Prctica No.

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Determinacin de la enzima sacarasa

Determinacin de la enzima Sacarasa

Objetivo
Observar la accin cataltica de la enzima Sacarasa sobre su sustrato especfico
que es la sacarosa.
Fundamento
La sacarasa rompe enlaces ( 1 - 2 ) de la sacarosa dando como productos
glucosa ms fructosa (azucares reductores que al hacer contacto con el reactivo
de Benedict reducen el Cu++ a Cu+ y ellas se oxidan produciendo as cido
aldnicos o urnicos.
Introduccin
Azucares Reductores y no reductores
Los azcares se clasifican en dos grupos: los reductores y los no reductores. Los
reductores se distinguen debido a que poseen la propiedad de reducir fcilmente
las soluciones alcalinas de muchas sales metlicas, tales como las de cobre,
plata, bismuto, mercurio y hierro.
Estos contiene grupos funcionales alcohol y carbonilo. Se describen en funcin del
nmero de carbonos y de la clase de grupo carbonilo que contienen. Los azucares
que poseen un grupo aldehdo se denominan aldosas, y aquellos que poseen un
grupo cetona se denominan cetosas.
Los azucares son las unidades bsicas de los hidratos de carbono, que van desde
los azucares sencillos o monosacridos a los polisacridos, polmeros que
contienen miles de unidades azcar. Los disacridos son azucares formados por
la unin de dos monosacridos mediante el enlace glucosidico, si este enlace se

efecta entre dos carbonos anomericos, el disacrido no tendr el potencial

aldehdo

o cetona libre, por lo tanto no darn positivo aquellas pruebas que

involucren la participacin de estos grupos, recibiendo el nombre de no

reductores.
Los carbohidratos que reducen el reactivo de Benedict se conocen como azucares
reductores. Esta reaccin es especfica para azucares con grupos reductores
libres. Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre. Esta prueba se
basa en la capacidad de carbohidrato de reducir el Cu+2 en un medio alcalino a
Cu+ para que este se oxide y se precipite a Cu2O dando la coloracin rojo ladrillo.
Enzima Sacarasa
La sacarosa (Azcar comn de mesa: azcar de caa o azcar de remolacha) se
produce en las hojas y races de las plantas.
La Beta fructofuranosidasa (invertasa, sacarasa). Enzima clasificada como EC
3.2.1.26, hidroliza oligosacidos, como la sacarosa y la rafinosa, se encuentra en
el jugo intestinal y sirve para metabolizar la sacarosa.
Como la sacarosa no es un azcar reductor, podemos detectar la actividad de la
sacarasa por transformacin de azucares reductores. sta hidroliza a la sacarosa
por escisin en sus constituyentes glucosa y fructosa. Actualmente, se entiende
generalmente por "Sacarasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras
(Sacaromyces

cerevisiae),

mientras

que

la

alfa-glucosidasa

constituye

preferentemente las sacarasas intestinales.

La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa puede ser realizada por dos
enzimas: La Beta fructofuranosidasa que acta sobre el extremo fructosa de la
molcula de sacarosa, y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la

glucosa.

La actividad enzimtica de la sacarasa depende del pH, siendo su ptimo de 4,5 a

5,0, y de la temperatura que puede variar de 25 C a 55 C.
El dficit de la sacarasa produce en los infantes trastornos de la absorcin de los
azcares particularmente la sacarosa. Casi todos los casos de la falta de invertasa
(sacarasa) publicados por (Rosenthal y col. 1962), iban acompaados de dficit de
isomaltasa.

Esta invariable asociacin entre dficit de sacarasa y dficit de

isomaltasa dio mucho que pensar, podra deberse probablemente, a yuxtaposicin

de los genes reguladores, o a que se compartieran genes reguladores u
operadores.
Esta enzima tiene gran aplicacin en la industria alimenticia ya que se usa para
fabricar alimentos azucarados debido a que se basa en la transformacin lenta y
parcial de la sacarosa en azcar invertido que tiene mayor poder edulcorante,
mayor carcter humectante, mayor solubilidad y, por lo tanto, menor tendencia a
cristalizar

endurecer.

De

esta

manera,

acta

como

un

agente

de

reblandecimiento en alimentos azucarados con tendencia a cristalizar la sacarosa

y evaporar agua, lo que afecta su aspecto y consistencia.

Material

Reactivo

1 mortero

Levadura

2 pipetas de 5 ml.

Arena

1 pizeta

ter

1 filtro

Agua destilada

1 embudo de filtracin rpida

Sacarosa al 1 %

6 tubos de ensayo

Almidn al 1 %

1 termmetro

Buffer de fosfato pH 5.8

Reactivo de Benedict

Metodologa
Extraccin de la sacarasa
Obtngase a partir de la levadura, moliendo un pedazo de levadura de pan, fresca
y comprimida, en un mortero junto con 5 gr. de arena y 10 ml. de ter; mientras se
hace la trituracin se le va aadiendo agua en porciones de 2 ml. hasta completar
30 ml. Esta trituracin y adicin de ter se hace con el objeto de destruir las
clulas de levadura para que queden en solucin las enzimas que contienen, entre
las que se encuentran la sacarasa. Djese reposar hasta que se haya
sedimentado bien la arena y fltrese.

Preprese 6 tubos de ensayo como sigue:

a) A 2 tubos de ensaye se le agregan 3 ml. de extracto enzimtico (sacarasa)

ms 3 ml. de agua y 1 ml. de Buffer de fosfatos pH 5.8.
b) A otros dos tubos se le introduce 3 ml de extracto enzimtico ms de 3 de
sacarosa al 1 % y 1 ml de Buffer de fosfatos.
c) Y en 2 tubos se le introducen 3 ml de extracto enzimtico ms 3 ml de
almidn al 1 % Y 1 ml de Buffer fosfatos

Mezclar los tubos perfectamente y se dejan reposar por 30 minutos a temperatura

ambiente y al trmino de este periodo se hace la reaccin de Benedict al
contenido de cada tubo. Los primeros tubos se emplean como testigo para ver si
la levadura o alguno de los reactivos tienen propiedades reductoras que pudieran
luego atribuirse a la sacarosa. Obsrvense los resultados y vase si la levadura
tena sacarasa y amilasa; si las enzimas son especficas o si carecan de toda
actividad.
Resultados

Tubo
Control 1 Sacarosa
Control 1 Glucosa

Color
Azul
Rojo intenso

Reaccin
Negativo
Positivo

H2o 2
H2o 2.2
Sacarasa 2
Sacarasa 2.2
Almidon 2
Almidon 2.2

Azul
Azul
Vede
Verde
Azul
Azul

Negativo
Negativo
Positivo
Positivo
Negativo
Negativo

Conclusin
La reaccin de Benedict es especfica para azucares con grupo reductor libre
(C=O). Los disacridos tienen grupo reductor libre, pero la sacarosa no, es por eso
que nos dio negativo al hacer la prueba de los controles, ya que en su estructura
qumica los radicales libres estn ocupados uniendo a las dos molculas, y por lo
tanto no tiene electrones para donar. Por ello, al agregar la enzima sacarasa en el
tubo, esta hizo que se hidrolizara la molcula obteniendo as fructosa y glucosa,
las cuales si son azucares reductores, por lo que la reaccin positiva fue evidente
tornndose un color verdoso en lugar del azul.

Cuestionario
1. Describa la oxidacin de los carbohidratos y productos que se forman
La oxidacin de los carbohidratos implica la puesta en marcha de diferentes
reacciones qumicas que completan el proceso de gluclisis, el ciclo de Krebs y la
cadena transportadora de electrones o cadena respiratoria mitocondrial.
Los cidos aldnicos son obtenidos por la oxidacin del grupo funcional aldehdo
de una aldosa para formar un grupo funcional carboxilo. Mientras que la oxidacin
biolgica del CH2OH terminal de los azcares produce cidos urnicos

2. Describir la enzima sacarasa.

Sacarasa o tambin llamada invertasa es una enzima que hidroliza a la sacarosa
por escisin en sus constituyentes glucosa y fructosa. La podemos encontrar en
clulas de la levadura, y en las vellosidades intestinales

3. Una lista de azcares reductores y no reductores.

Azcar no reductor

Azcar reductor

Almidn

Glucosa

Celulosa

Fructosa

Glucgeno

Maltosa
Xilosa
Lactosa

4. Carta de colores de azucares reductores en reaccin del reactivo

Benedict
Azcar Reductor

Azcar no Reductor

Molcula Hidrolizada

Glucosa
Fructosa
Maltosa
Xilosa
Lactosa

Almidn
Celulosa
Glucgeno
Sacarosa

Sacarosa

Bibliografa

1. Trudy, Mckee. 2003. Bioqumica. La base molecular de la vida. Tercera

edicin. The McGraw-Hill. Espaa.
2. Lehninger. AL. Nelson, Dl. Principios de bioqumica. Cuarta edicin.
Barcelona. Ediciones Ortega. 2005.
3. Mathews CK, Van Holde KE. Bioqumica. Tercera edicin. McGraw-Hill.

Espaa.