CUANTIFICACIN DE MICROORGANISMOS POR EL METODO DE RECUENTO EN

PLACA

LUIS MIGUEL OTRIZ PEREZ

MARYLUZ PEREIRA REGINO
ENAY SALCEDO SALAZAR
ROBERTO TIRADO SANTOS

ING. GILMA PADILLA

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE INGENIERIA
INGENIERIA DE ALIMENTOS
MICROBIOLOGIA GENERAL
2012

INTRODUCCION
El crecimiento de las poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras.
Algunos mtodos determinan el nmero de clulas y otros la masa total de la poblacin,
que a menudo es directamente proporcional al nmero de clulas. La magnitud de la
poblacin normalmente se registra como el nmero de clulas que hay en un mililitro de
lquido o en un gramo de material solido.
El mtodo utilizado con ms frecuencia para la medicin de poblaciones bacterianas es el
recuento en placa. Una ventaja importante de esta tcnica es que mide l nmero de
clulas viables. Una desventaja es que se requiere bastante tiempo, por lo general 24
horas o ms, para que se formen colonias visibles. Esto puede platear un grave problema
en algunas aplicaciones, como por ejemplo el control de calidad de la leche, cuando no es
posible mantener un lote determinado durante tanto tiempo. El recuento en placa se basa
en la suposicin de que cada bacteria
Crece y se divide para producir una sola colonia. Esto no siempre es cierto porque con
frecuencia crecen unidades en cadenas o como grumos. Por consiguiente, a menudo una
colonia no se produce como resultado de una nica bacteria sino de segmentos cortos de
una cadena o de un agregado bacteriano. Para reflejar esta realidad los recuentos en
placa suelen informarse como unidades formadoras de colonias (ufc).

OBJETIVOS
-

Contar las UFC teniendo en cuenta las reglas, depsues de evaluar la calidad de
los controles y de las diluciones.

Identificar los microorganismos que crecen en diferentes agares, cuantificando las

colonias.

Afianzar conocimientos adquiridos, sobre la preparacin de diluciones logartmicas

y la siembra en profundidad.
MATERIALES

Medios de cultivos:

Materiales:

Agua peptonada

Balanza

Agar plate count

Incubadora

Agar leche - Agar EMB

Asa bacteriolgica

Agar tributirina

Contador de colonias

PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTO DE LAS DILUCIONES

NOTA: guardar la muestra en refrigeracin a 4C, por un tiempo mximo de 24
horas, si la muestra no se va a procesar inmediatamente.

1.
2.
3.
4.

5.
6.
7.
8.

1.
2.
3.

Desinfectar con alcohol al 70% el frasco o envase que contiene el alimento.

En un frasco o fiola adicionar 90ml de agua peptonada al 0.1% y marcarla como
dilucin 10-1.
Marcar dos tubos de vidrio tapa rosca como dilucin 10 -2 y dilucin 10-3, adicionar a
cada uno de ellos 9 ml de agua peptonada al 0.1%.
Agitar unas 25 veces las muestras lquidas, formando un arco con el antebrazo de 30
cm o resuspendiendo con la pipeta unas 10 veces, si el recipiente no tiene espacio
libre con el fin de homogenizar la muestra y tomar una parte representativa del
producto. Para muestras slidas pesar 10g de la muestra, tratando de tomar
porciones de varias partes.
Tomar 10 ml o 10g de la muestra mezclada y agregarlos al frasco que contiene los 90
ml, mezclar resuspendiendo con la pipeta ms de 10 veces, hasta homogenizar la
mezcla; as se obtiene la dilucin 10-1.
Tomar 1 ml de la dilucin 10-1 y adicionarlos al tubo que contiene 9 ml de agua
peptonada al 0.1% marcado con la dilucin 10-2. Mezclar unas 10 veces aspirando
con la pipeta. Esta es la dilucin 10-2.
Tomar 1 ml de la dilucin 10-2 y adicionarlos al tubo marcado con la dilucin 10 -3.
Mezclar unas 10 veces aspirando con la pipeta. As se obtiene la dilucin 10-3.
De esta forma se tienen las diferentes diluciones, el nmero de ellas va a depender
del alimento y de los parmetros que existan, pero deben sembrarse por lo menos
tres (3) diluciones.
- PROCEDIMIENTO DE SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
Tomar 5 cajas de petri estriles y marcarlas en la tapa como dilucin 10 -1, 10-2, 10-3,
control del diluyente y control del medio; adems escribir en cada una de ellas el N
del grupo, el semestre, la fecha, el tipo de examen y el nmero de la muestra.
Mezclar unas diez veces con la pipeta la dilucin 10-1 y tomar 1ml de la dilucin y
adicionarlo en la caja marcada con 10-1 (ver figura 3), las diluciones deben sembrarse
por duplicado.
Mezclar de igual forma con pipeta diferente la dilucin 10 -2, tomar 1ml y adicionarlo en
la caja marcada como dilucin 10-2.
-

4.

Mezclar de igual forma con pipeta nueva la dilucin 10-3, pipetear 1ml y
- Adicionarlo en la caja marcada como dilucin 10 -3. El tiempo transcurrido entre la
realizacin de las diluciones y la siembra en la ltima caja, no debe ser mayor de 20
minutos.

5.

Adicionar 1ml de agua peptonada al 0.1% a la caja marcada como control del
diluyente.
Adicionar 15ml del agar fundido a 45C, a cada una de las cajas, incluyendo las cajas
marcadas como control del diluyente y del medio.

6.
-

Segn la temperatura de incubacin, se obtienen los mesfilos aerobios a 37C,

los termfilos cuando se incuban las cajas a 55C, los psicrfilos a 7C por 10
das. La temperatura elegida depender del objetivo que se pretenda con la
realizacin del recuento.

Tambin dependiendo del medio de cultivo se pueden determinar: mesfilos

aerobios y facultativos viables, utilizando agar plate count; protelticos, utilizando
agar leche; lipolticos, utilizando al agar tributirina; coliformes, utilizando agar EMB
o VRBD.

Cambiando las condiciones de aerobiosis por anaerobiosis y el medio de cultivo,

se pueden detectar loa mesfilos anaerobios y facultativos viables, utilizando agar
cisteinado e incubando por 72 horas en condiciones de anaerobiosis.

a. Mesfilos aerobios y facultativos viables: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido

a 45C a cada una de las cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y
como control del medio; mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las
cajas e incubar a 37C por 24 a 48 horas.
b. Termfilos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las cajas,
incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar
como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 55C por 24 a 48
horas.
c. Psicrtrofos: Adicionar 15 ml de Agar Plate Count fundido a 45C a cada una de las
cajas, incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio;
mezclar como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 7C por
10 das.
d. Proteolticos: Adicionar 15 ml de Agar leche fundido a 45C a cada una de las cajas,
incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar
como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 22C por 72 horas.
e. Coliformes: Adicionar 15 ml de Agar EMB fundido a 45C a cada una de las cajas,
incluyendo las marcadas como control del diluyendo y como control del medio; mezclar
como indica el numeral 7, dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C por 24 a 48
horas.
7. Mezclar cinco veces en forma de ochos, en direccin de las manecillas del reloj y
viceversa, de arriba hacia abajo y viceversa con el fin de obtener una distribucin
homognea de la muestra en el medio de cultivo.
8. Dejar solidificar, invertir las cajas e incubar a 37C de 24 a 48 horas.
-

PROCEDIMIENTO DE LA SIEMBRA EN SUPERFICIE.

1. Preparar la muestra y realizar las diferentes diluciones.

2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar con el nombre del alimento, fecha,
dilucin y No. del grupo.
3. Marcar dos cajas de petri del mismo medio, una como control del diluyente y otra
como control del medio.
4. Adicionar 0.1ml de cada una de las diluciones y del control del diluyente en las
cajas marcadas respectivamente que contienen el medio de cultivo.
5. Extender con una varilla de vidrio la muestra sobre toda la superficie del medio,
hasta que la superficie quede seca.
6. Incubar por 24-48 horas a 35-37C (ver figura 4).
7. Seleccionar las cajas que tengan entre 20 a 200 colonias.
8. Realizar el conteo final multiplicando por la dilucin y por 10.
-

RESULTADOS Y DISCUSION

Transcurrido el periodo de incubacin, y al sacar las cajas y al evaluar el control de

diluyente y el de medio. Se observo que no existen inconvenientes para la lectura,
por lo cual se procedi a aplicar las reglas de recuento. Para las diluciones:
-

Tabla N. 1: Resultados de UFC/ml.

Diluciones
- 10-1

87
26

Control del
medio
Control del
diluyente

13

UFC/ ml
- 173

10-2
10-3

Con los resultados anteriores y gracias al agar leche el cual es un medio que
brinda todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de microorganismos
proteolticos se puede comprobar la presencia o ausencia de ellos. En nuestra
muestra de alimento (jugo de mora con leche) se encontr este tipo de
microorganismos, para estar seguros y brindar una informacin ms verdica se
hizo una validacin de los medios. Esto nos indica que todos los alimentos tienen
una carga microbiana como flora natural de ellos, los cuales debemos controlar de
manera adecuada para que estos no causen dao a los consumidores.

Tabla N.2: Resultados obtenidos de las diferentes diluciones.

AGAR/ FACTOR DILUYENTE

Agar leche. Dilucin 10-1

-

Agar leche. Dilucin 10-2

-

Agar leche. Dilucin 10-3

-

Agar leche. Control del medio

Agar leche. Control del disolvente

-

RESULTADOS

INVESTIGACION
-

1.

Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los alimentos o productos donde la

contaminacin es esencialmente superficial?

- Sln: Para el empleo de las tcnicas de recuento y de cultivo, los alimentos slidos
deben convertirse en una suspensin liquida. El Stomacher hace posible esta
conversin. Este instrumento homogeniza el alimento golpendolo, dentro de una
bolsa de plstico estril en la que est contenida, junto con el diluyente, con la ayuda
de las dos paletas de que est dotado el instrumento. Se homogeniza una cantidad
exacta de muestra (25g) en un volumen exacto de diluyente (225ml) para obtener una
dilucin de 10-1.
- No son recomendables muestras menores de 25 gramos salvo que la cantidad
disponible de la misma no llegue a este peso. A partir de la suspensin de
homogenizado de 10-1 pueden prepararse otras.
Durante todas las operaciones de muestreo y preparacin de las muestras deben
utilizarse tcnicas aspticas para evitar la llegada a la muestra microorganismos
procedentes del analista, del equipo o del entorno.
2. Cmo se realiza la dilucin 10-1 en los productos grasos y que se hace cuando el
contenido graso es mayor del 20%?
- Los microorganismos (lipolticos, proteolticos, productores de cido) juegan un
papel muy importante en la produccin, conservacin y consumo de los alimentos.
Adems los alimentos pueden transmitir microorganismos patgenos causantes
de intoxicaciones lo cual afecta la salud pblica y causa prdidas econmicas. De
ah la gran importancia que reviste el conocimiento de los efectos que pueden
tener los microorganismos en los alimentos y las posibilidades y formas de
controlarlos. Por ello los objetivos generales son Que el estudiante conozca los
fundamentos de la degradacin de los alimentos por microorganismos lipolticos, y
adquiera la destreza en el recuento de lipolticos en muestras de alimentos. Se
informe de la importancia dela determinacin en alimentos de bacterias
proteolticas. Detectar la presencia de microorganismos productores de cido
mediante el recuento total en placa.
-

Algunas veces en alimentos grasos deteriorados no se aslan microorganismos

lipolticos debido a que la gran mayora de lipasas microbianas son exocelulares y
pueden actuar en ausencia de clulas viables. Comnmente las protenas no son
atacadas por microorganismos; las especies con esta capacidad son denominadas
proteoliticas.

Realice diluciones igual que para mesfilos aerobios. Marcar las cajas con fecha,
nmero de grupo y dilucin correspondiente Realice siembra en profundidad (1 ml)
Adicionar 15 mL de agar tributirina y homogenizar perfectamente, pues las lipasas

solo actan en la interfase lpido- agua. Dejar solidificar las cajas e invertir. Incubar
de 2 a 3 das. Sembrar controles negativos positivos y del medio de cultivo.
3.
-

Qu precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir de alimentos

congelados, deshidratados o pasteurizados?
Sln: 1. Preparacin de la dilucin primaria:
1.1. Muestras lquidas no viscosas (como agua, leche, refrescos, etc. en las
cuales la distribucin de microorganismos es homognea o fcilmente
homogeneizable por medios mecnicos como agitacin)
1. Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm., con 25 movimientos de
arriba abajo, efectuados en un tiempo de 7 segundos.
2. En condiciones aspticas, tomar 10.0 mL de la muestra y
3. Diluir con 90.0 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura
similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
1.1.1. Alimentos originalmente lquidos o licuables:
1. Fundir por completo en bao de agua entre 40 y 45C en un tiempo mximo de
15 minutos y homogenizar agitando vigorosamente.
2. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras lquidas no viscosas.

1.2 muestras deshidratadas y congeladas: En mesfilos se limitan en alimentos

deshidratados y congelados. En los alimentos tratados por el calor, la poblacin de
microorganismos viables suele ser muy baja, aunque un examen microscpico de
estos productos puede a veces poner de manifiesto la presencia de
microorganismos muertos, cuyo nmero indica que la materia prima estaba muy
contaminada.

Del mismo modo, en los alimentos deshidratados y en los congelados, siempre se

obtienen recuentos de bacterias viables ms bajos. As, un recuento en placa
puede no reflejar la calidad bacteriolgica de la materia prima antes de los
procesos o tratamientos correspondientes, y por ello, es necesario llevar a cabo un
examen microscpico directo para comprobar si, efectivamente, en un principio
existan o no abundantes grmenes. Los recuentos de bacterias mesfilas son de
escaso valor a la hora de predecir la vida til de un alimento conservado en
refrigeracin, ya que muchos microorganismos mesfilos no crecen a
temperaturas por debajo de los 5C. Para esta finalidad es preferible el recuento
de bacterias viables psicrotrficas con temperaturas de incubacin entre 0 y 5 C
durante 10 das.

4.
-

Cul es la importancia y utilidad del recuento en placa?

Sln: Los valores obtenidos en los recuentos bacterianos (recuento en placa) de
productos alimenticios se toman como base para su clasificacin en diferentes
grados de calidad. De all la gran importancia que esta determinacin reviste, tanto

desde el punto de vista del control de calidad a nivel de las industrias del ramo,
como del control sanitario de las agencias gubernamentales.
Las tcnicas microbiolgicas aplicadas cualquier producto, generalmente se rigen
por las normas establecidas por la Asociacin Americana de Salud Pblica
(Standard Methods for the Examination of Dairy Products) que a su vez han sido
recomendadas y traducidas por la Organizacin Panamericana de la Salud.

CONCLUSIONES

Despus de realizada la prctica es necesario tener en cuenta que para los

laboratorios de anlisis microbiolgico es importante desarrollar tcnicas que
produzcan confiabilidad de resultados, lo cual se logra atreves de la validacin de
secundaria de dichos mtodos, ya que de esta forma se consigue emitir resultados
exactos, que permiten al laboratorio mantener altos estndares de calidad.

De la cuantificacin total que se hizo en toda la prctica, se noto el crecimiento de

los microorganismos proteolticos, los cuales tienen las mejores condiciones en el
agar leche.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Tortora. Funke. Case. Introduccin a la microbiologa. 9 ed. Editorial

Panamericana. Madrid. 2007. Pg. 178 180.
http://www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis15.pdf
http://es.scribd.com/doc/59204994/INFORME-DE-MICROBIOLOGIA-CHEPPETORRES
http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas1/tema-1.pdf