UNIVERSIDAD DE LAS AMRICAS

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA

INFORME II DE CLNICA DE ANIMALES MAYORES

(REA DE EQUINO)

TEMA: TERAPIA REGENERATIVA DE TENDONES CON CLULAS MADRES

PROVENIENTE DEL TEJIDO ADIPOSO EN EQUINOS.

PROFESOR: MD. VET. RODRIGO SUAREZ

VICTORIA MENDEZ BUSTOS

CONCEPCION CHILE
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2016
NDICE DE CONTENIDO:

Pg.

1. Introduccin. ........................................................................................................... 3
2. Clulas madres...........................................................................................................4
3. Tipos de clulas madres.....4
4. Que hacen las clulas madres.....5
5. Estudios y veterinarios pioneros en clulas madres en medicina equina................. 5
6. Tratamiento de lesiones tendinosas .........................................................................6
7. Momento ideal para uso de clulas madres de origen adiposo..................................7
8. Ventajas de tejido adiposo.........................................................................................7
9. Extraccin y procesamiento de clulas madres provenientes de tejido adiposo...... 7
10. Cultivo de clulas madres. ................................................................................... 10
11. Implante intralesional........................................................................................... 10
12 Discusin y conclusin....12
13. Bibliografa.........14
14. Archivos electrnicos.....14

1-INTRODUCCION:
En la ltima dcada, las clulas madre mesenquimales (MSC) han recibido mucha atencin
dentro de la medicina veterinaria equina. El primer uso teraputico de MSC en equinos se
inform en 2003. Desde entonces, la aplicacin clnica de MSC ha sido una explosin de
miles de caballos que han sido tratados en todo el mundo. En la actualidad, MSCs se
utiliza principalmente en la medicina veterinaria para el tratamiento de enfermedades
musculoesqueltico en base a su capacidad de diferenciarse en diversos tejidos de origen
mesodrmico. El considerable potencial teraputico de las MSCs en medicina regenerativa
de equinos se basada tanto en la simplicidad de su aislamiento y su capacidad para
promover la regeneracin de los tejidos, como tambin en su capacidad de evitar la
formacin de cicatriz patolgica o exagerada mediante la modulacin de la respuestas
inmunes, y la regulacin de la respuesta inflamatoria. El caballo deportivo es un atleta de
alto rendimiento y posee exigencias que superan la de un caballo de paseo. El uso diario
con repetidos micro-traumas; las exigencias mximas y las fuerzas anormales (mala
conformacin o incorrecto herraje) desequilibran el ciclo fisiolgico de desgaste
reparacin. Por lo tanto es primordial tener en cuenta que; si no se corrigen los factores que
dieron origen a la lesin, sta volver a ocurrir. Junto con cualquier tratamiento
regenerativo es necesario controlar conformacin, herraje, superficie de trabajo, plan de
entrenamiento y rehabilitacin kinesiolgica, intensidad de entrenamiento, entre otras.
El objetivo en equinos es cambiar el destino de una herida llevndola de la reparacin y
formacin de una cicatriz a la regeneracin del tejido y de su funcin original. Las clulas
madre pueden regenerar muy bien las fracturas, pero esto no es novedoso ya que el hueso
por s solo es un tejido con gran capacidad de regenerar. Las lesiones de eleccin en
equinos resultan ser entonces las tendinopatas y desmopatas ya que en estos tejidos se
produce reparacin y formacin de una cicatriz siendo as difcil recuperar un tendn fuerte
y elstico que permita la vuelta a la competencia.
Un ejemplo de lo anterior son las tendinitis del flexor digital superficial. La que ocurre en
un 8-30% de los Fina Sangre de Carrera. Las recidivas de este tipo de lesiones al retornar al

entrenamiento es muy alta: 43-93% De acuerdo con estudios, las clulas madre logran
mejorar la regeneracin del tendn.
2-QUE SON LAS CLULAS MADRES:
Una clula madre es aquella clula que tiene la capacidad de dividirse por perodos
indefinidos de tiempo, y que bajo las condiciones adecuadas o dadas las seales correctas,
puede dar origen a los diferentes tipos celulares que componen el organismo. Las clulas
progenitoras o clulas madre (Stem cells) son clulas naturales regenerativas del cuerpo.
3-TIPOS DE CLULAS MADRES:
Clulas madre embrionrias.
Clulas madre del tejido adulto:
-Clulas progenitoras hematopoyticas.
-Clulas progenitoras mesenquimales.
Las clulas embrinicas (ESCs) pueden ser recuperadas de fetos o de embriones. Estas
clulas son pluripotentes y tienen la habilidad intrnseca de formar cualquier tipo de tejido.
El uso potencial de ESCs para enfermedades y lesiones es enorme. Sin embargo, la
investigacin ha estado restringida debido a problemas polticos, ticos y religiosos.
Las clulas hematopoyticas progenitoras (HSCs) pueden obtenerse de la mdula sea y
de la sangre del cordn umbilical. Son multipotentes por lo que nada ms pueden regenerar
cierto tipo de clulas sanguneas.
Las clulas mesenquimales (MSCs) se encuentran en tejido adiposo, mdula sea, sangre
del cordn umbilica y otros tejidos. Estas clulas son multipotenciales porque adems de
replicarse por s solas son capaces de diferenciarse en osteoblastos, condorcitos, tenocitos,
fibroblastos, adipositos y miofibroblastos. Adems no solo se desarrollan durante el periodo
embrionario sino que son capaces de regenerar tejidos esquelticos durante la vida adulta
por lo que su utilizacin es de gran utilidad para reparar lesiones en este tejido. Las clulas
mesenquimales inyectadas en el sitio de la lesin pueden diferenciarse en fibroblastos
maduros del tendn (o ligamento) bajo la influencia de seales del tejido daado y producir
productos de matriz apropiada.
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4- QU HACEN LAS CLULAS MADRES:

Regeneracin de los tejidos lesionados, creando una reparacin de mayor calidad, con un
tejido ms cercano al original, lo que en lesiones de ligamentos y tendones se traduce en
una reduccin del 50% del riesgo de recada. Reparacin de las lesiones ms rpida.
Reparacin de pequeas microlesiones, evitando la rotura completa. Efecto
antiinflamatorio. Efecto inmunodulador. No considerado Dopping
5-ESTUDIOS Y VETRINARIOS PIONEROS EN CLULAS MADRES EN
MEDICINA EQUINA
En equinos, el pionero en medicina regenerativa con clulas madres fue el Dr. Doug
Hertel (DVM) Alamo Pintado- California. Hertel aspir mdula sea del esternn de 100
caballos y la inyect en lesiones de ligamentos suspensorios, obteniendo buenos
resultados. La desventaja de esta tcnica es que hay pocas clulas madre mesenquimales,
pero es muy rica en factores de crecimiento. No produce efectos adversos, pero se
requieren inyectar grandes volmenes de mdula sea, 20-30 ml, que causan dao
mecnico por aumento de la presin. Por otra parte, los altos niveles de TGF-1
(transforming growth factor) producen excesiva cantidad de tejido cicatrizar.
Para superar estas desventajas se decidi cultivar la mdula sea para amplificar el
nmero de clulas madre (ya que solo hay 1 en 100.000). sta tcnica de amplificacin en
cultivo permite aumentar el nmero de clulas madre que se van a inyectar, pero para ello
es necesario que se cultiven entre 21 - 28 das, lo que hace a sta tcnica ms costosa y no
se puede utilizar en urgencias.
En el 2002 Robert Harman (California) comienzan a tratar lesiones en equinos con
clulas madre de tejido adiposo. Se obtiene un concentrado de clulas madre a partir de
tejido adiposo subcutneo equino. Hay gran cantidad de clulas madre en el tejido adiposo:
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1 de cada 50 clulas (2%). No se requiere cultivarlas para expandirlas, porque hay

suficientes clulas en la muestra para poder ser implantadas hasta en el mismo da

6-TRATAMIENTO DE LESIONES TENDINOSAS:

Los tendones son los tejidos que unen los msculos y los huesos y que estabilizan las
articulaciones. En el caballo, cuyas extremidades delanteras son ms alargadas, los
tendones adquieren grandes dimensiones, como ocurre en el caso del tendn flexor digital
superficial (SDFT) y del tendn flexor digital profundo (DDFT) . Estos tendones estn
localizados en los extremos de las patas y estn expuestos a un peso muy elevado. Cuando
el caballo galopa absorben y liberan gran cantidad de energa elstica para llevar a cabo el
movimiento, llevando el esfuerzo que realiza el tendn al lmite . Como consecuencia de la
tensin a la que se ve sometido el tendn cuando el animal est realizando esta actividad,
pueden aparecer sobrecargas en el tejido o tendinitis, alterando la funcin de elasticidad que
es crtica para la resistencia y velocidad del caballo . El tendn ms afectado por este
fenmeno en caballos es el SDFT. A nivel molecular, antes de que se produzca la lesin
existe una fase previa de degeneracin del tendn durante la cual se debilita, de forma que
la prctica habitual del ejercicio empuja al tendn a trabajar ms all de su lmite
provocando el dao.
Lesin de Tendones: Las lesiones en los tendones suponen, generalmente, un compromiso
para el regreso del animal a la vida deportiva al mismo nivel. Esto es debido a que el tejido
cicatrizal que se forma es menos funcional, lo que conlleva una reduccin de las
prestaciones deportivas y un alto riesgo de recada. El porcentaje de recadas en caballos de
carreras tratados con Clulas Madre, en lesiones de tendn flexor superficial y realizando
la misma actividad deportiva, es del 28,9%, mientras que en animales no tratados con este
mtodo, el porcentaje de relesin asciende al 56%.

7-MOMENTO IDEAL PARA EL USO DE CLULAS MADRES DE ORIGEN

ADIPOSO (adsc).
El momento ideal para el uso de clulas madre en una lesin tendinosa se ha descrito que
debiese realizarse despus de la etapa inflamatoria y antes de la de remodelacin. Entre los
7 y 28 das post lesin (etapa regenerativa), antes que el organismo apague las seales y
comience a formar una cicatriz. Si se implantan una buena cantidad de clulas, stas,
atraern otras, modulan la reparacin e inflamacin, formando neovascularizacin y tejido
tendinoso nuevo. Los tratamientos convencionales para tendinitis, apuntan a mejorar la
reparacin: desde el reposo (6 a 15 meses); ejercicio controlado, fro, antiinflamatorios,
fisioterapia, splitting, desmotoma del ligamento frenador distal, custicos, etc.
El implante intralesional de clulas madre apunta a la regeneracin, no solo a la
reparacin. Es decir, lograr tejido con la misma estructura y funcin del tejido original.
8-VENTAJAS DEL TEJIDO ADIPOSO:

Gran nmero de clulas madres.

Son muy accesibles en grandes cantidades con una mnima morbilidad.

La muestra es fcil de extraer

No es un tejido imprescindible para el animal.

Se implantan en su estado natural dentro del tejido daado para regenerarlo.

Estas clulas tienen pocas barreras prcticas, ticas e inmunolgicas para su

aplicacin clnica.

9-EXTRACCIN Y PROCESAMIENTO DE CLULAS MADRE PROVENIENTES

DE TEJIDO ADIPOSO.
Previo a la realizacin de este procedimiento, el equino debe ser sedado. La extraccin de
tejido adiposo puede realizarse en la regin dorsal a los msculos glteos o en la base de la
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cola. Esta zona debe ser preparada aspticamente, la piel y tejido subcutneo deben ser
insensibilizados con la aplicacin de lidocana al 2%. Es preferible realizar este
procedimiento en esta regin, debido a la ausencia de grandes vasos sanguneos y el fcil
acceso.
Al animal se proceda con una dosis de 1.1 mg/kg de xilazina IV, luego de esto se depila la
zona abaxial proximal de la base de la cola y desinfect preliminarmente para realizar la
desensibilizacin de la regin, para esto se utiliz un bloqueo en L invertido con lidocana
al 2%. Posterior al bloqueo se prepara quirrgicamente la zona con alcohol-yodo. Se
utilizar un campo estril con ventana en el sitio de la incisin, adems de guantes estriles,
gorro y bozal de ciruga. La incisin se realiz en piel y es de aproximadamente de 7 cm. de
largo, al llegar al tejido subcutneo se hace diseccin roma con unas tijeras Metzembaum
para extraer de este manera de 5 a 15 gramos de tejido adiposo.

La tcnica de aislamiento de las clulas madre provenientes de tejido adiposo en equinos se

basa en el protocolo usado en seres humanos; el tejido adiposo es macerado con una hoja de
bistur, luego es lavado y agitado suavemente con una fraccin de solucin buffer fosfato
salino (PBS) para promover la separacin en dos fases: la parte superior, consistente en el
tejido adiposo macerado y lavado y el infra nadante que corresponde a clulas
hematopoyticas suspendidas en PBS. Esta fraccin se elimina. El tejido adiposo (5 ml) es
digerido en el mismo volumen de solucin tampn PBS que contiene un 1% de albmina
8

srica bovina y 0,1 % de colagenasa tipo I. Se somete a agitacin continua por 50 minutos a
37 C Se extrae el pellet resultante y se somete a la centrfuga a 260g por 5 minutos. Para
completar la separacin de las clulas estromales de los adipocitos primarios, la muestra se
agita vigorosamente y se centrifuga nuevamente a 260g por 5 minutos. Como resultado, se
obtiene un pellet que corresponde a la fraccin vascular- estromal que contiene la porcin
de clulas madre de tejido adiposo. El sobrenadante (compuesto de grasa, adipocitos
primarios y solucin de colagenasa) se retira. La fraccin vascular-estromal puede ser
implantada directamente o ser suspendida nuevamente en medio de cultivo (10 ml de
Dulbeccos Eagle modificado - DMEM). Para determinacin de la viabilidad celular, una
pequea alcuota de la suspensin de las clulas se centrifuga y el pellet se 15 suspende en
un volumen igual de solucin buffer. Posterior a esto se realiza la tincin con azul tripano
de esta solucin. Este colorante penetra la membrana de las clulas muertas, de esta forma
se identifica cules son las clulas viables. Esta tcnica es prctica y sencilla. El conteo las
clulas viables se realiza mediante el uso de un Hemocitmetro.

10-CULTIVO DE CLULAS MADRE:

Las clulas nucleadas de la fraccin vascular-estromal son cultivadas con el propsito de
aumentar la cantidad de stas y de estimularlas para que expresen factores de crecimiento
que participan en la regeneracin del tejido en el cual sern implantadas. Se siembran en un
medio de cultivo estromal a una densidad de 5.000 clulas nucleadas por centmetro
cuadrado en frascos de cultivo indican que el cultivo se realiza a una densidad de 105
clulas/cm2 en placas de cultivo de 25 cm2. Estas placas son incubadas a 37 C bajo 5% de
CO2, en el medio de cultivo DMEM, que contiene 10% de suero fetal bovino. Este medio
es cambiado cada tres das. Cuando las clulas existentes en la placa ocupan un 70% a 80%
de sta, se realiza la tripsinizacin y el conteo. El nmero de clulas madre extradas de
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tejido adiposo viables luego del cultivo celular vara entre 9.1 x 106 y 17.8 x 106 clulas en
el primer pasaje y entre 10.2 x 106 y 52.9 x 106 clulas en el segundo pasaje.
Posteriormente, las clulas son diluidas en 0,5 ml de suero autlogo y se colocan
rpidamente en recipientes que contengan hielo para su uso inmediato en el equino.
11-IMPLANTE INTRALESIONAL:
Bajo sedacin y con anestesia local, se realiza tricotoma del sitio de inyeccin y con gua
ecogrfica y aguja, se han colocado en forma intralesional estos dos tipos de extractos
celulares. Se han utilizado adems antiinflamatorios no esteroides, hielo, vendaje
compresivo y DMSO que se describe empricamente que no daan a las clulas y reducen
el edema. Se dice adems que no es conveniente suministrar corticoesteroides porque
retardaran la cicatrizacin. Las clulas madre se ha descrito que pueden ser inyectadas en
forma endovenosa y migraran al sitio lesionado, ya que son atradas por las seales que
emite la inflamacin o dao.
En el caso de los tendones, el tejido es poco vascularizado por lo que esta caracterstica de
bsqueda y migracin a tejido afectado, no se aplica. Para superar este inconveniente es que
se implantan en forma intralesional las clulas en lugar de inyectarlas endovenosas y que
migren solas. Se describe que estas MSC se suspenden en suero autlogo para su inyeccin,
lo que suma ms variable de al analizar el contenido de factores moduladores del
crecimiento e inflamacin presentes en ese suero.

Inoculacin de clulas madres en la lesin.

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12-DISCUSIN Y CONCLUSIN:
Las terapias actuales de inoculacin de clulas madres que se est llevando a cabo estn
obteniendo resultados positivos en modelos animales. El objetivo es que tendn recobre la
fuerza y elasticidad que posea antes de que apareciera la lesin. La proliferacin de
tenocitos en el tendn, y de la sntesis de colgeno tipo I y proteoglicanos, han
incrementado la fuerza de traccin biomecnica del tendn semanas despus de la
administracin. Tras los tratamientos no se observaron reacciones adversas ni formacin de
tumores. La eficacia de este tratamiento qued demostrada en el seguimiento realizado tras
la administracin de las clulas, que mostr que el 98,2% de caballos de carreras con
lesiones en el SDFT volvieron a competir con un bajo ndice de recada en la lesin
(27,4%) En ensayos clnicos controlados, las BM-MSCs se han convertido en las clulas
ms utilizadas para investigar el uso de la terapia celular en lesiones en el SDFT. Estas
clulas han sido administradas en suspensin con distintos factores como fibringeno o
suero autlogo. Los resultados obtenidos en estos ensayos muestran una mejora ecogrfica
en la alineacin de las fibras en el tendn respecto a los controles y cambios significativos
en la histologa de los tejidos tratados, sin embargo no se observan diferencias
significativas en la expresin de genes relacionados con el metabolismo del tendn La
terapia celular es de suma importancia para el tratamiento de lesiones en caballos que de
otra manera tienen un mal pronstico de recuperacin. Pero de igual importancia es
determinar la naturaleza y el fenotipo de las clulas que se estn utilizando en la terapia: es
fundamental conocer sus caractersticas moleculares para comprender cmo actan durante
los procesos de reparacin y de esa forma potenciarlas para conseguir resultados clnicos
favorables
El tratamiento de tendinitis y desmitis con clulas madre extradas de tejido adiposo
produce tejido ms organizado, mayor proporcin de colgeno tipo I, confiere mayor
resistencia al tendn (ligamento), lo cual disminuye la ocurrencia de recidivas.
Las lesiones en tendones y ligamentos tratadas con clulas madre extradas de tejido
adiposo, producen menor infiltrado inflamatorio que las lesiones no tratadas con este
tratamiento; adems de retorno deportivo que va entre un 60% y 85,9% versus un 40% a

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60% producto de los tratamientos convencionales Sin embargo, estos aspectos no son
reflejados en la evaluacin ultrasonogrfica transcurridos 150 das del tratamiento.
.
La terapia con clulas madre no provoca una recuperacin ms rpida, no se acortan los
tiempos de recuperacin. La ventaja de esta terapia es tener un tendn mucho mejor
estructurado a nivel histolgico, ms elstico y con menor riesgo de volver a lesionarse.

13-BIBLIOGRAFA:
Beatriz Ranera Beltrn.2012. Clulas madre mesenquimales equinas: Obtencin y anlisis
de sus propiedades in vitro. Dpto. Anatoma, Embriologa y Gentica Animal Facultad de
Veterinaria UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.
Roberto Estrada McDermott. 2007. Establecimiento e implementacin de un protocolo de
extraccin, aislamiento, cultivo y reimplantacin de clulas madre mesenquimales para el
tratamiento de tendinitis y desmitis en equinos.

J. Ignacio Arias f, M.V., DSc, Carolina Beato. 2013. Terapia Regenerativa en Tendones y
Clulas Madres en Medicina Equina. Avances en Ciencias Veterinarias V28 N 2.

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Carla Stephany Otondo Casacurta.2012.Uso de clulas madres de origen adiposo para

tratamiento de tendinitis y desmitis equina.
14- ARCHIVOS ELECTRNICOS.

http://revistas.ucm.es/index.php/RCCV/article/view/40079/38508

http://fisioterapiaequina.com.ar/celulas-madre/
http://albeitar.portalveterinaria.com/noticia/3577/articulos-otros-temas-archivo/medicinaregenerativa-y-celulas-madres..html
http://www.lanacion.com.ar/1359091-ya-utilizan-celulas-madre-para-tratar-a-caballos-deelite
http://www.aplicacionescelulasmadre.com/2012/04/regeneracion-de-tendones-encaballos.html

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