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DE QUERETARO
FACULTAD DE CIENCIAS OUIMICAS
------T E S 1 S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
QUIMICO BIOLOGO
PRESENTA:
QUERETARO,
QR O.
1981
No. Rog(G 1 L{ 3
T:s
"~----.:-..:=----Clas. fi l.( =?-. 7 C.
He~:
a...
<.::-
.'
A mi Dios.
me-
A mis Padres.
Sara y Gonzalo
A mi hermano.
A mis abuelitos.
Mara y Sabino
incond~
trab~
Q. Michiko Shim3no.
Q.F.B. Conchita Garca.
Q.F.B. Shachiko Shimano.
Q.F.B. Guadalupe Barrera.
Q. Alfonso Buenrostro.
Q. Jess
~enegas.
CAPITULO I
INTRODUCCION.
Pgina
1
l.
Antecedentes Histricos
12
2.
Caractersticas Fisicoqumicas
18
21
22
CAPITULO II
30
2.5 Toxicidad
31
2.6 Usos
33
33
JUSTIFICACION
Justificacin
CAPITULO III
37
METODOLOGIA Y MATERIALES
Metodologa y Materiales
l.
35
OBJETIVOS
Objetivos
CAPITULO IV
29
38
Diseo Experimental
38
1.1 Muestreo
38
39
II
Pgina
1.2.1 Determinacin de Humedad
39
1.2.2 Determinacin PH
39
39
39
1.2.5 Determinacin del poder antagnico del Streptomyces Gri-seus grente a los microorga-nismos de prueba
39
2.
Materiales
39
3.
Metodologa
39
40
3.2 Determinacin de PH
40
CAPITULO V
40
RESULTADOS Y DISCUSION
Resultados y Discusin
41
III
Pgina
l.
2.
CAPITULO VI
40
Discusin de Resultados
48
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones y Recomendaciones
CAPITULO VII
49
BIBLIOGRAFIA
Bibliografa
ANEXO
ANEXO
52
54
II
56
IV
INDICE
CUADRO I Y II
DE
CUADROS.
Pgina
42
CUADRO V
44
CUADRO VI
46
47
2
las poblaciones microbianas pero la naturaleza de su efecto es
variable, y cada uno de ellos tiene limitada su aplicacin en la prctica.
En la aplicacin prctica de todo agente fsico o -qumico para controlar las poblaciones microbianas hay que considerar varios factores.
Los factores que influyen para elegir y emplear este
tipo de agentes son:
a).
b).
La velocidad con que mueren los microorganismos varan con la intensidad y naturaleza del agente fsico a que estn expuestos.
Cuanto ms intenso es dicho agente por ejem.: ms calor o ms radiacin ms rapidamente mata los microorganismos.
e).
Tiempo y Temperatura.
d).
Los microorganismos difieren en su susceptibilidad a los agen-tes fsicos y qumicos. En general, son ms susceptibles las -formas vegetativas en crecimiento, mientras que las formas espQ
ruladas, en especial las esporas bacterianas, son muy resistentes. Por su capacidad de sobrevivir en condiciones fsicas ad-versas. Se ha demostrado que cuanto mayor es la poblacin micrQ
biana, ms tiempo se requiere para matar todos los microorgani~
mas, siempre que todas las dems condiciones sean constantes.
e).
Las propiedades fsicas y qumicas del medio o substancias portador de los organismos tienen gran influencia tanto sobre la velocidad de destruccin como en la eficacia de la accin micrQ
bicida. La consistencia del material influye notablemente en la
4
penetracin del agente, y las concentraciones elevadas de hidr~
tos de carbono aumentan generalmente la resistencia trmica de
los organismos. La presencia de materia orgnica extraa puede
reducir en forma significativa la eficacia de un desinfectante,
inactivndolo o protegiendo de su accin a los microorganismos.
El empleo eficaz de un agente antimicrobiano requi~
re el conocimiento de la influencia de estas condiciones sobre
el agente elegido para poder utilizarlo en las circunstancias ms favorables para el desarrollo de su actividad microbicida.
a).
b).
e).
Cualquier situacin o substancia que altere este estado puede suponer un perjuicio irreparable para la clula. Las temperaturas elevadas coagulan las protenas celulares. Las concentraciQ
nes excesivas de alcohol desnaturalizan tambin las protenas y, por este motivo produce efecto letal sobre los microorganismos.
d).
Toda interferencia en las reacciones de aporte energtico ten-dr evidentemente, efecto nocivo sobre el metabolismo celular.
Los agentes oxidantes intensos, como loq halgenos y el perxido de hidrgeno, llegan a transformar tan profundamente los
constituyentes celulares, que estos no pueden intervenir en las
funciones metablicas normales. La actividad de muchas enzimas,
por ejemplo depende de uno de sus constituyentes, el grupo sul-
fhidrilo. Un agente oxidante puede alterar esta estructura qumica e inactivar las enzimas:
/S
/SH
Enzima
~SH
I/2 O
2
------f-
H O
2
Inactiva
Enzima
Activa
Enzima
Enzim~
~SH
Enzima
e).
Activa
HgC1
-------...
Enzima
/l
Enzima
Hg
+ 2HC1
~1S
Inactiva
Existen ciertos casos de inhibicin en los que la lesin ini- cial es una interferencia en alguna biosntesis especfica.
Un ejemplo clsico de este bloqueo es el de la sntesis de cido flico por la sulfonilamida. Pueden interrumpirse otros mu-chos procesos sintticos poniendo a disposicin de la clula a~
gn compuesto de estructura afn aunque ligeramente diferente,
a la del metabolito natural. Los productos que tienen estas prQ
piedades suelen denominarse metabolitos anlogos o antimetaboli
tos.
7
Los resultados que exige la eficacia de su empleo se
explica mejor considerando por separado los procedimientos que
se utilizan en la lucha antimicrobiana.
Los productos utilizados en la lucha contra las po-blaciones microbianas se les conoce con el nombre de antimicrobianos. Reciben este nombre por ser compuestos que de alguna m~
nera actan contra los microorganismos interfiriendo en el crecimiento y actividad o destruyndolos teniendo entre stos a: Los agentes qumicos
(1}.
De esta manera para resolver el problema cada vez -ms grave creado por el uso inmoderado y con frecuencia injusti
ficado que se hace de los antimicrobianos, pese al gran nmero
de libros y otras publicaciones hechas en la literatura mdica
de todo el mundo, y an en la prensa diaria, adems de los symposia mesas redondas y otra clase de reuniones dedicadas a tratar este tema, ha hecho que un gran nmero de personas se preocupe por este problema.
De acuerdo al estudio y el intercambio de conocimien
tos con personas dedicadas a los mismos problemas. Se puede as~
gurar que despus de las vitaminas, son los antimicrobianos los
medicamentos que ms se consumen en todo el mundo, y que ambos
Lo anterior no tendra importancia, sino fuera por los peligros a que estn expuestas las personas sometidas a la
accin de los antimicrobianos.
Por todo lo anterior el mdico toma parte muy importante en este problema ya que debe tener muy en cuenta que an-tes de preescribir este tipo de substancias debe preocuparse -por investigar cual es la causa que produce la enfermedad para
evitar la tendencia a preescribirlos "para ver si curan" sin antes preocuparse por una orientacin diagnstica.
De lo anterior se puede deducir que la administra--cin de los antimicrobianos debe estar regulada en base a la
e~
El xito y descubrimiento de la penicilina en 1929 por Fleming condujo a la bsqueda en gran escala de diversos an
tibiticos en principio en centros de investigacin mdica y en
De esta manera gracias a los estudios realizados -por varios investigadores con respecto a los microorganismos
productores de antibiticos y su importancia en el tratamiento
de enfermedades infecciosas, como complementos vitamnicos y para la conservacin de los alimentos en la industria alimenti
cia, ha hecho posible el descubrimiento de mtodos de aislamiento de microorganismos productores de antibiticos, as como mtodos de obtencin y comprobacin de sensibilidad y
resi~
10
El trmino antibitico se aplica a las substancias
producidas por microorganismos que son bacteriostticas Y fungistticas, bactericidas o fungicidas; esto es que detienen el
crecimiento de las bacterias y los hongos o los matan. La mayQ
ra de estas substancias son tambin relativamente txicas para formas de vida ms elevadas y solo unas cuantas son efica-ces para proteger a los animales contra los microorganismos p~
tgenos (7).
Los antibiticos son substancias qumicas de composicin y propiedades diferentes segn sea el organismo productor. Se han aislado un sinnmero de antibiticos pero solo algunos son utilizados, la mayor parte de los antibiticos aisl~
dos hasta ahora los originan hongos y bacterias; algunos micrQ
organismos pueden producir uno, dos o ms antibiticos o un ag
tibitico ser producido por uno dos o ms microorganismos
dif~
11
ciosa el puntal ms valioso, pero tambin es verdadero que el uso indebido puede dar origen a condiciones diversas no conve-nientes dependiendo del grmen o del organismo (11).
Ahora bien, los antibiticos al igual que los agen-tes quimioterpicos deben poseer las mismas cualidades para ser
verdaderamente beneficiosos como son:
I.
12
El uso de dsis adecuadas de antibiticos para supr1
mir prontamente la infeccin, su aplicacin combinada a otros antibiticos o quimioterpicos y su cambio a la menor sospecha
de resistencia por parte del microorganismo, son entre otras b~
ses fundamentales para una buena antibioticoterapia.
Actualmente se lleva a cabo la investigacin de nuevos antibiticos en gran nmero de laboratorios de varios pai-ses con la esperanza de encontrar algunos que ofrezcan menos -reacciones nocivas y utilidad en el tratamiento de infecciones
que carecen de terapetica en la actualidad o la tienen defi- ciente eventualmente se trata de hallar otros que puedan ser -superiores a la penicilina o estreptomicina (11).
I.
Antecedentes Histricos.
An cuando no se formulaba el concepto de infeccin
v~
De esta manera antes de 1935, las infecciones bacterianas generalizadas no podan tratarse eficazmente con medica-
13
mentes. Haba muchos antispticos y desinfectantes
(agentes qui
14
Encontrndose de esta manera dos tipos de compues-tos antirnicrobianos, que se han clasificado de acuerdo con su
obtencin. Tenindose as que los obtenidos por sntesis qurni
ca se denominan "Agentes quirnioterpicos" pudindose obtener tambin corno prodctos naturales de microorganismos y los obt~
nidos por sntesis biolgica "Antibiticos" obtenidos generalmente de organismos vivos.
Por lo que se refiere a los Agentes quirnioterpicos
la sfilis fue la primera enfermedad conocida para cuyo tratamiento se emple un agente quirnioterpico. Se refiere que ya hacia el afio de 1495 se aplicaba el mercurio para el tratarnien
to de la sfilis pero no fue sino hasta el afio de 1910 aproximadamente, cuando Pablo Ehrlich sintetiz el Salvarsan o com-puesto 606
Eherlich introduce el trmino quimioterapia para -significar el tratamiento de enfermedades infecciosas por compuestos qumicos que actan corno antispticos dentro del organismo sin producir efectos txicos graves en el paciente e ndice quirnioterpico, corno la relacin de la dsis mnima curativa por Kg de peso corporal.
15
De esta manera no fue sino hasta el ao de 1935 en
que Domagk demostr el valor teraputico de una serie de com-pustos del grupo sulfonamidas activas contra una variedad de grmenes patgenos. El primer compuesto de este grupo fue sintetizado por Gelmo en 1908, la sulfanilamida y Eisenberg en
1913 estudi las propiedades bacter.icidas de los colorantes
azoicos que contienen el grupo funcional sulfonamida. El pri-mer compuesto ensayado por Domagk en Alemania en 1935 fue un colorante rojo llamado Protonsil qumicamente sulfamida crisol
dina que curaba espectacularmente las infecciones estreptocci
cas.
Los campos de aplicacin de los compuestos sulfonamdicos fueron plenamente comprobados en infecciones generales
y locales debiendo a ellos la alta mortalidad de neumona, meningitis, gangrena gaseosa, etc., en el presente los que se-preescriben con ms frecuencia ~on: La sulfadiazina y la sulf~
merazina a causa de su accin antibacteriana en muchas infec-ciones
cas en el paciente.
A partir de 1935 se sintetizaron nuevos agentes qui
mioterpicos como: Acido p- amino salicilico (PAS) , la izoniacida, cido nalidixico, etc., lo cual revolucion no solamente
el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, sino tam- -
16
bin descurbimientos en el metabolismo bacteriano, abriendo
nuevos campos de la farmacologa.
Los xitos obtenidos revivieron el inters por ob-servaciones efectuadas con antibiticos, compuestos producidos
por algunos microorganismos que en cantidades extremadamente pequeas tienen la propiedad de inhibir o destruir a otros microorganismos.
La enorme potencia y la ausencia de toxicidad de e~
tos desviaron la atencin de los investigadores en direccin de los antibiticos como fuentes potenciales de agentes quimiQ
terpicos tiles.
El antagonismo microbiolgico entre microorganismos
fue descubierto por Pasteur y Jouvert en 1877 quienes demostra
ron que era posible impedir el desarrollo del antrax si se inyectaban simultneamente algunas bacterias comunes que des--truan el agente etiolgico.
Las primeras tnicas para el estudio y aislamiento
de microorganismos antagonistas pe deben a Garr en 1877 cuyo
mtodo de las estras alternas y modificaciones como el de la
estra cruzada se emplean en la actualidad con este propsito.
Pero no fue sino hasta el ao de 1889 en que Vuill~
17
man introduce el trmino antibiosis que tanta aceptacin tuvi~
ra para despus.
As despus de varios experimentos realizados por varios investigadores sobre el tratamiento de las enfermedades
infecciosas y de ver como ciertos microorganismos inofensivos
eliminaban y substituan otros patgenos, se lleg al descubr1
miento en 1929 de una substancia de gran efecto antibitico
SQ
Despus Waskman y Cols. en 1944 abrieron un nuevo campo en el estudio de los antibiticos cuando publicaron sus
brillantes investigaciones sobre actinomicetos antagonistas -obtenindose primeramente la actinomicina y despus la estreptomicina, la neomicina y la candicidina.
18
papel decisivo en la rama teraputica por su accin contra bacterias rickettsias y hongos.
La estreptomicina fue descubierta por Selman Wask- man en 1944. Fue el primer Antibitico con actividad hacia las
bacterias gram-negativas que adquiri importancia industrial.
Parece que su accin antibacteriana se debe al hecho
de que paraliza la biosntesis de determinados aminocidos como
son: La fenilalanina, la prolina y el cido asprtico.
2.
Caractersticas Fsico-Qumicas
El hecho de que la estreptomicina actuara principal-
19
contr que diversas enfermedades del hombre y de los animalescausadas por diferentes bacterias, respondan fcilmente al -tratamiento con estreptomicina.
t~r
cloroformo
y acetona. Se expenden sus sales inorgnicas, sobre todo el -sulfato y el complejo de cloruro clcico al igual que el clorhidrato son muy solubles en agua. El clorhidrato es sumamente
soluble en metanol, menos soluble en alcohol etlico y
virtua~
581
H N O , un peso mo21 39 7 12
el carbn activado y por la tierra de infusorios. Las soluciones acuosas de la sal son levgiras:caJ~5-s4 (C=I%) para el clo_;:
hidrato yCOJ~5-76(C=
!%)
20
NH
0----CH
1
O
1
CH NHCH
3
1
HCOH
H09H
~CH
1
'--------iCH2<)H _ _ ____,
N-METIL-L- GLUCOSAMINA
'
(3)
ESTREPTOSA
''
1
1
,' 2H -
REDU.CCION
DEL
GRUPO
CARBOXILO
EN LA ESTREPTOSA
''
'
HO-:HzC- C -OH
ESTREPTOBIOSAM INA
FIG
(20)
21
Est formada por tres compuestos: estreptidina (I),
estreptosa (2) y N-metil-L-glucosamina {3) unidos por enlaces glicosdicos. El enlace glicosdico entre la estreptidina y la
estreptosa es mucho ms dbil que el enlace entre la estreptosa
y la N-metil--L-glucosamina.
Sntesis Biolgica
El mtodo bioqumico para la elaboracin de estreptQ
22
micina, est basado en la fermentacin aerobia asptica de un
caldo nutritivo inoculado con Streptomyces griseus pertenecieg
te a la especie estreptomicetaceae, el caldo en fermntacin se airea y agita, la demanda de oxgeno de estos cultivos es
grande.
Despus de la fermentacin entre 25 y 28C con dur~
cin de 1 a 4 das aproximadamente, el caldo es filtrado y se extrae el material activo con carbn activo. Una vez que el -carbn ha absorbido el
antib~tico
El concentrado es luego tratado con acetona o con una mezcla de metanol y acetona para separar la estreptomicina
clorhidrada la cual se precipita. Por ltimo, se mezcla las -soluciones metanlicas de estreptomicina clorhidrato con CaCl
2.2
Actividad Antibacteriana.
La estreptomicina es un antibitico particularmente
23
activo contra las bacterias grarn-negativas, bacterias cidoresistentes corno el Mycobacteriurn tuberculosis y ciertas bacte-rias grarn-positivas sensibles a la influencia de ste antibitico. Dentro de este grupo de microorganismos se encuentran: La E. Coli, Brucella, Hernophilus, Klebsiella, Neisseria, Pseudornonas aureoginosas. Proteus, Bacilo de la Tuberculosis, Clo~
tridiurn, Streptococcus, Staphilococcus, Diplococcus, se ha vi~
to que no tiene actividad contra Hongos, Protozoarios, Ricket~
sias y Virus.
La accin de la estreptomicina se basa fundarnentalrneg
te en la inhibicin de la sntesis protica, para un mejor entendimiento de su accin haremos mencin en forma general del
mecanismo de dicha sntesis:
Es de importancia la intervencin de los genes ya
que van a regular la sntesis de protenas, sta se lleva a e~
bo en conglomerados departculas citoplasrnticas denominadas
"ribosornas" que son partculas aprxirnadarnente esfricas.
Los ribosornas se aislan fcilmente mediante una centrifugacin prolongada de los extractos de tejidos a velocidades de centrifugacin elevadas
OQ
24
pr~
CD
70S
o
50 S
1~
FIG
11 (10)
30 S
PROTEINA
PROTEI NA
RNAr- 16 S
25
Los ribosomas son de suma importancia para la sntesis de pro-tenas, la clave que determina la naturaleza de las protenas que se sintetizan estn a cargo de otro tipo de RNA el RNA mensajero (RNAm).
Las molculas de RNA mensajero se sintetizan en el -ncleo desde donde pasan al citoplasma donde se asocia con el
ribosoma. Por medio de ellas se transmite el mensaje gentico contenido en el DNA situado dentro del ncleo hacia los ribosomas situados en el citoplasma.
El DNA orienta la sntesis de RNAm, es decir la cadena de RNA recoge los ribonucletidos del medio circundante y -con la ayuda de una enzima en la cadena del RNA cuyo orden de bases es complementaria a las bases de la molcula de DNA y en
cada citosina del DNA se inserta una guanina de la cadena de -RNAm, para una guanina se recoge una citosina y toda timina_recoge una adenina, sin embargo toda adenina en la cadena de DNA
recoge un ribonucletido que contenga uracilo. cuando se compl~
ta el proceso, la cadena de RNAm se separa del DNA, abandonando
el ncleo para llevar el mensaje de ~a clave gentica.
Despus de abandonar el ncleo el RNAm es capturado por un ribosoma que lee el mensaje del RNAm, es decir el ribosQ
ma se adhiere al extremo de la cadena de RNAm y luego se mueve
26
Conforme al RNAm es ledo otro tipo de RNA presente en el citoplasma denominado RNA de transferencia (RNA ) escoge
t
Extensos estudios sobre el mecanismo de accin bactericida de la estreptomicina ha demostrado efectos importantes en la sntesis de protenas, encontrndose de esta
manera~que
la estreptomicina interfiere con la unin del formil-mtioniltRNA a los ribosomas y por tanto impide la iniciacin correcta
de la sntesis de protenas, as como, la biosntesis e incorpQ
racin de determinados aminocidos como son la fenilalanina, -prolina y cido asprtico en el polipeptido que forma la protei
na.
27
28
RNA MENSAJERO
(POLI-U)
R:-IA MENSAJERO
{POLI-U)
(COJI~
UUU)
RNA DE TRANSFERENCIA\
PARA LA FENILALA:"JINA
RNA DETRANSFERENCIA
PARA LA
R (CODIGO
..
UUA)
J
EPTOMICINA
La Fig. III es una posible representacin de la accin de la -estreptomicina, se desprende de considerar que ejerce una dis-torcin en el RNAm como modelo del tRNA.
En resumen la accin antibacteriana, depende de la -incapacidad de los microorganismos para sintetizar las prote-nas necesarias donde el sitio de accin de la estreptomicina es
el ribosoma, donde altera la funcin del RNAm y puede cau- - -
29
sar alteracin del cdigo del RNA y de esta manera se forman protenas anormales e inactivas desde el punto de vista funciQ
nal. Ello altera la clula y hace que muera (7, 12, 18 y 9).
2.3
Muy poca estreptomicina es absorbida en el tracto intestinal, an cuando se administra en grandes cantidades; no
es inactivada en el intestino y se elimina en gran proporcin
por las heces. Se absorbe rpidamente cuando se administra intramuscularmente o subcutneamente. Tambin se absorbe por la
pleura.
Casi toda la estreptomicina de la sangre se encuentra en el plasma y muy poca penetra en los eritrocitos. Se di~
tribuye en todos los lquidos extracelulares. Aproximadamente
un tercio de la cantidad se encuentra conjugada con las protei
nas plasmticas, en estas condiciones no puede ser filtrada -por el glomrulo renal.
La estreptomicina administrada por va parenteral,
se distribuye de la siguiente manra: En el ojo la mayor parte
se encuentra en el humor acuoso y muy poca penetra el vitreo.
30
2.4
Indicaciones y Dosificacin.
Las indicaciones de la estreptomicina en la actual~
31
dad son precisas y fundamentales, primero por ser un antibi6tico de gran importancia en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias gram-negativas, bacterias
cidor~
En la tuberculosis la estreptomicina es el antibi6tico de elecci6n, la estreptomicina es eficaz tambin contra la neumona causada por Klebsiella, la meningitis por Hemophilus influenzae, tularemia, fiebre recmrente, peste, granulona ingui
nal, disenteria bacilar, infecciones de las vas urinarias y -septicemias causadas por enterobacterias (E. Coli, Aerobacter aer6genes y proteus sp.).
La d6sis fluctan entre 20 y 40mg por kg de peso y -por da. La cantidad diaria se puede repartir en dos o ms a- plicaciones o ser administrada cada 24 hs., segn el padec--miento infeccioso. En trminos generales en el adulto se utilizan 1 6 2 gr. y en el nio de 20 a 24 mg, en las 24 hs. La du-raci6n del tratamiento depende del tipo de padecimiento y de la
tolerancia del enfermo al medicamento.
2.5
Toxicidad.
32
Actualmente se usa solo el sulfato de estreptomicina, durante algunos aos se pens que la dihidroestreptomicina
era menos txica, pero despus de mltiples observaciones clnicas se encontr que era ms txica que la estreptomicina.
Entre los tipos de reacciones observadas tras el -uso de estreptomicina se encuentran las siguientes: lo. La
pr~
sencia de dolor o molestia en el lugar de inyeccin; 2o. Reacciones de tipo histamnico, como ejemplo dolor de cabeza, fiebre, enrojecimiento de la piel y descenso de la presin
sangu~
nea; 3o. Trastornos del octavo par craneal, como sordera transitoria; 4o. Manifestaciones de sensibilizacin (erupciones de
la piel, etc.); So. Coloracin anormal y albmina en la orina.
rea~
ciones principales son las neurotxicas y las alrgicas. En -las personas en que se produce dao laberntico, pueden pasar
por una fase aguda de nuseas, vmitos y vrtigos.
def~
ciencia de la agudeza auditiva suele verse con relativa frecuencia, el dao parece estar en relacin con la dsis total y
la va de administracin, presentndose con ms frecuencia cuan
do se aplica la estreptomicina por va intratecal.
Se
h~registrado
33
citopenias y moderada leucopenia. Puede alterar la flora del intestino y de las vas respiratorias, permitiendo que
microo~
2.6
Usos.
La estreptomicina se emplea sola o en combinaciones
i~
2.7
Compuesto Afn.
3~
e~
pr~
temperat~
ra ordinaria.
(2, 6 y 12).
35
d~
sarrollo muy importante ya que se han aislado e identificado miles de substancias que tienen o ejercen accin antimicrobiana, dentro de las cuales; varias son tiles en el tratamiento
de enfermedades infecciosas.
estreptom~
obt~
nerse de cultivos puros pero la mayora hay que aislarlos de fuentes como son el suelo y de materiales en descomposicin, donde son aislados los estreptomicetos como lo es el "estreptQ
myces griseus", productor de la estreptomicina, del aire, agua
y superficie de frutos y vegetales.
36
37
Objetivo Mediato.
Realizar una investigacin bibliogrfica encaminada a ell
contrar la metodologa ms adecuada para la obtencin y comprQ
bacin de la actividad de ste antibitico.
Objetivos Inmediatos.
a. Realizar investigacin bibliogrfica para conocer los
mtodos de aislamiento del Streptomyces griseus
(actinomiceto
c. Llevar a cabo en las muestras las determinaciones fisicoqumicas y microbiolgicas para comprobar la presencia del
Streptomyces griseus as como su efecto antagnico.
I
ME T O D O L O G I A
V
Y
MA T E R I A L E S
38
Para llevar a cabo este estudio se emplearon muestras obtenidas de suelos ricos en materia orgnica de diferentes
lug~
microorgani~
l.
Diseo Experimental.
1.1
Muestreo.
39
1.2.1
Determinacin de Humedad.
1.2.2
Determinacin de PH.
1.2.3
1.2.4
1.2.5
2.
2.1
Materiales.
Reactivos, Medios de Cultivo, Cristalera y equipo de la-
boratorio.
2.2
3.
Metodologa.
Los mtodos de prueba para las muestras sujetas a estudio,
40
cr~
potenciom~
.trico: Anexo I.
3.3 Mtodos de Prueba para el aislamiento y comprobacin del antagonismo biolgico del Streptomyces griseus.
Los mtodos microbiolgicos de prueba para el aislamiento
del Streptomyces griseus del suelo y la comprobacin de su antagonismo frente a ciertos microorganismos de prueba se encuen
tran en el Anexo II.
RESULTADOS
DISCUSION
41
En los cuadros de resultados se puede observar queen
todas las muestras de suelo sujetas a estudio, se llev a cabo
el aislamiento del Streptomyces griseus as como la comproba-cin de su efecto antagnico frente a los microorganismos de prueba, para lo cual se llevaron a cabo mtodos fisicoqumicos
como la determinacin del PH y la humedad, los cuales se encorr
traton dentro de los lmites ptimos para el crecimiento y prQ
liferacin del Streptomyces griseus.
llev~
v.
42
CUADRO I.
De te minaciones Fisi,-.ocru{mi,-.as
Toma de la
Nmero
de
Muestra
1
2
Muestra
Vegetacin
1\bundante
"
"
"
"
6
7
8
9
10
11
12
13
14
"
"
"
"
"
"
"
"
"
15
"
16
"
"
17
18
19
20
21
22
23
24
25
"
"
"
"
"
"
"
"
Profundidad
Humedad
PH
15%
6.5
"
15%
6.5
"
"
"
"
"
15%
25%
7.0
6" 6 15 cm.
7.0
20%
7.5
10%
6.5
17%
6.5
"
"
"
"
"
18%
7.0
15%
7.5
10%
6.5
15%
7.0
10%
7.5
"
"
"
"
"
"
"
"
"
15%
6.5
10%
7.0
19%
7.5
20%
6.5
12%
7.5
30%
7.0
20%
6.5
19%
7.0
20%
6.5
"
"
19.5%
6.5
10.5%
6.5
"
15%
7.0
"
25%
6.5
43
CUADRO II.
Nmero
de
Muestra
26
27
Determinaciones Fisicog:umicas
Toma de la
Muestra
Profundidad
Humedad
Vegetacin
Abundante
29
"
"
"
30
"
31
32
"
"
33
"
34
"
"
28
35
36
"
37
40
"
"
"
"
41
"
42
"
"
"
"
"
"
"
"
"
38
39
43
44
45
46
47
48
49
50
6" 6 15 cm.
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
PH
30%
7.0
30%
7.5
20%
6.5
25%
7.0
20%
6.5
25%
7.5
15%
7.5
15%
6.5
10%
6.5
18%
7.0
10%
7.0
25%
6.5
15%
6.5
12%
7.0
10%
7.5
20%
6.5
30%
7.0
19.5%
6.5
15%
7.5
20%
7.0
30%
7.0
13%
6.5
30%
6.5
20%
6.5
25%
7.0
44
CUADRO III.
Determinaciones Microbiolgicas
Medio
Morfologa de
~islamiento
las colonias.
Selectivo.
Mtodo de
Nmero
de
Muestras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
20
21
22
23
24
25
Mtodo de
dilucin en
placa.
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
A G A
Favorecedor
Esporulacin
."
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
.
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
45
CUADRO
Nmero
de
Muestra
Mtodo de
~ilucin en
placa.
A G A
Favorecedor
Esporulacin
Se desarrolla en la S.);!
perficie formando un
micelio fino ramificado de aspecto algodon.Q
so color blanco y centro obscuro.
"
"
"
"
"
"
"
"
29
11
11
"
30
11
11
11
31
11
11
11
32
11
11
11
33
34
11
11
"
"
11
11
11
11
11
"
11
11
11
11
38
"
11
11
39
11
11
11
40
11
11
26
27
28
35
36
37
41
42
11
11
"
"
11
11
.
11
11
11
11
44
11
11
11
45
46
11
11
11
11
"
"
47
11
11
11
48
11
11
11
49
11
11
11
50
11
11
11
43
46
CUADRO V.
DETERMINACION DEL ANTAGONISMO BIOLOGICO DEL STREPTOMYCES GRISEUS FRENTE A LOS MICROORGANISMOS DE PRUEBA.
Mtodo de Comprobacin
Microorganismo
de
R~
Antagonista
griseus.
Mtodo de la Estra
Cruzada de Garr
Streptomyces
Staphilococcus
griseus
aures
sultados
+ + +
11
11
11
11
11
11
No inhibicin
Pobre
++
Buena
+++
Prueba
Muy buena
Escherichia coli
Klebsiella sp.
Bacillus subtilis
+ + +
+ +
+ +
47
CUADRO VI.
Antibitico
Microorganismo
Espectro
Productor
Antimicrobiano
Bacterias gram +
Bacterias gram Rickettsias
floramfenicol
Streptomyces Venezuelae
Tetraciclinas
Neomicinas
Eritromicina
Streptomyces Fradie
Bacterias gram +
Bacterias gram -
Streptomyces Erythreus
Bacterias gram +
Nistatina
Streptomyces Noursey
Hongos
A.nfotericina B
Streptomyces Nodosus
Hongos
48
2. Discusin de Resultados.
En la realizacin de este estudio se llev a cabo -una investigacin bibliogrfica para encontrar la metodologa
ms adecuada para llevar a cabo el aislamiento y comprobacin
del poder antagnico del Streptomyces griseus (actinomiceto e~
porulante) productor de la Estreptomicina.
Para cumplir con los objetivos de este trabajo se -llevaron a cabo en el laboratorio mtodos fisicoqumicos y microbiolgicos.
Encontrndose que para el aislamiento el mtodo de dilucin en placa en la cual se utiliza un medio selectivo - (AGA) que favorece la esporulacin es el adecuado, ya que permite conocer el nmero de colonias por gramo de suelo y selectivo para especies que esporulan abundantemente.
V I
e O N e L U S I O N E S Y R E e O ME N D A e I O N E S
49
1.
Del estudio llevado a cabo en las muestras de suelo de diversos lugares de la ciudad de Quertaro para llevar a cabo el aislamiento del Streptomyces griseus productor de la
estreptomicina, se obtuvieron resultados positivos en cuau
to a la presencia del Streptomyces griseus, pudindose a la vez demostrar su efecto antag6nico frente a los microoE
ganismos de prueba de acuerdo con los procedimientos fisico-qumicos y microbiol6gicos propuestos en este trabajo.
2.
obt~
ner resultados positivos en las determinaciones fisicoqumicas entre las cuales la determinaci6n de humedad y PH
son factores importantes en el crecimiento y desarrollo
del Streptomyces griseus sin
~ejar
de tomar en cuenta
veg~
3.
50
5.
6.
Para comprobar el efecto antagnico del Streptomyces gri-seus el mtodo de la estra cruzada de Garr es el ms recomendable,ya que permite determinar el antagonismo del
Streptomyces griseus frente a varios microorganismos de
prueba puesto que se emplea un medio que favorece el cree~
miento del antagonista como de los microorganismos de pru~
ba en una sola determinacin, obtenindose resultaqos que
pueden ir desde la no inhibicin hasta una buy buena, la -
51
determinacin es rpida y de bajo costo para la industria
de los antibiticos.
52
1.
2.
3.
Dr. L. Jack Brashaw, Microbiologa de Laboratorio Edito-rial El Manual Moderno, S. A., Mxico. Pag. 47- 48, 220
y 231
4.
(1976).
S.
Alfredo Snchez Marroqun D. S. Principios de Microbiologa Industrial Editorial Qumica, S. A., Mxico. Pag. - 237- 241 y 257- 259 (1961).
6.
Kirk K. Othrner, Enciclopedia de Tecnologa Qumica Volu-men II, la Edicin Derechos reservados UTHEA. Pag. 481 503 y 449.
7.
B.D. Davis, R.D. Dulbecco H.E.N. Helsen, H.S. Ginsberg, W.B. Wood, Tratado de Microbiologa Editores Salvat, S.A.
Mallorca 43, Barcelona (Espaa). Pag. 308, 327, 331 y - 680 - 681.
(1977).
53
8.
Dr. Mario Rebolledo Lara, Teraputica Clnica, La Edi- cin Francisco Mencez Otero, Editor y Distribuidor. Pag.
79 - 85.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Thamane D. Motiramani y B. Bali, Roy L. Donahue, Edito-rial Diana, Mxico. Pag. 249 - 265 y 375 - 376.
16.
54
17.
Stainer Doudoroff Adelberg Microbiologa Ediciones Aguilar. Pag. 168, 711 - 714.
18.
19.
20.
L.E. Casida Jr., Microbiology Industrial, PensylvaniaState, University. Pag. 248 - 252.
21.
Dr. Jos Beltrn Martnez, Anlisis Qumicos de los Suelos 2a. Edici6n, Editorial Omega, S. A., Barcelona.
Pag. 71 - 75 (1970) .
55
X O
l.
Determinacin de la Humedad.
X 100
Peso secado al horno
2.
Determinacin de PH.
56
de suelo empleadas para el aislamiento del Streptomyces gri- seus es otro de los factores que influyen de manera considerable en el crecimiento y desarrollo del Streptomyces griseus.
El PH debe oscilar entre 6.5 y 7.5 sto es de ligeramente cido a ligeramente alcalino.
Determinacin: Se lleva a cabo por el mtodo potenciomtrico ya que proporciona datos exactos, la medicin se realiza me- diante un potencimetro (con escala de PH) para calibrar se -utiliza una solucin buffer de PH 7 o lo ms cercano a la gama
en que se trabaje; hacer la determinacin, introduciendo
dire~
Una vez obtenidas las muestras de suelo se preparan suspensiones de 1:10 de tierra y agua, y se procede a la determinacin
del PH.
57
A
l.
Asparagina----------------O.Sgr/lt.
K HPO
2
Estracto de
----------------0.5
C~rne----------2.0
--------------10
6.8 - 7.0
despus de la esterilizacin
frascos de dilucin, para preparar estas diluciones se prepara una solucin Ringer cuya composicin es la siguiente 8.5 a 9 gr. de NaCl/lt.
Observaciones.- Las colonias del Streptomyces griseus presen-tan un aspecto pulvurento algodonoso de color blanco, se en- cuentran formando masas de filamentos ramificados los cuales se adhieren fuertemente al substrato, las colonias maduras
pr~
2.
El mtodo utilizado para la determinacin del antagonismo biolgico del Streptomyces griseus es mediante el mtodo de la es
tra cruzada de Garr.
59
a) Una vez aislado el Streptomyces griseus (microorganismo antagonista)en forma de cultivo puro, se ensaya la actividad
antibitica por el mtodo de estra cruzada de Garr. El -Streptomyces griseus se extiende pr~mero, en estra recta en un medio de gelosa-tripticasa (Medio slido) y se incuba
hasta que se ha obtenido un buen desarrollo de colonias (de
tres a cinco das a 28C.
Tripticasa
Fitona
Na Cl
15
Agar
"
5 - 7% de sangre humana.
Agua destilada
PH final
7.3
1000 ml.'
60
b) Posteriormente se siembran los microorganismos de prueba iQ
tersectando en ngulo recto con la estra de desarrollo del
antagonista; se incuban nuevamente durante 24 hs. a 36C y
se hace la lectura correspondiente.
Observaciones.- Los resultados obtenidos fueron positivos ya que se tuvo inhibicin que fue desde buena hasta muy buena.
gr/lt
"
61
Procedimientos.-
d~
rante 24 hs.
amar~lo
de hemlisis al rededor de las colonias se prepara una suspensin de estas colonias en solucin salina (solucin de cloruro de sodio al
0.~/c
en agua destilada).
62
e) Antes de preparar la suspensin se lleva a cabo la prueba
de la coagulaza colocando S ml de plasma citratado inoculado con S. Aureus incubando a 36C de 2-3 hs observndose coagulacin del plasma obtenindose S. Aureus patgeno.
s.oo
Sacarosa
5.0
2.0
gr/lt
0.4
0.065
1000
PH
"
ml
Procedimiento.-
a) Para el aislamiento de E. Coli se emple una muestra de excremento recogida en frasco estril.
63
cremento y agua y mediante una aza de platino se siembra
por el mtodo de estra en las cajas conteniendo el medio para el desarrollo de E. Coli la incubacin es a 36C duraQ
te 48 hs.
d) Obtenidas las colonias se prepara una suspensin en solu- cin salina (solucin de cloruro de sodio al 0.9% en agua destilada).
5.0
"
Sacarosa ------------------------
5.0
2.0
"
"
Eosina --------------------------
0.4
"
0.065 "
1000 ml
64
PH
final
7.2 + 0.2
Procedimiento.-
e)
65
Medio de Cultivo.- (Agar -Almidn).
Estracto de Res
------------- 3.0
gr/lt
Peptona
------------- 5.0
"
Agar
-------------15.0
"
Agua destilada
-------------1000 ml
Almidn soluble
------------- 2.0
gr/lt
Procedimiento.-
e) Mediante una aza de platino se inocula un tubo de agar nu-triente inclinado rayando suavemente la superficie del agar
el cual se incuba a 36C durante 48 hs.
48 hs.
e) Determinada la incubacin se bafia con una solucin'de Yodogram y se produce un color azul obscuro.
66
Yodo - Gram
Yodo, Q. P.
1.0 gr.
2.0 gr.
300 ml.
g) La reaccin hidroltica tpica del almidn con resultados positivos con bacilo subtilis, la carencia total del almi-dn se caracteriza por la carencia de un fondo azul obscuro
al rededor de la colonia, las cuales presentan un color am~
rillo. Se prepara una suspensin de estas colonias en solucin salina (solucin de Cloruro de sodio al 0.9% en agua destilada)