Gntique molculaire

Guerin Fabien

Du gne la protine
Introduction
- Squence du gnome humain publie en 2001 (Publi par nature, plus grande revue scientifique)
- Plus de 3 milliards de bases (A la recherche du temps perdu de Marcel Proust)
- 99,7 % ordre de succession des bases est connu
- Environ 21 000 gnent codent pour des protines 1,5 % du gnome
- Large part dinconnu
Les avances permises par les donnes de squenage dpassent le cadre scientifique
Intrt mdical
-Description de plus de 2800 maladies monogniques
-Analyse de la part hrditaire de nombreuses maladies communes (diabte de type
2, cancer, maladies psychiatriques.
Hypothses sur lorigine de lhomme
-Squenage de gnomes dhominidiens disparus
Objectifs
Connaitre lhistoire qui a permis le dveloppement de la gntique molculaire.
Avoir le langage ncessaire la comprhension de la gntique molculaire.
Comprendre les ambitions et les limitations de la gntique actuelle.
I- Historique
I.I- Gregor Mendel (1822-1884)

Mtiers : Moine, thologien, physicien, botaniste

Sujet dtude : Pisum sativum
Avantages : Autofcondation
Fcondation croise
Lexprience de base : croisement des petits pois
Etude de traits morphologiques par hybridation de plans purs
Hybridation de pois jaunes avec des pois verts fournit
uniquement des pois jaunes en F1.
Autofcondation des pois jaunes de la F1 donne 75 % de pois
jaunes et 25 % de pois verts.

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Il en conclut :
Chaque trait est associ avec un gne.
Un gne peut exister sous diffrentes formes :
allles.
Un trait est dfini par la combinaison de 2 allles
du gne.
A la formation des gamtes, les allles se
sparent, une moiti des gamtes contient lun des
allles et lautre moiti contient lautre = loi de la
sgrgation.

A la fcondation, les allles se rassocient au

hasard, chaque parent donnant un allle.

Chez les parents (P), les allles YY (gnotype)

donnent des pois jaunes (phnotype) et les allles
yy donnent des pois verts.
Les hybrides F1 sont jaunes avec des allles Yy.
Lallle Y lemporte sur lallle y : Y est
dominant et y est rcessif.

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Les gnes sgrgent indpendamment

Analyse de 2 traits
- Couleur : allles Y et y
- Rugosit (rr) : allles R et r
Les proportions sont conformes la loi de
sgrgation pour chacun des phnotypes.

La gntique mendlienne peut tre complexe

Dominance incomplte
Des fleurs codes pour RR(rouge) et pour BB(blanc). On sattend seulement des rouges ou des
blanches. Or prsence dun troisime phnotype Rr(rose).
Un gne peut avoir plus de 2 allles
(groupes sanguins avec 3 allles)
On a en nous 2 allles qui dterminent le
groupe sanguin sur 3 possibles.

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Lexpression dun gne peut tre contrl par lenvironnement (chat siamois)
Cette couleur est d une mutation qui a lieu dans une enzyme qui permet de coder pour la
mlanine. Cette mutation sensibilise lenzyme la temprature. Quand les tempratures sont
chaudes lactivit enzymatique est altre donc pas de mlanine produite. Chez le chat temprature
du corps pas homogne. Quand la temprature est plus basse fonctionnement de la mlanine et donc
les extrmits sont plus colores.
I.II- Thomas H. Morgan (1866-1945)

Sujet dtude : Drosophila melanogaster

Avantages : cycle de vie de 10j
Lanalyse gntique chez la drosophile
Une mutation est lapparition dun nouvel allle
Chez la drosophile :
- Mutation spontanes (rares)
- Mutations induites (rayons X, mutagnes)
- Visibles sur le phnotype (yeux rouges, ailes vestigiales)
Analyse de la transmission de 2 gnes
- Si 2 gnes sont sur le mme chromosomes, on observe une co-transmission : les 2 gnes
appartiennent au mme groupe de liaison.
- Si crossing-over durant la miose, on observe une dviation de la co-transmision :
recombinaison entre les gnes.
Carte gntique de la drosophile
2n=8 chromosomes, soit 4 groupes de liaisons
Dans un groupe, la
frquence de
recombinaison entre
2 gnes (probabilit
dun crossing-over
entre 2 gne)
augmente avec leur
distance sur le
chromosome.
Avec des mesures
de proche en
proche, on peut
tablir la carte
gntique des
chromosomes.

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Carte gntique et caryotype

Un caryotype est une image de tous les
chromosomes (en mtaphase).
Centromre, tlomres, bras court (p) et bras
long (q).
Un locus est la position dun gne sur le
chromosome.
...Et la gntique devint molculaire...
I.III- Friedrich Miescher (1844-1895)

Isole dans sperme da saumon une substance diffrente des protines

Contient carbone, azote, hydrogne et riche en acide phosphorique ?
Nomme cette substance nucline (1871)
Richard Altmann renomme la nucline en acide nuclique (1889)
Quel est le support de linformation gntique ?
On pensait lpoque que ctait les protines, puis depuis Miescher on sest demand si ce ntait
pas plutt les acides nucliques, ou bien mme peut tre autre chose.
I.IV- Frederick Griffith (1879-1941)

Mtier : Bactriologiste : travaux sur la pneumonie

Sujet dtude : Streptococcus pneumoniae
Caractristiques :
Infecte souris
Souche de type III-S (Smooth) : capsule polysaccharidique qui protge la bactrie contre les
dfenses immunitaires de lhte.
Souche de type II-R (Rough) : pas de capsule, d une mutation

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Exprience de Griffith (1928)

Conclusion exprience : Les cellules de type rugueux on t transformes par quelque chose qui
provient des bactries lisses tues.
Exprience de Griffith = exprience de transformation
Hypothse formule : Griffith suppose que les bactries de type R ont t transformes par un
lment provenant des bactries S tues par la chaleur
Hypothse de rversion de R vers S est exclut.
I.V- Avery (1877-1955), Mac Leod (1909-1972), McCarty (1911-2005)
Reprennent les travaux de Griffith pour dterminer le principe transformant.
Purifient et testent diffrentes molcules : protines, lipides, ARN, ADN

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Lexprience (1944)

I.VI- Alfred Herchey (1908-1997) et Marta Chase (1927-2003)

Etudient la multiplication du phage (virus qui infecte des bactries) T2 chez E. Coli
-Revoir cycle de multiplication phagique
Utilisation disotopes radioactifs comme marqueurs pour suivre la destine de macromolcules
-32P : suivi de ADN
-35S : suivi des protines
Lexprience (1952)

Aprs tape dadsorption, agitation pour dcrocher ce qui est lextrieur des cellules (phages
fantmes uniquement des protines).

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ADN a t inject et est transmis la descendance support de linformation gntique.

Le phage se fixe la bactrie et injecte son adn dans la bactrie, do le passage de llment triti
dans la bactrie, qui permet son suivi.
Dans cette exprience ils voient que llment triti est transmis la descendance, cest donc ladn
le support de linformation gntique.
I.VII- Watson(1928) , Crick (1916-2004), Wilkins (1916-2004), Franklin (1920-1958)
Structure ADN obtenue par Watson et Crick (1953) partir de donnes de cristallographie aux
rayons X de Wilkins et Franklin et des observations de Chargaff
Prix Nobel en 1962
Exprience de Chargaff (1905-1992) : 1949
A lpoque on ne connaissait pas la structure de lADN (polymre) mais on pouvait aprs
hydrolyse complte sparer les monomres par chromatographie sur papier et les doser afin
dvaluer leurs proportions relatives.
A+ G=1
T+C
A= G=1
T C

Purines (A, G) = pyrimidines (C, T) = 50 %

A=T, G=C
(A+T) / (G+C) caractristique de la source

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II- Structure et proprits de lADN

Nuclotides et leur enchainement
Nuclotide :
Sucre soxyribose
Estrifi par un phosphate
Substitu par :
- une base purique (A et G)
- pyrimidique (C et T)

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Polymrisation seffectue par lestrification dun alcool situ en 3 dun nuclotide par le
phosphate dun autre nuclotide : la liaison covalente tablie est dite liaison phosphodieste.

Polymre dADN nest pas ordonn (ABCDABCD) mais squenc : sucession de nuclotides.
Squence des nuclotides impose la structure primaire de lADN oriente 5P 3OH
Structures secondaires
Structures secondaires sont imposes par
lappariement des bases : formation de
liaisons hydrognes stabilisation de la
structure.
Pour des raisons dencombrement strique,
deux paires de bases sont stables.
- A-T : 2 liaisons H
- G-C : 3 liaisons
ADN : couples maintiennent les brins un
cartement constant
ADN : ponts hydrogne ne peuvent stablir
que si les 2 chanes nuclotidiques sont
antiparallles.

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Structure ADN
Structure en double hlice
Deux chaines antiparallles
Un tour dhlice correspond 10,4 nuclotides
Structures secondaires ARN
Molcules simple brin peuvent adopter localement des structures
secondaires selon le mme principe dappariement des bases.

La structure de lADN suggre un mode de rplication

Si lADN porte les gnes, sa rplication doit assurer
la mme information chacune des cellules filles
Louverture de la double hlice et sa recopie en un
brin complmentaire apparat comme une solution
lgante ce problme.
Dans cette hypothse, lADN dune cellule fille
comporterait un brin maternel et un nouveau brin.
Cest un modle semi conservatif

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Hypothses de rplication possible

A : Modle conservatif : partir dune molcule dADN bicatnaire mre, on forme une
nouvelle molcule dADN bicatnaire. Dans cette hypothse, la molcule mre est non modifie :
elle est donc conserve.
B : Modle semi conservatif : les 2 brins de la molcule mre sont dissocis et chaque brin sert
de matrice la synthse dun brin complmentaire.
C : Modle dispersif : On ne conserve aucun brin intact. La copie se ralise par fragments
disperss dans lensemble de lADN.
Exprience de Meselson et Stahl (1958)
Possible grce la mise au point de plusieurs techniques :
-Technique dobtention de gradient de densit par centrifugation (gradient de chlorure de
csium)
- Culture de bactries dans un milieu dans lequel les substances organiques utilises comme
source dazote contiennent de lazote lourd (15N)
- ADN lourd a une desnit de 1,724 et lADN lger de 1,710
- Mthode permettant de synchroniser pendant quelques gnrations, la division des
bactries

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Bactries cultives en prsence de 15N sont repiqus sur un milieu contenant des molcules 14N.
Fractions sont prleves aprs difrents temps de gnration
ADN extraits sont centrifugs en gradient de densit.
Rsultats attendus aprs 1 cycle cellulaire ?

A : ADN 15N et ADN 14N

B : ADN hybride (1brin 15N et 1 brin 14N)
C : ADN hybride (fragments 15N et
fragments 14N)

Rsultats attendus aprs 2 cycles cellulaires ?

B : ADN hybride (1 brin 15N et 1 brin 14N) + ADN 14N
C : ADN hybride (fragments 15N et fragments 14N)

Proprits Physico-chimiques
Taille et masse (ADN dune cellule)
Charge lectrique : lADN est charg
ngativement en raison des groupes phosphates.
Dans un champ lectrique (lectrophorse) lADN
migre vers le ple +.

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Absorption : les bases A, T, G, C et U ont une absorption maximale 260 nm.

Dnaturation rupture des liaisons H

- Temprature, pH, chaotrope (ure)
- Dpend de la taille du fragment,%GC
- Effet hyperchrome : absorption 260nm augmente
- Temprature de fusion : temprature laquelle la moiti de lADN est dnature.

Renaturation : r appariement spontan des 2 brins dADN

Proprits

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Le dogme central : comment linformation prsente dans lADN passe telle la cellule ?
Beadle et Tatum (1958) sont les premiers
avoir affirm que les gnes ciblaient les
protines.
Travaux sur Neurospora crassa : induction
par des rayons X de mutants incapables de
crotre sur milieu minimum du au blocage
dune voie mtabolique.

Comment linformation passe des gnes aux protines ?

Les protines sont synthtises dans le cytoplasme
Des particules riches en ARN sont les sites de synthse : ribosomes..
Le transfert dinformation est due une fraction dARN labile (temps de 1/2 vie : 2-3min chez les
bactries) : ARNmessager.

IiI- La rplication de ladn

La rplication est semi conservative
Sparation des brins
Alignement des nuclotides complmentaires sur la base
des paires Watson-Crick
Polymrisation des nuclotides avec formation
denchanements sucre-phosphate orients.

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La raction de polymerisation : lADN polymerase

Arthur Kornberrg (prix nobel 1959)
Dans la raction de polymrisation, le
groupe OH en 3 attaque le premier
phosphate du nuclotide
Llongation se fait par lextrmit 3
La lecture sur le brin copi se fait de 3
vers 5

Mcanisme de la rplication chez E. coli

Chez E.coli, le chromosome est
circulaire et lorigine de rplication se
situe une squence spciale : ORI
Louverture du double brin se fait grce
une hlicase (protine)
La bulle de rplication est stabilise par
des protines se liant au simple brin et
bloquant la fermeture de la fourche de
rplication : protines SSB (Single
Strand Binding)
Des amorces dARN (10nT) sont
synthtises grce une primase et
viennent se lier par complmentarit des
bases lARN simple brin.

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Le mode dlongation est diffrent
sur le brin 5-3 (leading strand) et
sur le brin 3-5 (lagging strand).
Leading strand : longation
continue dans le sens de progression
de la fourche de rplication.
Lagging strand : llongation
discontinue entre 2 amorces =
fragments dOkazaki (jusqu
2000nT) relis ensuite par une
ligase amorces. Les amorces sont
supprimes par la rnaseH.

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LADN polymerase III dE.coli a la forme dune
main (protine qui permet de lier les nuclotides)
LADN rpliquer est saisi dans la paume
Existe 2 autres ADN polymrases (I et II) qui ont
majoritairement une fonction de rparation (lors de
dgat effectus sur la structure de lADN)

Louverture de la double hlice se fait par des

hlicases (plusieurs types).
Brisent les liaisons hydrogne (ncessite ATP)
Ouverture jusqu 1000 paires/s
Lavance de la fourche de rplication induit des rotations en
amont- surenroulement
Topoisomrases (enzyme) permettent de relcher les contraintes
lies au surenroulement coupures temporaires sur un brin.

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La rplication du chromosome dE.coli est bidirectionnelle

Chromosome circulaire, double brin
Rplication commence un site unique : locus oriC 2 fourches de rplication
Rplication chacune des fourcehs -bidirectionnelle- jusqu que les 2 complexes de rplication
se rencontrent

Rplisome
Complexe multiprotique :
- Primosome : hlicases + primase
- ADN polymerase III
- Protines additionnelles
Sassemble au locus oriC
Rplication jusqu ce que le rplisome atteigne un site de terminaison (Ter)
- La protine Tus (Terminator Utilisation Substance) se lie au site Ter et inhibe lactivit de
lhlicase empchant la progression de la fourche de rplication.
Mcanisme de la rplication chez les eucaryotes
Mcanisme similaire celui des procaryotes
Nombreuses fourches de rplication qui fonctionnent plus lentement

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Fragments dOkazaki sont plus petits (100-200 nT)

5 ADN polymrases

Protines accessoires :
- PCNA ( proliferating cell nuclear antigen) : aide au glissement de la polymerase.
- RPC (replication factor C) : aide PCNA se fixer sur lADN
- RPA (replication factor A) : rle similaire aux SSB procaryotes
- Hlicases
- 2 Topoisomrases
-Type 1 : coupe 1 brin
- Type 2 : coupe 2 brins
Dommages et rparations
ADN est la seule macromolcule cellulaire pouvoir tre rpare
Dommages possibles :
- Modifications de bases
-Dltions ou insertions de nuclotides
-Erreur de rplication
-Cassures (simple ou double brins)
Rparation des erreurs pendant la rplication
Une erreur de rplication va tre transmise et conserve dans toute la descendance de la cellule
Rare : 1 erreur sur 109 1010 bases contre 1 errueur sur 104 pour la transcription ou la traduction
Systmes de rparation
- Procaryotes : ADN polymrases I et II possdent une activit exonuclasique 3-5
permettant dliminer les nuclotides mal apparis.
- Eucaryote : ADN polymrases delta, epsilon, gamma possdent une activit
exonuclasique

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Rparation des erreurs aprs la rplication
Mcanismes de rparation par excision
Excinuclase (endonuclase dexcision) : enzyme qui
coupe des 2 cts du site endommag. Adn pol I comble
la brche et laision grce la ligase
Glycosylases : gnrent des sites AP (sites apurinique ou
apyrimidique) puis endonuclase AP coupe les brins.
ADN pol I comble la brche et liaison grce la ligase.
Autres systmes (Mut, HLS, SOS, recombinaison)

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