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Teil-B: Methoden
B-1 Licht-Mikroskopie
Die Licht-mikroskopische Technik reicht von der schon lange bekannten Durchlichtmikroskopie bis
zu technisch sehr aufwndigen Konstruktionen wie der konfokalen Lasermikroskopie, die
dreidimensionale Darstellungen ermglicht.
Lichtmikroskope bieten bis heute die einzige Mglichkeit, lebende Mikroorganismen zu
untersuchen.
Elektronenmikroskope erreichen zwar Vergrerungen bis 100.000-fach und mehr, es knnen
aber nur fixierte und daher leblose Prparate verwendet werden.
Gute Mikroskope sind sehr teure Przisionsgerte, deren Benutzung genau gelernt werden muss.
Auch sind sehr viele verschiedene Bauarten mglich, und man muss sich auf jeden Fall mit den
jeweiligen Bedienungselementen vertraut gemacht haben.
Je nach Mikroskoptyp ist die Methode der Bildentstehung von der optischen Konstruktion
abhngig. Sie kann fr Routinegerte recht einfach sein, aber auch extrem aufwndig ausfallen wie
z.B. bei konfokalen Lasermikroskopen, die 3-dimensionale Bilder von Zellen erzeugen knnen.
Auflsungsgrenze d =
AObj .
Die numerische Apertur eines Objektivs gibt an, wie gut der Einblick eines Objektivs auf das
Objekt ist. Je weiter der Lichtkegel () ist, der nach dem Objekt in das Objektiv eintreten kann und
dort zur Bildgebung genutzt werden kann, desto besser.
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numerische Apertur
A = n sin
n ist in diesem Ausdruck der Brechungsindex des Objektivglases, und der Winkel der Spitze des
Lichtkegels, der vom Objektiv erfasst werden kann (je grer desto grer auch der sin und
damit eine bessere Auflsung). Sehr gute Objektive erreichen eine nA von bis zu 1,3. Dabei ergibt
sich fr blaues Licht (ca. 450nm) eine Auflsungsgrenze von 346nm oder 0,35m. Damit lassen
sich Bakterien gut erkennen, die innere Struktur von Zellorganellen aber nicht mehr.
Grundstzlich gilt, dass es fr jedes Prparat eine optimale Vergrerung gibt, denn das volle
Auflsungsvermgen lsst sich nur bei einem sehr dnnen Prparat erreichen !
Die optischen Eigenschaften eines Objektivs sind im Bild unten wie folgt angegeben:
Tubuslnge in mm
t 160/0,17 r
EF
63-fache Vergrerung
max. Deckglasdicke in mm
Objektivtype
t 63/0,85 r
numerische Apertur
Fr die Immersionstechnik drfen nur Objektive verwendet werden die deutlich mit Oel oder
Oil gekennzeichnet sind.
Fr die Vorbereitung einer Beobachtung bei so hohen Vergrerungen ist es wichtig das Prparat
zunchst bei den niedrigeren Vergrerungen genau zu untersuchen um zu entscheiden ob es sich
berhaupt lohnt.
Es bringt nichts, ein schlechtes Prparat bei strkerer Vergrerung zu betrachten ! (Vergrert
man Nichts wird nur mehr Nichts daraus )
B-1.3. Darstellungsmglichkeiten
B-1.3.1. Das Hellfeld
B-1.3.2. Das Dunkelfeld
Bei der Dunkelfeldmikroskopie wird das direkte Licht durch eine Ringblende ausgeblendet, sodass
kein direktes Licht mehr in das Objektiv gelangt. Es gelangen nur die vom Objekt reflektierten
Lichtanteile ins Objektiv, der Hintergrund bleibt dunkel. Das Dunkelfeld kann nur bei
Vergrerungen bis ca. 600-fach verwendet werden, weil die Lichtausbeute zu gering wird und die
starken Streueffekte das Bild verflschen wrden (Sieht dann so aus, wie Schifahren im
Schneetreiben). Es eignet sich manchmal fr die Beobachtung kontrastarmer Objekte.
Im Dunkelfeld lassen sich aber Strukturen beobachten, die kleiner sind als das
Auflsungsvermgen, weil die von ihnen reflektierten Lichtstrahlen zwar kein Bild ergeben
knnen, aber als Lichterscheinung vor dem dunklen Hintergrund dennoch auffallen (so wie ein
Leuchtturm, der nur anhand des Lichtes das von ihm ausgeht, gesehen wird und nicht als Turm
selbst). Bei vielen Mikroskopen kann man bei geschickter Kondensoreinstellung ein Dunkelfeld
erzeugen indem man einen etwa 1,5cm groen Kreis aus schwarzem Papier auf die ffnung der
Beleuchtungseinrichtung legt, sodass nur mehr ein etwa 3mm breiter Lichtring zum Kondensor
gelangt.
verluft). Der optische Trick bei der Phasenkontrast-Mikroskopie besteht nun darin, im Objektiv in
den Lichtweg dieses 1. Nebenmaximums eine Schicht einzubringen, in der es um /2 relativ zum
Hauptmaximum phasenverschoben wird, bevor es durch das Linsensystem wieder mit dem
Hauptmaximum zum Bild berlagert wird. Bei der Interferenz von Haupt- und Nebenmaximum
wird dadurch ein heller Hintergrund deutlich dunkler. An den Objektdetails geschehen ebenfalls
Phasenverschiebungen, und so erfhrt das Bild eine deutliche Kontrastverstrkung. Dies ist
besonders bei Objekten von Vorteil, die ungefrbt oder im Hellfeld kaum zu erkennen sind.
Jedes Phasenkontrastobjektiv hat seinen eigenen Phasenring und bentigt im Kondensor die dazu
passende Ringblende. Man muss also immer die richtige Phasenblende einstellen.
Durch den Phasenkontrast wird bei ungefrbten Objekten eine wesentliche Kontraststeigerung
erreicht, Bakterienzellen werden deutlich sichtbar. Gefrbte Objekte eignen sich nicht gut fr die
Beobachtung im Phasenkontrast, da die Helligkeitsunterschiede zu stark werden.
B-1.4.1. Zeichnungen
Zeichnungen ermglichen im Unterschied zu Fotografien eine selektivere Darstellung. Man kann
nur relevante Strukturen abbilden (z.B. keine strenden Steinchen). Gleichzeitig kann man sich
whrend des Zeichnens schon berlegen, um welche Struktur es sich handeln knnte. Durch
Bettigung des Feinfokus lsst sich ein 3-dimensionalen Eindruck gewinnen den man dann besser
in ein 2-dimensionales Bild umwandeln kann.
Mit der Zeichnung geschieht also schon eine Interpretation des Bildes, das man sieht. Dadurch
kann bei komplexen Objekten leichter ein berblicksbild erstellt werden, als dies mit der
Photographie mglich ist.
Zeichnungen anzufertigen ist bungssache, folgende Hinweise erleichtern diese Arbeit aber:
dnnen eher harten Bleistift verwenden.
Keinen Anspruch an knstlerische Qualitt stellen
Ein skizzenartiger berblick erleichtert spter das Auffinden
B-1.4.2. Fotographie
Mikrofotografien sind in Kombination mit berblicksdarstellungen gut zu verwenden. Trotz der
schlechteren Auflsung hilft manchmal ein Film vom selben Prparat, um dynamische Prozesse
besser erfassen zu knnen (z.B. Zeitrafferaufnahmen der Zellteilung).
B-1.5 Zusammenfassung:
Mikroskopische Prparate sollen dnn sein, um ein bersichtliches Bild zu bekommen.
Jedes mikroskopische Prparat wird zunchst bei der geringsten Vergrerung betrachtet. In
der Folge geht man schrittweise vorsichtig zu hheren Vergrerungen.
Das Lichtmikroskop dient vor allem der Beobachtung lebender Mikroorganismen bis zu 1600fachen Vergrerung.
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Fr eine optimale Auflsung sollte der Strahlengang eines Forschungsmikroskops gut justiert
und der Kondensor in der richtigen Hhe eingestellt sein (Khler).
Die Kondensorblende dient der Kontrast- und Schrfentiefenanpassung. Der Winkel des
austretenden Lichtkegels wird auf das verwendete Okular abgestimmt.
Die numerische Apertur ist abhngig von dem Brechungsindex des verwendeten Glases und
der optischen Konstruktion. Je hher die numerische Apertur, desto besser ist das
Auflsungsvermgen.
Die Auflsungsgrenze ist von der Wellenlnge des verwendeten Lichtes und von der
numerischen Apertur des Objektivs abhngig.
Die Gesamtvergrerung ergibt sich aus der Objektivvergrerung x Okularvergrerung
Immersionsobjektive ermglichen Vergrerungen bis an die Grenze
des
Auflsungsvermgens; zwischen Objektiv und Deckglas wird l eingebracht, das eine
Totalreflexion verhindert. Die numerische Apertur des Objektivs kann dadurch voll genutzt
werden.
Im Hellfeld wird das Objekt von unten durchstrahlt, dieses Licht gelangt vollstndig zum
Okular. Der Kontrast ist eher schwach, oft werden Frbungen genutzt, um den Kontrast zu
verstrken.
Die Phasenkontrastmikroskopie eignet sich vor allem zur kontrastreichen Beobachtung
lebender, schwach gefrbter Objekte. Bakterien sind besonders leicht zu erkennen.
bestimmte Stoffwechselprozesse durchfhren knnen, weil sie ber bestimmte Enzyme (und
damit ber bestimmte Gene) verfgen.
Voraussetzung fr eine mikrobiologische Identifikation ist das Vorliegen einer Reinkultur. Da die
meisten Proben mehr als eine Keimart enthalten (Mischkultur), wre es unmglich, das
Vorhandensein eines bestimmten Keims direkt in der Probe nachzuweisen. Will man das
Vorhandensein eines ganz bestimmten Keims nachweisen, muss man diesen Keim zuerst isolieren
und getrennt vermehren, dazu werden sogenannte Reinzuchtverfahren verwendet.
Enthlt eine Probe blicherweise keine Keime, wie z.B. Harn, ist es relativ einfach, einen Keim rein
zu zchten. Oft gengt einfaches Verdnnen und Anzchten. Ist die Keimzahl in der Probe gering,
muss der Keim z.B. durch Sterilfiltration angereichert werden - der Filter fischt alle Keime aus
einem greren Probenvolumen und kann zur Anzucht der Keime direkt auf ein festes
Nhrmedium gelegt werden.
Enthlt eine Probe hingegen normalerweise sehr viele unterschiedliche Keime, z.B. Stuhl, kann es
wesentlich aufwndiger sein, einen ganz bestimmten Krankheitserreger zu identifizieren. Damit
die Reinzucht nicht zu einer Suche nach einer Nadel im Heuhaufen ausartet, kann es notwendig
sein, die Wachstumsbedingungen so zu whlen, dass sich der gesuchte Keim gut vermehrt,
whrend alle anderen Keime kaum wachsen. Solche Verfahren bezeichnet man als
mikrobiologische Anreicherung. Die Selektivitt des Kulturmediums kann z.B. durch die Art der
vorhandenen Nhrstoffe, oder eine Wachstumshemmung durch Nhrmedienzustze erzielt
werden.
Quantitative Untersuchungen sind wichtig, wenn es nicht nur darum geht, welche Keime in der
Probe enthalten sind, sondern auch wie stark die Probe mit bestimmten Keimen belastet ist. Bei
quantitativen Bestimmungen kann einerseits die Zahl von Zellen (Zellzahlbestimmung),
andererseits die Zahl der Keime (Keimzahlbestimmung) ermittelt werden. Quantitative
Bestimmungen sind wichtig, weil z.B. die Zahl der pathogenen Keime in einem Lebensmittel
darber entscheidet, ob das Lebensmittel gesundheitsgefhrden ist, oder nicht. Ist die Zahl die
pathogener Keime gering, kann sich das Immunsystem gesunder Personen gegen eine Infektion
erfolgreich wehren, ist die Keimzahl hoch, gelingt die Immunabwehr oft nicht, die Person erkrankt.
Fr jeden Stamm gibt es daher Grenzwerte, die nicht berschritten werden drfen.
Beispiele
Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus casei
Staphylococcus aureus,
Bacillus anthracis, Yersinia pestis
Ebolaviren
Ausglhen
Das Ausglhen in der Flamme des Teclusbrenners eignet sich fr extrem hitzebestndige
Materialien (z.B. Impfsen aus Platindraht). Es reicht dabei aus, das Metall kurz zur Rotglut zu
bringen. Ausglhen eignet sich nicht fr Stahl, da dieser bei den hohen Temperaturen brchig
werden kann.
Abflammen
Mit dem Abflammen erreicht man eine geringere Keimabttung als durch Ausglhen oder mit dem
Hitzeschrank. Das Abflammen kann mit mindestens 70%igem Ethanol (flambieren), oder auch
ohne Ethanol (z.B. ffnungen von Kolben oder Flaschen) erfolgen. Durch das Flambieren kann die
Einwirkzeit der Hitze verlngert werden, es eignet sich fr Gegenstnde wie Drigalskispateln aus
Glas, oder Pinzetten. Wichtig ist dabei, das Ethanol nur anzuznden, und dann auerhalb der
Flamme abbrennen zu lassen (Glas wird zu groer Hitzeeinwirkung brchig).
Feuchte Hitze (Autoklavieren)
Durch den Einsatz von Feuchtigkeit kann die Wrmebertragung verbessert werden, fr die im
Vergleich zur trockenen Hitze gleichen Sterilisationswirkung gengen geringere Temperaturen.
Das gngigste Verfahren ist das Autoklavieren, viele mikrobiologische
Nhrmedien knnen auf diesem Weg sterilisiert werden. Autoklaven sind
mit aus der Kche bekannten Drucktpfen vergleichbar, mit
zustzlichem Thermometer, Manometer und Ventil. Autoklaven werden
luftdicht verschlossen, dadurch baut sich beim Erhitzen ein berdruck
auf, der eine Erhhung des Siedepunkts des Wassers bewirkt. Der
erhhte Druck hat als solcher keine Bedeutung fr den Sterilisationeffekt,
nur die Erhhung des Siedepunkts ist fr die verbesserte
Sterilisationswirkung im Vergleich zum Abkochen unter Normaldruck
verantwortlich.
Deckel Certoklav
Abbildung Manometer
und Ventil eines
Tischautoklaven
Vegetative Formen von Mikroorganismen knnten bereits bei 100oC (Auskochen) inaktiviert
werden, fr die Vernichtung von Dauerformen (z.B. Bakteriensporen) sind hingegen hhere
Temperaturen (z.B. 121oC bei 1 bar berdruck) erforderlich. Grotechnische Anlagen verfgen
auch ber elektronische Steuereinheiten und Dokumentationssysteme, die den Verlauf der
Sterilisation aufzeichnen.
Wie bei der Sterilisation mit dem Hitzeschrank muss das Sterilisatonsgut verschlossen/verpackt
werden, und ein Luftausgleich mglich sein. In Gefe mit sehr kleiner ffnung wird eine geringe
Menge Deionat eingefllt, um hinreichende Feuchtigkeit im Inneren zu garantieren. Um eine
optimale Wrmebertragung auf das Sterilisationsgut zu erzielen, muss die gesamte Luft im Gert
durch Wasserdampf ersetzt werden, daher wird das Ventil whrend des Aufheizprozesses
geffnet, und nach dem Fllen des Innenraums mit Wasserdampf verschlossen. Die
Sterilisationszeit bei 121oC betrgt je nach Volumen des Sterilisationsguts 15-20 min, und
beginnt erst mit dem Erreichen der Sterilisationstemperatur. Vor dem ffnen des Topfes ist darauf
zu achten, dass der berdruck vollstndig abgebaut worden ist, und die Temperatur deutlich unter
100oC betrgt, um Siedeverzge zu vermeiden. Nhrmedien, die Verfestigungsmittel enthalten
(z.B. Agar-Agar,) neigen auf Grund der hohen Viskositt besonders stark zu Siedeverzug.
Autoklaven werden auch zum schonenden Aufschmelzen von festen Nhrmedien (z.B. nach
Lagerung) verwendet, dabei wird mit geffnetem Ventil im strmenden Dampf bei 100oC
aufgeschmolzen.
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Sterilfiltration
Fr die Sterilfiltration werden unterschiedliche Typen von
Filtern verwendet:
Membranfilter: besitzen eine definierte Porengre. Sie eignen sich fr die Sterilisation
von hitzelabilen Flssigkeiten und Nhrmedien
Tiefenfilter: besitzen keine definierte Porengre, aber eine hohe Materialstrke. Die
einzelnen Hohlrume im Filtermaterials knnen durchaus grer als die abzutrennenden
Keime sein, auf Grund der hohen Materialstrke bleiben die Keime aber dennoch
irgendwann einmal im Material hngen. Wattestopfen eignen sich z.B. als Luftfilter fr
Pipetten und Kulturkolben. Beim Verschlieen von Kolben ist es wichtig, die Wattestopfen
so gro zu dimensionieren, dass sie auch mehrmals leicht entfernt, und wieder aufgesetzt
werden knnen.
UV-Licht
UV-Licht eignet sich nur fr Oberflchen- und Luftdesinfektion, weil UV-Strahlung fast nicht in
feste Materialien eindringen kann. Anwendung z.B. zur Luftdesinfektion steriler Arbeitsbereiche
(Sterilrume, sterile Werkbank). Achtung UV-Licht kann Netzhautschden und Hautkrebs
verursachen! Vor der Nutzung des bestrahlten Raums ist daher das UV-Licht auszuschalten.
Radioaktive Bestrahlung
Nur fr den industriellen Einsatz, z.B. bei der Sterilisation von Einmalkunstoffartikeln.
Chemische Sterilisation/Desinfektion
Desinfektionsmittel knnen nach ihrer Wirkung unterschieden werden:
Vorsilbe
bakteriofungiviro-
Endung
-zid
-statisch
-zid
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Im Laboralltag wird hufig 70%iges Ethanol eingesetzt. Der Wasseranteil reduziert die
Verdunstungsgeschwindigkeit, und verlngert somit die Einwirkzeit. Fr eine effiziente
Desinfektion sind 15 min Einwirkzeit sinnvoll.
Kommerzielle Desinfektionsmittel enthalten oft Isopropanol.
Alkohole fhren zur teilweisen Denaturierung von Proteinen und zur Auflsung biologischer
Membranen (Phosholipide); Bakteriensporen werden aber nicht abgettet.
Formaldehyd
Kommerzielle Desinfektionsmittel enthalten oft Aldehyde. Diese reagieren mit Proteinen und
inaktivieren sie. Aldehyde werden auch als Konservierungsmittel eingesetzt (Fixierung in der
Mikroskopie und Laerung von Leichen!).
Detergentien
Detergentien wirken im Prinzip wie Seife (Emulgatoren), sie lsen biologische Membranen auf
und lagern sich an Proteine an. Detergentien besitzen auch eine Reinigungswirkung, sie lsen
Lipide (= fetthnliche Stoffe); mineralische Rckstnde sind dadurch nicht entfernbar.
Arbeitsmntel, die lnger in Gebrauch sind, weisen auf ihrer Oberflche deutlich mehr Keime
auf als frisch gewaschene
in Ritzen und Fugen sammeln sich viele Keime, die zu Kontamination fhren knnen
Hnde waschen:
Mit Seife knnen 60-80% der auf der Hautoberflche vorhandenen Keime entfernt werden
(Mikrobiologische Arbeitsmethoden, Bast, 1998).
Laboruntersuchungen zeigen aber, dass sich auf mit Seife gewaschenen Hnden noch jede
Menge Keime befinden. Fr heikle Arbeiten (z.B. Operationen) wird daher mit Desinfektionsmitteln desinfiziert.
Gegenstnde knnen Keimtrger sein, bzw. wenn die Gegenstnde das Labor verlassen, knnen
unerwnschte Keime z.B. mit nach Hause genommen werden bzw. in den Pausen konsumierte
Lebensmittel kontaminiert werden.
Zugluft vermeiden:
Luft enthlt Bakterien- und Pilzsporen; Zugluft wirbelt Staub, und somit weitere Keime auf.
gleichzeitige Reduktion der Bewegungsgeschwindigkeit Gefahr der Aufwirbelung von Luft
Kreuz und quer ber den Platz greifen erhht die Kontaminationsgefahr
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zgige Arbeitstechnik reduziert die Gefahr, dass Keime aus der Luft in geffnete Gefe mit
sterilem Inhalt fallen
hastige Arbeitstechnik fhrt zur Aufwirbelung von Luft
nicht ber offene Gefe mit sterilem Inhalt greifen: Keime knnten von Hand/Arbeitsmantel in
das Gef fallen
nicht ber Kreuz greifen
heie Luft hat eine geringere Dichte und steigt daher auf. Keime werden nach oben mitgerissen
und fallen nicht auf die sterilen Gegenstnde/Medien (Kamineffekt)
Alle Gegenstnde, die mit Medien oder Kulturen in Kontakt kommen, werden sterilisiert.
Alle Gegenstnde, die mit sterilen Gegenstnden in Kontakt kommen werden desinfiziert.
Gegenstnde, die steril bleiben sollen, drfen nicht auf der Arbeitsflche abgelegt werden die
Arbeitsflche ist nicht steril, sondern nur desinfiziert, sie enthlt daher einige Keime.
Sterile Gefe sollen mglichst lange verschlossen gehalten werden - Verhinderung des
Eindringens von Keimen.
Gegenstnde mglichst weit von sterilem Bereich entfernt mit den Hnden angreifen z.B.
Glasmesspipette nur ganz oben angreifen
Unsterile Gegenstnden nicht in sterile Gefe tauchen z.B. sollte bei Mikroliterpipetten der
Schaft nicht in Flaschen mit sterilem Inhalt getaucht werden; hier hilft es, die Flasche schrg zu
halten, und somit die Pipette nicht so tief eintauchen zu mssen
bei Husten oder Niesen Kopf wegdrehen: Der Hals-/Rachenraum enthlt viele Keime
Sprechen mglichst vermeiden
Mit den Hnden whrend der sterilen Arbeit keine stark kontaminierten Flchen angreifen z.B.
das eigene Gesicht, das Handy etc.
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Das Abflammen von Flaschenffnungen ist nur sinnvoll, wenn der Brenner eine Abschirmung hat,
die eine Strung der laminaren Strmung verhindert.
Kurze Checkliste fr das Arbeiten im Laminar-flow:
Oberflchendesinfektion der Arbeitsflche whrend die Werkbank nicht in Betrieb ist
UV-Licht ausschalten, Ventilation einschalten
konsequente Hndedesinfektion
Abwischen von Gegenstnden mit Ethanol, bevor sie in die sterile Werkbank gestellt
werden
Sammelbehlter fr kontaminierte Gegenstnde vorbereiten
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Fleisch wird durch Proteasen anverdaut und dann ausgekocht: enthlt Peptide,
Aminosuren, andere organische Substanzen, Vitamine, Mineralstoffe
Hefeextrakt:
autolysierte (sich selbst zersetzende) Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae)
enthlt B-Vitamine (aus den Getreidekrnern, die zur Bierherstellung verwendet wurden)
Malzextrakt:
Malz = Gerstenkrner, die zum Keimen gebracht worden sind, Strke wird durch das in den
Krnern vorhandene Enzym Amylose zu Glukose abgebaut; Malz enthlt viel Maltose
(Zucker; Disaccharid aus 2 Glukoseeinheiten)
Verfestigungsmittel:
Zur Herstellung fester Nhrmedien = Nhrbden
Agar-Agar:
wichtigstes Verfestigungsmittel fr Mikrobiologie
aus marinen Rotalgen gewonnenes Kohlenhydrat
Gelatine:
seltener eingesetzt
aus Knochen und Knorpeln gewonnenes Protein
schmilzt bei 37oC, daher fr viele MOs nicht geeignet
schonend sterilisieren
Wahl von Nhrmedien
richtet sich nach den anzuzchtenden Organismen
richtet sich nach der Begleitflora (andere Keime in der Probe, die nicht angezchtet
werden sollen); z.B. fr definierte Stmme kein Selektivmedium erforderlich
Nhrbodenhandbuch bzw. Herstellerseiten zur Medienwahl heran ziehen
(www.oxoid.com; 3.7. 2012; www.merckmillipore.de/food-analytics; 3.7.2012)
Hinweise zur Herstellung von Nhrmedien
Nhrmedien, die durch Auflsen fester Inhaltstoffe hergestellt werden, mssen sofort nach dem
Lsen sterilisiert werden, da auch bei khler Lagerung ein gewisses Wachstum von
Mikroorganismen stattfindet.
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Lsungen sehr gering ist. Im kleinen Mastab hilft es a) das Kulturgef nur zu maximal
einem Drittel zu befllen, um gut schtteln zu knnen, und b) Kultivierungsgefe mit
Einbauten (Schikanen ) zu verwenden. In greren Mastben wird aktiv belftet.
In der Praxis wird hufig zu wenig auf den Zustand der Zellen geachtet, mit denen ein
Medium beimpft wird: Werden Bakterien ber lngere Zeit (mehrere Wochen, abhngig vom
Stamm) gelagert, enthlt die Kultur hufig eine groe Zahl abgestorbener/wenig vitaler Zellen.
Ebenso schlecht kann der Zustand von Zellen einer Kultur sein, die zu lange bebrtet worden
sind. Die Zellen leiden unter Nhrstoffmangel und der Anhufung wachstumshemmender und
toxischer Stoffwechselendprodukte (z.B. Suren).
Kontraproduktiv kann es auch sein, flssige Medien mit einer zu hohen Zellzahl zu beimpfen:
die Zellen gelangen rasch in die stationre Phase bzw. Absterbephase. Fr die Beimpfung von
Medien daher minimalste Zellmengen verwenden (z.B. berhrt man zur Zellentnahme eine
Kolonie nur mit einer Impfse).
B-2.4.1. Kulturgefe
Fr Flssigkuluren werden hufig Erlenmeyerkolben verwendet, da das Medium bei geringer
Befllung sehr gut geschttelt werden kann, und aerobe Organismen dadurch gut mit Sauerstoff
versorgt werden knnen. Die Erlenmeyerkolben werden vor der Sterilisation - mit einem
luftdurchlssigen Metallverschluss, oder Watte zugedeckt (diese wirkt als Tiefenfilter, fngt also
von oben herunterfallende Keime ab). Im kleineren Mastab knnen Kulturrhrchen*1, die mit
einer Metallkappe (Kapsenbergverschluss) abgedeckt sind, verwendet werden. Die
Durchmischung des Mediums ist allerdings schlechter als in Erlenmeyerkolben.
*1
B-2.4.2. Probenahme
Flssige oder feste Kulturmedien knnen entweder mit einer Probe (z.B. Lebensmittelprobe) oder
mit den Zellen einer Reinkultur beimpft werden.
Gerte zur Beimpfung flssiger Medien:
Pipette, ev. mit Drigalskispatel
Gerte zur Beimpfung fester Medien
Impfse: fr Bakterien, Hefen
Impfnadeln: fr Schimmelpilze
Beimpfung fester Medien
Zur Untersuchung von Luft knnen folgende Verfahren eingesetzt werden:
ffnen einer Petrischale mit Nhrboden fr einen definierten Zeitraum (z.B. 10 min)
Filtration eines definierten Luftvolumens durch ein Bakterienfilter; Auflegen des Filters
auf feste Nhrbodenoberflche
Zur Untersuchung von Oberflchen knnen folgende Verfahren eingesetzt werden:
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B-2.4.3. Bebrtung
Nach der Beimpfung wird bei einer fr die jeweiligen Mikroorganismen geeigneten Temperatur
bebrtet*2.
Temperatur und Zeit hngt von Mikroorganismus ab; beides muss daher protokolliert werden
z.B. viele Pilze 30oC, 3-4 Tage
z.B. Bakterien aus der Umwelt 30oC, 2 Tage
z.B. E. coli 37oC, ber Nacht
*2
..Das Wort Bebrtung schreibt man trotz des langgezogenen nicht mit h!
B-2.4.4. Anreicherungen
In vielen Fllen ist der Mikroorganismus, der identifiziert oder untersucht werden soll, Teil
einer Mischkultur, d.h. die Probe enthlt viele andere Mikroorganismen. Diese, fr die
jeweilige Untersuchung nicht interessanten Mikroorganismen bezeichnet man auch als
Begleitflora. Sie knnen eventuell weiteren Untersuchungsschritte stren.
Um den Anteil der erwnschten Keime gegenber der Begleitflora zu erhhen, kann man
Wachstumsbedingungen whlen, die das Wachstum der erwnschten Mikroorganismen
verbessern, und gleichzeitig das Wachstum der Begleitflora hemmen. Diese
Wachstumssteuerung kann durch selektive Nhrmedien (Wahl der Inhaltsstoffe,
Anwesenheit von wachstumshemmenden Stoffen, PH-Wert) sowie die Wahl der
Bebrtungstemperatur und zeit erfolgen.
B-2.4.5. Anzuchtverfahren
Anzucht von Pilzen aus der Umwelt
Pilzsporen sind ein Bestandteil von Staub; Pilzsporen findet man daher in der Luft, bzw. in
konzentrierte Form auf Kehrgerten. Da viele Pilze auch bei niedrigen pH-Werten gedeihen,
knnen sie auch von der Oberflche von Frchten bzw. anderen Pflanzenteilen gewonnen werden.
blicherweise wird ein Universalnhrmedium fr Pilze (z.B. Malzextraktagar, Wrzeagar,
Sabauroudagar) gewhlt.
Anzucht von Bakterien aus der Umwelt
Bakterien findet man an feuchten Standorten z.B. Waschbereichen, WC-Anlagen. Besonders
keimreich sind Oberflchen, die hufig angegriffen, und wenig gereinigt werden (z.B.
Computertastaturen, Schlssel). Eine ergiebige Quelle Bakterien sind auch Reinigungstcher (z.B.
Wettex).
B-2.4.6. Reinzuchtverfahren
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
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Eine Reinkultur enthlt nur Mikroorganismen eines ganz bestimmten Stammes, die Zellen einer
Reinkultur sind genetisch (fast) ident, sie sind Klone.
Ein einfaches Verfahren zur Anlegung von Reinkulturen ist das sterile Verdnnen der Probe, und
das anschlieende Ausplattieren von Aliquoten der Verdnnung auf einer Platte mit festem
Nhrmedium. Jede Einzelkolonie besteht aus Klonen.
In der Bakteriologie gngig ist vor allem der
fraktionierte Ausstrich (=13-Strich-Verfahren).
Dafr wird eine Impfse in die Probe getaucht,
und mehrere Parallelstriche auf einer Platte mit
Nhrboden gezogen. Anschlieend wird die
Impfse ausgeglht, um anhaftende Keime
abzutten, und die se in einem flachen Winkel
ber die ersten Impfstriche gezogen. Diese
Vorgangsweise wird 1-2x wiederholt.
Fraktionierter Ausstrich
B-2.5. Stammhaltung
Bakterien, aber auch Eukaryontenzellen (z.B. Spermien) knnen ber lngere Zeit haltbar gemacht
werden.
Die Wahl der Methode hngt von der Dauer der geplanten Lagerung ab. Die Konservierung wird
grundstzlich durch Verlangsamung (Khlen, Senkung der Nhrstoffkonzentration) oder
kompletter Hemmung des Wachstums erzielt (Einfrieren, Gefriertrocknung). Rasches Einfrieren
und der Zusatz von Gefrierschutzmitteln (z.B. Glyzerin, DMSO) verringert Zellschden und erhht
somit die berlebensrate.
Wenn mglich, sollte von genetisch mglichst einheitlichen Organismen ausgegangen werden (z.B.
Einzelkolonie von Bakterien; siehe Kapitel Reinzuchtverfahren).
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Kulturen auf festen Nhrmedien in Petrischalen knnen meist einige Wochen gelagert werden,
wenn die Platten im Khlschrank gelagert werden und mit Parafilm verschlossen sind (Schutz vor
Austrocknung).
Mittelfristige Lagerung (mehrere Monate)
Ausstrich auf Schrgagarrhrchen (Rhrchen mit Kapsenbergverschluss; Konzentration der
Medieninhaltsstoffe nur 1/10 der normalen Einwaage) oder in einem Schraubrhrchen mit
Schrgagar (dicht verschliebar); Lagerung im Khlschrank
Abbildung Schrgagarrhrchen
Langfristige Lagerung
Glyzerinkultur
900 l Flssigkultur in steriles Kryorhrchen (kltefester Kunststoff) einfllen
Zusatz von 10 % (v/v) sterilem Glyzerin*, gut mischen
Einfrieren (idealerweise mit flssigem Stickstoff Schutzbrille, Handschuhe, in
Styroporbehltnis bergieen), ansonsten direkt in den -80OC Schrank geben)
Lagerung bei -80C
* Glyzerinlsung in verdnnter Form (z.B. als 50%ige Lsung) autoklavieren
Lyophilisation (Gefriertrocknung)
Steht ein Lyophilisator zur Verfgung, kann eine gefriergetrocknete Kultur angelegt werden, die
besonders lange haltbar ist. Lyophilisate von Milchsurebakterien sind in der Apotheke zur
Behandlung von Darmerkrankungen erhltlich.
Lagerung in flssigem Stickstoff
Schockfrieren eines Aliquots einer Flssigkultur in flssigem Stickstoff (Schutzbrille,
Handschuhe, in Styroporbehltnis bergieen)
Lagerung in flssigem Stickstoff
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Tab. Koloniemerkmale
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Bakterien knnen in der Regel schon durch ihre geringere Gre von eukaryontischen Einzellern
unterschieden werden (Prokaryonten etwa 1m, Eukaryonten meist grer als 10m).
Morphologische Untersuchung
Bakterien besitzten unterschiedliche Formen (siehe Tabelle), die morphologische Untersuchung
erlaubt es aber nicht, die jeweilige Art zu identifizieren so gibt es tausende verschiedene Kokkenbzw. Stbchenbakterien. Bakterien sind meist regelmig geformt, im Gegensatz zu vielen Hefen,
deren Zellen sich in Form und Gre strker voneinander unterscheiden (siehe Abb.).
Abbildung links: Vibrio cholerae (Abbildung von Ronald Taylor, Tom Kirn, Louisa Howard, Bildquelle Wikimedia
commons); rechts: Saccharomyces cerevisiae (Abbildung von Masur, , Bildquelle Wikimedia commons)
Fachbegriff
Kokken
Form
kugelfrmig
Stbchen
an den Enden
abgerundete Zylinder
Kurz und gebogen
(U-Hakerl)
Spiralfrmig
Vibrionen
Spirillen
Fden
Zur morphologischen Untersuchung gehrt auch das Vorhandensein bzw. die Art der Begeielung.
Geieln sind aber zu dnn um im Lichtmikroskop ohne Frbung sichtbar zu sein. Sie knnen durch
Geielfrbungen dargestellt werden. Auch ohne Frbung kann die durch Geielrotation
hervorgerufene Bewegung beobachtet werden: die Zellen bewegen sich deutlich in
unterschiedliche Richtungen. Bewegen sich alle Zellen in die gleiche Richtung, deutet das auf
Strmungen im Prparat hin.
Die Form und die Beweglichkeit der Bakterien kann direkt im Nassprparat ermittelt werden.
Besser erkennbar ist die Form, wenn die Zellen vorher fixiert, und eventuell auch gefrbt worden
sind. Fr eine einfache Hitzefixierung wird eine Bakteriensuspension auf einem Objekttrger
ausgestrichen, die Bakterien werden getrocknet, und durch Hitze an Ort und Stelle fixiert. Fixiert
man, bevor die Bakteriensuspension vollstndig getrocknet ist, kocht das Wasser und die Zellen
platzen. Bakterienzellen schrumpfen zwar bei der Hitzefixierung etwas, ihre Form ist dennoch gut
erkennbar. Als Universalfarbstoffe (alle Strukturen werden eingefrbt) eignet sich z.B.
Methylenblau oder Kristallviolett.
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
22
Will man den im Mikroskop nicht sichtbaren Aufbau der Zellbegrenzung (Zellwand und
Membran/en) untersuchen, kann eine Gramfrbung durchgefhrt werden. Bei der Gramfrbung
werden die Zellen hitzefixiert, mit Kristallviolett eingefrbt (wobei unklar ist, ob nur die Zellwand,
oder das gesamte Cytoplasma eingefrbt sind). Anschlieend erfolgt ein Differenzierungsschritt
er dient der Unterscheidung zwischen grampositiven und gramnegativen Zellen. Durch eine
zeitlich exakt definierte Behandlung mit Ethanol werden gramnegative Zellen entfrbt, whrend
grampositive Zellen gefrbt bleiben. Um gramnegative Zellen ebenfalls besser sichtbar zu machen,
werden sie mit einem rosa Farbstoff (z.B. Safranin) eingefrbt, man bezeichnet das als
Gegenfrbung.
23
24
B-2.8.1. Zhlkammer
Mit einer Zhlkammer kann die Zahl der Zellen ermittelt
werden. Bei dieser Methode werden die Zellen in einem
exakt definierten Volumen unter dem Mikroskop
ausgezhlt (methodisches Prinzip). Die Methode eignet
sich nur fr Flssigkeiten und Proben, die eine relativ
groe Zahl von Keimen enthalten.
Eine Zhlkammer besteht aus einem speziellen
Objekttrger, auf den zwei idente Zhlfelder eingraviert
sind (exakt definierte Flche). Auf diesen Objekttrger
wird ein spezielles Deckglas aufgelegt, das einen exakt
definierten Abstand zur Flche mit dem Zhlnetz herstellt
(exakt definierte Hhe). Da die Zhlkammer sehr przise
sein muss, ist sie teuer!
dazu
unter
http://lo-
25
Zhlkammern wie jene nach Thoma und Brker-Trk haben ein Zhlfeld mit 1 mm2
Gesamtflche, das in 400 Kleinquadrate unterteilt ist. 4x4 Kleinquadrate werden auch als ein
Groquadrat bezeichnet. Der Abstand zwischen Zhlkammer und Deckglas betrt 0,1 mm. Die
Gre des Kleinquadrats und die Gesamtflche des Zhlfeldes sind meist auf der Zhlkammer
eingraviert.
Homogenisation der Zellsuspension: Die Probe sollte unmittelbar vor dem Auftragen auf die
Zhlkammer gut homogenisiert werden. Die Zellsuspension sollte auch nur mglichst kurz in der
Pipette stehen, da sich Zellen in der Pipette auf Grund der Schwerkraft rasch absetzen.
Erfassen der Zellzahl und Zhlstrategie:
Fr ein genaues Ergebnis reicht es nicht, einige wenige Zellen auszuzhlen. Fr sehr hohe
Genauigkeiten (max. 5% Irrtumswahrscheinlichkeit) mssen insgesamt mindestens 400 Zellen
ausgezhlt werden, in der Praxis gengt es oft, etwa 100 Zellen zu zhlen.
Die besten Ergebnisse erzielt man, wenn die Probe (oder eine Verdnnung der Probe) 2-12
Zellen/Kleinquadrat enthlt. Wenn die Probe deutlich weniger Zellen enthlt, knnen alle Zellen
auf einem Zhlnetz gezhlt werden, bei greren Zelldichten knnen z.B. nur alle jene Zellen, die
in den Kleinquadraten einer Diagonale liegen, erfasst werden. Da die grten Abweichungen
zwischen den Zhlergebnissen durch das Aufpipettieren bzw. unzureichende Homogenisation
entstehen, sollte die Zhlkammer mindestens 2x unabhngig voneinander befllt werden (da sich
auf jeder Kammer 2 Zhlnetze befinden, werden damit die Zellen auf insgesamt 4 Zhlnetzen
erfasst).
Liegt eine Zelle genau auf einer Linie, kann sie keinem Kleinquadrat eindeutig zugeordnet werden.
Man entscheidet sich daher willkrlich dafr, z.B. alle Zellen, die am linken und oberen Rand des
Kleinquadrats liegen, mitzuzhlen, und jene, die am rechten und unteren Rand liegen, nicht
mitzuzhlen.
..
Berechnung der Zellzahl
Rechenweg ber die Zahl der Zellen, die durchschnittlich pro Kleinquadrat ausgezhlt
wurde (Z):
Kammertiefe: 0,1 mm
22
Gesamtflche 1 mm Diese Flche besteht aus 400 Kleinquadraten 0,0025mm fr ein
Kleinquadrat (dieser Wert ist in die meisten Zhlkammern eingraviert)
2
Gesamtflche 1mm x Kammertiefe 0,1 mm = 0,1 mm , das entspricht 0,1 l (1000 L = 1m ; 1L= 1dm ; 1
3
3
ml=1cm ; 1l=1mm ). Da die Gesamtflche aus 400 Kleinquadraten besteht, sind auf der gesamten Flche
4
6
400 * X-Zellen; also 400 * X Zellen in 0,1 l; das entspricht 400 * X * 10 Zellen/ml; das entspricht X * 4 * 10
Zellen/ml.
Sollte die Zellzahl in einer Verdnnung der Probe gezhlt worden sein, muss anschlieend auf die
Originalprobe zurck gerechnet werden.
korrekte Einheit: Zellen/mL
..
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
26
Bei Hefen kann durch eine Methylenblaufrbung (siehe B-2.7.2) zwischen lebenden und toten
Zellen unterschieden werden. Methylenblau dringt in lebende und tote Zellen ein. Lebende Zellen
knnen Methylenblau enzymatisch entfrben, lebende Zellen sind daher ungefrbt, tote gefrbt.
Heikel ist dabei die Temperatur des verflssigten Nhrmediums: Ist sie zu hoch, knnen Keime
aus der Probe absterben. Ist sie zu tief, erstarrt das feste Nhrmedium zu frh, die Keime sind
schlecht verteilt, und knnen spter nicht als Einzelkolonien ausgezhlt werden. Wichtig ist
auch, nur jene Platten zur Kalkulation der Keimzahl heran zu ziehen, die nicht zu viele bzw. zu
wenige Kolonien enthalten. Einschlgige Lehrbcher (Mikrobiologische Arbeitsmethoden,
Bast) empfehlen, nur Platten zu zhlen, auf denen 30-300 Kolonien gewachsen sind. Bei
Platten mit nur wenigen Kolonien kann der statistische Fehler (siehe Box) sehr hoch sein. Bei
Platten, die sehr viele Keime enthalten, kann ein Teil der Keime nicht mehr zu einer Kolonie
heranwachsen, weil ihm benachbart liegende Keime zu viele Nhrstoffe entziehen die Zahl
der Keime in der ursprnglichen Probe wird systematisch unterschtzt.
Statistischer Fehler
Je kleiner das Volumen ist, in dem die Zahl der Keime gezhlt wird (Stichprobe), desto grer
ist der relative Fehler, den man machen kann, wenn man nur die Stichprobe auszhlt, und
daraus die Keimzahl in der Probe berechnet.
Der folgende Vergleich macht den Sachverhalt leicht verstndlich:
- Wenn man alle Schler/innen einer Schule zhlt, hat man den wahren Wert.
- Wenn man die Schler in einem Drittel der Klassenrume zhlt, hat man zwar nicht in allen
Klassen gleich viele Schler/innen, aber doch viele verschiedene Stichproben, das
berechnete Ergebnis Zhlung liegt nahe am wahren Wert.
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
27
- Wenn man die Schler/innen nur in 1 oder 2 Klassen zhlt, kann es sein, dass in diesen
beiden Klassen gerade zuflligerweise besonders viele oder wenige Schler/innen sitzen.
Wenn man jetzt aus dieser Zhlung auf die gesamte Schule schliet, kann der Fehler ziemlich
hoch sein.
Berechnung der Keimzahl:
Die Koloniezahlen von Parallelanstzen der auswertbaren Verdnnungsstufen werden durch
Mittelwertsbildung zu einem Wert zusammengefhrt. Wenn man Platten von mehr als einer
Verdnnungsstufe auszhlen kann, verwendet man am besten das gewichtete arithmetische
Mittel. Platten, die nur wenige Kolonien aufweisen, werden in der Berechnung weniger stark
bercksichtigt, da nur eine sehr kleine Stichprobe der gesamten Probe verwendet worden ist.
Gewichtetes arithmetisches Mittel - Berechnungsbeispiel
Platte Verdnnungsstufe 10-4: 258 Kolonien
Platte Verdnnungsstufe 10-5: 23 Kolonien - Umrechnung auf Verdnnungsstufe 10-4: 230
Platte Verdnnungsstufe 10-6: 3 Kolonien - Umrechnung auf Verdnnungsstufe 10-4: 300
B-2.8.3. Drigalski-Spatelplattenverfahren
Synonyme: Drigalski-Verfahren, Spatelplattenverfahren, Drigalski-Spatelverfahren
Gleiches Prinzip wie beim Kochsches Plattengussverfahren, allerdings werden die Keime hier nicht
in ein feste Nhrmedium eingegossen, sondern mit einer Drigalskispatel auf der Oberflche eines
Nhrbodens verteilt (Ausstrich). Mikroorganismen, die sauerstoffrmere Lebensrume
bevorzugen,
knnen
bei
diesem
Verfahren
nicht
vermehrt
werden.
Das
Drigalskispatelplattenverfahren ist arbeitstechnisch etwas einfacher als das Plattengussverfahren,
weil mit fertig gegossenen Platten gearbeitet wird, das kritische Temperieren des Nhrmedien
entfllt.
Abbildung Drigalskispatel
B-2.8.4. Titerverfahren
Mit dem Titerverfahren kann die Keimzahl annherungsweise ermittelt werden. Die Probe wird
solange dezimal (in Zehnerstufen) verdnnt, bis sich in einem mL kein, oder nur noch ein Keim
befindet. Die Rhrchen werden bebrtet, die Keime vermehren sich, und fhren zu einer Trbung
des Mediums. Der Titer der Probe ist die strkste Verdnnung, bei der gerade noch ein
Wachstum beobachtet werden kann, z.B. 10-7, die Probe enthlt somit etwa 107 Keime/mL. Das
Titerverfahren eignet sich fr flssige und feste Proben, letztere mssen gut homogenisiert und
suspendiert werden, um ein zuverlssiges Ergebnis zu erzielen.
28
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
10
-10
x steht fr Bewuchs.
In diesem Fall ergeben sich folgende Mglichkeiten zur Ermittlung der wahrscheinlichsten
Keimzahl (siehe Tabelle unten):
Kennzahl 3-2-2: Keimzahl von 21 fr die Verdnnung 1:10
Kennzahl 2-2-1: Keimzahl von 2,8 bei der Verdnnung 1:100
Kennzahl 2-1-0: Keimzahl von 1,5 bei der Verdnnung 1:1000
Der geringe Bewuchs bei der Verdnnung 10-2 geht vermutlich auf einen Pipettierfehler in der
ersten parallel-Reihe zurck. Daher ist die Auswertung etwas schwieriger und man sollte jenen
Rhrchensatz von drei aufeinanderfolgenden Verdnnungsstufen whlen, bei dem ein deutlicher
Unterschied im Bewuchs der Rhrchen zu sehen ist. Auerdem sollte jene Verdnnungsstufe
bercksichtigt werden, bei der ein Bewuchs gerade noch feststellbar ist. In obigem Beispiel wre
das die Kombination 2-2-1 , eine Stichzahl von 2,8 bei der Verdnnung 1:100 und damit eine MPN
von 280 Keimen/mL.
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29
0,1
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0,01
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
MPN
<0,30
0,30
0,30
0,61
0,62
0,94
0,36
0,72
1,10
0,74
1,10
1,10
1,50
1,60
0,92
1,40
2,00
1,50
2,00
2,70
2,10
2,80
3,50
2,90
3,60
2,30
3,80
6,40
4,30
7,50
12,00
16,00
9,30
15,00
21,00
29,00
24,00
46,00
110,00
>110,0
Vertrauensbereich-Grenze 95%
untere
0,00
0,01
0,01
0,12
0,12
0,35
0,02
0,12
0,40
0,13
0,40
0,40
0,50
0,50
0,15
0,40
0,50
0,40
0,50
0,90
0,50
0,90
0,90
0,90
0,90
0,50
0,90
1,60
0,90
1,70
3,00
3,00
1,80
3,00
3,00
9,00
4,00
9,00
20,00
obere
0,94
0,95
1,00
1,70
1,70
3,50
1,70
1,70
3,50
2,00
3,50
3,50
3,80
3,80
3,50
3,50
3,80
3,80
3,80
9,40
4,00
9,40
9,40
9,40
9,40
9,40
10,40
18,10
18,10
19,90
36,00
38,00
36,00
38,00
40,00
99,00
99,00
198,00
400,00
30
Wiederstand, die Zelle wird detektiert. Die Gre der Widerstandsnderung erlaubt es auch, die
Gre der gezhlten Zelle zu ermitteln. Dabei ist es wichtig, die Probe stark genug zu verdnnen,
um tatschlich einzelne Zellen zu detektieren.
B-2.9.Gewssergtebestimmung
Das Saprobiensystem war ursprnglich ein Hilfsmittel der Abwasserbiologen. Da es jedoch kaum
ein Gewsser gibt das vllig frei von organischer Substanz (Verunreinigungen) ist, kann es auf
alle Gewssertypen angewandt werden, sogar auf Aquarien oder Regentonnen. Vorraussetzung
fr eine fehlerfreie Gewssergtebestimmung ist jedoch eine genaue Kenntnis der Leitorganismen
und deren Lebensgemeinschaften. Die Gefahr von Fehlbeurteilungen aufgrund mangelnder
Erfahrung ist gro. So kann eine bestimmte Art ein charakteristischer Leitorganismus sein, eine ihr
sehr hnliche aus der selben Gattung aber ein Ubiquitist, der in ganz verschiedenen Zonen
gnstige Lebensbedingungen findet.
Eine einzelner Leitorganismus sagt daher wenig oder nichts ber die Saprphiestufe aus. Eine
zuverlssige Analyse setzt das Vorkommen mehrer oder typischer Leitarten vorraus sowie das
Auftreten der fr die bestimmte Zone typischen Lebensgemeinschaften.
Im Saprobiensystem spielen auch grere Tiere wie Muscheln, Insektenlaven und Egel eine Rolle.
Am wichtigsten sind allerdings die Mikroorganismen und unter ihnen die Protozoen.
An dieser Stelle sei erwhnt, dass aufgrund der oben angefhrten Fakten eine exakte
Gewssergtebestimmung im Zuge der bungen im Labor nicht durchgefhrt werden kann.
Vielmehr soll die Technik des Mikroskopieren anhand spannender Prparate wie der
Gewssergtebestimmmung gebt und vertieft werden. Das Eintauchen in die faszinierende Welt
der Kleinstlebewesen und das Finden und Beschreiben von mglichst vieler Protisten steht daher
im Vordergrund. Der Versuch einer Gewssergtebestimmung kann anschlieend unternommen
werden muss jedoch nicht unbedingt zu einem verbindlichen Ergebnis fhren.
Probennahme: Aus den oben beschiebenen Grnden soll die Probenauswahl bzw. -nahme so
erfolgen, dass mglichst viele verschiedene Organismen gefunden werden knnen. Kristallklare
Gebirgsbche, Schwimmbder oder gar Trinkwasser werden sich daher als Proben eher nicht
eigenen. Vielmehr sollten mglichst naturbelassene, stark mit Biomasse beladene Gewsser
beprobt werden. Dabei eigenen sich Gartenteiche oder kleinste, stehende Gewsser besonders.
Um die Menge an Mikroorganismen und deren Vielfalt zu steigern empfiehlt es sich die Probe aus
der unmittelbaren Uferzone zu entnehmen. Dabei sollen auch biogene Materialien wie Pflanzen,
verrottende Bltter oder mit Algen berzogene Steine ins Probennahmegef berfhrt werden.
Ein gut ausgewaschenes Gurkenglas eignet sich aufgrund des weiten Halses besonders fr dies
Aufgabe.
Hinweis: Durch den Abbau von Biomasse in der Uferzone steigt das Nhrstoffangebot im Wasser
lokal stark an. Dies fhrt zu einer direkten Zunahme an Mikroorganismen, aber auch zu einer
Verschiebung der Gewssergte durch die Vernderung der Populationszusammensetzung. Ein
Gewsser kann daher in verschiedenen Zonen, zu verschiedenen Untersuchungszeiten durchaus
sehr heterogene Gewssergten aufweisen!
31
A-2.10. -Test
Antibiotika sind Stoffe, die entweder das Wachstum von Bakterien hemmen, oder diese abtten.
Entsprechend unterscheidet man bakteriostatische (= das Wachstum hemmende) und bakterizide
(=Bakterien ttende) Antibiotika.
A-2.10.1. -Lactamantibiotika
Das erste entdeckte Antibiotikum war Penicillin: Dass Mikroorganismen sich gegenseitig im
Wachstum behindern knnen, war schon seit Beginn der systematischen Mikrobiologie Ende des
19.Jahrhunderts bekannt. Die Entdeckung von Penicillin gelang aber erst Alexander Fleming 1929,
der den antibakteriellen Effekt von Penicillin anhand einer Kontamination einer StaphylokokkenKultur mit dem Schimmelpilz Penicillium notatum genauer untersucht hat. Bakterien konnten
dort, wo der Schimmelpilz sich ausgebreitet hatte, selbst nicht wachsen. Die Isolierung des reinen
Penicillins gelang erst in den USA whrend des 2. Weltkrieges.
Penicillin verhindert die Verknpfung der Peptidketten im Peptidoglycans (siehe A-2), das den
Groteil der Bakterienzellwand bildet. Von der Hemmung des Zellwandaufbaus sind bestehende
Zellen nicht betroffen, sobald sich die Bakterienzellen jedoch teilen, wird die Zellwand instabil und
brchig (Wachstumshemmung). Gram-positive Bakterien reagieren auf Penicillin-Antibiotika
empfindlicher als Gram-negative, da ihre Zellwand aus einer dickeren Schicht Peptidoglycan
besteht und ihnen die zweite uere Hlle der Gram-negativen Bakterien fehlt.
R
CH3
S
CH3
HN
H
N
CH3
CH3
COOH
COOH
O
Penicillin
Penicillin-G
Alle Penicilline sind -Lactame (rotes Ringsystem in der Abbildung rechts ), die aus den
Aminosuren Cystein und Valin zusammen-gesetzt sind.
Der Rest (R) kann zur Entwicklung alternativer Antibiotika je nach Bedarf variiert werden
(Derivatisierungen), um dem Penicillin andere Eigenschaften zu verleihen (z.B. Lslichkeit,
Stabilitt gegenber Magensure). Als Derivate sind z.B. Ampicillin, Amoxicillin Methcillin, Oxacillin
im Handel.
Als Metabolit des Penicillium chrysogenum ist Penicillin-G ebenfalls ein natrliches Penicillin, das
zur Beseitigung wundpathogener Keime dient.
Die Entwicklung von Antibiotika ist nach wie vor ein wichtiges pharmakologisches
Forschungsgebiet, weil Bakterien einerseits sehr rasch vermehrungsfhig sind und andererseits
vielfltige Mglichkeiten besitzen, neue genetische Varianten hervorzubringen. Daher kommt es
oft zur Entwicklung von Resistenzen. Sie beruhen meist auf der Aktivitt bestimmter Proteine, die
antibiotischen Wirkstoffe zu spalten (z.B. Penicillinase) oder sie aus den Zellen zu pumpen, bevor
sie zu wirken beginnen.
A-2.10-2.Andere Antibiotikaklassen:
Antibiotikum
Organismus
Anwendung
Wirkungsweise
Bacitracin
Bacillus subtilis
G+ Bakterien
Cephalosporine
Cephalosporium
acremonium
Streptomyces
venezulae
Streptomyces
Breitband
Breitband
bei schweren Infektionen
Gram-positive Bakterien
Chloramphenicol
Erythromycin
32
erythreus
Micromonospora
purpurea
Streptomyces
kanamyceticus
Streptomyces fradiae
Gentamicin:
Kanamycin
Neomycin
(1mg = 1000 IE)
Penicillin-G
(1mg=1666 IE)
Streptomycin
Tetracycline
Vancomycin
;
Pseudomonas
aeruginosa; Hemmung der Proteinsynthese, Breitband gegen GStaphylococcus aureus
Stbchen, Nebenwirkungen problematische
z.B. Augeninfektionen
Breitband (Aminoglycosid)
Penicillium
chrysogenum
Streptomyces griseus
Streptomyces rimosus
Amycolatopsis
orientalis
Proteinsynthese -Lactam-Analogon
Zellwandaufbau
Gram-negative Bakterien
Breitband
Gram-positive Bakterien
Proteinsynthese
Proteinsynthese
Proteinsynthese
O
HO
OH
O
OH
N
O
OH
OH
Cl
HN
H2N
NH2
HO
OH
Cl
OH
H2N
Chloramphenicol
Erythromycin Gentamycin
O
NH2
OH
O
O
OH
O
HN
O2N
OH
HOH N
2
NH
HO
OH
H2N
OH
NH2
Kanamycin
HO
NH 2
O
OH
HO
OH
HO
NH2
NH2
HO
O
HO
NH
OH
OH
NH2
OH
NH
O
O
HO
OH
NH2
OH
Cl
HO
OH
H
N
H
N
N
H
OH
NH2
NH2
O
OH
NH
O
O
NH 2
NH 2
O
OH
N
H
O
HO
OH
OH
HO
H
N
O
NH
HO
Streptomycin Tetracyclin
NH
HO
NH2
Neomycin
H
N
Cl
HO
HO
O
O
H2N
HO
O
HO
H2N
OH
HO
Vancomycin
Neben Antibiotika, die den Zellwandaufbau stren, gibt es Substanzen, die auf verschiedene
andere Stoffwechselleistungen der Bakterien wirken. So wird z.B. mit Chloramphenicol die
bakterielle Proteinsynthese gehemmt. Aufgrund der unterschiedlichen Beschaffenheit der
Bakterienribosomen (70S) im Gegensatz zu jener der 80S-Ribosomen in Eukaryonten wird daher
der eukaryotische Zellstoffwechsel durch Chloramphenicol kaum beeintrchtigt.
Antibiotika:
Probenzubereitungen (z.B. von handelsblichen Antibiotika) knnen in Tablettenform auch ber
das Ablaufdatum hinaus fr den Hemmhoftest verwendet werden, wenn sie lichtgeschtzt,
trocken und khl gelagert worden sind. Antibiotikalsungen sollten nicht lnger als einen Monat
gelagert werden.
Sporensuspensionen (z.B. von Penicillium chrysogenum) sollten stets frisch zubereitet, und auf den
Platten in nur einem kleinen, klar begrenzten Bereich aufgebracht werden (z.B. 20L Suspension in
markierten Bereich auftragen).
A-2-10.3. Agardiffusionstest
Ein Antibiogramm dient zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Wirkung bestimmter
Antibiotika. Meist wird dazu ein Agardiffusionstest durchgefhrt, bei dem ein Teststamm dem zu
testenden Wirkstoff ausgesetzt wird. Je nach Art des verwendeten Bakterienstammes kann die
Wirkung verschiedener Antibiotika sehr unterschiedlich sein. In der Medizin werden solche Tests
durchgefhrt, um festzustellen, mit welchem Antibiotikum ein bestimmter bakterieller
Krankheitserreger wirkungsvoll bekmpft werden kann.
Bei einem Agardiffusiontest wird zunchst ein Nhrboden gleichmig mit einem geeigneten
Teststamm beschichtet (Deckschichtagar mit Bakteriensuspension). Danach werden
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
33
Filterscheibchen, die mit einem Antibiotikum in definierter Konzentration getrnkt sind, auf diesen
Nhrboden aufgelegt. Nach einer Inkubationszeit von 1-1 Tagen erkennt man den Bewuchs an
der Bildung eines gleichmigen Bakterienrasens, der rund um die Filterscheibchen durch
Hemmhfe unterbrochen ist. Der Hemmhofdurchmesser ist dem Wirkungsgrad des Antibiotikums
(qualitative Bestimmung) proportional, in den meisten Fllen ist dieser Wirkungsgrad auch
proportional der Konzentration des Antibiotikums (quantitative Bestimmung).
In der Abbildung rechts ist ein Nhrboden zu sehen auf dem eine Mischkultur aus Bacillus subtilis
(grampositiv) und Escherichia coli (gramnegativ) ausgestrichen worden sind. Die drei Plttchen
enthielten unterschiedliche Mengen des Antibiotikums. Wegen der unterschiedlichen
Empfindlichkeit Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien gegenber Penicillin-G sind zwei
Hemmhofgrenzen sichtbar.
34
Teil C - Arbeitsanleitungen
C-1. Mikroskopie
C-1.1. Arbeitsanleitungen - Mikroskopie
C-1.1.1. Protokollierung)
im Laborjournal:
Das Laborjournal ist das einzige rechtsgltige Belegexemplar zu den durchgefhrten Arbeiten ! Fr
Betriebe mit Qualittssicherungssystemen (z.B. Pharmasektor) ist die kontinuierliche
Protokollierung der durchgefhrten Arbeiten absolut essentiell. Kontrollbehrden gegenber muss
jederzeit nachgewiesen werden knnen, wer, was, wann und wie gemacht hat. Arbeitsschritte,
die zwischen den Laboreinheiten durchgefhrt worden sind, mssen ebenso protokolliert werden!
Die Kontrolle von Laborjournaleintragungen hat daher nichts mit Bosheit zu tun, sondern trgt
dazu bei, einen Qualittsstandard zu erreichen und zu erhalten .
Das Um und Auf ist also die Nachvollziehbarkeit (es muss auch Arbeitskollegen jederzeit mglich
sein, in laufende Arbeiten an Hand der Aufzeichnung einzusteigen, oder bereits abgeschlossene
Arbeiten zu wiederholen).
Das Laborjournal ist ein gebundenes Heft oder Buch und wird am Umschlagdeckel eindeutig mit
Namen, Datum und der Raumnummer gekennzeichnet. Die Seiten werden fortlaufend beschriftet.
Es drfen keinesfalls Seiten entfernt werden.
Sollten Texte oder Aufzeichnungen ungltig gemacht werden, mssen sie einfach durchgestrichen
werden. Die Streichung kennzeichnet man mit Datum und Unterschrift (oder Paraphe).
Zu Beginn der Arbeiten sollen gleich die ersten wichtigen Punkte aufgeschrieben werden:
Dazu zhlen Titel und Aufgabenstellung, bereits bekannte Literaturhinweise, Rezepturen oder
Arbeitsablufe, und eventuell auch die Planungen der Versuchsreihe. Vorberlegungen und
mgliche Erwartungen sollen ebenfalls protokolliert werden.
Verkleinerte Kopien einer Arbeitsvorschrift knnen mit Angabe der Literaturstelle eingeklebt
werden.
Alle wesentlichen Arbeitsschritte mssen whrend der jeweiligen Laborttigkeit protokolliert
werden !
Ergebnisse werden anhand von Computerausdrucken, Fotos oder Datentabellen im Laborjournal
gesammelt (eingeklebt). Ergebnisse sollten kommentiert werden: hat die Methode funktioniert,
was ist mglicherweise schief gelaufen, woran erkennt man, dass etwas geklappt hat, oder nicht.
Bei spter erledigten weiterfhrenden Arbeiten muss im Protokoll auf die entsprechenden
vorangegangenen Seiten verwiesen werden.
im Arbeitsprotokoll oder Arbeitsbericht
Einen Arbeitsbericht gliedert man am besten in folgende Abschnitte:
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
35
Aufgabenstellung:
z.B: Untersuchung einer Teichwasserprobe: lange Lacke 25-09-2012-A im Hellfeld
oder: Beobachtung der Plasmolyse eines Blttchens von Rhoeo spathaccea bei Verwendung von
Salzlsungen unterschiedlicher Konzentration und Zusammensetzung.
Prinzip:
Hier wird die genutzte Technik angegeben..
z.B. Hellfeldmikroskopie, Trockenprparation
Literatur:
Jede mglicherweise verwendete oder verwendbare Literatur wird hier vollstndig
angegeben: Autor, Titel, Auflage, Seiten, Verlag, Erscheinungsjahr
Kremer, Das groer Buch der Mikroskopie 1.Aufl. , S 234-236, (Kosmos-Verlag, 2007)
Materialien:
kurze Materialienliste
bei Verwendung von speziellen Chemikalien oder Reagenzien auch Rezeptur, bzw. Hersteller und
Chargen-Nummern; NaCl p.a. VWR 78999-922
Durchfhrung :
Kurzform, Stichworte, es ist bei der Protokollierung aber darauf zu achten, dass alle fr
ein erfolgreiches Arbeiten notwendigen Details angegeben werden:
Ergebnisse:
Hier werden alle gefundenen Daten, sowohl Rohdaten als auch die Rechengnge zu
daraus abgeleiteten Daten protokolliert. Sie bilden die Grundlage der Auswertung.
Auswertung und Diskussion:
Die zuvor aufgelisteten Ergebnisse werden interpretiert. Im Normalfall fhrt dies zu
einem Vergleich der erhaltenen Daten mit erwarteten Ergebnissen und zu einem
abschlieenden Kommentar ber die durchgefhrte Arbeit. Es kann auch der Erfolg und
eventuelle Hinweise oder Tipps fr zuknftige Arbeiten angegeben werden. Im Idealfall
kann man hier ein Fachgutachten erstellen:
.. Das untersuchte Wasser erfllt entsprechend der Normen und der
Badewasserverordnung 67/1973 alle erforderlichen Kriterien fr die Verwendung als
Badewasser.
36
Objekttisch langsam mit dem Grobtrieb hinauffahren und gleichzeitig durch das Okular schauen.
Sobald ein Bild erkennbar wird, nur mehr den Feintrieb verwenden bis das Bild scharf ist.
Falls nichts zu finden ist, kann man auf den Deckglasrand versuchen scharf zu stellen
Oft findet man ein Objekt erst, wenn man mit der Kreuztischeinstellung hin- und herfhrt und
auf einmal einen Schatten vorbei huschen sieht.
Prinzipiell kann man auch nach dem Einlegen des Prparates den Objekttisch ganz nahe an das
kleinste Objektiv heranfhren und von dieser Stellung ausgehend versuchen scharf zu stellen.
Der Vorteil dabei ist das sichere Vermeiden eines Zusammenstoes zwischen Objektivfrontlinse
und Prparat.
Kondensoreinstellung:
37
Wenn ein Prparat gut eingestellt ist und ein deutliches, scharfes Bild sichtbar ist, sollte
man sich Zeit nehmen das Prparat durch Bettigung des Feintriebs auch in
verschiedenen Schichten zu untersuchen, damit man ein Art 3D Eindruck gewinnt.
Ev. zu einem strker vergrernden Objektiv wechseln. Dazu muss der Objektivrevolver
vorsichtig in Richtung des nchst-strkeren Objektivs verdreht werden ohne dabei am
Grob- oder Feintrieb zu drehen.
Beachte dass ein strker vergrerndes Objektiv nur sinnvoll ist, wenn man auch was sieht!
Wenn man nichts findet, keinesfalls ein strker vergrerndes Objektiv einschwenken!
Wenn man die Beobachtung beendet dreht man mit dem Grobtrieb den Objekttisch
hinunter und entnimmt danach das Prparat.
Das Lichtmikroskop ermglicht Beobachtungen am lebenden Objekt. Bedenkt man diese Tatsache,
so versucht man in erster Linie das eingestellte Objekt zu beobachten und jagt nicht nach dem
hchsten, mglichen Vergrerungsmastab (1:1600). Starke Vergrerungen sind nur bei
ruhigen und sehr dnnen Objekten sinnvoll!
Es ist zu bedenken, dass die Schrfentiefe bei starker Vergrerung immer geringer wird und das
Auflsungsvermgen durch die Lichtwellenlnge und numerische Apertur des Objektivs begrenzt
ist.
Bei lebenden Prparaten sollte man stets nach folgenden Merkmalen suchen:
die Zellwand bzw. die Begrenzung der Zelle nach auen:
Zellwnde sind aufgrund der Dicke des Materials strker Licht-brechend als das Zytoplasma;
Zellmembranen sind selbst nicht erkennbar, jedoch das unterschiedliche Aussehen von Zellinhalt
und Umgebung der Zelle.
Wenn man einmal eine klar begrenzte Zelle erkannt hat kann man sich auf die Suche nach dem
Zellkern begeben.
Blende und Kondensor einstellen!
Der Zellkern ist meist oval und sieht wie eine Scheibe aus, die etwas dichter strukturiert ist als
das umgebende Cytoplasma.
Man beobachtet kleine Granula, die kaum Brownsche Molekularbewegung zeigen. Der Zellkern
liegt in Pflanzenzellen meist von einer groen Vakuole verdrngt an der Zellwand. Sein
Aussehen ist daher je nach Beobachtungswinkel mehr oder weniger zur Ellipse verzogen.
Durchschrfen (mit dem Feintrieb die verschiedenen Schrfeebenen beobachten)!
Organellen:
Am auffallendsten sind sicherlich die Chloroplasten in grnem pflanzlichem Material.
Bewegungen:
Plasmastrmungen (gerichtet, kontinuierlich) im Gegensatz zur Brownschen
Molekularbewegung (ungerichtet, chaotisch, Temperatur-abhngig)
Dokumentation:
38
Die Protokollierung mikroskopischer Beobachtungen erfolgt in der Regel durch Zeichnungen auf
glattes Papier zunchst mit einem feinen Bleistift. Beim Anfertigen der Zeichnungen soll folgendes
beachtet werden:
nicht zu dick zeichnen (Radieren ist mglich!)
zuerst ein bersichtsbild anfertigen
Detailzeichnungen immer mit einem Hinweis versehen, um welches Detail der
bersichtszeichnung es sich handelt
Das gezeichnete Bild soll vom Greneindruck ebenso gro erscheinen wie das Bild im
Mikroskop (man kann sich behelfen indem man einen Kreis zeichnet der den Blickfeld
im Mikroskop entspricht).
Es sollen keine Details gezeichnet werden, die nicht zu erkennen sind, sondern nur das
was man auch tatschlich gesehen hat.
Eingestellte Vergrerung dazuschreiben und beschriften
Die Khlersche Beleuchtungseinrichtung
Bei guten Mikroskopen gibt es bei der nicht blo eine Lampe sondern ein Linsensystem, das dem
Kondensor einen nahezu parallelen Lichtstrahl liefert.
Das typische Merkmal der Khlerschen Beleuchtungseinrichtung ist die sogenannte
Leuchtfeldblende, die den Durchmesser des Lichtstrahls der zum Kondensor gelangt verndern
kann. Mit seitlichen Stellschrauben kann dieser Lichtstrahl in die Mitte des Sehfeldes zentriert
werden was fr eine optimale Auflsung besonders wichtig ist.
Um richtig zu "Khlern" legt man ein einfaches, leicht erkennbares Prparat auf den
Objekttisch, stellt mit dem Grobtrieb scharf und schliet die Leuchtfeldblende (nicht zu
verwechseln mit der Kondensorblende!) bis der Lichtpunkt im Bild einen ganz kleinen
Durchmesser hat.
Ohne den Grobtrieb nun zu verndern verstellt man die Lage des Kondensors am
Objekttisch in der Hhe soweit, bis die Umrisse der Leuchtfeldblende scharf sichtbar
werden.
Dabei sieht man die Hell- Dunkelgrenze der Leuchtfeldblende nur mit auffallenden Farbrndern
und Abbildungsfehlern whrend das Prparat nach wie vor scharf abgebildet wird.
Mit den seitlichen Stellschrauben wird das Bild der Leuchtfeldblende zentriert.
Danach kann man die Leuchtfeldblende gerade so weit ffnen, dass das Blickfeld
vollstndig ausgeleuchtet ist.
39
Man schwenkt das zuletzt verwendete Objektiv aus dem Strahlengang, ohne jedoch
gleich das Immersionsobjektiv (Oil) vollstndig in den Strahlengang zu geben.
In dieser Zwischenstellung, whrend kein Objektiv auf das Objekt gerichtet ist, gibt man
einen kleinen ltropfen des speziellen, sehr sauberen Immersionsls direkt auf das
Deckglas an jene Stelle, die sich in der Mitte ber dem Kondensor befindet. Direkt im
Strahlengang befindet sich dann der ltropfen.
Nun kann man vorsichtig und ganz langsam das Immersionsobjektiv in den
Strahlengang schwenken, wobei man besonders darauf achten muss, das Deckglas mit
der Frontlinse nicht zu berhren. Das l soll langsam zwischen Deckglas und Frontlinse
des Immersionsobjektives gleiten, damit keine Luftblasen im l eingeschlossen werden,
denn die wrden die Abbildungsqualitt stren.
Sobald das Objektiv eingerastet ist wird ausschlielich mit dem Feintrieb scharf gestellt.
Die Entnahme des Prparates vom Objekttisch erfolgt erst nachdem der Tisch
abgesenkt wurde.
Nach der Benutzung wird das Immersionsobjektiv mit einem weichen Taschentuch
abgetupft. Dieser Vorgang wird mit etwas Xylol ( ) oder Toluol im Tuch wiederholt.
Grenmessung
Um in mikroskopischen Prparaten Lngen messen zu knnen muss fr
Okularmikrometer
jedes verwendete Objektiv der Okularmastab kalibriert werden.
Objektmikrometer [mm]
Dies geschieht indem man ein Objektmikrometer als Prparat durch die
jeweiligen Objektive betrachtet. Das Objektmikrometer ist ein
Objekttrger, der auf einer 2mm langen Strecke eine fein eingeritzte
0,1
Maeinteilung besitzt.
0,2
Wenn man das Bild des Objektmikrometers durch ein Messokular
0
betrachtet, das eine Skala von zumeist 100 Teilstrichen besitzt, kann
man fr die verschiedenen Vergrerungen diese Skala kalibrieren:
C.N.
Man sucht zunchst die Skala des Objektmikrometers bei der geringsten
Vergrerung und bringt deren 0,0-Linie mit der 0-Linie des Okularmastabes zur Deckung. Wie im
Bild oben gezeigt kann man dann die Lngenwerte den Okularteilstrichen zuordnen. In obigem
Beispiel entsprechen daher 100 Teilstriche im Messokular etwa 0,358 mm auf dem
Objektmikrometer. Diese Vorgangsweise wird fr alle anderen Objektive auer dem
Immersionsobjektiv wiederholt. Fr knftige Grenmessungen bentigt man nur mehr das
Messokular und die gefundenen Umrechnungsfaktoren.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
40
Gramfrbung
Theoretischer Hintergrund:
Der Aufbau der Zellbegrenzung (siehe Kapitel Zellbiologie) lsst sich mit Hilfe einer Gramfrbung
(siehe ) unterscheiden. Dazu werden zuerst alle Bakterienzellen mit Kristallviolett eingefrbt. Bei
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
41
der anschlieenden Behandlung mit Ethanol werden die gramnegativen Zellen entfrbt, whrend
die grampositiven ihre violette Farbe behalten. Um auch die gramnegativen Zellen besser sichtbar
zu machen, werden sie in einem abschlieenden Schritt mit einem weiteren Farbstoff rosa
eingefrbt.
1884 Hans Christian Gram
moderne Alternative: Fluoreszenzfarbstoffe
Sinn:
Unterscheidung zwischen Groteil aller Eubakterien fllt in eine der beiden Klassen; wichtigste
Frbung; ermglicht gemeinsam mit der mikroskopischen Untersuchung eine erst Einteilung der
Bakterien
Lsungen
In Tropfflschchen
Kristallviolett-Lsung:
I: 85%iges Kristallviolett: 4g Kristallviolett in 20 ml Ethanol lsen (Lagerung in brauner Flasche)
II: 0,8 g Ammoniumoxalat in 80 ml Deionat lsen; Lsungen I und II mischen; 5-fache Verdnnung
herstellen
Lugolsche Jodlsung:
1 g Jod (Jod lst sich nur in Anwesenheit von KJ in Wasser)
2 g KJ in 300 ml Deionat lsen; vollstndige Lsung erfordert oft lngeres Stehen-lassen; Lsung
etwa 1 Jahr haltbar - Jod ist flchtig, verlsst Polyjodidkomplex
96%iges Ethanol (kein Spiritus)
Safraninlsung:
10 ml 2,5%ige Safraninlsung mit 100 ml Deionat verdnnen
Materialien:
Frbewanne, Kchenrolle, Deionat zum Splen (Spritzflasche)
Herstellung eines Hitze-fixierten Ausstrichs
Parallel Fixierung und Frbung der zu untersuchenden Kultur und bekannter Gram-positiver- (z. b.
Bacillus subtilis) und Gram-negativer (z.B. Escherichia coli) Organismen. Junge, aktiv wachsende
Kultur (exponentielle Phase) verwenden; z.B. 12-14 Stunden alte bernachtkultur; ltere Kulturen
Gram-positiver Organismen sind reagieren Gram-negativ oder Gram-variabel)
geringe (!) Menge der Kultur mit Deckglas oder zweiten Objekttrger auf dem
Objekttrger dnn ausstreichen
vollstndig (!) Luft-trockenen lassen
ist die Kultur noch feucht, knnen Zellen whrend der Hitzefixierung platzen, werden
eventuell flschlicherweise Gram-negativ beurteilt
3x langsam durch die Brennerflamme ziehen
Zellen schrumpfen; Proteine denaturieren, Zellen bleiben am Objekttrger haften
Frbung
Ausstrich darf whrend Frbung nie austrocknen ! berschssiger Farbstoff ist nicht mehr
abwaschbar; Frbungen, wenn mglich, mit Cornettpinzetten durchfhren
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
42
Objektrger auf Frbewanne legen (Frbewanne mit Zeitungspapier unterlegen)
berschichten des Ausstrichs mit Kristallviolett-Lsung; 2 min einwirken lassen
Kristallviolett dringt in alle Zellen ein; reagiert als basischer Farbstoff mit sauren Gruppen des
Cytoplasmas
Farbstoff mit Lugolscher Jodlsung absplen
Deionat wrde Kristallviolett wieder auswaschen; Objektrger schrg halten; Kristallviolett frbt
Finger bzw. Cornettpinzette verwenden
berschichten des Ausstrichs mit Lugolscher Jodlsung-Lsung; 2 min einwirken lassen
Bildung eine Kristallviolett-Farblacks (Komplex mit Jod; Chlorid als Gegenion durch Jodid ersetztunlslich)
Farbstoff mit Deionat absplen; gut abrinnen lassen
Objekttrger exakt 30 s mit 96%-igem Ethanol berschichten
sofort mit Deionat absplen
Objekttrger etwa 15 s mit Safraninlsung berschichten
Farbstoff gut mit Deionat absplen; gut abrinnen lassen
Nach dem Trocken mikroskopieren (mit oder ohne Deckglas; Beleuchtung optimieren !)
Vereinzelt liegende Zellen mikroskopieren, dichte Gram-negative Zellgruppen sind
eventuell nicht entfrbt
Entsorgung von Frbelsungen in Kunststofftank
Alternative Arbeitsvorschriften:
Carbolgentianaviolett statt Kristallviolett: gesttigte Carbolgentianaviolettlsung in 70%igem
Ethanol; Verdnnung mit 10 Teilen Deionat; Zusatz von 5% Phenol
Karbolfuchsin nach Ziehl und Neelsen statt Safraninlsung 1: 10 mit Deionat verdnnte
43
Schimmelpilze: Will man Sporentrger untersuchen, wenn vorhanden, Probe aus gefrbten
Bereichen der Kolonie entnehmen (in der Mitte). Dazu mit zwei mit Ethanol ABGEFLAMMTE
Prpariernadeln (das Ethanol wird angezndet, und neben der Bunsenbrennerflamme abbrennen
gelassen; keinesfalls ausgeglhten der Stahl der Prpariernadeln wird brchig) Teile des Myzels
nach oben herausziehen (bei verfrbten Kolonien an den verfrbten Stellen Probe entnehmen)
und auf einen Objekttrger berfhren, Zusatz von 1 Tropfen physiologischer Kochsalzlsung oder
1 Tropfen 20%ige KOH (Pilze besser verteilt);
C-1.2.2. Strke :
Mikroskopische Strkeuntersuchungen knnen verwendet werden, um die Herstellerangaben bei
Backprodukten zu berprfen Strkekrner verschiedener Pflanzen unterscheiden sich in Form
der Krner, im Schichtaufbau und der Gre; beobachtet werden kann auch die Grenverteilung
(sind alle Krner annhernd gleich gro, oder nicht).
Trockene Prparation:
Zum Mikroskopieren der Strke gengt eine kleine Spatelspitze, das Pulver soll fein
verteilt werden, so dass man nur eine dnne Krnchenschicht sieht. Zur Verteilung der
Krner kann man nach dem Auflegen des Deckglases sanft (!) mit der Spatel darauf
klopfen.
Nassprparation:
Tropfen Wasser auf Objekttrger vorlegen, und sehr wenig (!) Strkepulver einrhren,
Deckglas aufleben
44
C-1.2.3. Hefesuspension:
zur nassen Prparation wird ein Tropfen einer leicht trben Hefesuspension auf einen
sauberen Objekttrger gebracht, danach setzt man schrg am Rand des Tropfens ein
Deckglas an und senkt es mit Hilfe einer Prpariernadel langsam ab, bis die gesamte
Flssigkeit zwischen Deckglas und Objekttrger mglichst ohne Luftblasen verteilt ist.
berstehende Flssigkeit wird mit einem saugfhigen Papier abgesaugt (danach in Biohazard) bis das Deckglas durch Kohsion fest am Objektrger haftet (Kipptest !) Wenn
der Objekttisch ganz nach unten gestellt und das kleinste Objektiv in den Strahlengang
gebracht ist, legt man den Objekttrger mit der Hefeprobe mit der Deckglasseite nach
oben auf den Objekttisch und justiert das Objekt im Strahlengang.
das Prparat ist umso besser, je dnner es ist !
Wichtig zu beobachten sind:
Man kann versuchen, Zellkern und Organellen zu unterscheiden. Deutlich erkennbar sind die stark
lichtbrechende Zellwand und - bei sprossbildenden Hefen - die Sprossung, vor allem, wenn man
die Suspension in etwas Zuckerlsung bereitet hat.
45
Wichtig ist es, relevante Objekte (d.h. Lebewesen) zu identifizieren, bevor Zeichnungen
angefertigt werden (nicht sinnlos stundenlang Steinchen abzeichnen !)
Falls die ersten Zeichnungen halbwegs gelungen sind, kann begonnen werden, in den
aufliegenden Katalogen nach den beobachteten Arten zu suchen (z.B. Leben im
Wassertropfen).
Viele der Mikroorganismen in solchen Gewsserproben sind uert flink und knnen
daher nur schwer beobachtet werden.
Man muss dabei damit rechnen, dass nicht die gesamte biologische Vielfalt, in diesen Bchern
abgebildet sein kann, sondern man in vielen Fllen nur einen Hinweis erhlt, zu welcher Familie
oder Gattung ein bestimmter Organismus gehren kann.
Wichtig zu beobachten:
Erkennen relevanter Objekte: Unterschiede zwischen Lebewesen und leblosem Material
Symmetrie als Merkmal vieler Lebewesen; Organismenvielfalt (Unterscheidung ProkaryontenEukaryonten, Unterscheidung Protozoen-Algen; Abschtzung der Gewssergte nach
Leitorganismen; Literaturangaben
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Man prpariert die Innenepidermis einer - idealerweise - roten Zwiebel und hlt mehrere
saugfhige Papierstreifen bereit. Das Prparat sollt zunchst in Wasser angefertigt werden.
Es folgt die Suche nach einer lebenden Zelle und achtet dabei auf typische Lebenskennzeichen wie
Plasmastrmung, einer deutlich abgegrenzten Vakuole, und dem Zellkern. Danach gibt man einen
kleinen Tropfen der 1%igen Salzlsung auf eine Seite an das Deckglas und saugt von der anderen
Seite mit dem Papier ab. Dabei sollte man darauf achten, dass das Deckglas nicht aufschwimmt
und das Prparat verrutschen knnte. Nachdem die osmotischen Verhltnisse sich in der
Umgebung der Zelle gendert haben, beobachtet man deren Verhalten und wiederholt nach
einiger Zeit die Prozedur auch bei den Salzlsungen hherer Konzentration. Die Zellmembran hebt
sich schlielich ab einer bestimmten Salzkonzentration von der Zellwand weil der Zell Wasser
entzogen wird und sich das Zellvolumen verkleinert. Ist man bei der hchsten Salzkonzentration
angelangt, so ist die beobachtete Zelle am weitesten geschrumpft (eigentlich der Protoplast, denn
die Zellwand ist auch Teil der Zelle schrumpft aber nicht). Der Prozess kann dann wieder
umgekehrt werden, man muss aber aufpassen, dass man langsam genug vorgeht, denn sonst hlt
die Plasmamembran dem osmotischen Stress nicht stand und die Zelle platzt auf (osmotischer
Schock).
Wichtig zu beobachten:
Zellwand, Zytoplasma, Zellkern; Vakuole, Beobachtung der Plasmastrmungen, Zellorganellen
Die unterschiedlichen Plasmolysestadien sollten als Skizze dokumentiert werden.
Zu beobachten und zu protokollieren:
Zeichnungen verschiedener Pflanzenzellen;. eindeutige Beschriftung und Vergrerungsfaktor !
bersichtszeichnungen und Detailzeichnungen; bei einem dnnen Objekt kann nach Einschulung
auch die limmersion verwendet werden kann. Manche Prparate werden besser mit der Zeit,
daher ausdauernd beobachten ! Plasmolysestadien
Die bei Pflanzenzellen vorhandene Zellwand ist leicht erkennbar.
Das groe Volumen der Vakuole ist vor allem bei der Verwendung roter Zwiebeln deutlich
erkennbar, die Vakuole sollte nicht mit dem Cytoplasma verwechselt werden. Die Plasmamembran
ist nicht als eigene Struktur sichbar, weil sie durch den hohen osmotischen Druck an die Zellwand
gedrckt wird.
C-1.2.6. Mundschleimhaut:
Fettfreien Objekttrger mit einem Tropfen physiologischer (0,85%iger)
NaCl-Lsung vorbereiten. Mit Hilfe einer sterilen Holzspatel oder eines
sterilen Zahnstochers schabt man von der Mundschleimhaut etwas Material
ab und bringt es auf dem Objekttrger in den Tropfen Kochsalzlsung. Man
verteilt die Zellen durch vorsichtiges Rhren mglichst dnn und gibt das
Mundschleimhautzelle,
Deckglas darauf. Zunchst kann man die Zellen ungefrbt beobachten, 400-fach
C.N.
danach kann etwas Methylenblau (1%ige Lsung in H2O) durch das Prparat
gesaugt werden, wobei die Zellen gettet werden, der Kern aber deutlich abgefrbt wird. Durch
die Frbung mit Methylenblau werden auch die bakteriellen Begleiter unserer Mundschleimhaut
sichtbar! Man kann sie daran erkennen, dass sie nur auerhalb der Zell zu sehen sind (beim
Durchfokussieren).
Mundschleimhautzellen knnen verwendet werden, um weibliche und mnnliche Zellen zu
unterscheiden, denn bei Frauen findet man das 2.X-Chromosom in der stark kondensierten
Metaphasenform als sogenanntes Barr-Krperchen im Zellkern (Vorschrift siehe Kremer, 2002).
47
Wichtig zu beobachten:
Wegen der guten Prparierbarkeit (einzelne Zellen sichtbar) und dem Detailreichtum empfiehlt es
sich, dieses Prparat auch bei hherer Vergrerung mit Hilfe einer limmersion zu beobachten.
Man erkennt Zellkern und Organellen, Bakterien an der Zelloberflche und manchmal
Zellverbnde. Fr die rumliche Vorstellung ist es besonders wichtig, das Prparat bei geringer
Schrfentiefe schichtweise zu untersuchen. Dabei erkennt man, dass die Bakterien nur
auerhalb der Zelle an der Zellmembran liegen.
C-1.2.7. Moosblttchen
Wegen des einschichtigen Blattaufbaus bei Moosen, eignen sich deren Bltter besonders, um den
Aufbau von photosynthetisch aktiven Pflanzenzellen zu sehen: Man kann dazu von Blattmoosarten
wie z.B. Funaria hygrometrica Blttchen abzupfen, im Ganzen prparieren und am Rand der
Blttchen mikroskopieren.
Wichtig zu beobachten:
Lohnend ist die Beobachtung der Chloroplasten, die sich je nach Lichtmenge in der Zelle
unterschiedlich orientieren knnen. Wenn die Pflanze teilweise beschattet wurde, findet man sie
flchig in den Zellen liegen, bei Starklicht jedoch seitlich in Profilstellung (siehe Kapitel
Chloroplasten A-3.7.5.).
Die Beobachtung sollte von der Unterscheidung verschiedener Blattteile bis zum Zeichnen von
Schnitten durch die Blattgefe (Leitbndel) reichen; auch Plasmastrmungen sind an diesem
Prparat gut zu erkennen.
48
Allerdings muss besonderer Wert darauf gelegt werden, dass die Zeichnungen genau sind und
kleine Merkmale der Form, der Wimpern, oder Mundffnungen dargestellt werden.
Eine Grenmessung ist bei solchen Prparaten auch sehr hilfreich.
Als Ergebnis gelten die Zeichnungen der gefundenen Mikroorganismen, welche Mikroorganismen
gefunden und identifiziert werden konnten (mglichst viele verschiedene), welcher Gteklasse die
Wasserprobe zuzuordnen ist (siehe Streble/Krauter, Das Leben im Wassertropfen) und welche
Erfahrungen bei der Handhabung des Mikroskops gemacht worden sind (ev. Tipps und
Anregungen). Man sollte nach Leitorganismen suchen und diese auf jeden Fall zeichnen.
Beobachtungen zum Verhalten (Bewegung, Reaktionen auf Reize etc.) knnen auf den
Zeichnungen durch Pfeile oder Beschreibungen protokolliert werden.
49
Sekunden, sie ist nur eine Schlusspunkt fr viele Prozesse, die sich vor der rumlichen Teilung der
Zelle ereignet haben mssen.
Mgliches anderes Prparat fr Mitosestadien: Staubfadenhaare von Tradescantia virginica.
C-2.2. Ausglhen
nur fr hocherhitzbare Materialien (z.B. Platindraht), Stahl oxidiert (!) z.B. Impfsen
vor Gebrauch bis zur Rotglut in Bunsenbrenner halten
schrg von oben kommend in die Flamme halten ganze Lnge der Impfse sterilisieren
einmalige Rotglut reicht, lngeres Glhen bringt nichts
nach Gebrauch: feuchte se zuerst langsam in unteren, klteren Teil der Flamme
halten, dann wie oben beschrieben ausglhen
C-2.3. Abflammen
fr Arbeitsgerte, die nicht ausgeglht werden drfen; fr Arbeitsgerte, die keine extreme
Sterilitt erfordern (z.B. Zellkulturbedarf), z.B. Impfnadeln, Drigalskispatel
Abflammen mit Ethanol (Flambieren)
Gegenstand in 70% Ethanol tauchen
Gegenstand abflammen
in der Flamme anznden, und gleich wieder herausziehen, in 10-20 cm Entfernung vom Brenner
abbrennen lassen
Vorratsgef mit Ethanol nicht unter die brennende Flamme stellen
Vor dem Gebrauch und vor dem erneuten Verschlieen des Gefes durchfhren
50
entionisiertes Wasser bis zum Unterrand des Innentopfes einfllen verschmutztes, altes
Wasser muss entfernt werden und der Topf vor Gebrauch gereinigt werden (Schmutz brennt sich
ein und Geruchsbelstigung)
Autoklaviergut einrumen
Deckel schlieen und mit orangefarbenen Sicherheitshebel verschlieen
Ventil ffnen
Heizung des Autoklaven einschalten
Erhitzen, bis grere Luft/Wasserdampfmengen aus dem Ventil strmen, dann 2-3
Minuten weiter erhitzen
Ventil schlieen
Druck auf 1 bar berdruck steigen lassen (blauer Bereich am Manometer; 121oC)
Autoklavierzeit beginnt: 15-20 min
Heizung des Autoklaven abschalten
Abkhlen lassen, bis kein berdruck im Topf herrscht und Temperatur auf 80oC gefallen
ist
Gefahr des Siedeverzugs, vor allem bei hochviskosen Medien wie Agar-Agar-hltigen Medien
Autoklaviergut entnehmen
C-2.5. Sterilfiltration
fr hitzelabile Flssigkeiten und Nhrmedien:
in kleinem Mastab: Injektionsspritze mit Filteraufsatz; Lsung durchdrcken
in grerem Mastab: obere Kammer mit unsteriler Lsung; darunter Filter aus
Kunststoff (Einweg) oder Glas (Mehrweg); Durchsaugen mit Vakuum; sterile Flssigkeit
in unterer Kammer
51
C-2.6. Desinfektionsmanahmen
C-2.6.1. UV-Licht
fr sterile Werkbank, Sterilrume; vor Benutzung UV-Licht ausschalten - darf nicht in die
Augen gelangen !!!
z.B. Mikroliterpipetten nicht tief in sterile Flaschen tauchen, stattdessen Flasche schrg halten
52
Handbuch der Nhrmedien-Hersteller (Merck, Oxoid, VWR, etc. ), oder onlin nachsehen;
Katalognummer protokollieren!
Art der anzuzchtenden Keime
fest-flssig?
z.B. Universalnhrmedien fr anspruchslose Bakterien: Nhrbouillon
z.B. Universalnhrmedien fr Pilze (besonders Hefen): Wrze
z.B. Universalnhrmedien fr Pilze: Malzextrakt
z.B. Kulturmedium fr Escherichia coli: LB-Medium
Einwaage in Erlenmeyerkolben
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ev. Portionieren
Sterilisation
Autoklavieren fr die meisten Nhrmedien (zugedeckt, aber nicht luftdicht verschlossen), sonst
Sterilfiltration; Angaben des Nhrbodenherstellers beachten
ev. Lagerung der Platten bei 4-8oC mit Nhrboden nach oben !
bei der Lagerung entsteht Kondenswasser, das nach oben verdampft (wre der Nhrboden
unten in der Petrischale, wrde das Kondenswasser vom Deckel auf den Nhrboden tropfen, und
dort eine berschwemmung verursachen; in Folge wrden Mikroorganismenkolonien
ineinander flieen und die Beurteilung von Kolonien erschweren)
bei den meisten Medien ist eine Lagerung ber mehrere Wochen mglich, Medien sollten, wenn
mglich, von Kulturen (=bewachsenen Medien) getrennt aufbewahrt werden Kontaminationsgefahr
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1 Tropfen der Probensuspension wird an den Kapillarspalt zwischen Zhlkammer und Deckglas
pipettiert die Probe wird durch Kapillarwirkung unter das Deckglas gesaugt.
Zhlstrategie whlen
z.B. alle Kleinquadrate in einer Diagonale von links oben nach rechts unten
Zellen zhlen:
pro Kleinquadrat sollten 2-12 Zellen vorhanden sein; sind es weniger, wird die Zhlung ungenau,
sind es mehr, Probe verdnnen und dann Verdnnung der Probe auszhlen
jeweils Zellen, die auf der linken und oberen Begrenzung eines Kleinquadrats liegen, mitzhlen;
Zellen, die auf der rechten und unteren Begrenzung liegen, nicht mitzhlen
fr 5% Irrtumswahrscheinlichkeit insgesamt 400 Zellen zhlen; in vielen Fllen reicht die Zhlung
von 100 Zellen
um Probenahmefehler zu minimieren, Zhlkammer mindestens 4x befllen und nur so viele
Kleinquadrate auszhlen, bis gewnschte Zellanzahl erreicht ist
wenn pathogene Mikroorganismen gezhlt wurden, Zhlkammer mit Ethanol oder anderen
Desinfektionsmitteln vor dem Absplen der Mikroorganismen desinfizieren!
Zhlkammer mit warmen Wasser absplen, ev. mit 70% Ethanol fettfrei machen, Deckglas in
Schutzhlle geben
Berechnung:
Falsche Zellzahl
zu hohe Zellzahl
mgliche Ursache
mangelnde Homogenisation
(A)
Zu wenig Zellen gezhlt (B)
Probe stand zu lange in
Pipette (C)
ungleiche Verteilung d. Probe
in der Zhlkammer (D)
A, B, C, D oder
Rechenfehler (E)
Probennahmefehler (F)
Zellsuspension zu konzentriert
Fehlerbehebung
Probe vortexen (a1)
krftig mehrmals Auf/Abpipettieren (a2)
b) mindestens 400 Zellen auszhlen
siehe a1 oder a2
d) Kleinquadrate in der Diagonale des
Groquadrates auszhlen
siehe a1), a2), b), c)
e) Berechung berprfen, siehe SOP
f)
mindestens
4
unabhngige
Befllungen der Zahlkammer
Probe
verdnnen
und
Zhlung
wiederholen
55
ist ein relativer Wert, fr absoluten Zellzahl des jeweiligen Mikroorganismus muss mit anderen
Methoden kalibiriert werden (z.B. Kochsches Plattengussverfahren)
Abwischen mit 70%igem Alkohol, Bunsenbrenner aufstellen; Hnde waschen; Probe vorbereiten
Arbeit in unmittelbarer Nhe des Brenners durchfhren, etc.
mit der linken Hand (zwischen kleinem Finger und Ringfinger; fr Linkshnder umgekehrt)
Verschluss des Rhrchens greifen und halten (nicht ablegen)
ev. die Pipette vorbereiten: Spitzenabwerfer abziehen, Schaft mit 70% Ethanol abwischen
56
Manche Keime haften auf der Kunststoffoberflche und knnen spter nicht mehr gut verteilt
werden, daher Keimsuspension nicht zu lange in der Petrischale stehen lassen, bevor Medium
hinzu kommt
Da hufig sehr viele Platten gleichzeitig gegossen werden, ist es gnstig, sie an einer Stelle, wo
sie nicht im Weg sind, zu stapeln. Aushrtung dauert aber lnger
Bebrtung mit dem Boden nach oben, zu Paketen gestapelt (ev. mit Klebeband zusammen
geklebt)
Kolonien auszhlen
Kolonien auf Platten auszhlen, die 30-300 Kolonien enthalten (optimal sind 100-200
Kolonien/Platte); Platten mit hheren Koloniezahlen als >300 oder n.a.(nicht auswertbar)
dokumentieren
Platten auf dunklen Untergrund legen, Boden nach oben
ev. Plattenbeschriftung entfernen, aber Verwechslungsgefahr
wasserfester Filzstift gezhlte Kolonie markieren, um Mehrfachzhlung zu vermeiden;
Alternativen: Zhlstab oder Zhlgert (jeweils elektrischer Zhler)
57
Angabe in KBE (Keim-bildende Einheiten)/ml bzw. cfu (colony forming units)/ml; nur eine
Kommastelle angeben, Schreibweise mit Hochzahlen; z.B. 5,4 x 106KBE/ml
Mgliche Ursache
Probe zu verdnnt
Nhrboden zu hei
Fehlerbehebung
Probe nicht verdnnen oder
Sterilfiltration zur Ermittlung der
Keimzahl
Genau
Temperieren
(im
Wasserbad)
falscher Nhrboden
Korrekte Medienwahl
Kolonien
8er-Schleifen nicht durchgefhrt
Sofortiges Mischen nach der
ungleichmig verteilt
Medienzugabe
Medium zu kalt, wird zu schnell hart Rhrchen einzeln aus dem
Wasserbad holen
Koloniezahl
variiert Probe schlecht gemischt
Unmittelbar vor Verwendung
zwischen
mischen
Parallelplatten stark
Pipettierfehler (z.B. Luft aufgezogen korrekt pipettieren
zu geringes Volumen)
Pipette berprfen (Volumen
abwiegen)
C-4.6. Drigalskispatelplattenverfahren
Platten mit festem Nhrmedium herstellen
Plattenbeschriftung eher klein am Rand, weil sie sonst spter beim Auszhlen strt
100L (20-200 l sind mglich) Probe bzw. Aliquote aller Verdnnungsstufen steril
aufpipettieren
58
alternativ kann Spatel auch auf einer freien Stelle des Nhrbodens (wo keine Probe ist)
abgekhlt werden
kreisfrmig abwechselnd in und gegen den Uhrzeigersinn einreiben; ev. Platte gleichzeitig
drehen
so lange reiben, bis sich Flssigkeit komplett in Nhrboden eingesaugt hat, d.h. ein deutlicher
Wiederstand zu spren ist, bzw. mindestens 20 Kreise
Bebrtung, Auszhlen der Kolonien, Berechnung und Protokoll wie beim Kochschen
Plattenguverfahren
Fehlerdiagnose und -behebung:
Fehler
keine/zu wenig Kolonien
Mgliche Ursache
Drigalskispatel
abgekhlt
Kolonien
verteilt
nicht
Fehlerbehebung
Drigalskispatel
nach
dem
Abflammen lange genug abkhlen
lassen
Nhrmedium
nicht
zu
hei
ausgieen und gut vortrocknen
lassen
Probe lange genug verteilen
Pipette kontrollieren (Abwaage
bestimmter Volumina), optische
Kontrolle beim Pipettieren
Probe unmittelbar (!) vor dem
Pipettieren mischen
Drigalskispatel
nach
dem
Abflammen lange genug abkhlen
lassen
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man whlt, wenn mglich die drei hchsten Verdnnungsstufen, bei denen noch ein
Bewuchs festzustellen ist
Ablesung der Stichzahl
Ablesen der wahrscheinlichsten Keimzahl in MPN-Tabelle
In manchen Fllen gibt es mehr als einen mglichen MPN-Wert, die Werte passen im Rahmen
der Genauigkeit des Verfahrens aber gut zueinander
Berechnung
Multiplikation der wahrscheinlichsten Keimzahl mit der schwchsten Verdnnung, die fr die
Ermittlung der Kennzahl verwendet worden ist
Beachte auch den Vertrauensbereich innerhalb dieses Bereichs liegt der wahre Wert, mit
einer Wahrscheinlichkeit von 5%, dass er auerhalb liegt
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Ausgieen wird das temperierte Deckschichtmedium mit 200l der vorbereiteten Flssigkultur
(ber Nacht) im Rhrchen beimpft, gut gemischt (Vortex) und auf einer zuvor auf 37C
temperierten Platte mit Grundschicht-Agar ausgegossen.
2.6. Penicillin Standardreihe:
Um die antibiotische Wirkung einer Substanz testen zu knnen, muss eine Vergleichsreihe
herangezogen werden. Jeder Charge oder Zubereitungsform wird dann eine bestimmte Wirkung
pro mg zugeordnet. Fr das Penicillin-G von Sigma gilt z.B. 1595IE/mg. Fr eine Standardlsung mit
200.000IE/mL mssen daher 0,1254g/mL an Penicillin-G eingewogen werden.
Internationale Einheiten sind nicht im SI-System und werden oft in der Medizin eingesetzt um eine
reproduzierbare Dosierung von Medikamenten anhand ihrer Wirkung zu ermglichen. Die World
Health Organization definiert internationale Einheiten indem entweder durch Referenzprparate
oder international vereinbarte Standards ein bestimmtes Verhltnis zwischen IE und Masse oder
Stoffmenge definiert wird (http://www.who.int/en/). Fr jeden Stoff ist dieses Verhltnis anders
und man muss die genaue Zahl auf der Packung nachsehen.
Fr dieses Beispiel knnen 0,478 g Penicillin eingewogen auf 2mL mit entmineralisierten Wasser
aufgefllt werden. Diese Stammlsung wird vor der Verwendung steril filtriert, wobei das Filter zur
Fllung etwa 0,5mL bentigt (Totvolumen). Verdnnt man nach folgendem Schema ergibt sich
eine Standardreihe:
IE/mL
Standard 1
Standard 2
200 000
100 000
Penicillin-G
[g/mL]
0,12
0,06
Standard 3
50 000
0,03
Standard 4
30 000
0,018
Standard 5
10 000
0,006
Standard 6
5.000
3,00mg/mL
Verdnnungsschritte
- (davon werden etwa 600L bentigt) Std.1, 1:2
verdnnt (250L Std1 + 250L
H2O)
Std.1, 1:4
verdnnt ( 50L Std1 + 150L
H2O)
Std.1, 1:6,6 verdnnt ( 30L Std1 + 170L
H2O)
Std.2, 1:10
verdnnt ( 50L Std2 + 450L
H2O)
Std.2, 1:20
verdnnt ( 50L Std2 + 950L
H2O)
2.7. Durchfhrung:
Von den Penicillin Standards gibt man jeweils 45L auf ein steriles Testscheibchen welches dann
mit einer sterilen Pinzette auf die erstarrte Deckschicht aufgelegt wird (2 Scheibchen pro
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik
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Pearson 2006
Durch Abmessung der Hemmhfe und Interpolation einer Standardgeraden (Ordinate:
Hemmhofdurchmesser, Abszisse: log(IE)) kann auf die Wirksamkeit (in IE) des Testantibiotikums
geschlossen werden.
Anhand der Standardreihe kann auch die Probenkonzentration bestimmt werden ;
Aus einer frheren Untersuchung ist z.B. bekannt, dass ein Testscheibchen getrnkt mit
Gentamicin ca. 11000 IE/mL entspricht (gemessen an Penicillin G Standardreihe bei E.coli). Dies
entspricht einer Penicillin-Konzentration von 6,6 mg/mL.
Ein Testscheibchen getrnkt mit Chloramphenicol entspricht ca. 70000 IE/mL (gemessen an
Penicillin G Standardreihe bei E.coli). Dies entspricht einer Penicillin-Konzentration von 42
mg/mL.
4. Protokollierung
Fr alle getesteten Antibiotika ist eine tabellarische Auswertung (Hemmhofdurchmesser gegen log
IE) und eine entsprechende Graphik abzugeben! (Excel)
1) Untersuchungsobjekt (Name der Substanz oder Probe), Entnahme wann, wo, welche
Chargennummer.
2) Beobachtungen: Bewuchs und Zustand der Platten.
3) Beobachtungen und Tipps zur Durchfhrung, Abweichungen von der Standardprozedur
4) zeichnerische oder photographische Anleitung zur Durchfhrung falls notwendig
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