido para el mtodo

desarrollado (0,9968) es comparable con el reportado por Ghari et al (Ghari,
Kobarfard, & Mortazavi, 2013) para el anlisis de azitromicina en materia prima
y formas farmacuticas mediante cromatografa lquida de alta eficiencia con
deteccin UV (0,9976) y mejor que el obtenido por Miguel et al (Miguel &
Barbas, 2003) para la determinacin de azitromicina en tabletas por
cromatografa lquida (0,9960)
45
4.5. PRECISIN
La precisin est relacionada con la dispersin de las medidas alrededor
de su valor medio. Esta se evalu en funcin de la repetibilidad y la precisin
intermedia segn protocolo de validacin CCQ-VA-025, ao 2015 (Duque, Lara,
& Perez, 2015) (ver Seccin 3.4.4.1 del Captulo 3), expresadas a travs del
coeficiente de variacin. Los resultados se muestran en la Tabla 4.6.
Tabla 4.13. Repetibilidad y precisin intermedia del mtodo de determinacin de
Repetibilidad
Precisin intermedia
CRP*
S
CV
102,1
2,60
2,6%
*Concentracin Relativa Promedio
CRP*
100,7
S
2.13
CV
2,1%
S: desviacin estndar
CV: coeficiente de variacin porcentual
Las concentraciones relativas por rplica se encuentran en la Tabla A.1 de los Apndices.
Estos resultados satisfacen los criterios de aceptacin establecidos en la

Tabla 3.3 y 3.4 (CV2,0% y %D 3,0%), cumpliendo con el protocolo de
validacin CCQ-VA-025, ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015)
Adicionalmente, se realiz la prueba F de igualdad de varianzas mediante
la siguiente hiptesis estadstica:
H ,0 : 2x = 2y (hiptesis nula)
H ,A : 2x 2y ( hiptesis alternativa)
El valor de p obtenido ( p=0,676 ) es mayor que 0,05, por lo tanto se
acepta la hiptesis nula
(H ,0 )
con un nivel de significancia del 95%. Esto
46
indica igualdad de varianzas
( 2x = 2y )
entre los resultados obtenidos en el
ensayo de repetibilidad y precisin intermedia.

Adems, se evalu estadsticamente la diferencia entre la concentracin
relativa promedio obtenida en el ensayo de repetibilidad y precisin intermedia a
travs de la siguiente hiptesis estadstica:
H A : x y (hiptesis alternativa)
El valor obtenido de p ( p=0,324 ) es superior a 0,05, razn por la cual
se acepta la hiptesis nula
H
( 0)
con un nivel de significancia del 95%. Se
concluye que no existe diferencia estadsticamente significativa
( x= y )
entre los resultados referentes a repetibilidad y precisin intermedia.

El mtodo es preciso y reproducible cuando ste es aplicado en diferentes
das, por distintos analistas en equipos diferentes. Adems, los resultados
obtenidos obedecen la ley de Horwitz (coeficiente de variacin porcentual
referido a la repetibilidad menor igual que 2,7%, en cuanto a la precisin
intermedia menor igual que 4,0% segn Tabla 2.1); evidencindose para el
mtodo desarrollado y validado que la tendencia de la Trompeta de Horwitz (ver
Figura 2.4) no depende de la naturaleza del analito ni del principio
fsicoqumico que deriva del mtodo de medicin.
47
Los coeficientes de variacin obtenidos para el mtodo desarrollado (CV

igual a 2,6% y 2,1% para repetibilidad y precisin intermedia respectivamente);
son superiores a los reportados por Ghari et al (Ghari, Kobarfard, & Mortazavi,
2013) para el anlisis de azitromicina en materia prima y formas farmacuticas
mediante cromatografa lquida de alta eficiencia con deteccin UV (CV igual a
1,6% para repetibilidad y precisin intermedia); sin embargo, ambos resultados
satisfacen los criterios establecidos en la USP 35 (Farmacopeia de los Estados
Unidos de Amrica 35, 2011). Por otra parte, Al-Rimawi y Kharoaf (Fuad &
Maher, 2010) no evaluaron la reproducibilidad del mtodo que desarrollaron,
perdiendo informacin sobre el efecto de la variacin de equipo, analista y da de
anlisis.
4.6. ESTABILIDAD DE SOLUCIONES
De acuerdo a los parmetros establecidos en el protocolo de validacin
CCQ-VA-025 ao 2015 (Duque, Lara, & Perez, 2015), la estabilidad de
soluciones se estudi en un perodo de dos das (ver seccin 3.4.4.1 del Captulo
3). Los resultados se muestran en la Tabla 4.7
Tabla 4.14. Estudio de la estabilidad de soluciones de azitromicina
24 horas
Concentracin relativa a
48 horas
la declarada
%R
pCalculado
100%
102,1
0,737
%R
pCalculado
100,7
0,799
%R
: Porcentaje de recobro promedio
*
=0.05
Los porcentajes de recuperacin por rplica se encuentran en la Tabla 5.3, ver Anexos
La diferencia entre el porcentaje de recobro promedio entre el ensayo de

repetibilidad y estabilidad a 24 y 48 horas es de 0,0% y 1,4% respectivamente,
48
estos resultados satisfacen los criterios establecidos en la Tabla 3.3 (% de
diferencia 2,0% con respecto al %R obtenido en la repetibilidad)

Se evalu estadsticamente la diferencia entre el
%R
obtenido a 24 y
48 horas con respecto a la concentracin relativa promedio obtenida en el ensayo

de repetibilidad (ver Tabla 4.5) a travs de la siguiente hiptesis estadstica:
H o : x y ( hiptesis alternativa)
Los valores obtenidos de p son superiores a 0,05 (ver Tabla 4.7), razn
por la cual se acepta la hiptesis nula
H
( 0) con un nivel de significancia del
5%. Se concluye que no existe diferencia estadsticamente significativa

( x = y )
entre los resultados referentes a la estabilidad de soluciones y el
ensayo de repetibilidad.
El analito no se degrada bajo las condiciones normales del laboratorio,
temperatura de (223) C y humedad relativa (505) %. Establecindose el
perodo de ejecucin del mtodo de 48 horas.
4.7. EXACTITUD
La exactitud del mtodo, corresponde a la diferencia entre el valor
obtenido (media) y el valor aceptado. Esta se estudi, segn la Seccin 3.6.3 del
Captulo 3, en los extremos de la linealidad y el 100% de la misma, los
resultados se muestran en la Tabla 4.8.
49
Tabla 4.15. Estudio de la exactitud del mtodo para la determinacin de

Concentracin
relativa a la
%R
CV
pCalculado
100,7
0,5
0,125
100,3
1,1
0,721
100,0
0,8
1,000
%R
declarada (terica)
70%
100%
130%
100,7
101,1
100,2
99,3
101,5
100,0
99,2
100,1
100,7
%R : Porcentaje de recobro
=0.05 *
La Tabla 4.8 evidencia que tanto el
%R
como el CV satisfacen los
criterios de aceptacin establecidos en la Tabla 3.3 (% recobro entre 98,0102,0% y CV2,0%). Adems, se evaluaron los resultados a travs de las
siguientes hiptesis estadsticas:
H 0 : X=(hiptesis
nula)
H a : X (hiptesis alternativa)
Los valores de p obtenidos son superiores a 0,05 (ver Tabla 4.8), razn
por la cual se acepta la hiptesis nula
( H 0 ) con un nivel de significancia del
5%. Se concluye que no existe diferencia estadsticamente significativa
50
( X =)
entre los resultados y el valor aceptado, la veracidad del mtodo es
adecuada.
Los porcentajes de recuperacin obtenidos para el mtodo desarrollado
(99,2-101,1%, con un promedio de 100,3%) son comparables a los reportados
por Zubata et al (Zubata, Ceresole, Rosasco, & Pizzorno, 2002) en la
cuantificacin de azitromicina tabletas por cromatografa lquida de alta
eficiencia (98,7-100,0%, con un promedio de 99,4%)
4.8. ROBUSTEZ
La robustez de un mtodo de anlisis es la medida que caracteriza su
capacidad de permanecer inafectado por pequeas variaciones en los parmetros
analticos (condiciones de operacin). El objeto de ste ensayo fue determinar
bajo qu condiciones analticas se puede obtener resultados confiables.
Esta se estudi, segn la Seccin 3.6.5 del Captulo 3, bajo un diseo de
experimentos con arreglo factorial
; varindose la longitud de onda, el pH
del buffer y el volumen de inyeccin. La Tabla 4.9 muestra los experimentos

realizados y los resultados (concentracin relativa).
Tabla 4.16. Concentraciones de azitromicina obtenidas al aplicar el diseo de
experimentos para evaluar la robustez del mtodo.
Longitud de
Factor
Volumen de
onda (nm)
210
inyeccin (L)
20
212
3
4
Experiment
o
CV
Conc.
pH
(%)*
rea
Altura
6,7
100,6
0,3
0,3
20
6,7
101,2
0,1
0,2
210
18
6,8
100,1
0,2
0,3
210
18
6,7
99,5
0,1
0,2
51
212
18
6,7
101,4
0,7
0,8
212
18
6,8
100,3
0,9
0,9
7
8
210
212
20
20
6,8
6,8
99,5
100,3
0,9
0,3
0,8
0,3
*Concentracin relativa
**CV: Coeficiente de variacin de la precisin del sistema.
Las reas y alturas por inyeccin correspondiente a la precisin del sistema se encuentran en la
Tabla 5.2, del apndice A
La Tabla 4.9 evidencia que la concentracin relativa y la precisin del

sistema en cada experimento satisfacen los criterios establecidos en la Tabla 3.5,
cumpliendo con el protocolo de validacin CCQ-VA-025 ao 2015 (Duque,
Lara, & Perez, 2015). Adems, el diagrama de pareto (ver Figura 4.9) muestra
que los efectos individuales y de interaccin no son significativos con un nivel
de significancia del 95%.
Figura 4.21. Diagrama de pareto de los efectos (la respuesta es la Concentracin Relativa;
=0,05; A: Longitud de Onda, B: Volumen de inyeccin; C: pH)
Se concluye que el mtodo no es afectado significativamente por los

cambios realizados en las condiciones analticas (pH del buffer, longitud de onda
52
y volumen de inyeccin) con un nivel de significancia del 5%, de acuerdo a este

estudio el mtodo es robusto.
Se determin el efecto individual y de interaccin de la longitud de
onda (adems del pH de la fase mvil y el volumen de inyeccin) en la
cuantificacin de azitromicina a travs de un diseo de experimentos factorial 2 3,
estudio de mayor impacto y alcance que el realizado por Aradhya et al (Aradhya,
y otros, 2014); quienes evaluaron el efecto individual de la longitud de onda
(adems de la velocidad de flujo) sobre la simetra y tiempo de retencin del pico
cromatogrfico
mediante
de
anlisis
univariado
(no
determinaron
la
concentracin relativa obtenida en este estudio). Por otra parte, Al-Rimawi y

Kharoaf (Fuad & Maher, 2010) no evaluaron la robustez del mtodo que
desarrollaron, perdiendo informacin sobre el efecto de la variacin en las
condiciones analticas (bien sea de forma univariada o mediante un diseo de
experimentos).
53
Captulo 5. CONCLUSIONES
Se desarroll un mtodo lineal, exacto, preciso y robusto por
cromatografa lquida de alta eficiencia para la determinacin de azitromicina en
suspensin
200mg/5mL emplendose
un
equipo
HPLC
con
detector
espectrofotomtrico UV, una de las tcnicas ms comunes en los laboratorios de

control de calidad. El mtodo desarrollado permiti reemplazar el mtodo de
estimacin microbiolgica no validado, lo cual redujo el tiempo de anlisis por
muestra de 16 horas (segn mtodo interno microbiolgico CDC-ME-036 ao
2016) a 10 minutos (tiempo total del cromatograma)
La selectividad ha sido demostrada por la pureza del pico cromatogrfico,
separacin de los compuestos de degradacin y aditivos de formulacin. ste
mtodo es capaz de generar resultados selectivos referidos a indicadores de
estabilidad, muestras sometidas a 30 y 40C y humedad relativa 75%, en
intervalos de tiempo determinados.
.
54
RECOMENDACIONES
Se recomienda el estudio de la estabilidad de las soluciones en un perodo

mayor a dos das para determinar en s cuando el activo comienza a
degradarse.
Se recomienda llevar a cabo un estudio sobre la incertidumbre del mtodo

desarrollado en este trabajo de investigacin.
Con el objeto de consolidar un mtodo nico de anlisis y optimizar el uso

del equipo HPLC, sera interesante determinar la aplicabilidad del principio
qumico del mtodo desarrollado en el anlisis de trazas, materia prima y
tabletas.
55
APNDICE
Tabla A.17. Concentracin relativa de azitromicina obtenida durante el ensayo
de precisin intermedia y repetibilidad
Parmetro
Precisin intermedia
Analista
Conc
(Equipo)
A
(%)*
102,9
(HPLC 3)
B
103,6
99,2
99,5
98,3
100,4
105,7
104,1
102,1
101,2
101,2
98,2
(HPLC 2)
C
(HPLC 1)
Repetibilidad
A
(HPLC 3)
*Concentracin relativa
56
Tabla A.18. Precisin del sistema para cada experimento en el ensayo de

Robustez, reas y alturas del pico Cromatogrfico.
Experimento
1
Inyeccin #
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
rea
1568360
1574537
1565293
1566078
1563634
1569631
1565971
1569756
1565637
1565338
1512870
1509530
1506752
1508530
1505834
1569631
1565971
1569756
1565637
1565338
1635377
1638420
1650902
1657090
1661566
1518527
1511892
1508165
1495692
1486774
1328065
1338576
1347101
1350892
1358928
1568360
1574537
1565293
1566078
1563634
57
Altura
144991
145479
145039
144609
144576
144857
144500
144518
144587
145055
139753
139217
138944
138976
138807
144857
144500
144518
144587
145055
150255
150787
152470
152183
153037
141946
140987
140013
139488
138592
121721
122370
123500
123506
124302
144991
145479
145039
144609
144576
Tabla A.19. Porcentaje de recuperacin durante el ensayo de Estabilidad de

Soluciones
Concentracin relativa
a la declarada (terica)
100%
Area
24 horas
1568360
1574537
1565293
1566078
1563634
48 horas
144991
145479
145039
144609
144576
Tabla A.20. Precisin del sistema en el ensayo de adecuabilidad, reas y alturas

del pico cromatogrfico
Inyeccin #
1
2
3
4
5
rea
1635377
1638420
1650902
1657090
1661566
58
Altura
150255
150787
152470
152183
153037
Figura A.22. Cromatograma tpico del producto azitromicina 200mg/5mL. Fase mvil:
metanol-acetonitrilo-buffer de fosfato 30mM de pH 6,7 (75:10:15 v/v), flujo 1,0ml/min, volumen
de inyeccin 20L. Columna X-Bridge C-18, 250mm de largo, 4,6mm de dimetro interno y
tamao de partcula 5m. Deteccin UV: 210nm
59
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62

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UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGA

DESARROLLO DE UN MTODO DE CUANTIFICACIN DE

Valencia, Julio de 2016

DESARROLLO DE UN MTODO DE CUANTIFICACIN DE

AUTOR: Luis E. Lpez P.

Valencia, Julio de 2016

TUTOR EMPRESARIAL: Dr. Jos Prez

Se desarroll y se valid un mtodo analtico para la cuantificacin de

DESARROLLO DE UN MTODO DE CUANTIFICACIN DE

TUTOR EMPRESARIAL: Dr. Jos Prez

It was developed and an analytical method for the quantification of

2.6.1. Nmero de platos tericos (N).......................................................................

2.6.3. Factor de asimetra

2.6.4. Factor de capacidad (k)..................................................................................

Tabla 4.7. Estudio de la estabilidad de soluciones de azitromicina.................................

Figura 4.13. Grfica del modelo ajustado para la determinacin de azitromicina

de azitromicina 200 mg/5 mL un polvo para suspensin oral

indicado en el tratamiento de infecciones de pulmn, amgdalas, odo, piel y

mL, evalundose la confiabilidad del mismo mediante ciertos parmetros de

dirigido a determinar los parmetros de

validacin especificados en la Farmacopeia de los Estados Unidos de Amrica

Respecto a la precisin, se determinar nicamente la repetibilidad y la

1.4.2. L. Miguel, C. Barbas (2003)

emplearon un detector UV a una longitud de onda de 210 nm, una columna

Captulo 2. MARCO TERICO

Cromatografa lquida de alta eficiencia.

ingles, High Performance Liquid Cromatography) es una tcnica analtica

1.1. Parmetros necesarios para una validacin

generadas durante el proceso de degradacin, mediante la comparacin a la

(Familiarizacin con el mdulo de

Figura 2.1. Informacin espectral. Adaptado de Familiarizacin con el modulo de

El detector de diodos permite adquirir espectros continuamente; debido a

prdida de sensibilidad durante la adquisicin de espectros (Familiarizacin con

Photodiode Array el Detector, 2009):

1. Longitud: proporcional a la concentracin de analito.

de absorbancia de un par de longitud de onda ofrece poca

informacin acerca de un compuesto. Para ms informacin, se deben

Figura 2.2. Comparacin espectral de dos componentes. Adaptado de Acquity UPLC

2.4.2. Linealidad y rango de trabajo

la recuperacin promedio porcentual y

desviacin estndar relativa. Los valores de

se comparan con los tabulados

para el intervalo de confianza requerido con n-1 grados de libertad. Si

no existe diferencia significativa con el 100 % de recuperacin.

Resulta conveniente graficar masa hallada versus masa agregada,

mltiple (n6) de una muestra homognea y el clculo de la desviacin estndar,

Extrados de Guidelines for Standard Method Performance Requirements (Appendix F:

Los valores de la Tabla 2.1 provienen de los estudios realizados por W.

Figura 2.4. Trompeta de Horwitz (extrado de Validacin de mtodos y determinacin de

La ecuacin de Horwitz se define como sigue (Thompson, 2004):

Con el objetivo de evaluar la robustez del mtodo, esto es el efecto

2k (k factores, todos con dos niveles de prueba). Esta herramienta

permite obtener una matriz de diseo de puntos experimentales o tratamientos

estndares y muestras preparadas. Este es un parmetro importante a considerar

Si cada proceso sigue una distribucin normal y son independientes entre

son los promedios de los ensayos X y Y. Por su parte,

puntos experimentales en cada ensayo.

El cual sigue una distribucin T de Student con

es un estimador de la varianza muestral comn,

suponiendo que dichas varianzas desconocidas sean iguales, y se calcula como:

las varianzas de los datos de cada proceso. Se rechaza

de la distribucin T de Student con

es el punto /2 de la cola derecha