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AISLAMIENTO DE BACTERIAS NO ESPORULADAS AEROBIAS DEL GNERO

(BACILLUS )-SOGAY -AREQUIPA


Introduccin

Bacterias grampositivas( nuestra bacteria de que tipo es?)


La clasificacin de las bacterias por la taxonoma clsica se sirve de diferentes
caractersticas, como son: la morfologa, la clasificacin nutricional, la qumica de la
pared celular, las inclusiones celulares, la sensibilidad a antibiticos, etc. Entre stas
se encuentra la tincin de Gram, que da cuenta de las diferencias estructurales entre
las paredes celulares de las bacterias grampositivas y las gramnegativas. De hecho,
estas ltimas tienen una pared celular ms compleja que involucra, adems de una
capa de peptidoglicano, una membrana externa compuesta por lipopolisacridos,
protena y protena. Por el contrario, las grampositivas tienen solamente una gruesa
capa de peptidoglicano. ste hecho permite que el complejo insoluble cristal violetayodo, producto de la aplicacin de este primer colorante (cristal violeta), dentro de las
grampositivas no pueda ser extrado por alcohol porque sus paredes se deshidratan y
esto provoca el cierre de los poros y la consecuente retencin del complejo. Por otra
parte, la permeabilidad de la membrana externa de las gramnegativas permitir el
paso del solvente y la extraccin del cristal violeta. De este modo, nos quedarn estas
bacterias incoloras que no son posibles de visualizar a microscopio, por lo que sern
teidas con un colorante de contraste, como es la safranina, que las tornar rosadas.
Cabe aclarar que dicha tincin involucra ms de un colorante, por lo cual es una
tincin compuesta, pero, adems, es diferencial, puesto que permite distinguir dos
tipos de bacterias diferentes de acuerdo a las caractersticas de sus paredes celulares.
Ello es posible gracias a los siguientes compuestos orgnicos utilizados como
colorante: el cristal violeta y la safranina, que son bsico y, por lo tanto, tendrn
afinidad por los componentes de carga negativa, como los polisacridos cidos y los
cidos nucleicos. Tambin, se utiliza para hacer ms efectiva la coloracin del cristal
violeta un mordiente, el lugol, que forma un complejo insoluble con el colorante.
Gnero Bacillus
Este linaje particular de bacterias grampositivas, abundante en suelo y aire, se
caracteriza por su forma de bastn, como indica su nombre; por ser aerobio y
quimiohetertrofo, que crece bien en medios de cultivo generales como agar nutritivo;
y por la posibilidad de formar esporas. Estas estructuras especiales son clulas
diferenciadas muy deshidratadas y resistentes al calor, a agentes qumicos y a
radiacin, por lo que permiten la supervivencia del organismo en condiciones
adversas.
Gracias a la esporulacin es posible aislar a las bacterias de este gnero del suelo,
pues la exposicin de una muestra a altas temperaturas matara a todas las bacterias
vegetativas, quedando slo las esporas de los Bacillus (es muy probable porque este
gnero esporulante es el ms abundante en el suelo). Slo restara germinar dichas
esporas para obtener los bacilos, que luego pueden tratarse con tincin de Gram para
comprobar que estn bien aisladas.

Objetivos
EN ESTE TRABAJO SE BUSCA ENCONTRAR UNA NUEVA BACTERIA EN LOS
SUELOS DE SOGAY,MEDIANTE LA SECUENCIACION DE ADN.
SE REALIZARA LAS PRUEBAS DE TINCION DE GRAM, TINCION DE ESPORAS,
antibiograma,y preservacin de muestra.

Materiales y mtodos
a. DA 1
1. Siembra sin seleccin: diversidad microbiana en el suelo
Primeramente, se tom una muestra de tierra de un gramo y se la homogeneiz con
agua destilada dentro de un tubo de ensayo. Se dej decantar unos minutos y se pas
el sobrenadante a un tubo de ensayo estril. Luego, se estri con un ansa sobre una
placa de Petri con agar nutritivo esterilizada.
Dicha placa se rotul como PLACA 1 y se cultiv a 30C por 48 horas en aerobiosis.

2. Paso de seleccin de bacterias esporulantes aerobias


A continuacin, la muestra contenida en el tubo de ensayo fue calentada a bao mara
a 80C durante 10 minutos.
3. Paso de enriquecimiento: germinacin de las esporas
Luego, se traspas parte del contenido a otro tubo que contena caldo nutritivo. Se lo
rotul como TUBO 1 y se lo incub en aerobiosis a 30C por 48hs.
Figura 1: esquema del trabajo realizado en el da 1.
b. DA 2
1. Aislamiento de bacterias esporuladas
Se tom con el ansa esterilizada a la llama una muestra del cultivo incubado (TUBO 1)
y se sembr sobre una placa de Petri con agar nutritivo (PLACA 2).
c. DA 3
1. Observacin de la morfologa de las colonias
Se describieron las colonias crecidas en la PLACAS 1 Y 2.
2. Obtencin de un cultivo puro
Luego, se tom de la PLACA 2 una muestra de una colonia bien aislada con un ansa
y se la estri en un tubo pico de flauta con agar nutritivo. Se rotul el tubo como
CULTIVO PURO y se lo incub a 30C en aerobiosis por 72 horas.

Figura 2: esquema del trabajo de aislamiento del da 3.

d. DA 4
1. Tincin de Gram del cultivo puro
I.

Preparacin del frotis

Se coloc una gota de agua destilada en un portaobjetos. Luego, con un ansa se tom
una muestra del CULTIVO PURO incubado y se la homogeneiz con el agua
obteniendo una solucin opalescente. Se procedi a fijar el frotis acercndolo a la
llama de un mechero.
II.

Tincin propiamente dicha

Primeramente, se coloc cristal violeta sobre el frotis y se lo dej actuar durante un


minuto. Luego, se enjuag el portaobjetos con agua destilada. A continuacin, se
aplic lugol durante un minuto, seguido de etanol por 30 segundos. Entonces, se
volvi a enjuagar con agua. Finalmente, se agreg safranina y al minuto se enjuag
con agua nuevamente.

2. Observacin al microscopio
Luego de la tincin del frotis, se lo observ al microscopio y se describieron los
microorganismos obtenidos, comprobando o no que el aislamiento fuera exitoso.
Resultados y discusin
1. Descripcin de lo observado en la PLACA 1
Se observaron varias colonias de bacterias aerobias del suelo. Entre ellas se destaca
la presencia de un Bacillus mycoides, que se entendi por toda la placa. Su
crecimiento es similar al de un hongo, es decir, de forma filamentosa como un micelio,
por ello su nombre. Entre otras, se observaron tambin varias colonias circulares
pequeas, de bordes enteros, elevacin convexa y color blanco brillante.
Cabe destacar que la diversidad visualizada en esta placa no es representativa de la
existente en el suelo, que es mucho mayor, puesto que se estima que slo el 10% de
los microorganismos son cultivables.
2. Descripcin de lo observado en la PLACA 2
En esta placa la diversidad se vio muy disminuida gracias al paso de seleccin.
Lamentablemente, el Bacillus mycoides sobrevivi (porque es esporulante) y ocup la
mayor parte de la placa. Se pudo ver que sus colonias eran de tamao mediano, de
forma y borde filamentoso, elevacin plana y color blanco opaco.
Se puede decir que el paso de seleccin funcion reduciendo la diversidad microbiana
a aquellas bacterias capaces de esporular.
3. Resultados del aislamiento segn lo observado por tincin de Gram
Se observ al microscopio, gracias a la tincin de Gram, slo un tipo de bacterias tipo
bastn en cadena, teidas de violeta, o sea, grampositivas. Adems, se pudieron
observar esporas (transparentes) dentro de la mayora de los bastones:

Figura 3: Bacillus sp. observados.


Conclusin
Durante el trabajo se pudo apreciar parte la diversidad microbiana del suelo y,
adems, se pudo aislar exitosamente un Bacillus, lo cual pudo corroborarse mediante
la tincin de Gram.