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Skriptum Mikrobiologisches Labor

PH-Seminar 18.+19.April, HBLVA fr chemische Industrie, Veronika Ebert


Auszug aus dem Kompendium fr Biochemie, angewandte Mikrobiologie,
& Gentechnik von Veronika Ebert, Christoph Neumann, Andrea PichlerWallace, Ingrid Schocher, Christoph Stacher, 2013
Empfohlene Lehrbcher, Fachliteratur und Programme
 Brock et al. Mikrobiologie (Spektrum-Verlag)
 Bast. Mikrobiologische Methoden. Eine Einfhrung in grundlegende
Arbeitsmethoden. Springer

Teil-B: Methoden
B-1 Licht-Mikroskopie
Die Licht-mikroskopische Technik reicht von der schon lange bekannten Durchlichtmikroskopie bis
zu technisch sehr aufwndigen Konstruktionen wie der konfokalen Lasermikroskopie, die
dreidimensionale Darstellungen ermglicht.
Lichtmikroskope bieten bis heute die einzige Mglichkeit, lebende Mikroorganismen zu
untersuchen.
Elektronenmikroskope erreichen zwar Vergrerungen bis 100.000-fach und mehr, es knnen
aber nur fixierte und daher leblose Prparate verwendet werden.
Gute Mikroskope sind sehr teure Przisionsgerte, deren Benutzung genau gelernt werden muss.
Auch sind sehr viele verschiedene Bauarten mglich, und man muss sich auf jeden Fall mit den
jeweiligen Bedienungselementen vertraut gemacht haben.

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B-1.1. Der Strahlengang im Lichtmikroskop


Bei jedem Lichtmikroskop wird sichtbares Licht ber das
optische System zunchst gebndelt und zum Objekt gefhrt.
Durch das Objekt wird das Licht einerseits gefrbt und
stellenweise abgeschwcht, andererseits wird es am Objekt
auch gebeugt (optischer Effekt, der mit der Wellennatur des
Lichtes zusammenhngt). Das Licht wird also am Objekt
verndert und gelangt dann zum Objektiv. Durch das
Linsensystem des Objektivs wird das Licht so gebndelt, dass
ein vergrertes reelles Zwischenbild des Objektes auf einer
Projektionsflche erzeugt werden kann.
Ist diese Projektionsflche ein Film oder ein Fotosensor kann
das Bild aufgenommen werden. Wird das Bild durch ein
Okular beobachtet, so entfllt die Projektionsflche, und das
Linsensystem des Okulars lsst das vergrerte Bild erst auf
der Netzhaut des Auges entstehen.

vereinfachte Darstellung des Strahlenganges


im Durchlichtmikroskop C.N.

Je nach Mikroskoptyp ist die Methode der Bildentstehung von der optischen Konstruktion
abhngig. Sie kann fr Routinegerte recht einfach sein, aber auch extrem aufwndig ausfallen wie
z.B. bei konfokalen Lasermikroskopen, die 3-dimensionale Bilder von Zellen erzeugen knnen.

B-1.1.1. Die Vergrerung :


Der Vergrerungsfaktor fr ein mikroskopisches Bild ergibt sich aus Objektivvergrerung x
Okularvergrerung. Die Leistung eines Mikroskops beurteilt man aber nicht nach der
erreichbaren Vergrerung, sondern nach seinem Auflsungsvermgen.

B-1.1.2. Das Auflsungsvermgen:


Als Auflsungsvermgen bezeichnet man die Fhigkeit eines Lichtmikroskops, genaue und
deutliche Bilder zu erzeugen. Ein gutes Auflsungsvermgen bedeutet also die mglichst genaue
Darstellung kleinster Details.
Das Auflsungsvermgen wird besser, je krzer die Wellenlnge des verwendeten Lichtes ist, und
je mehr Licht vom Objektiv eingefangen werden kann. Als Wert gibt man einfach die
Auflsungsgrenze (d) an, jenen Abstand in einem Objekt, bei dem 2 Punkte gerade noch als
getrennte Punkte wahrgenommen werden knnen.
Ein gutes Auflsungsvermgen bedeutet also eine kleine Auflsungsgrenze und ein kleiner Wert
fr d.
Diese Distanz ist abhngig von der Lichtwellenlnge und der
numerischen Apertur des Objektivs.

Auflsungsgrenze d =

AObj .

Numerische Apertur C.N.

Die numerische Apertur eines Objektivs gibt an, wie gut der Einblick eines Objektivs auf das
Objekt ist. Je weiter der Lichtkegel () ist, der nach dem Objekt in das Objektiv eintreten kann und
dort zur Bildgebung genutzt werden kann, desto besser.
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numerische Apertur

A = n sin

n ist in diesem Ausdruck der Brechungsindex des Objektivglases, und der Winkel der Spitze des
Lichtkegels, der vom Objektiv erfasst werden kann (je grer desto grer auch der sin und
damit eine bessere Auflsung). Sehr gute Objektive erreichen eine nA von bis zu 1,3. Dabei ergibt
sich fr blaues Licht (ca. 450nm) eine Auflsungsgrenze von 346nm oder 0,35m. Damit lassen
sich Bakterien gut erkennen, die innere Struktur von Zellorganellen aber nicht mehr.
Grundstzlich gilt, dass es fr jedes Prparat eine optimale Vergrerung gibt, denn das volle
Auflsungsvermgen lsst sich nur bei einem sehr dnnen Prparat erreichen !
Die optischen Eigenschaften eines Objektivs sind im Bild unten wie folgt angegeben:
Tubuslnge in mm

t 160/0,17 r
EF

63-fache Vergrerung

max. Deckglasdicke in mm

Objektivtype

t 63/0,85 r

numerische Apertur

Da die numerische Apertur im Nenner der Formel fr die


Auflsungsgrenze steht ist ein mglichst groer Wert von Vorteil. Die besten Objektive erreichen
hier 1,30.
Es gibt auch Lichtmikroskope die mit UV-Licht arbeiten, allerdings kann da nur Quarzglas
verwendet werden und man kann nur ber eine Kamera betrachten weil man sonst erblindete. Die
Mikroorganismen werden nach ca. 1 Minute durch das UV-Licht gettet, weshalb solche
Beobachtungen immer durch eine Videoaufzeichnung dokumentiert werden.
Durch die physikalischen Regeln begrenzt, ergibt sich fr das Lichtmikroskop eine sinnvolle
Maximalvergrerung von ca. 1300fach. Jede weitere Vergrerung bringt keine Verbesserung
(leere Vergrerung).

B-1.2. Die Einstellungen am Mikroskop:


B-1.2.1. Die Kondensoreinstellung:
Mit Hilfe des Kondensors wird das parallele Licht aus der Beleuchtungseinrichtung an das
verwendete Objektiv angepasst und in der
Ebene des Objektes gebndelt.
Fr jeden Mikroskoptyp gibt es eigene
Kondensorsysteme. Da der Kondensor das Licht
auf dem Objekt bndeln soll kann er in der Hhe
verschoben werden und sollte so eingestellt
sein, dass eine mglichst gleichmige und helle
Ausleuchtung des Bildfeldes erreicht wird.
Die Kondensorblende regelt die Form des
Lichtkegels, der auf das Objekt trifft.
Je kleiner die Blende, desto spitzer wird dieser
Schrfentiefeneffekte hervorgerufen durch unterschiedliche
Lichtkegel. Ein spitzer Lichtkegel wirkt sich wie
Blendeneinstellung C.N.
folgt aus:
 in der mikroskopischen Abbildung entsteht ein sehr kontrastreiches Bild, das eher wie ein
Schattenbild aussieht; Farben lassen sich schlechter erkennen
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 eine schlechtere Auflsung (siehe B-2.1.2. , wird kleiner).


 eine Zunahme der Schrfentiefe.
Eine hohe Schrfentiefe bedeutet, dass im Objekt mehrere Ebenen gleichzeitig nahezu scharf
abgebildet werden. Das ist selten wnschenswert, da Objekte, die sich vielleicht gar nicht nahe
sind, trotzdem gleichzeitig scharf gesehen werden, weil sie bereinander liegen. Man sieht in so
einem Fall zu viel auf einmal.
Ein weiterer Nachteil einer zu klein eingestellten Blende sind die Beugungserscheinungen die vor
allem an scharfen hell / dunkel Grenzen auffallen.
Mit kleinerer Blende gelangt natrlich weniger Licht in das Objektiv, aber man sollte nicht mit der
Kondensorblende die Helligkeit regulieren (Auflsungsvermgen wird geringer, siehe B-2.1.2.).

B-1.2.2. Die Khlersche Beleuchtungseinrichtung:


Bei guten Mikroskopen gibt es bei der Beleuchtungseinrichtung nicht blo eine Lampe sondern ein
Linsensystem, das dem Kondensor einen zentrierten und nahezu parallelen Lichtstrahl liefert. Da
alle Linsensysteme im Mikroskop entlang der optischen Achse des Gertes ausgerichtet sind, kann
eine einwandfreie Abbildung nur dann erreicht werden wenn auch das Licht genau ausgerichtet
ist. Bei schlampiger Einstellung kommt es zu den verschiedensten Abbildungsfehlern wie
Farbringen, Verzerrungen, starken Helligkeitsunterschieden im Bildfeld, etc.
Das typische Merkmal eines teuren Mikroskops ist die sogenannte Leuchtfeldblende, die den
Durchmesser des Lichtstrahls der zum Kondensor gelangt verndern kann. Mit seitlichen
Stellschrauben kann dieser Lichtstrahl auch noch in die Mitte des Sehfeldes zentriert werden.
Um richtig zu "Khlern" legt man ein einfaches, leicht erkennbares Prparat auf den Objekttisch,
stellt mit dem Grobtrieb scharf und schliet die Leuchtfeldblende (nicht zu verwechseln mit der
Kondensorblende!) bis der Lichtstrahl einen ganz kleinen Durchmesser hat. Den Kondensor
verstellt man dann in der Hhe soweit, bis die Umrisse der Leuchtfeldblende sichtbar werden,
ohne dabei den Objekttisch zu verndern. Dabei sieht man die Hell- Dunkelgrenze der
Leuchtfeldblende nur mit auffallenden Farbrndern whrend das Prparat nach wie vor scharf
abgebildet wird. Sobald zentriert ist kann man die Leuchtfeldblende gerade so weit ffnen, dass
das Blickfeld vollstndig ausgeleuchtet ist. Das Mikroskop ist dann fr die Beobachtung
vorbereitet. Nach jedem Objektivwechsel muss die Khlereinstellung kontrolliert und eventuell
angepasst werden.

B-1.2.3. Die Beobachtung mit Hilfe von Immersionsobjektiven:


Fr starke Vergrerungen benutzt man Objektive die eine kurze
Brennweite besitzen. Damit ausreichend Licht in das Objektiv gelangen
kann, muss der Lichtkegel der aus dem Kondensor kommt mglichst weit
sein ( gro und damit auch die numerische Apertur ).
Ab einem bestimmten Wert fr den Winkel kommt es am bergang vom
Deckglas in Luft zur Totalreflexion.
Totalreflexion C.N.
Wegen dieser Totalreflexion gelangen keine ueren Lichtstrahlen in das
Objektiv, sie wren aber fr das Erzeugen einer hochauflsenden Abbildung unbedingt ntig
(starke Vergrerung, Bild wird immer dunkler). Um nun auch die ueren Lichtstrahlen in das
Objektiv zu bekommen, kann man die Totalreflexion durch l zwischen Deckglas und der
Frontlinse des Objektivs unterbinden. Weil l einen hnlichen Brechungsindex wie Wasser bzw.
Glas hat, verschwindet die Glas/Luft Grenzschicht und der fr das Auflsungsvermgen wichtige
Winkel wird effektiv grer. Damit kann die numerische Apertur des Objektivs zur Gnze
genutzt werden und man erreicht das maximale Auflsungsvermgen (Wird ein
Immersionsobjektiv ohne l verwendet sieht man alles nur sehr verschwommen, falls man
berhaupt scharf stellen kann).
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Fr die Immersionstechnik drfen nur Objektive verwendet werden die deutlich mit Oel oder
Oil gekennzeichnet sind.
Fr die Vorbereitung einer Beobachtung bei so hohen Vergrerungen ist es wichtig das Prparat
zunchst bei den niedrigeren Vergrerungen genau zu untersuchen um zu entscheiden ob es sich
berhaupt lohnt.
Es bringt nichts, ein schlechtes Prparat bei strkerer Vergrerung zu betrachten ! (Vergrert
man Nichts wird nur mehr Nichts daraus )

B-1.3. Darstellungsmglichkeiten
B-1.3.1. Das Hellfeld
B-1.3.2. Das Dunkelfeld
Bei der Dunkelfeldmikroskopie wird das direkte Licht durch eine Ringblende ausgeblendet, sodass
kein direktes Licht mehr in das Objektiv gelangt. Es gelangen nur die vom Objekt reflektierten
Lichtanteile ins Objektiv, der Hintergrund bleibt dunkel. Das Dunkelfeld kann nur bei
Vergrerungen bis ca. 600-fach verwendet werden, weil die Lichtausbeute zu gering wird und die
starken Streueffekte das Bild verflschen wrden (Sieht dann so aus, wie Schifahren im
Schneetreiben). Es eignet sich manchmal fr die Beobachtung kontrastarmer Objekte.
Im Dunkelfeld lassen sich aber Strukturen beobachten, die kleiner sind als das
Auflsungsvermgen, weil die von ihnen reflektierten Lichtstrahlen zwar kein Bild ergeben
knnen, aber als Lichterscheinung vor dem dunklen Hintergrund dennoch auffallen (so wie ein
Leuchtturm, der nur anhand des Lichtes das von ihm ausgeht, gesehen wird und nicht als Turm
selbst). Bei vielen Mikroskopen kann man bei geschickter Kondensoreinstellung ein Dunkelfeld
erzeugen indem man einen etwa 1,5cm groen Kreis aus schwarzem Papier auf die ffnung der
Beleuchtungseinrichtung legt, sodass nur mehr ein etwa 3mm breiter Lichtring zum Kondensor
gelangt.

B-1.3.3. Der Phasenkontrast


Wie schon im Abschnitt F-1.2. erwhnt, wird das Licht am Objekt
auch in ein Beugungsmuster aufgeteilt, das rund um den
Hauptlichtkegel angeordnet ist.
Lichtbeugung ist ein normaler physikalischer Effekt, der meist
bersehen wird weil er nur recht schwach sichtbar ist. Deutlich zu
beobachten ist er aber an einer kleinen Lochblende in einem
schwarzen Karton, oder im Mikroskop bei klein eingestellter
Kondensor-Blende wenn man sich auf scharfe Hell/DunkelGrenzen konzentriert. An solch einer Kontrastgrenze erscheinen
dann Linien die genau parallel zur Objektkontur verlaufen, aber
nicht einem Detail des Prparates entsprechen sondern nur durch
Strahlengang bei Phasenkontrast C.N.
die Beugungseffekte entstehen.
Normalerweise wird das gebeugte Licht (1.Nebenmaximum) auch vom Objektiv eingefangen und
bei der Projektion des Bildes im Okular mit verwendet.
Fr die Mikroskopie im Phasenkontrast werden die Objektive nun so konstruiert, dass das 1.
Nebenmaximum optisch bearbeitet wird:
Dazu wird mittels einer Ringblende im Kondensor eine ringfrmige Lichtquelle erzeugt, wodurch
die Beugungsmuster des Prparates ringfrmig um den zentralen Lichtkegel auftreten und im
Objektiv einen Weg nehmen, der etwas weiter von der optischen Achse entfernt ist (weiter auen
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verluft). Der optische Trick bei der Phasenkontrast-Mikroskopie besteht nun darin, im Objektiv in
den Lichtweg dieses 1. Nebenmaximums eine Schicht einzubringen, in der es um /2 relativ zum
Hauptmaximum phasenverschoben wird, bevor es durch das Linsensystem wieder mit dem
Hauptmaximum zum Bild berlagert wird. Bei der Interferenz von Haupt- und Nebenmaximum
wird dadurch ein heller Hintergrund deutlich dunkler. An den Objektdetails geschehen ebenfalls
Phasenverschiebungen, und so erfhrt das Bild eine deutliche Kontrastverstrkung. Dies ist
besonders bei Objekten von Vorteil, die ungefrbt oder im Hellfeld kaum zu erkennen sind.
Jedes Phasenkontrastobjektiv hat seinen eigenen Phasenring und bentigt im Kondensor die dazu
passende Ringblende. Man muss also immer die richtige Phasenblende einstellen.
Durch den Phasenkontrast wird bei ungefrbten Objekten eine wesentliche Kontraststeigerung
erreicht, Bakterienzellen werden deutlich sichtbar. Gefrbte Objekte eignen sich nicht gut fr die
Beobachtung im Phasenkontrast, da die Helligkeitsunterschiede zu stark werden.

B-1.4. Dokumentation mikroskopischer Prparate


Die Protokollierung beginnt vor dem Anfertigen des ersten Prparates mit dem Notieren von Titel,
Datumsangabe, der Zusammenstellung notwendiger Materialien und Arbeitsvorschriften und
einer genauen Beschreibung der untersuchten Probe (Datum, Ort und Vorgangsweise der
Probennahme, Aussehen, Geruch, etc.)
Auch Tipps und Tricks fr das Anfertigen des Prparates sind an dieser Stelle auch sinnvoll !

B-1.4.1. Zeichnungen
Zeichnungen ermglichen im Unterschied zu Fotografien eine selektivere Darstellung. Man kann
nur relevante Strukturen abbilden (z.B. keine strenden Steinchen). Gleichzeitig kann man sich
whrend des Zeichnens schon berlegen, um welche Struktur es sich handeln knnte. Durch
Bettigung des Feinfokus lsst sich ein 3-dimensionalen Eindruck gewinnen den man dann besser
in ein 2-dimensionales Bild umwandeln kann.
Mit der Zeichnung geschieht also schon eine Interpretation des Bildes, das man sieht. Dadurch
kann bei komplexen Objekten leichter ein berblicksbild erstellt werden, als dies mit der
Photographie mglich ist.
Zeichnungen anzufertigen ist bungssache, folgende Hinweise erleichtern diese Arbeit aber:
 dnnen eher harten Bleistift verwenden.
 Keinen Anspruch an knstlerische Qualitt stellen
 Ein skizzenartiger berblick erleichtert spter das Auffinden

B-1.4.2. Fotographie
Mikrofotografien sind in Kombination mit berblicksdarstellungen gut zu verwenden. Trotz der
schlechteren Auflsung hilft manchmal ein Film vom selben Prparat, um dynamische Prozesse
besser erfassen zu knnen (z.B. Zeitrafferaufnahmen der Zellteilung).

B-1.5 Zusammenfassung:
Mikroskopische Prparate sollen dnn sein, um ein bersichtliches Bild zu bekommen.
Jedes mikroskopische Prparat wird zunchst bei der geringsten Vergrerung betrachtet. In
der Folge geht man schrittweise vorsichtig zu hheren Vergrerungen.
Das Lichtmikroskop dient vor allem der Beobachtung lebender Mikroorganismen bis zu 1600fachen Vergrerung.
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Fr eine optimale Auflsung sollte der Strahlengang eines Forschungsmikroskops gut justiert
und der Kondensor in der richtigen Hhe eingestellt sein (Khler).
Die Kondensorblende dient der Kontrast- und Schrfentiefenanpassung. Der Winkel des
austretenden Lichtkegels wird auf das verwendete Okular abgestimmt.
Die numerische Apertur ist abhngig von dem Brechungsindex des verwendeten Glases und
der optischen Konstruktion. Je hher die numerische Apertur, desto besser ist das
Auflsungsvermgen.
Die Auflsungsgrenze ist von der Wellenlnge des verwendeten Lichtes und von der
numerischen Apertur des Objektivs abhngig.
Die Gesamtvergrerung ergibt sich aus der Objektivvergrerung x Okularvergrerung
Immersionsobjektive ermglichen Vergrerungen bis an die Grenze
des
Auflsungsvermgens; zwischen Objektiv und Deckglas wird l eingebracht, das eine
Totalreflexion verhindert. Die numerische Apertur des Objektivs kann dadurch voll genutzt
werden.
Im Hellfeld wird das Objekt von unten durchstrahlt, dieses Licht gelangt vollstndig zum
Okular. Der Kontrast ist eher schwach, oft werden Frbungen genutzt, um den Kontrast zu
verstrken.
Die Phasenkontrastmikroskopie eignet sich vor allem zur kontrastreichen Beobachtung
lebender, schwach gefrbter Objekte. Bakterien sind besonders leicht zu erkennen.

B-2 Methoden der Mikrobiologie


B-2.1.Einsatzgebiete mikrobiologischer Arbeitstechniken
Der nachfolgende Text fhrt durch die spter im Einzelnen beschriebenen mikrobiologischen
Arbeitsmethoden und zeigt ihre jeweiligen Einsatzgebiete kurz auf.
In der Produktion (Biotechnologie)
Mikrobiologische Arbeitstechniken kommen zum Einsatz, wenn Mikroorganismen technologisch
(zur Herstellung verschiedener Produkte) verwendet werden. Typische mikrobiologische
Aktivitten in diesem Bereich wren z.B. die Isolierung von Mikroorganismen aus natrlichen
Quellen, die Anreicherung und Reinzucht bestimmter Stmme, die Stammhaltung und die
Fermentation (=Zchtung von Mikroorganismen). Auch im Bereich der Qualittskontrolle und sicherung werden mikrobiologische Arbeitstechniken verwendet (z.B. Hygienekontrollen).
Zum Nachweis von Mikroorganismen
Wie in der analytischen Chemie kann man auch in der Mikrobiologie qualitativ und quantitativ
arbeiten. Qualitative Nachweise wren z.B. der Nachweis bestimmter Krankheitserreger in
Lebensmittelproben - z.B. Salmonellen in Hhnerfleisch. Fr den qualitativen Nachweis, die
sogenannte Identifikation von Mikroorganismen werden nicht nur mikrobiologische
Arbeitsmethoden verwendet, sondern auch zunehmend mehr molekularbiologische Verfahren, bei
denen die Nukleinsure eines bestimmten Organismus nachgewiesen wird (z.B. PCR).
Mikrobiologische Identifikationen sind in der Regel mehrstufige Arbeitsreihen, bei denen nicht nur
morphologische Kriterien (z.B. die Form der Keime, das Vorhandensein von Geieln, das
Gramverhalten), sondern auch physiologische Eigenschaften berprft werden. Unter
physiologisch versteht man in diesem Zusammenhang, dass die jeweiligen Mikroorganismen
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bestimmte Stoffwechselprozesse durchfhren knnen, weil sie ber bestimmte Enzyme (und
damit ber bestimmte Gene) verfgen.
Voraussetzung fr eine mikrobiologische Identifikation ist das Vorliegen einer Reinkultur. Da die
meisten Proben mehr als eine Keimart enthalten (Mischkultur), wre es unmglich, das
Vorhandensein eines bestimmten Keims direkt in der Probe nachzuweisen. Will man das
Vorhandensein eines ganz bestimmten Keims nachweisen, muss man diesen Keim zuerst isolieren
und getrennt vermehren, dazu werden sogenannte Reinzuchtverfahren verwendet.
Enthlt eine Probe blicherweise keine Keime, wie z.B. Harn, ist es relativ einfach, einen Keim rein
zu zchten. Oft gengt einfaches Verdnnen und Anzchten. Ist die Keimzahl in der Probe gering,
muss der Keim z.B. durch Sterilfiltration angereichert werden - der Filter fischt alle Keime aus
einem greren Probenvolumen und kann zur Anzucht der Keime direkt auf ein festes
Nhrmedium gelegt werden.
Enthlt eine Probe hingegen normalerweise sehr viele unterschiedliche Keime, z.B. Stuhl, kann es
wesentlich aufwndiger sein, einen ganz bestimmten Krankheitserreger zu identifizieren. Damit
die Reinzucht nicht zu einer Suche nach einer Nadel im Heuhaufen ausartet, kann es notwendig
sein, die Wachstumsbedingungen so zu whlen, dass sich der gesuchte Keim gut vermehrt,
whrend alle anderen Keime kaum wachsen. Solche Verfahren bezeichnet man als
mikrobiologische Anreicherung. Die Selektivitt des Kulturmediums kann z.B. durch die Art der
vorhandenen Nhrstoffe, oder eine Wachstumshemmung durch Nhrmedienzustze erzielt
werden.
Quantitative Untersuchungen sind wichtig, wenn es nicht nur darum geht, welche Keime in der
Probe enthalten sind, sondern auch wie stark die Probe mit bestimmten Keimen belastet ist. Bei
quantitativen Bestimmungen kann einerseits die Zahl von Zellen (Zellzahlbestimmung),
andererseits die Zahl der Keime (Keimzahlbestimmung) ermittelt werden. Quantitative
Bestimmungen sind wichtig, weil z.B. die Zahl der pathogenen Keime in einem Lebensmittel
darber entscheidet, ob das Lebensmittel gesundheitsgefhrden ist, oder nicht. Ist die Zahl die
pathogener Keime gering, kann sich das Immunsystem gesunder Personen gegen eine Infektion
erfolgreich wehren, ist die Keimzahl hoch, gelingt die Immunabwehr oft nicht, die Person erkrankt.
Fr jeden Stamm gibt es daher Grenzwerte, die nicht berschritten werden drfen.

B-2.2. Sterilisation/Desinfektion/sterile Arbeitstechnik


Sterilisationsverfahren erfordern sehr viel Zeit, daher ist eine genaue Vorbereitung essentiell! Alle
spter durchzufhrenden Arbeiten mssen daher rechtzeitig bis ins letzte Detail geplant werden.
Definitionen:
Sterilitt bedeutet das Freisein von vermehrungsfhigen Mikroorganismen (inklusive Viren),
einschlielich deren Ruhe- oder Dauerformen. Aus theoretischer Sicht gibt es keine absolute
Sterilitt, die Zahl der Keime nimmt bei der Sterilisation exponentiell ab, erreicht aber nie die
Nulllinie. Beim Autoklavieren erreicht man z.B. eine Keimzahlreduktion um den Faktor 106.
Unter Desinfektion versteht man die Reduktion der Keimzahl um einen Faktor von mindestens
105, der Begriff stammt aus der Medizin, wo z.B. Hnde desinfiziert werden.
Unter Kontamination versteht man eine Verunreinigung mit unerwnschten Mikroorganismen.
Bedeutung steriler Arbeitstechniken:
 Schutz des Personals vor den Keimen aus der Kultur
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 Schutz der Kultur vor Keimen, die das Personal mitbringt


 Schutz der Umwelt vor umweltrelevanten Keimen
Grundregeln fr das mikrobiologische Arbeiten
 ALLE Gerte, die mit der Kultur in Kontakt kommen mssen sterilisiert sein.
 ALLE Arbeitsflchen mssen vor und nach der Arbeit desinfiziert werden.
 Die Hnde mssen gewaschen und eventuell desinfiziert sein.
Anwendungsbereiche von Sterilisationsverfahren
 Sterilisation von Nhrmedien (Autoklavieren, Sterilfiltration)
 Sterilisation von Zu- und Abluft (Sterilfiltration, UV-Bestrahlung)
 Sterilisation von Gerten und Apparaturen bis zur Gre von Fermentationsanlagen
 Sterilisation von Arbeitsgerten (Pipetten, Glasgerte etc.)
Gefahrenpotential bei Arbeiten mit Mikroorganismen
Von einzelnen pathogenen Keimen geht meist nur eine geringe Gefahr aus, weil sie vom
Immunsystem rasch besiegt werden knnen. Wenn solche Keime aber durch Bebrten stark
vermehrt werden, kann von den entstandenen Kulturen (= Kulturgef, Kulturmedium und
Keime) eine hohe Infektionsgefahr ausgehen, weil das Immunsystem mit der groen Zahl von
Keime nicht mehr zu Rande kommt. Es ist daher ein groer Unterschied, ob man mit einem
beimpften Medium oder mit einer dicht bewachsenen Kultur.
Die Einteilung der Mikroorganismen erfolgt nach Risikoklassen. Die erforderliche Ausstattung des
mikrobiologischen Labors hngt von der Risikoklasse des Mikroorganismus ab, mit dem gearbeitet
wird.
Risikoklasse
1
2
3
4

Eigenschaften der Keime


ohne erkennbare Gefahr
gewhnliches Gefahrenpotential
pathogene Keime
extrem gefhrliche Pathogene

Beispiele
Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus casei
Staphylococcus aureus,
Bacillus anthracis, Yersinia pestis
Ebolaviren

Tabelle: mikrobiologische Risikoklasse

B-2.2.1. Thermische Sterilisationsverfahren


Durch die Hitze werden Proteine denaturiert und viele Stoffe oxidiert, dies fhrt zum Absterben
der Keime.
Verfahren mit trockener Hitze
Hitzeschrank
Der Einsatz trockener Hitze ist apparatetechnisch unaufwndig, eignet sich aber nur fr
hitzestabile Stoffe, die keine Flssigkeiten enthalten. In der Regel verwendet man Temperaturen
von 160-180oC, die mindestens 2 Stunden einwirken. Die Gegenstnde mssen dabei
zugedeckt/eingewickelt/verschlossen werden, um eine erneute Verkeimung nach der Entnahme
zu verhindern. Behltnisse (Flaschen, Kolben) etc. drfen keine Gummi- oder Kunststoffdichtungen
besitzen und drfen keinesfalls dicht verschlossen werden, weil sonst kein Luftaustausch mehr
mglich wre, und die Behltnisse explodieren knnten. Um zu kontrollieren, ob die erforderliche
Temperatur tatschlich erreicht werden konnte, kann ein Hitze-empfindliches Band mit einem
Heiluftindikator verwendet werden. Der Farbumschlag besagt, dass die erforderliche Temperatur
erreicht worden ist, nicht aber, wie lange sie tatschlich eingewirkt hat.
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Ausglhen
Das Ausglhen in der Flamme des Teclusbrenners eignet sich fr extrem hitzebestndige
Materialien (z.B. Impfsen aus Platindraht). Es reicht dabei aus, das Metall kurz zur Rotglut zu
bringen. Ausglhen eignet sich nicht fr Stahl, da dieser bei den hohen Temperaturen brchig
werden kann.
Abflammen
Mit dem Abflammen erreicht man eine geringere Keimabttung als durch Ausglhen oder mit dem
Hitzeschrank. Das Abflammen kann mit mindestens 70%igem Ethanol (flambieren), oder auch
ohne Ethanol (z.B. ffnungen von Kolben oder Flaschen) erfolgen. Durch das Flambieren kann die
Einwirkzeit der Hitze verlngert werden, es eignet sich fr Gegenstnde wie Drigalskispateln aus
Glas, oder Pinzetten. Wichtig ist dabei, das Ethanol nur anzuznden, und dann auerhalb der
Flamme abbrennen zu lassen (Glas wird zu groer Hitzeeinwirkung brchig).
Feuchte Hitze (Autoklavieren)
Durch den Einsatz von Feuchtigkeit kann die Wrmebertragung verbessert werden, fr die im
Vergleich zur trockenen Hitze gleichen Sterilisationswirkung gengen geringere Temperaturen.
Das gngigste Verfahren ist das Autoklavieren, viele mikrobiologische
Nhrmedien knnen auf diesem Weg sterilisiert werden. Autoklaven sind
mit aus der Kche bekannten Drucktpfen vergleichbar, mit
zustzlichem Thermometer, Manometer und Ventil. Autoklaven werden
luftdicht verschlossen, dadurch baut sich beim Erhitzen ein berdruck
auf, der eine Erhhung des Siedepunkts des Wassers bewirkt. Der
erhhte Druck hat als solcher keine Bedeutung fr den Sterilisationeffekt,
nur die Erhhung des Siedepunkts ist fr die verbesserte
Sterilisationswirkung im Vergleich zum Abkochen unter Normaldruck
verantwortlich.

Deckel Certoklav
Abbildung Manometer
und Ventil eines
Tischautoklaven

Vegetative Formen von Mikroorganismen knnten bereits bei 100oC (Auskochen) inaktiviert
werden, fr die Vernichtung von Dauerformen (z.B. Bakteriensporen) sind hingegen hhere
Temperaturen (z.B. 121oC bei 1 bar berdruck) erforderlich. Grotechnische Anlagen verfgen
auch ber elektronische Steuereinheiten und Dokumentationssysteme, die den Verlauf der
Sterilisation aufzeichnen.
Wie bei der Sterilisation mit dem Hitzeschrank muss das Sterilisatonsgut verschlossen/verpackt
werden, und ein Luftausgleich mglich sein. In Gefe mit sehr kleiner ffnung wird eine geringe
Menge Deionat eingefllt, um hinreichende Feuchtigkeit im Inneren zu garantieren. Um eine
optimale Wrmebertragung auf das Sterilisationsgut zu erzielen, muss die gesamte Luft im Gert
durch Wasserdampf ersetzt werden, daher wird das Ventil whrend des Aufheizprozesses
geffnet, und nach dem Fllen des Innenraums mit Wasserdampf verschlossen. Die
Sterilisationszeit bei 121oC betrgt je nach Volumen des Sterilisationsguts 15-20 min, und
beginnt erst mit dem Erreichen der Sterilisationstemperatur. Vor dem ffnen des Topfes ist darauf
zu achten, dass der berdruck vollstndig abgebaut worden ist, und die Temperatur deutlich unter
100oC betrgt, um Siedeverzge zu vermeiden. Nhrmedien, die Verfestigungsmittel enthalten
(z.B. Agar-Agar,) neigen auf Grund der hohen Viskositt besonders stark zu Siedeverzug.
Autoklaven werden auch zum schonenden Aufschmelzen von festen Nhrmedien (z.B. nach
Lagerung) verwendet, dabei wird mit geffnetem Ventil im strmenden Dampf bei 100oC
aufgeschmolzen.

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10

Fr hitzeempfindliche Medien kann der Autoklav auch zur fraktionierten Sterilisation


(=Tyndallisation) eingesetzt werden, dabei wird das Medium nur auf 100oC erhitzt. Anschlieend
wird das Medium bei einer geeigneten Temperatur bebrtet, um eventuell vorhandene
Dauerformen (z.B. Bakteriensporen) zum Auskeimen (Ausbildung der vegetativen Form) zu
bringen. Anschlieend werden der Erhitzungs- und Bebrtungsprozess zweimal wiederholt, um
alle vorhandenen Dauerformen zu aktivieren und anschlieend abzutten.

B-2.2.2. Physikalische Sterilisationsverfahren


Physikalische Sterilisationsverfahren knnen entweder
zur Abtrennung der Keime fhren (z.B. Filtration), oder
zur irreversiblen Schdigung (z.B. Strahlung).

Sterilfilter (gro und Spritze)

Sterilfiltration
Fr die Sterilfiltration werden unterschiedliche Typen von
Filtern verwendet:
 Membranfilter: besitzen eine definierte Porengre. Sie eignen sich fr die Sterilisation
von hitzelabilen Flssigkeiten und Nhrmedien
 Tiefenfilter: besitzen keine definierte Porengre, aber eine hohe Materialstrke. Die
einzelnen Hohlrume im Filtermaterials knnen durchaus grer als die abzutrennenden
Keime sein, auf Grund der hohen Materialstrke bleiben die Keime aber dennoch
irgendwann einmal im Material hngen. Wattestopfen eignen sich z.B. als Luftfilter fr
Pipetten und Kulturkolben. Beim Verschlieen von Kolben ist es wichtig, die Wattestopfen
so gro zu dimensionieren, dass sie auch mehrmals leicht entfernt, und wieder aufgesetzt
werden knnen.
UV-Licht
UV-Licht eignet sich nur fr Oberflchen- und Luftdesinfektion, weil UV-Strahlung fast nicht in
feste Materialien eindringen kann. Anwendung z.B. zur Luftdesinfektion steriler Arbeitsbereiche
(Sterilrume, sterile Werkbank). Achtung UV-Licht kann Netzhautschden und Hautkrebs
verursachen! Vor der Nutzung des bestrahlten Raums ist daher das UV-Licht auszuschalten.
Radioaktive Bestrahlung
Nur fr den industriellen Einsatz, z.B. bei der Sterilisation von Einmalkunstoffartikeln.
Chemische Sterilisation/Desinfektion
Desinfektionsmittel knnen nach ihrer Wirkung unterschieden werden:
Vorsilbe
bakteriofungiviro-

Endung
-zid
-statisch
-zid

Tabelle Benennung der Wirkung von Desinfektionsmitteln; zid=abttend; statisch = wachstumhemmend

Kommerzielle Desinfektionsmittel werden zur Desinfektion von Oberflchen verwendet. Wenn


Gerte nicht autoklaviert werden knnen, knnen sie vor der Reinigung ebenfalls in
Desinfektionsmitteln eingelegt werden (z.B. Messpipetten aus Glas, Objekttrger). Dabei ist es
wichtig, die Herstellerinformationen zu beachten, da eine erfolgreiche Desinfektion bestimmte
Wirkstoffkonzentrationen und Einwirkzeiten (!) erfordert.
Inhaltsstoffe von Desinfektionsmitteln
 Alkohole
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Im Laboralltag wird hufig 70%iges Ethanol eingesetzt. Der Wasseranteil reduziert die
Verdunstungsgeschwindigkeit, und verlngert somit die Einwirkzeit. Fr eine effiziente
Desinfektion sind 15 min Einwirkzeit sinnvoll.
Kommerzielle Desinfektionsmittel enthalten oft Isopropanol.
Alkohole fhren zur teilweisen Denaturierung von Proteinen und zur Auflsung biologischer
Membranen (Phosholipide); Bakteriensporen werden aber nicht abgettet.

 Formaldehyd

Kommerzielle Desinfektionsmittel enthalten oft Aldehyde. Diese reagieren mit Proteinen und
inaktivieren sie. Aldehyde werden auch als Konservierungsmittel eingesetzt (Fixierung in der
Mikroskopie und Laerung von Leichen!).

 Detergentien

Detergentien wirken im Prinzip wie Seife (Emulgatoren), sie lsen biologische Membranen auf
und lagern sich an Proteine an. Detergentien besitzen auch eine Reinigungswirkung, sie lsen
Lipide (= fetthnliche Stoffe); mineralische Rckstnde sind dadurch nicht entfernbar.

B-2.2.3. Der sterile Arbeitsplatz


Um sterile Arbeitsbedingungen einhalten zu knnen, sind eine Reihe von Vorsichtsmanahmen zu
treffen. Es geht dabei nicht nur um den Schutz der Person und der Umwelt vor gefhrlichen
Keimen, sondern auch um den Schutz der Medien/Kulturen vor Kontaminationen. Die Einhaltung
der Vorsichtsmanahmen erscheint mitunter mhsam und bertrieben, ist aber fr erfolgreiches
mikrobiologisches Arbeiten essentiell eine einzige Kontamination whrend eines lngeren
Arbeitsprozesses kann dazu fhren, dass die ganze Arbeit wiederholt werden muss.
Folgende Grundstze sollten beachtet werden:
 frisch gewaschene Arbeitsmntel verwenden:

Arbeitsmntel, die lnger in Gebrauch sind, weisen auf ihrer Oberflche deutlich mehr Keime
auf als frisch gewaschene

 Uhr und Schmuck ablegen:

in Ritzen und Fugen sammeln sich viele Keime, die zu Kontamination fhren knnen

 Arbeitsflche vor Arbeitsbeginn und nach Arbeitsende mit Ethanol abwischen:

Der Arbeitsplatz kann Keime aufweisen und die Medien/Kulturen kontaminieren.


Keime knnten auf nachfolgende Personen und Kulturen bertragen werden.

 Hnde waschen:

Mit Seife knnen 60-80% der auf der Hautoberflche vorhandenen Keime entfernt werden
(Mikrobiologische Arbeitsmethoden, Bast, 1998).
Laboruntersuchungen zeigen aber, dass sich auf mit Seife gewaschenen Hnden noch jede
Menge Keime befinden. Fr heikle Arbeiten (z.B. Operationen) wird daher mit Desinfektionsmitteln desinfiziert.

 keine berflssigen Gegenstnde am Platz:

Gegenstnde knnen Keimtrger sein, bzw. wenn die Gegenstnde das Labor verlassen, knnen
unerwnschte Keime z.B. mit nach Hause genommen werden bzw. in den Pausen konsumierte
Lebensmittel kontaminiert werden.

 Zugluft vermeiden:

Luft enthlt Bakterien- und Pilzsporen; Zugluft wirbelt Staub, und somit weitere Keime auf.
gleichzeitige Reduktion der Bewegungsgeschwindigkeit Gefahr der Aufwirbelung von Luft

 Anordnung der erforderlichen Gegenstnde genau planen

Kreuz und quer ber den Platz greifen erhht die Kontaminationsgefahr

 zgig, aber nicht hastig arbeiten:

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zgige Arbeitstechnik reduziert die Gefahr, dass Keime aus der Luft in geffnete Gefe mit
sterilem Inhalt fallen
hastige Arbeitstechnik fhrt zur Aufwirbelung von Luft
nicht ber offene Gefe mit sterilem Inhalt greifen: Keime knnten von Hand/Arbeitsmantel in
das Gef fallen
nicht ber Kreuz greifen

 in der Nhe des Brenners arbeiten (max. 30 cm Entfernung!)

heie Luft hat eine geringere Dichte und steigt daher auf. Keime werden nach oben mitgerissen
und fallen nicht auf die sterilen Gegenstnde/Medien (Kamineffekt)

 Auf Sterilitt der verwendeten Gegenstnde achten:

Alle Gegenstnde, die mit Medien oder Kulturen in Kontakt kommen, werden sterilisiert.
Alle Gegenstnde, die mit sterilen Gegenstnden in Kontakt kommen werden desinfiziert.
Gegenstnde, die steril bleiben sollen, drfen nicht auf der Arbeitsflche abgelegt werden die
Arbeitsflche ist nicht steril, sondern nur desinfiziert, sie enthlt daher einige Keime.
Sterile Gefe sollen mglichst lange verschlossen gehalten werden - Verhinderung des
Eindringens von Keimen.
Gegenstnde mglichst weit von sterilem Bereich entfernt mit den Hnden angreifen z.B.
Glasmesspipette nur ganz oben angreifen
Unsterile Gegenstnden nicht in sterile Gefe tauchen z.B. sollte bei Mikroliterpipetten der
Schaft nicht in Flaschen mit sterilem Inhalt getaucht werden; hier hilft es, die Flasche schrg zu
halten, und somit die Pipette nicht so tief eintauchen zu mssen
bei Husten oder Niesen Kopf wegdrehen: Der Hals-/Rachenraum enthlt viele Keime
Sprechen mglichst vermeiden
Mit den Hnden whrend der sterilen Arbeit keine stark kontaminierten Flchen angreifen z.B.
das eigene Gesicht, das Handy etc.

 kontaminierte Gegenstnde getrennt sammeln (Biohazardkbel) und erst nach der


Dekontamination entsorgen.

Meist wird autoklaviert, in manchen Fllen auch in Desinfektionsmittel eingelegt. Autoklavierter


Mll ist harmlos, und kann mit dem Restmll entsorgt werden. Diese Manahme wre
gesetzlich erst ab Sicherheitsstufe 2 erforderlich, es ist aber ratsam, auch Keime der Risikoklasse
1 abzutten. Zudem knnen auf Nhrmedien auch unbekannte Keime aus der Umwelt
anwachsen, die einer hheren Sicherheitsklasse zuzuordnen sind

B-2.2.4. Die sterile Werkbank (Laminar Flow)


Sterile Werkbnke ermglichen weitaus sauberere Arbeitsbedingungen als konventionelle
mikrobiologische Arbeitsflchen. Die Keim-freie Umgebung ist z.B. fr Arbeiten mit tierischen oder
pflanzlichen Zellkulturen (menschliche, tierische, pflanzliche Zellen) unbedingt erforderlich (siehe
Kapitel Zellkultur).
In sterilen Werkbnken wird die Luft steril filtriert, und in der Regel von oben auf den sterilen
Arbeitsplatz geblasen (laminare Strmung). Bei der Arbeit in der sterilen Werkbank sollte man die
Richtung der Luftstrmung kennen, da die Keime von Hnden, Arbeitsmantel etc. in diese Richtung
mittransportiert werden, und in sterile Medien, Kulturen etc. gelangen knnen.
Der Luftfilter des Laminar-flow hat eine begrenzte Lebensdauer und muss regelmig gewartet
werden. Man sollte daher nur so lange wie notwendig in der Werkbank arbeiten und kontrollieren,
ob die Nutzungszeit des Filters noch nicht berschritten ist.
Vor Beginn der Arbeiten sollte die Ventilation schon etwa 5 Minuten in Betrieb sein.
Bei manchen Gerten kann whrend der Nicht-Benutzung eine UV-Lampe eingeschaltet werden.
Vor dem Arbeiten im Laminar-flow muss diese Lampe ausgeschaltet werden.
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Das Abflammen von Flaschenffnungen ist nur sinnvoll, wenn der Brenner eine Abschirmung hat,
die eine Strung der laminaren Strmung verhindert.
Kurze Checkliste fr das Arbeiten im Laminar-flow:
 Oberflchendesinfektion der Arbeitsflche whrend die Werkbank nicht in Betrieb ist
 UV-Licht ausschalten, Ventilation einschalten
 konsequente Hndedesinfektion
 Abwischen von Gegenstnden mit Ethanol, bevor sie in die sterile Werkbank gestellt
werden
 Sammelbehlter fr kontaminierte Gegenstnde vorbereiten

B-2.3. Nhrmedien und ihre Herstellung


Aufgaben von Nhrmedien
Flssige und feste Nhrmedien dienen der Kultivierung von Mikroorganismen zur Anreicherung,
Anzucht, Anlegen von Reinkulturen etc. Sie mssen alle Stoffe enthalten, die der jeweilige
Mikroorganismus zum Wachsen bentigt.
Zusammensetzung von Nhrmedien:
Die Zusammensetzung von Nhrmedien variiert wegen der unterschiedlichen Stoffwechselfhigkeiten verschiedener Mikroorganismen stark,
und muss daher an den jeweiligen
Mikroorganismus angepasst werden.
Da alle Organismen fr den Aufbau zelleigener Stoffe bestimmte Atome bentigen, knnen die
Inhaltsstoffe in sogenannten Quellen unterteilt werden:
Kohlenstoff-, C-Quelle:
 fr heterotrophe Organismen organische Stoffe (z.B. Zucker, Kohlenhydrate)
 fr autotrophe Organismen CO2 aus der Luft oder HCO32Sauerstoff-, O-Quelle
 fr aerobe Organismen Sauerstoff meist aus der Luft gut belften, flssige Kulturen
schtteln!)
Wasserstoff-, H-Quelle:
in organischen Verbindungen bzw. Wasser enthalten
Stickstoff-, N-Quelle:
fr die Protein- und Nukleinsurebiosynthese
 NO3-, NO2-, NH4+ fr die meisten Mikroorganismen
 anspruchsvolle Mikroorganismen, z.B. viele pathogene Keime, bentigen Aminosuren
 Stickstoff-fixierenden Mikroorganismen gengt N2 aus der Luft
Phosphat-, P-Quelle:
meist PO43-; wirkt auch puffernd
Weitere Inhaltsstoffe:
 Puffersubstanzen: CO3-, PO4-,..
 Stoffe, die spezielle Erfordernisse des jeweiligen Mikroorganismus abdecken z.B.
Vitamine, Mineralstoffe, bestimmte organische Verbindungen zur Synthese
mikrobieller Stoffwechselprodukte

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Einteilung von Nhrmedien:


Nhrmedium = berbegriff fr feste und flssige Nhrmedien
Einteilung nach der Konsistenz:
 flssig: Name: -bouillon, -extrakt
 fest (= NhrBODEN): enthalten Verfestigungsmittel (Name: -agar; --gelatine)
Einteilung nach der Verwendung:
Universalmedien:
viele verschiedene Organismen knnen gedeihen; z.B. Nhrbouillon fr Bakterien,
Malzextrakt odser Wrze fr Pilze
z.B. fr die Bestimmung der Gesamt-Keimzahl
Selektivmedien:
nur ein bestimmter/wenige Mikroorganismen knnen gedeihen; enthalten z.B. Substrate,
die nur von sehr wenigen Mikroorganismen verwertet werden knnen; enthalten z.B. pHIndikatoren, um Surebildung anzuzeigen,..
z.B. zum Nachweis eines bestimmten MOs
z.B. ENDO-Agar zur selektiven Anzucht von Enterobakterien
Einteilung nach den Ansprchen:
Minimalmedien:
nur Mindestansprche des jeweiligen MOs erfllt
fhrt zu niedrigen Wachstumsgeschwindigkeiten
kommt z.B. bei Selektivmedien vor
Vollmedien:
reiches Nhrstoffangebot, daher optimales MO-Wachstum
Einteilung nach der Zusammensetzung:
natrlich = komplex
bestehen aus natrlichen Ausgangsstoffen
keine exakt definierte chemische Zusammensetzung
z.B. Malzextrakt, Hefeextrakt
knstlich:
Zusammensetzung aus Einzelkomponenten
chemisch genau definiert
z.B. Einwaage bestimmter Salze
Wichtige natrliche Inhaltsstoffe von Nhrmedien:
Peptone:
Proteine (lange Aminosureketten; z.B. aus Fleisch, Soja,.-) werden zu Peptiden (krzere
Aminosureketten) zerlegt, daher besser von Mikroorganismen verwertbar (weniger
Verdauungsschritte erforderlich)
Zerlegung durch Sure Surehydrolyse
Zerlegung durch Proteasen (Protein-spaltende Enzyme) Proteolyse
z.B. Pankreasproteasen eine davon ist Trypsin: Trypton; z.B. Pepsin (Protease aus
dem Magen): Pepton
Fleischextrakt:

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Fleisch wird durch Proteasen anverdaut und dann ausgekocht: enthlt Peptide,
Aminosuren, andere organische Substanzen, Vitamine, Mineralstoffe
Hefeextrakt:
autolysierte (sich selbst zersetzende) Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae)
enthlt B-Vitamine (aus den Getreidekrnern, die zur Bierherstellung verwendet wurden)
Malzextrakt:
Malz = Gerstenkrner, die zum Keimen gebracht worden sind, Strke wird durch das in den
Krnern vorhandene Enzym Amylose zu Glukose abgebaut; Malz enthlt viel Maltose
(Zucker; Disaccharid aus 2 Glukoseeinheiten)
Verfestigungsmittel:
Zur Herstellung fester Nhrmedien = Nhrbden
Agar-Agar:
wichtigstes Verfestigungsmittel fr Mikrobiologie
aus marinen Rotalgen gewonnenes Kohlenhydrat
Gelatine:
seltener eingesetzt
aus Knochen und Knorpeln gewonnenes Protein
schmilzt bei 37oC, daher fr viele MOs nicht geeignet
schonend sterilisieren
Wahl von Nhrmedien
richtet sich nach den anzuzchtenden Organismen
richtet sich nach der Begleitflora (andere Keime in der Probe, die nicht angezchtet
werden sollen); z.B. fr definierte Stmme kein Selektivmedium erforderlich
Nhrbodenhandbuch bzw. Herstellerseiten zur Medienwahl heran ziehen
(www.oxoid.com; 3.7. 2012; www.merckmillipore.de/food-analytics; 3.7.2012)
Hinweise zur Herstellung von Nhrmedien
Nhrmedien, die durch Auflsen fester Inhaltstoffe hergestellt werden, mssen sofort nach dem
Lsen sterilisiert werden, da auch bei khler Lagerung ein gewisses Wachstum von
Mikroorganismen stattfindet.

B-2.4. Kultivierung von Mikroorganismen


Die Wachstumsgeschwindigkeit von Mikroorganismen hngt von vielen unterschiedlichen
Faktoren ab:
 Zustand der Zellen vor Kultivierungsbeginn (z.B. vorher eingefroren, oder auf
Minimalmedium wachsend, beraltert,)
 Bestandteile des Nhrmediums
 Konzentrationen der Bestandteile des Nhrmediums
 Kultivierungsform: fest oder flssig. In flssigen Medien knnen Nhrstoffe leichter
diffundieren, und Mikroorganismen besser versorgt werden; will man Keime
aufpppeln, ist es daher besser, zuerst in einem flssigen Medium zu kultivieren
 Bebrtungszeit
 Bebrtungstemperatur
 Bebrtungsbedingungen: z.B. aerob, oder anaerob. Bei aerober Kultivierung ist es
wichtig, gengend Sauerstoff zuzufhren, da die Sauerstoffsttigung wssriger
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Lsungen sehr gering ist. Im kleinen Mastab hilft es a) das Kulturgef nur zu maximal
einem Drittel zu befllen, um gut schtteln zu knnen, und b) Kultivierungsgefe mit
Einbauten (Schikanen ) zu verwenden. In greren Mastben wird aktiv belftet.
In der Praxis wird hufig zu wenig auf den Zustand der Zellen geachtet, mit denen ein
Medium beimpft wird: Werden Bakterien ber lngere Zeit (mehrere Wochen, abhngig vom
Stamm) gelagert, enthlt die Kultur hufig eine groe Zahl abgestorbener/wenig vitaler Zellen.
Ebenso schlecht kann der Zustand von Zellen einer Kultur sein, die zu lange bebrtet worden
sind. Die Zellen leiden unter Nhrstoffmangel und der Anhufung wachstumshemmender und
toxischer Stoffwechselendprodukte (z.B. Suren).

Abb. Wachstumskurve von Mikroorganismen in einer Flssigkultur

Kontraproduktiv kann es auch sein, flssige Medien mit einer zu hohen Zellzahl zu beimpfen:
die Zellen gelangen rasch in die stationre Phase bzw. Absterbephase. Fr die Beimpfung von
Medien daher minimalste Zellmengen verwenden (z.B. berhrt man zur Zellentnahme eine
Kolonie nur mit einer Impfse).

B-2.4.1. Kulturgefe
Fr Flssigkuluren werden hufig Erlenmeyerkolben verwendet, da das Medium bei geringer
Befllung sehr gut geschttelt werden kann, und aerobe Organismen dadurch gut mit Sauerstoff
versorgt werden knnen. Die Erlenmeyerkolben werden vor der Sterilisation - mit einem
luftdurchlssigen Metallverschluss, oder Watte zugedeckt (diese wirkt als Tiefenfilter, fngt also
von oben herunterfallende Keime ab). Im kleineren Mastab knnen Kulturrhrchen*1, die mit
einer Metallkappe (Kapsenbergverschluss) abgedeckt sind, verwendet werden. Die
Durchmischung des Mediums ist allerdings schlechter als in Erlenmeyerkolben.
*1

Kulturrhrchen haben im Gegensatz zu Eprouvetten keinen gebogenen Rand

Feste Kulturen werden meist in Petrischalen (Platten) angelegt.

B-2.4.2. Probenahme
Flssige oder feste Kulturmedien knnen entweder mit einer Probe (z.B. Lebensmittelprobe) oder
mit den Zellen einer Reinkultur beimpft werden.
Gerte zur Beimpfung flssiger Medien:
 Pipette, ev. mit Drigalskispatel
Gerte zur Beimpfung fester Medien
 Impfse: fr Bakterien, Hefen
 Impfnadeln: fr Schimmelpilze
Beimpfung fester Medien
Zur Untersuchung von Luft knnen folgende Verfahren eingesetzt werden:
 ffnen einer Petrischale mit Nhrboden fr einen definierten Zeitraum (z.B. 10 min)
 Filtration eines definierten Luftvolumens durch ein Bakterienfilter; Auflegen des Filters
auf feste Nhrbodenoberflche
Zur Untersuchung von Oberflchen knnen folgende Verfahren eingesetzt werden:

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 Print (=Abklatsch): kurzfristiges Auflegen des zu untersuchenden Gegenstands oder


Nutzung eines Klebestreifens zur bertragung der Keime auf den Nhrboden
Zur Untersuchung von Flssigkeiten knnen folgende Verfahren eingesetzt werden:
 Probenaliquot auf Petrischale ausstreichen, z.B. mit Drigalskispatel, fraktionierter
Ausstrich mit Impfse (siehe Reinzuchtverfahren)
 Aliquot einer Verdnnung der Probe ausstreichen
 Sterilfiltration eines definierten Probevolumens, Auflegen des Filters auf einen
Nhrboden
Zur Vermehrung von Pilzen kann ein Teil des Myzels mit einer sterilisierten Pinzette aufgelegt
werden.

B-2.4.3. Bebrtung
Nach der Beimpfung wird bei einer fr die jeweiligen Mikroorganismen geeigneten Temperatur
bebrtet*2.
Temperatur und Zeit hngt von Mikroorganismus ab; beides muss daher protokolliert werden
z.B. viele Pilze 30oC, 3-4 Tage
z.B. Bakterien aus der Umwelt 30oC, 2 Tage
z.B. E. coli 37oC, ber Nacht

*2

..Das Wort Bebrtung schreibt man trotz des langgezogenen nicht mit h!

B-2.4.4. Anreicherungen
In vielen Fllen ist der Mikroorganismus, der identifiziert oder untersucht werden soll, Teil
einer Mischkultur, d.h. die Probe enthlt viele andere Mikroorganismen. Diese, fr die
jeweilige Untersuchung nicht interessanten Mikroorganismen bezeichnet man auch als
Begleitflora. Sie knnen eventuell weiteren Untersuchungsschritte stren.
Um den Anteil der erwnschten Keime gegenber der Begleitflora zu erhhen, kann man
Wachstumsbedingungen whlen, die das Wachstum der erwnschten Mikroorganismen
verbessern, und gleichzeitig das Wachstum der Begleitflora hemmen. Diese
Wachstumssteuerung kann durch selektive Nhrmedien (Wahl der Inhaltsstoffe,
Anwesenheit von wachstumshemmenden Stoffen, PH-Wert) sowie die Wahl der
Bebrtungstemperatur und zeit erfolgen.

B-2.4.5. Anzuchtverfahren
Anzucht von Pilzen aus der Umwelt
Pilzsporen sind ein Bestandteil von Staub; Pilzsporen findet man daher in der Luft, bzw. in
konzentrierte Form auf Kehrgerten. Da viele Pilze auch bei niedrigen pH-Werten gedeihen,
knnen sie auch von der Oberflche von Frchten bzw. anderen Pflanzenteilen gewonnen werden.
blicherweise wird ein Universalnhrmedium fr Pilze (z.B. Malzextraktagar, Wrzeagar,
Sabauroudagar) gewhlt.
Anzucht von Bakterien aus der Umwelt
Bakterien findet man an feuchten Standorten z.B. Waschbereichen, WC-Anlagen. Besonders
keimreich sind Oberflchen, die hufig angegriffen, und wenig gereinigt werden (z.B.
Computertastaturen, Schlssel). Eine ergiebige Quelle Bakterien sind auch Reinigungstcher (z.B.
Wettex).

B-2.4.6. Reinzuchtverfahren
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Eine Reinkultur enthlt nur Mikroorganismen eines ganz bestimmten Stammes, die Zellen einer
Reinkultur sind genetisch (fast) ident, sie sind Klone.
Ein einfaches Verfahren zur Anlegung von Reinkulturen ist das sterile Verdnnen der Probe, und
das anschlieende Ausplattieren von Aliquoten der Verdnnung auf einer Platte mit festem
Nhrmedium. Jede Einzelkolonie besteht aus Klonen.
In der Bakteriologie gngig ist vor allem der
fraktionierte Ausstrich (=13-Strich-Verfahren).
Dafr wird eine Impfse in die Probe getaucht,
und mehrere Parallelstriche auf einer Platte mit
Nhrboden gezogen. Anschlieend wird die
Impfse ausgeglht, um anhaftende Keime
abzutten, und die se in einem flachen Winkel
ber die ersten Impfstriche gezogen. Diese
Vorgangsweise wird 1-2x wiederholt.
Fraktionierter Ausstrich

Eine Reinzucht in Flssigmedium erhlt man,


wenn die Probe so stark verdnnt wird, dass - statistisch gesehen - nur mehr 1 Keim pro Rhrchen
vorhanden ist.
Eine Reinzucht gilt ist erst dann als gesichert, wenn das Reinzuchtverfahren mindestens 2x
wiederholt worden ist.
Fr den biotechnologischen Einsatz ist es auch wichtig, dass alle Keime, die zu einer Fermentation
verwendet werden, das gleiche Wachstumsverhalten haben. Da in Nukleinsuren laufend
Mutationen auftreten, und viele Keime sehr kurze Generationszeiten haben, kann es sein, dass die
Tochterkeime bereits nach einmaliger Bebrtung genetisch nicht mehr ganz ident sind, und sich
daher in ihrer Wachstumsgeschwindigkeit unterscheiden. Man verwendet daher in der Praxis
immer eine Einzelkolonie (=Gruppe von Keimen, die aus einer Zelle entstanden sind) zur
Beimpfung.

B-2.5. Stammhaltung
Bakterien, aber auch Eukaryontenzellen (z.B. Spermien) knnen ber lngere Zeit haltbar gemacht
werden.
Die Wahl der Methode hngt von der Dauer der geplanten Lagerung ab. Die Konservierung wird
grundstzlich durch Verlangsamung (Khlen, Senkung der Nhrstoffkonzentration) oder
kompletter Hemmung des Wachstums erzielt (Einfrieren, Gefriertrocknung). Rasches Einfrieren
und der Zusatz von Gefrierschutzmitteln (z.B. Glyzerin, DMSO) verringert Zellschden und erhht
somit die berlebensrate.
Wenn mglich, sollte von genetisch mglichst einheitlichen Organismen ausgegangen werden (z.B.
Einzelkolonie von Bakterien; siehe Kapitel Reinzuchtverfahren).

B-2.5.1. Stammhaltung von Bakterien


Um mglichst vitale Zellen zu erhalten, sollte vor der Konservierung eine frische Kultur angelegt
werden am besten eine Flssigkultur. In einer Flssigkultur knnen die Nhrstoffe besser
diffundieren als in einem festen Nhrmedium - das Anwachsen der Zellen wird erleichtert. Die
Flssigkultur sollte nicht zu lange bebrtet werden (bernachtkultur), damit die Zellen ihre
Vitalitt nicht einben und in die Absterbephase gelangen. Bei rekombinanten Stmmen
Selektionsmedium (z.B. Antibiotikazusatz) verwenden.
Kurzfristige Lagerung (1-2 Wochen)
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Kulturen auf festen Nhrmedien in Petrischalen knnen meist einige Wochen gelagert werden,
wenn die Platten im Khlschrank gelagert werden und mit Parafilm verschlossen sind (Schutz vor
Austrocknung).
Mittelfristige Lagerung (mehrere Monate)
Ausstrich auf Schrgagarrhrchen (Rhrchen mit Kapsenbergverschluss; Konzentration der
Medieninhaltsstoffe nur 1/10 der normalen Einwaage) oder in einem Schraubrhrchen mit
Schrgagar (dicht verschliebar); Lagerung im Khlschrank
Abbildung Schrgagarrhrchen
Langfristige Lagerung
Glyzerinkultur
 900 l Flssigkultur in steriles Kryorhrchen (kltefester Kunststoff) einfllen
 Zusatz von 10 % (v/v) sterilem Glyzerin*, gut mischen
 Einfrieren (idealerweise mit flssigem Stickstoff Schutzbrille, Handschuhe, in
Styroporbehltnis bergieen), ansonsten direkt in den -80OC Schrank geben)
 Lagerung bei -80C
* Glyzerinlsung in verdnnter Form (z.B. als 50%ige Lsung) autoklavieren

Lyophilisation (Gefriertrocknung)
Steht ein Lyophilisator zur Verfgung, kann eine gefriergetrocknete Kultur angelegt werden, die
besonders lange haltbar ist. Lyophilisate von Milchsurebakterien sind in der Apotheke zur
Behandlung von Darmerkrankungen erhltlich.
Lagerung in flssigem Stickstoff
 Schockfrieren eines Aliquots einer Flssigkultur in flssigem Stickstoff (Schutzbrille,
Handschuhe, in Styroporbehltnis bergieen)
 Lagerung in flssigem Stickstoff

B-2.5.2. Stammhaltung von Schimmelpilzen


Sporensuspension
 Kultivierung der Pilze auf einer Platte bis zur Ausbildung von Sporen (meist an
Verfrbungen in der Koloniemitte erkennbar)
 Aufpipettieren von physiologischer Kochsalzlsung (0,9% w/v)
 Absplen der Sporen durch Schwenken der Platte und Auf-/Abpipettieren
 Lagerung im Khlschrank in verschlossenen Behltnissen (ev. mit 20% Glycerin versetzt)

B-2.6. Untersuchung von Bakterien


B-2.6.1 Makroskopische Untersuchung von Bakterienkolonien
Bakterienkolonien knnen vielfltige Morphologien annehmen. Folgende Koloniemerkmale
knnen erhoben werden:
 Farbe
 Glanz
 Rand (von oben betrachtet)
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 Form (von der Seite betrachtet)


 besondere Merkmale

Tab. Koloniemerkmale

B-2.6.2. Mikroskopische Untersuchung von Bakterienkolonien


In der mikrobiologischen Praxis spielen Archa nur eine geringe Rolle, weil viele von ihnen an
extreme Standorte angepasst sind. In der letzten Zeit mehren sich die Hinweise, dass sie weiter
verbreitet sind als bisher angenommen. In den meisten mikrobiologischen Proben (Wasser,
Lebensmittel, medizinische Proben) werden routinemig nur echte Bakterien (Bacteria)
nachgewiesen, Klrschlammproben enthalten aber auch Methanogene.

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Bakterien knnen in der Regel schon durch ihre geringere Gre von eukaryontischen Einzellern
unterschieden werden (Prokaryonten etwa 1m, Eukaryonten meist grer als 10m).
Morphologische Untersuchung
Bakterien besitzten unterschiedliche Formen (siehe Tabelle), die morphologische Untersuchung
erlaubt es aber nicht, die jeweilige Art zu identifizieren so gibt es tausende verschiedene Kokkenbzw. Stbchenbakterien. Bakterien sind meist regelmig geformt, im Gegensatz zu vielen Hefen,
deren Zellen sich in Form und Gre strker voneinander unterscheiden (siehe Abb.).

Abbildung links: Vibrio cholerae (Abbildung von Ronald Taylor, Tom Kirn, Louisa Howard, Bildquelle Wikimedia
commons); rechts: Saccharomyces cerevisiae (Abbildung von Masur, , Bildquelle Wikimedia commons)

Fachbegriff
Kokken

Form
kugelfrmig

Stbchen

an den Enden
abgerundete Zylinder
Kurz und gebogen
(U-Hakerl)
Spiralfrmig

Vibrionen
Spirillen
Fden

Tabelle Morphologie von Bakterien.


Varianten
Beschreibung
Monokokken
In der Regel einzeln vorliegend
Diplokokken
In der Regel als Paar vorliegend
Tetrakokken
In der Regel in Viererpaketen vorliegend
Octakokken
In der Regel als Achterpaket vorliegend (Wrfel),
z.B. Sarcina sp.
Streptokokken
In der Regel kettenfrmig
Staphylokokken
In der Regel haufenfrmige Anordnung
Kurzstbchen
Lnge : Breite < 3:1, z.B. Escherichia coli
Langstbchen
Lnge : Breite > 3:1

z.B. Borrelia sp.


Pilzartiges aussehendes Wachstum, aber Fden
dnner; z.B. Actinomycetes sp.

Zur morphologischen Untersuchung gehrt auch das Vorhandensein bzw. die Art der Begeielung.
Geieln sind aber zu dnn um im Lichtmikroskop ohne Frbung sichtbar zu sein. Sie knnen durch
Geielfrbungen dargestellt werden. Auch ohne Frbung kann die durch Geielrotation
hervorgerufene Bewegung beobachtet werden: die Zellen bewegen sich deutlich in
unterschiedliche Richtungen. Bewegen sich alle Zellen in die gleiche Richtung, deutet das auf
Strmungen im Prparat hin.
Die Form und die Beweglichkeit der Bakterien kann direkt im Nassprparat ermittelt werden.
Besser erkennbar ist die Form, wenn die Zellen vorher fixiert, und eventuell auch gefrbt worden
sind. Fr eine einfache Hitzefixierung wird eine Bakteriensuspension auf einem Objekttrger
ausgestrichen, die Bakterien werden getrocknet, und durch Hitze an Ort und Stelle fixiert. Fixiert
man, bevor die Bakteriensuspension vollstndig getrocknet ist, kocht das Wasser und die Zellen
platzen. Bakterienzellen schrumpfen zwar bei der Hitzefixierung etwas, ihre Form ist dennoch gut
erkennbar. Als Universalfarbstoffe (alle Strukturen werden eingefrbt) eignet sich z.B.
Methylenblau oder Kristallviolett.
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Will man den im Mikroskop nicht sichtbaren Aufbau der Zellbegrenzung (Zellwand und
Membran/en) untersuchen, kann eine Gramfrbung durchgefhrt werden. Bei der Gramfrbung
werden die Zellen hitzefixiert, mit Kristallviolett eingefrbt (wobei unklar ist, ob nur die Zellwand,
oder das gesamte Cytoplasma eingefrbt sind). Anschlieend erfolgt ein Differenzierungsschritt
er dient der Unterscheidung zwischen grampositiven und gramnegativen Zellen. Durch eine
zeitlich exakt definierte Behandlung mit Ethanol werden gramnegative Zellen entfrbt, whrend
grampositive Zellen gefrbt bleiben. Um gramnegative Zellen ebenfalls besser sichtbar zu machen,
werden sie mit einem rosa Farbstoff (z.B. Safranin) eingefrbt, man bezeichnet das als
Gegenfrbung.

B-2.6.3. Identifikation von Bakterien


Fr viele mikrobiologische Untersuchungen ist es wichtig festzustellen, ob ein ganz bestimmter
Keim in der Probe vorhanden ist, oder nicht. Diese Identifikation eines bestimmten Bakteriums ist
durch eine morphologische Untersuchung alleine nicht zu bewerkstelligen.
Bakterien unterscheiden sich in ihren Genen, und somit auch in den in der Zelle vorhandenen
Enzymen. Mit sogenannten physiologischen Tests knnen diese biochemischen Unterschiede
festgestellt werden.
Tabelle Strategien physiologischer Tests
Biochemischer Unterschied
Mikrobiologischer Unterschied
Enzym, das bestimmten Nhrstoff abbauen Wachstum auf Nhrmedium, das nur diesen Nhrstoff zur
kann
Verfgung stellt*
Enzym, das bestimmten Stoff umsetzen kann
natrlich vorkommender Stoff wird durch einen Stoff ersetzt,
der die Farbe durch die enzymatischen Umsetzung verndert
Enzyme vorhanden, die zur Bildung von Sure Nhrmedium mit pH-Indikator ndert seine Farbe
fhren
*.nur ein Nhrstoff bedeutet in diesem Zusammenhang, dass z.B. nur eine Kohlenstoffquelle verfgbar ist

Fr klassische mikrobiologische Identifikationsprozeduren ist es notwendig, die Herkunft des


Probenmaterials zu kennen Fleischproben knnen auf Grund ihrer Nhrstoffzusammensetzung
ganz andere Bakterienarten beherbergen als z.B. Getreideprodukte. Kennt man die Herkunft der
Probe kann das mgliche Keimspektrum bereits stark
eingeschrnkt werden. Zur Identifikation wird anschlieend eine
Reinkultur (siehe Kapitel Reinzucht) hergestellt, die Keime
anschlieend makroskopisch und mikroskopisch untersucht
(meist Gramfrbung), und anschlieend mehrere physiologische
Tests durchgefhrt. Die Tests werden so ausgewhlt, dass
Unterschiede zwischen mglicherweise in der Probe
vorhandenen Keime festgestellt werden knnen. Welche Tests
API-Test / Biomerieux
bei welchem Probenmaterial fr welchen Keim erforderlich sind,
ist der jeweiligen Literatur zu entnehmen (z.B. Literatur zur
Lebensmittelmikrobiologie*2). Firmen stellen fr bestimmte Anwendungsbereiche ganze
Testbatterien zur Verfgung, die es erlauben, eine groe Zahl biochemischer Tests mit geringem
Arbeitsaufwand im Mikroformat durchzufhren (z.B. API-Tests, siehe unten).
In der Praxis sind bei vielen Keimen auch analytische Untersuchungen (z.B. Lipidzusammensetzung
der Zellmembran), oder immunologische Tests (mit Antikrpern) erforderlich. Immunologische
Untersuchungen erlauben es oft, die einzelnen Stmme (innerhalb einer Art) zu unterscheiden.
Klassische mikrobiologische Untersuchungsgnge werden zunehmend durch molekularbiologische
Methoden ersetzt (siehe Kapitel PCR).
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

23

Die Bunte Reihe


Als Bunte Reihe wird eine laborchemische Methode zur Identifikation von Bakterien anhand
spezifischer Eigenschaften bezeichnet. Zur Identifizierung werden Enzymaktivitten,
Substratabbau und gewisse bakterielle Fhigkeiten (z.B. Bewegung) berprft.
Die Bunte Reihe setzt sich aus Reagenzrhrchen mit verschiedenen Nhrmedien zusammen.
Diese Reagenzrhrchen werden mit der Reinkultur des zu bestimmenden Bakteriums beimpft.
Die Bakterien spalten die Kohlenhydrate des Nhrmediums und setzen Suren frei. Diese
manifestieren sich in einer nderung des pH-Wertes, und knnen mit pH-Indikatoren
nachgewiesen werden. Zustzlich knnen auch noch andere Produkte (z.B. Aldehyde, Gas)
auftreten, die durch Indikatorzustze nachgewiesen werden knnen.
Die Ergebnisse werden mit einer Standardtabelle verglichen, womit eine Zuordnung zu einer
Bakterienspezies erfolgen kann.
Die Kleine Bunte Reihe ist die lteste, traditionellste Methode, die vor allem zur Identifikation
von Darmbakterien verwendet wird. Als Nhrmedien enthlt sie: Kligler-Agar, Harnstoff-Rhrchen,
MIO-Rhrchen und Simmons-Citrat-Agar.
Der API-Test
API steht fr Analytical Profile Index, und wird von der Firma bioMerieux kommerziell
hergestellt. Mit bestimmten API-Tests knnen unterschiedliche Arten innerhalb der
Enterobacteriaceae, Staphylokokken, Streptokokken, Listerien, Campylobacterdifferenziert
werden.
Ein API Streifen besteht aus ca. 20 Mikrorhrchen, die dehydrierte Substrate enthalten. Die
Rhrchen werden mit der zu untersuchenden Bakteriensuspension beimpft, dadurch werden die
Substrate gelst. Die Stoffwechselprodukte, die whrend der Inkubation entstehen, bewirken
Farbumschlge von Indikatoren, entweder direkt whrend der Inkubation, oder nach Zugabe
entsprechender Reagenzien. Die Ablesung der Reaktion erfolgt anhand einer Ablesetabelle, die
Identifizierung erfolgt mit Hilfe des Analytischen Profil Index.

B-2.7. Untersuchung von Pilzen


B-2.7.1. Makroskopische Untersuchung von Pilzkolonien
Hefekolonien (Kolonie= Ansammlung einer greren Organismenzahl nach Vermehrung auf einem
festen Nhrmedium) haben in der Regel eine glnzende Oberflche, sind meist gelblich, manchmal
auch orange oder rot gefrbt; die Kolonien sind makroskopisch nicht von Bakterienkolonien zu
unterscheiden.
Schimmelpilzkolonien: wattiges Aussehen (durch das Myzel), wei bzw. von der Mitte der Kolonie
ausgehende Verfrbung (Hinweis auf Sporenbildung)

B-2.7.2. Mikroskopische Untersuchung von Pilzen


Pilze knnen blicherweise nicht durch bloes Betrachten der Kolonie identifiziert werden. Aus
diesem Grund ist jede Pilzkultur so zu behandeln, als ob sie pathogen (krankheitserregend) wre.
Es ist daher konsequnt auf gute sterile Arbeitstechnik zu achten!
Hefen: rund bis oval, viel grer als Bakterien (auch bei 400-facher Vergrerung gut sichtbar); die
meisten Hefen vermehren sich durch Sprossung (Sprosspilze Sprosse sind charakteristisch fr
das Vorliegen einer Hefe; einige Hefen vermehren sich durch Spaltung wie Bakterien (Spaltpilze)
Schimmelpilze: Pilzfden (Hyphen) erkennbar - findet man nur kugelfrmige/ellipsoide Sporen, ist
es nicht gelungen, Hyphen auf den Objekttrger zu bertragen, die Prparation muss wiederholt
werden
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

24

Septierte Hyphen weisen auf Ascomyceten oder Basidiomyzeten hin (Septum=Querwand;


die Zellen sind durch eine Zellwand voneinander getrennt).
Unseptierte Hyphen (Zellen nicht durch Querwand getrennt, die Zellen bilden einen langen
Schlauch, der viele Zellkerne hat) weisen auf Zygomyzeten hin.
Klassifikation mit Hilfe von Fruchtkrpern: fr die Klassifikation braucht man viel Erfahrung.
Einige Pilze lassen sich aber von Nicht-Experten/innen grob klassifizieren: Die Gattungen
Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor und Rhizopus sind gut zu erkennen.
Frbungen von Pilzen
Die Frbung mit Methylenblau erlaubt die Unterscheidung zwischen lebenden und toten
Hefezellen. Lebende Zellen bauen den blauen Farbstoff ab, und sind daher farblos, tote Zellen blau
gefrbt.
Methylenblaufrbung: Zusatz von 1 Tropfen Methylenblaufrbelsung am Deckglasrand, mit
Kchenrolle durch das Prparat durch saugen.
Bei der Gramfrbung sind Hefen violett gefrbt, unterscheiden sich von Gram-positiven Bakterien
aber durch ihre Gre.

B-2.8. Zell- und Keimzahlbestimmungen


In der Mikrobiologie ist es oft wichtig, bestimmte Mikroorganismen quantitativ zu erfassen. So
sind pathogene Keime, die nur in geringer Zahl vorhanden sind, durch das Immunsystem gut
bekmpfbar, in hoher Zahl fhren sie zur Erkrankung. Aus diesem Grund gibt es fr viele
Lebensmittel, Wasser etc. gesetzliche Grenzwerte fr ganz bestimmte Mikroorganismen.
Methoden zur Bestimmung der Zellzahl erfassen alle (lebenden und toten) Zellen in einer Probe.
Methoden zur Bestimmung der Keimzahl erfassen die Zahl der unter den gewhlten
Bedingungen - vermehrungsfhigen Keime. Ob die einzelnen Zellen z.B. zu einer Kolonie
heranwachsen, oder nicht, hngt von
den konkreten Bedingungen ab, z.B. von der
Zusammensetzung des Nhrmediums, dem pH-Wert, der Bebrtungstemperatur und -dauer etc.
Die Angabe der konkreten Bedingungen sollte daher im Protokoll keinesfalls fehlen.

B-2.8.1. Zhlkammer
Mit einer Zhlkammer kann die Zahl der Zellen ermittelt
werden. Bei dieser Methode werden die Zellen in einem
exakt definierten Volumen unter dem Mikroskop
ausgezhlt (methodisches Prinzip). Die Methode eignet
sich nur fr Flssigkeiten und Proben, die eine relativ
groe Zahl von Keimen enthalten.
Eine Zhlkammer besteht aus einem speziellen
Objekttrger, auf den zwei idente Zhlfelder eingraviert
sind (exakt definierte Flche). Auf diesen Objekttrger
wird ein spezielles Deckglas aufgelegt, das einen exakt
definierten Abstand zur Flche mit dem Zhlnetz herstellt
(exakt definierte Hhe). Da die Zhlkammer sehr przise
sein muss, ist sie teuer!

Ausschnitt aus dem Zhlfeld einer


Zhlkammer; schwarz = 1 Kleinquadrat
(KQ); grau = 1 Groquadrat

Es gibt unterschiedliche Zhlkammern (Blutzellen,


Bakterien)
fr
verschiedene
Zelltypen
(Beispiele
laboroptik.de/deutsch/info/info.html).
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dazu

unter

http://lo-

25

Zhlkammern wie jene nach Thoma und Brker-Trk haben ein Zhlfeld mit 1 mm2
Gesamtflche, das in 400 Kleinquadrate unterteilt ist. 4x4 Kleinquadrate werden auch als ein
Groquadrat bezeichnet. Der Abstand zwischen Zhlkammer und Deckglas betrt 0,1 mm. Die
Gre des Kleinquadrats und die Gesamtflche des Zhlfeldes sind meist auf der Zhlkammer
eingraviert.
Homogenisation der Zellsuspension: Die Probe sollte unmittelbar vor dem Auftragen auf die
Zhlkammer gut homogenisiert werden. Die Zellsuspension sollte auch nur mglichst kurz in der
Pipette stehen, da sich Zellen in der Pipette auf Grund der Schwerkraft rasch absetzen.
Erfassen der Zellzahl und Zhlstrategie:
Fr ein genaues Ergebnis reicht es nicht, einige wenige Zellen auszuzhlen. Fr sehr hohe
Genauigkeiten (max. 5% Irrtumswahrscheinlichkeit) mssen insgesamt mindestens 400 Zellen
ausgezhlt werden, in der Praxis gengt es oft, etwa 100 Zellen zu zhlen.
Die besten Ergebnisse erzielt man, wenn die Probe (oder eine Verdnnung der Probe) 2-12
Zellen/Kleinquadrat enthlt. Wenn die Probe deutlich weniger Zellen enthlt, knnen alle Zellen
auf einem Zhlnetz gezhlt werden, bei greren Zelldichten knnen z.B. nur alle jene Zellen, die
in den Kleinquadraten einer Diagonale liegen, erfasst werden. Da die grten Abweichungen
zwischen den Zhlergebnissen durch das Aufpipettieren bzw. unzureichende Homogenisation
entstehen, sollte die Zhlkammer mindestens 2x unabhngig voneinander befllt werden (da sich
auf jeder Kammer 2 Zhlnetze befinden, werden damit die Zellen auf insgesamt 4 Zhlnetzen
erfasst).
Liegt eine Zelle genau auf einer Linie, kann sie keinem Kleinquadrat eindeutig zugeordnet werden.
Man entscheidet sich daher willkrlich dafr, z.B. alle Zellen, die am linken und oberen Rand des
Kleinquadrats liegen, mitzuzhlen, und jene, die am rechten und unteren Rand liegen, nicht
mitzuzhlen.
..
Berechnung der Zellzahl
 Rechenweg ber die Zahl der Zellen, die durchschnittlich pro Kleinquadrat ausgezhlt
wurde (Z):
Kammertiefe: 0,1 mm
22
Gesamtflche 1 mm Diese Flche besteht aus 400 Kleinquadraten 0,0025mm fr ein
Kleinquadrat (dieser Wert ist in die meisten Zhlkammern eingraviert)
2

Gesamtflche 1mm x Kammertiefe 0,1 mm = 0,1 mm , das entspricht 0,1 l (1000 L = 1m ; 1L= 1dm ; 1
3
3
ml=1cm ; 1l=1mm ). Da die Gesamtflche aus 400 Kleinquadraten besteht, sind auf der gesamten Flche
4
6
400 * X-Zellen; also 400 * X Zellen in 0,1 l; das entspricht 400 * X * 10 Zellen/ml; das entspricht X * 4 * 10
Zellen/ml.

 oder Einsetzen in folgende Formel:

Zellen pro L Probe bzw. Verdnnung der Probe

y.Zahl der insgesamt gezhlten Zellen


x..Zahl der Kleinquadrate, deren Zellen ausgezhlt worden sind

Sollte die Zellzahl in einer Verdnnung der Probe gezhlt worden sein, muss anschlieend auf die
Originalprobe zurck gerechnet werden.
korrekte Einheit: Zellen/mL
..
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26

Bei Hefen kann durch eine Methylenblaufrbung (siehe B-2.7.2) zwischen lebenden und toten
Zellen unterschieden werden. Methylenblau dringt in lebende und tote Zellen ein. Lebende Zellen
knnen Methylenblau enzymatisch entfrben, lebende Zellen sind daher ungefrbt, tote gefrbt.

B-2.8.2. Kochsches Plattengussverfahren


Synonym: Gussplattenverfahren
Das Kochsche Plattengussverfahren ist der Klassiker unter den Keimzahlbestimmungsmethoden. Das Prinzip der Methode ist es, (fr das menschliche Auge unsichtbare) Keime aus
einem bekannten Probenvolumen in ein festes Nhrmedium einzubetten, und sie dann zu
einer sichtbaren Kolonie heranwachsen zu lassen. Aus der Zahl der Kolonien kann dann die
Zahl der Keime in der Probe berechnet werden. Das Plattengussverfahren eignet sich nur fr
flssige Proben, da feste Partikel in der Probe mit Kolonien verwechselt werden knnten. Es
eignet sich nur fr Proben, die relativ viele Keime enthalten (man kann schwer 1 Liter Probe in
eine Platte eingieen).
Die wesentlichen Arbeitsschritte:
 Herstellung von portionierten festem Nhrmedium in Rhrchen
 Herstellung einer dezimalen Verdnnungsreihe der Probe
 Verflssigen und Temperieren des festen Nhrmediums
 Mischen des temperierten Nhrmediums mit einem Aliquot der Probe bzw. der
jeweiligen Probenverdnnung im Rhrchen*1
 Ausgieen des festen Nhrmediums
 Bebrtung
 Ermittlung der Koloniezahl
 Berechnung der Keimzahl in der ursprnglichen Probe
*1alternativ kann die Probe in der Platte vorgelegt werden, und das flssige Medium dazu gegossen
werden

Heikel ist dabei die Temperatur des verflssigten Nhrmediums: Ist sie zu hoch, knnen Keime
aus der Probe absterben. Ist sie zu tief, erstarrt das feste Nhrmedium zu frh, die Keime sind
schlecht verteilt, und knnen spter nicht als Einzelkolonien ausgezhlt werden. Wichtig ist
auch, nur jene Platten zur Kalkulation der Keimzahl heran zu ziehen, die nicht zu viele bzw. zu
wenige Kolonien enthalten. Einschlgige Lehrbcher (Mikrobiologische Arbeitsmethoden,
Bast) empfehlen, nur Platten zu zhlen, auf denen 30-300 Kolonien gewachsen sind. Bei
Platten mit nur wenigen Kolonien kann der statistische Fehler (siehe Box) sehr hoch sein. Bei
Platten, die sehr viele Keime enthalten, kann ein Teil der Keime nicht mehr zu einer Kolonie
heranwachsen, weil ihm benachbart liegende Keime zu viele Nhrstoffe entziehen die Zahl
der Keime in der ursprnglichen Probe wird systematisch unterschtzt.
Statistischer Fehler
Je kleiner das Volumen ist, in dem die Zahl der Keime gezhlt wird (Stichprobe), desto grer
ist der relative Fehler, den man machen kann, wenn man nur die Stichprobe auszhlt, und
daraus die Keimzahl in der Probe berechnet.
Der folgende Vergleich macht den Sachverhalt leicht verstndlich:
- Wenn man alle Schler/innen einer Schule zhlt, hat man den wahren Wert.
- Wenn man die Schler in einem Drittel der Klassenrume zhlt, hat man zwar nicht in allen
Klassen gleich viele Schler/innen, aber doch viele verschiedene Stichproben, das
berechnete Ergebnis Zhlung liegt nahe am wahren Wert.
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27

- Wenn man die Schler/innen nur in 1 oder 2 Klassen zhlt, kann es sein, dass in diesen
beiden Klassen gerade zuflligerweise besonders viele oder wenige Schler/innen sitzen.
Wenn man jetzt aus dieser Zhlung auf die gesamte Schule schliet, kann der Fehler ziemlich
hoch sein.
Berechnung der Keimzahl:
Die Koloniezahlen von Parallelanstzen der auswertbaren Verdnnungsstufen werden durch
Mittelwertsbildung zu einem Wert zusammengefhrt. Wenn man Platten von mehr als einer
Verdnnungsstufe auszhlen kann, verwendet man am besten das gewichtete arithmetische
Mittel. Platten, die nur wenige Kolonien aufweisen, werden in der Berechnung weniger stark
bercksichtigt, da nur eine sehr kleine Stichprobe der gesamten Probe verwendet worden ist.
Gewichtetes arithmetisches Mittel - Berechnungsbeispiel
Platte Verdnnungsstufe 10-4: 258 Kolonien
Platte Verdnnungsstufe 10-5: 23 Kolonien - Umrechnung auf Verdnnungsstufe 10-4: 230
Platte Verdnnungsstufe 10-6: 3 Kolonien - Umrechnung auf Verdnnungsstufe 10-4: 300

Gewichteter arithmetischer Mittelwert = (258x1 + 230x0,1 + 300 x 0,01)/1,11;


fr Endergebnis mit 104 multiplizieren

B-2.8.3. Drigalski-Spatelplattenverfahren
Synonyme: Drigalski-Verfahren, Spatelplattenverfahren, Drigalski-Spatelverfahren
Gleiches Prinzip wie beim Kochsches Plattengussverfahren, allerdings werden die Keime hier nicht
in ein feste Nhrmedium eingegossen, sondern mit einer Drigalskispatel auf der Oberflche eines
Nhrbodens verteilt (Ausstrich). Mikroorganismen, die sauerstoffrmere Lebensrume
bevorzugen,
knnen
bei
diesem
Verfahren
nicht
vermehrt
werden.
Das
Drigalskispatelplattenverfahren ist arbeitstechnisch etwas einfacher als das Plattengussverfahren,
weil mit fertig gegossenen Platten gearbeitet wird, das kritische Temperieren des Nhrmedien
entfllt.

Abbildung Drigalskispatel

B-2.8.4. Titerverfahren
Mit dem Titerverfahren kann die Keimzahl annherungsweise ermittelt werden. Die Probe wird
solange dezimal (in Zehnerstufen) verdnnt, bis sich in einem mL kein, oder nur noch ein Keim
befindet. Die Rhrchen werden bebrtet, die Keime vermehren sich, und fhren zu einer Trbung
des Mediums. Der Titer der Probe ist die strkste Verdnnung, bei der gerade noch ein
Wachstum beobachtet werden kann, z.B. 10-7, die Probe enthlt somit etwa 107 Keime/mL. Das
Titerverfahren eignet sich fr flssige und feste Proben, letztere mssen gut homogenisiert und
suspendiert werden, um ein zuverlssiges Ergebnis zu erzielen.

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28

B-2.8.5. Most Probable Number (MPN) -Verfahren


Das MPN-Verfahren ist eine Verfeinerung
des Titerverfahrens, hier wird die Keimzahl
mit statistischen Methoden abgeschtzt.
Dazu werden jeweils 3 bzw. 5 Rhrchen
mit der identen Verdnnungsstufe
beimpft
(siehe
Abbildung)
und
anschlieend bebrtet. Zur Auswertung
wird die Zahl der bewachsenen Rhrchen
in jeder Verdnnungsstufe ermittelt.
Mithilfe einer Tabelle (statistische
Berechnung) kann die wahrscheinlichste
Keimzahl errechnet werden: Aus drei aufeinander folgenden Stufen wird eine 3-stellige Kennzahl
ermittelt (bzw. eine 5-stellige Kennzahl, wenn mit 5 Parallelrhrchen gearbeitet worden ist): zuerst
wird gezhlt, wie viele Rhrchen in der jeweiligen
Verdnnungsstufe bewachsen sind; dann werden die Rhrchen zur
Ermittlung der Kennzahl ausgewhlt: wenn mglich sollten die drei
hchsten Verdnnungsstufen ausgewhlt werden, die noch
bewachsene Rhrchen aufweisen. Die Kennzahlen nutzt man zum
Ablesen der wahrscheinlichsten Keimzahl in einer MPN-Tabelle,
Der in der Tabelle angegebene Wert bezieht sich auf die geringste
Verdnnungsstufe, die zur Ermittlung der Kennzahl verwendet worden ist. Die Keimzahl in der
ursprnglichen Probe wird durch Multiplikation mit dem Kehrwert dieser Verdnnungsstufe
errechnet.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Beispiel:
Um einen berblick zu bekommen werden die Ergebnisse in Form einer Tabelle zusammengefasst:
Verdnnungsstufe
-1
-2
-3
-4
Parallelreihen 10 10
10
10
x
x
1.Reihe
x
x
2.Reihe
x
x
x
x
3.Reihe

10

-5

10

-6

10

-7

10

-8

10

-9

10

-10

x steht fr Bewuchs.

In diesem Fall ergeben sich folgende Mglichkeiten zur Ermittlung der wahrscheinlichsten
Keimzahl (siehe Tabelle unten):
Kennzahl 3-2-2: Keimzahl von 21 fr die Verdnnung 1:10
Kennzahl 2-2-1: Keimzahl von 2,8 bei der Verdnnung 1:100
Kennzahl 2-1-0: Keimzahl von 1,5 bei der Verdnnung 1:1000
Der geringe Bewuchs bei der Verdnnung 10-2 geht vermutlich auf einen Pipettierfehler in der
ersten parallel-Reihe zurck. Daher ist die Auswertung etwas schwieriger und man sollte jenen
Rhrchensatz von drei aufeinanderfolgenden Verdnnungsstufen whlen, bei dem ein deutlicher
Unterschied im Bewuchs der Rhrchen zu sehen ist. Auerdem sollte jene Verdnnungsstufe
bercksichtigt werden, bei der ein Bewuchs gerade noch feststellbar ist. In obigem Beispiel wre
das die Kombination 2-2-1 , eine Stichzahl von 2,8 bei der Verdnnung 1:100 und damit eine MPN
von 280 Keimen/mL.
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

29

MPN/g (mL) Tabelle (fr 3 parallel-Reihen)


Bewuchs in Verdnnungsstufe wahrscheinliche
Stichzahl
Keimzahl
1
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3

0,1
0
0
1
1
2
3
0
0
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
1
2
2
2
3
3
0
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3

0,01
0
1
0
1
0
0
0
1
2
0
1
0
1
0
0
1
2
0
1
2
0
1
2
0
1
0
1
2
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3

MPN
<0,30
0,30
0,30
0,61
0,62
0,94
0,36
0,72
1,10
0,74
1,10
1,10
1,50
1,60
0,92
1,40
2,00
1,50
2,00
2,70
2,10
2,80
3,50
2,90
3,60
2,30
3,80
6,40
4,30
7,50
12,00
16,00
9,30
15,00
21,00
29,00
24,00
46,00
110,00
>110,0

Vertrauensbereich-Grenze 95%
untere
0,00
0,01
0,01
0,12
0,12
0,35
0,02
0,12
0,40
0,13
0,40
0,40
0,50
0,50
0,15
0,40
0,50
0,40
0,50
0,90
0,50
0,90
0,90
0,90
0,90
0,50
0,90
1,60
0,90
1,70
3,00
3,00
1,80
3,00
3,00
9,00
4,00
9,00
20,00

obere
0,94
0,95
1,00
1,70
1,70
3,50
1,70
1,70
3,50
2,00
3,50
3,50
3,80
3,80
3,50
3,50
3,80
3,80
3,80
9,40
4,00
9,40
9,40
9,40
9,40
9,40
10,40
18,10
18,10
19,90
36,00
38,00
36,00
38,00
40,00
99,00
99,00
198,00
400,00

B-2.8.6. Fotometrische Bestimmung der optischen Dichte


Partikel wie z.B. Mikroorganismen) fhren zu einer Streuung des Lichts, die Lichtintensitt nimmt
daher ab, wenn die Probe durchstrahlt wird. Es handelt sich dabei um keine Absorption, sondern
um eine optische Dichte (OD). Die Messung wird bei einer in einem konventionellen Fotometer
bei 595 nm oder 600 nm durchgefhrt. Die Methode eignet sich fr flssige, stark keimhltige
Proben (z.B. Mikroorganismenkulturen), und liefert keinen absoluten Messwert. Will man aus der
optischen Dichte die Zellzahl ermitteln, mssen die OD-Werte einmal mit einer absoluten
Methode kalibriert werden (z.B. parallele Durchfhrung des Kochschen Plattengussverfahrens).

B-2.8.7. Coulter Counter


Die Zellzahlbestimmung mit dem Coulter Counter erfolgt automatisiert, und wird vor allem in der
Routinediagnostik (z.B. Zhlen von Blutzellen) eingesetzt. Dabei wird ein definiertes
Probenvolumen durch eine dnne Kapillare gepumpt. In der Kapillare wird der elektrische
Wiederstand gemessen. Wenn eine Zelle den Messbereich passiert, erhht sich der elektrische
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

30

Wiederstand, die Zelle wird detektiert. Die Gre der Widerstandsnderung erlaubt es auch, die
Gre der gezhlten Zelle zu ermitteln. Dabei ist es wichtig, die Probe stark genug zu verdnnen,
um tatschlich einzelne Zellen zu detektieren.

B-2.9.Gewssergtebestimmung
Das Saprobiensystem war ursprnglich ein Hilfsmittel der Abwasserbiologen. Da es jedoch kaum
ein Gewsser gibt das vllig frei von organischer Substanz (Verunreinigungen) ist, kann es auf
alle Gewssertypen angewandt werden, sogar auf Aquarien oder Regentonnen. Vorraussetzung
fr eine fehlerfreie Gewssergtebestimmung ist jedoch eine genaue Kenntnis der Leitorganismen
und deren Lebensgemeinschaften. Die Gefahr von Fehlbeurteilungen aufgrund mangelnder
Erfahrung ist gro. So kann eine bestimmte Art ein charakteristischer Leitorganismus sein, eine ihr
sehr hnliche aus der selben Gattung aber ein Ubiquitist, der in ganz verschiedenen Zonen
gnstige Lebensbedingungen findet.
Eine einzelner Leitorganismus sagt daher wenig oder nichts ber die Saprphiestufe aus. Eine
zuverlssige Analyse setzt das Vorkommen mehrer oder typischer Leitarten vorraus sowie das
Auftreten der fr die bestimmte Zone typischen Lebensgemeinschaften.
Im Saprobiensystem spielen auch grere Tiere wie Muscheln, Insektenlaven und Egel eine Rolle.
Am wichtigsten sind allerdings die Mikroorganismen und unter ihnen die Protozoen.
An dieser Stelle sei erwhnt, dass aufgrund der oben angefhrten Fakten eine exakte
Gewssergtebestimmung im Zuge der bungen im Labor nicht durchgefhrt werden kann.
Vielmehr soll die Technik des Mikroskopieren anhand spannender Prparate wie der
Gewssergtebestimmmung gebt und vertieft werden. Das Eintauchen in die faszinierende Welt
der Kleinstlebewesen und das Finden und Beschreiben von mglichst vieler Protisten steht daher
im Vordergrund. Der Versuch einer Gewssergtebestimmung kann anschlieend unternommen
werden muss jedoch nicht unbedingt zu einem verbindlichen Ergebnis fhren.
Probennahme: Aus den oben beschiebenen Grnden soll die Probenauswahl bzw. -nahme so
erfolgen, dass mglichst viele verschiedene Organismen gefunden werden knnen. Kristallklare
Gebirgsbche, Schwimmbder oder gar Trinkwasser werden sich daher als Proben eher nicht
eigenen. Vielmehr sollten mglichst naturbelassene, stark mit Biomasse beladene Gewsser
beprobt werden. Dabei eigenen sich Gartenteiche oder kleinste, stehende Gewsser besonders.
Um die Menge an Mikroorganismen und deren Vielfalt zu steigern empfiehlt es sich die Probe aus
der unmittelbaren Uferzone zu entnehmen. Dabei sollen auch biogene Materialien wie Pflanzen,
verrottende Bltter oder mit Algen berzogene Steine ins Probennahmegef berfhrt werden.
Ein gut ausgewaschenes Gurkenglas eignet sich aufgrund des weiten Halses besonders fr dies
Aufgabe.
Hinweis: Durch den Abbau von Biomasse in der Uferzone steigt das Nhrstoffangebot im Wasser
lokal stark an. Dies fhrt zu einer direkten Zunahme an Mikroorganismen, aber auch zu einer
Verschiebung der Gewssergte durch die Vernderung der Populationszusammensetzung. Ein
Gewsser kann daher in verschiedenen Zonen, zu verschiedenen Untersuchungszeiten durchaus
sehr heterogene Gewssergten aufweisen!

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A-2.10. -Test
Antibiotika sind Stoffe, die entweder das Wachstum von Bakterien hemmen, oder diese abtten.
Entsprechend unterscheidet man bakteriostatische (= das Wachstum hemmende) und bakterizide
(=Bakterien ttende) Antibiotika.

A-2.10.1. -Lactamantibiotika
Das erste entdeckte Antibiotikum war Penicillin: Dass Mikroorganismen sich gegenseitig im
Wachstum behindern knnen, war schon seit Beginn der systematischen Mikrobiologie Ende des
19.Jahrhunderts bekannt. Die Entdeckung von Penicillin gelang aber erst Alexander Fleming 1929,
der den antibakteriellen Effekt von Penicillin anhand einer Kontamination einer StaphylokokkenKultur mit dem Schimmelpilz Penicillium notatum genauer untersucht hat. Bakterien konnten
dort, wo der Schimmelpilz sich ausgebreitet hatte, selbst nicht wachsen. Die Isolierung des reinen
Penicillins gelang erst in den USA whrend des 2. Weltkrieges.
Penicillin verhindert die Verknpfung der Peptidketten im Peptidoglycans (siehe A-2), das den
Groteil der Bakterienzellwand bildet. Von der Hemmung des Zellwandaufbaus sind bestehende
Zellen nicht betroffen, sobald sich die Bakterienzellen jedoch teilen, wird die Zellwand instabil und
brchig (Wachstumshemmung). Gram-positive Bakterien reagieren auf Penicillin-Antibiotika
empfindlicher als Gram-negative, da ihre Zellwand aus einer dickeren Schicht Peptidoglycan
besteht und ihnen die zweite uere Hlle der Gram-negativen Bakterien fehlt.
R

CH3
S
CH3

HN

H
N

CH3
CH3

COOH

COOH
O

Penicillin

Penicillin-G

Alle Penicilline sind -Lactame (rotes Ringsystem in der Abbildung rechts ), die aus den
Aminosuren Cystein und Valin zusammen-gesetzt sind.
Der Rest (R) kann zur Entwicklung alternativer Antibiotika je nach Bedarf variiert werden
(Derivatisierungen), um dem Penicillin andere Eigenschaften zu verleihen (z.B. Lslichkeit,
Stabilitt gegenber Magensure). Als Derivate sind z.B. Ampicillin, Amoxicillin Methcillin, Oxacillin
im Handel.
Als Metabolit des Penicillium chrysogenum ist Penicillin-G ebenfalls ein natrliches Penicillin, das
zur Beseitigung wundpathogener Keime dient.
Die Entwicklung von Antibiotika ist nach wie vor ein wichtiges pharmakologisches
Forschungsgebiet, weil Bakterien einerseits sehr rasch vermehrungsfhig sind und andererseits
vielfltige Mglichkeiten besitzen, neue genetische Varianten hervorzubringen. Daher kommt es
oft zur Entwicklung von Resistenzen. Sie beruhen meist auf der Aktivitt bestimmter Proteine, die
antibiotischen Wirkstoffe zu spalten (z.B. Penicillinase) oder sie aus den Zellen zu pumpen, bevor
sie zu wirken beginnen.

A-2.10-2.Andere Antibiotikaklassen:
Antibiotikum

Organismus

Anwendung

Wirkungsweise

Bacitracin

Bacillus subtilis

G+ Bakterien

Cephalosporine

Cephalosporium
acremonium
Streptomyces
venezulae
Streptomyces

Breitband

Polypeptid-Komplex hemmt Zellwandaufbau


http://www.m-ww.de/pharmakologie/arzneimittel/
-Lactam Antibiotika, Zellwandaufbau

Breitband
bei schweren Infektionen
Gram-positive Bakterien

Typhus, Paratyphus, bakterieller Meningiten. Wirkt auf


bakterielle Ribosomen, Proteinsynthese
Ef-G Hemmung bei der Proteinsynthese

Chloramphenicol
Erythromycin

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32

erythreus
Micromonospora
purpurea
Streptomyces
kanamyceticus
Streptomyces fradiae

Gentamicin:
Kanamycin
Neomycin
(1mg = 1000 IE)
Penicillin-G
(1mg=1666 IE)
Streptomycin
Tetracycline
Vancomycin

;
Pseudomonas
aeruginosa; Hemmung der Proteinsynthese, Breitband gegen GStaphylococcus aureus
Stbchen, Nebenwirkungen problematische
z.B. Augeninfektionen
Breitband (Aminoglycosid)

Penicillium
chrysogenum
Streptomyces griseus
Streptomyces rimosus
Amycolatopsis
orientalis

Proteinsynthese -Lactam-Analogon
Zellwandaufbau

Gram-negative Bakterien
Breitband
Gram-positive Bakterien

Proteinsynthese
Proteinsynthese
Proteinsynthese

O
HO

OH
O

OH
N

O
OH

OH

Cl

HN

H2N

NH2

HO

OH

Cl

OH

H2N

Chloramphenicol

Erythromycin Gentamycin

O
NH2

OH

O
O

OH

O
HN
O2N

OH

HOH N
2

NH

HO

OH
H2N

OH
NH2

Kanamycin
HO
NH 2

O
OH
HO

OH
HO

NH2

NH2

HO
O

HO

NH

OH

OH

NH2

OH

NH

O
O

HO
OH
NH2

OH
Cl

HO

OH

H
N

H
N

N
H

OH

NH2

NH2
O

OH

NH
O
O

NH 2

NH 2
O

OH

N
H
O

HO

OH

OH

HO

H
N
O

NH

HO

Streptomycin Tetracyclin

NH

HO

NH2

Neomycin

H
N

Cl

HO

HO

O
O

H2N

HO
O

HO

H2N

OH

HO

Vancomycin

Neben Antibiotika, die den Zellwandaufbau stren, gibt es Substanzen, die auf verschiedene
andere Stoffwechselleistungen der Bakterien wirken. So wird z.B. mit Chloramphenicol die
bakterielle Proteinsynthese gehemmt. Aufgrund der unterschiedlichen Beschaffenheit der
Bakterienribosomen (70S) im Gegensatz zu jener der 80S-Ribosomen in Eukaryonten wird daher
der eukaryotische Zellstoffwechsel durch Chloramphenicol kaum beeintrchtigt.
Antibiotika:
Probenzubereitungen (z.B. von handelsblichen Antibiotika) knnen in Tablettenform auch ber
das Ablaufdatum hinaus fr den Hemmhoftest verwendet werden, wenn sie lichtgeschtzt,
trocken und khl gelagert worden sind. Antibiotikalsungen sollten nicht lnger als einen Monat
gelagert werden.
Sporensuspensionen (z.B. von Penicillium chrysogenum) sollten stets frisch zubereitet, und auf den
Platten in nur einem kleinen, klar begrenzten Bereich aufgebracht werden (z.B. 20L Suspension in
markierten Bereich auftragen).

A-2-10.3. Agardiffusionstest
Ein Antibiogramm dient zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Wirkung bestimmter
Antibiotika. Meist wird dazu ein Agardiffusionstest durchgefhrt, bei dem ein Teststamm dem zu
testenden Wirkstoff ausgesetzt wird. Je nach Art des verwendeten Bakterienstammes kann die
Wirkung verschiedener Antibiotika sehr unterschiedlich sein. In der Medizin werden solche Tests
durchgefhrt, um festzustellen, mit welchem Antibiotikum ein bestimmter bakterieller
Krankheitserreger wirkungsvoll bekmpft werden kann.
Bei einem Agardiffusiontest wird zunchst ein Nhrboden gleichmig mit einem geeigneten
Teststamm beschichtet (Deckschichtagar mit Bakteriensuspension). Danach werden
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33

Filterscheibchen, die mit einem Antibiotikum in definierter Konzentration getrnkt sind, auf diesen
Nhrboden aufgelegt. Nach einer Inkubationszeit von 1-1 Tagen erkennt man den Bewuchs an
der Bildung eines gleichmigen Bakterienrasens, der rund um die Filterscheibchen durch
Hemmhfe unterbrochen ist. Der Hemmhofdurchmesser ist dem Wirkungsgrad des Antibiotikums
(qualitative Bestimmung) proportional, in den meisten Fllen ist dieser Wirkungsgrad auch
proportional der Konzentration des Antibiotikums (quantitative Bestimmung).
In der Abbildung rechts ist ein Nhrboden zu sehen auf dem eine Mischkultur aus Bacillus subtilis
(grampositiv) und Escherichia coli (gramnegativ) ausgestrichen worden sind. Die drei Plttchen
enthielten unterschiedliche Mengen des Antibiotikums. Wegen der unterschiedlichen
Empfindlichkeit Gram-negativer und Gram-positiver Bakterien gegenber Penicillin-G sind zwei
Hemmhofgrenzen sichtbar.

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34

Teil C - Arbeitsanleitungen
C-1. Mikroskopie
C-1.1. Arbeitsanleitungen - Mikroskopie
C-1.1.1. Protokollierung)
im Laborjournal:
Das Laborjournal ist das einzige rechtsgltige Belegexemplar zu den durchgefhrten Arbeiten ! Fr
Betriebe mit Qualittssicherungssystemen (z.B. Pharmasektor) ist die kontinuierliche
Protokollierung der durchgefhrten Arbeiten absolut essentiell. Kontrollbehrden gegenber muss
jederzeit nachgewiesen werden knnen, wer, was, wann und wie gemacht hat. Arbeitsschritte,
die zwischen den Laboreinheiten durchgefhrt worden sind, mssen ebenso protokolliert werden!
Die Kontrolle von Laborjournaleintragungen hat daher nichts mit Bosheit zu tun, sondern trgt
dazu bei, einen Qualittsstandard zu erreichen und zu erhalten .
Das Um und Auf ist also die Nachvollziehbarkeit (es muss auch Arbeitskollegen jederzeit mglich
sein, in laufende Arbeiten an Hand der Aufzeichnung einzusteigen, oder bereits abgeschlossene
Arbeiten zu wiederholen).
Das Laborjournal ist ein gebundenes Heft oder Buch und wird am Umschlagdeckel eindeutig mit
Namen, Datum und der Raumnummer gekennzeichnet. Die Seiten werden fortlaufend beschriftet.
Es drfen keinesfalls Seiten entfernt werden.
Sollten Texte oder Aufzeichnungen ungltig gemacht werden, mssen sie einfach durchgestrichen
werden. Die Streichung kennzeichnet man mit Datum und Unterschrift (oder Paraphe).
Zu Beginn der Arbeiten sollen gleich die ersten wichtigen Punkte aufgeschrieben werden:
Dazu zhlen Titel und Aufgabenstellung, bereits bekannte Literaturhinweise, Rezepturen oder
Arbeitsablufe, und eventuell auch die Planungen der Versuchsreihe. Vorberlegungen und
mgliche Erwartungen sollen ebenfalls protokolliert werden.
Verkleinerte Kopien einer Arbeitsvorschrift knnen mit Angabe der Literaturstelle eingeklebt
werden.
Alle wesentlichen Arbeitsschritte mssen whrend der jeweiligen Laborttigkeit protokolliert
werden !
Ergebnisse werden anhand von Computerausdrucken, Fotos oder Datentabellen im Laborjournal
gesammelt (eingeklebt). Ergebnisse sollten kommentiert werden: hat die Methode funktioniert,
was ist mglicherweise schief gelaufen, woran erkennt man, dass etwas geklappt hat, oder nicht.
Bei spter erledigten weiterfhrenden Arbeiten muss im Protokoll auf die entsprechenden
vorangegangenen Seiten verwiesen werden.
im Arbeitsprotokoll oder Arbeitsbericht
Einen Arbeitsbericht gliedert man am besten in folgende Abschnitte:
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35

 Titel: (daneben Datum !)

Thema des Arbeitsberichtes.


Er ergibt sich in etwa wie eine Kurzbezeichnung der Aufgabenstellung; z.B. mikroskopische
Untersuchung von Gewsserproben (22.10.2012)

 Aufgabenstellung:
z.B: Untersuchung einer Teichwasserprobe: lange Lacke 25-09-2012-A im Hellfeld
oder: Beobachtung der Plasmolyse eines Blttchens von Rhoeo spathaccea bei Verwendung von
Salzlsungen unterschiedlicher Konzentration und Zusammensetzung.
 Prinzip:
Hier wird die genutzte Technik angegeben..
z.B. Hellfeldmikroskopie, Trockenprparation

 Literatur:
Jede mglicherweise verwendete oder verwendbare Literatur wird hier vollstndig
angegeben: Autor, Titel, Auflage, Seiten, Verlag, Erscheinungsjahr
Kremer, Das groer Buch der Mikroskopie 1.Aufl. , S 234-236, (Kosmos-Verlag, 2007)
 Materialien:

kurze Materialienliste
bei Verwendung von speziellen Chemikalien oder Reagenzien auch Rezeptur, bzw. Hersteller und
Chargen-Nummern; NaCl p.a. VWR 78999-922

 Durchfhrung :
Kurzform, Stichworte, es ist bei der Protokollierung aber darauf zu achten, dass alle fr
ein erfolgreiches Arbeiten notwendigen Details angegeben werden:

Probenentnahme: Lange Lacke, 25.9.2012 11:30 am Steg Unterneufriedlach


Prparation in physiolog. NaCl-Lsung;
Hellfeld 40-, 100-, 1000-fache Vergr. Hellfeld / 400-fach Phasenkontrast.
Fotographie mit Canon G7 Weiabgleich-Halogen, Labor-PC-L019 (D:\Dokumente\Mikro\092012, Bilder 6784-6796)

 Ergebnisse:
Hier werden alle gefundenen Daten, sowohl Rohdaten als auch die Rechengnge zu
daraus abgeleiteten Daten protokolliert. Sie bilden die Grundlage der Auswertung.
 Auswertung und Diskussion:
Die zuvor aufgelisteten Ergebnisse werden interpretiert. Im Normalfall fhrt dies zu
einem Vergleich der erhaltenen Daten mit erwarteten Ergebnissen und zu einem
abschlieenden Kommentar ber die durchgefhrte Arbeit. Es kann auch der Erfolg und
eventuelle Hinweise oder Tipps fr zuknftige Arbeiten angegeben werden. Im Idealfall
kann man hier ein Fachgutachten erstellen:
 .. Das untersuchte Wasser erfllt entsprechend der Normen und der
Badewasserverordnung 67/1973 alle erforderlichen Kriterien fr die Verwendung als
Badewasser.

C-1.1.2. Einfache mikroskopische Prparationstechnik


Wegen der geringen Gre mikroskopischer Prparate und der zumeist starken
Vergrerungsfaktoren ist es besonders wichtig, in einer mglichst dnnen Schicht zu prparieren
(unbedingt dnner als 0,1mm).

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36

Entsorgung der Prparate:


Da es unter den mikroskopischen Prparaten auch Objekte gibt, die mglicherweise pathogen
sind, mssen Deckglser und Objekttrger dekontaminiert werden:
Deckglser werden vom Objekttrger mit einer Einweg-Pipettenspitze in den Biohazard Abfall
abgeschoben, der Objekttrger in eine Desinfektionslsung gelegt (DanKlorix1:40/Splmittel).
Verunreinigungen am Mikroskop selbst werden unter Aufsicht mit Hilfe von Desinfektionslsung
entfernt.

C-1.1.3. Arbeitsanleitung - Mikroskopieren


Am Arbeitsplatz befinden nur die unbedingt bentigten Materialien:
Mikroskopierbesteck, fettfrei gereinigte Objekttrger, Deckglser (18*18mm), Laborjournal,
Schreibzeug.
Mikroskopierbesteck: Prpariernadeln, Impfsen und sonstiges Material fr sterile Arbeitsschritte.
Eine kleine, lngliche Glasschale zum Ablegen von Prpariernadeln, Impfsen oder sonstigem
Besteck ist sehr ntzlich, ev. Gasbrenner;
Filterpapier, ev. Kchenrolle zum Unterlegen beim Durchfhren von Frbungen.
Die Bedienung des Mikroskops:
Vor dem Mikroskopieren macht man sich auf jeden Fall mit
den Bedienungselementen vertraut:
In welche Richtung bewegt sich der Objekttisch wenn man
den Grob/Feintrieb benutzt; wie lsst sich der Kondensor
einstellen; wie funktioniert die Beleuchtungseinrichtung; wie
lassen sich die Okulare anpassen, etc.
Es kommt vor allem darauf an, nichts mit Gewalt zu
versuchen und die Frontlinse der empfindlichen Objektive
nicht zu zerkratzen.
 Grundeinstellung:

Man stellt zunchst den Objekttisch ganz nach unten


und schwenkt das kleinste Objektiv in den
Strahlengang.
Kondensor zunchst ganz oben, Kondensorblende ganz zu

Lichtmikroskop: Olympus BH-2 C.N.

 Objekt im Kreuztisch einspannen


 Schrfeeinstellung:

Objekttisch langsam mit dem Grobtrieb hinauffahren und gleichzeitig durch das Okular schauen.
Sobald ein Bild erkennbar wird, nur mehr den Feintrieb verwenden bis das Bild scharf ist.
Falls nichts zu finden ist, kann man auf den Deckglasrand versuchen scharf zu stellen
Oft findet man ein Objekt erst, wenn man mit der Kreuztischeinstellung hin- und herfhrt und
auf einmal einen Schatten vorbei huschen sieht.
Prinzipiell kann man auch nach dem Einlegen des Prparates den Objekttisch ganz nahe an das
kleinste Objektiv heranfhren und von dieser Stellung ausgehend versuchen scharf zu stellen.
Der Vorteil dabei ist das sichere Vermeiden eines Zusammenstoes zwischen Objektivfrontlinse
und Prparat.

 Kondensoreinstellung:

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37

Kondensorblende in der ffnungsweite und den Kondensor selbst in der Hheneinstellung so


eingestellt werden, dass das Bild an Genauigkeit (Auflsung!) und Klarheit gewinnt (keine
Beugungsmuster mehr, aber trotzdem guter Kontrast).
Die Wirkung des Kondensors und der Kondensorblende kann untersucht werden wenn man statt
eines Prparates ein kleines Papierstckchen auf den Kreuztisch legt (die Weite des Lichtkegels
wird durch die Blendenstellung beeinflusst). Bei diesem Versuch sollte der Objekttisch ganz nach
unten gestellt sein.

 Wenn ein Prparat gut eingestellt ist und ein deutliches, scharfes Bild sichtbar ist, sollte
man sich Zeit nehmen das Prparat durch Bettigung des Feintriebs auch in
verschiedenen Schichten zu untersuchen, damit man ein Art 3D Eindruck gewinnt.
 Ev. zu einem strker vergrernden Objektiv wechseln. Dazu muss der Objektivrevolver
vorsichtig in Richtung des nchst-strkeren Objektivs verdreht werden ohne dabei am
Grob- oder Feintrieb zu drehen.

Beachte dass ein strker vergrerndes Objektiv nur sinnvoll ist, wenn man auch was sieht!
Wenn man nichts findet, keinesfalls ein strker vergrerndes Objektiv einschwenken!

 Wenn man die Beobachtung beendet dreht man mit dem Grobtrieb den Objekttisch
hinunter und entnimmt danach das Prparat.
Das Lichtmikroskop ermglicht Beobachtungen am lebenden Objekt. Bedenkt man diese Tatsache,
so versucht man in erster Linie das eingestellte Objekt zu beobachten und jagt nicht nach dem
hchsten, mglichen Vergrerungsmastab (1:1600). Starke Vergrerungen sind nur bei
ruhigen und sehr dnnen Objekten sinnvoll!
Es ist zu bedenken, dass die Schrfentiefe bei starker Vergrerung immer geringer wird und das
Auflsungsvermgen durch die Lichtwellenlnge und numerische Apertur des Objektivs begrenzt
ist.
Bei lebenden Prparaten sollte man stets nach folgenden Merkmalen suchen:
 die Zellwand bzw. die Begrenzung der Zelle nach auen:

Zellwnde sind aufgrund der Dicke des Materials strker Licht-brechend als das Zytoplasma;
Zellmembranen sind selbst nicht erkennbar, jedoch das unterschiedliche Aussehen von Zellinhalt
und Umgebung der Zelle.

 Der Zellkern (bei Eukaryonten):

Wenn man einmal eine klar begrenzte Zelle erkannt hat kann man sich auf die Suche nach dem
Zellkern begeben.
Blende und Kondensor einstellen!
Der Zellkern ist meist oval und sieht wie eine Scheibe aus, die etwas dichter strukturiert ist als
das umgebende Cytoplasma.
Man beobachtet kleine Granula, die kaum Brownsche Molekularbewegung zeigen. Der Zellkern
liegt in Pflanzenzellen meist von einer groen Vakuole verdrngt an der Zellwand. Sein
Aussehen ist daher je nach Beobachtungswinkel mehr oder weniger zur Ellipse verzogen.
Durchschrfen (mit dem Feintrieb die verschiedenen Schrfeebenen beobachten)!

 Organellen:
Am auffallendsten sind sicherlich die Chloroplasten in grnem pflanzlichem Material.
 Bewegungen:
Plasmastrmungen (gerichtet, kontinuierlich) im Gegensatz zur Brownschen
Molekularbewegung (ungerichtet, chaotisch, Temperatur-abhngig)
Dokumentation:

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38

Die Protokollierung mikroskopischer Beobachtungen erfolgt in der Regel durch Zeichnungen auf
glattes Papier zunchst mit einem feinen Bleistift. Beim Anfertigen der Zeichnungen soll folgendes
beachtet werden:
 nicht zu dick zeichnen (Radieren ist mglich!)
 zuerst ein bersichtsbild anfertigen
 Detailzeichnungen immer mit einem Hinweis versehen, um welches Detail der
bersichtszeichnung es sich handelt
 Das gezeichnete Bild soll vom Greneindruck ebenso gro erscheinen wie das Bild im
Mikroskop (man kann sich behelfen indem man einen Kreis zeichnet der den Blickfeld
im Mikroskop entspricht).
 Es sollen keine Details gezeichnet werden, die nicht zu erkennen sind, sondern nur das
was man auch tatschlich gesehen hat.
 Eingestellte Vergrerung dazuschreiben und beschriften
Die Khlersche Beleuchtungseinrichtung
Bei guten Mikroskopen gibt es bei der nicht blo eine Lampe sondern ein Linsensystem, das dem
Kondensor einen nahezu parallelen Lichtstrahl liefert.
Das typische Merkmal der Khlerschen Beleuchtungseinrichtung ist die sogenannte
Leuchtfeldblende, die den Durchmesser des Lichtstrahls der zum Kondensor gelangt verndern
kann. Mit seitlichen Stellschrauben kann dieser Lichtstrahl in die Mitte des Sehfeldes zentriert
werden was fr eine optimale Auflsung besonders wichtig ist.
 Um richtig zu "Khlern" legt man ein einfaches, leicht erkennbares Prparat auf den
Objekttisch, stellt mit dem Grobtrieb scharf und schliet die Leuchtfeldblende (nicht zu
verwechseln mit der Kondensorblende!) bis der Lichtpunkt im Bild einen ganz kleinen
Durchmesser hat.
 Ohne den Grobtrieb nun zu verndern verstellt man die Lage des Kondensors am
Objekttisch in der Hhe soweit, bis die Umrisse der Leuchtfeldblende scharf sichtbar
werden.

Dabei sieht man die Hell- Dunkelgrenze der Leuchtfeldblende nur mit auffallenden Farbrndern
und Abbildungsfehlern whrend das Prparat nach wie vor scharf abgebildet wird.

 Mit den seitlichen Stellschrauben wird das Bild der Leuchtfeldblende zentriert.
 Danach kann man die Leuchtfeldblende gerade so weit ffnen, dass das Blickfeld
vollstndig ausgeleuchtet ist.

Das Mikroskop ist dann fr die Beobachtung vorbereitet.


Nach jedem Objektivwechsel muss die Khlereinstellung kontrolliert und eventuell angepasst
werden.

Arbeiten mit der limmersion


Vorbereitung:
 Man mikroskopiert wie gewohnt bis man bei der strksten Vergrerung ohne
Immersionsobjektiv ein deutliches und scharfes Bild bekommt. Ist nun das nchste
einschwenkbare Objektiv jenes mit der Vergrerungsangabe 100 und der
Zusatzbezeichnung Oel oder Oil kann man fr die Immersion vorbereiten.
 Das l muss eindeutig als Immersionsl bezeichnet und vollkommen klar durchsichtig
sein !
Einstellung:
 Die Scharfeinstellung (Grob- Feintrieb) darf nicht mehr verndert werden!
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39

 Man schwenkt das zuletzt verwendete Objektiv aus dem Strahlengang, ohne jedoch
gleich das Immersionsobjektiv (Oil) vollstndig in den Strahlengang zu geben.
 In dieser Zwischenstellung, whrend kein Objektiv auf das Objekt gerichtet ist, gibt man
einen kleinen ltropfen des speziellen, sehr sauberen Immersionsls direkt auf das
Deckglas an jene Stelle, die sich in der Mitte ber dem Kondensor befindet. Direkt im
Strahlengang befindet sich dann der ltropfen.
 Nun kann man vorsichtig und ganz langsam das Immersionsobjektiv in den
Strahlengang schwenken, wobei man besonders darauf achten muss, das Deckglas mit
der Frontlinse nicht zu berhren. Das l soll langsam zwischen Deckglas und Frontlinse
des Immersionsobjektives gleiten, damit keine Luftblasen im l eingeschlossen werden,
denn die wrden die Abbildungsqualitt stren.
 Sobald das Objektiv eingerastet ist wird ausschlielich mit dem Feintrieb scharf gestellt.
 Die Entnahme des Prparates vom Objekttisch erfolgt erst nachdem der Tisch
abgesenkt wurde.
 Nach der Benutzung wird das Immersionsobjektiv mit einem weichen Taschentuch
abgetupft. Dieser Vorgang wird mit etwas Xylol ( ) oder Toluol im Tuch wiederholt.
Grenmessung
Um in mikroskopischen Prparaten Lngen messen zu knnen muss fr
Okularmikrometer
jedes verwendete Objektiv der Okularmastab kalibriert werden.
Objektmikrometer [mm]
Dies geschieht indem man ein Objektmikrometer als Prparat durch die
jeweiligen Objektive betrachtet. Das Objektmikrometer ist ein
Objekttrger, der auf einer 2mm langen Strecke eine fein eingeritzte
0,1
Maeinteilung besitzt.
0,2
Wenn man das Bild des Objektmikrometers durch ein Messokular
0
betrachtet, das eine Skala von zumeist 100 Teilstrichen besitzt, kann
man fr die verschiedenen Vergrerungen diese Skala kalibrieren:
C.N.
Man sucht zunchst die Skala des Objektmikrometers bei der geringsten
Vergrerung und bringt deren 0,0-Linie mit der 0-Linie des Okularmastabes zur Deckung. Wie im
Bild oben gezeigt kann man dann die Lngenwerte den Okularteilstrichen zuordnen. In obigem
Beispiel entsprechen daher 100 Teilstriche im Messokular etwa 0,358 mm auf dem
Objektmikrometer. Diese Vorgangsweise wird fr alle anderen Objektive auer dem
Immersionsobjektiv wiederholt. Fr knftige Grenmessungen bentigt man nur mehr das
Messokular und die gefundenen Umrechnungsfaktoren.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10

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40

C-1.1.4. Arbeitsanleitung -Bakterienfrbungen


Bakterienausstrich
 Objekttrger entfetten: Aktivkohle-hltiges Geschirrsplmittel / Deionat / gut ab
trocknen
 Test mit Deionattrofen: Tropfen muss zerflieen (Nachteil fettiger Objekttrger: keine
homogenen Ausstriche mglich, dicke Bakterienschichten, verlngerte Trocknungszeit
des Ausstrichs)
 Kleinen Tropfen (15L) einer Bakteriensuspension an linken Rand des Objekttrgers
pipettieren;
 2. Objekttrger oder Deckglas im Winkel von 45 ansetzen, gleichmig nach rechts
ziehen (Tropfen benetzt Glasflchen und wird auseinandergezogen, gleichmige
Schichtdicke);
 Lufttrocknen lassen (nicht erhitzen, Bakterien zerplatzen)
 Fixierung: (Zellen kleben am Objekttrger, Proteine denaturieren)
 kleine nicht rauschende, aber blaue Brennerflamme
 Objekttrger mit Prparatseite nach oben, 3x mit der Geschwindigkeit von 20 cm/s
durchziehen
Frbung mit Methylenblau
Methlyenblau frbt Zellkerne und Bakterien
Herstellung eines Ausstrichprparats
 berschichten des getrockneten Ausstrichs mit 0,2-1%iger Methylenblaulsung
(Frbewanne!)
 8 min einwirken lassen
 Absplen mit Deionat, bis keine Farbspuren mehr abflieen
 Deckglas auflegen, mikroskopieren
Tuschefrbung
Zur Negativ-Kontrastierung: Bakterien hell, Umgebung dunkel
 Chinatusche 1:1 verdnnen;
 1 Tropfen auf entfetteten Objekttrger;
 mit Bakteriensuspension mischen und Ausstrichprparat herstellen;
 Trocknen lassen
 Hitzefixierung
(Achtung manchen Tuschen kristallisieren, funktioniert nicht; ev. mit Ultraschall homogenisieren)
Die Tuschefrbung lsst sich auch mit Methylenblaufrbung kombinieren:
Tusche-gefrbtes Prparat mit Methylenblau nachfrben

Gramfrbung
Theoretischer Hintergrund:
Der Aufbau der Zellbegrenzung (siehe Kapitel Zellbiologie) lsst sich mit Hilfe einer Gramfrbung
(siehe ) unterscheiden. Dazu werden zuerst alle Bakterienzellen mit Kristallviolett eingefrbt. Bei
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

41

der anschlieenden Behandlung mit Ethanol werden die gramnegativen Zellen entfrbt, whrend
die grampositiven ihre violette Farbe behalten. Um auch die gramnegativen Zellen besser sichtbar
zu machen, werden sie in einem abschlieenden Schritt mit einem weiteren Farbstoff rosa
eingefrbt.
1884 Hans Christian Gram
moderne Alternative: Fluoreszenzfarbstoffe
Sinn:
Unterscheidung zwischen Groteil aller Eubakterien fllt in eine der beiden Klassen; wichtigste
Frbung; ermglicht gemeinsam mit der mikroskopischen Untersuchung eine erst Einteilung der
Bakterien
Lsungen
In Tropfflschchen
Kristallviolett-Lsung:
I: 85%iges Kristallviolett: 4g Kristallviolett in 20 ml Ethanol lsen (Lagerung in brauner Flasche)
II: 0,8 g Ammoniumoxalat in 80 ml Deionat lsen; Lsungen I und II mischen; 5-fache Verdnnung
herstellen
Lugolsche Jodlsung:
1 g Jod (Jod lst sich nur in Anwesenheit von KJ in Wasser)
2 g KJ in 300 ml Deionat lsen; vollstndige Lsung erfordert oft lngeres Stehen-lassen; Lsung
etwa 1 Jahr haltbar - Jod ist flchtig, verlsst Polyjodidkomplex
96%iges Ethanol (kein Spiritus)
Safraninlsung:
10 ml 2,5%ige Safraninlsung mit 100 ml Deionat verdnnen
Materialien:
Frbewanne, Kchenrolle, Deionat zum Splen (Spritzflasche)
Herstellung eines Hitze-fixierten Ausstrichs
Parallel Fixierung und Frbung der zu untersuchenden Kultur und bekannter Gram-positiver- (z. b.
Bacillus subtilis) und Gram-negativer (z.B. Escherichia coli) Organismen. Junge, aktiv wachsende
Kultur (exponentielle Phase) verwenden; z.B. 12-14 Stunden alte bernachtkultur; ltere Kulturen
Gram-positiver Organismen sind reagieren Gram-negativ oder Gram-variabel)
 geringe (!) Menge der Kultur mit Deckglas oder zweiten Objekttrger auf dem
Objekttrger dnn ausstreichen

 vollstndig (!) Luft-trockenen lassen
 ist die Kultur noch feucht, knnen Zellen whrend der Hitzefixierung platzen, werden
eventuell flschlicherweise Gram-negativ beurteilt

 3x langsam durch die Brennerflamme ziehen
 Zellen schrumpfen; Proteine denaturieren, Zellen bleiben am Objekttrger haften
Frbung
Ausstrich darf whrend Frbung nie austrocknen ! berschssiger Farbstoff ist nicht mehr
abwaschbar; Frbungen, wenn mglich, mit Cornettpinzetten durchfhren
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42


 Objektrger auf Frbewanne legen (Frbewanne mit Zeitungspapier unterlegen)
 berschichten des Ausstrichs mit Kristallviolett-Lsung; 2 min einwirken lassen

Kristallviolett dringt in alle Zellen ein; reagiert als basischer Farbstoff mit sauren Gruppen des
Cytoplasmas


 Farbstoff mit Lugolscher Jodlsung absplen

Deionat wrde Kristallviolett wieder auswaschen; Objektrger schrg halten; Kristallviolett frbt
Finger bzw. Cornettpinzette verwenden


 berschichten des Ausstrichs mit Lugolscher Jodlsung-Lsung; 2 min einwirken lassen

Bildung eine Kristallviolett-Farblacks (Komplex mit Jod; Chlorid als Gegenion durch Jodid ersetztunlslich)


 Farbstoff mit Deionat absplen; gut abrinnen lassen

 Objekttrger exakt 30 s mit 96%-igem Ethanol berschichten

Farblack-Komplex wird aus Gram-negative Bakterien (dnne Zellwand) ausgewaschen uere


Membran abgelst, Lcher in Zellwand; Gram-positive Bakterien bleiben violett; Zellwand
schrumpft und lt Komplex nicht aus der Zelle; keinesfalls lnger, sonst sind Gram-positive
Zellen auch entfrbt


 sofort mit Deionat absplen

 Objekttrger etwa 15 s mit Safraninlsung berschichten

Gram-negative Bakterien werden rosa eingefrbt


 Farbstoff gut mit Deionat absplen; gut abrinnen lassen

 Nach dem Trocken mikroskopieren (mit oder ohne Deckglas; Beleuchtung optimieren !)
 Vereinzelt liegende Zellen mikroskopieren, dichte Gram-negative Zellgruppen sind
eventuell nicht entfrbt

 Entsorgung von Frbelsungen in Kunststofftank
Alternative Arbeitsvorschriften:
Carbolgentianaviolett statt Kristallviolett: gesttigte Carbolgentianaviolettlsung in 70%igem
Ethanol; Verdnnung mit 10 Teilen Deionat; Zusatz von 5% Phenol
Karbolfuchsin nach Ziehl und Neelsen statt Safraninlsung 1: 10 mit Deionat verdnnte

C-1.1.5. Prparation von Pilzen fr die Mikroskopie


Hefen: knnen wie Bakterien mit einer ausgeglhten Impfse entnommen werden

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Schimmelpilze: Will man Sporentrger untersuchen, wenn vorhanden, Probe aus gefrbten
Bereichen der Kolonie entnehmen (in der Mitte). Dazu mit zwei mit Ethanol ABGEFLAMMTE
Prpariernadeln (das Ethanol wird angezndet, und neben der Bunsenbrennerflamme abbrennen
gelassen; keinesfalls ausgeglhten der Stahl der Prpariernadeln wird brchig) Teile des Myzels
nach oben herausziehen (bei verfrbten Kolonien an den verfrbten Stellen Probe entnehmen)
und auf einen Objekttrger berfhren, Zusatz von 1 Tropfen physiologischer Kochsalzlsung oder
1 Tropfen 20%ige KOH (Pilze besser verteilt);

C-1.2. Empfehlenswerte Prparate fr den Anfang


C-1.2.1. Haare von verschiedenen Tierarten:
Trockene Prparation eines Haares (Wurzel, Spitze) wie es z.B. bei der Waren-Eingangskontrolle
oder in der Gerichtsmedizin wichtig sein kann.
 zur trockenen Prparation nimmt man einen sauberen, fettfreien Objekttrger,
schneidet das zu untersuchende Haar auf etwa 1cm zurecht, legt es auf den
Objekttrger und beschwert es mit einem Deckglas.
 Beachte die richtige Einstellung von Kondensor und Kondensorblende! Man beginnt bei
der kleinsten Vergrerung und verschafft sich zunchst einen berblick (Grobtrieb,
Kreuztisch verstellen). Ist das Prparat scharf zu sehen, kann man zur nchsten
Vergrerung bergehen, indem man einfach das nchstgrere Objektiv in den
Strahlengang bringt (ohne den Grobtrieb zu bettigen!) und anschlieend nur mehr mit
Hilfe des Feintriebes scharf stellt.
 Von der Seite kann ein kleiner Wassertropfen unter das Deckglas gesaugt werden, das
Trockenprparat wird zum Nassprparat. Das Haar verndert sich (Quellung), die
optischen Effekte (Beugung, Farbe) verndern sich.
Wichtig zu beobachten:
Der Vergleich von tierischem und menschlichem Haar (Pigmentierung, Luftkammern)
Hinweis:
Im Bezug auf die mikroskopischen Technik lsst sich die Kontrolle der Schrfentiefe gut lernen und
die Beugungserscheinungen bei stark abgeblendetem Kondensor einfach beobachten.

C-1.2.2. Strke :
Mikroskopische Strkeuntersuchungen knnen verwendet werden, um die Herstellerangaben bei
Backprodukten zu berprfen Strkekrner verschiedener Pflanzen unterscheiden sich in Form
der Krner, im Schichtaufbau und der Gre; beobachtet werden kann auch die Grenverteilung
(sind alle Krner annhernd gleich gro, oder nicht).
 Trockene Prparation:
Zum Mikroskopieren der Strke gengt eine kleine Spatelspitze, das Pulver soll fein
verteilt werden, so dass man nur eine dnne Krnchenschicht sieht. Zur Verteilung der
Krner kann man nach dem Auflegen des Deckglases sanft (!) mit der Spatel darauf
klopfen.
 Nassprparation:
Tropfen Wasser auf Objekttrger vorlegen, und sehr wenig (!) Strkepulver einrhren,
Deckglas aufleben

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 Falls mglich, kann man die verschiedenen Strketypen im polarisierten Licht


untersuchen: Dazu legt man in den Filterhalter des Kondensors ein Polarisationsfilter
und hlt mit der Hand zwischen Auge und Okular ein weiteres Polarisationsfilter. Wenn
man es dreht wird der Hintergrund dunkler und es knnen bei gekreuzten Pol-Filtern
die kristallinen Eigenschaften der Strke beobachtet werden (in Kristallen wird die
Ausrichtung des polarisierten Lichtes verndert).
Wichtig zu beobachten ist:
In manchen Strkeformen gibt es Risse, in wssriger Suspension kann es zur Quellung der Krner
kommen.
Hinweis: Der Einfluss der Kondensorblende auf den Kontrast kann besonders im Nassprparat der
Kartoffelstrke gut untersucht werden

C-1.2.3. Hefesuspension:
 zur nassen Prparation wird ein Tropfen einer leicht trben Hefesuspension auf einen
sauberen Objekttrger gebracht, danach setzt man schrg am Rand des Tropfens ein
Deckglas an und senkt es mit Hilfe einer Prpariernadel langsam ab, bis die gesamte
Flssigkeit zwischen Deckglas und Objekttrger mglichst ohne Luftblasen verteilt ist.
 berstehende Flssigkeit wird mit einem saugfhigen Papier abgesaugt (danach in Biohazard) bis das Deckglas durch Kohsion fest am Objektrger haftet (Kipptest !) Wenn
der Objekttisch ganz nach unten gestellt und das kleinste Objektiv in den Strahlengang
gebracht ist, legt man den Objekttrger mit der Hefeprobe mit der Deckglasseite nach
oben auf den Objekttisch und justiert das Objekt im Strahlengang.
 das Prparat ist umso besser, je dnner es ist !
Wichtig zu beobachten sind:
Man kann versuchen, Zellkern und Organellen zu unterscheiden. Deutlich erkennbar sind die stark
lichtbrechende Zellwand und - bei sprossbildenden Hefen - die Sprossung, vor allem, wenn man
die Suspension in etwas Zuckerlsung bereitet hat.

C-1.2.4. einfache Gewsserprobe:


Mikroskopische
Gewsseruntersuchungen
helfen,
die
Wasserqualitt einzuschtzen. Je nach Gewssergte finden sich
bestimmte Leitorganismen (Saprobiensystem). So kommen
bestimmte Kiesel- oder Zieralgenalgenarten nur in sehr sauberen
Gewssern vor.
Euglena gracilis / Phasenkontrast
CN
Interessant sind Teichwasserproben mit Sedimenten, grnen ( 400-fach)
Pflanzenteilen (Stngel von Wasserpflanzen) oder Steinen, von denen ein Belag abgekratzt werden
kann.
Die mitgebrachte Teichwasserprobe wird systematisch untersucht:
 Geruch, Aussehen (z.B. Farbe), Trbungen, makroskopisch erkennbares Getier, Sand,
Steinchen, etc.
 Die Prparation erfolgt von mehreren verschiedenen Stellen der Probe, z.B. vom
Sediment, eventuell herumschwimmende Tierchen fangen, Zupfprparate von
Pflanzenteilen usw.

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 Wichtig ist es, relevante Objekte (d.h. Lebewesen) zu identifizieren, bevor Zeichnungen
angefertigt werden (nicht sinnlos stundenlang Steinchen abzeichnen !)
 Falls die ersten Zeichnungen halbwegs gelungen sind, kann begonnen werden, in den
aufliegenden Katalogen nach den beobachteten Arten zu suchen (z.B. Leben im
Wassertropfen).
 Viele der Mikroorganismen in solchen Gewsserproben sind uert flink und knnen
daher nur schwer beobachtet werden.
Man muss dabei damit rechnen, dass nicht die gesamte biologische Vielfalt, in diesen Bchern
abgebildet sein kann, sondern man in vielen Fllen nur einen Hinweis erhlt, zu welcher Familie
oder Gattung ein bestimmter Organismus gehren kann.
Wichtig zu beobachten:
Erkennen relevanter Objekte: Unterschiede zwischen Lebewesen und leblosem Material
Symmetrie als Merkmal vieler Lebewesen; Organismenvielfalt (Unterscheidung ProkaryontenEukaryonten, Unterscheidung Protozoen-Algen; Abschtzung der Gewssergte nach
Leitorganismen; Literaturangaben

C-1.2.5. Allium cepa, Zwiebelschalenepidermis:


Fettfreien Objekttrger mit einem Tropfen physiologischer NaCl-Lsung vorbereiten. Von einer
frischen Kchenzwiebel entfernt man die uersten trockenen Schalen und schneidet mit einem
scharfen Skalpell ein etwa 7x7mm groes, quadratisches Segment aus. Von der konkaven
Innenseite der Zwiebelschuppe lsst sich mit einer Pinzette eine einschichtige Epidermis abziehen,
die man mit Hilfe von Prpariernadeln ausgerollt in den kleinen Tropfen physiologischer NaClLsung auf dem Objekttrger bringt und mit dem Deckglas einschliet. berschssige Flssigkeit
saugt man mit einem Filterpapier ab, bis das Prparat dnn genug ist. Bei roten Zwiebeln kann
auch die Epidermis der schwerer abziehbaren, aber gefrbte konvexen Seite der
Zwiebelschuppe untersucht werden. Da das Abziehen der Epidermis oft nicht gelingt, zuerst bei
schwacher Vergrerung eine Stelle des Prparats auswhlen, wo nur eine Zellschicht, die
Epidermis, erkennbar ist.
Um die dreidimensionale Anordnung von Strukturen zu erkennen, den Feintrieb permanent
verstellen (durchfokussieren).
Man sucht nach dem Zellkernen und versucht eine Stelle zu finden, an der mglichst keine
strenden Strukturen ber oder unter den Epidermiszellen liegen. Wenn man genau beobachtet,
sieht man nach einiger Zeit in der Nhe des Zellkerns Plasmastrmungen, die zum Teil in Form von
Hechtschen Fden sich auch durch den Vakuolenraum erstrecken.
Falls das Prparat schon lngere Zeit gelegen ist, ist eventuell auch das endoplasmatische
Retikulum (ER) in Form von klaren schlauchartigen Gebilden erkennbar. Bei guten Mikroskopen
erkennt man auch sog. Tpfel, kleine Lcher in der Zellwand, die benachbarte Zellen
miteinander verbinden.
Man muss immer wieder durchfokussieren um eine im Raum befindliche Struktur auch erkennen
zu knnen.
Da die Beobachtungszeit lange sein kann, muss man darauf achten, dass das Prparat nicht
austrocknet und hin und wieder von der Seite Wasser zugeben.
Plasmolyse:
Grundlagen: Kapitel A-1.1. Zellmembran, osmotischer Druck.
Zur Vorbereitung werden NaCl-Lsungen folgender Konzentrationen hergestellt:
1,0%; 1,4% und 1,6%

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Man prpariert die Innenepidermis einer - idealerweise - roten Zwiebel und hlt mehrere
saugfhige Papierstreifen bereit. Das Prparat sollt zunchst in Wasser angefertigt werden.
Es folgt die Suche nach einer lebenden Zelle und achtet dabei auf typische Lebenskennzeichen wie
Plasmastrmung, einer deutlich abgegrenzten Vakuole, und dem Zellkern. Danach gibt man einen
kleinen Tropfen der 1%igen Salzlsung auf eine Seite an das Deckglas und saugt von der anderen
Seite mit dem Papier ab. Dabei sollte man darauf achten, dass das Deckglas nicht aufschwimmt
und das Prparat verrutschen knnte. Nachdem die osmotischen Verhltnisse sich in der
Umgebung der Zelle gendert haben, beobachtet man deren Verhalten und wiederholt nach
einiger Zeit die Prozedur auch bei den Salzlsungen hherer Konzentration. Die Zellmembran hebt
sich schlielich ab einer bestimmten Salzkonzentration von der Zellwand weil der Zell Wasser
entzogen wird und sich das Zellvolumen verkleinert. Ist man bei der hchsten Salzkonzentration
angelangt, so ist die beobachtete Zelle am weitesten geschrumpft (eigentlich der Protoplast, denn
die Zellwand ist auch Teil der Zelle schrumpft aber nicht). Der Prozess kann dann wieder
umgekehrt werden, man muss aber aufpassen, dass man langsam genug vorgeht, denn sonst hlt
die Plasmamembran dem osmotischen Stress nicht stand und die Zelle platzt auf (osmotischer
Schock).
Wichtig zu beobachten:
Zellwand, Zytoplasma, Zellkern; Vakuole, Beobachtung der Plasmastrmungen, Zellorganellen
Die unterschiedlichen Plasmolysestadien sollten als Skizze dokumentiert werden.
Zu beobachten und zu protokollieren:
Zeichnungen verschiedener Pflanzenzellen;. eindeutige Beschriftung und Vergrerungsfaktor !
bersichtszeichnungen und Detailzeichnungen; bei einem dnnen Objekt kann nach Einschulung
auch die limmersion verwendet werden kann. Manche Prparate werden besser mit der Zeit,
daher ausdauernd beobachten ! Plasmolysestadien
Die bei Pflanzenzellen vorhandene Zellwand ist leicht erkennbar.
Das groe Volumen der Vakuole ist vor allem bei der Verwendung roter Zwiebeln deutlich
erkennbar, die Vakuole sollte nicht mit dem Cytoplasma verwechselt werden. Die Plasmamembran
ist nicht als eigene Struktur sichbar, weil sie durch den hohen osmotischen Druck an die Zellwand
gedrckt wird.

C-1.2.6. Mundschleimhaut:
Fettfreien Objekttrger mit einem Tropfen physiologischer (0,85%iger)
NaCl-Lsung vorbereiten. Mit Hilfe einer sterilen Holzspatel oder eines
sterilen Zahnstochers schabt man von der Mundschleimhaut etwas Material
ab und bringt es auf dem Objekttrger in den Tropfen Kochsalzlsung. Man
verteilt die Zellen durch vorsichtiges Rhren mglichst dnn und gibt das
Mundschleimhautzelle,
Deckglas darauf. Zunchst kann man die Zellen ungefrbt beobachten, 400-fach
C.N.
danach kann etwas Methylenblau (1%ige Lsung in H2O) durch das Prparat
gesaugt werden, wobei die Zellen gettet werden, der Kern aber deutlich abgefrbt wird. Durch
die Frbung mit Methylenblau werden auch die bakteriellen Begleiter unserer Mundschleimhaut
sichtbar! Man kann sie daran erkennen, dass sie nur auerhalb der Zell zu sehen sind (beim
Durchfokussieren).
Mundschleimhautzellen knnen verwendet werden, um weibliche und mnnliche Zellen zu
unterscheiden, denn bei Frauen findet man das 2.X-Chromosom in der stark kondensierten
Metaphasenform als sogenanntes Barr-Krperchen im Zellkern (Vorschrift siehe Kremer, 2002).

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Wichtig zu beobachten:
Wegen der guten Prparierbarkeit (einzelne Zellen sichtbar) und dem Detailreichtum empfiehlt es
sich, dieses Prparat auch bei hherer Vergrerung mit Hilfe einer limmersion zu beobachten.
Man erkennt Zellkern und Organellen, Bakterien an der Zelloberflche und manchmal
Zellverbnde. Fr die rumliche Vorstellung ist es besonders wichtig, das Prparat bei geringer
Schrfentiefe schichtweise zu untersuchen. Dabei erkennt man, dass die Bakterien nur
auerhalb der Zelle an der Zellmembran liegen.

C-1.2.7. Moosblttchen
Wegen des einschichtigen Blattaufbaus bei Moosen, eignen sich deren Bltter besonders, um den
Aufbau von photosynthetisch aktiven Pflanzenzellen zu sehen: Man kann dazu von Blattmoosarten
wie z.B. Funaria hygrometrica Blttchen abzupfen, im Ganzen prparieren und am Rand der
Blttchen mikroskopieren.
Wichtig zu beobachten:
Lohnend ist die Beobachtung der Chloroplasten, die sich je nach Lichtmenge in der Zelle
unterschiedlich orientieren knnen. Wenn die Pflanze teilweise beschattet wurde, findet man sie
flchig in den Zellen liegen, bei Starklicht jedoch seitlich in Profilstellung (siehe Kapitel
Chloroplasten A-3.7.5.).
Die Beobachtung sollte von der Unterscheidung verschiedener Blattteile bis zum Zeichnen von
Schnitten durch die Blattgefe (Leitbndel) reichen; auch Plasmastrmungen sind an diesem
Prparat gut zu erkennen.

C-1.2.8. Blattquerschnitt / Epidermis, Palisadenzellen, Stomata:


Fettfreien Objekttrger mit einem Tropfen NaCl-Lsung vorbereiten. Mit Hilfe einer scharfen
Rasierklinge oder eines Skalpells prpariert man von einem frischen, grnen Blatt die Ober- bzw.
Unterseite als mglichst dnne Schicht. Am besten erreicht man dies, indem man das Blatt auf ein
kleines Stck Kchenrolle legt, beides ber einen Finger rollt und vorsichtig die oberste Zellschicht
anschneidet.
An der angeschnittenen Stelle kann man, wenn ein nicht zu dnnes Blatt verwendet wurde, mit
einer feinen Pinzette die oberste(n) Zellschicht(en) abziehen und auf einen, mit NaCl-Lsung
benetzten, Objekttrger bringen.
Zu beachten sind die unterschiedlichen Gewebetypen, die sich in Vorhandensein/Anzahl und
Anordnung z.B. der Chloroplasten deutlich unterscheiden. Man findet Epidermiszellen,
Spaltffnungen, Schwamm- und Palisadenparenchym, Leitbndel mit ihren unterschiedlichen Zellund Geftypen. Das Schwamm- und Palisadenparenchym ist wegen der hohen Anzahl an
Chloroplasten pro Zelle optisch sehr dicht, man muss also gut darauf achten mglichst dnne
Prparate anzufertigen!
Unterscheidung der Stomata von ein- bzw. zweikeimblttrigen Pflanzen !
Interessant zu beobachten:
Unterscheidung der verschiedenen Blattgewebe; Schnitte durch die Blattgefe (Leitbndel);
Palisaden- und Schwammparenchym; Stomata. Auf klar begrenzte Zellen achten !

C-1.2.9. Teichwasserprobe, einfache limnologische Prfung


Fr die Charakterisierung eines Gewssers (limnologische Untersuchung) ist es notwendig, von
den verschiedenen Zonen (Ufer, Sand, Boden, Pflanzenteile) Proben zu nehmen, und die darin
vorkommenden Mikroorganismen, vor allem die Protisten zu bestimmen. Viele der Urtierchen
eignen sich als Indikatororganismen.
Zu beobachten und protokollieren:
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Allerdings muss besonderer Wert darauf gelegt werden, dass die Zeichnungen genau sind und
kleine Merkmale der Form, der Wimpern, oder Mundffnungen dargestellt werden.
Eine Grenmessung ist bei solchen Prparaten auch sehr hilfreich.
Als Ergebnis gelten die Zeichnungen der gefundenen Mikroorganismen, welche Mikroorganismen
gefunden und identifiziert werden konnten (mglichst viele verschiedene), welcher Gteklasse die
Wasserprobe zuzuordnen ist (siehe Streble/Krauter, Das Leben im Wassertropfen) und welche
Erfahrungen bei der Handhabung des Mikroskops gemacht worden sind (ev. Tipps und
Anregungen). Man sollte nach Leitorganismen suchen und diese auf jeden Fall zeichnen.
Beobachtungen zum Verhalten (Bewegung, Reaktionen auf Reize etc.) knnen auf den
Zeichnungen durch Pfeile oder Beschreibungen protokolliert werden.

C-1.2.10. Untersuchung der Mitosestadien


Zur Vorbereitung legt man eine gesunde Karminessigsure:
Kchenzwiebel (Allium cepa) auf die ffnung eines 45ml Eisessig + 55mL ddH2O mit 5g Karmin am Rckfluss
45min lang kochen lassen, filtrieren und in dunkler Flasche
teilweise mit Wasser gefllten Marmeladeglases. Man aufbewahren
soll darauf achten, dass die Wurzelplatte der Zwiebel
sich etwa cm oberhalb der Wasseroberflche befindet, ohne diese zu berhren.
Man lsst die Zwiebel in dieser Anordnung bei Raumtemperatur etwa 5-10 Tage lang stehen und
beobachtet, ob sich Wurzeln bilden.
Wenn sich Wurzel gebildet haben, trennt man mit einem Skalpell an einer der Wurzelspitzen ein
etwa 5mm langes Stckchen ab, schneidet es der Lnge nach noch einmal durch und legt es auf
einen Objekttrger. Dieses Stckchen soll an der Spitze deutlich kegelfrmig und glasig erscheinen.
Man tropft nun etwas Karminessigsure dazu und erhitzt vorsichtig bis von dem Wurzelgewebe
Blschen aufsteigen (Schutzbrille ! Vorsicht dass der Objekttrger nicht springt ! ). Die Essigsure
verdampft, die Frbelsung wird konzentrierter und muss immer wieder ergnzt werden - das
Prparat darf nicht austrocknen! Sobald die Wurzelspitze deutlich die Farbe angenommen hat und
weicher geworden ist, kann man am erkalteten Objekttrger die berschssigen Farbstoffreste mit
frischer Frbelsung absplen. Es kann auch noch mit 1,2%iger NaCl-Lsung gesplt werden um
die rote Hintergrundfarbe zu entfernen. Anschlieend wird mit einem stumpfen Gegenstand das
Deckglas auf die Zwiebelwurzel gedrckt und das Prparat gequetscht.
Durch das Fixieren und Frben sind die Zellen im Zustand kurz vor dem Absterben festgehalten.
Das Prparat kann in Kanadabalsam eingeschlossen werden, ist aber nicht sehr lange haltbar.
Vor allem etwas oberhalb der Wurzelspitze sind die Zellen recht kurz, dort lassen sich die
unterschiedlichen Teilungsstadien am ehesten finden. ltere Zellen, die weiter von der
Wurzelspitze entfernt sind zeigen nur mehr Streckungswachstum, und keine Zellteilungen mehr.
Wichtig zu beobachten:
Im Prparat fallen zunchst die dunkelrot
gefrbten Kerne auf, man sollte besonders auf
deren Struktur achten: die Prophase ist an der
etwas grberen Struktur im Zellkern erkennbar
(die Chromatidenfden sind kondensiert,
treten deutlich hervor und geben dem Zellkern
ein knuelartiges Aussehen). Zellen in der
Prophase knnen von jenen in der Telophase
Mitosestadien bei Allium cepa C.N.2007
oft nicht sicher unterschieden werden.
Man soll versuchen, sich den Ablauf der Zellteilung anhand der Momentaufnahmen im Prparat
vorzustellen. In vivo dauert der Vorgang der Chromosomentrennung selbst meist nur einige

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Sekunden, sie ist nur eine Schlusspunkt fr viele Prozesse, die sich vor der rumlichen Teilung der
Zelle ereignet haben mssen.
Mgliches anderes Prparat fr Mitosestadien: Staubfadenhaare von Tradescantia virginica.

C-2. Sterilisations- und Desinfektionsverfahren


Die Sterilisation von Gerten und Medien erfordert viel Zeit, eine grndliche Planung und
Einteilung der durchzufhrenden Arbeiten ist besonders wichtig, um lange Arbeitspausen oder
Stehzeiten zu vermeiden!

C-2.1. Sterilisation mit dem Hitzeschrank


nur fr hitzefeste Materialien
 Vorbereitung des Sterilisationsguts

Einpacken von Gegenstnden in hitzefesten Materialen (hitzefeste Spezialfolien, Alufolie,


Metalldosen,.)
Verschlieen von Gefen Gefe aber nicht luftdicht verschlieen, damit Luftaustausch
mglich ist
Anbringen eines kleinen (!) Stcks Thermoband - Kontrolle, ob das Sterilisationsgut, berhaupt
erhitzt worden ist Achtung: Verwechslungsgefahr mit Autoklavierband

 Hitzeschrank 180C 2 Stunden oder 160C 4 Stunden - Gerte trocken hineinstellen

C-2.2. Ausglhen
nur fr hocherhitzbare Materialien (z.B. Platindraht), Stahl oxidiert (!) z.B. Impfsen
 vor Gebrauch bis zur Rotglut in Bunsenbrenner halten

schrg von oben kommend in die Flamme halten ganze Lnge der Impfse sterilisieren
einmalige Rotglut reicht, lngeres Glhen bringt nichts

 nach Gebrauch: feuchte se zuerst langsam in unteren, klteren Teil der Flamme
halten, dann wie oben beschrieben ausglhen

langsame Erwrmung verhindert Verspritzen von Mikroorganismen-hltigem Material

C-2.3. Abflammen
fr Arbeitsgerte, die nicht ausgeglht werden drfen; fr Arbeitsgerte, die keine extreme
Sterilitt erfordern (z.B. Zellkulturbedarf), z.B. Impfnadeln, Drigalskispatel
Abflammen mit Ethanol (Flambieren)
 Gegenstand in 70% Ethanol tauchen

vor und nach dem Gebrauch des Gegenstandes

 Gegenstand abflammen

in der Flamme anznden, und gleich wieder herausziehen, in 10-20 cm Entfernung vom Brenner
abbrennen lassen
Vorratsgef mit Ethanol nicht unter die brennende Flamme stellen

Abflammen ohne Ethanol:


 Flaschenrnder kurz durch Bunsenbrennerflamme ziehen

Vor dem Gebrauch und vor dem erneuten Verschlieen des Gefes durchfhren

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C-2.4. Autoklavieren mit dem Certoclaven


Fr gngige mikrobiologische Kulturmedien, Kunststoffspitzen etc.
Vorbereitung des Sterilisationsguts
 Verschlieen von Gefen

Gefe aber nicht luftdicht verschlieen, damit Luftaustausch mglich ist


Flssigkeiten in Flaschen - Schraubverschluss halbe Drehung geffnet
Erlenmeyerkolben fr Flssigkeiten, die in einem Zug verbraucht werden, mit Metallkappe
oder Alufolie verschlieen; fr Flssigkeiten, aus denen mehrmals steril entnommen werden
soll, und fr Kulturgefe Wattestopfen anfertigen, der mit Alufolie abgedeckt ist (Watte
wrde in Feuchtigkeit nass werden, und dabei Filtrationswirkung verlieren); Wattestopfen gro
anfertigen, damit er leicht zu entnehmen und erneut aufzusetzen ist
Rhrchen mit Kapsenbergverschluss abdecken

 kleines Stck Autoklavierband am Autoklaviergut anbringen

Achtung nicht mit Thermoband fr Hitzeschrank verwechseln

 Wasserstand im Autoklaven kontrollieren und korrekt einstellen












entionisiertes Wasser bis zum Unterrand des Innentopfes einfllen verschmutztes, altes
Wasser muss entfernt werden und der Topf vor Gebrauch gereinigt werden (Schmutz brennt sich
ein und Geruchsbelstigung)

Autoklaviergut einrumen
Deckel schlieen und mit orangefarbenen Sicherheitshebel verschlieen
Ventil ffnen
Heizung des Autoklaven einschalten
Erhitzen, bis grere Luft/Wasserdampfmengen aus dem Ventil strmen, dann 2-3
Minuten weiter erhitzen
Ventil schlieen
Druck auf 1 bar berdruck steigen lassen (blauer Bereich am Manometer; 121oC)
Autoklavierzeit beginnt: 15-20 min
Heizung des Autoklaven abschalten
Abkhlen lassen, bis kein berdruck im Topf herrscht und Temperatur auf 80oC gefallen
ist
Gefahr des Siedeverzugs, vor allem bei hochviskosen Medien wie Agar-Agar-hltigen Medien

 erst dann Ventil ffnen, kurz warten


 Deckel ffnen

Deckel dabei als Schutzschild verwenden

 Autoklaviergut entnehmen

Achtung Siedeverzug !, Handschuhe einsetzen

C-2.5. Sterilfiltration
fr hitzelabile Flssigkeiten und Nhrmedien:
 in kleinem Mastab: Injektionsspritze mit Filteraufsatz; Lsung durchdrcken
 in grerem Mastab: obere Kammer mit unsteriler Lsung; darunter Filter aus
Kunststoff (Einweg) oder Glas (Mehrweg); Durchsaugen mit Vakuum; sterile Flssigkeit
in unterer Kammer

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C-2.6. Desinfektionsmanahmen
C-2.6.1. UV-Licht
fr sterile Werkbank, Sterilrume; vor Benutzung UV-Licht ausschalten - darf nicht in die
Augen gelangen !!!

C-2.6.2. Chemischen Desinfektionsmittel


Alkohole
Einwirkzeit Ethanol 15 min z.B. zur Dekontamination nach dem Verschtten von Keimhltigen Flssigkeiten
Kommerzielle Desinfektionsmittel
Anwendungsbereich, Konzentration und Einwirkungszeit beachten (Firmenangaben)!

C-2.7. Der sterile Arbeitsplatz


Die nachfolgenden Manahmen ermglichen eine weitgehend sterile Arbeitstechnik
 frisch gewaschene Arbeitsmntel verwenden
 Uhr und Schmuck ablegen
 Arbeitsflche vor Arbeitsbeginn mit Ethanol abwischen
 Arbeitsflche nach Arbeitsende mit Ethanol abwischen
 Hnde waschen/desinfizieren
 keine berflssigen Gegenstnde am Platz
 Zugluft vermeiden
 Reduktion der Bewegungsgeschwindigkeit
 zgig, aber nicht hastig arbeiten
 Anordnung der erforderlichen Gegenstnde genau planen
 nicht ber offene Gefe mit sterilem Inhalt greifen
 nicht ber Kreuz greifen
 in der Nhe (max. 30 cm Entfernung) des Brenners arbeiten
 alle Gegenstnde, die in Kontakt mit Medien oder Kulturen kommen, werden sterilisiert
 alle Gegenstnde, die mit sterilen Gegenstnden in Kontakt kommen werden
desinfiziert
 Gegenstnde, welche steril bleiben sollen drfen nicht auf der Arbeitsflche abgelegt
werden
 sterile Gefe sollen mglichst lange verschlossen gehalten werden
 Gegenstnde mglichst weit von sterilem Bereich entfernt mit den Hnden angreifen
 unsterile Gegenstnde nicht in sterile Gefe tauchen

z.B. Mikroliterpipetten nicht tief in sterile Flaschen tauchen, stattdessen Flasche schrg halten

 bei Husten oder Niesen Kopf wegdrehen


 Sprechen mglichst vermeiden
 Mit den Hnden whrend der sterilen Arbeit keine stark kontaminierten Flchen
angreifen

z.B. Handy, Trschnallen

 kontaminierte Gegenstnde getrennt sammeln (Biohazardkbel) und erst nach der


Dekontamination (autoklavieren) entsorgen
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Die sterile Werkbank


Alle Vorkehrungen des sterilen Arbeitsplatzes bercksichtigen, zudem Gegenstnde, die in die
Werkbank eingebracht werden, mit Ethanol abwischen.
Nach der Benutzung muss die sterile Werkbank komplett desinfiziert und wieder verschlossen
werden. UV-Licht whrend der Nichtbenutzung einschalten

C-3. Herstellung von Nhrmedien


C-3.1. Einwaage, Portionierung und Sterilisation
Achtung: Bei der Auswahl der Chemikalien und Nhrbodengrundlagen die genaue Beschreibung
des Herstellers beachtet werden (Analyse der Inhaltsstoffe und Zusammensetzung), denn in den
Rezepturen der Arbeitsvorschriften ist oft eine Zusammensetzung gefordert, die es am Markt nicht
gibt. In so einem Fall muss das Nhrmedium aus den einzelnen Komponenten zusammengemischt
werden.
 Wahl eines geeigneten Nhrmediums:

Handbuch der Nhrmedien-Hersteller (Merck, Oxoid, VWR, etc. ), oder onlin nachsehen;
Katalognummer protokollieren!
Art der anzuzchtenden Keime
fest-flssig?
z.B. Universalnhrmedien fr anspruchslose Bakterien: Nhrbouillon
z.B. Universalnhrmedien fr Pilze (besonders Hefen): Wrze
z.B. Universalnhrmedien fr Pilze: Malzextrakt
z.B. Kulturmedium fr Escherichia coli: LB-Medium

 Ermittlung des erforderlichen Volumens

z.B. 10 cm-Petrischale: 10-15 ml Medium


bei kleineren Volumina 20%, sonst 10% Reserve berechnen

 Einwaage in Erlenmeyerkolben

Fertignhrmedium oder Einzelkomponenten


Fllvolumen des Kolbens mindestens doppelt, besser dreifach so gro! sptere
Homogenisation (Schtteln) erfordert Platz; beim Aufkochen Gefahr des Siedeverzugs

 Aufschlmmen der Medienbestandteile

Gefahr der Klumpenbildung; diese sind spter schwer homogenisierbar


aufschlmmen = kleine Menge entionisiertes Wasser zusetzen, sofort heftig schwenken
sobald Wasser zugegeben worden ist, muss das Medium am gleichen Tag sterilisiert werden,
sonst Wachstum von Keimen

 Auflsen/Suspendieren der Inhaltsstoffe

(Schtteln, Rhren,..) mit entionisiertem Wasser (ungefhres Volumen gengt !)


Verfestigungsmittel wie Agar-Agar lsen sich erst beim Aufkochen, bleiben daher in Suspension

 ev. fr Homogenisation im Mikrowellenherd aufschmelzen

unbedingt erforderlich, wenn Medium portioniert werden soll


Aufschmelzen unter permanenter Beobachtung durchfhren (berkochen Verluste und
erforderliche Reinigungsarbeiten)
Entnahme mit hitzefesten Handschuhen
Achtung, Siedeverzug vorsichtig entnehmen und zaghaft zu schwenken beginnen
optische Kontrolle, ob Agar-Agar vollstndig aufgelst ist (keine Partikel, keine Schlieren beim
Schwenken)

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 ev. Portionieren

mit Hilfe der Abfllbrette


Volumen: ungefhre Menge Deionat in leerem, unsterilen Rhrchen als Fllstandskontrolle
vorlegen, und beim Abfllen daneben halten
werden feste Nhrmedien portioniert, hei portionieren (Agar-Agar wird bei 35C fest), und
sofort (!) mit heiem Wasser nachsplen (Agar-Agar wird sonst in der Brette fest)

 Sterilisation

Autoklavieren fr die meisten Nhrmedien (zugedeckt, aber nicht luftdicht verschlossen), sonst
Sterilfiltration; Angaben des Nhrbodenherstellers beachten

 grere Volumina nach dem Autoklavieren homogenisieren (schtteln)


 Verwendung des Mediums nach Abkhlung auf Kultivierungs-/Raumtemperatur oder
Lagerung nach dem Abkhlen auf Raumtemperatur bei 4C mglich

C-3.2. Platten mit festen Medien gieen (Nhrbden)


 ev. Aufschmelzen nach Lagerung

im strmenden Dampf aufschmelzen (Autoklav mit offenem Ventil, 15-20 min )

 Temperieren der Medien auf 55-60oC (Wasserbad!) 15-20 min

Gefahr der Quetschwasserbildung auf Platten (Flssigkeitsfilm auf der Oberflche)

 Ausgieen fester Medien

unter sterilen Bedingungen (Bunsenbrenner, Spiritus-desinfizierter Arbeitsplatz)


Petrischalendeckel nicht ablegen, nur aufkippen
Kolbenrand vor und nach dem Gieen abflammen
zgig, damit Festigungsmittel nicht erstarrt
Aushrten lassen
abseits der unmittelbaren Arbeitsflche aushrten lassen, z.B. hinter den Brenner schieben
sollen nicht bei weiteren Arbeiten im Weg sein
Aushrtung einzelner Platten direkt auf der Arbeitsflche: rascher, aber mehr Platz erforderlich;
Aushrtung im Plattenstapel: langsamer, weniger Platz erforderlich

 ev. Lagerung der Platten bei 4-8oC mit Nhrboden nach oben !

bei der Lagerung entsteht Kondenswasser, das nach oben verdampft (wre der Nhrboden
unten in der Petrischale, wrde das Kondenswasser vom Deckel auf den Nhrboden tropfen, und
dort eine berschwemmung verursachen; in Folge wrden Mikroorganismenkolonien
ineinander flieen und die Beurteilung von Kolonien erschweren)
bei den meisten Medien ist eine Lagerung ber mehrere Wochen mglich, Medien sollten, wenn
mglich, von Kulturen (=bewachsenen Medien) getrennt aufbewahrt werden Kontaminationsgefahr

C-4. Zell- und Keimzahlbestimmungsverfahren


Wichtige Informationen zur Probe:
Datum, Art und Ort der Probenahme; Bedingungen des Transports der Probe; Lagerung der Probe
(Temperatur, Dauer)

C-4.2. Zellzahlbestimmung mit einer Zhlkammer


Achtung: Zhlkammer = teuer; Es muss ein speziellen Deckglas verwendet werden, das nicht
entsorgt werden darf
 Zhlkammer und zugehriges Deckglas (z.B. Thoma, Brker-Trk) mit 70% Ethanol
reinigen
 Deckglas auf die Zhlkammer legen
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

54

 Stege der Zhlkammer mit Probe befeuchten

Deckglas klebt durch die Kapillarwirkung


die meisten Produkte haben 2 Zhlnetze pro Zhlkammer (oben und unten)

 Probe gut homogenisieren und zgig auf die Zhlkammer(n) auftragen

1 Tropfen der Probensuspension wird an den Kapillarspalt zwischen Zhlkammer und Deckglas
pipettiert die Probe wird durch Kapillarwirkung unter das Deckglas gesaugt.

 Zhlstrategie whlen

z.B. alle Kleinquadrate in einer Diagonale von links oben nach rechts unten

 Zellen zhlen:

pro Kleinquadrat sollten 2-12 Zellen vorhanden sein; sind es weniger, wird die Zhlung ungenau,
sind es mehr, Probe verdnnen und dann Verdnnung der Probe auszhlen
jeweils Zellen, die auf der linken und oberen Begrenzung eines Kleinquadrats liegen, mitzhlen;
Zellen, die auf der rechten und unteren Begrenzung liegen, nicht mitzhlen
fr 5% Irrtumswahrscheinlichkeit insgesamt 400 Zellen zhlen; in vielen Fllen reicht die Zhlung
von 100 Zellen
um Probenahmefehler zu minimieren, Zhlkammer mindestens 4x befllen und nur so viele
Kleinquadrate auszhlen, bis gewnschte Zellanzahl erreicht ist

 Reinigung der Zhlkammer

wenn pathogene Mikroorganismen gezhlt wurden, Zhlkammer mit Ethanol oder anderen
Desinfektionsmitteln vor dem Absplen der Mikroorganismen desinfizieren!
Zhlkammer mit warmen Wasser absplen, ev. mit 70% Ethanol fettfrei machen, Deckglas in
Schutzhlle geben

 Berechnung:

durchschnittliche Zellzahl/Kleinquadrat= Zahl der gezhlten Zellen / Zahl der gezhlten


Kleinquadrate
Zellzahl / ml= durchschnittliche Zellzahl/Kleinquadrat * 4* 106 [Einheit: Zellzahl/ml)]
Bercksichtigung einer eventuellen Vorverdnnung der Probe

Fehlerdiagnose und Behebung


Problem
Zellen
nicht
vereinzelt
(Klumpen)
starke Variation der Zellzahl
zwischen
verschiedenen
Befllungen

Falsche Zellzahl

zu hohe Zellzahl

mgliche Ursache
mangelnde Homogenisation
(A)
Zu wenig Zellen gezhlt (B)
Probe stand zu lange in
Pipette (C)
ungleiche Verteilung d. Probe
in der Zhlkammer (D)
A, B, C, D oder
Rechenfehler (E)
Probennahmefehler (F)
Zellsuspension zu konzentriert

Fehlerbehebung
Probe vortexen (a1)
krftig mehrmals Auf/Abpipettieren (a2)
b) mindestens 400 Zellen auszhlen
siehe a1 oder a2
d) Kleinquadrate in der Diagonale des
Groquadrates auszhlen
siehe a1), a2), b), c)
e) Berechung berprfen, siehe SOP
f)
mindestens
4
unabhngige
Befllungen der Zahlkammer
Probe
verdnnen
und
Zhlung
wiederholen

Lebend-/Totzellzahl bei Hefen:


Variante A (Weiterverwendung einer vorher ausgezhlten Zellsuspension)
 an den seitlichen Rand des Objekttrgers einen Tropfen Methylenblau ansetzen
 Methylenblau durch Ansetzen eines geraden Randes einer Kchenrolle auf der
gegenberliegenden Seite durch die Probe saugen (Zellen sind durch Deckglas fixiert)

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55

 Berechnung des Lebend-/Totanteils; Verdnnungseffekt durch Methylenblaulsung


bercksichtigen
Variante B
Wie oben, doch Probe direkt mit Methylenblau versetzen

C-4.3. Fotometrische Bestimmung der optischen Dichte (OD-Wert)


meist wird die unverdnnte Probe eingesetzt
 fotometrische Messung bei 600 nm (normiert) gegen Wasser oder
Suspendierungsmittel der Probe (Messbereich etwa OD = 0,2 0,8)
 Ergebnisberechnung

ist ein relativer Wert, fr absoluten Zellzahl des jeweiligen Mikroorganismus muss mit anderen
Methoden kalibiriert werden (z.B. Kochsches Plattengussverfahren)

 Entsorgung der mehrfach gebrauchten Kvetten im Biohazard

C-4.4. Herstellung einer dezimalen Verdnnungsreihe:


Vorbereitungsarbeiten
 Vorbereitung eines sterilen Probegefes
 Je 9 ml physiologische Kochsalzlsung (fr Hefen) in Rhrchen mit
Kapsenbergverschluss vorlegen und autoklavieren, abkhlen lassen
 Reserverhrchen nicht vergessen
Verdnnen
in der Regel werden 10 dezimale Verdnnungsstufen hergestellt
 sterilen Arbeitsplatz vorbereiten

Abwischen mit 70%igem Alkohol, Bunsenbrenner aufstellen; Hnde waschen; Probe vorbereiten
Arbeit in unmittelbarer Nhe des Brenners durchfhren, etc.

 Verschlsse der Rhrchen mit Verdnnungsflssigkeit lockern (aber nicht abziehen)


 (flssige) Probe unmittelbar (!) vor Gebrauch gut mischen
 Proberhrchen ffnen

mit der linken Hand (zwischen kleinem Finger und Ringfinger; fr Linkshnder umgekehrt)
Verschluss des Rhrchens greifen und halten (nicht ablegen)

 ffnung des Proberhrchens abflammen

1x langsam(!) durch die Flamme ziehen

 1ml der Probe aufziehen

ev. die Pipette vorbereiten: Spitzenabwerfer abziehen, Schaft mit 70% Ethanol abwischen

 Probe aus dem Rhrchen entnehmen

mit Mikroliter-Pipette (1 mL; blaue Spitzen) ohne Berhrung des Randes

 Rhrchenrand erneut abflammen


 Verschluss aufsetzen
 Wiederholung des Vorgangs fr alle weiteren Verdnnungsstufen

C-4.5. Kochsches Plattengussverfahren


 Steriles portioniertes festes Nhrmedium herstellen

Medienwahl nach Organismus

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56

10-15 mL/10cm Platte


Portionieren mit Abfllbrette: fr Einfachbestimmungen 10 (mit Reserve 11-12), fr genaue
Bestimmungen (Dreifachbestimmung) 30 Portionen (mit Reserve 34)
Rhrchen mit Kapsenbergverschluss verschlieen und autoklavieren
auf 55oC temperieren (Wasserbad) Achtung: zu hei: Mikroorganismen gehen ein; zu kalt:
Medium erstarrt zu frh, keine Durchmischung mit Keimen mglich
Gebte knnen das Medium auch nicht portioniert autoklavieren, aber Gefahr der berfllung
der Platten

 dezimale Verdnnungstufen einer Probe herstellen siehe oben

Petrischalen (1-3 Stck/Verdnnungsstufe) beschriften


Plattenbeschriftung eher klein am Rand, weil sie sonst spter beim Auszhlen strt

 sterilen Arbeitsplatz vorbereiten


 unmittelbar vor Arbeitsbeginn (!) erstes Rhrchen mit Nhrboden aus dem Wasserbad
entnehmen
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Variante 1:
 1 ml Probe bzw. Aliquot der Verdnnungsstufe steril entnehmen und zu flssigem
Nhrboden pipettieren (steriles Pipettieren siehe Herstellung einer
Verdnnungsreihe)
 Vortexen
 Nhrboden in Petrischale gieen (Deckel nur hochkippen)
Variante 2:
 1 ml Probe bzw. Aliquot der Verdnnungsstufe steril entnehmen und in unbefllter
Petrischale vorlegen (steriles Pipettieren siehe Herstellung einer Verdnnungsreihe)
 sofort 8er-Schleifen mit der Petrischale ziehen (Mischen von Keimen und Medium)

Manche Keime haften auf der Kunststoffoberflche und knnen spter nicht mehr gut verteilt
werden, daher Keimsuspension nicht zu lange in der Petrischale stehen lassen, bevor Medium
hinzu kommt

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- an einem ruhigen Ort erstarren lassen

Da hufig sehr viele Platten gleichzeitig gegossen werden, ist es gnstig, sie an einer Stelle, wo
sie nicht im Weg sind, zu stapeln. Aushrtung dauert aber lnger

 bei geeigneter Temperatur bebrten

Bebrtung mit dem Boden nach oben, zu Paketen gestapelt (ev. mit Klebeband zusammen
geklebt)

 Kolonien auszhlen

Kolonien auf Platten auszhlen, die 30-300 Kolonien enthalten (optimal sind 100-200
Kolonien/Platte); Platten mit hheren Koloniezahlen als >300 oder n.a.(nicht auswertbar)
dokumentieren
Platten auf dunklen Untergrund legen, Boden nach oben
ev. Plattenbeschriftung entfernen, aber Verwechslungsgefahr
wasserfester Filzstift gezhlte Kolonie markieren, um Mehrfachzhlung zu vermeiden;
Alternativen: Zhlstab oder Zhlgert (jeweils elektrischer Zhler)

 Keimzahl in der ursprnglichen Probe errechnen

Mittelwert von Parallelplatten errechnen


Keimzahl mehrerer Verdnnungen auf eine Verdnnungsstufe beziehen
gewichtetes arithmetisches Mittel errechnen

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57

Angabe in KBE (Keim-bildende Einheiten)/ml bzw. cfu (colony forming units)/ml; nur eine
Kommastelle angeben, Schreibweise mit Hochzahlen; z.B. 5,4 x 106KBE/ml

 Protokoll: Medium, Volumina, Bebrtungdauer angeben

Fehlerdiagnose und -behebung:


Fehler
keine Kolonien

Mgliche Ursache
Probe zu verdnnt

Nhrboden zu hei

Fehlerbehebung
Probe nicht verdnnen oder
Sterilfiltration zur Ermittlung der
Keimzahl
Genau
Temperieren
(im
Wasserbad)

falscher Nhrboden
Korrekte Medienwahl
Kolonien
8er-Schleifen nicht durchgefhrt
Sofortiges Mischen nach der
ungleichmig verteilt
Medienzugabe
Medium zu kalt, wird zu schnell hart Rhrchen einzeln aus dem
Wasserbad holen
Koloniezahl
variiert Probe schlecht gemischt
Unmittelbar vor Verwendung
zwischen
mischen
Parallelplatten stark
Pipettierfehler (z.B. Luft aufgezogen korrekt pipettieren
zu geringes Volumen)
Pipette berprfen (Volumen
abwiegen)

C-4.6. Drigalskispatelplattenverfahren
 Platten mit festem Nhrmedium herstellen

Rhrchen mit Kapsenbergverschluss


Medienwahl nach Organismus
10-15 mL/10cm Platte
fr Einfachbestimmungen 10 (mit Reserve 11-12), fr genaue Bestimmungen
(Dreifachbestimmungen) 30 Platten (mit Reserve 34)
Temperieren auf 55-60oC vor dem Ausgieen wichtig, da bei zu heiem Medium
Quetschwasser entsteht, es bildet sich an der Nhrbodenoberflche ein Flssigkeitsfilm, der
spter das Einziehen der flssigen Probe in den Nhrboden verhindert, die Keime werden
schlecht verteilt

 dezimale Verdnnungstufen einer Probe herstellen siehe Herstellung einer dezimalen


Verdnnungsreihe
 Petrischalen (1-3 Stck/Verdnnungsstufe) beschriften

Plattenbeschriftung eher klein am Rand, weil sie sonst spter beim Auszhlen strt

 sterilen Arbeitsplatz vorbereiten


 Nhrbodenoberflche trocknen

Begrndung siehe oben


1-2 Tage bei Raumtemperatur lagern (nicht eingepackt) oder, zur Not, 1-2 Stunden geffnet im
Brutschrank (Nhrbodenoberflche nach unten)

 100L (20-200 l sind mglich) Probe bzw. Aliquote aller Verdnnungsstufen steril
aufpipettieren

Steriles Pipettieren, siehe Herstellung einer dezimalen Verdnnungsreihe

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58

20-200l Pipette, Schaft mit Ethanol abgewischt


Probe unmittelbar vor dem Verstreichen aufpipettieren, da Flssigkeit sonst an einer Stelle des
Nhrbodens aufgesaugt wird, und Keime nicht gut verteilt werden knnen

 Drigalskispatel mit Alkohol abflammen, an der Luft abkhlen lassen (!)


 Spatel an der Luft abkhlen (!) lassen

alternativ kann Spatel auch auf einer freien Stelle des Nhrbodens (wo keine Probe ist)
abgekhlt werden

 Probe/Aliquot der Verdnnungsreihe in den Nhrboden einreiben

kreisfrmig abwechselnd in und gegen den Uhrzeigersinn einreiben; ev. Platte gleichzeitig
drehen
so lange reiben, bis sich Flssigkeit komplett in Nhrboden eingesaugt hat, d.h. ein deutlicher
Wiederstand zu spren ist, bzw. mindestens 20 Kreise

 Bebrtung, Auszhlen der Kolonien, Berechnung und Protokoll wie beim Kochschen
Plattenguverfahren
Fehlerdiagnose und -behebung:
Fehler
keine/zu wenig Kolonien

Mgliche Ursache
Drigalskispatel
abgekhlt

Kolonien
verteilt

nicht

ungleichmig Nhrboden zu nass (zu heies


Ausgieen,
zu
kurzes
Trocknen, zu kurzes Einreiben
der Probe)
Koloniezahl variiert zwischen Pipettierfehler (z.B. Luft
Parallelproben stark
aufgezogen zu geringes
Werte aufeinanderfolgender Volumen)
Verdnnungsstufen passen Probe schlecht gemischt
nicht zueinander
Drigalskispatel
nicht
abgekhlt

Fehlerbehebung
Drigalskispatel
nach
dem
Abflammen lange genug abkhlen
lassen
Nhrmedium
nicht
zu
hei
ausgieen und gut vortrocknen
lassen
Probe lange genug verteilen
Pipette kontrollieren (Abwaage
bestimmter Volumina), optische
Kontrolle beim Pipettieren
Probe unmittelbar (!) vor dem
Pipettieren mischen
Drigalskispatel
nach
dem
Abflammen lange genug abkhlen
lassen

C-4.7. Most Probable Number (MPN) -Verfahren


 Vorbereitung von 30 Rhrchen (fr sehr genaue Bestimmungen 50 Rhrchen) mit
flssigem Nhrmedium und autoklavieren

Rhrchen mit Kapsenbergverschluss


5-10 mL pro Rhrchen
Medienwahl nach Organismus
Achtung: Nhrmedium ohne Trbung verwenden (!)

 Herstellung einer dezimalen Verdnnungsreihe, siehe Herstellung einer dezimalen


Verdnnungsreihe
 je 1 mL Probe/Verdnnung zu 3 (bzw.) 5 flssigen Nhrmedienrhrchen pipettieren

steriles Pipettieren siehe Herstellung einer Verdnnungsreiche


zwischen den Pipettierschritten nicht zu lange stehen lassen bzw. erneut homogenisieren

 Bebrtung bei geeigneter Temperatur


 Auswertung
 Rhrchen vortexen, Trbung feststellen; ja Bewuchs, nein kein Bewuchs
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

59

 man whlt, wenn mglich die drei hchsten Verdnnungsstufen, bei denen noch ein
Bewuchs festzustellen ist
 Ablesung der Stichzahl
 Ablesen der wahrscheinlichsten Keimzahl in MPN-Tabelle

In manchen Fllen gibt es mehr als einen mglichen MPN-Wert, die Werte passen im Rahmen
der Genauigkeit des Verfahrens aber gut zueinander

 Berechnung

Multiplikation der wahrscheinlichsten Keimzahl mit der schwchsten Verdnnung, die fr die
Ermittlung der Kennzahl verwendet worden ist
Beachte auch den Vertrauensbereich innerhalb dieses Bereichs liegt der wahre Wert, mit
einer Wahrscheinlichkeit von 5%, dass er auerhalb liegt

C-5. Agardiffusionstest auf Penicillin G-Empfindlichkeit


2.2. Materialien:
bernachtkultur:
Escherichia coli: JM 101 (in Nhrbouillon)
Grundschicht: z.B. Plate Count Agar (1,5-2% Agar Agar)
Deckschicht: Nhrbouillon-Agar (0,7%ig) + 200L E.coli Vorkultur
Antibiotikum: Penicillin-G (Standardreihe Konzentrationen siehe Antibiogramm, 2.6.)
Testantibiotika:
Chloramphenicol, Bacitracin, Gentamicin (vorgefertigte Testscheibchen)
Testscheibchen (Von Sensi-Disc)
Steriles Deionat, 30 Eprouvetten + Kapsenbergverschlsse + Eprouvettengestell,
10
Eppendorfgefe
(steril),
10
Petrischalen,
2
Erlenmeyerkolben
500mL,
1 Erlenmeyerkolben 250mL, Abfllbrette, 1 Kolbenhubpipette 20L (verstellbar),
1 Kolbenhubpipette 1000L (verstellbar), Tarawaage, Analysenwaage, Mirkowellenherd, Brenner,
Autoklav, Laminar Flow, Brutschrank: 37C, Wasserbad, Pinzette, Spatel, Impfse, Impfnadel,
Geodreieck
2.3. Vorkultur (o/n-Kultur):
Fr die Anzucht des Teststammes (z.B. E.coli JM101 oder E.coli HB101) wird von einer Reinkultur in
5mL sterile Nhrbouillon berimpft und ber Nacht bei 37C im Schttelbrutschrank bebrtet.
2.4. Platten mit Grundschicht (1,5%ig an Agar-Agar):
Zur Herstellung der Platten mit der Grundschicht werden fr 200mL Nhrboden (inklusive Reserve
ca.10 Platten) in einem 300mL Erlenmeyerkolben 1,6g Nhrbouillon und 3g Agar-Agar (1,5%)
eingewogen und auf 200mL aufgefllt. Es wird bei 121C fr 15min autoklaviert und nach dem
Abkhlen auf ca. 80C im LF direkt aus dem Kolben in die Petrischalen etwa 20mL Nhrboden
ausgegossen. Nach dem Erstarren lsst man das Kondenswasser im Laminar-Flow (siehe
Steriltechnik, 2.1.) abtrocknen und legt die Platten vor dem Auftragen der Deckschicht (top-Agar)
fr ca. 15 min verkehrt in den Brutschrank, damit die Deckschicht beim Ausgieen auf einen zu
kalten Grundschichtagar nicht zu schnell fest wird. Es ist auch mglich die Grundschicht frher zu
gieen, allerdings muss darauf geachtet werden, dass vor dem Aufbringen der Deckschicht das
Kondenswasser auch nach Lagerung im Khlschrank getrocknet wird.
2.5. Deckschicht (top-Agar, ca.0,8%ig):
0,50 g Nhrbouillon und 0,50 g Agar-Agar werden in 60mL Wasser gelst, in dem Mikrowellenherd
aufgeschmolzen und zu je 5mL in Eprouvetten mittels Abfllbrette portioniert. Durch
Kapsenbergverschlsse geschtzt wird 15min bei 121C autoklaviert. Nach dem Autoklavieren
temperiert man die noch flssigen Medien in den Rhrchen auf 60C im Wasserbad. Vor dem
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

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Ausgieen wird das temperierte Deckschichtmedium mit 200l der vorbereiteten Flssigkultur
(ber Nacht) im Rhrchen beimpft, gut gemischt (Vortex) und auf einer zuvor auf 37C
temperierten Platte mit Grundschicht-Agar ausgegossen.
2.6. Penicillin Standardreihe:
Um die antibiotische Wirkung einer Substanz testen zu knnen, muss eine Vergleichsreihe
herangezogen werden. Jeder Charge oder Zubereitungsform wird dann eine bestimmte Wirkung
pro mg zugeordnet. Fr das Penicillin-G von Sigma gilt z.B. 1595IE/mg. Fr eine Standardlsung mit
200.000IE/mL mssen daher 0,1254g/mL an Penicillin-G eingewogen werden.
Internationale Einheiten sind nicht im SI-System und werden oft in der Medizin eingesetzt um eine
reproduzierbare Dosierung von Medikamenten anhand ihrer Wirkung zu ermglichen. Die World
Health Organization definiert internationale Einheiten indem entweder durch Referenzprparate
oder international vereinbarte Standards ein bestimmtes Verhltnis zwischen IE und Masse oder
Stoffmenge definiert wird (http://www.who.int/en/). Fr jeden Stoff ist dieses Verhltnis anders
und man muss die genaue Zahl auf der Packung nachsehen.
Fr dieses Beispiel knnen 0,478 g Penicillin eingewogen auf 2mL mit entmineralisierten Wasser
aufgefllt werden. Diese Stammlsung wird vor der Verwendung steril filtriert, wobei das Filter zur
Fllung etwa 0,5mL bentigt (Totvolumen). Verdnnt man nach folgendem Schema ergibt sich
eine Standardreihe:
IE/mL
Standard 1
Standard 2

200 000
100 000

Penicillin-G
[g/mL]
0,12
0,06

Standard 3

50 000

0,03

Standard 4

30 000

0,018

Standard 5

10 000

0,006

Standard 6

5.000

3,00mg/mL

Verdnnungsschritte
- (davon werden etwa 600L bentigt) Std.1, 1:2
verdnnt (250L Std1 + 250L
H2O)
Std.1, 1:4
verdnnt ( 50L Std1 + 150L
H2O)
Std.1, 1:6,6 verdnnt ( 30L Std1 + 170L
H2O)
Std.2, 1:10
verdnnt ( 50L Std2 + 450L
H2O)
Std.2, 1:20
verdnnt ( 50L Std2 + 950L
H2O)

2.7. Durchfhrung:

Von den Penicillin Standards gibt man jeweils 45L auf ein steriles Testscheibchen welches dann
mit einer sterilen Pinzette auf die erstarrte Deckschicht aufgelegt wird (2 Scheibchen pro
Kompendium Biologie & Mikrobiologie, Biochemie und Gentechnik

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Standard/Probe). Alternativ knnen die Testscheibchen in die Verdnnungslsung auch


eingetaucht werden, wobei man beachten muss, dass die Scheibchen alle von derselben Art und
Qualitt sind.
Beim Auflegen sollte darauf geachtet werden, dass die zu erwartenden Hemmhfe sich nicht
berschneiden, Plttchen mit hohen Wirkstoffkonzentrationen drfen also nicht nebeneinander
gelegt werden.
Fr die 6 Verdnnungen der Standardreihe werden insgesamt 4 Platten bentigt, eine fr den
Standard mit der hchsten Konzentration und 3 fr die restlichen Standards. 3 weitere Platten
werden mit Verdnnungen des zu testenden antibiotischen Wirkstoffes beschickt (z.B.
abgelaufene
Prparate
aus
der
Hausapotheke).
Parallel
dazu
kann
eine
Konzentrationsbestimmung einer ausgegeben Penicillin-G Probe erfolgen. Die Bebrtung erfolgte
1-2 Tage bei 37C.
3. Auswertungsrichtlinien

GM10: Gentamycin,10g / AM10: Ampicillin 10g /


P10: Penicillin-G 10g / C30: Chloramphenicol 30g

Pearson 2006
Durch Abmessung der Hemmhfe und Interpolation einer Standardgeraden (Ordinate:
Hemmhofdurchmesser, Abszisse: log(IE)) kann auf die Wirksamkeit (in IE) des Testantibiotikums
geschlossen werden.
Anhand der Standardreihe kann auch die Probenkonzentration bestimmt werden ;
Aus einer frheren Untersuchung ist z.B. bekannt, dass ein Testscheibchen getrnkt mit
Gentamicin ca. 11000 IE/mL entspricht (gemessen an Penicillin G Standardreihe bei E.coli). Dies
entspricht einer Penicillin-Konzentration von 6,6 mg/mL.
Ein Testscheibchen getrnkt mit Chloramphenicol entspricht ca. 70000 IE/mL (gemessen an
Penicillin G Standardreihe bei E.coli). Dies entspricht einer Penicillin-Konzentration von 42
mg/mL.
4. Protokollierung
Fr alle getesteten Antibiotika ist eine tabellarische Auswertung (Hemmhofdurchmesser gegen log
IE) und eine entsprechende Graphik abzugeben! (Excel)
1) Untersuchungsobjekt (Name der Substanz oder Probe), Entnahme wann, wo, welche
Chargennummer.
2) Beobachtungen: Bewuchs und Zustand der Platten.
3) Beobachtungen und Tipps zur Durchfhrung, Abweichungen von der Standardprozedur
4) zeichnerische oder photographische Anleitung zur Durchfhrung falls notwendig
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5) Vergleiche getesteter Antibiotika mit der Penicillin-Standardreihe


(Mikrobiologisches Praktikum, Gerhart Drews, S.144)
http://home.schule.at/member/neumann
http://www.wikipedia.de
http://www.who.int/en/
http://www.drak.de/Glossar/C.html

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