Sie sind auf Seite 1von 83

UNIVERSIDAD AUTONOMA

DE QUERETARO
FACULTAD DE CIENCIAS OUIMICAS

AISLAMIENTO Y MODO DE ACCION


DEL STREPTOMYCES
( GRISEUS )
Uf4JVER31DAO I.!Jr::tJ:' , , ::;:; QUERE'tAIId

------T E S 1 S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
QUIMICO BIOLOGO
PRESENTA:

QUERETARO,

QR O.

1981

No. Rog(G 1 L{ 3
T:s
"~----.:-..:=----Clas. fi l.( =?-. 7 C.
He~:

a...

<.::-

.'

A mi Dios.

Por ser el gua de mis pasos y el que me


ha dado la fuerza para alcanzar esta

me-

ta, sin el cual no sera nada ni nadie.

A mis Padres.

Sara y Gonzalo

Por su comprensin, cario y confianza depositada en m.

A mi hermano.

Miguel Angel, con todo cario por ser el


nico compaero de mi infancia.

A mis abuelitos.

Mara y Sabino

Por sus oraciones que siempre me han


acompaado as como por su cario.

A el Maestro Pedro Vela.

Por su amistad, consejos y ayuda

incond~

cional para la realizacin de este


jo.

trab~

A todos mis maestros:

Con todo respeto y agradecimiento por


sus conocimientos transmitidos a lo largo de mi carrera y en especial a:

Q. Michiko Shim3no.
Q.F.B. Conchita Garca.
Q.F.B. Shachiko Shimano.
Q.F.B. Guadalupe Barrera.
Q. Alfonso Buenrostro.
Q. Jess

~enegas.

Q.F.B. Carlos Sierra.


Q.l ... Luis Muoz.
Q. Gilberto Hernndez.
Q. Guerra Malo.
Q. Olmos.

A mis familiares y amigos:


Que de una u otra forma me ayudaron y alentaron para salir adelante en mi
carrera.

CAPITULO I

INTRODUCCION.

Pgina
1

l.

Antecedentes Histricos

12

2.

Caractersticas Fisicoqumicas

18

2.1 Sntesis Biolgica

21

2.2 Actividad Antibacteriana

22

2.3 Absorcin Distribucin y


Eliminacin

CAPITULO II

2.4 Indicaciones y Dosificaciones

30

2.5 Toxicidad

31

2.6 Usos

33

2.7 Compuesto Afn

33

JUSTIFICACION
Justificacin

CAPITULO III

37

METODOLOGIA Y MATERIALES
Metodologa y Materiales

l.

35

OBJETIVOS
Objetivos

CAPITULO IV

29

38

Diseo Experimental

38

1.1 Muestreo

38

1.2 Anlisis Fisicoqumicos y


Microbiolgicos

39

II

Pgina
1.2.1 Determinacin de Humedad

39

1.2.2 Determinacin PH

39

1.2.3 Aislamiento de Streptomyces


Griseus

39

1.2.4 Aislamiento del Microorganisroo de prueba en forma de cultivo puro

39

1.2.5 Determinacin del poder antagnico del Streptomyces Gri-seus grente a los microorga-nismos de prueba

39

2.

Materiales

39

3.

Metodologa

39

3.1 Determinacin de Humedad

40

3.2 Determinacin de PH

40

3.3 Mtodos de prueba para el aislamieg


to y comprobacin del antagonismo biolgico del Streptomyces griseus.

CAPITULO V

40

RESULTADOS Y DISCUSION
Resultados y Discusin

41

III

Pgina
l.

2.
CAPITULO VI

Aislamiento y Modo de Accin del Streptomyces Griseus

40

Discusin de Resultados

48

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones y Recomendaciones

CAPITULO VII

49

BIBLIOGRAFIA
Bibliografa

ANEXO

METODOS DE PRUEBA PARA DETERMINACIONES FISICOQUIMICAS

ANEXO

52

54

II

METODOS DE PRUEBA PARA DETERMINACIONES MICROBIOLOGICAS

56

IV
INDICE

CUADRO I Y II

DE

CUADROS.

Pgina

DETERMINACIONES FISICOQUIMICAS EFECTUADAS EN LAS MUESTRAS DE SUELO.

42

CUADRO III Y IV DETERMINACIONES MICROBIOLOGICAS EFECTUA


DAS EN LAS MUESTRAS DE SUELO.

CUADRO V

44

DETERMINACION DEL ANTAGONISMO BIOLOGICO


DEL STREPTOMYCES GRISEUS FREN'rE A LOS MICROORGANISMOS DE PRUEBA.

CUADRO VI

46

PRINCIPALES ANTIBIOTICOS PRODUCIDOS POR


ACTINOMICETOS.

47

El bienestar y la prosperidad del hombre dependen en


gran medida de su dominio sobre las poblaciones microbianas.
Se ha visto que el crecimiento ptimo de los rnicroo~
ganisrnos dependen de varios factores corno son: PH, temperatura,
nutrientes, presin osmtica, gases, etc.
Muchas prcticas de la vida cotidiana, corno la depuracin del agua, la pasteurizacin de la leche o la refrigera-cin de los alimentos, tiene por objeto este importante aspecto
del control de las poblaciones microbianas. Las razones principales de aplicacin de estos procedimientos de la lucha contra
los microorganismos son: Prevenir la transmisin de las enferrn~
dades e infecciones, evitar la descomposicin y el deterioro de
algunos productos as corno evitar la contaminacin.
La inhibicin de los microorganismos puede consegui~
se con el empleo de agentes fsicos o de productos qumicos.
Los procedimientos utilizados tienen por fundamento someter a los organismos a la accin de un producto que les sea nocivo o
a una condicin fsica desfavorable.
Algunas de estas condiciones se limitan a inhibir el
crecimiento, mientras que otras destruyen efectivarnentelas clulas. Existe una multitud de agentes que sirven para controlar

2
las poblaciones microbianas pero la naturaleza de su efecto es
variable, y cada uno de ellos tiene limitada su aplicacin en la prctica.
En la aplicacin prctica de todo agente fsico o -qumico para controlar las poblaciones microbianas hay que considerar varios factores.
Los factores que influyen para elegir y emplear este
tipo de agentes son:
a).

Concentracin y Clase de agente qumico.

Dentro de ciertos lmites y en dependencia de cada agente parti


cular, cuanto ms concentrado est el producto qumico ms rpi
da es su accin sobre los microorganismos, pudiendo ser bacte-ricida a cierta concentracin y bacteriosttica a concentracin
ms baja. Algunos agentes antimicrobianos pueden incluso hasta
ser estimulantes a concentraciones ms bajas.

b).

Intensidad y Naturaleza del agente fsico.

La velocidad con que mueren los microorganismos varan con la intensidad y naturaleza del agente fsico a que estn expuestos.
Cuanto ms intenso es dicho agente por ejem.: ms calor o ms radiacin ms rapidamente mata los microorganismos.

e).

Tiempo y Temperatura.

Dentro de ciertos lmites, cuanto ms largo es el tiempo de ca~


tacto entre los microorganismos y el agente antimicrobiano ma-yor es el nmero de organismos destruidos. El aumento de temperatura acelera la destruccin de los microorganismos sometidos
a la accin de un agente germicida, como un agente qumico. Esto es una pequea cantidad de un producto qumico germicida a temperatura elevada dar el mismo resultado que una cantidad m~
yor del mismo producto a temperatura ms baja.

d).

Clase y Nmero de organismos.

Los microorganismos difieren en su susceptibilidad a los agen-tes fsicos y qumicos. En general, son ms susceptibles las -formas vegetativas en crecimiento, mientras que las formas espQ
ruladas, en especial las esporas bacterianas, son muy resistentes. Por su capacidad de sobrevivir en condiciones fsicas ad-versas. Se ha demostrado que cuanto mayor es la poblacin micrQ
biana, ms tiempo se requiere para matar todos los microorgani~
mas, siempre que todas las dems condiciones sean constantes.
e).

Naturaleza del material de soporte de los microorgani~


mas.

Las propiedades fsicas y qumicas del medio o substancias portador de los organismos tienen gran influencia tanto sobre la velocidad de destruccin como en la eficacia de la accin micrQ
bicida. La consistencia del material influye notablemente en la

4
penetracin del agente, y las concentraciones elevadas de hidr~
tos de carbono aumentan generalmente la resistencia trmica de
los organismos. La presencia de materia orgnica extraa puede
reducir en forma significativa la eficacia de un desinfectante,
inactivndolo o protegiendo de su accin a los microorganismos.
El empleo eficaz de un agente antimicrobiano requi~
re el conocimiento de la influencia de estas condiciones sobre
el agente elegido para poder utilizarlo en las circunstancias ms favorables para el desarrollo de su actividad microbicida.

Ahora bien, es importante por razones tericas como


prcticas, tener idea de como son inhibidos o destruidos los mi
croorganismos. El conocimiento del modo de actuar de un agente
determinado, permite predecir las condiciones en que ser ms
eficaz, as como su espectro antimicrobiano. Se ha desarrolla-do un esfuerzo en la investigacin para determinar el lugar especfico de accin de diversos agentes. Estas investigaciones son complicadas, por el hecho de que cuando una clula se expone a un agente letal pueden observarse muchas alteraciones, entre las que se tienen las siguientes:

a).

Lesiones en la pared celular.

Algunos compuestos inhiben la formacin del material necesario


para constituir la pared en ciertos cultivos bacterianos en -crecimiento, producindose protoplastos.

b).

Alteracin de la permeabilidad celular.

De las acciones nocivas sobre la membrana celular se deriva la


inhibicin del crecimiento o la muerte de la clula. La actividad microbiana de ciertos compuestos como los fenlicos, los d~
tergentes, los jabones y los compuestos cuaternarios de amonio
se atribuye a su efecto sobre la permeabilidad celular. Estas substancias alteran la capacidad selectiva de la membrana, dando lugar al derrame de los constituyentes del protoplasma.

e).

Alteracin de la naturaleza coloidal del protoplasma.

Cualquier situacin o substancia que altere este estado puede suponer un perjuicio irreparable para la clula. Las temperaturas elevadas coagulan las protenas celulares. Las concentraciQ
nes excesivas de alcohol desnaturalizan tambin las protenas y, por este motivo produce efecto letal sobre los microorganismos.
d).

Inhibicin de la actividad enzimtica.

Toda interferencia en las reacciones de aporte energtico ten-dr evidentemente, efecto nocivo sobre el metabolismo celular.
Los agentes oxidantes intensos, como loq halgenos y el perxido de hidrgeno, llegan a transformar tan profundamente los
constituyentes celulares, que estos no pueden intervenir en las
funciones metablicas normales. La actividad de muchas enzimas,
por ejemplo depende de uno de sus constituyentes, el grupo sul-

fhidrilo. Un agente oxidante puede alterar esta estructura qumica e inactivar las enzimas:

/S

/SH
Enzima

~SH

I/2 O
2

------f-

H O
2

Inactiva

Enzima

Activa

Enzima

Enzim~

La inactivacin de ciertas enzimas puede tener lugar como resu~


tado de la combinacin con algunos ines metlicos, como el meK
curio sobre el grupo sulfhidrilo (-SH) .
/SH
Enzima

~SH

Enzima
e).

Activa

HgC1

-------...

Enzima

/l

Enzima

Hg

+ 2HC1

~1S

Inactiva

Interferencia en procesos sintticos.

Existen ciertos casos de inhibicin en los que la lesin ini- cial es una interferencia en alguna biosntesis especfica.
Un ejemplo clsico de este bloqueo es el de la sntesis de cido flico por la sulfonilamida. Pueden interrumpirse otros mu-chos procesos sintticos poniendo a disposicin de la clula a~
gn compuesto de estructura afn aunque ligeramente diferente,
a la del metabolito natural. Los productos que tienen estas prQ
piedades suelen denominarse metabolitos anlogos o antimetaboli
tos.

7
Los resultados que exige la eficacia de su empleo se
explica mejor considerando por separado los procedimientos que
se utilizan en la lucha antimicrobiana.
Los productos utilizados en la lucha contra las po-blaciones microbianas se les conoce con el nombre de antimicrobianos. Reciben este nombre por ser compuestos que de alguna m~
nera actan contra los microorganismos interfiriendo en el crecimiento y actividad o destruyndolos teniendo entre stos a: Los agentes qumicos

desinfectantes ) agentes quimioterpicos

que incluyen los antibiticos

(1}.

De esta manera para resolver el problema cada vez -ms grave creado por el uso inmoderado y con frecuencia injusti
ficado que se hace de los antimicrobianos, pese al gran nmero
de libros y otras publicaciones hechas en la literatura mdica
de todo el mundo, y an en la prensa diaria, adems de los symposia mesas redondas y otra clase de reuniones dedicadas a tratar este tema, ha hecho que un gran nmero de personas se preocupe por este problema.
De acuerdo al estudio y el intercambio de conocimien
tos con personas dedicadas a los mismos problemas. Se puede as~
gurar que despus de las vitaminas, son los antimicrobianos los
medicamentos que ms se consumen en todo el mundo, y que ambos

son utilizados con demasiada frecuencia sin haber indicacin al


guna.

Lo anterior no tendra importancia, sino fuera por los peligros a que estn expuestas las personas sometidas a la
accin de los antimicrobianos.

Cada da se registran ms reacciones nocivas produci


das por estas substancias y que van desde gastroenteritis sin mayor trascendencia hasta la produccin de sordera, encefalitis,
estado de choque mortal, lesiones renales y accin teratognica.

Por todo lo anterior el mdico toma parte muy importante en este problema ya que debe tener muy en cuenta que an-tes de preescribir este tipo de substancias debe preocuparse -por investigar cual es la causa que produce la enfermedad para
evitar la tendencia a preescribirlos "para ver si curan" sin antes preocuparse por una orientacin diagnstica.

De lo anterior se puede deducir que la administra--cin de los antimicrobianos debe estar regulada en base a la

e~

periencia clnica y el conocimiento del agente etiolgico (2).

El xito y descubrimiento de la penicilina en 1929 por Fleming condujo a la bsqueda en gran escala de diversos an
tibiticos en principio en centros de investigacin mdica y en

laboratorios dedicados al estudio de la microbiologa del suelo y posteriormente en la industria farmacutica.

De esta manera gracias a los estudios realizados -por varios investigadores con respecto a los microorganismos
productores de antibiticos y su importancia en el tratamiento
de enfermedades infecciosas, como complementos vitamnicos y para la conservacin de los alimentos en la industria alimenti
cia, ha hecho posible el descubrimiento de mtodos de aislamiento de microorganismos productores de antibiticos, as como mtodos de obtencin y comprobacin de sensibilidad y

resi~

tencia a los antibiticos etc., que a la vez han permitido en


la actualidad la produccin en gran escala de diversos antibiQ
ticos alcanzando un desarrollo muy importante la ind~tria fa~
macutica.
Los mtodos de produccin de estas substancias son
muy variados pero los mtodos generales de elaboracin son semejantes. Para poder obtener este tipo de substancias es necesario obtener un cultivo puro de microorganismos de tal forma
que se aseguren los rendimientos y as extraerlas y purificarlas.

Los antibiticos son substancias que se caracteri-zan por la especificidad de su accin.

10
El trmino antibitico se aplica a las substancias
producidas por microorganismos que son bacteriostticas Y fungistticas, bactericidas o fungicidas; esto es que detienen el
crecimiento de las bacterias y los hongos o los matan. La mayQ
ra de estas substancias son tambin relativamente txicas para formas de vida ms elevadas y solo unas cuantas son efica-ces para proteger a los animales contra los microorganismos p~
tgenos (7).
Los antibiticos son substancias qumicas de composicin y propiedades diferentes segn sea el organismo productor. Se han aislado un sinnmero de antibiticos pero solo algunos son utilizados, la mayor parte de los antibiticos aisl~
dos hasta ahora los originan hongos y bacterias; algunos micrQ
organismos pueden producir uno, dos o ms antibiticos o un ag
tibitico ser producido por uno dos o ms microorganismos

dif~

rentes. Su efecto es de una marcada accin bacteriosttica y pocas veces bactericida.


Entre los cuales se tiene a: La penicilina, la es-treptomicina, oxitetraciclina, cloromicetina, gramicidina, tirocidina, polimixina, neomicina, etc., de gran valor teraput~
co e importancia industrial considerable.
Representan actualmente en la terapetica antiinfes

11

ciosa el puntal ms valioso, pero tambin es verdadero que el uso indebido puede dar origen a condiciones diversas no conve-nientes dependiendo del grmen o del organismo (11).
Ahora bien, los antibiticos al igual que los agen-tes quimioterpicos deben poseer las mismas cualidades para ser
verdaderamente beneficiosos como son:
I.

Destruir e inhibir muchas especies diferentes de microo~

ganismos, es decir, antibiticos de amplio espectro o sea, efe~


tivos contra microorganismos gram-positivos y gram-negativos, dificultar el desarrollo de formas resistentes de los microorg~
nismos, no producir efectos secundarios desagradables, como, r~
acciones alrgicas, lesiones en los nervios o irritacin de los
sistemas renal y gastrointestinal.
2.

No modificar o suprimir la flora microbiana normal del -

huesped por que al hacerlo as se perturba el equilibrio de la


naturaleza, permitiendo que microorganismos que no son patge-nos de ordinario o formas patgenas facultativas que estn re-primidas normalmente por la flora habitual, establezcan una nu~
va infeccin, debe ser activo hacia los microorganismos patgenos "in vivo" y debe ser conservable por lo menos varios meses
(1)

12
El uso de dsis adecuadas de antibiticos para supr1
mir prontamente la infeccin, su aplicacin combinada a otros antibiticos o quimioterpicos y su cambio a la menor sospecha
de resistencia por parte del microorganismo, son entre otras b~
ses fundamentales para una buena antibioticoterapia.

Actualmente se lleva a cabo la investigacin de nuevos antibiticos en gran nmero de laboratorios de varios pai-ses con la esperanza de encontrar algunos que ofrezcan menos -reacciones nocivas y utilidad en el tratamiento de infecciones
que carecen de terapetica en la actualidad o la tienen defi- ciente eventualmente se trata de hallar otros que puedan ser -superiores a la penicilina o estreptomicina (11).

I.

Antecedentes Histricos.
An cuando no se formulaba el concepto de infeccin

el hombre primitivo reconoci que con frecuencia lesiones infl~


materias seguan a cortes y erociones y que el tratamiento con
vino o vinagre era eficaz.

Conforme avanz la civilizacin cada nuevo agente

v~

getal o qumico se ensay para sus efectos antispticos.

De esta manera antes de 1935, las infecciones bacterianas generalizadas no podan tratarse eficazmente con medica-

13
mentes. Haba muchos antispticos y desinfectantes

(agentes qui

micos) que podan erradicar las infecciones aplicados tpicamen


te, pero su empleo para fines generales no era posible por su bajo ndice teraputico.
Todos los agentes qumicos actan de diversas mane- ras sobre los microorganismos, pero han de ser siempre utilizados en la antisepsia y desinfeccin, ya que su aplicacin inteE
na no solo causara la destruccin del microorganismo parasita~
te, sino tambin del organismo hospedador.

Dentro de los principales agentes qumicos antimicrQ


bianos, se encuentran los siguientes: Alcoholes y compuestos f~
nlicos, Metales pesados y sus compuestos, Compuestos de amonio
y Cuaternarios, Aereosoles y Desinfectantes, etc.

Con el advenimiento de las sulfonamidas y los antibiQ


tices, los agentes qumicos simples se han ido haciendo menos tiles en la teraputica, pero han conservado su importancia p~
ra la destruccin de microorganismos de objetos inanimados.

A principios del siglo XIX fue de inters la bsqueda


de substancias de efectos selectivos sobre los microorganismos
sin que se lesionaran los tejidos orgnicos.

14
Encontrndose de esta manera dos tipos de compues-tos antirnicrobianos, que se han clasificado de acuerdo con su
obtencin. Tenindose as que los obtenidos por sntesis qurni
ca se denominan "Agentes quirnioterpicos" pudindose obtener tambin corno prodctos naturales de microorganismos y los obt~
nidos por sntesis biolgica "Antibiticos" obtenidos generalmente de organismos vivos.
Por lo que se refiere a los Agentes quirnioterpicos
la sfilis fue la primera enfermedad conocida para cuyo tratamiento se emple un agente quirnioterpico. Se refiere que ya hacia el afio de 1495 se aplicaba el mercurio para el tratarnien
to de la sfilis pero no fue sino hasta el afio de 1910 aproximadamente, cuando Pablo Ehrlich sintetiz el Salvarsan o com-puesto 606

(compuesto orgnico de arsnico) el cual fue de im-

portancia por que fue la primera investigacin dirigida a en-contr~r

un producto que tuviera propiedades paraticidas, esca-

sa toxicidad y buena estabilidad qumica.

Eherlich introduce el trmino quimioterapia para -significar el tratamiento de enfermedades infecciosas por compuestos qumicos que actan corno antispticos dentro del organismo sin producir efectos txicos graves en el paciente e ndice quirnioterpico, corno la relacin de la dsis mnima curativa por Kg de peso corporal.

15
De esta manera no fue sino hasta el ao de 1935 en
que Domagk demostr el valor teraputico de una serie de com-pustos del grupo sulfonamidas activas contra una variedad de grmenes patgenos. El primer compuesto de este grupo fue sintetizado por Gelmo en 1908, la sulfanilamida y Eisenberg en
1913 estudi las propiedades bacter.icidas de los colorantes
azoicos que contienen el grupo funcional sulfonamida. El pri-mer compuesto ensayado por Domagk en Alemania en 1935 fue un colorante rojo llamado Protonsil qumicamente sulfamida crisol
dina que curaba espectacularmente las infecciones estreptocci
cas.
Los campos de aplicacin de los compuestos sulfonamdicos fueron plenamente comprobados en infecciones generales
y locales debiendo a ellos la alta mortalidad de neumona, meningitis, gangrena gaseosa, etc., en el presente los que se-preescriben con ms frecuencia ~on: La sulfadiazina y la sulf~
merazina a causa de su accin antibacteriana en muchas infec-ciones

y por ser menos probable que provoquen reacciones txi

cas en el paciente.
A partir de 1935 se sintetizaron nuevos agentes qui
mioterpicos como: Acido p- amino salicilico (PAS) , la izoniacida, cido nalidixico, etc., lo cual revolucion no solamente
el tratamiento de muchas enfermedades infecciosas, sino tam- -

16
bin descurbimientos en el metabolismo bacteriano, abriendo
nuevos campos de la farmacologa.
Los xitos obtenidos revivieron el inters por ob-servaciones efectuadas con antibiticos, compuestos producidos
por algunos microorganismos que en cantidades extremadamente pequeas tienen la propiedad de inhibir o destruir a otros microorganismos.
La enorme potencia y la ausencia de toxicidad de e~
tos desviaron la atencin de los investigadores en direccin de los antibiticos como fuentes potenciales de agentes quimiQ
terpicos tiles.
El antagonismo microbiolgico entre microorganismos
fue descubierto por Pasteur y Jouvert en 1877 quienes demostra
ron que era posible impedir el desarrollo del antrax si se inyectaban simultneamente algunas bacterias comunes que des--truan el agente etiolgico.
Las primeras tnicas para el estudio y aislamiento
de microorganismos antagonistas pe deben a Garr en 1877 cuyo
mtodo de las estras alternas y modificaciones como el de la
estra cruzada se emplean en la actualidad con este propsito.
Pero no fue sino hasta el ao de 1889 en que Vuill~

17
man introduce el trmino antibiosis que tanta aceptacin tuvi~
ra para despus.
As despus de varios experimentos realizados por varios investigadores sobre el tratamiento de las enfermedades
infecciosas y de ver como ciertos microorganismos inofensivos
eliminaban y substituan otros patgenos, se lleg al descubr1
miento en 1929 de una substancia de gran efecto antibitico

SQ

bre una variedad de grmenes patgenos a la que llam Fleming


Penicilina por ser el producto del mismo un moho del gnero -Penicillium.
De esta manera un grupo de investigadores de Oxford
(Chain Florey y Cols.) logr finalmente en 1940 la obtencinde penicilina no txica de gran inters mdico, los cuales la
aislaron en forma cristalina a la substancia activa, estudiando sus caractersticas principales.

Despus Waskman y Cols. en 1944 abrieron un nuevo campo en el estudio de los antibiticos cuando publicaron sus
brillantes investigaciones sobre actinomicetos antagonistas -obtenindose primeramente la actinomicina y despus la estreptomicina, la neomicina y la candicidina.

A partir de esta fecha se consolida la produccin


en gran escala de diversos antibiticos, que entran a jugar un

18

papel decisivo en la rama teraputica por su accin contra bacterias rickettsias y hongos.
La estreptomicina fue descubierta por Selman Wask- man en 1944. Fue el primer Antibitico con actividad hacia las
bacterias gram-negativas que adquiri importancia industrial.
Parece que su accin antibacteriana se debe al hecho
de que paraliza la biosntesis de determinados aminocidos como
son: La fenilalanina, la prolina y el cido asprtico.

Los microorganismos que producen estreptomicina son


bacterias filamentosas que pertenecen al orden de los Actinomicetales, familia Streptomycetacea, gnero Estreptomyces. Los -estreptomicetos estn muy difundidos en el suelo y en los materiales en descomposicin (1, 11 y 5).

2.

Caractersticas Fsico-Qumicas
El hecho de que la estreptomicina actuara principal-

mente contra bacterias gram-negativas y cido resistentes como


el mycobacterium tuberculosis le confiri gran utilidad. Las i~
vestigaciones en gran escala sobre el uso de la estreptomicina
en el tratamiento de las infecciones bacterianas fueron de gran
importancia, ya que gracias a estas investigaciones se en-

19
contr que diversas enfermedades del hombre y de los animalescausadas por diferentes bacterias, respondan fcilmente al -tratamiento con estreptomicina.

La estreptomicina es un antibitico producido por ciertos Streptomyces, principalmente por el S. griseus. Es de


naturaleza bsica,'soluble en el agua y termoestable, es inodQ
ra y de sabor ligeramente amargo,insoluble en

t~r

cloroformo

y acetona. Se expenden sus sales inorgnicas, sobre todo el -sulfato y el complejo de cloruro clcico al igual que el clorhidrato son muy solubles en agua. El clorhidrato es sumamente
soluble en metanol, menos soluble en alcohol etlico y

virtua~

mente insoluble en alcohol n-butlico cido actico y piridina.


El sulfato es poco soluble en metanol. Las sales se presentan
en forma de polvos amorfos, las cuales son higroscpicas y delicuescentes expuestas al aire.

Tiene una frmula emprica C


lecular

581

H N O , un peso mo21 39 7 12

y un punto de fusin 164-165C absorbida por

el carbn activado y por la tierra de infusorios. Las soluciones acuosas de la sal son levgiras:caJ~5-s4 (C=I%) para el clo_;:
hidrato yCOJ~5-76(C=

!%)

para la sal doble de clorhidrato y clor_!!

ro clcico. La estrept;omicina es muy estable y resistente a la


mayor parte de las enzimas.

20

La molcula de estreptomicina tiene la siguiente estructura:

NH

0----CH
1

O
1

CH NHCH
3
1
HCOH
H09H

~CH
1

'--------iCH2<)H _ _ ____,
N-METIL-L- GLUCOSAMINA

'

(3)

ESTREPTOSA

''

1
1

,' 2H -

REDU.CCION

DEL

GRUPO

CARBOXILO

EN LA ESTREPTOSA

''

'

HO-:HzC- C -OH

ESTREPTOBIOSAM INA

D 1HIDRO - ESTREPTOMIC 1NA

FIG

(20)

21
Est formada por tres compuestos: estreptidina (I),
estreptosa (2) y N-metil-L-glucosamina {3) unidos por enlaces glicosdicos. El enlace glicosdico entre la estreptidina y la
estreptosa es mucho ms dbil que el enlace entre la estreptosa
y la N-metil--L-glucosamina.

Por consecuencia, la estreptomicina se divide por v~


rios reactivos en estreptidina y un disacarido de N-metil-L-glQ
cosamina y estreptosa unidas en forma de glicsido llamado es-treptobiosamina Fig. I.
Uno de los productos de la hidrlisis alcalina es el
matol y por hidrlisis cida produce furfural debiendo su ori-gen a la porcin estreptosa.
Adems de los tres grupos bsicos, la estreptomicina
contiene un grupo carbonilo (aldehdico) reactivo. Su presencia
fue demostrada por la inactivacin del antibitico por reacti-vos del grupo carbonilo y por la preparacin de oxima y la semi
carbazoma de la estreptomicina. En medio moderadamente cido o
alcalino tiene su mximo de estabilidad. La hidrogenacin del grupo aldehido para formar el grupo alcohlico produce dihidroestreptomicina c 21 H41N7 o 12 (6).
2.1

Sntesis Biolgica
El mtodo bioqumico para la elaboracin de estreptQ

22
micina, est basado en la fermentacin aerobia asptica de un
caldo nutritivo inoculado con Streptomyces griseus pertenecieg
te a la especie estreptomicetaceae, el caldo en fermntacin se airea y agita, la demanda de oxgeno de estos cultivos es
grande.
Despus de la fermentacin entre 25 y 28C con dur~
cin de 1 a 4 das aproximadamente, el caldo es filtrado y se extrae el material activo con carbn activo. Una vez que el -carbn ha absorbido el

antib~tico

se filtra, lava y se trata

con una solucin diluida de alcohol acidificado con HCL o con


una solucin cida de acetona al 6~/c, separada la solucin hidroalcohlica o hidroacetnica del carbn se neutraliza y concentra en el vaco hasta el 25% de substancia seca, una cuarta
parte de la cual es estreptomicina.

El concentrado es luego tratado con acetona o con una mezcla de metanol y acetona para separar la estreptomicina
clorhidrada la cual se precipita. Por ltimo, se mezcla las -soluciones metanlicas de estreptomicina clorhidrato con CaCl

en forma de agujas, los cristales se lavan con agua se filtran


y secan por liofilizacin (G).

2.2

Actividad Antibacteriana.
La estreptomicina es un antibitico particularmente

23

activo contra las bacterias grarn-negativas, bacterias cidoresistentes corno el Mycobacteriurn tuberculosis y ciertas bacte-rias grarn-positivas sensibles a la influencia de ste antibitico. Dentro de este grupo de microorganismos se encuentran: La E. Coli, Brucella, Hernophilus, Klebsiella, Neisseria, Pseudornonas aureoginosas. Proteus, Bacilo de la Tuberculosis, Clo~
tridiurn, Streptococcus, Staphilococcus, Diplococcus, se ha vi~
to que no tiene actividad contra Hongos, Protozoarios, Ricket~
sias y Virus.
La accin de la estreptomicina se basa fundarnentalrneg
te en la inhibicin de la sntesis protica, para un mejor entendimiento de su accin haremos mencin en forma general del
mecanismo de dicha sntesis:
Es de importancia la intervencin de los genes ya
que van a regular la sntesis de protenas, sta se lleva a e~
bo en conglomerados departculas citoplasrnticas denominadas
"ribosornas" que son partculas aprxirnadarnente esfricas.

Los ribosornas se aislan fcilmente mediante una centrifugacin prolongada de los extractos de tejidos a velocidades de centrifugacin elevadas

(100,000 x g y varias horas)

OQ

tenindose as cerca del 60% de cido ribonucleico (RN~) y 4~/c


de protenas.

24

En las clulas procariotas aparecen en forma libre


como monosomas, o bien en forma asociada a los RNAm, constituyendo los polisomas. En las clulas eucari6ticas se pueden

pr~

sentar en forma similar a las clulas procari6ticas o tambin


asocindose a las membranas del retculo endoplsmico.

Los ribosomas constan de una subunidad mayor y una


menor, que se asocian entre s para formar la unidad 70S, es-tas partculas ribosomales se disgregan en partculas 30S y -SOS bajo extracci6n con fenol que desnaturalizan las protenas
pero no el RNA, producen una nica molcula de RNAr de constall
tede sedimentaci6n 23S y la partcula 30S produce una molcula
de RNAr 16S. Fig. II.

CD
70S

o
50 S

1~

FIG

11 (10)

30 S

EXTRACCION CON FENOL

PROTEINA

PROTEI NA

RNAr- 16 S

25
Los ribosomas son de suma importancia para la sntesis de pro-tenas, la clave que determina la naturaleza de las protenas que se sintetizan estn a cargo de otro tipo de RNA el RNA mensajero (RNAm).
Las molculas de RNA mensajero se sintetizan en el -ncleo desde donde pasan al citoplasma donde se asocia con el
ribosoma. Por medio de ellas se transmite el mensaje gentico contenido en el DNA situado dentro del ncleo hacia los ribosomas situados en el citoplasma.

El DNA orienta la sntesis de RNAm, es decir la cadena de RNA recoge los ribonucletidos del medio circundante y -con la ayuda de una enzima en la cadena del RNA cuyo orden de bases es complementaria a las bases de la molcula de DNA y en
cada citosina del DNA se inserta una guanina de la cadena de -RNAm, para una guanina se recoge una citosina y toda timina_recoge una adenina, sin embargo toda adenina en la cadena de DNA
recoge un ribonucletido que contenga uracilo. cuando se compl~
ta el proceso, la cadena de RNAm se separa del DNA, abandonando
el ncleo para llevar el mensaje de ~a clave gentica.

Despus de abandonar el ncleo el RNAm es capturado por un ribosoma que lee el mensaje del RNAm, es decir el ribosQ
ma se adhiere al extremo de la cadena de RNAm y luego se mueve

26

a lo largo de ella "leyendo" el orden en que estn dispuestas las bases.

Conforme al RNAm es ledo otro tipo de RNA presente en el citoplasma denominado RNA de transferencia (RNA ) escoge
t

los aminocidos adecuados fijndolos en un extremo, presentando


en su otro extremo, 3 nucletidos que son ligados a los nucletidos complementarios de la tira del RNAm. En esta forma se - atrae los aminocidos al ribosoma en la sucesin ordenada de -acuerdo a la informacin imprimida en el RNAm.

Extensos estudios sobre el mecanismo de accin bactericida de la estreptomicina ha demostrado efectos importantes en la sntesis de protenas, encontrndose de esta

manera~que

la estreptomicina interfiere con la unin del formil-mtioniltRNA a los ribosomas y por tanto impide la iniciacin correcta
de la sntesis de protenas, as como, la biosntesis e incorpQ
racin de determinados aminocidos como son la fenilalanina, -prolina y cido asprtico en el polipeptido que forma la protei
na.

La clave de accin de la estreptomicina se encontr en el curso del estudio de la "estreptomicinodependencia".


La dependencia, la resistencia y la susceptibilidad se deben a
formas allicas del mismo gen.

27

Spotts y Stainer observaron que la sntesis proteca


era inhibida precozmente en clulas dependientes privadas del medicamento, as como en las clulas sensibles tratadas por l,
por ello supusieron que la estreptomicina actuaba directamente
en los ribosomas: Los de las mutantes dependientes seran efic~
ces solo cuando se unen con el medicamento; los de los alelos resistentes seran indiferentes. Esta hiptesis ha recibido apQ
yo de los experimentos "in vitro" en varios laboratorios.

El sitio de accin inhibitoria es la subunidad 308 de


los ribosomas, bacterianos donde no solo inhiben la sntesis
protica, sino induce a una lectura errnea del cdigo gentico,
si se usan ribosomas sensibles y el mensajero cido poliuridli
co que acta como cdigo para la fenilalanina la adicin de estreptomicina no solo inhiben la incorporacin de isoleucina y serina enormemente. El medicamento produce, al parecer, un cdi
go en el RNAm (en el ribosoma), que induce a la unin a una secuencia de aminoacidos de RNAt, distinta a la que normalmente se une.

28

RNA MENSAJERO
(POLI-U)

R:-IA MENSAJERO
{POLI-U)

(COJI~
UUU)

RNA DE TRANSFERENCIA\
PARA LA FENILALA:"JINA

RNA DETRANSFERENCIA
PARA LA
R (CODIGO
..
UUA)

J
EPTOMICINA

FIG 111 {7)

La Fig. III es una posible representacin de la accin de la -estreptomicina, se desprende de considerar que ejerce una dis-torcin en el RNAm como modelo del tRNA.
En resumen la accin antibacteriana, depende de la -incapacidad de los microorganismos para sintetizar las prote-nas necesarias donde el sitio de accin de la estreptomicina es
el ribosoma, donde altera la funcin del RNAm y puede cau- - -

29

sar alteracin del cdigo del RNA y de esta manera se forman protenas anormales e inactivas desde el punto de vista funciQ
nal. Ello altera la clula y hace que muera (7, 12, 18 y 9).

2.3

Absorcin, Distribucin y Eliminacin.


La estreptomicina pasa rpidamente a la corriente -

sangunea despus de la administracin por va parenteral.

Muy poca estreptomicina es absorbida en el tracto intestinal, an cuando se administra en grandes cantidades; no
es inactivada en el intestino y se elimina en gran proporcin
por las heces. Se absorbe rpidamente cuando se administra intramuscularmente o subcutneamente. Tambin se absorbe por la
pleura.
Casi toda la estreptomicina de la sangre se encuentra en el plasma y muy poca penetra en los eritrocitos. Se di~
tribuye en todos los lquidos extracelulares. Aproximadamente
un tercio de la cantidad se encuentra conjugada con las protei
nas plasmticas, en estas condiciones no puede ser filtrada -por el glomrulo renal.
La estreptomicina administrada por va parenteral,
se distribuye de la siguiente manra: En el ojo la mayor parte
se encuentra en el humor acuoso y muy poca penetra el vitreo.

30

Puede penetrar en el lquido plasmtico fetal y en el lquido


amnitico, la concentracin que alcanza en estos es aproximad~
mente la mitad de la que se encuentra en la sangre de la madre.
El uso intratecal de la estreptomicina ha sido desechado por -que implica ms pligros que ventajas.
En los riones se encuentra una concentracin relativamente alta y cantidades apreciables se hallan en el hgado
msculo y tiroides. En el lquido cerebro espinal se han encou
trado cantidades significativas, por inyeccin intramuscular a
intervalos de 2 a 3 hs. y por inyeccin intrameningea despus
de 24 hs. de la administracin.
Aproximadamente el 50 60% de la estreptomicina iu
yectada se elimina, sin cambio por la orina en las 24 hs.; la
mayor cantidad aparece en las primeras 12 hs. mientras mayor es la dosis administrada ~ayor ser la velocidad de elimina- cin renal, en el hombre es aproximadamente 3~~ menor de la v~
locidad de filtracin glomerular. No hay reabsorcin tubular.
La concentracin de estreptomicina en el plasma est relacionada con la dosis, va administracin, los interva-los entre las aplicaciones y la funcin renal.

2.4

Indicaciones y Dosificacin.
Las indicaciones de la estreptomicina en la actual~

31
dad son precisas y fundamentales, primero por ser un antibi6tico de gran importancia en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias gram-negativas, bacterias

cidor~

sistentes como el Mycobacterium tuberculosis causantes de la tQ


berculosis (Su aplicaci6n ms importante) as como ciertas bacterias gram-positivas y en segundo lugar, se conocen mejor su toxicidad y la resistencia de los microorganismos a ella.

En la tuberculosis la estreptomicina es el antibi6tico de elecci6n, la estreptomicina es eficaz tambin contra la neumona causada por Klebsiella, la meningitis por Hemophilus influenzae, tularemia, fiebre recmrente, peste, granulona ingui
nal, disenteria bacilar, infecciones de las vas urinarias y -septicemias causadas por enterobacterias (E. Coli, Aerobacter aer6genes y proteus sp.).

La d6sis fluctan entre 20 y 40mg por kg de peso y -por da. La cantidad diaria se puede repartir en dos o ms a- plicaciones o ser administrada cada 24 hs., segn el padec--miento infeccioso. En trminos generales en el adulto se utilizan 1 6 2 gr. y en el nio de 20 a 24 mg, en las 24 hs. La du-raci6n del tratamiento depende del tipo de padecimiento y de la
tolerancia del enfermo al medicamento.

2.5

Toxicidad.

32
Actualmente se usa solo el sulfato de estreptomicina, durante algunos aos se pens que la dihidroestreptomicina
era menos txica, pero despus de mltiples observaciones clnicas se encontr que era ms txica que la estreptomicina.

Entre los tipos de reacciones observadas tras el -uso de estreptomicina se encuentran las siguientes: lo. La

pr~

sencia de dolor o molestia en el lugar de inyeccin; 2o. Reacciones de tipo histamnico, como ejemplo dolor de cabeza, fiebre, enrojecimiento de la piel y descenso de la presin

sangu~

nea; 3o. Trastornos del octavo par craneal, como sordera transitoria; 4o. Manifestaciones de sensibilizacin (erupciones de
la piel, etc.); So. Coloracin anormal y albmina en la orina.

Tenindose de esta manera que los dos tipos de

rea~

ciones principales son las neurotxicas y las alrgicas. En -las personas en que se produce dao laberntico, pueden pasar
por una fase aguda de nuseas, vmitos y vrtigos.

La sordera total es bastante rara, pero alguna

def~

ciencia de la agudeza auditiva suele verse con relativa frecuencia, el dao parece estar en relacin con la dsis total y
la va de administracin, presentndose con ms frecuencia cuan
do se aplica la estreptomicina por va intratecal.

Se

h~registrado

casos raros de anemias, de trombo-

33

citopenias y moderada leucopenia. Puede alterar la flora del intestino y de las vas respiratorias, permitiendo que

microo~

ganismos que no son susceptibles a ella adquieran virulencia y


lleguen a producir enfermedad.

2.6

Usos.
La estreptomicina se emplea sola o en combinaciones

con otros agentes quimioterpicos en el tratamiento de muchas


enfermedades infecciosas como: Tuberculosis, meningitis e in-fecciones en las vas urinarias por cepas sensibles a la es
treptomicina pertenecientes a las bacterias gram-negativas;

i~

fecciones por Hemophilus influenzae de la corriente sangunea

y el corazn, meninges, aparato respiratorio y aparato urina-r~o,

endocarditis por bacterias resistentes a la penicilina,

neumona, empiema y otras infecciones pulmonares sensibles a


la penicilina, chancroide, granulona inguinal, gonorrea que cg
rresponde a la penicilina, brucelosis, tularemia, peste muermo,
lceras de la crnea, heridas e infecciones cutneas peritonitis y enteritis y profilcticamente en ciruga gastrointesti-nal. Emplendose tambin en medicina veterinaria. La estreptomicina ha demostrado por experimentos ser uno de los agentes ms prometedores en el tratamiento de infecciones bacterianas
en plantas.

2.7

Compuesto Afn.

3~

La hidroxiestreptomicina es producida por varias

e~

pecies de Streptomyces, entre ellas el S. rurireticuli. Es una


base orgnica muy soluble en el agua, menos soluble en los alcoholes inferiores e insoluble en otros disolventes orgnicos.
El clorhidrato de hidroxiestreptomicina en solucin acuosa

pr~

senta una rotacin especfica de -9lC. Como la estreptomicina


es estable en soluciones cidas a bases dbiles a la

temperat~

ra ordinaria.

La hidroxiestreptomicina es activa contra organis-mos gram-positivos, gram-negativos y cidoresistentes. Las


acciones txicas de la hidroxiestreptomicina y su derivado dihidroestreptomicina son escencialmente las de la estreptomicina y la dihidroestreptomicina. Ver Fig. I.

(2, 6 y 12).

35

La industria de los antibiticos ha alcanzado un

d~

sarrollo muy importante ya que se han aislado e identificado miles de substancias que tienen o ejercen accin antimicrobiana, dentro de las cuales; varias son tiles en el tratamiento
de enfermedades infecciosas.

Encontrndose entre estas substancias la

estreptom~

cina la cual ha alcanzado una importancia industrial consider~


ble en el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas - principalmente por bacterias gram-negativas as como cidore-sistentes (micobacterios).

El descubrimiento de una nueva substancia antimicrQ


biana es el resultado de una seria de investigaciones en las que se realizan el reconocimiento la separacin y el anlisis.

En donde un gran nmero de cultivos son escenciales


para realizar esta investigacin, algunos de ellos pueden

obt~

nerse de cultivos puros pero la mayora hay que aislarlos de fuentes como son el suelo y de materiales en descomposicin, donde son aislados los estreptomicetos como lo es el "estreptQ
myces griseus", productor de la estreptomicina, del aire, agua
y superficie de frutos y vegetales.

Debido a la importancia que tiene este producto se


han llevado a cabo un gran nmero de investigaciones encamina-

36

das a su aislamiento as como para conocer su mecanismo de


accin.

37

Objetivo Mediato.
Realizar una investigacin bibliogrfica encaminada a ell
contrar la metodologa ms adecuada para la obtencin y comprQ
bacin de la actividad de ste antibitico.

Objetivos Inmediatos.
a. Realizar investigacin bibliogrfica para conocer los
mtodos de aislamiento del Streptomyces griseus

(actinomiceto

esporulante) productor de la Estreptomicina, as como para la


comprobacin de su efecto antagnico.

b. Seleccionar el mtodo fisicoqumico y microbiolgico


ms adecuado para el aislamiento y comprobacin del efecto antagnico del Streptomyces griseus.

c. Llevar a cabo en las muestras las determinaciones fisicoqumicas y microbiolgicas para comprobar la presencia del
Streptomyces griseus as como su efecto antagnico.

I
ME T O D O L O G I A

V
Y

MA T E R I A L E S

38

El aislamiento y comprobacin del efecto antagnico del Streptomyces griseus

(actinomiceto esporulante) productor de -

la Estreptomicina, microorganismos de prueba, ha sido el resu1


tado de extensos programas de seleccin llevados a cabo en numerosas Universidades y laboratorios industriales de todo el mundo y en la mayor parte de los Estados Unidos.

Para llevar a cabo este estudio se emplearon muestras obtenidas de suelos ricos en materia orgnica de diferentes

lug~

res de la Ciudad de Quertaro, para el aislamiento del StreptQ


myces griseus. As como tambin, para obtener el microorganismo de prueba en forma de cultivo puro, se utilizaron muestras
donde se presume el habitat de los siguientes microorganismos:
Staphilococcus Aureus, Klebsiella sp, E. Coli y Bacilo Subti-lis.

Las muestras as obtenidas fueron llevadas al laboratorio


para el aislamiento del Streptomyces griseus as como para la
comprobacin de su efecto antagnico frente a los

microorgani~

mos de prueba de acuerdo a los procedimientos fisicoqumicos y


microbiolgicos.

l.

Diseo Experimental.

1.1

Muestreo.

39

Las muestras de suelo fueron obtenidas al azar de diversos


lugares de la ciudad de Quertaro tomando en cuenta ciertos -factores como son profundidad, humedad, vegetacin, etc., in-dispensables para el desarrollo y crecimiento del Streptomyces
griseus.

1.2 Anlisis Fisicogumicos y Microbiolgicos.


Efectuar los anlisis fisicoqumicos y microbiolgi
cos en cada una de las muestras de suelo:

1.2.1

Determinacin de Humedad.

1.2.2

Determinacin de PH.

1.2.3

Aislamiento de Streptomyces griseus.

1.2.4

Aislamiento del microorganismo de prueba en forma cultivo puro.

1.2.5

Determinacin del poder antagnico del Streptomyces


griseus frente a los microorganismos de prueba.

2.
2.1

Materiales.
Reactivos, Medios de Cultivo, Cristalera y equipo de la-

boratorio.
2.2

3.

Muestras de: Suelo.

Metodologa.
Los mtodos de prueba para las muestras sujetas a estudio,

40

son los siguientes:

3.1 Determinacin de Humedad.


El porcentaje de humedad en el suelo influye sobre el

cr~

cimiento y desarrollo del Streptomyces griseus del suelo.


La humedad se determin mediante el mtodo gravimtrico:
Anexo I.

3.2 Determinacin de PH.


En la determinacin de PH, se emple el mtodo

potenciom~

.trico: Anexo I.

3.3 Mtodos de Prueba para el aislamiento y comprobacin del antagonismo biolgico del Streptomyces griseus.
Los mtodos microbiolgicos de prueba para el aislamiento
del Streptomyces griseus del suelo y la comprobacin de su antagonismo frente a ciertos microorganismos de prueba se encuen
tran en el Anexo II.

RESULTADOS

DISCUSION

41
En los cuadros de resultados se puede observar queen
todas las muestras de suelo sujetas a estudio, se llev a cabo
el aislamiento del Streptomyces griseus as como la comproba-cin de su efecto antagnico frente a los microorganismos de prueba, para lo cual se llevaron a cabo mtodos fisicoqumicos
como la determinacin del PH y la humedad, los cuales se encorr
traton dentro de los lmites ptimos para el crecimiento y prQ
liferacin del Streptomyces griseus.

En cuanto a los mtodos microbiolgicos que se

llev~

ron a cabo para el aislamiento y determinacin del antagonismo


biolgico se observaron buenos resultados, es decir al emplear
los microorganismos de prueba se observaron buenas zonas de -inhibicin lo cual indica que tiene accin antagnica para dichos microorganismos que son responsables de un gran nmero de
problemas ya que causan tanto como infecciones como intoxica-ciones en el ser humano.

Los resultados obtenidos en las determinaciones fis1


coqumicas y microbiolgicas de las muestras de suelo sujetas
a estudio se muestran en los cuadros del I al

v.

42
CUADRO I.

DETERMINACIONES FISICOQUIMICAS EFECTUADAS


EN LAS MUESTRAS DE SUELO.

De te minaciones Fisi,-.ocru{mi,-.as
Toma de la

Nmero
de
Muestra
1
2

Muestra
Vegetacin
1\bundante

"
"
"

"

6
7
8
9
10
11

12
13
14

"
"
"
"
"
"
"
"
"

15

"

16

"
"

17
18
19
20
21
22
23
24
25

"
"
"
"
"
"
"
"

Profundidad

Humedad

PH

15%

6.5

"

15%

6.5

"
"
"
"
"

15%
25%

7.0

6" 6 15 cm.

7.0

20%

7.5

10%

6.5

17%

6.5

"
"
"
"
"

18%

7.0

15%

7.5

10%

6.5

15%

7.0

10%

7.5

"
"
"
"
"
"
"
"
"

15%

6.5

10%

7.0

19%

7.5

20%

6.5

12%

7.5

30%

7.0

20%

6.5

19%

7.0

20%

6.5

"
"

19.5%

6.5

10.5%

6.5

"

15%

7.0

"

25%

6.5

43
CUADRO II.

Nmero
de
Muestra
26
27

Determinaciones Fisicog:umicas
Toma de la
Muestra
Profundidad
Humedad
Vegetacin
Abundante

29

"
"
"

30

"

31
32

"
"

33

"

34

"
"

28

35
36

"

37

40

"
"
"
"

41

"

42

"
"
"
"
"
"
"
"
"

38
39

43
44
45
46
47
48
49
50

DETERMINACIONES FISICOQUIMICAS EFECTUA-DAS EN LAS MUESTRAS DE SUELO.

6" 6 15 cm.

"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"

PH

30%

7.0

30%

7.5

20%

6.5

25%

7.0

20%

6.5

25%

7.5

15%

7.5

15%

6.5

10%

6.5

18%

7.0

10%

7.0

25%

6.5

15%

6.5

12%

7.0

10%

7.5

20%

6.5

30%

7.0

19.5%

6.5

15%

7.5

20%

7.0

30%

7.0

13%

6.5

30%

6.5

20%

6.5

25%

7.0

44
CUADRO III.

DETERMINACIONES MICROBIOLOGICAS EFECTUADAS


EN LAS MUESTRAS DE SUELO.

Determinaciones Microbiolgicas
Medio
Morfologa de
~islamiento
las colonias.
Selectivo.
Mtodo de

Nmero
de
Muestras

1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11

12
13
14
15
16
17
18
20
21
22
23
24
25

Mtodo de
dilucin en
placa.

"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"

"
"
"
"
"

"
"
"
"

A G A
Favorecedor
Esporulacin

."
"
"
"
"

"
"
"
"

"
"
"

.
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"

Se desarrolla en la superficie formando


un micelio fino rami"ficado de aspecto algodonoso color blanco
y centro obscuro.

"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"

45
CUADRO

IV. DETERMINACIONES MICROBIOLOGICAS EFECTUADAS


EN LAS MUESTRAS DE SUELO.

Determi nr~ri rmP<: Mi rrnhi nl <"\ni r;o.,


Morfologa de
Medio
las colonias.
Selectivo.
~islamiento
Mtodo de

Nmero
de
Muestra

Mtodo de
~ilucin en
placa.

A G A
Favorecedor
Esporulacin

Se desarrolla en la S.);!
perficie formando un
micelio fino ramificado de aspecto algodon.Q
so color blanco y centro obscuro.

"
"
"

"
"
"

"
"

29

11

11

"

30

11

11

11

31

11

11

11

32

11

11

11

33
34

11

11

"

"

11

11

11

11

11

"

11

11

11

11

38

"

11

11

39

11

11

11

40

11

11

26
27
28

35
36
37

41
42

11

11

"
"

11

11

.
11

11

11

11

44

11

11

11

45
46

11

11

11

11

"
"

47

11

11

11

48

11

11

11

49

11

11

11

50

11

11

11

43

46

CUADRO V.

DETERMINACION DEL ANTAGONISMO BIOLOGICO DEL STREPTOMYCES GRISEUS FRENTE A LOS MICROORGANISMOS DE PRUEBA.

Mtodo de Comprobacin
Microorganismo

del Antagonismo Biol-

de

gico del Streptomyces

R~

Antagonista

griseus.

Mtodo de la Estra
Cruzada de Garr

Streptomyces

Staphilococcus

griseus

aures

sultados

+ + +

11

11

11

11

11

11

No inhibicin

Pobre

++

Buena

+++

Prueba

Muy buena

Escherichia coli

Klebsiella sp.

Bacillus subtilis

+ + +
+ +
+ +

47
CUADRO VI.

Antibitico

PRINCIPALES ANTIBIOTICOS PRODUCIDOS POR


ACTINOMICETOS.

Microorganismo

Espectro

Productor

Antimicrobiano

Bacterias gram +
Bacterias gram Rickettsias

floramfenicol

Streptomyces Venezuelae

Tetraciclinas

Streptomyces Aureofaciens Bacterias gram +


Bacterias gram Rickettsias
Streptomyces Rimosus

Neomicinas

Eritromicina

Streptomyces Fradie

Bacterias gram +
Bacterias gram -

Streptomyces Erythreus

Bacterias gram +

Nistatina

Streptomyces Noursey

Hongos

A.nfotericina B

Streptomyces Nodosus

Hongos

48

2. Discusin de Resultados.
En la realizacin de este estudio se llev a cabo -una investigacin bibliogrfica para encontrar la metodologa
ms adecuada para llevar a cabo el aislamiento y comprobacin
del poder antagnico del Streptomyces griseus (actinomiceto e~
porulante) productor de la Estreptomicina.
Para cumplir con los objetivos de este trabajo se -llevaron a cabo en el laboratorio mtodos fisicoqumicos y microbiolgicos.
Encontrndose que para el aislamiento el mtodo de dilucin en placa en la cual se utiliza un medio selectivo - (AGA) que favorece la esporulacin es el adecuado, ya que permite conocer el nmero de colonias por gramo de suelo y selectivo para especies que esporulan abundantemente.

En cuanto a la comprobacin de su efecto antagnico


el mtodo de la estra cruzada de garr es uno de los mtodos
ms adecuados, ya que se obtienen resultados en corto tiempo y
de bajo costo. Permitiendo comprobar su efecto antagnico, - frente a varios microorganismos de prueba. Los resultados obt~
nidos en esta prueba fueron satisfactorios ya que se obtuvo -desde una buena inhibicin hasta una muy buena.

V I

e O N e L U S I O N E S Y R E e O ME N D A e I O N E S

49
1.

Del estudio llevado a cabo en las muestras de suelo de diversos lugares de la ciudad de Quertaro para llevar a cabo el aislamiento del Streptomyces griseus productor de la
estreptomicina, se obtuvieron resultados positivos en cuau
to a la presencia del Streptomyces griseus, pudindose a la vez demostrar su efecto antag6nico frente a los microoE
ganismos de prueba de acuerdo con los procedimientos fisico-qumicos y microbiol6gicos propuestos en este trabajo.

2.

Podemos decir que los objetivos de este estudio se cumpli~


ron; sin embargo se hacen algunas recomendaciones en cuanto al muestreo, como son el que las muestras de suelo sean
obtenidas tomando en cuenta aspectos como: la profundidad
a que deben obtenerse las muestras de suelo, a fin de

obt~

ner resultados positivos en las determinaciones fisicoqumicas entre las cuales la determinaci6n de humedad y PH
son factores importantes en el crecimiento y desarrollo
del Streptomyces griseus sin

~ejar

de tomar en cuenta

veg~

taci6n y materia orgnica.

3.

El aislamiento del Streptomyces griseus as como la comprQ


baci6n de su efecto antag6nico, deben realizarse en condiciones aspticas para asegurar buenos resultados evitndose as contaminaciones que podran modificar dichos resultados. Se recomienda q~eel material como medios de culti-

50

vo estn perfectamente estriles.


4.

Se puede concluir que para el aislamiento del Streptomyces


griseus el mtodo de dilucin en placa es el mtodo ms r~
comendable ya que permite conocer el nmero de colonias
por gramo y selectivo para especies que esporulan abundantemente.

5.

Para llevar a cabo el aislamiento del Streptomyces griseus


(actinomiceto esporulante) los medios selectivos son los ms recomendables ya que por medio de stos se obtiene el
microorganismo en forma de cultivo puro y especficos para
especies que se encuentran en bajo nmero.
En este caso el medio selectivo que se recomienda para el
aislamiento del Streptomyces griseus es el medio de Krain~
ky (AGA), obtenindose resultados favorables.

6.

Para comprobar el efecto antagnico del Streptomyces gri-seus el mtodo de la estra cruzada de Garr es el ms recomendable,ya que permite determinar el antagonismo del
Streptomyces griseus frente a varios microorganismos de
prueba puesto que se emplea un medio que favorece el cree~
miento del antagonista como de los microorganismos de pru~
ba en una sola determinacin, obtenindose resultaqos que
pueden ir desde la no inhibicin hasta una buy buena, la -

51
determinacin es rpida y de bajo costo para la industria
de los antibiticos.

52
1.

Pelczar M.J. Reid, R.D. Microbiologa 2a. Edicin, Me.


Gram Hill. Pag. 293, 296 - 301, 333 - 335 y 343.

2.

Centro Mdico "La Rasa", Hospital General, Servicio Infe.s,


cioso, Manual Sobre Antimicrobianos, Instituto Mexicano
del Seguro Social Mxico. Pag. 9- 12 y 81- 90 (1968).

3.

Dr. L. Jack Brashaw, Microbiologa de Laboratorio Edito-rial El Manual Moderno, S. A., Mxico. Pag. 47- 48, 220
y 231

4.

(1976).

Eric. E. Conn y P.K. Stumpf Bioqumica Fundamental, Edit2


rial Limusa Mxico. Pag. 513- 542 (1978).

S.

Alfredo Snchez Marroqun D. S. Principios de Microbiologa Industrial Editorial Qumica, S. A., Mxico. Pag. - 237- 241 y 257- 259 (1961).

6.

Kirk K. Othrner, Enciclopedia de Tecnologa Qumica Volu-men II, la Edicin Derechos reservados UTHEA. Pag. 481 503 y 449.

7.

B.D. Davis, R.D. Dulbecco H.E.N. Helsen, H.S. Ginsberg, W.B. Wood, Tratado de Microbiologa Editores Salvat, S.A.
Mallorca 43, Barcelona (Espaa). Pag. 308, 327, 331 y - 680 - 681.

(1977).

53
8.

Dr. Mario Rebolledo Lara, Teraputica Clnica, La Edi- cin Francisco Mencez Otero, Editor y Distribuidor. Pag.
79 - 85.

9.

Nason Biologa, Editorial Limusa Mxico. Pag. 257 - 258


y 263 - 270 (1978) .

10.

Labert Stryer, Bioqumica Editorial Revert Venezolana,


S.A., versin Espaola. Pag. 668 - 670 y 659 - 660.

11.

Dr. Alejandro Divo Microbiologa Mdica 2a. Edicin. -Pag. 37 - 43.

12.

Philip Hans Hiss, Jr. Hans Zinsser y Stanhope Bayne - JQ


nes, Antonio Bustos Capella, 4a. Edicin en espaol Editorial Hispano-Americana Mxico. Pag. 191- 193 (1971).

13.

Samuel Cate Prescott Se. D. Cecil Gordon Dunn PH. D. 2a.


Edicin Microbiologa Industrial. Pag. 783 - 813.

14.

A. Burges Biologa del Suelo Ediciones Omega, S. A.


Pag. 65 - 67.

15.

Thamane D. Motiramani y B. Bali, Roy L. Donahue, Edito-rial Diana, Mxico. Pag. 249 - 265 y 375 - 376.

16.

F. E. BEAR Los suelos en relacin con el Creciminto de


Cultivos Ediciones Omega, S. A. Pag. 101.

54
17.

Stainer Doudoroff Adelberg Microbiologa Ediciones Aguilar. Pag. 168, 711 - 714.

18.

Philip L. Carpenter Microbiologa. Pag. 246.

19.

Merck Mediciones de PH, Manual de Asesora Tcnica, M-xico No. 5.

20.

L.E. Casida Jr., Microbiology Industrial, PensylvaniaState, University. Pag. 248 - 252.

21.

Dr. Jos Beltrn Martnez, Anlisis Qumicos de los Suelos 2a. Edici6n, Editorial Omega, S. A., Barcelona.
Pag. 71 - 75 (1970) .

55

X O

METODOS DE PRUEBA PARA DETERMINACIONES FISICOQUIMICAS.

l.

Determinacin de la Humedad.

Objeto e importancia.- La humedad presente en el suelo es uno


de los factores importantes en el desarrollo y crecimiento del
Streptomyces griseus. La reduccin de humedad y el aumento de
temperatura estimula el crecimiento de los estreptomicetos del
suelo.
Determinacin: La determinacin de humedad en las muestras de
suelo se realizan mediante el mtodo gravimtrico, el cual
consiste en obtener una muestra hmeda secarla al horno entre
100 y ll0c hasta que no pierde ms agua, determinando el porcentaje de humedad del modo siguiente:
Prdida de Peso
Porcentaje de humedad

X 100
Peso secado al horno

Por lo comn el contenido de humedad de los suelos en niveles


diversos de humedad, se presenta sobrela base de peso de unsuelo secado al horno.

2.

Determinacin de PH.

Objeto e importancia.- La determinacin de PH en las muestras

56
de suelo empleadas para el aislamiento del Streptomyces gri- seus es otro de los factores que influyen de manera considerable en el crecimiento y desarrollo del Streptomyces griseus.
El PH debe oscilar entre 6.5 y 7.5 sto es de ligeramente cido a ligeramente alcalino.

Determinacin: Se lleva a cabo por el mtodo potenciomtrico ya que proporciona datos exactos, la medicin se realiza me- diante un potencimetro (con escala de PH) para calibrar se -utiliza una solucin buffer de PH 7 o lo ms cercano a la gama
en que se trabaje; hacer la determinacin, introduciendo

dire~

tamente los electrodos en la muestra respectiva, sea lquida o


pastosa. Al finalizar deben lavarse prolficamente los electro
dos con agua destilada.

Una vez obtenidas las muestras de suelo se preparan suspensiones de 1:10 de tierra y agua, y se procede a la determinacin
del PH.

57
A

METODOS DE PRUEBA PARA LAS DETERMINACIONES MICROBIOLOGICAS

l.

Aislamiento del Streptomyces griseus (Mtodo de dilucin en placa)

Medio de Cultivo.- Medio de Krainsky (Asparagina-Glucosa-Agar)


Medio selectivo, favorece la esporulacin del Streptomyces gri
seus.
a) Composicin del medio.

Asparagina----------------O.Sgr/lt.
K HPO
2

Estracto de

----------------0.5
C~rne----------2.0

Bacto - Agar --------------20


Glucosa

--------------10

Agua Destilada ------------1000 ml.


PH

6.8 - 7.0

despus de la esterilizacin

Procedimiento.- Determinacin de la humedad al suelo, secando


lO gr. hasta peso constante, la cual es previamente tamizada.

frascos de dilucin, para preparar estas diluciones se prepara una solucin Ringer cuya composicin es la siguiente 8.5 a 9 gr. de NaCl/lt.

b) Colocar un ml. de cada dilucin en cajas petri previamente


esterilizadas, agregar aproximadamente 20 ml. del medio homogeneizar dejar solidificar e incubar 5 das a temperatura
ambiente.

Observaciones.- Las colonias del Streptomyces griseus presen-tan un aspecto pulvurento algodonoso de color blanco, se en- cuentran formando masas de filamentos ramificados los cuales se adhieren fuertemente al substrato, las colonias maduras

pr~

sentan centro obscuro. Las hifas tienen un dimetro de lu y se


ramifican en forma monopodial. Las hifas frtiles, conidiofo-ros llevan en su extremidad una cadena de conidios, los cuales
tienen una longitud variable entre 0.8 y l.Bu, tambin vara su forma pudiendo ser esfricos o cilndricos, elipsoidales o
en forma de rin.

2.

Determinacin del antagonismo biolgico del Streptomyces griseus.

El mtodo utilizado para la determinacin del antagonismo biolgico del Streptomyces griseus es mediante el mtodo de la es
tra cruzada de Garr.

Mtodo de la Estra Cruzada de Garr.


Consiste en sembrar el antagonista en una estra recta en la placa que contiene el medio favorable para el desarrollo tanto

59

para el antagonista como el microorganismo de prueba. Despus


de sembrado el antagonista se incuba a una temperatura de 36C
durante 24 hs., suficiente para la difusin del principio acti
va en el medio. Posteriormente se siembran las bacterias de -prueba intersectando en ngulo recto con la estra de desarrollo del antagonista se incuba nuevamente a 36C y se hace la lectura correspondiente a las 48 hs.

a) Una vez aislado el Streptomyces griseus (microorganismo antagonista)en forma de cultivo puro, se ensaya la actividad
antibitica por el mtodo de estra cruzada de Garr. El -Streptomyces griseus se extiende pr~mero, en estra recta en un medio de gelosa-tripticasa (Medio slido) y se incuba
hasta que se ha obtenido un buen desarrollo de colonias (de
tres a cinco das a 28C.

Composicin del medio.15 gr.

Tripticasa
Fitona

Na Cl

15

Agar

"

5 - 7% de sangre humana.
Agua destilada
PH final

7.3

1000 ml.'

60
b) Posteriormente se siembran los microorganismos de prueba iQ
tersectando en ngulo recto con la estra de desarrollo del
antagonista; se incuban nuevamente durante 24 hs. a 36C y
se hace la lectura correspondiente.

Observaciones.- Los resultados obtenidos fueron positivos ya que se tuvo inhibicin que fue desde buena hasta muy buena.

3. Aislamiento de microorganismos de prueba en forma de cultivos puros.


a) El microorganismo de prueba es el Staphilococcus Aureus.

Medio de Cultivo.- (Agar para Estaphilococcus No. 110).

a) Composicin del Medio.

Extracto de levadura --2.5

gr/lt

Peptona de Casena ----10.0


Gelatina --------------30.0
Lactosa --------------- 2.0
D - Manitol -----------10.0
Cloruro de Sodio ------75.0
Fosfato de Dipotsico-- 5.0
Agar ------------------15.0
Agua destilada --------1000 ml.
PH

final 7.0 - 0.2

"

61
Procedimientos.-

a) Tomar la muestra de Exudado Farngeo mediante aplicador de


algodn previamente esterilizado.

b) Tomada la muestra con el aplicador se introduce en un tubo


de ensaye conteniendo S c.c. de Agar-Infusin-cerebro-corazn, inclinado, rayando con suavidad la superficie del - - Agar, que favorece el crecimiento de toda clase de microorganismos, ya sea gram-positivos y gram-negativos. Se tapa el tubo con algodn y capuchn de papel incubando a 36C

d~

rante 24 hs.

e) Desarrolladas las colonias, se toman stas mediante una aza


de platino y se siembran las cajas por el mtodo de estra,
conteniendo medio selectivo para el desarrollo de Staphilococcus Aureus, es posible enriquecer el medio agregando 5%
de sangre con lo que se obtienen buenas reacciones de hemlisis y formacin de pigmento amarillo dorado. Las cajas
con el medio se incuban a 36C durante 48 hs.

d) Aparecidas las colonias de StaphiloGoccus Aureus las cuales


se caracterizan por ser

amar~lo

doradas observndose zonas

de hemlisis al rededor de las colonias se prepara una suspensin de estas colonias en solucin salina (solucin de cloruro de sodio al

0.~/c

en agua destilada).

62
e) Antes de preparar la suspensin se lleva a cabo la prueba
de la coagulaza colocando S ml de plasma citratado inoculado con S. Aureus incubando a 36C de 2-3 hs observndose coagulacin del plasma obtenindose S. Aureus patgeno.

B) Microorganismo de prueba E. Coli.

Medio de Cultivo.- (Agar de eosina y Azul de metileno).

a) Composicin del Medio.

Petona de Gelatina --------------- 10.0


Lactosa

s.oo

Sacarosa

5.0

Fosfato dipotsico ---------------

2.0

gr/lt

Agar ----------------------------- 13.5


Eosina ---------------------------

0.4

Azul de Metileno -----------------

0.065

Agua destilada -------------------

1000

PH

"
ml

final 7.2: 0.2

Procedimiento.-

a) Para el aislamiento de E. Coli se emple una muestra de excremento recogida en frasco estril.

b) Obtenida la muestra se prepara una suspensin de 1:10 de ex

63
cremento y agua y mediante una aza de platino se siembra
por el mtodo de estra en las cajas conteniendo el medio para el desarrollo de E. Coli la incubacin es a 36C duraQ
te 48 hs.

e) Una vez desarrolladas las colonias se procede a la identifi


cacin, las colonias presentan un color azul obscuro con -brillo metlico y centro negro azulado.

d) Obtenidas las colonias se prepara una suspensin en solu- cin salina (solucin de cloruro de sodio al 0.9% en agua destilada).

C) Microorganismo de Prueba Klebsiella sp.

Medio de Cultivo.- (Agar de eosina y azul de metileno).


a) Composicin del Medio.

Peptona de Gelatina ------------- 10.0 gr/lt


Lactosa -------------------------

5.0

"

Sacarosa ------------------------

5.0

Fosfato dipotsico --------------

2.0

"

Agar ---------------------------- 13.5

"

Eosina --------------------------

0.4

"

Azul de Metileno ----------------

0.065 "

Agua destilada ------------------

1000 ml

64

PH

final

7.2 + 0.2

Procedimiento.-

a) Tomar la muestra de Exudado Faringeo mediante aplicador dealgodn previamente esterilizado.

b) Tomando la muestra con el aplicador se introduce en un tubo


conteniendo S c.c. de Agar-infusin-cerebro-corazn inclin~
do rayando con suavidad la superficie del Agar, que favorece el crecimiento de toda clase de microorganismos, ya sea
gram-positivos y gram-negativos, tapando el tubo con algo-dn y capuchn de papel incubando a 36C durante 24 hs.

e)

Desarrolladas las colonias, se toman estas mediante una aza


estril y se siembran en las cajas mediante estras desli-zndola suavemente sobre el medio selectivo para el desarrQ
llo de Klebsiella las cajas se incuban a 36C durante 48hs.

d) Aparecidas las colonias se caracterizan por ser mucoides y


con centro pardo grisceo y de mayor tamao que la E. Coli,
se prepara una suspensin de estas colonias en solucin salina (solucin de Cloruro de sodio al 0.9% en agua destilada).

D) Microorganismos de Prueba Basillus Subtilis.

65
Medio de Cultivo.- (Agar -Almidn).

a) Composicin del Medio.

Estracto de Res

------------- 3.0

gr/lt

Peptona

------------- 5.0

"

Agar

-------------15.0

"

Agua destilada

-------------1000 ml

Almidn soluble

------------- 2.0

gr/lt

Procedimiento.-

a) Se aisl el bacilo subtilis de una muestra de suelo, en la


cual se comprob la presencia de el bacilo subtilis.
b) Se prepar una suspensin de 1:10.

e) Mediante una aza de platino se inocula un tubo de agar nu-triente inclinado rayando suavemente la superficie del agar
el cual se incuba a 36C durante 48 hs.

d) Aparecidas stas se siembran en cajas estriles conteniendo


Agar-Almidn en forma de estra, se incuba a 36C durante -

48 hs.

e) Determinada la incubacin se bafia con una solucin'de Yodogram y se produce un color azul obscuro.

66
Yodo - Gram
Yodo, Q. P.

1.0 gr.

Yoduro de potasio ---

2.0 gr.

Agua destilada ------

300 ml.

f) Las colonias del Bacilo Subtilis producen una enzima que


lleva a cabo la hidrlisis del almidn hidrolizndolo en
maltosa y glucosa.

g) La reaccin hidroltica tpica del almidn con resultados positivos con bacilo subtilis, la carencia total del almi-dn se caracteriza por la carencia de un fondo azul obscuro
al rededor de la colonia, las cuales presentan un color am~
rillo. Se prepara una suspensin de estas colonias en solucin salina (solucin de Cloruro de sodio al 0.9% en agua destilada)

Das könnte Ihnen auch gefallen