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Molekularbiologische Verfahren

Allgemein
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient dem
Nachweis spezifischer Nukleinsuresequenzen in
verschiedenen Matrices (z.B. Lebensmittel,
Pflanzen, Krperflssigkeiten, Zellkulturen, Organe,
Mikroorganismen).

Sie wird im CVUA-RRW fr den


Nachweis gentechnisch vernderter
Lebensmittel und Pflanzen verwendet, die
Diagnostik von Mikroorganismen in verschiedenen
Matrices und den Nachweis der Tierart in
Methodenbeschreibung
PCR (Polymerase-Kettenreaktion)

Lebensmittel- und Futtermittelproben.

Vor der Durchfhrung der PCR werden die in der


Probe enthaltenen Nukleinsuren mit geeigneten
Methoden aus dem vorhandenen Material
extrahiert.

Die PCR ist eine temperaturabhngige, zyklisch


ablaufende Reaktion, mit der spezifische
Nukleinsuresequenzen schnell und selektiv
amplifiziert werden.

Whrend des dreistufigen Reaktionsablaufes erfolgt


im ersten Schritt die Auftrennung der
doppelstrngigen DNA
(Desoxyribonukleinsure/deoxyribonucleic acid;
Trger der Erbinformation) in zwei Einzelstrnge.
Im zweiten Schritt lagern sich die Primer spezifisch
an die komplementre Zielsequenz an und im
dritten Schritt findet schlielich die Synthese
(Amplifizierung) der Zielsequenz durch die
thermostabile DNA-Polymerase statt. Sie verlngert
die angelagerten Primer unter Verwendung der

dNTPs (2-Desoxyribonukleosid-5-triphosphat,
Bausteine der DNA). Pro PCR wird dieser dreistufige
Prozess zwischen 30- bis 50-mal wiederholt. Bei
jedem Zyklus wird theoretisch die Anzahl der DNAKopien verdoppelt.
Agarosegelelektrophorese
In einer Gelelektrophorese wird das entstandene
Amplifikat aus der PCR im elektrischen Feld
mithilfe eines DNA-bindenden Farbstoffes (z.B.
Ethidiumbromid) und ultravioletten (UV)-Lichts
sichtbar gemacht.

Die Elektrophorese ist ein biochemisches


Trennverfahren, mit dem die Wanderung von
geladenen Moleklen in einem elektrischen Feld zu
deren Trennung ausgenutzt wird. Das Verfahren
wird sowohl zu analytischen als auch zu
prparativen Zwecken eingesetzt. Elektrophoresen
werden meist in einer elektrisch neutralen, festen
Gelmatrix aus Agarose oder Polyacrylamid
durchgefhrt. Nukleinsuren sind aufgrund ihres
Zucker-Phosphat-Gersts bei allen pH-Werten
negativ geladen. Sie wandern daher bei der
Elektrophorese zur Anode und das umso langsamer,
je grer sie sind.
Restriktionsverdau
Restriktionsendonukleasen sind Enzyme, die DNA
innerhalb einer Sequenz schneiden knnen. Jedes
Enzym erkennt dabei eine spezifische DNABasensequenz.

Durch unterschiedliche Sequenzen von PCRProdukten ergibt sich bei der Restriktion mit einem
bestimmten Enzym fr jedes Produkt ein

charakteristisches Schnittmuster, das durch eine


Agarosegelelektrophorese erkennbar wird.
Real-Time PCR
Die Real-Time-PCR ist wie die PCR eine
temperaturabhngige, zyklisch ablaufende
Reaktion, mit der spezifische
Nukleinsuresequenzen schnell und selektiv
amplifiziert werden. Im Gegensatz zu einer
normalen PCR kann allerdings die Amplifikation der
DNA bereits whrend der Reaktion verfolgt werden.

Die DNA-Amplifikate, die sich whrend des


dreistufigen Reaktionsablaufes bilden, werden
mithilfe einer spezifischen Sonde, an die ein
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt ist, detektiert. ber
die optische Einheit des Real-Time-PCR-Gertes
erfolgt dann die Detektion. Weitere Analysen und
Spezifizierungen der PCR-Produkte sind nicht
notwendig.
Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Voraussetzung fr den Nachweis von RNA aus
Untersuchungsmaterial mittels PCR ist die
Umschreibung (Transkription) der gesuchten RNA
in eine der RNA komplementren DNA (c-DNA). Dies
geschieht mit sequenzspezifischen Primern, die an
der gesuchten RNA binden und einer reversen
Transkriptase oder einem Enzym, das reverse
Transkriptase-Aktivitt besitzt. Diesen Vorgang des
Umschreibens von RNA in c-DNA nennt man reverse
Transkription (RT). Die daraus resultierende c-DNA
wird in der anschlieenden PCR amplifiziert.
Weitere Informationen

http://www.roche.com/pages/facetten/pcr_d
.pdf

http://www.biosicherheit.de/lexikon.html

http://www.karymullis.com/pcr.shtml

http://www.laborjournal.de/rubric/methoden

/index.lasso
Molekularbiologische Verfahren fr die Analyse von Lebens- und Futtermittelproben und die
Diagnostik von Krankheitserregern
Bestimmung der Tierart
ber zwei verschiedene molekularbiologische
Verfahren erfolgt die Bestimmung der Tierart zum
einen ber einen PCR-RFLP
(Restriktionsfragmentlngen-Polymorphismus) und
zum anderen ber tierartspezifische PCRs.

Die PCR-RFLP-Technik wird zur


Tierartidentifizierung in rohen und erhitzten
Fleisch- und Fischwaren und Tierprodukten
angewendet. Voraussetzung fr eine Identifizierung
der Tierart ist das Vorhandensein von
Referenzmaterial der zu bestimmenden Tierart. Fr
die Analyse wird aus den zerkleinerten Fleischwaren
die Gesamt-DNA isoliert. Jede Zelle enthlt dabei
vielfache Kopien des in der PCR zu vermehrenden
DNA-Abschnitts (vertebrales mitochondriales
Cytochrom-b-Gen/Cytb-Gen). Der Nachweis erfolgt
im ersten Schritt ber die PCR-Amplifikation eines
Abschnittes des in allen Tierarten vorkommenden
cytb Gens. In einem zweiten Schritt wird das PCRProdukt mit verschiedenen Restriktionsenzymen
geschnitten. Zur Bestimmung der Tierart wird das
Restriktionsfragmentlngenmuster der Probe mit
den Mustern des Referenzmaterials verglichen. Fr
die Identifizierung einer Tierart ist eine
bereinstimmung der beiden Restriktionsmuster
notwendig.
Die tierartspezifische PCR wird zur Identifizierung
und Differenzierung der Tierarten Schwein, Rind,
Schaf, Ziege, Huhn und Pute in rohen und erhitzten

Fleischwaren, in Fleischmischungen, Futtermitteln


und Tierprodukten angewendet. Im Unterschied
zum Tierartennachweis mittels PCR-RFLP werden
hierbei in der PCR Primer eingesetzt, die nur fr die
betreffende Tierart spezifisch sind und keine
Amplifikation mit Sequenzen anderer Tierarten
zeigen. Die Tierart wird als nachgewiesen beurteilt,
wenn ein spezifisches PCR-Produkt detektiert
werden kann.

Detektion von gentechnisch vernderten


Organismen (GVO)

Die Detektion von gentechnisch vernderten


Pflanzen umfasst Screening-Methoden,
konstruktspezifische PCR-Verfahren und
eventspezifische Methoden sowie PCRs zum
Nachweis der Pflanzenarten.

Mit einem Screening werden z.B. bestimmte


genetische Elemente erfasst, die bei der
Konstruktion vieler gentechnisch vernderter
Pflanzen verwendet wurden. Mit
pflanzenspezifischen PCR-Methoden werden
spezifisch genetische Elemente von einzelnen
Pflanzenarten erfasst, von denen es viele
gentechnisch vernderte Linien gibt, z.B. Mais und
Soja. Mit konstrukt- und eventspezifischen PCRMethoden lassen sich im Screening auffllige Proben
weiter charakterisieren und die vorhandene,
gentechnisch vernderte Pflanzenlinie bestimmen.

Je nach Nachweismethode werden dazu


konventionelle PCRs oder Real-Time-PCRs verwendet.

Bei der Verwendung von Real-Time-PCRs kann der


GVO-Gehalt der Probe auch quantifiziert werden.
Bestimmt wird dabei der relative Anteil einer fr
den zu bestimmenden GVO spezifischen DNASequenz im Verhltnis zu einer allgemeinen DNASequenz (z.B. Mais) innerhalb einer Probe.
Nachweis von Mikroorganismen in Probenmaterial von Tieren und Lebensmitteln
Molekularbiologische Methoden haben in den
letzten Jahren auch in der Tierseuchendiagnostik
und beim Nachweis von Krankheitserregern in
Lebensmitteln eine immer grere Bedeutung
erlangt. Mittlerweile stehen fr viele Tierseuchen
wie z.B. die klassische Schweinepest, PCRProtokolle zur Verfgung, die einen schnellen
Nachweis des genetischen Materials von Viren,
Bakterien oder Parasiten ermglichen. Auch fr die
Untersuchung von Krankheitserregern in
Lebensmitteln werden diese Methoden eingesetzt,
z.B. bei der Untersuchung von Tupferproben auf
Noro- und Rotaviren, die von verdchtigen
Lebensmitteln bzw. Gegenstnden genommen
werden.

Neben dem direkten Nachweis der DNA bzw. RNA


aus Untersuchungsmaterial eignet sich die PCR auch
fr die Erregeridentifizierung aus kulturellen
Anzuchten.
Weitere Informationen

http://www.roche.com/pages/facetten/pcr_d.
pdf

http://www.karymullis.com/pcr.shtml

http://www.laborjournal.de/rubric/methoden/
index.lasso

http://www.biosicherheit.de/lexikon.html

http://www.umwelt.nrw.de/verbraucherschutz
/lebensmittel/gentechnik/index.php