Empleo de las tcnicas de observacin y anlisis de la

fotomacrografa
Resumen:
En
el
presente
trabajo
abordaremos las tcnicas para la obtencin
de
las
fotomacrografas,
hablaremos
principalmente de tcnicas de campo claro,
oscuro, contraste de fases, luz polarizada e
Interferometra;
verificando
sus
caractersticas y campos de aplicacin.
Palabras clave: fotomacrografa, campo
claro, campo obscuro, contraste de fases,
luz polarizada, Interferometra.
Abstract: In this paper we will discuss
techniques for obtaining photomacrographs
mainly discuss techniques brightfield, dark
phase
contrast,
polarized
light
and
Interferometry;
verifying
their
characteristics and fields of application.
Key words: photomacrography, brightfield,
darkfield, phase contrast, polarized light
interferometry.

1 INTRODUCCIN
Una de las finalidades de la microscopa es
permitir observar los especmenes de la
mejor manera posible, logrando un buen
balance entre el contraste y la resolucin.
Esto es de extrema utilidad en muestras
incoloras, tales como las clulas vivas, que
en su estado natural son transparentes y
con poco contraste, en las cuales los
detalles permanecen invisibles a pesar de la
resolucin. Esto se debe a que las clulas
incoloras absorben muy poca luz y por lo
tanto en un microscopio de campo claro no
se
ven
correctamente.
Hay
clulas
(eritrocitos por ejemplo) que poseen
pigmentos propios que le confieren color y
contraste suficientes, pero esto es la
excepcin.
Desafortunadamente, con los microscopios
compuestos de campo claro ordinarios, no
se puede lograr un buen contraste de
clulas
vivas
no
coloreadas.
Los
microscopios de campo claro se denominan
as debido a que las muestras son
observadas en un campo brillante muy
iluminado, en el cual, el contraste se
sacrifica a expensas de la resolucin y
viceversa, limitndose por ejemplo el
estudio de clulas y tejidos vivos, en los
cuales la adicin de sustancias qumicas

para incrementar el contraste puede

provocar cambios o modificaciones en la
estructura de la clula e incluso producirle la
muerte.
El inters de observar clulas vivas radica
en la posibilidad de captar procesos vitales
en pleno desarrollo, tales como la motilidad,
la divisin, la fagocitosis y muchos otros.
Estas particularidades han motivado a los
investigadores a buscar mtodos para
incrementar el contraste con la finalidad de
obtener imgenes de clulas vivas con ms
detalles. De ordinario, en el microscopio
convencional, esto se puede lograr de cierta
manera si se reduce la apertura del
diafragma o se disminuye la cantidad de luz;
con estas maniobras se incrementa el
contraste, pero lamentablemente tambin
se reduce seriamente la resolucin y la
nitidez.
Ms recientemente, con el empleo de
programas informticos de digitalizacin y
edicin de imgenes, las micrografas de
clulas incoloras pueden ser tratadas
mejorando de manera significativa el
contraste, sin embargo, para observar ms
detalles
en
los
especmenes
vivos
necesariamente hay que emplear otros
mtodos
pticos
de
contraste
ms
sofisticados[1].

2 DESARROLLO
2.1 Microscopio de campo claro.
Para formar una imagen a partir de un corte
histolgico usa luz visible, por esto la
muestra debe ser lo bastante fina como
para que los haces de luz puedan
atravesarla. Tambin se usan mtodos de
tincin, segn las necesidades, con el fin de
aumentar los detalles en la imagen.
El campo del microscopio est intensamente
iluminado, mientras que los objetos
observados aparecen ms oscuros. En
general con este microscopio se pueden
alcanzar los 1000 aumentos, pudindose
llegar con ciertas modificaciones a 2000 y
3000
aumentos.
El ojo humano no logra distinguir objetos de
menos de 50 micras de dimetro ni
consigue resolver dos lneas separadas por

menos de 100 micras (es decir, las ve como

una sola lnea) Fig. 1.

Figura 1 Componente ptico

El condensador proyecta un cono de luz
sobre las clulas que estn siendo
examinadas en el microscopio. Despus de
atravesar a las clulas, ese haz luminoso, en
forma de cono, penetra en el objetivo; el
objetivo proyecta una imagen aumentada
en el plano focal del ocular, que
nuevamente la amplia. Por fin la imagen
provista por el ocular puede ser percibida
por la retina del ojo como una imagen
situada a 25 cm de la lente ocular. La
ampliacin total dada por un microscopio es
igual al aumento del objetivo multiplicado
por el aumento del ocular.

2.1.2Consideraciones para el uso

del microscopio de campo blanco
Imagen
Se debe tomar en consideracin que la
imagen de un microscopio ptico se
encuentra siempre cabeza abajo y si se
mueve la preparacin hacia un lado se
observa que se desplaza en sentido
opuesto, estas caractersticas se encuentran
siempre presentes en un microscopio ptico
y
debemos
acostumbrarnos
hasta
encontrarlo normal.
Enfoque.
El enfoque de una preparacin debe
iniciarse siempre con el objetivo de menor
aumento (lupa o 10X) ya que estos quedan
siempre ms alejados de la platina; se debe
subir la preparacin con el tornillo
micromtrico hasta el tope siempre mirando

por un lado del microscopio para evitar que

choque el objetivo con la preparacin,
despus mirando a travs del ocular se
empieza a bajar lentamente la platina hasta
localizar el foco, es decir donde la
preparacin
se
observa
ntidamente.
La mayor parte de los microscopios actuales
estn focalizados, lo que indica que al
quedar en foco la lupa, los dems objetivos
quedaran tambin enfocados, y solo se
requiere de un pequeo ajuste del tornillo
micromtrico para ver ntidamente la
imagen
Empleo del objetivo de inmersin en aceite
(x100)
Se deben utilizar preparaciones teidas
completamente secas. Para esto se pone
una pequea gota de aceite de inmersin
sobre la porcin que se va a examinar.
Preferencialmente se deben utilizar aceites
sintticos que no se secan, en vez de aceite
de madera de cedro que se seca
rpidamente.
Determinacin de la posicin de los objetos
observados
El crculo luminoso que se observa a travs
del
ocular
se
denomina
campo
microscpico y los objetos que se observan
en l se pueden localizar en relacin con las
manecillas del reloj.
Inversin
de
las
imgenes
Las imgenes son invertidas por los lentes.
De esta manera los objetos que aparecen en
el fondo del campo microscpico se
encuentran realmente en la parte ms alta y
los objetos que se encuentran en el lado
izquierdo del campo microscpico se
encuentran realmente en el lado derecho
[2].

2.2 Microscopio de campo

oscuro
De manera similar a un cielo nocturno en el
cual brillan las estrellas o al iluminar con
una linterna un cuarto oscuro y las
partculas de polvo flotantes en el aire se
tornan visibles porque reflejan o difractan la
luz,
los
especmenes
observados
al
microscopio de campo oscuro se ven
blancos y brillantes sobre un fondo oscuro
(negro).
La iluminacin de campo oscuro se puede
realizar tanto mediante luz transmitida

(trans-iluminacin) como con luz incidente

(epi-iluminacin). En el primer caso, para
lograr el efecto se requiere bloquear la parte
central del rayo de luz que normalmente
pasa a travs y alrededor del espcimen, de
tal manera que slo sea iluminado por rayos
oblicuos. La manera ms fcil y econmica
de lograrlo consiste en colocar un filtro
circular opaco (por ejemplo crculos de
cartulina negra o una moneda adherida a un
crculo de vidrio o plstico transparente)
bajo el condensador de un microscopio
compuesto
ordinario.
Esta
maniobra
funciona bien con objetivos de 10x-40x; el
dimetro del circulo opaco debe ser de
aproximadamente
16-18mm
para
un
objetivo de 10x cuya apertura numrica sea
de 0.25. Para un objetivo de 20x o 40x con
una apertura numrica de 0.65, el dimetro
del crculo opaco debe oscilar entre 2024mm. Para la iluminacin con luz incidente
o iluminacin oblicua se emplea un filtro en
forma de luna en cuarto decreciente (en
forma de C), obtenindose una interesante
imagen con relieve (15, 96) (fig. 2).

Figura 2Modelos de filtros de fcil

realizacin para lograr la tcnica de campo
oscuro (izquierda y centro) e iluminacin
oblicua (derecha, en cuarto decreciente).
Para campo oscuro el dimetro de la
mscara negra central depender del
objetivo que se emplee. Co

Figura 4 Clulas epiteliales observadas en

microscopio de campo

El mtodo ms apropiado consiste en el

empleo de un condensador caracterstico
que adems mejora la resolucin (12, 15)
(fig. 3). Con este dispositivo se forma un
cono hueco de luz (cuyo centro es oscuro)
que incide lateralmente sobre la muestra y
slo los rayos que son difractados o
reflejados por las estructuras penetran en la
lente objetivo y la clula aparece como un
objeto luminoso sobre un fondo oscuro (21)
(figs. 4 y 5).

Figura 5 Micrografas de la superficie de

una hoja que muestran diferencias de
contraste entre los diversos tipos de
Figura 3 Configuracin esquemtica del
principio de iluminacin de campo oscuro
(luz transmitida). El filtro opaco es de
forma circular y forma un cono de luz vaco
que incide sobre el espcimen en forma
oblicua y los rayos refractados, difractados
y reflejados

iluminacin. En la parte inferior se aprecia el

tipo de filtro empleado, en campo claro
(derecha) el haz de luz pasa sin
interrupcin.

2.2.1 Aplicaciones del microscopio

de campo oscuro
Aplicaciones del microscopio de campo
oscuro
(15,
96,
97):
Estudio de especmenes de tamao
pequeo
no coloreados,
tales
como
microorganismos
acuticos,
ovocitos,
clulas en cultivo (cuyos ndices de
refraccin oscilan en un rango de 1.2 a 1.4 y
no hay una diferencia notable con el ndice
de refraccin de 1.3 de la solucin acuosa
en la cual se encuentran).

Los heterogneos componentes celulares

absorben la luz de diferente manera y
causan pequeas variaciones de fase en las
radiaciones luminosas, es decir, las retrasan
ligeramente al disminuir la velocidad a la
cual viajan y el retraso vara segn el tipo de
estructura. En las clulas y tejidos no
coloreados, el escaso contraste se mejora y
acenta al transformar las diferencias de
fase (invisibles al ojo humano) en
diferencias de intensidad luminosa las
cuales s son detectables. Este tipo de
microscopio tambin se denomina de Fases
o Diferencia de Fases (98) (figs. 6 y 7).

Observacin de clulas mviles, como el

Treponema
pallidum,
una
espiroqueta
causante de la sfilis, la cual con la
microscopa ptica ordinaria es muy difcil
de visualizar.
Estudio de procesos fisiolgicos como
mitosis y migracin celular [3].

2.3 Microscopio de contraste de

fase
Las investigaciones iniciales de Frits Zernike
al inicio de la dcada de 1930 revelaron que
en microscopa, al crear interferencias en la
luz empleada para iluminar el espcimen se
creaban condiciones que producan un
incremento
del
contraste.
Este
descubrimiento le vali el premio Nobel en
fsica en el ao 1953 y revolucion la
investigacin en biomedicina al permitir el
estudio de clulas vivas. Con esta tcnica de
iluminacin se aumenta el contraste de
manera notoria entre las partes claras y
oscuras de las clulas transparentes.
El principio es semejante al de campo
oscuro; se ilumina la muestra con un cono
hueco de luz pero mucho ms estrecho. Se
emplea un filtro en forma de anillo que
disminuye la intensidad de la luz y al mismo
tiempo provoca un retraso o desfase en la
longitud de onda de la luz. Este mtodo
induce variaciones sutiles en el ndice de
refraccin (determinado por el espesor) de
los especmenes translcidos permitiendo
visualizar una riqueza de detalles muy finos
en la estructura, los cuales pasaran
desapercibidos con una iluminacin de
campo claro (15).

Figura 6 Esquema que representa parte del

principio de la iluminacin en contraste de
fases. A representa una onda luminosa. En
A al atravesar el objeto transparente C, la
onda se retrasa con respecto a la onda A
(que no ha pasado por el objeto).

Figura 7 Esquema que muestra una clula

sin coloracin en la cual la parte con ms
espesor corresponde a la zona del ncleo C,
el citoplasma a la zona delgada perifrica B
y el portaobjeto o solucin acuosa
circundante A. Existen diferentes ndices de
refraccin

Para convertir un microscopio convencional

en uno de contraste de fases se sustituye el
condensador y el objetivo por los de
contraste de fases, los cuales contienen un
filtro en anillo y una placa de fases
respectivamente (fig. 8). Los objetivos de
contraste de fases se identifican por sus
letras verdes y la indicacin del tamao del
anillo de fases (Ph1, Ph2, Ph3 o PhC, PhL,
PhP) (12).
El mtodo de Zernike consiste en acelerar
las ondas en de longitud de onda y como
resultado la interferencia produce una
imagen con detalles oscuros sobre un fondo
claro, denominndose contraste de fase
oscuro o positivo. Otro mtodo consiste en
el efecto contrario, es decir, retrasar o
disminuir la velocidad de la luz en de
longitud de onda y la interferencia produce
una imagen con detalles brillantes en un
fondo oscuro y se denomina contraste de
fase brillante o negativo (15) (figs. 9 y 10).

Figura 8 Diagrama para el microscopio de

contraste de fases. K: filtro anular, L: vista
transversal del filtro anular, M: condensador,
O-O: objetivo, P P: ocular, Q: diafragma
del ocular. La placa de fases est colocada
entre las lentes del objetivo

Figura 9 Micrografas de una neurona en

campo claro (izquierda) con detalles casi
invisibles y con iluminacin de contraste de
fases oscuro o positivo (derecha) en el que
los detalles son ms evidentes en un fondo
claro.

Figura 10 Micrografa de clulas epiteliales

en cultivo mediante la tcnica de contraste
de fases brillante o negativo, en la cual los
detalles y bordes de las clulas aparecen
brillantes (debido a un halo de difraccin)
en un fondo oscuro.

2.3.1.-Aplicaciones del microscopio

de contraste de fases
Observacin de clulas y tejidos vivos.
En estudios de diversas disciplinas como
por
ejemplo
fisiologa,
parasitologa,
farmacologa
(procesos
celulares,
identificacin
y
cuantificacin
de
microorganismos y parsitos en fluidos y
tejidos, efecto de medicamentos y otras
sustancias en las clulas y sus procesos de
motilidad, ciclosis, digestin, entre otros).
Estudio de alimentos y medicinas.

 Anlisis de materiales industriales

(metales,
cristales,
fibras
sintticas,
plsticos,
pigmentos,
emulsiones
y
suspensiones minerales).
Estudios geolgicos (minerales) [4].

2.4 Microscopio de luz

polarizada
Es un microscopio de campo claro al cual se
le adicionan filtros que modifican la luz.
Tambin
se
denomina
microscopio
petrogrfico o metalrgico por su uso inicial
en el estudio de minerales, sin embargo su
aplicacin se ha extendido al campo de la
biologa, medicina, qumica y muchas otras
disciplinas. Esta tcnica microscpica puede
emplear tanto la luz transmitida como la luz
incidente
(trans-iluminacin
y
epiiluminacin respectivamente).
Comparada con las otras tcnicas de
incremento de contraste, el uso de la luz
polarizada es la ms efectiva en el estudio
de
muestras
ricas
en
materiales
birrefringentes, puesto que mejora de
manera incomparable la calidad de la
imagen.
La luz proveniente de una fuente estndar
de iluminacin vibra y se propaga en todas
las direcciones, pero al pasar por un filtro
polarizador las ondas y su campo elctrico
oscilan todos en un mismo plano. El
polarizador es un dispositivo que solo deja
pasar la luz que vibra en un plano
determinado
denominado
eje
de
polarizacin (13) (fig. 11).

Figura 11 Esquema que muestra el efecto

de filtros polarizadores en un rayo de luz. A
la izquierda la luz no polarizada se
distribuye en todos los planos, pero al pasar
por el primer filtro (horizontal) ste slo
deja pasar las ondas que se propagan en un
plano h
Muchos materiales tienen sus tomos
uniformemente distribuidos en las tres
direcciones principales del espacio y
presentan una mxima simetra (cbica o
regular) o por el contrario, en algunos
materiales
sus
tomos
carecen
de
organizacin. Los primeros tienen las
mismas
propiedades
pticas,
independientemente de la direccin en que
se midan. Cuando la luz atraviesa sustancias
con estas caractersticas, la velocidad es la
misma en todas las direcciones y gracias a
ello se denominan istropos. Por el
contrario, los materiales cuya organizacin
cristalina es diferente (hexagonal, trigonal,
tetragonal, rmbico, entre otras) poseen sus
constituyentes
dispuestos
de
manera
asimtrica y varan segn la direccin; en
consecuencia el comportamiento de las
ondas luminosas tambin en diferente,
denominndose
anistropos
(101).
La
estructura interna del espcimen determina
su comportamiento istropo o anistropo.
Cuando se estudia el comportamiento de la
luz al atravesar un espcimen, los
materiales anistropos presentan distintos
ndices de refraccin en relacin a la
direccin del haz de luz; por el contrario, los
materiales istropos presentan un ndice de
refraccin constante. Cuando un rayo de luz
incide sobre la superficie de un material
anistropo transparente se presenta el
fenmeno de la doble refraccin o
birrefringencia; esto quiere decir que se
producen dos rayos refractados distintos

que vibran en planos diferentes que se

propagan con diferentes velocidades en el
interior del material.
Este microscopio facilita la investigacin de
las propiedades pticas de los especmenes
y es ideal para observar y fotografiar
aquellos elementos que son visibles gracias
a la anisotropa, de all su uso en
cristalografa; sin embargo, tambin se
emplea
para
estudiar
el
carcter
birrefringente
de
muchas
estructuras
celulares anistropas.
El contraste de la imagen se observa gracias
a la interaccin de la luz polarizada con los
elementos birrefringentes del espcimen
que producen las dos ondas refractadas,
cada una de ellas polarizada en planos
perpendiculares. Una vez que las ondas de
luz salen del espcimen lo hacen de manera
desfasada
(ver
fig.
6-9)
pero
son
recombinadas al pasar por otro filtro o filtro
analizador. De esta manera, el microscopio
de luz polarizada permite el estudio
comparativo entre minerales tomando en
cuenta la absorcin del color e ndices de
refraccin. Sin embargo, en biologa su
principal utilidad consiste en distinguir las
sustancias isotrpicas de las anisotrpicas,
revelando informacin detallada sobre la
estructura y composicin de los materiales
con la finalidad de caracterizarlos para fines
diagnsticos (102). El ojo humano no capta
las direcciones en las que vibra la luz y la
luz polarizada puede ser detectada como un
incremento en la intensidad luminosa o
como un efecto de color. O en lo cotidiano,
por ejemplo, con el uso de lentes de sol
polarizados se logra reducir el resplandor de
la luz ambiental.
El 90% de las sustancias slidas son
anisotrpicas y como materiales isotrpicos
se pueden enumerar una variedad de gases,
lquidos y cristales.
Este microscopio est equipado con:
Polarizadores: Un primer filtro polarizador
colocado entre la fuente de luz y el
condensador que se puede rotar 360 y un
analizador o segundo polarizador, colocado
por encima del objetivo, entre su lente
posterior y el tubo de observacin o cmara
fotogrfica. Tambin puede rotarse 90 o
360. Los polarizadores antiguos conocido

como nicoles estaban conformados por un

sistema de prismas de calcita descrito por
W. Nicol y. En los microscopios actuales el
polarizador est constituido por una lmina
polaroid, que consiste en una pelcula de un
polmero
transparente
(revestida
de
cristales
minsculos
de
sulfato
de
iodoquinina orientados en la misma
direccin) interpuesta entre dos placas de
vidrio (102) (fig. 12).
Condensador polarizador: Debe estar libre
de desperfectos en sus componentes
pticos.
Platina circular: Con capacidad de rotar
360 para facilitar la orientacin del eje
ptico con el campo de visin. Puede
contener un vernier para medir los ngulos
de rotacin. El espcimen debe rotarse y
colocarse en una posicin diagonal en la
cual
los
elementos
anisotrpicos
se
observarn ms brillantes (birrefringentes).
Objetivos polarizadores: Diferentes a los
objetivos comunes, estos deben estar libres
de
desperfectos
y
tener
capacidad
polarizadora. Son ensamblados de manera
que se evita en lo posible el dao de las
lentes ya que cualesquier dao por mnimo
que sea compromete el rendimiento del
objetivo. Poseen la inscripcin P, PO, o Pol.
Ocular con una cruz visible en el campo
visual: Para marcar el centro del campo
visual.

Lente
de
Bertrand:
Situada
inmediatamente debajo del ocular, es
removible y sirve para ver la interferencia
con la finalidad de ajustar la iluminacin de
una manera precisa.

 Identificar sustancias cristalinas o fibrosas

intracelulares (como el citoesqueleto) y
extracelulares (sustancia amiloide, asbesto,
colgeno, cristales de uratos y otras de
origen exgeno).
Identificar y estimar cuantitativamente los
componentes minerales [5].

2.5 Interferometra

Figura 12 Esquema simplificando la tcnica

de iluminacin con luz polarizada. El filtro
polarizador (1) est localizado por debajo
del condensador (2) y el espcimen (3) es
iluminado con luz polarizada lineal. El
analizador (5) rotado en ngulo de 90 en
relacin
Si no hay espcimen en la platina el campo
se observar completamente oscuro. Al
colocar un portaobjeto con alguna muestra,
los elementos anistropos cambian la
direccin de la vibracin de la luz polarizada
y el contraste se evidencia en la imagen con
algunos colores cuando se emplea otro
dispositivo denominado plato lambda (figs.
13).

Figura 13 Micrografa de luz polarizada de

fibroclulas musculares estriadas en la cual
se aprecia el patrn de bandas y
estriaciones transversales.

2.4.1.-Aplicaciones del microscopio

de luz polarizada

La Interferometra es el procedimiento por el

cual se hacen interferir dos ondas o seales
y se registra se toman medidas sobre el
patrn de interferencia que se produce.
Este patrn de interferencia puede ser
constructivo o destructivo y la imagen en la
cual se obtiene se llama interferograma.
A partir del interferograma puede obtenerse
informacin detallada del espejo.
Puede obtenerse la deformacin del frente
de onda que refleja el espejo y determinarse
la calidad de la superficie en unidades de .
El mtodo no depende de parmetros del
espejo como ser la Relacin Focal [6].

Figura 14 Funcionamiento

3 CONCLUSIONES
Microscopa es el conjunto de tcnicas y
mtodos destinados a hacer visible los
objetos de estudio que por su pequeez
estn fuera del rango de resolucin del ojo

normal.
Si bien el microscopio es el elemento central
de la microscopa, el uso del mismo se
requiere para producir las imgenes
adecuadas, de todo un conjunto de mtodos
y tcnicas afines pero extrnsecas al
aparato. Algunas de ellas son, tcnicas de
preparacin y manejo de los objetos de
estudio, tcnicas de salida, procesamiento,
interpretacin y registro de imgenes, etc.

4 REFERENCIAS

[1]
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/m
icroscopweb/MONOWEB/capitulo6.htm
[2]http://www.ipb.csic.es/servicios/Microsco
pia/uploads/3/6/2/2/3622788/microscopia_a_
grandes_rasgos.pdf
[3]http://www.medic.ula.ve/histologia/anexo
s/microscopweb/MONOWEB/capitulo6.1.htm
[4]http://www.medic.ula.ve/histologia/anexo
s/microscopweb/MONOWEB/capitulo6.2.htm
[5]http://www.medic.ula.ve/histologia/anexo
s/microscopweb/MONOWEB/capitulo6.3.htm
[6]http://www.fisica.edu.uy/~sroland/media/
Interferometria-y-telescopiosMontevideo.pdf