Tom Stracham. Genetica Humana 3ra Ed - VISION MEDICA

GENETICA
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3 a edicin
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Tom Strachan
Andrew P. Read
GENETICA
HUMANA
T E R C E R A E D IC I N
Tom Strachan
BSc PhD, FMedSci
Professor o f Human M olecular Genetics and Scientific Director, Institute o f Human Genetics
University o f Newcastle, Newcastle-upon-Tyne, UK
Andrew P. Read
MA PhD FRCPath FMedSci
Professor o f Human Genetics
University o f Manchester, Manchester, UK
Traduccin
Dr. Jorge Orizaga Samperio

Revisin tcnica:
Dr. Ismael Vzquez Moctezuma

Bilogo molecular, Instituto Politcnico Nacional,
Mxico, D. F.
Me
Graw
Hill
MXICO BOGOT BUENOS AIRES CARACAS GUATEMALA LISBOA
MADRID NUEVA YORK SAN JUAN SANTIAGO SAO PAULO
AUCKLAND LONDRES MILN MONTREAL NUEVA DELHI
SAN FRANCISCO SIDNEY SINGAPUR ST. LOUIS TORONTO
Contenido
Abreviaturas
xxiii
Prefacio
xxvii
Auxiliares didcticos suplementarios
xxviii
Antes de empezar: uso inteligente de internet
PARTE UNO:
Captulo 1
Bases
Estructura del DNA y expresin gnica
1.1
1.1.1
Formacin de bloques y enlaces qumicos en DNA, RNA y polipptidos

El DNA, RNA y polipptidos son grandes polmeros definidos por una secuencia lineal de unidades
simples rpidas
Los enlaces covalentes confieren estabilidad; los enlaces no covalentes, ms dbiles, facilitan relaciones
intermoleculares y estabilizan la estructura
Estructura y replicacin del DNA

La estructura del DNA es una hlice doble antiparalela
1.1.2
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
4
6
8
Recuadro 1-1. Ejemplos de la importancia del enlace de hidrgeno en cidos nucleicos

y protenas
10
La replicacin del DNA es semiconservadora y la sntesis de cadenas de DNA semidiscontinua

La maquinaria de replicacin del DNA en clulas de mamferos es compleja
10
10
Recuadro 1-2. Principales clases de protenas que se utilizan en la maquinaria

de replicacin de DNA
12
1.2.4
Los genomas virales se conservan con frecuencia por replicacin de RNA en lugar de DNA
13
1.3
1.3.1
1.3.2
Transcripcin del RNA y expresin genica

El flujo de informacin gentica en las clulas tiene un sentido casi exclusivo: DNA ! RNA ! protena
En organismos complejos, slo se expresa una fraccin pequea del DNA para formar una protena
o producto de RNA
Durante la transcripcin, la informacin gentica en algunos segmentos de DNA (genes)
especifica RNA
Se requieren elementos reguladores de accin c is y factores de transcripcin de accin transen la
expresin gnica eucaritica
La expresin gnica especfica de tejido incluye la activacin selectiva de genes especficos
13
13
Procesamiento del RNA

El corte y unin (splicing) del RNA elimina secuencias de RNA no esenciales del transcrito primario
Se aaden nucletidos especializados a los extremos 5' y 3' de la mayor parte de los transcritos de
polimerasa II de RNA
19
19
1.3.3
1.3.4
1.3.5
1.4
1.4.1
1.4.2
1.5
1.5.1
1.5.2
1.5.3
1.5.4
1.5.5
Captulo 2
xxix
Traduccin, procesamiento postraduccional y estructura de las protenas

Durante la traduccin se descodifica mRNA en los ribosomas para especificar la sntesis de polipptidos
El cdigo gentico se degenera, no es un cdigo universal
Las modificaciones postraduccionales incluyen modificaciones qumicas de ciertos aminocidos y
segmentacin polipeptdica
La secrecin de protenas y el traslado intracelular se controlan mediante seales de localizacin
especficas o modificaciones qumicas
La estructura protenica es muy variada y no es fcil predecirla por la secuencia de aminocidos
15
16
17
19
22
23
23
25
26
28
29
Estructura y funcin de los cromosomas
33
2.1
Ploida y ciclo celular
34
2.2
2.2.1
2.2.2
Estructura y funcin de los cromosomas

El empaque del DNA en los cromosomas sugiere mltiples jerarquas de doblamiento del DNA
Cromosomas individuales ocupan territorios no superpuestos en un ncleo en interfase
34
35
35
vi i CONTENIDO
2.2.3
Cromosomas como organelos funcionales: sitio central del centromero
36
Recuadro 2-1. Huso mittico y componentes
37
2.2.4
2.2.5
2.2.6
Cromosomas como organelos funcionales: orgenes de la replicacin

Cromosomas como organelos funcionales: los telmeros
Heterocromatina y eucromatina
37
39
40
2.3
2.3.1
2.3.2
Tipos de divisin celular: mitosis y nieiosis

La mitosis es la forma normal de divisin celular
La meiosis es una forma especializada de divisin celular que origina las clulas espermatozoo
y vulo
Pareamiento X-Y y regiones seudoautosmicas
40
40
Estudio de los cromosomas humanos

Es posible observar cromosomas mitticos en cualquier clula en divisin, pero en seres humanos es
difcil estudiar los cromosomas meiticos
44
Recuadro 2-2. Bandeo cromosomico
48
2.3.3
2.4
2.4.1
2.4.2
44
Citogentica molecular: hibridacin fluorescente in situ (HFIS) cromosomica
48
Recuadro 2-3. Nomenclatura del cromosoma humano
49
2.4.3
Pintado cromosomico, cariotipificacin molecular e hibridacin comparativa del genoma
49
2.5
2.5.1
2.5.2
Anormalidades de los cromosomas

Tipos de anormalidad cromosomica
Las anormalidades cromosmicas numricas incluyen ganancia o prdida de cromosomas completos
49
51
51
Recuadro 2-4. Nomenclatura de anormalidades cromosmicas
53
2.5.3
2.5.4
Captulo 3
40
44
Las anormalidades cromosmicas estructurales resultan de la reparacin errnea de roturas

de cromosomas o del mal funcionamiento del sistema de recombinacin
Los complementos cromosmicos al parecer normales pueden ser patognicos si tienen el origen
parental errneo
54
56
Clulas y desarrollo
59
3.1
3.1.1
3.1.2
Estructura y diversidad de clulas

Las procariotas y eucariotas representan la divisin fundamental de las formas de vida celular
El tamao y la forma de las clulas puede variar enormemente, pero los ndices de
difusin fijan algunos lmites superiores
En organismos multicelulares, se observa una diferenciacin fundamental entre las clulas somticas
y la lnea germinal
60
60
Recuadro 3-1. Organizacin intracelular de las clulas animales
62
Recuadro 3-2. Citoesqueleto: elemento fundamental para el movimiento y la forma celulares,

y un armazn estructural mayor para el transporte intracelular
63
3.1.4
3.1.5
Los organismos multicelulares no poseen dos clulas que porten la misma secuencia exacta de DNA
Las clulas de organismos multicelulares pueden estudiarse in situ o en cultivo
64
65
3.2
3.2.1
Interacciones celulares
La comunicacin entre clulas incluye la percepcin de molculas de sealamiento por
receptores especficos
Receptores activados inician vas de transduccin de seal que pueden incluir cascadas enzimticas
o segundos mensajeros y da por resultado activacin o inhibicin de factores de transcripcin
La organizacin de las clulas para formar tejidos requiere adherencia celular
La matriz extracelular proporciona una estructura central para todos los tejidos del cuerpo y tambin
es una fuente importante de seales que controlan la conducta celular
67
3.3
Generalidades del desarrollo
70
3.4
3.4.1
Especializacin de las clulas durante el desarrollo

La especializacin celular incluye una serie irreversible de decisiones jerrquicas
72
72
Recuadro 3-3. Modelos animales del desarrollo
72
3.1.3
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.4.2
61
61
67
68
68
70
La eleccin entre destinos alternativos puede depender del linaje o la posicin
73
Recuadro 3-4. Gemelacin en embriones humanos
73
Recuadro 3-5. De dnde provienen los tejidos: jerarqua del desarrollo en mamferos
74
CONTENIDO
Recuadro 3-6. Diversidad de clulas humanas
75
3.4.3
Las clulas madre son clulas progenitoras que se renuevan por s mismas
76
3.4.4
3.4.5
3.4.6
Se sabe que existe una variedad de clulas madre tisulares pero an queda mucho por aprender
acerca de ellas
Las clulas madre embrionarias (ME) tienen el potencial para formar cualquier tejido
El potencial de diferenciacin de las clulas madre titulares es motivo de controversias
77
78
79
3.5
3.5.1
3.5.2
3.5.3
Formacin del patrn en el desarrollo

El surgimiento del plan del cuerpo depende de la especificacin y polarizacin del eje
Las mutaciones hometicas revelan la base molecular de la identidad posicional
La formacin de patrones suele depender de los gradientes de seal
79
79
79
80
3.6
3.6.1
3.6.2
Morfognesis
Cambios en la forma y el tamao de las clulas pueden impulsar la morfognesis
Los principales cambios morfogenticos en el embrin son resultado de la afinidad diferencial
de las clulas
80
83
Recuadro 3-7. Polarizacin del embrin de mamferos: seales y productos gnicos
83
83
3.6.3
La proliferacin celular y la muerte programada de las clulas (apoptosis) son mecanismos

morfogenticos importantes
3.7
3.7.1
Desarrollo humano inicial: fecundacin a gastrulacin

La fecundacin activa el vulo y une entre s los ncleos del espermatozoo y el vulo para formar
un individuo nico
La segmentacin divide al cigoto en muchas clulas ms pequeas
Slo un porcentaje pequeo de las clulas del embrin temprano de mamferos origina el
organismo maduro
Implantacin
La gastrulacin es un proceso dinmico por el que las clulas del epiblasto originan las tres
capas germinales
85
3.8
Desarrollo neural
Recuadro 3-8. Membranas extraembrionarias y placenta
88
89
3.8.1
El sistema nervioso se desarrolla despus que el mesodermo subyacente induce al ectodermo a

diferenciarse
Recuadro 3-9. Determinacin del sexo: genes y ambiente en el desarrollo
89
93
La formacin del patrn en el tubo neural incluye la expresin coordinada de genes a lo largo de
dos ejes
La diferenciacin neuronal incluye la actividad combinatoria de factores de transcripcin
93
94
3.7.2
3.7.3
3.7.4
3.7.5
3.8.2
3.8.3
3.9
3.9.1
3.9.2
Captulo 4
vii
Conservacin de las vas del desarrollo

Muchas enfermedades humanas se deben a falla de procesos del desarrollo normales
Los procesos del desarrollo estn muy bien conservados tanto a nivel de genes nicos
como a nivel de vas completas
85
85
86
87
87
88
94
94
94
Genes en genealogas y poblaciones
101
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
Herencia monognica comparada con multifactorial

Patrones de genealoga mendelianos
Dominancia y recesividad son propiedades de caracteres, no de genes
Los cinco patrones bsicos de genealoga mendeliana
102
102
102
102
Recuadro 4-1. Caractersticas de los patrones de herencia mendelianos
104
Rara vez es posible definir sin ambigedad la modalidad de herencia en una genealoga aislada
Un gen-una enzima no implica un gen-un sndrome
La herencia mitocondrial origina un patrn de genealoga matrilineal identificable
104
105
106
Recuadro 4-2. Prueba de complementacin para descubrir si dos caracteres recesivos estn
determinados por genes allicos
106
Complicaciones de los patrones de genealoga mendelianos bsicos

Padecimientos recesivos comunes pueden originar a un patrn de genealoga seudodominante
La falta de manifestacin de un padecimiento dominante se denomina no penetrancia
Muchos padecimientos muestran expresin variable
En genes improntos, la expresin depende del origen parental
106
106
106
107
108
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.3
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
viii
CONTENIDO
4.3.5
4.3.6
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.5
4.5.1
4.5.2
4.5.3
Captulo 5
La letalidad masculina puede complicar genealogas ligadas a X

Con frecuencia nuevas mutaciones complican la interpretacin genealgica y pueden conducir
a mosaicismo
Gentica de caracteres multifactoriales: teora del umbral polignico
Algo de historia
Teora polignica de los caracteres cuantitativos
Recuadro 4-3. Dos conceptos errneos frecuentes respecto a la regresin a la media
Recuadro 4-4. Particin de varianza
Teora polignica de caracteres discontinuos
La asesora en padecimientos no mendelianos utiliza los riesgos empricos
Factores que afectan las frecuencias gnicas
Es posible que las frecuencias gnicas y las frecuencias de genotipo establezcan una relacin simple
Las frecuencias de genotipo pueden utilizarse (con cautela) a fin de calcular ndices de mutacin
Recuadro 4-5- Frecuencias de genotipo de equilibrio de Hardy-Weinberg para frecuencias
de alelos p(Aj) y q(A2)
Recuadro 4-6. La distribucin de Hardy-Weinberg puede utilizarse (con cautela) para calcular
frecuencias de portador y riesgos simples con fines de asesoramiento
Recuadro 4-7. Equilibrio entre mutacin y seleccin
La ventaja del heterocigoto puede ser mucho ms importante que la mutacin recurrente para
determinar la frecuencia de una enfermedad recesiva
Recuadro 4-8. Seleccin en favor de heterocigotos para fibrosis qustica (FQ)
109
109
111
111
112
114
115
115
115
116
116
117
117
118
118
118
119
Amplificacin del DNA: clonacin de DNA por PCR y basada en clulas
121
5.1
5.2
5.2.1
122
123
123
124
125
127
5.2.2
5.2.3
5.2.4
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.3.4
5.3.5
5.4
5.4.1
5.4.2
5.4.3
5.4.4
5.5
5.5.1
5.5.2
Importancia de la clonacin del DNA

PCR: caractersticas y aplicaciones bsicas
Principios de la PCR bsica y la PCR de transcriptasa inversa (TI)
Recuadro 5-1. Glosario de mtodos de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR tiene dos limitaciones importantes: tamaos cortos y elaboracin baja de productos
Aplicaciones generales de la PCR
Algunas PCR se disearon para permitir mltiples productos de amplificacin y amplificar
secuencias no caracterizadas con anterioridad
Principios de la clonacin del DNA basada en clulas
Generalidades de la clonacin del DNA basada en clulas
Recuadro 5-2. Endonucleasas de restriccin y sistemas de modificacin y restriccin
Las endonucleasas de restriccin permitieron cortar DNA blanco en piezas manejables que pueden
unirse a molculas vectoras cortadas de manera similar
La introduccin de DNA recombinante en clulas receptoras proporcionan un mtodo para fraccionar
una poblacin de DNA de inicio compleja
Las genotecas de DNA son un amplio grupo de clonas de DNA que representan una poblacin
de DNA de inicio compleja
Con frecuencia se logra la seleccin recombinante mediante inactivacin insercional de un gen marcador
Recuadro 5-3. Mutaciones supresoras sin sentido
Recuadro 5-4. Importancia de los sitios de secuencia marcados (SSM)
Sistemas de clonacin para amplificar fragmentos de diferentes tamaos
Los vectores plsmidos estndar proporcionan un medio simple para clonar fragmentos de DNA
pequeos en clulas bacterianas (y eucariotas simples)
Los vectores lambda y csmidos proporcionan medios eficientes para clonar fragmentos de DNA
moderadamente grandes en clulas bacterianas
Es posible clonar grandes segmentos de DNA en clulas bacterianas con vectores basados en
bacterifagos P1 y plsmidos de factor F
Los cromosomas artificiales de levadura (YAC) permiten clonar fragmentos de megabase
Sistemas de clonacin para producir DNA de cadena nica y mutagenizado
El DNA de cadena nica para utilizarse en la secuenciacin de DNA se obtiene con vectores
M I3 o fagmidos o amplificacin lineal por PCR
La mutagnesis de oligonucletido incompatibible puede crear un cambio predeterminado de
un nucletido nico en cualquier gen clonado
128
129
129
129
130
133
135
136
138
138
140
140
141
143
144
146
146
146
CONTENIDO I ix
5.5.3
5.6
5.6.1
5.6.2
5.6.3
La mutagenesis basada en PCR incluye el acoplamiento de secuencias o grupos qumicos deseados a una
secuencia blanco y mutagnesis especfica de sitio
Sistemas de clonacin diseados para expresar genes
Es posible producir grandes cantidades de protenas mediante la clonacin de expresin en clulas
bacterianas
La exhibicin de fago es una forma de clonacin de expresin en la que se expresan las protenas
en superficies de clulas bacterianas
La expresin gnica eucariota se lleva a cabo con mayor fidelidad en lneas de clulas eucariotas
Recuadro 5-5. Transferencia de genes a clulas animales cultivadas
Captulo 6
148
149
151
151
153
Hibridacin de cido nucleico: principios y aplicaciones
157
6.1
6.1.1
158
6.1.2
6.2
6.2.1
6.2.2
Preparacin de sondas de cido nucleico

Los cidos nucleicos pueden marcarse de manera conveniente in vitro si se incorporan nucletidos
modificados
Pueden marcarse cidos nucleicos mediante mtodos isotpicos y no isotpicos
158
159
Recuadro 6-1. Principios de la autorradiografa
161
Principios de la hibridacin de cido nucleico

La hibridacin de cido nucleico es un mtodo para identificar molculas relacionadas en forma
cercana dentro de dos poblaciones de cido nucleico
163
163
Recuadro 6-2. Sistemas de marcado y deteccin con fluorescencia
166
Las cinticas de reasociacin de DNA se definen mediante el producto de la concentracin de DNA

y el tiempo (C0t)
166
Recuadro 6-3. Glosario de hibridacin de cido nucleico
168
6.2.3
Es posible utilizar una gran variedad de valoraciones de hibridacin de cido nucleico
169
6.3
Valoraciones de hibridacin de cido nucleico mediante sondas de DNA clonado para

seleccionar poblaciones de cido nucleico no clonado
En la hibridacin dot-blot, un mtodo rpido de deteccin, suelen emplearse sondas de
oligonucletidos especficas de alelo
170
Recuadro 6-4. Valoraciones de hibridacin de cido nucleico estndar e inversa
171
6.3.1
6.3.2
6.3.3
6.3.4
6.4
6.4.1
6.4.2
6.4.3
Captulo 7
147
Las hibridaciones Southern b lo ty Northern blot detectan cidos nucleicos cuyo tamao se fraccion
mediante electroforesis en gel
La electroforesis en gel de campo pulsado extiende la hibridacin Southern al incluir la deteccin
de molculas de DNA muy grandes
Sondas de hibridacin in situ se hibridan para desnaturalizar DNA de una preparacin de
cromosomas o RNA de un corte de tejido fijado en un portaobjetos de vidrio
Valoraciones de hibridacin mediante el uso de DNA blanco clonado y microarreglos
La hibridacin colony b lo ty la de levantado de placa son mtodos para seleccionar colonias o placas
bacterianas separadas
Los arreglos de alta densidad en rejillas de clonas de clulas transformadas o clonas de DNA
incrementaron de modo considerable la eficiencia de la seleccin de genotecas de DNA
La tecnologa de microarreglos de DNA extendi muchsimo la potencia de la hibridacin de
cido nucleico
170
171
173
174
176
176
176
177
Anlisis del DNA y estructura, variacin y expresin gnicas
181
7.1
7.1.1
Secuenciacin y genotipificacin de DNA

La secuenciacin estndar de DNA incluye la sntesis enzimtica de DNA mediante terminadores de
cadena didesoxinucletidos especficos de bases
182
182
Recuadro 7-1. Produccin de plantillas de secuenciacin de DNA de cadena nica
182
7.1.2
7.1.3
Secuenciacin automatizada de DNA y resecuenciacin basada en microarreglos

Genotipificacin bsica de polimorfismos de sitio de restriccin y nmero variable de polimorfismos
de repeticin tndem
183
7.2
Identificacin de genes en DNA clonado y establecimiento de su estructura

Recuadro 7-2. Clases comunes de polimorfismo de DNA susceptibles a mtodos simples
de genotipificacin
183
186
187
1 CONTENIDO
7.2.1
7.2.4
El atrapamiento de exn identifica secuencias expresadas mediante una valoracin artificial de empalme
(splicing) de RNA
La seleccin de cDNA identifica secuencias expresadas en clonas genmicas mediante la formacin de
heterodplex
Obtencin de secuencias de cDNA de longitud completa: grupos de clonas superpuestas y
amplificacin PCR-RACE
Mapeo de sitios de inicio de transcripcin y definicin de lmites exn-intrn
7.3
7.3.1
Estudio de la expresin gnica

Principios de la seleccin de expresin
190
190
Recuadro 7-3. Investigacin de homologa en bases de datos
192
7.2.2
7.2.3
7.3.2
7.3.3
7.3.4
7.3.5
Anlisis de expresin gnica basado en hibridacin: del anlisis de un gen aislado a la seleccin de
la expresin del genoma completo
Anlisis de expresin gnica basados en PCR: PCR-RT y exhibicin diferencial de mRNA
En las selecciones de expresin de protenas suelen utilizarse anticuerpos muy
especficos
187
188
188
189
193
197
198
Recuadro 7-4. Obtencin de anticuerpos
200
Los marcados autofluorescentes de protena constituyen un medio potente para rastrear la

localizacin subcelular de protenas
202
PARTE DOS: El genoma humano y su relacin con otros genomas
205
Captulo 8
Proyectos del genoma y organismos modelos
207
8.1
8.1.1
8.1.2
Importancia pionera de los proyectos del genoma

Los proyectos del genoma prepararon el camino para los estudios sistemticos del universo interno
Se espera que los beneficios mdicos y cientficos de los proyectos del genoma sean enormes
208
208
208
Recuadro 8-1. Glosario de genmica
209
Fundamento y organizacin del Proyecto del Genoma Humano

Los polimorfismos de DNA y las nuevas tecnologas de clonacin de DNA allanaron el camino
para la secuenciacin del genoma humano
El Proyecto del Genoma Humano se llev a cabo en grandes centros de genoma con capacidades
de secuenciacin de alto rendimiento
210
Cmo se mape y secuenci el genoma humano

Los primeros mapas genticos humanos tiles se basaron en marcadores microsatlites
212
212
Recuadro 8-2. Genes humanos y nomenclatura del segmento de DNA
212
Recuadro 8-3. Principales acontecimientos importantes en el mapeo y secuenciacin del

genoma humano
213
8.2
8.2.1
8.2.2
8.3
8.3.1
8.3.2
8.3.3
8.3.4
8.3.5
8.3.6
8.3.7
8.3.8
8.4
8.4.1
210
210
Los primeros mapas fsicos de alta resolucin del genoma humano se basaron en contiguos de
clonas y referencias de sitios de secuenciacin marcados (STS)
213
Recuadro 8-4. Mapeo de clulas hbridas
215
La etapa final del Proyecto del Genoma Humano dependi en vital medida de los contiguos
de clonas BAC/PAC
217
Recuadro 8-5. Mapeo fsico mediante formacin de contiguos de clonas
218
Los primeros mapas de genes humanos de alta densidad se basaron en marcadores de

secuencias expresados (EST)
219
Recuadro 8-6. Cooperacin, competencia y controversia en los proyectos de genoma
220
El esquema de la secuencia del genoma humano sugiri 30 000 a 35 000 genes humanos,
pero es difcil estimar un total preciso
Etapas finales del Proyecto del Genoma Humano: anotacin de genes y ontologa gnica
Son importantes los anlisis de la variacin de secuencias del genoma humano para la
investigacin antropolgica y mdica
Sin las salvaguardas apropiadas, el Proyecto del Genoma Humano podra conducir a la
discriminacin contra portadores de genes de enfermedades y tambin al resurgimiento de la eugnica
225
Proyectos de genomas para organismos modelos

Existe una enorme diversidad de proyectos genmicos procariotas
225
225
221
222
224
CONTENIDO
8.4.2
8.4.3
8.4.4
Captulo 9
El proyecto del genoma de S. cerevisiae fue el primero de muchos proyectos de genomas protistas exitosos
El proyecto del genoma de Caenorhabditis elegans fue el primer proyecto de un genoma animal
terminado
Recuadro 8-7. Modelos de organismos unicelulares
Los proyectos del genoma de metazoarios se enfocan sobre todo en modelos del desarrollo y
enfermedades
Recuadro 8-8. Animales multicelulares modelos para comprender el desarrollo, las enfermedades
y la funcin genica
Organizacin del genoma humano

9.1
9.1.1
9.1.2
9.1.3
9.1.4
9.2
9.2.1
9.2.2
9.2.3
9.3
9.3.1
9.3.2
9.3.3
9.3.4
9.3.5
9.3.6
9.3.7
9.4
9.4.1
9.4.2
9.4.3
9.5
9.5.1
9.5.2
xi
226
226
227
228
230
239
Organizacin general del genoma humano

Generalidades del genoma humano
El genoma mitocondrial consiste en un dplex de DNA circular pequeo empacado a densidad
con informacin gentica
Recuadro 9-1. Variacin del nmero de copias del genoma en clulas humanas
240
240
Recuadro 9-2. Autonoma limitada del genoma mitocondrial

El genoma nuclear consiste en 24 molculas de DNA diferentes que corresponden a los 24 cromosomas
humanos distintos
El genoma humano contiene alrededor de 30 000 a 35 000 genes distribuidos de forma irregular pero
las cifras son inexactas
243
Recuadro 9-3. Mediacin del DNA e islotes CpG
246
Organizacin, distribucin y funcin de genes RNA humanos

Un total de casi 1 200 genes humanos codifican rRNA o tRNA y estn organizados sobre todo en
grupos gnicos grandes
Los RNA nuclear y nucleolar pequeos estn codificados por familias gnicas grandes esparcidas en
una gran proporcin
247
Recuadro 9-4. Especificidad de anticodn de tRNA citoplsmico eucariota
249
Los micro-RNA y otros RNA reguladores nuevos son desafiantes preconcepciones sobre la extensin
de la funcin del RNA
250
241
242
244
245
247
249
Organizacin, distribucin y (uncin de genes humanos que codifican polipptidos

Los genes humanos muestran una enorme variacin de tamao y organizacin interna
Algunas veces estn agrupados genes similares desde el punto de vista funcional en el genoma humano,
pero con mayor frecuencia estn esparcidos en diferentes cromosomas
253
253
Recuadro 9-5. Genoma humano y estadsticas de genes humanos
255
En ocasiones se encuentran en el genoma humano genes superpuestos, genes dentro de genes y

unidades de transcripcin policistrnicas
Las familias gnicas que codifican polipptidos pueden clasificarse de acuerdo con el grado y extensin
de la relacin de la secuencia en miembros de la familia
Los genes en familias gnicas humanas pueden estar organizados en grupos pequeos o esparcidos con
amplitud, o ambas cosas
En familias multignicas se encuentran casi siempre seudogenes, copias de genes truncadas y
fragmentos gnicos
Se ha iniciado la clasificacin del proteoma humano, pero an son inciertas las funciones precisas de
muchas protenas humanas
254
256
257
259
262
265
DNA no codificante de repeticin tndem

El DNA satlite consiste en disposiciones muy largas de repeticiones tndem que pueden separarse
del volumen del DNA mediante centrifugacin de gradiente de densidad
El DNA minisatlite est compuesto de configuraciones de tamao moderado de repeticiones tndem
y con frecuencia se localiza en telmeros o cerca de ellos
El DNA microsatlite consiste en configuraciones cortas de repeticiones tndem simples y est disperso
en la totalidad del genoma humano
265
DNA no codificante repetido disperso

Las repeticiones derivadas de transposn constituyen hasta > 40% del genoma humano y surgieron
sobre todo por intermediarios de RNA
Algunos elementos LINE-1 humanos se transponen de modo activo y permiten la transposicin de
SINES, seudogenes y retrogenes procesados
268
265
267
268
268
270
xii I CONTENIDO
9.5.3
Las repeticiones Alu ocurren ms de una vez cada 3 kb en el genoma humano y pueden someterse a
seleccin positiva
Captulo 10 Expresin gnica humana

10.1
10.2
10.2.1
10.2.2
10.2.3
10.2.4
10.2.6
10.3
10.3.1
10.3.2
10.3.3
276
Recuadro 10-1. Restriccin espacial y temporal de la expresin gnica en clulas de mamferos
276
Control de la expresin gnica por enlace de factores protenicos de accin tra ns a secuencias
reguladoras de accin cis en DNA y RNA
La modificacin de la histona y la remodelacin de la cromatina facilitan el acceso a la cromatina
mediante factores de enlace de DNA
La transcripcin mediante polimerasas de RNA I y III requiere factores de transcripcin ubicuos
La transcripcin mediante polimerasa de RNA II requiere juegos completos de secuencias reguladoras
con accin cis y factores de transcripcin especficos de tejido
Los factores de transcripcin contienen elementos estructurales conservados que permiten el enlace
de DNA
Una diversidad de mecanismos permite la regulacin transcripcional de la expresin gnica en

respuesta a estmulos externos
El control traduccional de la expresin gnica puede incluir el reconocimiento de secuencias
reguladoras UTR por protenas de enlace de RNA
Transcripcin y procesamiento alternativos de genes individuales
El uso de promotores alternativos puede generar isoformas especficas de tejido
Los genes humanos son propensos a empalme (corte y unin, splicing) y poliadenilacin alternativos
La edicin de RNA es una forma rara de procesamiento por la que se introducen
cambios especficos de bases en el RNA
Recuadro 10-3. El empalme (corte y unin, splicitig) alternativo puede alterar las
propiedades funcionales de una protena
10.4
10.4.1
10.4.2
10.4.3
10.5
10.5.1
10.5.2
10.5.3
10.5.4
10.5.5
10.5.6
10.6
10.6.1
10.6.2
10.6.3
275
Generalidades de la expresin gnica en clulas humanas
Recuadro 10-2. Clases de elementos de secuencia de accin cis que participan en la regulacin
de la transcripcin de genes codificadores de polipptidos
10.2.5
271
Expresin gnica diferencial: orgenes a travs de asimetra y perpetuacin hasta mecanismos

epigenticos como metilacin de DNA
Es muy probable que la expresin gnica selectiva en las clulas de embriones de mamferos
se desarrollara en respuesta a fenmenos de sealamiento intercelulares de corto alcance
La metilacin del DNA es un factor epigentico importante en la perpetuacin de la represin gnica
en clulas de vertebrados
La metilacin del DNA animal puede constituir una defensa contra transposones lo mismo que
la expresin gnica reguladora
Control de largo alcance de la expresin y la impronta gnicas
La estructura de la cromatina puede ejercer un control de la expresin gnica de largo alcance
Una regin de control de locus comn puede coordinar la expresin de genes individuales en
grupos gnicos
Algunos genes humanos muestran expresin selectiva de slo uno de los dos alelos parentales
La impronta genmica incluye diferencias en la expresin de alelos segn el padre de origen
277
278
279
280
282
283
285
288
291
291
291
293
293
294
295
295
297
298
298
299
300
301
Recuadro 10-4. Mecanismos que dan por resultado expresin monoallica a partir de genes
biallicos en clulas humanas
302
Recuadro 10-5. Falta de equivalencia de los genomas materno y paterno
302
El mecanismo de la impronta genmica no est claro pero la metilacin del DNA parece ser un
componente fundamental
La inactivacin del cromosoma X en mamferos comprende la represin de la expresin gnica
de accin cis de muy largo alcance
303
Organizacin y expresin nicas de genes de Ig y RCT

Reordenamientos del DNA en clulas B y T generan exones especficos de clulas que codifican
regiones variables de Ig y RCT
El cambio de clase de cadena pesada comprende la unin de un exn VDJ aislado a unidades de
transcripcin de regin constante alternativas
La monoespecificidad de las Ig y los RCT se debe a la exclusin allica y de cadena ligera
305
306
308
309
310
CONTENIDO | xiii
Captulo 11 Inestabilidad del genoma humano: mutacin y reparacin del DNA

11.1
11.2
11.2.1
11.2.2
11.2.3
11.2.4
11.2.5
11.2.6
11.3
11.3.1
11.3.2
11.3.3
11.4
11.4.1
11.4.2
11.4.3
11.4.4
11.5
11.5.1
11.5.2
11.5.3
11.5.4
11.5.5
11.5.6
11.6
11.6 .1
11.6.2
11.6.3
Generalidades de mutacin, polimorfismo y reparacin del DNA

Mutaciones simples
Las mutaciones que se deben a errores en la replicacin y la reparacin del DNA son frecuentes
Recuadro 11-1. Clases de polimorfismo gentico y variacin de secuencias
La frecuencia de sustituciones de bases individuales es no aleatoria de acuerdo con
la clase de sustitucin
La frecuencia y la gama de mutaciones en el DNA codificante difieren de las del DNA no codificante
Recuadro 11-2. Mecanismos que afectan la frecuencia de alelos en la poblacin
La localizacin de sustituciones de bases en el DNA de codificacin es no aleatoria
Las tasas de sustitucin varan de manera considerable entre diferentes genes y entre distintos
componentes gnicos
316
316
316
317
Recuadro 11-3. Clases de sustitucin de una base en el DNA que codifica polipptidos
La tasa de sustitucin puede variar en las diferentes regiones cromosmicas y en distintos linajes
Recuadro 11-4. Diferencias de sexo en la tasa de mutacin y el problema de la evolucin
impulsada por varones
321
323
Mecanismos genticos que producen intercambios de secuencias entre repeticiones

El deslizamiento de la replicacin puede causar polimorfismo de nmero variable de repeticin
tndem (NVRT) en repeticiones tndem cortas (microsatlites)
Las unidades grandes de DNA de repeticin tndem son propensas a insercin/delecin como
resultado de cruzamiento desigual o de intercambios desiguales de cromtides hermanas
Los acontecimientos de conversin gnica pueden ser ms o menos frecuentes en DNA
de repeticin tndem
Mutaciones patgenas
La tasa de mutacin perjudicial es alta en homnidos
El genoma mitocondrial es un punto crtico para mutaciones patgenas
Casi todas las mutaciones por empalme (splicing) alteran una secuencia conservadora necesaria
para el empalme normal, pero algunas ocurren en secuencias que no suelen requerirse para empalme
Las mutaciones que introducen un codn de terminacin prematuro a menudo dan por resultado
un mRNA inestable, pero otros resultados finales son posibles
Potencial patgeno de secuencias repetidas
El pareamiento errneo de cadena deslizada de repeticiones tndem cortas predispone a
deleciones patgenas e inserciones de cambio de marco
La expansin inestable de repeticiones tndem cortas puede causar una diversidad de enfermedades,
pero el mecanismo mutacional no se comprende bien
Las familias de repeticin tndem y de genes agrupados pueden ser propensas a cruzamiento
desigual patgeno y a acontecimientos semejantes a la conversin gnica
A menudo las repeticiones dispersas predisponen a deleciones y duplicaciones grandes
Las inversiones patgenas pueden producirse mediante recombinacin intracromtide entre
repeticiones invertidas
La transposicin de secuencias del DNA no es rara y puede causar enfermedad
Reparacin del DNA
La reparacin del DNA suele incluir cortar y eliminar, y sintetizar de nuevo un rea completa
de DNA que rodea el dao
Los sistemas de reparacin del DNA comparten componentes y procesos con la maquinaria
de transcripcin y recombinacin
A menudo la hipersensibilidad a agentes que daan el DNA produce un deterioro de la respuesta
celular al dao del DNA en lugar de una reparacin defectuosa del DNA
Captulo 12 Lugar del hombre en el rbol de la vida

12.1
12.1.1
12.1.2
315
Evolucin de la estructura gnica y genes duplicados

Es probable que los intrones espliceosmicos se originaran de intrones del grupo II y aparecieran
por primera vez en las clulas eucariotas iniciales
Recuadro 12-1. Grupos de intrones
Los genes complejos pueden evolucionar mediante duplicacin intragnica, muchas veces como
resultado de duplicacin exnica
318
318
319
320
320
326
326
329
329
329
331
332
332
333
336
337
337
337
339
341
342
343
344
345
347
347
351
352
352
353
353
12.1.3
12.1.4
La mezcla de exones puede traer consigo nuevas combinaciones de dominios protenicos

La duplicacin gnica tuvo un papel crucial en la evolucin de organismos multicelulares
354
354
Recuadro 12-2. Fases simtricas de exones e intrones
355
Recuadro 12-3. Mecanismos y paraloga de la duplicacin gnica
357
12.1.5
La superfamilia de la globina evolucion por un proceso de duplicaciones gnicas, conversiones

de genes y prdida/inactivacin gnica
358
12.1.6
La retrotransposicin puede permitir la mezcla de exones y contribuye de manera considerable

a la evolucin gnica
360
12.2
12.2.1
Evolucin de cromosomas y genomas

Es posible que el genoma mitocondrial se originara despus de la endocitosis de una clula
procariota por un precursor de la clula eucariota
362
362
Recuadro 12-4. Arbol universal de la vida y transferencia gnica horizontal
363
La presin de seleccin reducida caus la divergencia del cdigo gentico mitocondrial

Es posible que la evolucin de los genomas de vertebrados incluyera duplicacin del genoma completo
Durante la evolucin de los genomas de mamferos hubo numerosos reordenamientos cromosmicos
mayores
Duplicacin segmentaria en linajes de primates e inestabilidad evolucionista de secuencias
pericentromricas y subtelomricas
Los cromosomas X y Y humanos muestran regiones importantes de homologa secuencial,
incluidas las regiones seudoautosmicas comunes
Los cromosomas del sexo humanos evolucionaron de autosomas y divergieron debido a la
supresin regional peridica de recombinacin
La diferenciacin del cromosoma del sexo dio por resultado degeneracin progresiva del
cromosoma Y e inactivacin del cromosoma X
364
364
374
374
12.3.3
12.3.4
Filogentica molecular y genmica comparativa

La filogentica molecular utiliza alineamientos de secuencias para elaborar rboles evolucionistas
Los nuevos programas de computadora alinean secuencias a gran escala y del genoma completo
para asistir el anlisis y la identificacin evolucionistas de secuencias conservadas
El nmero de genes suele ser proporcional a la complejidad biolgica
Las comparaciones de proteomas revelan la extensin de la especializacin progresiva de protenas
12.4
12.4.1
12.4.2
Qu convierte al hombre en ser humano?

Qu diferencia a los seres humanos de los ratones?
Qu diferencia al ser humano de sus relacionados ms cercanos, los grandes monos?
379
380
384
Recuadro 12-5. Glosario de grupos y conceptos filogenticos metazoricos comunes
386
12.5
12.5.1
Evolucin de las poblaciones humanas

Las pruebas genticas sugieren un origen reciente de los seres humanos modernos en
poblaciones africanas
La diversidad gentica humana es baja y se debe sobre todo a variacin dentro de las
poblaciones ms que entre ellas
387
Recuadro 12-6. Anlisis de coalescencia
391
12.2.2
12.2.3
12.2.4
12.2.5
12.2.6
12.2.7
12.2.8
12.3
12.3.1
12.3.2
12.5.2
365
367
368
369
372
376
377
377
389
391
PARTE TRES: Mapeo e identificacin de genes patolgicos y mutaciones
39 7
Captulo 13 Mapeo gentico de caracteres mendelianos
399
13.1
13.1.1
13.1.2
13.1.3
13.1.4
13.1.5
13.2
13.2.1
13.2.2
Recombinantes y no recombinantes
La fraccin de recombinacin es una medicin de la distancia gentica
Sin embargo, las fracciones de recombinacin no exceden de 0.5 por muy considerable que sea
la distancia fsica
Las funciones de mapeo definen la relacin entre la fraccin de recombinacin y la distancia gentica
Cuentas de quiasmas y longitud total del mapa
Mapas fsicos y genticos: distribucin de recombinantes
400
400
Marcadores genticos
El mapeo de genes de enfermedades humanas requiere marcadores genticos
El contenido de informacin de heterocigosidad o polimorfismo mide el grado de informacin
de un marcador
404
404
Recuadro 13-1. Desarrollo de marcadores genticos humanos
405
400
401
401
402
405
CONTENIDO | xv
13.2.3
Los polimorfismos de DNA son la base de todos los marcadores genticos actuales
Recuadro 13-2. Meiosis informativa y no informativa
406
13.3
13.3.1
13.3.2
Mapeo de dos puntos

No siempre es fcil calificar recombinantes en genealogas humanas
El anlisis computadorizado de la calificacin lod es el mejor medio para analizar genealogas
complejas para enlace entre caracteres mendelianos
407
407
Recuadro 13-3. Clculo de calificaciones lod para las familias de la figura 13-6
408
Calificaciones lod de +3 y -22 son los criterios para enlace y exclusin (para una prueba nica)
Para investigaciones en el genoma completo debe utilizarse un umbral de significancia de toda
la extensin del genoma
408
13.3.3
13.3.4
13.4
13.4.1
405
407
409
El mapeo de mltiples puntos es ms eficiente que el mapeo de dos puntos

El enlace de mltiples puntos puede localizar un locus de enfermedad en un marco estructural
de marcadores
409
409
Recuadro 13-4. Clculo bayesiano del umbral de enlace
409
13.4.2
13.4.3
Mapas de marco estructural marcador: familias CEPH

Mapeo de marcador de enfermedad de mltiples puntos
410
410
13.5
13.5.1
Mapeo fino mediante genealogas extendidas y haplotipos ancestrales

El mapeo de autocigosidad puede mapear con eficiencia padecimientos recesivos en familias
endogmicas extendidas
La identificacin de segmentos ancestrales compartidos permiti el mapeo de alta resolucin
de los locus para la fibrosis qustica y el sndrome de rotura de Nijmegen
411
13.5.2
13.6
13.6.1
13.6.2
13.6.3
13.6.4
13.6.5
El anlisis de calificacin lod estndar no est exento de problemas

Los errores en la genotipificacin y los diagnsticos errneos pueden generar recombinantes falsas
Las dificultades computacionales limitan las genealogas posibles
La heterogeneidad de locus siempre es un posible error en el mapeo de genes humanos
El mapeo meitico tiene una resolucin limitada
Con los mtodos descritos en este captulo no es posible mapear caracteres cuya herencia no
es mendeliana
Captulo 14 Identificacin de genes patolgicos humanos
411
412
414
414
415
415
415
415
417
14.1
Principios y formas de identificar genes patolgicos
418
14.2
14.2.1
14.2.2
14.2.3
Conductas independientes de la posicin para identificar genes de enfermedad

Identificacin de un gen de enfermedad por el conocimiento del producto protenico
Identificacin del gen patolgico a travs de un modelo animal
Identificacin de un gen de enfermedad mediante el conocimiento de la secuencia de DNA
independiente de la posicin
418
418
420
14.3
14.3.1
14.3.2
14.3.3
14.3.4
Clonacin posicional
El primer paso consiste en definir la regin candidata tanto como sea posible
Es necesario establecer un contiguo de clonas a travs de la regin candidata
Un mapa de transcritos define todos los genes dentro de la regin candidata
Son prioritarios los genes de la regin candidata para pruebas de mutacin
420
421
421
422
423
Recuadro 14-1. Mapeo de transcritos: mtodos de laboratorio que complementan los anlisis de
bases de datos para identificar secuencias expresadas dentro de clonas genmicas
423
14.3.5
Importancia especial de los mutantes de ratn
424
14.4
14.4.1
Uso de anormalidades cromosmicas

Son interesantes los pacientes con una anormalidad cromosmica equilibrada y un fenotipo inexplicable
425
425
Recuadro 14-2. Mapeo de genes del ratn
425
Los pacientes con dos trastornos mendelianos, o uno mendeliano junto con retraso mental, pueden
tener una delecin cromosmica
427
14.4.2
420
Recuadro 14-3. Indicadores de la presencia de anormalidades cromosmicas
428
14.5
Confirmacin de un gen candidato

Recuadro 14-4. Efectos de la posicin: un peligro latente en la identificacin de genes patolgicos
429
429
14.5.1
14.5.2
Seleccin de mutacin para confirmar un gen candidato

Una vez que se confirma un gen candidato, el paso siguiente es comprender su funcin
430
430
xvi I CONTENIDO
Recuadro 14-5. Hibridacin genmica comparativa (HGC) para la deteccin de desequilibrios

cromosmicos submicroscpicos
14.6
14.6.1
14.6.2
14.6.3
14.6.4
14.6.5
14.6.6
14.6.7
14.6.8
Ocho ejemplos ilustran diversas formas de identificar genes de enfermedades

Identificacin directa de un gen a travs de una anormalidad cromosmica: sndrome de Sotos
Mapeo de transcritos puros: sndrome de Treacher-Collins
Secuenciacin y bsqueda de homlogos a gran escala: sndrome branquiootorrenal
Candidatos posicionales definidos mediante funcin: rodopsina y fibrilina
Un candidato posicional identificado a travs de la comparacin de mapas humanos y de ratn:
PAX3 y sndrome de Waardenburg
Inferencia de la funcin in vitro: anemia de Fanconi
Inferencia de funcin in vivo: miosina 15 y sordera DFNB3
Inferencia del patrn de expresin: otoferlina
Captulo 15 Mapeo e identificacin de genes que confieren susceptibilidad a enfermedades complejas

15.1
15.1.1
15.1.2
15.1.3
15.1.4
15.2
15.2.1
15.2.2
Decidir si un carcter no mendeliano es gentico: funcin de los estudios de familia, gemelos

y adopcin
El valor X es una medida de agrupamiento familiar
Importancia del ambiente familiar compartido
Los estudios de gemelos adolecen de muchas limitaciones
Estudios de adopcin: el estndar ideal para desenmaraar factores genticos y ambientales
El anlisis de segregacin permite analizar los caracteres que se encuentran en cualquier parte
del espectro entre puramente mendeliano y slo polignico
El sesgo de indagacin suele ser un problema con datos familiares: el ejemplo de padecimientos
autosmicos recesivos
El anlisis de segregacin compleja es un mtodo general para estimar la mezcla ms probable
de factores genticos en datos mancomunados de familias
430
431
431
431
432
432
433
433
433
433
437
438
438
438
439
439
440
440
440
Recuadro 15-1. Correccin de la relacin de segregacin
441
Anlisis de enlace de caracteres complejos

El anlisis de calificacin lod estndar no suele ser apropiado para caracteres no mendelianos
El anlisis de enlace no paramtrico no requiere un modelo gentico
Anlisis de segmento compartido en familias: anlisis de par de hermanos afectados y miembro
de la genealoga afectada
Los umbrales de significancia son una consideracin importante en el anlisis de enfermedades
complejas
442
442
443
Estudios de asociacin y desequilibrio de enlace

Por qu suceden asociaciones?
Asociacin es un principio muy distinto de enlace, pero donde la familia y la poblacin se fusionan,
el enlace y la asociacin se fnden
445
445
Recuadro 15-2. Medidas de desequilibrio de enlace
446
Muchos estudios muestran islotes de desequilibrio de enlace separados por puntos crticos
de recombinacin
Diseo de estudios de asociacin
447
448
Recuadro 15-3. Prueba de desequilibrio de transmisin (PDT) para determinar si el alelo

marcador M, se relaciona con una enfermedad
449
Enlace y asociacin: tcnicas complementarias
450
Recuadro 15-4. Tamaos de muestras necesarios para encontrar un locus de susceptibilidad

a una enfermedad por el estudio del genoma completo mediante el uso de pares de hermanos
afectados (PHA) o la prueba de desequilibrio de transmisin (PDT)
450
15.5
Identificacin de alelos de susceptibilidad
451
15.6
15.6.1
Ocho ejemplos que ilustran el xito variable de la diseccin gentica de enfermedades complejas
Cncer de mama: la identificacin de un subgrupo mendeliano condujo a adelantos mdicos
importantes, pero no explica las causas de la enfermedad espordica frecuente
Enfermedad de Hirschsprung: una enfermedad oligognica
Enfermedad de Alzheimer: los factores genticos son importantes tanto en la forma frecuente
de inicio tardo como en las formas mendelianas raras de inicio temprano, pero son genes
diferentes que actan de manera distinta
451
15.3
15.3.1
15.3.2
15.3.3
15.3.4
15.4
15.4.1
15.4.2
15.4.3
15.4.4
15.4.5
15.6.2
15.6.3
443
444
446
452
453
454
CONTENIDO | xvii
15.6.4
Diabetes mellitus tipo 1: an es la pesadilla de los genetistas?
455
Recuadro 1 de tica. Enfermedad de Alzheimer, prueba de ApoE y discriminacin
455
15.6.6
15.6.7
15.6.8
Diabetes tipo 2: dos factores de susceptibilidad, uno muy frecuente para ser indetectable mediante
enlace; el otro muy complejo y slo en ciertas poblaciones
Enfermedades inflamatorias del intestino: un gen de susceptibilidad preciso identificado
Esquizofrenia: los problemas especiales de los trastornos psiquitricos o conductuales
Obesidad: anlisis gentico de un carcter cuantitativo
457
458
459
460
15.7
15.7.1
15.7.2
Generalidades y resumen
Por qu es tan difcil?
Si todo funciona y se identifican alelos de susceptibilidad, entonces qu?
461
461
461
15.6.5
Captulo 16 Patologa molecular

16.1
Introduccin
16.2
16.3
La nomenclatura conveniente de alelos A y a oculta una inmensa diversidad de secuencias de DNA

Una primera clasificacin de mutaciones con prdida de funcin comparadas con mutaciones
con ganancia de funcin
El aspecto importante para la patologa molecular no es la secuencia de una alelo mutante sino su efecto
16.3.1
16.3.2
465
466
466
466
466
Recuadro 16-1. Principales clases de mutacin
466
Recuadro 16-2. Nomenclatura para describir cambios de secuencia
467
Recuadro 16-3. Nomenclatura para describir el efecto de un alelo
467
16.3.4
Una prdida de funcin es probable cuando las mutaciones de punto en un gen producen el
mismo cambio patolgico que las deleciones
Una ganancia de funcin es probable cuando slo una mutacin especfica en un gen produce
una patologa determinada
Puede ser difcil decidir si el cambio en una secuencia de DNA es patgeno
16.4
16.4.1
Mutaciones con prdida de funcin

Muchos cambios distintos en un gen pueden causar prdida de funcin
469
469
Recuadro 16-4. Hemoglobinopatas
469
Recuadro 16-5. Lincamientos para estimar la significancia de un cambio de secuencia de DNA
470
16.3.3
16.4.2
16.4.3
16.4.4
En la haploinsuficiencia una reduccin de 50% del nivel de la funcin gnica causa un

fenotipo anormal
Las mutaciones en protenas que actan como dmeros y multmeros a veces producen efectos
dominantes negativos
La modificacin epigentica puede abolir la funcin gnica aun sin un cambio de secuencia
de DNA
467
468
468
471
473
473
16.5
16.5.1
16.5.2
16.5.3
Mutaciones con ganancia de funcin

La adquisicin de una funcin nueva es rara en enfermedades hereditarias pero frecuente en el cncer
La expresin excesiva puede ser patgena
Los cambios cualitativos en el producto de un gen pueden causar ganancia de funcin
473
473
473
474
16.6
16.6.1
Patologa molecular: del gen a la enfermedad

En mutaciones con prdida de funcin el efecto fenotpico depende del nivel residual de
funcin gnica
475
Recuadro 16-6. Patologa molecular de los sndromes de Prader-Wlli y de Angelman
476
16.6.2
16.6.3
16.6.4
16.6.5
16.6.6
16.7
16.7.1
16.7.2
475
Las mutaciones con prdida de funcin y ganancia de funcin en el mismo gen causarn
diferentes enfermedades
La variabilidad entre familias es evidencia de genes modificadores o efectos al azar
Repeticiones en expansin inestables: una nueva causa de enfermedad
La agregacin de protenas es un mecanismo patgeno frecuente en enfermedades por ganancia
de funcin
La heteroplasmia y la inestabilidad complican la relacin entre genotipo y fenotipo en las mutaciones
mitocondriales
482
Patologa molecular: de la enfermedad al gen

Es posible que el gen subyacente a una enfermedad no sea el obvio
La heterogeneidad de locus es la regla en lugar de la excepcin
482
482
483
478
478
479
481
xviii I CONTENIDO
16.7.3
16.7.4
16.8
16.8.1
16.8.2
Mutaciones en diferentes miembros de una familia gnica pueden producir una

serie de sndromes
relacionados o superpuestos
483
Las clasificaciones clnica y molecular son herramientas alternativas para pensar acerca de las
enfermedades y cada una es vlida en su esfera
483
Patologa molecular de trastornos cromosmicos
484
Los sndromes de microdelecin unen la brecha entre sndromes de gen nico y
cromosmicos484
Los principales efectos de las aneuploidas cromosmicas pueden deberse a desequilibrios de dosis
en unos cuantos genes identificables
486
Captulo 17 Gentica del cncer
48 9
17.1
Introduccin
490
17.2
Evolucin del cncer
490
Recuadro 17-1. Dos formas de establecer una serie de mutaciones sucesivas ms probables
491
17.3
17.3.1
17.3.2
17.3.3
Oncogenes
Historia de los oncogenes
Funciones de los oncogenes
Activacin de protooncogenes
491
491
492
492
17.4
17.4.1
17.4.2
494
494
17.4.3
Genes supresores de tumor

El paradigma del retinoblastoma
La seleccin de prdida de heterocigosidad (LoH) se utiliza con amplitud para intentar
identificar las localizaciones de genes supresores de tumor (ST)
Con frecuencia los genes supresores de tumor son silenciados epigenticamente
17.5
17.5.1
17.5.2
17.5.3
17.5.4
Estabilidad del genoma

Inestabilidad cromosmica
Reparacin de defectos del DNA e inestabilidad a nivel del DNA
Cncer de colon no polipsico hereditario e inestabilidad microsatlite
p53 y apoptosis
499
499
501
501
502
17.6
17.6.1
Control del ciclo celular

Punto de control Gl-S
503
503
17.7
17.7.1
17.7.2
Integracin de los datos: vas y capacidades

Vas en el cncer colorrectal
Un tumor con xito debe adquirir seis capacidades especficas
504
505
506
17.8
Para qu sirve todo este conocimiento?
506
Captulo 18 Pruebas genticas en individuos y poblaciones
499
por metilacin499
511
18.1
Introduccin
512
18.2
Eleccin del material para pruebas: DNA, RNA o protenas
512
18.3
18.3.1
18.3.2
18.3.3
18.3.4
18.3.5
18.3.6
Estudio de un gen para mutaciones

Mtodos basados en secuenciacin
Mtodos basados en la deteccin de compatibilidades errneas o heterodplex
Mtodos basados en anlisis de conformacin de cadena nica
Mtodos basados en traduccin: prueba de truncamiento de protena (PTT)
Mtodos para detectar deleciones
Mtodos para detectar patrones de metilacin del DNA
513
513
513
514
515
515
516
18.4
Pruebas para un cambio de secuencia especificado
18.4.1
Se dispone de muchos mtodos simples para genotipificar una variante especificada
517
518
Recuadro 18-1. Hibridacin multiplex con sonda amplificable (MAPH)
520
Mtodos para genotipificacin de alto rendimiento

Pruebas genticas para enfermedades por repeticin de tripletos
El origen geogrfico es una consideracin importante para algunas pruebas
521
521
523
18.5
Rastreo gnico
18.5.1
El rastreo gnico incluye tres pasos lgicos
18.5.2 La recombinacin establece un lmite fundamental en la precisin del rastreo gnico
18.5.3
Clculo de los riesgos en el rastreo gnico
523
525
526
526
18.4.2
18.4.3
18.4.4
CONTENIDO xix
Recuadro 18-2. Dos mtodos para la genotipificacin de alto rendimiento
526
18.6
18.6.1
Problemas especiales de la distrofia muscular de Duchenne

Recuadro 18-3. Lgica del rastreo gnico
Seleccin de poblacin
Los programas de seleccin aceptables deben ajustarse a ciertos criterios
529
529
530
531
Recuadro 18-4. Uso del teorema de Bayes para combinar probabilidades
531
18.6.2
18.6.3
La especificidad y la sensibilidad miden el desempeo tcnico de una prueba de seleccin

Organizacin de un programa de seleccin gentica
531
532
18.7
18.7.1
18.7.2
18.7.3
18.7.4
El perfil de DNA puede utilizarse para identificar individuos y determinar relaciones

Para el perfil suele emplearse una diversidad de polimorfismos de DNA diferentes
El perfil de DNA puede usarse para determinar la cigosidad de gemelos
El perfil de DNA puede emplearse para descartar o establecer la paternidad
El perfil del DNA es un medio potente para las investigaciones forenses
Recuadro 18-5. La falacia del fiscal
533
534
534
536
536
537
18.5.4
PARTE CUATRO: Nuevos horizontes: en el siglo xxi
539
Captulo 19 Ms all del proyecto del genoma: genmica funcional, protemica y bioinformtica
539
19.1
19.1.1
19.1.2
19.1.3
19.1.4
19.2
19.2.1
19.2.2
19.2.3
19.2.4
19.2.5
19.3
19.3.1
19.3.2
19.3.3
19.3.4
19.3.5
19.4
19.4.1
19.4.2
19.4.3
Generalidades de genmica funcional

La informacin obtenida de la fase estructural del Proyecto del Genoma Humano es de uso
limitado sin una anotacin funcional
Las funciones de genes individuales pueden describirse a niveles bioqumico, celular y del
organismo completo
Las relaciones funcionales entre los genes deben estudiarse a niveles del transcriptoma y el proteoma
Recuadro 19-1. Funcin de la glucocinasa
Las tcnicas de anlisis de alto rendimiento y la bioinformtica son tecnologas que hacen capaz
la genmica funcional
Anotacin funcional mediante comparacin de secuencias
La comparacin de secuencias permite asignar funciones tentativas a los genes
Mtodos de bsqueda consenso pueden extender el nmero de relaciones homologas identificadas
Las similitudes y diferencias entre genomas indican secuencias conservadas e importantes desde el
punto de vista funcional
La genmica comparativa puede aprovecharse para identificar y caracterizar genes de enfermedades
en humanos
Una minora inflexible de genes resiste la anotacin funcional mediante bsqueda de homologa
Perfil global del mRNA (transcriptmica)
El anlisis del transcriptoma revela cmo los cambios en los patrones de expresin gnica coordinan
las actividades bioqumicas de la clula en la salud y la enfermedad
El muestreo secuencial directo es un mtodo estadstico para determinar la abundancia relativa
de diferentes transcritos
Recuadro 19-2. Tcnicas de muestreo de secuencias para el anlisis global de la expresin gnica
Los microarreglos de DNA recurren a valoraciones de hibridacin multiplex para medir la
abundancia de miles de transcritos en forma simultnea
El anlisis de datos de arreglos de DNA incluye la creacin de una matriz de distancia y el
agrupamiento de puntos de datos relacionados utilizando algoritmos reiterativos
Los arreglos de DNA se utilizan para estudiar la expresin gnica global en lneas de clulas humanas,
biopsias de tejidos y modelos animales de enfermedad
Protemica
'
La protemica comprende el anlisis de la expresin de protenas y de la estructura y las interacciones
protenicas
La protemica de expresin floreci a travs de la combinacin de dos plataformas de tecnologa
mayores: la electroforesis en gel bidimensional (EG2D) y la espectrometra de masa
Recuadro 19-3. Chips de protenas
Recuadro 19-4. Espectrometra de masa en protemica
La protemica de expresin se usa para estudiar cambios en el proteoma relacionados con
enfermedad y toxicidad
542
542
542
542
543
543
543
543
545
545
546
547
548
548
548
549
550
554
555
556
556
556
557
561
562
XX
CONTENIDO
19.4.4
19.4.5
Las estructuras de las protenas proveen informacin funcional importante

Existen muchas maneras distintas para estudiar interacciones de protenas individuales
Recuadro 19-5. Determinacin de estructuras de protenas
562
565
566
19.4.6
Seleccin de interaccin de alto rendimiento con mtodos basados en genotecas
567
19.4.7
19.4.8
Recuadro 19-6. Clasificacin estructural de protenas

El desafo de la protemica de interaccin es ensamblar un mapa de interaccin funcional de la clula
La informacin de interacciones protenicas con ligandos pequeos puede mejorar el conocimiento
de los procesos biomoleculares y proveer una base racional para el diseo de frmacos
570
573
Resumen
575
19.5
Captulo 20 Manipulacin gentica de clulas y animales
574
577
20.1
Generalidades de la tecnologa de transferencia gnica
578
20.2
20.2.1
Principios de la transferencia gnica

La transferencia gnica puede utilizarse para nuevas secuencias de DNA funcionales en clulas
animales cultivadas, en forma pasajera o estable
La produccin de animales transgnicos requiere la transferencia gnica estable a la lnea germinal
578
Recuadro 20-1. Mtodos de transferencia gnica a clulas animales en cultivo
580
20.2.2
20.2.3
20.2.4
20.2.5
20.2.6
20.2.7
20.3
20.3.1
20.3.2
20.3.3
20.4
20.4.1
20.4.2
20.4.3
20.4.4
20.4.5
20.4.6
Recuadro 20-2. Marcadores seleccionables para clulas animales
581
Recuadro 20-3. Aislamiento y manipulacin de clulas madre embrionarias de mamferos
584
El control de la expresin transgnica es una consideracin importante en cualquier experimento

de transferencia gnica
La transferencia gnica tambin es til para producir mutaciones definidas y alterar la expresin
de genes endgenos
El envo dirigido de genes permite producir animales que portan mutaciones definidas en
todas las clulas
La recombinacin especfica de sitio posibilita la inactivacin gnica condicional y la
ingeniera cromosmica
Las estrategias transgnicas pueden usarse para inhibir la funcin de genes endgenos
21.2
586
588
588
591
592
Uso de la transferencia genica para estudiar la expresin y la funcin gnicas

La expresin y la regulacin gnicas pueden investigarse por medio de genes rastreadores
La funcin gnica puede investigarse generando mutaciones con prdida de funcin y ganancia
de funcin, y fenocopias
595
595
Recuadro 20-4. Genes rastreadores para clulas animales
597
596
Los anlisis de la funcin gnica a gran escala por mutagnesis insercional e interferencia sistemtica
del RNA son partes fundamentales de la genmica funcional
598
Recuadro 20-5. Vectores complicados utilizados para mutagnesis insercional
600
Creacin de modelos de enfermedad mediante transferencia gnica y tecnologa de envo

dirigido de genes
Modelado de la patognesis de enfermedades y tratamiento farmacolgico en cultivos de clulas
Puede ser difcil identificar modelos de enfermedad en animales generados de manera espontnea
o inducidos por mutagnesis aleatoria
Los ratones tienen una gran utilidad como modelos animales de enfermedades humanas en gran
parte porque pueden crearse mutaciones especficas en un locus predeterminado
Es posible modelar mutaciones con prdida de funcin mediante envo dirigido de genes y
mutaciones con ganancia de funcin por expresin de genes mutantes dominantes
601
602
602
603
603
Recuadro 20-6. Potencial de animales para el modelado de enfermedades en humanos
605
La atencin se dirige cada vez ms al uso de animales transgnicos para modelar trastornos complejos
Una variedad de diferencias entre el humano y el ratn puede dificultar la construccin de modelos
de enfermedades humanas en ratones
606
Captulo 21 Nuevas conductas para el tratamiento de enfermedades

21.1
578
579
606
611
El tratamiento de una enfermedad gentica y la teraputica gentica de una afeccin no son

lo mismo
612
Tratamiento de anormalidades genticas
612
CONTENIDO
sci
21.3.3
21.3.4
Uso del conocimiento gentico para mejorar los tratamientos existentes y desarrollar nuevas
teraputicas convencionales
La farmacogentica promete incrementar la efectividad de los medicamentos y reducir los efectos
secundarios peligrosos
Las compaas farmacuticas realizan grandes inversiones en genmica para identificar nuevos blancos
farmacolgicos
Los tratamientos basados en clulas prometen transformar el potencial de los transplantes
Protenas recombinantes y vacunas
Recuadro 1 de tica. Etica de la clonacin humana
613
614
615
616
21.4
Principios de la teraputica gnica
618
21.5
21.5.1
Mtodos para insertar y expresar un gen en una clula o tejido blanco

Es posible transferir genes a clulas receptoras en el laboratorio (ex vivo) o dentro del cuerpo
del paciente (in vivo)
619
Recuadro 2 de tica. Teraputica con lnea germinal y tratamiento gnico somtico
619
Pueden disearse vectores para integrarse en los cromosomas de la clula husped o permanecer
como episomas
621
Los virus son los vectores utilizados con ms frecuencia para la teraputica gnica
621
Recuadro 21-1. Informe del Panel de los NIH de 1995 sobre teraputica gnica (informe
Orkin-Motulsky)
621
Recuadro 3 de tica. Diseo de nios
622
21.3
21.3.1
21.3.2
2 1 .5.2
21.5.3
612
612
619
21.5.4
Los sistemas vectores no virales evitan muchos de los problemas de inseguridad de los virus
recombinantes, pero las tasas de transferencia gnica son casi siempre bajas
625
21.6
2 1 .6.1
2 1 .6.2
21.6.3
21.6.4
Mtodos para reparar o inactivar un gen patgeno en una clula o tejido

Reparacin de un alelo mutante mediante recombinacin homologa
Inhibicin de la traduccin mediante oligonucletidos antisentido
Destruccin o reparacin selectiva de mRNA por una ribozima
Inhibicin selectiva del alelo mutante mediante interferencia por RNA (iRNA)
627
627
627
627
628
21.7
21.7.1
21.7.2
21.7.3
21.7.4
21.7.5
Algunos ejemplos de intentos de teraputica gnica humana

El primer xito definitivo: curacin de la inmunodeficiencia combinada grave ligada a X
Intentos de teraputica gnica para la fibrosis qustica
Intentos de teraputica gnica para la distrofia muscular de Duchenne
Teraputica gnica para el cncer
Teraputica gnica para las enfermedades infecciosas: HIV
628
628
629
630
631
631
Glosario
635
ndice de enfermedades
647
ndice
649
Abreviaturas
2D
5-MeC
A
Acm
AcMNPV
ADAR
AE
AEC
AEC1
AID
ALH
AMH
ANCP
APT
AREC
ASEG
AT
ATCC
BDG
BDP
BLAST-IPE
BOR
BrdU
BrEt
C
CAP
CATH
CBA
CCC
CCNPH
CCRE
CD
CDLAE
cDNA
CE
CGP
CIP
CLAP
cM
CMH
COMT
CQt
CP
CPV
CSIR
CU
D
DAM
DC
Bidimensional
5-Metilcitosina
Adenina
Anticuerpo monoclonal
Virus de la polihedrosis nuclear califrnica
autgrafa
Desaminasa de adenosina que acta en el RNA
Aceptor de empalme
Ataxia espinocerebeiosa
Ataxia espinocerebeiosa tipo 1
Desaminasa inducida por activacin
Antgeno de leucocitos humanos
Hormona antimlleriana
Antgeno nuclear de clula proliferante
Activador del plasmingeno tisular
Amplificacin rpida de extremos de cDNA
Anlisis seriado de expresin gnica
Ataxia telangiectsica
American Type Culture Collection
Base de datos del genoma
Banco de Datos de Protenas
BLAST iterado de posicin especfica
Sndrome branquiootorrenal
Bromodesoxiuridina
Bromuro de etidio
Citosina
Cromosoma artificial P1
Class Architecture Topology Homologous,
superfamilia
Cromosoma bacteriano artificial
Circular covalentemente cerrado
Cncer de colon no polipsico hereditario
Complementacin cruzada de reparacin de
escisin
Cruzamiento desigual
Cromatografa desnaturalizante en lquido de
alta ejecucin
DNA complementario
Carcinoma embrionario
Clula germinal primordial
Contenido de informacin de polimorfismo
Cromatografa en lquido de alta presin
CentiMorgan
Clula madre hemopoytica
Centro de organizacin de microtbulos
Producto de la concentracin de DNA y tiempo
Compatibilidad perfecta
Clulas productoras de vector
Complejo silenciador inducido por RNA
Colitis ulcerosa
Desplazamiento o diversidad
Dispersin anmala de multilongitud de onda
Dicigtico
ddNTP
DE
DE
DEEP
df
DFP
DIMJ
DIQ
DMD
DNA
DN-asa I
DO
DRMC
DUP
E2DG
EARS
EASV
EBV
EC
ECACC
ECM
EDG
EG
EGCP
EGF
EGGD
EH
EHi
Eli
EM
ENEC
ENEL
ENO
EPRA
ERH
ES/EM
ESRN
EVA
FIE
FCU
FISH
FIV
FQ
FR
FSRN
FT
FU
Fvcu
G
Gcv
GE
GPI
Trifosfato de didesoxinuclesido
Desequilibrio de enlace
Donador de empalme
Clasificacin de doblez basada en la alineacin
estructura-estructura de protenas
Doble filamento
Displasia fibrosa poliosttica
Diabetes con inicio en la madurez del joven
Dimerizacin inducida qumicamente
Distrofia muscular de Duchenne
cido desoxirribonucleico
Desoxirribonucleasa I
Densidad ptica
Desviacin de raz media cuadrada
Disoma uniparental
Electroforesis bidimensional en gel
Empalme alterado relacionado sin .sentido
Estenosis artica supravalvular
Virus de Epstein-Barr
Enfermedad de Crohn
European Collection o f Cell Cultures
Elemento centrmero
Electroforesis de diferenciacin en gel
Equivalentes de genomas
Electroforesis en gel de campo pulsado
Factor de crecimiento epidrmico
Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante
Enfermedad de Huntington
Enfermedad de Hirschsprung
Enfermedad inflamatoria del intestino
Espectrometra de masa
Elementos nucleares entremezclados cortos
Elementos nucleares entremezclados largos
Efecto nuclear de Overhauser
Enfermedad poliqustica renal del adulto
Elemento que responde al hierro
Espectroscopia de masa tndem
Elemento silenciador restrictivo neural
Endodermo visceral anterior
Factor 1 esteroidognico
Fenilcetonuria
Hibridacin fluorescente in situ
Fecundacin in vitro
Fibrosis qustica
Forma replicativa
Factor silenciador restrictivo neural
Factores de transcripcin
Filamento nico
Fragmento variable de cadena nica
Guanina
Ganciclovir
Germen embrionario
Gradiente de pH inmovilizado
xxiv
ABREVIATURAS
GSS
GST
HAH
HAT
HDAC
HDMP
HDV
HFIS
HFISM
HGC
HGH
HMSA
HPRT
HSV-TK
HUGO
ICLC
IDCG
IDCG-X
IDCH
IE
IEE
IELS
IEP
Ig
IICE
IM
IMC
IMER
INC
INCP
IP3
IPD
IPTG
ISCN
ITCF
kb
KEGG
L
LCC
LLA
LMA
LNP
LPM
m7G
Ma
MACI
MACN
MADL
MAIL
Mb
Me
MCI
ME
MEC
Gerstmann-Straussler-Scheinker
Transferasa de glutatin S
Hlice-asa-hlice
Acetiltransferasa de histona
Desacetilasa de histona
Impresin digital de masa de pptidos
Virus delta humano
Hibridacin fluorescente in situ
HFIS mltiple
Hibridacin genmica comparativa
Hlice-giro-hlice
Hibridacin multiplex de sonda amplificable
Fosforribosiltransferasa de hipoxantina y guanina
Cinasa de timidina del virus del herpes simple
Human Genome Organization (Organizacin del
Genoma Humano)
Interlab Cell Line Collection (Coleccin Interlab
de Lneas Celulares)
Inmunodeficiencia combinada grave
Enfermedad de inmunodeficiencia combinada
grave ligada a X
Intercambio desigual de cromtide hermana
Identidad por estado
Intensificador de empalme exnico
Implicaciones ticas, legales y sociales
Ionizacin por electropulverizacin
Inmunoglobulina
Inyeccin intracitoplsmica de espermatozoides
Inestabilidad microsatlite
Indice de masa corporal
Integracin mediada por enzima de restriccin
Inestabilidad cromosmica
Incompatibilidad
1,4,5-trifosfato de inositol
Identidad por descendencia
IsopropiI-tio-(3-D-galactopiransido
International System fo r Human Cytogenetic
Nomenclature (Sistema Internacional para la
Nomenclatura Citogentica Humana)
Isotiocianato de fluorescena
Kilobases
Kyoto Encyclopedia o f Genes and Genomes
(Enciclopedia Kioto de Genes y Genomas)
Luz
Locus de carcter cuantitativo
Leucemia linfoblastoide aguda
Leucemia mieloide aguda
Lod no paramtrico
Leucemia promieloctica
7-Metilguanosina
Milln de aos
Marcadores de afinidad codificados por istopo
Molcula de adherencia de clula neural
Monmero Alu derecho libre
Monmero Alu izquierdo libre
Megabase
Monocigtico
Masa celular interna
Madre embrionaria
Matriz extracelular
MFT
MGSC
MI
miRNA
MLA
MP
MPE
mRNA
MSE
mtDNA
NF1
NUE
OEA
OG
OI
P
PAF
pb
PCR
PCR-COD
PCR-TI
PDGH
PDT
PDTE
PEG
PeH
PFV
PGH
Ph
PHA
Pi
PIPj
PNU
PP.
PRLF
PRS
PRSS
PRTC
PSR
PTP
Pu
RAP
RCL
RCT
RDC
RE
REB
REM
REN
RER
REST
RFA
RFM
RIUDA
Monofosfato de timidina
Mouse Genome Sequencing Consortium (Consorcio
de Secuenciacin del Genoma del Ratn)
Mesodermo intermedio
Micro-RNA
Marco de lectura alternativo
Mesodermo paraaxil
Mesodermo de placa externa
RNA mensajero
Marcados de secuencia expresada; metilsulfonato
de etilo
DNA mitocondrial
Neurofibromatosis tipo I
Nitrosourea de etilo
Oligonucletido especfico de alelo
Ontologia gnica
Osteognesis imperfecta
Pesada
Poliposis adenomatosa familiar
Pares de bases
Reaccin en cadena de la polimerasa
Reaccin en cadena de la polimerasa cebada con
oligonucletido degenerado
Reaccin en cadena de la polimerasa de
transcriptasa inversa
Proyecto de la Diversidad del Genoma Humano
Prueba de desequilibrio de transmisin
PDT extendida
Polietilenglicol
Prdida de heterocigosidad
Protena fluorescente verde
Proyecto del Genoma Humano
Filadelfia
Par de hermanos afectados
Pirimidina
4,5-Difosfato de fosfatidilinositol
Polimorfismo de nucletido nico
Residuo pirofosfato
Polimorfismo de longitud de fragmento de
restriccin
Partcula de reconocimiento de seal
Polimorfismo de repeticin de secuencia simple
Polimorfismo de repeticin tndem corta
Polimorfismo de sitio de restriccin
Prueba de truncacin de protena
Purina
Regin de agrupamiento de punto de rotura
Regin de control de locus
Receptor de clula T
Regin determinante de la complementariedad
Retculo endoplsmico
Reparacin de escisin de base
Repeticin entremezclada de amplitud de
mamferos
Reparacin de escisin de nucletido
Retculo endoplsmico rugoso
Factor de transcripcin silenciador RE-1
Regiones de fijacin de andamiaje
Regin de fijacin de matriz
Restitucin isomorfa nica con dispersin
anmala
Prefacio
Gentica m olecular humana se revis y actualiz a la luz de los descubrimientos consecutivos del Proyecto del Genoma Humano
l Human Genome Proyect). A medida que entramos en la era posgenoma, an pensamos que este libro proporciona un enlace entre libros
de texto elementales y la bibliografa sobre investigacin, de tal manera que las personas sin demasiadas bases sobre el tema puedan
apreciar y leer las ltimas investigaciones.
La gentica molecular humana es un tema enorme. Hemos intentado hacerla ms comprensible al organizar el texto en secciones
codificadas a color demarcadas con claridad, con oraciones sinpticas en forma de encabezados y nuevos trminos importantes destacados
en cursivas.
La primera seccin (captulos 1 a 7) incluye material bsico sobre la estructura y funcin del DNA, cromosomas, clulas y desarrollo,
anlisis de genealoga y tcnicas bsicas utilizadas en un laboratorio. La segunda (captulos 8 a 12) comenta los diversos proyectos de
secuenciacin del genoma y las informaciones que proporcionan sobre la organizacin, expresin, variacin y evolucin del genoma
humano. La tercera (captulos 13 a 18) se enfoca en el mapeo, identificacin y diagnstico de causas genticas de enfermedades
mendelianas, complejas y oncolgicas. Por ltimo, en la cuarta parte (captulos 19 a 21) se analizan los horizontes ms amplios de la
genmica funcional, protemica, bioinformtica, modelos animales y teraputica.
Asimismo, se incluye un glosario extenso y tres glosarios especiales adicionales en los captulos 5, 6 y 12. Tambin hay dos ndices:
uno principal (marcado con una cinta verde en el borde de la pgina) y un ndice de enfermedades (indicado con una cinta roja).
Durante los cuatro aos transcurridos desde que se public la segunda edicin de Gentica m olecular humana se han observado
muchos acontecimientos. El borrador de la secuencia del genoma humano apareci en 2001 y la versin terminada se public en 2003.
Los lectores familiarizados con la edicin previa advertirn muchos cambios. Hay nuevos captulos sobre clulas y desarrollo y genmica
funcional. Se reescribieron y organizaron por completo las secciones sobre enfermedades complejas y el captulo de proyectos del
genoma. Entre los mltiples cambios ms pequeos hay que mencionar una nueva seccin sobre filogentica molecular (captulo 12) y la
introduccin de recuadros de tica para comentar algunas de las implicaciones del nuevo conocimiento. Adems, se revis y actualiz
virtualmente cada pgina para considerar los desarrollos sorprendentes de los ltimos cuatro aos. La produccin a todo color fue un
cambio agradable y signific una revisin total de todas las figuras, con muchas del todo nuevas. Tal y como en la edicin anterior, las
figuras estn disponibles (excepto algunas tomadas de otras publicaciones) para descargarlas de sitios de la red del editor.
Algunas cosas no han cambiado. Nuestro propsito es an explicar los principios y no proporcionar gran nmero de hechos. Es fcil
consultar los acontecimientos relevantes, sobre todo a travs de internet, y proporcionamos las referencias necesarias. El carcter cientfico
exige que en las revisiones de investigacin se utilice la referencia a fin de dar crdito a las personas que llevaron a cabo los
descubrimientos originales. Sin embargo, en esta obra, las bibliografas al final de cada captulo tienen un propsito ms didctico; con
frecuencia citamos revisiones en lugar del primer artculo sobre un tema y hemos intentado elegir referencias de revistas de fcil acceso.
Esperamos la comprensin de las personas que no encuentren una referencia a un artculo bsico. Antes que todo, como en ediciones
previas, intentamos reflejar la sensacin de una investigacin de rpido movimiento y esperamos que los lectores compartirn al final
nuestra motivacin y entusiasmo para continuar la travesa del descubrimiento hacia nuestro genoma.
Como siempre, agradecemos a las mltiples personas que comentaron la edicin antecesora, incluso si no fue posible siempre
incorporar sus sugerencias. En la edicin actual, apreciamos el consejo y los comentarios sobre captulos de muchos colegas, en especial
Gavin Cuthbert, Ian Hampson, Mike Jackson, Ralf Kist, Chris Mathew, Heiko Peters, Nalin Thakker, Andy Wallace y John
Wolstenholme. Richard Twyman amerita un agradecimiento especial por su importante ayuda en los captulos 3, 19 y 20. Ha sido un
placer trabajar con Jonathan Ray, Fran Kingston, el grupo de Garland Science/BIOS Scientific Publishers y Touchmedia, quienes
desarrollaron las ilustraciones a todo color. Por ltimo, agradecemos a nuestras familias, en especial Meryl, Alex, James y Gilly, y a las
secretarias Anne, Kate, Leanne y Margaret su apoyo y tolerancia, lo que ha representado en ocasiones tiempo de estrs para todos ellos.
Tom Strachan y Andrew Read
Auxiliares didcticos suplementarios
El m aterial suplementario para estudiantes incluye:
Gentica molecular humana 3: problemas y soluciones

Es un texto adjunto de Gentica m olecular humana 3 y en l se halla una autovaloracin que contiene muchas preguntas de eleccin
mltiple, preguntas y respuestas de revisin y problemas de respuesta abierta.
Los materiales suplementarios disponibles para profesores incluyen:

The Art of Human Molecular Genetics 3
Es un CD-ROM que contiene todas las figuras del libro para fines de presentacin. Las figuras se encuentran disponibles en formato
JPEG y PowerPoint y estn disponibles para los conferencistas que adopten el texto. Tambin pueden adquirirse.
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Tenemos el agrado de ofrecer Garland Science Classwire a quienes adquieran Gentica m olecular humana 3, un sitio de la red que
permite:
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Classwire es una marca registrada de Chalkfree Inc.
Antes de empezar:
uso inteligente de internet
A los estudiantes e investigadores de la actualidad no es necesario indicarles que utilicen internet. Sin embargo, hay algunos puntos en
particular importantes para los lectores de este libro que desearamos sealar desde el inicio.
En este libro intentamos incluir los principios de la gentica molecular humana, pero no hemos indicado demasiados hechos. Cuando
los proporcionamos, son sobre todo para ilustrar principios. Pero los principios sin hechos son bastante estriles y esperamos que el lector
vea los hechos, segn sea necesario, en internet. Los proyectos del genoma, y todos los investigadores relacionados con la gentica humana,
han producido una enorme cantidad de datos. El uso inteligente y selectivo de internet es una habilidad clave para cualquier cientfico, pero
tal vez en especial para genetistas y estudiantes de gentica.
Hemos llevado a cabo una bsqueda en Google para gentica y aqulla produjo 3 630 000 referencias. Algunos de esos sitios son
recursos claves, muchos son secundarios y algunos son errneos e imprecisos. Durante el curso del libro recomendamos varios sitios para
temas particulares. A continuacin sugerimos algunos sitios especficos; los elegimos porque son confiables, estables (no es probable que
cambien durante la vida de este libro) y proporcionan enlaces de gran ayuda a muchos otros portales. Con base en estos puntos
preliminares, el lector debe ser capaz de elaborar su lista personal de sitios tiles y aprovechar de modo sensible las asombrosas riquezas
que se encuentran en internet.
Puntos de inicio generales para datos genticos: http://www.ncbi.nlm.nih.gov; http://www.ebi.ac.uk/services/
Para informacin sobre el genoma: www.ensembl.org;http://genome.cse.ucsc.edu
Para informacin sobre protenas: http://ca.expasy.org/;
Para informacin sobre cualquier fenotipo mendeliano: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/
Acceso a publicaciones biomdicas: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
PARTE UNO
Bases
CAPTULO UNO
Estructura del DNA

y expresin genica
Contenido del captulo
4 [ CAPTULO UNO [ ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GNICA
1.1 Form acin de bloques y enlaces

qum icos en DNA, RNA y
polpptidos
La gentica molecular se relaciona sobre todo con la interrelacin
entre las macromolculas de informacin de DNA ( cid o desoxirrib o n u cleico ) y RNA ( cid o rib o n u cleico ) y la forma en que se
utilizan esas molculas para sintetizar p o lip p tid o s, el componente
bsico de todas las protenas. En algunos virus, el RNA es el mate
rial hereditario, pero en todas las clulas la informacin gentica se
aloja en molculas de DNA. Regiones seleccionadas de las molcu
las celulares de DNA sirven como plantillas para sintetizar molcu
las de RNA. La gran mayora de las molculas de RNA se emplea,
a su vez, para especificar la sntesis de polipptidos, sea de manera
directa o mediante la ayuda de la expresin gnica en diferentes eta
pas. Si se toma en cuenta que la expresin gnica est enfocada ca
si en su totalidad en la sntesis de polipptidos, las protenas
representan el principal punto final funcional del DNA y constitu
yen la mayor parte del peso seco de una clula. El trmino p r o te
na deriva del griego proteios, que significa de la primera jerarqua,
y alude a las actividades importantes de las protenas en diversas
funciones celulares al actuar como enzimas, receptores, protenas
de almacenamiento, protenas de transporte, factores de transcrip
cin, molculas de sealamiento, hormonas, etctera.
1.1.1 El DNA, RNA y polipptidos son grandes

polmeros definidos por una secuencia lineal
de unidades simples rpidas
En eucariotas se encuentran molculas individuales de DNA en los
cromosomas de los ncleos, las mitocondrias y asimismo los cloro-
plastos de clulas de plantas. Son polmeros grandes, con una es

tructura bsica lineal de residuos de azcar y fosfato alternados. El
azcar en las molculas de DNA es desox irribosa, un azcar de
cinco carbonos, y estn unidos residuos sucesivos de azcar por en
laces fosfodister covalentes. Fijada de manera covalente al tomo
de carbono nmero 1 ' (uno p rim a ) de cada residuo de azcar figu
ra una base de nitrgeno. Se encuentran cuatro tipos de bases: a d en in a (A), cito sin a ( C), gu a n in a (G) y tim in a (T) y consisten en
anillos heterocclicos de tomos de carbono y nitrgeno. Pueden
dividirse en dos clases:
Purinas (A y G) que tienen dos anillos heterocclicos engrana
dos.
Pirimidinas (C y T) que poseen uno de estos anillos.
Un azcar con una base unida se denomina nuclesido. Un nuclesido con un grupo fosfato unido al tomo de carbono 5' o 3'
constituye un nucletido, que es la unidad de repeticin bsica de
una cadena de DNA (figs. 1-1 y 1-2). La composicin de las molcu
las de RNA es similar a la de las molculas de DNA, pero difiere en
que contiene residuos de azcar ribosa en lugar de desoxirribosa y
u ra cilo (U) en lugar de timina (figs. 1-1 y 1-2).
Para su composicin, las protenas incluyen una o ms molcu
las polipeptdicas que pueden modificarse por la adicin de varias
cadenas laterales de carbohidratos u otros grupos qumicos. Al igual
que el DNA y el RNA, las molculas polipeptdicas son polmeros
que consisten en una secuencia lineal de unidades repetidas, en es
te caso aminocidos. Estos ltimos se conforman con los grupos
amino, de carga positiva, y cido carboxlico (carboxilo), de carga
negativa, conectados por un tomo de carbn central al cual est
unida una cadena lateral de identificacin. Los 20 aminocidos di
ferentes pueden agruparse en distintas clases segn sea la naturale-
NUCLESIDO
(= base + azcar)
BASE
N U C LE TID O
(= nuclesido + fosfato)
R IB O S A
I
D E SO XIR R IB O SA
M O N O FO SFA TO
DIFO SFATO
TR IFO SFA TO
A deno sina
Desoxiadenosina
A M P (adenilato)
dA M P
ADP
ATP
G uanosina
I PU R IN A S I
A denina
G uanina
Desoxiguanosina
M P (guanilato)
dG M P
dADP
dATP
GDP
dGDP
GTP
dGTP
P IR IM ID IN A S
C itosina
C itidina
Desoxicitidina
C M P (citidilato)
dCM P
CDP
dCDP
CTP
dCTP
Tim ina
Tim idlna
Desoxitim idina
[T M P ] (timidilato)
dTM P
[TDP]
dTDP
FTP]
[U M P ] (uridilato)
dUM P
UDP
dUDP
UTP
dUTP
U ridina
Uracilo
Desoxiuridina
dTTP
Fig. 1-1. Bases comunes que se encuentran en cidos nucleicos con nuclesidos y nucletidos correspondientes.
Nota: 1) los nucletidos con un monofosfato suelen describirse con nombres en los que se reemplaza el sufijo -in a de la base por el sufijo -ila to , como
en adenilato, guanilato, etc.; 2) los parntesis en TMR TDP y TTP indican que en condiciones normales no se encuentran.
1.1 | FORMACIN DE BLOQUES Y ENLACES QUMICOS EN DNA, RNA Y POLIPfiPTIDOS | 5
N
I
HC
C
II
C
N 4
HN
/
NH
,C
H 2N
\5
3/
\ S/c h 33
C
II
HN
I
CH
II
I
C
o ^ 2 X nh
2 X NH 6
T im in a (T)
U ra c ilo (U)
NH,
NH2
NH2
CH
n/
c4
HN
I
I
c
CH
II
CH
/ 6
NH
C ito s in a (C)
2^
0I
II
P4
3/
\5
CH8
/
NH
G u a n in a (G)
M
XC
z3^
N N
93
A d e n in a (A)
N
I
C
_ ^ 2 \
C
I II
C
CH
\ .CH
4 X n7
n^
1
C6x c5/C \
II
CH
C
2^ N X 4 X N
Xe
CH
XC
S
II y
CH2 o
"C I H/
H C1
41 \ I
l/
C H
4I \ !
2LL _
OH
A d e n o s in a
I
o
CH
II K
O
I I
II o
ch2
5l
H C 1
I/S
H C C H
3 | r -'i'OH OH
H C C H
OH
2\
" O -P -O -P -O -P -
51 / N
3 '|
CH
" o -p - 0
I 1
O- CH2 n
OH
> C\ 5
5 -m o n o fo s fa to d e a d e n o s in a
(A M P )
C H
4'l \ l
H C
l / l 1'
H C C H
3 '|
OH
r 2JL_
5 -trifo s fa to d e 2 '-d e s o x lc tid n a

(d C T P )
Fig. 1-2. Estructuras de bases, nuclesidos y nucletidos.

Las lneas negras en la parte inferior de los anillos de azcar indican que el plano del anillo se estableci a un ngulo de 90 respecto del plano de la base
correspondiente (es decir, si el plano de una base se representa com o si reposara sobre la superficie de la pgina, los tomos de carbono 2' y 3 ' [tres
p rim a ] del azcar pueden imaginarse en 'proyeccin hacia arriba, fuera de la pgina, y el tomo de oxgeno hacia abajo de la superficie de la pgina).
Nota: la numeracin en los azcares desoxrribosa y ribosa se limita a los cinco tomos de carbono, que se numeran 1' a 5', pero la numeracin de las
bases incluye tomos de carbono y nitrgeno que ocurren dentro de los anillos heteroccllcos. Los tomos de hidroxilo e hidrgeno destacados unidos
al carbono 2 ' indican la diferencia esencial entre los residuos de azcares ribosa y desoxrribosa. Los grupos fosfato se sealan de modo secuencial
como a , (3, y , etc., segn sea la proximidad al anillo de azcar (vase estructura dCTP).
CAPTULO UNO j ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GNICA
za de sus cadenas laterales (fig. 1-3). La clasificacin se basa en lo

siguiente:
Aminocidos bsicos, que llevan una cadena lateral con una car
ga positiva neta: un grupo amino (NH2) o anillo de histidina en
la cadena lateral adquiere un ion H a un pH fisiolgico.
Aminocidos cidos, que incluyen una cadena lateral con una
carga neta negativa: un grupo carboxilo en la cadena lateral
pierde un ion H^ a un pH fisiolgico para formar COO .
Aminocidos polares sin carga, que son neutros en sentido elc
trico pero portan cadenas laterales con grupos elctricos polares,
que se distinguen por tener cargas elctricas fraccinales (que se
indican como 8 + o 8 ). Por ejemplo, el tomo de hidrgeno
en el gru p o hidrox ilo (OH) y su lfh id rilo (SH) posee una
carga fraccional positiva, en tanto que los tomos de oxgeno/
azufre tienen una carga fraccional negativa, lo que conduce a las
designaciones siguientes: (O8 H8+) y (S& H8+).
Aminocidos neutros no polares, que son hidrfobos (rechazan
agua). Por lo general, interactan entre s y con otros grupos hi
drfobos.
Los polipptidos se forman con una reaccin de condensacin en
tre los grupos amino de un aminocido y el carboxilo del siguiente
para crear u na estru ctu ra bsica rep etid a (-N H CHRC O -),
en la que las cadenas laterales R difieren de un aminocido a otro
(vase fig. 1-21 ).
1.1.2 Los en laces covalentes confieren estabilidad;

los en laces no covalentes, m s dbiles,
facilitan relaciones interm oleculares y
estabilizan la estru ctu ra
La estabilidad del cido nucleico y los polmeros protenicos depen
de en particular de los enlaces covalentes potentes que unen los
tomos constituyentes de sus estructuras bsicas lineales. En las in
teracciones entre estas molculas y grupos dentro de un cido nu
cleico o una molcula de protena aislados, son importantes,
adems de los enlaces covalentes, varios enlaces no covalentes d

biles (vase cuadro 1-1). Es tpico que estos enlaces no covalentes
sean ms dbiles que los covalentes por un factor mayor de 10. A
diferencia de los enlaces covalentes, cuya fuerza depende slo de los
tomos particulares que participan, la fuerza de los enlaces no co
valentes tambin depende en notable proporcin de su ambiente
acuoso. La estructura del agua es en particular compleja, con una
red de enlaces no covalentes de rpida transformacin que tiene lu
gar entre las molculas individuales de H20 . La fuerza predomi
nante en esta estructura es el enlace de hidrgeno, un enlace
electrosttico dbil formado entre un tomo de hidrgeno parcial
mente positivo y un tomo parcialmente negativo que, en el caso
de las molculas de agua, es un tomo de oxgeno.
Las molculas cargadas son muy solubles en agua. Debido a las
cargas de fosfato que se encuentran en sus nucletidos componen
tes, el DNA y el RNA poseen carga negativa (polianiones). De acuer
do con su composicin de aminocidos, las protenas pueden llevar
una carga positiva neta (protenas bsicas) o una carga negativa
neta (protenas cidas). El potencial de enlace del hidrgeno de las
molculas de agua significa que las molculas con grupos polares
(incluidos DNA, RNA y protenas) pueden formar mltiples inte
racciones con las molculas de agua, que conducen a su solubilizacin. Por consiguiente, incluso las protenas neutras muchas veces
son solubles con facilidad si contienen un nmero considerable de
aminocidos polares cargados o neutros. En contraste, las protenas
enlazadas a la membrana suelen caracterizarse por un contenido al
to de aminocidos hidrfobos, que son ms estables desde el pun
to de vista termodinmico en el ambiente hidrfobo de una
membrana lpida.
A diferencia de los enlaces covalentes que requieren un ingreso
considerable de energa para romperse, los no covalentes se forman
y rompen de manera constante a temperaturas fisiolgicas. Como
resultado, permiten con facilidad interacciones moleculares reversi
bles (transitorias), que son esenciales para la funcin biolgica. En
el caso de los cidos nucleicos y las protenas, poseen una variedad
completa de acciones fundamentales que aseguran la replicacin
fiel del DNA, la transcripcin del RNA y el reconocimiento codn-
Cuadro 1-1. Enlace no covalente dbil

Tipo de enlace
Naturaleza del enlace
Hidrgeno
Se forman enlaces de hidrgeno cuando queda intermedio un tomo de hidrgeno entre dos tomos que atraen electrones,
por lo general tomos de oxgeno o nitrgeno. Vase el recuadro 1-1 para ver ejemplos de su importancia en la estructura y
funcin del cido nucleico y las protenas.
Inico
Ocurren interacciones inicas entre grupos cargados. Pueden ser muy potentes en cristales, pero en un ambiente acuoso los
grupos cargados son protegidos por molculas de H20 y otros iones en solucin y en consecuencia son muy dbiles. No
obstante, pueden ser muy importantes en la funcin biolgica, como es el caso del reconocimiento enzima-sustrato.
Van der Waals
Cualesquiera dos tomos que estn muy cerca entre s muestran una interaccin de enlace atractiva dbil debido a sus cargas
elctricas fluctuantes (atraccin de Van der Waals) hasta que quedan en extremo cerca, cuando se repelen entre s de forma
muy intensa (repulsin de Van der Waals). Aunque las atracciones de Van der Waals son muy dbiles en el plano individual,
pueden tornarse importantes cuando hay un buen ajuste entre las superficies de dos macromolculas.
Fuerzas hidrfobas
El agua es una molcula polar. Cuando se colocan molculas hidrfobas o grupos qumicos en un ambiente acuoso se fuerzan
juntas a fin de reducir al mnimo sus efectos destructores en la red compleja de enlaces de hidrgeno entre las molculas de
agua. Se dice que los grupos hidrfobos que se fuerzan juntos en esta forma se conservan unidos entre s por enlaces
hidrfobos, aunque la base de su atraccin se debe a repulsin comn por molculas de agua.
1,1 1 FORMACIN DE-BLOQUES Y ENLACES QUMICOS EN DNA, RNA Y POL1PPT1DOS 7
ESTRUCTURA
GENERAL
h 2n
II
c c-
OH
R
POLARES CARGADOS
I
CH,
I
C
* \
0-
CH,
I
CH,
I
C
pch 2
ch2
I
CH.
I
ch2
y ch2
8ch2
cido
ch2
asprtioo = aspartato
cido
(Asp)
glutmico = glutamato nh3
(Glu)
Lisina
(Lis)
O-
CH,
I
NH
I
C
'gtm? X
h 2n
CH
ib ,
HC =
NH
nh2
Arginina
(Arg)
Histidina
(His)
BSICO
CIDO
CH2
POLARES SIN CARGA
I
OH
ch,
c
o
ch2
ch2
ch2
I
c
nh2
3
A s p a ra g in a
(A sp)
NNH,
Serina
(Ser)
* C\
C H - CH,
I
OH
HC
CH
HC
CH
Treonina
(Tre)
CH,
I
OH
G lu ta m in a
(Glu)
Cistena (Cis)
Tirosina (Tir)
GRUPOS S
SULFHIDRILO
GRUPOS
HIDROXILO
G R U P O S A M ID A
NO POLARES
ch2
I
CH,
Alanina
(Ala)
Metionina
(Met)
ch3
Leucina
(Leu)
Valina
(Val)
I
CH2
I
ch2
s
I
CH,
ch3
CH3
CH3
3
CH2
i 2
CH,
II
C C OH
CH ,
/
VCH2
i"
-o
ch3
Glicina
(Gli)
I
CH
CH
HN-
CH
Isoleucina
(lie)
Prolina
(Pro)
ch2
HC
HC
CH
II
CH
CH
Fenilalanina
(Fen)
HC
CH2
CH
C-
-c
HC
^ CH/ \ NH/ C
Triptfano
(Trp)
Fig. 1-3. Estructuras de los 20 aminocidos principales.

Los aminocidos en una subclase (p. ej., los aminocidos cidos) son muy similares desde el punto de vista qumico. Los grupos que se destacan son
grupos qumicos polares. La convencin de la numeracin de tomos de carbono se emplea para designar el tomo de carbono central como a y los
carbonos subsecuentes de las cadenas laterales lineales como (3, y , 8, etc. (vase el ejemplo de la cadena lateral de la Usina en la parte superior).
Aunque, en general, los aminocidos polares son aminocidos hidrfilos y los no polares hidrfobos, la glicina (que tiene una cadena lateral muy
pequea) y la cistena (cuyo grupo sulfhidrilo no es tan polar como un grupo hidroxilo) ocupan posiciones intermedias en la escala hldrfila-hidrfoba.
Nota: la prolina es rara porque la cadena lateral une el tomo de nitrgeno del grupo NH2 y tambin el tomo central de carbono.
CAPTULO UNO | ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GNICA
1.2 Estructura y replicacin del DNA
2O
4-1
1.2.1 La estructura del DNA es una hlice doble

antiparalela
B as e
CH,
^.1
C' H
H C
IV
l/l
I2'
Como se mencion, la estructura bsica lineal de una molcula de

DNA y una molcula de RNA consiste en residuos de azcar y gru
pos de fosfato alternados. En cada caso, el enlace que une un resi
duo de azcar individual con los residuos de azcar vecinos es un
enlace 3\5-fosfodister. Ello significa que un grupo fosfato une el
tomo de carbono 3 d e un azcar con el tomo d e carbono 5' d el az
car contiguo (fig. 1-4).
En condiciones normales, las molculas de RNA dentro de una
clula existen como molculas nicas; en cambio, la estructura del
DNA es una doble hlice en la cual estn sostenidas entre s dos
molculas de DNA (ca d en a s d e DNA) por enlaces de hidrgeno
dbiles para formar un DNA dplex. El enlace de hidrgeno ocurre
entre bases opuestas lateralmente y los pares de bases (pb) de las dos
cadenas de DNA dplex siguen las reglas de Watson-Crick: A se
enlaza d e modo especfico con T y C con G (fig. 1-5). Como resulta
do, la composicin de bases del DNA de diferentes fuentes celula
res no es aleatoria: la cantidad d e adenina es igual a la d e timina y la
de citosina equivale a la de guanina. Por consiguiente, la composicin
de bases del DNA puede especificarse con precisin al indicar su
composicin de %GC (= %G + %C). Por ejemplo, si se seala
que una fuente de DNA celular es 42% GC, puede deducirse que
la composicin de bases es: G, 21%; C, 21%; A, 29%; T, 29%).
El DNA puede adoptar diferentes tipos de estructuras helicoi
dales. El A - D N A y el B - D N A son hlices derechas (aquellas en las
cuales la hlice forma una espiral en direccin dextrgira a medida
que se aleja del observador). Son, de manera respectiva, 11 y 10 pb
por giro. El Z - D N A es una hlice a la izquierda que tiene 12 pb por
giro. En condiciones fisiolgicas, casi todo el DNA en un genoma
bacteriano o eucaritico es de la forma B-DNA, en la que cada ca
dena helicoidal tiene una vu elta co m p leta (la distancia ocupada
H C C H
o = p -o
I
o
CH.
B as e
.O
C H
H C
\\\
l/l
H C C H
I2'
Fig. 1-4. Enlace 3 '-5 ' fosfodister.
anticodn. Aunque dbiles de modo individual, la accin combi

nada de numerosas uniones no covalentes puede contribuir en bue
na medida a la estabilidad de la estructura (conformacin) de estas
molculas y por consiguiente puede ser crucial para especificar la
forma de una macromolcula (vase fig. 1-7B para el ejemplo de
la forma en que el enlace intramolecular de hidrgeno proporciona
gran parte de la forma de una molcula de RNA de transferencia).
I 5+
h c ^ \
N
\S
6/
5-
h .......... ok
\ *
C C
N
9
/
C
4\
ch,
h c ^
5/
8S+ /
N ...........
N
..........HH-------N
3\
/ 2
O
N ^
/ /- 9
'5
1\
AZUAH
6y
/
4\
C CH
\
n
\
S+
8 - /
5
v* 6
N -------H ........... N
CH
/ 1 3\
2\
8+
8- / 2
N
A Z CA R
8+ I
xmmmh
C C
CH
CH
8-
C C
\
H .......O
\
AZ CA R
1\
C
Clave:
........... E nlace de
hidrgeno
Fig. 1-5. Los pares de bases A-T tienen dos enlaces de hidrgeno de conexin; los pares de bases G-C tienen tres.
Las cargas positivas fraccinales en los tomos de hidrgeno y las cargas negativas fraccinales en los tomos de oxgeno y nitrgeno se Indican por
8 + y S_ , respectivamente.
1.2 ! ESTRUCTURA Y REPLICACIN DEL DNA
por un giro aislado de la hlice) de 3.4 nm. A medida que los en

laces fosfodister unen los tomos de carbono nmeros 3' y 5' de
residuos de azcar sucesivos, un extremo de cada cadena del DNA,
el llamado extremo 5', posee un residuo de azcar terminal en el
cual el tomo de carbono nmero 5' no est unido a un residuo de
azcar vecino (fig. 1-6). El otro se define como el extremo 3' de
bido a una ausencia similar del enlace fosfodister en el tomo de
carbono nmero 3 del residuo de azcar terminal. Se dice que las
dos cadenas de un DNA dplex son antiparalelas porque siempre
se relacionan (anneal) en forma tal que la direccin 5>3' de una
cadena de DNA es la opuesta a la de su compaera (fig. 1-6).
La informacin gentica est codificada por la secuencia lineal
de bases en la cadena de DNA (la estructura primaria). En conse
cuencia, se dice que las dos cadenas de DNA de un DNA dplex
tienen secuencias complementarias (o que muestran complementariedad de bases) y es posible deducir con facilidad la secuencia de
bases de una cadena de DNA si se conoce la secuencia de DNA de
su cadena complementaria. Por estas razones, es usual describir una
secuencia de DNA al escribir la secuencia de bases slo de una ca
dena y en la direccin
Esta es la direccin de la sntesis de
A)
Extrem o 5'
OH
I 3'h
H C C i
VC /lH
H
H C
5c h 2
0
1
o -p = o
I
IV 4'
H C
.....
4'l\l
l/l
H C C H
31 I*
Surco
m enor
I 2' I 3'
o=p-o
oI
H C C H
r Cl / !H
I~
C H>H H\
C
4' l \ l
l/ l
H C C H
3|
IM 4-
H C
"o-
I2'
5c h ,
0
1
p=o
I
Surco
m ayor
I 2' 13'
H C C H
o = p O
1-1/1
o
I
CH
5'?H / 0 '
C H
Ht C
4'l\ l
l/l
3'|
12'
H C C H
Extrem o 3
Extrem o 3'
\Z
I
0
1
ch2
5VC H
nuevas molculas de DNA durante la replicacin del DNA y asi

mismo de la transcripcin cuando se sintetizan molculas de RNA
y se utiliza el DNA como una plantilla (vase ms adelante). Sin
embargo, cuando se describe la secuencia de una regin de DNA
que incluye dos bases vecinas (en realidad, un dinucletido) en una
cadena del DNA, es usual insertar una p para indicar un enlace
fosfodister de conexin; por ejemplo, CpG significa que una citidina est unida de manera covalente a una guanosina vecina en la
misma cadena de DNA, mientras que un par de bases CG represen
ta que una citosina en una cadena de DNA est enlazada por hi
drgeno a una guanina en la cadena complementaria (vase fig. 1-6 ).
El enlace intermolecular de hidrgeno tambin permite la for
macin de RNA-DNA dplex y RNA de doble cadena, que son re
querimientos importantes para la expresin gnica (vase recuadro
1-1). Adems, el enlace de hidrgeno puede ocurrir entre bases
dentro de una molcula aislada de DNA o RNA. Las secuencias
que tienen repeticiones invertidas complementarias colocadas muy
prximas son propensas a formar estructuras en horquilla o asas
que estabilizan los enlaces de hidrgeno entre las bases en el cuello
de la asa (fig. 1-7A; vase asimismo fig. 9-6 para el ejemplo de los
B)
0 = P -C T
OH H
j CH2
0I
o -p = o
1
"O
Extrem o 5'
Fig. 1-6. La estructura del DNA es una hlice antiparalela, de doble cadena.
A) Naturaleza antiparalela de las dos cadenas de DNA. Las dos cadenas son antiparalelas porque tienen direcciones opuestas para la unin del
tomo de carbono 3 ' con el tomo de carbono 5 '. La estructura que se muestra es un trinucletido de doble cadena cuya secuencia puede representarse
como: 5 ' pCpGpT-OH 3 (cadena de DNA a la izquierda)/5' pApCpG-OH 3'(cadena de DNA a la derecha) (en la que p es un enlace fosfodister y -O H un
grupo OH terminal en el extremo 3 '). En condiciones normales, esto se abrevia al eliminar los smbolos p y OH y proporcionar la secuencia slo en
una cadena (p. ej., la secuencia podra representarse tambin como 5'CGT 3 ' o 5 ' ACG 3'). B) Estructura helicoidal doble del DNA. Las dos cadenas
estn arrolladas una con la otra para form ar un serpentn plectonmico. La vuelta completa de cada hlice representa la distancia ocupada por un giro
y en la estructura del B-DNA (vase texto) incluye 10 nucletidos.
10
CAPTULO UNO i ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GNICA
Recuadro 1-1. Ejemplos de la importancia del enlace de hidrgeno en cidos nucleicos y protenas
Enlace de hidrgeno intermolecular en cidos nucleicos
Es importante para permitir la formacin de cidos nucleicos de doble ca
dena, segn se indica a continuacin:
DNA de doble cadena. La estabilidad en la doble hlice se conserva
por enlaces de hidrgeno entre pares de bases A -T y C-G (seccin
1.2.1 y fig. 1-5).
Dplex DNA-RNA. Se forman de manera natural durante la transcrip
cin del RNA y el enlace de hidrgeno apoya los tipos siguientes de
pares de bases: A-U ; C-G y A -T (enlace de A en la cadena de RNA
con T en la cadena de DNA). Vase seccin 1.3.3 y figura 1-12.
RNA de doble cadena. Los genomas de ciertos virus consisten en
dplex RNA-RNA pero, adems, durante el procesamiento del RNA y
la expresin gnica se forman dplex transitorios RNA-RNA en todas
las clulas. El corte y unin (splicing) de RNA requiere el reconoci
m iento de los lmites exn-intrn despus del enlace de hidrgeno
entre los transcritos de RNA sin cortar y unir (unspliced) y varias
micro-RNA originados por segmentacin de precursores RNA en

horquillo). Estas constricciones estructurales, que son adicionales a
las impuestas por la estructura primaria, contribuyen a la estructu
ra secundaria de la molcula. Ciertas molculas de RNA, como el
RNA de transferencia (tRNA), muestran cantidades en particular
altas de estructura secundaria (fig. 1-7B).
N ota: en los enlaces de hidrgeno en RNA-RNA dplex y tambin
en el enlace intramolecular de hidrgeno dentro de una molcula
de RNA, se encuentran de modo ocasional pares de bases G~ U adems
de los pares de bases AU y CG (fig. 1-7B). Esta forma de pares de
bases no es en especial estable, pero no altera en grado significativo
la hlice de RNA-RNA.
1.2.2 La replicacin del DNA es semiconservadora y ia

sntesis de cadenas de DNA semidiscontinua
Durante el proceso de sntesis del DNA (replicacin del DNA) se
desenrollan las dos cadenas de DNA de cada cromosoma por ac
cin de una helicasa y cada cadena de DNA dirige la sntesis de una
cadena de DNA complementaria. Se forman dos dplex hijas de
DNA, cada una de ellas idntica a la molcula original (parental)
(fig. 1-8). Debido a que cada dplex de DNA hija contiene una ca
dena de la molcula original y una cadena de DNA recin sintetizada,
el proceso de replicacin se describe como semiconservador. La
enzima polimerasa de DNA cataliza la sntesis de nuevas cadenas de
DNA mediante los cuatro trifosfatos de desoxinuclesidos (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP) como precursores nucletidos.
La replicacin del DNA se inicia en puntos especficos, que se
denominan orgenes de replicacin. Si se comienza desde uno de
estos orgenes, el inicio de la replicacin del DNA tiene como re
sultado una horquilla de replicacin en forma de Y, en la cual se
bifurca el DNA dplex original en dos dplex hijas de DNA. Las
dos cadenas del DNA dplex original son antiparalelas, pero ac
tan de forma individual como plantillas para la sntesis de una ca
dena hija antiparalela complementaria. Se deduce que las dos
cadenas hijas deben seguir en direcciones opuestas (es decir, la di
reccin del crecimiento de la cadena debe ser 5'>3' en una cadena
molculas de RNA nuclear pequeo (seccin 1.4.1). De igual modo,

el reconocimiento codn-anticodn incluye el enlace de hidrgeno
entre dos molculas de RNA: mRNA y tRNA (seccin 1.5.1 y figura
1-20). El enlace de hidrgeno entre molculas de RNA incluye pares
de bases G -U y asim ism o la formacin de pares de bases A -U y C-G
(vase cuadro 1 -6).
Enlace de hidrgeno intramolecular en cidos nucleicos. Es im por
tante para proporcionar la estructura secundaria en molculas de DNA y
RNA, com o sucede en la formacin de horquillas en el DNA y los brazos
complejos del tRNA (vase seccin 1.2.1 y figura 1-7). En el ltim o ca
so, cabe sealar que las formaciones de pares de bases incluyen pares
de bases G -U y asim ismo pares de bases A -U y G-C.
Enlace de hidrgeno intramolecular en protenas. Algunas unidades
fundamentales de la estructura secundara de las protenas, como la h
lice a , la hoja plegada j8 y el giro
se definen en gran parte mediante
enlaces de hidrgeno intracatenarios (seccin 1.5.5 y fig. 1-24).
hija, la cadena rpida [leading, 3'->5' en la otra cadena hija, la ca

dena lenta [la ggin g; fig. 1-9).
Las reacciones catalizadas por polimerasas de DNA incluyen la
adicin de un residuo de dNMP del grupo hidroxilo 3' libre de
la cadena de DNA en crecimiento (el residuo de dNMP lo propor
ciona un precursor de dNTP se cortan los dos residuos fosfato
distales y 7 y se descarta el grupo pirofosfato resultante). Este re
querimiento introduce una asimetra en el proceso de replicacin
del DNA: slo la cadena rpida posee un grupo hidroxilo 3 libre
en el punto de bifurcacin. Esto posibilita la adicin secuencial de
nucletidos y el alargamiento continuo en la misma direccin en la
que se mueve la horquilla de replicacin.
La 5'->3' de la sntesis de la cadena lenta es la direccin opuesta
respecto de la que sigue la horquilla de replicacin. Como resulta
do, la sntesis tiene que llevarse a cabo en pasos que generan una se
rie progresiva de fragmentos pequeos, de manera caracterstica de
100a 1 000 nucletidos de largo (fragmentos de Okazaki). Debi
do a que slo la cadena rpida se sintetiza de modo continuo, se di
ce que la sntesis de cadenas de DNA es semidiscontinua. Cada
fragmento de la cadena lenta se sintetiza en la direccin 5-*3, la
opuesta a la que sigue la horquilla de replicacin. Los fragmentos
sintetizados de forma sucesiva se unen de manera covalente en sus
extremos mediante la enzima ligasa de DNA. Por consiguiente, la
cadena lenta crece en la direccin en la que se mueve la horquilla
de replicacin.
1.2.3 La maquinaria de replicacin del DNA en clulas

de mamferos es compleja
Tal y como ocurre en los ribosomas, la maquinaria de replicacin
del DNA est muy conservada y es en esencia similar, desde la Es
cherichia coli hasta las clulas de mamferos, con una variedad de di
ferentes tipos fundamentales de protenas (recuadro 1-2). Sin
embargo, la complejidad es mayor en las clulas de mamferos, en
trminos de la cifra de diferentes polimerasas de DNA y el nme
ro de protenas constituyentes y subunidades de protenas. Casi to
das las polimerasas de DNA en las clulas de los mamferos usan
1.2
A)
5'
AGACCACCAGTACAAGACGTTTCTTGTACTGGAACAAG
3'
ESTRUCTURA Y REPL1CACIN DEL DNA
B)
11
OH E xtrem o 3 '
C
Extrem o 5 '( P ) C
i - i B razo a c e p to r
A T
1-8
G C
A-
Om|it
1 -1
A-
B razo D
A- T
Clave:
- E n la ce d e hidrgeno
T- A
G-
A-
C G
gI
_____
a c
u u g
l i l i
aG a a u
mC
Ua ffAG
C-.G
B razo an ticod n
C G
A G AC C A
A A C AA G
, r CG G C C
,
, 1
mC G G
'
m5C G
U U
i1A
G
B razo Tyj/ C
U-G
C -G
CC - GmsC
Anticodn
Fig. 1-7. Enlace de hidrgeno intramolecular en DNA y RNA.

A) Formacin de un asa en horquilla de doble cadena dentro de una cadena de DNA nica. Las secuencias que se destacan en la cadena de DNA
arriba representan secuencias de repeticin invertidas que pueden enlazar hidrgeno para form ar una estructura en horquilla (abajo). B) El RNA de
transferencia (tRNA) tiene una estructura secundaria extensa. El ejemplo que se muestra es un gen tRNAGIU humano. Los nuclesidos menores son:
D,5,6-dhidrouridina; psi (\P), seudouridina (5 ribosiiuracilo); m5C, 5-metiicitidina; m 1A, 1-metiladenosina. La estructura en hoja de trbol est estabilizada
por un enlace de hidrgeno intramolecular extenso, sobre todo por los pares de bases Watson-Crick G-C y A-U , pero asim ismo con el par de bases
ocasional G-U. Se reconocen cuatro brazos: en el brazo aceptor puede fijarse un aminocido (en el extremo 3 '); el brazo T'PC se define por este
trinucletido; el brazo D se denomina as porque contiene residuos de dihidrouridina; y el brazo anticodn contiene el trinucletido anticodn en el
centro del asa. La estructura secundaria del tRNA virtualmente no vara; siempre hay siete pares de bases en el tallo del brazo aceptor, cinco en el brazo
T 'l'C , cinco en el brazo anticodn y tres o cuatro en el brazo D.
una cadena de DNA individual como plantilla para sintetizar una

cadena de DNA complementario y en consecuencia son p o lim er a
sas d e DNA d irigid a s p o r DNA. A diferencia de las polimerasas de
RNA, las polimerasas de DNA requieren absolutamente el extremo
hidroxilo 3 de una cadena oligonucletida iniciadora (cebador) de
bases pareadas como sustrato para la extensin de la cadena. Por

consiguiente, se necesita un o ligo n u cletid a in icia d o r d e RNA
(cebador) sintetizado con anterioridad (que sintetiza una p rim a sa )
para proporcionar el grupo 3-OH libre que requieren las polimera
sas de DNA para iniciar la sntesis de DNA.
En las clulas de los mamferos existen ms de 20 tipos diferen
tes de polimerasa de DNA (Friedberg y cois., 2000; 2002), que pue
den agruparse de manera conveniente en tres clases principales
(vase cuadro 1-2 ):
P olim erasas d e DNA d irigid a s p o r DNA tp ica s (alta fi d e l i
dad). De ellas, dos participan en la replicacin estndar de
DNA cromosmico, son especficas para sintetizar DNA a par
tir de la cadena rpida o la lenta (polimerasas de DNA 8 y a,
Fig. 1-8. La replicacin del DNA es semiconservadora.
Nuevo Original
C adena
hija
Original Nuevo
C adena
hija
El dplex de DNA original consiste en dos cadenas de DNA antiparalelas y complementarias, que
se desenrollan y a continuacin actan de manera individual como plantillas para la sntesis de
nuevas cadenas de DNA antiparalelas y complementarias. Cada uno de los dplex de DNA hijas
contiene una cadena de DNA parental original y una nueva cadena de DNA que forman dplex de
DNA, que es en trminos estructurales idntico al dplex del DNA parental. Nota: esta figura
muestra el resultado de la duplicacin de DNA, pero no la forma en que acta el proceso (para
ello vase fig. 1-9).
12 i CAPITULO UNO
c
o
ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GNICA
5'
5'
3'
5'
3'
'5
E
o
H e lic a s a
3' 5'
3' 5'
C adena
r p id a
C adena
le n ta
3 '5 '
3'5'
3 '5 '
3'5'
Fig. 1-9. Asimetra de la sntesis de la cadena durante la replicacin del DNA.

La helicasa desenrolla el dplex de DNA para permitir que se repliquen las cadenas individuales. A medida que tiene lugar la replicacin, la direccin
5'-*3 de la sntesis del filamento rpido es la mism a en la que se mueve la horquilla de replicacin y en consecuencia la sntesis puede ser continua.
Sin embargo, la sntesis de la cadena lenta tiene la direccin opuesta a la del movimiento de la horquilla de replicacin. Necesita sintetizarse en piezas
(fragmentos de Okazaki), primero A, despus B y a continuacin C, que sella de manera subsecuente la enzima ligasa de DNA para form ar una cadena
continua de DNA. Nota: la sntesis de estos fragmentos comienza mediante un nucletido iniciador RNA. En clulas eucariotas, las polimerasas de DNA
8 y sintetizan las cadenas rpida y lenta, respectivamente (vase cuadro 1 -2).
respectivamente), dos estn encargadas de reparar DNA ((3 y e) y

una de la replicacin y reparacin del DNA mitocondrial (7 ).
P olim erasas d e DNA d irigid a s p o r DNA p ro p en sa s a error.
Se identific una amplia variedad de diferentes polimerasas de
DNA con fidelidad muy baja de replicacin de DNA (p. ej., la
tasa de error para la polimerasa de DNA iota ( 1) es 20 000 ve
ces mayor que la de la polimerasa del DNA e. Se sabe que
algunas poseen gran expresividad en clulas del sistema inmunitario y esta observacin, aunada a su baja fidelidad de replica
cin de DNA, sugiere su participacin en la hipermutacin en
linfocitos B y T (vase seccin 10.6).
P olim erasas d e DNA d irigid a s p o r RNA. Algunas polimerasas
de DNA sintetizan DNA mediante una plantilla del RNA y por
esta razn se describen como tra n scrip ta sa s in versa s (vase
secciones 1.2.4 y 1.3.1). Incluyen una actividad que se encuen-
Recuadro 1-2. Principales clases de protenas que se utilizan en la maquinaria de replicacin de DNA
Las topoisomerasas inician el proceso de desdoblamiento del DNA al
crear una muesca (romper) en una cadena de DNA. Como resultado, se
libera la tensin que sostiene la hlice en sus formas arrollada y superarrollada.
Las helicasas llevan a cabo el desenrollamiento de la cadena doble origi
nal, una vez que se elimin el superarrollamiento por accin de una topoisomerasa.
Las polimerasas de DNA sintetizan nuevas cadenas de DNA. Las polime
rasas de DNA son agregados complejos de varias subunidades de prote
nas diferentes, que incluyen con frecuencia actividades de lectura de
pruebas y nucleasa de DNA, de tal manera que es posible identificar
cualquier base incorporada de forma errnea y cortarse y eliminarse una
tira local del DNA que contiene el error y a continuacin repararse. En las
clulas, el DNA se replica por la sntesis de nuevo DNA a partir de una
plantilla de la cadena de DNA existente, para lo cual emplea polimerasas
de DNA dirigidas por DNA y en las clulas de mamferos existe una ex
tensa variedad de estas polimerasas de DNA. En situaciones ms espe
cializadas, puede sintetizarse DNA en las clulas a partir de plantillas de
RNA mediante polimerasas de DNA dirigidas por RNA (llamadas asimis
mo transcriptasas inversas), como en el caso de la sntesis de los ex

tremos de un cromosoma lineal con la transcriptasa inversa de la enzima
te lomera sa
Primasas. Las polimerasas de DNA tienen dificultad para iniciar la snte
sis nueva de una plantilla desnuda de cadena nica. En lugar de ello, se
requiere un oligonucletido iniciador (cebador) con un grupo OH 3 ' al cual
puede fijar un dNTP la polimerasa. Las primasas fijan un oligonucletido
iniciador de RNA pequeo al DNA de cadena nica para actuar como un
sustituto de OH 3 ' a fin de que comience a sintetizarse la polimerasa de
DNA a partir de l. Este oligonucletido iniciador de RNA lo elimina al fi
nal una ribonucleasa, se llena la hendidura mediante una polimerasa de
DNA y a continuacin se sella con una ligasa de DNA.
Las ligasas catalizan la formacin de un enlace fosfodister para obtener
un OH 3 ' y un fosfato 5 ' no fijados pero adyacentes.
Las protenas de enlace de cadena nica son importantes para conser
var la estabilidad de la horquilla de replicacin. El DNA de cadena nica
es muy lbil, o inestable, de tal manera que estas protenas se unen a l
en tanto permanece como cadena nica y evitan que se degrade.
1.3
TRANSCRIPCIN DEL RNA Y EXPRESIN GNICA
13
Cuadro 1-2, Principales clases de polimerasas de DNA de mamferos

A) Polimerasas de DNA de alta fidelidad (tpicas) dirigidas por DNA
Clase de polimerasa de DNA
a
Localizacin
Nuclear
Nuclear
Replicacin general de DNA
Sntesis y
oligonucletido
iniciado de cadena
lenta
Exonucleasa3 3 ' -* 5'
No
-
Funcin de reparacin de DNA
Replicacin de
mtDNA
mitocondrial
Nuclear
Nuclear
No
Por escisin
de bases
Reparacin
de mtDNA
Por escisin de
nucletido y base
Por escisin de
nucletido y base
Sntesis de
cadena rpida
aTiene actividad de lectura de pruebas.
B) Polimerasas de DNA de baja fidelidad (propensas a error) dirigidas por DNA

Polimerasa de DNA (zeta)
Se expresa en clulas B y T mutantes; participa en hipermutacin?
Polimerasa de DNA t] (eta)
Muta nucletidos A y T durante la hipermutacin?
Polimerasa de DNA i (iota)
Fidelidad de replicacin muy baja; se piensa que participa en la hipermutacin
Polimerasa de DNA n, (mu)
Muy expresada en clulas B y T; se piensa que participa en la hipermutacin
C) Polimerasas de DNA dirigidas por RNA (transcriptasas inversas)

Telomerasa de transcriptasa inversa (Tert)
Replica DNA en los extremos de cromosomas lineales
Transcriptasa Inversa LINE-1/retrovlrus endgenos
En ocasiones convierte mRNA y otro RNA en cDNA que puede integrarse en cualquiera otra
parte dentro del genoma
tra en la enzima telom era sa que tiene a su cargo la replicacin

de los extremos de cromosomas lineales (seccin 2.2.5) junto
con transcriptasas inversas codificadas por algunos DNA muy
repetitivos y clases de retrovirus endgenos.
1.2.4 Los genomas virales se conservan con frecuencia

por replicacin de RNA en lugar de DNA
El DNA es el material hereditario en todas las clulas en la actuali
dad y se acostumbra pensar en genomas como trmino colectivo pa
ra las molculas de DNA hereditarias de un organismo o una clula.
A pesar de la ubicuidad del DNA como material hereditario celular,
hoy da muchas clases diferentes de virus tienen un gen o m a RNA.
Las molculas de RNA pueden autorreplicarse, pero el grupo OH 2'
en los residuos de ribosa d el RNA hace que sean bastante inestables, des
de el punto d e vista qumico, los enlaces azcar-fosfato. En el DNA, los
residuos de desoxirribosa slo llevan tomos de hidrgeno en la po
sicin 2' y por consiguiente el DNA es mucho ms adecuado que el
RNA para ser un portador estable de informacin gentica. La repli
cacin de RNA tambin es propensa a errores y las tasas normales de
error de replicacin de RNA son alrededor de 10 000 veces ms al
tas que las registradas durante la replicacin de DNA.
Los virus desarrollaron muchas formas diferentes para infectar y
trastornar clulas y sus genomas muestran una diversidad extraor
dinaria (vase cuadro 1-3; fig. 1-10). Como resultado de su eleva
da carga mutacional, los genomas de RNA virales suelen ser muy
pequeos pero tienen como ventaja ndices de mutacin rpidos. A
diferencia de los virus DNA, que por lo general se replican en el

ncleo, los virus RNA se replican casi siempre en el citoplasma. En
tre algunas excepciones de importancia a esta regla general se en
cuentra un grupo de virus RNA conocido como retrovirus. Los
retrovirus son virus RNA raros porque se replican en el ncleo y el
RNA se replica a travs de un intermedio de DNA, mediante una
tra nscripta sa inversa, una polimerasa de DNA dirigida por RNA
que, al igual que las polimerasas de RNA, tiene tasas de error de
replicacin relativamente altas. Despus de la conversin de RNA
en DNA complementario (cDNA), se integra el cDNA retroviral en el
DNA cromosmico del husped (vase seccin 21.5.3).
1.3
Transcripcin dei RNA y expresin

gnica
1.3.1
El flujo de informacin gentica en las clulas

tiene un sentido casi exclusivo:
ONA - RNA - protena
La expresin de la informacin gentica en todas las clulas es en

gran parte un sistema de un sentido: el DNA especifica la sntesis
de RNA y a continuacin el RNA especifica la sntesis de polipptidos (que de modo subsecuente forman protenas). Debido a su
universalidad, el flujo DNA -* RNA - polipptido (protena) de
informacin gentica se describe como el dogma central de la bio
loga molecular. En todos los organismos celulares son esenciales
dos pasos sucesivos:
14
CAPTULO UNO
A)
RNA
DNA
L IN E A L
C IR C U L A R
CADENA
N IC A
P arv o viru s
p. ej., M 1 3 , fd , f1
L IN E A L
C IR C U L A R
p e ro sin D N A
in te rm ed io ,
p. ej., h e p a titis A
p. ej., viru s d e
h e p a titis d e lta
p. ej., ra b d o v iru s
R p lic a p o r D N A in te rm e d io ,
p. ej., retrovirus
DOBLE
CADENA
iiiiiiiiiiiiiiiiiniiiiiiiiiiiii
H e rp e s virus,
P a p o v a v iru s
b cu lo v iru s
R eo v iru s
.......................
A d en o viru s
(tie n e u n a p ro te in a te rm in a l
u n id a d e fo rm a covalente )
P iirirn iiiirn m m m n n n rQ
P o x viru s (tien e
e x tre m o s c e rra d o s )
B)
V irus d e la in flu en za
(R N A d e c a d e n a n e g a tiv a
s e g m e n ta d a )
V irus G em in i
(b ip a rtito ; d o s m o l c u la s
d e D N A circulares)
Fig. 1-10. La extraordinaria variedad de genomas virales.

A) Estructuracin y topologa de los genomas virales. En genomas virales de cadena nica, el RNA que se utiliza para elaborar productos protenicos
puede tener el mism o sentido que el genoma; ste, en consecuencia, es un genoma de cadena positiva ( + ) o de sentido opuesto (antisentido) al genoma
que se describe como genoma de cadena negativa ( - ) . Algunos virus RNA de cadena nica ( + ) pasan a travs de un DNA Intermedio (retrovirus) y
algunos virus DNA de cadena doble, como el de la hepatitis B, pasan a travs de una forma repllcativa de RNA. B) Genomas virales segmentados y
multipartitos. Los genomas segmentados tienen una variedad de diferentes molculas de cido nucleico que especifican mRNA monocistrnicos, como
en los virus de la influenza que tienen ocho molculas de RNA de cadena nica negativas diferentes. Los genomas multipartitos son un subgrupo de
genomas segmentados en los que cada una de las diferentes molculas est empacada en una partcula viral separada.
1.3
TRANSCRIPCIN DEL RNA Y EXPRESIN GENICA
15
M ITO C O N D R IA
- nc leo ]
D N A crom osm ico
Protenas
Transcripcin nucleares
snRNA
O tras
protenas
m itocondriales
Transcripcin
/Transcrito
prim ario
MitorRNA mRNA tRNA
Ribosomas
citoplsmicos
A
mRNA
Traduccin
RNA
tRNA citoplsm ico
pequeo
Procesam iento
postraduccional
Protenas en otros organelos + citosol
Protenas secretadas
Fig. 1-11. Expresin gnica en una clula animal.

Nota: a) Slo de manera muy ocasional, una proporcin pequea de molculas de RNA nucleares puede convertirse en forma natural en cDNA por
transcriptasas inversas codificadas viralmente y celulares y ms adelante integrarse en el DNA cromosmico en diversas localizaciones; b) la
mitocondria sintetiza su rRNA y tRNA propios y unas cuantas protenas que participan en el sistema de fosforilacin oxidativa (Ox. fos.). Sin embargo,
genes nucleares codifican a las protenas de los ribosomas mitocondriales y la mayor parte de las protenas del sistema de fosforilacin oxidativa
mitocondrial, adems de otras protenas mitocondriales, y se traducen en ribosomas citoplsmicos, antes de llevarse al interior de la mitocondria.
1 . Transcripcin. sta emplea una p o lim era sa d e RNA d irigid a
p o r DNA y tiene lugar en el ncleo de clulas eucariticas y, en

grado limitado, en mitocondrias y cloroplastos, los nicos otros
organelos que tienen capacidad gentica adems del ncleo
(vase fig. 1- 11 ).
2. Traduccin. Ocurre en los ribosomas, complejos grandes de
RNA y protenas que se encuentran en el citoplasma y asimis
mo en las mitocondrias y los cloroplastos. Las molculas de
RNA que especifican polipptidos se conocen como RNA
mensajeros (mRNA).
La expresin de la informacin gentica sigue un principio de colinearidad: la secuencia lineal de nucletidos en el DNA se descodifi
ca en grupos de tres nucletidos a la vez (trip leto s d e bases) para
obtener una secuencia lineal de nucletidos en el RNA que puede
descodificarse a su vez en grupos de tres nucletidos (codon es) para
crear una secuencia lineal de aminocidos en el producto polipptido.
En fecha reciente se aclar que las clulas eucariticas, incluidas
las de los mamferos, contienen secuencias de DNA cromosmico
no virales que codifican transcriptasas inversas celulares, como los
miembros de la familia de DNA repetido de mamferos LINE-1

(vase seccin 9.5.2). Debido a que se sabe que ciertas secuencias
de RNA no viral actan como plantillas para la sntesis de DNA ce
lular, ya no es estrictamente vlido el principio del flujo unidirec
cional de informacin gentica en las clulas.
1.3.2 En organismos complejos, slo se expresa

una fraccin pequea del DNA para formar una
protena o producto de RNA
Slo una pequea proporcin de todo el DNA en las clulas se
transcribe alguna vez. De acuerdo con sus necesidades, las diferen
tes clulas transcriben distintos segmentos de DNA (unidades de
transcripcin) que son unidades discretas, espaciadas de forma
irregular a lo largo de la secuencia de DNA. Las polimerasas de
RNA utilizan unidades de transcripcin como plantillas para sinte
tizar de manera inicial molculas de RNA de tamao equivalente
(tra n scrito sp rim a rio s) que a continuacin se modifican para ge
nerar productos de expresin maduros. Sin embargo, la gran mayo
ra del DNA celular nunca se transcribe en ninguna clula. Ms
16
CAPTULO UNO
Cuadro 1 -3 . Diferentes clases de genomas (vase fig. 1-10 para revisar ejemplos de organizacin del genoma viral)
DNA
RNA
Doble cadena
(de)
Cadena nica
(cu)
Doble cadena
(de)
Cadena nica
(cu)
Molcula circular
nica
Muchas bacterias y arc/iaea;

mitocondria, cloroplastos;
algunos virus
Ciertos virus
Muy pocos virus
Molcula lineal nica
Unas cuantas bacterias; por

ejemplo, Borrella; algunos virus
Ciertos virus
Unos cuantos virus
Ciertos virus
Molculas lineales
mltiples
Ncleos eucariticos; algunos

virus de DNA de segmentados
Ciertos virus DNA cu

segmentados
Ciertos virus RNA de

segmentados
Ciertos virus RNA cu

segmentados
Molculas circulares
mltiples
Algunas bacterias; algunos

virus bipartitos y tripartitos
Lineales y circulares
mixtas
Muy pocas bacterias; por

ejemplo, Agrobacterium
tumefaciens
an, slo una porcin del RNA elaborado mediante transcripcin

se traduce en un polipptido. Ello se debe a que:
Algunas unidades d e transcripcin especifican RNA no codificante:
el producto de RNA no codifica polipptidos como mRNA, si
no que tiene una funcin diferente. Adems del RNA ribosmico (rRNA) y el RNA de transferencia (tRNA), bien establecidos
hoy en da, se conoce una amplia variedad de RNA no codifi
cantes de diversas funciones (seccin 9.2).
El transcrito prim ario d e unidades de transcripcin que especifican
mRNA se som ete a l procesam iento de RNA. Como resultado, gran
parte de la secuencia de RNA inicial se descarta para formar un
mRNA mucho ms pequeo (seccin 1.4.1).
Slo se traduce una parte central d el mRNA maduro; secciones de
longitud variable en cada extremo del mRNA permanecen sin
traducirse (seccin 1 .5 . 1).
En clulas animales se encuentra DNA en el ncleo y las mitocondrias. Sin embargo, las mitocondrias slo tienen una fraccin muy
pequea del DNA celular total y un nmero muy limitado de ge
nes (vase seccin 9.1.2); la inmensa mayora del DNA de una c
lula se localiza en los cromosomas del ncleo.
La fraccin de DNA codificante en los genomas de eucariotas
complejas es bastante pequea. Ello resulta en considerable medi
da de la naturaleza no codificante de gran parte de la secuencia den
tro de los genes. Otra razn es que una fraccin grande del genoma
de eucariotas complejas contiene secuencias repetidas que no son
funcionales o que no se transcriben en RNA. La primera incluye
copias defectuosas de genes funcionales (seu d ogen es y fr a g m en to s
gn ico s) y DNA no codificante muy repetido.
1.3.3 Durante la transcripcin, ia informacin gentica

en algunos segm entos de DNA (genes) especifica
RNA
La sntesis de RNA se lleva a cabo mediante una polimerasa de
RNA, con DNA como plantilla y ATP, CTP, GTP y UTP como
precursores de RNA. Este ltimo se sintetiza como una cadena ais
lada y la direccin de la sntesis es 5'

3'. El alargamiento de la
cadena ocurre por la adicin del residuo monofosfato del ribonuclesido apropiado (AMP, CMP, GMP o UMP) al grupo hidroxilo
libre 3' en el extremo 3' de la cadena de RNA en crecimiento. Es
tos nucletidos se derivan al cortar un residuo pirofosfato (PP) de
los precursores de trifosfato de ribonuclesido (rNTP) apropiados.
Ello significa que el nucletido en el extremo terminal 5' (el nucle tid o in icia d or) difiere de todos los otros porque su cadena lleva
un grupo trifosfato 5'
En condiciones normales, slo una de las dos cadenas de DNA
acta como plantilla para la sntesis de RNA. Durante la transcrip
cin se desenreda el DNA de doble cadena y la cadena de DNA que
acta como plantilla para la sntesis de RNA forma un h b rid o
R N A - D N A de doble cadena transitorio con la cadena de RNA en
crecimiento. A medida que el transcrito del RNA es complementa
rio de esta cadena plantilla, el transcrito tiene la misma direccin
5' 3' y secuencia de bases (excepto porque U reemplaza a T) res
pecto de la cadena no plantilla opuesta de la doble hlice. Por esta
razn, la cadena no plantilla se conoce con frecuencia como cadena
de sentido y la cadena plantilla suele denominarse cadena de anti
sentido (fig. 1-12). Cuando se documentan las secuencias gnicas es
usual mostrar slo la secuencia de DNA de la cadena de sentido. La
orientacin de secuencias en relacin con una secuencia gnica se
llama las ms de las veces cadena de sentido. Por ejemplo, el extre
mo 5' de un gen se refiere a secuencias en el extremo 5' de la cade
na de sentido y las secuencias corriente arriba o corriente abajo
aluden a las secuencias que flanquean al gen en los extremos 5' o 3',
respectivamente, con referencia a la cadena de sentido.
En clulas eucariticas se requieren tres molculas de polimera
sa de RNA diferentes para sintetizar las distintas clases de RNA
(cuadro 1-4). La inmensa mayora de los genes celulares codifica
polipptidos y los transcribe la polimerasa II de RNA. Sin embar
go, cada vez se concede mayor importancia a los genes que codifi
can RNA como su producto maduro: hoy en da se sabe que
molculas funcionales de RNA tienen una amplia variedad de ac
ciones y se han atribuido a algunas de ellas funciones catalticas
(vase seccin 9.2.3).
i . 3 | TRANSCRIPCIN DEL RNA Y EXPRESIN GENICA
17
P ro m o to r
\J0
% ^ W
f j j r * ' f T ''
-ni- r ^
/ t \
TF
RNA
p ol.
TF
5'
f* S \
%*. J ^ L w
'^ -
<
5'
C a d e n a d e s e n tid o
3'
5'
111111111111111111111111
5 ' P P P > ....... .........i....:............-> O H 3 '

C la v e :
l i l l l l l l l l i l Enlaces de
' C a d e n a p la n tilla
hidrgeno
(= cadena de antisentido)
RNA
Fig. 1-12. El RNA se transcribe como una cadena nica que es complementaria en la secuencia de bases a una cadena (cadena en plantilla)
de un gen.
Se requieren varios factores de transcripcin (TF) para unirse a una secuencia promotora en la cercana inmediata de un gen (1), a fin de colocar y
guiar de form a subsecuente la polimerasa de RNA que transcribe el gen (2). La sntesis de la cadena se inicia con un trifosfato de nuclesido y el
alargamiento de la cadena ocurre por la adicin sucesiva de residuos de monofosfato de nuclesido proporcionados por rNTP al OH 3 . Esto significa
que el extremo 5 ' tiene un grupo trifosfato, que puede modificarse ms adelante (p. ej., mediante bloqueo [capping]; vase seccin 1.4.2) y el extremo
3 ' posee un grupo hidroxilo libre. Nota: en condiciones normales, la secuencia de RNA es idntica a la cadena de sentido del gen (excepto que U
reemplaza a T ) y complementaria en secuencia a la cadena plantilla.
1.3.4 Se requieren elementos reguladores de accin cis

y factores de transcripcin de accin trans en la
expresin gnica eucaritica
Las polimerasas de RNA eucariticas no pueden iniciar la transcrip
cin por s mismas. Por el contrario, las combinaciones de elemen
tos de secuencia corta en la cercana inmediata de un gen actan
como seales de reconocimiento para que se unan factores de
transcripcin al DNA a fin de guiar y activar la polimerasa. Mu
chas veces se rene un grupo mayor de estos elementos de secuen
cia corta corriente arriba de la secuencia de codificacin de un gen,
en donde constituyen en conjunto el p rom otor. Despus de unirse
Cuadro 1
Clase
varios factores generales de transcripcin a la regin promotora, se

une una polimerasa de RNA al complejo de factor de transcripcin y
se activa para iniciar la sntesis de RNA desde una localizacin nica.
Se dice que los factores de transcripcin tienen accin tra ns porque
los sintetizan genes localizados en posicin remota y se requieren
para migrar a sus sitios de accin. En contraste, los elementos pro
motores tienen accin cis porque su funcin est limitada al DNA
dplex en el que residen (cuadro 1-5). Los principales agrupamientos funcionales de elementos de accin cis incluyen:
Promotores. Los elementos comunes de accin cis incluyen:
TATA box, con frecuencia TATAAA o una variante, y por lo
general se encuentran en una posicin alrededor de 25 pb
Las tres clases de polimerasa de R N A eucaritica

Genes transcritos
Comentarios
28S rRNA; 18S rRNA; 5.8S rRNA
Localizado en el nuclolo. Se segmenta un transcrito primario nico (45S rRNA) para

form ar las tres clases de rRNA indicadas
Todos los genes que codifican polipptidos;

casi todos los genes snRNA
Los transcritos de polimerasa II son nicos porque estn sujetos a bloqueo (capping)
y poliadenilacin
5S rRNA; tRNA genes; U6 snRNA; 7SL RNA;

7SK RNA; 7SM RNA; SiRNA
El promotor de algunos genes transcritos por polimerasa III de RNA (p. ej., 5S rRNA,
tRNA, 7SL RNA) se halla dentro del gen (vase fig. 1-13) y en otros (p. ej., 7SK RNA)
corriente arriba
18
CAPTULO UNO
ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GENICA
Ejemplos de elementos de accin cis reconocidos por factores de transcripcin ubicuos

Elemento cis
La secuencia de DNA es idntica a

(o es una variante de)
Factores de accin trans

relacionados
Comentarios
GC box
GGGCGG
Spi
El factor Spi es ubicuo
TATA box
TATAAA
TFIID
TFIIA se une al complejo

TFIID-box TATA para
estabilizarlo
CAAT box
CCAAT
Muchos, p. e j C/EBR CTF/NF1
Familia grande de factores

de accin trans
TRE (elemento de respuesta de TPA)
GTGAGT(A/C)A
AP-1 familia, p. ej., JUN/FOS
Familia grande de factores

de accin trans
CRE (elemento de respuesta de cAMP)
GTGACGT(A/C)A(A/G)
CREB/ATF familia, p. ej., ATF-1
Genes activados en
respuesta a cAMP
corriente arriba (25) del sitio de inicio transcripcional (fig.

1-13). De manera caracterstica se encuentran en genes que
son transcritos de forma activa por la polimerasa II de RNA,
pero en un sentido restringido, esto es, en una etapa espec
fica del ciclo celular (p. ej., histonas) o en tipos especficos
de clulas (como la globina (3). La mutacin en el elemento
-100
-9 0
-8 0
-7 0
-6 0
-1 0 0 0
-9 0 0
-8 0 0
-5 0
__I_
G lo b in a -p
R e c e p to r
g lu c o c o rtic o id e
TATA no previene el inicio de la transcripcin, pero causa el

desplazamiento del punto de inicio de la transcripcin de la
posicin normal.
GC box, una variante de la secuencia consenso GGGCGG,
que se halla en una diversidad de genes, muchos de ellos ca
recen del TATA box como en el caso de los genes que cuidan
-7 0 0
-4 0
I_
-6 0 0
-5 0 0
-4 0 0
-3 0 0
1---------.---------'------- *--------- J-------------- ---------------.------- U -------------- 1----------------O
>
-1 5 0 -1 4 0 -1 3 0
H is to n a H 2 B _ _ | _______I_______I
O ct
<'
'
<
-20
-3 0
__I
-2 0 0
--------- 1-------------
^>>
__
+40
+50
+60
+70
+1
-L
-1 0 0
+1
1------------- L
-1 2 0 -1 1 0 -1 0 0
-9 0
-8 0
-7 0
-6 0
-5 0
-4 0
-3 0
I_______I_______|_______I_______|_______|_______|_______|_______|_______I
O ct
+30
-10
__|_
-2 0
I
-1 0
+1
I_______I
+80
C la v e :
TATA b o x
y
y <G Cbox
CAAT box
O ct O ctm ero
+1 S itio d e in ic io tra n s c rip c io n a l
Fig. 1-13. Los promotores eucariticos consisten en un conjunto de elementos de secuencia corta conservados, localizados a distancias
relativamente constantes desde el sitio de inicio de la transcripcin.
Las orientaciones alternativas para los elementos GC y box CAAT estn indicadas por la orientacin de la sardineta: > significa orientacin normal;
< indica orientacin inversa. El gen del receptor de glucocorticoides es poco comn porque posee 13 boxes GC corriente arriba (10 en la orientacin
normal; tres en la orientacin inversa). La polimerasa III de RNA transcribe los genes de tRNA y stos tienen un promotor bipartito interno que comprende
el elemento A (por lo general dentro de los nucletidos numerados + 8 a + 1 9 , segn el sistema de numeracin de nucletidos del tRNA estndar) y un
elemento B (casi siempre entre los nucletidos + 5 2 y + 6 2 ). A estos elementos se enlazan factores de transcripcin especficos y a continuacin guan
a la polimerasa III de RNA para iniciar la transcripcin en + 1 .
1.4 j PROCESAMIENTO DEL RNA_ 19
la casa (seccin 1.3.5). Aunque la secuencia GC box es asi

mtrica, al parecer funciona en cualquier orientacin (vase
fig. 1-13).
CAAT box se localiza con frecuencia en la posicin -80. Por
lo regular es el determinante ms potente de la eficiencia del
promotor. Al igual que GC box, es capaz al parecer de fun
cionar en cualquier orientacin (fig. 1-13).
Adems de los anteriores se sabe que los factores de transcripcin
restringidos a tejido identifican ms elementos de reconocimiento
especficos (vase cuadro 10-3).
Los intensificadores incluyen a grupos de elementos de secuen
cia corta de accin cis, que pueden intensificar la actividad
transcripcional de genes eucariticos especficos. Sin embargo,
a diferencia de los elementos promotores cuyas posiciones res
pecto del sitio de inicio transcripcional son relativamente cons
tantes (fig. 1-13), los intensificadores se localizan a una distancia
variable, y a menudo considerable, del sitio de inicio transcripcio
nal y su funcin es independiente de su orientacin. Al parecer,
enlazan protenas reguladoras de gen y, de manera subsecuente, el
DNA entre el promotor y el intensificador forma un asa, que
permite que se unan protenas al intensificador para interactuar
con los factores de transcripcin enlazados al promotor, o con
la polimerasa de RNA.
Los silenciadores son elementos reguladores con propiedades
similares a las de los intensificadores, pero inhiben la actividad
transcripcional de genes especficos.
1.3.5 La expresin gnica especfica de tejido incluye la

activacin selectiva de genes especficos
El contenido de DNA de un tipo especfico de clula eucariota, por
ejemplo un miocito, es virtualmente idntico al de un linfocito,
una clula heptica o cualquier otro tipo de clulas nucleadas del
mismo microorganismo. El hecho que distingue a los diferentes ti
pos de clulas es que en una clula determinada slo se expresa en
grado significativo una proporcin de los genes y el catlogo de genes
expresados vara entre diferentes tipos d e clulas. En algunas clulas,
en particular las cerebrales, se expresa un gran nmero de genes di
ferentes; en muchos otros tipos de clulas, una fraccin grande del
gen es inactiva en sentido transcripcional.
Desde luego, los genes que se expresan son los que definen las
funciones de la clula. Algunas de ellas son funciones celulares gene
rales y se especifican por los llamados genes que cuidan la casa (p.
ej., genes que codifican histonas, protenas ribosmicas, etc.). Otras
funciones pueden restringirse en gran parte a tipos particulares de te
jidos o clulas (expresin gnica especfica de tejido). Sin embar
go, cabe sealar que incluso en el caso de genes que muestran una
gran especificidad de expresin tisular, algunos transcritos gnicos
pueden estar representados a niveles muy bajos en todos los tipos de
clulas.
La distincin entre regiones de DNA activas en sentido trans
cripcional e inactivas en una clula se refleja en la estructura de la
cromatina vinculada:
La cro m a tin a in a ctiv a d esd e e l p u n to d e vista tra n scrip cio
n a l suele adoptar una conformacin muy condensada y con fre
cuencia se relaciona con regiones del genoma que se someten a
una replicacin tarda durante la fase S del ciclo celular. Esto se
vincula con el enlace estrecho por la molcula H 1 de histona.
La cro m a tin a a ctiv a en sen tid o tra n scrip cio n a l adopta una
conformacin ms abierta y muchas veces se replica temprano
en la fase S. Se caracteriza por el enlace relativamente dbil por
molculas H1 de histona y acetilacin extensa de los cuatro ti
pos de histonas nucleosmicas (es decir, histonas H2A, H2B,
H3 y H4; vase seccin 10.2.1).
De modo adicional, las regiones promotoras de los genes de verte
brados suelen caracterizarse por la ausencia de citosinas metiladas
(vase ms adelante). Los factores de transcripcin pueden mostrar
nucleosomas y por consiguiente es posible distinguir por medios
experimentales la conformacin abierta de la cromatina activa en
sentido transcripcional, porque ello tambin permite el acceso a
nucleasas: a concentraciones muy bajas, la enzima desoxirribonucleasa I (DN-asa I) digiere regiones largas de DNA sin nucleosoma.
Aunque las regiones reguladoras pueden contener varias protenas
de unin especficas de secuencia, la estructura de la cromatina
abierta se caracteriza por la presencia de sitio s h ip ersen sib les a
DN-asa /(vase seccin 10.5.2).
1.4
Procesam iento del RNA
El transcrito de RNA de la mayor parte de los genes eucariticos se

somete a una serie de reacciones de procesamiento. Con frecuencia
incluyen la eliminacin de segmentos internos indeseables y la nue
va unin de los segmentos restantes (RNA sp licin g, corte y unin).
Adems, en los transcritos de polimerasa II de RNA se aade una
unin nucletida especializada (7-trifo sfa to d e m etilgu an osin d) al
extremo 5' del transcrito primario (capping, recubrimiento de blo
queo) y se aaden de modo secuencial residuos de adenilato (AMP)
al extremo 3' de mRNA para formar una cola poli-(A) (p o lia d en ilaciri).
1.4.1 El corte y unin (splicing) del RNA elimina

secuencias de RNA no esenciales del transcrito
primario
La secuencia lineal de una unidad de transcripcin rige la sntesis
de un producto de expresin correspondientemente lineal, sea un
polipptido o un RNA no codificante maduro. Sin embargo, en la
mayor parte de los genes de vertebrados se ha interpretado que s
lo una porcin pequea de la secuencia del gen proporciona el pro
ducto final. Por el contrario, en la gran mayora de los genes que
codifican polipptidos, y muchos de los genes que especifican RNA
no codificante, la informacin gentica se halla en segmentos (exones) separados por secuencias intermedias que no contribuyen con
informacin gentica que se utiliza para sintetizar el producto final
(intrones).
El fenmeno de transcripcin inicial incluye la produccin de
una secuencia de RNA complementaria a la longitud total del gen,
el llamado tra n scrito p rim a rio . En genes que contienen mltiples
exones, el transcrito primario posee secuencias complementarias
para los exones y los intrones que incluye el gen. Sin embargo, ms
adelante, el transcrito de RNA se somete a splicing de RNA, una
serie de reacciones de procesamiento mediante las cuales se cortan
y descartan segmentos de RNA intrnicos y se unen los tramos de
RNA exnicos extremo con extremo (spliced) para obtener un pro
ducto de RNA ms corto (fig. 1-14). El splicing (corte y unin) de
RNA requiere que se reconozcan las secuencias de nucletidos en
20
CAPTULO UNO
ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GENICA
Las reacciones anteriores las media un complejo RNA-protena

grande, el spliceosoma, que consiste en cinco tipos de snRNA (del
ingls sm all nuclear RNA, RNA nuclear pequeo) y ms de 50 pro
tenas (vase Staley y Guthrie, 1998; Hastings y Krainer, 2001).
Cada una de las molculas de snRNA est unida a las protenas es
pecficas para formar partculas snRNP y la especificidad de la
reaccin de splicing se establece por el pareamiento (formacin de
pares) de bases RNA-RNA entre el transcrito de RNA y las mo
lculas de snRNA. Hay dos tipos de spliceosoma:
los lmites del exn/intrn (uniones de splice). En la inmensa ma

yora de los casos, los intrones comienzan con GT (o GU a nivel
del RNA) y el extremo con AG (regla GT-AG; vase fig. 1-15).
Aunque los dinucletidos GT (GU) y AG conservados tienen una
importancia crucial para el splicing, no son suficientes por s mismos
para sealar la presencia de un intrn. Comparaciones de secuen
cias comprobadas revelaron que las secuencias inmediatamente ad
yacentes a los dinucletidos GT y AG tambin muestran un grado
considerable de conservacin (fig. 1-15). Una tercera secuencia intrnica conservada que es esencial desde el punto de vista funcio
nal en el splicing es el llamado sitio de ramificacin, que suele estar
localizado muy cerca d el extremo del intrn, cuando mucho 40 nucletidos antes del dinucletido AG terminal (fig. 1-15). Adems,
algunas otras secuencias exnicas e intrnicas tienen efectos positi
vos (secuencias in ten sifica d o ra s d e splice) o efectos negativos (se
cuencias silen cia d o ra s d e sp lice) en el sp licin gy las mutaciones en
esas secuencias pueden ser patognicas (seccin 1 1.4.3).
El mecanismo de splicing (corte y unin) comprende las secuen
cias siguientes:
El spliceosoma mayor (GU-AG) procesa intrones GT-AG tpi

cos. En la inmensa mayora de intrones en genes que codifican
polipptidos, las cinco especies de snRNA son snRNA U l, U2,
U4, U5 y U 6 . La terminal 5' del snRNA U l tiene una secuen
cia UACUUAC cuya base forma pares con el consenso donador
de splice (GUAAGUA). Despus de enlazarse la snRNP U l, el
snRNA U2 reconoce el sitio de ramificacin por una reaccin
similar de pareamiento de bases y, de manera subsecuente, la in
teraccin entre snRNP U l y snRNP U2 acerca entre s las dos
uniones de splice. Ms adelante, una partcula multi-snRNP
que contiene snRNA U4, U5 y U 6 se vincula con el complejo
snRNP U1-U2 (fig. 1-16B).
Corte en la unin de splice 5'

Ataque nucleoflico por el nucletido G terminal del sitio do
nador del splice en la invariante A del sitio de ramificacin para
crear una estructura en forma de lazo.
Spliceosoma menor (AU-AC). ste procesa una clase rara de

intrones, que se conocen como intrones AT-AC porque los di
nucletidos 5' GT y 3' AG conservados son reemplazados por
AT y AC, respectivamente. En este caso, snRNA U ll y U12
sustituyen a U l y U2 (vase Tarn y Steitz, 1997).
Corte en el sitio de splice 3', que da lugar a la liberacin del

RNA intrnico como un lazo y splicing de segmentos exnicos
de RNA (fig. 1-16A).
Unidad de transcripcin
P ro m o to r
Exn 1
Exn 2
Intrn 1
Intrn 2 Exn 3
G en
E2
E1
>E3
T ra n s c rito d e
R N A p rim a rio
Segmentacin en :
GU AG
- D e s c a r ta r
E3
E2
C o r te y u n i n
/ /
// // //
// / ' / '
E2
E3 /
R N A m a d u ro
Fig. 1-14. El splicing de RNA incluye el corte endonucleoltico y la eliminacin de segmentos de RNA intrnicos y splicing (unin) de segmentos
de RNA exnicos.
1.4 | PROCESAMIENTO DEL RNA
S itio d o n a d o r d e
c o rte y unin
S itio d e
ra m ific a c i n
ag
A
21
Sitio
splice a c e p to r
_ t A . x
\ \
T..CTA .C
C C CC C CCCCCCMC Ar
G T G A G T .......................... ............................................... C T C G
T ................................... T T T T T T T T T T T N T A G
Ex n
1 0 s a > 1 0 0 0 0 n u c le tid o s *
< 20 n u c le tid o s1-
Exn
Fig. 1-15. Secuencias de consenso a nivel del DNA para el splice (corte) donador y el splice (unin) del aceptor y sitios de ramificacin en
los Intrones de eucariotas complejos.
Los nucletidos que se destacan son casi Invariables (nota: existen asimismo intrones AT-AC raros, en los que el dinucletido GT splice donador
conservado se reemplaza por AT y en los que el dinucletido AG splice aceptor conservado se sustituye con AC; vase texto). Otros nucletidos
representan la mayor parte de los nucletidos que se encuentran en esta posicin particular, o el equivalente entre dos nucletidos, por ejemplo entre C
y T en la via de poiipirimidina adyacente al extremo 3 ' del intrn. Los elementos tpicos preferidos para el splice donador, el sitio de ramificacin y el
splice aceptor en especies Individuales (Incluidos los humanos, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans y Saccharomyces cerevisiae) se
encuentran en una lista de Lim y Burge (2001). Se sabe que algunas otras secuencias exnicas e ntrnicas regulan el corte y la unin (splicing)
Incluidas las secuencias splice intensificadoras y silenciadoras (vase Berget y cois., 1995). Vase asimismo Fairbrother y cois. (2002) para las
secuencias consenso y la secuencias splicing Intensificadoras exnicas.
B)
A)
S plice
j
donador
_ ... .
S plice
S itio d e
.
...
. . a c e p to r c<3
_________ra m ific a c i n ic i
A
AG
____
Splice
donador
S itio d e
Splice
ra m ific a c i n
E2
A
A G M M
.OH
1. SnRNP U1 se enlaza al sitio splice donador
2. SnRNP U2 se enlaza al sitio de ramificacin
1. Corte en el extremo 5' (s)
2. El ataque nucleoflico ( v _ . ) tiene como
resultado la formacin de un lazo
E2
is m
X W
L a zo
E2
E1
AG
la r
Enlace de U 4/U 5/U 6
Complejo SnRNP; SnRNP U5
se enlaza al splice donador + aceptor
1. Corte en el extremo 3'

2. Ligadura de exones
E1
E2
Fig. 1-16. Mecanismo de splicing (corte y unin) de RNA (intrones GU-AG).

A) Mecanismos. Vase la figura 1-15 para hallar una descripcin de las secuencias de consenso de splice donador, splice aceptor y sitio de ramifica
cin. El ataque nucleoflico incluye el grupo de hidroxilo 2 ' fijado al A conservado en el sitio de ramificacin y el G del GU conservado al inicio del intrn
y que tiene por resultado un enlace covalente nuevo que une estos dos nucletidos para form ar una estructura ramificada (lazo).
B) Sitio de las snRNP. Las partculas de ribonucleoprotena nucleares pequeas (snRNP) son parte del spllceosoma. snRNA U1 tiene una secuencia C
terminal complementaria al consenso del splice donador y se unen a l mediante el pareamiento de bases RNA-RNA. Despus del enlace de snRNP U1,
snRNA U2 reconoce el sitio de ramificacin por una reaccin de pareamiento de bases similar. Se estabilizan la interaccin entre las uniones splice do
rador y splice aceptor mediante el enlace subsecuente de una partcula multi-snRNP preformada, que contiene snRNA U4, U5 y U6, y el snRNP U5 es
capaz de unirse de manera simultnea al splice donador y el splice aceptor.
22 | CAPTULO UNO | ESTRUCTURA DEL DNA Y EXPRESIN GNICA
El spliceosoma, si se lo representa de forma mental, acta en una

forma procesal: una vez que se reconoce un sitio de splice 5 ', busca
la secuencia de RNA hasta que encuentra el siguiente sitio de spli
ce 3 ' (que se sealara como un blanco por la secuencia de consen
so del sitio de ramificacin localizado justo antes de l). Sin
embargo, el orden en que se eliminan las secuencias intrnicas y se
unen (sp liced) sus secuencias exnicas de flanqueo no est regido
por su patrn lineal en el transcrito de RNA; por el contrario, se
piensa que la conformacin del RNA influye en la accesibilidad de
los sitios de splice 5'.
1.4.2 Se aaden nucletidos especializados a los

extremos 5' y 3' de la mayor parte de los
transcritos de polimerasa II de RNA
Adems del corte y unin (splicing) de RNA, los transcritos de po
limerasa II de RNA se someten a dos fenmenos de procesamien
to del RNA adicionales:
Bloqueo (capping)
Ocurre poco despus de la transcripcin. En el caso de transcritos
primarios que se procesan para obtener mRNA, se une un nucle
sido metilado, 7-metilguanosina (m7G), al primer nucletido 5'

del transcrito de RNA por un enlace fosfodister 5'-5' especial. A
medida que este enlace establece un puente efectivo del carbono 5'
del residuo m7G al carbono 5' del primer nucletido, se dice que el
extremo 5' est bloqueado o capped (fig. 1-17). Los transcritos de
los genes snRNA tambin estn capped, pero sus bloqueos (caps)
pueden sufrir una modificacin adicional. Por lo general se consi
dera que el bloqueo (cap) tiene varias posibles funciones:
Proteger al transcrito del ataque de exonucleasa S'-*3' (las mo
lculas de mRNA que no se bloquean [decapped\ se degradan
con rapidez).
Facilitar el transporte del ncleo al citoplasma.
Promover el splicing de RNA.
Tener una funcin esencial en la fijacin de la subunidad 40S de
los ribosomas citoplsmicos al mRNA (vase ms adelante).
Poliadenilacin
Se sabe que la transcripcin por la polimerasa I de RNA y la III se
detiene una vez que la enzima reconoce un sitio de terminacin de
transcripcin especfico. Sin embargo, es difcil identificar los posi
bles sitios de terminacin de la transcripcin mediante polimerasa
OH OH
2'|___ 3'
A
mG
4'
s'ch 2:
l S
o I
O
5'CH2
O
5
[P1
4w r
5'CH2
0\
3i r
O
0
1
OH
P rd id a d e y -fo s fa to
O , ED
5'CH.
OH
U nin trifo s fa to
5-5'
A d ic i n d e G M P
w
0
M e tila c i n del to m o d e n itr g e n o 7 d e

G a g re g a d o y d e l c a rb o n o 2 ' d e la
rib o s a d e l n u c le tid o a d y a c e n te
(y d e su a d ju n to en v e rte b ra d o s )
[Pu]
o
ch3
o
5'CH,
S]
W
CHa
Fig. 1-17. El extremo 5 ' de las molculas de mRNA eucarticas est protegido (bloqueado) por un nucletido especializado (capping).
Despus de eliminarse el fosfato gamma original del nucletido terminal 5 ', un precursor GTP proporciona un nuevo residuo GMP que forma una
unin especializada 5 - 5 ' trifosfato con lo que era el nucletido terminal 5 '. Reacciones posteriores conducen a la metilacin del tomo de nitrgeno
7 de la terminal G y, en vertebrados, del tomo de carbono 2 ' de la ribosa de cada uno de los dos nucletidos adyacentes. N, cualquier nucletido;
Pu, purina.
1.5 | TRADUCCIN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS [ 23
S itio d e ad ic i n
S e ale s
p o li-(A )
c o rrie n te ab ajo ?
S itio d e inicio
d e tra n s c rip c i n
=t
i
5 ' m 7G p p p
5 ' m 7G p p p
5 ' m 7G p p p
AATAAA
TTA TTT
T ran scrip ci n
AAUAAA
i
i
3'
C o rte
AAUAAA
3'
A d ic i n
d e poli-(A )
AAUAAA
A A A A A A A - -A A A -O H 3 '
N u c le tid o s
1 5 -3 0
Fig. 1-18. El extremo 3' de la mayor parte de las molculas de mRNA eucariticas se poliadenila.
El extremo de la transcripcin de transcritos de polimerasa II de RNA est indicado por un corte 3 ' en el RNA transcrito. En casi todas las especies de
mRNA, esto se logra por una seal corriente arriba AAUAAA en conjunto con seales corriente abajo no identificadas, hasta la fecha. En condiciones
normales, la segmentacin ocurre alrededor de 15 a 30 nucletidos corriente abajo del elemento AAUAAA y despus se aaden residuos a AMP por la
polimerasa poli-(A) para form ar una cola poli-(A). El mRNa de histona sufre una reaccin de corte 3 ' diferente (vase texto).
de RNA porque los extremos 3' de las molculas de mRNA estn

determinados por una reaccin de segmentacin postranscripcional.
La secuencia AAUAAA (o en ocasiones la variante AUUAAA,) es una
secuencia de seal de poliadenilacin mayor que seala el corte de
3' para la inmensa mayora de los transcritos de polimerasa I I (los
transcritos de genes de histona y genes snRNA son excepciones notables).
El corte sucede en un sitio especfico localizado 15 a 30 nucletidos
corriente abajo del elemento AAUAAA (fig. 1-18).
El transcrito primario puede continuar cientos o miles de nu
cletidos ms all del punto de corte hasta que tiene lugar la termi
nacin en uno de varios sitios posteriores. Una vez que se observ
el corte corriente abajo del elemento AAUAAA, en clulas de ma
mferos, la enzima polimerasa poli-(A) aade de modo secuencial
alrededor de 200 residuos de adenilato (es decir, AMP) para formar
una cola poli-(A). A menudo se piensa que la cola poli-(A) tiene
varias funciones posibles:
En los genes de histona, los cuales son nicos en la produccin de

mRNA que no se poliadenila, la terminacin de la transcripcin in
cluye asimismo el corte 3' del transcrito primario. Esta reaccin de
pende de la estructura secundaria en el transcrito de RNA, incluida
una secuencia en horquilla corriente arriba conservada y una se
cuencia corriente abajo corta con pares de bases en el extremo 5
del snRNA U7.
Facilitar el transporte de las molculas de mRNA al citoplasma.
Despus del procesamiento postranscripcional, el mRNA transcri

to de los genes en el DNA nuclear migra al citoplasma. En este si
tio, se une con ribosomas y otros componentes para dirigir la
sntesis de polipptidos especficos. Las mitocondrias tambin tie
nen ribosomas y una capacidad limitada para sintetizar protenas
(vase seccin 9.1.2).
Slo el segmento central de una molcula de mRNA eucaritica tpica se traduce para especificar la sntesis de un polipptido.
Las secuencias de flanqueo, regiones 5' y 3' no traducidas (RNT
II
Estabilizar cuando menos algunas de las molculas de mRNA

en el citoplasma [el acortamiento de las vas poli-(A) se acom
paa de degradacin del mRNA, pero algunas especies de mRNA (p. ej., mRNA de actina), continan estables sin poli-(A) o
muy poca].
Promover la traduccin y mejorar el reconocimiento del mRNA
por la maquinaria ribosmica.
1.5
Traduccin, procesamiento
poslraduccional y estructura
de ias protenas
1.5.1 Durante la traduccin se descodifica el mRNA

en los ribosomas para especificar la sntesis de
polipptidos
24
CAPTULO UNO
Exn 1
Intrn 1
Exon 2
Intrn 2
Exn 3
Fig. 1-19. Expresin del gen de globina p humana.

Los exones 1 y 3 contienen cada uno secuencias no codificantes (barras sombreadas) en sus extremidades, que se transcriben y se encuentran en los
extremos 5 ' y 3 ' del mRNA de la globina p, pero no se traducen para especificar sntesis polipeptdica. Sin embargo, se piensa que estas regiones 5 ' y
3 ' no traducidas (RNT 5' y RNT 3 ') son importantes para asegurar la gran eficiencia de la traduccin (vase texto). El codn de detencin UAA
representa los tres primeros nucletidos de la regin no traducida 3 '. Obsrvese que el producto inicial de la traduccin tiene 147 aminocidos, pero
que se elimina la metionina N terminal por el procesamiento postraduccional para producir el polipptido maduro globina p. El exn 1 codifica las dos
primeras bases del codn que especifican Arg30 y el exn 2 la tercera base (es decir, el intrn 1 separa las bases segunda y tercera del codn, un
ejemplo de un intrn de lase 2; vase recuadro 12-2). El segundo intrn separa los codones 104 y 105 y es un ejemplo de un intrn de fase 0; vase
el recuadro 12-2 y asimismo la figura 1-23 para hallar un ejemplo de intrn de fase 1.
5'; RNT 3') se transcriben a partir de los exones terminales 5' y 3'
y, al igual que el cap 5' y la poli-(A) cola 3, contribuyen al enlazamiento y la estabilizacin del mRNA en los ribosomas en donde
ocurre la traduccin del segmento central (fig. 1-19).
Los ribosomas son complejos de RNA y protenas grandes que
poseen dos subunidades. En eucariotas, los ribosomas citoplsmicos tienen una subunidad 60S grande y una subunidad 40S pequea
(los valores S son una medida de la rapidez con que se sedimentan
las estructuras moleculares grandes en la ultracentrifugacin y de
penden de la masa y la forma molecular). La subunidad 60S con
tiene tres tipos de molculas de rRNA: 28S rRNA, 5.8S rRNA y 5S
rRNA y alrededor de 50 protenas ribosmicas. La subunidad
40S incluye un 18S rRNA aislado y ms de 30 protenas ribosmi
cas. Los ribosomas proporcionan un marco estructural para la sn
tesis de polipptidos en la que los componentes de RNA se encargan, de
modo predominante, de la funcin cataltica del ribosoma; se piensa que
los componentes protenicos aumentan la funcin de las molculas
de rRNA y en apariencia un nmero sorprendente de ellos no pa
rece esencial para la funcin del ribosoma.
El ensamble de un nuevo polipptido a partir de sus aminoci
dos constituyentes est regido por un cdigo gentico de triple
tos. Se descodifican de manera secuencial grupos sucesivos de tres

nucletidos (codones) en la secuencia lineal del mRNA a fin de es
pecificar aminocidos individuales. El proceso de descodificacin
recibe la mediacin de un conjunto de molculas del tRNA, a ca
da una de las cuales se enlaza de modo covalente un aminocido es
pecfico (en el grupo hidroxilo 3' libre del tRNA, vase fig. 1-20),
por accin de una sintetasa de aminoacilo de tRNA.
Distintas molculas de tRNA enlazan diferentes aminocidos.
Cada tRNA tiene una secuencia trinucletida especfica, llamada
anticodn, en un sitio crucial localizado en el centro de un brazo
del tRNA (fig. 1-7B). Este sitio proporciona la especificidad nece
saria para interpretar el cdigo gentico: a fin de que se inserte un
aminocido en la cadena polipeptdica en crecimiento, debe reco
nocerse el codn importante de la molcula de mRNA mediante el
pareamiento de bases con un anticodn complementario adecuado
de la molcula de tRNA apropiada (fig. 1-20).
Un modelo de traduccin supone que la subunidad ribosmica
40S reconoce al principio el cap 5' a travs de la participacin de
protenas que se unen de modo especfico a este ltimo. A conti
nuacin explora a lo largo del mRNA hasta que encuentra el codn
de inicio, que casi siempre es metionina de especificacin AUG (se
1.5
5'
TRADUCCIN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS
AUG
A G G ----------C U C
25
A U G ---------- A U G ------------------U G G ---------^ ---------3'
t
t
ACC
Term inal N
M e t-
AT
A r g ------------ Leu
Trp
o= P - 0
C H ,?
S
CH
CH,
n2
NH,
I
c
I
OH
Fig. 1-20. El cdigo gentico se descifra por el reconocimiento codn-anticodn.

La secuencia de nucletidos en la secuencia del mRNA se interpreta a partir de un punto de inicio traduccional (casi siempre indicado por la secuencia
AUG) y contina en la direccin 5 ' - 3 ' hasta llegar a un codn de detencin en ese marco de lectura. La secuencia anticodn complementaria de una
molcula de tRNA reconoce cada codn en el mRNA; a ella se enlaza de modo covalente un aminocido especfico de la adenosina en el extremo 3'
(vase inserto).
conocen unos cuantos casos en los que se utilizan, en lugar de l,

ACG, CUG o GUG). Por lo general, el primer AUG que se halla
es el codn de inicio. Sin embargo, el AUG se reconoce con eficien
cia como un codn de inicio slo cuando est incluido en una se
cu en cia d e recon o cim ien to d e l co d n d e in icio adecuada y la
ptima es la secuencia: GCCPuCCAUGG. Los determinantes ms
importantes en esta secuencia son los G despus del codn AUG y
la purina (Pu), de preferencia A, a la que precede por tres nucleti
dos (Kozak, 1996). Con posterioridad, se incorporan aminocidos
sucesivos en la cadena polipeptdica en crecimiento mediante una
reaccin de condensacin: el grupo amino del aminocido que in
gresa reacciona con el grupo carboxilo del ltimo aminocido por
incorporar y el resultado es un enlace peptdico entre residuos su
cesivos (fig. 1-21). Esto sufre catlisis de la actividad de la transferasa de peptidil que reside en el componente RNA de la subunidad
ribosmica grande.
nocido en promedio; empero, en algunos aminocidos, por ejem

plo leucina y serina, hasta seis codones intervienen en la especifica
cin, en tanto que otros estn representados de manera mucho ms
escasa (fig. 1-22 ).
H
HN-
II
c - - C OH
A
R,
L
h 2n
II
c c
OH
1.5.2 El cdigo gentico se degenera, no es un cdigo

universal
E n la ce p e p td ic o
El gentico es un cdigo de tres letras. Hay cuatro posibles bases a

elegir de cada una de las tres posiciones de bases en un codn. Por
consiguiente, hay (4)3 = 64 posibles codones, pero slo 20 tipos
mayores de aminocidos. Como resultado, el cdigo gentico es
d egen era tivo: unos tres codones diferentes especifican a cada ami
Fig. 1-21. Los polipptidos se sintetizan por la formacin de enlaces

pptidos entre aminocidos sucesivos.
26 | CAPTULO UNO
AAA]
Lis
AAGJ
AAC1
Asn
AAUJ
CAA
CAG
CAC
CAU
ACA
ACG
ACC
ACU
CCA
CCG
CCC
CCU
Tre
} G|n q g }
G
IS}D
ETEN
C
I
N
His
GAC1 .
G A U J A sp
U A C } _.
UAUJ
Pro
GCA1
GCG
A la
GCC
GCUJ
UCA]
u c g L
UCC |
UCUJ
(DETENCIN (N)
U G A IT r p (M )
U G G T rp
A G A lf A r g ( N )
CGA
A G G J [DETENCIN (M )C G G
A rg
AGC1
CGC
S er
AGUJ
CGU
file (N)
A U A iM e t ( M )
CUA]
CUG
AUG
M et
Leu
AUCl
CUC
lie
AUUJ
CUUJ
GGA]
GGG
Gli
GGC
GGUJ
GUA
GUG
GUC
GUU
Val
UGC1<
>Cis
UGU J
UUA]
Leu
UUGJ
UUC1
Fen
UUUJ
Fig. 1-22. Los cdigos genticos nuclear y mitocondrial son

similares pero no idnticos.
Los cuatro codones (se muestran en rojo) se interpretan de manera
diferente en el ncleo y las mitocondrias de las clulas de mamferos;
la interpretacin mitocondrial se indica en verde. Por consiguiente, el
cdigo mitocondrial tiene cuatro codones de detencin en lugar de tres
(UAA, UAG, AGA, AGG), dos codones Trp en vez de uno (UGA, UGG),
cuatro codones Arg en lugar de seis (CGA, CGC, CGG, CGU), dos
codones Met en vez de uno (AUA, AUG) y dos codones lie en lugar de
tres (AUC, AUU). Notas: a) la degeneracin del cdigo gentico incluye
con mayor frecuencia la tercera base del codn. En ocasiones puede
sustituirse cualquier base (GGN = glicina, CCN = prolina, etc.; N es
cualquier base). En otros casos lo hace cualquier purina (Pu) o
pirimidina (Pi) (AAPu = lisina, AAPi = asparagina, etc.); b ) las seales
en algunos mRNA pueden conducir a interpretaciones alternativas de
codones de detencin, de tal manera que UGA puede especificar un
21 aminocido, selenocisteina, y UAG glutamina o un 22 aminocido,
p irro lisin a (Atklns y Gesteland, 2002).
Aunque hay 64 codones, es menor el nmero correspondiente

de molculas de tRNA con diferentes anticodones: 30 tipos de tR
NA citoplsmico y slo 22 tipos de tRNA mitocondrial. Es posible
interpretar todos los 64 codones en ribosomas citoplsmicos y mitocondriales, dado que las reglas normales de pareamiento de bases
se relajan cuando llegan al reconocimiento del codn-anticodn.
La hiptesis de bamboleo indica que el pareamiento de codn y
anticodn sigue las reglas normales A-U y G-C para las dos prime
ras posiciones de bases en un codn, pero que tiene lugar un bam
boleo excepcional en la tercera posicin y que tambin pueden
utilizarse pares de bases GU (vase cuadro 1-6).
Es usual describir el cdigo gentico como un c d ig o un iversal,
lo que significa que se utiliza el mismo cdigo en todas las formas
de vida. Esto no es cierto en sentido estricto por la interpretacin
alternativa de codones debido a:
^ La d iv erg en cia ev o lu tiva d e c d igo s g e n tico s d e organ elos.
Las mitocondrias y los cloroplastos tambin tienen capacidad
para sintetizar protenas, aunque limitada. Durante la evolu
cin, estos organelos adoptaron cdigos genticos algo diferen
tes respecto de los que se usan en los genes nucleares. Por
consiguiente, por ejemplo, contina la traduccin de mRNA de
Cuadro 1 -6 . El par codn-anticodn admite pares de bases

relajadas (bamboleantes) en la posicin tercera base de
codones
Base en el extremo 5'
del anticodn tRNA
Base reconocida en el
extremo 3' del codn mRNA
U slo
G slo
G (o 1)*
CoU
AoG
*1, inosina, una forma de adenina modificada de forma postraduccional. Vase el

recuadro 9-4 para mayores detalles del reconocimiento de inosina y codn-anticodn dei tRNA citoplsmico.
codificacin nuclear hasta que se encuentra un codn de ter

minacin, que es una de tres posibilidades -UAA, UAG, UGA,
en tanto que en las mitocondrias de mamferos hay cuatro po
sibilidades: UAA, UAG, AGA y AGG; vase figura 1-22.
N ueva d efin ici n d e cod on es d ep en d ien te d e l contexto. Las se
ales en algunos mRNA, incluidos unos cuantos tipos de mRNA
de codificacin nuclear, conducen a la nueva definicin (redefini
cin) de algunos codones. Por ejemplo, en una gran variedad de
clulas (incluidas las humanas), algunos mRNA de codificacin
nuclear pueden interpretar de forma alternativa el mRNA como
un 21 aminocido, la selen ocisteina, e interpretarse de forma al
ternativa UAG o glutamina (vase Atkins y Gesteland, 2002).
Por consiguiente, la estructura bsica del producto primario de la
traduccin tiene en un extremo una metionina con un grupo amino libre (el extremo N terminal) y en el otro un aminocido con
un grupo carboxilo libre (el extremo C terminal). Cabe sealar que
aunque los codones se traducen en un marco de lectura traduccional especfico, en ocasiones se encuentran en eucariotas genes
superpuestos, en los que se utilizan marcos de lectura traduccional
diferentes (vase para un ejemplo la fig. 9 -3 ).
El paso predominante en el control de la traduccin es el enla
ce ribosmico. Adems del cap 5, la RNT 5' (con frecuencia <
200 pb) y la RNT 3 ' (por lo general mucho ms larga que la RNT
5') tienen acciones crticas en la incorporacin del mRNA para tra
duccin. Se han caracterizado varios elementos de accin cis que
participan en este proceso y, adems, identificado unos cuantos fac
tores de accin trans que se enlazan a estos elementos. Es posible
que interacten las secuencias de RNT 5' y 3' para mejorar la tra
duccin. La RNT 3 tiene un sitio fundamental en la regulacin de
la traduccin y en esta regin se encontraron seales para controlar
la traduccin, la estabilidad y la localizacin del mRNA (vase
Wickens y cois., 1997; vase asimismo seccin 10 .2 .6 ).
1.5.3 Las modificaciones postraduccionales incluyen

modificaciones qumicas de ciertos aminocidos y
segmentacin polipeptdica
Con frecuencia, los productos primarios de la traduccin sufren
una diversidad de reacciones de modificacin que incluyen la adi
cin de grupos qumicos que se fijan de manera covalente a la ca
dena polipeptdica en los niveles de traduccin y postraduccional.
1.5 | TRADUCCIN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTENAS | 27
Ello puede incluir una modificacin qumica simple (hidroxilacin, fosforilacin, etc.) de las cadenas laterales de aminocidos
nicos o la adicin de diferentes tipos de grupos de carbohidratos
o de lpidos (vase cuadro 1-7).
Modificacin de protenas por la adicin de grupos

carbohidrato
Las glucoprotenas contienen oligosacridos que estn fijados de
manera covalente a las cadenas laterales de ciertos aminocidos. Po
cas protenas en el citosol estn glucosiladas, es decir, que tienen un
carbohidrato unido y estas ltimas llevan un residuo de azcar ni
co, iV-acetilglucosamina, unido de forma covalente a un residuo de
serina o treonina. En contraste, las protenas que se secretan de las
clulas o se llevan a lisosomas, el aparato de Golgi o la membrana
plasmtica son glucosiladas. Los componentes oligosacridos de las
glucoprotenas son preformados en gran parte y se aaden en blo
que a polipptidos. Se reconocen dos tipos principales de glucosilacin:
Glucosilacin N: incluye, en casi todos los casos, la transferen
cia de una secuencia oligosacrida comn al grupo NH2 de la
cadena lateral de un residuo de asparagina dentro del retculo
endoplsmico (RE; vase cuadro 1-7). En el aparato de Golgi
sucede el recorte subsecuente de residuos y su restitucin con
diferentes monosacridos.
Cuadro 1
Glucosilacin O: vase cuadro 1-7.

Los proteoglucanos son protenas con glucosam inoglucanos unidos
que suelen contener unidades disacridas repetidas que incluyen
glucosamina o galactosamina. Los proteoglucanos mejor caracteri
zados son componentes de la matriz extracelular.
Modificacin de protenas por la adicin de grupos lpidos

Algunas protenas, en especial las de la membrana, se modifican
por la adicin de grupos grasos acilo o prenilo, que tpicamente sir
ven como fijadores de membrana. Los ejemplos de grupos grasos
acilo incluyen el grupo miristoilo, un lpido C 14 fijado a un resi
duo de glicina en el extremo N terminal que permite que la prote
na modificada interacte con un receptor de membrana o la bicapa
lipdica de la membrana. Otro grupo graso acilo que sirve como un
fijador de membrana es el grupo palmitoilo C ^, que se fija al to
mo S de residuos de cisterna.
Es tpico que los gru p o s p r en ilo se fijen a residuos de cisterna
cerca del C terminal e incluyen los grupos farnesilo (C 15) y geranilgeranilo (C 2o). Muchas protenas que participan en la transduccin
de seal y el blanco de protenas contienen una unidad farnesilo o
una unidad geranilgeranilo en su C terminal.
En la fijacin de una protena a la capa externa de la membra
na plasmtica se utiliza un mecanismo diferente: la fijacin de un
grupo inositol del glucosilfosfatidilo (GPI). Este grupo glucolpido
Principales tipos de modificacin de polipptidos
Tipo de modificacin
(grupo aadido)
Aminocidos blanco
Comentarios
Fosforilacin (P04~)
Tirosina, serina, treonina
Lograda por cinasas especficas. Pueden

revertirse por fosfatasas
Metilacin (CH3)
Usina
Lograda por metilasas y desechas por

desmetilasas
Hidroxilacin (OH)
Prolina, lisina, cido asprtico
Hidroxiprolina e hidroxilisina son en particular

comunes en colgenas
Acetilacin (CH3C0)
Usina
Lograda por una acetilasa y desecha por

desacetilasa
Carboxllacin (COOH)
Glutamato
Lograda por carboxilasa 7
Acetilacin (CH3C0)
Lisina
Lograda por una acetilasa y desecha por

desacetilasa
Glucosilacin N (carbohidrato complejo)
Asparagina, por lo general en la secuencia:

Asn-X-(SerlThr)
Se lleva a cabo al principio en el retculo

endoplsmico; X es un aminocido distinto de la
prolina
Glucosilacin 0 (carbohidrato complejo)
Serina, treonina, hidroxilisina
Se lleva a cabo en el aparato de Golgi; menos

comn que la glucosilacin N
GPI (glucolpido)
Aspartato en el C terminal
Sirve para fijar protenas a la capa externa de la

membrana plasmtica
Miristoilacin (grupo graso acilo C14)
Glicina en el N terminal (vase texto)
Sirve como fijador de membrana
Palmitoilacin (grupo graso acilo C16)
Cistena para form ar unin S-palmitolo
Farnesilacln (grupo prenilo C15)
Cistena en el C terminal (vase texto)
Geranilgeranilacin (grupo prenilo C20)
Cistena en el C terminal (vase texto)
28 CAPTULO UNO
complejo contiene un grupo graso acilo que sirve como el anclaje

de membrana, que est unido de manera sucesiva a una unidad de
glicerofosfato, una unidad oligosacrida y al final, a travs de una
unidad fosfoetanolamina, al C terminal de la protena. Con excep
cin de la fijacin GPI, la totalidad de la protena se localiza en el
espacio extracelular.
protenas, incluidas las plasmticas, hormonas polipeptdicas, neuropptidos, factores de crecimiento, etc. Como se describe en la
seccin siguiente, muchas veces se usan secuencias de seal que
pueden cortarse para marcar protenas que estn destinadas a en
viarse a un sitio especfico. Adems, en algunos casos, una molcula
de mRNA aislada puede especificar ms de una cadena polipept
dica funcional como resultado de la segmentacin (corte) proteoltica de un polipptido precursor grande (fig. 1-23).
Corte postraduccional
El principal producto de la traduccin tambin puede sufrir un
corte (segmentacin) interno a fin de generar un producto madu
ro ms pequeo. En ocasiones se corta la metionina iniciadora del
producto primario de la traduccin como sucede durante la snte
sis de la globina beta (fig. 1-19). Se observa una segmentacin (cor
te) polipeptdica ms importante en la maduracin de muchas
E x n 1
G en
Intrn 1
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mRNA
m 7G p p p
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S e c . g u a I M e t
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P rep ro in su lin a
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i
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\ .
Para la funcin dentro de las mitocondrias se requieren protenas

sintetizadas en los ribosomas mitocondriales. Sin embargo, las nu-
E x n 2
AG
\5 '
1.5.4 La secrecin de protenas y el traslado

intracelular se controlan mediante seales de
localizacin especficas o modificaciones qumicas
i A A A A A A --A >
A la i
F en
65 2 66
A rg | G li
3 0 i 31
Leu I G lu
86
A sn | P roinsulina
i
35
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I Fen
C la v e :
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30
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C a d e n a B d e in s u lin a
1
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tr a d u c ir
21
A sn l
C a d e n a A d e in s u lin a
S itio d e c o rte
Fig. 1-23. La sntesis de insulina incluye mltiples cortes postraduccionales de precursores polipeptdicos.
El primer intrn interrumpe la regin no traducida 5 '; el segundo intrn las posiciones base 1 y 2 del codn 63 y se clasifica como un intrn de fase I
(vase recuadro 12-2 y figura 1-19 para otras fases de intrn). El producto primario de la traduccin, preproinsulina, posee una secuencia gua de 24
aminocidos que se requiere para que la protena cruce la membrana celular y luego se descarte. El precursor proinsulina contiene un segmento central,
el pptido de conexin, que al parecer es importante para conservar la conformacin de los segmentos de las cadenas A y B de tal manera que puedan
crear puentes disulfuro (vase fig. 1-25).
1.5 ! TRADUCCIN, PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONAL Y ESTRUCTURA DE LAS PROTEINAS 29
merosas protenas que se sintetizan en ribosomas citoplsmicos tie

nen diversas funciones que quiz requieran que se secreten las mis
mas protenas de la clula en donde se sintetizaron (p. ej., las
hormonas y otras molculas de sealamiento intercelular) o que se
trasladen a compartimientos intracelulares especficos, como el n
cleo (histonas, DNA y polimerasas de RNA, factores de transcrip
cin, protenas de procesamiento de RNA, etc.), la mitocondria
(protenas ribosmicas mitocondriales, muchos componentes de la
cadena respiratoria, etc.), peroxisomas, etc. Con el fin de llevarlo a
cabo, es necesario que est alojada en la estructura del polipptido
una seal de localizacin especfica, de tal manera que pueda en
viarse a la direccin correcta. Por lo general, la seal de localizacin
tiene la forma de una secuencia peptdica corta. A menudo esto re
presenta una llamada secuencia de seal (o secuencia gua), que
se elimina de la protena por una peptidasa de seal especializada
una vez que se lleva a cabo el proceso de seleccin.
Seales para el traslado al retculo endoplsmico (RE) y el

espacio extracelular
En las protenas secretadas, el pptido de seal comprende casi los
20 primeros aminocidos en el extremo N terminal y siempre in
cluye un nmero considerable de aminocidos hidrfobos (vase
cuadro 1-8). La secuencia de seal se gua hacia el RE por una par
tcula de reconocimiento de seal (PRS), un complejo de RNA y
protena que consiste en una especie de RNA citoplsmico pequea,
7SL RNA, y seis protenas especficas. El complejo de PRS se une
a la cadena polipeptdica en crecimiento y al ribosoma y los dirige
a una protena receptora de PRS en el lado citoslico de la superfi
cie de la membrana del retculo endoplsmico rugoso (RER). Con
posterioridad, puede pasar un polipptido a la luz del RE, destina
do para eliminarse de la clula, a menos que haya segmentos hidr
fobos adicionales que detengan el proceso de transferencia, como
en el caso de las protenas transmembranosas.
Otras seales
Al igual que la seal del RE, se requiere una secuencia de seal de
la N terminal para atravesar la membrana mitocondrial y se seg
menta de modo subsecuente. De manera caracterstica, un pptido
de seal mitocondrial tiene, adems de muchos aminocidos hidr
fobos, varios aminocidos de carga positiva, las ms de las veces es
paciados a intervalos de unos cuatro aminocidos. Se piensa que
esta estructura forma una hlice a anfiptica, una estructura heli

coidal con aminocidos cargados en una superficie y aminocidos
hidrfobos en la otra (vase ms adelante y fig. 1-24A).
Las seales de localizacin nucleares pueden localizarse casi
en cualquier parte de la secuencia polipeptdica y consisten de ma
nera habitual en una tira de cuatro a ocho aminocidos de carga
positiva, junto con residuos prolina contiguos. No obstante, mu
chas veces la seal es bipartita y los aminocidos de carga positiva
se encuentran en dos bloques de dos a cuatro residuos, separados
por unos 10 aminocidos (vase cuadro 1-8). Cabe sealar que al
gunas protenas nucleares carecen de cualquier secuencia de locali
zacin nuclear en s mismas, pero se transportan al interior del
ncleo con ayuda de otras protenas nucleares que tienen las sea
les apropiadas.
Las protenas lisosmicas se dirigen al lisosoma por la adicin
de un residuo de 6 -fosfato de manosa que se aade en el comparti
miento cis del aparato de Golgi y que reconoce una protena recep
tora en el compartimiento trans de Golgi.
1.5.5 La estructura protenica es muy variada y no es

fcil predecirla por la secuencia de aminocidos
Las protenas estn compuestas de uno o ms polipptidos, cada
uno de los cuales puede someterse a modificacin postraduccional.
Pueden interactuar con cofactores especficos (p. ej., que requieren
cationes divalentes como Ca2+, Fe2+, Cu2+, Zn2+ o molculas pe
queas para la actividad enzimtica funcional, como NAD+) o ligandos (cualquier molcula que enlaza una protena especfica),
cada uno de los cuales puede tener influencias poderosas en la con
formacin de la protena. Por lo regular se distinguen para las pro
tenas cuando menos cuatro niveles diferentes de organizacin
estructural (vase cuadro 1-9).
Dentro de una cadena polipeptdica aislada hay una esfera de
accin amplia para enlaces de hidrgeno entre diferentes residuos;
al margen de las cadenas laterales, el oxgeno de un enlace peptdico del grupo carbonilo (CO) puede enlazar hidrgeno al hidrge
no del grupo NH de otro enlace peptdico. Las unidades
estructurales fundamentales definidas por enlazamiento de hidr
geno entre residuos aminocidos muy cercanos de un polipptido
aislado incluyen:
La hlice a . sta incluye la formacin de un cilindro rgido.
La estructura sufre el dominio del enlace de hidrgeno entre el
Cuadro 1 -8 . Ejemplos de secuencias protenicas de localizacin

Destino de la protena
Localizacin y forma de seal
Ejemplos
Retculo endoplsmico y
secrecin de la clula
Pptido N terminal de unos

20 aminocidos; muy hidrfobo
Insulina humana: 24 aminocidos, pptido de seal muy hidrfobo;

N-Met-Ala-Leu-Trp-Met-Arg-Leu-Leu-Pro-Leu-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-Leu-TrpGli-Pro-Asp-Pro-Ala-Ala-Ala
Mitocondrias
Pptido N terminal; hlice a con

residuos de carga positiva en
una cara e hidrfobos en la otra
Deshidrogenasa de aldehido mitocondrial humana

17 aminocidos N terminal:
N-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Ala-Arg-Fen-Gli-Pro-Arg-Leu-Gli-Arg-Arg-Leu-Leu
Ncleo
Secuencia interna de aminocidos; con

frecuencia un cordn de aminocidos
bsicos ms prolinas; puede ser bipartita
Antigeno SV40 T continuo: Pro-Pra-Lis-Lis-Lis-Arg-Lis-Val

p53 bipartito: Lis-Arg-Ala-Leu-Pro-Asn-Asn-Tre-Ser-Ser-Ser
Pro-GIn-Pro-Lis-Lis-Lis
Lisosoma
Adicin de residuos de manosa 6-fosfato
30
CAPITULO UNO
Cuadro 1-9. Niveles de estructura de protenas

Nivel
Definicin
Comentario
Primario
Secuencia lineal de aminocidos

en un poiipptido
Puede variar de longitud de modo notorio, desde un pptido pequeo hasta miles
de aminocidos de largo
Secundario
Va que sigue la estructura bsica polipeptdica
Puede variar en sentido local, por ejemplo como hlice a u hoja plegada p
Terciario
Estructura tridimensional total de

un poiipptido
Puede variar en grado notable; por ejemplo, globular, en bastn, tubo, serpentn,
hoja, etctera.
Cuaternario
Estructura total de una estructura multimrica

( = una combinacin de subunidades de protenas)
Con frecuencia estabilizada por puentes disulfuro y enlace a ligandos, etctera.
Fig. 1-24. Con frecuencia, los enlaces de hidrgeno intracatenarios dominan las regiones de estructura secundaria en polipptidos.
A) Estructura de una hlice a . Izquierda: slo se muestra la estructura bsica del poiipptido para efectos de claridad. El oxgeno carbonilo (CO) de
cada enlace pptido est enlazado al hidrgeno en el enlace pptido del grupo amida (NH) del cuarto aminocido distante, de tal form a que la hlice
tiene 3.6 aminocidos por giro. Nota: para mayor claridad se omitieron algunos enlaces. Las cadenas laterales de cada aminocido se hallan en la parte
exterior de la hlice y casi no hay un espacio libre dentro de la hlice. Derecha: se localizan aminocidos cargados y aminocidos hidrfobos en
superficies diferentes en una hlice a antiptica. La secuencia que se muestra es la secuencia peptdica de seal de 17 aminocidos de largo para la
deshidrogenasa de aldehido mitocondrial (vase cuadro 1-8). B) Estructura de una hoja plegada p . Obsrvese que el enlace de hidrgeno ocurre
entre los tomos de oxgeno de CO e hidrgeno de NH de los enlaces peptdicos en segmentos paralelos adyacentes de la estructura bsica pollpeptdica.
El ejemplo muestra un enlace entre segmentos antiparalelos de la estructura bsica polipeptdica (hoja p antiparalela), y el cambio sbito forzado de
direccin entre segmentos antiparalelos suele llevarse a cabo mediante giros p (vase texto). Las flechas indican la direccin de la N terminal al C
terminal. Nota: tambin es comn encontrar hojas plegadas p paralelas con los segmentos adyacentes en la misma direccin.
! LECTURAS ADICIONALES
.............0
H j N - G I V E Q C C T S
SH
C adena A
I C S L Y Q L E N Y C N -C O O
ISH I
SH
SH
0
H j N - F V N Q H L C G S H L V E A L Y L V C G E R G F F Y T P K T -C O O
[s] [s]
H3N G I V E Q c
1c
C T s I
j 31
rc S L Y Q L E N Y C N
C adena B
COO
fsl
h 3n
m
f v n q h l c g s h l v e a l y l v c g e r g f f y t p k t
-C O O
Fig. 1-25. Puentes disulfuro intracatenarios e inlercatenarios en la insulina humana.

Los puentes disulfuro ( -S -S -) se forman por una reaccin de condensacin entre grupos sulfhidrilo (-SH ) opuestos de los residuos de cisteina 6 y 11 de
la cadena A o entre los residuos indicados de las diferentes cadenas.
oxgeno carbonilo de un enlace peptdico con el tomo de hi

drgeno del nitrgeno amino de un enlace peptdico localizado
cuatro aminocidos ms lejos (vase fig. 1-24). Cabe sealar
que los dominios de enlace de DNA de los factores de transcrip
cin suelen ser helicoidales a (vase seccin 10.2.4). Una h
lice a anfiptica tiene residuos cargados en una superficie e
hidrfobos en otra (fig. 1-24). Las hlices a idnticas con una
ordenacin repetida de cadenas laterales no polares pueden
arrollarse entre s para formar una estructura estable particular
llamada superarrollamiento. Los superarrollamientos largos
parecidos a bastones se encuentran en muchas protenas fibro
sas, como las fibras de queratina a de la piel, el pelo y las uas
o el fibringeno del cogulo sanguneo.
La hoja plegada (3. Es caracterstica de la formacin de enlaces
de hidrgeno entre enlaces peptdicos opuestos en segmentos
paralelos (muchas veces en realidad antiparalelos) de la misma
cadena polipeptdica (vase fig. 1-24). Las hojas plegadas (3 for
man el ncleo de la mayor parte de las protenas globulares.
El giro p. El enlace de hidrgeno entre el enlace peptdico del
grupo CO del residuo aminocido n de un polipptido con el
enlace peptdico del grupo NH del residuo n + 3 tiene como
resultado un giro en horquilla. Al permitir que el polipptido
invierta de forma sbita la direccin, pueden lograrse formas
globulares compactas. Los giros beta se llaman as porque tam

bin conectan con frecuencia cadenas antiparalelas en hojas ple
gadas (3 (vase fig. 1-24B).
Elementos estructurales ms complejos que consisten en combina
ciones de los mdulos estructurales anteriores constituyen los domi
nios protenicos; son regiones compactas de una protena formadas
por el doblamiento nuevo de la estructura primaria, de tal manera
que los elementos de la estructura secundaria pueden aproximarse
cerca entre s. Estos dominios suelen representar unidades funciona
les que participan en el enlace de otras molculas. Adems, a menu
do se forman puentes disulfuro covalentes entre los grupos
sulfhidrilo (SH) de pares de residuos de cisteina que ocurren den
tro de la misma cadena polipeptdica o en cadenas polipeptdicas di
ferentes (vase fig. 1-25).
Desde luego, la estructura terciaria o cuaternaria de las prote
nas depende de la secuencia primaria de aminocidos. Sin embar
go, aunque al analizar la secuencia primaria es posible predecir
secuencias tpicas de estructuras secundarias, como hlices a , hojas
plegadas (i y giros (3, en la actualidad no es posible predecir con
precisin la estructura tridimensional total. Adems de la comple
jidad estructural de los polipptidos simples, muchas protenas estn
organizadas como agregados complejos de mltiples subunidades
polipeptdicas.
Lecturas adicionales
A lb e rts B, J o h n s o n A , L e w is J, R a ff M , R o b e rts K , W a lte r P
(2001) Molecular Biology of the Cell, 4th Edn. Garland Publishing,
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Rev. Biochem. 71 , 307-331.
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V iro lo g y /B V H o m e P a a e .h tm l
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Edn. Garland Science, New York.
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D a rn e ll J (1995) Molecular Cell Biology, 3rd Edn. Scientific
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32
CAPTULO UNO
Bibliografa
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Wickens M, Anderson P, Jackson RJ (1997) Life and death In the
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CAPTULO
DOS
Estructura y funcin
de los cromosomas
34
CAPTULO DOS
ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
El DNA funciona en un contexto. El DNA humano est estructu

rado en crom osom a s y los cromosomas funcionan dentro de las c
lulas que se derivan de otras clulas por divisin celular. El proceso
de la divisin celular es, por supuesto, un pequeo componente del
ciclo celu la r, el proceso por el cual los cromosomas y sus molcu
las de DNA constituyentes necesitan elaborar copias perfectas de s
mismas y a continuacin segregarse en la forma de clulas hijas. Es
to necesita dirigirse con sumo cuidado, de tal manera que las clu
las hijas reciban el juego correcto de cromosomas. En la forma
usual de divisin celular, la m itosis, cada clula hija tiene el mismo
nmero y tipo de cromosomas que la clula parental. Adems, en
ciertas clulas del testculo y el ovario ocurre una forma de divisin
celular especializada, m eiosis, que da lugar respectivamente a las c
lulas espermatozoo y vulo.
2.1
Ploida y ciclo celu lar
El nmero de diferentes cromosomas en cualquier clula nucleada,

el juego de cromosomas, y el contenido de DNA relacionado se
designan n y C, de forma respectiva. En los seres humanos n es igual
a 23 y C se aproxima a 3.5 pg (3.5 X 10 12 g). Las clulas pueden
variar en el nmero de copias que tienen del juego de cromosomas
(ploida). Los espermatozoos y vulos llevan un juego de cromo
somas y se dice que son haploides (n cromosomas; contenido de
DNA, C). Sin embargo, casi todas las clulas humanas poseen dos co
pias del juego de cromosomas y son diploides (2 n cromosomas;
contenido de DNA, 2C). Casi todos los mamferos son diploides
(la rata vizcacha roja es una rara excepcin; vase Gallardo y cois.,
1999), pero en otros organismos hay muchos ejemplos de especies
que en condiciones normales son haploides, tetraploides (4n) o poliploides (> 4n). Es menos comn la triploida (3n) porque los tri
plo ides tienen problemas con la meiosis (vase ms adelante).
Las clulas diploides del cuerpo del hombre proceden al final
de una clula diploide nica, el cigoto, a travs de rondas repetidas de
divisin celular mittica. Cada ronda puede resumirse como una
vuelta del ciclo celular (fig. 2-1). Esto comprende una etapa corta
de la divisin celular, la fase M (mitosis: vase fig. 2-7) y una interfase intermedia larga. La interfase puede dividirse en fase S (sn
tesis de DNA), fase G1 (espacio entre la fase M y la fase S) y fase
G2 (espacio entre la fase S y la fase M). Desde la anafase de la mi
tosis, de manera directa, hasta la duplicacin del DNA en la fase S,
un cromosoma de una clula diploide contiene una doble hlice de
DNA y el contenido total de DNA es 2C. La fase G1 es el estado
normal de una clula y el estado final a largo plazo de las clulas
que no se dividen. Las clulas slo entran en la fase S si estn dis
puestas para la mitosis; las clulas que no se dividen permanecen en
una etapa G1 modificada, llamada en ocasiones fase G0. El diagra
ma del ciclo celular puede dar la impresin de que toda la accin
interesante sucede en las fases S y M, pero esto es una ilusin. Una
clula pasa la mayor parte de su vida en la fase GO o G1 y es all
donde el genoma lleva a cabo la mayor parte de su trabajo.
Un subgrupo de las clulas diploides del cuerpo constituye la l
nea germinal (vase fig. 2-9). Dichas clulas originan las clulas di
ploides especializadas en el ovario y los testculos, que pueden
dividirse por meiosis para producir gametos haploides (espermato
zoo y vulo). En seres humanos (n = 23), cada gameto contiene 22
autosomas (cromosomas que no son sexuales) ms un cromosoma
del sexo. En los vulos, el cromosoma del sexo siempre es una X;
en el espermatozoo puede ser una X o una Y. Despus de la fecun-
: Total d e 92
+ crom osom as
j divididos en dos
clulas hijas
46
c ro m o s o m a s
(c o n d e n s a d o s )
4C
46 crom osom as (extendidos),
dos dobles hlices d e DNA
por crom osom a
Sntesis
DNA
46 crom osom as (extendidos),

una doble hlice de DNA
por crom osom a
2C
Fig. 2-1. Contenido cromosomico del DNA humano durante el ciclo

celular.
La interfase comprende G1 + S + G2. Los cromosomas contienen
una hlice doble de DNA desde la anafase de la mitosis hasta que se
duplic el DNA en la fase S. Desde esta etapa hasta el final de la
metafase de la mitosis, el cromosoma consiste en dos cromtides que
contienen cada uno un dplex de DNA, para form ar dos dobles hlices
por cromosoma. El contenido de DNA de una clula diploide antes de
la fase S es 2C (el doble del contenido de DNA de una clula haploide),
en tanto que entre la fase S y la mitosis es 4C.
dacin, el cigoto es diploide (2 n) con la constitucin cromosmica

46,XX o 46,XY (fig. 2-2). Las otras clulas del cuerpo, aparte de la
lnea germinal, se conocen como clulas somticas. Las clulas so
mticas humanas suelen ser diploides, pero algunas clulas carecen
de ncleo y cualquier cromosoma y se dice que son n u lip loides, y
otras son p o r naturaleza poliploides como resultado de mltiples
rondas de replicacin del DNA sin divisin celular (vase seccin
3.1.4).
2.2
Estructura y funcin de los

crom osom as
Los cromosomas, como se observan bajo el microscopio y se ilus

tran en libros de texto, son bastante engaosos porque representan
un estado poco com n que ocurre brevem ente en el ciclo celular, du
rante una parte de la fase M, a medida que se preparan las clulas
para llevar a cabo la divisin celular (metafase). Los cromosomas de
metafase y los cromosomas de prometafase se hallan en un estado
muy condensado y tienen una estructura poco comn de dos cromtides
2.2
E s p e rm a to z o o
1 ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
35
C ig o to
Fig. 2-2. La vida humana desde un punto de vista cromosmico.

Las clulas haplodes espermatozoo y vulo se originan por meiosls a partir de precursores dlploides (vase fig. 2-9). En el vulo fecundado los crom o
somas del espermatozoo y el vulo forman al principio los proncleos femenino y masculino separados. stos se combinan durante la primera mitosis.
porque en esta etapa el DNA se replic en preparacin para la divi

sin celular. Tan slo por estar empacados apretadamente en haces
puros, los cromosomas en metafase son lo bastante grandes para ob
servarse con un microscopio de luz, pero no son representativos por
que el empaque extremo asegura que los genes estn desconectados.
Los procesos de la divisin celular son fascinantes por s mismos
y los errores en el empaquetamiento o la divisin del genoma tienen
consecuencias mdicas de importancia (seccin 2.5). Sin embargo,
es esencial recordar que la inmensa mayora de los cromosomas en
el ciclo celular tiene un aspecto muy diferente. Durante toda la pro
longada etapa de la interfase, los cromosomas estn extendidos en
gran proporcin y por consiguiente son mucho ms difusos que los
cromosomas en metafase que se observan en la figura 2-14. Como
hecho importante, un cromosoma de interfase slo comprende una
cromtide aislada y una doble hlice de DNA y la estructura extendi
da permite que se expresen los genes.
Como organelos funcionales, al parecer, los cromosomas eucariticos slo requieren tres clases de elementos de secuencia de
DNA: centrmeros, telmeros y orgenes de replicacin. Se verifi
c este requerimiento simple por el xito en la construccin de cro
mosomas artificiales en levaduras: los fragmentos grandes extraos
de DNA se comportan como cromosomas autnomos cuando se
unen a secuencias cortas que especifican un centrmero funcional,
dos telmeros y un origen de replicacin (fig. 5-17). En fecha re
ciente se crearon cromosomas artificiales de mamferos con base
en principios similares (Huxley, 1997; Schindelhauer, 1999).
2.2.1 El empaque del DNA en los cromosomas sugiere

mltiples jerarquas de doblamiento del DNA
En la clula est muy ordenada la estructura de cada cromosoma
(Manuelidis, 1990). Incluso en el ncleo de interfase la doble hli
ce de DNA de 2 nm est sujeta cuando menos a dos niveles de arro
llamiento (fig. 2-3):
El nucleosoma es la unidad fundamental del empaquetamiento.
Consiste en un ncleo central de ocho protenas histona, prote
nas bsicas (= carga positiva) y pequeas, muy conservadas, de
102 a 135 aminocidos. Cada ncleo comprende dos molcu
las de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, alrededor
de las cuales se arrolla un tramo de 146 pb de DNA de doble
cadena en 1.75 vueltas. Los nucleosomas adyacentes estn co
nectados por un tramo corto de DNA espaciador. Las fotomi

crografas electrnicas de preparaciones adecuadas muestran un
aspecto en hilo de cuentas. Nota: las clulas del espermatozoo
son diferentes. Se logra un empaquetamiento muy apretado de
DNA en las cabezas de los espermatozoos en reemplazo de his
tonas con una clase alternativa de protenas bsicas pequeas
conocidas como protam in as.
El hilo de cuentas, de unos 10 nm de dimetro, se arrolla a su
vez en una fibra de cromatina de 30 nm de dimetro. Al pa
recer, el cromosoma de interfase consiste en estas fibras de cro
matina, organizadas tal vez en asas largas como se describe ms
adelante.
Durante la divisin celular, los cromosomas estn mucho ms condensados. El DNA en un cromosoma en metafase est compactado
alrededor de 1/10 000 de su longitud en extensin. Se encuentran
asas de la fibra de cromatina de 30 nm, que contienen 20 a 100 kilobases (kb) de DNA por asa, unidas a una estructura central, que
se integra con protenas cidas diferentes de las histonas, en espe
cial topoisomerasa I I , una enzima que tiene la interesante capaci
dad de pasar una hlice doble de DNA a travs de otra y abrir una
hendidura y repararla. Se sabe que la topoisomerasa II y algunas
otras protenas de la cromatina se unen a una secuencia abundante
en AT y las asas de cromatina pueden ser unidas por tiras de varios
cientos de pares de bases de DNA muy abundante en AT (> 65%)
(regiones de fijacin a la estructura central). En las cromtides
de un cromosoma en metafase est ms compactado an el com
plejo de asa-estructura central por arrollamiento (vase fig. 2-3).
2.2.2 Cromosomas individuales ocupan territorios

no superpuestos en un ncleo en interfase
Hace mucho tiempo se conoce el alto grado de organizacin en el
citoplasma, pero el ncleo, asimismo, tiene una subestructura con
siderable. Adems del n u cleo lo familiar, en el que se transcribe el
rRNA y se ensamblan subunidades ribosmicas, en fecha reciente
se identificaron muchos otros compartimientos subnucleares (cuer
pos d e CajaL, cuerpos de PML, paramanchas, etc.; vase recuadro
3-1). La colocacin de los cromosomas dentro del ncleo tambin
est muy organizada y se desarrollaron tcnicas especializadas para
seguir los movimientos de cromosomas individuales dentro de c
lulas vivas en el transcurso de la interfase.
36
CAPTULO DOS
C ro m tid e s
h e rm a n a s
80 M b
de DNA
80 M b
de DNA
A sa s d e fib ra d e
c ro m a tin a (~ 7 5 kb)
D o b le
h lice
E s tru c tu ra
ce n tra l
F ib ra d e
c ro m a tin a
d e 3 0 nm
1 0 nm
Fig. 2-3. Del DNA dplex hasta el cromosoma en metalase.

La figura muestra el cromosoma 17 humano, como se observa en una preparacin de 400 bandas con bandeo G. Las relaciones estimadas de
empacamiento (el grado de compactacin del DNA dplex lineal) para los cromosomas humanos son 1:6 para nucteosomas, 1:36 en la fibra de 30 nm
y > 1:10 000 para el cromosoma en metafase. En la actualidad no se sabe con certeza si el DNA en el centrmero del cromosoma en metafase se
retras en su replicacin a diferencia del resto de la cromtide o si la replicacin completa del DNA ocurri en la fase S y la contraccin en el cen
trmero se debe a alguna otra causa.
En cierto grado, la mitosis origina una restriccin en la orienta

cin cromosmica durante la interfase. Justo antes que se divida la
clula, los microtbulos unidos al centrmero tiran cada cromoso
ma hacia uno de los dos polos del hu so m it tico (la red de micro
tbulos que colocan los cromosomas durante la mitosis; vase
recuadro 2-1). Durante el movimiento de los cromosomas, los centrmeros guan el camino y tira detrs de s los brazos de los cro
mosomas para crear formas en V. Al inicio de la interfase, los
cromosomas tienden a conservar esta llamada o rien ta cin Rab, con
los centrmeros alineados en direccin de un polo del ncleo y los
telmeros en la direccin opuesta (en algunas clulas en las que la
interfase es corta, los cromosomas tienden a adoptar esta orienta
cin durante toda la interfase).
En los mamferos, los cromosomas de las clulas en interfase no
suelen encontrarse en la orientacin Rab y no estn tan bien ali
neados los diferentes centrmeros (aunque tienden a agruparse
entre s en la periferia del ncleo durante la fase G 1 antes de dis
persarse mucho ms en el transcurso de la fase S). No obstante,
aunque cada cromosoma se encuentra en una forma muy extendi
da, los cromosomas no estn entrelazados de manera extensa. Por
el contrario, ocupan al parecer territorios cromosmicos no super
puestos relativamente pequeos (fig. 2-4 y Cremer y Cremer, 2001;
Parada y Misteli, 2002).
Aunque en apariencia los cromosomas en interfase no tienen si
tios nucleares favoritos, la colocacin cromosmica no es aleatoria.
Por ejemplo, se sabe que los cromosomas humanos con mayor abun
dancia de genes se concentran en el centro del ncleo, en tanto que
los cromosomas con menos genes se localizan hacia la envoltura nu
clear (fig. 2-4; vase Boyle y cois., 2001; y Parada y Mistelli, 2002).
Es probable que los movimientos de los cromosomas se restrinjan
por interaccin con la envoltura nuclear y asimismo por las estructu
ras internas del ncleo, incluido el nucleolo (en el caso de cromoso
mas que contienen genes de RNA ribosmicos).
2.2.3 Cromosomas como organeios funcionales: sitio

centrai del centrm ero
Los cromosomas normales slo tienen un centrmero que se obser
va al microscopio como la constriccin primaria, la regin en la
que se unen las cromtides hermanas. El centrmero es esencial pa
ra la segregacin durante la divisin celular. Los fragmentos cromo
smicos que carecen de un centrmero (fragmentos acntricos)
no se unen al hu so m it tico (vase recuadro 2-1 y fig. 2 -7 ) y tam
poco se incluyen en los ncleos de cualquiera de las clulas hijas.
Durante la profase tarda de la mitosis se forman en cada cen
trmero un par de complejos multiprotenicos grandes que se co
nocen como cin eto co ro s, unido cada uno a una de las cromtides
hermanas. Los microtbulos se fijan a cada cinetocoro, con unin
del centrmero de un cromosoma y los dos polos del huso (vase
recuadro 2-1 y fig. 2-7). En la anafase, los microbtulos del cineto-
2.2 | ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
El huso mittico (vase figura abajo) est formado por microtbulos

(polmeros hechos de un heterodmero repetido de tubulina a y p) y pro
tenas relacionadas con microtbulos. Cada uno de los dos polos del
huso est definido por un centrosoma, el principal centro organizador del
microtbulo. El centrosoma origina el crecimiento hacia afuera de fibras
microtubulares polares, con un extremo ( - ) en el exterior del centrosoma
y el extremo distal en crecimiento definido como el extremo ( + ) .
Cada centrosoma est compuesto de una matriz fibrosa (que consiste en
unas 50 copias de un complejo anular de tubulina y) en la cual est inclu
ido un par de centriolos (vase dibujo A en la figura de abajo). Los cen
tr lo s son estructuras cilindricas cortas compuestas de microtbulos y
protenas relacionadas y los dos centriolos del par siempre estn dis
puestos en ngulos rectos entre si, para form ar una figura en L (vase
dibujo A de la figura). En cierto punto de la etapa G1 se separan los dos
centriolos en un par y durante la fase S comienza a crecer un centriolo
hijo en la base de cada centriolo madre y en ngulos rectos con ste has
ta que se forma por completo alrededor de G2. Los dos pares de centrio
los permanecen juntos entre s en un complejo centrosmico nico hasta
el inicio de la fase IVI en la que se divide el complejo en dos y comienzan
37
a separarse las dos mitades. Cada centrosoma desarrolla ahora su dis

posicin radial propia de los microtbulos (ster) y comienza a migrar a
los extremos opuestos de la clula en donde se forman los polos del huso
(vase dibujo C en la figura).
En el huso se encuentran tres formas diferentes de fibras de microtbu
los (vase dibujo C en la figura abajo):
Fibras polares que se extienden desde los dos polos del huso hacia
el ecuador. Se desarrollan en la profase en tanto est intacta an la
membrana nuclear. Nota: para mayor claridad slo se muestra un par
de estas fibras superpuestas.
Las fibras del cinetocoro no se desarrollan hasta la prometafase.
Estas fibras se fijan al cinetocoro, una estructura multiprotenica uni
da al centrmero en cada cromtide (dibujo B) y se extienden en
direccin de los polos del huso.
Se forman fibras astrales alrededor de cada centrosoma y se extien
den hacia la periferia.
M atriz del
centro so m a
1 P laca de
J m etafa se
C en triolos
M ic rotbulos
del cin etocoro
M ic rotbulos
o = co m p lejo s d e anillo d e tu b u lin a y
M icrotbu los
polares
M ic rotbulos
astrales
A ) Estructura del centrosoma; B) relacin cinetocoro-centrmero; C ) estructura del huso mittico.
coro tiran las dos cromtides hermanas hacia polos opuestos del
huso (fig. 2-7). Los cinetocoros tienen un sitio central en este pro
ceso y controlan el ensamble y desensamble de los microtbulos fi
jados y, a travs de la presencia de molculas motoras, impulsan al
final el movimiento del cromosoma.
Tal vez secuencias especficas de DNA dictaminan la estructura y
funcin de los centrmeros. En eucariotas simples, las secuencias que
especifican la funcin del centrmero son muy cortas. Por ejemplo,
en la levadura Saccharomyces cerevisiae el elemento centrmero tiene
alrededor de 110 pb de largo y consiste en dos elementos de flanqueo
muy conservados de 9 pb y 11 pb y un segmento central rico en AT
de unos 80 a 90 pares de bases (pb) (vase fig. 2-5). Los centrmeros
de estas clulas son intercambiables; un fragmento del elemento cen
trmero derivado de un cromosoma de la levadura puede reemplazar
al centrmero de otra sin consecuencias aparentes.
En mamferos, el DNA de centrmeros individuales consiste en
cientos de kilobases de DNA repetido, algunos especficos de cro
mosomas y otros inespecficos. Un componente mayor del DNA
centromrico humano es un DNA sa tlite a , una familia comple

ja de DNA repetidos en tndem basada en un monmero de 171
pb (vase seccin 9.4.1 para una descripcin ms completa de las
secuencias centromricas humanas). Se sabe que varias protenas
diferentes se relacionan con centrmeros humanos, incluido el
CENP-B, que se enlaza de forma directa a un DNA satlite a (va
se cuadro 2-1). Como hecho sorprendente, al tomar en cuenta que
la maquinaria de segregacin cromosmica est muy conservada a
travs de eucariotas, han evolucionado con rapidez el DNA centro
mrico y las protenas vinculadas e incluso se considera que tienen
a su cargo el aislamiento reproductor de especies en surgimiento
(Henikoff y cois., 2001).
2.2.4 Cromosomas como organeios funcionales:

orgenes de la replicacin
En condiciones normales, en la mayor parte de las clulas diploides el
DNA slo se replica una vez por ciclo celular. El inicio de la replica-
38
CAPTULO DOS
C e n tr m e ro
TCACATGAT
AGTGTACTA
USA
18
80-90 pb
> 90% (A+T)
TGATTTCCGAA
ACTAAAGGCTT
III
T e lm ero
R e p e tic io n e s t n d e m b a s a d a s en la f rm u la g en eral
H S 19
(TG)i_3 TG2. 3/C2- 3A(CA)1.3

e.g.
5'... .T G T G T G G G T G T G G T G T G T G T G G ... .3'
3 '....A C A C A C C C A C A C C A C A C A C A C C ....5 '
H S A 19
S ecuen cia d e replicacin autnom a
H SA
18
C o n tie n e un co n s e n s o d e n c leo d e 11 p b q u e es a b u n d a n te
en AT, a u n a d o a a lg u n as co p ia s im p e rfe c ta s d e e s ta s e c u e n c ia
q u e a b a rc a una regin del D N A d e unos 5 0 pb
SE
IQI
Fig. 2-4. Cromosomas individuales ocupan territorios precisos en el
cromosoma en el ncleo en interfase.
La fotografa muestra un ejemplo de pintado crom osm ico (vase
seccin 2.4.3) con dos pinturas cromosmicas, una especfica para
HSA18 ( = cromosoma humano 18: seal verde, localizacin perifri
ca) y otra para HSA19 ( = cromosoma humano 19: seal roja, locali
zacin nuclear interna) con un ncleo en interfase. El ncleo aparece
azul como resultado de la contratincin con DAPI, un colorante fluores
cente que enlaza DNA. Imagen proporcionada gentilmente por Wendy
Bickmore, MRC Human Genetics Unit, Edinburgh.
cin est controlado por secuencias de accin cis que se encuentran

cerca de los puntos en que comienza la sntesis de DNA. Es probable
que stos sean sitios en los que se enlazan protenas de accin trans.
Los orgenes eucariticos de la replicacin se estudiaron de modo ms
exhaustivo en la levadura, en la que es posible estudiar mediante una
valoracin gentica la presencia del posible origen de una replicacin.
A fin de analizar la capacidad de un fragmento aleatorio de DNA de
levadura para promover la replicacin autnoma, se incorpora en un
plsmido bacteriano junto con un gen de levadura que es esencial pa-
C o p ia s
im p e rfe c ta s
C o n se n so d e n c leo =
ATTTAT(A/G)TTTA
TAAATA(T/C)AAAT
Fig. 2-5. Elementos funcionales del cromosoma de una levadura.
ra el crecimiento de clulas de levadura. Esta estructura formada se

utiliza para transformar una levadura mutante que carece del gen
esencial. Las clulas transformadas slo pueden formar colonias si es
posible que el plsmido se replique en las clulas de levadura. Sin em
bargo, la replicacin bacteriana originada en el plsmido no funciona
en la levadura. Por consiguiente, los pocos plsmidos que se transfor
man con una gran eficiencia deben poseer una secuencia dentro del
fragmento de levadura insertado que confiere la capacidad para repli
carse de forma extracromosmica con gran eficacia, un elemento lla
mado de secuencia autnomamente replicante (SAR).
Se piensa que los elementos SAR derivan de orgenes de repli
cacin autnticos y, en algunos casos, se ha confirmado al mapear
Principales protenas del centrmero humano

Nombre
Localizacin
Caractersticas
CENP-A
Placa externa del cinetocoro
Una variante H3 de histona especfica de centrmero; esencial para la vida y necesaria para
dirigir CENP-C al cinetocoro
CENP-B
Heterocromatina centromrica
Enlaza una secuencia de 17 pb que se encuentra en monmeros satlite alfa (box CENP-B);
necesaria para la estructura de la heterocromatina centromrica?
CENP-C
Placa interna del cinetocoro
Esencial para la funcin apropiada centrmero/cinetocoro
CENP-G
Placa interna del cinetocoro
Se enlaza a un subgrupo de secuencias en la familia satlite a
N ota: Las protenas CENP-E (en la corona fibrosa), CENP-F (placa externa del cinetocoro) y las protenas INCENP (heterocromatina cntrica) se vinculan
de modo transitorio con el centrmero. Vase Craig y cois. (1999) para detalles adicionales.
2.2 | ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
un elemento SAR especfico en una localizacin cromosomica pre

cisa y demostrar que la replicacin del DNA se inicia en realidad
en ese punto. Los elementos SAR de la levadura slo se extienden
alrededor de 50 pb y consisten en una regin abundante en AT que
contiene un consenso de centro conservado y algunas copias imper
fectas de esta secuencia (fig. 2-5). Adems, los elementos de SAR
contienen un sitio de enlace para un factor de transcripcin y se sa
be que se une al origen un complejo multiprotenico.
Se han definido de manera ms imprecisa los orgenes de la re
plicacin del DNA de mamferos por la ausencia de una valoracin
gentica. Se estudiaron algunos sitios de inicio pero esos estudios
no fueron capaces de identificar un origen nico de la replicacin.
Esto condujo a pensar que la replicacin puede comenzar en ml
tiples sitios sobre regiones de decenas de kilobases de largo (vase
Gilbert, 2001). Al parecer, los cromosomas artificiales de mamfe
ros actan sin que se proporcionen secuencias de SAR especficas.
39
Telomerasa y el problema de la replicacin del extremo

Durante la replicacin del DNA se sintetiza la cadena lenta en pie
zas porque debe crecer en una direccin opuesta a la del sentido
5'>3' de la sntesis de DNA. Se requiere una sucesin de sntesis
de puntos reversos para formar una serie de fragmentos de DNA
cuyos extremos sella a continuacin la ligasa de DNA (vase fig.
1-9 y secciones 1.2.2 y 1.2.3). A diferencia de las polimerasas de
RNA, las de DNA requieren absolutamente un grupo -OH 3' libre
de un cido nucleico de doble cadena a partir del cual pueden ex
tender la sntesis. Ello se logra mediante una polimerasa de RNA
para sintetizar un oligonucletido iniciador (cebador) RNA com
plementario a fin de cebar la sntesis de cada uno de los fragmen
tos de DNA utilizado para elaborar la cadena lenta. En estos casos,
los oligonucletidos iniciadores RNA (cebadores) requieren la pre-
2.2.5 Cromosomas como organelos funcionales:

los teim eros
Estructura, funcin y evolucin del telmero
Los teimeros son estructuras especializadas que contienen DNA y
protenas y que cubren los extremos de cromosomas eucariticos.
Es posible que tengan varias funciones:
C onservacin d e la in tegracin estructural. Cuando se pierde
un telmero, el extremo resultante del cromosoma es inestable.
Tiene la tendencia a fusionarse con los extremos de otros cromo
somas rotos, participar en fenmenos de recombinacin o ser
degradado. Las protenas de unin del telmero reconocen el ex
tremo 3' sobresaliente de un telmero (vase ms adelante) y pue
de proteger el DNA terminal in vitro y tal vez in vivo.
A segurar la rep lica ci n co m p leta d e l DNA (vase seccin so
bre telomerasa ms adelante).
C oloca ci n d e l crom osom a . Los teimeros ayudan al esta
blecimiento de la configuracin tridimensional del ncleo, al
pareamiento de cromosomas, o ambas cosas. En algunas clu
las, los extremos del cromosoma parecen atados a la envoltura
nuclear, lo que sugiere que los teimeros pueden ayudar a la
posicin de los cromosomas.
Los teimeros eucariticos consisten en disposiciones moderadamen
te largas de repeticiones tndem de una secuencia simple abundante
en TG en una de las cadenas de DNA y abundante en CA en la ca
dena complementaria. En el hombre (y en otros animales), la secuen
cia de repeticin es el hexanucletido TTAGGG. La estructura
(TTAGGG)n del telmero humano abarca de manera caracterstica
alrededor de 3 a 20 kb, punto ms all del cual (en direccin del cen
trmero) se encuentran alrededor de 100 a 300 kb de rep eticio n es
rela cion a d a s co n e l tel m ero antes de encontrar alguna secuencia
nica.
A diferencia de los centrmeros, la secuencia de los teimeros se
conserv en la evolucin -la secuencia simple repetida es muy similar
en teimeros de diferentes especies, por ejemplo TTGGGG en Paramecium, TAGGG en Trypanosoma, TTTAGGG en Arabidopsis y
TTAGGG en Homo sapiens-. (Nota: sin embargo, en algunas especies
existe cierta flexibilidad en la repeticin precisa de la unidad como se
observa en la levadura S. cerevisiae\ vase fig. 2-5.) Adems, hay una
gran conservacin en los tipos de protenas de enlace de telmero (va
se Blackburn, 2001). No obstante, las repeticiones relacionadas con el
telmero no estn conservadas en eucariotas y se desconoce su funcin.
S n te sis
de DNA
T e lo m e ra s a
Translocacin
en zim tica
AATCCC 5'
S n te sis
de DNA
Fig. 2-6. La telomerasa extiende la cadena abundante en TG de

teimeros mediante la sntesis de DNA con una plantilla interna de
RNA.
Nota: se muestran hexanucletidos recin sintetizados sombreados y
el mecanismo de alargamiento depende de la plantilla de RNA que con
tiene una repeticin tndem casi perfecta com o se muestra subrayada
en la secuencia siguiente: 5 ' CUAACCCUAAC 3 '.
sencia de cierto DNA adelante d e la secuencia que se copia con la

finalidad de que sirva como plantilla. Sin embargo, nunca puede
encontrarse dicha plantilla en el extremo final de una molcula li
neal de DNA y es necesario un mecanismo diferente para solucio
nar el problema de la replicacin de los extremos de una molcula
lineal de DNA.
40
CAPTULO DOS
El problema de la replicacin del extremo se soluciona al ex

tender la sntesis de la cadena rpida con una forma especializada de
transcriptasa inversa (polimerasa de DNA dependiente de RNA) pro
porcionada por una enzima de RNA y protena especializada cono
cida como telomerasa. Esta ltima lleva en su componente de RNA
una secuencia corta dentro de su extremo 5, CUAA CCCUAAC.
con una secuencia hexanucletida interna (cursivas subrayadas) que
es la secuencia antisentido de la secuencia de repeticin del telmero
humano (TTAGGG). Esta secuencia acta como una plantilla para
cebar la sntesis extendida de DNA de secuencias de DNA telomricas en la cadena rpida. La extensin adicional de la cadena rpida
proporciona la plantilla necesaria para que la polimerasa alfa de DNA
complete la sntesis de la cadena lenta (fig. 2-6). Este mecanismo de
ja al telmero en s mismo con un extremo 3 saliente que suminis
tra un blanco de DNA de filamento nico para ser unido por
protenas especficas de telmero, como TRF2 humano. Pese a ello,
es posible que no sea importante la naturaleza real de la secuencia del
telmero. Se sabe que la longitud del telmero es muy variable y es
t sujeta a control gentico (vase seccin 17.5.1).
2.2.6 Heterocromatina y eucromatina

En el ncleo de interfase, la mayor parte de la cromatina est ex
tendida, dispersada en la totalidad del ncleo, y se rie de forma di
fusa (eucromatina). No obstante, durante el ciclo celular parte de
la cromatina permanece muy condensada y forma la regin de tin
cin oscura (heterocromatina). Los genes que se hallan en la eu
cromatina pueden expresarse o no, segn sean el tipo de clula y sus
requerimientos metablicos, pero es muy poco probable que se ex
presen los genes localizados dentro de la heterocromatina, sea de
manera natural o como resultado de un reordenamiento cromoso
mico. Existen dos clases de heterocromatina:
Heterocromatina constitutiva: casi siempre es inactiva y con
densada. Consiste en gran parte en repeticiones de DNA y se
encuentra en los centrmeros de los cromosomas, alrededor de
ellos y en ciertas otras regiones (vase fig. 2-15 para la localiza
cin de heterocromatina constitutiva en cromosomas humanos
y el cuadro 9-2 para las cantidades estimadas de DNA relacio
nado) .
Heterocromatina facultativa: puede existir en una forma ge
nticamente activa (descondensada) o inactiva (condensada).
Los ejemplos incluyen la inactivacin del cromosoma X en ma
mferos (seccin 10.5.6) o el silenciamiento del cromosoma del
sexo durante la meiosis masculina. En el ltimo caso, durante
la meiosis masculina estn inactivados el cromosoma X y el Y
(por un periodo aproximado de 15 das en seres humanos). Se
condensan para formar el corpsculo XY y son segregados ha
cia un compartimiento nuclear especial.
En la eucromatina, las ba n d a s G muestran algunas de las propieda
des de la heterocromatina, pero en menor grado (las bandas G son
las bandas oscuras del cromosoma que resultan de la tincin positi
va con el colorante de Giemsa; las bandas plidas, negativas al
Giemsa, se denominan bandas R; vase la seccin 2.4.1). La croma
tina de la banda G en cromosomas en metafase est ms condensa
da que la de la banda R y las bandas G contienen relativamente
pocos genes. El subgrupo de bandas R que se revela mediante el
bandeo T tiene una densidad en particular alta de genes. En la sec
cin 1.3.5 se discuten las diferentes estructuras de la cromatina en
regiones cromosmicas activas e inactivas en sentido transcripcional.
2.3
Tipos de divisin celular: m itosis

y m eiosis
2.3.1 La mitosis es la forma normal de divisin celular

A medida que se forma una persona a partir de un embrin, en el
trnsito de feto a lactante y adulto, se requieren divisiones celulares
a fin de generar el gran nmero de clulas necesarias. Adems, mu
chas clulas tienen un periodo de vida limitado, de tal manera que
en el adulto hay una necesidad continua de generar nuevas clulas.
Todas estas divisiones celulares ocurren por mitosis. Esta ltima es
el proceso normal de divisin celular, desde la segmentacin del ci
goto hasta la muerte de la persona. En el tiempo de vida de un ser
humano puede haber alrededor de 10 divisiones mitticas (sec
cin 11 .2 . 1).
La fase M del ciclo celular (fig. 2-1) consiste en las diversas eta
pas de la divisin nuclear (profase, prometafase, metafase, anafase y
telofase de la mitosis) y la divisin celular (citocinesis), que super
pone las etapas finales de la mitosis (fig. 2-7). En preparacin para
la divisin celular se contraen y condensan los cromosomas, antes
muy extendidos, de tal modo que alrededor de la metafase de la
mitosis se observan con facilidad bajo el microscopio. Aunque el
DNA se replic antes en algn momento, slo en la prometafase es
posible observar que los cromosomas individuales comprenden dos
cromtides hermanas, unidas en el centrmero.
La interaccin entre las diferentes fibras del huso (vase recua
dro 2 - 1) tracciona los cromosomas hacia el centro y alrededor de la
metafase est alineado cada cromosoma en el plano ecuatorial (pla
ca de metafase). Nota: durante la mitosis, cada cromosoma en el
juego diploide se comporta de manera independiente y no se rela
cionan en lo absoluto los homlogos maternos y paternos. En la anafa
se se dividen los centrmeros y dan lugar a la separacin fsica de lo
que fueron antes cromtides hermanas; la traccin por los fibras del
huso asegura que las cromtides hermanas separadas se desplacen a
polos opuestos (figs. 2-7 y 2-8). El DNA de las dos cromtides her
manas es idntico y se elimina cualquier error en la replicacin del
DNA. Por consiguiente, el efecto de la mitosis es generar clulas hi
jas que contienen precisamente el mismo juego de secuencias de
DNA.
2.3.2 La meiosis es una forma especializada de divisin

celular que origina las clulas espermatozoo y
vulo
Las clulas germinales primordiales migran dentro de la gnada
embrionaria y llevan a cabo rondas repetidas de mitosis para formar
la oogonia en mujeres y la espermatogonia en varones (n ota : esto
incluye mucho ms mitosis en varones que en mujeres -vase re
cuadro 11-4y ello puede ser un factor importante que explica las
diferencias de sexo en el ndice de mutacin). El crecimiento y la
diferenciacin adicionales producen oocitos primarios en el ova
rio y espermatocitos primarios en el testculo. Estas clulas diploides especializadas pueden sufrir meiosis (fig. 2-9).
La meiosis incluye dos divisiones celulares sucesivas pero slo
una ronda de replicacin del DNA, de tal manera que los produc
tos son haploides. En varones, el resultado son cuatro espermato
zoos; empero, en mujeres hay una d ivisi n celu la r a sim trica
porque el citoplasma se divide de manera desigual en cada etapa:
los productos de la meiosis I (la primera divisin meitica) son un
2.3 1 T IPOS DE DIVISIN CELULAR: MITOSIS Y MEIOSIS | 41
INTERFASE
Nucleolo
Envoltura nuclear intacta

No hay crom osom as visibles
Profase
Se condensan los crom osom as y
se tornan visibles
Se desarrolla el huso bipolar
P laca de
m etafase
Prometafase
Se disuelve la envoltura nuclear
Los crom osom as com ienzan a migrar
al plano ecuatorial (placa d e m etafase)
y se observa que contienen
dos crom tides
Mitosis
Metafase
C rom osom as plenam ente condensados
y localizados en la placa de m etafase
Plano ecuatorial =
placa d e m etafase
Anafase
Se divide ca d a centrm ero
Las dos crom tides d e cada
crom osom a sufren traccin a
polos opuestos
Telofase
Los crom osom as llegan a los
polos y com ienzan a descondensarse
S e form a nuevam ente
la m em brana nuclear
C om ienza a dividirse el citoplasm a
Citocinesis
Divisin del citoplasm a term inada
para crear dos clulas hijas
Fig. 2-7. Representacin de la divisin celular por mitosis.
oocito secundario grande y una clula pequea (cuerpo polar).

Durante la meiosis II (la segunda divisin meitica), el oocito se
cundario origina a continuacin la clula vulo madura grande y
un segundo cuerpo polar.
Existen dos diferencias cruciales entre mitosis y meiosis (cuadro
2 - 2 ):
Los productos de la mitosis son diploides; los de la meiosis son

haploides.
Los productos de la mitosis son idnticos en sentido gentico;
los de la meiosis son diferentes en ese mismo aspecto.
La mitosis incluye una vuelta del ciclo celular (fig. 2-1). En la fase
S se replica el DNA y en la fase M se dividen las dos copias exacta
mente iguales entre las clulas hijas. La meiosis tambin va prece
dida por una ronda de sntesis de DNA, pero a continuacin hay
dos divisiones celulares sin sntesis intermedia de DNA, de tal for
ma que los productos terminan haploides. La segunda divisin de

la meiosis es idntica a la mitosis, pero la primera divisin tiene di
ferencias importantes cuyo propsito es generar diversidad genti
ca entre las clulas hijas. Esto se lleva a cabo por dos mecanismos:
segregacin independiente de homlogos paternos y maternos y re
combinacin.
Segregacin independiente de homlogos

paternos y maternos
Durante la meiosis I, los homlogos materno y paterno de cada par
de cromosomas forman un bivalente al parearse entre s (sinapsis;
vase fig. 2-11). Despus de la replicacin del DNA cada cromoso
ma consiste en dos cromtides hermanas, de tal manera que el bi
valente es una estructura de cuatro cadenas en la placa de metafase.
A continuacin, las fibras del huso tiran un cromosoma completo
42 j CAPTULO DOS i ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
Fig. 2-8. Vsta de la figura 2-7 realizada por un bilogo celular.

Las imgenes son de clulas HeLa y se obtuvieron mediante microscopa de desconvolucin. El DNA est teido con OAPI (color rojo falso) y los
microtbulos con un anticuerpo a tubulina p (color verde falso). Imagen proporcionada por Willlam Eamshaw, University of Edinburgh. Reimpreso a par
tir de Pollard y Earnshaw (2002), Cell Biology, con autorizacin de Elsevier.
Cuadro 2-2. Comparacin de mitosis y meiosis

Mitosis
Meiosis
Localizacin
Todos los tejidos
Slo en testculos y ovario
Productos
Clulas somticas diploides
Clulas haploides espermatozoo y vulo
Replicacin de DNA y divisin celular
En condiciones normales una ronda de

replicacin por divisin celular
Slo una ronda de replicacin pero dos divisiones celulares
Extensin de la profase
Corta (-30 minutos en clulas

humanas)
La meiosis 1 es larga y compleja; puede requerir varios aos

para terminarse
Pareamiento de homlogos
Ninguna
S (en la meiosis 1)
Recombinacin
Rara y anormal
En condiciones normales cuando menos una vez en cada

brazo del cromosoma
Relacin entre clulas hijas
Genticamente Idntica
Diferente (recombinacin y separacin independientes de

homlogos)
2.3 | TIPOS DE DIVISIN CELULAR: MITOSIS Y MEIOSIS | 43
La clula germinal
- primordial penetra la gnada
Ovario
x
Divisiones
d e oogonia
repetidas +
Testculo
--jp
Esperm atogonia
m itticas
diploide
esperm atogonia
C recim iento y
diferenciacin
Esperm atocito
prim ario (2r)
M eiosis I
Esperm atocitos
secundarios
(n )
Meiosis II
Un
vulo
m aduro
Segundo
cuerpo
polar
(n)
(n)
<>
(m) Esperm tides

(n)
C uatro esperm atozoos m aduros (n)
Fig. 2-9. Desarrollo de la lnea germinal.

La lnea germinal se desarrolla por divisin mittica repetida de las clulas diploides y culmina con la produccin de oocitos y espermatocitos primarios.
Estas clulas diploides pueden someterse a meiosis. Esta ltima comprende dos divisiones celulares pero slo una ronda de replicacin de DNA, de tal
manera que los productos son haploides. En los seres humanos, los oocitos primarios entran en meiosis I durante la vida fetal pero a continuacin se
detienen en la etapa profase hasta la pubertad o despus. Durante este tiempo, los oocitos primarios completan su fase de crecimiento y adquieren una
cubierta gelatinosa externa, granulos corticales, ribosomas, mRNA, vitelo, etc. Despus de la pubertad, cada mes completa la meiosis un oocito. Los
espermatozoos se producen de manera continua desde la pubertad en adelante.
(dos cromtides) hacia cada polo. Sin embargo, para cada uno de
los 23 pares de homlogos es independiente la eleccin del hom
logo que ingresa con la clula hija. Esto permite que se produzcan
en una persona 22ii o alrededor de 8.4 X 106 posibles combinacio
nes de cromosomas parentales (fig. 2 - 10 ).
Recombinacin
Durante la profase de la meiosis I los homlogos en sinapsis dentro
de cada bivalente intercambian segmentos en una forma aleatoria.
En la etapa cigotena, cada par de homlogos comienza a formar un
complejo sinaptonemal que consiste en dos cromosomas en apo
sicin estrecha, separados por una protena de centro lineal larga. La
terminacin de este complejo marca el inicio de la etapa paquitena,
justo cuando ocurre la recombinacin (cruzamiento o cruce). El
cruce incluye la rotura fsica de la doble hlice en una cromtide
materna y otra paterna y la unin de los extremos paterno y ma
terno. En conjunto, la combinacin de recombinacin entre ho
mlogos en la profase I aunada a la segregacin independiente de
homlogos en la anafase I asegura que una clula individual pueda

producir un nmero casi ilimitado de gametos diferentes desde el
punto de vista gentico.
No se comprende el mecanismo que posibilita la alineacin de
los homlogos. Sin embargo, se piensa que para la recombinacin
se requiere esta aposicin cercana. Se cree que los nodulos de recom
binacin, ensambles muy grandes de mltiples protenas localizadas
a intervalos en el complejo sinaptonemal, median los fenmenos de
recombinacin. Es posible observar que los dos homlogos estn
unidos fsicamente en puntos especficos. Cada una de estas cone
xiones se describe como un quiasma e indica un punto de cruza
miento. En la meiosis masculina humana hay en promedio 55
quiasmas por clula y tal vez 50% ms en la meiosis femenina. En
el captulo 13 se consideran las consecuencias genticas del cruza
miento.
Adems de su funcin en la recombinacin, se piensa que los
quiasmas son esenciales para la segregacin correcta de cromosomas
en la meiosis I. Al conservar los homlogos materno y paterno de
cada par de cromosomas unidos en el huso hasta la anafase I (figs.
44
CAPTULO DOS
O
1 2 3 4
5 6 7 8 9 10111213141516171819202122 X
M a te rn o
1 2 3 4 5 |6 7 8 |9 (1011 i1 2 f1 3 !14 (l5(l6 {l718 |1 92 0|2 1 ;22 Y
P a te rn o
C lu la
s o m tic a
d ip lo id e
A ) [ i 12 |3 |4 |5 6 |7 8 9 [l0 |l1 [i2 [i3 r |4 [ l5 [ l 6 | l 7 [ l 8 [l920|21 |2 2 [y [
I 1 .1 i'RttiI ---r=lTif
9 1011 [ 2 j l 3 ( l 4 [15 16N718p9|20 21 22 [xj
B)
|l 2 |3 4 5 6 7 8 9 10 11 1213(14 15(16 17 18 19 20 21 22 Y l
E s p e rm a to zo o s
h a p lo id e s
D) |l 2 j3 |4 [5 |6 7|8|9[l0|nMNIl4|l5|l6h7|8|9|20|2l|22|x|
|
.........I
I ...... 1..........
"
.........I
I ......... I
I" " " "
E) [1 2 3 4 5 |6 |7 8 9 10 11 |l2|l3|l4 1516 17|l8|l9j2021 2 2 |X
Fig. 2-10. Meiosis: la segregacin independiente de homlogos maternos y paternos en la meiosis I produce el primer nivel de diversidad gentica.
Hay 223 u 8.4 millones de formas diferentes de tom ar un cromosoma de cada uno de los 23 pares en una clula diploide. Los gametos A-E muestran
tan slo cinco de las posibles combinaciones de cromosomas maternos y paternos. En este diagrama se Ignora la recombinacin, que introduce un
segundo nivel de diversidad gentica, lo que asegura que cada cromosoma individual que pasa es una mezcla de secuencias maternas y paternas.
2-11 y 2 - 12 ) tienen una funcin que es anloga a la de los centr-
meros en la mitosis y la meiosis II. Pruebas genticas indican que

los nios con nmeros incorrectos de cromosomas suelen ser el
producto de gametos en los que un bivalente careci de cruces.
Al parecer, la meiosis I I es idntica a la mitosis, excepto que
slo existen 23 cromosomas en lugar de 46. Cada cromosoma
consiste en dos cromtides y stas se separan en la anafase II; em
pero, hay una diferencia. Las cromtides hermanas de un cromo
soma mittico son idnticas, son copias una de la otra, pero las
dos cromtides de un cromosoma en la meiosis II pueden ser di
ferentes en sentido gentico como resultado de cruces en la meio
sis I (fig. 2 - 12 ).
2.3.3 Paramiento X-Y y regiones seudoautosmicas

En la meiosis femenina, cada cromosoma tiene un compaero por
completo homlogo y los dos cromosomas X hacen sinapsis y se
cruzan justo igual que cualquier otro par de homlogos. En la
meiosis masculina hay un problema. Los cromosomas humanos del
sexo X y Y son muy diferentes entre s. No obstante, en varones se
parean en la profese I, lo que asegura as que en la anafase I cada
clula reciba un cromosoma del sexo, sea X o Y. El pareamiento de
los cromosomas X y Y es terminoterminal y no a lo largo de toda
su longitud, y es posible por una regin base de 2.6 mega (Mb) de
homologa entre los cromosomas X y Y en las puntas de sus brazos
cortos. El pareamiento se sostiene por un cruce obligatorio en esta
regin. Los genes en el segmento de pareamiento tienen ciertas pro
piedades interesantes:
Se encuentran como copias homologas en los cromosomas X
y Y.
No estn sujetos a inactivacin X (como se esperara ya que ca
da sexo tiene dos copias).
Debido al cruzamiento, los alelos de estos locus no muestran
los patrones normales de herencia ligados a X o Y, sino que se
segregan como alelos autosmicos.
Debido a esta conducta, esta regin se conoce como regin mayor

seudoautosmica. En las puntas de los brazos largos de ambos cro
mosomas se halla una segunda regin seudoautosmica ms peque
a de 320 kb, pero el pareamiento y cruzamiento en esta regin
seudoautosmica menor no es una caracterstica obligatoria de la
meiosis masculina.
2.4
Estudio de los crom osom as

hum anos
2 A 1 Es posible observar cromosomas mitticos en

cualquier clula en divisin, pero en seres
humanos es difcil estudiar ios cromosomas
meiticos
Obtencin y preparacin de ciuias humanas
para anlisis cromosmico
En condiciones normales se observan los cromosomas en las clu
las en divisin y es difcil obtener clulas en divisin directamente
del cuerpo humano. La mdula sea es una posible fuente pero
siempre es mucho ms fcil obtener una fuente accesible de clulas
que no estn en divisin y cultivarlas en el laboratorio. Las fuentes
de clulas humanas que se utilizan ms a menudo para anlisis citogentico son las sanguneas y los fibroblastos de la piel. Casi nin
guna persona tiene inconveniente en proporcionar unos cuantos
mililitros de sangre y mediante tratamiento con lectinas, como la
fitohemaglutinina, es posible inducir con facilidad a los linfocitos
T sanguneos para que se dividan. Los fibroblastos de la piel se cul
tivan de biopsias de piel. Adems, el diagnstico prenatal incluye
de rutina anlisis cromosmicos en clulas fetales que se despren
den hacia el lquido amnitico o en vellosidades corinicas.
Aunque en algunos organismos se han descrito con precisin los
cromosomas tan temprano como en la dcada de 1880, durante
2.4
17
17 '
1
ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS 45
Leptoteno
------------------------------------- -
Los crom osom as son cadenas

finas no pareadas que consisten en
dos crom tides herm anas enlazadas
d e m odo estrecho
Gigoteno
17
Los hom logos m aterno y paterno se

parean entre s para form ar bivalentes
Paquiteno
Engrasam iento de los crom osom as
O curre el cruzam iento
Diploteno
Se separan los hom logos
pero se conservan juntos por
quiasm as
Pueden contarse los cruces
y registrarse las posiciones
Diacinesia
Bivalentes ms
contrados
Fig. 2-11. Meiosis: las cinco etapas de la profase en la meiosis I.

Se muestran dos pares representativos de homlogos. Hay dos cruzamientos en el cromosoma 1 bivalente y uno en el cromosoma 17 bivalente. Para
mayor claridad, los dos cruzamientos en el cromosoma 1 incluyen las dos mismas cromtides. En realidad, es probable que el nmero de cruzamientos
sea alto y mltiples cruzamientos pueden incluir tres o Incluso todas las cuatro cromtides en un bivalente, como se muestra en la figura 13-2.
muchos decenios todos los intentos por preparar dispersiones de

cromosomas humanos proporcionaron una maraa que impidi
analizarlos. La clave para obtener preparaciones diseminadas anali
zables fue una nueva tcnica, el desarrollo de clulas en suspensin
lquida y su tratamiento con solucin hipotnica para tornarlas tu
mefactas. Esto permiti obtener las primeras preparaciones de bue
na calidad en 19 5 6 . Se colocan los glbulos blancos de la sangre en
un medio de cultivo rico entrelazado con fitohemaglutinina y se
permite que crezcan durante 48 a 72 horas, cuando deben estar ya
en divisin libre. No obstante, debido a que la fase M slo ocupa
una parte pequea del ciclo celular, en realidad estn en divisin
pocas clulas en cualquier momento determinado.
El ndice mittico (proporcin de clulas en mitosis) se incre
menta al tratar el cultivo con un agente que altera el huso, como la
co lcem id a . Las clulas llegan a la fase M del ciclo, pero no son ca
paces de superarla y de esa forma se acumulan clulas en la metafase de la mitosis. Muchas veces es preferible estudiar crom osom a s en
la p rom eta fa se, que estn menos contrados y por consiguiente
muestran ms detalles. Los cultivos celulares pueden sincronizarse y
evitar de modo temporal que lleven a cabo el ciclo. Con frecuencia
eso se logra al aadir timidina en exceso (a fin de provocar una re
duccin de dCTP y originar un retraso de la sntesis de DNA, de tal
manera que las clulas permanezcan en la fase S). Cuando se supri
men los efectos de la timidina, las clulas progresan a travs del ciclo
de manera sincrnica. Mediante ensayo y error, un tiempo despus
de la supresin es posible determinar cuando se encuentra una bue

na proporcin de clulas en la etapa de prometafase deseada.
La meiosis slo puede estudiarse en muestras testiculares u ovricas.
La meiosis femenina es en especial difcil, ya que slo es activa en ova
rios fetales, en tanto que la meiosis masculina puede estudiarse en una
biopsia testicular de cualquier varn pospber que desee proporcionar
un espcimen. Los resultados de la meiosis pueden estudiarse al ana
lizar los cromosomas de espermatozoos, aunque la metodologa para
ello es molesta. En algunos modelos de investigacin de infecundidad
masculina se recurre al anlisis meitico.
Cariotipificacin y bandeo cromosmico

Hasta la dcada de 1970 se identificaron los cromosomas a partir
de su tamao y la posicin de los centrmeros. Esto hizo posible
clasificarlos en grupos (cuadro 2-3), pero no identificarlos sin am
bigedad. La introduccin de las tcnicas de bandeo (recuadro 2-2)
posibilit al final identificar cada cromosoma y asimismo definir
con mayor precisin puntos de rotura de translocacin, deleciones
subcromosmicas, etc. La resolucin del bandeo puede incremen
tarse mediante cromosomas ms alargados, por ejemplo cromoso
mas de la prometafase o ms temprano, en lugar de la metafase. Los
procedimientos tpicos de bandeo de alta resolucin para cromoso
mas humanos pueden proporcionar un total de 400, 550 u 850
bandas (figs. 2-13 y 2-14).
46
CAPITULO DOS
Fig. 2-12. Meiosis: de la metafase I a los gametos.

La figura es una continuacin de la tigura 2-11. A) De la m etalase a la d ivisi n ce lu la r en la m eiosis I. La figura muestra un posible patrn de segre
gacin de los dos bivalentes. B) M eiosis II. Aunque las dos cromtides hermanas de cada cromosoma se segregan a diferentes clulas hijas, los distin
tos cromosomas se comportan de manera independiente y, en consecuencia, como se muestra, son posibles muchas combinaciones.
La constitucin cromosomica se describe por un cariotipo que

seala el nmero total de cromosomas y la constitucin de cromo
somas del sexo. Los cariotipos normales de mujeres y varones hu
manos son 46,XX y 46,XY, respectivamente. Cuando hay una
anormalidad cromosomica, el cariotipo tambin describe el tipo
de anormalidad y las bandas o subbandas cromosmicas afectadas.
Vase el recuadro 2-3 para detalles de la nomenclatura de los cro
mosomas.
Los cromosomas se muestran en un cariograma (vase fig. 2-14;
con frecuencia denominado tan slo cariotipo). Los cariogramas se
preparaban al cortar una fotografa de los cromosomas homlogos
diseminados y compatibles; en la actualidad se utiliza una compu
tadora con un programa de anlisis de imgenes.
Como se comenta con detalle en el recuadro 2-2, el bandeo cro
mosomico consiste en someter los cromosomas a desnaturacin, di
gestin enzimtica, o ambos, seguido de la incorporacin de un
colorante especfico de DNA, que origina que los cromosomas hu
manos y otros mitticos se tian como una serie de bandas claras y
\ oscuras (figs. 2-13, 2-14; vase Craig y Bickmore, 1993). Son inte
resantes los patrones de bandeo (y asimismo tiles para citogenetistas) porque proporcionan pruebas de cierta clase de estructura en
regiones de 1 a 10 Mb. Los patrones de bandeo se correlacionan
con otras propiedades. Las regiones que se tien como bandas G
oscuras se replican tarde en la fase S del ciclo celular y contienen
cromatina ms condensada, en tanto que las bandas R (= bandas G
claras) suelen replicarse temprano en la fase S y tienen menos cromatina condensada. Los genes se concentran sobre todo en las ban
das R, mientras que el DNA de la banda G ms condensada, de
replicacin ms tarda, es menos activo en sentido transcripcional.
Existen asimismo diferencias en los tipos de elementos de repeti
cin dispersados que se hallan en las bandas G y R (secciones 9.5.2
y 9.5.3).
Es posible producir bandas similares a las G mediante tincin
con q u in a crin a , que enlaza de preferencia DNA abundante en AT,
en tanto que el patrn de bandeo R puede obtenerse con cro m o m icin a, que enlaza de modo preferencial DNA con abundancia de
GC. Aunque el porcentaje del contenido de AT del DNA de la
banda G humana slo es un poco mayor que el del DNA de la ban
da R, las bandas G son localm ente pobres en G-C (es decir, las ban
das G individuales siempre tienen un %GC ms bajo que sus
secuencias de flanqueo inmediatas; Niimura y Gojobori, 2002).
Saitoh y Laemmli (1994) sugirieron que la diferencia depende de
las variaciones de la formacin estructura central-asa. Se piensa que
las asas de cromatina se fijan a la estructura central de los cromoso
mas en regiones de fijacin de estructuras centrales (RFEC) es
peciales. Segn el modelo de Saitoh y Laemmli, las bandas G tienen
asas ms pequeas y una disposicin ms apretada de RFEC a lo lar
go de la estructura central. Ello significa ms RFEC por unidad de
longitud de DNA en las bandas G que en las R, que da lugar a una
tincin potente con colorantes selectivos de AT como Giemsa.
2.4 I ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS HUMANOS
A)
B)
47
C)
Fig. 2-13. Las diferentes resoluciones de bandeo cromosmico pueden determinar bandas, subbandas y sub-subbandas.
Se muestra el cromosoma 4 (acompaado de un idiograma) a niveles crecientes de resolucin que se aproximan a A) 400, B) 550 y C) 850 bandas por
juego haploide. Ntese la subdivisin de bandas en subbandas a medida que aumenta la resolucin. Adaptado a partir de Cross y Wolstenhoime
(2001). En: Human Cytogenetics: Constitutional Analysis, 3rd Edn (ed. D. E. Rooney). Reproducido con autorizacin de Oxford University Press.
Fig. 2-14. Cariograma de prometafase con bandeo G de cromosomas mitticos de linfocitos de un varn normal entre 550 y 850 bandas por juego
haploide.
Comprese con los ideogramas idealizados en la figura 2-15. Las longitudes totales de los cromosomas en metafase varan entre 2 y 10 /L/m; el DNA de
cada clula tendra alrededor de 2 m de largo, si se estirara. Reproducido a partir de Cross y Wolstenhoime (2001). En: Human Cytogenetics:
Constitutional Analysis, 3rd Edn (ed. 0. E. Rooney). Reproducido con autorizacin de Oxford University Press.
48
CAPTULO DOS
Cuadro 2-3. Grupos de cromosomas humanos
Grupo
Cromosomas
Descripcin
1-3
El ms grande; 1 y 3 son metacntricos pero 2 es submetacntrico
4,5
Grande; submetacntrico, con dos brazos de tamao muy diferente
6-1 2 ,X
Tamao mediano; submetacntrico
13-15
Tamao mediano; acrocntrico con satlites
16-18
Pequeo; 16 es metacntrico pero 17 y 18 son submetacntricos
19,20
Pequeo; metacntrico
2 1 ,22,Y
Pequeo; acrocntrico, con satlites en 21 y 22 pero no en la Y
Los autosomas se numeran del ms grande al ms pequeo, excepto que el cromosoma 21 es ms pequeo que el 22.
Recuadro 2-2. Bandeo crom osom ico

Bandeo G: se someten los cromosomas a digestin controlada con trip
sina antes de teirse con filernsa, un colorante qumico que enlaza DNA.
Las bandas oscuras de tincin positiva se conocen como bandas G. Las
bandas plidas son G negativas.
Bandeo Q: se tien los cromosomas con un colorante fluorescente que
se enlaza de modo preferencial a DNA abundante en AT. com o la Quinacrina, DAPI (4 ',6 damidino-2-fenilindol) u Hoechst 33258 y se observan
mediante fluorescencia V. Las bandas fluorescentes se denominan ban
das Q e indican los mismos segmentos cromosmicos que las bandas G.
Bandeo R: es en esencia el patrn inverso (del ingls reverse) del patrn
de bandeo G. Los cromosomas se desnaturalizan mediante calor en so
lucin salina antes de teirse con Giemsa. El tratamiento con calor des-
2.4.2 Citogentica molecular: hibridacin fluorescente

in situ (HFIS) cromosomica
La h ib rid a ci n cro m o som ica in situ estndar consiste en hibridar
una sonda de DNA marcada con DNA cromosmico desnaturali
zado que se encuentra en una preparacin de cromosomas en me
talase en un portaobjetos para microscopio secado al aire. Con
anterioridad se marcaban sondas con radioistopos que a menudo
proporcionaban relaciones de ruido: seal altas, pero el desarrollo
de HFIS cromosomica (hibridacin de fluorescencia in sitii) (vase
Trask, 1991; Van Ommen y cois., 1995) ofreci una sensibilidad y
resolucin mejores en grado notorio (vase en la figura 2-16 el m
todo bsico). En este caso, se marca la sonda de DNA de forma di
recta mediante la incorporacin de un precursor de nucletidos
marcado con fluorescencia, o de manera indirecta con la incorpo
racin de un nucletido que contiene una molcula rastreadora (o
reportera) (como biotina o digoxigenina), que despus de incorpo
rarse en el DNA es enlazada a continuacin por una molcula de
afinidad marcada con fluorescencia (vase seccin 6.1.2). Con el
fin de incrementar la intensidad de la seal de hibridacin, casi
siempre se prefieren sondas de DNA grandes, si se dispone de ellas.
La HFIS tiene la ventaja de proporcionar resultados rpidos que
pueden calificarse de manera conveniente con la vista mediante un
!
vm
I n mi
naturaliza DNA abundante en AT y las bandas R son Q negativas. Puede
producirse el mism o patrn al enlazar colorantes especficos de GC como
cromomicina A3, olivomicina o mitramicina.
Bandeo T: identifica un subgrupo de bandas R que estn concentradas
sobre todo en los telmeros. Las bandas T son las bandas R que se tien
de modo ms intenso y se observan mediante un tratamiento por calor en
especial Intenso del cromosoma antes de teirlo con Giemsa, o con una
combinacin de colorante y fluorocromos.
Bandeo C: se piensa que demuestra heterocromatina constitutiva, sobre
todo en los centrmeros. De manera tpica, los cromosomas se exponen
a desnaturalizacin con una solucin saturada de hidrxido de bario, an
tes de teirse con Giemsa.
m icroscop io d e flu o rescen cia (para los principios bsicos subyacen

tes de la microscopia fluorescente, vase fig. 6-5). En la HFIS cromo
somica convencional se emplean dispersiones en metafase (HFIS d e
m etafas) y las seales de hibridacin positiva con frecuencia se
muestran como puntos dobles, que corresponden a la sonda hibridada a ambas cromtides hermanas (fig. 2-17A). Con un tipo de
procesamiento de imgenes complicado y molculas de enlace ras
treadoras que llevan diferentes fluorforos es posible mapear y or
denar varias clonas de DNA de manera simultnea.
La resolucin mxima de la HFIS en la metafase es de varias
megabases. El uso de los cromosomas de la prometafase ms exten
didos puede permitir una resolucin de 1 Mb, pero debido a pro
blemas con el doblamiento de la cromatina pueden aparecer dos
seales de sonda marcadas de modo preferencial de lado a lado, a
menos que estn separadas por distancias mayores de 2 Mb. Sin
embargo, en fecha reciente se desarrollaron nuevas variaciones, co
mo la HFIS de fibra, que incluye el estiramiento artificial de fibras
de DNA o cromatina, que permite una resolucin ms alta (vase
Heiskanen y cois., 1996). La HFIS en los cromosomas de ncleos
de interfase (HFIS de interfase; vase fig. 2-17B) tambin puede
suministrar un anlisis de alta resolucin porque los cromosomas es
tn muy extendidos en forma natural comparados con los cromoso
mas de la metafase o prometafase.
2.5 ! ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS
49
Recuadro 2-3. N o m e n c la t u r a d e l c r o m o s o m a h u m a n o
El International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) est
fijado por el Standing Committee on Human Cytogenetic Nomenclature
(vase lecturas adicionales). La terminologa bsica para el bandeo de
cromosomas se decidi en una reunin en Pars en 1971 y con frecuen
cia se conoce com o nomenclatura de Pars.
Las localizaciones en el brazo corto se marcan p ip e tit) y en los brazos
largos q (queue). Cada brazo del crom osom a est dividido en regiones
marcadas p1, p2, p3, etc., y q1, q2, q3, etc., con conteo hacia fuera
desde el centrmero. Las regiones estn delimitadas por referencias
especficas, que son caractersticas m orfolgicas consistentes y pre
cisas, com o los extremos de los brazos del cromosoma, el centrmero
y ciertas bandas. Las regiones se dividen en bandas marcadas p11
(uno-uno, no once!), p1 2 , p13, etc., subbandas marcadas p1 1 .1 , p1 1 .2 ,
2.4.3 Pintado cromosomico, cariotipificacin molecular

e hibridacin com parativa del genoma
Pintado cromosomico estndar
Una aplicacin especial de la HFIS ha sido el uso de sondas de
DNA en las que el DNA de inicio est compuesto de un conjunto
grande de diferentes fragmentos de DNA slo de un tipo de cro
mosoma. Estas sondas pueden prepararse al combinar todos los in
sertos de DNA humano en una biblioteca de DNA especfica de
cromosomas (vase seccin 8.3.2). De forma alternativa, es posible
amplificar fragmentos especficos de seres humanos a partir de c
lulas hbridas monocromosmicas humanas (un tipo de clula hbri
da de ser humano y roedor en la que hay un juego completo de
cromosomas de roedor aunado slo a un tipo de cromosoma hu
mano (vase recuadro 8-4 para los detalles en la forma en que se
preparan clulas hbridas; las secuencias humanas pueden amplifi
carse de forma selectiva mediante Alu-PCR, un mtodo de PCR en
el que se usan oligonucletidos iniciadores (cebadores) derivados de
la secuencia repetida AIu que no se encuentra en el genoma de roe
dores; vase recuadro 5-1).
La seal de hibridacin resultante representa las contribuciones
combinadas de mltiples clonas de DNA marcadas, derivadas de
muchos diferentes locus que abarcan un cromosoma completo, una
p in tu ra d e l crom osom a, y en consecuencia causa fluorescencia de
todos los cromosomas (pintado cromosomico; vase Ried y cois.,
1998 y fig. 2-16 para la base del mtodo). La figura 2-4 muestra un
ejemplo de pintado cromosomico en ncleos en interfase, pero ca
si todo el pintado cromosomico se lleva a cabo en cromosomas en
metafase. Una aplicacin importante es la definicin de reordena
mientos nuevos y marcado de cromosomas en citogentica clnica y
del cncer (vase fig. 2-18 para un ejemplo). Es en particular til
en citogentica del cncer en la que las preparaciones de cromoso
mas tumorales suelen ser de mala calidad.
Cariotipificacin molecular e hibridacin fluorescente

in situ multiplex (HFIS-M)
El pintado cromosomico se limit al inicio por el nmero relativa
mente pequeo de colorantes fluorescentes de distintos colores
(fluorforos) que podan emplearse para distinguir distintos cromo-
etc. y sub-subbandas, por ejemplo p1 1 .2 1 , p1 1 .22, con conteo en cada

caso hacia fuera del centrmero (figs. 2-13 y 2-15).
La distancia relativa del centrmero se indica con las palabras proximal y distai. Por consiguiente, Xq proximal significa el segmento del bra
zo largo de X que est ms cerca del centrmero, en tanto que 2p distal
indica la porcin del brazo corto del cromosoma 2 que est ms distante
del centrmero, y en consecuencia ms cerca del telmero. Otros trm i
nos comunes son los que se indican ms adelante.
Cuando se comparan cromosomas humanos con los de otras especies,
el acuerdo es utilizar la primera letra del nombre de gnero y las dos prime
ras letras del nombre de especie (p. ej., HSA18 significa humano: Homo sapiens, cromosoma 18).
somas. A fin de incrementar el nmero de diferentes blancos que

pueden detectarse, suelen utilizarse un marcado combinatorio
(sondas de marcado individuales con ms de un tipo de fluorforo) y la proporcin de marcado (diferentes proporciones de los dis
tintos fluorforos) (vase Lichter, 1997). Los colores mixtos no se
detectan mediante microscopa de fluorescencia estndar con fil
tros apropiados. Por el contrario, es preferible el anlisis digital au
tomatizado de imgenes mediante el cual se asignan a diversas
combinaciones de fluorforos seudocolores artificiales.
Los mtodos anteriores permitieron en fecha reciente observar
de modo simultneo los 24 cromosomas humanos, una forma de
cariotipificacin molecular. El mtodo general se conoce como
HFIS multiplex (HFIS-M) y emplea imgenes digitales adquiridas
por separado de cada uno de estos cinco fluorforos diferentes me
diante una cmara CCD (dispositivo de carga acoplado). Las imge
nes se analizan con un grupo de programas de computadora que
generan una imagen compuesta en la cual a cada cromosoma se le
proporciona un seudocolor diferente segn sea la composicin del
fluorforo. Estos mtodos son aplicables en especial para analizar
muestras tumorales en las que son en especial frecuentes reordena
mientos cromosmicos complejos (vase fig. 17-10 para un ejemplo).
Hibridacin comparativa del genoma (HCG)

Una extensin adicional del pintado cromosmico es la hibridacin
comparativa del genoma (HCG) que incluye el pintado simultneo
de cromosomas en dos colores diferentes y que utiliza como sondas
DNA total de dos fuentes relacionadas, que se espera que muestren
diferencias que incluyen la ganancia o prdida de regiones subcromosmicas o incluso de cromosomas completos. Una aplicacin
comn es el anlisis de muestras tumorales para prueba de regiones
del genoma que se amplificaron, o en las que hubo prdidas cromosmicas. Estas se identifican al comparar las proporciones de las
dos seales de color cromosoma por cromosoma (vase fig. 17-3
para un ejemplo).
2.5 Anormalidades de ios cromosomas

Las anormalidades de los cromosomas podran definirse como
cambios que dan por resultado una alteracin visible de los cromo-
50 j CAPTULO DOS j ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
1 1 2 11
11.2 11
11.21
11.22
11.23
21.1
21.2
21.3
31.2
31.3
31.2
31.3
37.1
37.2
37.3
12
13
O
13:1
21.2
21.3
22.1
22.2
22.3
14.1
14.2
14.3
21.1
24.1
24.2
24.3
12
13
14
15
11.32
11.31
11.2
21.2
21.3
13.2
13.1
Itt
11.2
15
n
12.1
12.2
12.3
11:1
13.1
13.2
18
19
20
C lave:
iQ
C en tr m ero
rD N A
H etero cro m atin a
no cen tro m rica
22
Fig. 2-15. Patrn de bandeo de cromosomas humanos.

Se muestra una recopilacin de los mejores patrones de bandeo que podran observarse en cada cromosoma y no una fotografa de la forma en que apare
cen al microscopio los cromosomas en cualquier clula. Los cromosomas estn numerados en orden de tamao, excepto que el 21 es en realidad ms
pequeo que el 22. Las disposiciones de genes de DNA ribosmico repetidos en los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos 1 3 ,1 4 ,1 5 , 21 y 22
aparece con frecuencia como tallos delgados que llevan perillas de cromatina (satlites). La heterocromatina constitucional ocurre en los centrmeros, en
gran parte del brazo largo del cromosoma Y en las constricciones secundarias en 1q, 9q y 16q y en los brazos cortos de los cromosomas acrocntricos.
2.5
ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS
B U SQ U ED A ESTNDAR
PINTADO
C R O M O S O M IC O
C onjunto heterogneo de
m uchas clonas d e D N A con
insertos derivados de
m uchas diferentes regiones
d e un m ism o crom osom a
C LO N A P U R IFIC A D A DE DNA
Preparacin d e crom osom a en
portaobjeto para m icroscopio
Desnaturalizacin d e DNA
M arcado que incorpora

nucletidos con fluorforo
unido; desnaturalizar
in situ
Sonda nica de marcado
Enlace de
sonda nica
51
Pintado cromosomico
D ejar fijar (annea/),

exponer a UV y observar
la fluorescencia in situ
Enlace d e pintado
crom osom ico
Fig. 2-16. Bases de la HFIS de cromosomas y mtodos de pintado cromosomico.

Nota: para efectos de simplificacin, slo se muestra el resultado final en cromosomas en metafase. Vase las figuras 2-17A y 2-17B para ejemplos de
HFIS en metafase y HFIS en interfase, respectivamente, y las figuras 2-18 y 2-4 para ejemplos de pintado cromosomico en cromosomas en metafase e
interfase, de modo respectivo.
somas. La cuanta de lo que puede observarse depende de la tcni

ca utilizada. La prdida o ganancia ms pequea de material visible
mediante los mtodos tradicionales en preparaciones citogenticas
estndar es alrededor de 4 Mb de DNA. Sin embargo, la HFIS per
mite observar cambios mucho ms pequeos; el desarrollo de la citogentica molecular elimin cualquier lnea divisoria clara entre
los cambios descritos como anormalidades cromosmicas y los que
se piensa que son defectos moleculares o del DNA. Una definicin
alternativa de anormalidad cromosmica es una anormalidad pro
ducida por mecanismos especficamente cromosmicos. Casi todas
las aberraciones cromosmicas se originan por pares errneos de
cromosomas rotos, recombinacin inapropiada o mala segregacin
de cromosomas durante la mitosis o la meiosis.
Las anormalidades cromosmicas, sean constitucionales o so

mticas, corresponden sobre todo a dos categoras: anomalas nu
mricas y estructurales (vase recuadro 2-4). En ocasiones se
identifican anormalidades en las que los cromosomas tienen el n
mero y estructura correctos, pero representan contribuciones desi
guales de los dos padres (seccin 2.5.4). Tal vez de forma
inesperada corrigen problemas de origen parental.
2.5.2 Las anormalidades cromosmicas numricas

incluyen ganancia o prdida de cromosomas
completos
Es posible distinguir tres clases de anormalidades cromosmicas
numricas: poliploida, aneuploida y mixoploida.
2.5.1 Tipos de anormalidad cromosmica

Las anomalas cromosmicas pueden clasificarse en dos tipos segn
sea la extensin con que ocurren en las clulas del cuerpo. En todas
las clulas corporales existe una anormalidad constitucional. Cuando
sucede, la anomala debe presentarse muy temprano en el desarrollo,
con mayor probabilidad como resultado de un espermatozoo u vu
lo defectuosos, o tal vez fecundacin anormal o un fenmeno an
malo en el embrin muy temprano. Slo en ciertas clulas o tejidos
de un individuo existe una anormalidad somtica (o adquirida).
Como resultado, un individuo con una anomala somtica es un mo
saico (fig. 4-10), contiene clulas con dos constituciones cromosmi
cas diferentes y ambos tipos de clulas derivan del mismo cigoto.
Polipioida
Uno a 3% de los embarazos humanos reconocidos son triploides. La
causa ms usual es la de dos espermatozoos que fecundan un vulo
(dispermia); algunas veces se debe a un gameto diploide (fig. 2-19).
Los triploides muy rara vez sobreviven hasta el trmino y el trastorno
no es compatible con la vida. La tetraploida es mucho ms rara y
siempre mortal. Por lo regular se debe a falta de terminacin de la pri
mera divisin cigtica: se replic el DNA para dar un contenido 4C,
pero a continuacin no se efecta la divisin celular en forma normal.
Aunque la poliploida constitucional es rara y mortal, todas las perso
nas normales tienen algunas clulas poliploides (seccin 3.1.4).
52
CAPTULO DOS
Fig. 2-17. HFIS de dos colores en metafase e interlase para detectar el reordenamiento BCR-ABL en la leucemia mieloide crnica.
Casi todos los casos de leucemia mieloide crnica resultan de una translocacin recproca en t(9 ;22 ) que genera la fusin de genes entre el
oncogn ABL en 9q34 y el gen BCR en 22q11 (vase fig. 17-4 para detalles). Se muestra la hibridacin con sondas marcadas para ABL (seal roja)
y BCR (seal verde) para cromosomas en metafase de un paciente con LMC (a la izquierda y con las reas dentro de los crculos con rayas
aumentadas en los dibujos de la parte media) y para cromosomas de interfase del mismo paciente (fotografa de la derecha). Los genes ABL y
BCR normales emiten seales estndar roja y verde, respectivamente (nota: son visibles las seales en la metafase de las dos cromtides hermanas
cuando menos en el caso del gen ABL). Las flechas blancas muestran seales caractersticas para el gen de fusin BCR-ABL en los dos crom oso
mas de translocacin (der[9] y der[22]). stas pueden identificarse por la colocacin muy cercana de las seales roja y verde y la superposicin de
las seales roja y verde aparece en naranja-amarillo. Imagen proporcionada por Fiona Hardng, Institute of Human Genetics, Newcastle Upon Tyne.
Aneuploida
J
|
Fig. 2-18. Puede utilizarse el pintado cromosmico para definir

reordenamientos de cromosomas.
En este caso se investig un cromosoma X anormal, con presencia de
material cromosmico adicional en el brazo corto, identificado median
te cariotipificacin de una muestra de sangre perifrica, con pintado
completo del cromosoma X (rojo) y pintado completo del cromosoma 4
(verde). Esta imagen confirma que el material adicional que se en
cuentra en el brazo corto del crom osom a X anormal se origin del
crom osom a 4. La tincin de fondo de los cromosomas emplea el co
lorante DAPI azul. Imagen proporcionada por Gareth Breese, Institute
of Human Genetics, Newcastle Upon Tyne.
Euploida significa la presencia de un juego completo de cromoso

mas (n, 2n, 3n, etc.). La aneuploida es lo opuesto: se encuentran
uno o ms cromosomas individuales en una copia adicional o fal
tan en un juego euploide. Trisoma significa tres copias de un cro
mosoma particular en una clula por otra parte diploide, por
ejemplo trisoma 21 (47,XX+21 o 47,XY+21) en el sndrome de
Down. Monosoma es la falta correspondiente de un cromosoma,
por ejemplo monosoma X (45,X) en el sndrome de Turner. Con
frecuencia, las clulas cancerosas muestran aneuploida extrema,
con mltiples anormalidades cromosmicas (vase fig. 17-10). Las
clulas aneuploides surgen por dos mecanismos principales:
No disyuncin: falta de separacin (desunin) de cromosomas
pareados en la anafase de la meiosis I o falta de desunin de
cromtides hermanas en la meiosis I I o la mitosis. La no dis
yuncin en la meiosis produce gametos con 22 o 24 cromoso
mas, que despus de la fecundacin por un gameto normal
producen un cigoto trismico o monosmico. La no disyun
cin en la mitosis crea un mosaico.
Retraso de la anafase: falla de un cromosoma o una cromtide para incorporarse en uno de los ncleos hijos despus de la
divisin celular, como resultado del movimiento tardo (retra
so) durante la anafase. Los cromosomas que no penetran en el
ncleo de la clula hija se pierden.
Mixoploida (mosaicismo y quimerismo)

Mixoploida significa la presencia de dos o ms linajes de clulas di
ferentes en sentido gentico en un mismo individuo. Las poblacio-
2.5 [ ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS
nes celulares distintas desde el punto de vista gentico pueden ori

ginarse del mismo cigoto (mosaicismo) o ms rara vez surgir de di
ferentes cigotos (quimerismo). Vase la seccin 4.3.6 y la figura
4-10 para una explicacin ms completa. Las anomalas que seran
mortales en forma constitucional pueden ser compatibles con la vi
da en mosaicos.
Son comunes m osaicos d e aneuploidia. Por ejemplo, el mosaicis
mo que da por resultado una proporcin de clulas normales y otra
de clulas aneuploides (p. ej., trismicas) puede atribuirse a no dis
yuncin o retraso del cromosoma que ocurre en una de las divisio
nes mitticas del embrin temprano (cualquier clula monosmica
que se forma suele morir).
En ocasiones se encuentran m o sa ico sp o lip lo id es (p. ej., mosai
cos humanos diploide/triploide). Como es muy poco probable la ga
nancia o prdida de un juego haploide de cromosomas por no
disyuncin mittica, los mosaicos humanos diploides/triploides se
originan con gran probabilidad por la fusin del segundo cuerpo po
lar con uno de los ncleos segmentados del cigoto diploide normal.
Consecuencias clnicas de las anormalidades numricas

La presencia de un nmero errneo de cromosomas tiene conse
cuencias importantes, por lo general mortales (cuadro 2-4). Aun
que el cromosoma 21 adicional en un varn con sndrome de
Down es un cromosoma del todo normal, heredado de un padre
normal, su presencia causa mltiples anomalas congnitas. Las
monosomas autosmicas tienen consecuencias incluso ms catas
trficas que las trisomas. Estas anormalidades deben ser conse
cuencia de un desequilibrio en los niveles de productos gnicos
codificados en distintos cromosomas. El desarrollo y la funcin
normales dependen de innumerables interacciones entre productos
gnicos, incluidos muchos que se codifican en diferentes cromoso
mas. La alteracin de las cifras relativas de cromosomas afecta estas
interacciones.
53
D u p lic a c i n d e D N A
pe ro sin d ivisi n c e lu la r
(en d o m ito s is)
T e tra p lo id a
Fig. 2-19. Orgenes de triploida y tetraploida.
La presencia de un nmero errneo de cromosomas del sexo tie

ne, con mucho, menos efectos perjudiciales que la existencia de un
nmero errneo de cualquier autosoma. Muchas veces, las personas
47,XXX y 47,XYY funcionan dentro de los lmites normales; los
varones 47,XXY tienen problemas relativamente menores compa
rados con personas que presentan cualquier trisoma autosmica, e
incluso la monosoma, en mujeres 45,X, tiene pocas consecuencias
mayores. De hecho, ya que las personas normales pueden tener uno
o dos cromosomas X, y uno o ninguno Y, deben existir mecanismos
especiales que permitan el funcionamiento normal con nmeros
variables de cromosomas del sexo. En el caso del cromosoma Y, se
debe a que lleva muy pocos genes, cuya funcin importante slo es
determinar el sexo masculino. En el cromosoma X humano, el me
canismo especial en mamferos de in a ctiv a ci n d e l crom osom a X
1
R e c u a d r o 1 i . N o m e n c la t u r a d e a n o r m a li d a d e s c r o m o s m ic a s
Anorm alidades num ricas:
Triploida
Trisoma
Monosoma
Mosaicismo
69,XXX, 69.XXY, 69.XYY

p. ej. 47,X X ,+21a
p. ej. 45,X
p. ej. 47.XXX/46.XX
Anorm alidades estructurales:

Delecin
Inversin
Duplicacin
Insercin
Anillo
(del ingls ring)
Marcador
Translocacin
recproca
Translocacin
robertsoniana
(da lugar a un
cromosoma
derivado)
p. ej. 46,XYdel(4) (p16.30b; 46,XX,del (5)(q13q33)b

p. ej. 46,XYnv(11)(p11p15)
p. ej. 46,XX,dup(1)(q22q25)
p. ej. 46,XX,ins(2)(p13q21q31)c
p. ej. 46,XY,r(7)(p22q36)
p. ej. 47,XX,+m ari
p. ej. 46,XX,t(2;6)(q35;p21.3)e
p. ej.45,XYder(14;21)(q10;q10)'
p. ej. 46,XX,der(14;21 )(q10;q10),+ 2 1 9
Notas:
aLa ganancia de un cromosoma est indicada por + ; la prdida de un cro
mosoma por
bDelecin terminal (punto de rotura en 4p16.3) y delecin intersticial
(5q13-q33).
cUn reordenamiento de una copia del cromosoma 2 por insercin del seg
mento 2q21-q31 dentro de un punto de rotura en 2p13.
Cariotipo de una clula que contiene un cromosoma marcador (un cro
mosoma adicional no identificado).
eUna translocacin reciproca equilibrada con puntos de rotura en 2q35 y
6p21.3.
fUn portador equilibrado de una translocacin robertsoniana 14:21. q10
no es en realidad una banda cromosomica sino que indica el centrmero;
der significa derivado del cromosoma (y se utiliza cuando est presente
un cromosoma de una translocacin).
8Translocacin de sndrome de Down; un paciente con un cromosoma
normal 14, una translocacin robertsoniana cromosomica 14;21 y dos
copias normales del cromosoma 2 1 .
sta es una nomenclatura corta; una nomenclatura ms complicada est
definida por el ISCN que permite la descripcin completa de cualquier
anormalidad cromosomica; vase Lecturas adicionales.
54 { CAPITULO DOS ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
(seccin 10.5.6) controla el nivel de los productos gnicos que co

difica X al margen del nmero de cromosomas X que se encuen
tren en la clula.
La monosoma autosmica es, de manera invariable, mortal en
la etapa ms temprana de la vida embrionaria. En cada cromosoma
hay tal vez unos cuantos genes en los que la reduccin del nivel del
producto gnico al 50% es incompatible con el desarrollo. Asimis
mo, si bien esta reduccin no es desde luego patognica para la ma
yor parte de los genes (seccin 16.4.2), puede tener efectos menores
y la combinacin de cientos o miles de estos efectos menores pue
de ser suficiente para alterar el desarrollo normal del embrin. Las
trisomas dan lugar a un cambio ms pequeo que las monosomas
en los niveles relativos de productos gnicos y sus efectos son un
poco menores. Los embriones trismicos sobreviven ms tiempo
que los monosmicos y las trisomas 13, 18 y 21 son compatibles
con la supervivencia hasta el nacimiento. Como hecho interesante,
al parecer estos tres cromosomas contienen relativamente pocos ge
nes (seccin 9.1.4).
No es tan obvia la razn por la que la triploida es mortal en se
res humanos y otros animales. Con tres copias de cada autosoma,
la dosis de genes autosmicos est equilibrada y no debe causar pro
blemas. Los triploides siempre son estriles porque los tripletos de
cromosomas no pueden formar pares y segregarse de modo correc
to en la meiosis, pero muchas plantas triploides son sanas y vigoro
sas en todos los otros aspectos. La letalidad en animales se explica
quiz por un desequilibrio entre los productos codificados en el

cromosoma X y los autosomas, que es incapaz de compensar la
inactivacin del cromosoma X.
2.5.3 Las anormalidades cromosmicas estructurales

resultan de la reparacin errnea de roturas de
cromosomas o del mal funcionamiento del sistema
de recombinacin
Las roturas cromosmicas ocurren como resultado de dao del
DNA (p. ej., por radiacin o sustancias qumicas) o como parte del
mecanismo de recombinacin. En la fase G2 del ciclo celular (fig.
2-1) los cromosomas consisten en dos cromtides. Las roturas que
suceden en esta etapa se manifiestan como roturas de cromtides
y slo afectan a una de las dos cromtides hermanas. Si las roturas
que ocurren en la fase G1 no se reparan antes de la fase S, se pre
sentan ms tarde como roturas cromosmicas, que afectan a ambas
cromtides. Las clulas tienen sistemas enzimticos que reconocen,
y tal vez reparan, extremos cromosmicos rotos. Las reparaciones
pueden incluir la unin entre s de dos extremos rotos o la adicin
de un telmero a uno de ellos. En condiciones normales, los meca
nismos de punto de control del ciclo celular (seccin 18.7.3) impi
den que las clulas con roturas cromosmicas no reparadas inicien
la mitosis; si no es posible reparar el dao, la clula se suicida
(apoptosis).
Consecuencias de anormalidades cromosmicas numricas

Poliploida
Triploida (69,XXX, XXY o XYY)
1-3% de todas las concepciones; casi nunca nace vivo; no sobrevive
Aneuploida (autosomas)
Nulsoma (falta de un par de homlogos)
Mortal antes de la implantacin
Monosoma (falta de un cromosoma)
Mortal embrionaria
Trsoma (un cromosoma adicional)
Por lo general mortal en las etapas embrionaria o fetal; pero en las trisomas 13 (sndrome de Patau) y
18 (sndrome de Edwards) pueden sobrevivir hasta el trmino y la trsoma 21 (sndrome de Down)
suele sobrevivir hasta los 40 aos de edad o ms
Aneuploida (cromosomas del sexo)

Cromosomas del sexo adicionales
(47,XXX; 47,XXY; 47,XYY) presenta problemas relativamente menores, con tiempo de vida normal
Ausencia de un cromosoma del sexo
45,X = sndrome de Turner. Alrededor de 99% de los casos se aborta de form a espontnea; los
sobrevivientes tienen inteligencia normal pero son infecundos y muestran signos fsicos menores. 45,Y
= no viable.
Cuadro 2 - ~ Anormalidades estructurales que resultan de la reparacin errnea de roturas cromosmicas o recombinacin
entre cromosomas no homlogos
Un cromosoma afectado
Una rotura
Dos roturas
Tres roturas
Delecin terminal (cicatrizado por adicin de telmero)

Delecin intersticial; inversin
Cromosoma anular (fig. 2-20)
Duplicacin o delecin por intercambio desigual
de cromtides hermanas (fig. 11-7)
Varios reordenamentos, por ejemplo inversin
con delecin, insercin intracromosmica
Dos cromosomas afectados
Translocacin recproca (fig. 2-21)

Translocacin robertsoniana (fig. 2-21)
Duplicacin o delecin por recombinacin desigual (fig. 11-7)
Insercin intercromosmica (directa o invertida)
2.5 ANORMALIDADES DE LOS CROMOSOMAS
Dos roturas en el mismo brazo
Inversin
paracntrica
Delecin
intersticial
Dos roturas en diferentes brazos
Inversin
pericntrica
Crom osom a
anular
Fig. 2-20. Posibles resultados estables de dos roturas en un mismo

cromosoma.
Las anormalidades estructurales se presentan cuando las roturas

no se reparan de forma correcta. A condicin de que no haya extre
mos rotos libres, es posible pasar a travs de los puntos de control
del ciclo celular. Por consiguiente, algunas veces se unen entre s los
extremos rotos errneos. Cualquier cromosoma acentrico (falta de
un centromero) o cromosoma dicntrico (que posee dos centrmeros) resultante no se segrega de manera estable en la mitosis y al
final se pierde. Sin embargo, los cromosomas con un centromero
pueden propagarse de modo estable a travs de rondas sucesivas de
mitosis, incluso si son anormales desde el punto de vista estructu
ral. La recombinacin meitica entre cromosomas pareados de for
ma errnea es una causa comn de translocaciones, en especial en
la espermatognesis. En el cuadro 2-5 se resumen las principales
anormalidades estructurales estables.
Una clase adicional rara de anormalidad estructural que no se
muestra en el cuadro 2-5 es la de los isocromosomas. Son cromoso
mas simtricos que poseen dos brazos largos o dos brazos cortos de un
cromosoma particular. Se piensa que surgen de un intercambio anor
mal tipo U entre cromtides hermanas justo cerca del centrmero de
un cromosoma. Los isocromosomas humanos son raros excepto i(Xq)
e i(21q), que es una causa ocasional de sndrome de Down.
Las anomalas cromosmicas estructurales se equilibran si no hay
ganancia o prdida neta de material cromosmico y desequilibran si
hay ganancias o prdidas netas. En general, las anormalidades equili
bradas (inversiones, translocaciones equilibradas) no tienen efecto en
el fenotipo, aunque hay excepciones importantes a ello:
Una rotura cromosomica puede alterar un gen esencial.
La rotura puede afectar la expresin de un gen, aunque eso no
altere la secuencia de codificacin. Puede separar un gen de un
elemento de control o colocar el gen en un ambiente de cro
matina inapropiado, por ejemplo la translocacin de un gen
normalmente activo dentro de la heterocromatina.
S atlites
T R A N S L O C A C I N
R O B E R TS O N IA N A
Intercam bio en
brazos cortos
proxim ales
P rdida
C ro m osom as
dicntrico + acntrico
In estables en la m itosis
55
Translocacin
recproca es tab le
Translocacin ro bertsonian a
estable
Fig. 2-21. Orgenes de translocaciones.

Los cromosomas dicntricos y acntrcos son inestables durante toda la mitosis. Se producen translocaciones robertsonianas por intercambios entre
los brazos cortos proximales de los cromosomas acrocntricos 1 3 ,1 4 ,1 5 , 21 y 22 (las disposiciones de genes de DNA rbosmico repetidos en los
brazos cortos de los cromosomas acrocntricos 1 3 ,1 4 ,1 5 ,2 1 y 22 aparecen con frecuencia como tallos delgados que llevan perillas de cromatna,
satlites). En una translocacin robertsoniana se encuentran los dos centrmeros pero funcionan com o uno y el cromosoma es estable. Se pierde el
fragmento acntrico pequeo, pero ello no tiene consecuencias patolgicas porque slo contiene secuencias repetidas de rDNA, que tambin se
encuentran en los otros cromosomas acrocntricos.
56 | CAPTULO DOS | ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
G a m e to s
F e c u n d a c i n
p o r g a m e to
n o rm a l
n
J jL
C ig o to s
N o rm a l
Portador
balanceado
Monosom a parcial
Trsoma parcial
Fig. 2-22. Resultados de la meiosis en un portador de una translocacin recproca equilibrada.

Tambin son posibles otros modos de segregacin, por ejemplo segregacin 3:1. No es fcil predecir la frecuencia relativa de cada posible gameto. El
riesgo de que un portador tenga un nio con cada uno de los posibles resultados finales depende de su frecuencia en los gametos y asimismo de la
posibilidad de que un concepto con dicha anormalidad se desarrolle hasta el trmino. Vase el libro de Gardner y Sutherland (Lecturas adicionales) para
la discusin.
Translocaciones equilibradas del autosoma X que causan pro

blemas con la inactivacin de X (fig. 14-10).
Las translocaciones robertsonianas se denominan en ocasiones fu
siones cntricas, pero es errneo porque de hecho las roturas se en
cuentran proximales en los brazos cortos. La translocacin del
cromosoma es en verdad dicntrica, pero debido a que dos centrmeros estn muy cerca entre s funcionan como uno y el cromoso
ma se segrega de manera regular. Las partes distales de los brazos
cortos se pierden como un fragmento acntrico. Los brazos cortos
de cromosomas acrocntricos slo contienen disposiciones de genes
RNA ribosmicos repetidos y la prdida de dos brazos cortos no
tiene efecto fenotpico. Debido a que no existe este ltimo, las
translocaciones robertsonianas se consideran equilibradas, aunque
de hecho se perdi cierto material.
Las anormalidades desequilibradas pueden surgir de modo di
recto, por delecin o, rara vez, duplicacin, o de manera indirecta
por segregacin errnea de cromosomas durante la meiosis en un
portador de una anomala equilibrada. Los portadores de anorma
lidades estructurales equilibradas pueden tener problemas durante
la meiosis, si no corresponden las estructuras a los pares homlogos
de cromosomas:
Un portador de una translocacin recproca equilibrada puede
producir gametos que, despus de la fecundacin, originan un
nio por entero normal, un portador equilibrado desde el pun
to de vista fenotpico normal o varios cariotipos desequilibra

dos que siempre combinan monosoma por parte de uno de los
cromosomas con trisoma de parte del otro (vase fig. 2 -22 ).
No es posible hacer afirmaciones generales sobre las frecuencias
relativas de estos resultados finales. El tamao de cualquier seg
mento desequilibrado depende de la posicin de los puntos de
rotura. Si los segmentos desequilibrados son grandes, es proba
ble que el feto se aborte de manera espontnea; un desequili
brio de segmentos ms pequeos puede tener como resultado
nios anormales que nacen vivos.
Un portador de una translocacin robertsoniana equilibrada
puede producir gametos que despus de la fecundacin dan lu
gar a un nio del todo normal, un portador equilibrado en sen
tido fenotpico normal o un concepto con trisoma o
monosoma completas para uno de los cromosomas relaciona
dos (fig. 2-23).
Un portador de una inversin pericntrica puede tener una
descendencia desequilibrada porque los homlogos invertidos
y no invertidos forman un asa cuando se parean de tal manera
que se parean segmentos compatibles a lo largo de todo el cro
mosoma. Si ocurre un cruce dentro del asa, el resultado es un
cromosoma que lleva una delecin y duplicacin desequilibra
das. Las inversiones cromosmicas paracntricas forman asas
similares, pero cualquier cruce dentro del asa genera un cromo-
2.5 j ANORMALIDADES DELOS CROMOSOMAS
N o rm a l
P o rta d o r
eq u ilib ra d o
(Trisom a 14)
(M o n o so m a 14)
(M o nosom a 21 )
_57
Tris o m a 21
v.
Fig. 2-23. Resultados de la meiosis en un portador de una translocacin robertsoniana.

Los portadores son asintomticos pero con frecuencia producen gametos desequilibrados que pueden dar por resultado un cigoto monosmico o
trism ico. Los cigotos monosmico y trism ico en este ejemplo no se desarrollaran hasta el trmino.
soma acntrico o dicntrico que no es probable que sobreviva.

En el libro de Gardner y Sutherland (lectura adicional) o cual
quier otro texto de citogentica se menciona con ms detalles
la meiosis en portadores de inversiones.
2.S.4 Los com plem entos eromosmcos al parecer

norm ales pueden ser patognicos si tienen
el origen parental errneo
Las raras anomalas que se describen ms adelante demuestran que
no es suficiente tener el nmero y estructura correctos de cromoso
mas; tambin deben tener el origen parental apropiado. Los con
ceptos 46,XX en los que ambos genomas se originan del mismo
padre (diploida uniparental) nunca se desarrollan de forma co
rrecta. En algunos cromosomas individuales, la presencia de ambos
homlogos derivados del mismo padre (disoma uniparental) tam
bin causa anormalidades. Un nmero pequeo de genes lleva la im
pronta de su origen parental (seccin 10.5.4) y se expresa de manera
diferente segn sea el origen. Se presupone que las anomalas de di
soma y diploida uniparentales se deben a la expresin anormal de
estos genes improntados.
La diploida uniparental se observa en molas hidatidiformes,
conceptos anormales con un cariotipo 46,XX de origen exclusiva
mente paterno. Los embarazos molares muestran hiperplasia dise
minada del trofoblasto, pero sin partes fetales y tienen un riesgo
considerable de transformarse en cariocarcinomas. Estudios de

marcadores genticos muestran que casi todas las molas son homocigotas en todos los locus, lo que indica que surgieron por duplicacin
cromosmica de un espermatozoo. Los teratomas ovricos resultan
de diploida uniparental materna. Son tumores benignos raros del
ovario que consisten en tejidos embrionarios desorganizados, sin
membranas extraembrionarias. Se originan por activacin de un
oocito no ovulado.
La disoma uniparental (DUP), que afecta slo a un par de ho
mlogos, no se diagnostica si el resultado no es anormal, pero se de
tecta por cromosomas en los que producen sndromes caractersticos
(vase recuadro 16-6). La DUP puede incluir isodisoma, en la que
los dos homlogos son idnticos, o heterodisomla, cuando derivan de
ambos homlogos en un padre. Se piensa que la causa usual es res
cate de trisoma: un concepto que es trismico y que de otra mane
ra morira en ocasiones pierde un cromosoma por no disyuncin
mittica o retraso de anafase de una clula totipotente. La progenie
euploide de esta clula forma el embrin, en tanto que todas las c
lulas aneuploides mueren. Si cada una de las tres copias tiene una
posibilidad igual de perderse, habr dos de tres probabilidades de
que se pierda un cromosoma aislado, lo que conduce a la constitu
cin cromosmica normal y una en tres posibilidades de disoma
uniparental (sea paterna o materna). La isodisoma uniparental pue
de surgir tal vez por presin de seleccin en un embrin monosmi
co para lograr la euploida mediante la duplicacin selectiva del
cromosoma monosmico.
58
CAPITULO DOS i ESTRUCTURA Y FUNCIN DE LOS CROMOSOMAS
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CAPTULO
TRES
Clulas y desarrollo
60
CAPTULO TRES | CLULAS Y DESARROLLO
Con excepcin de los virus, toda la vida consiste en clulas com

partimientos acuosos limitados por membranas que interactan en
tre s y con el ambiente-. Cada clula se origina por divisin o
fusin de clulas preexistentes. Finalmente debe haber una cadena
ntegra de clulas que conduce de nuevo a la primera clula primor
dial satisfactoria que vivi tal vez hace 3.5 miles de millones de aos.
Cmo se form esa clula? Es una pregunta interesante.
Algunas clulas son organismos unicelulares independientes,
que pueden llevar a cabo todas las actividades necesarias para con
servar la vida y deben ser capaces de reproducirse. Por tanto son en
extremo sensibles a cambios en su ambiente, por lo general tienen
ciclos de vida muy cortos y en consecuencia son adecuadas para
proliferar con rapidez. Como resultado pueden adaptarse rpido a
cambios en su alrededor las mutantes que son ms capaces de so
brevivir en un ambiente particular pueden florecer muy rpido.
Ello dio lugar a una enorme gama de microorganismos unicelula
res que evolucionaron para ajustarse a diferentes nichos ambienta
les, en ocasiones extremos. Sin embargo, la complejidad de estos
microorganismos siempre es limitada.
En comparacin, los organismos multicelulares tienen una mayor
longevidad y los cambios en el fenotipo son lentos de manera corres
pondiente. Su xito se basa en la reparticin de diferentes funciones
a distintos tipos celulares, y la disponibilidad resultante de numero
sas formas de interaccin de clula con clula proporciona un poten
cial enorme de complejidad funcional. El ciclo de vida de algunos
microorganismos unicelulares, como el moho del limo Diclyostelium
discoideum, tiene una etapa multicelular, pero existen de modo pre
dominante como clulas nicas. En contraste los animales y las plan
tas son multicelulares durante toda su existencia vegetativa, con
clulas germinales especializadas que facilitan la reproduccin. Los
organismos multicelulares pueden variar mucho de tamao, forma y
nmero de clulas, pero en todos los casos la vida se inicia con una
clula. El proceso de desarrollo, desde la clula nica hasta el orga
nismo maduro, incluye muchas rondas de divisin celular durante las
que las clulas deben tornarse cada vez ms especializadas y organi
zarse en patrones precisos. Su conducta e interacciones durante el de
sarrollo moldea la morfologa total del organismo.
3.1 Estructura y diversidad de clulas

3.1.1
eucariotas representan la
dm sifi fundamenta* de las term as de d a I
Las clulas pueden clasificarse en grupos taxonmicos amplios de

acuerdo con diferencias en su organizacin interna y distinciones
funcionales mayores que surgen de la divergencia evolutiva tempra
na (vase fig. 3-1). La principal divisin de los organismos en pro
cariotas y eucariotas se basa en diferencias fundamentales en la
arquitectura celular (fig. 3 -2 ).
Las clulas procariotas tienen una organizacin interna simple,
notablemente carente de organelos y compartimientos intracelulares. No poseen un ncleo definido. El DNA cromosmico, que no
parece estar muy organizado, existe como un complejo de ncleoprotenas conocido como nucleoide. Las clulas procariotas se ob
servan hasta cierto punto sin rasgos caractersticos bajo el
microscopio electrnico. Sin embargo, las procariotas estn muy le
jos de ser primitivas, puesto que han existido a travs de muchas
Protistas
ID
o
P ro to p h y ta
LU
Pa ita s
M e ta p h y ta
Hongos
P ro to zo a
Unicelular
Aninr
,ales
M e ta z o a
Multicelular
Fig. 3-1. Clasificacin de organismos unicelulares y multicelulares.

Nota: los protistas incluyen organismos unicelulares que se clasificaron
como animales (protozoarios), plantas (protofitos) y hongos (p. ej., leva
dura), pero muchos protistas no se clasifican en ninguno de estos grupos.
ms generaciones de evolucin que los humanos. Comprenden dos

reinos de vida: bacterias (llamadas con anterioridad eubacterias pa
ra diferenciarlas de las archaebacterias) y archaea (un grupo de or
ganismos muy mal comprendido que semeja en forma superficial a
las bacterias y por esa razn antes se denominaban archaebacte
rias). Todos los organismos procariotas son unicelulares. Las bacte
rias se encuentran en muchos ambientes y algunas son patgenas
para el hombre. Con frecuencia las archaea se hallan en ambientes
extremos, como primaveras cidas calientes, pero algunas especies
se encuentran en localizaciones ms aptas para la convivencia jun
to con eubacterias (p. ej., en el intestino de las vacas). El genoma
procariota tpico se considera de manera convencional como un
cromosoma circular nico que contiene menos de 10 Mb de DNA.
Sin embargo, este concepto se desafi en fecha reciente conforme
ms especies procariotas se caracterizaron a detalle y se descubrie
ron estructuras genmicas diversas. Por ejemplo, se identificaron
procariotas que poseen mltiples cromosomas circulares o lineales,
mezclas de cromosomas circulares y lineales, y genomas hasta de 30
Mb de tamao (p. ej., Bacillus megateriurn).
Se piensa que las clulas eucariotas aparecieron por primera vez
hace alrededor de 1.5 miles de millones de aos. Tienen una orga
nizacin mucho ms compleja que sus contrapartes procariotas,
con membranas internas y organelos limitados por membranas, in
clusive un ncleo (vase recuadro 3-1). Slo se conoce un reino de
organismos eucariotas -el eukaryapero abarca tanto especies uni
celulares (p. ej., levaduras, protistas, algas) como multicelulares (en
especial animales y plantas). En todos los organismos eucariotas co
nocidos el genoma comprende dos o ms cromosomas lineales con
tenidos dentro del ncleo. Cada cromosoma es una molcula
aislada de DNA muy larga empacada en una forma elaborada y
3.1 I ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD DE CLULAS
E u c a ro ta
61
P ro c a rio ta
1 0 (OTTI
N u c le o lo
C p s u la
P a re d c e lu la r
N c le o
R ib o s o m a s
M to c o n d ria
Fig. 3-2. Anatoma de las clulas procariota y eucarota.

La clula eucarota que se muestra en esta figura es una clula animal genrica. Los ejemplos de tipos individuales de clulas se describen en el recuadro 3-6.
muy organizada con histonas y otras protenas. El nmero y el con

tenido de DNA de los cromosomas varan mucho entre las especies
v, aunque la tendencia se dirige a que el tamao del genoma sea pa
ralelo a la complejidad del organismo, se observan excepciones no
tables (vase seccin 3.1.4). Adems de los organelos mayores, las
porciones solubles tanto del citoplasma como del nucleoplasma es
tn altamente organizadas. En el ncleo se identific una diversi
dad de estructuras subnucleares dispuestas en el contexto de la
matriz nuclear (vase recuadro 3-1). El citoplasma alberga una red
compleja de diferentes clases de filamentos protenicos llamados en
conjunto citoesqueleto, que determina la forma y el movimiento
de la clula, y proporciona un esqueleto para el transporte intracelular (vase recuadro 3-2).
3.1.2 El tam ao y la form a de las clulas puede variar

enorm em ente, pera los ndices de difusin fijan
algunos lmites superiores
Muchos factores afectan el tamao de las clulas (Su y OTarrel,
1998; Saucedo y Edgar, 2002). Las clulas dependen de la difusin
para coordinar sus actividades metablicas y sus interacciones con el
ambiente y con otras clulas. Conforme su tamao aumenta, la rela
cin entre superficie y volumen disminuye. Se piensa que la estruc
tura interna simple de las clulas procariotas limita su tamao
mximo por lo general las clulas bacterianas tienen 1 mcm de di
metro-. Las membranas internas complejas y la compartamentaliza-
cin de las clulas eucariotas pueden ser importantes para permitir

les crecer ms. No obstante, las regiones internas con actividad metablica rara vez se encuentran a ms de 15 a 25 |i.m de la superficie
celular y ello limita el tamao de la clula a cerca de 50 |j,m. En rea
lidad el dimetro promedio de las clulas en un organismo multice
lular se encuentra dentro de los lmites de 10 a 30 mcm. Algunas
clulas especializadas pueden crecer mucho ms de este tamao. Por
ejemplo, las neuronas suelen alcanzar hasta 1 m de largo, aunque eso
refleja la proyeccin de axones largos y muy delgados, en tanto que
el cuerpo celular permanece bastante dentro de los parmetros co
mentados. Los vulos tambin son clulas muy grandes. Los vulos
de los mamferos tienen alrededor de 100 mcm de dimetro, pero los
de otros animales que almacenan nutrimentos necesarios para el de
sarrollo pueden ser mucho mis grandes. La clula ms grande que se
conoce es el huevo de avestruz, que puede alcanzar hasta 20 cm de
largo y tiene un volumen aproximado al de 24 huevos de pollo.
3.1.3 Es organism os m ulticelulares, se observa

una diferenciacin fundam ental entre clulas
som ticas y ia linea germinal
Las funciones vegetativas y de la reproduccin estn separadas en los
organismos multicelulares. Una poblacin de clulas germinales es
pecializadas para realizar las funciones de la reproduccin se encuen
tra aparte, en tanto que la funcin de las clulas somticas restantes
consiste en proporcionar un recipiente en el que estas clulas repro-
62 } CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
Recuadro 3-1. Organizacin intracelular de las clulas animales

La diversidad de organelos demuestra la complejidad de las clulas eucariotas, pero a causa de la especializacin funcional no siempre se encuentran
los mismos organelos en todos los tipos de clulas. Algunas clulas huma
nas muestran variaciones extremas (p. ej los glbulos rojos maduros care
cen de ncleo y los queratinocitos diferenciados terminalmente no poseen
organelos en lo absoluto). En otros casos se hallan organelos particulares en
muy pocos tipos de clulas y se requieren para funciones especificas. Por
ejemplo, las clulas epiteliales que recubren el aparato respiratorio contienen
cilios para eliminar las partculas contaminantes de los pulmones, en tanto
que los espermatozoos maduros son las nicas clulas humanas que po
seen flagelos. Sin embargo, casi todas las clulas contienen un paquete es
tndar" de organelos cuyas funciones se comentan a continuacin.
NCLEO: el depsito del material gentico
El ncleo contiene la inmensa mayora (por lo general 99.55%) del DNA
de una clula animal, en la forma de cromosomas lineales. Est rodeado
por una envoltura nuclear, compuesta de dos membranas separadas por
un espacio estrecho que se contina con el retculo endoplsmico (vase
ms adelante). El resto de la clula se conoce como citoplasma y est
constituido por diversos organelos, membranas y un compartimiento
acuoso denominado citosoL La comunicacin entre el ncleo y el cito
plasma se efecta a travs de poros nucleares, aberturas en la envoltu
ra nuclear que estn rodeadas por complejos de poro nuclear. Estos
ltimos son complejos protenicos que actan como transportadores es
pecficos de macromolculas entre el ncleo y el citoplasma.
Dentro del ncleo, los cromosomas estn dispuestos en una forma muy
ordenada, que indica la existencia de una subestructura compleja conoci
da como matriz nuclear, una red de protenas y RNA a la que se fijan los
cromosomas mediante secuencias de DNA que se denominan regiones
de fijacin de matriz (RFM). El ncleo presenta otras estructuras discernibles que sugieren una organizacin compleja de diferentes procesos bio
qumicos. El nuclolo es una regin discreta en la que el RNA ribosmico
(rRNA) se sintetiza y procesa En este organelo se localizan los genes del
rRNA, que se encuentran de manera predominante como grupos en los
brazos cortos de los cromosomas 1 3 ,1 4 ,1 5 , 21 y 22 en clulas huma
nas. El alto contenido de RNA confiere al ncleo su aspecto denso en las
fotomicrografas electrnicas. Se identifican otros corpsculos nucleares
pero estn menos bien caracterizados. Por ejemplo, se piensa que los cor
psculos de Cajal (que tambin se conocen como corpsculos arrollados
o gems) son los sitios de sntesis de partculas de ribonucleoproteina nu
clear pequea (snRNP) y tambin pueden participar en la regulacin gnica. Est demostrado que el ncleo contiene varios factores de
transcripcin y protenas reguladoras del ciclo celular, localizados en fo
cos, que a menudo se relacionan con locus genticos particulares. Esto
sugiere que la cromatina se incorpora en regiones de transcripcin acti
va en sitios nucleares particulares, en contraste con el concepto tradicio
nal de que los factores de transcripcin se difunden con libertad alrededor
del ncleo. Un ejemplo en particular interesante es el corpsculo LPM, que
aparece como un anillo y est compuesto sobre todo por la protena de
leucemia premeloctca (LPM). En pacientes con leucemia premieloctca
aguda, una translocacin que incluye el gen de LPM y otro gen que codi
fica un receptor de cido retinoico genera una protena de fusin que no
puede formar corpsculos de LPM en forma normal. El tratamiento con
cido retinoico restablece la capacidad de la clula para formar corpscu
los de LPM quizs al permitir que la protena se localice correctamente y
asimismo conduce a remisin del cncer. Al parecer otros corpsculos nu
cleares participan en procesos de transcripcin corriente abajo. Incluyen
fibrillas de pericromatina (sitios de acumulacin de RNA naciente), cor
psculos de segmentacin (sitios de poliadenilacin y segmentacin) y
manchitas o grupos de grnulos de intercromatina (que participan en el
corte y la unin del RNA).
MITOCONDRIAS: las centrales de energa de clulas eucariotas aerobias

Las mitocondrias, una caracterstica notable en el citoplasma de la ma
yor parte de las clulas eucariotas, son los organelos que se encargan de
generar energa. La cadena respiratoria mitocondrial es una serie de cin
co complejos protenicos unidos a la membrana, que incluye varias quinonas, citocrom os y protenas de hierro y azufre. El conjunto de estos
complejos tiene a su cargo la fosforilacin oxidativa, una reaccin en la
que el oxgeno molecular oxida los nutrimentos orgnicos y la energa qu
mica resultante se utiliza para generar ATR Medante la difusin subse
cuente a todas las otras partes de la clula, el ATP puede donar su energa
almacenada (por hidrlisis de ATP o ADP) y la energa liberada se emplea
para impulsar numerosas funciones celulares.
Aunque su tamao es variable, el dimetro de las mitocondrias suele ser
de alrededor de 1 mcm, similar al de las clulas bacterianas. Las m itocon
drias tienen dos membranas: una externa, hasta cierto punto lisa, y una
membrana mitocondrial interna compleja que posee un rea de superfi
cie muy grande por numerosos dobleces (crestas). El compartimiento in
terno, la matriz mitocondrial, es una solucin acuosa muy concentrada de
muchas enzimas e intermediarios qumcos relacionados con el metabolis
mo energtico.
Las mitocondrias (y los cloroplastos de las clulas vegetales) son los ni
cos otros organelos eucariotas que contienen DNA. Asimismo albergan ribosomas propios que son distintos de los que se encuentran en el citosol.
Los rbosomas mitocondriales se usan para traducir el mRNA transcrito
del DNA mitocondrial. Esta prueba y otras sugieren que las mitocondrias
son descendientes de bacterias aerobias que vivieron en simbiosis con
los precursores de clulas eucariotas (seccin 12.2.1). Sin embargo, el
DNA mitocondrial slo puede especificar unas cuantas de las funciones
mitocondriales y casi todas las protenas mitocondriales son codificadas
por genes del ncleo. En el ltimo c a s tv ll mRNA se traduce en ribosomas en el citosol y a continuacin las protenas resultantes se llevan al in
terior de las mitocondrias.
RETCULO ENDOPLSMICO: un sitio mayor de sntesis de protenas
y lpidos
El retculo endoplsmico consiste en vesculas aplanadas, de membrana
nica, cuyos compartimientos internos, las cisternas, se conectan entre
s para form ar conductos a travs del citoplasma. Desde los puntos de
vista fsico y funcional se divide en dos componentes. El retculo endopls
mico rugoso, llamado as porque la superficie est cubierta de rbosomas
que son ms grandes que los que se encuentran en las mitocondrias, en
tanto que el retculo endoplsmico liso carece de cualquier ribosoma ad
herido. Las protenas sintetizadas por los rbosomas que se adhieren al
retculo endoplsmico rugoso cruzan la membrana del retculo endopls
m ico y aparecen en el espacio intracisternal. Desde este sitio se trans
portan a la periferia de la clula, donde se incorporarn a la membrana
plasmtica, restaurarn el retculo endoplsmico o se secretarn por
completo de la clula. Muchas protenas humanas son glucosiladas (tie
nen residuos de azcar aadidos a ellas) y este proceso se inicia en el re
tculo endoplsmico.
APARATO DE GOLGI: la maquinaria para secrecin
El complejo de Golgi consiste en vesculas aplanadas, de membrana ni
ca, con frecuencia apiladas. Las principales funciones del aparato de Gol
gi comprenden la secrecin de productos celulares, como protenas,
hacia el exterior y la formacin de las membranas plasmtica y lisosmica. Vesculas pequeas surgen en la periferia mediante un proceso de
desprendimiento por pellizcado y algunas de estas vesculas concentran
productos secretorios (vacuolas secretorias). Las glucoprotenas que
llegan del retculo endoplsmico se modifican en forma adicional en el
complejo de Golgi.
3.1 ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD DE CLULAS
63
Recuadro 3-1. (con tinuaci n)

PEROXISOMAS (MICROCUERPOS): especialistas en qumica peligrosa
Los peroxisomas (microcuerpos) son vesculas pequeas de membrana
nica que contienen una diversidad de enzimas que emplean oxgeno m o
lecular para oxidar sus sustratos y generar perxido de hidrgeno. Este l
tim o lo utiliza una enzima peroxismica mayor, catalasa, para oxidar una
gran variedad de compuestos. Las especies de oxgeno reactivo, como
perxido, y los radicales superxido son muy txicos para las clulas y
deben guardarse con cuidado extremo.
LISOSOMAS: rganos digestivos intracelulares
Los lisosomas son vesculas pequeas, delineadas por una membrana,
que contienen enzimas hidroltcas, como ribonucleasa y fosfatasa. Los li
sosomas participan en la digestin de materiales que llegan al interior de
la clula por fagocitosis o pinocitosis y ayudan a degradar los componen
tes celulares despus de la muerte de la clula.
MEMBRANA PLASMTICA (MEMBRANA CELULAR): confn protector de
la clula
La membrana plasmtica est compuesta por una bicapa fosfolpida en
cuyo interior se localizan grupos lpidos hidrofbicos. Se encuentran en
tre grupos fosfato hidroflicos que estn en contacto con un ambiente
acuoso polar en ambos lados, el exterior de la clula y el citoplasma. Ade
ms de proporcionar una barrera casi siempre protectora, la membrana
plasmtica tiene una diversidad de funciones importantes:
es selectivamente permeable, regula el transporte de diversos iones
y molculas pequeas al interior y el exterior de las clulas. Contiene
sistemas de transporte activo para diversos iones, com o Na+ , K+ y
Ca2+ , y varios nutrimentos, por ejemplo, glucosa y aminocidos, as
como diversas enzimas importantes:
contiene una variedad de protenas integrales de membrana o prote
nas unidas a una cara de la membrana que desempean funciones
importantes en el sealamiento intercelular.
CITOSOL: una solucin acuosa muy concentrada y estructurada
El cltosol, el componente acuoso del citoplasma, constituye alrededor de
la mitad del volumen de la clula y es el sitio de mayor actividad metab
lica, que incluye casi toda la sntesis de protenas y el metabolismo inter
mediario. El citosol, que tambin contiene componentes solubles, est

muy organizado por una serie de filamentos protenicos que se denomi
nan en conjunto citoesqueleto y desempean una funcin importante
tanto en el movimiento y la forma de las clulas como en el transporte in
tercelular (vase recuadro 3-2).
CILIOS y FLAGELOS: trasladadores y agitadores
Los cilios y los flagelos son estructuras que se extienden desde la mem
brana plasmtica y se emplean para facilitar el movimiento. Los cilios son
estructuras pequeas que se baten hacia atrs y adelante o giran. Con fre
cuencia los microorganismos unicelulares se desplazan por el movimiento
coordinado de miles de cilios, pero en animales estas estructuras tambin
se encuentran en clulas fijas en las que se usan para desplazar comentes
de lquido. En humanos, los cilios se hallan en clulas epiteliales que recu
bren las vas respiratorias (donde impulsan el moco y cualquier partcula de
material contenido en l hacia fuera de los pulmones) y el oviducto (en el que
proporcionan una corriente para desplazar el vulo hacia el tero). Los cilios
tambin se hallan en una estructura embrionaria muy pequea llamada nu
do (vase seccin 3.7.5), donde su rotacin produce el movimiento del l
quido perinodal a un lado del embrin. Se piensa que este proceso es
Importante en la especificacin del eje de izquierda a derecha del embrin
(recuadro 3-7). Los flagelos son estructuras ms grandes que se mueven
en forma similar a un ltigo. Aunque muchos microorganismos unicelulares
se desplazan por flagelos, a diferencia de los cilios, slo suele haber uno o
dos por clula. Las nicas clulas humanas que poseen flagelos son los es
permatozoos, que los utilizan como un medio de propulsin. Tanto los cilios
como los flagelos estn compuestos por haces de filamentos microtubulares, con una estructura caracterstica '9 + 2 ' (nueve microtbulos dobles
externos rodeados por dos microtbulos nicos en el centro) o una '9 + 0'.
Estas estructuras se unen a corpsculos basales bajo la membrana plas
mtica, que se originan por la duplicacin repetida de centriolos durante la
diferenciacin celular (vase recuadro 2.1). El movimiento se produce por el
deslizamiento entre s de la pareja externa de microtbulos, que est contro
lado por la protena motora dinena. Las deficiencias de dinena en humanos
ocasionan el sndrome de cilios inmviles, que se caracteriza por infec
ciones respiratorias recurrentes y defectos de lateralidad, y tambin cau
san infertilidad por la Imposibilidad de los vulos para llegar al tero y la
incapacidad de los espermatozoides para mover sus colas.
Recuadro 3-2. Citoesqueleto; elemento fundamental para el movimiento y la forma celulares, y un armazn
estructural mayor para el transporte intracelular
El citoesqueleto de las clulas eucariotas es una estructura interna de fila
mentos proteinicos que proporciona estabilidad, genera la fuerza necesa
ria para el movimiento y los cambios en la forma de la clula, facilita el
transporte intracelular de organelos y permite la comunicacin entre ia
clula y su ambiente. Hay tres tipos de filamentos citoesquelticos: microfilamentos de actina, microtbulos (hechos de tubulina) y filamentos in
termedios (elaborados con una diversidad de diferentes protenas, algunas
especficas de tipo celular). Las actinas y las tubulinas se conservaron
bastante durante la evolucin. Los microfllamentos y los microtbulos son
estructuras muy dinmicas y tambin estn polarizados debido a la asime
tra durante la polimerizacin de las subunldades de actina y tubulina a par
tir de las cuales se forman. Por tanto los polmeros crecen por la fijacin
de nuevas subunidades en ambos extremos pero a ritmos distintos, lo que re
sulta en un crecimiento ms rpido de la punta denominada extremo plus
( + ) y uno ms lento de la terminacin que se conoce com o extremo
minus ( - ) . A los filam entos polarizados suelen enlazarse clases espe
cficas de protenas motoras que se mueven de manera constante a lo
largo de ellos en una direccin, impulsados por hidrlisis de ATR
Vi
Los filamentos de actina (tambin llamados microfilamentos) pueden dis

ponerse en haces paralelos o enlazados semejantes a redes. Proporcionan
apoyo mecnico en la forma de fibras para esfuerzo, posibilitan cambios con
trolados de la forma de la clula (p. e j constricciones apicales, constriccio
nes durante la divisin celular) y facilitan el movimiento de la clula por
estructuras como filopodios y lamelipodios (extensiones de la clula que le
permiten desplazarse a lo largo de superficies). Los filamentos de actina son
la base de estructuras especiales, como las microvellosidades, las placas de
adherencia y el proceso acrosmico de la cabeza del espermatozoo. Consis
ten en polmeros helicoidales de dos cadenas de la protena actina y tienen
un dimetro aproximado de 7 a 8 nm. Interactan con miembros de la superfamilia miosina de protenas motoras. Las interacciones entre actina y miosina en las clulas musculares forman unidades contrctiles que confieren a
las clulas musculares su potencia de contraccin. Las actinas tambin tie
nen una funcin celular ms general en las clulas no musculares, por ejem
plo, permitir que las membranas se invaginen, como en la endocitosis.
Los microtbulos son cilindros huecos largos, de unos 25 a 30 nm de di
metro, y mucho ms rigidos que los filamentos de actina. Estn formados
64
CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
3 - 2 . (C
por el ensamble de una serie de polmeros basados en residuos alternados
de tubulina y tubulina p. Con los microtbulos se vinculan miembros de
dos superfamilias de protenas motoras, dinenas y cinesinas, cuya funcin
consiste en mover elementos particulares a lo largo de los trayectos de los
microtbulos en la clula. sta es el modo en que las mitocondrias, los apilamientos de Golgi y las vesculas secretorias, por ejemplo, llegan a sus si
tios apropiados dentro de la clula. Las dinenas y las cinesinas se mueven
a lo largo de los microtbulos en direcciones opuestas.
Por lo general los extremos minus de microtbulos individuales en clu
las animales convergen en un centro de organizacin de m icrotbulos
(COMT), que se localiza en una porcin del citoplasma adyacente al n
cleo. En casi todas las clulas animales se encuentra un centro nico y
ductoras puedan transportarse y un medio para lograr la reproduc

cin (Wylie, 2000). En trminos evolutivos, los animales pueden
considerarse incubadores y facilitadores para el espermatozoo y los
vulos que permiten que la especie se reproduzca. Aunque en plan
tas y animales primitivos, las clulas somticas ordinarias pueden
dar lugar a clulas germinales durante toda la vida del organismo, en
casi todos los animales que se conocen a detalle insectos, nematodos y vertebrados- las clulas germinales se sitan aparte muy tem
prano en el desarrollo, como una lnea germinal especializada, y
representan la nica fuente de gametos. Las clulas germinales son
las nicas clulas del cuerpo capaces de efectuar la meiosis y por
consiguiente son las nicas clulas que dan lugar a descendientes haploides que pueden tomar parte en la fecundacin. Las clulas de la
lnea germinal en mamferos se originan a partir de clulas germi
nales primordiales (CGP) que en el caso de los humanos surgen du
rante la segunda semana del desarrollo.
3.1.4 Los organism os m ulticelulares no poseen dos

clulas que porten la misma secuencia exacta
de DNA
Como se describi en la seccin 2 . 1 , el contenido de referencia del
DNA de las clulas, el valor C, lo proporciona el juego de cromo
somas haploides (n), como en las clulas espermatozoo y vulo. Es
te valor vara de manera muy amplia para los diferentes organismos
bien definido de este tipo, que se conoce com o centrosoma. Durante la

divisin celular, los microtbulos forman el huso m it tico y los filamen
tos de los microtbulos se fijan a un ensamble protenico (el cinetocoro)
localizado en los centrmeros de los cromosomas en duplicacin y ase
guran el movimiento ordenado de los cromosomas hacia las dos clulas
hijas (recuadro 2-1). Asimismo los microtbulos forman el ncleo de ci
lios y flagelos que se estudi en el recuadro 3-1.
Los filamentos intermedios tienen 7 a 11 nm de dimetro y una funcin
principalmente estructural. No estn polarizados y no se vinculan con pro
tenas motoras. Los neurofilamentos (especficos de las clulas neurales)
y las queratinas (especiales de clulas epiteliales) son protenas filam en
tosas intermedias.
y la falta de una relacin directa entre el valor C y la complejidad

biolgica se conoce como paradoja del valor C. Por ejemplo, en
tanto que la mayor parte de los mamferos tiene un tamao de genoma haploide en los lmites de unos 2 500 a 3 500 Mb de DNA,
sorprende un poco encontrar que el contenido de DNA haploide
de una clula humana es slo 19% del de una cebolla, 4% del de
algunos lirios y apenas 0.5% del de un eucariota unicelular, Amoeba dubia (vase cuadro 3-1 y la base de datos de tamaos del genoma en (http://www.cbs.dtu.dk/databases/DOGS).
En un mismo individuo tambin se observa una variacin consi
derable en el contenido de DNA como resultado de diferencias en el
nmero de copias del juego de cromosomas (ploida). Aunque casi
todas las clulas somticas humanas son diploides, existen excepcio
nes. Como se comenta en el recuadro 3-1, algunas clulas diferencia
das terminalmente, como los glbulos rojos, los queratinocitos y las
plaquetas, carecen de ncleo y se describen como nuliploides. Otras
clulas son poliploides como resultado de la replicacin de DNA sin
divisin celular (endomitosis) o de la fusin celular. Por ejemplo, la
ploida de los hepatocitos vara de 2 n a 8 n, la de los cardiomiocitos (clulas de msculo cardiaco) de 4 n a 8 n y la de los megacariocitos gigantes de la mdula sea de 16 n a 64 n. Las ltimas clulas
originan de modo individual miles de clulas plaquetarias nuliploides
(fig. 3-3). La poliploida que se debe a fusin celular ocasiona que al
gunas clulas que ocurren de manera natural (p. ej., fibras muscula
res) tengan mltiples ncleos diploides y formen un sincitio (fig. 3 -3 ).
V aso sa n g u n eo (s e n o s sa n g u n eo s )
Las plaq uetas

b ro tan del p ro ce so
del m e ga ca riocito
Fig. 3-3. Algunas clulas se forman por fragmentacin o fusin de otras clulas.
Las plaquetas se forman por gemacin de un megacariocito gigante. Carecen de ncleo. Las clulas musculares se forman por fusin de un gran nme
ro de clulas mioblastos.
3.1 I ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD DE CLULAS
Cuadro 3-1 Paradoja del valor C : el tamao del genoma no

se relaciona simplemente con la complejidad del organismo
Ta m a o de l
genom a
N m e ro de
ge n e s
Escherichia coli
4.2 Mb
4 300
Saccharomyces cerevisiae
13 Mb
6 300
Amoeba dubia
670 000 Mb
Caenorhabditis elegans
95 Mb
ca. 20 000
Drosophila melanogaster
165 Mb
ca. 13 000
Allium cepa (cebolla)
15 000 Mb
Mus musculus
3 000 Mb
ca. 30 000
Homo sapiens
3 300 Mb
ca. 30 000
O rg a n is m o
Unicelular
65
Q uim erism o y colonizacin. En muy pocas ocasiones un indi

viduo puede estar representado por dos o ms clonas de clu
las con secuencias de DNA muy diferentes, que reflejan la
fusin temprana de embriones gemelos fraternos en el desarro
llo o la formacin de un embrin de colonias de clulas deri
vadas de otro (fig. 4-10). A nivel superficial, tales diferencias se
identifican tambin cuando un individuo recibi un injerto,
un trasplante o una transfusin.
3.1.5 Las clulas de organismos multicelulares pueden

estudiarse in situ o en cultivo
M ulticelular
El DNA de las clulas de distintos organismos puede variar mu

chsimo como resultado de diferencias hereditarias en la secuencia
de DNA (mutaciones). La extensin de las diferencias de secuencia
es en gran parte proporcional a la distancia evolutiva que separa los
dos organismos. Por consiguiente el DNA de una clula humana se
relaciona de modo muy cercano en secuencia con el de una clula
de chimpanc (98 a 99%), pero las divergencias se incrementan en
comparacin con las clulas del ratn, la rana y la mosca de la fruta
respectivamente. El DNA de las clulas de diferentes individuos de
la misma especie tambin muestra diferencias mutacionales. Se ob
serva aproximadamente un cambio en cada 1 000 nucletidos cuan
do se compara el DNA de dos humanos no relacionados. Asimismo
existen diferencias en la secuencia de DNA de las clulas de un in
dividuo aislado. Tales diferencias pueden originarse en tres formas:
D iferencias program a das en clulas especializadas. Los ejem
plos incluyen las clulas espermatozoos que tienen un cromo
soma X o uno Y, y por tanto llevan diferentes juegos de DNA
del cromosoma del sexo as como linfocitos B y T maduros que
experimentan reordenamientos del DNA especficos de clula que
conducen a diferencias de una clula con otra en los tipos de
anticuerpo o receptor de clula T producidos.
M utacin aleatoria e inestabilidad d e l DNA. El DNA de to
das las clulas est sujeto de manera constante a dao ambien
tal, degradacin y reparacin qumica, y ello influye en la
precisin de la replicacin del DNA. La tasa de error pequea,
pero importante, significa que en cada ronda de divisin celu
lar surgen nuevas mutaciones en la secuencia del DNA. En
consecuencia durante el desarrollo cada clula forma un perfil
nico de mutaciones y ningn p a r de clulas del mismo indivi
duo tendr la misma secuencia de DNA precisa. La mayor parte
de estas mutaciones no tiene ningn efecto fenotpico e inclu
sive las mutaciones que se presentan en genes esenciales tienen
poco efecto en el organismo como conjunto cuando se presen
tan en clulas aisladas (a menos que causen proliferacin de la
clula, vase cap. 17). Slo cuando una mutacin perjudicial
en la lnea germinal, en las clulas madre o en las clulas som
ticas ocurre temprano en el desarrollo es probable que los efec
tos se observen a nivel fenotpico.
Con frecuencia los organismos unicelulares pueden estudiarse cul

tivndolos en un medio que representa su ambiente normal. Como
tal vez sea difcil reproducir el ambiente de una clula individual en
el caso de los organismos multicelulares, las clulas de estos orga
nismos pueden estudiarse en su contexto natural entero o en un
ambiente artificial fuera del mismo. Es factible utilizar varios m
todos distintos.
Anlisis in situ (como parte del animal original). En los anima
les ms simples, como Caenorhabditis elegans, pueden estudiar
se con el microscopio clulas individuales en especmenes vivos
completos. El uso de la protena fluorescente verde como un
marcador vital (recuadro 20-4) permite realizar estudios in situ
en especmenes vivos de animales ms grandes en tanto el teji
do que se investiga sea pticamente transparente. Los embrio
nes de muchos animales (p. ej., Drosophila, pez cebra, ratn)
son transparentes en las etapas tempranas: En especmenes
opacos, quiz sea necesario preparar cortes de tejido despus de
tratarlos.
Como un explante d e tejido. La investigacin de la conducta de
explantes de tejidos particulares aislados o en combinacin facili
ta muchos estudios de biologa del desarrollo. Tal investigacin se
usa para probar el efecto de molculas del desarrollo particulares
o los efectos inductores ele una poblacin celular en otra (vase sec
cin 3.4.2).
Como clulas prim arias. Un explante tisular puede disociarse,
lo que permite separar clulas individuales y desarrollarlas de
ese mismo modo en cultivo. ste no siempre es un mtodo di
recto ya que quiz sea muy difcil que algunos tipos de clulas
crezcan y el esfuerzo necesario para conservar las clulas prima
rias puede ser considerable.
Como una lnea celu lar estable. A menudo es fcil que una l
nea de clulas estables crezca en cultivo y por tanto puede ex
pandirse con facilidad y enviarse a investigadores de todo el
mundo. Puesto que las clulas se distinguen por diversas carac
tersticas diagnsticas, los investigadores pueden estar seguros
de que los resultados que obtienen de una lnea celular son
comparables con los de otras personas que trabajan en alguna
otra parte en la misma lnea celular o integrarse a ellos.
Aunque el estudio de explantes tisulares o de clulas primarias cul
tivadas tiene muchas ventajas, stos son difciles de manejar y re
presentan un recurso temporal. Ello se debe a que casi todas las
clulas animales en cultivo pasan por cierto nmero de divisiones
y a continuacin envejecen, dejan de dividirse y se eliminan del ci
clo celular al entrar al estado latente conocido como Gq (Campisi, 1996). El nmero de rondas de divisin depende del tipo de
clula, la especie y la edad del organismo de origen. Por ejemplo,
los fibroblastos fetales humanos se dividirn cerca de 60 veces en
66 CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
cultivo, en tanto que los fibroblastos obtenidos de un adulto expe

rimentarn casi la mitad de este nmero de divisiones. Al parecer
el potencial de divisin y la longevidad de la especie guardan cier
ta relacin. Por ejemplo, el nmero de divisiones que los fibroblas
tos fetales humanos efectan (alrededor de 60 divisiones, periodo
mximo de vida 120 aos) se encuentra entre la cifra lograda por
los fibroblastos fetales de ratones (alrededor de 15 divisiones, perio
do de vida mximo tres aos) y los fibroblastos fetales de la tortu
ga gigante Galapagos (alrededor de 125 divisiones, periodo de vida
mximo 175 aos).
Las limitaciones de las clulas primarias pueden superarse me
diante el establecimiento de una lnea celular permanente que se di
vidir en forma indefinida en cultivo. Se establecieron muchas lneas
celulares de explantes de tumores que ya haban perdido ciertas res
tricciones del crecimiento. Por ejemplo, la lnea celular HeLa que se
utiliza con amplitud se deriv de un tumor cervical extirpado a una
paciente llamada Henrietta Lacks en 1995. El problema con las l
neas celulares de tejidos tumorales es que a menudo tienen cariotipos muy distintos en comparacin con los del tejido original del que
se obtuvieron, lo que da por resultado diferencias fenotpicas que se
tornan ms pronunciadas con el nmero creciente de pasos. Tam
bin es posible obtener lneas celulares de clulas primarias hacien
do que sufran transformacin del crecimiento (inmortalizacin) en
cultivos. Este proceso, que es anlogo a la prdida de restricciones
del crecimiento que se observa en tumores, puede ocurrir de modo

espontneo por mutaciones adquiridas o inducirse mediante radia
cin, mutgenos qumicos o virus de transformacin. En fecha ms
reciente se establecieron lneas celulares mediante la transfeccin de
clulas primarias con secuencias particulares de DNA que son oncgenas. Se conservan miles de lneas celulares, que representan di
ferentes tejidos humanos y de animales, en bancos de clulas como
la American Type Culture Collection (ATCC), la European Collection of Cell Cultures (ECACC) y la Interlab Cell Line Collection
(ICLC) (vase cuadro 3-2; Stacey y Doyle, 2000).
Una aplicacin importante de las lneas celulares es la conserva
cin de recursos genticos renovables de pacientes humanos par
ticulares. Esto se requiere para diversos procedimientos: desde el
control de calidad en laboratorios que tipifican tejido hasta el an
lisis de enlace y el mapeo basado en marcadores. En este caso el fe
notipo de la clula no es importante pero el genotipo debe
conservarse con precisin. Uno de los medios ms directos para lo
grarlo es hacer lneas de clulas linfoblastoides mediante transfor
macin con virus Epstein-Barr (EBV), que permanece epism ico
(no integrado) y en consecuencia no altera el genoma endgeno.
Los linfocitos B humanos tienen un receptor para EBY y una vez
que se infectan pueden inmortalizarse con una tasa alta de xito pa
ra producir una lnea celular que es posible propagar en forma in
definida en el cultivo (o criopreservarse para necesidades futuras).
Cuadro 3-2. Ejemplos de lneas celulares humanas y sus usos

Cdigo ATCC
Lnea celular
Orgenes y aplicaciones
CCL123
DAU0I
Lnea de clulas B, derivadas del linfoma de Burkitt, se utiliza en estudios de cncer
CRL1432
NAMALWA
Lnea de clulas B, derivadas del linfoma de Burkitt, se usa para elaborar interferones
TIB152
JURKAT E61
Lnea de clulas T, derivadas de la leucemia linfoblstica aguda, produce grandes cantidades

de interleucina-2
CRL1942
SUP-T1
Lnea de clulas T, derivadas de la leucemia linfoblstica T, apoya la replicacin del VIH
CCL240
HL-60
Derivada de clulas de leucemia promielocticas, se emplea para estudiar la diferenciacin

del linaje mieloide
TIB202
THP
Derivada de leucemia monoctica aguda, se utiliza para estudiar la activacin y la maduracin

de macrfagos
CRL1573
293
Clulas de rin fetal transformadas por adenovirus, se usan para estudiar los adenovirus
CRL2190
HK-2
Lnea de clulas tubulares proximales transformadas con genes E6/E7 de virus del papiloma
humano, se emplea como sistema modelo para estudios del tbulo proximal
HB8064
Hep3B
Produce muchas protenas del plasma
HTB52
SK-HEP-1
Se deriva del adenocarcinoma heptico, induce tumores en el ratn desnudo
HTB75
Caov-3
De adenocarcinoma del ovario, produce el mutante p53, se utiliza en estudios de citocinas y cncer
CRL1572
PA/1
De teratoma del ovario, se usa en estudios del desarrollo y pruebas de frmacos
Lneas celulares linfoides
Lneas celulares mieloides
Lneas celulares renales
Lneas celulares hepticas
Lneas celulares ovricas
3.2 I INTERACCIONES CELULARES
3.2 In teracciones celulares

3.2.1 La comunicacin entre clulas incluye la
percepcin de molculas de sealamiento
por receptores especficos
La supervivencia y la reproduccin de clulas individuales en un or
ganismo multicelular est subordinada a la supervivencia y la re
produccin del organismo como un todo. Las clulas somticas
deben cooperar entre s en beneficio del organismo. Por esta razn
las clulas de un organismo multicelular necesitan comunicarse a
fin de coordinar y regular funciones fisiolgicas y bioqumicas. La
comunicacin celular se basa en la produccin de molculas de se
alamiento por una poblacin de clulas y su reconocimiento por
los receptores que suelen encontrarse en la superficie de las clulas
correspondientes (cuadro 3-3). Las clulas animales se cubren po
sitivamente en abundancia con receptores para molculas de seala
miento y estos receptores estn conectados con vas de transduccin
de seal internas que permiten regular la actividad del factor de
67
transcripcin y por ltimo alterar patrones de expresin gnica

(vase Twyman 2001 para una revisin general).
El sealamiento entre las clulas puede realizarse en diferentes
extensiones. Casi todas las personas estn familiarizadas con el con
cepto de sealamiento endocrino, en el que una hormona liberada
de una glndula endocrina en una parte del cuerpo llega a una po
blacin distante de clulas blanco a travs del torrente sanguneo.
El sealamiento endocrino es importante para conservar la ho
meostasis y tambin tiene una funcin destacada en el desarrollo
ulterior, una vez que el sistema vascular se establece. Sin embargo,
en el desarrollo temprano las seales ms importantes viajan distan
cias cortas. El sealamiento paracrino comprende la liberacin de
una molcula de sealamiento de una poblacin de clulas y la di
fusin de dicha molcula por una distancia corta a las clulas que
responden. El sealamiento yuxtracrino se basa en la interaccin
de clulas vecinas y suele reflejar el hecho de que la seal produci
da por una clula permanece fijada a la membrana plasmtica. Las
clulas tambin responden a molculas que se encuentran en su
ambiente inmediato, la matriz extracelular (seccin 3.2.4).
Cuadro 3-3 Clases importantes de molculas de sealamiento y sus receptores

Receptor
Ejemplos
Diversas (pptidos, protenas, molculas

orgnicas pequeas, estmulos fsicos)
Receptor acoplado a protena G

Polipptldo nico. La regin hidrofbica central
form a un dominio transmembrana de siete pasos,
el dominio terminal N enlaza el ligando, el dominio
terminal C interno se vincula con una protena
de enlace de nucletido de guanidina
Receptores de adrenalina, serotonina,

glucagon, hormona estimulante del folculo,
histamina, opioides y neurocininas. Tambin
receptores olfatorios, del gusto y del receptor
visual rodopsina
Factores de crecimiento, efrinas
Receptor de cinasa de tirosina

Dimrico; dominio de enlace de ligando de
la terminal N, dominio de cinasa interno,
atraviesa la membrana una vez
Receptores de Insulina, factores de

crecimiento de fibroblastos y de crecimiento
epidrmico, efrinas
Citocinas
Receptores con actividad relacionada de cinasa

de tirosina
Oligomricos; dominio de enlace de ligando
de la terminal N, dominio interno vinculado con
cinasa Janus (JAK)
Receptores de hormona del crecimiento,

prolactina, eritropoyetina, factores estimulantes
de colonias, interleucinas, interferones
Familia del factor de transformacin

del crecimiento p
Receptores con actividad relacionada de cinasa de

serina/treonina
Oligomricos; dominio de enlace de ligando
de la terminal N, dominio Interno vinculado
con protenas SMAD
Receptores de protenas TGF-p y morfogenticas

seas, Nodal, factor neurotrfico derivado glial
Familia hedgehog
En placas
Receptores para Sonic e Indlan hedgehog

en el desarrollo de mamferos
Familia Wnt
Rizado
Receptores para protenas de la familia Wnt

en el desarrollo de mamferos
Hormonas esteroides, retinoides
Receptores nucleares
Dimricos; residen en el citoplasma o el ncleo,
se convierten en factores de transcripcin
en relacin con ligando
Receptores para hormonas esteroides

y tiroideas, vitamina D, cido retinoico
Escotadura
Delta y Serrate en el desarrollo neural
SEALES SECRETADAS
SEALES FIJAS
Familia delta/Serrate
68
CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
3.2.2 Receptores activados inician vas de transduccin

de seal que pueden incluir cascadas enzimticas o
segundos mensajeros y dar por resultado activacin
o inhibicin de factores de transcripcin
Una vez que el receptor de una protena de sealamiento particu
lar se activa, se desata una cadena de acontecimientos cuyo ltimo
resultado es un cambio del patrn de actividad gnica en la clula
que responde. El nmero y la naturaleza de uniones en la cadena
depende de la molcula de sealamiento particular relacionada.
Tanto las hormonas esteroides y tiroideas como el cido retinoico
que regula el desarrollo son capaces de difundirse a travs de la
membrana plasmtica, de tal manera que sus receptores se localizan
en el interior de la clula. Tras unirse a sus ligandos, estos recepto
res actan de manera directa como factores de transcripcin a fin
de modular la expresin de genes corriente abajo. Por tanto las mo
lculas similares a esteroides utilizan una va de transduccin de se
al de un paso (Tsai y OMalley, 1994).
Casi todas las otras molculas de sealamiento permanecen fue
ra de la clula y se enlazan a receptores transmembrana. El enlace
del ligando al dominio extracelular del receptor ocasiona un cam
bio de conformacin en el dominio interno que suele estimular una
actividad enzimtica latente. En el caso de las cinasas de receptor,
este cambio de conformacin estimula una actividad de cinasa que
Ligando
/\/> 'V v/V/
Fig. 3-4. Los receptores de citocina son dimricos u oiigomricos,

con cada polipptido atravesando la membrana una vez.
Los receptores no poseen actividad de cinasa de tirosina intrnseca,
pero se relacionan de manera constitutiva con cinasas de tirosina
citoplsmicas de la familia Janus (cinasas Janus, JAK). El enlace de
ligando causa la dimerizacin de los receptores. Esto resulta en
autotransfosforilacin recproca de las JAK vinculadas, que se tornan
activas y fosforilan el receptor en s mismo. A continuacin el receptor
es capaz de incorporar factores de transcripcin inactivos llamados
STAT (transductores de seal y activadores de transcripcin) que se
unen a residuos de fosfotirosina mediante sus dominios SH2. Despus
los STAT son fosforilados por las JAK, lo que les permite dimerizarse y
translocarse hacia el ncleo, donde activan genes corriente abajo.
Redibujado de Twyman (2001) Instant Notes in Developmental Biology,
publicado por BIOS Scientific Publishers.
es integral para el receptor o para una protena que se relaciona con

el mismo. Ello causa que el receptor se fosforile en s mismo prime
ro y a continuacin permite que fosforile otras protenas dentro de
la clula y en consecuencia las active. Estas protenas blanco suelen
ser cinasas en s mismas, que en seguida fosforilan protenas co
rriente ms abajo. Al final esta cascada de actividad de cinasa llega
a un factor de transcripcin, que se activa o inhibe segn sea apro
piado y que produce un cambio en la expresin gnica. En algunos
casos esta cascada de sealamiento es corta (p. ej., la va JAK-STAT
regulada por citocina; Pellegrini y Dusanter-Fourt, 1997; Hou y
cois., 2002; fig. 3-4), en tanto que en otros puede contener muchos
pasos (como la va de cinasa MAP regulada por factor de creci
miento; Robinson y Cobb, 1997; fig. 3-5).
La transduccin de seal en receptores acoplados a la protena
G se efecta por la activacin de segundos mensajeros (molculas
pequeas, como cAMP, calcio y lpidos). El enlace del ligando oca
siona que la protena de enlace de nucletido de guanidina (prote
na G) relacionada con el receptor intercambie GDP por GTP, que
da lugar a que se disocie en unidades a y fS-7 . A continuacin ca
da una de estas unidades puede interactuar con protenas corriente
abajo con objeto de regular los niveles de segundo mensajero
(Bourne, 1997). Segn el tipo particular de protena G presente, el
enlace del ligando puede estimular o inhibir la enzima ciclasa de
adenilato, lo que resulta en un cambio en los niveles de cAMP intracelular (Houslay y Milligan, 1997). Otras protenas G estimulan
la produccin de lpidos, como 1,4,5 trifosfato de inositol y diacilglicerol (Speigel y cois., 1996), o la liberacin de iones de calcio
(Clapham, 1995). Los segundos mensajeros activan a su vez cina
sas de protena corriente abajo, como la cinasa de protena A de
pendiente de cAMP y la cinasa de protena C dependiente de
calcio, que se fosforilan y en consecuencia modifican la actividad
de factores de transcripcin particulares.
Las vas de sealamiento comentadas sostienen una pltica cru
zada extensa. Por ejemplo, tanto la cinasa de protena A como la ci
nasa de protena C interactan con la va de cinasa MAP, las cinasas
del receptor de tirosina pueden estimular la va JAK-STAT e influir
los niveles de segundos mensajeros, y los receptores de citocina sue
len influir la actividad Ras. La respuesta que una clula particular
produce depende de la suma de todos los sealamientos que llegan
a su superficie y de los receptores y componentes de sealamiento
especficos que se presentan.
3.2.3 La organizacin de las clulas para formar tejidos

requiere adherencia celular
Las clulas se organizan en tejidos mediante la expresin de mo
lculas de adherencia (Cunningham, 1995; Gumbiner, 1996). En
esencia las molculas de adherencia actan en la misma forma que
cualquiera otra interaccin receptor-ligando, aunque en este caso el
receptor y el ligando estn fijos a las superficies de clulas adyacen
tes y puede haber cientos de miles de estas molculas por clula pa
ra asegurar que el enlace sea muy potente. Las clulas pueden
adherirse entre s de modo directo, por la expresin de molculas
de adherencia complementarias en sus superficies, mediante la for
macin de vnculos con la matriz extracelular, o por ambos proce
sos. Durante el desarrollo, los cambios en la expresin de molculas
de adherencia permiten que las clulas formen y rompan conexio
nes entre s, lo que facilita que la migracin sea individual o en ho
jas y produce reordenamientos a gran escala (McNeil, 2000; Irvine
y Rauskolb, 2001). En el organismo maduro las interacciones de
3.2 I INTERACCIONES CELULARES [ 69
Fig. 3-5. Los factores de crecimiento actan como ligandos para cinasas de tirosina receptoras.
El enlace de ligando estimula la dimerizacin del receptor e inicia la actividad de cinasa de tirosina citoplsmica intrnseca para el receptor. Luego el
receptor puede fosforilar no slo otras protenas sino tambin a s mism o (autotransfosforilacin) y ocasionar la incorporacin de protenas que se
enlazan en forma especfica a residuos de fosfotirosina, inclusive enzimas que modulan la actividad de Ras. Los Ras activados incorporan Raf a la
membrana donde se estimula su actividad de cinasa. En seguida Raf activa MEK, que a su vez activa la cinasa MAR Tanto MEK como la cinasa MAP
activan factores de transcripcin latentes y por tanto cambian los patrones de expresin en el ncleo. Redibujado de Twyman (2001), Instant Notes
Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.
i. Uniones celulares
Uniones adherentes
Uniones de anclaje en las que los filamentos de actina del citoesqueleto se conectan con caderinas en la superficie celular
y por tanto unen clulas vecinas en un cinturn continuo de adherencia
Desmosomas
Uniones de anclaje en las que los filamentos intermedios del citoesqueleto se conectan con caderinas en la superficie celular
Contactos focales
Uniones de anclaje en las que los filamentos de actina del citoesqueleto se conectan con integrinas en la superficie celular
y proporcionan sitios de fijacin punteados a la matriz extracelular
Hemidesmosomas
Uniones de anclaje en las que los filamentos intermedios del citoesqueleto se conectan con integrinas en la superficie
celular, se utilizan para conectar clulas epiteliales con la lmina basal
Uniones comunicantes
Son poros que conectan el cltosol de clulas adyacentes. Estn formados por seis protenas conexina idnticas que forman
un canal en cada membrana. La fijacin de complejos de conexina en clulas adyacentes crea la unin comunicante
Uniones estrechas
Protenas transmembrana interconectadas que sellan clulas epiteliales en una hoja continua. Segn la densidad de las
protenas en la unin, la barrera puede ser por completo impermeable o selectivamente permeable a molculas de un
tamao particular
70 | CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
adherencia entre las clulas suelen reforzarse por la formacin de

regiones de contacto especializadas que se conocen como uniones
celulares (Steinberg y McNutt, 1999; Prez-Moreno y cois., 2003;
cuadro 3-4).
Las principales clases de molculas de adherencia celular son
cuatro (Humphries y Newham, 1998; Hynes, 2002):
Caderinas. Son protenas de adherencia transmembrana depen
dientes de calcio que reconocen caderinas idnticas en la super
ficie de otras clulas y se enlazan con ellas. El proceso de enlace
con molculas idnticas se conoce como enlace homoflico. En
los mamferos se encuentran alrededor de 30 caderinas distin
tas, las ms importantes de las cuales son la caderina E (que se
restringe sobre todo a clulas epiteliales) y la caderina (que se
expresa de manera predominante en el sistema nervioso).
CAM-lg. Son molculas de adherencia transmembrana inde
pendientes del calcio que tiene una similitud estructural con la
familia de las inmunoglobulinas (Ig). Por ejemplo, la molcula
de adherencia d e clulas neurales (NCAM) se expresa en el siste
ma nervioso y en las somitas en desarrollo.
Integrinas. Son molculas de adherencia dependientes de cal
cio que suelen mediar interacciones entre la clula y la matriz
(vase ms adelante), pero ciertas integrinas de leucocitos tam
bin participan en la adherencia intercelular.
Selectinas. Estas molculas las expresan clulas endoteliales du
rante una respuesta inflamatoria. Reconocen residuos de car
bohidratos en la superficie de los neutrfilos y guan estas
clulas a los sitios de inflamacin.
3.2.4 La matriz extracelular proporciona una estructura

central para todos los tejidos del cuerpo y tambin
es una fuente importante de seales que controlan
la conducta celular
Los espacios entre las clulas del cuerpo estn vacos. El espacio extracelular est lleno de una estructura tridimensional de fibras protenicas embebidas en un gel de carbohidratos complejos llamados
glucosaminoglucanos. Este material, el material extracelular (MEC),
tiene una composicin variable segn los materiales que las clulas
locales secreten hacia su ambiente inmediato. Las clulas tambin
influyen en la estructura del MEC mediante la secrecin de enzi
mas modificadoras, como proteasas, y esto puede influir en la con
ducta celular (Streuli, 1999). A su vez el MEC proporciona una
estructura central que desempea una funcin esencial en la con
servacin de la integridad tisular y gua la conducta de la clula du
rante el desarrollo al interactuar con receptores que abarcan la
membrana (Giancotti y Ruoslahti, 1999; Bokel y Brown, 2002).
Los componentes del MEC pueden dividirse en varios grupos
(vase cuadro 3-5):
protenas estructurales, como colgenas y elastinas;
protenas de adherencia, por ejemplo, lamininas y fibronectinas;
proteoglucanos, que comprenden una protena central relaciona
da con varios glucosaminoglucanos. Los proteoglucanos difie
ren de las glucoprotenas porque los residuos de azcar en los
primeros representan hasta 95% del peso total de la molcula;
el glucosaminoglucano libre, cido hialurnico.
Las protenas estructurales y de adherencia de la MEC tienen una
participacin importante en la determinacin de su funcin. Por
ejemplo, los tejidos ricos en colgena son muy fuertes (como los
tendones), en tanto que los tejidos ricos en elastina son muy elsti
cos (p. ej., los vasos sanguneos). Las protenas de la MEC interactan con las clulas por medio de receptores transmembrana
llamados integrinas. stas se unen a protenas de la MEC en el ex
terior de la clula y a microfilamentos de actina en el interior me
diante protenas en puente, como la talina y la actinina alfa. Tales
interacciones permiten que las clulas se muevan al contraer los fi
lamentos de actina contra la estructura fija en el material extracelu
lar (MEC). Asimismo est demostrado que las integrinas activan las
vas internas de sealamiento, lo que sugiere que la MEC puede in
fluir en la expresin gnica dentro de la clula y por tanto modifi
car la conducta celular en respuesta a componentes especficos del
material extracelular (MEC). Un ejemplo importante de la funcin
del MEC en la conducta de las clulas es la conservacin de la po
laridad celular por medio de la lmina basal (para ms ejemplos,
vase Dustin, 2002). En el epitelio intestinal, la presencia de la l
mina basal en Un lado de la monocapa celular tiene a su cargo el es
tablecimiento y la conservacin de una superficie basal plana
adyacente al tejido conjuntivo y una superficie apical caracterizada
por un borde en cepillo.
Los componentes proteoglucano y glucosaminoglucano de la
MEC realizan varias funciones. Primero, las molculas son muy so
lubles y forman geles hidratados que actan como amortiguadores
para proteger los tejidos contra compresiones. El tejido es muy re
sistente a la compresin (p. ej., cartlago) en los sitios en que el con
tenido de proteoglucano de la MEC es en particular alto. Los
proteoglucanos pueden formar superestructuras complejas en las
que molculas de proteoglucano individuales estn dispuestas alre
dedor de estructuras bsicas de cido hialurnico. Estos complejos
actan como reservorios biolgicos al almacenar molculas activas,
por ejemplo, factores de crecimiento. De hecho es posible que los
proteoglucanos sean esenciales para la difusin de ciertas molculas
de sealamiento. Por ejemplo, las vas de sealamiento Hedgehog
y Wingless se inhiben en el mutante Drosophila sugarless, que es in
capaz de sintetizar de modo correcto proteoglucanos (vase Selleck,
2000). Por ltimo los proteoglucanos tambin ayudan a mediar la
adherencia entre la clula y la matriz. Ello se logra mediante el en
lace con enzimas en la superficie celular conocidas como glucosiltransferasas, cuya funcin consiste en aadir residuos de azcar a
los grupos de carbohidratos. Cuando no hay azcar libre, la enzi
ma mantiene la cadena de carbohidratos. Cuando se dispone de
azcar, la reaccin se completa y la cadena de carbohidratos se libe
ra. Estos ciclos de adherencia y liberacin pueden tener importan
cia particular en el control de la migracin celular.
3.3
G eneralidades del desarrollo
El trmino desarrollo, como se aplica a los animales, se refiere a un

proceso por el que una clula aislada origina un organismo maduro.
A menudo es conveniente dividir el desarrollo animal en una etapa
embrionaria, durante la cual se establecen todos los principales siste
mas orgnicos, y una posembrionaria que (en el caso de los mamfe
ros) consiste sobre todo en crecimiento y refinamiento. Los bilogos
del desarrollo tienden a concentrarse en la etapa embrionaria porque
es sta en la que ocurren los acontecimientos ms excitantes y dram
ticos, pero esto no disminuye la importancia del desarrollo posembrionario. An no se aclara cundo se detiene el desarrollo una vez
que el plan bsico del cuerpo se establece. Los humanos experimen
tan un continuo de crecimiento y consolidacin posembrionarios
3.3
GENERALIDADES DEL DESARROLLO
71
Cuadro 3 ' Componentes moleculares de la matriz extracelular

Componente
Distribucin
Colgenas
Muchos tejidos
Las colgenas son glucoprotrenas trimricas grandes. Existen varias formas de

colgena qumicamente distintas cuya abundancia vara en diferentes tejidos. Las
formas ms abundantes son las colgenas I, II y III, que tienden a form ar fibrillas
estabilizadas mediante enlaces cruzados entre residuos de lisina. Brindan apoyo
estructural e influyen en la diferenciacin y la migracin celulares por medio de
interacciones con integrinas. En contraste, la colgena IV forma enrejados ms que
fibrillas y es un componente importante de la lmina basal. Interacta de manera
indirecta con clulas, mediante el vnculo con laminina
Fibronectina
Muchos tejidos
La fibronectina es una glucoprotena dimrica cuya principal funcin es facilitar la

adherencia entre clula y matriz. Las fibronectinas tienen dominios de enlace
de colgena y heparina que ayudan a organizar el MEC. Las fibronectinas interactan
con clulas por medio de integrinas e influyen en la forma, el movimiento y la
diferenciacin celulares
Lamininas
Tejidos epiteliales
Las lamininas son protenas trimricas que comprenden las subunldades A, B1 y

B2. Interactan con la colgena IV para form ar la lmina basal y su principal funcin
es facilitar la adherencia de las clulas a la lmina basal al interactuar con integrinas
y otras molculas de la superficie celular. Hay muchas formas especficas de tejidos
de cada subunidad de laminina
Entactina
Tejidos epiteliales
Se relaciona estoiquiomtricamente con laminina y contiene secuencias que pueden

permitir interacciones con Integrinas de la superficie celular
Elastina
Muchos tejidos, pero

abundantes en vasos
sanguneos, piel y otras
estructuras que se estiran
y deforman
La elastina es una protena no glucosilada que forma redes y hojas por enlace
cruzado. La protena tiene un retroceso elstico natural y confiere a los tejidos
la capacidad de recuperar su form a despus de deformarse
Tenasclna
Embrin, sistema nervioso

adulto
La tenascina es una glucoprotena hexamrica que desempea una funcin importante

en el control de la migracin celular. Posee efecto adhesivo en algunas clulas y
repelente en otras segn los receptores que se encuentran en la superficie celular
Vitronectina
Sangre y otros tejidos
Esta protena suele vincularse con la fibronectina, aunque no se distribuye de manera

tan amplia, e Interacta con clases particulares de integrinas para facilitar la adherencia
entre clula y matriz
Proteoglucanos
Muchos tejidos
Familia muy diversa de molculas que comprende una protena de centro, como
decorina o sindecn, relacionada con uno o ms glucosaminoglucanos (p. ej.,
sulfato de condroitina, sulfato de dermatn, heparina, sulfato de heparn). A
menudo adopta una estructura de mayor orden en el material extracelular (MEC).
Estas molculas median la adherencia celular y tambin pueden enlazar factores de
crecimiento y otras molculas bloactivas
Acido hialurnico
Muchos tejidos
El nico glucosaminoglucano no sulfatado y no unido de modo covalente a una

protena para form ar un proteoglucano. Facilita la migracin celular en particular
durante el desarrollo y la reparacin de tejidos
Estructura/funcin
que inicia en el nacimiento y transcurre hasta por dos decenios pos

teriores, con algunos rganos que llegan a la madurez antes que
otros. Podra argumentarse que el desarrollo humano cesa cuando el
individuo se torna maduro sexualmente, pero muchos tejidos nece
sitan restituirse durante toda la vida (p. ej., piel, sangre, epitelio in
testinal) y en estos casos el desarrollo nunca se detiene del todo, slo
llega a un equilibrio. Algunos cientficos consideran inclusive el en
vejecimiento como una parte del desarrollo puesto que representa
una parte natural del ciclo de vida.
El desarrollo es un proceso gradual. El vulo fecundado origina
primero un embrin simple con caractersticas relativamente grue
sas. Conforme el desarrollo prosigue, el nmero de tipos de clulas
aumenta y la organizacin de estas ltimas se toma ms compleja.
La complejidad se adquiere de manera progresiva. A nivel molecu

lar, el desarrollo incorpora varios procesos distintos que afectan la
conducta de las clulas. Estos procesos estn interrelacionados y
pueden ocurrir por separado o en combinacin en diferentes par
tes del embrin (Twyman, 2 0 0 1 ):
proliferacin celular, por la divisin repetida de las clulas, que
conduce a un incremento de su nmero. En el organismo ma
duro, sta se equilibra por la prdida celular;
crecimiento, por la sntesis de macromolculas, que conduce a
un aumento del tamao y la biomasa totales;
diferenciacin, el proceso por el que las clulas se toman espe
cializadas desde los puntos de vista estructural y funcional;
72 j CAPTULO TRES j CLULAS Y DESARROLLO
formacin de patrn, el proceso mediante el cual se organizan

las clulas, primero para formar el plan del cuerpo fundamen
tal del organismo y luego las estructuras detalladas de diferen
tes rganos y tejidos;
morfognesis, o cambios en la forma total. En la morfognesis
pueden participar varios mecanismos subyacentes, que incluyen
proliferacin celular diferencial, adherencia selectiva intercelu
lar o adherencia entre clula y matriz, cambios en la forma y el
tamao de las clulas, uso selectivo de la muerte celular progra
mada y control de la simetra y el plano de la divisin celular.
Todos los procesos anteriores estn controlados por genes, que espe
cifican dnde y cundo se sintetizan protenas particulares en el em
brin y por tanto la forma en que las distintas clulas se comportan.
Si bien un organismo multicelular presenta diferencias menores en
la secuencia de DNA entre las clulas, la mayor parte de ellas con
tiene cuando menos los mismos genes. Por consiguiente, para que
las clulas en el embrin en desarrollo se diversifiquen debe haber
una expresin gnica diferencial. Puesto que la expresin gnica est
controlada por factores de transcripcin, el desarrollo depende final
mente de los factores de transcripcin que se activan en cada clula
(vase, p. ej., Kuo y cois., 1992). Como se seal en la seccin 3.2.2,
la actividad de los factores de transcripcin puede regularse por se
alamiento entre las clulas. Un objetivo mayor de la investigacin
biomdica es descubrir las vas de sealamiento y los programas re
guladores que controlan el desarrollo. Este captulo se dirigir al de
sarrollo de vertebrados y en especial de mamferos. El conocimiento
del desarrollo inicial del humano es fragmentario porque el acceso a
La investigacin de! desarrollo se dirigi a un nmero hasta cierto punto

pequeo de organismos modelo, que se consideran representativos de
las principales divisiones taxonmicas de la vida multicelular. Algunos de
estos organismos se eligieron al principio por la facilidad con que podran
obtenerse y reproducirse en cautividad, en tanto que otros se selecciona
ron por las ventajas experimentales especficas que ofrecan. El estudio de
estos organismos demostr que los genes del desarrollo, y de hecho to
das las vias reguladoras, estn muy conservados. Han sido instrumenta
les en la identificacin y la caracterizacin de los genes humanos que
participan en el desarrollo. La importancia de estas especies com o m o
delos experimentales la indica su precedencia entre los proyectos del genoma que se planean o se encuentran en curso (recuadro 8.8).
INVERTEBRADOS
Los principales modelos invertebrados son la mosca de la fruta (Drosop
hila melanogaster) y el nematodo (Caenorhabditis elegans). Estos dos
organismos son genticamente accesibles y por consiguiente adecuados
para la seleccin de mutaciones a gran escala y el anlisis y la manipula
cin genticas. Los embriones de ambas especies (y tambin los gusa
nos adultos) son transparentes y factibles de manipulaciones quirrgicas.
Drosophila fue el primer modelo animal que se estudi con detalle a nivel
molecular y muchos de los mecanismos moleculares que sustentan el
desarrollo embrionario temprano se establecieron en esta especie. Dro
sophila tambin proporciona modelos con utilidad particular de neurognesis y desarrollo del ojo. Caenorhabditis es notable por su programa
estereotipado de desarrollo que se caracteriza por un linaje celular casi in
variable y la disponibilidad de un diagrama completo de conexiones del
sistema nervioso. Los mutantes de linaje constituyen un medio til para
estudiar ia memoria celular en el desarrollo. La vulva del nematodo es un
modelo bien establecido de organognesis. Otros modelos de Invertebra
dos Incluyen moluscos, ascidianos (tunicados) y anlidos.
muestras para estudio suele restringirse por razones ticas o prcti

cas. Como resultado gran parte de la informacin disponible se de
riva de modelos animales del desarrollo (vase recuadro 3-3).
3 .4
Especializacin de las clulas

durante el desarrollo
3.4.1 La especializacin celular incluye una serie

irreversible de decisiones jerrquicas
El desarrollo es comparable con una corriente que desciende por un
lado de una montaa, con las clulas individuales representadas por
hojas que fluyen con el agua (fig. 3-6). El curso del agua puede ra
mificarse muchas veces antes de llegar al fondo, pero una hoja slo
puede seguir una va. Conforme se aproxima a un punto de rami
ficacin, la hoja debe comprometerse con una va u otra. Una vez
que la decisin se toma, la hoja ya no puede retroceder y elegir una
va diferente. La decisin es irreversible.
Despus de la fecundacin, las primeras divisiones celulares que
el cigoto de mamferos experimenta son simtricas y originan clulas
hijas con el mismo potencial (o potencia) de desarrollo. El cigoto y
sus descendientes inmediatos no son especializados; se dice que son
totipotentes porque cada clula retiene la capacidad para diferenciar
se en todas las posibles clulas del organismo, inclusive las membra
nas extraembrionarias. Esto es anlogo a una hoja al inicio de su
trayecto en la montaa. A medida que el desarrollo procede, las c
lulas se tornan ms especializadas y a la vez ms restringidas en su ca-
VERTEBRADOS
Los organismos modelo vertebrados sirven como modelos representati
vos del desarrollo humano a los niveles tanto anatmico como molecular.
Se prefieren el pollo domstico (Gallus gallus) y la rana africana con ga
rras (Xenopus iaevis) porque ambas especies producen embriones robus
tos que se desarrollan fuera del cuerpo y pueden manipularse con facilidad.
Sin embargo, estas especies se utilizan poco para anlisis gentico; en el
caso de X. iaevis, a causa sobre todo del intervalo de generacin prolon
gado y el genoma tetraploide, que dificultan el anlisis gentico. En fecha
ms reciente despert inters una especie relacionada, X. tropicalis, que
produce embriones ms pequeos pero tiene un intervalo de generacin
ms corto y es diploide. El ratn [Mus musculus) tiene ventajas en trm i
nos de su accesibilidad gentica, su adecuacin a manipulaciones genti
cas (en particular dirigirse a blancos gnicos, lo que permite inactivar
genes especficos; vase cap. 20), y su cercana con humanos. No obs
tante, como el embrin debe desarrollarse internamente, resulta difcil
efectuar manipulaciones quirrgicas. El pez cebra (Danio reiro) combina ia
docilidad con la accesibilidad genticas y por tanto tal vez sea el ms ver
stil de los organismos modelo de vertebrados.
Todos los embriones vertebrados pasan por etapas similares del desarro
llo, inclusive segmentacin de un vulo grande, gastrulacin, neurulacin,
somitognesis y formacin de yemas de los miembros. Llegan a una eta
pa filotpica en la que el plan corporal de todos los vertebrados es muy
parecido. A pesar de estas similitudes, las cinco clases de vertebrados
tambin presentan diferencias mayores entre si, en especial en las etapas
de segmentacin y gastrulacin, que indican estrategias nutricionales al
ternativas. Este hecho se explica con mayor amplitud en la seccin 3.7.2.
Asim ism o existen diferencias en los mtodos que se utilizan para especi
ficar los ejes embrionarios primarios (seccin 3.5.1) y en otros procesos
del desarrollo, com o la determinacin del sexo (recuadro 3-9).
3.4 1 ESPECIALIZACIN DE LAS CLULAS DURANTE EL DESARROLLO
Fig. 3-6. Las vas de desarrollo pueden imaginarse como corrientes

ramificantes que corren cuesta abajo por el lado de una montaa.
racidad para generar diferentes tipos de descendientes celulares. Las

clulas son forzadas a tomar decisiones y elegir vas alternativas.
La primera decisin en el embrin de los mamferos es la elec
cin entre masa celular interna y trofoblasto. La primera se constitu
ye en el embrin propiamente dicho y el amnios, en tanto que la
segunda se torna en el corion de la porcin embrionaria de la pla
centa. Las clulas de la masa celular interna son pluripotentes, es
decir, pueden dar lugar a todas las clulas del embrin y en conse
cuencia a un animal completo, pero ya no son capaces de originar
-s estructuras extraembrionarias derivadas de un trofoblasto. En
cualquier momento hasta este punto, la potencia de las clulas em
brionarias se demuestra por la capacidad del embrin para formar
gemelos (recuadro 3-4).
Las clulas que se ramificaron hacia el linaje de la masa celular
..-.terna afrontan luego tres elecciones. Pueden escoger uno de los
tres tipos celulares fundamentales del embrin: ectodermo, mesodermo o endodermo. A continuacin cada una de estas capas germinativas puede dar lugar a una gama especfica y limitada de tipos
celulares pero ninguna de ellas es capaz de producir un embrin
completo. Se dice que son multipotentes. Adems, una vez que las
;elulas se comprometen a una capa germinativa, por lo general no
c-ieden producir los tipos de clulas caractersticos de las otras,
=_nque una prueba reciente sugiere que las clulas madre podran
: ;trar ms plasticidad en el desarrollo de lo que se supuso con an
terioridad (vase seccin 3.4.6). Por ejemplo, las clulas del linaje
ecrodrmico suelen originar epidermis, clulas de tejido neural o de
k cresta neural, pero por lo regular no pueden dar lugar a clulas
renales (que se derivan del linaje mesodrmico) ni a clulas heptique provienen del linaje endodrmico) (recuadro 3-5). Por l
73
timo, en el fondo de la montaa, surgen las clulas progenitoras

que slo dan origen a un tipo aislado de clulas diferenciadas. s
tas se describen como unipotentes.
Los libros de texto de histologa reconocen ms de 200 tipos di
ferentes de clulas en el cuerpo humano, que comprenden una va
riedad amplia de funciones (vase recuadro 3-6). Algunas tienen
una funcin limitada a un rgano (p. ej., hepatocitos, cardiomiocitos), mientras que otras pueden tener funciones ms generales, co
mo los fibroblastos. Algunas clulas especializadas maduras no se
dividen y se dice que son diferenciadas terminalmente. Otras c
lulas se dividen en forma activa y actan como precursoras de c
lulas diferenciadas terminalmente. Estos tipos de clulas suelen
distinguirse por el sufijo - blasto, como en osteoblastos, condroblastos, mioblastos, etc. En algunos casos las clulas precursoras tam
bin son capaces de renovarse por s mismas y stas se conocen
como clulas madre (seccin 3.4.3).
3.4.2 La eleccin entre destinos alternativos puede

depender del linaje o la posicin
Una pregunta que los bilogos del desarrollo suelen hacerse es si el
destino de una clula (la gama de tipos de clulas que puede pro
ducir) depende de su linaje (es decir, las clulas de las que se deri
va) o de su posicin (esto es, las clulas con que se encuentra en
contacto). La posicin de una clula parece ser el determinante de
mayor importancia del destino celular en el desarrollo temprano de
los embriones de vertebrados. Con frecuencia los destinos de las c
lulas estn especificados por seales de clulas cercanas, un proceso
denominado induccin. La formacin de la placa neural en el em
brin de Xenopus constituye un ejemplo bien caracterizado (Harland, 2000; Bainter y cois., 2001; fig. 3-7).
La placa neural proviene del ectodermo de superficie a lo largo de
la lnea media dorsal del embrin en tanto que el ectodermo a cada
lado de la lnea media da lugar a la epidermis. Sin embargo, al inicio
todo el ectodermo de superficie no est comprometido o es virgen; es
decir, es competente para dar lugar a la epidermis o la placa neural.
La seal para la induccin neural proviene del notocordio, una estruc
tura mesodrmica que corre a lo largo del eje craneocaudal del em
brin. Las clulas ectodrmicas arriba del notocordio reciben seales
que promueven el desarrollo neural, no as el ectodermo circundante.
Sin embargo, si el notocordio se extirpa, entonces todo el ectodermo
forma epidermis. De igual forma, si se injerta una pieza extra de no
tocordio bajo el ectodermo ventral o lateral (que en condiciones nor
males formara epidermis), en lugar de ello forma tejido de la placa
neural. El ectodermo removido de la supuesta regin de la placa neu-
Recuadro .3-4. Gemelacin en embriones humanos

- rededor de 1 de cada 200 embarazos humanos origina gemelos. stos
son de dos tipos distintos: fraternos (dicigticos) e idnticos (monocigtcosi Los gemelos fraternos resultan de la fecundacin independiente de
dos vulos y no se relacionan en forma ms cercana que cualquiera otro
nermano. Aunque se desarrollan en la misma matriz, los embriones tienen
ru p o s separados e independientes de membranas extraembrionarias. Los
:~ e lo s idnticos surgen del mism o fenmeno de fecundacin y se pro:. : e n por la divisin del embrin en tanto las clulas son an totipotentes
: plunpotentes. Las divisiones tempranas, que ocurren durante la etapa de
-o ru la o antes, producen blastocistos separados que originan embriones
r * je ito s por grupos independientes de membranas extraembrionarias.
stos constituyen alrededor de un tercio de los gemelos idnticos. En los

dos tercios restantes, la gemelacin ocurre en la etapa de blastoclsto y
comprende la divisin de la masa celular interna. La naturaleza de la ge
melacin indica la etapa exacta en que la divisin ocurre y qu tan com
pleta es. En casi todos los casos la divisin se realiza antes del noveno da
de la gestacin, que es cuando se forma el amnios. Estos gemelos com
parten una misma cavidad corinica pero estn rodeados por amnios in
dividuales. En una proporcin muy pequea de los embarazos la divisin
ocurre despus del noveno da y los embriones en desarrollo estn ence
rrados dentro de un amnios comn. En ocasiones estos gemelos son sia
meses sea por separacin Incompleta o por fusin subsecuente.
74 | CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
Recuadro 3-S. De dnde provienen los tejidos: jerarqua del desarrollo en mamferos
Cada tipo de clula humana puede seguirse a travs de la jerarqua del de
sarrollo hasta el vulo fecundado. El esquema de la parte inferior mues
tra las decisiones del desarrollo necesarias para que el vulo d lugar a
cada uno de estos tipos de clulas, el viaje de descenso por la montaa
segn la analoga en la seccin 3.4.1. Casi todas las clulas se derivan

de una de las tres capas germinales primarias y la mayor excepcin son
las clulas germinales primordiales, que se separan del linaje somtico
antes de la gastrulacin.
C igoto
Clulas
germ inales
prim ordiales
G am etos
I
S eg m entaci n
Vejiga urinaria*
G lndulas
sudorparas*
E ctoderm o
extraem brionario de
am nios y corion
U as
Gastrulacin
Glndulas mamarias*
Pelo
ENDODERMO
A lantoides*
H gado
Trquea,*
bronquios,*
pulm ones
Pncreas*
EPITELIO EXTER N O
' DEL C U E R P O
E C TO D E R M O
T
Cristalino del ojo
Tubo digestivo*
NOTOCORDtO
Tiroides
FARINGE
t j
Mecanismo del odo interno
R eceso
am igdalino*
Epitelio nasal y
olfatorio y
nervio olfatorio
MESODERMO
PARAXIL
Tim o prim itivo,*

paratiroides*
V_____
Esqueleto
axil
Esqueleto
ap endicular
Yemas para
apndices
Divertculo metanfrico,
urteres, pelvis renal,
tbulos colectores
Mesonefros,
conductos eferentes
P arte neural
Races de los nervios
d e la hipfisis
raqudeos motores
Conducto anal*
A Mdula espinal
M iotom as
^
Msculos esquelticos
del tronco
C ap a s de tejido
<
conjuntivo d e la piel
Lbulo anterior
d e la hipfisis
Esclerotomas
Msculos de
apndices
Epitelio bucal
Esmalte de los dientes
Epitelio
proctodeal
C uerpos
posbranquiales
"*
Epitelio
estom odeal
MESODERMO
Fosas
farngeas*
Odo medio,* trompa
de Eustaquio
Vescula
auditiva*
G lndulas
sebceas*
R etina* y
nervio ptico
D erm atom as
Epididim o,
conductos
deferentes
r~
i ___
TUBO NEURAL
C RESTA N EU R A L
--------------
^
Vesculas pticas i
\
C erebro
Nervios motores craneales
Races de los nervios

Ganglios y nervios
raqudeos sensoriales
* sensoriales craneales
Ganglios en las
- races raqude;
dorsales
MESODERMO
IN TE R M E D IO
M d u la
suprarrenal
D entina
G anglios
C rneo y
sim pticos
-------------------------------- f cartlagos
a h . . i i.
. S
^ RM0
M E S N Q U IM A DE LA |
branquiales C ap a s externas
Vagina* Oviductos* U tero* LATERAL
..
C A B E ZA i
del ojo
^
Tejido
Mesodermo extraembrionario
conjuntivo
Mesodermo
C0JV
de amnios y corion
ceflico
extraembrionario
del saco vitelino
M e so d erm o som atopleural
y la alantoides
M sculos
I
Mesodermo
Corteza
de
las
M
esenterios
Peritoneo
visceral
Pleura, pericardio,
esplacnopleural
suprarrenales
4 Epim iocardio,
peritoneo
V___
C orazn
epicardio,
Estrom a o
m iocardio
---------------------------%
M
e
s
n
q
u
m
a
g nadas * Pleura visceral
Tejido hemangioblstico
M etanefros,
tbulos renales*
Pronefros
Indica el origen slo de partes epiteliales
Tejido conjuntivo y
msculo liso de visceras
y vasos sanguneos
C orpsculos
sanguneos
Endotelio de
vasos sanguneos
Endocardio
3.4 [ ESPECIALIZACfN DE LAS CLULAS DURANTE EL DESARROLLO
75
V -------- D
t*
\k
Placa neural
Placa neural
Epidermis
Fig. 3-7. Los experimentos de injertos en Xenopus muestran cundo las clulas del ectodermo se comprometen con destinos de clulas epidrmi
cas y neurales.
En el lado izquierdo, el ectodermo ventral (V) (verde) da lugar a epidermis en tanto que el ectodermo dorsal (D) (rojo) origina la placa neural. A la dere
cha, si se Injerta ectodermo ventral en el lado dorsal del embrin, ste se reespecifica y es capaz de formar la placa neural. Lo anterior demuestra que
el destino del ectodermo depende de las seales que emanan de otras clulas en la cercana de la placa neural, es decir, las clulas del mesodermo axil.
Recuadro 3-6. Diversidad de clulas humanas
....
......................
*................... .
Los libros de texto de histologa describen ms de 200 tipos de clulas.

A continuacin se ilustra la variedad de tamao y forma entre algunos ti
pos de clulas comunes.
vulo y espermatozoo (vase fig. 3-12 para las caractersticas y recua
dro 11.4 para la form a en que se generan a partir de clulas germinales
primordiales).
Linfocito (fig. 3-9): clula redonda pequea, de 6 a 8 y,m de dimetro.
Muy poco citoplasma. Por lo general 5 000 por (xm de sangre.
Eritrocito (fig. 3-9): disco bicncavo plano de 7.2
de dimetro. Los
eritrocitos carecen de ncleo, mitocondrias o ribosomas. El metabolismo
ocurre mediante giuclisis por completo. El periodo de vida es de 120
das. Casi siempre 5 millones por mcl de sangre.
Megacariocito (figs. 3-3 y 3-9): clula grande de la mdula sea de 35 a
150 |xm de dimetro. Ncleo lobulado Irregular que contiene 8 a 32 genomas, formados por endomitosis. Los megacarloctos se fragmentan
para form ar miles de plaquetas.
Plaquetas (figs. 3-3 y 3-9): fragmento de 3 a 5 ^ m de citoplasma muy es
tructurado sin ncleo. Periodo de vida de ocho das. Por lo general 200 000
por p.l de sangre.
Macrfago (fig. 3-9): clula de form a variable que se desplaza por medio
de seudpodos. Especializada para englobar partculas por fagocitosis,
contiene muchos lisosomas para digerirlas. Muchos macrfagos se fu
sionan alrededor de grandes cuerpos extraos y forman clulas tisulares
gigantes.
....................
Clula epitelial: clulas muy adherentes que se unen entre s para formar
los epitelios con uniones estrechas (desmosomas) entre las clulas. Al
gunas clulas epiteliales estn especializadas en transporte de Iones, ab
sorcin o secrecin.
Fibroblasto: clula de tejido conjuntivo no especializada capaz de diferen
ciarse en cartlago, hueso, grasa y clulas de msculo liso.
Hepatocito: clula polihdrica de 20 a 30 (m de dimetro, en ocasiones
muitinucleada. Abundante en mitocondrias y retculo endoplsmico; con
tiene lisosomas; puede incluir gotitas de lpidos.
Clula de fibra muscular (fig. 3-3): clula muitinucleada formada por la
fusin de mioblastos. Tiene 10 a 100 p.m de dimetro y puede alcanzar
varios centmetros de largo. Los ncleos se sitan alrededor de la perife
ria; casi todo el interior est ocupado por miofibrillas de 1 a 2 ^ m , con
muchas mitocondrias entre ellas.
Neurona: tamao y forma muy variables. Cuerpo celular de 4 a 150 ^ m ;
por lo general muchas dendritas y un axn. Una clula puede tener ms
de 100 000 conexiones con otras neuronas. Los axones de clulas espi
nales que inervan los pies miden 1 m de largo.
Melanocito (fig. 3-9): clula epitelial con procesos ramificados largos si
tuada entre queratinocitos y que pasa paquetes de pigmento (melanosomas) al interior de ellos. Por lo general 1 500 por mm 2 de piel (con
independencia del color de la misma).
Queratinocito: los queratinocitos maduros son estructuras similares a es
camas llenas de queratina y desprovistas de ncleo o cualquier organelo.
76
CAPITULO TRES [ CLULAS Y DESARROLLO
ral del embrin e injertado en alguna otra parte formar epidermis, en

tanto que el ectodermo que se extirpa del lado ventral del embrin y
se injerta arriba del notocordio formar placa neural. Por consiguien
te, es claro que el destino del ectodermo epidrmico o neuralde
pende de la posicin de las clulas y no de su linaje, y al principio es
reversible. En esta etapa se dice que el destino de las clulas es especi
ficado, lo que significa que an puede alterarse si se cambia el ambien
te de las clulas. Una vez que transcurre cierto periodo, el destino del
ectodermo se torna fijo y ya no puede alterarse mediante injertos. En
esta etapa se dice que las clulas son determinadas, o sea, comprome
tidas de manera irreversible con su destino. Por lo general determina
cin significa que la clula inici un proceso molecular que conduce
de modo inevitable a diferenciacin. En algunos casos esto se debe a
la sntesis de nuevo factor de transcripcin y el factor de transcripcin
no puede inactivarse. En otros casos puede haber modificaciones de
la cromatina que fijan el patrn de expresin gnica en el sitio. Tam
bin es posible que ocurra prdida de competencia por induccin. Por
ejemplo, las clulas ectodrmicas que estn comprometidas a transfor
marse en epidermis pueden dejar de sintetizar el receptor que respon
de a la seal que proviene del notocordio.
Aunque se cuenta con menos ejemplos del destino de las clulas es
pecificado por el linaje en embriones de vertebrados, un caso explcito
es la conducta de las clulas madre, que se comenta ms adelante.
3,4.3 Las clulas madre son clulas progenitores

que se renuevan por s mismas
Inclusive cuando un organismo est desarrollado a plenitud, algu
nas clulas en especial las sanguneas, las epiteliales en la piel y el
intestino, y las espermticasnecesitan producirse de manera con
tinua. stas son producto de clulas precursoras que se renuevan
por s mismas, o clulas madre. Las clulas madre pueden proliferar por divisin celular simtrica y generar dos clulas hijas simila
res. Segn se requiera, tambin pueden someterse a divisin celular
asimtrica-, una clula hija tiene el mismo tipo de propiedades que
la clula madre original, pero la otra clula hija posee propiedades
alteradas y queda comprometida a producir un linaje de clulas di
ferenciadas. El destino de la clula hija comprometida no est in
fluido por su posicin o por las seales de otras clulas. La decisin
es intrnseca al linaje de la clula madre. Este tipo de especificacin
no condicional (autnomo) de los destinos de las clulas es resulta
do de la distribucin asimtrica de molculas reguladoras en la di
visin celular. Por ejemplo, en las clulas madre neurales se observa
una distribucin asimtrica de las protenas Notch-1 (concentradas
en el polo apical) y las Numb (que se concentran en el polo basal).
La divisin en el plano de la superficie epitelial ocasiona que estos
determinantes se distribuyan por igual, pero una divisin en ngu-
Fig. 3-8. El destino de la clula en los descendientes de clulas madre neurales depende del plano de divisin celular, que refleja la distribucin asi
mtrica de protenas que abarcan la membrana como Notch y determinantes intracelulares, por ejemplo Numb.
Ocurre divisin simtrica en el plano del neuroepitelio y da por resultado la distribucin uniforme de Notch (crculos verdes) y Numb (tringulos rojos)
entre clulas hijas. Las divisiones asimtricas perpendiculares al neuroepitelio conducen a la formacin de un progenitor neuronal apical y una clula
madre de reemplazo basal.
3.4 | ESPECIALIZACIN DE LAS CLULAS DURANTE EL DESARROLLO | 77
CLULA MADRE HEMOPOYTICA PLURIPOTENTE

A u to rre n o v a c i n
R e p lic a d o r)
e n d o m it tic a
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O
Reticulocito
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C lu la T
o o
Plaquetas
(trombocitos)
Macrofago
L in fo cito s
Basfilo
Neutrfilo
Eosinfilo
Eritrocito
Granulocitos
Fig. 3-9. Compromiso y diferenciacin en el linaje de clulas sanguneas.
los rectos a la superficie epitelial causa que stos se segreguen en las

clulas hijas, que en consecuencia se desarrollan de manera distin
ta (Kim y Schagat, 1996; fig. 3-8).
Las clulas sanguneas son un ejemplo til de linajes de clulas
madre. Un tipo de clula nico, la clula madre hemopoytica
(CMH), puede dar lugar a todas las clulas sanguneas (Morrison y
cois., 1995). Esto se comprob con claridad mediante la irradiacin
de ratones para asegurar la destruccin de la mdula sea y a conti
nuacin injertando CMH purificadas de una cepa distinta de rato
nes, tras lo cual las clulas que se produjeron fueron capaces de
diferenciarse y repoblar la sangre. Las CMH son multipotentes pero
los linajes celulares a que dan lugar se tornan cada vez ms especiali
zados y por ltimo producen todas las clulas hematolgicas diferen
ciadas terminalmente (fig. 3-9).
3.4.4 Se sabe que existe una variedad de clulas madre

tisulares, pero an queda mucho por aprender
acerca de ellas
Una clula madre tisular (en ocasiones tambin descrita como una
clula madre somtica) es una clula indiferenciada que se encuen
tra entre las clulas diferenciadas en un tejido u rgano (Verfaile,

2002). Puesto que es una clula madre, puede renovarse por s mis
ma y diferenciarse para reproducir los principales tipos de clulas
especializadas del tejido o el rgano. Por lo general cada tejido po
see un nmero muy pequeo de estas clulas y aunque su origen
preciso se desconoce en gran parte, se piensa que residen en reas
especficas de cada tejido. En algunos casos pueden permanecer la
tentes (sin dividirse) durante muchos aos hasta que una enferme
dad o lesin las activa, pero en otras circunstancias en las que es
necesario restituir clulas con frecuencia (p. ej., para reemplazar c
lulas epiteliales de la piel y el intestino) son regularmente activas.
Las primeras clulas madre de adultos se encontraron en el de
cenio de 1960 cuando se observ que la mdula sea contena
cuando menos dos tipos de clulas madre; clulas madre bemopoyticas, que forman todos los tipos sanguneos, y clulas d el estroma de
la mdula sea, una poblacin mixta que genera hueso, cartlago,
grasa y tejido conjuntivo fibroso. A partir de entonces se realizaron
algunos descubrimientos sorprendentes y se hizo pblico que las
clulas madre cerebrales generan los tres tipos principales de clu
las del cerebro: las neuronas (clulas nerviosas) y los astrocitos y oligodendrocitos no neuronales.
78
CAPTULO TRES
Cuadro 3
CLULAS Y DESARROLLO
Ejemplos de clulas madre adultas
Tipo de clula madre
Localizacin
Diferenciacin en
Clulas madre hemopoyticas
Mdula sea
Todas las clulas sanguneas (vase fig. 3-9)
Clulas madre mesenquimatosas

de mdula sea (clulas estrmicas)
Mdula sea
Osteocitos (clulas seas), condrocitos (clulas de cartlago), adipocitos

(clulas adiposas) ms otros tipos de clulas de tejido conjuntivo como
las de tendones
Clulas madre neurales
Cerebro
Neuronas (clulas nerviosas), astrocitos, oligodendrocitos
Clulas madre de epitelio intestinal
Criptas profundas en
el recubrimiento del tubo
digestivo
Clulas de absorcin, caliciformes, de Paneth y enteroendocrinas
Clulas madre epidrmicas
Capa basal de la epidermis
Queratinocitos
Clulas madre foliculares
Base de los folculos pilosos
Folculos pilosos y clulas epidrmicas
En la actualidad las publicaciones indican que diversos tejidos

adultos contienen clulas madre (vase cuadro 3 -6 ) y se ha progre
sado un poco en la identificacin de localizaciones especificas de al
gunas clulas madre tisulares. Una de las principales dificultades
para el uso experimental de clulas madre tisulares estriba en que la
mayor parte slo puede permanecer en cultivo sin diferenciarse du
rante periodos cortos (a diferencia de las clulas madre embriona
rias; vase la seccin siguiente) y su potencial de diferenciacin es
mucho ms limitado que el de las clulas madre embrionarias. No
obstante, pruebas recientes sugieren que el potencial de desarrollo
de algunas clulas madre adultas puede ser ms plstico de lo que se
pensaba. Este tema se expone en la seccin siguiente.
3.4.5 Las clulas madre embrionarias (ME) tienen

el potencial para formar cualquier tejido
Desde etapas muy tempranas del desarrollo, las clulas son indiferenciadas comparativamente. Como su nombre lo sugiere, las clu
las madre embrionarias (ME) se derivan de embriones. Al inicio
del decenio de 1980 se efectu un adelanto cientfico importante
cuando se logr cultivar clulas de la masa celu lar in tern a de blastocistos de ratn (Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Las c
lulas ME son plu rip oten tes y poco tiempo ms tarde se demostr
que son capaces de desarrollar ratones adultos sanos despus de in
yectarse en blastocistos de una cepa de ratn diferente que luego se
transfirieron al oviducto de una madre adoptiva (las aplicaciones de
este proceso se comentan en el cap. 20 ).
Las clulas ME de ratn se cultivaron mediante la transferencia de
clulas de la masa celular interna a un plato que contena un medio de
cultivo y cuya superficie interna estaba recubierta con una capa de c
lulas alimentadoras. Las clulas de la masa celular interna (MCI) pue
den crecer y dividirse en tanto estn unidas a la superficie adherente de
las clulas alimentadoras que, como su nombre lo indica, tambin li
beran nutrimentos hacia el medio. Una vez que las clulas de la MCI
proliferan, se extraen con suavidad y se subcultivan sembrndolas de
nuevo en varios platos para cultivo fresco. Tras unos seis meses de subcultivos repetidos, las cerca de 30 clulas originales de la MCI pueden
proporcionar millones de clulas madre embrionarias (ME). Las clu
las ME que proliferaron en cultivo celular durante seis meses o ms sin
diferenciarse y que son pluripotentes y parecen genticamente norma
les se denominan lnea de clulas madre embrionarias (ME).
Para valorar si es probable que las clulas ME sean pluripoten

tes pueden seguirse varios mtodos experimentales, algunos de los
cuales conducen a la produccin de los tipos deseados del produc
to de la diferenciacin.
D iferenciacin espontnea. En circunstancias normales las c
lulas ME se desarrollan bajo ciertas condiciones que las man
tienen en un estado indiferenciado. Las alteraciones de las
condiciones del cultivo suelen permitir que las clulas se adhie
ran entre s para formar grupos celulares que se conocen como
cuerpos embrioides, tras lo cual las clulas comienzan a dife
renciarse de modo espontneo para formar clulas de diferen
tes tipos, aunque en una forma bastante impredecible.
D iferenciacin dirigida. Las clulas se manipulan (por medio
del cambio de la composicin qumica del medio de cultivo,
etc.) de tal manera que se diferenciarn para formar los tipos
de clula especifica deseados.
Form acin d e teratomas. Las clulas se inyectan en un ratn
inmunosuprimido a fin de estudiar la formacin de un tipo
particular de tumor benigno que se conoce como teratoma. Los
teratomas que ocurren en forma natural y los inducidos por
medios experimentales contienen de manera caracterstica una
mezcla de muchos tipos de clulas diferenciadas o parcialmen
te diferenciadas -una indicacin de que las clulas ME son ca
paces de diferenciarse en mltiples tipos celulares.
Cabe sealar que aunque las clulas ME se denominan clulas madre,
son diferentes a las clulas madre tisulares porque no se dividen de
modo asimtrico para producir una clula madre de reemplazo y una
clula hija preparada para la diferenciacin. Las clulas ME se dividen
simtricamente y todas las clulas hijas tienen el mismo potencial de
diferenciacin, acorde con las circunstancias experimentales.
En fecha ms reciente se notific xito en el cultivo de clulas
ME humanas (Thomson y col-, 1998), derivadas de embriones de
sarrollados de vulos fecundados in vitro en una clnica de fecu n d a
cin in vitro (FIV). El objetivo del procedimiento de FIV es ayudar
a las parejas con dificultades para tener hijos y por lo general se ob
tiene un exceso de vulos fecundados que pueden donarse despus
para fines de investigacin. Los embriones de los que se derivan las
clulas ME casi siempre son de cinco das de edad o blastocistos,
pelotas microscpicas huecas que contienen alrededor de 100 clu
las, de las que casi 30 constituyen las clulas de la masa celular in
3.5 j FORMACIN DEL PATRN EN EL DESARROLLO
terna (MCI). El xito en el cultivo de clulas ME humanas fue un

delanto cientfico importante y excitante porque origin la posi
bilidad de nuevas conductas teraputicas y nuevos caminos de in
vestigacin hacia la diferenciacin celular. Los trastornos y las
-csiones graves en los que la patognesis es resultado de la prdida
ce clulas del cuerpo podran tratarse mediante estrategias de res
titucin celular y puesto que, en principio, es posible programar las
.elulas ME para que se diferencien en clulas de un tipo especfico,
hay grandes expectativas (cap. 2 1 ).
Una estrategia alternativa es el aislamiento de clulas germinales
primordiales, las clulas del reborde gnadal que en condiciones nor
males se desarrollarn en gametos maduros (vase figura en el recua
dro 11.4). Estas clulas pueden cultivarse in vitro y dar lugar a clulas
germinales embrionarias (GE) pluripotentes que se mantienen en
torma muy similar a las clulas ME. Shamblott y colaboradores
998) cultivaron por primera vez las clulas GE humanas derivadas
de clulas germinales primordiales o de embriones y fetos de 5 a 10
emanas de edad. Vase tambin Donovan y Gearhart, 2001.
3.4.6 Ei potencia! de diferenciacin de ias clulas

madre tisulares es motivo de controversias
El potencial de diferenciacin de las clulas madre tisulares se revaor en los ltimos aos con base en varios informes de finales del
decenio de 1990 que indicaron que al parecer ciertas clulas madre
tisulares adultas son pluripotentes. La capacidad aparente de las c. Jas madre adultas para diferenciarse en mltiples tipos de clulas
muy distintas se denomina transdiferenciacin o plasticidad. Los
templos informados incluyen:
clulas madre hemopoyticas que se diferencian en los tres tipos
principales de clulas cerebrales (neuronas, oligodendrocitos y
astrocitos), en clulas de msculo esqueltico y de msculo car
diaco, y en hepatocitos (p. ej., Petersen y cois., 1999);
clulas cerebrales que se diferencian en clulas sanguneas y de
msculo esqueltico o viceversa (p. ej., Shih y cois., 2002; Clarke y cois., 2000; Bjornson y cois., 1999).
clulas del estroma de la mdula sea que se diferencian en c
lulas de msculo cardiaco y esqueltico (Orlic y cois., 2001).
La excitacin que estos informes originaron reflej en gran parte
el potencial de la teraputica con clulas madre. En principio cual
quier tejido u rgano daado podra renovarse y aun reemplazarse
utilizando las clulas madre ms accesibles y stas podran inclusive
manipularse de manera previa (vase Weissman, 2000; Daley, 2002).
Por ejemplo, las clulas madre hemopoyticas de un paciente, que
son de fcil acceso, podran reprogramarse para producir clulas ce
rebrales que reemplacen las que se perdieron en una enfermedad
neurodegenerativa o en lesiones de la mdula espinal. Sin embargo,
surgieron dudas respecto a la posibilidad de aprovechar con fines te
raputicos la transdiferenciacin (vase Medvinsky y Smith, 2003).
Vase tambin el captulo 21 para problemas prcticos y ticos gene
rales relacionados con el uso de clulas madre humanas.
5.5 Formacin del patrn en el desarrollo

Si bien la diferenciacin da lugar a clulas con estructuras y funcio
nes especializadas, eso no constituye un organismo a menos que las
clulas se organicen en una forma til. Sin organizacin, el huma
no podra terminar como una burbuja amorfa de tejido heterog
79
neo, con clulas hepticas, neuronas y de la piel distribuidas de ma

nera aleatoria incapaces de formar tejidos y rganos identificables.
Aunque los individuos presentan muchas diferencias menores, to
dos los miembros de la misma especie tienden a ajustarse al mismo
plan bsico del cuerpo (Wolpert, 1996). En los humanos, y en los
vertebrados en general, el plan del cuerpo muestra simetra bilate
ral superficial con respecto al eje craneocaudal, en tanto que el otro
eje mayor (el dorsoventral) sigue de la espalda al vientre. Al interior
del cuerpo ciertos rganos estn colocados asimtricamente y defi
nen un eje de izquierda a derecha. Los rganos y tejidos del cuerpo
se distribuyen en esencia de la misma manera en relacin con estos
ejes en cada individuo y este patrn surge muy temprano en el de
sarrollo. Despus emergen patrones definidos dentro de rganos
particulares. Un buen ejemplo es la formacin de los cinco dedos
de cada mano y de cada pie. El ordenamiento de clulas dentro de
los tejidos genera patrones ms detallados. Tales patrones surgen de
manera gradual durante el desarrollo, con un embrin al principio
tosco que poco a poco se refina como una fotografa que se enfoca
con precisin. En esta seccin se estudian la manera en que la for
macin del patrn en el embrin en desarrollo se inicia y los meca
nismos moleculares relacionados.
3.5.1 El surgimiento del plan del cuerpo depende de la

especificacin y la polarizacin del eje
El desarrollo comienza con una clula aislada, que debe polarizarse
de alguna manera para producir un embrin con una cabeza y una
cola, un dorso y un frente, y lados izquierdo y derecho. En muchos
animales la diferenciacin del huevo durante la gametognesis com
prende el depsito de molculas particulares en diferentes sitios intracelulares y stas dan lugar a la polaridad del vulo. Cuando el
huevo fecundado se divide, estos determinantes se segregan hacia
diferentes clulas hijas y de este modo se polariza el embrin. La si
metra del huevo de otros animales se rompe por un indicio exter
no del ambiente. Por ejemplo, en pollos el eje craneocaudal del
embrin se define por la gravedad conforme el huevo gira en su ca
mino hacia el oviducto. Las ranas utilizan ambos mecanismos: una
asimetra preexistente en el huevo definida por la distribucin de los
productos gnicos matemos, en tanto que el sitio de entrada del es
permatozoo proporciona otra coordenada de posicin. Aunque an
no se aclara el mecanismo de simetra-rotura en mamferos, es pro
bable que tambin incluya el sitio de entrada del espermatozoo (re
cuadro 3-7).
3.5.2 Las mutaciones hometicas revelan la base

molecular de la identidad posicional
Investigaciones a gran escala de mutagnesis en Drosophila que se
realizaron en el decenio de 1980 produjeron un nmero pequeo
de moscas en las que una parte del cuerpo se desarroll con el as
pecto de otra (una transformacin hometica). Un ejemplo es la
Antennapedia mutante, en la que las patas crecen de la cabeza en lu
gar de las antenas. Lo que este hecho muestra respecto a la forma
cin del patrn es que la identidad posicional de una clula, es
decir, la informacin que indica a cada clula dnde se encuentra
en el embrin y por consiguiente cmo debe comportarse para ge
nerar una estructura apropiada para la regin est controlada por
genes. Estos genes se conocen como genes hometicos.
Anlisis moleculares subsecuentes de las mutantes hometicas de
Drosophila revelaron dos grupos de genes muy similares (fig. 3-10),
CAPTULO TRES
C LULAS Y DESARROLLO
cada uno de los cuales codifica un factor de transcripcin que con

tiene un dominio de unin de DNA conservado llamado homeodominio. Los genes se expresaron de manera notable en patrones
superpuestos a lo largo del eje de la cabeza a la cola de la mosca para
dividir el cuerpo en zonas discretas. Al parecer la combinacin parti
cular de genes expresados en cada zona estableci un cdigo que con
firi a cada clula una identidad posicional especfica a lo largo del
eje (vase Morata, 1993; Lawrence y Morata, 1994). La manipula
cin de los cdigos, sea mediante la mutacin de uno o ms de los
genes o por su expresin deliberada en exceso, permiti generar mos
cas con transformaciones especficas de partes del cuerpo.
En mamferos se encuentran grupos muy similares de genes homeobox (genes Hox). Tanto los humanos como los ratones tienen
cuatro grupos no unidos de genes Hox que se expresan en patrones
superpuestos a lo largo del eje craneocaudal de una manera muy si
milar a la de las moscas (Krumlauf, 1994; Lumsden y Krumlauf,
1996; Burke, 2000; fig. 3-10). Ms an, al parecer el mecanismo
general de actividad del gen Hox se conserva ya que los estudios de
mutaciones knockout y la expresin excesiva deliberada lograron
transformaciones de partes del cuerpo que incluyen las vrtebras
del ratn. Por ejemplo, la alteracin dirigida del gen Hoxc8 produ
jo ratones con un par extra de costillas a causa de la transformacin
de la primera vrtebra lumbar en la 13a. vrtebra torcica (Le
Mouellic y cois., 1992).
Dos de los grupos de genes Hox, HoxA y HoxD, tambin se ex
presan en patrones superpuestos a lo largo de los miembros. El ra
tn knockout y los mutantes de expresin excesiva de estos genes
muestran reordenamientos especficos de los segmentos de los
miembros. Por ejemplo, los ratones con alteraciones dirigidas de los
genes H ox all y H ox dll carecen de radio y cbito (Davis y cois.,
1995). Las mutaciones que ocurren de manera natural en el gen
HOXD13 humano se acompaan de una gama de defectos de las
manos, inclusive polisindactilia (Manouvrier-Hanu y cois., 1999).
3.5.3 La formacin de patrones suele depender

de los gradientes de seal
La especificacin del eje y la polarizacin son acontecimientos tem
pranos importantes en el desarrollo porque las clulas de las distin
tas partes del embrin deben comportarse de manera diferente, en
ltima instancia en trminos de los productos del gen que sinteti
zan, a fin de generar el plan corporal apropiado. Una clula slo se
comporta de modo apropiado si puede indicar dnde se encuentra
en relacin con otras clulas. Ello requiere a su vez un armazn de
referencia. Los principales ejes del embrin brindan una referencia
que permite definir en forma absoluta y sin ambigedad la posicin
de cualquier clula.
Cmo reconocen las clulas su posicin a lo largo de un eje y
en consecuencia se comportan como corresponde? Esta pregunta
resulta pertinente porque a menudo es necesario que clulas con
funciones equivalentes en diferentes posiciones produzcan estruc
turas distintas. Los ejemplos abarcan la formacin de los distintos
dedos a partir de los mismos tipos de clulas en la mano en desa
rrollo y la de diferentes vrtebras (algunas con costillas y otras sin
ellas) de variedades idnticas de clulas en las somitas.
Est demostrado que en muchos sistemas en desarrollo la con
ducta especfica de regin de las clulas depende de un gradiente de
seal, que tiene diferentes efectos en clulas blanco equivalentes a
distintas concentraciones. Las molculas de sealamiento que ac
tan en esta forma se conocen como morfgenas. Tanto el princi

pal eje craneocaudal del cuerpo como los ejes anteroposterior y
proximodistal de los miembros de embriones vertebrados se mode
lan mediante este mecanismo (Wolpert, 1996; Ng y cois., 1999).
En los miembros en desarrollo (vase Schwabe y cois., 1998;
Niswander, 2003), se encuentra un subgrupo particular de clulas
en el margen posterior de cada brote de los miembros llamado zo
na de actividad polarizante (ZAP) que es el origen de un gradien
te morfgeno (fig. 3-11). Las reas ms cercanas a la ZAP forman
los dedos ms pequeos y posteriores de la mano o el pie, en tanto
que las que estn ms alejadas originan el pulgar o el dedo gordo.
La capacidad de organizacin de la ZAP puede demostrarse con fa
cilidad si se injerta una ZAP donadora en el margen anterior del
brote de un miembro que ya tiene su propia zona de actividad po
larizante (ZAP). En este experimento el miembro se torna simtri
co, con dedos posteriores en ambas extremidades. Al parecer el
morfgeno en el miembro en desarrollo es la protena de seala
miento Sonic hedgehog (Shh), aunque se piensa que la protena ac
ta de manera indirecta puesto que no es capaz de difundirse ms
all de unas cuantas clulas de ancho desde su origen. Una cuenta
sumergida en la protena Shh sustituir en funciones a la ZAP, lo
mismo que una cuenta humedecida en cido retinoico, que se sabe
induce la expresin del gen Shh. Los cinco genes distales HoxD
(Hoxd9 a Hoxdl3) se expresan en el centro de la ZAP. Sin embar
go, conforme la fuerza de la seal disminuye, los genes HoxD se
apagan uno por uno hasta el margen anterior de la yema del miem
bro que forma el pulgar y slo Hoxd9 permanece activo. Los gra
dientes de seal que especifican los principales ejes embrionarios
estn unidos a los genes hometicos que controlan la conducta re
gional de la clula en esta forma.
Como ya se coment, los genes Hox no slo se expresan en los
miembros sino tambin a lo largo de los ejes craneocaudales mayo
res del embrin. En este caso se piensa que el origen del gradiente
morfgeno que gua la expresin del gen Hox es el mido em briona
rio y que el morfgeno en s mismo es cido retinoico. Puesto que
el nudo secreta cantidades cada vez ms abundantes de cido reti
noico a medida que involuciona, las clulas posteriores se exponen
a mayores cantidades de la sustancia qumica que las clulas ante
riores, lo que produce la activacin progresiva de ms genes Hox en
las regiones posteriores del embrin.
3.6
Morfognesis
La divisin celular, con la formacin progresiva de patrones y dife

renciacin celular, proporcionara por ltimo un embrin con tipos
de clulas organizadas, pero ese embrin sera una pelota esttica de
clulas. Los embriones reales son estructuras dinmicas, con clu
las y tejidos que se someten a interacciones y reordenamientos
constantes para generar estructuras y formas. Las clulas forman
hojas, tubos, masas reticulares laxas y aglomerados densos. Las c
lulas migran de manera individual o en masa. En algunos casos es
ta conducta es una respuesta al programa de desarrollo, pero en
otros tales procesos impulsan el desarrollo al llevar entre s grupos
de clulas que de otra manera nunca entraran en contacto. Varios
mecanismos sustentan la morfognesis; se resumen en el cuadro
3-7 y se comentan con mayor detalle ms adelante (Hogan, 1999;
Mathis y Nicols, 2002; Peifer y McEwan, 2002; Lubarsky y Krasnow, 2003).
3.6 i MORFOGNESIS 81
1
Pro
A N T -C
Labial
Mia
a
iv
M x Lb
T1 T 2 T 3
10
11
12
13
14
A1 A 2 A 3 A 4 A 5 A 6 A 7 A 8
P a ra s e g m e n to s
Tel
S e g m e n to s
proboscipedia
d eform ada
peines de sexo reducidos
antennapedia
B X -C
U ltrabitrax
abdom inal-a
abdom inal-B
!
lab
Pb
Dfd
Ser
Antp
Ubx
abdA
AbdB
H O M -C
O c c ip ita l
C ervical
1 2 3 4 1 2 3 4 5
T o r cic o
Lum bar
S a c ro
Caudal
6 1 2 3 4 1 2 3 4
Fig. 3-10. Comparacin de los complejos gnicos HOM-C/Wox de Drosophila y el ratn y sus dominios de expresin a lo largo del eje anteroposterior
del embrin.
Redibujado de Twyman (2001 ) Instant Notes in Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.
82
CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
G e n e s H oxD
IV
11 1 0 9
G e n e s H oxD
IV
Flg. 3-11. El Injerto de una segunda zona de actividad polarizante en el margen anterior de la yema del miembro del pollo ocasiona duplicacin de
los dedos en una imagen en espeio.
A) Un gradiente de seal establecido por la expresin de Sonic hedgehog en la zona de actividad polarizante (ZAP) genera un patrn anidado de
superposicin de patrones de expresin del gen HoxD en la yema de la extremidad en desarrollo, que conduce a la especificacin de cinco dedos.
B) Los injertos de ZAP establecen un gradiente opuesto y producen una reversin en imagen en espejo de los destinos de los dedos. El efecto puede
simularse mediante perlas recubiertas con cido retinoico (AR) o protena snica hedgehog (Shh). Redibujado de Twyman (2001) Instant Notes in
Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.
Procesos morfogenticos en el desarrollo y ejemplos de sistemas modelo del desarrollo

P ro c e s o
E je m p lo s
Ritmos diferenciales de proliferacin celular
Brote selectivo de yemas de los miembros de vertebrados mediante proliferacin de clulas en la zona
de progreso
Colocacin alternativa, orientacin

del huso mittico, o ambos
Patrones de segmentacin embrionaria diferentes en animales. Divisiones celulares estereotipadas

en nematodos
Cambio del tamao celular
Expansin celular conforme los adipocitos acumulan gotitas de lpidos
Cambio de la form a celular
Cambio de forma de las clulas de cilindrica a cua durante el cierre del tubo neural en aves y mamferos
Fusin celular
Formacin de trofoblasto y miotubos en mamferos
Muerte celular
Separacin de los dedos en la yema de los miembros de vertebrados. Seleccin de slnapsis funcionales
en el sistema nervioso de mamferos
Ganancia de adherencia clula-clula
Condensacin del mesnquima de cartlago en la yema de los miembros de vertebrados
Prdida de adherencia de clula-clula
Deslaminacin de clulas del epiblasto durante la gastrulacin en mamferos
Interaccin clula-matriz
Migracin de clulas de la cresta neural y clulas germinales. Migracin del axn
Prdida de adherencia clula-matriz
Deslamlnacin de las clulas de la capa basal de la epidermis
Reproducido de Twyman (2001 ), Instant Notes in Developmental Biology. 2001 BIOS Scientific Publishers.
3.6 | MORFOGNESIS ] 83
3.6.1 Cambios en la forma y el tamao de las clulas

pueden impulsar la morfognesis
La reorganizacin del citoesqueleto puede originar cambios instrumen
tados en la forma de la clula y es posible que esto tenga un efecto ma
yor en la estructura de todos los tejidos. Uno de los acontecimientos
destacados en el desarrollo de los vertebrados, la formacin del tubo
neural, es impulsado en parte por cambios en la forma de la clula. Las
constricciones apicales originadas por la contraccin local de microfilamentos determinan que algunas de las clulas cilindricas de la placa
neural tomen forma de cufia, lo que les permite actuar como bisagras.
En combinacin con el incremento de la proliferacin en los mrgenes
de la placa neural, ello proporciona la fuerza suficiente para que toda la
placa neural se enrolle hacia un tubo (Schoenwolf y Smith, 1990). Una
conducta similar dentro de cualquier hoja plana de clulas tender a
ocasionar la invaginacin de esa hoja.
3.6.2 Los principales cambios morfogenticos en el

embrin son resultado de la afinidad
diferencial de las clulas
La adherencia selectiva clula-clula y la de la clula con la matriz se
describieron en las secciones 3.2.3 y 3.2.4 como mecanismos que se
utilizan para organizar las clulas en tejidos y conservar los lmites del
tejido. En el desarrollo, la regulacin de la sntesis de molculas de
adherencia celular particulares permite que las clulas formen y rom
pan contactos entre s, y experimentan una reorganizacin muy di
nmica. La gastrulacin, que se describe en la seccin 3.7.5, es quizs
el ejemplo ms notable de un proceso morfogentico. La hoja nica
de epiblasto gira sobre s misma y se convierte en las tres capas ger
minales fundamentales del embrin, un proceso impulsado por una
combinacin de cambios en la forma de la clula, proliferacin celu
lar selectiva y diferencias en la afinidad de las clulas. La alteracin de
Recuadro 3-7. Polarizacin del embrin de mamferos: se ales y productos gnicos

EJE D0RS0VENTRAL
El primer signo franco de asimetra en el embrin de mamferos es la se
gregacin de la masa celular interna (MCI) a un lado del blastocisto (Lu y
col., 2001; Zernicka-Goetz, 2002). Ello define el e/e embrionario-abembrionario y la MCI representa el polo embrionario. La cara embrionaria de
la MCI est expuesta al trofoblasto y en contacto con l, en tanto que la
cara abembrionarla est abierta hacia el blastocele. Esta diferencia en el
ambiente es suficiente para especificar las dos primeras capas precisas
de clulas en la MCI: ectodermo primitivo en el polo embrionario y endodermo primitivo en el polo abembrionario. Esto a su vez define el eje dorsoventral del embrin. Aunque an no se aclara cmo se posiciona
asimtricamente la MCI en el blastocisto en primer lugar, es Interesante
sealar que cuando el sitio de entrada del espermatozoo se sigue median
te cuentas fluorescentes, siempre se localiza en las clulas del trofoblas
to en el borde embrionario-abembrionario.
EJE CRANEOCAUDAL
La posicin de la entrada del espermatozoo tambin tiene una funcin im
portante en la definicin del eje craneocaudal del embrin de mamferos,
pero an no se aclara cmo se polariza este eje (Beddington y Robertson,
1999; Lu y cois., 2001). La fecundacin induce la segunda divisin meitica y por lo general se expulsa el segundo cuerpo polar opuesto al sitio
de entrada del espermatozoo. Lo anterior define el eje animal-vegetal del
cigoto, con el cuerpo polar en el polo animal. Las divisiones por segmen
tacin subsecuentes que ocurren en el contexto del eje animal-vegetal
producen un blastocisto que muestra simetra bilateral alineada con el eje
animal-vegetal inicial del cigoto. El eje de simetra bilateral en el blastoclsto predice la alineacin de la estria primitiva, pero no su orientacin. La
decisin en cuanto al extremo que debe form ar la cabeza y el que form a
r la cola descansa en una regin de tejido extraembrionario llamada endodermo visceral anterior (EVA). En ratones, al principio se localiza en la
punta del cilindro del huevo. ste gira hacia el futuro polo craneal del eje
craneocaudal justo antes de la gastrulacin y el nudo embrionario se es
tablece en el extremo opuesto del epiblasto.
EJE IZQUIERDA A DERECHA
El primer signo evidente de asimetra izquierda-derecha en el embrin de
mamferos es la formacin del asa del tubo cardiaco. Sin embargo, m u
cho antes de este hecho se observa asimetra molecular (Capdevila y col.,

2000). En el embrin de mamferos ocurre un paso de determinacin im
portante durante la gastrulacin cuando la rotacin de cilios en el nudo
embrionario ocasiona un flujo unidireccional del lquido perinodal que se
requiere para especificar el eje izquierda-derecha. Aunque an no se
aclara el mecanismo (Tabin y Vogan, 2003), el resultado es la activacin
de genes que codifican las molculas de sealamiento Nodal y Lefty-2,
de manera especfica en el lado izquierdo del embrin. stas inician vas
de sealamiento que activan factores de transcripcin especficos del la
do izquierdo (p. ej., Pitx2) e inhiben factores de transcripcin especficos
dei lado derecho. En el lado derecho del embrin, que carece de Lefty-2
y Nodal, Pitx2 no se activa. Otras protenas, com o Lefty-1, se expresan
en la lnea media del embrin y establecen una barrera que Impide el es
cape de seales de un lado del embrin al otro. Las mutaciones en los ge
nes humanos LEFTA, LEFTB y NODAL se acompaan de una gama de
malformaciones del eje que incluyen reversin izquierda-derecha (situs
inversus, situs ambiguous) y simetra de imagen en espejo (isomerismo).
En ocasiones estas malformaciones afectan la totalidad del cuerpo y a ve
ces slo rganos individuales (heterotaxia). Las mutaciones que afectan
subunidades de la protena motora dinena, necesaria para la rotacin uni
direccional de cilios, tambin se acompaan de defectos de lateralidad.
Como hecho interesante, con frecuencia stas ocurren aunadas a infec
ciones respiratorias recurrentes e infertilidad, que refleja la falta de motilidad de los cilios en otras partes del cuerpo (recuadro 3-1).
Generalidades de la formacin temprana del eje en el embrin de ratn
desde la fecundacin hasta la etapa de estra media (vase pg. sig.).
El polo animal del eje animal-vegetal en el embrin de ratn se define co
mo el punto en el que el segundo cuerpo polar se expulsa justo despus
de la fecundacin. El eje embrionario-abembrionario en el blastocisto es
ortogonal al eje animal-vegetal y se define por la localizacin de la MCI
con el polo embrionario en el lado del blastocisto que contiene la MCI y el
polo abembrionario en el lado con la cavidad del blastocele. El eje P-D en
la etapa de cilindro del huevo del embrin se forma con el polo proximal
localizado en el cono ectoplacentario y el polo distal en el fondo del em
brin en forma de copa. Antes de la gastrulacin, el eje P-D gira 90 y se
convierte en un eje A-R Tomado de Lu y col. (2001) Curr. Opin. Genet.
Dev. 11, 384-392. Con autorizacin de Elsevier.
84
CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
Recuadro 3-7. (co n tin u a ci n )
vu lo sin
fe c u n d a r
A n im al
A nim al
A nim al j
] V eg etal
[V eg etal [
V eg etal :
Segundo
c u e rp o p o la r
Segundo
c u e rp o p o la r
Posicin de la
entrada del
espermatozoo
Posicin de la
entrada del
espermatozoo
Embrin de dos clulas
C ig o to
Embrin de tres clulas
! E m b rio n ario i
V eg etal
Cono
ectoplacentario
Ectodermo
extraembrionario'
A nim al
Abembrionario
Trofoectodermo
polar
MCI
Endodermo
primitivo
EV
extraembrionario
Epiblasto
proximal
EV
EV/A
Cuerpo polar
Trofoectodermo
mural
4.5 dpc
Posicin de la
entrada del espermatozoo
Cavidad del
blastocelo
EV distal
Trofoblasto
5.5 dpc
5.75 dpc
EV
extraembrionario
A n terio r ]< >-| P o s te rio r]
EV
desplazado
Mesodermo
extraembrionario
Estra
------ primitiva
Neuroectodermo
anterior
Mesodermo
anterior
6.0 dpc
6.5 dpc
Nudo
. 7.5 dpc
3.7 [ DESARROLLO HUMANO INICIAL: FECUNDACIN A GASTRULACIN
las propiedades adherentes de las clulas puede dar lugar a varios pro
cesos diferentes (McNeil, 2000; Irvine y Rauskolb, 2001):
Migracin. Movimiento de una clula individual con respecto
a otras clulas del embrin. Algunas clulas, en especial las de
la cresta neural y las germinales, sufren migracin extensa du
rante el desarrollo y pueblan partes del embrin que estn muy
distantes de sus sitios originales.
Ingresin. Movimiento de una clula de la superficie de un
embrin hacia su interior.
85
La muerte celular programada (apoptosis) es otro mecanismo

morfogentico importante, ya que permite que se introduzcan hen
diduras dentro del plan corporal (Vaux y Korsmeyer, 1999). Las
hendiduras entre los dedos de las manos y los pies se originan por la
muerte de clulas interdigitales en las placas de la mano y del pie que
comienza alrededor de los 45 das de la gestacin. En el sistema ner
vioso de mamferos, la apoptosis se utiliza para eliminar las neuro
nas con conexiones no productivas, lo que permite que el circuito
neuronal se refine progresivamente. De esta manera se descarta has
ta 50% de las neuronas y en la retina puede aproximarse a 80%.
Egresin. Movimiento de una clula del interior de un em

brin a la superficie externa.
Deslaminacin. Movimiento de clulas fuera de una hoja epi
telial, con frecuencia para convertir una hoja aislada de clulas
en mltiples capas. ste es uno de los principales procesos que
sustentan la gastrulacin en embriones de mamferos. Las c
lulas tambin pueden deslaminarse a partir de una membrana
basal, como ocurre en el desarrollo de la piel.
Intercalacin. Fusin de clulas a partir de mltiples capas ce
lulares hacia una capa epitelial nica.
Condensacin. Conversin de clulas mesenquimatosas empa
cadas de manera laxa en una estructura epitelial. En ocasiones
se denomina transicin mesenquimatosa a epitelial.
Dispersin. Conversin de una estructura epitelial en clulas me
senquimatosas laxas. Una transicin epitelial a mesenquimatosa.
Epibolia. Diseminacin de una hoja de clulas.
Involucin. Giro hacia el interior de una hoja de clulas en ex
pansin de tal manera que las clulas se diseminan sobre la su
perficie interior de la hoja y crean una segunda capa.
3.6.3 La proliferacin celular y la muerte programada

de las clulas (apoptosis} son mecanismos
morfogenticos importantes
Despus de un periodo inicial de segmentacin en el que todas las
-elulas se dividen casi al mismo ritmo, clulas en distintas partes
dd embrin comienzan a dividirse a ritmos diferentes. Esto puede
;mplearse para generar nuevas estructuras. Por ejemplo, la divisin
;u lar rpida en regiones seleccionadas de la placa lateral mesodr_ca da origen a las yemas de los miembros, en tanto que las regio
nes adyacentes, que se dividen ms lentamente, no forman estas
estructuras. El plano de la divisin celular tambin es importante.
Por ejemplo, las divisiones perpendiculares al plano de una hoja
;c:telial ocasionarn que la hoja se expanda por la incorporacin de
cuevas clulas. Sin embargo, las divisiones en el mismo plano de la
generarn capas adicionales. Si las clulas son asimtricas, co- ; es el caso de las clulas madre neurales que se comentan en la
seccin 3.4.3, entonces el plano de la divisin celular puede influir
en .os tipos de clulas hijas que se producen. Ms an, si el plano
as segmentacin no es medial, es posible que se generen clulas de
"trentes tamaos. Eso ocurre en la gametognesis femenina,
- jn dn la divisin meitica produce un vulo masivo que contie.i. mayor parte del citoplasma y cuerpos polares vestigiales que
esencia son vasijas de desecho del juego de cromosomas haploiI no deseado. Lo anterior contrasta con la gametognesis mascuen la que la meiosis produce cuatro espermtides equivalentes
- i e figura del recuadro 11-4).
3.7
Desarrollo hum ano inicial:

fecundacin a gastrulacin
3.7.1 La fecundacin activa el vulo y une entre s

los ncleos del espermatozoo y el vulo
para formar un individuo nico
Fecundacin es el proceso por el que dos clulas sexuales (gam etos)
se fusionan entre s para crear un nuevo individuo con potenciales
genticos derivados de ambos padres, pero diferentes a ellos (Wassarman, 1999). El gameto masculino, la clula espermatozoo, es
una clula pequea con citoplasma muy reducido y un ncleo haploide. El ncleo est condensado de manera intensa y no posee ac
tividad transcripcional porque las histonas normales estn
reemplazadas por una clase especial de protenas de empaque cono
cidas como protaminas. En el extremo posterior se encuentra un
fla gelo largo que se ondula para dar impulso y en el extremo ante
rior se halla la vescula acrosmica, que contiene enzimas digesti
vas (vase fig. 3-12).
El gameto femenino, la clula vulo (o huevo), es una clula
grande que contiene el material necesario para iniciar el crecimien
to y el desarrollo (vase fig. 3-12). El citoplasma est en extremo
bien dotado de muy grandes cantidades de mitocondrias y ribosomas, y de DNA y polimerasa de RNA. Tambin alberga cantidades
enormes de protenas, RNA, sustancias qumicas protectoras y fac
tores morfogenticos. En muchas especies, inclusive aves, reptiles,
peces, anfibios e insectos, el huevo contiene una cantidad grande o
moderada de vitelo, un conjunto de nutrimentos necesarios para
nutrir el embrin en desarrollo antes que pueda alimentarse en for
ma independiente. Aunque los embriones de mamferos tienen un
saco vitelino, los vulos de mamferos no requieren vitelo porque
el embrin se nutre gracias al aporte sanguneo de la placenta.
Fuera de la membrana plasmtica se encuentra la envoltura vitelina, que en los mamferos es una matriz extracelular separada y
gruesa conocida como zona pelcida. Tambin en los mamferos,
el vulo est rodeado por una capa de clulas que se conocen como
clulas cmulo y sirven para nutrir el vulo antes y justo despus
de la ovulacin.
Las clulas espermatozoo humanas tienen que migrar distancias
muy considerables y slo alrededor de 200 de los cerca de 280 mi
llones que se eyaculan en el interior de la vagina llegan a la parte ne
cesaria del oviducto donde la fecundacin se efecta. Esta ltima
inicia con la fijacin de un espermatozoo a la zona pelcida seguida
de la liberacin de enzimas de la vescula acrosmica, que causan la
digestin local de la zona. A continuacin la cabeza del espermato
zoo se fusiona con la membrana plasmtica del oocito y el ncleo
del espermatozoo pasa al interior del citoplasma. Dentro del oocito,
86
CAPTULO TRES | CLULAS V DESARROLLO
A)
M e m b ra n a
p la s m tic a
G rn u lo
co rtical
V es cu la a c ro s m ic a
N c le o
P ie z a m e d ia
5 |j,m
M ito c o n d ria
M e m b ra n a p la s m tic a
F la g elo
Fig. 3-12. Clulas sexuales especializadas.

A) vulo (huevo). El vulo de mamferos es una clula grande, de 120 ixm de dimetro, rodeada por una envoltura extracelular, la zona pelcida, a la
que debe unirse primero el espermatozoo, que contiene tres glucoprotenas, ZP-1, ZP-2 y ZP-3, que se polimerizan para form ar un gel. El primer cuerpo
polar (no se muestra), el producto de la meiosis I, se sita abajo de la zona dentro del espacio pervitelino. En la ovulacin los oocitos se encuentran en
metafase II. La meiosis II no termina hasta despus de la fecundacin. Esta ltima desencadena la secrecin de grnulos corticales que inhiben con
efectividad el paso de espermatozoos adicionales a travs de la zona pelcida. B) Espermatozoo. Esta clula es mucho ms pequea que el vulo con
una cabeza de 5 (im que contiene DNA muy compactado, un cuerpo cilindrico de 5 (xm, la pieza media, con mltiples mitocondrias, y una cola de
50 |xm. En el frente, el acrosoma contiene enzimas que ayudan al espermatozoo a hacer un orificio en la zona pelcida, los que le permite acceder al
vulo y fecundarlo. Por lo general el semen contiene 100 millones de espermatozoos por mililitro. Tomado de Alberts y cois. (2002), M olecular Biology
o fth e Cell, 4a. ed., p. 1147. Copyright 2002, Garland Science.
al principio se separan entre s los juegos haploides de cromosomas

del espermatozoo y el vulo, y constituyen los proncleos masculino
y femenino respectivamente. Ms adelante se fusionan para formar
un ncleo diploide. El oocito fecundado se conoce como cigoto.
3,7.2 La segmentacin divide ei cigoto en muchas

clulas ms pequeas
Segmentacin es la etapa del desarrollo en la que el cigoto se divide
para formar varias clulas ms pequeas llamadas blastmeros. La
naturaleza de las divisiones de segmentacin tempranas vara con
amplitud entre las distintas especies animales y en muchos insectos
(inclusive Drosophild) el proceso no incluye siquiera divisin celular
(por el contrario, el ncleo del cigoto sufre una serie de divisiones en
un citoplasma comn para generar una gran clula multinucleada
aplanada, el blastodermo sincitial). Con algunas excepciones, el re
sultado de la segmentacin suele ser una pelota de clulas, que a me
nudo rodea una cavidad llena de lquido llamada blastocele.
La pelota de clulas que resulta de la segmentacin se denomina
blstula en casi todos los invertebrados, pero la terminologa vara
en los vertebrados. En anfibios y mamferos se utiliza el trmino
mrula para describir la pelota inicial, empacada con laxitud, de c
lulas que resultan de la segmentacin inicial y ms adelante, cuando
el blastocele lleno de lquido se forma, la pelota de clulas se cono
ce como blstula en anfibios, pero como blastocisto en mamferos
(vase fig. 3-13). La situacin es distinta en aves, peces y reptiles, en
los que el huevo contiene mucho vitelo que inhibe la divisin celu
lar. En este caso la segmentacin se restringe a un blastodisco apla

nado en la periferia de la clula.
En muchas especies (pero no en mamferos, vase ms adelan
te), las divisiones por segmentacin son rpidas porque no intervie
nen las fases de latencia intermedias G1 y G2 del ciclo celular entre
la replicacin del DNA y la mitosis. En estos casos no hay creci
miento neto del embrin y de esa manera conforme el nmero de
clulas aumenta, el tamao de las mismas disminuye. Cuando lo
anterior sucede, el genoma heredado del cigoto (el genom a cigtic)
es transcripcionalmente inactivo durante la segmentacin y en conse
cuencia esta ltima depende mucho de los productos gnicos de la
herencia materna distribuidos en el citoplasma del vulo. Los pro
ductos gnicos maternos regulan el ciclo celular y determinan el
ritmo de segmentacin, y las divisiones de segmentacin son sin
crnicas. Con frecuencia este tipo de regulacin se denomina re
gulacin por el gen om a m aterno y los productos gnicos maternos
suelen conocerse como determ in an tes m aternos.
La segmentacin de los mamferos es excepcional en varios aspectos:
activacin temprana del genoma cigtico: en algunas especies
tan pronto como en la etapa de dos clulas. Como resultado, el
genoma cigtico, en lugar de los productos gnicos heredados
de la madre, controla las divisiones de segmentacin y stas son
divisiones lentas (porque los ciclos celulares incluyen las fases
de latencia G1 y G2) y asincrnicas;
segmentacin rotacional: el primer plano de segmentacin es
vertical, pero en la segunda ronda de divisin celular una de
3.7 | DESARROLLO HUMANO INICIAL: FECUNDACIN A GASTRULACIN
vulo
S e g m e n ta c i n
ro tac io n a l
87
E ta p a d e c u a tro c lu la s
T ro fo e c to d e rm o
MCI
U nin
e s tre c h a
\
B la s to c e le
M ru la
M ru la
c o m p a c ta d a
B la s to c is to
Fig. 3-13. Desarrollo temprano del embrin de mamfero, desde la fecundacin hasta la formacin del blastocisto.
êcibujado de Twyman (2001) Instant Notes Developmental Biology, publicado por BIOS Scientific Publishers.
las clulas se segmenta en sentido vertical y la otra en direc

cin horizontal (vase fig. 3-13);
compactacin: los blastmeros del embrin de ocho clulas,
vinculados de manera laxa, se aplanan unos contra otros para
maximizar su contacto y formar una mrula empacada apreta
damente (nota: la compactacin no ocurre en muchos embrio
nes no mamferos, inclusive Xenopus, pero en mamferos es
manifiesta). La compactacin tiene el efecto de introducir un
erado de p o la rid a d celular. Antes de la compactacin, los blas
tmeros son clulas redondas con microvellosidades distribui
das de modo uniforme y la molcula de adherencia celular
caderina E se encuentra siempre que las clulas estn en con
tacto entre s. La situacin es muy diferente despus de la com
pactacin: las microvellosidades se restringen a la superficie
apicaL en tanto que la caderina E se distribuye sobre las super
ficies basolaterales. Ahora las clulas forman uniones estrechas
con sus vecinas y los elementos citoesquelticos se reorganizan
para formar una banda apical (vase cuadro 3-4).
Alrededor de la etapa de mrula de 16 clulas en mamferos es pom tie diferenciar dos tipos de clulas: polarizadas externas y apolares
jzrimas. Conforme la poblacin de clulas apolares aumenta, las cUas comienzan a comunicarse entre s a travs de uniones comuniLa distincin entre los dos tipos de clulas es fundamental y
se txplica en la seccin siguiente.
1 7 2 Slo un porcentaje pequeo de las clulas

del embrin temprano de mamferos origina
el organismo maduro
muchos modelos animales del desarrollo el organismo est for.i- o por clulas que son descendientes de todas las clulas del em
brin original. Sin embargo, los mamferos son muy diferentes y

slo una pequea minora de las clulas del embrin inicial da lu
gar al organismo propiamente dicho. Ello se debe a que gran parte
del desarrollo inicial de los mamferos se relaciona con el estableci
miento de tejidos que actan como apoyo para la vida pero que en
su mayor parte no contribuyen al organismo final, stos son las
membranas extraembrionarias y la placenta (vase recuadro 3-8).
Los dos tipos de clulas que pueden distinguirse alrededor de la
etapa de 16 clulas en mamferos tienen diferentes destinos. Las c
lulas polarizadas externas comprenden el trofoblasto (o trofectodermo) que evolucionar para formar una de las cuatro membranas
extraembrionarias, el corion, que proporciona la porcin embrio
naria de la placenta. Las clulas apolares internas comprenden el
embrioblasto. A medida que el blastocele se forma (alrededor de la
etapa de 32 clulas en humanos), las clulas apolares internas se
congregan en un extremo del blastocele para formar una masa de
clulas internas (MCI) descentrada. Las clulas de la MCI origina
rn todas las clulas del organismo aunadas a las otras tres membra
nas extraembrionarias (recuadro 3-8).
3.7.4 Implantacin
Despus de algn tiempo (da cinco del desarrollo humano), el blas
tocisto m adura: se libera una enzima que perfora un orificio a tra
vs de la zona pelcida y el blastocisto se exprime hacia el exterior.
Ahora el blastocisto est libre para interactuar en forma directa con
el endometrio uterino. Muy poco despus de llegar al tero (da seis
del desarrollo humano), el blastocisto se fija estrechamente al epite
lio uterino (implantacin). Las clulas del trofoblasto proliferan con
rapidez y se diferencian en una capa interna de citotrofoblasto y una
capa externa de clulas multinucleadas, el sincitiotrofoblasto, que
comienza a invadir el tejido conjuntivo del tero.
88
CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
Incluso antes que la implantacin ocurra, las clulas de la MCI co

mienzan a diferenciarse en capas externa e interna precisas. La capa ce
lular externa es el epiblasto (o ectodermo primitivo). Las clulas del
epiblasto originan el ectodermo, el endodermo y el mesodermo (y en
consecuencia todos los tejidos del embrin), as como el amnios, el sa
co vitelino y la alantoides. La capa de clulas internas, el hipoblasto
(o endodermo primitivo) origina el m esoderm o extraem brionario
que recubre el saco vitelino primario y el blastocele.
Al interior de la masa de clulas internas se forma una cavidad
llena de lquido, la cavidad amnitica, encerrada por el amnios. El
embrin, que se deriva de una parte de la masa celular interna, con
siste ahora en las capas distintas epiblasto e hipoblasto (y se cono
ce como disco germinal bilaminar). Se localiza entre dos cavidades
llenas de lquido: la cavidad amnitica en un lado y el saco vitelino
en el otro (fig. 3-14).
3.7.5 La gastrulacin es un proceso dinmico por el

que las clulas del epiblasto originan las tres
capas germinales
Como Lewis Wolpert lo remarc el acontecimiento realmente im
portante en la vida no es el nacimiento, el matrimonio o la muerte,
sino la gastrulacin. La gastrulacin se efecta durante la tercera se
mana del desarrollo humano y es el primer proceso morfogentico
importante del desarrollo. Durante la gastrulacin se establece la
orientacin del cuerpo y el embrin se convierte en una estructura de
tres capas germinales: ectodermo, endodermo y mesodermo, todas
las cuales se derivan d el epiblasto. Las tres capas germinales son las progenitoras de la totalidad de los tejidos del organismo (recuadro 3-5).
La principal estructura que caracteriza la gastrulacin en mam
feros, aves y reptiles es lineal, la estra primitiva. Aparece alrededor
del da 15 del desarrollo humano, como un surco dbil a lo largo de
la lnea media longitudinal del disco germinal bilaminar ahora
de forma oval. En el transcurso del da siguiente, el surco prim itivo
se profundiza y alarga para ocupar alrededor de la mitad de la lon
gitud del embrin. Alrededor del da 16 es evidente una depresin
profunda (el fo so p rim itivo) rodeada por un montculo ligero de
epiblasto (el nudo p rim itivo) al final del surco, cerca del centro del
disco germinal (vase fig. 3-14).
El proceso de gastrulacin es en extremo dinmico e incluye mo
vimientos celulares muy rpidos (Narasimha y Leptin, 2000; Myers
y cois., 2002). El da 16 del desarrollo humano comienzan a proliferar y aplanarse las clulas del epiblasto, cerca de la estra primitiva, y
pierden sus interconexiones. Estas clulas aplanadas desarrollan seudpodos que les permiten migrar a travs de la estra primitiva hacia
el espacio entre el epiblasto y el hipoblasto (fig. 3-14). Algunas de las
clulas del epiblasto que estn ingresando invaden el hipoblasto, des
plazan sus clulas y por ltimo reemplazan por completo el hipoblas
to con una nueva capa de clulas, el endodermo definitivo. A partir
del da 16 algunas de las clulas del epiblasto que migraron a travs
de la estra primitiva se desvan hacia el espacio entre el epiblasto y el
endodermo definitivo naciente para formar una tercera capa, el me
sodermo intraembrionario. Una vez que el mesodermo intraembrionario y el endodermo definitivo se forman, el epiblasto residual se
describe como ectodermo y la nueva estructura de tres capas se de
nomina disco germinal trilaminar (fig. 3-14).
Las clulas mesodrmicas que ingresan migran en diferentes di
recciones, algunas hacia afuera y cranealmente, en tanto que otras
se depositan en la lnea media. Las clulas que migran a travs del
foso primitivo y llegan a reposar en la lnea media forman dos es
tructuras:
la placa precordial, una masa compacta de mesodermo craneal

al foso primitivo. La placa precordial inducir estructuras cra
neales importantes en la lnea media, como el cerebro;
el proceso notocordial, un tubo que brota del foso primitivo y
aumenta de longitud conforme las clulas que proliferan en la
regin del nudo primitivo se aaden a su extremo proximal y
conforme la estra primitiva involuciona. El proceso notocor
dial est formado por completo alrededor del da 20 del desa
rrollo humano, pero a continuacin se transforma de un tubo
en un bastn slido, el notocordio, que despus induce la for
macin de componentes del sistema nervioso (vase la seccin
siguiente).
Las clulas mesodrmicas que ingresan y migran hacia las partes la
terales se condensan hacia estructuras similares a bastones y hojas
en ambos lados del notocordio. Hay tres estructuras principales
(vase fig. 3-15):
El mesodermo paraxil (MP), un par de condensaciones cilin
dricas que se sitan justo adyacentes al notocordio y lo flan
quean. El MP se desarrolla primero en una serie de estructuras
semejantes a verticilos que se conocen como somitmeros y se
forman en una secuencia craneal a caudal durante la tercera y
cuarta semanas del desarrollo humano. Los primeros siete son
los somitmeros craneales que al final formarn los msculos es
triados de la cara, la mandbula y la garganta, pero los otros so
mitmeros se desarrollan adicionalmente en bloques discretos
del mesodermo segmentario conocidos como somitas (vase
fig. 3-15). Las somitas cervicales, torcicas, lumbares y sacras es
tablecern la organizacin segmentaria del cuerpo al dar lugar a
la mayor parte del esqueleto axil (inclusive la columna verte
bral), los msculos voluntarios y parte de la dermis de la piel.
El mesodermo intermedio (MI), un par de condensaciones ci
lindricas menos pronunciadas, justo laterales al mesodermo pa
raxil. El MI formar el sistema urinario y partes del sistema
genital.
El mesodermo de la placa lateral (MPL), el resto del mesoder
mo lateral que forma una hoja aplanada. El MPL se divide en
dos capas a partir del da 17 del desarrollo humano:
3.8
el m esoderm o esplacnopleural, la capa adyacente al endo

dermo, que origina el recubrimiento mesotelial de los r
ganos viscerales;
el m esoderm o som atopleural, la capa adyacente al ectoder

mo, que da lugar al recubrimiento interno de la pared del
cuerpo, parte de los miembros y la mayor parte de la der
mis de la piel.
Desarrollo neural
Como ya se describi, el resultado de la gastrulacin es un grupo

notable de cambios en el embrin que lo transforman de una es
tructura en dos capas en una de tres capas. Ahora el desarrollo del
embrin est programado para organizar los tejidos en los precur
sores de muchos rganos y sistemas contenidos en el adulto. A con
tinuacin se describe el desarrollo inicial del sistema nervioso como
un ejemplo de organognesis porque muestra la forma en que los
procesos de diferenciacin, formacin de patrones y morfognesis
se coordinan de manera exquisita.
3.8 | DESARROLLO NEURAL
89
Recuadro 3-8. Membranas extraem brionarias y placenta

El desarrollo temprano de los mamferos se relaciona sobre todo con la
formacin de tejidos que en general* no contribuyen al organismo final.
Hay cuatro membranas extraembrionarias (saco vitelino, amnios, corion
y alantoides) y la placenta, que se deriva de una combinacin de tejido
embrionario (el corion) y tejido materno. Adems de proteger el embrin
(y despus el feto), estos sistemas de apoyo de la vida son necesarios
:ara proveer su nutricin, respiracin y excrecin.
'L a s excepciones son: la parte dorsal del saco vitelino, que se incorpo
ra en el embrin como el precursor del intestino primitivo, y la alantoi
des, que en el adulto est representada por un cordn fibroso, un residuo
del cordn umbilical.)
SACO VITELINO. La ms primitiva de las cuatro membranas extraembriolarias, el saco vitelino, se encuentra en todos los amniotas y asimismo
en tiburones, peces vertebrados y algunos anfibios. En embriones de
aves, el saco vitelino rodea una masa vitelina nutritiva (la parte amarilla
del huevo, que consiste principalmente en fosfolpidos). En muchos ma
mferos (inclusive humanos y ratones) el saco vitelino no contiene ningn
vitelo. El saco vitelino suele ser importante porque:
las clulas germinales primordiales, que se originan del epiblasto,
migran al saco vitelino antes que invadan el reborde gnadal;
es la fuente de las primeras clulas sanguneas del conceptus y de
casi todos los primeros vasos sanguneos (algunos de los cuales se
extienden por s mismos dentro del embrin en desarrollo).
El saco vitelino se origina de la placa lateral esplcnica (visceral) mesodermo y endodermo.
AMNIOS. El amnios no slo se encuentra en amniotas (mamferos, aves,
reptiles) sino tambin en forma primitiva en algunos peces vertebrados y
ciertos anfibios. Es la ms interna de las membranas extraembrionarias y
oermanece unida al embrin rodendolo inmediatamente. Contiene liqui
do amnitico que baa el embrin y en consecuencia evita que este lti
mo se seque durante el desarrollo: lo ayuda a que flote (lo que reduce los
efectos de la gravedad en el cuerpo) y acta como un cojn hidrulico paa protegerlo de sacudidas mecnicas, etc. El amnios se deriva del ectodermo y el mesodermo somtico de la placa lateral.
CORION. Como el amnios, el corion se encuentra en amniotas y tambin
en forma primitiva en algunos peces vertebrados y anfibios. Asimism o se
3.8.1 El sistema nervioso se desarrolla despus que

el mesodermo subyacente induce al ectodermo
a diferenciarse
El desarrollo del sistema nervioso marca el principio de la organog
nesis y comienza al final de la tercera semana del desarrollo humano.
El acontecimiento inicial es la induccin del ectodermo suprayacenrc por el mesodermo axil (Wilson y Edlund, 2001). Al interior de es
te ultimo, clulas de la placa precordial y de la porcin craneal de la
r aca notocordial transmiten seales a las clulas suprayacentes del
ectodermo y ocasionan su diferenciacin en una placa gruesa de c_las neuroepiteliales (neuroectodermo). La placa neural resultante
carece el da 18 del desarrollo humano pero crece con rapidez y
cambia de proporciones durante los siguientes dos das (fig. 3-16).
Al inicio de la cuarta semana, un proceso que se conoce como
neurulacin conduce a la conversin de la placa neural en el tubo
oeural, el precursor del cerebro y la mdula espinal. La placa neu
ral comienza a plegarse en sentido ventral a lo largo de su lnea me
deriva del ectodermo y el mesodermo somtico de la placa lateral. En em

briones de aves, como los pollos, el corion est presionado contra la
membrana de recubrimiento pero en embriones de mamferos est com
puesto por clulas trofoblsticas, que producen las enzimas que erosio
nan el recubrimiento del tero y ayudan al embrin a implantarse en la
pared uterina. El corion tambin es una fuente de hormonas (gonadotropina corinica) que Influyen tanto en el tero como en otros sistemas. En
todos estos casos el corion sirve como una superficie para el intercam
bio respiratorio. El corion proporciona el componente fetal de la placenta
en mamferos placentados (vase ms adelante).
ALANTOIDES. La ms reciente en trminos evolutivos de las membranas
extraembrionarias, la alantoides, slo se encuentra en amniotas (cuyo
nombre quiz deba cambiarse por alantoisotas). Acta como un sistema
de depsito de desechos (orina) en aves, reptiles y de hecho en la mayor
parte de los amniotas, pero no en mamferos placentados. La alantoides
se deriva de un abultamiento hacia el exterior del piso del intestino caudal
y en consecuencia se compone de endodermo y mesodermo esplcnlco
de la placa lateral. Aunque es notable en algunos mamferos, en otros (in
clusive los humanos) es un vestiglo (no tiene ninguna funcin) excepto
que sus vasos sanguneos dan origen al cordn umbilical.
PLACENTA. La placenta es una caracterstica que slo presentan los ma
mferos placentados y se deriva en parte del conceptus y en parte de la
pared uterina. Se desarrolla despus de la implantacin, cuando el em
brin induce una respuesta en el endometrio materno vecino y lo cambia
para que se constituya en un tejido muy vascular que contiene nutrimen
tos llamado decidua. Durante la segunda y la tercera semanas del desa
rrollo, el tejido del trofoblasto se torna vacuolado, las vacuolas unen los
capilares maternos cercanos y se llena rpidamente con sangre. Confor
me el corion se forma, se proyectan evaginaciones al interior de las va
cuolas, conocidas como vellosidades corincas, que ponen en ntimo
contacto los aportes sanguneos materno y embrionario. Al final de las
tres semanas el corion est diferenciado a plenitud y contiene un sistema
vascular conectado al embrin. El intercambio de nutrimentos y produc
tos de desecho ocurre sobre las vellosidades corinicas. Al inicio el em
brin est rodeado del todo por la decidua, pero a medida que crece y se
expande hacia el tero, el tejido decidual suprayacente (decidua capsular)
se adelgaza y luego se desintegra. La placenta madura se deriva por com
pleto de la decidua basal subyacente.
dia para formar una depresin llamada surco neural. Se piensa que
ste se desarrolla en respuesta a seales inductoras del notocordio
apuesto en la cercana. Los pliegues neurales gruesos giran alrede
dor del surco neural y se encuentran dorsalmente, al principio en
un punto medio a lo largo del eje craneocaudal (fig. 3-16A). El cie
rre del tubo neural prosigue en forma semejante a una cremallera y
en ambas direcciones. Los sitios en que el cierre es incompleto
muestran un neuroporo anterior y un neuroporo posterior. En oca
siones parte del tubo neural no se cierra y esto ocasiona trastornos
como la espina bfida.
Durante la neurulacin, una poblacin especfica de clulas que
surge a lo largo de los mrgenes laterales de los pliegues neurales se
desprende de la placa neural y migra a muchos sitios especficos
dentro del cuerpo. Este grupo de clulas muy verstiles, denomina
do cresta neural, origina parte del sistema nervioso perifrico, los
melanocitos, parte de hueso y msculo, la retina y otras estructuras
(Garca-Castro y Bonner-Fraser, 1999; Knecht y Bonner-Fraser,
2 0 02 ; recuadro 3-5).
GASTRULACIN DEL RATN
GASTRULACIN HUMANA
C ono ectoplacen tario

Ectoderm o
extraem brionario
Endoderm o visceral
Endoderm o parietal
S aco vitelino
M e m b ra n a am niotica
C avidad am niotica
Epiblasto (em brin)
H ipoblasto
S aco vitelino
Epiblasto
(curvado)
Pared uterina
Trofoblasto
M esod erm o
Estra
prim itiva
N udo prim itivo
B)
Am nios
Epiblasto
Endoderm o
H ipoblasto
\
x Epiblasto
S aco vitelino
N otocordio
C)
M ovim iento de clulas a travs

del surco prim itivo. Invaginacin
para form ar m esoderm o y en doderm o
D isco germ inal bilam inar
Estra prim itiva
Epiblasto
Hipoblasto
14 a 15 das
Endoderm o
16 das
M esod erm o
E ndoderm o definitivo
Fig. 3-14. La gastrulacin en humanos y otros primates incluye la reorganizacin de un disco germinal bilaminar plano para formar un embrin tri
laminar mediante la deslaminacin programada de clulas del epiblasto.
(A a C) Aunque el resultado final de la gastrulacin es similar en todos los mamferos, puede haber diferencias mayores en los detalles de la morfognesis, en
particular en el modo en que se forman y utilizan las estructuras extraembrionarias. A la derecha se muestra la gastrulacin en el ratn para comparacin. En
esta especie el disco germinal plano es reemplazado por un huevo cilindrico en forma de copa y las clulas salen de la estria primitiva hacia la superficie del
embrin y no al interior del mismo. El futuro eje anteroposterior se envuelve alrededor de la base de la copa. D) Despus de 14 a 15 das del desarrollo huma
no, las clulas mesodrmicas que estn ingresando invaden el hipoblasto y desplazan sus clulas, lo que conduce a la formacin del endodermo embrionario.
El da 16 alguna de las clulas del epiblasto que est ingresando se desvan hacia el espacio entre el epiblasto y el endodermo naciente para formar el meso
dermo embrionario. Obsrvese que si bien el epiblasto da lugar a las tres capas germinales (ectodermo, endodermo y mesodermo), el hipoblasto origina el
endodermo extraembrionario que recubre el saco vitelino. Embriones humanos redibujados de Larsen (2002) Human Embryology 3a. ed, con autorizacin de
Elsevier. Embriones de ratn redibujados de Twyman (2001), Instant Notes Developmental Biology. Publicado por BIOS Scientific Publishers.
3.8
DESARROLLO NEURAL
91
A)
S u rc o
p r im it iv o
N udo
p r im it iv o
E p ib la s t o E n d o d e rm o
B)
M e s o d e rm o
p a r a x il
M e s o d e rm o
in te r m e d io
M esod erm o de
la p laca lateral
P ro c e s o
n o to c o r d ia i
S o m ita
D)
M e s o d e r m o in te r m e d io
S o m it m e r o s 1 a 7
S o m ita s
N o to c o r d io
M e s o d e r m o in te r m e d io
E m in e n c ia
caudal
Fig. 3-15. Vas de migracin y destinos de las clulas mesodrmicas que ingresan durante la gastrulacin.
A) Migracin temprana del mesodermo. Las clulas del epiblasto que ingresan a travs del nudo primitivo migran cranealmente para formar la placa
precordial, una masa compacta de mesodermo justo craneal al nudo primitivo, y el proceso notocordiai un tubo denso en la lnea media que despus
formar un bastn slido, el notocordio. Las clulas del epiblasto que ingresan a travs del surco primitivo migran para form ar el mesodermo lateral que
flanquea la lnea media. B) Diferenciacin temprana del mesodermo lateral. El mesodermo que flanquea inmediatamente el proceso notocordiai forma
condensaciones cilindricas, el mesodermo paraxil. Las condensaciones cilindricas vecinas, menos pronunciadas, son el mesodermo intermedio. El res
to del mesodermo lateral form a una hoja aplanada, el m esodermo de la placa lateral. C) Diferenciacin del mesodermo de la placa lateral (MPL). Se
forman vacuolas en el MPL y se dividen en dos capas, una ventral, el mesodermo esplacnopieural. que da lugar al recubrimiento mesotelial de los rga
nos viscerales, y el mesodermo somatopleural dorsal, que origina el recubrimiento interno de las paredes del cuerpo y la mayor parte de la dermis.
D) Formacin de somitmeros. El mesodermo paraxil forma una serie de estructuras redondas semejantes a verticilos, los somitmeros. Con excep
cin de los somitmeros 1 a 7 (vase texto), los somitmeros darn lugar a las somitas, bloques de mesodermo segmentario que establecen la organi
zacin segmentaria del cuerpo. En este diagrama de un embrin humano de 21 das ya se diferenciaron en somitas seis somitmeros centrales.
Adaptado de Larsen (2002) con autorizacin de Churchill Livingstone Publishers.
92
CAPTULO TRES ! CLULAS Y DESARROLLO
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co co
o <3
5 ca cr .co
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3.8
DESARROLLO NEURAL
93
Recuadro 3->. Determinacin del sexo: genes y ambiente en el desarrollo

Como los mamferos, los humanos son sexualmente dimorfos, es decir
hay sexos masculino y femenino separados. La decisin entre desarrollo
masculino y femenino ocurre en la concepcin, durante la que el esper
matozoo lleva un cromosoma X o uno Y al vulo, que siempre contiene
un cromosoma X (Schafer y Goodfellow, 1996). Las nicas excepciones
a esta regla general se observan cuando errores en la meiosis producen
gametos con menos o ms cromosomas del sexo, cuyo resultado son in
dividuos con aneuploidias de cromosoma del sexo (seccin 2.5.2). Aun
que el sexo del embrin humano se establece en la concepcin, la
diferenciacin sexual comienza hasta que el embrin tiene alrededor de
cinco semanas de edad. Las formas de diferenciacin sexual son dos;
una incluye las caractersticas sexuales primarias (el desarrollo de la
gnada y la eleccin entre el desarrollo de espermatozoo y vulo) y otra
comprende las caractersticas sexuales secundarias (las estructuras
especficas del sexo del sistema urogenital y los genitales externos). Las
caractersticas sexuales primarias dependen del genotipo del embrin, en
tanto que las caractersticas sexuales secundarias, de seales del am
biente, mediadas por sealamiento hormonal.
El desarrollo masculino depende de la presencia o ausencia del crom oso

ma Y, que contiene un gen determinante masculino critico llamado SRY
(regin determinante del sexo del cromosoma Y). El SRY codifica un fac
tor de transcripcin que activa genes corriente abajo necesarios para el
desarrollo de los testculos. A continuacin estos ltimos producen hor
monas sexuales que se requieren para el desarrollo de las caractersticas
sexuales secundarias masculinas. Durante mucho tiempo se pens que el
desarrollo de la gnada femenina era un estado de descuido y que el
gen SRY era suficiente para cambiar la gnada embrionaria indiferente de
la diferenciacin femenina a la masculina. Este hecho se apoy en varias
lneas de pruebas: los raros varones XX suelen tener un fragmento peque
o del cromosoma Y, inclusive SRY, translocado hacia la punta de uno de
sus cromosomas X y los ratones genticamente hembras transgnicos
del gen Sry del ratn se desarrollan como machos. Sin embargo, estudios
ms recientes sugieren que los genes en el cromosoma X y los autosomas participan en la regulacin positiva del desarrollo del ovario. La ex
presin excesiva de estos genes, que comprenden DAX y WNT4A, puede
feminizar individuos XY aun si poseen un gen SRY funcional.
Al parecer el desarrollo temprano del gameto est controlado ms por el
ambiente que por el genotipo de las clulas germinales. Las clulas ger
minales primordiales (CGP) femeninas introducidas en los testculos co
3.8.2 La formacin del patrn en el tubo neural incluye

la expresin coordinada de genes a lo largo
de dos ejes
Tan pronto se forma la placa neural, se tornan visibles tres vesculas
craneales grandes (el futuro cerebro) y una seccin caudal ms estre
cha que formar la mdula espinal. Esta polaridad craneocaudal re
fleja la especificidad regional de la induccin neural, es decir, que las
seales que provienen del mesodermo axil contiene informacin posidonal que conduce a que el ectodermo suprayacente forme tejido
neural especfico para diferentes partes del eje. La naturaleza precisa
de la seal en amniotas no se comprende (Stern, 2002). En Xenopus
hay un modelo bien establecido en el que miembros de la familia de
la protena morfogentica sea (PMO) de protenas de sealamien
to previenen el desarrollo neural y antagonistas de la protena mor
fogentica sea (PMO) inician la induccin neural. Sin embargo, al
parecer el mecanismo en aves y mamferos es mucho ms complejo
menzarn a diferenciarse en espermatozoos y las CGP masculinas que se

introducen en el ovario comenzarn a diferenciarse en oocitos. Esto pue
de indicar la regulacin del ciclo celular, ya que las CGP que entran en el
testculo se detienen antes de la meiosis en tanto que las que ingresan al
ovario comienzan la meiosis de inmediato. Por tanto las CGP de cualquie
ra de los sexos que invaden tejido somtico fuera de la gnada empiezan
a diferenciarse en oocitos porque no hay una seal para detener el ciclo
celular. Sin embargo, no se producen gametos funcionales en todas estas
situaciones poco frecuentes. La diferenciacin aborta en una etapa hasta
cierto punto tardia, tal vez porque el genotipo de las clulas germinales en
s mismas tambin tiene una funcin crtica en el desarrollo del gameto.
A diferencia de lo que ocurre con las caractersticas sexuales primarias,
al parecer las caracteristicas sexuales secundarias femeninas son el es
tado de falta de cumplimiento. Uno de los genes regulados por SRY es
NR5A1, que codifica otro factor de transcripcin llamado factor 1 esteroidgeno (SF1). ste activa genes necesarios para la produccin de hormonas
sexuales masculinas, Inclusive HSD17B3 (que codifica la deshidrogenasa 3 de hidroxiesteroides beta-17, necesaria para la sntesis de testosterona) y AMH (el gen que codifica la hormona antimulleriana). Ambas
hormonas tienen acciones importantes en la diferenciacin del sistema
urogenital masculino. Por ejemplo, AMH origina la desaparicin de los
conductos mullerianos (que se constituyen en las trompas de Falopio y el
tero en mujeres). Las mutaciones que inhiben la produccin, distribu
cin, eliminacin o percepcin de estas hormonas producen individuos
XY feminizados. Por ejemplo, el sndrome de insensibilidad al andrgeno
es resultado de defectos en el receptor de testosterona que impiden que
el cuerpo responda a la hormona aun si se produce a concentraciones
normales. El aspecto exterior de los individuos XY con esta enfermedad
es de mujeres normales, pero debido a los efectos de SRY y AMH poseen
testculos no descendidos en lugar de ovarios y carecen de tero y trom
pas de Falopio. Las mutaciones que conducen a la produccin excesiva
de hormonas sexuales masculinas en mujeres tienen el efecto opuesto,
es decir, la virilizacin de individuos XX. En ocasiones esto ocurre en ge
melos fraternos masculino/femenino en desarrollo cuando el gemelo
hembra se expone a las hormonas masculinas de su hermano. La enzima
CYP19 convierte los andrgenos en estrgenos de tal manera que las
mutaciones que incrementan su actividad pueden producir feminizacin
de varones, en tanto que las que la disminuyen o suprimen suelen condu
cir a virilizacin en mujeres.
y constituye un rea de investigacin activa. Parece probable que

una seal general neurulizante se libere del mesodermo que induce
la formacin de la placa neural que es de carcter anterior. Esto de
be posteriorizarse por otra seal que se origina en la regin caudal
del embrin. Se requieren molculas adicionales, secretadas de mo
do especfico por el mesodermo anterior, para formar la cabeza.
Cualquiera que sea el mecanismo subyacente, las seales activan
diferentes grupos de factores de transcripcin a lo largo del eje y s
tos confieren identidades de posicin a las clulas y regulan su con
ducta. En el cerebro anterior y el cerebro medio se expresan factores
de transcripcin de las familias Emx y Otx. Las identidades de po
sicin estn controladas por los genes H oxen el cerebro caudal y la
mdula espinal. Al parecer en el cerebro caudal los valores posicionales de las clulas se fijan en la etapa de la placa neural y las clu
las de la cresta neural que migran con esta informacin posicional
imponen identidades de posicin en los tejidos circundantes. Por el
contrario, la identidad posicional en la mdula espinal est impues
94
CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
ta por seales del mesodermo paraxil circundante. Esto puede de

mostrarse mediante el trasplante de clulas a diferentes partes del
eje. Las clulas de la cresta neural craneal se comportan segn su li
naje cuando se mueven a una nueva posicin, es decir, hacen las
mismas cosas que haran en su posicin original. Las clulas de la
cresta del tronco se comportan de acuerdo con su nueva posicin
-hacen las mismas cosas que sus vecinas.
El sistema nervioso central en desarrollo es un buen modelo de
formacin y diferenciacin del patrn, ya que a lo largo del eje dorsoventral surgen varios tipos de clulas (diferentes clases de neuro
nas y gla). Una jerarqua de reguladores genticos controla este
proceso (Lumsden y Krumlauf, 1996; Tanabe y Jessel, 1996;EisIen
1999; fig. 3-16B, C).
La polaridad dorsoventral es generada por grupos oponentes de
seales que se originan en el notocordio y el ectodermo adyacente.
El notocordio secreta la molcula de sealamiento Sonic hedgehog,
que tiene actividad ventralizante, en tanto que el ectodermo secre
ta varios miembros de la superfamilia del factor transformador del
crecimiento 3 (TGF), inclusive BMP4, BMP7 y una protena de
nominada dorsalina. Conforme la placa neural comienza a doblar
se, estas mismas seales empiezan a expresarse en las regiones
extremas ventral y dorsal del tubo neural en s mismo -la placa del
piso y la placa del techo respectivamente. Las seales oponentes
tienen efectos contrarios en la activacin de varios factores de trans
cripcin de clase homeodominio. Como se muestra en la figura 316B, esto divide el tubo neural en zonas dorsoventrales discretas, o
dominios de factor de transcripcin, que despus se convierten en
los centros regionales de diferentes clases de neuronas. Por ejemplo,
la zona definida por la expresin de Nkx6.1 slo se convierte en la
regin poblada por neuronas motoras, que residen en el tercio ven
tral del tubo neural.
3.8.3 La diferenciacin neurona! incluye ta actividad

com binatoria de facto res de transcripcin
Las neuronas no surgen de manera uniforme en el ectodermo neural
sino que se restringen a regiones especficas delimitadas por la expre
sin de genes proneurales, como neurogenina, MASH1 y MATH1
(fig. 3-16C), que codifican factores de transcripcin de la familia
bHLH. La expresin gnica proneural confiere a las clulas capacidad
para formar neuroblastos, pero no todas las clulas proneurales pue
den adoptar este destino. Por el contrario, hay competencia entre las
clulas que incluyen la expresin de genes neurgenos como Notch y
Delta. Las clulas que tienen xito forman neuroblastos e inhiben las
clulas circundantes para que realicen lo mismo. En consecuencia los
neuroblastos surgen en un patrn de espaciamiento preciso. Este pa
trn que forma procesos se denomina inhibicin lateral. A continua
cin las neuronas comienzan a diferenciarse segn su posicin con
respecto a los ejes dorsoventral y craneocaudal del sistema nervioso,
que se define por la combinacin de los factores de transcripcin que
se comentaron en la seccin previa (Panchision y McKay, 2002).
Refinamientos en los patrones de expresin de estos factores de
transcripcin controlan la diversificacin adicional. Por ejemplo, al
principio todas las neuronas motoras expresan dos factores de trans
cripcin de la familia homeodominio LIM: Islet-1 e Islet-2. Luego s
lo las neuronas motoras que proyectan sus axones a los msculos de
la extremidad ventral expresan estos factores de transcripcin LIM y
no otros. Las neuronas que expresan Isl-1, Isl-2 y un tercer factor de
transcripcin, Lim-3, proyectan sus axones hacia los msculos axiles
de la pared del cuerpo. Las neuronas que expresan Isl-2 y Lim-1 pro
yectan sus axones a los msculos de la extremidad dorsal, en tanto que
las que expresan Isl-1 slo proyectan sus axones a ganglios linfticos
(fig. 3-16C). Los factores de transcripcin determinan las combina
ciones particulares de receptores que se expresan en los conos de cre
cimiento del axn y por tanto determinan tambin la respuesta de los
axones en crecimiento a diferentes indicios fsicos y qumicos (quimioatrayentes, etc.) (Tessier-Lavigne y Goodmans, 1996). Una vez
que los primeros axones llegan a sus blancos, los axones adicionales
pueden encontrar su camino al crecer a lo largo de las vas de axn
existentes -un proceso que se denomina fasciculacin,
3.9 Conservacin de las vas

dei desarrollo
3.9.1 M uchas enferm edades hum anas % deben a falla

de procesos del desarrollo norm ales
Las enfermedades humanas ms espectaculares incluyen anormalida
des morfolgicas notables que se deben a alteraciones de los procesos
generales de diferenciacin, formacin de patrn y morfognesis. Un
ejemplo es la holoprosencefalia, una falla del proceso normal de de
sarrollo del cerebro anterior que en su forma ms grave da lugar a
individuos con un solo ojo (ciclopa) y sin nariz. Como en otras en
fermedades humanas, el fenotipo puede influirse tanto por factores
genticos como ambientales. En algunos casos es claro que este de
fecto lo causaron mutaciones especficas, por ejemplo, mutaciones
en el gen SHHque codifican la protena de sealamiento Sonic hed
gehog. Por otra parte la anormalidad puede seguirse hasta una cau
sa ambiental, como el consumo limitado de colesterol en la dieta
materna. La determ inacin del sexo, que se describe en el recuadro 39, ilustra con claridad las funciones relativas de los genes y el am
biente en un proceso de desarrollo.
Aunque ciertas anormalidades del desarrollo pueden seguirse
hasta el uso de frmacos (las sustancias qumicas que se sabe tienen
efectos teratgenos incluyen alcohol, ciertos antibiticos, talidomida, cido retinoico y drogas ilegales como cocana y herona), mu
chas resultan de mutaciones en genes especficos. Como se indic
al inicio de este captulo, algunos de los genes del desarrollo ms
importantes son de naturaleza reguladora y codifican factores de
transcripcin o componentes de vas de sealamiento. Los genes
que codifican componentes estructurales de la clula o de la matriz
extracelular, e inclusive enzimas metablicas, tambin tienen una
funcin destacada en el desarrollo y revelan fenotipos de enferme
dades importantes. El cuadro 3-8 presenta algunos ejemplos.
3.9J2 Los procesas del desarrollo estn muy bien

conservados tanto a nivel de genes nicos
co n a nivel de vas com pletas
En los casos en que se demuestra que los genes causan enfermeda
des del desarrollo, a menudo se observa un grado notable de con
servacin evolutiva entre animales. Esta conservacin no slo se
aplica a los genes sino tambin a las vas completas en las que par
ticipan (Pires-daSilva y Sommer, 2003; fig. 3-17).
Con frecuencia se utilizan vas moleculares conservadas para
procesos similares en especies relacionadas de manera muy distan
te. Por ejemplo, como se coment antes brevemente, la induccin
3.9 ^ CONSERVACIN DE LAS VIAS DEL DESARROLLO
95
Cuadro 3-8 Seleccin de genes del desarrollo humano relacionados con fenotipos de enfermedad especficos. Se consideran varias cla
ses mayores de productos gnicos: protenas de sealamiento, receptores, factores de transcripcin, protenas estructurales y enzimas
Gen
Producto y funcin normal
Trastorno relacionado
Protenas de sealamiento secretadas

SHH
Sonic hedgehog
Protena de sealamiento a cargo de la form a
cin del patrn de tubo neural, somltas, intesti
no y yemas de los miembros
Holoprosencefalia, un trastorno en el que el cerebro anterior en desarrollo no se

separa en hemisferios izquierdo y derecho. En casos graves, hay un ventrculo
cerebral nico y ciclopa. En casos muy leves, la enfermedad puede manifestar
se por un incisivo central nico
EDN3
Endotelna 3, hormona pptda que regula la va

soconstriccin, necesaria durante el desarrollo
para la diferenciacin de derivados de la cresta
neural
Enfermedad de Hirschsprung, un trastorno de la diferenciacin de la cresta neu

ral en el que no se forman ganglios entricos; causa megacolon (estreimiento
y obstruccin intestinal crnicos) que se debe a la ausencia de movimientos pe
ristlticos
GH1
Hormona del crecimiento 1, hormona polipptida que se expresa en la glndula hipfisis y tie
ne a su cargo la regulacin del crecimiento
Enanismo hipofisario, una form a de enanismo que puede tratarse con la admi
nistracin de hormona del crecimiento purificada o recombinante durante la ni
ez
LEFTB
Lefty 2, protena de sealamiento relacionada con

el nudo que se expresa de manera especifica en
el lado izquierdo del embrin temprano y ayuda a
establecer la asimetra izquierda-derecha
Defectos de lateralidad situs inversus, isomerlsmo o heterotaxia , ocasiona

dos por falta de especificacin del eje izquierda-derecha
FGFR3
Receptor para factores de crecimiento de fibro

blastos, que se expresa con fuerza particular en
cartlago y sistema nervioso. Desempea una
funcin mayor en el desarrollo seo
Acondroplasla, la forma ms frecuente de enanismo de miembros cortos

Sndrome de Crouzon y craneosinostosis, anormalidades craneofaciales graves
EDNRB
Receptor de endotelna B, se encuentra en clu

las de la cresta neural y se requiere para su dife
renciacin en melanocltos y ganglios entricos
Enfermedad de Hirschsprung (vase EDN3, antes)
KIT
KIT es un receptor de cinasa de tirosina, llama

da as porque originalmente se encontr como
oncogn en un virus de sarcoma felino. El re
ceptor se expresa en form a amplia pero tiene
acciones particularmente Importantes en el de
sarrollo del linaje de clulas sanguneas, melanocitos y clulas germinales
Piebaldismo, caracterizado por placas congnitas de piel y pelo blancos por fal
ta de proliferacin de melanocitos
GHR
Receptor de hormona del crecimiento, transduce

seales para la hormona del crecimiento (vase
antes)
Enanismo de Laron, una forma de enanismo en la que los valores sricos de hor
mona del crecimiento son normales y que no responde al tratamiento con hor
mona del crecimiento. Tambin se conoce como sndrome de insensibilidad a
hormona del crecimiento
Receptores
Factores de transcripcin
H0XD13
Factor de transcripcin que participa en la for

macin del patrn. Confiere informacin posicional a lo largo del eje craneocaudal y en el
desarrollo de los miembros
Polisindactllia (dedos extrafusionados) causada por la especificacin errnea de

tipos celulares y la consiguiente formacin de estructuras seas anormales en
las regiones distales de los miembros
PAX6
Factor de transcripcin con mltiples acciones

en el desarrollo del ojo
Defectos oculares que varan de pupilas con ectopia leve (pupilas fuera del cen
tro) a aniridia (ausencia parcial o total del iris, en combinacin con malformacio
nes del cristalino y la cmara anterior, y degeneracin corneal)
TBX5
Factor de transcripcin que se expresa de modo es

pecfico en la regin del miembro delantero del em
brin en desarrollo, tiene una funcin importante en
el establecimiento de la Identidad del miembro (de
sarrollo del brazo comparado con el de la pierna)
Sndrome de Holt-Oram, un trastorno de los miembros superiores que tambin

afecta el desarrollo del corazn
SRY
Factor de transcripcin expresado en el reborde

gonadal de embriones masculinos y necesario
para iniciar la diferenciacin sexual masculina.
Se encuentra en el cromosoma Y
Reversin del sexo masculino (aspecto externo femenino en individuos XY) que
suele acompaarse de disgenesia gonadal completa
96 1 CAPTULO TRES
CLULAS Y DESARROLLO
Cuadro 3-8. continuacin

Gen
Producto y funcin norm al
Trastorno relacio nado
Protenas estructurales
C0L6A1
Subunidad alfa de la colgena VI, principal com

ponente de microflbrillas en la matriz extracelular que proporciona rigidez estructural a los
tejidos
Mopata de Bethlem, que incluye la contraccin de articulaciones (en particular

los codos y los tobillos), a causa de ausencia de microfibrlllas de colgena VI.
La expresin excesiva puede contribuir a defectos cardiacos en el sndrome de
Down
ELN
Elastina, una protena de la matriz extracelular

que permite que los tejidos recuperen su forma
original despus de deformarse
Cutis laxa, piel suelta y holgada que resulta de una deformacin permanente;
puede deberse a elastina anormal y disfuncional
Estenosis artica, ocasionada por deformacin de la aorta
LAMA3
Subunidad alfa 3 de laminina 5, un componente

de la membrana basai de la piel que desempea
una funcin Importante en la diferenciacin de
queratinocitos
Epidermlisis ampollar de la unin grave, un trastorno vesicante de la piel en el

que se desprenden clulas basales de la membrana basai
USH2A
Proteina de matriz extracelular necesaria para el

desarrollo del ojo y el odo interno
Sndrome de Usher tipo II, caracterizado por sordera grave desde el nacimiento
e inicio de retinitis pigmentosa en los ltimos aos de la adolescencia
WRN
Una helicasa que tal vez se relaciona con la re

paracin de roturas del DNA de doble cadena
Sndrome de Werner, una enfermedad de envejecimiento prematuro
CYP11B1
Hidroxilasa de esteroides 11 -beta, necesaria pa

ra la sntesis de aldosterona (una hormona que
acta en los riones y regula el equilibrio mine
ral y del agua)
Hiperplasia suprarrenal congnita, que incluye crecimiento rpido en la niez pe

ro terminacin prematura del alargamiento seo cuyo resultado es estatura cor
ta de adulto
HSD17B3
Deshidrogenasa de hidroxesteroides beta-17,

necesaria para la sntesis de testosterona
Seudohermafroditismo masculino, en el que los nios nacen con aspecto feme

nino externo no ambiguo, pero se virilizan durante la pubertad
EXT1
Glucosiltransferasa necesaria para la sntesis de

un sulfato de heparn, un constituyente impor
tante de la matriz extracelular
Exostosis mltiple hereditaria, un trastorno en el que se forman tumoraciones

cartilaginosas cerca de los extremos de los huesos, en particular en los miem
bros, pero a veces tambin en las costillas y los hombros
Enzimas
neural en embriones de Xenopus incluye una batalla entre los efec

tos opuestos de BMP4, que favorece destinos ventral y lateral, y
factores de dorsalizacin (neurulizantes) como Chordin, Noggin y
Follistatin. Los ortlogos de Drosophila de BMP4 y Chordin son
protenas llamadas decapentapljicas (Dpp) y de gastrulacin corta
(Sog) respectivamente. Resulta notable que estas protenas tengan
funciones equivalentes en la formacin del sistema nervioso de
Drosophila. De hecho la relacin va ms all. La actividad de Dpp
en Drosophila se incrementa con la protena Tolloid (Tol) que de
grada Sog. En Xenopus la funcin de Tol la realiza su ortlogo Xolloid (Xol) y en el pez cebra la molcula equivalente es BMP1.
Tanto Xolloid como BMP1 degradan Chordin. Hay asimismo un
pareamiento de phylum cruzado de Xenopus BMP7 y la protena
Drosophila Screw, protenas accesorias necesarias para la actividad
de BMP4/Dpp.
En otros casos la misma va del desarrollo se emplea para pro
psitos muy diferentes en distintas especies. En mamferos el factor
de crecimiento epidrmico (EGF) se utiliza para promover la pro
liferacin de clulas epidrmicas. Este factor de crecimiento se en
laza con el receptor de EGF, un receptor de cinasa de tirosina, e
inicia la cascada de cinasa Ras-Raf-MAP (seccin 3.2.1). Drosophi
la usa la misma va para promover la diferenciacin de uno de los
ocho tipos de clulas fotorreceptoras durante el desarrollo del ojo.
Los nematodos emplean la misma va para estimular la divisin y

la diferenciacin de clulas vulvares.
El mejor ejemplo de conservacin evolutiva incluye los genes
que contienen homeobox, que al parecer se encuentran en todos los
animales y desempean funciones muy similares. La capacidad de
genes ortlogos de muy diferentes especies para sustituirse entre s
demuestra la funcin fundamental de estos genes en la formacin
del patrn. Por ejemplo, se introdujeron genes humanos HOX y
OTXen lneas de Drosophila en las que se mutaron genes ortlogos
y ello condujo a un rescate completo del fenotipo mutante.
Sin embargo, tambin se observan diferencias importantes en
tre especies, aun entre las que estn relacionadas muy de cerca. Con
base en la similitud extensa entre humanos y ratones, tal vez sor
prenda que el proceso de gastrulacin deba ser tan distinto (fig.
3-14). De hecho se observa una gran diferencia entre los embrio
nes vertebrados antes de la gastrulacin, que refleja diferentes estra
tegias para la adquisicin de nutrimentos. Los mecanismos que
determinan el sexo tambin son muy diversos (Morrish y Sinclair,
2002). No todos los mamferos emplean el modelo humano de de
terminacin del sexo XY (Graves, 2002) y muchos reptiles prescin
den por completo del uso de cromosomas del sexo heteromorfos y
confan en la temperatura del ambiente para especificar el sexo del
embrin.
BIBLIOGRAFA ! 97
V e r te b r a d o s
D ro s o p h ila
In h ib id o r
X o llo d /B M P 1
T o llo id
E lim in a d o r
C h o rd in
SOG
A c tiv a d o r
BMP7
S c re w
L ig a n d o
BMP4
DPP
H um anos
D ro s o p h ila
C a e n o r h a b d itis
L ig a n d o
EGF
BOSS
L IN -3
R e c e p to r
EGFR
S e v e n le s s
L E T -2 3
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GRB2
D rk
S E M -5
P r o te n a G
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L E T -6 0
G A P /G N R P
G a p 1 /S O S
G a p -1
A ctivador de G T P -as a e
intercam blador d e nucletido
Fig. 3-17. Conservacin evolutiva de las vas del desarrollo.

A) Va BMP4/Chordin que sustenta la induccin neural en Drosophila y vertebrados. B) Va de sealamiento del factor de crecimiento, que tiene diversas
acciones en vertebrados, moscas y gusanos.
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CAPTULO TRES
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CAPTULO
CUATRO
Genes en genealogas y poblaciones

102
CAPTULO CUATRO
GENES EN GENEALOGAS Y POBLACIONES
4.1 Herencia monognica comparada

con muitifactorial
Los caracteres genticos ms simples son aquellos cuya presencia o
ausencia dependen del genotipo en un locus aislado. Esto no signi
fica que el carcter en s mismo sea programado slo por un par de
genes: es probable que la expresin de cualquier carcter humano re
quiera un gran nmero de genes y factores ambientales. Sin embar
go, en ocasiones es tanto necesario como suficiente un genotipo
particular en un locus para que el carcter se exprese, si se conside
ra el fondo gentico y ambiental humano normal. Estos caracteres
se denominan mendelianos. Los caracteres mendelianos pueden re
conocerse por los patrones genealgicos caractersticos que propor
cionan (seccin 4.2). En el hombre se conocen ms de 6 000
caracteres mendelianos. Como se describe en Antes de comenzar:
uso inteligente de la Internet, el punto de inicio esencial para ad
quirir informacin de cualquiera de estos caracteres, sea patolgico
o no, es la base de datos OMIM (www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/).
Casi todos los caracteres humanos estn regidos por genes en
ms de un locus. Cuanto ms alejado est un carcter de la accin
gnica primaria, menos probable es que muestre un patrn de ge
nealoga mendeliana simple. Las variantes de secuencias del DNA
casi siempre son puramente mendelianas -lo que constituye su
principal atraccin como marcadores genticos (seccin 13.2)-.
Aunque las variantes de protenas (movilidad electrofortica o acti
vidad de la enzima) suelen ser mendelianas, pueden depender de
ms de un locus por la modificacin postraduccional (seccin
1.5.3). Es probable que la falla o el mal funcionamiento de una va
del desarrollo que origina un defecto de nacimiento incluya un
equilibrio complejo de factores. Por tanto, los defectos comunes del
nacimiento (paladar hendido, espina bifida, cardiopatia congnita,
etc.) rara vez son mendelianos. Aunque es menos probable an que
los caracteres conductuales, como el desempeo en la prueba de IQ
(CI) o la esquizofrenia sean mendelianos, pueden estar determina
dos genticamente en mayor o menor grado.
Los caracteres no mendelianos dependen de dos, tres o muchos
locus genticos, con contribuciones mayores o menores de factores
ambientales. En este captulo se utiliza muitifactorial como un tr
mino incluyente que abarca todas estas posibilidades. De manera
ms especfica, la determinacin gentica puede comprender un n
mero pequeo de locus (oligognica) o muchos de ellos, cada uno
con un efecto individual pequeo (polignico); o es posible que ha
ya un locus mayor nico con un fondo polignico. Para los caracte
res dictomos (caracteres que pueden tenerse o no, como dedos
extra) los locus subyacentes se asumen como genes de susceptibili
dad en tanto que para los caracteres cuantitativos o continuos
(estatura, peso, etc.) se ven como locus de carcter cuantitativo
Varn
M u je r
1 S e x o d e s c o n o c id o
(LCC). Cualquiera de estos caracteres puede tender a presentarse en

familias, pero los patrones genealgicos no son mendelianos y no ad
miten un anlisis simple.
4.2
Patrones de genealoga mendelianos
4.2.1 Dominancia y recesividad son propiedad

de caracteres, no de genes
Un carcter es dominante si se manifiesta en heterocigotos y re
cesivo si no se presenta. Cabe sealar que dominancia y recesividad
son propiedades de caracteres, no de genes. Por consiguiente la ane
mia de clulas falciformes es recesiva porque slo los homocigotos
manifiestan HbS, pero el carcter falciforme, que es el fenotipo de
los heterocigotos de HbS, es dominante. Casi todos los sndromes
dominantes en humanos se conocen slo en heterocigotos. A veces
se describen homocigotos que nacen de matrimonios de dos perso
nas heterocigotas afectadas y a menudo los homocigotos se afectan
mucho ms. Los ejemplos son la acondroplasia (enanismo con
miembros cortos, MIM 100800) y el sndrome de Waardenburg ti
po 1 (sordera con anormalidades pigmentarias, MIM 193500). No
obstante, por lo general estos dos trastornos se describen como do
minantes porque estos trminos indican fenotipos que se observan
en heterocigotos. En organismos experimentales, en los que la incertidumbre no cabe, los genetistas tienden a utilizar el trmino se
midominante cuando el heterocigoto tiene un fenotipo
intermedio y reservan dominante para los padecimientos en que
no es posible distinguir entre homocigoto y heterocigoto -p. ej., la
enfermedad de Huntington (deterioro neurolgico progresivo de
inicio en el adulto, MIM 143100)-. Wilkie (1994) revis bien el
problema de la dominancia. Los varones son hemicigotos para lo
cus en los cromosomas X y Y, donde slo tienen una copia de cada
gen, de manera que no presentan el problema de dominancia o re
cesividad para caracteres ligados a X o a Y.
4.2.2 Los cinco patrones bsicos de genealoga

m endeliana
La figura 4-1 muestra los smbolos que se utilizan para dibujar ge
nealogas y el recuadro 4-1 resume los principales factores de cada
patrn. Los caracteres mendelianos pueden ser determinados por
locus en un autosoma o en los cromosomas del sexo X y Y. Los
caracteres autosmicos en ambos sexos y los caracteres ligados a X
en mujeres pueden ser dominantes o recesivos. Nadie tiene dos cro
mosomas Y genticamente distintos (en los raros varones XYY, los
dos cromosomas Y son duplicados). Por tanto existen cinco patro-
In d e m n e
M a trim o n io
c o n s a n g u n e o (o p cio n al)
A fe c ta d o
0
(D
P o rta d o r (op cio n al)
G e m e lo s
JZ 0
M u e rte
Fig. 4-1. Principales smbolos utilizados en genealogas.

Las generaciones suelen indicarse en nmeros romanos y los individuos dentro de cada generacin en nmeros arbigos; III-7 o ili7 es la sptima per
sona de la izquierda (a menos que se numere en forma explcita de otra manera) en la generacin II!. Puede emplearse una /* para indicar los hijos de
pacientes o propsitos (mujer: proposita) a travs de los que se descubri la familia.
4.2
A)
PATRONES DE GENEALOGA MENDELIANOS | 103
C br t O
1
III D
1
Sh E
5
r O rO tO
d o
B)
&
11
12
10
h rO
III 4 t O
1
13
-<5
O-
Q r
=0
12
0 =
11
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10
c) i
-0
2
~ S ~ k >
3
4
>
IV
iv T
(l H - Q
| 4
-o
D)
III
4 55
.
1
r O
56
i7-
~D
E ^ 10
IV
1
10
11
12
"i
13 14
Fig. 4-2. Patrones de genealoga mendeliana bsicos.

A) Autosmico dominante; B) autosmco recesivo; C) recesivo ligado a X; D) dominante ligado a X; E) ligado a Y. El riesgo para los individuos que se
ndican con una interrogacin son: A) 1 en 2; B) 1 en 4; C) 1 en 2 varones o 1 en 4 de toda la descendencia; D) insignificantemente bajo para varones,
100% para mujeres. Vase la seccin 4.3 y la figura 4-5 para las complicaciones de estos patrones bsicos.
nes de genealoga mendeliana arquetpicos (fig. 4-2). Como se des

cribe ms adelante, se aplican consideraciones especiales a padeci
mientos ligados a X y ligados a Y, de modo que en la prctica los
natrones de genealoga mendeliana importantes son autosmico
dominante, autosmico recesivo y ligado a X (dominante o recesi
vo). Estos patrones bsicos estn sujetos a varias complicaciones
que se comentan en la seccin 4.3 (ms adelante) y se ilustran en la
figura 4-5.
La inactivacin de X (iionizacin) confunde la distincin

entre padecimientos ligados a X dominantes y recesivos
Los portadores de afecciones ligadas a X recesivas suelen manifes
tar algunos signos del padecimiento, en tanto que comparados con
los varones afectados, los heterocigotos para afecciones ligadas a X
dominantes suelen afectarse en menor grado y de manera variable.
Esto es una consecuencia de la inactivacin de X. Como se describe
104
CAPTULO CUATRO
R ecuadro 4-1. C aractersticas de los patrones de herencia m endelianos

Herencia autosmica dominante (fig. 4-2A):
una persona afectada suele tener cuando menos un padre afectado (para
excepciones vase fig. 4-4);
afecta cualquier sexo;
la transmite cualquier sexo;
un nio de un apareamiento afectado x no afectado tiene 50% de posibi
lidad de afectarse (ello supone que la persona afectada es heterocigota,
lo que suele ser cierto en padecimientos raros).
Herencia autosmica recesiva (fig. 4-2B):
las personas afectadas suelen nacer de padres no afectados;
los padres de personas afectadas suelen ser portadores asintomticos;
la incidencia de consanguinidad parental es mayor;
afecta cualquier sexo;
despus del nacimiento de un nio afectado, cada nio subsecuente tie
ne 25% de posibilidad de afectarse (si se asume que ambos padres son
portadores fenotipicamente normales).
las mujeres pueden afectarse si el padre lo est y la madre es un porta

dor o en ocasiones como resultado de inactivacin de X no aleatoria (sec
cin 4.2.2);
no se transmite de varn a varn en la genealoga (pero los matrimonios
de un varn afectado y una mujer portadora pueden dar el aspecto de
transmisin de varn a varn, vase fig. 4-5G).
Herencia dominante ligada a X (fig. 4-2D):
afecta cualquier sexo, pero ms a las mujeres;
por lo general las mujeres se afectan de manera ms leve y variable que
los varones;
el nio de una mujer afectada, con independencia de su sexo, tiene una
posibilidad de 50% de afectarse;
todas las hijas de un varn afectado estn afectadas, pero ninguno de los
hijos.
Herencia ligada a Y (fig. 4-2E):
slo afecta a varones;
Herencia recesiva ligada a X (fig. 4-2C):
los varones afectados siempre tienen un padre afectado (a menos que

haya una mutacin nueva);
afecta sobre todo a varones;
todos los hijos de un varn afectado estn afectados.
los varones afectados suelen nacer de padres no afectados; por lo gene

ral la madre es un portador asintomtico y puede tener familiares varones
afectados;
en la seccin 10 .5 .6 , los mamferos compensan nmeros desiguales

de cromosomas X en varones y mujeres mediante la inactivacin
permanente de todos los cromosomas X, excepto uno en cada clu
la somtica. Los varones XY conservan su X nica activa, en tanto
que las mujeres XX inactivan una X (que se elige de modo aleato
rio) en cada clula. La inactivacin ocurre temprano en la vida em
brionaria y una vez que una clula elige la X que activa, esa eleccin
se transmite en forma clonal a todas sus clulas hijas.
Un heterocigoto femenino para un padecimiento ligado a X
(dominante o recesivo) es un mosaico (vase seccin 4.3.6). Cada
clula expresa el alelo normal o el anormal, pero no ambos. Cuan
do el fenotipo depende de un producto circulante, como la hemo
filia (falta de coagulacin de la sangre, MIM 306700, 306900), hay
un efecto promediado entre las clulas normales y anormales. Las
mujeres portadoras tienen un fenotipo intermedio y no suelen ma
nifestar afeccin clnica pero son anormales desde el punto de vis
ta bioqumico. Cuando el fenotipo es una propiedad localizada de
clulas individuales, como en la displasia ectodrmica hipohidrtica (falta de glndulas sudorparas, dientes y pelo anormales; MIM
305100), las mujeres portadoras muestran placas de tejido normal
y anormal. En ocasiones se observan heterocigotos con manifes
taciones de padecimientos recesivos ligados a X. Estas mujeres pue
den afectarse de modo muy grave porque, por mala suerte, casi
todas las clulas de algunos tejidos crticos inactivaron la X normal.
El cromosoma Y porta hasta cierto punto pocos genes

Adems de la masculinidad en s misma, la genealoga estereotpi
ca ligada a X de la figura 4-2E no confiere ningn carcter huma
no conocido (las afirmaciones de varn puerco espn y odos
pilosos son dudosas, vase MIM 146600 y 425500 respectivamen
te). Puesto que las mujeres normales carecen de todos los genes li
gados a Y, cualquiera de dichos genes debe codificar los caracteres
no esenciales o las funciones especficas masculinas. Algunos genes
existen como copias funcionales, tanto en Y como en X; quiz re
sulten una excepcin a este argumento, pero no proporcionaran
un patrn de genealoga ligado a Y clsico. Las deleciones intersti
ciales de Yq son una causa importante de infertilidad masculina pe
ro, desde luego, los varones infrtiles no producirn genealogas
como la de la figura 4-2E. Jobling y Tyler-Smith (2000) y Skaletsky
y cois. (2003) resumieron el contenido gnico del cromosoma Y y su
posible participacin en enfermedades.
Genes localizados en la regin de pareamiento Xp-Yp

muestran herencia seudoautosmica
Como se menciona en la seccin 2.3.3, las 2.6 Mb distales de Xp e
Yp son homologas y estn sujetas a cruzamiento en la meiosis. Por
consiguiente los pocos genes en estas regiones se segregan en un pa
trn seudoautosmico y no alguno ligado al sexo.
4.2.3 Rara vez es posible definir sin ambigedad la

modalidad de herencia en una genealoga aislada
Con base en el tamao limitado de las familias humanas, rara vez
es posible estar del todo seguro de la forma de herencia de un ca
rcter mediante la simple inspeccin de una genealoga aislada. En
animales de experimentacin podra establecerse una prueba cruza
da y revisarse para una relacin 1:2 o 1:4. En genealogas humanas
la proporcin de nios afectados no es un indicador muy seguro.
Ello se debe sobre todo a que los nmeros son muy pequeos pe
ro, adems, la forma en que se descubre a la familia puede predis
4.2
poner la relacin de nios afectados con los que no lo estn. En pa

decimientos recesivos a menudo la proporcin de nios afectados
parece mayor de 1 en 4. Esto se debe a que las familias suelen des
cubrirse cuando tienen un nio afectado; las familias en que ambos
padres son portadores pero, por fortuna, ninguno est afectado se
pasan por alto de manera sistemtica. Estos sesgos de indagacin
y las formas de corregirlos se comentan en la seccin 15.2.1.
La modalidad de herencia establecida para muchos de los pade
cimientos ms raros no es ms que una suposicin informada. La
asignacin de las modalidades de herencia tiene importancia por
que constituye la base de las estimaciones del riesgo que se utilizan
en asesora gentica. Sin embargo, es esencial reconocer que con
frecuencia las formas de herencia son hiptesis de trabajo ms que
hechos establecidos. La OMIM utiliza un asterisco para indicar las
entradas con modalidades de herencia hasta cierto punto bien esta
blecidas. La herencia slo puede definirse con certeza cuando se
dispone de una copia clonada del gen.
4.2.4 Un gen-una enzima no implica un gen-un sndrome

Los patrones de genealoga proporcionan el punto de entrada esen
cial a la gentica humana, pero slo son un punto de inicio para de
rruir genes. Sera un error muy serio imaginar que los cerca de
6 000 caracteres mendelianos definen 6 000 secuencias de codifi
cacin de DNA. Constituira una extensin injustificada de la hi
ptesis un gen-tina enzima de Beadle y Tatum. Desde el decenio
ce 1940 esta hiptesis permiti un adelanto importante en la comprensin de la forma en que los genes determinan fenotipos. A par
i r de entonces se extendi: algunos genes codifican RNA no
Traducidos, ciertas protenas no son enzimas y muchas protenas
contienen varias cadenas polipptidas que se codifican por separa
do. Pero, incluso con estas extensiones, no es posible utilizar la hir-tesis de Beadle y Tatum para implicar una correspondencia uno
i uno entre entradas en el catlogo de OMIM y unidades de trans
cripcin de DNA.
Los genes de la gentica clsica son entidades abstractas. Nin
gn carcter determinado en una localizacin cromosmica nica
^ segregar en un patrn mendeliano -pero es posible que el de
terminante no sea un gen en el sentido de la palabra molecular de
ios genetistas-. Aunque la distrofia muscular fascio-escpulo-hueral (debilidad intensa pero no mortal de ciertos grupos muscu.res; MIM 158900) se debe a deleciones pequeas de secuencias
PATRONES DE GENEALOGA MENDELIANOS
heterogeneidad de locus, cuando el mismo fenotipo clnico pue

de resultar de mutaciones en cualquiera de varios locus distintos;
heterogeneidad allica, cuando pueden observarse muchas
mutaciones diferentes dentro de un gen determinado en distin
tos pacientes con cierto padecimiento gentico (se analiza en
forma ms completa en el cap. 16). Muchas enfermedades
muestran heterogeneidad tanto de locus como allica;
heterogeneidad clnica, que se utiliza aqu para describir la si
tuacin en que las mutaciones en el mismo gen producen dos
o ms enfermedades diferentes. La seccin 16.6 proporciona
ejemplos.
La heterogeneidad de locus es comn en sndromes

que se deben a la falla de una va compleja
La prdida de la audicin brinda buenos ejemplos de heterogenei
dad de locus. Cuando dos personas con prdida de la audicin con
gnita profunda, autosmica recesiva, contraen matrimonio, como
suele suceder, por lo general los nios tienen una audicin normal
(fig. 4-3). Es fcil observar que se necesitaran muchos genes distin
tos para construir una mquina tan exquisita como las clulas piliformes cocleares y un defecto en cualquiera de estos genes podra
ocasionar sordera. Los nios tienen una audicin normal siempre
que los padres llevan mutaciones en diferentes genes. ste es un
ejemplo de complementacin (recuadro 4-2). Esta heterogeneidad
de locus slo cabe esperarla en padecimientos como sordera, cegue
ra o retraso mental, en los que fracas una va bastante general; pe
ro incluso con patologas ms especficas, mltiples locus son muy
frecuentes. Un ejemplo notable es el sndrome de Usher, una com-
AaB B
AABb
-r-
aa B B
III
A aB b
A aB b
AABb
AAbb
A aB b
105
4q35, hasta el momento de escribir este libro nadie ha intentado

encontrar una secuencia de codificacin de protenas importante
en esa localizacin a pesar de la investigacin y la secuenciacin in
tensivas. El gen de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo
1A (neuropata motora y sensorial; MIM 118220) result ser una
duplicacin tndem de 1.5 Mb sobre el cromosoma 17pl 1.2 (sec
cin 16.5.2). Estos ejemplos son muy poco frecuentes; la mayor
parte de las entradas de OMIM probablemente describen las con
secuencias de mutaciones que afectan una unidad de transcripcin
aislada. Sin embargo, an no se establece una correspondencia uno
a uno entre fenotipos y unidades de transcripcin a causa de tres ti
pos de heterogeneidad:
O
AaB B
A aB b
A aB b
A aB b
- ; 4-3. Complementacin: los padres con prdida profunda de la audicin autosmica recesiva suelen tener nios con audicin normal.
, ll7 son descendientes de padres no afectados pero consanguneos y cada uno tiene hermanos afectados, lo que determina que sea probable que cada
. X tenga prdida de la audicin autosmica recesiva. Todos sus nios no estn afectados, lo que demuestra que ll6 y ll7 tienen mutaciones no allicas.
106
CAPTULO CUATRO GENES EN GENEALOGAS Y POBLACIONES
binacin autosmica recesiva de prdida de la audicin y ceguera

progresiva (retinitis pigmentosa) que puede deberse a mutaciones
en 10 locus o ms no relacionados (Hereditary H earing Loss Home
page, www.uia.ac.be/dnalab/hhh/). La OMIM separ entradas pa
ra ejemplos conocidos de heterogeneidad de locus (definidos por
anlisis de enlace o mutacin), pero deben existir muchos ejemplos
no detectados que an se incluyen dentro de entradas nicas.
Las series ailicas son una causa de heterogeneidad clnica

En ocasiones varios fenotipos humanos en apariencia distintos tienen
como causa diferentes mutaciones ailicas en el mismo locus. La di
ferencia puede ser de grado: mutaciones que inactivan en forma par
cial el gen de distrofina producen la distrofia muscular de Becker, en
tanto que mutaciones que inactivan por completo dicho gen causan
la distrofia muscular de Duchenne, similar pero ms grave (desgaste
muscular mortal: MIM 310200). Otras veces la diferencia es cualita
tiva: la inactivacin del gen del receptor de andrgeno ocasiona in
sensibilidad al andrgeno (los embriones 46,XY se desarrollan como
mujeres; MIM 313700), pero la expansin de un tramo de codones
de glutamina dentro del mismo gen causa una enfermedad muy di
ferente, la atrofia muscular espinobulbar o enfermedad de Kennedy
(MIM 313200). Tanto estas correlaciones entre genotipo y fenotipo
como otras ms se comentan con mayor amplitud en el captulo 16.
4.2.5 La herencia mitocondrial origina un patrn de

genealoga matrilineal identificable
Adems de las mutaciones en genes que se portan en los cromoso
mas nucleares, las mutaciones mitocondriales son una causa impor
tante de enfermedad gentica humana (vase la base de datos
MITOMAP para detalles; www-mitomap.org). El genoma mito
condrial (seccin 9.1.2) es pequeo pero muy mutable en compa
racin con el DNA nuclear, tal vez porque la replicacin del DNA
mitocondrial es ms propensa a errores y el nmero de replicaciones
es mucho mayor. Las enfermedades codificadas de manera mitocon
drial tienen dos caractersticas poco usuales: herencia matrilineal y
heteroplasmia frecuente.
La herencia es matrilineal porque el espermatozoo no contribu
ye con mitocondrias al cigoto (la afirmacin se apoya en pruebas li
mitadas; sin embargo, en nios casi nunca se detectan variantes
mitocondriales derivadas del padre). Por tanto un padecimiento
heredado en forma mitocondrial puede afectar ambos sexos, pero
slo las madres afectadas lo transmiten (fig. 4-4), lo que origina un
patrn de genealoga identificable.
Las clulas contienen muchos genomas mitocondriales. En al
gunos pacientes con una enfermedad mitocondrial cada genoma
mitocondrial lleva la mutacin causal (homoplasmia), pero en otros
casos se observa una poblacin mixta de genomas normales y mutantes (heteroplasmia) dentro de cada clula. A diferencia del mosaicismo gentico nuclear, que debe surgir despus de la etapa de
cigoto (seccin 4.3.6), la heteroplasmia mitocondrial puede trans
mitirse de la madre heteroplsmica al nio heteroplsmico. En es
tos casos la proporcin de genomas mitocondriales anormales
puede variar de modo notable entre la madre y el nio, lo que su
giere que un nmero en extremo pequeo de molculas de DNA
maternas origina todo el DNA mitocondrial del nio (vase sec
cin 11.4.2). La patologa molecular complicada de las enfermeda
des mitocondriales se estudia en la seccin 16.6.6.
C om plicaciones de ios patrones de

genealoga m endeiianos bsicos
En la vida real varias complicaciones suelen ocultar un patrn mendeliano bsico. La figura 4-5 muestra diversas complicaciones fre
cuentes.
4.3.1 Padecimientos recesivos comunes pueden originar

un patrn de genealoga seudodominante
Si un carcter es comn en la poblacin, es muy posible que dos o
ms personas lo introduzcan en la genealoga de manera indepen
diente. Un carcter recesivo comn, como el grupo sanguneo O,
puede observarse en generaciones sucesivas por matrimonios repeti
dos de personas grupo O con heterocigotos. Esto produce un patrn
que semeja la herencia dominante (fig. 4-5A). Por consiguiente los
patrones genealgicos clsicos se observan mejor con caracteres raros.
4.3.2 La falta de manifestacin de un padecimiento

dominante se denomina no penetrancia
La no penetrancia es una complicacin frecuente en padecimientos
dominantes. Para un genotipo determinado, la penetrancia de un ca
rcter se define como la probabilidad de que una persona con el geno
tipo manifieste el carcter. Por definicin un carcter dominante se
manifiesta en una persona heterocigota y por tanto debe mostrar
100% de penetrancia. No obstante, aunque muchos caracteres en hu
manos suelen mostrar herencia dominante, a veces brincan una gene
racin. En la figura 4-5B, II2 tiene un padre y un nio afectados, y casi
con certeza porta el gen mutante, pero es normal desde el punto de vis
ta fenotpico. ste se describira como un caso de no penetrancia.
La no penetrancia no entraa ningn misterio -de hecho,
100% de penetrancia es el fenmeno ms sorprendente. Muy a
menudo la presencia o ausencia de un carcter depende, tanto en las
Recuadro 4-2. Prueba de complementacin para descubrir si dos caracteres recesivos estn determinados por
genes allicos
Cruzamiento parental
un locus
a ^ x a2a2
dos locus
aaBB x AAbb
Descendencia
a ^
AaBb
Fenotipo
mutante
tipo silvestre
Anmales homocigotos para los dos caracteres se cruzan y se observa el

fenotipo de la descendencia. Cuando ambos animales llevan mutaciones
en el m ism o locus, la progenie no tendr un alelo tipo silvestre y en consecuencia ser fenotpicamente anormal. Si hay dos locus diferentes, la
progenie es heterocigota para cada uno de los dos caracteres recesivos
y pQ(. consgUente fenotpicamente normal. En muy pocas ocasiones
alelos en el m ism o locus pueden complementarse entre s (complementacin interallica).
4.3 | COMPLICACIONES DE LOS PATRONES DE GENEALOGA MENDELIANOS BSICOS ; 107
4.3.3 Muchos padecimientos muestran expresin

variable
Fig. 4-4. Genealoga de una enfermedad mitocondrial.

Patrn de genealoga tpico que muestra prdida de la audicin deternnada de modo mitocondrial (familia informada por Prezant y cois.,
1993). Obsrvese la penetrancia incompleta.
circunstancias principales como en las normales, del genotipo en

n locus, pero un fondo gentico poco frecuente, un estilo de vida
particular o tan slo el azar significan que es posible que una per
sona ocasional no manifieste el carcter. La no penetrancia es un
rtligro latente mayor en asesora gentica. Sera imprudente que un
esor que sabe que el padecimiento de la figura 4-5B es dominan:e y observa que III7 no tiene signos diga a la mujer que no corre
riesgo de procrear nios afectados. Una de las labores de los aseso
res genticos es conocer el grado usual de penetrancia de cada sn
drome dominante.
Con frecuencia, por supuesto, un carcter depende de mu
chos factores y no muestra un patrn de genealoga mendeliano
inclusive si es del todo gentico. Existe un continuo de caracte
res, desde el mendeliano por completo penetrante hasta el multifactorial (fig. 4-6), con influencia creciente de otros locus
genticos, el ambiente, o ambos. Ninguna divisin lgica sepa
ra los caracteres mendelianos imperfectamente penetrantes de
'os multifactoriales; ste es un aspecto de la descripcin ms til
que se aplicara.
Penetrancia relacionada con la edad en enfermedades

de inicio tardo
En enfermedades de inicio tardo se observa un caso en particular
importante de penetrancia reducida. Los padecimientos genticos
no siempre son congnitos (presentes al nacer). Aunque el genoti
po se fija en la concepcin, es posible que el fenotipo no se mani
fieste hasta la vida adulta. En estos casos la penetrancia se relaciona
con la edad. Un ejemplo bien conocido (fig. 4-7) es la enfermedad
de Huntington (neurodegeneracin progresiva; MIM 143100). El
retraso del inicio podra deberse a la acumulacin lenta de una sus
tancia nociva, la muerte paulatina del tejido o la incapacidad para
reparar cierta forma de dao ambiental. Los cnceres hereditarios
son causados por una segunda mutacin que afecta una clula de
una persona que ya porta una mutacin en un gen supresor de tu
mor (cap. 17). Segn la enfermedad, la penetrancia puede ser de
100 % si la persona vive el tiempo suficiente o es posible que un in
dividuo que lleva el gen nunca presente sntomas sin considerar el
tiempo que viva. Las curvas de edad de inicio, como las de la figu
ra 4-7, son medios importantes en asesora gentica porque permi
ten que el genetista estime la posibilidad de que una persona con
riesgo pero asintomtica desarrolle despus la enfermedad.
Relacionada con la no penetrancia, la expresin variable se obser

va a menudo en padecimientos dominantes. La figura 4-5C mues
tra un ejemplo de una familia con sndrome de Waardenburg.
Diferentes miembros de la familia presentan distintas caractersticas
del sndrome. La causa es la misma que la de la no penetrancia: otros
genes, factores ambientales o el azar puro tiene cierta influencia en
el desarrollo de los sntomas. Por lo general la no penetrancia y la ex
presin variable son problemas con caracteres dominantes, ms que
recesivos. Ello indica en parte la dificultad para sealar casos no pe
netrantes en una genealoga recesiva tpica. Sin embargo, como re
gla general, los padecimientos recesivos son menos variables que los
dominantes, tal vez porque el fenotipo de un heterocigoto incluye
un equilibrio entre los efectos de los dos alelos, de manera que el
resultado final puede ser ms sensible a la influencia externa que
el fenotipo de un homocigoto. Sin embargo, tanto la no pene
trancia como la expresin variable se observan a veces en padeci
mientos recesivos.
Estas complicaciones son mucho ms notables en humanos que
en plantas u otros animales. Los animales de laboratorio y las plan
tas de siembras presentan mayor uniformidad gentica que los hu
manos. Lo que se observa en gentica humana es tpico de una
poblacin silvestre. No obstante, los genetistas de ratones estn fa
miliarizados con la forma en que la expresin de un mutante pue
de cambiar cuando se introduce en un fondo gentico distinto
-una consideracin importante cuando se estudian modelos de en
fermedades humanas en el ratn.
La anticipacin es un tipo especial de expresin variable

Anticipacin se refiere a la tendencia de algunos padecimientos
dominantes variables a tornarse ms graves (o iniciar antes) en ge
neraciones sucesivas. Hasta hace poco tiempo la mayora de los ge
netistas se mostraba escptica respecto a que este hecho sucediera
alguna vez. El problema es que variaciones aleatorias en la grave
dad simulan con mucha facilidad la anticipacin verdadera. Una
familia recibe atencin clnica cuando nace un nio con una afec
cin grave. En la investigacin de los antecedentes el genetista ob
serva que uno de los padres est afectado, pero de manera muy
leve. Aunque esto parece anticipacin, en realidad puede ser slo
un sesgo de indagacin. Si el padre hubiera estado muy afectado
es muy posible que nunca hubiera tenido un hijo; si la afeccin del
nio es muy leve, es probable que la familia no se hubiera detec
tado. Con base en la falta de cualquier mecanismo plausible para
la anticipacin, y en los problemas estadsticos de demostrarla an
te estos sesgos, la mayora de los genetistas no deseaba considerar
con seriedad la anticipacin hasta que los adelantos moleculares
los obligaron a hacerlo.
La anticipacin se torn respetable de pronto, e inclusive se
puso de moda, con el descubrimiento de repeticiones extensibles
de trinucletidos inestables en el sndrome de X frgil (retraso
mental con varios signos fsicos; MIM 309550) y despus en la
distrofia miotnica (una enfermedad multisistmica muy varia
ble con disfuncin muscular caracterstica; MIM 160900) y la
enfermedad de Huntington. La gravedad o la edad de inicio de
estos trastornos se correlaciona con la longitud de la repeticin y
esta ltima tiende a crecer conforme el gen se transmite a travs
de las generaciones (vase seccin 16.6.4). Estos padecimientos
108 | CAPTULO CUATRO
A)
C)
B)
-1
00
AO
AO | AA
0 0 | AO
AO
00
AA
AO
AO
AO
00
AO
OO
00
IV
E)
-Q -
0 D r
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6cj
/
Fig. 4-5. Complicaciones de los patrones mendelianos bsicos.

A) Un recesivo comn, por ejemplo, un grupo sanguneo O, puede dar el aspecto de un patrn dominante. B) Herencia autosmica dominante con no
penetrancia en ll2. C) Herencia autosmica dominante con expresin variable: en esta familia con sndrome de Waardenburg, primer cuadro lleno = pr
dida de la audicin; segundo cuadro = ojos de diferentes colores; tercer cuadro = copete blanco; cuarto cuadro = encanecimiento prematuro.
D) Impronta gentica: en esta familia los tumores glomosos autosmicos dominantes se manifiestan slo cuando el gen se hereda del padre (familia
descrita por Heutink y cois., 1992). E) Impronta gentica: en esta familia el sndrome de Beckwith-Wledemann autosmico dominante se manifiesta slo
cuando el gen se hereda de la madre (familia Informada por Viljoen y Ramesar, 1992). F) Incontinencia pigmentaria dominante ligada a X. Los varones
afectados se abortan de manera espontnea (cuadros pequeos). G) Genealoga recesiva ligada a X en la que la endogamia produce una mujer afectada
y transmisin aparente de varn a varn. H) Mutacin autosmica dominante nueva que simula un patrn autosmico o ligado a X recesivo.
muestran anticipacin verdadera. Ahora de nuevo se reclama

considerar la anticipacin para muchas enfermedades y es impor
tante recordar que la objecin antigua respecto el sesgo de inda
gacin an es vlida. A fin de que sea creble, una afirmacin de
anticipacin requiere un respaldo estadstico cuidadoso, no slo
la impresin clnica.
4.3.4 En genes improntos, la expresin depende

del origen parental
Ciertos caracteres humanos son autosmicos dominantes, afectan a
ambos sexos y los transmiten los padres de cualquier sexo, pero slo
se manifiestan cuando se heredan de un padre de un sexo particular.
4.3 I COMPLICACIONES DE LOS PATRONES DE GENEALOGIA MENDELIANOS BSICOS j 109
Gen nico
M endeano
Fig. 4-6. Espectro de caracteres humanos.

Pocos caracteres son puramente mendelianos, polignicos o ambien
tales. Casi todos dependen de la misma mezcla de determinantes genti
cos mayores y menores aunados a influencias ambientales. La mezcla
de factores que determina cualquier carcter determinado podra repre
sentarse por un punto localizado en alguna parte dentro del tringulo.
Por ejemplo, se describen familias con tumores glomosos autosmicos dominantes que slo se expresan en varones o mujeres que here
dan el gen de su padre (fig. 4-5D), en tanto que el sndrome de
Beckwith-Wiedemann (exnfalos, macroglosia, crecimiento excesi
vo; MIM 130650) en ocasiones es dominante pero slo se expresa en
nios que lo heredan de su madre (fig. 4-5E). Estos efectos del sexo
parental son prueba de improntacin, un fenmeno mal compren
dido por el que ciertos genes son marcados (improntos) de alguna
manera con su origen parental. Los mltiples problemas que rodean
el mecanismo y el propsito evolutivo de la improntacin se estudian
en la seccin 10.5.4 y el recuadro 16.6 describe un ejemplo clnico
de particular notabilidad.
4.3.5 La letalidad m asculina puede com plicar

genealogas ligadas a X
En algunos padecimientos dominantes ligados a X, la ausencia del
alelo normal es letal antes del nacimiento. Por consiguiente los varo
nes afectados no nacen y se observa un padecimiento que slo afecta
a mujeres, que lo transmiten a la mitad de sus hijas pero a ninguno
de sus hijos (fig. 4-5F). Es posible que haya un antecedente de abor
tos espontneos, pero las familias rara vez son lo bastante grandes pa
ra demostrar que el nmero de hijos slo es la mitad que el de hijas.
Un ejemplo es la incontinencia pigmentaria (defectos lineales de la
piel que siguen patrones definidos conocidos como lneas de Blaschko, que a menudo se acompaan de problemas neurolgicos o esque
lticos; MIM 308310).
4.3.6 Con frecuencia nuevas m utaciones complican

ia interpretacin genealgica y pueden
conducir a mosaicismo
Muchos casos de enfermedad gentica dominante o ligada a X gra
ve resultan de mutaciones nuevas, sin advertencia notable en una
E d a d (aos)
Fig. 4-7. Curva de edad de inicio en la enfermedad de Huntington.

Curva A: probabilidad de que un individuo que porta el gen de enfer
medad desarrolle sntomas a una edad determinada. Curva B: riesgo
de que un nio sano de un padre afectado lleve el gen de enfermedad a
una edad determinada. Tomado de Harper (2001). Practical Genetc
Counselling, 5a. ed Hodder Arnold. Reproducido con autorizacin de
Hodder Arnold.
familia que carece de antecedentes de la enfermedad. Un dominan

te mortal por completo penetrante ocurrira de manera necesaria
por una mutacin nueva y los padres nunca estaran afectados; un
ejemplo, es la displasia tanatofrica (acortamiento grave de los hue
sos largos y fusin anormal de suturas craneales; MIM 187600).
Para un padecimiento dominante no mortal, pero grave, se aplica
un argumento similar, aunque en menor grado. Si la enfermedad
impide que la mayora de las personas se reproduzca, pero de cual
quier modo se presentan casos nuevos de la enfermedad, muchos o
la mayor parte de ellos se deben a nuevas mutaciones. Los recesivos
ligados a X importantes tambin muestran una proporcin signifi
cativa de mutaciones nuevas, porque el gen est expuesto a selec
cin natural siempre que se encuentra en un varn. Por otra parte,
las genealogas autosmicas recesivas no se afectan de modo impor
tante -un alelo mutante puede propagarse durante muchas genera
ciones en portadores asintomticos y cabe asumir con seguridad
que ambos padres de un nio afectado son portadores.
Si se considera que, promediadas con el tiempo, las mutaciones
nuevas reemplazan a los genes de enfermedad que se perdieron a
travs de la seleccin natural, su frecuencia en la poblacin depen
de de una relacin simple (que se describe en la seccin 4.5.2) en
tre el ritmo al que la seleccin natural elimina genes desventajosos
y el ritmo al que se crean nuevas mutaciones. Los mecanismos ge
nerales que afectan la frecuencia de alelos en la poblacin se comen
tan en el captulo 11 , recuadro 11 .2 .
Puede ser muy difcil decidir la modalidad de herencia y el ries
go de recurrencia cuando una pareja normal sin un antecedente
110
CAPTULO CUATRO
familiar importante tiene un nio con anormalidades graves (fig.

4-5H); el problema podra ser autosmico recesivo, autosmico
dominante con una mutacin nueva, recesivo ligado a X (si el ni
o es varn) o no gentico. El mosaicismo germinal introduce una
complicacin adicional (vase a continuacin).
Los mosaicos tienen dos

genticamente distintas
(o ms)
lneas celulares
Suele observarse que en enfermedades autosmicas dominantes y li

gadas a X importantes, en las que las personas afectadas no tienen
nios o muy pocos, los genes de la enfermedad se conservan en la
poblacin mediante mutacin recurrente. Una suposicin usual es
que una persona por completo normal produce un gameto mutante nico. Sin embargo, no siempre sucede as. A menos que exista
algo especial en el proceso mutacional, como slo puede suceder du
rante la gametognesis, las mutaciones pueden surgir en cualquier
momento durante la vida poscigtica. Las mutaciones poscigticas
producen mosaicos con dos (o ms) lneas celulares genticamente
distintas.
El mosaicismo puede afectar tejidos con lneas somticas, germi
nales, o ambas. Las mutaciones poscigticas no slo son frecuentes, si
no inevitables. Por lo general las tasas de mutacin en humanos son
de 10 7 por gen por generacin celular y el cuerpo contiene tal vez
1013 clulas. Cabe pensar que todas las personas deben ser un mosai
co para innumerables enfermedades genticas. De hecho, como lo re
marc en forma memorable el profesor John Edwards, un varn
normal bien podra producir la totalidad del catlogo de la OMIM en
cada eyaculado. Esto no debe originar ansiedad. Si una clula en el de
do meique de una persona muta para el genotipo de enfermedad de
Huntington, o una clula en el odo capta una mutacin de fibrosis
qustica, la persona o su familia no sufren ninguna consecuencia. S
lo cuando una mutacin somtica conduce al surgimiento de una clo
na sustancial de clulas mutantes existe un riesgo para todo el
organismo. Lo anterior puede suceder en dos formas:
la mutacin causa proliferacin anormal de una clula que en
condiciones normales se replicara con lentitud o no del todo,
lo que genera una clona de clulas mutantes. sta es la forma
en que se presenta el cncer; el tema se estudia en su totalidad
con ms detalle en el captulo 17.
la mutacin ocurre en un embrin temprano, afecta una clu
la que es la progenitora de una fraccin importante del orga
nismo completo. En este caso el individuo mosaico puede
mostrar signos clnicos de la enfermedad.
Las mutaciones que ocurren en la lnea germinal de un padre pue
den causar una enfermedad hereditaria nueva en un nio. Una mu
tacin temprana en la lnea germinal puede producir una persona
que aloja una clona de clulas de la lnea germinal mutantes (mo
saicismo germinal o gonadal). Como resultado, una pareja nor
mal sin un antecedente familiar puede tener ms de un nio con la
misma enfermedad dominante grave. La genealoga simula heren
cia recesiva. Inclusive si la modalidad de herencia correcta se cono
ce, es muy difcil calcular el riesgo de recurrencia para utilizarlo en
la asesora a los padres (Van der Meulen y cois., 1995). Por lo ge
neral se cita un riesgo emprico (seccin 4.4.4). La figura 4-8 mues
tra un ejemplo de la incertidumbre que el mosaicismo introduce en
la asesora, en este caso en una enfermedad ligada a X.
Los estudios moleculares pueden ser muy tiles en estas circuns
tancias. A veces es posible demostrar de manera directa que un pa
dre normal est produciendo una proporcin de espermatozoos
Fig. 4-8. Mutacin nueva en la distrofia muscular de Duchenne

recesiva ligada a X.
Los tres cromosomas X de la abuela se distinguieron por medio de
marcadores genticos y se muestran en azul, rosa y pardo (Ignorando
la recombinacin). 111, tiene X de la abuela, que adquiri una mutacin
en algn punto en la genealoga. Hay cuatro posibles puntos en los que
pudo ocurrir:
si Ilh porta una mutacin nueva, el riesgo de recurrencia para todos
los miembros de la familia es muy bajo;
si II, es un mosaico germinal, hay un riesgo importante (pero difcil de
cuantificar) para su nio futuro, pero no para sus hermanas;
s Ih fue el resultado de un espermatozoo mutante nico, ella tiene el
riesgo de recurrencia estndar para recesivas ligadas a X, pero sus
hermanas no lo tienen;
s h fue un mosaico germinal, todas las hermanas tienen un riesgo sig
nificativo, que es difcil cuantificar.
mutantes. Aunque las mujeres no pueden someterse a estudios di

rectos de la lnea germinal, otros tejidos accesibles, como los fibro
blastos o las races del pelo, pueden someterse a pruebas de
mosaicismo. Un resultado negativo en tejidos somticos no descar
ta mosaicismo de la lnea germinal, pero un resultado positivo, au
nado a un nio afectado, lo comprueba (fig. 4-9).
Las quimeras contienen clulas de dos cigotos separados

en un mismo organismo
Los mosaicos inician la vida como un vulo fecundado nico. Las
quimeras resultan de la fusin de dos cigotos para formar un em
brin (el inverso de la gemelacin) o de la colonizacin limitada
de un gemelo por clulas de un cogemelo no idntico (fig. 4-10).
El quimerismo se demuestra por la presencia en muestras de teji
dos mancomunados de demasiados alelos parentales en varios locus (si slo participara un locus, cabra sospechar mosaicismo por
una mutacin aislada). En ocasiones los centros de grupos sangu
neos descubren quimeras entre donadores normales y algunos pa
cientes intersexuales resultan ser quimeras XX/XY. Strain y
colaboradores (1998) describieron, por ejemplo, a un nio
46,XY/46,XX que fue el resultado del amalgamiento de dos em
briones despus de una fecundacin in vitro en la que se transfirie
ron tres embriones a la madre.
.4
GENTICA DE CARACTERES MULTIFACTORIALES: TEORIA DEL UMBRAL POLIGENICO
111
In d iv id u o III-4 :
h a p lo tip o :
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Fig. 4-9. Mosaicismo de lnea germinal y somtico en una enfermedad dominante.

Los individuos II-2 y III-2 sufren poliposis adenomatosa familiar, una form a de cncer colorrectal que se hereda de manera dominante y se mapea en el
cromosoma 5 (MIM 175100, vase seccin 17.5.3). Los padres de II-2 no estn afectados. La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (vase
seccin 18.3.2) demuestra una mutacin, W593X, en el exn 14 del gen/lPC en III-2 (se observa en las bandas superiores en la pista 1 del gel). Para
II-2 el gel muestra las bandas mutantes, pero slo de manera muy dbil, lo que indica que la sangre de esta persona es mosaico para la mutacin. La
mutacin est ausente en III-4, aunque los estudios con marcadores ligados (cromosomas codificados con color, vase seccin 18.5) mostraron que
hered el cromosoma de riesgo alto (azul) de su madre. El examen clnico (colonoscopia) confirm que III-4 no tena la enfermedad. II-2 debe ser tanto
una lnea germinal como un mosaico somtico para la mutacin. Ejemplo y gel cortesa del profesor Bert Bakker, Leiden.
4.4 G entica de c a ra c te re s
m u ltifactoriales: te o ra del um bral
polignico
4.4.1 Algo de historia
Cuando el trabajo de Mendel se redescubri en 1900 ya estaba bien
establecida una escuela rival de genetistas en el Reino Unido y algu
na otra parte. Francis Galton, el primo notable y excntrico de Char
les Darwin, dedic gran parte de su inmenso talento a sistematizar el
estudio de la variacin humana. A partir del artculo Hereditary Talent an d Character"publicado el mismo ao, 1865, como trabajo de
Mendel (y aumentado en 1869 a un libro, Hereditary Genius), invir~ muchos aos en la investigacin de semejanzas familiares. Galton
s dedic a cuantificar observaciones y aplicar anlisis estadsticos. Su
.-jithropometric Laboratory, establecido en Londres en 1884, registr
r o , estatura en posicin sedente y de pie, brazada, capacidad respi
ratoria, fuerza de tiramiento y opresin, fuerza de soplido, tiempo de
reaccin, agudeza visual y auditiva, diferenciacin de colores y juicios
ie longitud de sus sujetos (quienes le pagaron tres peniques por el
rrivilegio). En una de las primeras aplicaciones estadsticas compar
ios atributos fsicos de padres y nios, y estableci el grado de corre
ccin entre familiares. Alrededor de 1900 contaba ya con un gran
-mero de conocimientos respecto a la herencia de dichos atributos
v una tradicin (biomtrica) de su investigacin.
Cuando el trabajo de Mendel se redescubri, surgi una con

troversia. Los biometras aceptaron que los genes mendelianos po
dran explicar unas cuantas anormalidades raras o desviaciones
curiosas, pero sealaron que la mayor parte de los caracteres que
podan ser importantes en la evolucin (talla corporal, estructura,
fuerza, habilidad para atrapar presas o encontrar alimento) la
constituan caracteres continuos o cuantitativos y no factibles de
anlisis mendeliano. Puesto que todas las personas tienen estos
caracteres, pero en grados distintos, no es posible definir su he
rencia mediante el dibujo de genealogas y el mareaje de las per
sonas que las tienen. El anlisis mendeliano requiere caracteres
dictomos que se tienen o no. La controversia sigui, en ocasio
nes acalorada, entre mendelianos y biometras hasta 1918. En ese
ao R. A. Fisher public un artculo de gran influencia que de
mostr que los caracteres regidos por un gran nmero de factores
mendelianos independientes (caracteres polignicos) mostraran
con precisin la naturaleza continua, la variacin cuantitativa y
las correlaciones familiares descritas por los biometras. Ms ade
lante Falconer ampli este modelo para incluir los caracteres di
ctomos. Los anlisis de Fisher y de Falconer crearon la base
terica unificada para la gentica humana. Las secciones siguien
tes exponen sus ideas, en una forma no matemtica. Puede en
contrarse una descripcin ms rigurosa en cualquier libro de texto
de gentica cuantitativa, por ejemplo Falconer y Mackay, 1996
(vase lecturas adicionales).
112
CAPTULO CUATRO
r
U n cig o to
C a m b io
g e n tic o
Fusin o
intercam bio
d e clulas
D o s c ig o to s
Fig. 4-10. Mosaicos y quimeras.

Los mosaicos tienen dos o ms lneas celulares genticamente distintas de un cigoto nico. El cambio gentico indicado puede ser una mutacin
gnica, un cambio crom osom ico numrico o estructural o, en el caso especial de lionizacin, inactivacin de X. Una quimera deriva de dos cigotos,
que suelen ser normales pero genticamente distintos.
4.4.2 Teora polignica de los caracteres cuantitativos

Cualquier carcter variable que depende de la accin aditiva de un
gran nmero de causas independientes individualmente pequeas
mostrar una distribucin normal (gausiana) en la poblacin. La
figura 4-11 presenta una ilustracin muy simplificada de este he
cho. Se supone que el carcter depende de alelos en un solo locus,
despus dos locus y a continuacin tres. Conforme ms locus se in
cluyen, se observan dos consecuencias:
la relacin simple uno a uno entre genotipo y fenotipo desapa
rece. Excepto por los fenotipos extremos, no es posible deducir
el genotipo a partir del fenotipo;
a medida que el nmero de locus aumenta, la distribucin se
ve cada vez ms como una curva gausiana. La adicin de una
variacin ambiental pequea aplanara la distribucin de tres
locus hacia una buena curva gausiana.
Un concepto ms complicado, que comprende dominancia y fre
cuencias de gen variables, conduce a las mismas conclusiones. Co
mo los familiares comparten genes, sus fenotipos se correlacionan
y el artculo de Fisher de 1918 predijo el tamao de la correlacin
para diferentes relaciones.
Una caracterstica muy mal entendida, tanto de los datos biomtricos como de la teora polignica, es la regresin a la media.
Slo como ejemplo imagnese que la variacin en el IQ estuviera
determinada de modo gentico por completo. La figura 4-12 mues
tra cmo en el modelo simplificado de dos locus, para cada clase de

madres, el IQ promedio de sus nios se encuentra a la mitad del va
lor de la madre y la media de la poblacin. Esta es la regresin a la
media -pero con frecuencia sus implicaciones se interpretan de
modo errneo (vase recuadro 4-3). Sin embargo, en este modelo
simple cabe sealar una suposicin oculta: que hay un apareamien
to aleatorio. Para cada clase de madres se asume que el IQ prome
dio de sus esposos es de 100. Por tanto el IQ promedio del nio es
la mitad del IQ parental, como lo sugerira el sentido comn. En
el mundo real mujeres muy inteligentes tienden a casarse con varo
nes de inteligencia mayor que el promedio (apareamiento concor
dante) y no cabra esperar la regresin a la mitad de la media de la
poblacin, inclusive si el IQ fuera un carcter gentico puro.
Una segunda suposicin del modelo simplificado es que no hay
dominancia: cada fenotipo de la persona es la suma de la contribu
cin de cada alelo a cada locus importante. Si se introduce la domi
nancia, alelos dominantes e invisibles en su fenotipo ocultaran el
efecto de algunos de los genes de un padre, pero an as pueden
transmitirse y afectar el fenotipo del nio. Si se toma en cuenta la
dominancia, la expectativa para el nio ya no es el valor medio pa
rental. La mejor suposicin respecto al efecto fenotpico probable de
alelos recesivos ocultos se obtiene buscando en el resto de la pobla
cin. Por consiguiente el fenotipo esperado del nio se mostrara a
partir del valor medio parental hacia una media de la poblacin. La
cuanta del desplazamiento depende de qu tan importante es la do
minancia para determinar el fenotipo.
4.4 GENTICA DE CARACTERES MLTIFACTORIALES: TEORA DEL UMBRAL. POLIGNICO
A) U n lo c u s
113
Aa
B) D o s locus
A A bb
A aB b
aaB B
A abb
aa B b
AABb
A aB B
aabb
i
70
C) Tres lo c u s
A A bbcc
A aB b c c
A ab b C c
aa B b C c
aa b b C C
aaB B cc
A A B bcc
A A bbC c
A aB bC c
A ab b C C
A aB B cc
aag B C c
aaBbCC
70
80
i.
90
..
i
100
. ___ i__ .. i__

110
120
130
D) M u c h o s locus
A A B B cc
A A B bC c
A A bbC C
A aB B C C
A aB bC C
aaB B C C
A abbcc
aa B b cc
aab b C c
a a b b cc
___L.......
80
AABB
AAB B C C
A A B bC C
A aB B C C
... i __ __ ! ... - __ i ... .... i....

90
100
110
120
AABBCC
130
Fig. 4-11. Aproximacin sucesiva a una distribucin gausiana.

Las grficas muestran la distribucin poblacional de un carcter hipottico que tiene un valor medio de 100 unidades. El carcter est determinado por
los efectos aditivos (codominantes) del alelo. Cada alelo del caso superior contribuye con cinco unidades al valor y cada alelo del caso inferior resta
cinco unidades. Todas las frecuencias de alelo son 0.5. A) El carcter est determinado por un locus aislado; B) dos locus; C) tres locus: la adicin de
una cantidad menor de variacin aleatoria" (ambiental o polignica) produce una curva Gaussiana D).
La herencia es la proporcin de varianza debida a efectos

genticos aditivos
Las curvas gaussianas slo se especifican por dos parmetros, la
media y la varianza (o la desviacin estndar, que es la raz cua
drada de la varianza). Las varianzas tienen la propiedad til de
ser aditivas cuando se deben a causas independientes (recuadro
4-4). Por consiguiente la varianza total del fenotipo Vp es la su
ma de las varianzas que se deben a las causas individuales de va
riacin: la varianza ambiental VEy la varianza VG genrica. Esta
ltima puede descomponerse a su vez en una varianza V\ debida
a efectos genticos aditivos simples y un trmino VD extra debi
do a efectos de dominancia. La heredabilidad (h2) de un carc
ter es la proporcin de la varianza total que es gentica, es decir
Vg/Vp. Para los criadores de animales que se interesan en aparear
vacas con producciones altas de leche sta es una medida impor
tante de la forma en que un programa de apareamiento puede
crear un ganado en el que el animal promedio se asemeja al me
jor del momento. En sentido estricto, Vg/Vp es la heredabilidad
amplia. Puesto que la varianza de dominancia no puede fijarse
por apareamiento, la respuesta de seleccin est determinada por
la heredabilidad estrecha, VAI Vp. A menudo las heredabilidades
de caracteres humanos se estiman como parte de los anlisis de
segregacin (vase seccin 15.2 y cuadro 15.4). Sin embargo, de
be recordarse que para muchos caracteres conductuales humanos
no es aplicable la divisin simple de la varianza en componentes

ambiental y gentico. Los padres proporcionan a sus hijos tanto
sus genes como su ambiente. La desventaja gentica y la desven
taja social tienden a ir juntas, de modo que los factores genticos
y ambientales se correlacionan con frecuencia. Si estos dos no
son independientes, V> no es igual a Vq + Vg; hay varianzas de
interaccin adicionales. Una proliferacin de varianzas puede re
ducir con rapidez la potencia explicativa de los modelos y en ge
neral es un rea difcil de trabajar.
A menudo el trmino heredabilidad se comprende mal. La
heredabilidad es muy diferente de la modalidad de herencia (autosmica dominante, polignica, etc.). La modalidad de herencia es
una propiedad fija de un carcter, pero la herencia no. La hereda
bilidad del IQ es la abreviatura para heredabilidad de variaciones
en IQ. Contrastan las dos preguntas:
hasta q u grado es gen tico e l IQ? sta es una pregunta sin
sentido;
qu tanto de la diferencia en el IQ entre personas en un pas y un
tiempo particulares se debe a sus diferencias genticas y qu tanto
a sus distintos am bientes e historias de vida? sta es una pregun
ta importante aunque difcil de responder.
La heredabilidad del IQ (CI) vara en diferentes circunstancias so
ciales. Cuanto ms igual es una sociedad, ms alta debe ser la here-
114
O CUA! RO
80 90 100 110 120

D e s c e n d e n c ia d e s p u s
d e a p a re a m ie n to a le a to rio
80 90 1 0 0 1 1 0 1 2 0
80 90 1 0 0 1 1 0 1 2 0
80 90 100 110 120
80 90 100 1 1 0 1 2 0
80 90 100 110 120
D istrib u ci n e n tre nios
I I
80 90 1 0 0 1 1 0 1 2 0
Fig. 4-12. Regresin a la media.

El mismo carcter de la figura 4 -1 1B: media 100, determinado por alelos codominantes A, a, B y b en dos locus, todas frecuencias gnicas = 0.5.
Arriba: distribucin en una serie de madres. En medio: distribucin en nios de cada clase de madres, asumiendo apareamiento aleatorio. Abajo:
distribucin sumada en los nios. N tese que: a) la distribucin en los nios es la misma que la distribucin en las madres; b) para cada clase de
madre, la media para sus nios es la equidistante entre el valor de la madre y la media en la poblacin (100), y c) para cada clase de nios (abajo),
la media para sus madres es equidistante entre el valor en los nios y la media poblacional.
Recuadro 4-3. Dos conceptos errneos frecuentes respecto a la regresin a la media

1) Despus de unas cuantas generaciones, todas las personas sern
exactamente guales.
2) SI un carcter muestra regresin a la media, debe ser gentico.
La figura 4-12 muestra que el primero de estos conceptos es errneo.
En un modelo gentico simple:
la distribucin total es la misma en cada generacin;
la regresin funciona en ambos caminos: para cada clase de nios, el
promedio para sus madres es equidistante entre el valor de los nios y
la media de la poblacin. Aunque puede parecer paradjico, suele con
firm arse mediante la inspeccin, por ejemplo, de la columna del lado
derecho en la parte inferior del histograma de la figura 4-12 (nios con
IQ de 120). Una cuarta parte de sus madres tiene un IQ de 120, la mitad
1 1 0 y una cuarta parte 100, lo que da un promedio de 1 1 0 .
Sin considerar la segunda de estas creencias, la regresin a la media no

es un mecanismo gentico sino un fenmeno estadstico puro. Sea que
los determinantes de IQ sean genticos, ambientales, o cualquier com
binacin de ambos, si se toma un grupo excepcional de madres (p. ej.,
las que tienen un IQ de 120), entonces estas madres deben haber tenido
un juego excepcional de determinantes. Si se considera un segundo
grupo que comparte la mitad de esos determinantes (sus nios, her
manos o incluso sus padres), el fenotipo promedio en este segundo
grupo se desviar de la media de la poblacin pero cuando mucho la
mitad. La gentica proporciona la cifra de una mitad, pero no el principio
de regresin.
4.4
GENTICA DE CARACTERES MULTIFACTORIALES: TEORA DEL UMBRAL POLIGNICO
115
Recuadro 4-4. Particin de varianza

Varianza de fenotipo ( / P) = varianza gentica (t/G) + varianza ambientai
V? ~
(V
Heredabilidad (amplia) = V ^V ?
yG = varianza por efectos genticos aditivos (l/A) + varianza por efectos

dominantes (l/D)
Heredabilldad (reducida) = iy i/p
dabilidad del IQ. Si todas las personas tienen iguales oportunida

des se eliminan varias de las diferencias ambientales entre las perso
nas. En consecuencia, ms de las diferencias restantes en el IQ se
debern a las diferencias genticas entre las personas.
4.4.3 Teora polignica de caracteres discontinuos

La mayor parte de los caracteres polignicos clsicos continua
mente variables, como estatura y peso, tiene poco inters para los
genetistas mdicos (aunque se discute la obesidad; seccin 15.6.8).
Resultan mucho ms interesantes las innumerables enfermedades y
malformaciones que tienden a presentarse en familias, pero que no
muestran patrones de genealoga mendeliana. Una elemento con
ceptual importante en la gentica no mendeliana la proporcion la
extensin de Falconer de la teora polignica a caracteres dictomos
o discontinuos (los que una persona tiene o no).
Falconer postul una susceptibilidad subyacente continuamente
variable. Puede tenerse o no un paladar hendido, pero cada embrin
posee una cierta susceptibilidad a paladar hendido, que puede ser al
ta o baja; es polignica y sigue una distribucin gausiana en la pobla
cin. Aunada a la susceptibilidad polignica, Falconer postul la
existencia de un umbral. Los embriones cuya susceptibilidad excede
un valor umbral crtico desarrollan paladar hendido; aquellos cuya
susceptiblidad es menor del umbral no tienen paladar hendido, inclu-
Fig. 4-13. Determinacin multifactorial de una enfermedad o malfor

macin.
Los ngeles y los demonios pueden representar cualquier combinacin
de factores genticos y ambientales. La adicin de un demonio o la
supresin de un ngel puede inclinar la balanza, sin que ese factor par
ticular sea la causa de la enfermedad. Cortesa del profesor R. S. W.
Smithells.
+ Vi
sive si slo es un poco menor. Despojado de sutileza matemtica el

modelo puede representarse como en la figura 4-13. El umbral puede
imaginarse como el punto neutro de la balanza. El cambio del equili
brio de los factores inclina el fenotipo en un sentido o en el otro.
En el paladar hendido, parecer ser intuitivamente razonable un
modelo de umbral polignico (Fraser, 1980). Todos los embriones
comienzan con un paladar hendido. Durante el desarrollo tempra
no, los entrepaos palatinos deben tornarse horizontales y fusio
narse entre s. Es necesario que esto ocurra dentro de una ventana
de tiempo especfica del desarrollo. Muchos factores genticos y
ambientales diferentes influyen en el desarrollo embrionario, de
manera que parece razonable que la susceptibilidad deba ser poli
gnica. No es importante si los entrepaos palatinos se encuen
tran y fusionan con un tiempo de ahorro suficiente o que slo se
fusionen a tiempo: si se fusionan, se forma un paladar normal y
si no lo hacen, entonces resulta un paladar hendido. Por tanto hay
un umbral natural superpuesto en un proceso continuamente va
riable.
La teora del umbral de Falconer ayuda a explicar la forma en
que los riesgos de recurrencia varan en familias. Las personas afec
tadas deben tener una combinacin desafortunada de alelos con
susceptibilidad alta. Sus familiares que comparten genes con ellos
tambin tendrn, en promedio, mayor susceptibilidad segn la di
vergencia de la media de la poblacin en la proporcin de genes
compartidos. Por consiguiente los caracteres del umbral polignico
tienden a presentarse en familias (fig. 4-14). Es posible que los pa
dres con varios nios afectados hayan tenido mala suerte, pero en
promedio tendrn ms alelos de riesgo alto que los padres que slo
tienen un nio afectado. El umbral es fijo, pero la susceptibilidad
promedio, y en consecuencia el riesgo de recurrencia, aumenta con
un nmero cada vez mayor de nios afectados.
Muchos supuestos padecimientos de umbral tienen diferentes
incidencias en los dos sexos. Esto implica umbrales especficos de
sexo. Por ejemplo, la estenosis pilrica congnita es cinco veces ms
frecuente en nios. El umbral debe ser ms alto para nias que pa
ra los nios y, por tanto, los familiares de una nia afectada tienen
una susceptibilidad promedio ms alta que los familiares de un ni
o afectado (fig. 4-15). El riesgo de recurrencia es de manera co
rrespondiente ms alto, aunque en cada caso el riesgo de que se
afecte un hijo es cinco veces ms alto si es varn (cuadro. 4-1).
4.4.4 La asesora en padecimientos no mendelianos

utiliza los riesgos empricos
En la asesora gentica para padecimientos no mendelianos los ries
gos no se derivan de la teora polignica; son riesgos empricos que
se obtienen mediante encuestas en la poblacin, como los que se
muestran en el cuadro 4-1. Esto es en esencia distinto de los pade
cimientos mendelianos, en los que los riesgos uno en dos, uno en
cuatro, etc., provienen de la teora. El efecto del antecedente fami-
116
CAPTULO CUATRO
Distribucin del riesgo en

la poblacin general
D istrib u ci n d e l riesgo
en la p o b la c i n g e n e ra l
Distribucin del riesgo en los

hermanos de nios afectados
Distribucin de! riesgo en hermanos

U m b ra l
de la persona afectada
In d e m n e n ^ A fe c ta d o -
Distribucin del riesgo en los

hermanos de nias afectadas
R ies g o
bajo
R ie s g o p ro m e d io
en la p o b la c i n
g e n e ra l
R ie s g o p ro m e d io
en tre h e rm a n o s d e
p e rs o n a s a fe c ta d a s
Um brales especficos de sexo

Nios
Nios
R ies g o
alto
Riesgo m e d io para:
p o b la ci n g e n e ra l------he rm a nos de
n io s afectad os
he rm a nos de
nias afectadas
Fig. 4-14. Modelo de umbral polignico de Falconer para caracteres

dictomos no mendelianos.
El riesgo para el padecimiento es polignico y distribuido normalmente
(curva verde). Las personas cuyo riesgo es mayor de un cierto valor
umbral (el punto de equilibrio en la figura 4-13) estn afectadas. Sus
hermanos (curva de color lila) tienen un riesgo promedio ms alto que
el promedio de la poblacin y una proporcin mayor de ellos posee un
riesgo que excede el umbral. Por consiguiente el padecimiento tiende a
presentarse en familias.
liar tambin es muy distinto. Si los dos miembros de una pareja son
portadores de fibrosis qustica, el riesgo de que su prximo nio se
afecte es de uno en cuatro. Lo anterior es cierto sin considerar
cuntos nios afectados o normales hayan tenido ya (el azar no tie
ne memoria). Si tienen un nio con un defecto del tubo neural, el
riesgo de recurrencia es alrededor de 1 en 25 en el Reino Unido,
pero si ya tienen dos nios afectados, el riesgo de recurrencia se
aproxima a uno en dos (que quiz pueda resumirse como a l de
be concedrsele). La procreacin de un segundo nio afectado no
es la causa del incremento de su riesgo de recurrencia, sino que per
miti reconocerlos como una pareja que siempre haba tenido un
riesgo en particular alto. Aunque un cnico dira que esto implica
que el asesor es muy astuto despus del acontecimiento, la prctica
concuerda tanto con el conocimiento basado en la teora del um
bral como con los datos epidemiolgicos, y representa lo mejor que
puede ofrecerse en un estado de conocimientos imperfecto.
Fig. 4-15. Carcter polignico con umbrales especficos de sexo.

Si un carcter dctomo no mendeliano afecta a varones de manera
predominante, ste corresponde a la teora del umbral multifactorial,
que postula un umbral ms bajo para varones que mujeres. Se deduce
que los riesgos de recurrencia son ms altos para familiares de
mujeres afectadas, pero la mayora de estos casos recurrentes la
constituirn varones. Vase cuadro 4-1 para un ejemplo de datos que
se ajustan a esta interpretacin.
4.5
Factores que afectan las frecuencias

gnicas
4.5.1 Es posible que las frecuencias gnicas y las

frecuencias de genotipo establezcan una relacin
simple
Un experimento meditado: escoger genes del fondo comn
gnico
En una poblacin completa debe haber muchos alelos diferentes en
un locus particular, aunque cada persona tiene slo dos alelos, que
Riesgos de recurrencia de estenosis pilrica.

Familiares de
Hijos
Hijas
Hermanos
Hermanas
Hijos de pacientes masculinos
19/296
7/274
5/230
5/242
(6.42%)
(2.55%)
(2.17%)
(2.07%)
14/61
7/62
11/01
9/101
(22.95%)
(11.48%)
(10.89%)
(8.91%)
Hijos de pacientes femeninos
Aunque ms nios que nias estn afectados, el riesgo de recurrencia es ms alto para familiares de una nia afectada. Los datos se ajustan a un
modelo de umbral polignico con umbrales especficos de sexo (fig. 4-15). Datos de Fuhrmann y Vogel (1976).
4.5 1 FACTORES QUE AFECTAN LAS FRECUENCIAS GNICASJ
pueden ser idnticos o diferentes. Es posible imaginar un fondo

comn gnico, que consiste en todos los alelos en el locus A en la
poblacin. La frecuencia gnica del alelo Aj es la proporcin de
todos los alelos A en el fondo comn gnico que son A i. Consid
rense dos alelos, Aj y A2 en el locus A. Asmase que sus frecuencias
gnicas sean p y q respectivamente (p y q estn, cada una, entre 0
v i ) . Llvese a cabo un experimento meditado:
eljase al azar un alelo del fondo comn gnico. Hay una posi
bilidad de que p sea Aj y una de que q sea A2;
seleccinese un segundo alelo al azar. Una vez ms la posibili
dad de seleccionar A, es p y la posibilidad de elegir A2 es q (se
supone que el fondo comn gnico es suficientemente grande
para que la eliminacin del primer alelo no cambie de manera
significativa las frecuencias gnicas en el fondo comn restan
te). Se deduce que:
la posibilidad de que ambos alelos fueran Aj es p2;
la posibilidad de que ambos alelos fueran A2 es q ;
la posibilidad de que el primer alelo fuera At y el segundo A2
es pq. La posibilidad de que el primero fuera A2 y el segun
do A[ es qp. En total, la posibilidad de seleccionar un alelo
Aj y uno A2 es 2pq.
Distribucin de Hardy-Weinberg
La eleccin al azar de una persona de la poblacin equivale a selec
cionar en forma aleatoria dos genes del fondo comn gnico. La
posibilidad de que la personas sea AjA es p2, la de que sea AjA2 es
2pq y la de que sea A2A2 es q2. Esta relacin simple entre las fre
cuencias gnicas y las frecuencias de genotipo (la distribucin de
Hardy-Weinberg, vase recuadro 4-5) es aplicable siempre que se
extraen del fondo comn gnico dos genes de una persona de ma
nera independiente y al azar. Es posible que Ai y A2 sean los ni
cos alelos en el locus (en cuyo caso p + q = 1) o que haya otros
alelos y otros genotipos (p + q < 1). Para locus ligados a X, los va
rones, siendo hemicigotos (slo un alelo), son A! o A2 con frecuen
cias p y q respectivamente, en tanto que las mujeres pueden ser
AjAj, AjA2 o A2A2 (vase recuadro 4-5).
Limitaciones de la distribucin de Hardy-Weinberg

Estos clculos simples se descomponen si no se sigue la suposicin
subyacente de que los dos genes de una persona se captaron de ma
nera independiente del fondo comn gnico. En particular es un
problema si no ha habido apareamiento aleatorio. El apareamiento
concordante puede tomar varias formas, pero la ms importante
suele ser la endogmica. Si una persona se casa con un familiar, lo
hace con alguien cuyos genes se parecen a los de ella. Este hecho
aumenta la posibilidad de que los nios sean homocigotos y dismi
nuye la de que sean heterocigotos. Los padecimientos recesivos ra
117
ros se relacionan de manera firme con consanguinidad parental y

los clculos de Hardy-Weinberg que lo ignoren estimarn en exce
so la frecuencia de portador en la poblacin en conjunto.
Uso de la distribucin de Hardy-Weinberg en asesora gentica

Las frecuencias gnicas o las de genotipo constituyen informacin
esencial en muchas formas de anlisis genticos, como el anlisis de
enlace (seccin 13.3) y el anlisis de segregacin (seccin 15.2), y
tienen importancia particular en el clculo de los riesgos genticos.
El recuadro 4-6 presenta algunos ejemplos.
4,5.2 Las frecuencias de genotipo pueden utilizarse (con

cautela) a fin de calcular los ndices de mutacin
Los genes mutantes se crean por mutaciones nuevas y se eliminan
por seleccin natural (recuadro 11-2). Para un nivel determinado
de seleccin es posible calcular el ndice de mutacin que se reque
rira para reemplazar dos genes que se perdieron por seleccin. Si se
supone que la poblacin presenta un equilibrio entre las tasas de
prdida y de restitucin, el clculo indica el ndice de mutacin que
existe. Es posible definir el coeficiente de seleccin (s) como la
posibilidad relativa de fracaso de la reproduccin de un genotipo
debido a seleccin (el tipo ms idneo en la poblacin tiene s = 0 ,
un letal gentico tiene s = 1).
Para un padecimiento autosmico recesivo una proporcin q
de la poblacin est afectada. La prdida de los genes de enfer
medad de cada generacin es sq . Esto se equilibra por la muta
cin al ndice de p.(l q ) en la que p. es el ndice de mutacin
por gen por generacin. En equilibrio sq^ = (x(l q) o alrede
dor de (si q es pequea) p, = sq2.
Para un padecimiento autosmico dominante raro los homocigotos son en extremo raros. Los heterocigotos ocurren con
una frecuencia 2 pq (frecuencia del gen de enfermedad = p).
Slo una mitad de los genes que se perdieron a travs de su fra
caso reproductivo es el alelo de la enfermedad, por lo que el n
dice de prdida gentica es muy cercano a sp. Una vez ms esto
se equilibra mediante un ndice de nuevas mutaciones de p.q",
que se aproxima a p, si q es casi 1. Por consiguiente, p, = sp.
Para una enfermedad recesiva ligada a X el ndice de prdida
gnica a travs de varones afectados es sq, lo que se equilibra
por una tasa de mutacin 3p. ya que todos los cromosomas X
en la poblacin estn disponibles para mutacin, pero slo un
tercio de los cromosomas X que se encuentran en varones est
expuesto a seleccin. Por consiguiente, p, = sq/3.
Estos resultados se resumen en el recuadro 4-7. Las estimaciones
derivadas de su empleo pueden compararse con la expectativa ge
neral, de estudios en muchos organismos, de que los ndices de mu
tacin suelen ser 10 5 a 10 ' por gen por generacin.
Recuadro 4-5. Frecuencias de genotipo de equilibrio de Hardy-Weinberg para frecuencias de alelo p ^ ) y q(Az)
Locus autosmico
Genotipo
Frecuencia
P2
Locus ligado a X
Varones
Mujeres
A ,A 2
A2A2
Ai
A2
A1A1
A,A 2
2pq
q2
p2
2pq
Ntese que estas frecuencias de genotipos se observarn sea o no que A, o A2 sean los nicos alelos en el locus.
A2A2
i?
118
CAPTULO CUATRO
Recuadro 4-6. La distribucin de Hardy-Weinberg puede utilizarse (con cautela) para calcular frecuencias
de portador y riesgos sim ples con fines de asesoram iento
Un padecimiento autosmico recesivo afecta a 1 recin nacido en 10 000.
Cul es la frecuencia esperada de portadores?
Fenotipos:
No afectado
(el riesgo de portador del padre) x (el riesgo de portador de la nueva

esposa) x 1/4 = 1 x 1/50 x 1/4
1/200
Afectado
Esto asume que no hay un antecedente familiar de la misma enfermedad

en la familia de la nueva esposa.
Genotipos:
AA
Aa
aa
Frecuencias:
p2
2pq
p2 = 1/10 000
La ceguera a los colores rojo y verde ligada a X afecta a 1 de 12

varones britnicos. Qu proporcin de mujeres sern portadoras y
qu proporcin estarn afectadas?
q2 es 1 0 " 4 y por tanto q = 10 "2 o 1/ 100.

1 en 100 genes en el locus A son a, 99/100 son A.
La frecuencia de portador, 2pq, es 2 x 99/100 x 1/100, muy cerca de
1 en 50. Esto supone que la frecuencia del padecimiento no aument por
endogamia.
Varones
Mujeres
Genotipos:
Ai
A2
A1A1
A1A2
A2A2
Si un padre de un nio afectado con los padecimientos anteriores se

casa de nuevo, cul es el riesgo de que procree un nio afectado en
el nuevo matrimonio?
Frecuencias:
q = 1/12
p2
2pq
q2
q = 1 / 1 2 , por tanto p = 11/12
Para tener un nio afectado, ambos padres deben ser portadores y el

riesgo entonces es de uno en cuatro. Por consiguiente el riesgo total es:
2 pq = 2 x 1/12 x 11/12 = 22/144

q2 = 1 en 144. En consecuencia este modelo de locus nico predice que
15% de las mujeres ser portador y 0.7% estar afectado.
R ecuadro 4-7. Equilibrio entre mutacin y seleccin

Padecimiento autosmico recesivo*
ix = sq2
ijl = F(1 f)
Padecimiento autosmico dominante
= sp
p. = 1/2F(1 - f )
|x = sq/3
ix = 1/3F(1 - f)
Padecimiento recesivo ligado a X
ix = ndice de mutacin por gen por generacin

p,q = frecuencias gnicas
s = coeficiente de seleccin
f = idoneidad biolgica = 1 - s
F = frecuencia del padecimiento en la poblacin
*Esta frmula proporciona un estimado muy errneo del ndice de mutacin si hay ventaja del heterocigoto, vase recuadro 4-8.
4.5.3 La ventaja del heterocigoto puede ser mucho

ms importante que la mutacin recurrente para
determinar la frecuencia de una enfermedad
recesiva
La frmula p, = sq2 proporciona una tasa de mutacin inesperada
mente alta para algunos padecimientos autosmicos recesivos; por
ejemplo, la fibrosis qustica (FQ). Hasta fecha muy reciente, casi
nadie con FQ viva el tiempo suficiente para reproducirse y por
tanto s = 1. La FQ afecta a alrededor de 1 nacimiento en 2 000 en
el Reino Unido. En consecuencia, q2 = 1/2 000 y la frmula da
p, = 5 X 10 4, que sera un ndice de mutacin muy alto para
cualquier gen -aunque las pruebas indican que las mutaciones nue
vas de FQson muy raras. Lo anterior se deduce de la distribucin
tnica desigual de la FQ y la existencia de un desequilibrio de en
lace potente (seccin 13.5.2).
El factor perdido es la ventaja del heterocigoto. Los portado
res de FQ tienen, o tuvieron, cierta ventaja en la reproduccin so
bre los homocigotos normales. An se discute cul puede ser esta
ventaja. Puesto que el gen de FQ codifica un canal de cloruro en la
membrana que se requiere para que Salmonella typhi penetre a las

clulas epiteliales, es probable que los heterocigotos sean hasta cier
to punto resistentes a la fiebre tifoidea (Pier y cois., 1998). Cual
quiera que sea la causa de la ventaja del heterocigoto, si Sj y S2 son
los coeficientes de seleccin contra los genotipos AA y aa respecti
vamente, entonces el equilibrio se establece (ignorando la mutacin
recurrente) cuando la relacin de las frecuencias gnicas de A y a,
p/q, es s2/sj. El recuadro 4-8 ilustra el clculo para la fibrosis qus
tica y muestra que una ventaja del heterocigoto muy pequea para
observarse en encuestas poblacionales puede tener un efecto mayor
en las frecuencias gnicas.
Merece la pena recordar que las enfermedades mendelianas con
importancia en medicina son tanto frecuentes como graves. Todas
tambin deben tener algn truco especial para permanecer comu
nes ante la seleccin. El truco puede ser un ndice de mutacin en
extremo alto (distrofia muscular de Duchenne), la propagacin de
premutaciones no patolgicas (X frgil) o el inicio de sntomas des
pus de la edad de la reproduccin (enfermedad de Huntington);
no obstante, para padecimientos recesivos importantes ms a me
nudo es la ventaja del heterocigoto.
4.5 ! FACTORES QUE AFECTAN LAS FRECUENCIAS GNICAS
119
Recuadro 4-8. Seleccin en favor de heterocigotos para fibrosis qustica (FQ)

Para FQ, la frecuencia de enfermedad en el Reino Unido se aproxima a 1
en 2 000 nacimientos
Fenotipos:
No afectados
Afectados
Genotipos:
AA
Aa
aa
Frecuencias:
p2
2pq
q2 = 1/2 000
q2 es 5 x 10 4, por consiguiente q = 0.022 y p = 1 - q = 0.978

p/q = 0.978/0.022 = 43.73 = s2/s,
Si s2 = 1 (los homocigotos afectados nunca se reproducen), s, = 0.023
La frecuencia del gen de FQ presente se mantendr, inclusive sin muta
ciones nuevas, si los heterocigotos Aa tienen en promedio 2.3% ms
nios sobrevivientes que los homocigotos AA.
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CAPTULO
CINCO
Amplificacin del DNA: clonacin de

DNA por PCR y basada en clulas
122
5.1
CAPTULO CINCO
AMPLIFICACIN DEL DNA: CLONACIN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CLULAS
Im po rtancia de la clonacin
del DNA
Los fundamentos de la tecnologa actual del DNA se basan de mo

do muy amplio en dos conductas bastante diferentes para estudiar
secuencias especficas de DNA dentro de una poblacin de DNA
complejo (vase fig. 5-1):
Clonacin de DNA. Deben amplificarse d e form a selectiva la
secuencia o el fragmento elegido de DNA para producir un
gran nmero de copias idnticas y el resultado es la purifica
cin del producto deseado. A continuacin es posible estudiar
en extenso su estructura y funcin.
Hibridacin molecular. No se amplifica ni purifica en ningu
na forma el fragmento de inters; por el contrario, se detecta de
modo especfico dentro de una compleja mezcla de muchas se
cuencias diferentes.
Antes de la clonacin del DNA, el conocimiento sobre este ltimo
era en extremo limitado. La tecnologa de clonacin del DNA
cambi todo lo anterior y revolucion el estudio de la gentica. Pa
ra comprender por qu sucedi as, deben reconocerse el tamao
y la complejidad enormes de las secuencias de DNA (comparadas,
por ejemplo, con las secuencias de protenas). Las molculas indi
viduales de DNA nuclear contienen cientos de millones de nucletidos. Cuando se asla DNA de las clulas mediante mtodos
estndar, estas molculas enormes se fragmentan por accin de
fuerzas de desgarro, lo cual crea mezclas complejas de fragmentos
de DNA an muy grandes (50 a 100 kb de largo).
Si se toma en cuenta la complejidad del DNA aislado de clu
las eucariticas tpicas o incluso una procariota, el desafo fue la for
ma de analizarlo. Se requera cierto mtodo de fraccionamiento del
DNA de tal manera que pudieran purificarse las diferentes subpoblaciones de secuencias del DNA. En muchas eucariotas, un mto
do inicial consisti en separar distintas poblaciones de secuencias
de DNA mediante centrifugacin. La ultracentrifligacin en gra
dientes de densidad de equilibrio (p. ej., gradientes de densidad
CsCl) fracciona de forma caracterstica el DNA de una clula eucariota en una banda mayor (la m asa d e DNA) y varias bandas me
nores. Las densidades boyantes de las bandas menores de DNA
difieren de la masa de DNA (y entre s) porque estn formadas por
secuencias de DNA sa tlite de repeticin tndem, cuya composi
cin de bases es diferente en grado notorio de la masa de DNA. Se
encontr que las secuencias de DNA satlite participan en aspectos
especficos de la estructura y funcin de los cromosomas. Aunque
de valor e inters, los DNA satlite purificados fueron un compo
nente menor del genoma y no contienen genes. La clonacin d el
DNA ofreca un m todo general para pu rificar y estudiar cualquier se
cuencia de DNA?
La clonacin de DNA exige la amplificacin selectiva de un
componente especfico de DNA (el DNA blanco) que ocurre den
tro de una poblacin de DNA inicial grande y compleja, que pue
de ser el DNA genmico total dentro de un tejido particular (o el
tipo de clula) o DNA co m p lem en ta rio (cDNA) preparado a par
tir del RNA total de un tejido particular. La amplificacin se logra
mediante una polimerasa de DNA y puede llevarse a cabo in vitro
o dentro de las clulas.
Clonacin del DNA in vitro

En este caso se selecciona el DNA blanco deseado mediante ceba
dores (oligonucletidos iniciadores) que se enlazan de modo espe
cfico a esta secuencia. Una vez que se enlazan al blanco los
P oblacin d e D N A com plejo,!
p. ej., D N A genm ico total,
cD N A total d e tejido, etc.
A m p lific a c i n espe cfica

(clonacin d e DNA)
C lo n a c i n d e
DNA basada
en c lu la s
.....................................
1. C lu la h u sp e d
a p ro p ia d a
2. R ep lic n
3. M e d io s d e fijaci n
d e D N A e x tra o al
rep lic n y tra n s fe re n c ia
a la c lu la h u sp e d
M to d o s g e n e ra le s p a ra
e s tu d ia r s e c u e n c ia s d e
D N A e s p e c fic a s
D e te c c i n
e s p e c fic a
M to d o s
H ib rid a c i n m o le c u la r
1. S o n d a m a rc a d a
de DNA o RNA
1. P o lim e ra s a d e
D N A te rm o e s ta b le
2. L a in fo rm aci n d e
s e c u e n c ia p e rm ite la
sntesis d e c e b a d o re s
o lig o n u c le tid o s
e s p ec fic o s
R eq u e rim ie n to s
es e n c ia le s
Fig. 5-1. Mtodos generales para el estudio de secuencias especficas de DNA en poblaciones de DNA complejas.
2. M edios para d etectar

fragm entos a los que
se en laza la sonda
5-2
aradores especficos de secuencia, una polimerasa de DNA ter- -estable puede crear copias adicionales de la secuencia objetivo.
Las nuevas copias del DNA blanco sirven a su vez como plantillas
rara elaborar ms copias an en una rea cci n en ca d en a que se de- : na reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas
ingls).
I : nacin del DNA basada en clulas

Se rijan las molculas blanco de DNA a un tipo aislado de molcu de replicn (que es capaz de replicar DNA d e manera indepenlum te dentro de una clula husped adecuada) y se transfieren a
clulas husped apropiadas. De manera tpica, las molculas hbri1^5 de blanco y replicn llevan a cabo muchas rondas de replica_
de DNA (a m p lifica ci n d e DNA), despus de las cuales
rueden separarse las molculas de DNA blanco amplificadas de
o:ro contenido celular y asimismo de las molculas del replicn. La
clave para la clonacin del DNA basado en clulas es que, cuando se
transfieren las diferentes molculas de blanco-replicn a las clulas
tra n sform a cin ), cada clula slo capta un tipo de molcula de
DNA blanco-replicn y de esa manera todos los descendientes d e la c
lula contienen exactamente e l mismo tipo de molculas blanco (clon a s
d e DNA). Al desarrollar un gran nmero de clulas a partir de una
colonia celular aislada es posible preparar poblaciones puras del
DNA blanco deseado.
PCR: c a ra c te rs tic a s y aplicaciones

bsicas
La PCR revolucion la gentica molecular al permitir la clonacin
y anlisis rpidos de DNA. Desde los primeros informes que descri
bieron esta nueva tecnologa a mediados de la dcada de 1980 se
utiliz en mltiples aplicaciones en investigacin bsica y clnica.
5.2.1 Principios de la PCR bsica y la PCR de

transcriptasa inversa (TI)
Seleccin del cido nucleico de inicio
Por lo general, la PCR est diseada para permitir la amplificacin
selectiva de una(s) secuencia(s) especfica(s) de DNA blanco dentro
de un conjunto heterogneo de secuencias de DNA. Con frecuen
cia, el DNA de inicio es DNA genmico total de un tejido particu
lar o clulas cultivadas, en cuyo caso el DNA blanco es casi siempre
una fraccin minscula del DNA de inicio. Por ejemplo, si se tiene
la intencin de amplificar el gen de globina (i de 1.6 kb del DNA
humano (el tamao del genoma haploide es de 3 300 Mb), la rela
cin blanco:DNA de inicio es 1.6 kb:3 300 Mb o 1:2 000 000.
Muchas PCR incluyen la amplificacin de blancos incluso ms pe
queos, como exones aislados con 140 pb en promedio, y por con
siguiente representan menos de 0.000005% de una poblacin de
inicio del DNA genmico humano.
En el caso de secuencias blanco de DNA codificante, muchas
veces el DNA de inicio puede ser cDNA total preparado al aislar
RNA de un tejido o una lnea celular adecuados y convertirlo a
continuacin en DNA con la enzima transcriptasa inversa (PCRTI). Segn sea la extensin a la cual se expresa la secuencia blanco
como transcritos en la poblacin original de RNA, puede haber un
enriquecimiento considerable de la secuencia blanco (cuando se
compara con su representacin en el DNA genmico). Sin embar
PCR: CARACTERSTICAS Y APLICACIONES BSICAS
123
go, bajo condiciones ptimas es posible utilizar en ocasiones la

PCR-TI para amplificar secuencias blanco de tejidos en los que s
lo hay un nivel de transcripcin basal.
Seleccin de cebadores (oligonucletidos iniciadores)

Con el fin de permitir la amplificacin selectiva es necesaria cier
ta informacin previa de la secuencia de DNA de las secuencias
blanco. Estos datos se utilizan para disear dos cebadores oligonu
cletidos (amplmeros), en condiciones ptimas de unos 18 a 25
nucletidos de largo, que son especficos para las secuencias que
flanquean a la secuencia blanco (es decir, sus secuencias de bases
estn representadas perfectamente en las secuencias que flanquean
la secuencia blanco).
En la mayor parte de las PCR, el objetivo es amplificarûna se
cuencia de DNA aislada y por lo tanto es importante reducir la po
sibilidad de que se enlacen los cebadores en otros sitios del DNA
que no sean los deseados. Por consiguiente, es esencial evitar se
cuencias repetidas de DNA y en el diseo del cebador es necesario
tomar en cuenta varias consideraciones:
composicin de bases. El contenido de GC debe ser de 40 a 60%
con una distribucin uniforme de los cuatro nucletidos.
temperatura de fusin ( Tm; vase seccin 6 .2.1 para su defini
cin). Los valores de Tm calculados para los dos cebadores usa
dos juntos no debe variar > 5C y la Tm del producto de
amplificacin no diferir de las de los cebadores > 10C.
secuencias terminales 3'. La secuencia 3' de un cebador no de
be ser una secuencia complementaria de ninguna regin del
otro cebador en la misma reaccin. Nota: es crtica la compa
tibilidad de bases correcta en el extremo 3' del cebador y pue
de emplearse para asegurar que incluso es posible amplificar un
alelo especfico pero no otros, lo que proporciona la base de la
PCR esp ecfica d e a lelo (vase recuadro 5-1).
secuencias autocomplementarias. Deben evitarse repeticiones in
vertidas o cualquier secuencia autocomplementaria > 3 pb de
largo.
El diseo del cebador se facilita mediante programas comercia
les de computacin y otros sin costo, como los disponibles en
http://www.hgmp.mrc.ac.uk/GenomeWeb/nucprimer.html
Naturaleza cclica y amplificacin exponencial

La PCR consiste en una serie de ciclos de tres reacciones sucesivas:
desn atu ra liz acin , que se ajusta a una temperatura de 93 a
95C para el DNA genmico humano.
tem p la m ien to d e l ceb a d o r (annealing), a temperaturas casi
siempre de 50 a 70C de acuerdo con la temperatura d e fusin
del dplex esperado (por lo regular la temperatura de templa
do se ajusta a unos 5C menos respecto de la temperatura de
fusin calculada).
sn tesis d e DNA, de manera caracterstica alrededor de 70 a
75C. La polimerasa de DNA empleada es termoestable (necesi
ta alargarse con eficiencia a 70 a 75C y no debe afectarse de
forma adversa por los pasos de la desnaturalizacin). Cuando
existen una polimerasa de DNA termoestable y precursores de
DNA adecuados (los cuatro trifosfatos de desoxinuclesido,
dATP, dCTP, dGTP y dTTP), los cebadores inician la sntesis de
nuevas cadenas de DNA que son complementarias a las cadenas
de DNA individuales del segmento de DNA blanco.
124 | CAPTULO CINCO
PCR especfica de alelo. Se design para am plificar una secuencia

de DNA al tiempo que excluye la posibilidad de am plificar otros ale
los. Se basa en la necesidad de una compatibilidad precisa de bases
entre el extremo 3 ' de un cebador de PCR y el DNA blanco. Vase la
figura 5-4.
PCR-ftlu. Es un mtodo de PCR en el que se usa un cebador espec
fico para la repeticin Alu, una secuencia que ocurre alrededor de una
vez cada 3 kb en el DNA humano. Cuando las repeticiones Alu conti
guas estn orientadas en direcciones opuestas, un tipo aislado de ce
bador Alu puede amplificar la secuencia intermedia (p. e cebadores
A o B en la figura A de este recuadro).
PCR anclada. Emplea un cebador especfico de secuencia y un ceba
dor universal para amplificar secuencias adyacentes a una secuencia
conocida. El cebador universal reconoce y se enlaza a una secuencia
comn que se aade de modo artificial a todas las molculas de DNA
diferentes en la poblacin de inicio, por ejemplo con la fijacin covalente de un enlazador oligonucletido de cadena doble.*
PCR de exhibicin diferencial. Una forma de PCR-TI para comparar
poblaciones de mRNA expresadas de dos fuentes relacionadas de c
lulas a fin de captar genes que se expresan de form a diferencial (va
se fig. 7-16).
PCR-DOP (PCR con cebador oligonucletido degenerado). Se em
plean de forma parcial cebadores oligonucletidos degenerados
(grupos de secuencias oligonucletidas que se sintetizan en paralelo
para que tengan la mism a base en ciertas posiciones de nucletidos,
en tanto que difieren en otras) para amplificar una variedad de DNA
blancos relacionados.
PCR de inicio por calor. Es un medio para incrementar la especifici
dad de una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El mezclado
de todos los reactivos de la PCR antes de un paso Inicial de desnatu
ralizacin por calor ofrece ms oportunidades para el enlace inespecfico de secuencias cebadoras. Con el fin de reducir esta posibilidad,
se separan de form a fsica uno o ms componentes de la PCR hasta
el primer paso de desnaturalizacin.
PCR inversa. Otra forma de acceso al DNA inmediatamente adyacen
te a una secuencia conocida (vase PCR anclada). En este caso se
digiere la poblacin de DNA de inicio con una nucleasa de restriccin,
se diluye a una concentracin baja de DNA y a continuacin se trata
con ligasa de DNA para fomentar la formacin de molculas de DNA
circular mediante ligadura intramolecular. Los cebadores de la PCR se
colocan de tal manera que se unen a una secuencia de DNA conoci
da y en seguida inician la sntesis del nuevo DNA en una direccin
que se aleja de la secuencia conocida y hacia la secuencia descono
cida adyacente, lo que posibilita la amplificacin de esta ltima. Va
se la figura B de este recuadro (X y Y son secuencias no
caracterizadas que flanquean una secuencia conocida).
PCR de rescate de Islote. Es un mtodo especializado para amplifi
car secuencias en islotes CpG.
PCR con cebador enlazador (PCR con adaptador de ligadura). Se
trata de una form a de am plificacin indiscrim inada. Se digiere un
compiejo de DNA de inicio con una nucleasa de restriccin para
producir mltiples tipos de fragmentos con el m ism o tipo de extre
mo saliente. Se liga a los fragmentos un enlazador oligonucletido
de doble cadena* de secuencia conocida y con extremos salientes
similares. A continuacin se lleva a cabo la PCR con cebadores que

son especficos para las secuencias enlazadoras a fin de am plificar
todos los fragmentos del DNA fuente flanqueados por molculas en
lazadoras.
PCR con cebador anidado. Es una forma de incrementar la especifi
cidad de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Se diluyen los
productos de una reaccin de amplificacin inicial y se emplean co
mo fuente de DNA de inicio para una segunda reaccin en la que se
usa un grupo de cebadores diferentes, que corresponde a secuencias
localizadas prximas, pero internas, a las empleadas en la primera
reaccin.
PCR cuantitativa. Vase PCR de tiempo real.
PCR-RACE. Es una forma de PCR con cebador anclado (vase an
tes) para la amplificacin rpida de extremos de cDNA (del ingls rapid am plificaron of cDNA ends) (vase fig. 7-12).
PCR de tiempo real. Es una variante de la PCR cuantitativa en la que

se usa un aparato termociclador de deteccin de fluorescencia para
amplificar secuencias especficas de cido nucleico y medir de ma
nera simultnea sus concentraciones. Tiene dos aplicaciones princi- j
pales en investigacin: a) cuantificar la expresin gnica (y confirmar
la expresin diferencial de genes detectados mediante anlisis de hi
bridacin de microarreglo); y b) seleccionar mutaciones y polim orfismos de nucletido nico. En laboratorios analticos tambin se
practica para medir la abundancia de secuencias de DNA o RNA en
muestras clnicas e industriales.
PCR-TI (PCR de transcriptasa inversa, del ingls reverse transcriptase). PCR en la que la poblacin de inicio es mRNA y en la
que se requiere un paso de transcriptasa inversa inicial para producir cDNA.
PCR touch-down. Es un medio para incrementar la especificidad de

una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Puede programarse la mayor parte de los cicladores trm icos para que efecten cur
sos en los que se disminuye de manera gradual la temperatura de
templado (annealing) durante el ciclo de PCR, desde un valor inicial
mayor al Tm esperado hasta un valor menor de Tm. Al conservar muy
alta de form a inicial la rigidez de hibridacin, se evita la form acin
de productos falsos y ello posibilita que predomine la secuencia es
perada,
PCR de genoma total. PCR indiscriminada en la que se emplean en
extenso cebadores degenerados o se fijan enlazadores de oligonu
cletido a una poblacin de DNA complejo y a continuacin se utili
zan cebadores oligonucletidos especficos de enlazador para
amplificar todas las secuencias.
*N ota: se prepara un enlazador (adaptador) oligonucletido de doble
cadena al disear dos oligonucletidos con secuencias complementaras. Los dos oligonucletidos se sintetizan por medios qumicos en
reacciones separadas y una vez que se purifican se permite que formen
pares de bases entre s a fin de producir la secuencia de doble cadena
deseada. Los enlazadores oligonucletidos se ligan (enlazan) a una se
cuencia de DNA con objeto de permitir: a) la PCR mediante un oligonu
cletido especfico para un enlazador; o b) la adicin de caractersticas
convenientes, por ejemplo sitios de restriccin para contribuir a la clona
cin (vase fig. 5-10). Se insertan de rutina en vectores de clonacin polienlazadores complejos que contienen varios sitios de restriccin (vase
seccin 5.3.5).
5.2 i PCR: CARACTERSTICAS Y APLICACIONES BSICAS
125
Recuadro 5-1. (c o n tin u a ci n )

A)
B)
C eb a d o r B
C ebador A
R epeticin Alu
DNA conocido
_______
I
(i) Digerir con nucleasa de restriccin en ( r )

(ii) Circularizar m ediante ligasa de DNA
(iii) Desnaturalizar, tem plar (annea) cebadores > PCR
/-v
3 J L ,
A) PCR-Alu
B) PCR inversa
La orientacin de los cebadores se elige de modo deliberado de tal

manera que la direccin de la sntesis de la nueva cadena ocurra a
partir de un cebador y se dirija hacia el sitio de unin del otro ce
bador. Como resultado, las cadenas recin sintetizadas pueden ser
vir a su vez como plantillas para la sntesis del nuevo DNA, lo que
da lugar a una reaccin en cadena con un incremento exponencial
del producto (fig. 5-2).
La necesidad de contar con una enzima termoestable llev a los
investigadores a aislar polimerasas de DNA de microorganismos cuvos hbitat naturales son las aguas termales. Un ejemplo inicial que
se utiliza con amplitud fue la polimerasa Taq que se obtiene de Thermus aquaticus y es termoestable hasta 94C, con una temperatura
ptima de trabajo de 80C. Sin embargo, la polimerasa Taq carece
de una actividad de exonucleasa 3/_>5' adjunta para proporcionar
una fu n ci n d e lectu ra d e p r u eb a s y de esa manera comparar los
errores de copiado (incorporacin de la base errnea) con los que
ocurren dentro de las clulas. Como resultado, en la actualidad se
usan con frecuencia enzimas alternativas con^ha actividad de exo
nucleasa de lectura de pruebas 3,_>5', com la polimerasa Pfu de
Pyrococcus furiosus (Cline y cois., 1996).
5.2.2 La PCR tiene dos limitaciones importantes:

tamaos cortos y elaboracin baja
de productos
Una desventaja evidente de la PCR como mtodo de clonacin del
DNA es el tamao limitado de los productos de la amplificacin.
A diferencia de la clonacin de DNA basada en clulas, en la que
el lmite superior del tamao de las secuencias de DNA clonadas
puede aproximarse a 2 Mb, los productos de la PCR publicados

tienen entre 0 y 5 kb de tamao, con frecuencia en el extremo in
ferior de esta escala. Aunque suele ser posible amplificar los seg
mentos pequeos de DNA mediante PCR, es cada vez ms difcil
obtener una amplificacin eficiente a medida que aumenta la lon
gitud del producto deseado. Sin embargo, se han desarrollado pro
tocolos de PCR de largo alcance, que proporcionan productos
que tienen decenas de kilobases de longitud, como un producto de
42 kb del bacterifago \ (vase Cheng y cois., 1994). A menudo, las
condiciones modificadas incluyen una mezcla de dos tipos de polime
rasas termoestables como esfuerzo para proporcionar niveles ptimos
de polimerasa de DNA y actividad de exonucleasa de 3'~*5' que sir
ve como un mecanismo de lectura de pruebas.
Tambin es una limitacin la cantidad de material que puede
clonarse en una reaccin de PCR aislada, adems de que requiere
tiempo y es costoso repetir la misma reaccin de PCR muchas ve
ces con el fin de obtener grandes cantidades del DNA deseado. De
igual modo, es posible que el producto de la PCR no se encuentre
en una forma adecuada que permita ciertos estudios subsecuentes.
Como resultado, muchas veces es conveniente clonar el producto
de la PCR en un sistema de clonacin basado en clulas para con
seguir grandes cantidades de DNA y permitir una diversidad de
anlisis.
Se usan varios sistemas de clonacin en plsmidos para propagar
el DNA clonado mediante PCR en clulas bacterianas. Una vez que
se clona, puede cortarse y eliminarse el inserto mediante nucleasas de
restriccin apropiadas y transferirse a otros plsmidos que pueden te
ner usos especializados para posibilitar la expresin que se confiere a
un producto de RNA o proporcionar grandes cantidades de una pro
tena. Varias polimerasas termoestables, incluida la polimerasa Taq,
126
CAPTULO CINCO
Sitio d e en lac e
del c e b a d o r
5 ':
3 '-
Sitio d e en la c e
del c e b a d o r
B lanco
S ec u en cia
D es n atu ralizaci n p o r ca lo r
P erm ite te m p la r (anneal) ce b ad o res
Sntesis d e D N A
P ro d u cto p red o m in an te
p o r in crem en to ex p o n en c ia l
del nm ero d e co p ias
Fig. 5-2. La PCR es un mtodo in vitro para amplificar secuencias de DNA mediante cebadores oligonucletidos definidos.
Despus de identificar una secuencia por amplificar (la secuencia blanco), se disean cebadores oligonucletidos para que sean complementarios de las
secuencias de DNA localizadas en cadenas de DNA opuestas y a los lados de la secuencia blanco. La PCR consiste en ciclos de desnaturalizacin, tem
plado (annealing) de cebadores y luego sntesis de DNA en la que se Incorporan los cebadores en las cadenas de DNA recin sintetizadas. El primer ciclo
tiene como resultado dos cadenas de DNA nuevas (N) cuyos extremos 5 ' estn fijos a la posicin del cebador oligonucletido, pero cuyos extremos 3 '
son variables (se indica con lneas punteadas). Despus del segundo ciclo, las cuatro cadenas nuevas consisten en dos productos con extremos 3 ' varia
bles, al igual que en el primer ciclo, aunque ahora dos cadenas de longitud fija (ambas con extremos 5 ' y 3 ') definidas por las secuencias del cebador.
Despus del tercer ciclo, seis de las ocho cadenas nuevas tienen la longitud fija deseada y despus de unos 30 ciclos hay un incremento masivo (amplifi
cacin) de este tipo de producto.
5 . 2 I PCR: CARACTERISTICAS Y APLICACIONES BSICAS } 127
tienen actividad de transferasa de desoxinucleotidilo terminal que

modifica de modo selectivo fragmentos generados mediante PCR al
aadir un nucletido aislado, por lo general adenina, a los extremos
3' de los fragmentos de DNA amplificados.
Los extremos salientes resultantes pueden dificultar la clonacin
de los productos de la PCR y suelen utilizarse varios mtodos para
facilitar la clonacin, que incluyen el uso de vectores con residuos
T salientes en su sitio de clonacin polienlazador (fig. 5-3) y el em
pleo de enzimas de pulimiento como la polimerasa T4 o la polimerasa Pfu que pueden eliminar los nucletidos aislados salientes.
De manera alternativa, pueden modificarse los cebadores de la
PCR si se disea una extensin aproximada de 10 nucletidos que
contiene un sitio de restriccin apropiado en el extremo 5'. La ex
tensin del nucletido no forma pares de bases con el DNA blan
co durante la amplificacin, pero con posterioridad puede digerirse
el producto amplificado con la enzima de restriccin adecuada a fin
de generar extremos salientes para clonacin dentro de un vector
apropiado (vase seccin 5.5.3).
lada (Li y cois., 1988). Se han hallado varias aplicaciones en

diagnsticos, anlisis de enlace gentico (incluida la tipifica
cin de espermatozoos nicos) y ciencia forense (es posible ti
pificar mediante PCR rastros de tejidos dejados por un
individuo -como un cabello aislado o clulas de piel descarta
das- con marcadores de DNA muy polimrficos para identifi
car al sujeto de origen).
Es muy vigorosa y con frecuencia es posible amplificar DNA
de tejidos o clulas que estn mal degradados o incluidos en
algn medio que dificulta aislar el DNA con los mtodos es
tndar. Asimismo, pueden amplificarse secuencias cortas de
cantidades pequeas de DNA degradado extradas de tejidos
descompuestos en sitios arqueolgicos/histricos y es posible
tener xito en la amplificacin mediante PCR de muestras
de tejidos fijados en formalina (con ventajas notorias para la
patologa molecular y, en algunos casos, estudios genticos
de enlace).
Las mltiples aplicaciones de la PCR y la necesidad de optimizar su
eficiencia y especificidad llevaron a idear una gran variedad de m
todos de PCR (recuadro 5-1). Debido a la crucial importancia de
la especificidad del cebador, se utilizan por lo regular varias modi
ficaciones a fin de reducir las posibilidades de enlace de un cebador
inespecfico (p. ej., PCR hot-start, cebadores anidados, PCR touch
down 5 vase recuadro 5 - 1).
La dependencia esencial del pareamiento de bases correcto en el
extremo 3 de cebadores enlazados permiti desarrollar mtodos
que hacen posible distinguir entre alelos que difieren tan slo en un
5.2.3 Aplicaciones generales de la PCR

Debido a su sencillez, la PCR es una tcnica difundida con una
gran variedad de aplicaciones que dependen en esencia de tres ven
tajas principales del mtodo:
Muy rpido y fcil de practicar.
Muy sensible y con la posibilidad de amplificar cantidades di
minutas de DNA blanco -incluido el DNA de una clula ais
5 '-----------------------------------3'
3 '-----------------------------------5'
A c tiv id a d d e tra n s fe ra s a
d e d e s o x in u c le o tid ilo term in al
d e p o lim e ra s a te rm o e s ta b le
5' ----------------------------------- a 3'

3'A----------------------------------- 5'
P ro d u c to d e P C R
c o n s a lie n te A
C lo n a c io n T -fi
T ra ta m ie n to co n e n zim a
p a ra p u lim ie n to
Fig. 5-3. Clonacin de productos de la PCR en clulas bacterianas

Con frecuencia, los productos de la PCR tienen una saliente de adenosina en sus extremos 3 ' (vase texto). El sistema de clonacin T-A posee un siste
ma polienlazador con salientes de timina complementarias para facilitar la clonacin. Una alternativa es recortar de nueva cuenta la saliente de adenina
con una enzima pulidora" apropiada que deja el fragmento con un extremo romo.
128
CAPTULO CINCO
10
R e g i n c o n s e rv a d a
15
. .7777777777.^/eio
..........................................A le lo 2
D is e o d e c e b a d o re s e s p e c fic o s
d e a le lo (n u c le tid o s 1 -1 7 )
I
1
10
15
5'
> 3 - C e b a d o r e s p e c fic o d e a le lo 1 (A S P 1)
1
10
15
fe > 3 ' C e b a d o r e s p e c fic o d e a le lo 2 (A S P 2)
5'
P C R con ASP1 o A S P 2 + ce b ad o r
c o n s e rv a d o (C O N )
DNA del alelo 1

5 '.
i 3'
n n i.
CON
A SP1
f e
pero
ASP2
55 7
N o a m p lific a c i n
3' =
DNA del alelo 2
CON
ASP2
f e
p e ro
_ASP1
3 'c
N o a m p lific a c i n
Fig. 5-4. La PCR especfica de alelo mediante el sistema ARMS depende del pareamiento de bases perfecto del extremo 3' nucletido de los cebadores.
Los cebadores oligonucletidos especficos de alelo ASP1 y ASP2 estn diseados para que sean idnticos a la secuencia de los dos alelos sobre una
regin precedente a la posicin del nucletido variable, hasta este ltimo y con trmino en l mismo. El ASP1 enlaza a la perfeccin la cadena comple
mentaria de la secuencia del alelo 1 y ello hace posible la amplificacin con el cebador conservado. Sin embargo, la terminal C 3 ' del cebador ASP2 es
incompatible con la T de la secuencia del alelo 1, lo que imposibilita la amplificacin. De igual forma, ASP2 puede enlazarse de forma perfecta al alelo 2
e iniciar la amplificacin, a diferencia de ASP1.
nucletido (PCR especfica de alelo). En el difundido ARMS (sis

tem a d e m u ta cin refra cta rio a la a m p lifica cin ), los cebadores
se preparan con sus nucletidos en el extremo 3 ' diseados para
formar pares de bases con el nucletido variable que distingue los
dos alelos y con la secuencia restante del cebador diseada para
complementar a la secuencia inmediatamente adyacente al nucle
tido variable. Bajo condiciones experimentales adecuadas, no se lle
va a cabo la amplificacin en donde el nucletido del extremo 3'
no forma perfectamente pares de bases y se distinguen en conse
cuencia los dos alelos (fig. 5-4).
5.2.4 Algunas PCR se disearon para permitir mltiples

productos de amplificacin y amplificar
secuencias no caracterizadas con anterioridad
Las reacciones estndar de PCR/PCR-TI se basan en la necesidad
del enlace del cebador muy especfica a fin de permitir la amplifi
cacin selectiva de una secuencia blanco conocida deseada. Sin em
bargo, en ocasiones es conveniente disear las PCR para amplificar
secuencias de DNA en las que no existe informacin previa sobre
la secuencia o es limitada.
5.3
PRINCIPIOS
DE -------LA CLONACIN
DEL DNA
BASADA EN CLULAS I-----129
---------------------------- ---- ----------------- ----------------------------------i
Amplificacin de nuevos miembros de una familia de DNA

nediante PCR-DOP
Uso de una secuencia conocida para amplificar

una secuencia de DNA cercana no caracterizada
Algunas veces es posible clonar secuencias de DNA no caracteriza

das antes mediante la PCR si se trata de miembros de una familia
gnica o de DNA repetido de los cuales se caracteriz ya cuando
menos uno de ellos. Por ejemplo, se aislaron por primera vez mu
chos miembros nuevos de la familia del gen de mamferos Wnt des
pus de observar que los productos de los primeros genes Wnt
tenan secuencias de aminocidos muy similares dentro de un do
minio particular conservado. Esto hizo posible disear cebadores
para esta secuencia basada en oligo n u cletid os d egen era d os, con
una mezcla en cada caso de diferentes oligonucletidos que represen
tan varios cambios de aminocidos. La PCR ceb a d a co n oligon u cletid o d egen era d o {PCR-DOP, por sus siglas en ingls) posibilita
amplificar al mismo tiempo una diversidad de distintos genes, pero
relacionados muy de cerca, incluidos genes nuevos, y a continuacin
fraccionarlos y purificarlos mediante clonacin de DNA basada en
clulas.
Se han ideado varias modificaciones ingeniosas con la finalidad de

progresar de una secuencia de DNA de inicio conocida a una se
cuencia contigua no caracterizada, sea en DNA genmico o en cDNA. En los ejemplos se incluyen PCR an clada , PCR inversa,
RACE-PCR (recuadro 5-1).
Amplificacin indiscriminada
Si la fuente de DNA es de gran valor y tiene cantidades muy limi
tadas, es posible emplear la PCR para amplificar todo el DNA me
diante oligonucletidos enlazadores de doble cadena unidos de
manera covalente a las extremidades de todas las secuencias de DNA
en la poblacin de inicio. Para preparar los oligonucletidos enlaza
dores se sintetizan de manera individual dos oligodesoxirribonucletidos diseados para complementarse en su secuencia y ser
capaces de realizar un pareamiento de bases para formar una secuen
cia de DNA de doble cadena con un extremo saliente. Se digiere el
DNA por amplificar con una nucleasa de restriccin que produce
extremos salientes similares, de tal forma que puedan unirse en sen
tido covalente los enlazadores (ligarse). Los cebadores especficos de
enlazador posibilitan la amplificacin de molculas de DNA blanco
con enlazadores en ambos extremos. Como resultado, es posible am
plificar de modo simultneo todas las secuencias de DNA en una se
cuencia iniciadora, lo que permite a m p lifica r tod o e l gen o m a en
el caso del DNA genmico. Un mtodo alternativo consiste en usar
de forma extensa oligonucletidos degenerados como cebadores de
tal suerte que puedan enlazarse los cebadores a muchsimos sitios
de enlace.
5 .3
Principios de la clonacin del DNA

basada en clulas
5.3.1 Generalidades de la clonacin del DNA

basada en clulas
La clonacin del DNA basada en clulas se desarroll por prime
ra vez al inicio de la dcada de 1970. Fue posible por el descu
brimiento de endonucleasas de restriccin tip o II, que son
enzimas bacterianas capaces de cortar DNA en todos los sitios
que contienen una secuencia de reconocimiento especfica y pe
quea, por lo general de 4 a 8 pb de largo. En condiciones nor
males, estas enzimas sirven para proteger a las bacterias de
bacterifagos invasores al seccionar de forma selectiva el DNA
extrao (vase recuadro 5-2 y la seccin siguiente). La enorme
ventaja que ofrecieron a los genetistas moleculares fue la de dis
poner de un medio para cortar DNA en fragmentos definidos
que pudieran unirse con facilidad a otros fragmentos de DNA
cortados de manera similar.
La esencia de la clonacin del DNA basada en clulas es el uso
de nucleasas de restriccin para cortar molculas de DNA en una
poblacin de DNA iniciador {DNA blanco) en piezas de tamao
manejable y a continuacin unirlas a un replicn (cualquier se
cuencia capaz de replicar DNA de manera independiente) y trans
ferir las molculas hbridas resultantes {DNA recom b in a n te) en
una clula husped apropiada que a continuacin prolifera por di
visin celular. Debido a que el replicn puede replicarse dentro de
las clulas (con frecuencia hasta grandes nmeros de copias), al
igual que el DNA blanco unido, el resultado es una forma de am
plificacin de DNA basada en clulas.
En la clonacin de DNA basada en clulas hay cuatro pasos
esenciales (vase fig. 5-5):
Recuadro 5-2. Endonucleasas de restriccin y sistem as de modificacin y restriccin

Los bacterifagos que se liberan de una bacteria de una cepa particular
pueden Infectar a otras bacterias de la misma cepa, pera no a las de una
cepa diferente. Eso se debe a que el DNA del fago tiene el mism o patrn
de modificacin que el DNA de las cepas bacterianas que puede infectar;
el fago se restringe a esa cepa de bacterias. La restriccin es absoluta:
algunos fagos pueden escapar a la restriccin y adquirir el patrn de m o
dificacin del nuevo husped.
En la actualidad se sabe que la base de los sistemas de modificacin y
restriccin incluyen dos tipos de actividad enzimtica:
Una actividad de metiiasa de DNA especfica de secuencia proporcio
na la base del patrn de modificacin.
/
El fenmeno de restriccin se basa en una actividad de endonucleasa de restriccin especfica de secuencia: corta DNA del fago cuyo
patrn de metlacin es diferente al DNA de la clula husped.
La cepa bacteriana posee una actividad de metiiasa de DNA con la m is
ma especificidad de secuencia que la actividad de la nucleasa de restric
cin correspondiente. Como resultado, las endonucleasas de restriccin
celulares no cortan el DNA de la clula husped metilado de manera apro
piada, pero pueden cortar el DNA del fago que ingresa s no est metila
do de modo adecuado.
Nota: algunos plsmidos y bacterifagos poseen genes para sistemas de
modificacin y restriccin y pueden conferir esta especificidad a una c
lula husped.
130 [ CAPTULO CINCO
5,3.2 Las endonucleasas de restriccin permitieron

cortar DNA blanco en piezas manejables que
pueden unirse a molculas vectoras cortadas
de manera similar
creacin de molculas de DNA recombinante. De forma t

pica, se producen fragmentos de DNA de tamao apropiado al
cortar con una nucleasa de restriccin seguida de la unin covalente (ligadura) de los fragmentos de DNA blanco a un tipo
nico de molcula de replicn . La creacin de DNA recombi
nante se facilita si se asegura que el DNA blanco y las molcu
las de replicn se corten mediante nucleasas de restriccin, que
producen los mismos tipos de extremo antes de unir los frag
mentos de DNA blanco a las molculas de replicn mediante
la enzima ligasa de DNA;
Nucleasas de restriccin tipo II

En condiciones normales, las secuencias de reconocimiento de la
inmensa mayora de las endonucleasas de restriccin tipo II son palndromes (la secuencia de bases es igual en ambas cadenas cuan
do se lee en la direccin 5'~*3', como resultado de un eje de
simetra doble). Segn sea la localizacin de los sitios de corte pro
ducidos mediante una nucleasa de restriccin, los fragmentos de
re str icci n resultantes pu ed en tener;
transformacin. Las molculas de DNA recombinante se

transfieren a clulas husped (a menudo clulas bacterianas o
de levadura) en las que el replicn elegido puede replicar el
DNA sin importar cul sea el(Ios) cromosoma(s) de la clu
la husped. Los replicones empleados en clonacin celular
suelen denominarse molculas vectoras porque ayudan a
transportar las molculas blanco pasajeras hacia el interior de
las clulas y a continuacin ayudan a que se repliquen den
tro de ellas;
extremos romos (los puntos de corte ocurren exactamente en

el eje de simetra).
extremos salientes (los puntos de corte no se encuentran en el eje
de simetra, de tal manera que los fragmentos de restriccin resul
tantes poseen las llamados sa lien tes 5' o 3' (vase cuadro 5-1).
Nota: los dos extremos salientes de cada fragmento son comple
mentarios en su secuencia de bases y muestran la tendencia a
vincularse entre s (o con cualquier otra saliente similar comple
mentaria) para formar pares de bases. Como resultado de su pro
pensin a adherirse a otros extremos del mismo tipo, los extremos
salientes de este tipo se conocen como extremos pegajosos.
propagacin selectiva de clonas celulares que incluye dos

etapas. Al inicio, se siembran las clulas transformadas en
placas y se las disemina en una superficie de agar con el fin
de promover el crecimiento de colonias de clulas bien sepa
radas. Todas las clulas en una colonia aislada son idnticas
(ya que descienden slo de una clula) y se describen como
clonas celulares. De manera subsecuente, pueden tomarse de
una placa colonias individuales y dejar que las clulas lleven a
cabo una segunda etapa de crecimiento en cultivo lquido;
Las nucleasas de restriccin tipo II ofrecieron dos grandes ventajas

para la clonacin y el anlisis de DNA:
un gru p o d efin id o d e fr a g m en to s d e DNA d e in icio. Cuando
se asla DNA de tejidos y clulas cultivados, el desempacamien
to de molculas de DNA voluminosas y el corte por desgarro f
sico inevitable dan por resultado poblaciones heterogneas de
aislamiento de clonas de DNA recombinante al reunir culti

vos celulares expandidos y aislar de manera selectiva el DNA
recombinante.
Ejemplos de endonucleasas de restriccin de uso comn (vase asimismo cuadro 6-3 para los cortadores raros).
Enzima
Fuente
Corte de secuencia;
N = A, C, G o T
Fragmentos de restriccin
con los extremos siguientes
Produce extrem os romos

Alul
Arthrobacter luteus
a ag c t
5 C T-----------------A G 3'
3' G A ---------- -TC 5'
T tC G
Produce salientes 5
EcoRI
Factor
Producen
Pstl
Providencia stuartii
R de Escherichia coli
A A T TC
CTTAtAG
5 ' A A T T C ----------- G 3'

3'
G---------------- C T T A A 5 '
C T G C AA G
A CGT C
3'
c c t c n n n n n n
4n
GGAGNNNNNtNN
5' ~~------------ C C T C N N N N N N N 3 '

3' N .............. G G A G N N N N N N 5'
CCANNNN'VlNTGG
G G T tN N N N N N A C C
5' N T G G C C A N N N N N 3 '
3 ' N N N N N A C C --G G T N
tG
5 ' g ---------------- C
C---------------- G 5 '
3'
Reconoce ecuencia no palindrmica

M nl 1
Moraxella nonliquefaciens
Reconoce secuencia de reconocimiento bipartita

BstXI
Nota: en condiciones normales, los nombres derivan de la primera letra del gnero y las dos primeras letras del nombre de la especie, por ejemplo Pstl
es la primera nucleasa de restriccin que se aisl de Providencia stuartir, vase http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html para la base de datos REBA
SE de nucleasas de restriccin.
5.3
PRINCIPIOS DE LA CLONACIN DEL DNA BASADA EN CLULAS
131
OR
R e p lic o n e s h o m o g n e o s
(m o l c u la s v e c to ra s ;
O R = o rig e n d e re p lic a c i n )
e tc .
P o b la c i n d e D N A
c o m p le jo (b la n c o )
(C o lig a d u ra )
D N A re c o m b in a n te
B)
< g j|> 1 - O R
< ^ 2 - R
(1 -O R )
(2 -O R )
< g & 3 -O R
D N A c ro m o s o m ic o
(3 -O R )
D N A r e c o m b in a n te
_o 1 - R
S ^ 3 -O R
C lu la s h u s p e d
(C o tra n s fo rm a c i n )
T ra n s fo r m a d o r e s
C)
A m p lific a c i n
p rim a ria
< g jjg 1 -O R
< ^ j|> 1 -O R
1 -O R
S*.
S e m b r a d o e n p la c a
d e a g a r n u trie n te
's * .
O b te n e r c o lo n ia s y p e rm itir el
c r e c im ie n to a d ic io n a l en
c u ltiv o lq u id o
^ ^ 1 -OR
A m p lific a c i n
s e c u n d a r ia
*
< ^ 1 -OR
e tc .
C o lo n ia d e clo n as
c e lu la re s id n tic a s
D)
> 1 -O R
> 1 -O R
P u rific a c i n d e
D N A re c o m b in a n te
>
> 1 -O R
>1 -O R
C lo n a s d e D N A
r e c o m b in a n te
Fig. 5-5. Los cuatro pasos esenciales para la clonacin de DNA basada en clulas.
A) Formacin de DNA recombinante. Obsrvese que, adems de los productos simples vector-ligadura del blanco, pueden ocurrir fenmenos de coli
gadura por los cuales pueden ligarse en un mism o producto dos secuencias de DNA blanco no relacionadas (p. ej., secuencias 1 ms 2 en el ejemplo
de la parte inferior). OR, origen de la replicacin. B) Transformacin. ste es un paso fundamental en la clonacin de DNA porque en condiciones nor
males las clulas slo captan una molcula de DNA extrao. Sin embargo, obsrvese que algunas veces se presentan fenmenos de cotransformacin,
como las clulas que se ilustran en la parte inferior, que transforman dos molculas de DNA diferentes (una molcula recombinante que contiene la se
cuencia 1 y una molcula recombinante que posee la secuencia 3). C) Amplificacin para producir numerosas clonas celulares. ste es otro paso
fundamental. Despus de sembrar en la placa las clulas transformadas, pueden separarse colonias de clonas individuales en un plato y a continuacin
tomarse de forma individual y llevarse a un paso secundario de amplificacin a fin de asegurar la homogeneidad de la clona. D) Aislamiento de clonas
de DNA recombinante.
132
CAPTULO CINCO
fragmentos de DNA de longitudes aleatorias diferentes. Al usar

endonucleasas de restriccin es posible convertir estas poblacio
nes considerablemente heterogneas de fragmentos de DNA rotos
en grupos t fra gm en to s d e restriccin de longitudes definidas.
Un m edio p a ra o b ten er d e fo r m a a rtificia l m olcu las d e D N A .
Los fragmentos de restriccin con los mismos tipos de extremo
pegajoso pueden unirse con facilidad entre s mediante una liga sa d e D N A . Por consiguiente, a fin de elaborar un DNA recombinante podra cortarse la molcula de replicn (v ecto r) y
DNA blanco con el mismo tipo de nucleasa de restriccin, o
bien con nucleasas de restriccin que producen los mismos ti
pos de extremo pegajoso.
Las terminales de fragmentos de restriccin que tienen el mismo
tipo de extremos salientes pueden relacionarse en una diversidad
de diferentes formas, sea de modo /fmmolecular (ciclizacin) o
entre molculas para formar concatmeros lineales o molculas
circulares compuestas. Las reacciones intermoleculares ocurren
con mayor facilidad cuando las concentraciones de DNA son al
C o rte d e D N A
b la n c o co n M b o l
tas. Sin embargo, a concentraciones de DNA muy bajas, las ter

minales individuales en diferentes molculas tienen menos opor
tunidad de hacer contacto entre s y se favorece la ciclizacin
intramolecular. Por lo general, las reacciones de ligadura estn
diseadas para promover la formacin de DNA recombinante
(mediante la ligadura de DNA blanco a DNA vector), aunque
tambin son posibles la ciclizacin de vector, concatmeros vec
tor-vector y la ligadura de DNA blanco con DNA blanco (vase
fig. 5-6). Con la finalidad de lograr lo anterior, se tratan las mo
lculas vectores de tal modo que se impida o minimice su capa
cidad para llevar a cabo la ciclizacin.
Vectores simples para clonacin en clulas bacterianas

Durante la clonacin del DNA basada en clulas, los fragmentos de
DNA blanco deben ser capaces de replicarse dentro de las clulas.
Puesto que carecen de un origen funcional de replicacin, necesi
tan unirse a un replicn (vector) que pueda replicarse dentro de la
clula husped, al margen de sus cromosomas. El vector puede te-
V e c to r d e D N A co n
sitio n ic o B a /n H I
>GATC
>G ATC
<
CTA G <
p. ej., in te rm o le cu la r;
c o n c a t m e ro s
1
> GATC
<
2
1 GATC
CTAG 1
B am H I
B am HI
M bo \
CTA G <
p. ej., intram olecular,

cic liz a c i n
>
CTAG <"
Fig. 5-6. Las terminales cohesivas pueden relacionarse de manera intramolecular e intermolecular.
Nota: slo se muestran algunos de los posibles resultados finales. Por ejemplo, las molculas vectoras tambin pueden form ar concatmeros intermole
culares, los multmeros suelen llevar a cabo ciclizacin y los fenmenos de coligadura pueden incluir dos diferentes secuencias blanco Incluidas con
una molcula vectora en la misma molcula de DNA recombinante (vase fig. 5-5A). La tendencia a la ciclizacin de molculas individuales es ms pro
nunciada cuando el DNA se encuentra a una concentracin baja y son reducidas las posibilidades de colisin entre diferentes molculas con extremos
pegajosos complementarios.
5.3
-.er un origen de replicacin que procede de un replicn extracroosmico natural o, en algunos casos, un replicn cromosmico
como sucede en los cromosomas artificiales de levadura; vase secon 5.4.4).
Las clulas husped que se utilizan con mayor frecuencia son
ncterianas o micticas modificadas. Las clulas husped bacteria
nas se usan en extenso, en particular por su capacidad de divisin
celular rpida. Tienen un cromosoma de doble cadena circular
lisiado con un origen nico de replicacin. La replicacin del cro
mosoma husped desencadena con posterioridad la divisin cetair de tal manera que cada una de las dos clulas hijas resultantes
contiene un cromosoma aislado igual que su clula original (es
decir, se conserva el nmero de copias en una copia por clula).
Mn embargo, la replicacin de replicones extracromosmicos no
se restringe en esta forma: muchos de estos replicones pueden lle
var a cabo varios ciclos de replicacin durante el ciclo celular y
rormar gran nmero de copias. Como resultado, es posible pro
ducir grandes cantidades de DNA blanco mediante correplicacin con un replicn. Existen dos clases generales de replicn
extracromosmico:
plsmidos, o molculas de DNA de doble cadena circulares y
pequeas, que contienen a nivel individual muy pocos genes.
Su existencia es intracelular, se distribuyen en sentido vertical a
clulas hijas despus de la divisin de la clula husped, aun
que pueden transferirse de forma horizontal a clulas vecinas
durante los fenmenos de conjugacin bacteriana. Los ejem
plos naturales incluyen plsmidos que llevan los factores del se
xo (F) y los que alojan genes de resistencia a frmacos;
Bacterifagos, o virus que infectan clulas bacterianas. Los
bacterifagos que contienen DNA suelen tener genomas que
incluyen DNA de doble cadena que puede ser circular o lineal.
A diferencia de los plsmidos, pueden existir de modo extracelular. La partcula viral madura (virin) tiene incluido su genoma en una cubierta protenica a fin de facilitar la adsorcin y
entrada a una nueva clula husped.
5.3.3 La introduccin de DNA recombinante en clulas

receptoras proporciona un mtodo para fraccionar
una poblacin de DNA de inicio compleja
La membrana plasmtica de la clula es permeable de manera selec
tiva y en condiciones normales no admite molculas grandes como
fragmentos de DNA largos. Sin embargo, es posible tratar las clu
las en algunas formas (p. ej., mediante exposicin a ciertas sales de
potencia inica alta, choques elctricos cortos, y otras), de tal for
ma que se alteren las propiedades de permeabilidad de las mem
branas plasmticas. Como resultado, una fraccin de las clulas se
torna competente, lo que significa que son capaces de captar DNA
extrao del ambiente extracelular.
Slo un porcentaje pequeo de las clulas capta el DNA extra
o (transformacin de DNA). Sin embargo, las que captan DNA
extrao recogen con frecu en cia slo una molcula aislada (que, no obs
tante, puede replicarse despus muchas veces dentro de una clula).
sta es la base del paso crtico de fraccionamiento en la clonacin
de DNA basado en clulas: la poblacin de clulas transformadas
puede considerarse como una oficina de clasificacin en la cual se
selecciona la mezcla compleja de fragmentos de DNA al depositar
molculas de DNA individuales en clulas receptoras individuales
(fig. 5-7).
133
Debido a que el DNA circular (incluido el DNA circular corta

do en muesca [nicked\) se transforma con mucho mayor eficiencia
que el DNA lineal, casi todos los transformadores celulares contie
nen productos ciclizados en lugar de concatmeros de DNA recombinante lineales y, si es necesario suprimir la ciclizacin del
vector (p. ej., mediante desfosforilacin), casi todos los transforma
dores poseen DNA recombinante. Sin embargo, cabe sealar que
en algunos sistemas de clonacin los fenmenos de cotransformacin (la ocurrencia de ms de un tipo de molcula de DNA intro
ducida dentro de una clona celular; vase fig. 5-5B) pueden ser
comunes en trminos comparativos.
Se permite que se multipliquen las clulas transformadas. En
las clonaciones en que se usan vectores plsmidos y una clula
husped bacteriana, tan slo se disemina sobre la superficie de agar
nutriente en una placa de Petri una solucin que contiene las c
lulas transformadas (sembrado en placa). Esto tiene como resul
tado la formacin de colonias bacterianas que consisten en
clonas de clulas (progenie idntica de una clula ancestral ni
ca). La introduccin de una colonia individual en un tubo para
crecimiento subsecuente en cultivo lquido permite una expansin
secundaria del nmero de clulas que pueden aumentarse para su
ministrar muy grandes rendimientos de clonas celulares, todas
idnticas a una clula ancestral nica (fig. 5-7). Si la clula origi
nal contena un tipo aislado de fragmento de DNA extrao unido
a un replicn, tambin lo tendrn las descendientes, lo que dar
por resultado una amplificacin inmensa de la cantidad del frag
mento extrao especfico. Los cultivos expandidos que representan
clonas celulares derivadas de una clula pueden procesarse a con
tinuacin para recobrar el DNA recombinante.
Con objeto de recuperar de modo selectivo el DNA recombi
nante de clulas lisadas, se aprovechan las diferencias fsicas entre el
DNA de la clula husped y el DNA recombinante. En clulas bac
terianas, el cromosoma bacteriano de doble cadena es circular, al
igual que en cualquier plsmido que contiene DNA extrao intro
ducido pero de un tamao mucho mayor. Como resultado, es pro
penso al corte en muesca y desgarro durante la lisis celular y
extraccin subsecuente de DNA, lo que crea fragmentos lineales de
DNA con extremos libres. Despus de someter el DNA aislado a
un paso de desnaturalizacin, por ejemplo mediante tratamiento
con alcalinos, se desnaturaliza con facilidad el DNA linealizado de
la clula husped, pero las cadenas de DNA del plsmido circu la res
cerra d a s d e m anera co va len te (CCC) no son capaces de separarse y,
cuando se permite que se renaturalicen, se vinculan de nueva cuenta
las dos cadenas para formar molculas nativas superhelicoidales o el
llamado DNA superenrollado (fig. 5-8). El DNA desnaturalizado
de la clula husped se precipita de la solucin y deja el DNA circu
lar cerrado de forma covalente (CCC) del plsmido.
Si
se requiere, es posible una purificacin adicional mediante
cen trifu ga ci n d e g r a d ien te d e d en sid a d d e eq u ilib rio (cen trifu
g a ci n isop cnica ): se centrifuga el DNA purificado de forma par
cial hasta equilibrarse en una solucin de cloruro de cesio que
contiene bromuro de etidio (EtBr). Este ltimo une DNA median
te in terca la ci n entre los pares de bases y propicia en consecuen
cia el desenrollamiento de la hlice de DNA. A diferencia del DNA
cromosmico, un DNA CCC de plsmido no tiene extremos libres
y slo puede desenrollarse hasta un grado limitado, lo que restrin
ge la cantidad de EtBr que puede enlazar. Los complejos de EtBRDNA son ms densos cuando contienen menos EtBr, de tal manera
que el DNA CCC del plsmido forma una banda en la posicin
ms inferior en el gradiente de cloruro de cesio que el DNA ero-
134
CAPTULO CINCO
C lu la s q u e c o n tie n e n
rep lic n e x tra c ro m o s m ic o (O )
C lu la s q u e c o n tie n e n D N A p o r c lo n a r
(i) E x p a n d ir en cu ltivo
(ii) P u rific a r rep lico n e s
(iii) C o rta r co n n u c le a s a
d e restriccin
(i) P u rific a r D N A
(ii) C o rta r co n n u c le a s a
d e restriccin
V e c to r
B lan co
(Tipo nico
d e m o lc u la)
(N u m e ro s o s fra g m e n to s
d ife re n te s ... 1, 2, 3, etc .)
...e tc .
M o l c u la s d e D N A re c o m b in a n te
(i) T ra n s fo rm a c i n d e D N A
(i) R e p lic a c i n d e n tro d e la c lu la
...e tc .
C a d a c lu la s lo c o n tie n e un tip o d e D N A re c o m b in a n te
S e m b ra r en
p la c a co n a g a r
n u trie n te
Cada co lo n ia es una p o b la ci n de clulas

bacteria nas id n ticas (clo n a s c elu lare s) que
contien e una m olcula d e DNA re com bin an te espe cfica
(i) E x p a n d ir en cu ltivo d e
co lo n ia s in d ivid u ale s
1
1
O I
0
A
(ii) P u rific a r D N A
re c o m b in a n te
A
r - i
02
l
03
C lo n a s d e D N A
Fig. 5-7. Clonacin de DNA en clulas bacterianas.

El ejemplo ilustra la clonacin de DNA genmico pero podra aplicarse asimismo a la clonacin de cDNA.
5.3 | PRINCIPIOS DE LA CLONACIN DEL DNA BASADA EN CLULAS 135
O
DNA CCC
re la ja d o
DNA
s u p eren ro llad o
Fig. 5-8. DNA circular cerrado de forma covalente (CCC) y superenrollamlento de DNA.
A la izquierda se muestra en manera esquemtica DNA CCC (no se in

tent mostrar la estructura helicoidal doble). A menos que se haga un
corte con muesca en una de las dos cadenas de DNA, no puede re d
arse el retorcimiento de la doble hlice y la tensin inducida da lugar a
la formacin espontnea de una estructura superenrollada que se
muestra a la derecha. Sin embargo, la muesca en cualquiera de las ca
denas de DNA alivia la tensin y permite la rotacin del extremo libre.
mosmico o los crculos de plsmido que estn abiertos, lo cual po

sibilita separar el DNA recombinante del DNA de la clula hus
ped. Las molculas de DNA recombinante resultantes son idnticas
entre s (representan un fragmento de DNA blanco nico) y se de
nominan clonas de DNA.
5.3.4 Las genotecas de DNA son un amplio grupo de

clonas de DNA que representan una poblacin
de DNA de inicio compleja
Los primeros intentos de clonacin de fragmentos de DNA huma
nos en clulas bacterianas se concentraron en secuencias blanco que
eran muy abundantes en una poblacin de DNA de inicio particu
lar. Por ejemplo, las clulas humanas nucleadas contienen gran par
te del mismo grupo de secuencias de DNA, pero las poblaciones de
mRNA pueden ser muy diferentes. Aunque la poblacin de mRNA
en cada clula es compleja, algunas clulas estn dedicadas en par
ticular a sintetizar un tipo especfico de protena y por consiguien
te tienen pocas especies de mRNA predominantes (p. ej., gran
parte del mRNA que se forma en los eritrocitos consiste en mRNA
de globina a y (3). Puede utilizarse la enzima transcriptasa inver
sa (TI; polimerasa de DNA dependiente de RNA) a fin de elabo
rar una copia de cDNA cuya secuencia de bases es complementaria
al mRNA. En consecuencia, el cDNA de eritrocitos se enriquece
en grado considerable en cDNA de globina y ello facilita su aisla
miento.
Los mtodos modernos de clonacin de DNA ofrecen la posi
bilidad de producir conjuntos amplios de clonas de DNA (genote
cas de DNA) a partir de poblaciones de DNA de inicio en extremo
complejas (como el DNA genmico humano total). Este mtodo
permite que las secuencias de DNA que son muy raras en la pobla
cin de inicio estn representadas en una biblioteca de clonas de
DNA, en donde pueden aislarse de manera individual al seleccio
nar una colonia adecuada de clulas husped y amplificarla. Por lo

general se practican dos variedades bsicas de este mtodo, segn
sea la naturaleza del DNA de inicio: genotecas de DNA genmico
y genotecas de cDNA.
Se dice que las genotecas recin formadas no estn a m p lifica
das, aunque es un trmino errneo porque las clulas transformadas
de manera inicial se amplificaron para formar colonias de clulas se
paradas. Con frecuencia se permite que prosiga la formacin de co
lonias celulares en la parte superior de membranas que se colocan
sobre la superficie de agar nutriente en platos para cultivo estriles.
A continuacin es posible hacer copias de la biblioteca mediante rep lica ci n p o r sem b ra d o en p la ca en una membrana de tamao si
milar antes de extenderse sobre la superficie de un agar nutriente y
del crecimiento de colonias. En fechas ms recientes se diseminaron
colonias de clulas obtenidas de modo individual en configuracio
nes en parrilla sobre membranas adecuadas o dentro de fosos de pla
cas para microttulo en los que pueden guardarse por periodos
prolongados a -70C en presencia de un medio estabilizador de c
lulas, como el glicerol.
Para una distribucin mltiple se precisan g e n o te ca s a m p lifi
cadas. Se lavan en un medio de cultivo celular las clulas de fil
tros primarios representativos, se diluyen y estabilizan mediante
la presencia de glicerol o algn agente estabilizador alternativo. A
continuacin, en una etapa posterior, pueden sembrarse en placas
alcuotas individuales para regenerar la biblioteca. Sin embargo,
este paso de amplificacin adicional puede deformar la represen
tacin original de clonas celulares porque es posible que durante
la etapa de amplificacin haya ritmos diferenciales de crecimien
to de distintas colonias.
Genotecas de DNA genmico

En eucariotas complejas, como las de mamferos, todas las clulas
nucleadas tienen en esencia el mismo contenido de DNA y muchas
veces es conveniente preparar una biblioteca genmica de clulas
fcilmente accesibles, como los leucocitos. El material de inicio es
DNA genmico que se fragment en cierta forma, las ms de las
veces mediante digestin con una endonucleasa de restriccin.
Es tpico que se digiera el DNA genmico con un cortador de
4 pb, como M bol, que reconoce la secuencia GATC. Esta secuen
cia ocurre casi cada 280 pb en promedio en el DNA genmico hu
mano y, por consiguiente, hay pocas secuencias de DNA que
carezcan de un sitio de reconocimiento de esta enzima. La digestin
completa del DNA de inicio con M bol produce fragmentos muy
pequeos. En lugar de ello, se lleva a cabo la digestin parcial de
restriccin (concentracin baja de enzima, tiempo corto de incu
bacin, etc.) y de esta manera el corte slo tiene lugar en un nme
ro pequeo de los posibles sitios de restriccin.
La digestin parcial de restriccin no slo produce fragmentos
para clonacin grandes convenientes sino que, algo muy importan
te, tambin permite la fragm entacin aleatoria d el DNA. Por consi
guiente, para la localizacin de una secuencia especfica, el patrn
de corte es diferente en distintas copias de la misma secuencia de
DNA de inicio (fig. 5-9). Esta fragmentacin aleatoria asegura que
la biblioteca contenga tantas representaciones como sea posible del
DNA de inicio. Adems, tiene la ventaja de producir clonas con in
sertos superpuestos. Como resultado, despus de caracterizarse el in
serto de una clona, puede intentarse el acceso a clonas de la misma
regin general e identificar aqullas cuyos insertos muestran ciertas
similitudes con las de la clona original (vase recuadro 8-5).
136
CA
) CINC(
(i) Lisis c e lu la r
(i) E x tra c c i n d e D N A
(ii) D ig e sti n p a rc ial co n
n u c le a s a d e res tricci n
I 3
5
O)
12 l
00
m
\g j
13
C lu la s
n u c le a d a s
10
I
14
11
S e c u e n c ia s d e D N A
c ro m o s m ic o id n tic a s
c o rta d a s a le a to ria m e n te
15
Lig a r a v e c to r y
p ro c e d e r c o m o en
la fig u ra 5 -7
Fig. 5-9. Elaboracin de una biblioteca de DNA genmico.

Todas las clulas nucleadas de un individuo tienen el mismo contenido genmico de DNA, de tal manera que pueda utilizarse como material de origen
cualquier clula accesible con facilidad (p. ej., glbulos blancos). Debido a que el DNA se extrae de numerosas clulas con molculas de DNA idnticas,
el DNA aislado contiene grandes nmeros de secuencias de DNA idnticas. Sin embargo, la digestin parcial con una endonucleasa de restriccin corta el
DNA slo en un subgrupo pequeo de los sitios de restriccin disponibles y el patrn vara entre molculas individuales y el resultado es un corte casi
aleatorio. Por lo general, esto crea una serie de fragmentos de restriccin que, si derivan del mism o locus, pueden compartir algunas secuencias de DNA
comunes (p. ej., el fragmento 6 se superpone de modo parcial en los fragmentos 2 y 3, como se muestra, y asimismo los fragmentos 9 y 10, y 13 y 14).
La complejidad (nmero de clonas de DNA independientes)

de una biblioteca de DNA genmico puede definirse en trmi
nos de equivalentes de genoma (EG). Un equivalente de genoma de 1 , llamada b ib lio teca d e un d ob lez , se obtiene cuando el
nmero de clonas independientes es igual al tamao del geno
ma/tamao promedio del inserto. Por ejemplo, para una biblio
teca de DNA genmico humano con un tamao de inserto
promedio de 40 kb, 1 EG = 3 000 Mb/40 kb = 75 000 clonas
independientes. Una biblioteca como sta, que tiene 300 000
clonas, se denomina en ocasiones biblioteca cudruple porque
tiene cuatro equivalentes de genoma (EG). Sin embargo, debido
a la variacin del muestreo, el nmero de EG debe ser conside
rablemente mayor de uno para que tenga una alta posibilidad de
incluir cualquier secuencia particular dentro de esa biblioteca.
En consecuencia, en condiciones normales se intenta preparar
genotecas complejas (> 4 EG).
Genotecas de cDNA
Debido a que la expresin gnica puede variar en diferentes c
lulas y distintas etapas del desarrollo, el material de inicio para
crear genotecas de cDNA suele ser RNA total de un tejido espe
cfico o una etapa precisa del desarrollo de la embriognesis.
Puesto que la inmensa mayora del mRNA es poliadenilado, se eli
ge mRNA poli (A)+ mediante el enlace especfico a una secuencia
complementaria oligo(dT) o poli(U) conectada a una sefarosa sli
da o matriz de celulosa. El mRNA poli (A)+ aislado puede conver
tirse a continuacin, mediante transcriptasa inversa, en una copia
de cDNA de cadena doble. A fin de favorecer la clonacin, se ligan
a cada extremo del cDNA en la z a d ores o ligo n u cle tid o s (a dap ta
dores) de doble cadena que contienen sitios de restriccin apropia
dos (fig. 5-10).
5.3.5 Con frecuencia se logra la seleccin recombinante

mediante inactivacin insercional de un gen
marcador
Un requerimiento esencial para los sistemas de clonacin de DNA
basados en clulas es un mtodo para detectar las clulas que contie
nen la molcula vectora apropiada y, dentro de este grupo, el sub
grupo que posee el DNA recombinante. La seleccin generalizada
para recombinantes es til en la seleccin de genotecas de DNA
elaboradas a partir de poblaciones de DNA que no se han caracte
rizado tan bien. Sin embargo, cada vez es ms comn la seleccin
dirigida para estudiar d e form a especfica la presencia d e alguna se
cuencia conocida con anterioridad o una m uy relacionada con una
secuencia conocida.
Seleccin para clulas transformadas mediante molculas

vectoras
La identificacin de clulas que contienen la molcula vectora exi
ge ingeniera o seleccin de la molcula vectora para que conten
ga un gen marcador apropiado, cuya expresin proporciona un
medio para reconocer las clulas que lo contienen. Dos sistemas
marcadores de genes que se utilizan con amplitud se basan en lo
siguiente:
genes de resistencia a antibiticos. Debe elegirse una cepa de
clula husped que sea sensible a un antibitico particular, con
frecuencia ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol. El vector co
rrespondiente se prepara mediante ingeniera para que conten
ga un gen que confiera resistencia al antibitico. Despus de la
transformacin, se siembran las clulas en una placa de agar
que contiene el antibitico a fin de rescatar las clulas transfor
madas por el vector;
5.3
Clulas de rgano,
te jid o o e ta p a del
desarrollo especficas
(p. ej., clulas de
cerebro fetal)
(i) Lisis c e lu la r
(i) E x tra c c i n d e R N A
(Mi) C ro m a to g ra fa d e c o lu m n a
d e c e lu lo s a d e olg o (dT)
137
. AAAAAA
.A A A A A A
.A A A A A A
T ra n s c rip ta s a in versa
T T T T T T 5'
H e te r d p le x m R N A /c D N A
R N -a s a H u O H
5'
cD N A de
c a d e n a n ic a
P o lim e ra s a d e D N A + n u c le a s a S1
Â A A A A A 3 '
' T T T T T T 5 '
cD N A de
d o b le c a d e n a
L ig a r e n la z a d o re s d e l o lig o n u c le tid o
q u e c o n tie n e la s e c u e n c ia d e re c o n o c im ie n to E c o R I
NNNG AATTCNNN
NNNCTTAAGNNN
.A A A A A A N N N G A A T T C N N N N
.T T T T T T N N N C TTA A G N N N N
Eco Rl
. AAAAAA
T T T T T T
L ig a r al v e c to r
y p ro c e d e r c o m o
en la fig u ra 5 -5
Fig. 5-10. Elaboracin de una biblioteca de cDNA.

Con frecuencia, en el paso de transcriptasa inversa se utiliza un cebador olgo (dT) a fin de cebar la sntesis de la cadena de cDNA. En fecha ms re
ciente se emplearon mezclas de cebadores oligonucletdos aleatorios en lugar de proporcionar una representacin de secuencias ms normal. La RNasa H digiere de modo especfico RNA enlazado a DNA en un hbrido RNA-DNA. El extremo 3 ' del cDNA de cadena nica resultante tiene una tendencia
a hacer de nueva cuenta asas para form ar una horquilla corta. Eso puede usarse para cebar la sntesis de la segunda cadena mediante polimerasa de
DNA y a continuacin puede cortarse el asa corta resultante que une las dos cadenas mediante nucleasa S1 que corta de manera especfica regiones
de DNA de cadena nica.
complementacin con gen de galactosidasa (i. La clula hus

ped es un mutante que condene un fragmento del gen de galac
tosidasa (3, pero no puede elaborar ninguna galactosidasa (3
funcional. Se prepara el vector mediante ingeniera para que con
tenga un fragmento diferente del gen de galactosidasa 3. Despus
de la transformacin se observa la complementacin funcional', la
clula husped y los fragmentos de galactosidasa (3 codificados
por vector son capaces de combinarse para producir una enzi
ma activa. La actividad de la galactosidasa (3 funcional se valora
mediante la conversin de un sustrato incoloro, Xgal (5-bromo,
4-cloro, 3-indolil (3-D-galactopiransido), a un producto de co
lor azul.
Seleccin recombinante generalizada

Por lo general, las selecciones generalizadas para DNA recombinan
te se basan en inactivacin insercional: se disea el vector para que
contenga algn gen marcador que confiere cierto fenotipo que pue
de calificarse con facilidad y contiene dentro de l sitios de restric

cin nicos para insertar DNA extrao en el gen marcador, que se
inactiva en consecuencia y cambia el fenotipo. Con objeto de lo
grarlo, es habitual modificar el gen marcador al insertar en l un
polienlazador d e sitio d e clo n a ci n m ltiple, un oligonucletido
de doble cadena diseado para incluir secuencias de reconocimien
to de nucleasas de restriccin especficas (los sitios de restriccin
preexistentes para estas enzimas se eliminan del vector si es necesa
rio a fin de asegurar la presencia de sitios de clonacin nicos).
Debido a que el polienlazador es corto (cerca de 30 pb) y ml
tiplo de tres nucletidos de largo (con conservacin del marco de
lectura del gen marcador), no afecta la expresin del gen marcador.
Sin embargo, cuando se clona a continuacin un fragmento de
DNA extrao dentro del polienlazador, el gen marcador tiene una
insercin grande con la cual inactivarlo. Los sistemas empleados in
cluyen casi siempre:
selecciones basadas en galactosidasa (3. En un gen marcador
de galactosidasa (3, la inactivacin insercional tiene como
138
CAPTULO CINCO
AMPLIFICACIN DEL DNA: CLONACIN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CLUIAS
Los cambios de bases en el anticodn de un tRNA pueden permitir que

se inserte un aminocido en respuesta a un codn de detencin. El glutamato tiene dos codones, GAG y GAA, que son reconocidos por dos m o
lculas de tRNA diferentes. El tRNA61" en la parte superior lleva un
anticodn CUC que reconoce el codn de glutamato GAG. La mutacin
del gen de tRNA puede producir un tRNA61 mutante que tiene un cambio
C - A en la base 3 ' en el anticodn. Este tRNA mutante puede recono
cer ahora el codn de detencin UAG m bar y al insertar un glutamato su
prim e la seal de detencin mbar. El ejemplo en la parte Interior de la
figura ilustra una mutacin similar (C - * A) aplicada a la base 3 ' en el an
ticodn del otro tRNA61 , lo que genera en esta ocasin un tRNA mutante
que puede suprimir el efecto de un codn de detencin ocre.
Mutacin de un tRNA de glutamina para obtener un supresor mbar
C odn
G lu
5' G AG 3'
m bar
5' UAG 3'
A n tic o d n
3' C U C 5'
3' A U C 5'
I
I
I
1
I
1
tR N A
tR N A G,u
(C >A)
tR N A Glu*
(su p re so r
m b a r)
Mutacin de un tRNA de glutamina para obtener un supresor ocre

O c re
Codn
Glu
5 ' G A A 3'
5' UAA 3'
A n tic o d n
3' C U U 5'
3' A U U 5'
I
I
I
1
tR N A
|
1
tR N A Glu
(C >A)
tR N A Glu*
(su p re so r
ocre)
- ....... ....... 4 , * ^ . .
.. '
*7*i
......................... .......
...
Ufe
Recuadro 5-4. Importancia de los sitios de secuencia m arcados (SSM)
Los sitios de secuencia marcados son medios importantes para mapeo

porque la presencia de esa secuencia puede valorarse de manera muy
conveniente mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Casi
ningn SSM es polimrfico y en genomas que se secuenciaron se cono
ce con precisin la localizacin subcromosmica nica de cada segmen
to de secuencia marcado (SSM). A continuacin se muestra un ejemplo
de la forma en que se desarrolla el SSM a partir de una secuencia de DNA.
En un genoma complejo com o el humano, las posibilidades de enlace de
un cebador de 16 nucletidos de largo a una secuencia relacionada pero
diferente, aparte del blanco pretendido, no son insignificantes. Sin embar
go, en condiciones normales son muy bajas las posibilidades de que am
bos cebadores se enlacen a secuencias relacionadas no pretendidas que
tan slo se encontraban ambas en proximidad cercana y asim ismo en
una orientacin apropiada. La especificidad de la reaccin puede valo
rarse de manera sencilla al fraccionar el tamao de los productos de
am plificacin en un gel de agarosa. Si existe un producto de PCR po
tente, nico, del tamao aproximado esperado (141 pb en el ejemplo
anterior), hay una excelente posibilidad de que la valoracin sea espe
cfica para la secuencia blanco intentada, lo que define el sitio de se
cuencia marcado (SSM).
resultado clulas incoloras en presencia de Xgal, en tanto que

las clulas que contienen el vector no recombinante son azules;
selecciones basadas en tRNA supresor. Los genes tRNA supresores son mutantes y llevan una secuencia anticodn alte
rada complementaria de uno de los codones de terminacin
normales: UAA (ocre), UAG (m bar) o UGA (palo). En res
puesta al codn de detencin importante, el tRNA supresor
inserta un aminocido (vase recuadro 5-3). De manera carac-
1
40
5' CCCAGCGGGCCCGCGGCGCAGGGGCCCGGCGGGGCCCTGG
CEBADOR A
41
5' CAGTGAGCATCAGATA * 3'
80
GGCCGCCCGGCAGTGAGCATCAGATACAGAACCTAGACGA
81
120
ACCTAG GACCAGTACCTACAAGGTACT CTAGATGATCTAT
121
160
ACTGAGGATCCTATTCAGATCCTAGGTACCACACTGATTA
161
200
AGGATACTAGCTATACGGACATGGCATTACACCCCCGGGG 3'
<------ 3' TGCCTGTACCGTAATG 5'

CEBADOR B
terstica, la clula husped lleva un gen marcador defectuoso

diseado para que posea un codn de detencin prematuro,
que crea un fenotipo que es posible calificar con facilidad. Si
el vector lleva un gen de tRNA supresor adecuado para anular
la mutacin del gen marcador, se restablece el fenotipo de ti
po silvestre. La clonacin de DNA extrao dentro del gen de
tRNA supresor provoca inactivacin insercional y restablece ei
fenotipo mutante.
5.3 ! PRINCIPIOS DE LA CLONACIN DEL DNA BASADA EN CLULAS
A. S eleccin prim aria

Et-ategia de seleccin mediante PCR para la biblioteca ICI-YAC.
Se desarrollan de forma individual 35 000 clonas en 360 platos de
- icrottulos. Se combinan los cultivos de nueve platos (864 YAC) y
se utilizan para elaborar un fondo comn maestro de muestra de
TNA para seleccin
139
B) S elecc i n se cu n d aria
Se logra la seleccin tridim ensional m ediante
el anlisis del D N A preparado para placa, hileras
y fondo s com unes por colum na
U na d e ocho hileras
de fondos comunes
- (este fondo com n
tiene A1 -A 1 2 para
nueve placas)
Uno d e nueve
fondos comunes
de placa (es decir,
Mezcla de 864 DNA de YAC = 1 fondo comn maestro
to dos los YAC en

una placa)
Uno de los 12 fondos comunes por columna
(este fondo comn tiene A1-H1 para nueve placas)
Muestra de DNA analizada mediante PCR
4
- +1 5
Muestras de DNA analizadas mediante PCR
y
12
20
-+
A B C D E F G H
Fig. 5-11. Seleccin de una biblioteca basada en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
El ejemplo ilustra la seleccin de una biblioteca YAC humana. Se depositaron alrededor de 35 000 clonas individuales en ios 96 fosos de 360 platos de
microtitulo. Con el fin de facilitar la seleccin, se gener en total 40 fondos comunes maestros tras combinar todas las 864 clonas en grupos de nueve
platos de microtitulo (platos A-I). Modificado de Jones y cois. (1994), Genomics, 24, pp. 266-275 con autorizacin de Academic Press Inc. A) La selec
cin prim aria incluye la valoracin mediante PCR de los 40 fondos comunes maestros. En este ejemplo, tres fondos comunes maestros fueron positi
vos cuando se refirieron contra testigos positivos ( + ) y negativos ( - ) : fondos comunes 5 ,1 2 , 33. B) La seleccin secundaria identifica YAC nico
tras valorar diferentes subgrupos de los 864 YAC en un fondo comn maestro positivo, en este caso el fondo comn maestro 12. Seleccin tridim ensio
nal de cada uno de los nueve fondos comunes de la placa (de 96 YAC cada uno), ocho fondos comunes en hilera (de 106 YAC cada uno), 12 fondos
comunes de columna (de 72 YAC cada uno) e identificacin de un YAC positivo en la placa 12G (dibujo de la parte superior), hilera E (dibujo de la par
te media), columna 5 (dibujo inferior). Este ejemplo incluy la seleccin para YAC que contena una secuencia de cromosoma X annima. Tomado de
Jones y cois. (1994), Genomics 24 (1), 266-275, con autorizacin de Elsevier. El Dr. Sandie Herrell, University of Newcastle upon Tie, proporcion
gentilmente las fotografas.
Seleccin recombinante dirigida mediante hibridacin y PCR

La seleccin de una biblioteca de DNA se lleva a cabo casi siempre
de modo direccional al estudiar clulas para la presencia de una secuen
cia de DNA caracterizada antes o alguna relacionada con una se
cuencia de DNA conocida. Por ejemplo, podra seleccionarse una
biblioteca de DNA con insertos de clonas muy grandes a fin de re
cuperar una clona recombinante muy grande para anlisis funcio
nal, o bien seleccionarse una biblioteca de DNA de una especie poco
estudiada para secuencias relacionadas con un gen humano bien co
nocido. Esto puede lograrse mediante seleccin de DNA basada en
hibridacin o con reaccin en cadena de la polimerasa (PCR):
selecci n basada en h ib rid a ci n . Se marca una clona de DNA

especfica de inters en alguna forma y a continuacin se utiliza
como una sonda de hibridacin para identificar colonias de c
lulas que contienen la secuencia de inters (vase seccin 6.4.1).
seleccin basada en PCR. Una vez que se conoce una secuencia
de DNA es posible disear una valoracin de PCR especfica para
estudiar su presencia. Se dice a continuacin que la secuencia se
marc (ya que siempre puede reconocerse mediante la valoracin
de PCR especfica). Si la secuencia ocurre en un sitio (localiza
cin) dentro del genoma de inters, entonces se dice que es un si
tio de secuencia marcado (SSM; vase recuadro 5-4). Los sitios
140
) C IN CO
Cuadro 5-2. Tamaos de DNA insertado que pueden

obtenerse con diferentes vectores de donacin.
Vector de clonacin
Tamao del inserto
Vectores plsmidos estndar con gran

nmero de copias
0-5 kb
Vectores de insercin de bacterifago \
0-10 kb
Vectores de restitucin de bacterifago X
9-23 kb
Vectores csmidos
30-44 kb
Bacterifago P1
70-100 kb
Vectores PAC (cromosoma artificia! P1)
130-150 kb
Vectores BAC (cromosoma artificial

bacteriano)
hasta 300 kb
Vectores YAC (cromosoma artificial de

levadura)
5.4 Sistem as de clonacin para

a m p lific ar fragm entos de
diferentes tam aos
La clonacin del DNA basada en clulas se utiliza muchas veces co
mo un medio para producir cantidades de DNA puro para caracte
rizacin fsica y estudios funcionales de genes individuales, grupos de
genes y otras secuencias del DNA de inters. Sin embargo, el tama
o de las diferentes secuencias del DNA puede variar en notoria me
dida (p. ej., se sabe que los tamaos de los genes humanos varan
entre 0.1 kb y 2 Mb). Los primeros sistemas de clonacin basados en
clulas slo podan clonar fragmentos de DNA muy pequeos. Sin
embargo, en fecha reciente se lograron rpidos adelantos en los siste
mas de clonacin que hicieron posible clonar fragmentos de DNA
muy grandes (vase cuadro 5-2).
5.4.1 Los vectores plsmidos estndar proporcionan

un medio simple para clonar fragmentos
de DNA pequeos en clulas bacterianas
(y eucariotas simples)
0.2-2.0 Mb
de secuencia marcados son muy tiles para proporcionar mapas

fsicos generales de genomas (vase seccin 8 .3 .2 ), pero puede
aplicarse el mismo principio en la seleccin de genotecas. En este
caso, se guardan miles de clonas de clulas individuales y el DNA
recombinante aislado de cada una de ellas se deposita de modo
individual en fosos de platos para mltiples microttulos. Pueden
estudiarse fondos comunes de clonas de diferentes grupos de fo
sos -dispuestos en distintas jerarquas- para la presencia de un
SSM especfico a fin de identificar un foso que contiene el DNA
deseado y luego la clona celular original (vase fig. 5 - 11).
Con la finalidad de adaptar molculas de plsmidos naturales co

mo vectores de clonacin se llevan a cabo, en condiciones norma
les, varias modificaciones:
insercin de un g e n d e resisten cia a a n tib i tico s (para selec
cionar al vector; vase seccin 5.3.5);
insercin de un g e n m a rca d o r que incluye en su interior un
p o lien la z a d o r d e sitio d e clo n a ci n m ltip le (para seleccio
nar a los recombinantes; seccin 5.3.5).
Como ejemplo, el vector plsmido pUC19 contiene un polienlaza
dor con sitios de clonacin nicos para mltiples nucleasas de res-
Polienlazador MCS
400
420
440
460
. Sacl
Sroal
Xba I
P st I
H/ndIII
agtgaattCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGcgtaatcatggtcat
pUC19
2686 bp
* PR
Fig. 5-12. Mapa del vector plsm ido pUC19.

El origen de la replicacin (ori) deriv originalmente de un plsmido parecido a ColE1, pMB1. El gen de resistencia a ampicilina (ApR) permite seleccio
nar clulas que contienen la molcula vectora. Se incluye una porcin del gen la c l y se expresa para dar un fragmento terminal amino de galactosidasa
beta. A ste lo complementa un gen mutante la c l en la clula husped: pueden relacionarse los productos del vector y las secuencias de la clula hus
ped la c l, aunque inactivos de forma individual, para form ar un producto funcional. Se inserta el sitio de clonacin mltiple polienlazador de 54 pb (letras
maysculas) en el componente vector la c l (letras minsculas) de manera tal que preserve el marco de lectura y la expresin funcional. Sin embargo, la
clonacin de un inserto en mltiples sitios de clonacin (MSC) causa inactivacin insercional y ausencia de actividad de galactosidasa p.
5.4
SISTEMAS DE CLONACIN PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAOS
C u b ie rta p ro te n ic a
Fig. 5-13. El fago
141
E xtre m o s
s a lie n te s d e
s e c u e n c ia s eo s
X puede penetrar en las vas ltica y lisognica.
triccin y un gen de resistencia a ampicilina que permite identifi

car clulas transformadas (fig. 5-12). Adems, se logra la seleccin
de recombinantes mediante la inactivacin insercional de un com
ponente del gen de galactosidasa p y se proporciona una porcin
complementaria de este gen mediante una clula husped de Escherichia coli modificada.
5.4.2 Los vectores lambda y csmido proporcionan

medios eficientes para clonar fragmentos de DMA
moderadamente grandes en clulas bacterianas
La principal desventaja de los vectores plsmidos reside en que su ca
pacidad para aceptar fragmentos de DNA grandes es muy limitada:
la mayor parte de los insertos tiene unas cuantas kilobases de largo y
son muy raros los insertos mayores de 5 a 10 kb. Adems, los mto
dos estndar de transformacin de clulas bacterianas con vectores
plsmidos son relativamente ineficientes. Con objeto de superar es
tas dificultades, se dirigi la atencin a una etapa ms temprana en
cuanto a la posibilidad de utilizar el bacterifago lambda como un
vector de clonacin. La partcula de virus X tipo silvestre (virin)
contiene un genoma de casi 50 kb de DNA de doble cadena lineal

empacado dentro de una cubierta protenica y result un mecanismo
de infeccin de clulas de E. coli muy eficiente.
Una vez que se fija el virin X a la clula bacteriana, se dese
cha la cubierta protenica y se inyecta el DNA lambda en la clula.
En las partes terminales del DNA lambda se encuentran extremos
5 ' salientes de 12 nucletidos de largo y con secuencia de bases
complementarias. Debido a que estas salientes 5' grandes pueden
formar pares de bases, son extremos pegajosos muy eficaces, simila
res a los extremos pegajosos pequeos, pero ms cohesivos que ellos,
generados por ciertas nucleasas de restriccin (vase seccin 5.3.2).
Estas propiedades de cohesin se reconocen por el nombre que se
proporciona a esta secuencia (la secuencia eos). Una vez en el inte
rior de la clula bacteriana, las secuencias eos forman pares de bases
y sellan los cortes en muesca (nicks) mediante ligasas celulares y el
resultado es la formacin de un DNA circular de doble cadena. Con
posterioridad, el DNA lambda puede seguir dos vas alternativas
(fig- 5-13):
ciclo ltico. De manera inicial se replica el DNA X en forma
bidireccional y despus mediante un modelo de crculo de
142 ; CAPT ULO CINCO
R eg i n no
e s e n c ia l
P ro te n a s d e
re c u b rim ie n to
In te g ra c i n y
re c o m b in a c i n
R eg u laci n , sn tes is d e D N A
/ y lisis d e l h u s p e d
Fig. 5-14. Mapa del genoma X que muestra las posiciones de genes (barras verticales).
En los vectores de reemplazo x se elimina la regln no esencial mediante digestin con endonucleasa de restriccin y se deja un brazo \ izquierdo y
uno derecho. Puede ligarse un fragmento de DNA extrao a los dos brazos en lugar del fragmento original de relleno", lo que proporciona tamaos m
ximos del inserto mayores de 20 kb.
L is g en o X in d u cid o
E. c o li B H B 2 6 8 8
Eam
sin p ro te in a E
C o la s X
P ro te in a D
P ro te n a s d e e n s a m b le
P ero n o p re c a b e z a s y a
q u e n o h a y p ro te in a E
L is g en o X in d u c id o
c o li B H B 2 6 9 0
D am => sin p ro te in a D
C o la s X
P re c a b e z a s c o n p ro te in a E
P ro te n a s d e e n s a m b le
P e ro e m p a c a m ie n to d e D N A
b lo q u e a d o y a q u e no hay
p ro te in a D
L isar y m e z c la r en p re s e n c ia d e D N A
re c o m b in a n te fla n q u e a d o p o r
se c u e n c ia s eo s e s p a c ia d a s p o r
~ 4 0 -5 0 kb (v as e p. ej., fig .5 -1 6 ).
- 4 0 kb d e D N A re c o m b in a n te
C abeza X
C o la X
Fig. 5-15. Puede llevarse a cabo in vitro el empacamiento de DNA en una cubierta protenica de fago lambda con un lisado mixto de dos lisgenos
\ mutados.
El empacamiento in vivo normal de DNA x supone primero elaborar precabezas, estructuras compuestas de la protena cpside mayor codificada por el
gen E. Se inserta en la precabeza una unidad de longitud de DNA x y se prepara la unidad de longitud mediante el corte de sitios eos vecinos. A conti
nuacin se inserta una protena D cpside menor en las precabezas para completar la maduracin de la cabeza y los productos de otros
genes sirven como protenas de ensamble, lo cual asegura la unin de las colas completas a las cabezas completas. Un defecto de la produccin de
protena E, que resulta de una mutacin mbar introducida en el gen E (am), impide que se formen las precabezas mediante BHB2688. Una mutacin
mbar en el gen D (Dm ) imposibilita la maduracin de las precabezas, con el DNA incluido, dentro de cabezas terminadas. Sin embargo, los componen
tes del lisado mixto de BHB2688/BHB2690 complementan entre s la deficiencia y proporcionan todos los productos para el empacamiento correcto.
arrollamiento que genera multmeros lineales de la longitud de

unidad. Se sintetizan protenas de recubrimiento y se recortan
los multmeros X en los sitios eos a fin de generar longitudes de
unidad de genoma X que se empacan dentro de las cubiertas
protenicas. Algunos de los productos del gen X lisan la clula
husped y permiten que escapen los viriones e infecten nuevas
clulas.
estado lisognico. El genoma X posee un gen att que tiene un
homlogo en el cromosoma de E. coli. La aposicin de los dos
genes att puede propiciar la recombinacin entre los genomas
X y E. coli y la integracin subsecuente del DNA X dentro del
cromosoma de E. coli. En ese estado, el DNA X se describe co

mo provirus y la clula husped como lisgeno porque, si
bien el DNA X puede permanecer integrado de modo estable
por periodos prolongados, tiene la capacidad de separarse del
cromosoma husped y penetrar en el ciclo litico (fig. 5-13). Los
genes necesarios para la funcin lisognica se localizan en un
segmento central del genoma X (fig. 5-14).
Dos genes reguladores, el y ero, controlan la penetracin del ci
clo lrico o el estado lisognico. Estos dos genes son mutuamente
antagnicos: en el estado litico, domina la protena ero y condu
ce a la represin de el, en tanto que en el estado lisognico
5.4
SISTEMAS DE CLONACIN PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAOS
143
B am H I
Z \ A genm ico blanco
Mbo I
parcial
S eleccin
del tam ao
3 0 -4 2 kb
: g. 5-16. La ligadura a molculas vectoras csmidas cortadas puede producir concatmeros de vector y blanco, que dan por resultado un frag- ento de ONA exgeno grande flanqueado por secuencias eos.
i : nina el represor fl y suprime la transcripcin de otros genes

L incluido el ero. En clulas husped que crecen con normali i , se favorece el estado lisognico y se replica el genoma X.
_nto con el DNA cromosmico del husped. El dao de las c
lulas husped favorece una transicin al ciclo ltico y ello posir:l;ta que el virus escape de la clula daada e infecte nuevas
clulas.
A fin de disear vectores de clonacin adecuados basados en X
-je necesario crear un sistema que hiciera posible fijar el DNA ex
trao al replicn X in vitro y que el DNA recombinante resultante
raer capaz de transformar clulas de E. coli con gran eficiencia. Es
to ltimo se logr tras desarrollar un sistema de empaque in vitro, que simul la forma en que se empaca el DNA X tipo silvestre
en una cubierta protenica, lo que suministr una gran eficiencia de
infeccin (fig. 5-15).
En las secciones siguientes se describen varios tipos mayores de
vectores de clonacin que se desarrollaron al modificar el fago X o
usar la seleccin del tamao impuesta por secuencias eos.
R eem plazo d e v ecto res A. Slo las molculas de DNA de 37 a
52 kb de largo pueden empacarse con estabilidad dentro de la
partcula X. El segmento central del genoma X contiene genes
necesarios para el ciclo lisognico, pero no esenciales para la
funcin ltica. Como resultado, pueden eliminarse y reempla
zarse por un fragmento de DNA extrao. De esta forma es po
sible clonar DNA extrao hasta de 23 kb de largo y estos
vectores se emplean a menudo para elaborar genotecas de
DNA genmico;
in sercin d e v ecto res A. Los vectores X que se utilizan para ela
borar genotecas de cDNA no requieren una capacidad de inclu
sin grande (casi todos los cDNA tienen < 5 kb de largo). El
diseo de vectores de insercin incluye con frecuencia modifi
cacin del genoma X para posibilitar la clonacin insercional
dentro del gen d;
v ecto res csm id os que contienen secuencias eos insertadas en
un vector plsmido pequeo. Es posible clonar grandes frag
mentos de DNA extrao (alrededor de 30 a 44 kb) mediante
estos vectores en una reaccin de empacamiento in vitro por
que muchas veces el tamao total del vector csmido es de
8 kb (fig. 5-16).
5.4.3 Es posible clonar grandes segmentos de DNA

en clulas bacterianas con vectores basados
en bacterifago P1 y plsmidos de factor F
Vectores de cromosoma artificial bacteriano (BAC)
Muchos vectores usados para la clonacin de DNA en clulas bac
terianas se basan en el nmero (grande a mediano) de copias de re
plicones. El nmero de copias grande tiene como resultado una
produccin considerable de DNA: cada clula en la que se propaga
una molcula vectora posee varias a mltiples copias de la molcula
vectora. Una desventaja importante es que estos vectores muestran
con frecuencia inestabilidad estructural de insertos y ello causa delecin o reordenamiento de porciones del DNA clonado. Esta ines
tabilidad es en particular comn en insertos de DNA de origen
eucariota, en los que ocurren con frecuencia secuencias repetidas.
Como resultado, es difcil clonar y conservar intacto DNA grande
en clulas bacterianas.
Para superar esta limitacin, en fecha reciente se enfoc la
atencin en vectores basados en replicones con nmeros de copias
bajos, como el plsmido de fecundidad de E. coli, el factor F. Es
te plsmido contiene dos genes, parA y parB, que conservan el
nmero de copias del factor F en una a dos por clula de E. coli.
Los vectores basados en el sistema de factor F son capaces de
aceptar fragmentos grandes de DNA extrao (> 300 kb). Los recombinantes resultantes pueden transferirse con gran eficiencia al
interior de clulas bacterianas mediante electroporacin (un m
todo de exposicin de las clulas a grandes voltajes para alterar la
permeabilidad selectiva de sus membranas plasmticas). Sin em
bargo, debido a que los cromosomas artificiales bacterianos (BAC)
contienen un nmero bajo de copias de replicn, slo es posible
recuperar de las clulas husped cantidades bajas de DNA recom
binante.
Vectores de bacterifago P1 y cromosomas artificiales P1

(PAC)
Ciertos bacterifagos tienen genomas relativamente grandes y per
miten por consiguiente la posibilidad de desarrollar vectores que
pueden incluir fragmentos grandes de DNA extrao. Uno de ellos
144 j CAPTULO CINCO j AMPLIFICACIN DEL DNA: CLONACIN DE DNA POR PCR Y BASADA EN CLULAS
5.4.4 Los cromosomas artificiales de levadura (YAC)

permiten clonar fragmentos de megabase
es el b a cteri fa go P l que, al igual que el fago X, empaca su genoma en una cubierta protenica; se empacan 1 1 0 a l l 5 k b d e DNA
lineal en la cubierta protenica P l. En consecuencia, se disearon
vectores de clonacin P 1 en los cuales se incluyeron componentes
P l en un plsmido circular.
Es posible cortar el vector plsmido Pl para generar dos bra
zos vectores a los cuales pueden ligarse hasta 100 kb de DNA ex
trao y empacarse dentro de una cubierta protenica Pl in vitro.
Casi siempre se favorece la adsorcin del fago P 1 recombinante a
un husped adecuado, despus de lo cual se inyecta el DNA Pl
recombinante en la clula, se circulariza y puede amplificarse (ex
tenderse) (Sternberg, 1992). Un adelanto en los lmites del tama
o de insertos que acepta el sistema de clonacin P l bsico es el
uso del bacterifago T4 en sistemas de empacamiento in vitro con
vectores Pl que hace posible recuperar insertos hasta de 122 kb
de tamao. En fecha ms reciente, se combinaron caractersticas de
los sistemas Pl y factor F para producir sistemas de clonacin
(Iouannou y cois., 1994).
El sistema para la clonacin de fragmentos de DNA muy grandes que

se emplea con mayor frecuencia incluye la formacin de cromosomas
artificiales de levadura (YAC; vase Schlessinger, 1990). Es difcil o
imposible propagar ciertas secuencias eucariotas, en especial las que in
cluyen organizaciones de secuencia repetida, clulas bacterianas que
carecen de estos tipos de organizacin de DNA, pero que puede anti
ciparse que se tolerarn en clulas de levadura eucariotas. Sin embargo,
la principal ventaja es la capacidad para clonar fragmentos de DNA
muy grandes. Este desarrollo se inici cuando se reconoci que para la
funcin cromosmica normal no se requiere la gran masa de DNA en
un cromosoma. Como se detalla en la figura 2-5, los componentes
funcionales esenciales de los cromosomas de levaduras son tres:
se requieren cen tr m ero s para la disyuncin de cromtides
hermanas en la mitosis y cromosomas homlogos en la prime
ra divisin meitica;
S itio d e clo n a c i n
E coRI
D ig e sti n co n S a m H I y E co R I |
TEL
TRP A R S C E N
URA
TEL
TRP A R S C E N
D N A b la n co
D ig e sti n p a rc ial co n E c o R I
t y
TEL
L ig a r
URA
TEL
Fig. 5-17. Elaboracin de YAC.

Las secuencias de DNA vector incluyen: CEN4, secuencia de centrmeros; TEL, secuencias de telmero; ARS1, secuencias de replicacin autnoma; Amp,
gen que contiere resistencia a ampicilina; ori, origen de replicacin para la propagacin en un husped E. coli. El vector se emplea con una clula husped
de levadura especializada, AB1380, que es de color rojo porque lleva una mutacin ocre en un gen, ade-2, que participa en el metabolismo de la adenina, y
tiene como resultado la acumulacin de un pigmento rojo. Sin embargo, el vector lleva un gen SUP4, un gen tfNA supresor (vase recuadro 5-3), que
supera el efecto de la mutacin ocre ade-2 y restablece la actividad tipo silvestre, con colonias incoloras resultantes. Las clulas husped tambin estn
diseadas para tener alelos recesivos trp l y ura3 que pueden complementarse con los alelos TRP1 y URA3 correspondientes en el vector, lo cual proporcio
na un sistema de seleccin para identificar clulas que contienen el vector de cromosoma artificial de levadura (YAC). La clonacin de un fragmento de DNA
extrao dentro del gen SUP4 causa inactivacin insercional de la funcin del gen supresor y ello restablece el fenotipo mutante (color rojo).
5.4 | SISTEMAS DE CLONACIN PARA AMPLIFICAR FRAGMENTOS DE DIFERENTES TAMAOS
145
Fig. 5-18. Produccin de DNA recombinante de cadena nica mediante vectores M13 y fagmidos.
A) Vectores M13. Los vectores M13 son form as repiicativas (FR) de derivados M13 que contienen un componente no funcional del sistema galactosidasa de la c l que puede complementarse en su funcin por la presencia de un componente complementario lacZ en la serie E. cot JM. El DNA recombinante M13 de doble cadena penetra en el ciclo normal de replicacin del DNA para generar numerosas copias del genoma, antes de cambiar a
la produccin de DNA de cadena nica (slo cadena + ). El fago recombinante maduro sale de la clula sin lisis. B) Vectores fagm idos. La serie
pBluescript de vectores plsmidos contiene dos orgenes de replicacin: uno normal a partir de Co/E1 y un segundo del fago f1 que, en presencia de
un genoma fago filamentoso, especifica la produccin de DNA de cadena nica. La superinfeccin de clulas transformadas con fago WI13 da lugar a
dos tipos de partculas parecidas a fago liberadas de las clulas: el fago superlnfectante original y los recombinantes plsmidos con una cubierta protenica de fago. Se utilizan cebadores de secuenciacin especficos para el vector fagmldo a fin de obtener secuencias no ambiguas.
146
CAPTULO CINCO
se necesitan telrn eros para la replicacin completa de molcu

las lineales y proteger as los extremos del cromosoma de ata
ques de nucleasas;
Se precisan elementos de secu en cia d e rep lica cin a u tn om a
para la replicacin autnoma del DNA cromosmico y se pien
sa que actan como orgenes de replicacin especficos.
En cada caso, el segmento de DNA necesario para la actividad fun
cional in vivo en levaduras se limita cuando ms a unos cuantos
cientos de pares de bases de DNA (fig. 2-5). Como resultado, fue
posible idear un sistema de clonacin novedoso basado en el uso de
replicones cromosmicos (elementos de secuencia de replicacin au
tnoma) como una alternativa a los replicones extracromosmicos
(los que se encuentran en plsmidos y bacterifagos) e incluye la
formacin de un cromosoma artificial.
Con objeto de preparar YAC basta combinar cuatro secuencias
cortas que pueden funcionar en clulas de levadura: dos telrneros, un
centrmero y un elemento ARS, adems de un fragmento de DNA
extrao de tamao adecuado para obtener una molcula de DNA li
neal en la cual se coloquen correctamente secuencias de telrneros en
las terminales (fig. 5-17). El producto resultante no puede transfectarse de manera directa dentro de clulas de levadura. En lugar de ello,
es necesario tratar las clulas de levadura en forma tal que se eliminen
las paredes celulares externas. Los esferoplastos de levadura resul
tantes pueden aceptar fragmentos exgenos pero son inestables des
de el punto de vista osmtico y es necesario incluirlos en agar. La
eficiencia total de transformacin es muy baja y asimismo la pro
duccin de DNA clonado (alrededor de una copia por clula). No
obstante, la capacidad para clonar grandes fragmentos de DNA
exgeno (hasta 2 Mb) hizo que los YAC fueran un medio vital en
el mapeo fsico (vase seccin 8.3.2).
5.5 Sistemas de clonacin para
producir DNA de cadena nica

y mutagenizado
Son tiles las clonas de DNA de cadena nica para varias aplicacio
nes, incluida la secu en cia ci n d e DNA (debido a que las secuencias
obtenidas se leen con mayor claridad y facilidad) y la mutagnesis
dirigida a sitio (en la cual es preciso alterar un sitio especfico en un
DNA clonado en una forma precisa y predeterminada). Las muta
ciones dirigidas a sitio pueden disearse para crear sustituciones es
pecficas de nucletidos especficos, deleciones, entre otros, que
pueden ayudar a identificar residuos aminocidos fundamentales u
otras secuencias de importancia funcional si se dispone ya de una va
loracin funcional para la secuencia de DNA de inters.
5.5.1 El DNA de cadena nica para utilizarse en la

secuenciacin de DNA se obtiene con vectores
M13 o fagmidos o amplificacin lineal por PCR
Por lo regular se utilizan como plantillas clonas de DNA recombi
nante de cadena nica para secuenciacin de DNA con el uso de
vectores basados en ciertos bacterifagos que adoptan de manera
natural una forma de DNA de cadena nica en cierta etapa de su
ciclo de vida. Debido a que ya se conoce la secuencia del vector, es
conveniente emplear un cebador de secuenciacin especfico de
vector nico que sea complementario a una secuencia en el vector
adyacente al sitio de clonacin.
Vectores M13
MI 3 es un b a cteri fa go fila m en to so que puede infectar ciertas ce
pas de E. coli. Su genoma circular de cadena nica de 6.4 kb est
encerrado en una cubierta protenica que forma una estructura fi
lamentosa larga. Despus de adsorberse a la bacteria, penetra el ge
noma M13 en la clula bacteriana y se convierte en una forma de
doble filamento, la fo r m a rep lica tiva (FR) que sirve como planti
lla para hacer numerosas copias del genoma. Despus de un cierto
tiempo, un producto codificado por fago cambia la sntesis de
DNA a la produccin de cadenas nicas que migran a la membra
na celular. En este sitio se encierran en una cubierta protenica y se
expulsan cientos de partculas de fago maduras de la clula infecta
da sin lisarse esta ltima. Los vectores M 13 se basan en la FR con
un sitio de clonacin mltiple para aceptar insertos extraos de ta
mao limitado. Los ltimos pueden transfectarse en cepas adecua
das de E. coli. Despus de un cierto periodo, se obtienen partculas
fago y se despojan de sus cubiertas protenicas a fin de liberar DNA
recombinante de cadena nica para uso directo como plantilla en
reacciones de secuenciacin de DNA (fig. 5-18A).
Vectores fagmido
Es posible insertar un segmento pequeo del genoma de un bacteri
fago filamentoso, como M13 (o los fagos filamentosos relacionados
fd o fl), en un plsmido para formar un vector hbrido conocido co
mo fagmido. Las secuencias de fago seleccionadas contienen todos
los elementos de accin cis necesarios para la replicacin y ensamble
del DNA dentro de partculas fago. Posibilitan el xito en la clonacin
de insertos de varios kilobases de largo (a diferencia de los vectores
M I3 en los que dichos insertos tienden a ser inestables). Despus de
la transformacin de una cepa adecuada de E. coli con un fagmido
recombinante, se superinfectan las clulas bacterianas con un fago co
laborador filamentoso, como f l , que se requiere para proporcionar la
protena de recubrimiento. Las partculas de fago secretadas de las c
lulas superinfectadas son una mezcla de fago colaborador y fagmidos
recombinantes (fig. 5-18B). La poblacin de DNA de cadena nica
mixta puede utilizarse de forma directa para la secuenciacin del
DNA porque el cebador para iniciar la sntesis de la cadena de DNA
est diseado para enlazarse de manera especfica a una secuencia del
vector fagmido adyacente al sitio de clonacin. Los vectores fagmi
dos usados de modo general incluyen la serie pEMBL de plsmidos y
la familia pBluescript (vase fig. 5-18B).
Amplificacin lineal por PCR

En una forma de secuenciacin basada en PCR que se conoce como
secu en cia ci n d e ciclo (recuadro 7-1) se utiliza una reaccin de PCR
modificada para generar plantillas de cadena nica para secuencia
cin. Esto se logra al utilizar slo un cebador aislado de tal manera que
se acumule producto de cadena nica, pero en una forma lineal en lu
gar de la amplificacin exponencial que se observa en la PCR normal.
5.5.2 La mutagnesis de oligonucletido incompatible

puede crear un cambio predeterminado de un
nucletido nico en cualquier gen clonado
Muchas valoraciones in vitro de la funcin gnica se dirigen a
obtener informacin sobre la importancia de aminocidos indi
viduales en el polipptido codificado. Esto puede ser relevante
5.5 i SISTEMAS DE CLONACIN PARA PRODUCIR DNA DE CADENA NICA Y MUTAGENIZADO
147
C ebador
m u ta g n ic o
S e c u e n c ia
m u ta n te
S e c u e n c ia
tip o silve stre
H om od plex tip o silvestre
H e te ro d p le x d e
d o b le c a d e n a
S n te sis d e n u e vo D N A
H o m o d p le x m u ta n te
Fig. 5-19. La mutagnesls de incompatibilidad de oligonucletido puede crear un punto de mutacin deseado en un sitio predeterminado nico
dentro de una molcula de DNA clonada.
.a figura slo ilustra uno de los muchos diferentes mtodos de mutagnesis de incompatibilidad de oligonucletido basada en clulas. El ejemplo ilustra
uso de un oligonucletido mutagnico para dirigir la sustitucin de un nucletido aislado en un gen. El gen se clona en M13 a fin de generar un DNA
^com binante de cadena nica. Se disea un cebador oligonucletido para que su secuencia sea complementaria a un porcin de la secuencia del gen
que incluye el nucletido por mutar (A) y que contiene la base no complementaria deseada en la posicin (C, no T). A pesar de la incompatibilidad intern(a. es posible el templado (annealing) del cebador mutagnico y puede extenderse la sntesis de la segunda cadena mediante polimerasa de DNA y se
carse la hendidura con llgasa de DNA. El heterodplex resultante puede transformarse en E coli, en tanto que es posible recubrir las dos poblaciones de
-ecombinantes: tipo silvestre y homodplex muante. El ltimo puede identificarse mediante hibridacin molecular (con el cebador mutagnico como una
sonda olingonucletida especfica de alelo; vase fig. 6-11) o con mtodos de amplificacin especficos de alelo basados en PCR (vase fig. 5-4).
cuando se intenta estimar si una mutacin de sentido errneo

particular que se encuentra en un gen de una enfermedad cono
cida es patognica o por lo general slo a fin de valorar la con
tribucin de un aminocido especfico a la funcin biolgica de
una protena.
Un mtodo general difundido incluye la clonacin del gen o
cDNA en un vector M13 o fagmido a fin de recuperar DNA recombinante de cadena nica (vase seccin previa). A continuacin
se disea un cebador oligonucletido mutagnico cuya secuencia se
complementa de forma perfecta con la secuencia del gen en la re
gin por mutar, excepto por una diferencia aislada: en el sitio d e la
mutacin pretendida lleva una base que es complementaria para el nu
cletido m uante deseado en lugar del original. En seguida se permi
te que el oligonucletido mutagnico cebe la nueva sntesis de
DNA para crear una secuencia complementaria de longitud com
pleta que contiene la mutacin deseada. El heterodplex recin for
mado se utiliza para transformar clulas y es posible identificar los
genes mutantes deseados al seleccionarlos para la mutacin (vase
fig- 5-19).
Tambin es posible introducir otras mutaciones a escala peque
a, adems de las sustituciones de nucletido nico. Por ejemplo,
puede introducirse una delecin de tres nucletidos que tiene como
resultado la eliminacin de un aminocido aislado del polipptido
codificado o una insercin que aade un nuevo aminocido. A con
dicin de que el oligonucletido mutagnico sea lo bastante largo,
es capaz de unirse de modo especfico a la plantilla del gen incluso
si existe una gran incompatibilidad central. Es posible introducir
mutaciones ms grandes an si se utiliza mutagnesis de casete, en
cuyo caso se elimina una regin especfica de la secuencia original
del gen original y se reemplaza por casetes de oligonucletidos (Bedwell y cois., 1989).
5.5.3 La mutagnesis basada en PCR incluye el

acoplamiento de secuencias o grupos
qumicos deseados a una secuencia blanco
y mutagnesis especfica de sitio
La mutagnesis dirigida a sitio mediante PCR es cada vez ms
usada y se han diseado varias medidas para permitir sustitucio
nes, deleciones e inserciones de bases (vase ms adelante,
Newton y Graham, 1997). Adems de producir mutaciones pre
determinadas especficas en un DNA blanco, una forma de mu
tagnesis que se conoce como mutagnesis de adicin 5' permite
aadir una secuencia o grupo qumico deseado en forma muy si
milar a la que suele lograrse mediante ligadura de enlazadores
oligonucletidos.
La mutagnesis de adicin 5' es una prctica de uso comn en
la que se aade una nueva secuencia o grupo qumico al extremo 5'
de un producto de PCR con la creacin de cebadores que tienen la
secuencia especfica deseada para la parte 3' del cebador, en tanto
que la parte 5' del cebador contiene la secuencia novedosa o una
secuencia con un grupo qumico unido. La secuencia 5 adicional
no participa en la primera etapa de templado (annealing) de la reac
cin de PCR (slo la parte 3' del cebador es especfica para la se
cuencia blanco), pero de manera subsecuente se incorpora en el
producto amplificado, lo que genera as un producto recombinante (fig. 5-20A). Varias alternativas habituales para la secuencia 5'
incluyen: d) un sitio de restriccin apropiado, que puede facilitar la
clonacin subsecuente de DNA basada en clulas; b) un compo
nente funcional, por ejemplo una secuencia promotora para expre
sin de impulso; c) un nucletido modificado que contiene un
grupo rastreador o un grupo marcado, como un nucletido biotinilado o fluorforo.
148
CAPITULO CINCO
Mutagnesis de cebador incompatible. El cebador (nucletido iniciador) est diseado para que slo sea en parte complemen
tario respecto del sitio blanco, pero en forma tal que an se una de
manera especfica a l. De modo inevitable, eso significa que la mu
tacin se introduce cerca del extremo final del producto de la reac
cin en cadena de la polimerasa (PCR). Como se ilustra en la figura
18-8, este mtodo se explora al introducir un sitio de restriccin
diagnstica artificial que hace posible seleccionar una mutacin co
nocida. Tambin pueden introducirse mutaciones en cualquier
punto dentro de una secuencia elegida si se usan cebadores incom
patibles. Se han ideado dos reacciones mutagnicas en las cuales los
dos productos de PCR separados tienen secuencias parcialmente
superpuestas que contienen la mutacin. Se combinan los produc
tos desnaturalizados para generar un producto ms grande con la
mutacin en una localizacin ms central (Higuchi, 1990; vase
fig. 5-20B).
A)
s
.
-----------3
....
.......
5'
^
3
...... 5'
Los sistemas de clonacin que se describen en la seccin 5.4 se

emplean cuando el objetivo es tan slo amplificar el DNA intro
ducido a fin de obtener cantidades suficientes para una diversi
dad de estudios estructurales y funcionales subsecuentes. Sin
embargo, en el caso de secuencias gnicas, hay muchas circuns
tancias en las que en lugar de amplificar y propagar slo el DNA
clonado, es aconsejable expresar el gen en cierta forma (clona
cin de expresin). En cada caso, el sistema de clonacin nece
sita proporcionar seales de expresin apropiadas. La clonacin
de expresin puede llevarse a cabo con sistemas basados en PCR,
pero a menudo se emplean sistemas de clonacin basados en c
lulas. Es posible utilizar una gran variedad de sistemas de clona
cin, de acuerdo con lo siguiente:
B)
3
P C R -A j
|
I
S istem as de clonacin diseados

para expresar genes
5.6
1M
2
-------------------S o t t ----------------------- 3:
..................... ....... ......... = 5'
n
n i--------------,
P C R -B
--------------- ^
1+1M
W
i
r ----
5 ' ........- ................

3'
3 ' 1... ............................ 5'
y
*
E lim inar c e b a d o re s . C o m b in a r A + B,
d e s n a tu ra liz a r y te m p la r o tra ve z
(reannea) p a ra fo rm a r h e te ro d p le x
5 ' ---------------------------------------- 3'

3'
--- -----------------
3 ' r--------------
= 5'
5 ' * -----------------------------------------3 '

------------------ ^ = 5 '
^
3 ' e x te n s i n
5 '-------------------------- *-------------------------* 3'

3 ' -------------------- .----------<=^ --------
5'
P C R con
1+ 2
5 ' ---------------------------------------- * ---------------------------------------- 3'
3 ' ............................... ^ ........................
... - 5'
Fig. 5-20. M utagnesis de PCR.

A) M u tag n esis a ad ida 5'. Es posible m odificar los cebadores en el extremo 5 ' a fin de introducir, por ejem plo, un grupo marcado (p. ej.,
fig. 7-1 1), una secuencia que contiene un sitio de restriccin apropiado o un prom otor fago para expulsar la expresin gnica. B) M u tag n esis
e s p e c ific a de s itio . La m utagnesis que se m uestra puede crear un producto am plificado con una m utacin predeterm inada especfica locali
zada en un segm ento central. Las reacciones de la PCR A y B se consideran segm entos de DNA de am plificacin superpuestos que contienen
una m utacin introducida (por la incom patibilidad de bases deliberada mediante un cebador muante: 1M o 2M ). Despus de com binar los dos
productos, desnaturalizarlos y perm itir que se tem plen (reanneai), la polim erasa de DNA puede extender el extremo 3' de heterodplex con ex
trem os 3' en receso. Con posterioridad, puede am plificarse un producto de longitud com pleta con la m utacin introducida en un segmento
central con tan slo los cebadores externos 1 y 2.
5.6 | SISTEMAS DE CLONACIN DISEADOS PARA EXPRESAR GENES
tipo de producto de expresin. Para ciertos propsitos, puede

s<er suficiente obtener un producto de RNA. Los ejemplos in
tuyen la generacin de sondas de RNA antisentido (riboson das. vase fig. 6-3) para usarse en estudios de hibridacin in situ
de tejidos o la generacin de RNA antisentido con la finalidad
de inhibir o destruir la expresin de genes especficos, sea en es
tudios funcionales o con propsitos teraputicos (secciones
20.2.6 y 21.7.5). Sin embargo, en muchos casos es convenien
te un producto protenico;
tipo de ambiente. En ocasiones es suficiente expresar el pro
ducto in vitro. No obstante, con frecuencia suele ser convenien
te tener la posibilidad de expresar el producto en un sistema
celular particular que puede ser una lnea de clulas procariotas
o eucariotas muy definida.
propsito del sistema de expresin. El sistema de expresin
puede disearse slo para investigar la expresin. Empero, en
muchos casos, el propsito puede ser recuperar grandes cantida
des de un producto de expresin, por ejemplo cuando es necesa
rio generar nmeros considerables de una protena especfica
para ayudar en estudios de cristalografa subsecuentes o como in
tentos para elaborar anticuerpos especficos contra la protena.
; han diseado muchos vectores diferentes de clonacin de exprean para emplearse en distintos sistemas de clulas huspedes, que
derivan de clulas bacterianas o de mamferos, con vectores espec
ficos elaborados mediante ingeniera a fin de que sean tiles en ti
ros especficos de clulas husped.
5.6.1 Es posible producir grandes cantidades de

protenas mediante la clonacin de expresin
en clulas bacterianas
\ luchas veces es necesario clonar cDNA eucariota en un vector de
expresin con objeto de producir compuestos o protenas de im
portancia mdica para estudios bsicos de seguimiento de investi
gaciones, por ejemplo estudios estructurales. Por lo general, en
estos casos el cDNA se disea slo para proporcionar la informa
cin gentica que especifica la secuencia protenica y las seales de
expresin se proporcionan de forma externa al unir promotores,
elementos reguladores, etc., de potencia adecuada dentro del vector
de expresin. Puesto que el sistema de expresin se basa en DNA
recombinante y tambin incluye con gran frecuencia la creacin de
protenas de fusin artificiales o protenas modificadas mediante la
adicin de ciertos marcadores peptdicos a ellas, las protenas resul
tantes se describen en ocasiones como protenas recombinantes.
Las clulas bacterianas tienen la ventaja de crecer con rapidez y
expandirse con facilidad en cultivos hasta volmenes de cultivo
muy grandes; la clula husped preferida, bien estudiada para la
expresin de protenas heterlogas (extraas), es E. coli (Baneyx,
1999). Es posible expresar una gran variedad de protenas me
diante sistemas de expresin basados en p o lim er a sa RNA T7 de
bacterifago, que es capaz de producir transcritos completos casi
de cualquier secuencia de codificacin.
Ya que la produccin de grandes cantidades de protena heterloga puede ser perjudicial, e incluso txica, para el crecimiento de
la clula husped, tiene ventajas controlar la expresin mediante un
promotor inducible. Si se toma en consideracin que la polimera
sa de RNA de E. coli no reconoce el promotor T7, el DNA clona
do en el vector permanece en gran parte sin expresarse cuando no
existe la polimerasa de RNAT7. La polimerasa de RNA normal del
149
husped no reconoce el promotor T7, pero para los propsitos de

clonacin se usa una cepa que tiene una polimerasa de RNA T7
inducible dentro del cromosoma bacteriano. Por ejemplo, cuando
se emplean los sistemas de clonacin de v ecto rp E T (fig. 5-21A), se
modifica el husped para que contenga una polimerasa de RNA T7
regulada por un promotor lac y en consecuencia pueda inducirse
cuando se desea con el inductor lac isopropil-tio-|3-D-galactopiransido (IPTG). Como resultado, las clulas transformadas pueden
seleccionarse y desarrollarse en grandes cantidades sin expresin;
con posterioridad puede aadirse IPTG a fin de inducir expresin
y obtenerse las clulas poco despus.
Aunque las bacterias tienen muchas ventajas para la expresin
de protenas heterlogas, existen varios tipos de limitacin:
p ro cesa m ien to p o stra d u ccion a l. La ausencia de patrones de
glucosilacin o fosforilacin normales en ciertas protenas eu
cariotas producidas en clulas bacterianas significa que las pro
tenas se tornan inestables o no muestran actividad biolgica o
tan slo limitada.
lo n g itu d d e la p ro ten a . Muchas protenas eucariotas, en es
pecial algunas protenas de mamferos, son mucho ms grandes
que las protenas bacterianas y no pueden sintetizarse con faci
lidad en E. coli.
doblamiento y solubilidad de la protena. Con frecuencia, la
expresin excesiva conduce a la produccin de cu erp o s d e in
clu sin -agregados insolubles de protenas dobladas de modo
errneo. Los cuerpos de inclusin suelen purificarse con faci
lidad, pero las ms de las veces la protena expresada slo pue
de solubilizarse con situaciones muy desnaturalizantes y un
problema crucial es entonces la forma de lograr el doblamien
to eficiente in vitro.
Los esfuerzos para incrementar el rendimiento y la solubilidad han
incluido a menudo la produccin de protenas de fusin en las que
se acopla la protena deseada a una protena endgena, por ejemplo
protena de unin de maltosa, tiorredoxina, ubiquitina, etc. Tam
bin es comn modificar los vectores de expresin de protenas de
tal manera que se aade un marcador de afinidad, que ayuda a la
purificacin del recombinante mediante cromatografa de afinidad.
Los dos sistemas favoritos son los siguientes:
a fin id a d p o r G ST-glutatin. La transferasa de glutatin S
(GST) es una protena pequea con una gran afinidad por su
sustrato glutatin. Es posible generar una protena de fusin
GTS (vase fig. 5-21B) y purificarla mediante enlace selectivo
a una columna que contiene glutatin.
a fin id a d p o r p o lih istid in a -n q u el. Las cadenas laterales de
ciertos aminocidos, como la histidina, tienen una gran afinidad
por algunos iones metlicos. En este caso, los vectores de expre
sin suelen conducir al acoplamiento de un marcador de afini
dad de seis residuos consecutivos de histidina (vase fig. 5-23).
Las cadenas laterales del marcador (His)6 se enlazan de manera
selectiva y potente a iones de nquel, lo que contribuye a la pu
rificacin mediante cromatografa de afinidad con una matriz de
nquel-cido nitrilotriactico.
Genotecas de expresin
En la clonacin de expresin se usan muchas veces vectores plsmidos porque es fcil trabajar con ellos y, si el objeto es expresar un
gen especfico de inters, son los medios de eleccin. Sin embargo,
150
CAPITULO CINCO
A)
Fig. 5-21. Ejemplos de vectores de expresin bacteriana.

A) Vectores de expresin bacteriana pET-3. Es posible una expresin
de alto nivel mediante el promotor bacterifago T7. El vector tambin
contiene una secuencia que codifica el pptido gua 10 del gen T7 y un
terminador 10 del gen T7 (T7 ter). Es posible la clonacin en el sitio de
clonacin Nde\ o BamH1. En este ltimo se elabora una protena de fu
sin que contiene 13 aminocidos en la terminal N a partir del gen 77 10
con la secuencia rpida T7, lo que asegura una traduccin de alto nivel.
Se induce la expresin al aadir IPTG que promueve la expresin de un
gen de polimerasa de RNA T7 localizado dentro del cromosoma bacteria
no modificado. RBS, sitio de unin del ribosoma. B) Vectores de fusin
gnica pGEX-4T. Se localiza el sitio de clonacin mltiple de tai manera
que se produzca una protena de fusin despus de la transcripcin del
promotor tac, que comprende un componente terminal N de GST y un
componente terminal C de la protena deseada. Primero en fcoR I, se
arreglan los sitios de clonacin mltiple para pGEX-4T-1, -2 y -3 de tal
forma que sean posibles marcos de lectura de los tres aminocidos.
Puede purificarse con facilidad la protena de fusin GST en una columna
de purificacin de afinidad de glutatin, como sefarosa de glutatin 4B, y
cortarse la protena deseada en el sitio de corte de trombina.
B)
p G E X -4 T -1
T ro m b in a
L e u V a l P ro A rg J G ly S e r P ro G lu P h e P ro G ly A rg L e u G lu A rg P ro H is A rg A s p
C TG G TT C C G C G T G G A T C C .C C G G A A T T C C C G G G T C G A C TC G AG C G G C C G Q A T C G T G A C TG A
B am H I
...........................................
J
EcoRI
Sm a I
Sal I
U______ '
Xho I
N o ti
Codones de
d e te n c i n
P G E X -4 T -2
T ro m b in a
L e u V a l P ro A rg G ly S e r P ro G ly lie
P ro G ly
Ser
T h r A rg A la A la
A la S e r
C TG G TT C C G C G T G G A T C C C C A G G A A TT C C C GGG TCG A C T C G A GCG G C C GCA, TC G TG A
B am H I
EcoR I
Sm a I
Sal I
Not I
Xho I
C odn de
d e te n c i n
P G E X -4 T -3
T ro m b in a
L e u Vai P ro A rg * G ly S e r P ro A s n S e r A rg V a l A s p S e r S e r G ly
A rg IL e V al T h r A s p
C T G G T T C C G C G T G G A T C C , C C G A A T Tp
C C C G G iGiTZ----C G A C , T C G A p C G G C C G C ,A T C G T G A C T G A C T G A
B am H I
-------------- 1O
E c o R I 11
Sn
all II
Sm a I
T ra n s fe ra s a
d e g lu ta ti n S
L_
Xho I
N o ti
Codones de
d e te n c i n
n ocasiones la finalidad es generar un gran nmero de diferentes

-tembinantes como un recurso para expresin, una biblioteca de
acpresin. En estos casos tiene ventajas emplear vectores bacteri3 eos A. modificados porque es posible seleccionar con facilidad, en
:nos comparativos, grandes nmeros de recombinantes.
De manera caracterstica, las genotecas de expresin se elaboran
a eionar cDNA de un tejido de inters con un vector X. como \gtl 1
: XZAP. Mediante exposicin a anticuerpo es posible seleccionar filos que contienen colonias bacterianas individuales infectadas por
a i:'. A continuacin pueden propagarse las bacterias que reaccionan
n rorma positiva para aislar la clona de cDNA y, a su vez, usarse la
ôna de cDNA aislada para seleccionar una biblioteca genmica a
sn de identificar el gen afn (cognate).
5.6.2 La exhibicin de fago es una forma de clonacin

de expresin en la que se expresan protenas en
superficies de clulas bacterianas
L; exhibicin de fago es una forma de clonacin de expresin de
jenes extraos que utiliza un fago (vase Clackson y Wells, 1994).
Se aplican tcnicas de ingeniera gentica para insertar fragmentos
de DNA extrao en un gen fago con recubrimiento protenico con
veniente. En seguida puede expresarse el gen modificado como una
r rotena de fusin que se incorpora en el virin y se muestra en la
; jperficie del fago que, pese a ello, conserva su infectividad (fago
de fusin). Si se dispone de un anticuerpo para una protena espe
cifica, es posible seleccionar el fago que muestra esa protena
mediante enlace preferencial al anticuerpo: puede lograrse la puri-.cacin de afinidad de viriones que llevan un determinante blanco
de un exceso 108 veces del fago que no lleva el determinante, con
cantidades aun diminutas del anticuerpo importante.
De forma inicial, la exhibicin de fago incluy el uso de fagos
filamentosos, como fd, fl, M13, en los que se incorporaba el gen
extrao en un gen que especificaba una protena de recubrimiento
menor, como la protena del gen III (vase fig. 5-22). Se disearon
arias aplicaciones tiles, como las siguientes:
in geniera d e anticuerpo. Es probable que la exhibicin de fago
sea una forma alternativa potente para elaborar anticuerpos, inclui
dos los anticuerpos humanizados, lo cual evitara la inmunizacin
e incluso la tecnologa de hibridoma (vase Winter y cois., 1994);
in gen iera g e n e r a l d e p roten a s. La exhibicin de fago es un
coadyuvante potente para programas de mutagnesis aleatoria
como un medio para seleccionar variantes deseadas de una bi
blioteca de mutantes;
estu d io d e in tera ccio n es p r o ten a co n p ro ten a . Esto incluye
un mtodo basado en genotecas que puede emplearse para iden
tificar protenas que interactan con una protena determinada.
En la misma forma que suelen usarse anticuerpos en la seleccin
de afinidad, se utiliza como agente selectivo una protena conve
niente (o cualquiera otra molcula a la que pueda enlazarse una
protena). La protena puede seleccionar el fago de fusin que ex
hibe cualquiera otra protena que se enlaza en grado notorio a l.
5.6.3 La expresin gnica eucarota se lleva a cabo con

mayor fidelidad en lneas de clulas eucariotas
Es posible que las propiedades biolgicas de muchas protenas eu
cariotas sintetizadas en bacterias no sean muy representativas de las
151
molculas naturales por la falta de procesamiento postraduccional

normal y doblez incorrecto o ineficiente de la protena. En tanto
que los sistemas bacterianos de expresin tienen la gran ventaja de
expresar la protena a un nivel muy alto, las desventajas llevaron al
uso alternativo de clulas eucariotas huspedes para la expresin
de protena recombinante, incluidos insectos y mamferos. Ade
ms de alojar la expresin de protenas, las clulas de mamferos
se usan a menudo como un medio para seleccionar los efectos de
manipulaciones in vitro en secuencias de control transcrpcionalesy
postranscripcionales.
Cuando se emplean lneas de clulas animales como clulas
husped, es necesario considerar la forma en que debe llevarse el
DNA extrao al interior de las clulas husped (vase recuadro 5-5
y cuadro 5-3) y la duracin de la expresin. En este ltimo caso,
son posibles dos tipos de sistemas de expresin:
expresin transitoria. Se pretende que el DNA llevado por el
vector de expresin permanezca como un elemento gentico
independiente dentro de las clulas transfectadas, un llamado
episoma, en lugar de integrarse en los cromosomas de la c
lula husped. La expresin del transgn (cualquier gen intro
ducido en clulas animales o de plantas) alcanza un nivel
mximo alrededor de dos a tres das despus de la transfeccin del vector de expresin en la lnea de clulas de mamfe
ros, pero ms adelante disminuye con rapidez la expresin
debido a la muerte celular o prdida del elemento de expre
sin formado;
expresin estable. El DNA transportado por el vector de ex
presin est diseado para integrarse en los cromosomas de la
clula husped. El establecimiento puede requerir alrededor de
un mes, pero una vez establecido deben hallarse los productos
de expresin en todas las clulas a condicin de que el transgn
sea capaz de expresarse.
Expresin transitoria de protenas de alto nivel en clulas de

insectos mediante baculovirus
La ex presin d e l g e n d e b a cu lo v iru s es un mtodo difundido pa
ra producir grandes cantidades de protenas recombinantes en
clulas husped de insectos y los rendimientos protenicos son
mayores respecto de sistemas de expresin de mamferos, en tan
to que los costos son ms bajos. En casi todos los casos, el pro
cesamiento postraduccional de protenas eucariotas expresadas
en clulas de insectos es similar al procesamiento de protenas
que ocurre en clulas de mamferos y es posible la expresin de
protenas muy grandes. Como resultado, las protenas generadas
en clulas de insectos tienen actividades biolgicas y reactivida
des inmunolgicas comparables a las protenas expresadas en c
lulas de mamferos.
Para la expresin de protenas, el baculovirus que se usa es el
virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV),
que puede propagarse en ciertos lneas de clulas de insectos. La
protena polihedrn viral se transcribe a ndices altos y aunque es
esencial para la propagacin viral en su hbitat normal, no se re
quiere en cultivos. Como resultado, es posible reemplazar su se
cuencia de codificacin por la de una protena extraa. El vector
de clonacin est diseado para expresar la potente protena heterloga del promotor polihedrina, con niveles consecutivos de
expresin que corresponden a ms del 30% de la protena total
de la clula.
152
IN<
Sitio d e
clonacin
V M W vW
Transfectar
Proteina de fusin ( a proteina del gen III

proteina extraa)
E. coli
3
etc.
Conjunto
heterogneo de
secuencias de cDNA
Ensam ble y
obtencin del fago
Form a
replicativa f,
R ecom binantes
2
Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2 Ab2

Fago purificado
que expresa
proteina 2
Biblioteca
de fago
(solucin
acuosa)
Eluir
Aadir
anticuerpo
especfico
conjugado
con biotina
Aadir
placa de
Petri
Ab2 B
C lave:
recubierta con
estreptavidina
y lavar
Enlace selectivo d e fago
conjugado con biotina
(que expresa protena 2)
v_y
Enlace selectivo d e fago
q u e expresa protena 2
B iotina
Estreptavidina
A52 Anticuerpo
que reconoce
protena 2
Fig. 5-22. Exhibicin de fago.

Se clona cDNA extrao dentro de vectores fago a fin de expresar protenas extraas en la superficie del fago. En este caso se inserta DNA en el gen III
del fago f1 (o M I3, fd), que codifica una protena de recubrimiento de fago menor. El sitio de clonacin est localizado en la regin que especifica la se
cuencia terminal N extrema de la protena del gen III. Se produce una biblioteca de expresin de fago despus de la transfeccin de E. coli, el ensamble
del fago, la expulsin de las clulas y la obtencin del fago (vase asimismo fig. 5-18). Muchas veces pueden expresarse recombinantes con insertos
en el marco para obtener una protena de fusin en la que el componente de la terminal N consiste en una secuencia protenica extraa. Puede enlazarse
de modo especfico un anticuerpo especfico para una de las protenas extraas en el fago que muestra la secuencia, lo que conduce a su purificacin.
Esta p u rifica ci n de a finidad permite reconocer secuencias cDNA que codifican una protena de inters no caracterizada (vase Parmley y Smith, 1988).
Expresin transitoria en clulas de mamferos

La expresin de protenas de mamferos en clulas de mamferos tie
ne la ventaja obvia de que no existe el problema de corregir el doblamiento de la protena y la modificacin postraduccional y es posible
analizar seales y efectos celulares corriente abajo. Los sistemas de
expresin estables en clulas de mamferos (que se basan de forma
tpica en secuencias de plsmidos integradas a cromosomas) propor
cionan kilogramos de protenas complejas en biorreactores de escala
industrial, pero habitualmente requirieron grandes inversiones en
tiempo, recursos y equipo. Como alternativa, se desarrollaron sistemas
de expresin transitoria a gran escala para producir protenas recom
binantes en clulas de mamferos (Wurm y Bernard, 1999).
Adems de llevar la expresin de la protena, algunas lneas de
clulas de mamferos han tenido aplicaciones mayores en la selec
cin de los efectos de las manipulaciones in vitro en secuencias de
control transcripcionales y postranscripcionales. Un ejemplo ade
cuado lo proporcionan las clulas COS, lneas estables de clulas
de rin del mono verde africano que derivaron de la lnea permi
siva de clulas de simios SV40, CV-1. Cuando se infectan clulas
CV-1 con SV40, se presenta el ciclo ltico SV40 normal. Sin em
bargo, Gluzman (1981) fue capaz de transformar clulas CV-1
despus de integrar en el cromosoma de CV1 un segmento del genoma SV40 que contena un origen de replicacin mutante.
Las clulas COS resultantes (CV1 con origen defectuoso de

SV40) expresan constitutivam ente (de manera estable) el antgeno
T grande codificado por SV40, la nica protena viral necesaria
para activar el origen de la replicacin SV40. Al expresar el ant
geno SV40 T grande en una forma estable, las clulas COS per
miten introducir cualquier DNA circular con un origen de
replicacin SV40 funcional a fin de replicar de forma indepen
diente los cromosomas de la clula husped, sin limitacin clara
del tamao. Cuando se transfectan vectores de expresin transito
ria en clulas COS, no se obtienen lneas de clulas permanentes
porque la replicacin masiva del vector determina que las clulas
no sean viables. Incluso aunque slo se transfecte con xito una
proporcin baja de clulas, la amplificacin del DNA introduci
do a nmeros considerables de copias en esas clulas compensa el
ndice de captacin bajo.
Expresin estable en clulas de mamferos

Los transgenes pueden integrarse de manera estable en el DNA cromosmico del husped, pero el proceso es muy ineficiente y por esa
razn las clulas raras transformadas de modo estable deben aislar
se del fondo de clulas no transformadas mediante seleccin para al
gn marcador. Por lo regular se practican dos mtodos amplios:
153
Recuadro 5-5. Transferencia de genes a clulas anim ales cultivadas

Puede recurrirse a una diversidad de m todos para transferir genes a
clulas humanas y animales, pero por lo general se agrupan en dos
clases:
Transduccin. Es la transferencia de genes que median los virus.
Ciertos virus de DNA y RNA animales infectan de manera natural a c
lulas humanas y de mamferos. Las modificaciones de estos virus
permiten utilizarlos como vectores para transferir genes exgenos a
clulas blanco convenientes con una gran eficiencia. Proporcionan
sistemas de expresin transitoria que ofrecen la expresin de un gran
nmero de copias, como sucede en los vectores adenovirus, y siste
mas de expresin estable, por ejemplo los basados en retrovirus, una
clase de virus de RNA cuyo ciclo de vida natural incluye la elabora
cin de copias de cDNA que se integran en los cromosomas de la c
lula husped (vase cuadro 5-3).
Liposomas (vesculas lipdicas artificiales) a los que se enlaza

DNA. Los liposomas pueden formarse de manera espontnea en
solucin acuosa despus de mezclar de modo artificial molculas
de fosfolpidos. Los liposomas pueden fusionarse con la membra
na plasmtica y permitir as el acceso al interior de la clula (va
se la figura de abajo).
Electroporacin. Es un mtodo difundido en el que se utiliza un

choque elctrico para producir una despolarizacin temporal de la
membrana en las clulas blanco, lo que contribuye al paso de m o
lculas de DNA grandes.
Sea mediante transduccin o transfeccin, los genes que se transfieren a

clulas animales (o de plantas) se conocen com o Iransgenes y pueden
tener los diferentes destinos siguientes:
Transgenes epismicos. Los transgenes que no se integran a los

cromosomas de la clula husped pueden conservarse en el n
cleo en un estado extracromosmico (episoma). S se enlaza el
transgn a un vector con un origen de replicacin que funciona en
la clula husped, puede amplificarse, en ocasiones hasta un gran
nmero de copias. Si el transgn no se acopla a este origen de re
plicacin, persiste slo un tiempo corto antes de diluirse (a medi
da que se dividen las clulas husped) y degradarse.
Transgenes integrados. En algunos casos, los transgenes pue

den integrarse a los cromosomas de la clula husped y heredar
se de manera estable. Por lo regular, este estado se describe
como transformacin estable (nota: el uso estricto del trmino
transformacin significa que se altera el fenotipo de la clula, de
tal form a que esta ltima adquiere caractersticas de crecimiento
no restringido) y la clula resultante se describe como una lnea
celular. La integracin es un proceso muy ineficiente y en conse
cuencia las clulas transformadas, rara vez estables, deben ais
larse del fondo de clulas no transformadas mediante seleccin
para algn marcador (vase texto).
Transfeccin. Es la transferencia de genes sin mediacin viral. Cabe

sealar que el trmino transleccin es anlogo al proceso de trans
form acin en bacterias. Este ltimo trmino no se aplica al proceso
de transferencia de genes en clulas animales por su nexo con un fe
notipo alterado y un crecimiento no restringido (vase ms adelante).
Los transgenes pueden transferirse por diferentes medios:
con la utilizacin de vectores plsmidos no replicantes.
con el empleo de vectores plsmidos con replicones virales.

Muchas veces se usan un replicn SV40 (como en las clulas
COS; vase seccin 5.6.3), virus de Epstein-Barr (clulas husped
humanas) o virus del papiloma bovino (clulas husped de ratn).
Se dispone de varios mtodos de transfeccin que incluyen el uso de:
Fosfato de calcio. El fosfato de calcio y el DNA forman coprecipitados en la superficie de las clulas blanco. La elevada concen
tracin del DNA en la membrana plasmtica puede incrementar la
eficiencia de la transfeccin.
A) E s tru c tu ra lip o s m lc a
B) L ip o s o m a s am n ic o s y c a ti n ic o s
L p id o
L ip o s o m a s
a n i n ic o s
L ip o s o m a s + |
c a ti n ic o s + \ \
C) T ran sferir D N A
F usin
C lu la b la n co
F o s fo lp id o s
N c le o
11+
//+
154
CAPTULO CINCO
CCuadro 5-3. Sistemas de vector viral comunes para expresin en clulas de mamferos.
Sistema vector basado en
Lmites de huspedes y localizacin
Otros comentarios
Adenovirus
Lmites amplios de huspedes mamferos; por lo general

epism ico nuclear
Tamao del inserto slo hasta 8 kb; nivel de expre

sin alto; ttulos altos de virus recombinante
Virus adeno relacionado
Lmites amplios de huspedes mamferos; virus silvestre

que se integra en el sitio especfico en el cromosoma 19
humano
Tamao del inserto slo hasta 4.5 kb; requiere adenovrus para empaque; expresin estable
Epstein-Barr
Se conserva como un episoma nuclear en seres humanos,

monos y perros pero casi nunca en roedores
Herpes simple
Lmites amplios de huspedes mamferos; Utico
Tamao del inserto hasta 150 kb; los virus recombi

nantes se hacen deficientes para replicacin mediante
la delecin de uno de los genes virales importantes
Papiloma
Se conserva como un episoma nuclear en roedores (BPV)

o seres humanos y monos (HPV)
Se utiliza para el estudio de la regulacin gnica y la

expresin de transgn de alto nivel
Polioma
Lmites amplios de huspedes mamferos; puede integrarse
Se replica mejor en clulas de ratn; se utiliza para

estudiar la regulacin gnica y la expresin de trans
gn de alto nivel
Retrovirus
Lmites variables de huspedes pero algunos tienen lmites

amplios de huspedes mamferos; se integra como copias
de cDNA en los cromosomas del husped
Tamao del Inserto limitado al mximo de 8.5 kb; t

tulos bajos de virus recombinante; expresin estable
SV40
Lmites amplios de huspedes mamferos; puede integrarse

pero es epism ico en presencia del origen de replicacin
SV40 junto con antgeno Tgrande
Vaccinia
Limites amplios de huspedes mamferos; Utico
Se usa sobre todo para la expresin excesiva de

transgn
Fig. 5-23. Un vector de expresin de mamferos: pcDNA3.1/myc-HIS.

La serie pcDNA invitrgena de vectores de expresin plsmdos ofrece
una expresin constitutiva de alto nivel en clulas de mamferos. Los
insertos de cDNA clonados pueden transcribirse del promotor potente
citomegalovirus (PCMV) (que asegura una expresin de alto nivel) con
un elemento de secuencia de poliadenlacin de hormona del creci
miento bovina (BGHpA) que permite generar un extremo 3 ' definido al
mRNA producido a partir del inserto. Un marcador gnico neo (regu
lado por un prom otor/intensificador SV40 y secuencia poli A) hace
posible la seleccin por crecimiento en G418. El polienlazador en la
parte superior contiene un sitio de clonacin mltiple, seguido por se
cuencias que especifican seis residuos de histidina consecutivos
(6xH s ; tales residuos facilitan la purificacin de la protena recombinante), un marcador eptopo m yc (que posibilita la seleccin mediante
anticuerpo de la protena recombinante con un anticuerpo especfico
para esta secuencia) y al final seales de terminacin de la traduc
cin. Los componentes para la propagacin en E. c o li se indican en
amarillo Incluido un origen permisivo de replicacin del plsmido CoIE1 (pUCori), un gen de resistencia a ampicilina (Amp) y un origen f1
que proporcionan una opcin para producir recombinantes de cadena
nica (seccin 5.5.1).
5.6 [ SISTEMAS DE CLONACIN DISEADOS PARA EXPRESAR
co m p lem en ta ci n fu n c io n a l d e clu la s h u sp ed m utantes.

Las clulas husped son genticamente deficientes en alguna
forma, pero puede restablecerse la funcin original mediante
un m a rca d o r en d gen o. Es posible transferir el transgn y el
marcador en la forma de molculas separadas por un proceso
conocido como cotransformacin. Un ejemplo es el uso de
clulas que son deficientes, desde el punto de vista gentico,
en cinasa de timidina (Tk ) y un marcador del gen Tk. Se re
quiere TK para convertir la timidina en monofosfato de timi
dina (TMP), pero tambin puede sintetizarse TMP mediante
la conversin enzimtica a partir de dUME El frmaco a m in op terin a bloquea la reaccin dUMP->TMP y, por consi
guiente, en presencia de este frmaco las clulas no pueden
crecer a menos que cuenten con alguna fuente de timidina y
un gen Tk funcional. Casi siempre es posible lograr la selec
cin de clulas Tk+ en medio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina);
155
uso d e m arcadores dom ina n tes seleccionables. La principal des

ventaja de los marcadores endgenos es que slo pueden utilizarse
en lneas de clulas husped mutantes en las que el gen correspon
diente no es funcional. Como resultado, se reemplazaron en gran
parte los marcadores endgenos por marcadores dominantes se
leccionables que confieren un fenotipo que es por completo nue
vo para la clula y por tanto puede usarse en cualquier tipo de
clula. Los marcadores de este tipo suelen ser genes de resistencia
a frmacos de origen bacteriano que pueden suministrar resisten
cia a frmacos que afectan clulas eucariotas y bacterianas. Por
ejemplo, los antibiticos aminoglucsidos (entre ellos neom icinay
G418) inhiben la sntesis de protenas en clulas bacterianas y eu
cariotas. El gen de fosfotransferasa de neomicina (neo) confiere
resistencia a neomicina, G418, etc., y de esa manera pueden se
leccionarse clulas que se transformaron con el gen neo para que
crezcan en G418. En la figura 5-23 se incluye un ejemplo de un
vector de expresin de mamferos con un marcador neo.
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CAPTULO SEIS
Hibridacin de cido nucleico:

principios y aplicaciones
158
CAPTULO SEIS
HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
La hibridacin de cido nucleico es un medio fundamental en ge

ntica molecular que aprovecha la capacidad de las molculas indi
viduales de cido nucleico de cadena nica para formar molculas
de cadena doble (es decir, hibridarse entre s). A fin de que lo an
terior suceda, las molculas de cadena nica que interactan deben
tener un grado suficientemente alto de co m p lem en ta ried a d d e ba
ses. Las valoraciones estndar de hibridacin de cido nucleico in
cluyen el empleo de una son d a de cido nucleico marcada para
identificar molculas de DNA o RNA relacionadas (es decir, con
un grado considerable de similitud de secuencias) dentro de una
mezcla compleja de molculas de cido nucleico no marcadas, el
cido nucleico b la n co (nota: blanco tiene un uso bastante distinto
en la clonacin de DNA cuando suele referirse a fragmentos espe
cficos de DNA que se pretende amplificar por clonacin).
6.1
Preparacin de sondas de cido

nucleico
En las valoraciones estndar de hibridacin de cido nucleico se

m a rca la sonda de alguna manera. Las sondas de cido nucleico
pueden prepararse como molculas de cadena nica o de cadena
doble (vase fig. 6 - 1), pero la sonda de trabajo debe estar en form a de
cadena nica.
Las sondas de DNA convencionales se aslan mediante clona
cin de DNA basada en clulas o por reaccin en cadena de polimerasa (PCR). En ambas las sondas suelen ser de doble cadena al
inicio. El DNA clonado dentro de clulas puede variar de tamao
de 0.1 kb a cientos de kilobases, pero el DNA clonado por PCR
suele tener menos de 1 kb de longitud. Casi siempre las sondas se
marcan incorporando dNTP marcados durante una reaccin de
sntesis de DNA in vitro.
Las sondas de RNA se derivan de molculas de RNA de cadena

nica por lo general de unos cuantos cientos de pb a varios kilobases
de largo. Pueden generarse de modo conveniente de DNA que se clo
n en un vector plsmido especializado que contiene una secuencia
promotora fago justo adyacente al sitio de clonacin mltiple. Se lle
va a cabo una reaccin de sntesis de RNA con la polimerasa de RNA
fago importante y los cuatro rNTP, de los que cuando menos uno es
t marcado. A continuacin pueden generarse transcritos de RNA
marcados especficos a partir del inserto clonado.
Las sondas de oligonucletidos son de cadena nica y muy
cortas (por lo general de 15 a 50 nucletidos de largo). Se preparan
mediante sntesis qumica (a diferencia de otras sondas que se ori
ginan de la clonacin de DNA). Se aaden mononucletidos, uno
a la vez, a un mononucletido inicial, por convencin el nucletido del extremo 3', que primero se enlaza a un apoyo slido. Las
sondas oligonucletidas casi siempre estn diseadas con una se
cuencia especfica que se elige en respuesta a informacin previa
respecto al DNA blanco. Sin embargo, en ocasiones se utilizan co
mo sondas oligonucletidos degenerados, que comprenden el
marcado de un grupo de oligonucletidos relacionados que se sin
tetizan en paralelo y que se disearon para ser idnticos en ciertas
posiciones de nucletidos pero diferentes en otras. En consecuen
cia las sondas oligonucletidas se marcan al incorporar un tomo
de 32P o algn otro grupo marcado en el extremo 5.
6.1.1 Los cidos nucleicos pueden marcarse de manera

conveniente in vitro si se incorporan nucletidos
modificados
Aunque el DNA y el RNA pueden marcarse in vivo mediante la
adicin de desoxinucletidos marcados a clulas de cultivos de te
jidos, este procedimiento tiene un uso limitado. Un mtodo mucho
Sondas de
h ib rid aci n
T ip o
O rigen
C a ra c te rs tic a s
d e l m a teria l
d e inicio
M a rc a d o
Dh>
RNA
O lig o n u c le tid o
Transcripcin del
inserto d e DNA
clonado en
vectores apropiados
S n te sis q u m ic a
Por lo general cadena doble;

0.1 kb a cientos d e kb para clonas
de DNA conven fo n ales, 0.1 kb
a > 20 kb para pi oductos de PCR
C ad e n a nica, casi
siem pre hasta unos
cu antos m iles d e
nucletidos d e largo
C a d e n a nica;
p o r lo g e n e ra l
1 5 a 5 0 nt d e larg o
Por lo general sntesis de cadena

de DNA basada en polimerasa de
DNA (vase fig. 6-12)
Transcripcin corrida"
de DNA clonado
(vase fig. 6-3)
M arcado final (p. ej., por

cinasa de polinucletldo;
vase fig. 6-4)
D N A b a s a d o en c lu la s,
c lo n a c k 5n o P C R
Fig. 6-1. Origen y caractersticas de sondas de hibridacin de cido nucleico.
6.1
-i: verstil comprende el marcado in v itro : DNA, RNA u oligo- -detidos purificados se marcan in vitro con una enzima convez_;nte para incorporar nucletidos marcados. Se emplean con
jr.z'litud dos tipos principales de procedimientos:
marcado de sntesis de cadena: es el mtodo estndar de mar
cado en el que se usa polimerasa de DNA o RNA para hacer co
pias de DNA o RNA marcadas a partir de un DNA de inicio.
La reaccin de sntesis de DNA o RNA in vitro requiere que
cuando menos uno de los cuatro nucletidos precursores lleve
un grupo marcado. En condiciones normales el DNA se marca
con uno de tres mtodos: muesca (wzf)-traduccin, marcado
con cebamiento aleatorio o marcado mediante PCR. El marca
do del RNA se logra con un sistema de transcripcin in vitro;
marcado final: es un procedimiento ms especializado en el
que se aade un grupo marcado a slo uno o unos cuantos nu
cletidos terminales. El marcado final es til para marcar oligonucletidos de cadena nica (vase ms adelante) y en el m apeo
d e restriccin . Ya que slo se incorporan uno o unos cuantos
grupos marcados, la actividad especfica del cido nucleico
marcado (la cantidad de marcador incorporado dividida entre la
masa total) es inevitablemente mucho menor que la de las son
das en que se incorporaron mltiples nucletidos marcados en
toda la longitud de la molcula.
Marcado de DNA mediante muesca y traduccin

El procedimiento de muesca y traduccin consiste en introducir
roturas en muesca (nicks) de cadena nica en el DNA, lo que deja
expuestas las terminales hidroxilo 3' y fosfato 5*. La muesca puede
hacerse al aadir una endonucleasa apropiada, como DN-asa pan
cretica. A continuacin la muesca expuesta puede servir como un
punto de inicio para introducir nuevos nucletidos en el lado hi
droxilo 3' de la muesca mediante la actividad de polimerasa de
DNA de la polimerasa I de DNA de E. coli al tiempo que se elimi
nan los nucletidos existentes del otro lado de la muesca por me
dio de la actividad de exonucleasa 5,->3 de la misma enzima.
Como resultado, la muesca se mueve en forma progresiva a lo lar
go del DNA (se traduce) en la direccin 5/_>3r (vase fig. 6-2A).
Si la reaccin se efecta a una temperatura hasta cierto punto baja
alrededor de 15C), no prosigue ms de una renovacin completa
de la secuencia nucletida. Aunque no ocurre una sntesis neta de
DNA a estas temperaturas, la reaccin de sntesis permite incorpo
rar nucletidos marcados en el lugar de los no marcados previos.
Marcado de DNA con cebamiento aleatorio

El mtodo de marcado de DNA con cebamiento aleatorio (que en
ocasiones se conoce como oligomarcado; vase Feinberg y Vogelstein, 1983) se basa en la hibridacin de una mezcla de todos los po
sibles hexanucletidos: el DNA de inicio se desnaturaliza y luego se
enfra con lentitud de manera que hexanucletidos individuales
puedan enlazarse a secuencias complementarias apropiadas dentro
de las cadenas de DNA. La sntesis de nuevas cadenas de DNA com
plementarias se ceba por el enlace de hexanucletidos y es cataliza
da por la subunidad Klenow de la polimerasa I de DNA de R coli
(que contiene actividad de polimerasa en ausencia de actividad hexonucleasa 5'~k3' relacionada). La sntesis de DNA ocurre en pre
sencia de los cuatro dNTP, de los que cuando menos uno tiene el
grupo marcado (vase fig. 6-2B). Este mtodo produce DNA mar
cados con actividad especfica alta. Como en la mezcla de hexanu
cletidos estn representadas todas las combinaciones de secuencias,
PREPARACIN DE SONDAS DE CIDO NUC
159
el enlace del cebador a la plantilla de DNA ocurre en una forma

aleatoria y el marcado es uniforme en toda la longitud del DNA.
Marcado de DNA mediante PCR

Es posible modificar la PCR estndar para incluir uno o ms pre
cursores nucletidos marcados que se incorporan en el producto de
la PCR en toda su longitud.
Marcado de RNA
Pueden obtenerse sondas de RNA (ribosondas) mediante la trans
cripcin in vitro de un inserto de DNA clonado en un vector plsmido conveniente con un promotor fago. Por ejemplo, el vector
plsmido pSP64 contiene la secuencia promotora SP6 de bacteri
fago justo adyacente al sitio de clonacin mltiple. Luego se em
plea polimerasa de RNA SP6 para iniciar la transcripcin desde un
punto inicial especfico en la secuencia del promotor SP6 , transcri
biendo por completo cualquier secuencia de DNA que se inserta en
los mltiples sitios de clonacin. El uso de una mezcla de NTP, de
los que cuando menos uno est marcado, permite generar transcri
tos radiomarcados de actividad especfica (fig. 6-3). Los sistemas de
bacterifago T3 y promotor T7/polimerasa de RNA tambin sue
len emplearse para generar ribosondas. Es factible obtener riboson
das de sentido y antisentido marcadas a partir de cualquier gen
clonado en estos vectores (el gen puede clonarse en una u otra de
las dos orientaciones) y se utilizan con amplitud en hibridacin in
situ de tejidos (seccin 6.3.4).
Marcado final
Por lo general los oligonucltidos de cadena nica se marcan con
cinasa de polinucletido (marcado final con cinasa). El marcado
suele proporcionarse en forma de un 32P en la posicin fosfato y de
ATP y el polinucletido cataliza una reaccin de intercambio con
fosfatos de la terminal 5 (vase fig. 6-4A). Asimismo, puede usarse
marcado final en fragmentos de DNA ms grandes, pero a menudo
por mtodos alternativos, que incluyen:
marcado final de relleno (fig. 6-4B): el DNA se trata con una
enzima de restriccin apropiada que genera una saliente en el
extremo 5' y se recurre a una actividad de polimerasa para aa
dir nucletidos complementarios marcados a fin de llenar los
extremos cortados. Lo anterior suele lograrse al utilizar la su b u
n id a d K len ow de la polimerasa I de DNA de R coli (vase an
tes). Segn se requiera, los fragmentos marcados pueden cortarse
internamente con otra nucleasa de restriccin con objeto de pro
ducir dos fragmentos marcados en un extremo cada uno que
pueden fraccionarse de tamao;
marcado final de 5' mediado por cebador: es un mtodo sim
ple de PCR en el que se emplea un cebador con un grupo mar
cado unido a su extremo 5. Conforme la PCR procede, el
cebador con su extremo 5' marcado se incorpora en el produc
to de la PCR.
6.1.2 Pueden marcarse cidos nucleicos mediante

mtodos isotpicos y no isotpicos
Marcado y deteccin isotpicos
Los cidos nucleicos suelen marcarse mediante la incorporacin de
nucletidos que contienen radioistopos. Estas sondas radiomar-
160
CAPTULO SEIS
A)
D N -a s a I
pApGpCpTpApCpGpApCpGpCpTpApTpT ,
pTpCpG pApTpG pCpTpGpCpG pApTpApA.
pol
C o rte o
m uesca
D N -a s a I
p a n c re tic a
OH P
pApG C p T p A p C p G p A p C p G p C p T p A p T p T ,
p o lim e ra s a I d e
D N A d e E. coli
1. 5 - 3 ' e x o n u c le a s a
2. 5 - 3 ' p o lim e ra s a
, dATP, d C T P
dG TP , d T T P
C o rte o
m uesca
oh p
_/ \
pApGpCpTpApCpG pApCpGpCpT A p T p T .
B)
D e s n a tu ra liza r y a s o c ia r (anneal) en p re s e n c ia
d e u n a m e z c la d e h e x a n u c le tid o s a le a to rio s
I
5 '.
I M
5'
S '
5'
3'
3'
3'
" I
5'
S u b u n id a d K len o w d e p o lim e ra s a D N A
+
dATP, d C T P
dG TP, d T T P
I
i
11
3 '.
5V
.T
C lave:
T N ucletido
m arcado
i i 111i i 1111) 11in r

1
TT
1
T f
TT
- '> 3 5 '
TT
TT
T T T.
L 3 5'
Fig. 6-2. Marcado de DNA mediante sntesis de cadenas de DNA in vitro.

A) Traslacin de la muesca. La DN-asa I pancretica introduce muescas de cadena nica mediante el corte de enlaces (p) fosfodister internos y genera
un grupo fosfato 5 ' y una terminal hidroxilo 3 '. La adicin de la enzima multisubunidad polimerasa I de DNA de E. coli contribuye con dos actividades
enzimticas: a) una exonucleasa 5 '
3 ' ataca la terminal 5 ' expuesta de una muesca y elimina de modo secuencial nudetidos en direccin 5 ' -> 3 ';
b) una polimerasa de DNA aade nuevos nudetidos al grupo hidroxilo 39 expuesto, prosigue en la direccin 5' - * 3 ', y en consecuencia reemplaza los
nudetidos eliminados mediante la exonucleasa y origina el desplazamiento lateral (traslacin) de la muesca. B) M arcado cebado en form a aleatoria.
La subunidad Klenow de polimerasa I de DNA de E. coli puede sintetizar nuevas cadenas de DNA radiomarcadas utilizando como plantilla cadenas de
DNA separadas y cebadores exonucletidos aleatorios.
cadas contienen nudetidos con un radioistopo (a menudo 32P,

33P, 35S o 3H), que pueden detectarse de modo especfico en solu
cin o, con mucho mayor frecuencia, dentro de un espcimen s
lido (autorradiografa; vase recuadro 6 - 1).
La intensidad de una seal autorradiogrfica depende de la in
tensidad de la radiacin emitida por el radioistopo y del tiempo
de exposicin, que a menudo puede ser largo (uno o ms das, o
aun semanas en algunas aplicaciones). En valoraciones de hibrida
cin de cido nucleico se utiliza mucho 32P porque emite partcu
las |3 de alta energa que proveen un alto grado de sensibilidad de

deteccin. Sin embargo, tiene la desventaja de que es hasta cierto
punto inestable (vase cuadro 6 - 1).
La energa alta de emisin de partculas beta de 32P puede ser
una desventaja en circunstancias en las que se requiere una resolu
cin fsica fina para interpretar imgenes autorradiogrficas sin am
bigedad. Por tanto en ciertos procedimientos suelen preferirse
radionclidos que emiten partculas P menos energticas, por
ejemplo, 35S y 33P en la secuenciacin de DNA y la hibridacin de
6.1 ! PREPARACIN DE SONDAS DE CIDO NUCLEICO
161
In icio d e tra n s c rip c i n c o n S P 6

. ATTTAGGTGACACTATAG.I aMt A C AAGCTT.
_i i_______ i
P ro m o to r S P 6
H /n d lll
S itio d e clo n a c i n m ltip le
SP6
or
am p
-f
w sm m m nM -
l
AV
L in e a riz a r co n e n z im a d e restricci n
d is tal a p ro p ia d a , p. ej., PvuW
p ro In s e rto d e D N A
P o lim e ra s a R N A S P 6
U TP , CTP, G TP, ATP
In s e rto d e D N A
TTT ,
T T TTTT
J L lim i
T T T T T T ttT t
TT T T T T T T tT T T T .
N u m e ro s o s tra n s c rito s
d e R N A m a rc a d o s
C lave:
T N u c le tid o
m a rc a d o
Fig. 6-3. Se generan ribosondas (sondas de RNA) por repeticin de la transcripcin de insertos de DNA clonados en vectores plsmido
especializados.
El vector plsmido pSP64 contiene una secuencia promotora para polimerasa RNA del fago SP6 enlazada al sitio de clonacin mltiple (SCM) adems
de un origen de replicacin (ori) y el gen de resistencia a ampicilina (amp). Despus de clonar un fragmento conveniente de DNA en uno de los 11 sitios
nicos de restriccin de SCM, el DNA recombinante purificado se lineariza mediante un corte con una enzima de restriccin en un sitio de restriccin
nico justo distal al DNA insertado (en este ejemplo Pvu II). Luego pueden generarse transcritos de RNA marcados especficos de inserto con el uso de
polimerasa de RNA SP6 y una combinacin de NTR de los que cuando menos uno est marcado (en este caso UTP).
Principios de la autorradiografa
Autorradiografa es un procedimiento para localizar y registrar un com
puesto radlomarcado dentro de una muestra slida, y comprende la pro
duccin de una Imagen en una emulsin fotogrfica. En las aplicaciones
en gentica molecular, la muestra slida a menudo consiste en DNA de
tamao fraccionado o muestras de protenas embebidas en un gel seco,
fijados a la superficie de una membrana de nylon seca o un filtro de nitrocelulosa, o localizados dentro de muestras de cromatina o tejidos fijados
en un portaobjetos de vidrio. Las emulsiones fotogrficas son cristales
de halida argntica en suspensin en una fase gelatinosa transparente.
Despus una partcula (3 o un rayo -y emitido por un radionclido pasa a
travs de la emulsin, los Iones de Ag+ se convierten en tomos de plata
(Ag). La imagen latente resultante puede convertirse luego en otra visible
una vez que la imagen se revela, un proceso de amplificacin en el que
cristales enteros de halida argntica se reducen para proporcionar plata
metlica. El proceso de fijacin da por resultado la eliminacin de cual
quier cristal de halida argntica no expuesto y produce una imagen
autorradiogrfica que brinda una representacin bidimensional de la dis
tribucin del radiomarcador en la muestra original.
La autorradiografa directa consiste en colocar la muestra en contacto

ntimo con una placa de rayos X, una hoja de plstico con un recubrimien
to de emulsin fotogrfica; las emisiones radiactivas de la muestra pro
ducen reas oscuras en la placa revelada. Este mtodo es ms adecuado
para detectar radionclidos de em isin p de potencia dbil a media (p.
ej., 3H, 35S, etc.). Sin embargo, no es adecuado para partculas beta de
alta energa (p. ej., de 32P): estas emisiones pasan a travs de la pelcula
y causan el agotamiento de la mayor parte de la energa. La autorradio
grafa indirecta es una modificacin en la que una sustancia qumica
apropiada (centellador o flor) convierte en luz la energa emitida. En un
mtodo popular se utilizan pantallas de intensificacin, hojas de un cen
tellador Inorgnico slido que se colocan atrs de la placa en casos de
muestras que emiten radiacin de alta energa, como 32P Las emisiones
que pasan a travs de una emulsin fotogrfica son absorbidas por la
pantalla y convertidas en luz. La imagen se intensifica si se superpone
con efectividad una emisin fotogrfica sobre la emisin autorradiogrfi
ca directa.
162
CAPITULO SE IS
A)
5 '( P
3'
32
A ' p
- p
C in a s a d e
p o lin u c le tid o
a< p x s x p
) ^
^ 32
H 3'
& =
D N A se lec cio n ad o
B)
D ig e rir co n n u c le a s a d e res tricci n p a ra

fo rm a r sa lie n te s 5 (p. ej., E c o R I)
5' AA TTC C
G C
CTTAA
3'
5'
P o lim e ra s a D N A K len o w
dATP , d T T P
TT
---------1 G A A T T
I ZZZ1 C T T A A
5' A A T T C r
TTAAG C
11
3'
5'
C o rte co n n u c le a s a d e restricci n en un sitio intern o

p a ra o b te n e r fra g m e n to s d e d ife re n te s ta m a o s
5' A A TTC
T T A A G r... -
11
P u rific ar
TT
G AATT
CTTAA
P u rific ar
C lav e:
T N u cle tid o
m a rc a d o
Fig. 6-4. Marcado final de cidos nucleicos.

M arcado fin a l de oligonucletidos con cinasa. El fosfato de la terminal 5 ' del oligonucletido se reemplaza en una reaccin de intercambio por
el fosfato 7 de [-y-32P] ATP marcado con 32R El mism o procedimiento puede emplearse para marcar las dos terminales 5 ' de DNA de doble cadena.
B) M arcado fin a l con rellenado. El DNA de inters se corta mediante una nucleasa de restriccin apropiada para generar salientes 5 '. Las salientes
actan como un cebador para polimerasa de DNA Klenow a fin de incorporar nucletidos marcados complementarios a las salientes. Los fragmentos
marcados en un extremo slo pueden generarse mediante el corte interno con una enzima de restriccin apropiada para generar dos fragmentos de
distinto tamao que se fraccionan de tamao con facilidad.
A)
( adro 6 Radioistopo
Caractersticas de radioistopos que se utilizan con frecuencia para marcar sondas de DNA y RNA.
Vida media
Tipo de descomposicin
Energa de emisin
12.4 aos
0.019 Mev
32P
14.3 das
1.710 Mev
33p
25.5 das
0.248 Mev
35S
87.4 das
0.167 Mev
6.2 PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO
tcj idos in situ, y 3H para la hibridacin cromosmica in situ. 35S y

B p
tienen vidas medias moderadas. 3H posee una vida media muy
r::>:ongada pero no constituye una ventaja por la energa comparaimente baja de las partculas (3 que emite, que requiere tiempos
de exposicin muy prolongados.
Los nucletidos marcados con 3~P y 33P que se usan en las reac- : nes de marcado durante la sntesis de la cadena de DNA tienen
d radioistopo en la posicin fosfato alfa, porque los fosfatos P y y
ir los precursores de dNTP no se incorporan en la cadena de DNA
crecimiento. Sin embargo, en el marcado final mediado por ciîsa, se emplea ATP [~y32P] (fig. 6-4A). En nucletidos marcados
con 35S que se incorporan durante la sntesis de cadenas de DNA o
RNA, el NTP o el dNTP lleva un istopo 35S en lugar del O del
pupo fosfato a . Los nucletidos marcados con 3H portan el radiototopo en varias posiciones. La deteccin especfica de molculas
que tienen un radioistopo se realiza con mayor frecuencia por autoradiografa (vase recuadro 6 - 1).
Marcado y deteccin no isotpicos

Los sistemas de marcado no isotpicos incluyen el uso de sondas no
radiactivas y tienen aplicaciones amplias en una variedad de reas
Kricka, 1992). Se efectan dos tipos principales de marcado no ra
diactivo:
marcado no isotpico directo: se incorpora un nucletido que
contiene un grupo marcado unido. Con frecuencia estos siste
mas comprenden la incorporacin de nucletidos modificados
que contienen un fluorforo, un grupo qumico que puede
fluorescer cuando se expone a luz de cierta longitud de onda
(vase fig. 6-5 y recuadro 6-2).
marcado no isotpico indirecto, que suele caracterizarse por
el acoplamiento qumico de una molcula rastreadora modifi
cada a un precursor nucletido. Tras incorporarse en el DNA,
los grupos rastreadores pueden unirse de modo especfico me
diante una molcula de afinidad, una protena u otro ligando
que tiene una afinidad muy alta por el grupo rastreador. Con
jugado a la molcula de afinidad se encuentra una molcula o
un grupo marcador que puede detectarse en una valoracin
apropiada (fig. 6 -6 ). Las molculas rastreadoras en nucletidos
modificados deben sobresalir bastante de la estructura bsica de
cido nucleico a fin de facilitar su deteccin por la molcula de
afinidad y por consiguiente se requiere un tomo de carbono es
p a cia d o r largo para separar el nucletido del grupo rastreador.
163
Es posible conjugar una diversidad de grupos o molculas marcado

ras a molculas de afinidad como la estreptavidina o el anticuerpo
especfico de digoxigenina. Abarcan varios flu o r fo r o s (recuadro
6 -2 ) o enzimas, como fosfatasa alcalina y peroxidasa, que posibili
tan la deteccin mediante valoraciones colorimtricas o qumicas
de luminiscencia, entre otras.
6.2
Principios de la hibridacin
de cido nucleico
La hibridacin de cido nucleico es una tcnica fundamental en ge

ntica molecular. El recuadro 6-3 presenta un glosario de los trmi
nos importantes a fin de ayudar a los lectores que tal vez no estn
familiarizados con la terminologa.
6.2.1 La hibridacin de cido nucleico es un mtodo

para identificar molculas relacionadas en forma
cercana dentro de dos poblaciones de cido
nucleico
Definicin y justificacin
El propsito usual de la hibridacin de cido nucleico es obtener
informacin de una poblacin de cidos nucleicos (el blanco) que
no se com prende a la perfeccin y que por lo general es compleja. Se
logra mediante el uso de una poblacin conocida de molculas de
cido nucleico como una sonda con objeto de identificar cidos
nucleicos relacionados cercanamente dentro del blanco.
La especificidad de la interaccin entre la sonda y el blanco pro
viene de la co m p lem en ta ried a d d e bases, porque ambas poblacio
nes se tratan de manera tal que asegura que todas las secuencias de
cido nucleico presentes sean de cadena nica. Por consiguiente, si
la sonda o el blanco iniciales son de doble cadena, es necesario se
parar las cadenas individuales (desn atu ra lizarlas), casi siempre
por calentamiento o tratamiento alcalino. Despus de mezclar las
cadenas nicas de la sonda con las cadenas nicas del blanco, se
permite que se rea so cien (t s decir, que se fijen entre s [rean n eal])
cadenas con secuencias de bases complementarias para formar ci
dos nucleicos de doble cadena. Cuando lo anterior ocurre se for
man dos tipos de productos:
Se utilizan de manera amplia dos sistemas de marcado no isotpi

co indirecto:
homodplex: cadenas complementarias dentro de la sonda o

dentro del blanco que se reasocian (reanneal) a fin de regene
rar molculas de doble cadena que originalm ente se encontraban
en las poblaciones de la sonda o el blanco;
el sistema biotina-estreptavidina emplea la afinidad en extre

mo alta de dos ligandos: la b io tin a (una vitamina que ocurre de
manera natural), que acta como rastreador, y la protena bac
teriana estrep tavidin a , que es la molcula de afinidad. La bio
tina y la estreptavidina se unen entre s en una forma muy
estrecha con una constante de afinidad de 10 l4, una de las ms
potentes que se conocen en biologa. Pueden prepararse con fa
cilidad sondas biotinadas con la inclusin de un nucletido biotinado apropiado en la reaccin de marcado (vase fig. 6-7).
heterodplex: un cido nucleico de cadena nica dentro de los

pares de bases de la sonda con una cadena complementaria en
la poblacin blanco. El cido nucleico de doble cadena que se
forma en este caso es una combinacin nueva de cadenas de ci
do nucleico. Los heterodplex definen la utilidad de una valo
racin de hibridacin de cido nucleico porque el objeto total
de la valoracin de hibridacin es usar la sonda conocida para
identificar fragmentos de cido nucleico relacionados en el
blanco (fig. 6 - 8 ).
la digoxigenina es un esferoide (que se obtiene de la planta Digitalis) contra el que se elabor un anticuerpo especfico. El an
ticuerpo especfico de la digoxigenina permite detectar
molculas de cido nucleico que incorporaron nucletidos que
contienen el grupo rastreador digoxigenina (vase fig. 6-7).
A menudo las sondas son poblaciones de cido nucleico homog

neas (p. ej., un DNA clonado especfico o un oligonucletido sin
tetizado por medios qumicos) y por lo general estn marcadas y en
solucin. En contraste, las poblaciones de cido nucleico blanco
son poblaciones complejas no marcadas y suelen enlazarse a un
164
CAPITULO SEIS
B)
F u e n te lu m in o s a,
p. ej., l m p a ra d e
v a p o r d e m e rcu rio
Fig. 6-5. Microscopa de fluorescencia y estructura de fluorforos frecuentes.

A) Estructura de fluorforos. El ejemplo de la parte superior muestra fluorescena-dUTR El grupo de fluorescena est unido al tomo de carbono 5' de
la uridina por un grupo espaciador de manera que cuando el nucletido modificado se incorpora en el DNA, el grupo de fluorescena es fcilmente
accesible. Abajo se encuentra la estructura de la rodamina de la que se deriv una variedad de fluorforos. B) M icroscopa de fluorescencia. El filtro de
excitacin es un filtro de barrera de color que en este ejemplo se eligi para dejar pasar slo luz azul. La luz azul transmitida tiene una longitud de onda
apropiada para reflejarse con el espejo dicroico (divisin del haz) hacia la muestra marcada que despus fluoresce y emite luz de una longitud de onda
ms larga, en este caso luz verde. La longitud de onda ms larga de la luz verde emitida significa que pasa en form a directa a travs del espejo dicroico.
A continuacin la luz pasa a travs de un segundo filtro de barrera de color que bloquea las seales fluorescentes Indeseables y deja que la emisin de
fluorescencia verde deseada pase a travs del ocular del microscopio. Un segundo dispositivo de divisin del haz tambin puede permitir registrar la luz
en una cmara de dispositivo cargado acoplado (DCA).
6.2 I PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO
165
5 ' ---------------------------------------------------- 3 '

3 ' -------------------------------------------5'
Marcado de DNA
.....
.
con nuc eotido marcado aue
.
,
,4
lleva un grupo rastreador
Acoplam iento de grupo de

r. .
.
afinidad y grupo marcador
1
9
{ }
Enlace del grupo de afinidad al rastreador
3 ' --------------------------------------------------------------------------------------- I '
Clave
r
Grupo rastreador
f a Grupo de afinidad
Deteccin del marcador mediante

valoracin fluorim trica/valoracin
enzimtica, etctera
Marcador
Fig. 6-6. Principios generales del marcado no isotpico indirecto.

Con frecuencia la protena que el grupo rastreador reconoce es un anticuerpo especfico, como en el sistema de digoxigenina, o cualquier otro ligando
que tiene una afinidad muy alta para un grupo especfico, como la estreptavidina cuando se utiliza biotina como rastreador (vase fig. 6-7). El marcador
puede detectarse de varias maneras. Si lleva un colorante fluorescente especfico, es posible detectarlo en una valoracin fluorimtrica. De manera
alternativa, puede ser una enzima como fosfatasa alcalina, que suele acoplarse a una valoracin enzimtica y proporciona un producto factible de medir
por medios colorimtricos.
apoyo slido. Sin embargo, algunas valoraciones de hibridacin im

portantes utilizan sondas no marcadas enlazadas a un apoyo slido
para interrogar poblaciones de DNA blanco marcadas en solucin.
Temperatura de fusin y rigor de la hibridacin

La desnaturalizacin de sondas de DNA de doble cadena suele lo
grarse calentando una solucin del DNA marcado a una tempera
tura lo bastante alta para romper los enlaces de hidrgeno que unen
entre s las dos cadenas complementarias de DNA. La energa ne
cesaria para separar dos cadenas perfectamente complementarias de
DNA depende de varios factores, en especial:
lo n g itu d d e la ca d en a : los homodplex largos contienen un
gran nmero de enlaces de hidrgeno y se requiere ms energa
para separarlos; como por lo general el procedimiento de mar
cado produce sondas de DNA cortas, este aspecto es insignifi
cante por arriba de una longitud original (es decir, anterior al

marcado) de 500 pb;
com p o sicin d e bases: los pares de bases GC tienen un enlace
ms de hidrgeno que los pares de bases AT. En consecuencia
las cadenas con un porcentaje de composicin GC alto son ms
difciles de separar que las que tienen una composicin de GC
de un porcentaje bajo;
a m b ien te q u m ico: la presencia de cationes monovalentes (p.
ej., iones Na+) estabiliza el dplex, en tanto que ciertas molcu
las muy polares, como la fo r m a m id a (H-CO-NH3+) y la u rea
(H-jN -C O -N H j ), actan como desnaturalizantes qumi
cos: desestabilizan el dplex al alterar los enlaces de hidrgeno
entre pares de bases .
Una medida til de la estabilidad de un dplex de cido nucleico
es la temperatura de fusin ( Tm). sta es la temperatura que co
rresponde al punto medio en la transicin de la forma de doble ca-
166
CAPTULO SEIS
Sistemas de marcado y deteccin con fluorescencia

El marcado fluorescente de cidos nucleicos se desarroll en la dcada
de 1980 y su gran valor se demuestra en muchas aplicaciones distintas,
que incluyen hibridacin cromosmica in situ, hibridacin in situ de tejidos
y secuenciacin automatizada de DNA. Los marcadores fluorescentes
pueden usarse en el marcado directo de cidos nucleicos incorporando
un nucletido modificado (con frecuencia 2 desoxiuridina 5 ' trifosfato)
que contiene un fluorforo apropiado, un grupo qumico que fluoresce
cuando se expone a una longitud de onda luminosa especfica. Los fluorforos populares que se emplean en el marcado directo comprenden:
fluore scen a, un colorante fluorescente verde plido; rodam ina, un colo
rante fluorescente rojo, y am ino m etilcum arina. un colorante fluorescente
azul (vase fig. 6-5A). Asimismo, pueden utilizarse sistemas de marcado
indirecto mediante los cuales nucletidos modificados que contienen un
grupo rastreador (como biotina o digoxigenina) se incorporan en cido
nucleico (vase fig. 6- 6) y luego el grupo rastreador se enlaza en forma
especfica mediante una molcula de afinidad (como estreptavidina o un
anticuerpo especfico a digoxigenina) al que se fija un fluorforo, por
ejemplo, cido actico am inom etilcum arina (AAMC), isotiocianato de
fluorescena (ITCF) u otros derivados de la fluorescena e isotiocianato
de tetrametilrodamina (ITCTR) u otros derivados de la rodamina.
La deteccin del fluorforo en sistemas de marcado directo o indirecto se
efecta pasando un haz de luz de una fuente luminosa adecuada (p. ej.,
una lmpara de vapor de mercurio en microscopa de fluorescencia, un
lser de argn en la secuenciacin automatizada de DNA) a travs de
dena a la de cadena nica. Esta transicin puede seguirse de modo

conveniente si se mide la densidad ptica (DO) del DNA. Las ba
ses de los cidos nucleicos absorben con potencia luz ultravioleta
(UV) de 260 nm. Sin embargo, la adsorcin por DNA de doble ca
dena es bastante menor que la de los nucletidos libres. Esta dife
rencia, el llamado efecto hipocrmico, se debe a interacciones
entre los sistemas de electrones de bases adyacentes, que provienen
de la forma en que bases adyacentes se apilan en paralelo en una
doble hlice. Por tanto, si el DNA dplex se calienta de manera gra
dual, habr un incremento de la luz que se absorbe a 260 nm (la
DO260) hacia el valor caracterstico de las bases libres. La tempera
tura a la que se halla un punto medio en el cambio de la densidad
ptima se considera entonces la Tm (vase fig. 6-9).
En genomas de mamferos, con una composicin de bases apro
ximada de 40% de GC, el DNA se desnaturaliza con una Tm cer
cana a 87C bajo condiciones ms o menos fisiolgicas. La Tm de
hbridos perfectos formados por DNA, RNA o sondas oligonucletidas puede determinarse segn la frmula que se presenta en el
cuadro 6-2. A menudo se eligen condiciones de hibridacin que
permitan promover la formacin de heterodplex y la temperatura
de hibridacin suele ser hasta 25C menor que la Tm. No obstan
te, despus de la hibridacin y la eliminacin del exceso de sondas
pueden realizarse lavados de hibridacin bajo condiciones ms rgi
das para alterar todos los dplex adems de los que se encuentran
entre secuencias relacionadas de manera muy cercana.
Los heterodplex sonda-blanco poseen una termodinmica
muy estable cuando la regin de la formacin dplex contiene ba
ses perfectamente compatibles. Las incompatibilidades entre las
dos cadenas de un heterodplex reducen la Tm: para sondas norma
les de DNA, cada 1% de incompatibilidad reduce la Tm alrededor
de 1C. Aunque los heterodplex sonda-blanco no suelen ser tan
un filtro de color apropiado (filtro de excitacin) diseado para transm itir

luz a la longitud de onda de excitacin deseada. En sistemas de m icros
copa de fluorescencia esta luz se refleja sobre la muestra marcada con
fluorescencia en un portaobjetos para m icroscopio por medio de un es
pejo dicroico, que refleja luz de ciertas longitudes de onda en tanto per
mite que la luz de otras longitudes de onda pase de modo directo a travs
de l. A continuacin la luz excita el fluorforo para que fluoresca y al ha
cerlo emite luz de una longitud de onda un poco ms larga, la longitud de
onda de emisin. La luz emitida por el fluorforo regresa y pasa directa
mente por el espejo dicroico, a travs de un filtro de barrera apropiado, y
despus se transmite al ocular del microscopio, y tambin puede captu
rarse con una cmara de DCA (dispositivo cargado acoplado). A conti
nuacin se indican las longitudes de onda de emisin y excitacin
mximas de fluorforos usuales:
Fluorforo
Color
Excitacin mxima
(nm)
Emisin mxima
(nm)
AMCA
Fluorescena
Azul
399
446
Verde
494
523
CY3
Rojo
552
565
Rodamina
Rojo
555
580
Rojo Texas
Rojo
590
615
estables como las sondas homodplex reasociadas (reannealed), es

posible tolerar un grado considerable de incompatibilidad si la re
gin total de complementariedad de bases es larga (> 100 pb; va
se fig. 6 - 10 ).
El incremento de la concentracin de NaCl y la disminucin de
la temperatura reducen el rigor de la hibridacin y mejoran la es
tabilidad de hetereodplex incompatibles. Ello significa que pue
den identificarse miembros comparativamente divergentes de una
familia multignica o de otra familia de DNA repetido por hibri
dacin si se utiliza como sonda un miembro especfico de la fami
lia. Adems puede emplearse como sonda una secuencia gnica de
una especie a fin de identificar homlogos en otra especie divergen
te, a condicin de que la secuencia se conserve de modo razonable
durante la evolucin.
Tambin es posible elegir condiciones para maximizar el rigor
de la hibridacin (p. ej., disminuir la concentracin de NaCl e in
crementar la temperatura), con objeto de fomentar la disociacin
(desnaturalizacin) de heterodplex incompatibles. Si la regin de
complementariedad de bases es pequea, como en las sondas de oligonucletidos (casi siempre 15 a 20 nucletidos), pueden elegirse
condiciones de hibridacin de tal ndole que una incompatibilidad
aislada torna inestable un heterodplex (vase seccin 6 .3 . 1).
6.2.2 Las cinticas de reasociacin de DNA se definen

mediante el producto de la concentracin de 0NA
y el tiempo (C0t)
Cuando se desnaturaliza DNA de doble cadena (p. ej., por calor) y
se permite que la complementariedad de cadenas nicas se asocie
de nuevo (reasocie) para formar DNA de doble cadena, la rapidez
6.2
PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO
CH,
OH 3
CH
E s p a c ia d o r C 1 1
O
II
H.
O
II
II
3H
OH
> / C H = C H - C H 2- N H - C - ( C H 2) 5- N H - C - C H 2
167
G ru p o ra s tre a d o r
d e d ig o x ig e n in a
CH
-C H ,
D ig o xig en in a-11 -d U T P |
N?
' c - cV
I
G ru p o
r a s tre a d o r
d e b io tin a
OH H
E s p a c ia d o r C 1 6
O
H
..
C "H
NH
C H -C H
/
\
II
CH
B io tin a -1 6 -d U T P
C C"
HN
w C H = C H - C H 2- N H - C - ( C H 2) 3- N H - C - ( C H 2) 3- N H - C - ( C H 2)4- C H
-c h 2
O
II
CH
C la v e :
E n la c e p o te n c ia l d e
h id r g e n o en p a re a m ie n to d e ba se s
c u a n d o se in c o rp o ra
en d o b le h lic e
OH H
Fig. 6-7. Estructura de nucletidos modificados con digoxigenina y biotina.

Obsrvese que los grupos digoxigenina y biotina de estos ejemplos estn unidos al tomo de carbono 5 ' de la uridina de dUTP mediante grupos
espaciadores que consisten respectivamente de un total de 11 tomos de carbono (digoxigenina-11-UTP) o 16 tomos de carbono (biotina-16-dUTP).
Los grupos digoxigenina y biotina son grupos rastreadores: tras su incorporacin en un cido nucleico se enlazan mediante ligandos especficos que
contienen un marcador unido, como un fluorforo.
con que las cadenas complementarias se reasocian depende de la

concentracin inicial del DNA. Si la concentracin de secuencias
complementarias de DNA es alta, se reducir el tiempo que se re
quiere para que cualquier molcula de DNA de cadena nica en
cuentre una cadena complementaria y forme un dplex. Cintica
de reasociacin es el trmino que se usa para medir la rapidez a la
que son capaces de encontrarse entre s molculas complementarias
de cadena nica y formar un dplex. Existen dos parmetros prin
cipales: la concentracin de inicio (C0) de la secuencia especfica de
DNA en moles de nucletidos por litro y el tiempo de reaccin ()
en segundos. Si se toma en cuenta que el ritmo de reasociacin es
proporcional a C0 y t, el valor C0t (que en ocasiones se denomina
valor cot) es una medida til. El valor CBt tambin vara segn la
temperatura de reasociacin y la concentracin de cationes mono
valentes. Como resultado, es usual emplear el valor de referencia fi
jo: una temperatura de reasociacin de 65C y una concentracin
[Na+] de 0.3 M de NaCl.
Casi todas las valoraciones de hibridacin utilizan un exceso de
cido nucleico blanco comparado con el de la sonda a fin de esti
mular la unin de la sonda con el blanco. Esto se debe a que la son
da suele ser homognea y con frecuencia consiste en un tipo aislado
de molcula de DNA o molcula de RNA clonada, pero por lo ge
neral el cido nucleico blanco es heterogneo y comprende, por
ejemplo, DNA genmico o RNA celular total. En el ltimo caso la
concentracin de cualquier secuencia puede ser muy baja y en con

secuencia dar lugar a un ritmo de reasociacin lento. Por ejemplo,
si en una Southern blot se utiliza un gen de globina (3 clonado como
sonda para identificar secuencias complementarias en el DNA ge
nmico humano, este ltimo se encontrar en una concentracin
muy baja (el gen de globina (3 es un ejemplo de una frecuencia de
copia nica y en este caso slo representa 0.00005% del DNA ge
nmico humano). Por tanto es necesario usar varios microgramos
de DNA blanco para impulsar la reaccin. En contraste, algunas
otras secuencias estn muy repetidas en el DNA genmico (vase
cap. 9) y esta concentracin muchsimo mayor de DNA produce
un tiempo de reasociacin rpido.
Como la cantidad de cido nucleico blanco que enlaza una son
da depende del nmero de copias de la secuencia reconocida, la in
tensidad de la seal de hibridacin es proporcional al nmero de
copias de la sustancia reconocida: genes con copia nica dan seales
de hibridacin dbiles, secuencias de DNA muy repetidas propor
cionan seales muy potentes. Si una sonda particular es heterog
nea y contiene una secuencia de inters de copias bajas (como un
gen especfico), mezclada con una secuencia de DNA repetida muy
abundante, la seal potente del DNA repetido ocultar por com
pleto la seal de hibridacin dbil que se obtiene con la secuencia
de copias bajas. Sin embargo, este efecto puede evitarse mediante la
h ib rid a ci n d e co m p eten cia (vase recuadro 6 -3 ).
168
CAPTULO SEIS
HIBRIDACIN DE ACIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
Glosario de hibridacin de cido nucleico (para mtodos individuales, vase el recuadro 6-4)
Hibridacin de oligonucletido especfica de alelo (OEA). Se utilizan
sondas de oligonucletidos cortas de ca. 20 nucletidos de largo espec
ficas para alelos individuales bajo condiciones de hibridacin rgidas en
las que la incompatibilidad de una base impide la hibridacin satisfacto
ria. Vase figura 6-11.
Asociacin (anneal). Dos cidos nucleicos de cadena nica que compar
ten suficiente complementariedad de bases formarn un dplex de DNA
de doble cadena. Asociar significa permitir que se formen enlaces de hi
drgeno entre dos cadenas nicas y en consecuencia tiene significado
opuesto a desnaturalizar.
Complementariedad de base. Grado al que las secuencias de dos cidos
nucleicos de cadena nica pueden form ar un dplex de DNA mediante el
pareamiento de bases Watson-Crick (seccin 1.2.1).
Hibridacin de competencia ( = hibridacin de supresin). Reaccin de
hibridacin en la que una sonda que contiene algunas secuencias de DNA
repetidas sufre un paso de prehibridacin para bloquear el acceso a se
cuencias repetidas en la sonda. Esta ltima se desnaturaliza primero y se
permite que se reasocie en presencia de una poblacin de DNA no mar
cada que se enriqueci con DNA repetido: como resultado los elementos
repetidos dentro de la sonda se eliminan con efectividad por fijacin a se
cuencias de DNA repetidas complementarias y dejan disponibles slo las
secuencias no repetidas.
Desnaturalizar. Separar las cadenas individuales de un DNA dplex de
doble cadena mediante la rotura de los enlaces de hidrgeno entre ellas
(por calentamiento o tratamiento con un desnaturalizante qumico, como
formamida).
Hibridacin de fluorescencia in situ (HFIS). Cualquier reaccin de hibri
dacin in situ en la que se marcan cidos nucleicos por fijacin de gru
pos qumicos que pueden fluorescer bajo ciertas longitudes de onda.
Heterodplex. DNA de doble cadena que se form a cuando se permite que
dos secuencias de cadena nica con complementariedad de bases par
cial se asocien (anneal). Los heterodplex pueden surgir en diferentes for
mas:
heterodplex allicos. La desnaturalizacin seguida del enfriamiento
de una muestra de DNA diploide nica o una mezcla de muestras de
DNA de diferentes individuos permitir que cadenas complementarias
de dos alelos que defieren un poco en la secuencia de DNA formen
dplex compatibles casi a la perfeccin;
heterodplex paralogos. La desnaturalizacin seguida del enfria
miento de una muestra de DNA aislada de una clula eucariota com
pleja tambin puede originar la reasociacin entre secuencias de DNA
relacionadas no allicas como los miembros diferentes relacionados
en form a cercana de una familia de genes o de una familia de DNA re
petido no codificado;
heterodplex interespecificos. Muestras de DNA desnaturalizado de
especies con genes relacionados hasta cierto punto cercanos, por
ejemplo, humano y ratn, se mezclan y se permite que cadenas ni
cas se reasocien (reanneal).
Homodplex. DNA de doble cadena que se forma cuando se permite que

dos secuencias de cadena nica con complementariedad de bases per
fecta se asocien (anneal).
Valoracin de hibridacin. Una reaccin de prueba en la que se utiliza un
cido nucleico conocido (la sonda) para buscar secuencias relacionadas
en un conjunto heterogneo de secuencias de DNA (el blanco). En una
valoracin de hibridacin estndar la sonda es marcada y por lo general
en solucin, en tanto que el blanco no se marca y suele enlazarse a un
apoyo slido. En la hibridacin inversa sucede lo contrario.
Hibridacin in situ. Una reaccin de hibridacin en la que una sonda se
hbrida a cidos nucleicos de clulas o cromosomas que se montaron en
un portaobjetos de vidrio, por ejemplo, DNA desnaturalizado de crom oso
mas en metafase (hibridacin cromosmica in situ, seccin 2.4.2) o
RNA preparado de cortes de tejido (hibridacin de tejido in situ). Vase
seccin 6.3.4.
Temperatura de fusin ( r j . Medida de la estabilidad de un dplex de
cido nucleico, es la temperatura que corresponde al punto medio en la
transicin de formas de cadena doble a cadena nica. De manera conve
niente, esta transicin puede seguirse midiendo la densidad ptica del
DNA a una longitud de onda de 260 nm. Vase figura 6-9.
Sonda. Poblacin de cido nucleico conocido que se usa para interrogar
una poblacin heterognea compleja de cido nucleico en una valoracin
de hibridacin. Originalmente puede ser de doble cadena, pero a fin de
que acte com o una sonda tiene que desnaturalizarse para obtener cade
nas nicas. Aunque por lo general la sonda es marcada y en solucin,
vase valoraciones de hibridacin inversa.
Reasociar. Asociar de nuevo (reannef) despus de un paso de desnatu
ralizacin previo.
Cinticas de reasociacin. Ritmos a los que se reasocian cadenas de
DNA complementarias. Las cadenas de DNA muy repetido se reasocian
con rapidez; las secuencias de copia nica lo hacen con lentitud.
Valoracin de hibridacin inversa. Una valoracin en la que el blanco se
marca y por lo general se encuentra en solucin en tanto que la sonda no
se marca y suele estar enlazada a un apoyo slido. Los ejemplos inclu
yen valoraciones dot-blot inversa e hibridacin de microarreglo.
Hibridacin de sustraccin. Mtodo basado en hibridacin para identifi
car secuencias de cido nucleico que se sabe que existen en una pobla
cin (la poblacin plus) pero que no se encuentran en otra poblacin
relacionada en form a cercana (la poblacin m inus). La hibridacin se di
sea para que tenga la poblacin ( - ) en gran exceso y en consecuencia
acte como un DNA impulsor, lo que asegura que todas las secuencias
relacionadas en la poblacin ( + ) se eliminen como heterodplex y deja
las secuencias deseadas que se encuentran slo en la poblacin ( + ) .
Blanco. Poblacin heterognea compleja de cido nucleico que se inte
rroga en una valoracin de hibridacin mediante un cido nucleico cono
cido, a menudo homogneo. Por lo general no marcado y enlazado a un
apoyo slido pero en las valoraciones de hibridacin inversa los blancos
estn marcados y en solucin.
6.2
PRINCIPIOS DE LA HIBRIDACIN DE ACIDO NUCLEICO
169
un
rm
D N A b la n c o |
Sonda de D N A j
(M e z c la d e d ife re n te s
fra g m e n to s d e D N A )
(P o r lo g e n e ra l h o m o g n e o
y m a rc a d o )
D e s n a tu ra liza r
1112
M e z c la r y p e rm itir
rea so c iac i n
(reanneal)
n n
r
rm
mi
D N A b la n c o re a s o c ia d o
(reannealed)
H e te ro d p le x
s o n d a -b la n c o
2112
ITTI
S o n d a D N A re a s o c ia d a
(reannealed)
C lave:
T M a rc a d o
Fig. 6-8. La valoracin de hibridacin de cido nucleico requiere la formacin de heterodplex entre sondas de cido nucleico de cadena nica
marcadas y secuencias complementarias dentro de un cido nucleico blanco.
Se considera que la secuencia de la sonda se relaciona con firmeza a con un segmento central de uno de los muchos tipos de molculas de cido
nucleico en el blanco. El mezclado de la sonda y el blanco desnaturalizados produce una sonda reasociada (reannealed)-sonda homodplex (abajo a la
derecha) y homodplex blanco-blanco (abajo a la izquierda), pero tambin heterodplex formados entre el DNA sonda y cualquier molcula de DNA
blanco que se relacione en form a importante en cuanto a la secuencia (centro abajo). Si se dispone de un mtodo para eliminar el DNA sonda que no
est enlazado al DNA blanco, es posible identificar con facilidad los heterodplex mediante mtodos que pueden detectar el marcador.
6.2.3 Es posible utilizar una gran variedad de

valoraciones de hibridacin de cido nucleico
Fig. 6-9. La desnaturalizacin de DNA ocasiona un incremento de ia

densidad ptica.
D0SS y DOqs indican la densidad ptica del DNA de cadena nica (SS)
y DNA de cadena doble (DS) respectivamente. La diferencia entre
ambas constituye el efecto hipocrmico (vase texto).
Aunque en los experimentos iniciales de hibridacin de cido nu

cleico se empleaba la hibridacin en solucin, que inclua el mezcla
do de soluciones acuosas de sonda y cidos nucleicos blanco, la
concentracin muy baja de secuencias de copia nica en genomas
complejos significaba que los tiempos de reasociacin eran inevita
blemente lentos. Un medio que se usa mucho para aumentar la ra
pidez de la reasociacin consiste en incrementar de modo artificial
la concentracin total de DNA en la solucin acuosa al eliminar
molculas de agua (p. ej., con la adicin de concentraciones altas de
polietilenglicol).
Una alternativa a la hibridacin en solucin que facilita la de
teccin de molculas reasociadas consiste en inmovilizar el DNA
blanco en un apoyo slido, como una membrana de nitrocelulosa
o nylon, al que se enlaza con facilidad DNA de cadena nica. La fi
jacin de la sonda marcada al DNA blanco inmovilizado puede se
guirse luego eliminando la solucin que contiene la sonda de DNA
libre, lavando en forma extensa la membrana y secndola como
preparacin para la deteccin.
170
CAPI 11 LO SEIS
Cuadro
6 -2 .
Ecuacin para calcular Tm.
Hbridos
Tm(C)
DNA-DNA
81.5
16.6(log10[Na+] a)
0.41 (%GCb) - 500/L0
DNA-RNA o RNA-RNA
79.8
18.5(log10[Na+] a)
0.58(%GCb)
11,8(%GCb)2 - 820/L0
oligo-DNA u oiigo-RNA:d
Para
<
20 nucletidos
(/)
22 +
2
Para 20 a 35 nucletidos
1.46
(/)
a0 para otro catin monovalente, pero slo es preciso en los lmites de 0.01 a 0.4 M.
bSlo preciso para 30 a 75% de GC.
L = longitud de dplex en pares de bases.
doligo = oligonucletido: / = longitud efectiva del cebador = 2 x (nm. de G + C) + (nm. de A
+ T).
Nota: para cada 1% de formamida, la Tm se reduce alrededor de 0.6 C, en tanto que la presencia de 6 M de urea reduce la Tm alrededor de 30C.
sta el base de las valoraciones de hibridacin de cido nuclei

co estndar que se utilizan en la actualidad. Sin embargo, en fecha
ms reciente tambin se popularizaron las valoraciones de hibri
dacin inversa. En estos casos la poblacin de la sonda no est
marcada y se fija al apoyo slido, en tanto que el cido nucleico
blanco se marca y se presenta en solucin acuosa. Por consiguiente
cabe sealar que la distincin entre sonda y blanco no se basa en es
pecial en cul es la poblacin marcada y cul es la poblacin no
marcada. Por el contrario, la consideracin importante es que el
DNA blanco debe ser la poblacin compleja, comprendida de modo
imperfecto, que la sonda (cuya identidad molecular se conoce) in
tenta interrogar. Segn la naturaleza y forma de la sonda y el blan-
Sonda de DNA:
convencional
Sonda
o lig o n u c le tid a
TTTTTTTTTTTT
E s ta b le
ZZZZZMZZZZI
E s ta b le
E s ta b le
a rigor d e
h ib rid aci n
re d u c id o
p e rfe c ta
In c o m p a tib ilid a d
n ic a
(p. ej., allica)
co, es posible disear una variedad muy amplia de valoraciones de

hibridacin de cido nucleico (recuadro 6-4).
6.3
Valoraciones de hibridacin
de cido nucleico m ediante
sondas de DNA clonado para
seleccionar poblaciones de cido
nucleico no clonado
Las mltiples aplicaciones en gentica molecular incluyen obtener

una clona individual de DNA y usarla como sonda de hibridacin
para seleccionar la presencia de secuencias relacionadas dentro de
un blanco complejo de DNA o RNA no clonado. En ocasiones la
valoracin se restringe a slo verificar la presencia o ausencia de se
cuencias relacionadas con la sonda. En otros casos es posible obte
ner informacin til del tamao de las sustancias complementarias,
su localizacin subcromosmica o sus localizaciones dentro de teji
dos o grupos de clulas especficos.
E s ta b le
6.3.1 En la hibridacin dot-blot, un mtodo rpido

de deteccin, suelen emplearse sondas de
oligonucletidos especficas de alelo
In e s ta b le a
rig o r d e
h ib rid aci n alto
2 0 % d e in c o m p a tib ilid a d
(p. ej., s e c u e n c ia s
d e c o d ific a c i n d e
genes hum anos y
d e ratn)
Fig. 6-10. La hibridacin de cido nucleico puede identificar

secuencias blanco considerablemente divergentes de una sonda
de cido nucleico convencional o idnticas a una sonda de
oligonucletidos.
El procedimiento general de dot-blotting consiste en obtener una

solucin acuosa del DNA blanco, por ejemplo, DNA genmico to
tal humano, colocar manchas en una membrana de microcelulosa
o de nylon y despus permitir que se seque. La tcnica variante de
slot-blotting comprende colocar con pipeta el DNA a travs de
una hendidura individual en una plantilla apropiada. En ambos
mtodos se desnaturalizan las secuencias del DNA blanco ya sea
por exposicin previa a calor o exposicin del filtro que las contie
ne a un lcali. Las secuencias de DNA blanco desnaturalizadas in
mviles ahora en la membrana se exponen a una solucin que
contiene secuencias de cadena nica de la sonda marcadas (con fre
cuencia se marca con 32P a fin de optimar la deteccin). Tras per
mitir que transcurra el tiempo suficiente para la formacin de
heterodplex sonda-blanco, la solucin de la sonda se decanta y la
membrana se lava para eliminar el exceso de sondas que puedan ha
berse enlazado en forma inespecfica al filtro, que a continuacin se
seca y expone a una placa autorradiogrfica.
6.3
VALORACIONES DE HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO MEDIANTE SONDAS DE DNA
171
Valoraciones de hibridacin de cido nucleico estndar e inversa

VALORACIONES ESTNDAR
Sonda marcada en solucin
Blanco no marcado enlazado en apoyo slido
Dot blot (fig. 6-11)
Cualquier DNA o RNA marcado pero

con frecuencia un oligonucletido
Poblacin de DNA o RNA complejo; no fraccionada por

tamao, pero manchada directamente en la membrana
Southern blot (fig. 6-12 para

el mtodo; figs. 7 - 9 ,18-12B y
18-12C para ejemplos)
Cualquiera
A menudo DNA genmico complejo (pero pueden ser

clonas de DNA individuales); digerido con nucleasa de
restriccin y fraccionado por tamao, luego transferido a
membrana
Northern blot (fig. 6-13)
Cualquiera
Poblacin de RNA complejo (p. ej., RNA celular total o poli

A + RNA) que se fraccion por tamao y a continuacin se
transfiri a una membrana
Hibridacin cromosomica in situ

(p. ej., figs. 2-16 a 2 -1 8 ,1 4 -1 2 )
Por lo general una clona genmica

marcada
DNA dentro de cromosomas (con frecuencia en metafase)

de clulas lisadas en un portaobjetos para microscopio
Hibridacin tisular in situ

(fig. 6-15)
Por lo general una ribosonda u

oligonucletido antisentidos marcados
RNA dentro de las clulas de cortes de tejido fijados en un

portaobjetos para microscopio
Colony blot (fig. 6-16)
Cualquiera
Colonias de clulas separadas despus de sembrarlas en

placa de agar y despus transferidas a una membrana
Levantamiento de placa
Cualquiera
Colonias bacterianas infectadas por fago separadas luego

de sembrarlas en una placa de agar y transferirlas a una
membrana
Valoracin de hibridacin de
clona en rejilla (fig. 6-17)
Cualquiera
Clonas manchadas robticamente en una membrana en

arreglos geomtricos
VALORACIONES INVERSAS
Blanco marcado en solucin
Sondas sin marcas enlazadas a un apoyo slido
Dot blot inversa
DNA complejo
Oligonucletidos manchados en una membrana
Microarreglo de DNA o de
oligonucletidos presintetizados
DNA complejo
Clonas de DNA u oligonucletidos manchados

robticamente en un portaobjetos para microscopio
DNA complejo
Oligonucletidos sintetizados en vidrio
(fig. 6-19)
Microarreglo de oligonucletidos
fig. 17-18)
Una aplicacin til de dot-blotting comprende la distincin en

tre alelos que difieren por la sustitucin inclusive de un nucletido
; slado. Para efectuarla se elaboran sondas con oligonucletido esrecfico de alelo (OEA) a partir de secuencias que abarcan el sitio
iriable del nucletido. Por lo general las sondas OEA tienen 15 a
20 nucletidos de largo y suelen emplearse bajo condiciones de hir ridacin a las que el dplex de DNA entre sonda y blanco es esta
ble slo si la com plem entariedad de bases entre ellos es perfecta: es
suficiente una incompatibilidad aislada entre la secuencia de la son
da v el blanco para tornar inestable el heterodplex corto (fig. 6 - 10 ).
Csi siempre esto incluye disear los oligonucletidos de tal manera
q je ocurran diferencias de un nucletido entre los alelos en un seg
mento central de la secuencia oligonucletida, lo que en conse
cuencia maximiza la inestabilidad termodinmica de un dplex
^compatible. Esta discriminacin puede usarse para una variedad
propsitos de investigacin y diagnstico. Aunque el OEA puede
emplearse en la hibridacin convencional Southern blot (vase ms
idelante), es ms conveniente utilizarlo en valoraciones dot-blot
vase fig. 6 - 11 ).
Otro mtodo dot blotting con OEA recurre a una tcnica dot
rlotting inversa. Esto significa que las sondas oligonucletidas no
estn marcadas y se encuentran fijas a un filtro o una membrana en
tinto que el DNA blanco est marcado y se proporciona en solu
cin. Se considera que el enlace positivo del DNA blanco marcado

a un oligonucletido especfico en la membrana indica que el blan
co tiene esa secuencia especfica. Tanto este mtodo como las tc
nicas de microarreglo de DNA relacionadas tienen muchas
aplicaciones diagnsticas.
6.3.2 Las hibridaciones Southern blot y Northern blot

detectan cidos nucleicos cuyo tamao se
fraccion mediante electroforesis en gel
Hibridacin Southern blot
En este procedimiento el DNA blanco se digiere con una o ms endonucleasas de restriccin cuyas secuencias de reconocimiento sue
len ser de 4 a 6 pb de largo, lo que genera fragmentos que tienen
varios cientos o miles de pares de bases de longitud. Los fragmen
tos de restriccin se fraccionan de tamao mediante electroforesis
en gel de agarosa, se desnaturalizan y transfieren a una membrana
de nitrocelulosa o nylon para hibridacin (fig. 6-12). Durante la
electroforesis de fragmentos de DNA, que tienen una carga negati
va por los grupos fosfato, se repelen del electrodo negativo hacia el
positivo y se tamizan a travs del gel poroso. Los fragmentos de
DNA ms pequeos se mueven ms rpido. La rapidez de migra-
172
CAPITULO SEIS
N o rm a l
H e te ro c ig o to H o m o c ig o to d e c lu la fa lc ifo rm e
As
AA
s s
Dot
b lo t
H ib rid a c i n
A -A S O
5' TG
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CCT GAG
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3'
H f S n te sis d e O E A
|N O R M A L |
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G C C ---------------3 '
M u ta c i n d e c lu la fa lc ifo rm e
S E C U E N C IA S G E N IC A S
[M U T A N T E I
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CTG
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GAG
AAG
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S n te s is d e O E A
S-ASO 5 '
TG ACT
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GAG
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H ib rid a c i n
Dot
b lo t
qA qS
AA
N o rm al
s s
H e te ro c ig o to H o m o c ig o to d e c lu la fa lc ifo rm e
Fig. 6-11. La hibridacin dot-blot de oligonucletido especfica de alelo (OEA) puede identificar individuos con la mutacin de clula falciforme.
El dot blot esquemtico de la parte superior muestra el resultado del sondeo con un OEA especfico para el alelo de globina beta normal (p A-0EA; que
se muestra justo abajo). Los resultados son positivos (crculos negros) en individuos normales y heterocgotos, pero negativos en homocigotos de
clula falciforme (crculo de guiones, blanco). La dot blot de la parte inferior muestra el resultado del sondeo con un OEA especfico para el alelo
de globina (3 de clula falciform e ((3S-0EA; se muestra justo arriba) y en este caso los resultados son positivos para homocigotos y heterocgotos de
clula falciforme, pero negativos para individuos normales. El p A-0EA y el |3S-0EA se disearon para que tuvieran 19 nucletidos de largo en este caso
elegidos de los codones 3 a 9 de secuencias del gen de globina (iA y p s de sentido respectivamente rodeando el sitio de mutacin de clulas
falciformes. El ltimo es una sustitucin de nucletido nico (A - * T) en el codn 6 en el gen de globina p, que resulta en una sustitucin GAG
(Glu)-KBIG (Val) (vanse secuencias medias).
cin de fragmentos entre 0.1 y 30 kb de largo depende de su lon

gitud, pero muy poco de la composicin de bases. Por tanto los
fragmentos de estos lmites de tamao se fraccionan de tamao en
un sistema de electroforesis en gel de agarosa convencional.
Una aplicacin importante de la hibridacin Southern blot en
gentica de mamferos es el uso de una sonda para identificar se
cuencias relacionadas que pueden pertenecer al mismo genom a (ade
ms de los miembros de una familia de genes o secuencias de DNA
relacionados en trminos evolutivos) o a otros genom as (p. ej., un
gen ortlogo, que es un equivalente directo del gen que se utiliza co
mo sonda). Una vez que se demuestra que una sonda recin aisla
da se relaciona con otras secuencias no caracterizadas, puede
intentarse aislar los otros miembros de la familia mediante la selec
cin de genotecas d e DNA genm ico (seccin 5.3.4). Asimismo, la
seleccin puede realizarse en muestras de DNA genmico de dife
rentes especies (una z o o b lo t) con objeto de identificar secuencias
conservadas entre diferentes especies (vase fig. 7-9). Como las se

cuencias de codificacin estn comparativamente muy bien conser
vadas, ste es un medio para identificar DNA codificante.
Hibridacin Northern blot

La hibridacin Northern blot es una variante de la Southern blotting en la que el cido nucleico blanco es RNA no digerido en lu
gar de DNA. Una utilidad principal de este mtodo es obtener
informacin de los patrones de expresin de genes especficos. Una
vez que se clona un gen, puede emplearse como sonda e hibridarse
contra un Northern blot que contiene, en diferentes sendas, mues
tras de RNA aisladas de una variedad de tejidos distintos (vase fig.
6-13). Es posible que los datos obtenidos proporcionen informa
cin respecto a la gama de tipos de clulas en los que el gen se ex
presa y la abundancia relativa de transcritos. Adems, al revelar
6.3 j VALORACIONES DE HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO MEDIANTE SONDAS DE DNA
D N A b la n c o
173
S onda de DNA
D ig e rir c o n e n d o n u c le a s a
d e res tricci n
A a d ir m a rcad o r,
p. ej., m a rc a d o r
ra d ia c tiv o (*)
A p lic a r a fo s o s in d ivid u ale s

en un gel d e a g a ro s a
M ig ra c i n
D e s n a tu ra liza r
p o r c a lo r
P es o
m o le c u la r a lto
P eso
m o le c u la r b a jo
D e s n a tu ra liza r en lcali
H ib rid a r a
D N A b la n c o
in m o v iliza d o
A p lic a r a u n a m e m b ra n a
d e n itro c e lu lo s a o nylon
M e m b ra n a
T ran sferir D N A
G el
f
a la m e m b ra n a
L a v a r el
exceso de
sonda de DNA
A p lic a r p la c a
d e ray o s X
P la c a
M e m b ra n a
Fig. 6-12. La hibridacin Southern blot detecta fragmentos de DNA blanco que se fraccionaron de tamao mediante electroforesis en gel.
transcritos de diferentes tamaos, puede brindar pruebas de distin

tas isoformas (p. ej., resultantes de promotores alternativos, sitios
de empalme, sitios de poliadenilacin, etc.).
6.3.3 La electroforesis en gel de campo pulsado

extiende la hibridacin Southern al incluir la
deteccin de molculas de DNA muy grandes
La electroforesis en gel de agarosa estndar puede resolver fragmen
tos de DNA de tamao limitado, de 100 pb a unas 30 kb, como
resultado del efecto d e tamizaje, las molculas de DNA pasan a tra
vs de poros en el gel de agarosa y las pequeas pueden migrar con
mayor rapidez por los poros. Sin embargo, por arriba de un cierto
tamao de fragmento de DNA, el efecto de tamizado ya no es efi
caz y la resolucin de fragmentos de DNA mayores de 40 kb es en
extremo limitada. Ya que muchos genes de mamferos y otras uni
dades de secuencia funcionales son muy grandes, se requieren m
todos de electroforesis alternativos para separar fragmentos de
DNA muy grandes.
La electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP) es una
modificacin ms reciente de la electroforesis en gel de agarosa que
puede resolver fragmentos de DNA de un tamao que vara de
unas 20 kb a varios Mb de largo. Aunque las molculas de DNA

muy grandes incluidas en cromosomas de mamferos casi siempre
de cientos de Mb de longitud no pueden separarse por tamao
con este mtodo, se sabe que nudeasas de restriccin especializa
das cortan DNA de vertebrados muy rara vez y producen fragmentos
de restriccin grandes que pueden separarse por tamaos mediante
la electroforesis en gel de campo pulsado (EGCP). Estas enzimas,
que tambin se conocen como en d on u clea sa s d e restricci n co r
ta d ora s raras, a menudo identifican secuencias de reconocimiento
abundantes en GC que contienen uno o ms dinucletidos CpG.
Puesto que el dinudetido CpG se observa con poca frecuencia en
DNA de vertebrados, el DNA humano y los DNA de otros vertebra
dos tienen comparativamente pocas secuencias de reconocimiento de
enzimas de restriccin que cortan las secuencias que contienen CpG
(cuadro 6-3).
El DNA genmico preparado no suele ser adecuado para
EGCP porque los procedimientos relacionados con la lisis de clu
las y la purificacin del DNA producen fuerzas de desgarro que
causan una fragmentacin considerable del DNA. En lugar de ello,
el DNA se asla en una forma que permita reducir al mnimo la ro
tura artificial de las molculas grandes y luego se digieren con en
donucleasas de restriccin cortadoras raras apropiadas. Para
174
CAPTULO SEIS
LLI
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de la tcnica recurren a un campo elctrico nico pero con rever

siones peridicas de la polaridad ( electro fo resis en g e l d e in versin
d e cam po), o rotacin peridica del gel o los electrodos.
En general cada uno de los diferentes mtodos es el principio de
un campo elctrico discontinuo de modo que las molculas de DNA
se fuerzan de manera intermitente a cambiar su conformacin y di
reccin de migracin durante su paso a travs del gel. El tiempo
que una molcula de DNA requiere para alterar su configuracin y
reorientarse por s misma en la direccin del nuevo campo elctri
co depende por completo del tamao; por tanto pueden fraccionar
se con eficiencia fragmentos de DNA hasta de varios Mb de
tamao, inclusive DNA intacto de cromosomas de levadura com
pletos (Schwartz y Cantor, 1984).
6.3.4 Sondas de hibridacin in situ se hibridan

para desnaturalizar DNA de una preparacin
de cromosomas o RNA de un corte de tejido
fijado en un portaobjetos de vidrio
Hibridacin cromosmica in situ
Fig. 6-13. La hibridacin Northern biot se usa para valorar los

patrones de expresin gruesos de un gen.
El Northern blotting consiste en fraccionar de tamao muestras de
RNA total [o mRNA poll(A)+ purificado], transferir a una membrana e
hibridar con una sonda de cido nucleico marcada apropiada. El ejemplo
muestra el empleo de una sonda cDNA marcada del gen FMR1
(sndrome de retraso mental por X frgil). Se detectaron concentraciones
ms altas en el cerebro y el testculo (4.4 kb), con expresin
decreciente en placenta, pulmones y riones respectivamente. Se
encuentran mltiples transcritos ms pequeos en el corazn.
Reproducido de Hinds y col. (1993) con autorizacin de Nature
Publishing Group.
preparar DNA de peso molecular alto se mezclan muestras de clu

las, por ejemplo, glbulos blancos, con agarosa fundida y despus
se transfieren a fosos en un formador de bloques y se dejan enfriar.
Como resultado las clulas quedan atrapadas en bloques slidos de
agarosa (fig. 6-14). Se remueven los bloques de agarosa y se incu
ban con enzimas hidrolticas que se difunden a travs de los poros
pequeos en la agarosa y digieren componentes celulares, pero de
jan casi intacto el DNA cromosmico de peso molecular alto. A
continuacin pueden incubarse bloques individuales que contienen
DNA de peso molecular alto purificado en un amortiguador que
incluye una endonucleasa de restriccin cortadora rara.
Con objeto de separar por tamao los fragmentos de restriccin
grandes incluidos dentro de los bloques de agarosa, estos ltimos se
colocan en fosos en un extremo de un gel de agarosa contenido en
un aparato de EGCP. Como en la electroforesis en gel convencio
nal, el DNA de carga negativa se repele del electrodo negativo y mi
gra en el campo elctrico. Sin embargo, durante una carrera de
EGCP la orientacin relativa d el g e l y el campo elctrico se altera de
manera peridica, p o r lo general m ediante el ajuste de un interruptor
para proporcionar pulsos de potencia breves, activando alternativa
m ente dos campos orientados en form a diferente (fig. 6-14). Variantes
Un procedimiento simple para marcar genes y otras secuencias de

DNA consiste en hibridar una sonda de DNA marcada apropiada
contra DNA cromosmico que se desnaturaliz in situ. Para efec
tuarlo se hace una preparacin de cromosomas en un portaobjetos
para microscopio que se seca al aire (con frecuencia cromosomas en
metafase o prometafase de linfocitos de sangre perifrica o lneas de
clulas linfoblastoides). El tratamiento con ribonucleasa (RN-asa)
y proteinasa K produce DNA cromosmico purificado en forma
parcial, que se desnaturaliza al exponerlo a formamida. Se dispone
entonces de DNA desnaturalizado para hibridacin in situ con una
solucin aadida que contiene una sonda de cido nucleico marca
da, recubierto con un cubreobjetos. Segn la tcnica particular que
se utiliza, el bandeo cromosmico de los cromosomas puede arre
glarse antes o despus del paso de hibridacin. Como resultado, la
seal obtenida tras eliminar el exceso de sonda puede correlacionar
se con el patrn de bandeo cromosmico con objeto de identificar
un mapa de localizacin para las secuencias de DNA que la sonda
reconoce. El uso de tcnicas de h ib rid a ci n d e flu o r es cen cia in si
tu (HFIS) revolucion la hibridacin cromosmica in situ (vase
seccin 2.4.2).
Hibridacin de tejidos in situ

En este procedimiento se hibrida una sonda marcada contra RNA
en cortes de tejido (Wilkinson, 1998). Los cortes se elaboran de te
jido embebido en parafina o congelado por medio de un criostato y
luego se montan en un portaobjetos de vidrio. La mezcla de hibri
dacin que incluye la sonda se aplica al corte en el portaobjetos y
se protege con un cubreobjetos de vidrio. Por lo general la mezcla
de hibridacin tiene una concentracin de formamida de 50% a fin
de disminuir la temperatura de hibridacin y minimizar los proble
mas de evaporacin.
Aunque se utilizan cDNA de doble cadena como sondas, se pre
fieren las sondas de RNA complementario de cadena nica (ribosondas): la sensibilidad de las sondas iniciales de cadena nica suele
ser ms alta que la de las sondas de doble cadena, quiz porque una
proporcin de la sonda de doble cadena desnaturalizada se renaturaliza para formar una homodplex de sondas. Las ribosondas de
cRNA que son complementarias al mRNA de un gen se conocen
6.3
VALORACIONES DE HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO MEDIANTE SONDAS DE DNA
175
Cuadro 6 3. Ejemplos de endonucleasas de restriccin cortadoras raras.

Enzima
Origen
Corte de secuencia; CG = CpG; N = A, C, G o T
Sma 1
Serratia marcescens
CCCGGG
78
SssHil
Bacillus stearothermophilus
GCGCGC
390
Sacli
Streptomyces lividans
CCGCGG
390
Sffl
Streptomyces fimbriatus
GGCCNNNNNGGCC
400
Atoa
Norcadia otitidis-caviarum
GCGGCCGC
Tamao de fragmento promedio

esperado (kb) en DNA humano3
9 766
Asumiendo 40% de G + C y una frecuencia de CpG 20% de la esperada.
S an gre^
R eunir
} g l b u lo s
b la n c o s
A g a ro s a
fu n d id a
T ran sferir la m e z c la
a c a v id a d e s en un m o ld e
p a ra fo rm a r b lo q u e s
y p e rm itir q u e el a g a r
s e so lid ifiq u e
In a c tiv a r
p ro te in a s a K;
la var p a ra elim in ar
, d e s e c h o s ce lu la res
D ig e rir co n
DNA de
peso
m o le c u la r
a lto a tra p a d o
n u c le a s a d e
res tricci n
c o rta d o ra rara
V
E2 I
In c u b a r en
p ro te in a s a K
y SDS
E 1 0
C lu la s
a tra p a d a s
__ i___
E2
<
i E1
P o ro en
a g a ro s a
Insertar bloques
In te rru p to r p e ri d ic o (pulsacin)
d e e n e rg a e n tre p a re s d e
e le c tro d o s (E1 y E2)
en fo s o s d e
gel d e a g a ro s a
M ig ra c i n
n e ta
Fig. 6-14. Fraccionamiento de DNA de peso molecular alto de clulas hematolgicas mediante electroforesis en gel de campo pulsado.
como ribosondas antisentido y pueden obtenerse mediante clona

cin de un gen en la orientacin inversa en un vector apropiado co
mo pSP64 (fig. 6-3). En estos casos la polimerasa fago sintetizar
transcritos marcados de la cadena de DNA opuesta a la que en con
diciones normales se transcribe in vivo. Los testigos tiles para estas
reacciones incluyen ribosondas de sentido que no deben hibridarse a
mRNA excepto en los casos raros en que las dos cadenas de DNA
de un gen se transcriben.
El marcado de sondas se realiza con radioistopos seleccionados,
en especial 35S, o mediante marcado no isotpico. En el primer ca
so la sonda hibridada se visualiza por procedimientos autorradiogr-
ficos. A menudo la localizacin de los granos de plata se observa s

lo con microscopa de campo oscuro (no se permite que llegue luz
directa al objetivo; en su lugar, los rayos de luz que iluminan se di
rigen de un lado de manera que slo penetra luz dispersa en las len
tes del microscopio y la seal aparece como un objeto iluminado
contra un fondo negro). Sin embargo, la microscopa de campo
brillante (en la que la imagen se obtiene por transmisin directa de
la luz a travs de la muestra) proporciona una deteccin de seal ms
adecuada (vase fig. 6-15). El marcado con fluorescencia es un m
todo de marcado no isotpico popular y la deteccin se efecta por
microscopa de fluorescencia (vanse recuadro 6-2, fig. 6-5).
176
,o
6.4 Valoraciones de hibridacin

m ediante el uso de DNA blanco
clonado y m icroarreglos
Algunas de las tcnicas descritas en la seccin anterior (p. ej la hi
bridacin Southern blot y la hibridacin dot-blot) tambin se em
plean para estudiar tanto DNA clonado como DNA no clonado.
Sin embargo, las tcnicas que se describen en las dos secciones si
guientes se usan para analizar DNA clonado. En una tercera sec
cin se describen tecnologas de microarreglos muy potentes
desarrolladas en fecha ms reciente.
6.4.1 La hibridacin colony blot y la de levantado de

placa son mtodos para seleccionar colonias o
placas bacterianas separadas
Como se describe en la seccin 5.3.5, suele ser posible seleccionar e
identificar colonias de bacterias u otras clulas husped apropiadas
que contienen DNA recombinante por la capacidad del inserto
para inactivar un gen vector marcador (p. ej., galactosidasa @, o un
gen de resistencia a antibiticos). No obstante, si el DNA recombi
nante apropiado contiene una secuencia de DNA que se relaciona
muy de cerca con una sonda de cido nucleico disponible puede
detectarse en forma especfica por hibridacin. En el caso de clulas
bacterianas utilizadas para propagar plsmidos recombinantes se
permite que las colonias de clulas crezcan en una superficie de agar
y luego se transfieren por contacto de superficie a una membrana de
nitrocelulosa o nylon, un proceso que se conoce como blotting co
lony (manchado de colonias) (vase fig. 6-16). De otra manera la
mezcla de clulas se disemina en una membrana de microcelulosa o
nylon colocada en la parte superior de la superficie de agar nutrien

te y se permite que se formen colonias directamente en la parte su
perior de la membrana. En cualquiera de los mtodos, la membrana
se expone despus a lcali para desnaturalizar el DNA antes de hibridarlo con una sonda de cido nucleico marcada.
Tras la hibridacin, se elimina la solucin sonda, el filtro se la
va en forma extensa, se seca y se enva para autorradiografa con
una placa de rayos X. La posicin de las seales radiactivas poten
tes se relaciona contra una placa maestra que contiene el patrn ori
ginal de colonias a fin de identificar las que contienen DNA
relacionado con la sonda. A continuacin puede tomarse y ampli
ficarse de manera individual el cultivo antes de la extraccin y pu
rificacin del DNA recombinante.
Puede realizarse un proceso similar cuando se utilizan vectores
fago. Las placas que se forman despus de la lisis de clulas bacte
rianas por fago contendrn partculas residuales de fago. Se coloca
una membrana de nitrocelulosa o nylon en la parte superior de la
placa de agar en la misma forma que la anterior y cuando se remue
ve de la placa constituye una copia fiel del material fago en las placas,
un mtodo llamado levantamiento de placa. El procesamiento
subsecuente del filtro es idntico al del esquema que se muestra en
la figura 6-16.
6.4.2 Los arreglos de alta densidad en rejillas de clonas

de clulas transformadas o clonas de DNA
incrementaron de modo considerable la eficiencia
de la seleccin de genotecas de DNA
La creacin de genotecas de DNA complejo demand mtodos
ms eficientes de seleccin de clonas. En lugar de slo sembrar las
colonias de clulas en una placa en un plato para cultivo celular y
Fig. 6-15. La hibridacin de tejida in situ proporciona patrones de expresin gnica de alta resolucin.
El ejemplo muestra el patrn de hibridacin producido mediante una ribosonda antisentido de cadena pesada de miosina p marcada con 35S contra un
corte transversal del tejido de un embrin de ratn de 13 das. Las reas oscuras representan un marcado potente, notable en los ventrculos del
corazn. Proporcionada por el doctor David Wilson, University of Newcastle upon Tyne, UK.
6.4 ! VALORACIONES DE HIBRIDACIN MEDIANTE EL USO DE DNA BIANCO CLONADO
177
M e m b ra n a
n itro c e lu lo s a /n y lo n
C o lo c a r la m e m b ra n a
en la p a rte s u p e rio r d e a g a r
q u e c o n tie n e co lo n ia s
b a c te ria n a s s e p a ra d a s
In v ertir la m e m b ra n a y c o lo c a rla s o b re n u e v a
s u p e rfic ie d e ag ar; p e rm itir q u e las co lo n ia s
reg e n ere n en la p a rte s u p e rio r del filtro
P e rm itir la re c u p e ra c i n
d e c lu la s o rig in ale s
\
P la c a m a e s tra
/ \
C re c im ie n to en
cu ltivo
Id e n tific a r en lq u id o I
co lo n ia s
/
p o s itiva s y
p a s a rla s a
A
cu ltivo en lq uido
,
P
I
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R p lic a d e l filtro en a g a r n u e vo
Q u ita r la m e m b ra n a
co n c o lo n ia s unidas;
s u m e rg irla en
s o lu c io n e s su ces iva s
a) D e s n a tu ra liza n te
b) N e u tra liza r
c) L a var
d) S e c a r/fija r D N A
P la c a d e .
rayos X
1. H ib rid a r con
s o n d a m a rc a d a
2. L a var
3. A u to rra d io g ra fa
D N A b a c te ria n o
fija d o a la
m e m b ra n a
Fig. 6-16. La hibridacin colony blot consiste en replicar colonias en una membrana durable antes de la hibridacin con una sonda de cido
nucleico marcado.
Este mtodo se usa para Identificar colonias que contienen DNA recombinante, debera disponerse de una sonda marcada.
transferirlas a una membrana en el colony blotting estndar se pre

firi tomar colonias individuales y transferirlas a membranas gran
des en el formato de un a rreg lo en rejilla d e a lta densidad.
El proceso de generar arreglos se simplific mucho con la apli
cacin de dispositivos robticos para enrejado que permiti au
tomatizar la realizacin del manchado necesario colocando con
pipetas las clonas dispuestas en platos de microttulo en coordena
das lineales predeterminadas en una membrana. Los filtros de clo
nas de alta densidad resultantes permitieron la seleccin rpida y
eficiente de genotecas (vase fig. 6-17) y posibilitaron copiarlas y
distribuirlas a numerosos laboratorios en todo el mundo.
dad de miniaturizacin y automatizacin (Schena y cois., 1998).

Aunque es una reminiscencia de los arreglos basados en filtros, la
construccin de microarreglos incluye procedimientos muy distin
tos. Por lo general las superficies relacionadas son portaobjetos de
un microscopio de vidrio tratados por medios qumicos en lugar de
las membranas porosas, aunque en fecha ms reciente se observa
una tendencia a utilizar sustratos ms porosos, por ejemplo, super
ficies de vidrio recubiertas con nitrocelulosa, como esfuerzo para
enlazar ms DNA e incrementar la sensibilidad. Existen dos tipos
muy distintos de tecnologa de microarreglo segn las diferencias
en la forma en que se generan y llevan muestras de cido nucleico
a los microarreglos:
6.4.3 La tecnologa de microarreglos de DNA extendi

muchsimo la potencia de la hibridacin de cido
nucleico
microarreglos de cidos nucleicos presintetizados. En este

caso los cidos nucleicos que se encuentran en los microarreglos
se sintetizaron antes (con frecuencia consisten en conjuntos de
clonas de DNA diferentes pero en principio pueden ser conjun
tos de oligonucletidos sintetizados con anterioridad). Aqu la
construccin del microarreglo significa que se manchan clonas
Los microarreglos de DNA recin desarrollados mejoraron la tec

nologa de valoracin por hibridacin gracias a su enorme capaci
178
CAPTULO SEIS
Fig. 6-17. Los filtros de hibridacin de clonas en rejilla facilitaron el

mapeo fsico del genoma humano.
La figura ilustra la autorradiografa de una membrana que contiene
clonas de YAC humanos (es decir, DNA total de clonas de levadura
individuales que contienen YAC humanos). La membrana alberga un
total de 17 664 clonas que se colocaron en arreglos en rejilla de
una unidad rejilla de 6 x 6 clonas. Las seales de hibridacin incluyen
seales dbiles de todas las clonas con una sonda marcada con 35S
de DNA de levadura total aunadas a seales potentemente hibridantes
obtenidas con una sonda de cromosoma del sexo nico marcada con
32P (DXYS646). Fotografa original del doctor Mark Ross, Sanger
Centre, Cambridge. Reproducida de Ross y Stanton (1995) En:
Current Protocols in Human Genetics, Vol. 1, este material se utiliz
con autorizacin de Wiley-Liss, Inc., una subsidiaria de John Wiley &
Sons, Inc.
de DNA o de oligonucletidos individuales en sitios separados

en la superficie de un portaobjetos para microscopio, especifi
cados mediante coordenadas x,y precisas en una parrilla miniaturizada (fig. 6-18A). Aunque la alta precisin en el suministro
de las muestras requiere dispositivos de pintado por contacto
robticos muy complicados, pueden encontrarse instrucciones
detalladas para preparar este tipo de dispositivos en
http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/
microarreglos de oligonucletidos sintetizados in situ. Este
mtodo lo propuso por primera vez por la compaa Affymetrix
y casi siempre comprende una combinacin de tecnologa de
fotolitografa de la industria de semiconductores con la qumi
ca de sntesis de oligonucletidos. En este caso se ensamblan in
situ muchos miles de oligonucletidos distintos en la superficie
de un portaobjetos de vidrio, en una serie de pasos de sntesis
secuenciales que incluye la adicin de un nucletido a la vez. El
proceso requiere el acoplamiento covalente de mononucletidos a una molcula enlazadora que termina con un grupo pro
tector fotolbil (fig. 6-18B).
Se usa una fotomscara para determinar las posiciones que reaccio

nan con la luz: una abertura en la fotomscara en un sitio particu
lar admitir luz de una fuente luminosa externa, destruyendo los
grupos protectores fotolbiles. A continuacin se utiliza una reac
cin qumica de acoplamiento para aadir un tipo particular de nu
cletido al nuevo sitio desprotegido y el proceso se repite con una
mscara diferente, pero las posiciones ocultadas por la mscara se
protegern de la luz. En esta forma es posible construir secuencias
de oligonucletidos especficas en sitios predeterminados segn el
ordenamiento de orificios cortados en el fotolitgrafo que se em
plea para ese paso de sntesis. La similitud con la produccin de
chips de silicn condujo a popularizar el uso del trmino chip de
DNA para los microarreglos de este tipo. A causa de la compleja
tecnologa necesaria para producirlos, los chips de DNA deben ad
quirirse de compaas especializadas.
Como en el dot-blotting inverso (seccin 6.3.1), las tecnologas
del microarreglo de DNA operan con un mtodo de hibridacin de
cido nucleico inverso. La son d a es el grupo de cidos nucleicos no
marcados fijada al microarreglo. Aunque resulta complejo, la son
da es la cantidad conocida y se utiliza para interrogar el b la n co que
a pesar de consistir en cidos nucleicos marcados en solucin se de
riva de fuentes de las que se desea informacin.
La reaccin de hibridacin puede llevarse a cabo una vez que se
construye o compra un microarreglo, y se asla una fuente de cido
nucleico a investigar. El blanco se marca con un flu o r fo r o y se de
ja que entre en contacto con el microarreglo, lo que permite que se
formen heterodplex de sonda-blanco, despus de lo cual el lavado
por hibridacin reduce al mnimo al marcador no enlazado de ma
nera especfica. En la mayor parte de las hibridaciones de microa
rreglos se utilizan dos fluorforos, por lo general Cy3 (excitacin de
canal verde) y Cy5 (excitacin de canal rojo).
Tras la hibridacin, el marcado fluorescente enlazado se detecta
con un ex plorador l ser de alta resolucin y el proceso de explora
cin incluye adquirir una imagen de ambos fluorforos para elaborar
una imagen de relacin. El patrn final de hibridacin se obtiene me
diante el anlisis de la seal emitida de cada punto en el arreglo con
un p rogra m a d e com p u ta d ora d e im gen es digita les que convier
te la seal en una paleta de colores segn su intensidad (fig. 6-19).
Aunque la tecnologa para establecer microarreglos de DNA se
desarroll slo hasta fecha muy reciente, ya tiene numerosas aplica
ciones importantes y se espera que su efecto en investigacin biomdica y mtodos diagnsticos futuros sea profundo. Las
principales aplicaciones comprenden:
selecci n d e expresin. El enfoque de la mayor parte de los es
tudios actuales basados en microarreglos es la vigilancia de los
niveles de expresin de RNA (Granjeaud y cois., 1999), que pue
de realizarse con microarreglos de clonas de cDNA (fig. 6-19)
o de oligonucletidos especficos de gen (por lo general prepa
rados mediante sntesis de oligonucletidos in situ; vase figs.
17-18 y 19-6, y seccin 19.3.3).
selecci n d e v a ria cin d e DNA. Para este propsito general se
requieren microarreglos de oligonucletidos y se disearon va
rias aplicaciones. La nueva secuenciacin del genoma mitocondrial humano mediante microarreglos de DNA fue una prueba
satisfactoria del poder de esta tecnologa para estimar la varia
cin de secuencias a gran escala en individuos (vase fig. 7-4).
Tambin tiene un potencial enorme para valorar la presencia de
mutaciones en genes de enfermedad conocidos. Adems se efec
tan grandes esfuerzos para identificar y catalogar marcadores
de polimorfismo de nucletido nico (PNU) humanos.
6.4
VALORACIONES DE HIBRIDACIN MEDIANTE EL USO DE DNA BLANCO CLONADO
179
A)
B)
F U E N T E L U M IN O S A
F o to m s c a ra
G ru p o s
p ro te c to re s fo to l b ile s
S IN T E S IS
O b le a d e vidrio
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A
G
C
T
C
T
T
C
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C
C
G
T
C
G
A
P a s o s d e fo to o c u lta c i n y sntesis re p e tid o s
Fig. 6-18. Preparacin de microarreglos de DNA de oligonucletidos.

A) Manchado robtico para la elaboracin de microarreglos de DNA. Izquierda: un robot para microarreglos en forma de mesa que contiene
160 portaobjetos con cuatro placas del microttulo, dos estaciones para lavado y el secador. Derecha: escner lser que muestra la mesa ptica,
abastecedores de energa para los lser y enfriamiento con tubo fotomultipllcador, la etapa Lud y lentes (vase Cheung y cois., 1999 para mayores
detalles). El micromanchado de muestras mediante el robot puede realizarse por contacto fsico entre las agujas de manchado y la superficie slida (de
jn portaobjetos para microscopio) con un mtodo de chorro de tinta (ink-jetting) que se utiliza en las imprentas estndar (la muestra se carga en una
Doquilla en miniatura equipada con una piezoelctrica ajustada y se usa una corriente elctrica para expulsar una cantidad precisa de lquido del chorro
-acia el sustrato). Fotografas proporcionadas por Aldo Massimi, Raju Kucherlapati y Geoffrey Childs del Albert Einstein College of Medicine. Reimpresas
de Cheung y cois. (1999) Nature Genet. 21 (Suppl.), 15-19, con autorizacin de Nature Publishing Group. B) Preparacin de un microarreglo de
oligonucletidos combinando fotolitografa y sntesis in situ de oligonucletidos. Estos ltimos se sintetizan in situ en pasos secuenciales comenzando
:ssde un mononucletido 3 ' que est anclado a la superficie de una oblea de vidrio. La fotolitografa comprende la modificacin de la oblea de vidrio
con grupos protectores fotolbiles que pueden eliminarse cuando se exponen a la luz y el uso de fotomscaras construidas con cuidado que permiten
que pase luz a travs de ellas hacia coordinadas espaciales seleccionadas cuidadosamente. En las reas de la oblea que reciben la luz que pasa a
ravs de la fotomscara, la eliminacin de los grupos protectores fotolbiles permite un nuevo paso de sntess. En este ejemplo se muestra el
::D lam iento de timidina junto con un grupo fotolbil protector.
180 i CAPTULO SEIS j HIBRIDACIN DE CIDO NUCLEICO: PRINCIPIOS Y APLICACIONES
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humana. Las exploraciones lser confocales del marcador fluorescente

estn representadas en una escala de seudocolor en arco iris para
indicar la cuantificacin gruesa de niveles de expresin: los niveles
de fondo son de color violeta, luego progresan a travs del ndigo,
azul-verde, amarillo, naranja hasta el rojo, que es la expresin ms
abundante. El formato paralelo del arreglo permite comparaciones
precisas y mediciones diferenciales de la expresin. Fotografa
proporcionada por el doctor Mark Schena, Stanford. Reproducido de
Strachan y cois. (1997) Nature Genetics 16,12 6-1 32, con autorizacin
de Nature Publishing Group.
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Un microarreglo de DNA de 1.0 cm2 que contenia 1 046 clonas de

una genoteca de cDNA de una clula sangunea humana completa se
hibrid con una sonda de cDNA marcada con fluorescencia preparada
medante transcripcin inversa a partir de mRNA de mdula sea
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Fig. 6-19. Perfil de expresin gnica mediante hibridacin a un

microarreglo de clona de cDNA.
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3O
'O
, * &
9
9
O C
090
%*"
9
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CAPTULO
SIETE
Anlisis del DNA y estructura

variacin y expresin gnicas
182
.1
CAPITI LO SIETE
ANLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIN Y EXPRESIN GNICAS
Secuenciacin y genotipificacin
de DNA
Los individuos de una especie portan diferencias genticas, mu

chas de las cuales pueden tener consecuencias importantes. Por
tanto, si bien fue fundamental comprometer tanto esfuerzo a los
proyectos del genoma, an sern de inters el mapeo y la secuen
ciacin de DNA de individuos dentro de una especie, en especial
la humana, y la tipificacin de la variacin del DNA (genotipi
ficacin) .
Aun cuando los mtodos tradicionales de mapeo y secuencia
cin o fsicos a gran escala sern tiles para obtener nuevas secuen
cias del genoma, los superarn tcnicas ms potentes, por completo
automatizadas, para establecer la estructura del DNA, de manera
directa o en la bsqueda de variaciones gnicas. La hibridacin de
microarreglos basada en oligonucletidos, por ejemplo, permite la
nueva secuenciacin (resecuenciacin) del DNA de individuos una
vez que se establece una secuencia de referencia.
7.1.1 La secuenciacin estndar de DNA incluye la

sntesis enzimtica de DNA mediante terminadores
de cadena didesoxinucletidos especficos de bases
Aunque los mtodos clnicos para la secuenciacin del DNA an
tienen ciertas aplicaciones (Maxam y Gilbert, 1980) (p. ej., secuen
ciacin de oligonucletidos; vase seccin 7.2.4), la vasta mayora
de la secuenciacin actual de DNA utiliza un mtodo enzimtico
desarrollado por Freed Sanger, quien obtuvo un segundo premio
Nobel (el primero lo recibi por el desarrollo de la secuenciacin
de protenas). En el mtodo de secuenciacin didesoxi, el DNA se
proporciona en forma de cadena tnica (vase recuadro 7-1 ) y acta
como plantilla para formar una cadena de DNA complementaria
nueva in vitro mediante una polimerasa de DNA apropiada. Hay
cuatro reacciones paralelas, cada una de la cuales contiene los cua
tro dNTP aunados a una proporcin pequea de uno de los cuatro
didesoxinucletidos (ddNTP) anlogos que servirn como un terminador de cadena especfico de bases.
Recuadro 7-1. Produccin de plantillas de secuenciacin de DNA de cadena nica

Las plantillas de cadena nica para secuenciacin de DNA pueden ob
tenerse mediante:
la elaboracin de DNA recombinante de cadena nica utilizando vec
tores de clonacin especializados como M13 o fagmides, un mto
do que se utiliza con amplitud; vanse seccin 5.5.1 y fig. 5-18. Aqui
la sntesis de DNA complementario se ceba mediante un cebador de
secuenciacin universal que es complementarlo de la secuencia del
vector que flanquea el sitio de clonacin y tambin puede emplearse
para cebar la sntesis de nuevas cadenas para cualquier recombinan
te de cadena nica que se produzca por medio de ese vector (vase
fig. Inferior Izquierda);
secuenciacin de ciclo (tambin llamada secuenciacin de am pli

ficacin lineal). Como la PCR estndar, la secuenciacin de ciclo usa
una polimerasa de DNA termoestable y un formato de desnaturaliza
cin del ciclo de temperatura, asociacin (annealing) y sntesis de
DNA. La diferencia radica en que en la secuenciacin de ciclo slo se
emplea un cebador e incluye un terminador de cadena ddNTR El uso
de slo un cebador significa que el producto se acomoda de manera
lineal, a diferencia del Incremento exponencial del producto durante la
PCR estndar (vase fig. inferior derecha).
5' I
3'C
3'
I 5'
D esnaturalizar por calor
y asociar (anneal)
el ce b ad o r nico
51
Inserto
o
o
o
W
0
Puede utilizarse un cebador de secuenciacin universal a fin de

secuenciar muchos DNA de plantilla diferentes
3'
5'
Sntesis d e D N A en presencia
de cuatro d N T P aunados
a un d d N T P * y polim erasa
de D N A term oestable
La secuenciacin del ciclo incluye la amplificacin lineal mediante

un cebador aislado para iniciar la sntesis de DNA
7.1 | SECUENCIACIN Y GENOTIPIFICACIN DE DNA
Los ddNTP se relacionan muy de cerca con los dNTP normajs : slo difieren en que carecen de un grupo hidroxilo en la posicin
te. carbono 39 as como en e l carbono 29 (fig. 7-1). Puede incorpo-use un didesoxinucletido en la cadena de DNA en crecimiento
si formar un enlace fosfodister entre su tomo de carbono 59 y el
:jrbono 39 del nucletido incorporado con anterioridad. Sin emr irgo, como los ddNTP carecen del grupo hidroxilo 39, cualquier
idNTP que se incorpore en una cadena de DNA en crecimiento
zo puede participar en el enlace fosfodister en su tomo de carbo
no 39 y por consiguiente originar la terminacin sbita de la sn
tesis de la cadena.
La cadena de DNA en crecimiento se marca mediante el asegu-miento del marcado de uno de los cuatro dNTP o del cebador con
jji grupo radioistopo o un fluorforo caracterstico. Al establecer
.ma concentracin de ddNTP mucho ms baja que su anlogo
dNTP normal, habr una competencia entre una molcula especfi
ca de ddNTP y un exceso de molculas anlogas de dNTP para in
fusin en la cadena de DNA en crecimiento -si se incluye un
cNTP, la extensin de la cadena contina, pero a veces se incorpo
ra un ddNTP y da lugar a la terminacin de la cadena-. En conse
cuencia cada reaccin es una reaccin parcial porque la terminacin
e la cadena ocurrir de manera aleatoria en una de las posibles elec;iones para un tipo especfico de base en cualquier cadena de DNA.
Puesto que el DNA en una reaccin de secuenciacin de DNA
casi siempre es una poblacin de molculas idnticas, cada una de
las cuatro reacciones especficas de base generar un conjunto de
aginemos de DNA marcados. Los fragmentos de DNA sintetiza
dos en cada una de las cuatro reacciones abarcarn una gama de ta
maos diferentes. Tienen un extremo 59 comn pero extremos 39
.ariables (el extremo 59 se define por el cebador de secuenciacin;
los extremos 39 son variables porque la insercin del ddNTP selec
cionado ocurre en form a aleatoria en una de las mltiples posicio
nes distintas que aceptarn esa base especfica) (vase fig. 7-2).
Los fragmentos que difieren de tamao incluso en un nucleti
do aislado pueden fraccionarse de tamao en un g e l d e p olia crila -
183
m ida desnaturalizante (un gel que contiene una concentracin al

ta de un agente desnaturalizante -como urea 8 M - que asegura que
el DNA que migra permanezca de cadena nica). Con anterioridad
en las reacciones de secuenciacin de DNA se utilizaba el marcado
con radioistopos como 35S o 33P y despus de exponer el gel de se
cuenciacin secado a una placa de rayos X, la secuencia se lea ma
nualmente siguiendo las bandas sucesivas en la autorradiografa.
Los mtodos de secuenciacin de DNA automatizados superaron
este problemtico mtodo.
7.1,2 Secuenciacin automatizada de DNA y

resecuenciacin basada en microarregios
Secuenciacin automatizada de DNA
La secuenciacin automatizada de DNA utiliza el m arcado con
fluorescencia-, el DNA se marca mediante la incorporacin de un
cebador o dNTP que porta un flu or fo ro (un grupo qumico capaz
de fluorescer; vase seccin 6.1.2). El uso de diferentes fluorforos
en las cuatro reacciones especficas de base significa que, a diferen
cia de la secuenciacin convencional de DNA, todas las cuatro
reacciones pueden cargarse en una sola lnea. Durante la electroforesis, un monitor detecta y registra la seal de fluorescencia confor
me el DNA pasa a travs de un punto fijo en el gel (fig. 7-3A). Esto
proporciona un rendimiento en forma de perfiles de intensidad pa
ra cada uno de los diferentes fluorforos de colores al tiempo que
la informacin se guarda electrnicamente (fig. 7-3B). Si se sabe
que la secuencia de DNA es codificante, el producto obtenido pue
de traducirse de inmediato en diferentes marcos de lectura a fin de
deducir una secuencia polipptida.
Aunque muchos secuenciadores automatizados de DNA recurren
a la electroforesis en planchas de gel de acrilamida, en la secuenciacin
de DNA de alta productividad se emplean secuenciadores capilares
en los que las muestras de DNA migran a travs de tubos capilares de
vidrio largos muy delgados que se llenaron con el gel (vase Meldrum,
2000). Es posible lograr un mayor grado de automatizacin si se
evita la necesidad de gel en moldes grandes.
NH,
Nueva secuenciacin mediante hibridacin de microarregios

HC
HC
o -c h 2
mi
Fig. 7-1. Estructura de un didesoxinucletido, 2 ,3' didesoxi CTP (ddCTP).

N ota: el grupo hidroxilo unido al carbn 3 ' en nucletidos normales es
reemplazado por un tomo de hidrgeno (se muestra en el cuadro
sombreado).
Una vez que las secuencias se establecieron, en principio pueden

usarse como secuencias de rtferencia con objeto de ayudar a disear
oligonucletidos para secuenciacin de DNA basada en hibridacin.
Ello comprende la sntesis de oligonucletidos in situ en una super
ficie de vidrio para que acte como una sonda de hibridacin a fin
de estudiar el DNA a secuenciar (vase seccin 6.4.3 para el princi
pio de microarregios de oligonucletidos). La nueva secuenciacin
(resecuenciacin) puede efectuarse mediante la hibridacin de microarreglos en una forma muy automatizada con una productividad
que excede con mucho la de la secuenciacin automatizada del
DNA. Un caso de estudio incluy la resecuenciacin de DNA mitocondrial de 16.5 kb (mtDNA) (Chee y cois., 1966; vase fig. 7-4),
pero la secuenciacin a muy gran escala por hibridacin de microarreglos implica grandes desafos tcnicos.
7.1.3 Genotipificacin bsica de polimorfismos

de sitio de restriccin y nmero variable
de polimorfismos de repeticin tndem
Dos tipos bsicos de polimorfismo son factibles de genotipificarse
por medio de mtodos simples: polimorfismos de sitio de restriccin
184 | CAPTULO SIETE
Plantilla de DNA d e caden a nica
+20
5' -
+1
CGAATGCTCAGGCCATCATC.
IIIIIIIIIIIIII
I5'
Sntesis de !
DNA nuevo !
C ebador
n n u c le tid o s
d e la rg o
r e a c c i n ] ( t e r m in a c p n c jd A T P )
i
AG
AGTAG
3'
G TCCG G TAG TAG
ACGAGTCCG GTAGTAG
c
:
t
:
L o n g itu d d e l
D N A s in te tiz a d o
n
n
5' n
n
+
+
+
+
2
5
13
16
F r a c c io n a m ie n to
s e g n e l ta m a o
n + 20 = G
n + 19 = C
n + 18 = T
n + 17 = T
r e a c c i n ( t e r m in a c o n d d C T P )
n + 16 = A
n + 15 = C
.C G G T A G T A G c
CCGG TAG TAG c
3' .
C G A G T C C G G T A G T A G t:
C TTAC GAG TCCG G TAG TAG c
n
n
5' n
n
+
+
+
+
9
10
15
19
n + 14 = G
n + 13 = A
n + 12 = G
n + 11 = T
r e a c c i n ( t e r m in a c o n d d G T P )
n + 10 = C
.
GTAG c
GTAGTAG c
3'
,
GGTAGTAG c
. G TCCG G TAG TAG c
,
GAGTCCGGTAGTAG=
G C TTAC GAG TCCG G TAG TAG c
n
n
n
5' n
+1
+ 4
+ 7
+ 8
n + 12
n + 14
r? + 20
[T i r e a c c i n ( t e r m in a c o n d d T T P
.
TAG l
.
TAG TAG :
3'
.
T CCGG TAG TAG :
.T A C G A G T C C G G T A G T A G c
TTAC G AG TCCG G TAG TAG :
n
n
5' n
n
n
+ 3
+ 6
+ 11
+ 17
+18
n +
9 = C
n +
8= G
n+
7 = G
n+
6 = T
n +
5 = A
n +
4 = G
n+
3 = T
n+
2 = A
n +
1 = G
Fig. 7-2. La secuenciacin de dldesoxi DNA se basa en la incorporacin aleatoria de termlnadores de cadena especficos de base durante la snte
sis de DNA in vitro.
El cebador de secuenciacin se enlaza de manera especfica a una regin 3 ' de la secuencia deseada de DNA y ceba la sntesis de una cadena de DNA
complementaria en la direccin indicada. Se llevan a cabo cuatro reacciones especficas de base paralelas, cada una de ellas con los cuatro dNTP y con
un ddNTR La competencia para la incorporacin en la cadena de DNA en crecimiento entre un ddNTP y su anlogo dNTP normal produce una poblacin
de fragmentos de diferentes longitudes. Los fragmentos tendrn un extremo 5 ' comn (definido por el cebador de secuenciacin) pero extremos 3 ' varia
bles segn se haya insertado un didesoxinucletido (que se muestra con un crculo lleno arriba). Por ejemplo, en la cadena de reaccin especfica A la ex
tensin ocurre hasta que se incorpora un nucletido ddA (se muestra como A con un crculo rojo lleno arriba). Esto dar lugar a una poblacin de
fragmentos de DNA de longitudes n + 2, n + 5, n + 13, n + 16 nucletidos, etc., cuyo fraccionamiento de tamao, como se muestra a la derecha, pro
ducir la secuencia siguiente de n = 1 a n + 20, GATGATGGCCTGAGCATTCG, que es el complemento inverso de la secuencia que se muestra en la par
te superior izquierda.
7.1 i SECUENCIACIN Y GENOTIPIFICACIN DE DNA
185
Computadora
Salida
L ser
D e te c to r
B)
450
460
470
480
490
500
510
520
ATTCACACTTG AGTAACTCG CTATCCATTTCTTCCAATG TCTCTTCAG CCATCATGTCTTCTATCTCTG TG TCGG A
Fig. 7-3. Secuenciacin automatizada de DNA con cebadores fluorescentes.

A) Principios de la secuenciacin automatizada de DNA. Los cuatro productos de reaccin se cargan en hileras nicas de gel de electroforesis o en
capilares de gel nicos. Se utilizan cuatro colorantes fluorescentes separados como marcadores para las reacciones especficas de base (el marcador
puede incorporarse mediante su fijacin a un ddNTP especfico de base o su unin al cebador y teniendo cuatro grupos de cebadores que correspon
den a las cuatro reacciones). Durante la electroforesis se enfoca un haz lser en una posicin especfica constante en el gel. Conforme los fragmentos
de DNA individuales migran despus de esta posicin, el lser causa la fluorescencia de los colorantes. La fluorescencia mxima ocurre a diferentes lon
gitudes de onda para los cuatro colorantes, la inform acin se registra por medios electrnicos y la secuencia interpretada se almacena en una base de
datos de computadora. B) Ejemplo de produccin total de secuencia de DNA. Se muestra una produccin tpica de datos de secuencia como una su
cesin de perfiles de intensidad especficos de colorante (y por tanto especficos de base). El ejemplo que se ilustra muestra una secuencia de cDNA
:e l gen polihometico humano recin identificado PHC3 (Tonkin y cois., 2002). Datos proporcionados por la doctora Emma Tonkin, Institute of Human
Genetics, University of Newcastle upon Tyne, UK.
>N'P) y polimorfismos de nmero variable de repeticin tndem

~.'NTR). En el recuadro 7-2 se describen varios polimorfismos de
rivados.
Genotipificacin de polimorfismos de sitio de restriccin (SNP)

En el estudio de la susceptibilidad a enfermedades frecuentes a me
nudo se emplean polimorfismos de nucletidos nicos (SNP) co
mo marcadores y para detectarlos se dise una variedad de
mtodos automatizados de genotipificacin de alto rendim iento (va
se recuadro 18-2). Un subgrupo de SNP origina una prdida o una
ganancia de un sitio de restriccin (polimorfismos de sitio de res
triccin o SNP) y con frecuencia se tipifican a pequea escala por
mtodos de genotipificacin simples.
En el pasado los SNP se tipificaran mediante hibridacin Southem con una sonda cercana para detectar el fragmento de restriccin
iterado y cuando este tipo de valoracin se usaba los SNP se descrir :an como polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin
(RFLP; vase fig. 7-5A para el principio general). Sin embargo, en la

actualidad es ms sencillo emplear un mtodo basado en PCR para
tipificar un SNP: se disean cebadores a partir de secuencias que
flanquean el sitio de restriccin polimrfico y el producto amplifica
do se corta con la enzima de restriccin apropiada y se fracciona de
tamao mediante electroforesis de gel de agarosa (fig. 7-6).
Genotipificacin de polimorfismos de nmero variable de

repeticin tndem (VNTR)
El polimorfismo microsatlite es un tipo de VNTR en el que el tama
o del arreglo y el de las repeticiones tndem son cortos (vase recuadro
7-2 para nombres alternativos) y por tanto resulta conveniente llevar a
cabo la tipificacin mediante PCR. Los cebadores se disean a partir de
secuencias que se sabe que flanquean un locus microsatlite especfico,
lo que permite la amplificacin mediante PCR de alelos cuyos tamaos
varan por unidades integrales repetidas (fig. 7-7). A continuacin los
productos de la PCR pueden fraccionarse de tamao mediante
186
CAPTULO SIETE } ANLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIN Y EXPRESIN GNICAS
C)
A)
3 46 0 g > a
-O H
13 708
W B jg assafr*
1 cm
3 460
4 2 1 6 - t t - ( 16 569 pb j
B S J
11778
100 jim
B)
4 2 1 6 t^ c
i *
** I
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m . *
v *s t
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i.." . .,. *
l>
13 7 0 8 ^ > a
...
w"
. . }**
11 778
*
. V*
1 mm
Fig. 7-4. Nueva secuenciacin (resecuenciacin) del genoma mitocondrial mediante hibridacin de microarreglo chip-oligonucletido nico.
A) Imagen del arreglo hibridado a 16.6 kb del RNA blanco mitocondrial (hilera L) aunado a un mapa del genoma de mtDNA. B) Una porcin del patrn de
hibridacin amplificado. C) Capacidad del arreglo para detectar y leer diferencias de base nica en una muestra de 16.6 kb. Dos secuencias blanco dife
rentes se hibridaron en paralelo a distintos chips. Los patrones de hibridacin se compararon para las cuatro posiciones diferentes en la secuencia. El gru
po superior de cada par muestra la hibridacin de una secuencia de referencia y el inferior indica el patrn generado por una muestra tomada de un paciente
con neuropata ptica hereditaria de Leber. Se detectaron con claridad tres mutaciones patgenas conocidas en los nucletidos 3 460, 4 216 y 13 708.
Para comparacin, el cuarto grupo del conjunto muestra una regin alrededor de la posicin 11 778 que es idntica en las dos muestras. Reimpreso con
autorizacin de Chee y cois. (1996). Science 274, 610-614, American Association for the Advancement of Science.
electrofbresis en gel de poliacrilamida. En condiciones normales la

PCR incluye un precursor nucletido radiactivo o fluorescente que se
incorpora en los productos de la PCR pequeos y facilita su detec
cin. Los productos de la PCR se desnaturalizan antes de la electroforesis para asegurar el fraccionamiento de alelos de tamao adecuado.
La figura 7-8 muestra un ejemplo del uso de un microsatlite (CA)n
Los polimorfismos de VNTR minisatlite suelen tipificarse me
diante hibridacin Southern. El DNA se digiere con una(s) enzima(s) de restriccin que se sabe que corta(n) en sitios de flanqueo
cercanos a la secuencia VNTR importante. Esto produce un frag
mento de restriccin que contiene el VNTR aunado a la secuencia
nica de DNA vecino. Una sonda obtenida de la ltima secuencia
puede detectar la variacin de longitud como un polimorfismo de

longitud de fragmento de restriccin (RFLP) (vase fig. 7-5B).
7.2
Id en tificacin de genes en DNA

clonado y e s tab lecim ien to
de su estru ctu ra
La identificacin de genes en DNA clonado se basa en la valoracin

de las propiedades especficas del gen. Dos caractersticas principa
les permiten distinguir el DNA de los genes del DNA que no tie
nen una funcin de codificacin: d) conservacin evolutiva total alta
7.2 ! IDENTIFICACIN DE GENES EN DNA CLONADO Y ESTABLECIMIENTO DE SU ESTRUCTURA
187
Recuadro 7-2. C lases com unes de polimorfismo de DNA susceptibles a m todos simples de genotipificacin
Como se detalla en el captulo 11, una variacin del DNA puede ocurrir a
diferentes niveles. En ocasiones se observan grandes cambios, como
duplicaciones, inserciones, deleciones y transposiciones de kilobases, y
aun extensiones de DNA de tamao megabase, algunas de las cuales se
relacionan con enfermedades. Sin embargo, los cambios ms frecuentes
en la secuencia de DNA incluyen sustituciones, inserciones y deleciones
de nucletidos nicos. No suelen relacionarse con una enfermedad a me
nos que alteren una secuencia de codificacin o una secuencia regula
dora importante. Una variacin del DNA se describe com o p o lim o rfism o
si es lo bastante frecuente en una poblacin para que pueda explicarse
por una mutacin recurrente (vase seccin 11.1). Los polim orfism os
que pueden genotipificarse de manera simple corresponden a dos clases
bsicas:
SNP (polimorfismos de nucletido nico). Un SNP es un polim or
fism o que se origina por el cambio de un nucletido aislado. Suele va
lorarse mediante secuenciacin del DNA (secciones 7.1.1; 7.1.2) o
valoraciones de extensin del cebador (recuadro 18-2);
polimorfismo VNTR (nmero variable de repeticiones tndem). Un
polim orfism o que surge por inestabilidad en un arreglo de repeticio
nes tndem que causa un cambio en el nmero de unidades de repe
ticin. Aunque es un trmino general que incluye polim orfism o de
VNTR microsatlite y VNTR minisatlites (vase ms adelante), a me
nudo se utiliza con laxitud para indicar la clase minisatlite.
e b) expresin para dar transcritos de RNA. En la inmensa mayora

de los casos los transcritos de RNA se someten a empalme (splicing,
corte y unin) y se traducen para dar polipptidos (y en consecuen
cia se distinguen por tener m arcos d e lectu ra abiertos [MLA] lar
gos). Adems con frecuencia los genes de vertebrados se relacionan
con islotes CpG (vase recuadro 9-3). Estas caractersticas posibili
taron el desarrollo de una variedad de mtodos para identificar ge
nes DNA de vertebrados clonados (Monaco, 1994).
Mtodos de rutina para identificar genes

Una vez que se dispuso de clonas de DNA genmico, los genes se de
finieron mediante mtodos simples como primer recurso. A fin de es
tudiar las pruebas de expresin, los mtodos estndar incluyen
seleccin de genotecas de cDNA (seccin 5.3.5), la realizacin de
PCR-RT (seccin 5.2.1) y sondas de prueba hibridantes contra Nort
hern blots (fig. 6-13). Despus las valoraciones de expresin suelen ex
tenderse a valoraciones de hibridacin in situ contra RNA en cortes
de tejido (fig. 6-15). El mtodo alternativo para buscar la conserva
cin evolutiva sola confiar en la zooblot para identificar secuencias
muy conservadas a travs de una gama de especies (vase fig. 7-9). En
fecha ms reciente, la bsqueda de homologa de bases de datos de se
cuencia se constituy en un medio importante para identificar genes:
si una secuencia de prueba se relaciona de manera cercana con alguna
otra secuencia de codificacin hay una buena posibilidad de que tam
bin sea una secuencia codificante (vase recuadro 7-3).
Adems de los mtodos de rutina para identificar genes, se uti
lizan dos procedimientos ms especializados: atrapamiento de exn
mediante valoracin artificial de empalme (splicing) de RNA y se
leccin del cDNA.
Algunas subclases derivadas de las clases anteriores de polimorfismos son:

SNP (polimorfismo del sitio de restriccin). Un SNP es un subgrupo de SNP en el que el cambio en el nucletido causa prdida o ga
nancia de un sitio de restriccin. Se tipifica mediante PCR o, de
manera alternativa, hibridacin Southern, en cuyo caso el polim orfis
mo tambin puede describirse como un RFLP (vase abajo);
RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento de restriccin). Un
polim orfism o que produce un cambio en la longitud de un fragmento
de restriccin y se tipifica mediante hibridacin Southern. Puede pre
sentarse en dos formas:
como resultado de un SNP (vase antes);
como resultado de variacin de la longitud de un fragmento de res
triccin que contiene un arreglo VNTR moderadamente largo de
repeticiones tndem. Los sitios de restriccin de flanqueo no
cambian, pero la longitud entre ellos puede aumentar o dism inuir
segn el nmero de unidades repetidas.
VNTR microsatlite [tambin llamado polimorfismo de repeticin
tndem corto (PRTC) o polimorfismo de repeticin de secuencia
simple (PRSS)]. Un tipo de VNTR en el que son pequeos tanto el
arreglo (por lo general de 100 pb) como la unidad repetida, casi siem
pre de 1 a 4 nucletidos de largo; vase tambin la seccin 9.4.3;
VNTR minisatlite (a menudo se abrevia de manera confusa como
VNTR). En este caso el tamao del arreglo es ms o menos largo y
con frecuencia la unidad repetida tiene 9 a 65 pb de longitud; vase
tambin seccin 9.4.2.
7.2.1 El atrapamiento de exn identifica secuencias

expresadas mediante una valoracin artificial
de empalme (splicing) de RNA
El empalme (corte y unin) de RNA comprende la fusin de secuen
cias exnicas a nivel del RNA y la excisin de secuencias intrnicas.
Los espliceosomas son capaces de realizarlo in vivo mediante el reco
nocimiento de ciertas secuencias en los lmites exn-intrn: una se
cuencia donadora d e em palm e en la unin entre un exn y su intrn
corriente abajo (3 ), y una secuencia aceptora d e em palm e en la unin
entre un exn y su intrn corriente arriba (5') (vase fig. 1-15). Un
csmide u otra clona de DNA genmico apropiada que contiene un
exn interno flanqueado por secuencias intrnicas contendr en con
secuencia el donador de empalme funcional y secuencias aceptoras.
Es posible identificar exones en DNA genmico clonado me
diante la subclonacin de DNA en un vector de expresin apropia
do y su transfeccin a una lnea de clulas eucariotas apropiada en
la que el DNA insertado se transcribe en RNA y el RNA transcri
to se somete a empalme (corte y unin) de RNA. Estas tcnicas se
conocen como atrapamiento de exn (a menudo se denominan am
plificacin de exn si se utiliza una PCR para recuperar los exones y
una copia de cDNA del RNA cortado y unido [empalmado]). Por
ejemplo, en el mtodo de Church y colaboradores (1994) el DNA se
subclona en un vector de expresin plsmide pSPL3 (fig. 7-10A) que
contiene un minign artificial que puede expresarse en una clula
husped apropiada. El minign consiste en: un segmento del genoma del virus simiano 40 (SV40) que comprende un origen de replicacin aunado a una secuencia promotora potente; dos exones
competentes de empalme separados por un intrn que contiene un
sitio de clonacin mltiple, y un sitio de poliadenilacin SV40.
188
CAPTULO SIETE
SV40 produce un transcrito de RNA que por lo general se empal

ma para incluir los dos exones del minign. Sin embargo, si el
DNA clonado dentro del intrn intermedio contiene un exn fun
cional, los exones extraos pueden empalmarse a los exones que se
encuentran en el minign del vector. Despus de elaborar una co
pia de cDNA por medio de transcriptasa inversa, las PCR que uti
lizan cebadores especficos para secuencias del exn vector deben
distinguir entre el empalme normal y el empalme que incluye exo
nes en el inserto de DNA (vase fig. 7-10B).
A)
A le lo s
7.2.2 La seleccin de cDNA identifica secuencias

expresadas en clonas genmicas mediante
la formacin de heterodplex
V a lo ra c i n
a ) d ig e rir c o n n u c le a s a d e re s tric c i n R
b ) fra c c io n a r d e ta m a o e n g e l
c ) h ib rid a r c o n s o n d a m a rc a d a
A le lo s
(x + y) o x , y
G e n o tip o s
x + y
mmmm X + y
y
x
a, a
a, b
b, b
B)
Los alelos
v aran en los
n m e ro s de rep eticione s
t nde m
A le lo s
(c o m o e n A a rrib a )
T a m a os d e a le lo : x + y + (n x re p eticione s) en la q u e n es v a ria ble
Fig. 7-5. Tipificacin de un RFLP mediante una valoracin basada en

hibridacin.
A) Tipificacin de un RFLP tipo PCR. ste es el tipo usual de RFLP y se
debe a una alteracin menor de la secuencia de DNA que causa prdida (o
ganancia) del sitio de restriccin. Este tipo de polimorfismo es ms fcil
de tipificar mediante una valoracin de PCR; vase figura 7-6. B) Tipifica
cin de un RFLP tipo VNTR Slo se utiliza una valoracin de hibridacin
si la expansin y la contraccin de la VNTR incluyen cambios de longitud
importantes. De otra manera se emplea una valoracin tipo PCR.
El DNA recombinante se transfecta en clulas COS que, como

se explica en la seccin 5.6.3, permiten que cualquier DNA circu
lar que contiene un origen de replicacin SV40 se replique de mo
do independiente del DNA celular. La transcripcin del promotor
El mtodo de seleccin de cDNA implica hibridar un DNA com

plejo clonado, como el inserto de un YAC, a una mezcla compleja
de cDNA, como los insertos de todas las clonas de cDNA en una
genoteca de cDNA (Lovett, 1994). El principio que sustenta la tc
nica es que los cDNA afines (cognate) correspondientes a los genes
que se encuentran dentro del YAC se enlazarn de preferencia con
el DNA del cromosoma artificial de levadura (YAC); varias rondas
de hibridacin deben conducir al enriquecimiento enorme de las
secuencias deseadas de cDNA, lo que permite identificar los genes
correspondientes. Se requiere un bloqueo considerable de secuen
cias de DNA repetidas.
Los primeros mtodos que se usaron inmovilizaban los YAC, pe
ro las tcnicas ms modernas emplean una reaccin de hibridacin
en solucin y mtodos de captura de biotina-estreptavidina (vase
fig. 7-11). Como todos los sistemas que se basan en expresin, el
mtodo depende de niveles apropiados de expresin gnica (los cD
NA afines [cognate] no deben ser muy raros en la poblacin de ini
cio). Adems es posible que se pasen por alto genes que contienen
exones muy cortos porque los heterodplex que se formaron con
cDNA afines tal vez no posean la estabilidad suficiente. Otro pro
blema es que los cDNA pueden enlazarse a seudogenes que mues
tran un grado alto de homologa con los genes funcionales afines.
7.2.3 Obtencin de secuencias de cDNA de longitud

completa: grupos de clonas superpuestas
y amplificacin PCR-RACE
Una prioridad inicial en la definicin de la estructura gnica con
siste en obtener una secuencia de cDNA de longitud completa y de
finir los sitios de inicio y terminacin de la traduccin y el (los)
sito(s) de poliadenilacin.
Definicin de grupos de clonas superpuestas

Un mtodo inicial para obtener una secuencia de cDNA de longi
tud total consisti en seleccionar una variedad de diferentes genotecas de cDNA y a continuacin mapear la extensin de las
superposiciones de los insertos de clonas positivas (por secuencia
cin o por mapeo basado en PCR/hibridacin). Como resultado
se estableci una serie de clonas de cDNA superpuestas, un conti
guo de clona de cDNA (para un ejemplo, vase el contiguo para
el cDNA de fibrosis qustica en Riordan y cois., 1989). La secuen
ciacin completa o seleccionada de una clona definir una secuen
cia consenso que puede proporcionar una secuencia de cDNA de
longitud completa.
7.2 j IDENTIFICACION DE GENES EN DNA CLONADO Y ESTABLECIMIENTO DE SU ESTRUCTUR \
189
R
A lelo 1
..ninnai
8
I
A lelo 2
i *
' X
um iliai
(1) A m p lific a r
(2) C o rta r el p ro d u c to d e la P C R co n e n z im a d e res tricci n R
I
(3) F ra c c io n a r d e ta m a o m e d ia n te ele c tro fo re s is en gel
I
----------- a + b
. ........ . . K
A le lo s
1 ,1
2 ,2
1 ,2
C lave:
S itio d e la
n u c le a s a
d e res tricci n
Fig. 7-6. Los polimorfismos de sitio de restriccin pueden tipificarse fcilmente mediante PCR como una alternativa a las valoraciones de RFLP laboriosas.
Los alelos 1 y 2 se distinguen por un polim orfism o que altera la secuencia de nucletidos de un sitio de restriccin especfico para la nucleasa de restric
cin R. El alelo 1 posee el sitio, pero el alelo 2 tiene un nucletido(s) alterado X, X ' y en consecuencia carece de l. Pueden disearse cebadores de PCR
a partir de secuencias que flanquean el sitio de restriccin para elaborar un producto corto. La digestin del producto de la PCR con enzima R y el frac
cionamiento de tamao pueden conducir a la tipificacin simple para los dos alelos.
PCR-RACE para extender cDNA de cadena corta

Aunque la PCR-RT puede ayudar a definir transcritos, una varian
te de la PCR-RT, la tcnica RACE (amplificacin rpida de extre
mos de cDNA), tiene eficacia particular para extender secuencias
cortas de cDNA a fin de lograr un cDNA de longitud completa
(Forman y cois., 1988). La PCR-RACE es una modificacin de la
PCR de anclaje de la reaccin en cadena de la polimerasa de transcriptasa inversa (RT-PCR). Su justificacin es amplificar secuencias
entre una regin aislada caracterizada con anterioridad en el mRNA (cDNA) y una secu en cia d e an cla je acoplada a los extremos 5'
o 3'. Se disea un cebador (a partir de la secuencia interna conoci
da) y el segundo cebador se elige de la secuencia de anclaje impor
tante (vase fig. 7-2).
7.2.4 Mapeo de sitios de inicio de transcripcin

y definicin de lmites exn-intrn
Con frecuencia se localizan secuencias reguladoras importantes cer
ca de los sitios de inicio de transcripcin. Aunque es posible que la
PCR-RACE 5' permita rescatar secuencias correspondientes al ex
tremo 5' de un mRNA (y por consiguiente, el sitio de inicio de la

transcripcin), se utilizan de preferencia dos mtodos principales
para definir el sitio de inicio transcripcional: proteccin de nuclea
sa S 1 y extensin del cebador. La estructura exn-intrn puede de
terminarse mediante la referencia de la secuencia de cDNA contra
las secuencias de clonas de DNA genmicas afines (cognate). Des
pus puede intentarse terminar la caracterizacin del gen a nivel genmico mediante la secuenciacin de regiones promotoras,
secuencias de flanqueo 5' y 3', y secuencias de intrn.
Proteccin de nucleasa S1
La endonudeasa SI es una enzima obtenida del moho Aspergillus
oryzae que corta RNA y DNA de cadena nica pero no molculas
de cadena doble. Para mapear el sitio de inicio de transcripcin de
un gen se requiere una clona de DNA genmico que se piensa que
contiene el sitio de inicio. A continuacin la clona de DNA se di
giere con una endonudeasa de restriccin apropiada para generar
un fragmento que se espera que contenga el sitio de inicio de trans
cripcin. Como se muestra en la figura 7-13A, la hibridacin al
mRNA afn y la digestin con nucleasa S 1 definen la distancia del
190
Usar cebadores de PCR P1, P2 para am plificar alelos en muestras de DNA genmico
40 bp
.................... ..
A lelo 1 = (C A )16
P2
CA] CAICA CA CA CA C ACA CA CA CA CA CA CA CA CA

GTIGTIGT GT GTlGT GT GT g t Ig t i g t I g t g t . g t GTlGT
P1
40 pb
P ro d u c to d e la P C R = 8 0 + 3 2 = 1 1 2 pb
P2
M ----------
A elo 2 = (C A )i
CA CA CA CA CA CA U A U A (JA UA CAjCA CA CA
GT GT GT GT GT GT ftT ftT P J P,T GTGT GT GT
P1
-------
P ro d u c to d e la P C R = 8 0 + 2 8 = 1 0 8 p b
A lelo 3 = (C A )n
P2
P1
P ro d u c to d e la P C R = 8 0 + 2 2 = 1 0 2 p b
(2 ) Desnaturalizar productos de la PCR y fraccionar de tam ao mediante electrofosis en gel de poliacrilamida
@ A u to rra d io g ra f a
Fig. 7-7. Se utiliza PCR para tipificar polimorfismos de repeticin tndem cortos (PRTC).
El ejemplo ilustra la tipificacin de un marcador microsatlite, en este caso un polim orfism o de repeticin de dinucletido (CA)/(TG) que tiene tres alelos
como resultado de una variacin en el nmero de las repeticiones (CA)/(TG). En la autorradiografa cada alelo est representado por una banda superior
mayor y dos bandas sombreadas menores (vase fig. 7-8). Los individuos A y B tienen los genotipos (entre parntesis) siguientes: A(1,3); B(2,2).
sitio de inicio de la transcripcin a partir del extremo no marcado

del fragmento de restriccin. Cuando se requiere una localizacin
ms precisa puede secuenciarse el fragmento de DNA marcado en
el heterodplex mediante un mtodo qumico de secuenciacin de
DNA (vase Maxam y Gilbert, 1980). Cabe sealar que, en gran
parte en la misma forma, tambin puede utilizarse el mapeo con
nucleasa SI con objeto de mapear otros lmites entre DNA codifi
cante y no codificante, como los lmites de exn-intrn (vase ms
adelante) y el extremo 3' de un transcrito.
mentos del cDNA y utilizarse en secu en ciacin cclica d e l DNA

con clonas genmicas desnaturalizadas conforme la secuenciacin
de DNA forma plantillas (vase recuadro 7-1). La secuencia obte
nida debe cruzar un lmite exn-intrn, a menos que el exn sea
muy grande, en cuyo caso quiz se requieran cebadores de secuen
ciacin adicionales. Por supuesto, una vez que se secuenci un ge
noma, lo nico que se requiere es una referencia cruzada de clonas
cDNA contra la secuencia genmica disponible.
Extensin dei cebador
7 .3 Estudio de la expresin gnica
El mtodo es muy similar al de la proteccin de nucleasa SI. En es

te caso el fragmento de restriccin elegido debe ser ms corto que
el mRNA y la saliente se llena mediante transcriptasa inversa (fig.
7-13B). Como con el mapeo con nucleasa SI, es posible localizar
con ms precisin el sitio de inicio de transcripcin si se recurre al
mtodo de secuenciacin qumica de Maxam y Gilber (1980) a fin
de secuenciar la cadena de DNA marcada.
Determinacin de la organizacin exn-intrn

Aunque no todos los genes humanos tienen intrones (vase cuadro
9-5), cuando se encuentran suelen ser grandes en comparacin con
los exones. La presencia de intrones suele inferirse por el mapeo
comparativo de clonas genmicas y de cDNA afines. Una vez que
la secuencia completa del cDNA se establece, es posible disear ce
badores de secuenciacin segn se requiera a partir de varios seg
7.3.1 Principios de la seleccin de expresin

La seleccin de expresin puede realizarse a diferentes niveles y uti
lizarse una diversidad de tecnologas distintas. El blanco lo consti
tuyen transcritos de RNA o protenas. En la expresin protenica
an suelen emplearse anticuerpos muy especficos, pero los trans
critos de RNA pueden seguirse por diferentes tipos de mtodos.
Por lo general incluyen hibridacin molecular con una sonda de
cido nucleico antisentido especfica o cierta variante de la reaccin
PCR-RT. Sin embargo, se disearon algunos mtodos alternativos
ingeniosos como el SAGE (anlisis seriado d e expresin g n ica ),
que rastrea grandes nmeros de transcritos individuales siguiendo
marcadores de secuencia corta representativos (vase seccin
19.3.2), Los parmetros importantes en la expresin gnica son el
origen del material de estudio, la resolucin de expresin y el ren
dimiento (vase fig. 7-14).
7.3 I ESTUDIO DE LA EXPRESIN GENICA
191
Origen del material de estudio
Fig. 7-8. Ejemplo de tipificacin para una repeticin CA.

El ejemplo muestra la tipificacin de miembros de una familia grande con
el marcador (CA)/(TG) D17S800. Las flechas de la izquierda indican la
banda superior (principal) que se observa en diferentes alelos 1-7. Ob
srvese que los alelos individuales presentan una banda superior poten
te seguida de dos bandas sombreadas" inferiores, una de intensidad
intermedia justo subyacente a la banda superior potente y una que es
muy dbil y se localiza inmediatamente abajo de la primera banda som
breada. Para los individuos indicados, los genotipos (entre parntesis)
son los siguientes: 1(3,6); 2(1,5); 3(3,5); 4(2,5); 5(3,6); 6(2,5); 7(3,5);
8(3,6); 9(3,5); 10(5,7); 11(3,3); 12(2,4); 13(3,3); 14(3,6); 15(3,3); 16(3,4).
Obsrvese tambin que en el ltimo caso la banda media es particular
mente intensa porque contiene tanto la banda principal para el alelo 4 co
mo la banda sombreada principal para el alelo 3. Se piensa que el
principal mecanismo que origina la produccin de bandas sombreadas
en repeticiones tndem de dinucletidos es el pareamlento errneo de
cadena deslizada (vase seccin 11.3.1) (Hauge y Litt, 1993).
El material de estudio puede variar mucho. Con frecuencia se pre

paran extractos de RNA/cDNA o protenicos sin refinar, pero en
otros casos la expresin se muestrea en cortes de tejidos o aun en
embriones complejos fijados de una manera que permita conservar
la morfologa original in vivo. La expresin tambin puede estu
diarse en clulas vivas en cultivo de tejido (pero siempre queda la
duda de lo representativas que son en relacin con el mismo tipo
de clulas in vivo). En organismos experimentales vivos en los que
los tejidos son pticamente transparentes, es posible rastrear la ex
presin gnica con ayuda de marcadores fluorescentes.
Los mtodos recientes de microdiseccin con captura lser
comprenden el uso de lser a fin de microdisecar tejidos para pro
ducir poblaciones celulares puras de fuentes como biopsias de teji
dos y tejidos teidos, inclusive clulas aisladas (vase Schutze y
Lahr, 1998; Simone y cois., 1998). Estos adelantos permitirn en
focar una diversidad de anlisis de expresiones gnicas en clulas
aisladas o en poblaciones celulares homogneas que sern ms re
presentativas del estado in vivo de las lneas celulares.
Resolucin de la expresin gnica

Algunos mtodos se disearon slo para rastrear la expresin gruesa de
genes en extractos de RNA o de protenas. Estos patrones de expresin
de resolucin baja suelen intentarse como un mtodo de primer paso.
Adems de ser capaces de muestrear la expresin en diferentes tejidos,
pueden brindar informacin til del tamao del producto y las posi
bles isoformas. En contraste, es posible obtener una expresin de alta
resolucin mediante mtodos que rastrean patrones de expresin den
tro de una clula, o en grupos de clulas y tejidos con una organizacin
espacial representativa de la organizacin normal in vivo.
SHOX2
SHOX
o e <5

njS' COcOO<Df
E S c t S g 'Om>cD
sr'H
CCIrOCL>00
i i
23 kb
23 kb
9.4 kb
9.4 kb
6.6 kb
6.6 kb
4.4 kb
4.4 kb
2.3 kb
2.3 kb
2.0 kb
2.0 kb
Fig. 7-9. La hibridacin zooblot identifica secuencias conservadas en trminos evolutivos.

Algunos genes muestran una conservacin extraordinaria a travs de las especies; en otros es menor, inclusive el que se ilustra aqu. El gen SHOX humano se loca
liza en la regin seudoautosmica m ayor en la punta de Xp/Yp (fig. 12-15). Es un locus para algunos sndromes de estatura baja que se caracterizan por anorma
lidades esquelticas y pueden contribuir de manera importante al sndrome de Turner. Aunque se conserva en una diversidad de mamferos distintos, los roedores
carecen de l (vase panel derecho, lneas a la izquierda) como resultado de la delecin del gen en el pasado evolutivo, quizs en una etapa temprana del linaje que
condujo a roedores. La secuenciacin reciente del genoma de ratn confirm la ausencia de un homlogo de SHOX. El gen SH0X2 autosmico relacionado est
mucho ms conservado (panel izquierdo). Reproducido de Clement-Jones y cois. (2000) Human Molec. Genet. 9 ,696, con autorizacin de Oxford University Press.
192
SIE
Recuadro 7-3. Investigacin de homologa en b ases de datos

Se disearon programas de computadora potentes con objeto de buscar ba
ses de datos de secuencias de cido nucleico y protenas para compatibili
dad de secuencia significativa (homologa de secuencia) con una secuencia
de prueba en investigacin. Los que ms se utilizan son los diferentes pro
gramas BLAST y FASTA (vase Ginsburg, 1994 y el cuadro de abajo).
_________ ________________
Programa
Compara
FASTA
Una secuencia nucletida con una base de datos o una

secuencia de aminocidos con una base de datos de
secuencias protenicas.
TFASTA
Una secuencia de aminocidos con una base de datos

de secuencia de nucletidos traducida en los seis mar
cos de lectura
Una secuencia nucletida con una base de datos de se
cuencia nucletida
Una secuencia nucletida traducida en los seis marcos de
lectura con una base de datos de secuencia protenica
Una secuencia cDNA/EST con bases de datos de se
cuencias cDNA/EST
de secuencia de protenas
de secuencia de nucletidos traducida en los seis mar
cos de lectura
BLASTIN
BLASTX
EST BLAST
BLASTP
TBLASTN
TGGCA G G A G C T
*****
*-k-k**
G AT A TTA TC A C TG G A G C C
***
****
Nota: puesto que el diseo de programas comparables como FASTA y

BLASTN es distinto, pueden brindar resultados diferentes (vase Gins
burg, 1994). Todos los programas anteriores son accesibles a travs de
la Internet de diversos centros, como el US National Center for Biotech
nology Information (http://www.ncbi.nih.gov/) y el European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uK/)
Los programas como BLAST y FASTA utilizan algoritmos para identificar ali
neamientos de secuencia ptimos y por lo general muestran la produccin
total como una serie de comparaciones a manera de pares entre la secuen
cia de prueba (secuencia de interrogacin) y cada secuencia relacionada
que identifica el programa en la base de datos (secuencias tema).
Pueden seguirse diferentes mtodos para calcular las alineaciones de se
cuencia ptimas. Por ejemplo, en alineaciones de secuencia de nucletidos
el algoritmo diseado por Needleman y Wunsch (1970) busca maximizar
el nmero de nucletidos compatibles. En contraste, en otros programas,
com o el de Waterman y cois. (1976), el objetivo es reducir al mnimo el
nmero de incompatibilidades. Las comparaciones de alineamientos de
secuencia a manera de pares son comparativamente simples cuando las
secuencias de estudio son compatibles de manera muy cercana y tienen
longitudes similares, de preferencia idnticas. Cuando las dos secuencias
que se comparan son muy diferentes entre s, y en especial cuando hay
diferencias claras en la longitud a causa de deleciones/inserciones, quiz
se requiera un gran esfuerzo para calcular la alineacin ptima (vanse
los siguientes renglones).
G A T T T T A T G A C T G G A G C C T G A -A G G A G C T
G A TA TTA TC A C TG G A G C C TG G C A G G A G C T
G A T T T T A T G A C T G G A G C C T -G A A G G A G C T
Dificultad en las alineaciones de secuencias. En este caso las secuencias de dos nucletidos se relacionan claramente pero en la secuencia GGC que se
muestra en la parte superior hay incertidumbre en cuanto a la mejor alineacin con la secuencia GA correspondiente en la secuencia inferior.
Si la secuencia que se investiga es de codificacin, entonces pueden aa
dirse alineamientos de secuencias de nucletidos mediante alineamientos
paralelos de secuencias de aminocidos utilizando el marco de lectura de
traduccin supuesto para la secuencia de codificacin. Esto se debe a que
hay 20 aminocidos diferentes pero slo cuatro nucletidos distintos. Las
alineaciones de secuencias de aminocidos a manera de pares tambin
pueden apoyarse en las subclases qumicas de aminocidos. Las sustitu
ciones conservadoras son cambios de nucletidos que ocasionan el cam
bio de un aminocido pero en las que el nuevo aminocido est relacionado
qumicamente con el aminocido sustituido y casi siempre pertenece a la
misma subclase (recuadro 11-3). Como resultado, los algoritmos que se
emplean para comparar secuencias de aminocidos por lo general recurren

a una matriz de calificacin en la que se disponen pares de calificaciones
en una matriz 20 x 20 donde las ms altas concuerdan con aminocidos
idnticos y aquellos que son de carcter similar (p. e j isoleucina y leucina) y las calificaciones ms bajas se asignan a aminocidos que son de un
carcter diferente (p. ej., isoleucina y aspartato; vase Henikoff y Henikoff, 1992). La produccin total tpica proporciona dos resultados totales
por porcentaje de secuencia relacionada, que a menudo se denominan %
de identidad de secuencia (compatibilidad de residuos idnticos slo) y
% de similitud de secuencia (compatibilidad tanto de residuos idnticos
com o de los relacionados qumicamente; vase el grupo abajo).
Calificacin = 58.2 bits (125), esperada = 9e-08

Identidades = 39/120 (32%), positivas = 57/120 (47%), vacios = 9/120
(7%)
Interrogacin : 1
AKLLIKHDSNIGIPDVEGKIPLHWAANHKDPSAVHTNRCILDAAPTESLLNWQDYEGRTP 60
Tema: 548
Interrogacin : 61
A + LL++HD+ +
G PLH A +H +
+ V+
+L +
W Y
TP
AELIEHDAHPNAAGKNGLTPLHVAVHHNN-- LDIVKLLLPRGGSPHSPAWNGY---TP 601
LHFAVADGNLTWDVLTSY-ESCNITSYDNLFRTPLHWAALLGHAQIVHLL1ERNKSGTI 119
LHA
Tema: 602
TPLH AA GH + + V LLL + + G +
LHIAAKQNQIEVARSLLQYGGSANAESVQGV TPLHLAAQEGHTEMVALLLSKQANGNL 659
Identidad de secuencia y similitud de secuencia. La produccin de BLASTP es resultado de la interrogacin de la base de datos de protenas Swiss-prot con una secuen
cia de interrogacin de aminocidos de 165-283 de la proteina inversina recin identificada. La secuencia tema que aqu se muestra es una secuencia de anquirina de eritro
cito de ratn. El programa considera no slo la identidad de secuencia (39 de las 120 posiciones, o 32%, tiene residuos idnticos en las dos secuencias; que se muestran
con letras rojas), sino tambin la similitud de secuencia (indicadas aqu como positivas") en la que 19 posiciones adicionales tienen aminocidos qumicamente similares
(se sealan con + ),
7.3
(1)
A)
x y
ESTUDIO DE LA EXPRESIN GNICA
B)
193
scm
t n
SD
SA
lia
Patrn de em palm e I
SD
SA
llb
Patrn d e em palm e
lia + llb
ID
cDNA
P ro d u c to
d e la P C R
i
I
II
E x n a tra p a d o
1.
2.
3.
4.
5.
F ra g m e n to d e c lo n a d e D N A g e n m ic o en sitio d e c lo n a c i n m ltip le (S C M )
T ra n s fe c ta r a c lu la s C O S
E xp re si n d e l p ro m o to r S V 4 0 - p ro d u c to d e R N A
A islar R N A y u sarlo c o m o p la n tilla p a ra e la b o ra r c D N A
A m p lific a r en P C R c o n c e b a d o re s e s p e c fic o s p a ra e x o n e s en el v e c to r
Fig. 7-10. Atrapamiento de exn mediante el vector pSPL3.

A) Vector plsm ide pSPL3. Este vector en lanzadera puede propagarse en coli (por medio del origen de replicacin or y la seleccin para resistencia
a ampicilina) y en clulas COS de mono (mediante el origen de replicacin funcional SV40) (Church y cois., 1994). El vector pSPL3 contiene un minign
(en negro): la transcripcin ocurre del promotor SV40 y el RNA experimenta empalme controlado por la maquinaria de empalme de RNA de la clula hus
ped, lo que resulta en la fusin de las dos secuencias de exn del vector. B) Patrones de em palm e (co rte y unin). El patrn normal de empalme que se
observa cuando se presentan exones del vector est indicado por el patrn de empalme I. Si un fragmento de DNA genmico clonado en un pSPL3 con
tiene un exn con un donador de empalme funcional (DE) y secuencias aceptares de empalme (AE), puede ocurrir un patrn de empalme diferente (lia +
llb). Los dos patrones de empalme (corte y unin) pueden distinguirse a nivel del cDNA utilizando varios cebadores de PCR especficos de vector, y el
fraccionamiento del tamao en geles suele conducir a la recuperacin del exn amplificado del DNA genmico.
Rendimiento de la expresin gnica
Hibridacin Northern blot
Algunos mtodos estn diseados para obtener datos de expresin

de slo uno o un nmero muy pequeo de genes a la vez (expre
sin de rendim iento baj). Otros pueden rastrear al mismo tiempo
la expresin de muchos genes al mismo tiempo y en algunos casos
en los que un proyecto de genoma identific todos los genes de un
organismo suele ser posible conducir la seleccin d e expresin d el
genom a com pleto (vase seccin 19.3).
Este mtodo proporciona patrones de expresin de resolucin bajos

mediante la hibridacin de un gen o una sonda de cDNA a RNA to
tal o extractos de RNA total o RNA poli(A)+preparados de diferen
tes tejidos o lneas celulares. Como el RNA se fracciona de tamao
en un gel, es posible estimar el tamao de los transcritos. La presen
cia de mltiples bandas de hibridacin en una lnea puede indicar la
existencia de isoformas de diferente tamao (vase fig. 6-13).
7.3.2 Anlisis de expresin gnica basado en

hibridacin: del anlisis de un gen aislado a
la seleccin de la expresin del genoma completo
La seleccin tradicional de la expresin basada en hibridacin ha
tenido un rendimiento bajo, enfocada al anlisis de transcritos de
RNA de uno o slo unos cuantos genes a la vez, pero la resolucin
puede variar de baja a alta. Sin embargo, en fecha reciente los an
lisis de expresin gnica basados en microarreglos anunciaron un
nuevo tipo de rendimiento muy alto de anlisis de la expresin de
resolucin baja que permite el muestreo simultneo de transcritos
de RNA de miles de genes a la vez.
Hibridacin in situ de tejidos

Por lo general se obtienen patrones de expresin espacial de alta resolu
cin de RNA en tejidos y grupos de clulas mediante hibridacin in
situ de tejidos. Los tejidos suelen congelarse o embeberse en cera y lue
go se seccionan con un micrtomo para obtener cortes muy delgados
(p. ej., 5 micrones de grosor) que se montan en un portaobjetos para
microscopio. La hibridacin de una sonda apropiada especfica de gen
al tejido en el portaobjetos puede brindar luego imgenes de la expre
sin detalladas representativas de la distribucin del RNA en el tejido
de origen (vase fig. 6-15). A menudo los tejidos utilizados incluyen los
embrionarios que poseen la ventaja de que su tamao en miniatura per
mite seleccionar la expresin de muchos tejidos en un mismo corte.
194
CAPTULO SIETE
N u m e ro sa s c lo n a s d e DNA
en g e n o te c a s de cD N A
C lo n a de D N A g e n m ic o
(YAC, c s m id e , etc.)
wwwwvw^HI
/wwwwvwvw-HSSI
D ig e rir c o n c o rta d o re s d e 4 pb
Lig a r e n la za d o re s ( S i )
V e c to r
BVlMMMMMMM
H gÂ M M A M A M A A
In s e rta r
-^WO
vW vAAAAAMM
/V W W W W W i
PCR mediante
cebadores especficos de (())
enlazador marcados con biotina
V e cto r
| Insertos de PCR con

L cebadores especficos de vector
/wwwwwvwfi
>=>-
g-vA/WVMMAMM
HHHHHHHHhAAAAAAAA/v
fW
tM
AAAAA/
# - 4 -
I 2
} 3 e tc te ra
H ib rid a r d e s p u s de b lo q uje
e a rr '^ / r ereppee tic io n e s
N u evo c ic lo
N r is /
r
/~ T \
C u en tas p a ram a g n tica s

cu b iertas con e strap tivid in a
Im n
*
*
Captura de todos los

fragmentos marcados con biotina
C a p tu ra de c u e n ta s
co n im n
E lusin y a m p lific a c i n c o n PCR
m e d ia n te c e b a d o re s e s p e c fic o s
de v e c to r cD N A
Fig. 7-11. Seleccin de cDNA mediante captura de cuentas magnticas.

El mtodo se basa en la formacin de heterodplex entre cadenas nicas de una clona de DNA genmico nica (con el nmero 1) y una poblacin de cD
NA compleja, como los insertos de una genoteca de cDNA (numerados 1 ,2 ,3 , etc.). Las cadenas de DNA genmico se marcan con un grupo biotina (uni
do a cebadores de PCR que se incorporan durante la amplificacin). La reaccin de hibridacin favorecer la formacin de heterodplex que incluyen las
clonas de cDNA afnes con la clona de DNA genmico. En este ejemplo se consideran afines la clona 1 de DNA genmico y la clona 1 de cDNA, es decir,
contienen secuencias comunes que permiten que cadenas en sentido opuesto se enlacen entre s para form ar un heterodplex. Los productos de la hibri
dacin con un grupo biotina (inclusive heterodplex DNA genmico-cDNA) se enlazarn a cuentas paramagnticas recubiertas con estraptavidina y pue
den eliminarse de otros componentes de la reaccin mediante un imn. A continuacin las cuentas separadas pueden tratarse a fin de eludir las molculas
que contienen biotina y, por medio de cebadores de PCR especficos para las secuencias vectores que flanquean el cDNA, es posible amplificar el cDNA
enlazado. Esta poblacin se enva para ciclos de hibridacin adicionales con objeto de enriquecer el cDNA deseado.
7.3 j ESTUDIO DE LA EXPRESIN GENICA
5 ' P C R -R A C E
3 ' P C R -R A C E
A A A A A A A -------- A
3'
- A A A A A A A -------- A
5'
3'
3'
5'
3' < -
5'
195
R T con
ce b ad o r d e an claje
-------------------A A A A A A A ----------K
5' -
3'
5' -
3' A A A A A A A -
3'
5'
D esnaturalizar; asociar
ce b ad o r d e an claje y exten d er
ce b ad o r d e anclaje
^ ----------------- A A A A A [] 3'
3%
T ran sfera sa term inal

y dA TP
------------------------ A A A A A A A ----------A
___ 5 '
5 I
3'
5'
^ ----------------- A A A A A 3 3 '
-A A A A A A A -------- A
3 '-
cebad or interno d e sentido
3'
R T con cebad or
Interno antisentido
3' AAAAAAA
: ____ ]5 '
P C R con cebad ores

interno y d e anclaje
| -------------------A A A A A f ^ ^ l 3'
AAAAAAA-
--------------------T T T T T B3USS3 5 '
AAAAA
ce b ad o r prim ario y ex tender
TTTTT
P C R con cebad ores
interno y d e an claje
AAAAA
TTTTT
3'
5'
Fig. 7-12. La PCR-RACE puede facilitar el aislamiento de secuencias de los extremos 5' y 3' del cDNA.
Una etapa preliminar en la PCR-RACE incluye la introduccin de una secuencia mediante una form a de mutagenesis aadida 5 ' (vase seccin 5.5.3).
A) 3 PCR-RACE. Se utiliza un cebador de inicio antisentido con una secuencia de extensin 5 especfica (secuencia de anclaje, con frecuencia > 15 nucletidos de largo) que se incorpora al transcrito cDNA en el paso de transcriptasa inversa. Luego se emplea un cebador interno en sentido para generar
una segunda cadena corta que termina en una secuencia complementaria a la secuencia de anclaje original. Despus se inicia la PCR usando el cebador
interno en sentido y un cebador de secuencia de anclaje. B) 5 PCR-RACE. En este caso se emplea un cebador interno antisentido para cebar la sntesis
de una plantilla de mRNA (rojo) de una primera cadena parcial de cDNA (negro). Se aade una poli(dA) al extremo 3 ' del cDNA usando transferasa term i
nal. La sntesis de la segunda cadena se ceba con un cebador en sentido con una secuencia de extensin especfica (andador). Esta cadena se emplea
como plantilla para un paso adicional de sntesis con el cebador interno para producir una copia complementaria de la secuencia de anclaje. A continua
cin puede efectuarse la PCR con cebadores de secuencia interna y de anclaje.
196
CAPITULO SIETE : ANLISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIN Y EXPRESIN GNICAS
A)
5'
B)
7 -32P ( )
5'
y -32P ( )
C in a s a d e p o lin u c le tid o
3'
3 ' ----------
5'
C in a s a d e p o lin u c le tid o
*--------M e z c la r con
R N A to tal
3' -
-------- * 5
5 '-
3'
AAAAA 3'
N u c le a s a S1
3 '5 '-
RT +
dNTP
3'
5'E le ctro fo res is
d e s n a tu ra liz a n te ;
a u to rra d io g ra fa
M e z c la r con
R N A to tal
----------- 5 '
A A A A A 3'
5'
-A A A A A 3 '
E le ctro fo res is
d e s n a tu ra liza n te ;
a u to rra d io g ra fa
Fig. 7-13. El sitio de inicio de la transcripcin puede mapearse mediante proteccin de nucleasa S1 o valoraciones de extensin del cebador.
A) Valoracin de proteccin de nucleasa S1. Se sospecha que un fragmento de restriccin del extremo 5 ' de un gen clonado contiene el sitio de inicio de
transcripcin. Se marca terminalmente en los extremos 5' y luego se desnaturaliza y mezcla con el RNA total de las clulas en que se piensa que el gen im
portante est expresado. El mRNA afn puede hibridar la cadena DNA antisentido para formar un heterodplex RNA-DNA. El tratamiento subsecuente con nu
cleasa S1 produce el corte progresivo de la secuencia de DNA 3 ' saliente hasta el punto en que el DNA se hbrida al extremo 5 ' del mRNA. El fraccionamiento
de tamao en un gel de electroforesis desnaturalizante permite identificar la diferencia de tamao entre el DNA original y el DNA despus del tratamiento con
nucleasa S1. B) Valoracin de extensin del cebador. En este caso se elige de modo deliberado que el fragmento de restriccin que se sospecha contie
ne el sitio de inicio de la transcripcin sea pequeo. La hibridacin con un mRNA afn dejar el mRNA con un extremo 5 ' saliente. El DNA puede servir co
mo un cebador para que la transcriptasa inversa (RT) extienda su extremo 3' hasta alcanzar el extremo 5 ' del mRNA. El aumento de tamao despus del
tratamiento con transcriptasa inversa (+R T) comparado con el que tena antes del tratamiento (-R T ) mapea el sitio de inicio de la transcripcin. Con am
bos mtodos puede lograrse un mapeo ms preciso si el DNA se secuencia despus del tratamiento con S1 o transcriptasa inversa (RT).
Hibridacin in situ de montaje total

Una extensin de la hibridacin in situ de tejidos es el estudio de la
expresin en un embrin completo. La hibridacin in situ de monta
je total es un mtodo popular para rastrear la expresin durante el
desarrollo en embriones completos a partir de organismos vertebrados
modelo. Por las dificultades ticas y prcticas para efectuar anlisis
equivalentes de genes humanos, suele confiarse en la extrapolacin
de anlisis realizados en embriones de ratn (vase fig. 7-15). La
cantidad hasta cierto punto alta de tejido disponible significa que
el mtodo es ms o menos sensible y la automatizacin de la tcnica
increment su popularidad.
Perfil de expresin gnica de clulas nicas

El empleo de sondas marcadas de manera apropiada permite ras
trear secuencias de RNA especficas dentro de clulas aisladas a fin
de identificar los sitios de procesamiento, transporte y localizacin
citoplsmicos de RNA. La hibridacin fluorescente in situ (FISH)
cuantitativa y la microscopa digital de imgenes posibilitan inclu

sive observar transcritos de RNA o aislados in situ (Femino y cois..
1998). Un refinamiento adicional recurre a combinaciones de dife
rentes tipos de sondas de oligonucletidos marcadas en mltiples
sitios con una diversidad de fluorforos con espectros distintos.
Ello permiti rastrear de manera simultnea los transcritos de ml
tiples genes (Levsky y cois., 2002).
Seleccin de la expresin a gran escala mediante

microarreglos
La capacidad para preparar oligonucletidos de alta densidad o m i
croarreglos de clonas de cDNA en superficies de vidrio transforme
las selecciones de la expresin gnica (vase seccin 6.4.3 para los
procedimientos generales). En algunos genomas que ya se secuenciaron por completo existe la posibilidad de seleccionar la expresin
del genoma completo y por tanto vigilar al mismo tiempo la expre
sin de cada gen aislado en un organismo (vase seccin 19.3).
7.3 I ESTUDIO DE LA EXPRESIN GNICA
RNA
P R O T E N A
R E S O L U C I N
R E N D IM IE N T O
EJEM PLO S
Alta
Bajo
Hibridacin in situ d e tejido

H ibridacin in situ celular
B aja
Bajo
H ibridacin N orthern blot

Hibridacin dot blot d e R N A
P C R -R T
Valoracin d e proteccin d e ribonucleasa
B a ja
A lto
Hibridacin de microarreglo de DNA

Exhibicin diferencial
Anlisis seriado de expresin gnica (SAGE)
A lta
Bajo
Inm unocitoqum ica

M icroscopia d e inm unofluorescencia
B aja
B ajo
Inm unoblotting (w estern blotting)
B aja
Alto
Electroforesis con gel 2 -D

Esp ectrom etra d e m a sa
197
Fig. 7-14. El mapeo de expresin puede efectuarse a diferentes niveles.

Rendimiento se refiere al nmero de genes/protenas que pueden estudiarse a la vez.
7.3.3 Anlisis de expresin gnica basados en PCR:

PCR-RT y exhibicin diferencial de mRNA
Como se describe en la seccin 5.2, las grandes ventajas de la PCR
son su rapidez, sensibilidad y sencillez. Aunque no es adecuada pa
ra aportar patrones de expresin espaciales (p. ej., como lo hace la
hibridacin in situ de tejidos), suele proporcionar patrones de ex
presin gruesos, rpidos, que pueden ser valiosos.
Reaccin en cadena de ia polimerasa de transcriptasa

inversa (PCR-RT) convencional
La PCR de transcriptasa inversa (PCR-RT; vase seccin 5.2.1 para
el principio bsico) puede brindar una cuantificacin gruesa de la
expresin de un gen particular (til en tipos de clulas o tejidos cu
yo acceso en gran cantidad no es fcil, p. ej., embriones humanos
tempranos en etapa preimplantacin; vase Daniels y cois., 1995).
La sensibilidad extrema de la PCR implica que tambin es posible
utilizar la PCR-RT para estudiar la expresin en clulas aisladas.
Adems la PCR-RT puede ser til para identificar y estudiar dife
rentes isoformas y un transcrito de RNA. Por ejemplo, pueden pro
ducirse diferentes isoformas de mRNA mediante empalme (corte y
unin) alternativo e identificar cundo cebadores especficos de
exn reconocen productos de amplificacin extra adems de los pro
ductos esperados (para un ejemplo, vase Pykett y cois., 1994).
Exhibicin diferencial de mRNA

El uso de cebadores de PCR parcialm ente degenerados (cebadores
en los que la eleccin de bases en ciertas posiciones es deliberada
mente flexible) permite disear formas modificadas de PCR-RT

que pueden rastrear la expresin de muchos genes al mismo tiem
po. Una de estas tcnicas es la exhibicin diferencial de mRNA.
Se utiliza un cebador oligo(dT) m odificado que en su extremo 3'
tiene un nucletido nico diferente (es decir, A, C o G pero no T)
o un dinucletido distinto (como CA). Como resultado se unir a
la cola poli(A) de un subgrupo d e mRNA (Liang y cois., 1993). Por
ejemplo, si el oligonucletido TTTTTTTTTTTCA (=TnCA)
se utiliz como cebador, cebar de modo preferencial la sntesis de
cDNA a partir de los mRNA en que el dinucletido TG precede
a la cola poli (A).
El cebador corriente arriba suele ser una secuencia corta arbitra
ria (con frecuencia de 10 nucletidos de largo) pero a causa de la
incompatibilidad, en especial en el extremo 59, puede unirse a mu
chos sitios ms de los esperados para un decmero. Los patrones de
amplificacin resultantes estn diseados en forma deliberada para
producir una escalera compleja de bandas cuando se fraccionan de
tamao en un gel de poliacrilamida largo (fig. 7-16).
A diferencia de las selecciones del microarreglo de DNA, la ex
hibicin diferencial de mRNA es un medio para vigilar al mismo
tiempo la expresin de mltiples genes en los que las identidades
de los genes que se rastrean no se establecieron con anterioridad. Por
consiguiente, en lugar de seleccionar la expresin de genes conoci
dos, es un simple mtodo de seleccin de la expresin. Su principal
uso suele darse en estudios de expresin gnica comparativa para
identificar la forma en que la expresin gnica se altera cuando se
comparan dos orgenes (p. ej., la comparacin de dos tipos de c
lulas en diferentes etapas fisiolgicas o del desarrollo). Es posible
que esto permita identificar un subgrupo pequeo de genes cuyos
patrones de expresin son distintos entre los tipos celulares.
198
CAPITULO SIETE
Una vez que se enlaza a su blanco, el anticuerpo primario es enla

zado a su vez por un reactivo secundario que se conjuga con un grupo
rastreador. Un reactivo secundario usual es la protena A, una protena
que se encuentra en la pared celular de Staphylococcus aureus. Por razo
nes que se desconocen, la protena A se enlaza con firmeza a sitios en
las regiones constantes segunda y tercera de la porcin Fe de la cadena
pesada de Ig. Como alternativa es posible utilizar un anticuerpo secun
dario (un anticuerpo formado contra un anticuerpo primario).
Los grupos rastreadores tpicos pueden ser un fluorocromo (seccin
6 . 1.2 ), una enzima (p. ej., peroxidasa de rbano picante, fosfatasa alca
lina, galactosidasa (3, etc.) o bien oro coloidal. Los sistemas de detec
cin directa tienen la desventaja de requerir la conjugacin de una gran
variedad de anticuerpos primarios a molculas rastreadoras, en tanto
que los sistemas indirectos ofrecen el uso de anticuerpos secundarios de
afinidad purificada disponibles en el comercio. Los sistemas de detec
cin y marcado para su empleo con mtodos especficos de rastreo de
la expresin protenica se delinean en el cuadro 7-1.
Inmunoblotting (Western blotting)
Fig. 7-15. Montaje com pleto en hibridacin in situ.

El ejemplo muestra la expresin Pax9 en un embrin de ratn E9.5 (da
9.5 embrionario = 9.5 das poscoito). La expresin es evidente en la re
gin craneofacial (CF; en lo que se desarrollar hacia mesnquima na
sal), las bolsas farngeas (PP), las somitas (S) y la yema de la cola (T).
Fotografa proporcionada por el doctor Heiko Peters, Institute of Human
Genetics, Unversity of Newcastle upon Tyne, UK.
7.3.4 En las selecciones de expresin de protenas

suelen utilizarse anticuerpos muy especficos
Por su diversidad y sensibilidad exquisitas en la deteccin de prote
nas, los anticuerpos tienen mltiples aplicaciones en investigacin y
su potencial teraputico es considerable (vase seccin 21.3.4). Aun
que de manera tradicional los anticuerpos se aislaban mediante la
inmunizacin de animales, ahora se usan cada vez ms anticuerpos
genticamente manipulados por ingeniera (vase recuadro 7-4). Por
lo general se emplean anticuerpos para detectar protenas por dife
rentes mtodos y es posible recurrir a sistemas de marcado distintos.
Sistemas de marcado y deteccin de anticuerpos

Los anticuerpos pueden marcarse en diferentes formas y, como en el
marcado y la deteccin de cido nucleico, es posible utilizar anticuer
pos en sistemas de deteccin directa o indirecta. En los mtodos de
deteccin directa, el anticuerpo purificado se marca de manera apro
piada con una molcula rastreadora (p. ej., fluorescena, rodamina,
biotina, etc.; vase tambin la seccin 6 . 1.2 ) y luego se usa de mane
ra directa para enlazar la protena blanco. En los sistemas de d etec
cin indirecta el anticuerpo primario se emplea como una molcula
intermedia y no se une de modo directo a un grupo marcado.
Este mtodo est diseado para seguir la expresin gruesa de pro

tenas mediante extractos celulares que se fraccionan de acuerdo
con el tamao. Lo anterior suele lograrse por medio de SDS-PAGE
unidim ensional, una forma de electroforesis en gel de poliacrilamida (^>oliJcrylamide gel dectrophoresis) en la que la mezcla de pro
tenas extradas se disuelve primero en una solucin de sulfato
sdico de dodecilo (SDS), un detergente aninico que altera casi
todas las interacciones no covalentes en protenas naturales. Asi
mismo se aaden mercaptoetanol o ditiotreitol para reducir enlaces
de disulfuro. Despus de la electroforesis es posible observar las
protenas fraccionadas tiendo con un colorante adecuado (p. ej.,
azul Coomassie) o un colorante argntico.
Tambin pueden emplearse geles PAGE tridimensionales: la prime
ra dimensin incluye enfocamiento isoelctrico, que es la separacin segn
la carga en un gradiente de pH, y la segunda dimensin, en ngulos rec
tos con la primera, comprende el fraccionamiento de tamao median
te SDS-PAGE (vase Stryer, 1995). En este caso las protenas
fraccionadas se transfieren (blotted, manchan) a una hoja de nitrocelulosa y luego se exponen a un anticuerpo especfico (vase fig. 7-17).
Inmunocitoqumica (inmunohistoquimica)
Esta tcnica se relaciona con el estudio del patrn total de expresin
a nivel protenico, dentro de un tejido o de otra estructura multice
lular. En consecuencia puede considerarse como el equivalente en
las protenas de los mtodos de hibridacin in situ de tejidos que se
utilizan para seleccionar la expresin de RNA. Como en el ltimo
caso, los tejidos casi siempre se congelan o embeben en cera y des
pus se seccionan en cortes muy delgados con un micrtomo antes
de montarse en un portaobjetos. Se permite que un anticuerpo es
pecfico apropiado se una a la protena en el corte de tejido y esto
puede proporcionar datos de la expresin susceptibles de relacionar
con la tincin histolgica de cortes de tejido vecino (fig. 7-18).
Microscopa de inmunofluorescencia
Este mtodo se emplea cuando se investiga la localizacin subcelula r t una protena de inters. Un colorante fluorescente adecuado,
como fluorescena o rodamina, se acopla al anticuerpo deseado, lo
que permite localizar la protena importante dentro de la clula por
medio de microscopa de fluorescencia (vase fig. 6-5B).
7.3 ! ESTUDIO DE LA EXPRESIN GENICA
199
B)
A)
T||A
P oblacin heterognea
de mRNA
T||C
II
T||G
II
10 11 12 16 10 11 12 16 10 11 12 16
A A A A A A ..A ,
A A A A A A ...A n
A A A A A A ...A n
T ranscriptasa inversa con

c e b a d o r oligo(dT) m od ifica do,
p. ej., TIIG
------------------- \CAAAAAA...An
------------------ G T T T T T T T T T T T
i
k
A m p lifica ci n de PCR con

TIIG y c e b a d o r nu cle tido
10 arb itrario , p. ej.,
TCGATACAGG
TCG ATACAG G AGCTATG TCC -
-C A A A A A A A A A A
-G T T T T T T T T T T T
m m m '
E lectroforesis en
gel de po lia crilam id a
Fig. 7-16. La exhibicin diferencial de mRNA es un mtodo de PCR-RT modificado para explorar la expresin gnica multiplex.
A) Representacin esquem tica. El RNA total de dos o ms tipos de clulas se transcribe inversamente con un cebador oligo (dT) modificado (en este
ejemplo, TTTTTTTTTTTG o T ^G para abreviar), que debe cebar de manera preferencial la sntesis de cDNA a partir de la secuencia de mRNA en la que
una C precede a la cola poli(A). La amplificacin se realiza con un cebador arbitrario y los productos se fraccionan de tamao en un gel de poliacrilami
da. Las diferencias en las bandas de amplificacin entre las fuentes de RNA que se comparan (A y B) indica la expresin diferencial. B) Una aplicacin:
identificacin de genes que se expresan en forma diferencial en distintas etapas del desarrollo del corazn del ratn (das embrionarios 10 , 1 1 , 1 2 y 16).
Se usaron tres grupos de condiciones de reaccin, con un cebador T ^G en cada caso y uno de los tres cebadores arbitrarios diferentes AP1, AP2 y AP3.
La figura muestra una seccin del gel en la que puede observarse el cambio de intensidad en varias bandas en diferentes etapas del desarrollo. Un cam
bio en particular notable (indicado por la flecha) result ser globlna p. Fotografa proporcionada por Andy Curtis y David Wilson, University of Newcastle
upon Tyne, UK.
200
CAPTULO SIETE
Recuadro 7-4. Obtencin de anticuerpos

MTODOS TRADICIONALES PARA OBTENER ANTICUERPOS
Por tradicin los anticuerpos contra productos gnicos humanos se ob
tienen mediante la inyeccin repetida de animales apropiados (p. e j roe
dores, conejos, cabras, etc.), con un inmungeno adecuado. A menudo
se utilizan dos tipos de inmungeno:
pptidos sintticos. Se observa la secuencia de aminocidos (dedu
cida de la secuencia conocida de cDNA) y se disea un pptido sin
ttico (con frecuencia de 20 a 50 aminocidos de largo). La idea es
que, cuando se conjuga con una molcula adecuada (p. e j hemocianina adherente de ajuste perfecto), el pptido adopta una conforma
cin semejante a la del segmento correspondiente del polipptido
natural. Aunque este mtodo es hasta cierto punto simple, el xito pa
ra generar anticuerpos especficos apropiados est lejos de ser segu
ro y resulta difcil predecirlo;
protenas de fusin. Un mtodo alternativo consiste en insertar una
secuencia apropiada de cDNA en un gen bacteriano modificado in
serto en un vector de clonacin de expresin apropiado. El razona
miento es que se producir un mRNA hbrido que se traducir para
proporcionar una protena de fusin con una regin terminal N deri
vada del gen bacteriano y el resto proveniente del gen insertado
(vase figura). A pesar de que la secuencia bacteriana terminal N
suele disearse para ser muy corta, puede conferir ciertas ventajas.
Por ejemplo, suele brindar una secuencia de seal a fin de asegurar
la secrecin de la protena de fusin hacia el medio extracelular, lo
que simplifica su purificacin y puede proteger la protena extraa de
su degradacin dentro de la bacteria. Como la protena de fusin
contiene la totalidad, o casi, de la secuencia polipptida deseada, la
probabilidad de producir anticuerpos especficos puede ser razona
blemente alta.
Si el sistema inmunitario de los animales respondi, deben secretarse an
ticuerpos especficos hacia el suero. El suero rico en anticuerpos (anti
suero) que se rene contiene una mezcla heterognea de anticuerpos,
elaborados por un linfocito B diferente [porque los reordenamientos del
gen de inmunoglobulina son especficos de clula y tambin de tipo ce
lular (linfocito B), vase seccin 10.6]. Los diferentes anticuerpos reco
nocen distintas partes (epitopos) del inmungeno (antisuero policlonal).
Sin embargo, es posible elaborar una preparacin homognea de anti
cuerpos al propagar una clona de clulas (originalmente derivadas de un
linfocito B).
Como las clulas B tienen un perodo de vida limitado en cultivo, es pre
ferible establecer una lnea celular inmortal: las clulas que producen an
ticuerpo se fusionan con clulas derivadas de un tum or de clula B
inmortal. A partir de la mezcla heterognea resultante de clulas hbridas
se seleccionan las que tienen tanto la capacidad para elaborar un anti
cuerpo particular como la propiedad de multiplicarse de manera indefini
da en cultivo. Estos hibridomas se propagan como clonas individuales,
cada una de las cuales puede proporcionar una fuente permanente y es
table de un tipo aislado de anticuerpo monoclonal (Ame).
Los mtodos anteriores para elaborar anticuerpos no siempre garantizan
la produccin de anticuerpos especficos adecuados. Un mtodo alterna
tivo para rastrear la expresin subcelular de una protena de inters con
siste en utilizar un anticuerpo obtenido con anterioridad a fin de seguirlo
como resultado de su enlace a un epitopo acoplado de modo artificial
(marcado de epitopo). En este procedimiento se genera un producto de
DNA recombinante acoplando una secuencia que codifica un epitopo, pa
ra el que se dispone del anticuerpo obtenido antes, a la secuencia de co
dificacin de la protena de inters en form a muy similar a la figura,
excepto que en este caso el sistema vector est diseado para expresar
se en clulas de mamferos u otras clulas en las que se pretende inves
tigar ia expresin. La expresin de este producto en las clulas deseadas

puede vigilarse por medio del anticuerpo especfico para la marca del epi
topo con objeto de rastrear la protena. A continuacin se muestran los
marcadores de epitopos que ms se utilizan.
Secuencia
del marcador
Origen
Localizacin Acm
DYKDDDDK
FLAG sinttico
Terminal N, C
Anti-FLAG M1
EQKLISEEDL
c-Myc humano
Terminal N, C
9E10
Terminal N
Ac Marcador T7
MASMTGGQQMG G enT710
QPELAPEDPED
Protena D de HSV Terminal C
Ac Marcador HSC
RPKPQQFFGLM
Sustancia P
Terminal C
NC1/34
YPYDVPDYA
Influenza HA1
Terminal N, C
12CA5
Flag[Q33], virus de herpes simple, HSV.

ANTICUERPOS POR INGENIERA GENTICA
Los anticuerpos generados por los mtodos clsicos anteriores provie
nen de animales. Sin embargo, una vez que los diversos genes de inmu
noglobulina se clonaron fue factible utilizar la tecnologa de corte y
ligadura de DNA para generar nuevos anticuerpos, inclusive tanto anti
cuerpos parcialmente humanizados com o anticuerpos plenamente hu
manos (vase seccin 21.3.4). Por ejemplo, ratones transgnicos se
SCM
C lo n a d e c D N A
e n S C M (s itio d e
c lo n a c i n m ltip le )
y e x p re s a r
|3 -g a l
p ro te n a X
N m m
P ro te n a d e fu s i n
Con frecuencia las protenas de fusin se disean como

inmungenos para formar anticuerpos
7.3 1 ESTUDIO DE LA EXPRESIN GNICA ; 201
manipularon mediante ingeniera para que contuvieran locus de inmunoglobulina humana a fin de permitir la produccin in vivo de anticuerpos
plenamente humanos.
Es posible que los mtodos recientes eviten por completo la necesidad de
recurrir a la tecnologa de hibridoma e inmunizacin. La potente te cn olo
ga de exhibicin de lago permite elaborar un repertorio casi ilimitado de
anticuerpos humanos con especificidades contra antgenos extraos y
propios (vase Winter y cois., 1994). La esencia de este mtodo es que
los segmentos gnicos que codifican las secuencias variables de cadena
pesada y ligera del anticuerpo se clonan y expresan en la superficie de un
bacterifago filamentoso, y los fagos raros se seleccionan de una pobla
cin compleja mediante el enlace con un antgeno de inters (vase sec
cin 19.4.6 para una explicacin completa).
Cuadro
El vector plsmide que aqu se muestra tiene un origen de replicacin (ori)

y un gen de resistencia a la ampicilina (ampR) diseado para crecer en E.
coli. El sitio de clonacin mltiple (SCM) se localiza justo adyacente a un
gen lacZ que puede codificar galactosidasa p y la transcripcin del pro
motor lacZ (P,ac) ocurre en la direccin que la flecha muestra. Se clona
una secuencia de cDNA de un gen de inters (gen X) en una orientacin
apropiada dentro del sitio de clonacin mltiple (SCM). La expresin del
promotor lacZ dar por resultado una protena de fusin galactosidasa beta-X que puede producirse en grandes cantidades y utilizarse como un inmungeno para estimular la produccin de anticuerpos a la protena X.
Una alternativa popular consiste en usar protenas de fusin GST, en las
que la transferasa de glutatin S se acopla a la protena de inters y la
protena de fusin puede purificarse con facilidad mediante cromatogra
fa de afinidad con el empleo de columnas de glutatin y agarosa.
Marcado y deteccin de anticuerpo para rastrear la expresin protenica.
Marcador
Mtodo de deteccin
Aplicacin
Yodo-125
Placa de rayos X
Inmunoblotting
Enzima
Sustrato cromgeno detectado a simple vista
inmunoblotting; inmunocitoqumica
Biotina
Avidina o estreptavldina acoplada a diversos marcadores
Inmunoblotting; inmunocitoqumica
Fluorocromo
Microscopa de fluorescencia (fig. 6-5B)
Inmunocitoqumica; microscopa de inmunofluorescencia
8
- 4 0 0 kD a
D istro fin a
(blot)
200
100
M io s in a
(aell
B)
Fig. 7-17. Inmunoblotting (Western blotting) detecta protenas que se

fraccionaron de tamao en un gel de electroforesis.
1
8
- ,4 0 0 kD a
D istrofin a
(blot)
M io s in a
(en
200
100
Inmunoblotting consiste en detectar polipptidos despus del fraccio

namiento de tamao en un gel de poliacrilamida y transferirlos (blotting,
manchado) a una membrana. Este ejemplo ilustra su aplicacin en la
deteccin de distrofina con el uso de dos anticuerpos. El anticuerpo
Dy4/6D3 es especifico para el dominio de bastn y se gener con un
inmungeno de protena de fusin (vase recuadro 7-4). El anticuerpo
Dy6/C5 es especfico para la regln terminal C y se gener a partir
de un inmungeno pptido sinttico. Reproducido de Nicholson y
cois. (1993) con autorizacin de BMJ Publishing Group. Fotografa
proporcionada por Louise Anderson (antes Nicholson), University of
Newcastle upon Tyne, UK.
202
CAPTULO SIETE i ANALISIS DEL DNA Y ESTRUCTURA, VARIACIN Y EXPRESIN GNICAS
Estudios ultraestructuraIes
La microscopa electrnica brinda una resolucin an ms alta de
la localizacin intracelular de un producto gnico o de otra mol
cula. Por lo general el anticuerpo se marca con una partcula electrodensa, como esferas de oro coloidal.
7.3.5 Los marcados autofluorescentes de protenas

constituyen un medio potente para rastrear
ia localizacin subcelular de protenas
La protena verde fluorescente (PVF) es una protena de 238 ami
nocidos que se identific primero en la medusa Aequoria victoria.
Protenas similares se expresan en muchas medusas y al parecer ori
ginan la luz verde que emiten y son estimuladas por la energa que
se obtiene despus de la oxidacin de luciferina u otra fotoprotena (vase Tsien, 1998). Cuando el gen de PVF se clon y tranfect
en clulas blanco en cultivo, tambin se marc la expresin de PVF en
clulas heterlogas por la emisin de luz fluorescente verde. Esto
significa que la PVF es una p roten a a u tofluorescen te; puede actuar
por s misma como un fluorforo funcional. Por estas razones suele
ser til como rastreador nico, ya que no requiere otros agentes, co
mo anticuerpos, cofactores, sustratos enzimticos, etc. Como resul
tado, es posible seguir con facilidad la PVF mediante microscopa
convencional y de fluorescencia confocal, y se constituy en un
medio popular para rastrear la expresin de genes en animales (va
se seccin 20.3.1).
Fig. 7-19. El marcado con la protena verde fluorescente constituye

un medio potente para rastrear la expresin de protenas.
Este ejemplo muestra una clula HeLa viva transfectada en forma transito
ria que expresa una proteina de la enfermedad de Batten marcada con PVF.
CLN3 se clon en el vector de expresin de PVF, pEPVF-N1, de manera que
produjo una protena constituida por la proteina de la enfermedad de Bat
ten con una secuencia de PVF acoplada a su terminal C (un marcador
PVF). Esta clula es un ejemplo de una proporcin pequea de clulas HeLa que expresan CLN3P/PVF en un patrn vesicular punteado distribuido
en la totalidad del citoplasma. Estos anlisis, y otros, indican que la pro
teina de la enfermedad de Batten es una protena integral de la membrana
de Golgi. Reproducido de Kremmidiotis y cois. (1999) Hum. Mol. Genet.
8,523-531, con autorizacin de Oxford University Press.
Fig. 7-18. Inmunocitoqumica.

En este ejemplo se seleccion la expresin de tubulina p en un corte
transversal de cerebro de un embrin de ratn de 12.5 das. El sistema
de deteccin de anticuerpo utilizado identific la expresin como una
reaccin de color pardo basada en peroxidasa de rbano picante/3,3'
diaminobencidina. La histologa subyacente se revel mediante contra
tincin con azul de toluidina. Abreviaturas: LV, ventrculo lateral; D, dien
cfalo; R protuberancia. Fotografia proporcionada por Steve Lisgo,
Institute of Human Genetics, University of Newcastle upon Tyne, UK.
Las aplicaciones de mayor xito y popularidad suelen usar la

PVF como un marcador en una protena de fusin en la que se aco
pla la protena cuya expresin se rastrear. En estos casos el objeti
vo principal es investigar la localizacin subcelular de la protena en
investigacin. La PVF en s misma no se localiza de manera espec
fica dentro de las clulas: en casi todos los tipos de clulas la fluores
cencia de la PVF al parecer est diseminada de modo homogneo en
la totalidad del ncleo, el citoplasma y procesos celulares distales. Es
posible recurrir a la ingeniera gentica para producir vectores que
contienen una secuencia de codificacin de PVF dentro de la que
una secuencia de codificacin para una proteina, X, no caracteriza
da puede clonarse. El producto de fusin PVF-X resultante puede
transfectarse en clulas blanco adecuadas, como clulas de mamfe
ros cultivadas, y la expresin de la protena de fusin PFV-X vigilar
se a fin de rastrear la localizacin subcelular de la misma. Vase la
figura 7-9 para un ejemplo del rastreo de la expresin de la protei
na producida por CLN3, el gen relacionado con la enfermedad de
Barten, una afeccin neurodegenerativa de la niez.
PARTE DOS
Genoma humano y su relacin

con otros genomas
8
P royectos d e l gen o m a y orga n ism os m od elos
207
O rgan izacin d e l gen o m a hu m an o
239
10
Expresin g n ica h u m an a
275
11
In estab ilid ad d e l gen om a hum ano: m u tacin y reparacin d e l DNA
315
12
L ugar d e l h om b re en e l rb o l d e la vid a
351
CAPTULO
OCHO
Proyectos del genoma

y organismos modelos
CAPTULO OCHO
.1
PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
Im p o rtan cia pionera de los

proyectos del genom a
8.1.1 Los proyectos del genoma prepararon el camino

para los estudios sistemticos del universo interno
Despus de muchos siglos de investigacin se integr un conoci
miento aproximado, cuando menos de las partes ms accesibles del
universo externo. La escala es impresionante y algunos conceptos
estn desde luego fuera de la experiencia normal del hombre (co
mo las 13 dimensiones que en la actualidad se piensa que existen!).
Sin embargo, tambin hay un universo interno (dentro del hombre)
que en buena medida an no se explora y tiene asimismo una esca
la extraordinaria (la complejidad del cerebro humano es un ejem
plo til: alrededor de 1011 neuronas y 1015 interconexiones).
Hasta fecha reciente, las exploraciones del universo interno del
hombre eran modestas y de escala limitada. La aplicacin del mi
croscopio al estudio de las clulas y las estructuras subcelulares pro
porcion una va importante hacia este mundo interno; a ella le
siguieron adelantos pioneros en bioqumica y a continuacin bio
loga molecular y celular. Hoy en da, al inicio de un nuevo mile
nio, se cuenta con el equilibrio para pasar de estas investigaciones
iniciales a un plano por completo superior. Ahora es posible llevar
a cabo una exploracin seria y sistemtica del universo interno del
hombre.
El factor que allan el camino para esta nueva fase del descubri
miento fue el Proyecto del Genoma Humano (PGH), una labor
en verdad internacional. Comenz de forma oficial en 1990 y fue
el primer proyecto grande de la biologa, con un tiempo proyec
tado de 15 aos. El PGH y otros proyectos de genomas buscaron
por primera vez conocer las instrucciones qumicas precisas que de
finen a los organismos vivientes, las secuencias completas del geno
ma (el g en o m a se refiere al corpus total de las diferentes molculas
de DNA; vase el glosario de genmica en el recuadro 8-1). Para
muchos cientficos, esto fue el equivalente en biologa de la tabla
peridica; toda la materia puede reducirse a una tabla peridica de
elementos, pero a un nivel ms alto; as, todo ser viviente puede re
ducirse a una tabla peridica de genes.
Objetivos del Proyecto del Genoma Humano (PGH)

La principal justificacin del PGH fue adquirir informacin funda
mental sobre la constitucin gentica que podra ampliar el cono
cimiento cientfico bsico de la gentica humana y el papel de
diversos genes en la salud y la enfermedad. Desde que se public en
1981 la secuencia pequea (16.5 kb) del DNA mitocondrial huma
no (mtDNA) (vase seccin 9.1.2), el principal objetivo del PGH
fue secuenciar el genoma nuclear, inmensamente ms grande (cer
ca de 3 000 Mb). Como un primer paso para lograrlo, se requeran
mapas genticos humanos de alta resolucin que sirvieran como
una estructura central (armazn) para construir mapas fsicos de
gran precisin, hasta culminar en el mapa fsico final, la secuencia
completa del genoma humano.
Adems del objetivo primario de mapear y secuenciar el geno
ma nuclear humano, el PGH previo desde el principio varios pro
yectos auxiliares:
d esa rro llo d e tecn o lo g a s y h erra m ien ta s a p rop ia d a s. Esto
inclua desarrollo de los mtodos de mapeo gentico y fsico,
tecnologa de secuenciacin del DNA, diseo y elaboracin
de bases de datos e informtica para anlisis de secuencias, et

ctera;
p r o y e cto s d e l g en o m a p a r a cin co o rga n ism os m od elos: la bac
teria E. coli, la levadura Saccharomyces cerevisiae, el gusano re
dondo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila
melanogaster y el ratn. En este caso, el objeto fue doble: pro
porcionar informacin abundante necesaria para estos organis
mos modelos y asimismo pruebas y casos para practicar y
depurar las diversas tecnologas y herramientas que fueran ne
cesarias para el proyecto del genoma humano;
efecto s ticos, lega les y sociales. Una parte importante del cos
to total se dedic a este componente fundamental, pero fcil de
pasar por alto.
Alrededor del ao 2003 se haban logrado los objetivos de la secuen
ciacin del genoma humano y los genomas de los cinco organismos
modelos iniciales y se dispona de las secuencias a travs de internet.
Durante el curso del PGH se iniciaron otros proyectos de genomas
para una amplia variedad de otros organismos modelos y hacia ma
yo de 2003 se haban determinado las secuencias del genoma de
otros 140 organismos (vase seccin 8.4). Los estudios auxiliares
adicionales se preocuparon de la extensin de la variacin de la se
cuencia dentro del genoma humano.
8.1.2 Se espera que los beneficios mdicos y cientficos

de los proyectos del genoma sean enormes
Para muchos bilogos y genetistas humanos, el PGH fue una mi
sin histrica. Un justificacin mayor an fueron los beneficios
mdicos anticipados (Collins y McKusick, 2001; Subramanian y
cois., 2001; Van Ommen, 2002). Para trastornos hereditarios
que dependen de un gen aislado mayor es factible el diagnstico
amplio prenatal y presintomtico de afecciones en individuos
con riesgo de tener un gen de la enfermedad. Adems, se utiliza
la informacin sobre la estructura gnica para valorar el modo en
que funcionan genes individuales y la forma en que se regulan.
Esta informacin proporciona explicaciones que se requieren
con urgencia para procesos biolgicos en seres humanos. Tam
bin caba esperar que proporcionara una estructura para el de
sarrollo de nuevos tratamientos de enfermedades y extender los
mtodos teraputicos actuales. Se espera que la aplicacin a gran
escala de la seleccin de mutaciones represente un cambio radical
en la conducta para el cuidado mdico: pasar del tratamiento de
una enfermedad avanzada a la prevencin d e la anormalidad, con
base en la identificacin del riesgo individual (m ed icin a p e r so n a
lizada) .
Sin embargo, aunque estas posibilidades son fascinantes, es
posible que haya dificultades inesperadas para comprender con
precisin y amplitud la manera en que funcionan y se regulan al
gunos genes (las precauciones precedentes son en realidad el len
to progreso para predecir la estructura de las protenas a partir de
la secuencia de aminocidos y la falta de conocimientos sobre la>
formas precisas en que se coordina la regulacin de la expresin
del gen de globina, dcadas despus de obtenerse las secuenciasde importancia). Adems, los trastornos de gen nico que seran
los blancos ms fciles para desarrollar teraputicas novedosas
son muy raros; las alteraciones ms comunes son multifactoriles y representan grandes desafos. Por consiguiente, aunque loi
datos obtenidos en el proyecto del genoma humano tendrn de
modo inevitable un valor mdico, es posible que algunas de las
8.1
Recuadro 8-1. Glosario de
IMPORTANCIA PIONERA DE LOS PROYECTOS DEL GENOMA
209
genm ica
i
CentiMorgan (cM): unidad de distancia en un mapa gentico (vase ms

adelante); en el genoma humano IcM corresponde ms o menos a una
distancia en el mapa fsico de 1 Mb.
CentiRay (cR): unidad de distancia en un mapa hbrido por radiacin
(vase ms adelante).
Clona: las clonas de DNA son poblaciones de molculas de DNA idnti
cas que se purificaron mediante mtodos de clonacin basados en clu
las (seccin 5.3.1) o por PCR (seccin 5.2.1).
Contiguo: serie de clonas de DNA que contienen insertadas molculas de
DNA derivadas de regiones prximas y superpuestas de un cromosoma;
vase recuadro 8-5.
Marcador de DNA: trmino general para una secuencia de DNA que se
coloc, o puede situarse, en un mapa gentico (si se trata de marcado
res polimrficos; vase ms adelante) o un mapa fsico (en el caso de
todos los marcadores).
Islote de CpG: tira corta de DNA abundante en GC, con frecuencia < 1
kb, que contiene dinucletidos CpG no metilados frecuentes. Los islo
tes de CpG tienden a marcar los extremos 5 ' de genes; vase recuadro
9-3.
genoteca de DNA: conjunto de clonas de DNA que tiene com o fin re
presentar de fo rm a colectiva una poblacin de inicio de DNA. Para una
genoteca de DNA genmico, el DNA de inicio es el DNA total de una
poblacin celular determinada (que muestra poca variacin entre los
diferentes tipos de clulas); cuando se trata de una genoteca de cD
NA, el DNA de inicio es cDNA preparado mediante transcriptasa inver
sa de RNA de cadena nica de un tejido especifico (con una variacin
muy considerable en el cDNA de diferentes tejidos); vase secciones
5.3.4 y 5.3.5 para la form a en que se preparan y seleccionan las genotecas.
EST (marcador de secuencia expresado): un STS expresado (sitio de
secuencia marcado: vase ms adelante) que se obtiene al seleccionar
de modo aleatorio una clona de cDNA para secuenciacin y el diseo de
cebadores especficos a fin de amplificar de manera particular mediante
PCR el fragmento correspondiente de DNA genmico.
Mapa gentico: es un mapa que se basa en el rastreo de la herencia de
fenotipos, marcadores polim rficos, o ambos, a travs de generaciones;
los locus polim rficos estn colocados relativamente entre s con base en
la frecuencia con que se recombinan durante la meiosis; la unidad de dis
tancia es 1 centiMorgan (1 cM) que indica una posibilidad de recom bi
nacin del 1 %.
Genoma: nombre colectivo para las diferentes molculas de DNA que se
encuentran en las clulas de una especie particular; en seres humanos el
genoma comprende 25 molculas de DNA diferentes: un tipo nico de
DNA mitocondrial y 24 molculas de DNA nuclear diferentes (vase sec
cin 9.1.1). Sin embargo, debido a que la cantidad de DNA en el ncleo
es tan grande, a menudo se utiliza de manera general el trmino genoma
para referirse al grupo de molculas de DNA nuclear (denominado con
mayor precisin genoma nuclear: con frecuencia, el DNA mitocondrial se
describe como genoma mitocondrial)
aplicaciones mdicas relevantes requieran an un tiempo consi

derable para desarrollarse.
A medida que se transita hacia la era posgenoma se han
emprendido enormes esfuerzos internacionales para determinar
la forma en que la secuencia del genoma humano puede espe
cificar a una persona y cmo se relaciona el DNA de otros or
ganismos con el del hombre y sus biologas. La informacin
Mapeo de clula hbrida: pueden asignarse marcadores de DNA humano

a una localizacin cromosmica o subcromosmica especfica mediante
grupos de diferentes clulas hbridas que contienen un complemento total
de cromosomas de una especie de roedor (hmster o ratn) y un subgrupo
variable de cromosomas humanos o fragmentos de cromosomas huma
nos rotos medante exposicin a rayos X (hbridos por radiacin; vase
recuadro 8-4).
Marcador microsatlite: es una variedad de marcador de DNA que se
emplea de modo habitual, en buena medida porque los marcadores de es
te tipo puede ser muy polim rficos; vase figuras 7-7 y 7-8.
Mapa fsico: es un mapa que proporciona informacin sobre la estructu
ra lineal de molculas de DNA; el mapa fsico ms detallado es la secuen
cia de nucletidos.
Marcadores polimrficos: los marcadores polim rficos (genticos)
son secuencias de DNA que muestran variacin entre los individuos y
se usan para elaborar mapas genticos de acuerdo con la form a en que
se segregan alelos en fam ilias grandes. Los marcadores pueden loca
lizarse dentro de las secuencias de codificacin u otros componentes
gnicos, pero se hallan sobre todo en el DNA no codificante. Los m ar
cadores que se utilizan con frecuencia son microsatlites y SNP, aun
que con anterioridad se empleaban RFLP e incluso polim orfism os
protenicos.
Mapa hbrido por radiacin (HR): es un mapa de un genoma en el cual
los STS se interrelaconan segn sea la frecuencia con que se separan
mediante roturas cromosmicas inducidas por radiacin. La frecuencia
se valora tras analizar un grupo de lneas de clulas hbridas (ser humano-hmster) que contienen diferentes patrones de fragmentos cromosmicos humanos generados de modo inicial por exposicin a rayos X. La
unidad de distancia del mapa es 1 centiRay (1 cR), que indica una posi
bilidad de 1 % de que ocurra una rotura entre dos locus.
RFLP (polimorfismo de longitud de fragmento de restriccin): es un ti
po de marcador de DNA que se us en extenso con anterioridad, pero con
muy poca frecuencia en la actualidad porque no suele ser muy polim rfico y no es fcil tipificarlo; vase la seccin 7.1.3.
SNP (polimorfismo de nucletido nico): los SNP suministran un tipo de
marcador de DNA que se ha empleado cada vez ms. Ocurren con gran
frecuencia en el DNA-y pueden tipificarse con facilidad mediante mtodos
automatizados, lo que hace posible analizar al mism o tiempo enormes
cantidades de muestras; vase la seccin 7.1.3 y el recuadro 18-2 don
de se describe la forma en que se tipifican los polim orfism os de nucle
tido nico (SNP).
STS (sitio de secuencia marcado): cualquier secuencia corta (por lo ge
neral < 500 pb) representada de manera nica en un genoma y para la
cual se disean cebadores que permiten la amplificacin especifica de
esa secuencia mediante PCR (vase recuadro 5-4). Los STS se obtenan
al secuenciar de manera aleatoria los extremos de clonas genmicas y
por consiguiente muchas veces no eran polim rficos, pero se sabe que
un subgrupo de STS es polim rfico, incluidos los marcadores microsa
tlites (vase antes).
sobre la secuencia obtenida por el estudio de la estructura de

genomas (genmica convencional) ha facilitado el camino pa
ra la aparicin de otros mtodos a gran escala que permitan in
vestigar la funcin de los genomas (g e n m ic a fu n c io n a l) y la
manera en que se vinculan entre s los diferentes genomas ( g e
n m ica c o m p a r a tiv a ). Estos temas se comentan en el captulo
19 y la seccin 12.3.
210
CAPITULO OCHO
8.2
Fundam ento y organizacin del

Proyecto del Genoma Hum ano
8.2.1 Los polimorfismos de DNA y las nuevas tecnologas

de clonacin de DNA allanaron el camino para la
secuenciacin del genoma humano
Desde mediados de la dcada de 1950 se contaba ya con un mapa
fsico muy general del genoma humano -un mapa citogentico ba
sado en la distincin de los cromosomas por tamao y forma-. Con
la finalidad de progresar hacia mapas fsicos muy detallados se re
quirieron nuevas medidas. Un problema principal fue que pareca
imposible el objetivo inicial de obtener un mapa gentico humano
que actuara como una estructura central para construir mapas fsi
cos detallados-. En lugar de ello, los genetistas humanos se limita
ban a vigilar, a medida que se elaboraban desde haca dcadas, los
m apas g e n tico s tp ico s de Drosophila y el ratn, que despus se
depuraban de forma continua.
Los mapas genticos habituales se basan en gen es. Se elaboran
al cruzar diferentes mutantes para determinar si los genes de dos locus estn ligados o no. Sin embargo, nunca podra lograrse un ma
pa gentico humano comn porque la frecuencia del matrimonio
entre dos individuos que sufren diferentes trastornos genticos es
cada vez ms pequea. Sin un mapa gentico que proporcionara
puntos de fijacin era difcil imaginar cmo disear mapas fsicos
detallados de todos los cromosomas.
Un punto decisivo fue el reconocimiento cada vez mayor, a fines
de la dcada de 1970, de que mucha (en realidad la gran mayora)
de la variacin de secuencias en el genoma humano ocurra fuera de
los genes y poda valorarse. La variacin que se haba estudiado hasta
entonces se enfoc a continuacin en polimorfismos de protenas.
Slo fue factible estudiar unos cuantos marcadores de protenas por
que el DNA de codificacin es una fraccin muy pequea (2%) del
genoma y no propensa a variaciones (porque es esencial en sentido
funcional y est muy conservada en la evolucin). En contraste, la
inmensa mayora del > 98% del DNA humano que no es codifi
cante no est bien conservado y es muy susceptible a cambios de la
secuencia de DNA.
A finales de la dcada de 1970 se dispuso por primera vez de
mtodos para valorar la variacin d el DNA (mediante la seleccin
para p o lim o rfism o s d e lo n g itu d d e l fr a g m en to d e restricci n o
RFLP-, recuadro 8-1). Por ltimo, se torn una posibilidad la idea
de construir un mapa gentico humano atpico y amplio (Botstein
y cois., 1980). Desde esa fecha en adelante, los genetistas humanos
elaboraran mapas de enlace gentico cada vez ms detallados me
diante marcadores de DNA que se dispersaran al azar en la totali
dad del genoma humano. Tras llevar a cabo pruebas para observar
si en estudios de familias se segregaban juntos alelos especficos de
dos o ms marcadores, fue factible asignar marcadores de DNA a
un gr u p o d e u n in particular. Fue posible a su vez asignar grupos
de unin individuales a cromosomas especficos mediante el mapeo
fsico de uno o ms de los marcadores constituyentes (p. ej., al se
alar un marcador e hibridarlo en una preparacin de cromosomas
en metafase [vase figs. 2-16 y 2-17] o al utilizar grupos de clulas
hbridas [vase seccin 8.3.2]).
Otra necesidad bsica fue el desarrollo de tecnologas de clona
cin de DNA potentes que posibilitaran ensamblar clonas que con
tenan grandes piezas de DNA (g e n o te ca s d e DNA d e in serto
gra n d e). Los insertos de las clonas se haban creado mediante frag
mentacin aleatoria del genoma, pero fue posible estudiarlos para

observar los marcadores de DNA particulares que contenan y ve
rificar si compartan marcadores con insertos en otras clonas. De
ser as, las clonas tenan con frecuencia insertos de DNA superpues
tos y fue posible producir mapas ordenados de clonas de DNA de
acuerdo con la superposicin entre los insertos de DNA, los llama
dos co n tigu o s d e clonas.
8.2.2 El Proyecto del Genoma Humano se llev a cabo

en grandes centros de genoma con capacidades
de secuenciacin de alto rendimiento
Organizacin del Proyecto del Genoma Humano
Si bien el U.S. Human Genome Project proporcion el impulso
inicial para el proyecto del genoma humano consolidado pblica
mente, otros pases desarrollaron con rapidez sus propios proyectos
de genoma humano. Centros en el Reino Unido y Francia se apre
suraron a distinguirse y en fecha ms reciente hubo contribuciones
considerables de centros en otros pases, de forma notable Japn y
Alemania. Con objeto de coordinar los diferentes esfuerzos nacio
nales, se estableci en 1988 la Human Genome Organization
(HUGO, Organizacin d el Genoma Humano) con libertad para fa
cilitar el intercambio de recursos de investigacin, fomentar el de
bate pblico y asesorar en relacin con las implicaciones de la
investigacin del genoma humano (McKusick, 1989).
Debido a la gran escala del proyecto, la tecnologa necesaria pa
ra la secuenciacin del genoma humano se concentr en unos
cuantos centros de genoma muy grandes con capacidades de se
cuenciacin en proporciones industriales (fig. 8-1). La secuencia
cin de DNA basada en el marcado fluorescente automatizado se
constituy en la norma y el advenimiento de la secu en cia ci n d e
DNA basada en ca p ila res (seccin 7.1.2) proporcion un refuer
zo muy necesario para la secuenciacin de alto rendimiento. Para el
PGH cinco grandes centros se encargaron de la mayor parte de la
Fig. 8-1. Secuenciacin de DNA a gran escala en el Wellcome Trust

Snger Institute.
El Wellcome Trust Snger Institute, en Hinxton, Reino Unido, ha sido el
contribuyente independiente principal del Proyecto del Genoma Huma
no patrocinado de forma pblica al que puede tenerse acceso en
http://www.sanger.ac.uk
8.2
FUNDAMENTO Y ORGANIZACIN DEL PROYECTO DEL GENOMA HUMANO
211
........... " ...............

FISH
Hbridos de clulas
somticas
Hbridos por radiacin
Ensamble
de contiguos
Unin de
m ltiples
puntos
(C EPH , etc.)
Unin:
Lods, homocigosidad
de pares de hermanos
M a p a d e arm azn
m a rcad o r-m arca d o r
Localizacin inicial del

gen de enfermedad
Clave:
M apa
gentico
M apa
fsico
U_____
Inform aciones
M to d o s
fsicos
------- M to d o s
g enticos
M a p a del g e n o m a hum ano
S ec u en cia ci n
Identificacin
gnica
J8
N ube
negra
Fig. 8-2. Medidas y mtodos cientficos utilizados en el Proyecto del Genoma Humano.
El principal impulso cientfico para este proyecto se inici con el aislamiento de clonas genmicas y cDNA humanas (mediante clonacin basada en c
lulas o PCR). A continuacin se emplearon para construir mapas genticos y fsicos de alta resolucin antes de obtener el mapa fsico final, es decir, la
secuencia completa de nucletidos de las 3 000 Mb del genoma nuclear. De manera inevitable, el proyecto interactu con la investigacin sobre el tra
peo e identificacin de genes de enfermedades humanas. Adems, proyectos auxiliares incluyeron el estudio de la variacin gentica (el Proyecto de Di
versidad del Genoma Humano; seccin 8.3.7), proyectos de genoma para organismos modelos (seccin 8.4) e investigacin sobre implicaciones
ticas, legales y sociales. Los datos obtenidos se canalizaron hacia bases de datos de mapeo y secuencias que permitieron el acceso y anlisis de da
tos electrnico rpidos. EST, marcador de secuencia expresado; STS, sitio de secuencia marcado.
secuencia, el Wellcome Trust Sanger Institute del Reino Unido y

cuatro centros de Estados Unidos: The Whitehead Institute^Massachussetts Institute of Technology en Massachusetts, Washington University, DoE Joint Genome Institute y Baylor College of Medicine. Al
interactuar con los anteriores y algunos otros grandes centros se
cre una red mundial de laboratorios pequeos que trataban sobre
todo de mapear e identificar genes de enfermedades y de manera
caracterstica se enfocaron en regiones subcromosmicas muy es
pecficas (vase fig. 8 -2 ).
La comunicacin entre la red de centros del genoma y los labo
ratorios adjuntos se basaba (y an ahora) en la comunicacin elec
trnica. La necesidad de manejar y almacenar la enorme cantidad
de datos sobre secuenciacin que se producan con rapidez oblig
a desarrollar grandes bases de datos electrnicas que, cuando me
nos para los esfuerzos de mapeo y secuenciacin patrocinados de
forma pblica, son accesibles a travs de internet. Puede conducir
se as el anlisis desde terminales de computadora remotas en todo
el mundo. Segn fuera el origen de los datos de informacin, se dis
puso de dos tipos de bases de datos:
centrales d e depsito para alm acenar datos sobre mapeo y secuen

ciacin producidos de manera global. Dcadas antes de iniciar
se el proyecto del genoma se establecieron bases de datos de
secuencias de DNA y protenas universales, pero hasta fecha
ms reciente se formaron bases de datos de mapeos especficas
d e especie especializadas, como la G enom e d a ta b a se ( GDB
Base de datos del genoma), una base de datos de mapas diri
gida en particular a almacenar datos sobre mapeo humano
(n ota : existe una nomenclatura especfica para nombrar los
segmentos de DNA y ios genes en diferentes especies; vase
las lecturas adicionales y el recuadro 8-2 para la terminologa
en seres humanos).
bases de datos para almacenar informacin producida a nivel local.
A fin de mejorar su eficiencia, los grandes centros de secuencia
cin de genoma almacenaron los datos obtenidos en sus labora
torios en bases de datos especializadas. A diferencia de la entrada
de datos, es libre el acceso a los datos a travs de la red de los
centros de genoma patrocinados de forma pblica.
212
CAPTULO OCHO
8.3
Cmo se m ape y secuenci

el genom a humano
El Proyecto del Genoma Humano se proyect para 15 aos, de

1990 a 2005, pero el progreso fue ms rpido de lo esperado. Se
desarrollaron mapas genticos antes del tiempo previsto y se fa
cilit la etapa final de la secuenciacin del DNA a gran escala por
los adelantos en secuenciacin de DNA basada en fluorescencia
automatizada y el impulso adicional que result de la competen
cia con una compaa privada, Celera. Alrededor del ao 2003
estaba disponible para todos a travs de internet una secuencia
esencialmente terminada. Vase el recuadro 8-3 acerca de los
aos en que se consiguieron algunos de los principales aconteci
mientos.
8.3.1 Los primeros mapas genticos humanos tiles

se basaron en marcadores microsatlites
La verificacin al inicio de la dcada de 1980 de que ya era asequi
ble la elaboracin de un mapa gentico humano amplio suscit es
fuerzos de consideracin para disear uno. El primero de esos
mapas se public en 1987 y se bas sobre todo en p o lim o rfism o s
d e lo n g itu d d e l fr a g m en to d e restriccin (RFLP). A pesar de su
heroico logro, el mapa de RFLP tuvo limitaciones notorias: el espaciamiento promedio entre los marcadores era considerable y, ms
importante an, los marcadores de RFLP no son muy informativos
(slo dos alelos) y no es tan fcil tipificarlos.
Con posterioridad se desplaz la atencin hacia la elaboracin

de mapas con m a rca d o res m icro sa tlites, cuya ventaja es la de ser
muy informativos, fciles de tipificar y se dispersan en la totali
dad del genoma (vase seccin 9.4.3 y figs. 7-7 y 7-8). En el
transcurso de otros cinco aos, los investigadores del laboratorio
Gnthon en Francia publicaron el primer mapa de enlace del ge
noma humano basado en microsatlites (Weissenbach y cois.,
1992) y dos aos despus un consorcio internacional public un
mapa mejorado, basado en esencia en microsatlites con una den
sidad de marcadores alta, cerca de un marcador cada centimorgan
(cM) (Murray y cois., 1994).
El mapa gentico humano de alta resolucin publicado en 1994
satisfizo el primer objetivo cientfico del Proyecto del Genoma Hu
mano e hizo posible ahora una estructura central importante para
desarrollar mapas fsicos detallados de todos los cromosomas. A
partir de entonces, el principal enfoque del PGH sera desarrollar y
depurar mapas fsicos que condujeran al mapa fsico final, la se
cuencia completa de DNA de cada cromosoma (vase seccin
8.3.2). Pese a ello, el mapeo gentico del genoma humano conti
nu en dos direcciones esenciales:
d ep u ra cin d e m apas m icrosatlites. En la actualidad, el mapa
ms detallado es el elaborado por el grupo gentico deCODE
en Islandia, que incluy la tipificacin de 5 136 marcadores mi
crosatlites en 146 familias, con un total de 1 257 acontecimien
tos meiticos (Kong y cois., 2002).
d esa rro llo d e m apas d e p o litn o rfism o d e n u cle tid o n ico
(SNP) (seccin 8.3.7).
Recuadro 8 2. G e n e s humanos y nomenclatura del segm ento de DNA

La nomenclatura que se utiliza la decidi el comit de momenclatura de HUGO. A los genes y seudogenes suele asignrseles smbolos de dos a seis ca
racteres. Las secuencias de seudogenes se indican con una P despus del smbolo importante del gen. En secuencias de DNA annimas, el convenio
es utilizar D ( = DNA) seguida de 1-22, X o Y a fin de indicar la localizacin cromosmica, a continuacin S para un segmento nico, Z para una fam i
lia de DNA repetido especfica de cromosoma o F para una familia de DNA de mltiples locus, y finalmente un nmero de serie. La letra E despus del
nmero de una secuencia de DNA annima indica que se sabe que se expresa la secuencia.
Smbolo
Interpretacin
CRYB1
Gen para polipptido (3-1 cristalino
GAPD
Gen para deshidrogenasa de gliceraldehdo 3-fosfato
GAPDL7
Gen 7 parecido a GAPD, estado funcional desconocido
GAPDP1
Seudogen GAPD 1
AK1
Gen para cinasa de adenilato, locus 1
AK2
Gen para cinasa de adenilato, locus 2
PGK1*2
Segundo alelo en el locus PGK1
B3P42
Punto de rotura nmero 42 en el cromosoma 3
DYS29
Segmento nico de DNA nmero 29 en el cromosoma Y
D3S2550E
Segmento nico de DNA nmero 2 550 en el cromosoma 3, se sabe que se expresa
D11Z3
Nmero 3 de la familia de DNA repetido especfico del cromosoma 11
DXYS6X
Segmento de DNA en el cromosoma X, con una homologa conocida en el cromosoma Y, y que representa el 6o. par XY homlogo por
clasificar
DXYS44Y
Segmento de DNA en el cromosoma Y, con un homlogo conocido en el cromosoma X, 44o. par XY homlogo
D12F3S1
Segmento de DNA en el cromosoma 12, primer miembro de la familia 3 de mltiples locus
DXF3S2
Segmento de DNA en el cromosoma X, segundo miembro de la familia 3 de mltiples locus
FRA16A
Sitio frgil A en el cromosoma 16
8.3 I CMO SE MAPE Y SECUENCI EL GENOMA HUMANO
213
Recuadro 8-3. Principales acontecim ientos en el mapeo y secuenciacin del genoma humano
1956: Se determin el primer mapa fsico del genoma humano; la m icros
copa de luz de tejido teido revela que las clulas del hombre contienen
46 cromosomas, con un total de 24 tipos diferentes de ellos.
1977: Fred Sanger y sus colaboradores en Cambridge, Reino Unido, pu
blicaron el mtodo de secuenciacin de didesoxi-DNA, que an es la ba
se de la tecnologa de secuenciacin de DNA actual ms de un cuarto de
siglo despus.
1980: Botstein y cois., (1980) advirtieron que era posible construir un ma
pa gentico mediante un grupo de marcadores de DNA aleatorios (RFLP).
1981: Fred Sanger y cois., publicaron la secuencia completa del DNA mitocondrial humano (vase seccin 9.1.2).
1984: Reunin en Alta, Utah, patrocinada de manera parcial por el U.S.
Department of Energy (DoE) para valorar los mtodos de deteccin y ca
racterizacin de mutaciones y proyectar tecnologas futuras. Una conclu
sin principal fue que se requera un programa de secuenciacin de
grandes dimensiones, complejo y caro, para detectar mutaciones con
una gran precisin.
1987: El U.S. Department of Energy Report on a Human Genome Initiative considera tres objetivos principales: creacin de mapas fsicos depu
rados de cromosomas humanos; desarrollo de tecnologas de apoyo y
facilidades para la investigacin del genoma humano; y expansin de las
redes de comunicacin y capacidades de computacin y bases de datos.
1988: Los U.S. National Institutes of Health (NIH) establecen una Office
of Human Genome Research (conocida ms adelante como National
Center fo r Human Genome Research) a fin de coordinar las actividades
sobre genoma de NIH en cooperacin con otras organizaciones estadou
nidenses. La Human Genome Organization (HUGO) se estableci en el
mism o ao para coordinar esfuerzos internacionales y tiene la libertad de
facilitar el intercambio de recursos de investigacin, fomentar el debate
8.3.2 Los primeros mapas fsicos de alta resolucin del

genoma humano se basaron en contiguos de
clonas y referencias de sitios de secuenciacin
marcados (STS)
Mtodos generales en el mapeo fsico del genoma humano
Aunque en la elaboracin de diferentes mapas genticos humanos
se utilizaban distintos tipos de marcadores, hubo un principio sub
yacente comn, los marcadores se tipificaron en miembros de una
variedad de familias de mltiples generaciones y se introdujeron los
datos en la computadora para buscar marcadores con alelos de cosegregacin. El mapeo fsico es diferente porque son posibles mu
chos tipos distintos de mapa (vase cuadro 8-1). El primer mapa
fsico del genoma humano se bas en bandeo cromosmico y se ob
tuvo hace ms de 40 aos (vase fig. 2.14 para ver un ejemplo mo
derno de un mapa de bandeo cromosmico).
Si bien la resolucin es burda, los mapas citogenticos propor
cionaron un armazn general muy til para ordenar las secuencias
de DNA humano mediante hibridacin in situ y los puntos de rocura citogenticos definidos suministraron herramientas para el
mapeo adicionales. De igual modo, se generaron m apas d e restric
ci n d e lm ites la rgos al emplear nucleasas de restriccin de corte ra
ro, por ejemplo, para producir un mapa de restriccin NoA de 2 1 q
(Ichikawa y cois., 1993). No obstante, en el contexto del PGH, el
primer mapa fsico de alta resolucin del genoma humano fue po
pblico y asesorar sobre las implicaciones de la investigacin del geno

ma humano (McKusick, 1989).
1990: Lanzamiento oficial del Proyecto del Genoma Humano (PGH) des
pus de autorizar un proyecto de tres mil millones de dlares para 15
aos en Estados Unidos.
1991: Se establece la Genome Database (GDB), una reserva para datos
sobre el mapeo del DNA humano.
1992: Jean Weissenbach y cois., del laboratorio Gnthon de Francia pu
blican el primer mapa de enlace gentico humano amplio basado en mar
cadores microsatlites (Weissenbach y cois., 1992).
1993: Daniel Cohn y cois., del laboratorio Gnthon de Francia publican
un mapa fsico de primera generacin del genoma humano, basado en In
sertos de clonas de DNA grandes (Cohn y cois., 1993).
1995: Eric Lander y colegas del Whitehead Institute/Massachusetts Institute
of Technology publican el primer mapa fsico detallado del genoma humano,
basado en sitios de secuenciacin marcados (Hudson y cois., 1995).
1998: Un consorcio internacional dirigido por investigadores del Sanger
Centre de Inglaterra (Deloukas y cois., 1998) publica el GeneMap '98, el
primer mapa razonablemente amplio de marcadores basados en genes.
1999: Un consorcio internacional dirigido por investigadores del Sanger
Centre, Inglaterra, publica la primera secuencia completa de un crom oso
ma humano, el cromosoma 22 (Dunham y cois., 1999).
2001: Publicacin de esquemas de trabajo generales acerca de la secuen
cia del genoma humano (que comprende alrededor de 90% de la secuen
cia total) por un consorcio internacional de investigadores patrocinados
con recursos pblicos y por una compaa privada, Celera (International
Human Gene Sequencing Consortium, 2001; Venter y cois., 2001).
2003: Se termina la secuencia del genoma humano.
sible tras establecer g e n o te ca s d e clo n a s d e DNA g e n m ico me

diante clonas de DNA basadas en clulas (vase en la seccin 5.3.4
los principios generales). Una vez que se dispuso de ellas, fue facti
ble seleccionar las genotecas con la finalidad de identificar clonas
individuales que pudieran agruparse a continuacin en grupos de
clonas con insertos originados del mismo cromosoma y regin subcromosmica. Por ltimo, sera posible organizar las clonas en grupos
que abarcaran regiones subcromosmicas grandes y al final cromo
somas completos.
Para preparar genotecas de clonas de DNA genmico fue habi
tual comenzar con una lnea celular permanente (linfoblastoide) pa
ra proporcionar una fuente continuamente renovable de una
poblacin celular homognea. Despus de aislar el DNA genmico
de la lnea celular con mtodos estndar, se corta el DNA con una
nucleasa de restriccin y se clona en un vector apropiado a fin de
preparar la genoteca de DNA genmico de eleccin. Por lo general,
los intentos iniciales usaban vectores lambda y csmido para crear
genotecas con insertos entre 15 y 40 kb (seccin 5.4.2). Los inser
tos de clonas podan seleccionarse (al inicio mediante hibridacin
con una clona de cDNA pequea aislada de forma previa, pero en
fecha ms reciente con PCR) y a continuacin mapearse con facili
dad a una regin subcromosmica mediante h ib rid a ci n crom osm ica in situ (vase figs. 2-16 y 2-17; nota: el mapeo de clonas de
cDNA mucho ms cortas mediante su hibridacin a cromosomas
de metafase fue mucho ms difcil a nivel tcnico que mapear grandes
clonas genmicas y casi nunca se intent).
214
CAPTULO OCHO i PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
Cuadro 8-1. Es posible utilizar diferentes tipos de mapas fsicos para trazar el mapa del genoma nuclear humano.
Tipo de mapa
Ejemplos/metodologa
Resolucin
Citogentico
Mapas de bandeo cromosmico
Una banda promedio tiene varios Mb de DNA
Mapas de punto de rotura

cromosmica
Grupos de clulas hbridas somticas que contienen frag

mentos de cromosomas humanos derivados de transloca
cin o delecin cromosmicas naturales
La distancia entre puntos de rotura cromosmicos

adyacentes en un cromosoma suele tener varios Mb
Mapas de hbridos por radiacin (HR) monocromosmcos
La distancia entre puntos de rotura tiene con fre

cuencia muchos Mb
Mapas de HR del genoma completo
La resolucin puede ser tan alta como 0.5 Mb
Mapa de restriccin
Mapas de restriccin de cortador raro, p. e j mapas Not\
Varios cientos de kb para mapas de restriccin de

cortador raro
Mapa de contiguo de clona
Clonas YAC superpuestas
El inserto promedio de YAC tiene varios cientos de

kb de DNA
Clonas csmidas superpuestas
El inserto csmido promedio es de 40 kb
Mapa de STS (sitio de secuen

cia marcado)
Requiere informacin de secuencia previa de clonas orde

nadas de tal modo que puedan ordenarse los sitios de se
cuencia marcados (STS)
Es posible menos de 1 kb. pero los mapas estndar

de STS tienen resoluciones de decenas de kb
Mapa de EST (marcador de

secuencia expresado)
Requiere secuenciacin de cDNA y a continuacin otra vez

mapeo de los cDNA para otros mapas fsicos
La resolucin promedio del genoma nuclear humano

es - 9 0 kb
Mapa de secuencia de DNA
Secuencia completa de nucletidos de DNA cromosmico
1 pb
En las primeras genotecas de DNA genmico humano, la in

mensa mayora de las clonas era annima (porque se desconoca la
identidad de su DNA insertado) y careca de mapeo. De modo gra
dual se caracterizaron cada vez ms clonas de cDNA diferentes, lo
que permiti identificar las clonas de DNA genmicas correspon
dientes (afines) y en seguida mapearse en regiones subcromosmicas (fue ms fcil caracterizar clonas de cDNA porque tenan
insertos cortos que podan secuenciarse con relativa rapidez y las
genotecas eran menos complejas, con tipos particulares de clonas
que a menudo predominaban por expresin gnica diferencial, por
ejemplo, transcritos de globina en muestras de sangre).
Con objeto de ayudar a mapear clonas de DNA genmico hu
mano, se desarrollaron mtodos adicionales, entre ellos los si
guientes:
en riq u ecim ien to d e l DNA d e in icio. En lugar de usar DNA
del genoma completo, se purificaron cromosomas individuales
mediante cito m etra d e flu jo con los mismos principios em
pleados para fraccionar clulas en un seleccionador celular
FACS. Tras reunir suficientes nmeros de un tipo particular de
cromosoma, se crearon g e n o te ca s d e DNA esp ecfica s d e cr o
m osom a (Davies y cois., 1981). Adems, los procedimientos
de m icro d isecci n cro m o sm ica hicieron posible elaborar ge
notecas de DNA a partir de DNA aislado de una regin subcromosmica especfica (Ludecke y cois., 1989).
m a p eo d e clu la h b rida . Despus de secuenciar un tramo cor
to al final de una clona genmica se dise una valoracin de
PCR para esta secuencia especfica y a continuacin se utiliz
para tipificar un grupo de clulas hbridas ideadas para carecer
de ciertos cromosomas o regiones subcromosmicas humanos
(vase recuadro 8-4).
u n in g e n tica a un fragmento de DNA colocado con anterio

ridad en el mapa fsico mediante una de las diversas tcnicas de
mapeo descritas.
Mapa fsico dei genoma humano basado en cromosomas

artificiales de levadura (YAC)
Al inicio del Proyecto del Genoma Humano en 1990, las genote
cas de DNA genmico disponibles contenan insertos hasta de 40
kb de largo (clonas csmidas), que en la inmensa mayora de los ca
sos eran annimos y no estaban mapeados en gran parte. Debido al
tamao muy grande del genoma humano, una genoteca csmida,
con un tamao de inserto promedio de unos 40 kb, requerira va
rios cientos de miles de clonas diferentes a fin de asegurar una pro
babilidad alta, que se aproximara al 100 %, de que el genoma se
representara en la genoteca. Seleccionar estas genotecas complejas a
fin de aislar clonas individuales y organizar estas ltimas en grupos
relacionados eran labores atemorizantes.
Para reducir el problema de seleccionar nmeros inmensos de
clonas y facilitar su organizacin en grupos relacionados resultaban
atractivos los sistemas de clonacin que ofrecan insertos de tama
os muy grandes. Se desarrollaron mtodos novedosos con la fina
lidad de lograr este objetivo y se obtuvieron cromosomas eucariotas
artificiales. El sistema cromosmico se bas en cromosomas de le
vadura lineales en los que se saba que slo eran indispensables se
cuencias muy pequeas para la funcin del cromosoma. Mediante
la purificacin de estas secuencias y tras combinarlas a continua
cin con fragmentos de DNA humano grandes fue posible hacer
molculas hbridas que contenan insertos humanos del tamao de
megabases, pero que se comportaban an como cromosomas en
8.3
CMO SE MAPE Y SECUENCI EL GENOMA HUMANO
215
Recuadro 8-4. Mapeo de clulas hbridas

PRINCIPIOS BSICOS DE HBRIDOS DE CLULAS SOMTICAS
Bajo ciertas condiciones experimentales es posible inducir la fusin entre
s de clulas cultivadas de diferentes especies, lo cual crea hbridos de
clulas somticas. Para propsitos de mapeo humano, las clulas hbri
das se preparan de manera caracterstica al fusionar clulas humanas
con clulas de roedores (ratn o hmster). Los productos iniciales de la
fusin se denominan heterocariones, porque las clulas contienen un n
cleo humano y otro de roedor. Por ltimo, los heterocariones prosiguen
hacia la mitosis y se disuelven las dos envolturas nucleares. Ms adelan
te se unen entre s los cromosomas humanos y de roedor en un solo n
cleo. Estas clulas hbridas son inestables. Por razones desconocidas, la
mayor parte de los cromosomas humanos no se replica en rondas sub
secuentes de divisin celular y se pierde. Esto da lugar al final a una va
riedad de lneas celulares hbridas ms o menos estables, cada una de las
cuales contiene un juego completo de cromosomas de roedor adems de
unos cuantos tipos de cromosomas humanos (vase la primera figura del
recuadro). En esencia, los cromosomas humanos se pierden en forma
aleatoria, pero pueden controlarse mediante seleccin.
Es posible emplear grupos de clulas hbridas con diferentes subgrupos
de cromosomas humanos para mapear un gen o una secuencia de DNA
humano de un cromosoma humano especfico. Sin embargo, es ms efi
ciente usar grupos de hbridos monocromosmicos (clulas que slo
contienen un tipo aislado de cromosoma humano), que representan en
conjunto todos los 24 tipos de cromosomas humanos (Cuthbert y cois.,
1995). Para formar un hbrido monocromosmco se exponen clulas hu
manas de donador a colcemida, lo que causa que se divida el juego de
cromosomas en paquetes subnucleares menores (m icro ncleos). La
centrifugacin subsecuente puede precipitar la formacin de m icroclulas que consisten en un microncleo aislado con un anillo delgado de ci
toplasma, rodeado por una membrana plasmtica intacta. Se fusionan las
microclulas con clulas de roedor receptoras (fusin microcelular) a fin
de generar hbridos, algunos de ellos con un cromosoma humano aisla
do (vase, por ejemplo, Warburton y cois., 1990).
HBRIDOS POR RADIACIN
Tambin es posible mapear un gen o una secuencia de DNA humano a
una localizacin subcromosmica mediante grupos de hbridos por ra
diacin, clulas hbridas que contienen fragmentos de cromosomas hu
manos integrados con un juego completo de cromosomas de roedor. Los
fragmentos de cromosomas humanos se generan al someter las clulas
del donador a una dosis letal de radiacin que provoca roturas cromosmicas (el tamao promedio del fragmento depende de la dosis de radia
cin). Despus de radiar las clulas del donador se fusionan con clulas
del roedor receptor y se usa un sistema de seleccin para tomar las c
lulas del receptor que captaron algunos de los fragmentos cromosmicos
del donador (vase Walter y cois., 1994).
Con anterioridad se utilizaban grupos de hbridos por radiacin mono
cromosmicos en los que la linea celular donadora era un hbrido monocromosmico: en este caso se integraran fragmentos del tipo aislado de
cromosoma humano a fragmentos de los cromosomas de roedor rotos en
el juego de cromosomas de roedor de la clula receptora (Cox y cois.,
1990). Se superaron por grupos de hbridos por radiacin del genoma
completo en los que el donador es una clula diplode humana normal
radiada (Walter y cois., 1994). En cualquier hbrido, slo se integra una pro
porcin de las piezas de los cromosomas humanos rotos y, por consiguien
te, los diferentes hbridos poseen distintas fracciones del genoma humano
integrado en el juego de cromosomas del roedor receptor.
Un mapa hbrido por radiacin (HR) puede elaborarse al tipificar un gru
po de hbridos con un juego de marcadores de DNA humano. Debido a
que los hbridos individuales tienen diferentes subgrupos del genoma hu
mano pero superpuestos, se encuentran los distintos marcadores en
C lu la h u m a n a
C lu la d e rat n o h m s te r
P rd id a a le a to ria
d e c ro m o s o m a s
h u m an o s
S lo u n o s c u a n to s
c ro m o s o m a s
hum anos
J u e g o c o m p le to d e
c ro m o s o m a s
d e ro e d o r
H b rid o d e c lu la s o m tic a e s ta b le
P rin cip io de hbridos de clulas som ticas.

algunos hbridos aunque no en otros. Aunque el patrn de integracin de
los fragmentos es sobre todo aleatorio, marcadores individuales propor
cionan patrones de tipificacin relacionados si se localizan com o vecinos
cercanos en un cromosoma particular. El principio de un mapa hbrido
por radiacin recuerda el anlisis de enlace meitico (cap. 13): cuanto
ms cerca se encuentren entre si dos secuencias de DNA en un crom o
soma, ms baja es la probabilidad de que se separen por la ocurrencia al
azar de un punto de rotura entre ellas. La frecuencia de rotura cromosmica entre dos marcadores puede definirse por un valor o, anlogo a la
frecuencia de recombinacin en el mapeo meitico. El valor o vara de ce
ro (los dos marcadores nunca se separan) a 1.0 (los dos marcadores
siempre se separan).
Al igual que en el mapeo meitico, theta subestima la distancia entre mar
cadores que estn muy apartados en el mismo cromosoma, en este ca
so debido a que la clula puede captar dos marcadores en fragmentos
separados. Una estimacin ms precisa la proporciona una funcin de
mapeo de HR, D = ln(1 o), que es anlogo a la funcin de mapeo
Haldane que se utiliza en el anlisis de enlace meitico (seccin 13.1).
D se mide en centiRays (cR) y depende de la dosis de radiacin, de tal
manera que se contrasta contra el nmero de rads. Por ejemplo, una dis
tancia de 1 cRgooo entre dos marcadores representa una frecuencia de 1 %
de rotura entre ellos despus de exponerse a 8 000 rads de rayos X.
En el Proyecto del Genoma Humano son en particular im portantes dos
grupos de hbridos por radiacin. El grupo Genebridge 4 consiste en 93
hbridos por radiacin ser hum ano-criceto con un tamao promedio del
fragmento humano de 25 Mb y 32% de retencin de cualquier secuen
cia humana particular en cada hbrido. Los laboratorios pueden mapear
216
CAPTULO OCHO
Recuadro 8-4. (con tinuaci n)

cualquier STS desconocido al calificar los hbridos 93 Genebridge y
com parar el patrn con los patrones de marcadores mapeados antes,
que se conservan en un servidor central (figura, parte inferior). Un se
gundo grupo ser humano-criceto, el Grupo Stanford G3, se llev a ca
bo tras utilizar una dosis de radiacin ms alta, de tal manera que el
tamao promedio del fragmento humano fue ms pequeo. Los 83 h
bridos en G3 tienen un promedio de 16% de retencin del genoma hu

mano, con un tamao promedio del fragmento de 2.4 Mb. Por consi
guiente, puede utilizarse G3 para un mapeo ms fino. Es posible tener
acceso a los impresionantes resultados del uso a gran escala de estos
grupos en http:w w w.ncbi.nlm .nih.gov/genem ap98/ (Deloukas y cois.,
1998).
Fusionar con clulas TK

hm ster
Dosis letal de
Fibroblastos humanos
normales
radiacin
Clulas con cromosomas

fragm entados
de
C lulas hbridas
(TK+)
Mapeo de HR en laboratorio perifrico
S TS por m apear
S eleccionar 100 a 200 hbridos
diferentes (cada uno conserva
25 a 3 0 % del g enom a hum ano
en fragm entos pequeos)
C rom osom as de ratn que contienen
fragm entos d e D N A hum ano integrados ()
PCR am plifica STS

en cada hbrido
Igualar
patrn
H ibridar con
STS m apeados
conocidos
Base de datos sobre

servidor central
Localizacin
Mapeo de hbrido por radiacin.
clulas de levadura, los llamados cromosomas artificiales de leva

dura (YAC; vase la seccin 5.4.4 para ms detalles).
Las genotecas de YAC con un tamao promedio de inserto, por
ejemplo de 1 Mb, requeriran cerca de 12 000 a 15 000 clonas slo
para ser razonablemente representativas del genoma humano y ten
dran la ventaja de permitir incluir en una clona aislada genes gran
des (aunados a grupos de genes u otros segmentos funcionales).
Con base en este razonamiento, Daniel Cohn y colaboradores del
laboratorio CEPH de Pars elaboraron un mapa del genoma huma
no basado en YAC, el primer mapa fsico de alta resolucin ms o
menos detallado (Cohn y cois., 1993). De manera subsecuente, el
mismo grupo public un mapa de YAC actualizado que inclua tal
vez 75% del genoma humano y consista en 225 contiguos con un
tamao promedio de 10 Mb (Chumakov y cois., 1995).
El principio subyacente en los mapas de YAC (y todos los otros
mapas fsicos basados en clonas), es ordenar las clonas en la genote
ca a partir de la regin subcromosmica de origen para los insertos
de DNA. El mapa se construye al definir grupos de clonas en las
que el inserto de DNA deriva de una regin subcromosmica comn

y en los que el inserto de DNA de cualquier clona se superpone en
el inserto de DNA de algunas otras clonas en el grupo de clonas.
Esto significa que la regin subcromosmica relevante est repre
sentada por una disposicin lineal de clonas superpuestas en parte
sin dejar ningn intersticio. Este grupo contiguo de secuencias de
DNA clonadas se denomina contiguo de clona (vase recuadro 8-5).
Mapa del sitio de secuencia marcado (STS) del genoma

humano de alta resolucin
La precisin de los mapas de contiguo de clona depende en esencia
del grado al cual el DNA de la clona insertado representa en reali
dad la secuencia genmica original. A pesar de que el mapa de YAC
humano fue un logro impresionante, hubo reas considerables del
genoma no representadas en el mapa y una limitacin inherente
notable: muchas veces los DNA insertados no eran representacio
nes fieles del DNA genmico. Los insertos grandes de YAC son
8.3
propensos a reordenamientos (que incluyen prdida de secuencias

internas) y se observ un problema de consideracin con el q u im erism o (en el que una clula aislada transformada contena dos o
ms piezas de DNA humano de porciones no contiguas del geno
ma, a menudo de diferentes cromosomas, como resultado de coli
gadura o cotransformacin; vase respectivamente figs. 5-5A y 5-5B).
Para prevenir posibles problemas consecutivos a la falta de fidelidad
de insertos de la clona, las medidas de mapeo fsico del PGH insistie
ron, asimismo, en la necesidad de elaborar mapas basados en sitios de
secuencia marcados (STS; vase recuadro 5-4). Con una densidad su
ficientemente alta de STS notables poda evitarse el problema de la
inestabilidad del inserto en genotecas de YAC: un gran nmero de STS
significara que la cobertura fsica de cualquier regin problema podra
restablecerse con rapidez al tipificar STS de otros tipos de clonas (BAC,
Pl, PAC, etc.). Con base en este razonamiento, Eric Lander y colabo
radores del Whitehead Institute of Biomedical Research and Massachusetts Institute of Technology publicaron el logro sobresaliente de
un mapa de STS humano con ms de 15 000 STS y un espaciamiento promedio de menos de 200 kb (Hudson y cois., 1995).
El mapa de STS humano fue un mapa fsico integrado en el cual
los STS se utilizaron para tipificar: a) un grupo de clu las hbridas
p o r ra diacin humanas (vase recuadro 8-4); y b) la genoteca CEPH
YAC. Los marcadores de los STS fueron de dos tipos, no polimrficos y polimrficos. Los marcadores STS no polimrficos incluyeron
STS derivados mediante la secuenciacin aleatoria de clonas genmicas y a continuacin se elaboraron cebadores de PCR de regiones no
repetidas y STS seleccionados de secuencias de cDNA (con cebadores
correspondientes a secuencias no separadas por un intrn), los llama
dos m arcadores d e secu en cia expresados o EST (vase seccin
8.3.4). Los marcadores de STS polimrficos consistieron en esencia en
marcadores microsatlites, a la mayora de los cuales los haba utiliza
do el grupo Gnthon en el mapeo gentico humano.
El mapa de STS publicado por Hudson y colaboradores (1995)
proporcion un esquema fsico extenso del genoma humano y, de
bido a que inclua ms de 2 400 EST, suministr asimismo un ma
pa gnico humano embrionario. En adelante, el enfoque del proyecto
del genoma humano sigue dos direcciones: creacin de mapas gnicos (transcritos) de alta resolucin y uso del mapa de STS existente
a fin de proporcionar una estructura para construir contiguos de
clonas mediante clonas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC).
8.3.3 La etapa final del Proyecto del Genoma Humano

dependi en vital medida de los contiguos
de clonas BAC/PAC
Mtodos de secuenciacin
Debido a que los insertos de YAC no son con frecuencia represen
taciones fidedignas del DNA de inicio original, se requeran mapas
de contiguos de clonas del genoma humano de segunda generacin
con objeto de suministrar el DNA humano clonado a secuenciar.
Se seleccionaron cromosomas artificiales BAC y P l (PAC) como
sistemas de clonacin porque si bien el tamao de sus insertos (100
a 250 kb) es mucho ms pequeo que los de YAC, esta desventaja
es ms que superada por la mayor fidelidad del inserto (vase sec
cin 5.4.3). Por consiguiente, podra utilizarse como plantilla fsi
ca para secuenciacin una variedad de diferentes BAC humanos y
en menor grado genotecas de cromosomas artificiales Pl (PAC).
El mtodo de secuenciacin que se us en el Proyecto del Ge
noma Humano consolidado se bas en secuenciacin en escopeta
217
zo jerrquica (en contraste, Celera emple una medida de secuen

ciacin en escopetazo del genom a completo; vase fig. 8-3). Secuen
ciacin en escopetazo significa que se corta de manera aleatoria un
DNA de inicio en fragmentos pequeos, de modo caracterstico
mediante sonicacin seguida de reparacin del extremo y los frag
mentos resultantes se clonan en un vector a partir del cual es posi
ble preparar DNA recombinante de cadena nica con facilidad y
usarse de forma directa en la secuenciacin (vase recuadro 7-1).
En el mtodo de secuenciacin en escopetazo jerrquica, el DNA uti
lizado para secuenciacin en escopetazo son los insertos purificados
de clonas de BAC individuales que se colocaron con precisin en un
mapa fsico; en contraste, la secuenciacin en escopetazo del genoma
completo comprende la secuenciacin en escopetazo de manera di
recta del DNA genmico aislado (fig. 8-3).
La base de la metodologa de secuenciacin usada en la secuen
ciacin del genoma humano fue el mtodo de dideoxisecuenciacin que desarrollaron hace un cuarto de siglo Fred Sanger y
colaboradores. Aunque no haba cambiado el mtodo subyacente,
se introdujeron varios adelantos en la eficiencia al automatizar va
rios aspectos de la generacin de secuencias y el anlisis de datos. El
desarrollo de secuenciadores de DNA automatizados basados en
marcado fluorescente y despus secuenciadores capilares (vase sec
cin 7.1.2) permiti rendimientos de secuenciacin mucho ms al
tos. Varios programas de computadora especiales ayudaron a la
interpretacin y ensamble de secuencias, en especial el PHRED
(que analiza trazos de secuencias crudas y proporciona una califica
cin de calidad en cada posicin de base a fin de indicar con un gra
do de confianza que la llamada base asignada es correcta) y el
PHRAP (que ensambla secuencias crudas en contiguos de secuen
cias tras seleccionar secuencias superpuestas compartidas por dos o
ms clonas independientes en escopetazo).
El problema con el DNA repetido

El ensamble de secuencias de clonas individuales para identificar
superposiciones (y por consiguiente reconstruir la secuencia del
genoma) depende de modo decisivo de una suposicin importan
te: las secuencias superpuestas estn representadas de form a singular
dentro del genoma. Sin embargo, una fraccin muy grande (cerca
de 50%) del genoma humano se integra con DNA repetido (sec
ciones 9.4 y 9.5). Se conocan bien clases de DNA entremezcladas
muy repetidas, por ejemplo las repeticiones LINE-1 y Alu y, en
consecuencia, se evitaron siempre que fue posible cuando se bus
caban pruebas de superposiciones importantes entre las secuencias
de clonas.
A pesar de las precauciones anteriores, resultaran problemticas
reas muy ricas en secuencias repetidas conocidas, en tanto que otra
preocupacin era la de repeticiones de nmeros de copias bajas no iden
tificadas con anterioridad (una preocupacin muy real ya que de ma
nera subsecuente se encontr que una fraccin valorable del genoma
haba sufrido duplicacin segmentaria, con secuencias que abarcaban
decenas de kilobases y en ocasiones cientos de kilobases presentes en
dos o ms regiones del genoma; vase seccin 12.2.5). Cuando me
nos en el PGH, el mtodo de clonacin en escopetazo jerrquica fa
cilit el ensamble de secuencias, en tanto que el de clonacin en
escopetazo del genoma completo utilizado por la compaa privada
Celera implicaba grandes demandas en potencia de computacin y
los crticos argumentaron que si se empleaba en el aislamiento esta me
dida, estaba condenada a fracasar por la complejidad y el alto conte
nido de repeticiones en el genoma humano (vase recuadro 8 -6 ).
218
CAPTULO OCHO
Recuadro 8-5. Mapeo fsico mediante formacin de contiguos de clonas

La elaboracin de genotecas de DNA genmico incluye una digestin de
restriccin parcial del DNA por clonar controlada de manera cuidadosa.
De forma caracterstica, la enzima que se emplea para producir fragmen
tos de restriccin del DNA de inicio es Mbo\ que identifica una secuencia
de reconocimiento de 4 pb (IGATC) y cabra esperar que, en promedio,
cortara el DNA una vez cada 300 pb. En lugar de exponer el DNA de ini
cio a concentraciones muy bajas de la enzima y por perodos cortos, s
lo se corta un nmero muy pequeo del total de sitios de restriccin
disponibles. Por ejemplo, cuando se preparan genotecas de BAC, el ta
mao del fragmento de clonacin deseado tiene alrededor de 200 kb y a
fin de lograrlo deben cortarse menos de 1% de los sitios Mbo\ disponi
bles para corte.
tados por millones de copias idnticas del par original de molculas de

DNA cromosmico. Sin embargo, cuando se someten a digestin por
restriccin parcial, se cortan de manera aleatoria las molculas de DNA.
En consecuencia, para cualquier regin subcrom osmica determinada, el
milln de molculas importantes revela diferentes patrones de corte de
sitio de restriccin (vase figura, parte superior).
Como resultado de la digestin por restriccin parcial, se generan frag
mentos diferentes que poseen secuencias superpuestas derivadas de la
misma regin subcromosmica. Aunque los fragmentos individuales se
clonan en diferentes clulas husped, es posible identificar clonas con in
sertos superpuestos al seleccionar similitudes entre los insertos de distin
tas clonas y definir al final un juego de clonas con insertos superpuestos
de tal manera que est representada toda la secuencia original de DNA en
la regin cromosmica, sin vacos, dentro de los insertos de este grupo
de clonas, un llamado contiguo de clona (vase figura, parte media).
El DNA de inicio se consigue de millones de clulas diploides y por lo tan

to cada uno de los 23 tipos originales de molcula de DNA humano (que
corresponden a los 23 tipos diferentes de cromosomas) estn represen
DNA de inicio: una poblacin de m olculas de DNA
C orte parcial (aqu = una vez cada

15 sitios en promedio)
Fragm entos su p erp u e sto s --------- Clona en diferentes clulas

Dibujo superior. Generacin de fragmentos de DNA superpuestos mediante corte de restriccin parcial.
Dibujo en medio. Un contiguo de clona (una serie de clonas con insertos de DNA superpuestos de modo parcial).
TG F
a
MAD
327
AN X
IV
2115
2113
291
21 1
2109
2112
145
EGR ACTA3 2116 2114
90
H10
HKZ
286
967b10
432a12
-( )----- ( h
973c8 -
682g6 -
-< h
772h3 -
-< )----- ( h
792f4
850q4 -
------ ( h
-i )----- ( h
747f5 * 941 g 2 7 6 3 h 1 0 ---------( ) -
-i h
-i h
D ibujoinferior. Ejemplo de un contiguo de STS eneilcrom osom a2.

Los marcadores en la parte superior incluyen STS de genes (TGFa, MAD, etc.) y asimismo marcadores annimos (D2S327, D2S2115, etc., que se abre
vian aqu al eliminar el prefijo D2S). Las clonas son de YAC y los parntesis indican ausencia de STS esperado, con mayor probabilidad com o resulta
do de reordenamientos internos del cromosoma artificial de levadura (YAC).
8.3
;. - w
' -
' C- ' . W ;
y, ' 1
-- '
-- - ' '
219
'
Recuadro 8 5. (c o n tin u a c i n )
Las clonas con insertos superpuestos pueden identificarse en diferentes
formas. En el caso del mapa de YAC humano (seccin 8.3.2) se recono
cieron las clonas superpuestas mediante hibridacin clona con clona
(con una sonda formada a partir de un YAC para hibridar opuesta a las
otras clonas YAC) o una huella digital de clona (tras comparar clonas
para observar si comparten patrones caractersticos de espaciamiento de
secuencias repetidas o sitios de restriccin particulares). En fecha ms
A)
reciente, el mtodo preferido ha sido el mapeo del contenido de STS.

como se demostr en el mapa STS publicado por Hudson y colaborado
res (1995). En este caso, todas las clonas se tipifican para la presencia
de cada uno de un grupo de marcadores de sitio de secuencia marca
do y a continuacin se segregan en grupos, sea que las clonas conten
gan dos o ms marcadores de STS especficos en comn (vase figura,
dibujo inferior).
Escopetazo jerrquico
B)
Escopetazo de genoma completo
G enom a
C o n tig u o d e clo n a s d e in s erto g ra n d e
F ra g m e n ta c i n a le a to ria
S e c u e n c ia c i n y
e n s a m b le
A n c la je
E n s a m b le d e l g e n o m a
Fig. 8-3. Diferentes medidas de secuenciacin en escopetazo para secuenciar el genoma humano.
A) Secuenciacin en escopetazo jerrquica. Se fragmenta el DNA genmico humano mediante digestin por restriccin parcial y los fragmentos de
restriccin grandes resultantes se clonan en vectores BAC a fin de generar una genoteca de clonas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC). Las
clonas de BAC se organizan en contiguos grandes tras tipificar todas las clonas mediante marcadores STS a fin de identificar clonas con insertos super
puestos. Los insertos de clonas de BAC seleccionados se clonan y secuencian en escopetazo. Los fragmentos secuenciados de un BAC se ensamblan
a continuacin para dar la secuencia de BAC y se integran secuencias completas de BAC con objeto de eliminar superposiciones. B) Secuenciacin en
escopetazo del genoma completo. En este caso, se enva de modo directo DNA genmico aislado para clonacin y secuenciacin en escopetazo y las
piezas secuenciadas se ensamblan en contiguos grandes que abarcan megabases. Adaptado de Waterston y cois., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 2002; 99,
p. 3713, con autorizacin de la National Academy of Sciences, USA.
8.3.4 Los primeros mapas de genes humanos de alta

densidad se basaron en marcadores
de secuencias expresados (EST)
Al inicio del PGH se discuti con amplitud la decisin de abarcar
la totalidad (secuenciacin de tres mil millones de bases) o enfocar
se primero en una fraccin muy pequea que representaba la se
cuencia del DNA de codificacin, que era con mucho la parte ms
interesante y de relevancia mdica. Quienes apoyaron la secuencia
cin del genoma completo predominaron al final en la discusin y
resaltaron que podra ser difcil encontrar todos los genes (algunos
genes pueden tener una expresin muy restringida) y que cierto
DNA no codificante posee importancia funcional, por ejemplo en
el caso de elementos reguladores y secuencias esenciales para la fun
cin cromosmica. No obstante, en los aos iniciales del proyecto,

los intereses comerciales competidores tornaron una prioridad el
hallazgo de genes.
Un mtodo inicial incluy la secuenciacin a gran escala de
secuencias cortas en las regiones no traducidas 3' (RNT) de clo
nas de cDNA que se haban seleccionado de modo aleatorio de
una diversidad de genotecas de cDNA humano (Adams y cois.,
1991). Estas secuencias cortas se describieron como marcadores
de secuencia expresados (EST) porque, al igual que para los si
tio s d e secu en cia m a rca d o s ms generales, la secuencia permita
disear una valoracin especfica de PCR para la secuencia expre
sada (las secuencias genmicas que especifican secuencias de RNT
3' estn separadas de manera menos comn por intrones que el
DNA codificante y en consecuencia los cebadores de PCR de un
220
CAPTULO OCHO
Recuadro 8 - 6 . Cooperacin, com petencia y controversia en proyectos del genoma

Cooperacin y competencia en proyectos de genomas patrocinados de
forma pblica
Debido a su escala, los proyectos de genomas son empresas mayores.
En muchos casos hubo loables intentos de cooperacin: com partir recur
sos entre diferentes centros y laboratorios, subdivisin acordada de dife
rentes labores del proyecto, etc. El proyecto del genoma de la levadura
fue un excelente ejemplo que incluy la cooperacin muy organizada en
tre distintos centros europeos que se extendi de forma subsecuente a la
cooperacin en el anlisis funcional. En otros casos suelen ser obvias las
tensiones com o resultado de la feroz competencia entre diferentes labo
ratorios y la duplicacin desperdiciada de esfuerzo, por ejemplo en el pro
yecto del genoma de E. coli. En este caso se desarroll una carrera de
competencia entre estadounidenses y japoneses que condujo a un final
muy cerrado: el laboratorio estadounidense deposit su secuencia en el
GenBank una semana antes que el grupo japons.
Tensiones entre los sectores pblico y privado: patentes gnicas
Las diferentes prioridades de los sectores pblico y privado provocaron
puntos de tensin en los proyectos del genoma. Un rea inicial de dispu
ta se relacion con las patentes gnicas. El primer problema se presen
t en 1991, cuando el U.S. NIH solicit las patentes de ms de 7 000
fragmentos de clonas de cDNA del cerebro humano, cuyas secuencias se
haban establecido como parte de un ejercicio de mapeo de EST condu
cido por Craig Venter. Este intento se encontr con la amplia oposicin de
la comunidad-cientfica, en especial porque no se saba nada sobre las
funciones de las secuencias expresadas. Bajo presin, la oficina estadou
nidense de patentes rechaz las solicitudes. Surgi por primera vez una
nueva pregunta importante: guin es el propietario del genoma huma
no? (vase Thomas y cois., 1996). As, a muchas personas la idea del
monopolio comercial de lo que es tan slo la herencia gentica del hom
bre les pareci alarmante y ofensiva.
Con posterioridad, Venter dej los NIH para establecer un nuevo institu
to con respaldo comercial, el Institute of Genome Research, adopt una
conducta fabril para la secuenciacin de EST y reuni en poco tiempo el
m ayor banco de datos sobre genes humanos del mundo. En abril de
1994 la compaa farmacutica SmithKIine Beecham invirti 80 millones
de libras esterlinas para un inters exclusivo en la base de datos de Ven
ter y anunci a los cientficos que slo podran tener acceso a l si acep
taban conceder los primeros derechos a cualquier descubrimiento
patentable. Una vez ms, la posibilidad de una corporacin que intenta
ba monopolizar el control de una gran parte del genoma humano expre
sado alarm a la comunidad cientfica. Muchos pensaron que podra
solicitarse la patente despus de identificar la funcin de un gen, pero no
antes. Se otorgaron miles de patentes por secuencias de DNA humano
en las que la secuencia se vincul con alguna caracterstica funcional
EST de una RNT 3 amplifican con frecuencia la secuencia espe

cfica en una muestra de DNA genm ic). Ms adelante se extendi
la secuenciacin a los extremos 5' de clonas de cDNA y por ltimo
se obtuvieron secuencias de los extremos de cientos de miles de clo
nas de cDNA humanas.
Despus de obtener un gran nmero de EST humanos (por
grupos de investigacin privados y patrocinados con medios pbli
cos), la labor siguiente fue comenzar a colocarlos en mapas fsicos
del genoma humano. Esto incluy la tipificacin de contiguos de
YAC para la presencia de EST individuales o la seleccin de grupos
de h b rid o s p o r ra d ia ci n de ser humano-criceto (vase seccin
8.3.2 y asimismo recuadro 8-4 para la descripcin del principio de
hbridos por radiacin). Con anterioridad se haba obtenido me-
(vase Thomas y cois., 1996), pero en octubre de 1998 la oficina esta

dounidense de patentes concedi la primera patente para una secuen
cia de EST (a Incyte Pharmaceuticals). Como lo describi Knoppers
(1999), el problema de la patentablldad del genoma humano an es un
problema.
Tensiones entre los sectores pblico y privado: secuenciacin del
genoma
Tambin existen controversias acerca de la secuenciacin del genoma
patrocinado en form a privada. Los esfuerzos de secuenciacin del geno
ma humano y de ratn por Celera se establecieron en una competencia
intensa con los proyectos patrocinados de forma pblica fundados mu
cho antes. De manera audaz, Celera afirm en 1999 que su tcnica de
escopetazo del genoma completo (vase texto y fig. 8-3) podra produ
cir un bosquejo de la secuencia del genoma humano en dos aos, lo cual
superaba la medida ms lenta de mapeo y secuenciacin clona por clo
na del PGH patrocinado con recursos pblicos.
Asi, se publicaron de modo simultneo los informes del PGH y Celera y
ello anunci el logro de esquemas de secuencias del genoma humano
(International Human Genome Sequencng Consortium, 2001; Venter y
cois., 2001). Sin embargo, nunca fue una carrera igual, porque en todas
las etapas Celera declin poner a disponibilidad con facilidad y libertad
sus datos (se neg el acceso externo a su inform acin e incluso cuan
do se terminaron exigi elevados cargos por suscripcin y los datos no
dejaron de ser restringidos). En sorprendente contraste, los laboratorios
patrocinados de form a pblica se haban comprometido a poner a dis
posicin de inmediato y ampliamente la nueva inform acin sobre se
cuencias (con actualizaciones cada 24 horas en internet).
Al igual que cualquiera otro, Celera tuvo acceso continuo y libre a los da
tos de secuenciacin del DNA que provenan del PGH pblico y, de mane
ra desvergonzada, captur bloques muy considerables de los datos de
secuencia del genoma humano disponibles, los reproces y aliment los
datos resultantes en su recopilacin personal. Como resultado, el esfuer
zo de secuenciacin de Celera paraslt en extensa medida los datos pbli
cos generados. S se toma en cuenta que la tcnica de Celera se basaba
en el mtodo de escopetazo del genoma completo ms difcil, se suscit
un enorme escepticismo en cuanto a que la secuencia del genoma huma
no publicada por Venter y colegas (2001) fuera en alguna forma una vin
dicacin de la tcnica de escopetazo del genoma completo. En cambio,
Waterston y colaboradores (2002) proporcionaron datos que indicaban
que la secuencia de Celera publicada por Venter y colegas (2001) no era
una secuencia independente del genoma humano en lo absoluto (ya que
gran parte de los datos sobre secuencia de Celera result de la captura y
reempacamiento de grandes cantidades de la secuencia del proyecto del
genoma humano [PGH]).
diante estudios de hibridacin una distribucin cromosomica ge

neral de los genes humanos (fig. 8-4), pero la colocacin de un gran
nmero de EST en mapas fsicos fue el primer mtodo sistemtico
para construir un mapa gnico humano.
El dato del mapeo se integr en relacin con el mapa gentico
humano y luego se cruz para referencia con mapas de bandas citogenticas de los cromosomas. Con el fin de definir un grupo
d e genes no redundante, se intent integrar informacin del ma
peo en los diferentes EST, como en el caso del sistema UniGen
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/). Schuler y colaboradores
(1996) y Deloukas y colegas (1998) editaron los primeros mapas de
genes humanos razonablemente amplios. En el ltimo caso se pu
blicaron posiciones en el mapa de lo que se estimaba (de manera in-
8.3
CMO SE iMAPE Y SECUENCI EL GENOMA HUMANO
221
correcta) que eran 30 000 genes humanos y en esa poca se pensa

ba que representaban un poco menos de la mitad del total del cat
logo de genes humanos. Sin embargo, la secuenciacin del genoma
humano proporcion una sorpresa inesperada (vase seccin si
guiente).
8.3.5 El esquema de la secuencia del genoma humano

sugiri 30 000 a 35 000 genes humanos, pero es
difcil estimar un total preciso
Antes de secuenciarse el genoma humano, las predicciones sobre el
nmero total de genes humanos (basadas en extrapolaciones de una
diversidad de grupos de datos limitados) oscilaban entre 60 000 y
100 000 genes. Despus de publicarse en el ao 2001 los esquemas
de secuencias, la estimacin revisada arroj una cifra sorprendente
por baja, tal vez slo cercana a 30 000 a 35 000 genes. Con apenas
50% ms genes que C. elegans, un gusano largo de 1 mm que slo
tiene 959 clulas somticas, se haba infligido otro golpe al orgullo
humano, tal vez incluso ms contundente que la p a r a d o ja d e l va
lo r Cestablecida desde haca mucho tiempo (el contenido de DNA
celular no siempre se relaciona con la complejidad funcional; algu
nos tipos de amebas tienen en notable proporcin ms DNA por
clula que el hombre; vase cuadro 3-1).
13
14
15
19
20
21
10
11
12
16
17
18
22
Dificultades en el establecimiento del nmero preciso

de genes humanos
Aun en el ao 2003, despus de secuenciar en esencia todo el ge
noma humano, todava no se conoca con seguridad el nmero de
genes del hombre, aunque las estimaciones ms recientes (Ensembl
build 29) sugieren un total cercano a 30 000 o tal vez incluso me
nor de esa cifra (vase las comparaciones de ser humano-ratn en
el artculo del M ouse Genome Sequencing Consortium, 2002). Con
objeto de comprender la dificultad para estimar el nmero preci
so de genes, es instructivo considerar cmo se definen los genes.
Tal y como se detalla en la seccin 7.2, slo existen dos criterios
especficos de genes esenciales: transcripcin a RNA y prueba de
secuencias conservadas durante la evolucin. Sin embargo, identi
ficar por medios experimentales todos los genes con base en cual
quiera de estos criterios es muy difcil a nivel prctico por las
siguientes razones:
aunque muchas veces la investigacin de secuencias de transcri
tos relacionados suele ser compensadora (Camargo y cois.,
2002), es posible que en las genotecas de cDNA disponibles no
se interpreten bien los genes que se expresan en valores muy
bajos, que tienen localizaciones celulares y etapas de desarrollo
infrecuentes, o ambas cosas;
puede ser difcil identificar los genes que codifican RNA no
traducidos cuando no existe un marco de lectura abierto valorable.
Como resultado de lo anterior, a menudo se pasan por alto genes si
se utilizan slo mtodos experimentales; as, cuando se public el
esquema de las secuencias del genoma humano haba un apoyo ex
perimental tal vez para slo 11 000 genes; los otros se predijeron
mediante computadoras (a n lisis in silico). Los programas basa
dos en computadoras usados para identificar genes (Zhang, 2002)
comparan una secuencia de prueba con otras secuencias gnicas co
nocidas (seleccin de homologa) e intentan identificar exones
(programas de prediccin de exn):
Fig. 8-4. Mapa inicial de la distribucin de genes humanos

de la totalidad del genoma.
Casi todos los genes humanos se vinculan con islotes CpG (vase re
cuadro 9-3). Se marc una fraccin de un islote CpG humano purifica
do con un colorante rojo Texas y se hbrido en cromosomas humanos
en metafase (Craig y Bickmore, 1994). Las reglones cromosmicas de
replicacin tarda (en especial inactivas en sentido transcripcional) se
muestran en verde (como resultado de la incorporacin de bromodesoxiurldina [BrdU] marcada con isotocianato de fluoresceina). Las regio
nes amarillas (superposicin de seales roja y verde) indican regiones
de replicacin tarda abundantes en genes (o, estrictamente, islotes
CpG). Las reglones del genoma de replicacin temprana con pocos ge
nes son invisibles (ya que no se contratien), al igual que ios centrmeros (en los que no tiene acceso el anti-BrdU). En ciertos
cromosomas (p. ej., cromosoma 22) se encuentra una cantidad gnica
abundante (que se muestra con el color rojo de la fraccin del islote
CpG marcada), en tanto que otros (p. ej., cromosomas 4 ,1 8 , X, Y) tie
nen muy pocos genes. Adaptado de Craig y Bickmore, Nature Genet.
1994;7:376-381, fig. 1, con autorizacin de Nature Publishing Group.
in vestigacin d e h om ologa con tra bases d e d atos d e secu en

cia. Para cualquier secuencia de prueba puede compararse la
compatibilidad de la secuencia de nucletidos con todas las se
cuencias de nucletidos en bases de datos disponibles y tal vez
pueden equipararse secuencias de polipptidos traducidas contra
todas las secuencias de protenas conocidas (vase cuadro 8-2 y
recuadro 7-3). A medida que se aaden ms y ms secuencias a
las bases de datos de secuencias, se constituyen en un medio en
particular eficaz para identificar secuencias que se conservaron
durante la evolucin, lo que representa una indicacin de man
tenimiento de la funcin;
222
CAPTULO OCHO ! PROYECTOS DEL GENOMA Y ORGANISMOS MODELOS
Cuadro 8-2. Principales bases de datos electrnicas que sirven como depsitos de secuencias de nucletidos o protenas.
Tipo de base de datos
Base de datos Localizacin
SECUENCIA DE NUCLETIDOS
GenBank
Conservada por el U.S. National Center for Biotechnology

Information (NCBI) en U.S. National Institutes of Health
(NIH)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
EMBL
Conservada por el European Bioinformatics Institute (EBI)

en Hlnxton, cerca de Cambridge, Reino Unido
http://www.ebi.ac.uk
DDBJ
Conservada por el National Institute of Genetics, Japn, en

Mishima, Shizouka
http://www.ddbj.nig.ac.jp/
SWISSPROT
Secuencias de protenas con anotacin de alta calidad.

Conservada en colaboracin conjunta en el Swiss Institute
of Bioinformatics, Ginebra, y el European Bioinformatics
Institute (EBI), Hinxton, Reino Unidos
http://ca.expasy.org/sprot/
http://www.ebi.ac.uk/swissprot/
TREMBL
Traducciones de secuencias de codificacin de la base de

datos EMBL no depositadas an en Swiss-Prot
http://www.ebi.ac.uk/trembl/
http://ca.expasy.org/sprot/
PIR
Conservada en colaboracin conjunta por U.S. National Bio

medical Research Foundation (NBRF), Georgetown; Japan
International Protein Information Database, en Japn (JlPID); y Munich Information Center for Protein Sequences
(MIPS). Disponible en muchos sitios a nivel mundial.
http://pir.georgetown.edu/
http://www.ddbj.nig.ac.jp/
http://mips.gsf.de/
http://www.hgm p.m rc.ac.uk/
SECUENCIA DE PROTENAS
p rogra m a s d e p r ed icci n d e exn. En algunos programas slo

se emplea informacin sobre la secuencia informada, como el
difundido programa GENSCAN (vase Burge y Karlin, 1997).
Otros usan como referencia la seleccin basada en homologa
conservadora. Sin embargo, hasta la fecha incluso el mejor de
estos programas, como GENSCAN, slo ha resultado modera
damente satisfactorio para reconocer exones cuando se compa
ra con genes cuyas organizaciones exnicas estaban establecidas
con anterioridad. Las comparaciones cruzadas por especies su
ministraron otro medio importante para identificar exones, ya
que a diferencia de la mayor parte de las secuencias del genoma,
los exones tienden a conservarse bien durante la evolucin (va
se p. ej., Batzoglou y cois., 2000);
progra m a s d e com p u ta dora in tegrados p a ra en co n tra r genes.
Se han diseado varios programas de computadora que usan ba
ses de datos basados en homologa de secuencia general junto con
programas ideados para identificar elementos y exones relaciona
dos con genes. Por lo general se producen en la forma de grficas.
Los programas comunes son N1X (http://www.hgmp.mrc.ac.uk/
Registered/Webapp/nix/; vase fig. 8-6 para el rendimiento de
este programa) y G enotator (vase http://www.fruitfly.org/"nomi/
genotator/genotator-paper.html).
A pesar del valor de las predicciones de genes y exones basadas en
computadora, an existen problemas en la estimacin del nmero
de genes humanos, que incluyen predicciones mayores y menores.
Por ejemplo, puede ocurrir una prediccin mayor cuando grupos de
genes al parecer separados son en verdad diferentes partes de un so
lo gen muy grande, o efecto de artefactos de cDNA (por la forma en
que se elaboran las genotecas de cDNA, algunos cDNA no empal
mados en apariencia son artefactos consecutivos al cebamiento de
cadenas complementarias por vas oligo(dA) en DNA genmico).
La prediccin m enor suele ocurrir por la dificultad para encontrar ge
nes con exones muy pequeos y expresin restringida y hallar y con
firmar genes que codifican RNA no traducido.
URL
8.3.6 Etapas finales del Proyecto del Genoma Humano:

anotacin de genes y ontologa gnica
A medida que la secuenciacin del genoma humano llegaba a la fase fi
nal, se dedicaron grandes esfuerzos al desarrollo de nuevos programas
de computadora que permitieran buscar informacin en las cantidades
enormes del genoma humano en una forma sistemtica y fcil de uti
lizar. El diseo inteligente de buscadores de genoma como E nsem bl
(desarrollado en colaboracin entre el Wellcome Trust Sanger Institute y el European Bioinformatics Institute) proporciona interfses
grficas para seleccionar informacin del genoma de cromosomas
individuales y regiones subcromosmicas. Quienes lo usan pueden na
vegar con rapidez en la secuencia de un cromosoma humano seleccio
nado, pasar de una gran escala a la escala de nucletidos e identificar
genes y exones, RNA y protenas vinculadas. Un elemento central de
la navegacin son las herramientas de cambios (click-over) que hacen
posible una mirada de conexiones con otras bases de datos y progra
mas (incluidos los enlaces directos a otras secuencias del genoma en
sambladas, en especial el genoma de ratn) y que permite a quienes
lo emplean avanzar a travs de una informacin solicitada (vase
http://www.ensembl.org/ y fig. 8-5). Conforme se desarrolla cada vez
ms informacin sobre genes y otras unidades funcionales, se dispone
de una anotacin gnica ms informativa y precisa, en actualizacio
nes frecuentes y peridicas de los buscadores generales del genoma.
Otro adelanto importante es la ontologa gnica, en la que se de
sarrollan vocabularios sistemticos y jerrquicos a fin de definir la fun
cin de los genes. El Gene Ontology (GO) Consortium incluy la
colaboracin entre investigaciones que estudian genomas humanos y
otros para desarrollar un sistema comn de definicin de la funcin
gnica que pueda aplicarse a todos los organismos (Gene Ontology
Consortium, 2000, 2001; vase asimismo http://www.geneontology.
org/). El uso de un vocabulario comn posibilitar investigar a travs
de mltiples protenas y especies para caractersticas comunes. El Ge
ne Ontology Consortium desarroll tres ontologas separadas -proceso
biolgico, com ponente celular y fu n cin molecularpara describir los
8.3
CronsoM 3
i l,.,i
..1 .
223
~ H iT K Z ir ir ~ ~ ~
Banda del
croraosoia 3 1
g27.1
17!. 11b
181. 3 Hb
(cont iguoos)
flarcadores
D3S34I2
D3S247
SFNlê
C3S438
D3S1M
0K3111
D3S3423
Genes
l W K 7t HBEUB
l ftTPli6
I GENES EHSftlBL PREDICHOS (CONOCIDOS!
genes
179.48 Hb
Longitud
179.49 Hb
179.50 Hb
l HCCC
ll l 4 2
L53NT5
LKLHL6
I GENES ENSfitIBL PREDICHOS (NUEUOS)
179.51 Hb
179.52 Hb
179.53 Hb
179.54 Hb
179.55 Hb
179.56 Hb
179.57 Hb
*----------------------------------------------- 108. 00 Kb-----------------------------------------------
Niiwro ife caradtarfat ia*s efe TOS m
NCBI
'*m > de ceroRtPstiraB <te
Secuencias de referencia
Coepat ibi i idades
0 Unign
de ratn
m ia
regin
en esta regtn
a
i
0 Protenas
Inuestigocin de gen
OHi (contiguos)
Effisaib! transcrito
ilSE transcrito
Inuestigocin de gen
0 Protenas
B Unigen
T~TT
liz z ili
~r t~
mRHfi husionos
X X
ZZZ1ZO
z rz x i
Secuencias de referencia
NCBI
179.48 Hb
Ua tile
Leyenda de gene3
179.49 Hb
179.50 Hb
179.51 Mb
179.52 Hb
WmmKBBmmBm
179.53 Hb
179.54 Hb
179.55 Hb
179.56 Hb
179.57 Hb
PN>li-484H&
I GEHES EHSflTfflL PREDICHUS (NUEUOS)
Fig. 8-5. Las interfases grficas en la bsqueda general de Ensembl genome permiten navegar con facilidad a travs de cromosomas individuales
en secuencias genmicas ensambladas.
La bsqueda general de Ensembl genome (http://www.ensembl.org) se desarroll por una colaboracin entre el Wellcome Trust Sanger Institute y el European Bioinformatics Institute y permite una bsqueda general por cromosoma para varias secuencias genmicas ensambladas, Incluidas la humana y
la del ratn. Despus de seleccionar de forma inicial el cromosoma 3 humano, se eligi una regin subcromosmlca que abarcaba el borde 3q26.333q27.1 mediante clicks en un ideograma de cromosmico (que se muestra con el cuadro rojo abierto en el dibujo de la parte superior). Se muestra la
regln seleccionada expandida, en el dibujo de la parte media, definida como la regin de 1 Mb de 179.03 a 180.03 Mb. El cuadro rojo abierto en el di
bujo de la parte media es un segmento de 100 kb (179.48 a 179.58 Mb) y se muestra en una imagen aumentada en el dibujo de la parte inferior, que
lustra gen, exn, RNA, estructura protenica, etctera.
224
CAPTULO OCHO
productos gnicos y ello permite la anotacin de propiedades mole

culares a travs de especies. Cada vocabulario est estructurado como
grficas acclicas dirigidas, en las que cualquier trmino puede tener
ms de un parentesco o ninguno, uno o ms descendientes. Esto en
riquece mucho ms los intentos para describir la biologa de lo que
sera posible con una grfica jerrquica. En la actualidad, el vocabu
lario de la GO posee ms de 11 000 trminos que con el tiempo ten
drn, todos, definiciones estrictas para su uso.
8.3.7 Son importantes los anlisis de la variacin de

secuencias del genoma humano para la
investigacin antropolgica y mdica
Al inicio, el Proyecto del Genoma Humano se concibi para obte
ner la secuencia de nucletidos de un conjunto de fragmentos de
DNA humano clonados que llegaba en total a uno o unos cuantos
genomas haploides. Lo que no consider fue la diversidad gentica
de los seres humanos. De modo subsecuente, se consider conve
niente la informacin sobre esta ltima en diferentes contextos:
an tropologa . La informacin debe ser til en investigacin an
tropolgica e histrica en el rastreo de los orgenes humanos,
movimientos de poblacin prehistricos y estructura social.
an lisis fo ren se. La precisin de las pruebas basadas en DNA

que se llevan a cabo para identificar personas o confirmar rela
ciones biolgicas cercanas ( p e r fil d e DNA) depende, en parte,
del conocimiento de la forma en que varan los marcadores
diagnsticos de DNA de una poblacin a la siguiente.
in vestiga ci n m dica. Las enfermedades comunes son multifactoriales y puede ser frustrante y difcil identificar los genes
subyacentes (vase cap. 15). En fecha reciente se consagr un
esfuerzo enorme a la identificacin de variantes genticas que
pueden explicar diferencias entre poblaciones humanas respec
to de la mayor susceptibilidad a anomalas particulares o, de
hecho, la resistencia comparativa a ciertas afecciones.
Proyecto de Diversidad del Genoma Humano

La idea de una esfuerzo global para el estudio de la diversidad de la
secuencia del genoma humano, el Proyecto de Diversidad del Ge
noma Humano (HGDP, por sus siglas en ingls) lo propusieron
Cavalli-Sforza y colaboradores (1991). El nfasis se dirigi de mane
ra predominante a la necesidad de reunir muestras de DNA de un
gran nmero de grupos tnicos. Sin embargo, aunque apoyado por
HUGO, este proyecto ha tenido enormes dificultades (vase Greely,
GRAIL/Prom
TSSW /Promotor
GENSCAN/Prom
I I!
I I
I
Fex
Hexon
MZEF
Genemark
GRAIL
G enefl rider
Gen F
GENSCAN
G enes F
Gen HMM
BLAST/trembl
I I
4-4 -
i l
4 -ti i
-H h
-M
g m -
-M -H -
-41 1-
GENSCAN/p o i i a d e n i la c 6 n
G enes F /p o i i a d e n i la c in
GRflIL /p o I i a d e n i Iac in
BLAST/ecol
BLA ST/vector
lasker reP*t
4-
E x p lo r a c i n de tRNR-SE
I I
I fi
Fig. 8-6. Hallazgo de genes mediante anlisis de secuencias genmicas basado en computadora.
Este ejemplo muestra el anlisis NIX (vase texto) de una secuencia CAP de una regin del cromosoma 12q24.1 que incluye el locus de la enfermedad
de Darier. El tamao de nucletido de la regin se ilustra con la barra en la parte inferior. El anlisis incluye el uso de programas para buscar elementos
relacionados con genes como secuencias promotoras (tringulos verdes invertidos en la parte superior), sitios de poliadenilacin (tringulos invertidos
de color ocre) y diversos programas de prediccin de exn (GRAIL, GENSCAN, etc.). Las homologas importantes con otras secuencias a niveles de nu
cletidos y protenas se indican con los cuadros para los diversos programas B LA S ! Datos proporcionados por Vctor Ruiz-Perez y Simn Crter, University of Newcastle upon Tyne, UK.
8.4 1 PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
2001). Desde el inicio estuvo acosado por una falta conspicua de pa

trocinio. Mientras que el principal objetivo de este proyecto fue tan
slo reconocer marcadores para grupos tnicos y seguir los orgenes
de la migracin y los linajes ancestrales humanos, no fue tan persua
sivo el caso para obtener fondos a gran escala.
El HDGP tambin ha estado perseguido por controversias.
En algunos casos, los investigadores visitaron poblaciones huma
nas aisladas en los lmites de la supervivencia, obtuvieron mues
tras con rapidez sin tomar tiempo para explicar su importancia y
a continuacin las dejaron sin comunicacin ulterior, o muy po
ca. Si bien quienes lo proponen se refieren a la necesidad de sal
vaguardar la herencia cultural del hombre, los crticos suelen
utilizar de manera agotadora trminos como gen tica d e helicp
tero para referirse a la conducta insensible de entrada rpida y sa
lida rpida practicada con frecuencia para obtener muestras.
Mapas de polimorfismo de nucletido nico (SNP)

Si bien los marcadores microsatlites muy polimrficos estn distri
buidos en la totalidad del genoma, no son susceptibles en particular
de tipificacin automatizada y slo ocurren alrededor de una vez ca
da 30 kb. Los p o lim o rfism o s d e n u cle tid o n ico (SNP) no son
muy polimrficos (de forma caracterstica slo dos alelos), pero pue
den tipificarse con facilidad mediante automatizacin y ocurren con
mucha frecuencia en el genoma, en promedio alrededor de una vez
cada kilobase en el genoma humano (vase seccin 7.1.3 y recuadro
18-2 para la descripcin de la forma en que se tipifican). Como re
sultado, los mapas de SNP humanos encontraron aplicaciones im
portantes en la elaboracin de mapas genticos, incluso de ms alta
resolucin que eran necesarios para investigar regiones cromosmicas que se esperaba que incluyeran genes de enfermedades comunes.
En 1999 se inaugur el In tern a tio n a l SNP C onsortium L td
como una sociedad no lucrativa entre Wellcome Trust y alrededor de
una docena de compaas privadas, sobre todo farmacuticas. En el
transcurso de dos aos proporcion un mapa de SNP humano con
un total de 1.42 millones de SNP, que equivalen aproximadamen
te a un SNP cada dos kilobases (Grupo Internacional de Trabajo
del Mapa de SNP, 2001). En la actualidad se llevan a cabo grandes
esfuerzos a fin de mapear genes para enfermedades comunes me
diante mapas de SNP de alta densidad y se ha concedido asimismo
un inters comercial a las aplicaciones fa rm a co gen m ica s.
8.3.8 Sin las salvaguardas apropiadas, el Proyecto

del Genoma Humano podra conducir
a la discriminacin contra portadores de genes
de enfermedades y tambin al resurgimiento
de la eugnica
Cualquier adelanto cientfico importante conlleva el temor de la ex
plotacin. El PGH no es la excepcin y los beneficios percibidos del
proyecto tambin tienen su lado oscuro. Cuando se conozcan todos
los genes humanos y pueda detectarse una gran cantidad de mutacio
nes que se acompaen de una enfermedad, se obtendr un enorme
beneficio para dirigir la prevencin de anormalidades a los individuos
con genes de la afeccin demostrados. Pese a ello, podra usarse la
misma informacin para discriminar a esas personas. Por ejemplo,
existe la genuina y difundida preocupacin de que las compaas de
seguros pudieran exigir pruebas de seleccin gentica a gran escala
para la presencia de genes que confieren susceptibilidad a trastornos
comunes, como diabetes, afecciones cardiovasculares, cnceres y va
225
rios trastornos mentales. En consecuencia, a las personas por comple

to sanas pero portadores de estos alelos adjuntos de enfermedad po
dra negrseles los seguros de vida o mdicos. Por supuesto, esta
discriminacin slo se llevara a cabo a pequea escala por el momen
to; un hecho que es alarmante para muchos es la posibilidad de
discriminacin de un porcentaje muy grande de personas en la so
ciedad. Asimismo, es esencial preservar el derecho de las personas a
no saber. Un principio tico fundamental en todas la asesora y las
pruebas genticas es que la informacin gentica slo debe generarse
en respuesta a una solicitud explcita de un paciente adulto del todo
informado.
Otra rea problemtica es el aspecto del determinismo biolgi
co y si el conocimiento amplio de los genes humanos fomentara
una revisin de la eugnica, esto es, la aplicacin del apareamiento
selectivo u otras tcnicas genticas a fin de mejorar las calidades
humanas (Garver y Garver, 1994). En aos pretritos, los movi
mientos eugnicos negativos en algunos pases (incluidos Estados
Unidos y Alemania) discriminaron a individuos que se juzgaban in
feriores en alguna forma y se los forz a esterilizarse. Existe de igual
modo la preocupacin con la m ejo ra g e n tica a fin de seleccionar
de manera positiva cualidades hereditarias que se juzgan conve
nientes (vase Etica en el recuadro 3 del cap. 21). En reconocimien
to de los problemas anteriores, el U.S. Human Genome Project
(Proyecto del Genoma Humano Estadounidense) dedic grandes
recursos para apoyar proyectos de investigacin sobre los efectos
tico, legal y social (vase, p. ej., http://www.nhgri.nih.gov/ELSI).
8.4
Proyectos de genom as para

organism os m odelos
El mapeo del genoma humano no fue el nico enfoque cientfico del

Proyecto del Genoma Humano; desde un principio se reconoci con
claridad el valor de secuenciar los genomas de cinco organismos mo
delos fundamentales y desde entonces la lista se torn sustancial.
Incluye una amplia variedad de microorganismos microbianos
unicelulares y asimismo varios microorganismos modelos multicelula
res, muchos de ellos en particular adecuados para anlisis gentico. En
parte, la secuenciacin de genomas ms pequeos se considera tambin
como piloto para la secuenciacin a gran escala del genoma humano.
Alrededor de mayo de 2003 estaban terminados los genomas de ms
de 140 microorganismos (o casi concluidos; vase http://wit.integratedgenomics.com/GOLD/; http://www2.ebi.ac.uk/genomes/).
8.4.1 Existe una enorme diversidad de proyectos

de genoma procariotas
Diversidad de proyectos de secuenciacin
del genoma procariota
Desde hace mucho tiempo se estableci una diversidad de modelos
procariotas (vase recuadro 8-7). De manera caracterstica, los ge
nomas procariotas son pequeos (con frecuencia slo una o unas
cuantas megabases) y en especial factibles de una secuenciacin
comparativamente rpida, que dio por resultado el pronto desarro
llo de muchos proyectos de genoma procariota. Alrededor de ma
yo de 2003 se haban secuenciado ya los genomas de un total de
122 procariotas diferentes (16 archaea y 106 bacterias) y se encon
traban en curso los de otros 342 (23 archaea, 319 bacterianos) (va
se, asimismo, Doolittle, 2002).
226
CAPTULO OCHO
El primer genoma procariota terminado (en 1995) fue el geno

ma de H aem ophilus in flu en z a e de 1.83 Mb. Fue un hecho sobre
saliente: la primera vez que se secuenciaba el genoma de un
organismo que vive con libertad (vase Tang y cois., 1997). Ms ade
lante se logr una diversidad de otros primeros', el genoma de la en
tidad autnoma autorreplicante ms pequea (M ycoplasm a genitaliu m
en 1995), el primer genoma archaeal (M eth a n ococcu s ja n n a sch ii en
1996) y a continuacin el logro relevante de la secuencia completa del
genoma de E. c o li de 4.6 Mb (vase Pennisi, 1997).
La lista de organismos procariotas cuyos genomas ya se secuenciaron muestra diferentes prioridades. En algunos casos, el impul
so se centr en comprender las relaciones evolutivas entre diferentes
microorganismos, como en los genomas de archaea (vase Olsen y
Woese, 1997) y en Mycoplasma genitalium en comprender lo que
constituye un genom a mnimo, que es el genoma celular ms peque
o conocido (que en la actualidad se sabe que slo tiene 470 ge
nes). En otros casos, como en E. coli y Bacillus subtilis, la prioridad
fue tan slo una investigacin bsica ms amplia sobre microorga
nismos experimentales comunes. Para muchos investigadores el
premio mayor ha sido E. coli, la bacteria estudiada de modo ms in
tenso. Como hecho sorprendente, si se toma en cuenta la enorme
cantidad de investigacin previa, casi el 40% de los 4 288 genes
identificados de manera inicial no tena funcin conocida y se
constituyeron en el objeto de una investigacin intensiva. Sin em
bargo, para muchos otros microorganismos, la principal motiva
cin para secuenciar el genoma es su trascendencia mdica.
Proyectos del genoma procariota relacionado

con enfermedades
En algunos casos se eligieron procariotas para la secuenciacin del
genoma por sus vnculos conocidos con enfermedades crnicas
(vase Danesh y cois., 1997) o porque se saba que eran agentes cau
sales de enfermedad (vase cuadro 8-3). Adems de obtener un co
nocimiento ms completo de estos microorganismos, cabe esperar
que la nueva informacin conduzca a medios diagnsticos ms sen
sibles y nuevos objetivos para establecer frmacos/vacunas.
De los 6 340 genes, alrededor del 7% especifica RNA no traducido.

Aunque es uno de los organismos estudiados de manera ms inten
sa, 60% de sus genes no tena una funcin determinada por medios
experimentales cuando se public por primera vez la secuencia. No
obstante, fue factible demostrar que una fraccin valorable de los ge
nes de levadura posee un homlogo mamfero identificable y por
consiguiente slo en alrededor del 25% de los genes de la levadura
no hubo indicio alguno sobre su funcin (Botstein y cois., 1997). La
conclusin satisfactoria de este proyecto dio paso en la actualidad a
anlisis funcionales a gran escala (vase cap. 19).
Proyecto del genoma de Schizosaccharomyces pombe

La levadura de fisin es otro hongo unicelular que desde hace mu
cho tiempo se ha convertido en un microorganismo modelo prefe
rido (vase recuadro 8-7). Wood y colaboradores (2002) publicaron
la secuencia completa de 13.8 Mb y revel un total de 4 824 genes
que codifican protenas. Los datos mostraron una gran diferencia
entre los genomas de S. cerevisiae y S. pombe, incluidos cientos de
genes que se encuentran en S. Pombe, pero al parecer no en S. cere
visiae y viceversa, diferencias en el nmero de intrones (4 700 en S.
pom be comparados con slo 275 en S. cerevisiae) y elementos transponibles (muy pocos en S. pom be cuando se comparan con S. cere
visiae), etctera.
Proyecto del genoma de Plasmodium falciparum

El informe de Gardner y colaboradores (2002) de la secuenciacin
del genoma de P falciparum fue otro acontecimiento de importan
cia: era la primera vez que se secuenciaba el genoma de un parsito
eucariota. P. falciparum es el parsito mortfero del paludismo y la
publicacin simultnea del genoma completo de su husped, el
mosquito A nophelesgambiae (vase seccin 8.4.4), ofrece una nue
va dimensin en la batalla contra el paludismo, con frecuencia un
padecimiento mortal que causa la muerte de un milln de personas
cada ao, sobre todo en el frica subsahariana.
Otros proyectos de genomas de protistas

8.4.2 El proyecto del genoma de S. cerevisiae fue el
primero de muchos proyectos de genomas
protistas exitosos
Los p ro tista s son eucariotas unicelulares, un trmino que incluye a
animales unicelulares (p rotoz oa rios), hongos celulares y plantas
unicelulares. Se efectu una diversidad de proyectos del genoma
protista, en algunos casos por la necesidad de comprender microor
ganismos modelos bsicos y en otros como medio para combatir
una anomala causada por protozoarios patgenos.
Proyecto del genoma de Saccharomyces cerevisiae

La levadura con gemacin S acch a rom yces cer ev isia e es un hongo
unicelular y desde hace mucho tiempo es un microorganismo mode
lo eucariota favorito, en parte porque es muy susceptible al anlisis
gentico (recuadro 8-7). Consorcios europeos y estadounidenses secuenciaron sus 16 cromosomas y Goffeau y colegas (1996) publica
ron la secuencia completa. Esto represent otro acontecimiento
importante en biologa: la primera secuencia completa de una clula
eucariota. Los datos indican que los genes de levadura estn agrupa
dos de forma estrecha y espaciados en promedio una vez cada 2 kb.
Los otros proyectos de genomas de protistas incluyen los del geno

ma de varios protozoarios patgenos relacionados con infecciones
parasitarias en el hombre. En casi todos los casos, son sustanciales
los tamaos del genoma, de manera caracterstica de 30 a 90 Mb
(vase cuadro 8-3). Adems, se desarrollaron proyectos de genoma
para otros microorganismos bien estudiados y que son factibles de
anlisis bioqumico/gentico, incluidos los mohos A spergillus nid u la n s y N eurospora crassa.
8.4.3 El proyecto del genoma de Caenorhabditis elegans

fue el primer proyecto de un genoma animal
terminado
Proyecto del genoma de Caenorhabditis elegans
Aunque es un organismo simple, slo alrededor de 1 mm de largo,
C. elegans se ha considerado como un modelo importante del desa
rrollo y tambin fue til para modelar otros procesos relevantes pa
ra las clulas humanas (vase recuadro 8 - 8 ). Debido al gran tamao
de su genoma (casi 100 Mb), el proyecto del genoma de C. elegans
tambin se considera como el modelo piloto ms importante para
8.4
PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
Una diversidad de organismos unicelulares es en particular adecuada pa

ra anlisis genticos y bioqumicos y ofrece las relevantes ventajas de
tiempos de generacin en extremo rpidos, facilidad de cultivo a gran es
cala, etc. Aunque relacionados de modo muy distante con el hombre en
trminos evolucionistas, tienen ventajas para estudiar mltiples factores
cientficos y mdicos. Los beneficios para genetistas humanos e investi
gadores mdicos incluyen nuevas informaciones sobre una extensa va
riedad de reas de investigacin, algunas con aplicaciones mdicas
claras, entre ellas las siguientes:
Funcin gnica y procesos celulares: durante la evolucin se conser
varon de manera extraordinaria muchas actividades celulares centra
les de crucial im portancia. Es posible obtener informacin sobre la
forma en que funcionan los diversos genes de mamferos y la natu
raleza de los procesos celulares esenciales, como la biognesis de
los ribosomas, el control del ciclo celular, el transporte a travs de la
membrana, la funcin de polimerasa, etc., si se estudian genes y pro
cesos equivalentes en organismos unicelulares;
Patogenia: se sabe que muchos microorganismos unicelulares cau
san enfermedades y durante aos la medicina ha luchado con fre
cuencia para encontrar frmacos u otros tratamientos eficaces
apropiados. Mediante la determinacin de los genomas completos de
estos organismos patgenos y el estudio de la base molecular exac
ta de la forma en que causan afeccin cabra esperar nuevas informa
ciones sobre la manera de abordar a los m icroorganism os
patgenos;
Evolucin: los anlisis de secuencia proporcionan el medio ms til
para comprender la forma en que los microorganismos se relacionan
entre s. Por consiguiente, si bien el anlisis de secuencias de rRNA
proporcion el camino para establecer la divisin fundamental en tres
reinos de vida mayores: archaea, bacterias y eucariotas (recuadro
12-4), sin duda alguna la comparacin completa de las secuencias
genmicas suministrar informaciones adicionales importantes; va
se tambin la figura 1 2 -22.
BACTERIAS
Desde hace mucho tiempo, una m ultiplicidad de bacterias, no patge
nas en condiciones normales, se toma com o modelo de m icroorganis
mos, en especial Escherichia cot en form a de bastn, que vive en el
intestino del hombre y otros vertebrados (es una relacin simbitica:
contribuye a sintetizar la vitam ina K y las vitaminas del complejo B que
el hombre absorbe). Gracias a los estudios intensivos durante dcadas,
ha sido posible obtener ms conocim ientos de E. co li que de cualquie
ra otro tipo de clula y la m ayor parte del conocim iento sobre los me! cansm os fundamentales de la vida, incluidas la replicacin, la
transcripcin de DNA, la sntesis de protenas, etc, proviene de estudios
de este m icroorganism o.
Adems, por supuesto, diversas bacterias patgenas causan enferme
dades de gravedad variable. Entre ellas se encuentran las cepas de E.
co li, que ocasionan infecciones en el hombre, incluidas meningitis, sep
ticemia e infecciones de vas urinarias e intestinales. Un ejemplo notorio
es E. coli 0157:H7 que, com o resultado de la adquisicin de una se
cuencia particular de bacterifago en aos pretritos, se m odific de
modo gentico para producir una toxina. En algunos casos, esta ltima
produce hemorragia intensa que puede ser m ortal en nios pequeos o
personas de edad avanzada; en otros pacientes suele provocar insufi
ciencia renal. Se iniciaron diversos proyectos de genoma com o intento
para obtener las secuencias completas de microorganism os patgenos
(vase cuadro 8-3).
227
ARCHAEA
En la categora Archaea se incluyen procariotas cuya form a semeja de
manera superficial a las bacterias, pero se diferencian de estas ltimas
en una etapa muy temprana de la evolucin. De modo inicial se encon
traron en ambientes poco comunes, a menudo extremos: temperaturas
muy altas en aguas termales y cerca de grietas de respiraderos en ma
res profundos, aguas con pH o salinidad extremos, lodazales de panta
nos carentes de oxgeno, depsitos profundos de petrleo bajo la tierra
y el fondo de ocanos. Sin embargo, en la actualidad se sabe que habi
tan ambientes ms familiares, como suelos y lagos, y se han encontra
do en el tubo digestivo de vacas, termitas y vida marina en donde
producen metano.
Los sistemas m etablicos y de conversin de energa de archaea son
similares a los de las bacterias, pero los sistemas utilizados para tratar
y procesar inform acin gentica (replicacin, transcripcin, traduccin
de DNA) se relacionan de modo ms estrecho con los de eucariotas, en
comparacin con sus correspondientes bacterianos. No se sabe que ar
chaea se vincule con enfermedades y el principal inters en el estudio
de sus genomas radica en su posicin como un reino muy separado de i
otras form as de vida; por consiguiente, la atencin se centra en cono
cer ms sobre la form a en que evolucionaron para ser tan diferentes.
LEVADURAS (HONGOS UNICELULARES)
Las levaduras son hongos unicelulares y tambin eucariotas. Son com u
nes en hojas y flores de plantas, suelo y agua salada y asimismo se en
cuentran en la superficie de la piel y el intestino de animales de sangre
callente, en donde pueden vivir de form a simbitica o com o parsitos. De
manera caracterstica, se replican por gemacin en lugar de fisin bina
ria: el citoplasma y el ncleo en divisin de la clula original se continan
al principio con la yema, o levadura hija, antes de depositarse la nueva
pared celular para separar a ambas.
Las levaduras han resultado valiosos m icroorganism os modelos por
que se sabe que se conserv en sum o grado una diversidad de m ol
culas fundamentales, desde las levaduras hasta los mamferos. Como
hecho Im portante, se hall que las versiones humanas de varios ge
nes del ciclo celular y reparacin de DNA de levaduras participan de
form a directa en la divisin de clulas humanas. El mal funcionam ien
to suele conducir a cncer o defectos del nacim iento. La actividad
norm al de estos genes se estudia con m ayor facilidad en clulas de
levaduras, que se manipulan en el laboratorio. Esto proporciona informaciones de im portancia sobre sus m ecanism os en seres humanos,
que ayudan a realizar experimentos directos en tipos de clulas ms
com plicadas. En consecuencia, el estudio del control de la divisin
celular en levaduras es esencial para la salud humana a fin
de com prender muchos trastornos clnicos. Por lo general, las levadu
ras no causan enfermedades, pero algunas levaduras patgenas -e n
particular las especies C andida- constituyen un problem a de salud
comn.
Saccharomyces cerevisiae es una levadura de gemacin que
desde hace mucho tiem po es im portante en la elaboracin de pa
nes y cerveza. Debido a que es simple y fcil de desarrollar, se tra
ta de un organism o favorito para investigacin bsica y uno de los
eucariotas estudiados de manera ms extensa. En parte por una al
ta frecuencia de recom binacin no hom ologa, ha sido muy recep
tivo a anlisis genticos. Por lo regular se usa com o modelo para
estudiar varios aspectos de biologa celular, incluidos el control del
ciclo de la clula, el transporte de protenas y la regulacin transcripcional.
contina en la pgina siguiente
;
j
228
CAPITOLO OCHO
Recuadro 8-7. (co n tin u aci n )

Schizosaccharomyces pombe es una levadura de fisin y con un
tiempo de generacin rpido (dos a cuatro horas). Slo hasta fecha
ms reciente se estudi bastante, en especial como un modelo del con
trol (existe una fase G2 precisa del ciclo) y la diferenciacin del ciclo
celular. Se relaciona de forma distante con S. cerevisiae y en algunos
aspectos de la estructura de los cromosomas y el procesamiento del
RNA se vincula de modo ms prximo con eucariotas ms altos que S.
cerevisiae.
Candida albicans se encuentra de manera natural en la boca de per
sonas sanas, pero puede causar irritacin y en ocasiones infecciones
debilitantes en individuos cuyo sistema inmunitario no es tan activo
como el normal; provoca algodoncillo vaginal y bucal, exantema del
paal y otras anomalas.
PROTOZOARIOS (ANIMALES UNICELULARES)
Los protozoarios son un grupo grande de animales unicelulares (no fotosintticos) que incluyen amebas, flagelados y ciliados (que se desplazan
con la ayuda de seudpodos, flagelos y cilios, respectivamente) y otros
microorganismos con ciclos de vida complejos. Tienen inters para inves
tigadores biomdicos como modelos de diversas facetas de la biologa ce
lular y del desarrollo y asimismo porque muchos son parsitos que causan
enfermedades. Los ltimos pueden ser huspedes de bacterias patgenas
(que ocasionan afecciones como la enfermedad de los legionarios, salmonelosis, tuberculosis, y otras) o producen anormalidades directas:
Entamoeba histolytica: una ameba parasitaria que provoca enferme
dad gastrointestinal grave.
Tripanosomas: parsitos flagelados que producen la fiebre tropical
conocida como enfermedad del sueo.
Giardia: un parsito flagelado que causa diarrea grave.
Plasmodium: provoca el paludismo.
Toxoplasma: produce afecciones digestivas y dao de rganos in
ternos.
Como modelos de biologa celular y del desarrollo, el principal inters se
enfoc en Dictyostelium discoldeum, una llamada ameba social: aun-
la secuenciacin a gran escala del genoma humano. El xito del pro

yecto del genoma lo consiguieron Wellcome Trust Sanger Institute y
la Washington University School of Medicine (Consorcio de Secuen
ciacin de C. elegans, 1999). Fue otro logro de trascendencia que
proporcion por primera vez las instrucciones genticas para un ani
mal multicelular (m etaz oario).
En el proyecto del genoma de C. elegans se public de forma
inicial un total de casi 19 OOO genes que codifican polipptidos y
ms de 1 000 genes que codifican molculas de RNA no traduci
das, lo que proporcion un espaciamiento promedio de un gen
cada 5 kb. Al parecer, ocurre un nmero sorprendentemente
grande de genes como parte de o p ero n es en los que se transcriben
genes individuales que forman parte de transcritos de RNA multignicos grandes. A la fecha, tras la aparicin del informe inicial,
la comparacin con secuencias publicadas de alguna otra parte re
vel que casi uno de cada tres de los genes de C. elegans recin
identificados mostraba similitudes con genes conocidos con ante
rioridad y 12 000 de los genes que codifican polipptidos no te
nan una funcin conocida y casi todos eran genes predichos sin
confirmacin experimental.
De los 19 000 genes que codifican polipptidos publicados, s
lo se dispone de prueba experimental de apoyo para tan slo 9 000
que es tpico su crecimiento en la forma de clulas separadas e indepen

dientes, las clulas pueden interactuar para form ar estructuras multice
lulares cuando se someten a condiciones adversas como la inanicin.
Hasta 100 000 clulas producen seales entre s al liberar el cAMP quimioatrayente y se congregan unas y otras mediante quim iotaxis para fo r
mar un montculo rodeado por una matriz extracelular. Este mecanismo
para generar un microorganismo multicelular difiere de form a radical de
los pasos iniciales de la embriognesis de los metazoarios. Sin embar
go, los procesos subsecuentes dependen de la comunicacin intercelu
lar tanto en Dictyostelium com o en metazoarios. Este microorganismo
es singular para estudios de citocinesis, motilldad, fagocitosis, quim io
taxis, transduccin de seales y aspectos del desarrollo, com o seleccin
celular, formacin de patrn y determinacin del tipo de clula. Muchas
de estas conductas y mecanismos bioqumicos celulares no existen o
son menos accesibles en otros organismos modelos.
An no se investigan los ciliados de manera tan extensa como las otras
clases de protozoarios. El nico ciliado al que se concedi ms atencin
es Tetrahymena, un microorganism o de agua dulce que habita por lo ge
neral en corrientes, lagos y estanques; en la actualidad se considera un
proyecto de genoma para Tetrahymena thermophila (vase Turkewitz y
cois., [2002]). Tetrahymena tiene clulas grandes (40 a 50 ^.m a lo largo
de su eje anteroposterior) y, al igual que otros ciliados, las clulas po
seen una variedad notable de estructuras celulares muy complejas y es
pecializadas. Como es tpico de los ciliados, el aparato nuclear de
Tetrahymena est constituido por dos tipos de ncleos diferentes desde
el punto de vista estructural y funcional, un fenmeno que se conoce co
mo dim orfism o nuclear. El m icrondeo es la lnea germen, es decir, al
macena informacin gentica para la progenie sexual. Es diploide y
contiene cinco pares de cromosomas. El macroncleo (MAC) es el n
cleo somtico, esto es, el ncleo se expresa de form a activa durante la
multiplicacin vegetativa y no se transmite a la progenie sexual DNA de
MAC conocido. Tetrahymena es un modelo bien establecido para biolo
ga celular y del desarrollo y el principal inters se relaciona con la m o
tilldad de clulas redondas, los reordenamientos de DNA programados
por el desarrollo, la secrecin regulada, la fagocitosis y la conservacin
y funcin del telmero.
casos; los casi 10 000 genes predichos restantes slo se identifica

ron mediante anlisis de secuencia basados en computadora. An
lisis subsecuentes para estudiar estos genes en busca de pruebas de
transcritos de RNA correspondientes sugirieron que cuando menos
80% de los genes predichos por computadora era autntico, lo que
llev a Reboul y colegas (2001) a concluir que C. elegans tiene
cuando menos 17 300 genes. En la actualidad se realizan grandes
esfuerzos para investigar la funcin especfica de genes y programas
de mutagnesis qumica a gran escala que intentan producir un
gran nmero de fenotipos mutantes.
8.4.4 Los proyectos del genoma de metazoarios se

enfocan sobre todo en modelos del desarrollo
y enfermedades
El xito del proyecto de secuenciacin de C. elegans anunci una
era nueva y confiable. Para contribuir a los escasos proyectos de genomas animales de larga duracin (p. ej., D. melanogaster) se desa
rroll una pltora de nuevos proyectos con diferentes motivaciones:
investigacin bsica (p. ej., el deseo de conocer por completo
modelos valiosos del desarrollo);
8.4
229
Cuadro 8 -3 . Guerras contra grmenes: ejemplos de proyectos de genomas para microorganismos patgenos (vase las lecturas
adicionales para obtener fuentes en internet).
Microorganismos
Tamao del genoma

(nmero de cromosomas)
Enfermedad concomitante
Bacillus anthracis
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
Chlamydia pneumoniae
Chlamydia trachomatis
Clostridium difficile.
Helicobacter pylori
Mycrobacterium leprae
Mycrobacterium tuberculosis
Ricketssia prowazekii
Salmonella typhi
Treponema pallidum
Vibrio cholerae
Yersinia pestis
4.5 Mb (1)
3.88 Mb (1)
0.95 Mb (1)
1.0 Mb (1)
1.7 Mb (1)
4.4 Mb (1)
1.67 Mb (1)
2.8 Mb (1)
4.4 Mb (1)
1.1 Mb (1)
4.5 Mb (1)
1.1 Mb (1)
2.5 Mb (1)
4.38 Mb (1)
Carbunco
Tosferina
Enfermedad de Lime
Afeccin respiratoria; cardiopata coronaria
Tracoma, una causa principal de ceguera
Diarrea relacionada con antibiticos; colitis seudomembranosa
lceras ppticas
Lepra
Tuberculosis
Tifus
Fiebre tifoidea
Sfilis
Clera
Peste
Protozoarios
Leishmania m ajor
Plasmodium falciparum
Trypanosoma brucei
Trypanosoma cruzi
33.6 Mb (36)
23 Mb (14)
54 Mb (22)a
87 Mb (> 4 2 )
Leishmaniasis
Paludismo
Tripanosomosis africana (enfermedad dei sueo)
Tripanosomosis americana (enfermedad de Chagas)
Bacterias
Organizada en la forma de 1 1 pares.
comercial (p. ej., proyectos de genoma para granjas de animales).
Proyecto del genoma de Anopheles gambiae
mdicos (p. ej., comprender modelos de enfermedad y la pato

genia secundaria a nematodos parasitarios o bien originada por
vectores de enfermedades como mosquitos, los portadores del
paludismo).
Anopheles gam biae es un mosquito que disemina el parsito mortal

del paludismo, Plasmodium falciparum . Con el patrocinio propor
cionado sobre todo por el U.S. NIH-NIAID y el Ministerio Francs
de Investigacin, se secuenci el genoma de Anopheles gam biae me
diante una colaboracin entre Celera Genomics, el centro nacional
francs de secuenciacin Gnoscope y el Institute for Genome Re
search (TIGR), en asociacin con varios grupos de investigacin de
universidades (Holt y cois., 2002 ). Su secuencia se public de forma
simultnea con la de Plasmodium falciparum (vase seccin 8.4.2) y
ofreci una nueva dimensin en la lucha contra el paludismo.
Proyecto del genoma de D. melanogaster

Este proyecto se condujo al principio en gran parte como una co
laboracin entre la University of California en el Berkeley laboratory
y un consorcio de laboratorios europeos, pero despus se incorpo
r una importante compaa privada, Celera. La secuencia publica
da por Adams y colaboradores (2000) no fue la secuencia completa
del genoma, de 165 Mb, sino la de casi toda la porcin eucromtica de alrededor de 120 Mb en la que reside la inmensa mayora de
los genes. La versin 3.0 publicada en agosto-septiembre de 2002
eliminaba la mayor parte de los intervalos en la secuencia de eucromatina (http://www.fruitfly.org/sequence/index.html).
El informe inicial de la secuencia del genoma de Drosophila in
cluy 13 601 genes que codifican polipptidos, con una densidad
gnica de alrededor de uno por 9 kb. La cifra baja de genes fue una
sorpresa cuando se compar con los 19 000 genes que codifican
polipptidos de C. elegans, que se public primero, un organismo
ms simple con tal vez slo 10% del nmero de clulas de D. m e
lanogaster. Con la finalidad de relacionar D. melanogaster con espe
cies de Drosophila, relacionadas de forma ms distante, en fecha
reciente se iniciaron otros proyectos de genoma, en particular el
proyecto de D. pseudoobscura.
Proyecto del genoma del ratn (Mus musculus)

Debido a diversas caractersticas, el ratn proporciona el modelo de
genoma ms importante para el proyecto del genoma humano (va
se recuadro 8 - 8 ) y se esperaba que tuviera en esencia el mismo n
mero de genes. Los esfuerzos para la secuenciacin del genoma del
ratn patrocinada con recursos pblicos se iniciaron en 1999 y al
principio se plane obtener un esquema de la secuencia hacia el ao
2005. Sin embargo, cuando la compaa privada Celera anunci en
tonces su intencin de secuenciar el genoma del ratn en dos aos,
se llevaron a cabo esfuerzos conjuntos para acelerar el esfuerzo p
blico de secuenciacin. Con ese fin se form el Mouse Genome Sequencing Consortium (MGSC) con los U.S. National Institutes of
Health y el U.K.s Wellcome Trust en asociacin con tres compaas
privadas (GlaxoSmithKline, Merck Genome Research Institute y
Affymetrix, Inc.). El esfuerzo de secuenciacin de MGSC se deleg
230
CAPTULO OCHO
Recuadro 8 - 8 . Animales multicelulares m odelos para com prender el desarrollo, las enferm edades y la
funcin gnica
Se recurre a una amplia variedad de modelos animales multicelulares pa
ra conocer los procesos bsicos del desarrollo y la biologa celular, con
objeto de comprender la funcin gnica y como modelos de enfermeda
des, El espectro es amplio, desde gusanos y moscas invertebrados has
ta diferentes especies de peces, ranas, aves y mamferos; vase Hedges
(2002) y asimismo las figuras 12-23 y 12-24 para conocer la filogenia.
CAENORHABDITIS ELEGANS (GUSANOS REDONDOS)
sistema nervioso. Existe un diagrama completo de Interconexiones

del sistema nervioso: se conocen todas las 302 neuronas y las unio
nes entre ellas. C. elegans tambin posee genes para la mayor parte
de los componentes moleculares conocidos del cerebro de vertebra
dos. En tanto que muchos cientficos piensan que el cerebro humano
es tan complejo que nunca se tendr la esperanza de comprenderlo
por completo, el conocimiento del sistema nervioso simple de C. ele
gans proporcionar mucha informacin y ser importante conocer
los genes de C. elegans para entender su sistema nervioso.
envejecimiento. Se estudia con facilidad porque el gusano se desa
rrolla a partir de una clula hasta la form a de crecimiento completa
en el transcurso de tres das y slo sobrevive dos semanas. Se han
identificado numerosas mutaciones en C. elegans que dan por re
sultado prolongaciones notorias del periodo de vida y algunos m u
tantes viven cinco veces ms tiempo que los gusanos de tipo
silvestre.
C. elegans es un nematodo o gusano redondo (en comparacin con los

gusanos planos y los segmentados). Los gusanos redondos superan en
nmero a todas las otras criaturas complejas del planeta, se encuentran
casi en cualquier parte del mundo templado y prosperan en el suelo. Pue
den vivir libremente (C. elegans) o como parsitos. Los gusanos redon
dos infestan a mil millones de seres humanos y diseminan enfermedades,
que incluyen la ceguera de los ros y la elefantiasis, y devoran cosechas.
apoptosis. Los genes que participan en la apoptosis (muerte celular

programada) suelen conservarse bastante y se comprendi bien el
patrn de apoptosis en el desarrollo de C. elegans (al principio se for
ma un total de 1 090 clulas en el hermafrodita, pero 131 clulas es
tn programadas para m orir durante el desarrollo).
DROSOPHILA MELANOGASTER
C. elegans tiene 1 mm de largo. Hay dos sexos: masculino (XO) y hermafrodita (XX), una hembra modificada que es el sexo predominante. Al
producir espermatozoos y huevos puede fecundarse y dar por resultado
homoclgosidad para alelos. El macho se desarrolla por la prdida ocasio
nal de uno de los dos cromosomas X del hermafrodlta y ste se aparea
de preferencia con machos, segn estn disponibles. El linaje celular es
Invariable y hay 959 clulas somticas en el hermafrodlta y 1 031 en el
macho adultos.
C. elegans es un modelo importante del desarrollo, puede cultivarse con
facilidad en el laboratorio (en placas de agar con alimentacin de bacte
rias o en cultivo lquido) y es muy susceptible de anlisis genticos. En el
ltimo caso, adems de los mtodos estndar de knocking out de la fun
cin gnica a nivel del DNA, es posible lograr la inactivacin temporal de
la expresin de genes especficos mediante tecnologa de RNA de inter
ferencia (RNAi). En este mtodo, el investigador inyecta en el oocito RNA
de doble cadena para el gen de inters. El RNA de doble cadena inactiva
la expresin del gen homlogo y los fenotipos mutantes que resultan pue
den examinarse para buscar indicios de la funcin gnica (vase seccin
20 .2 .6 ).
Varias caractersticas determinan que C. elegans sea un buen organismo
modelo para estudios de biologa del desarrollo y otros relacionados:
estudios de expresin. Debido a que C. elegans es transparente du
rante todo su ciclo de vida, es posible unir el gen de protena verde
fluorescente (PVF\ vase recuadro 20-4) con un gen de C. elegans y
utilizarse para encontrar el sitio en donde se expres el gen en el gu
sano.
estudios de linaje. La transparencia de C. elegans hace posible ob
servar y seguir cada clula durante el desarrollo. Como resultado, y
debido a la invariabilidad del linaje celular, se conoce el linaje exacto
de cada clula de C. elegans -inform acin que se desconoce en to
dos los otros organismos multicelulares.
La mosca de la fruta se llama as por su inclinacin por la fruta descom

puesta. Tiene un ciclo de vida corto, es en particular dcil para anlisis
genticos com plicados y se ha estudiado en extenso durante muchas
dcadas. Se ha analizado de manera sistemtica un gran nmero de
mutantes y obtenido una cantidad inmensa de inform acin sobre la fun
cin gnica (vase Perrimon [1998] para hallar un resumen de los nue
vos adelantos en el estudio de la funcin gnica). Una diversidad de
caractersticas y conductas contribuy al mapeo gentico y el anlisis
funcional:
8.4 I PROYECTOS DE GENOMAS PARA ORGANISMOS MODELOS
231
Recuadro 8 - 8 . Animales multicelulares modelos para comprender el desarrollo, las enfermedades y la

funcin gnica (c o n tin a )
cromosomas polilenos. Son cromosomas de interfase de 2 mm de
largo que se encuentran en las clulas de las glndulas salivales en
las etapas larvarias. Son caractersticos porque se producen por replicacin repetida sin separarse hacia ncleos hijos y el resultado es
un juego de 1 024 copias de DNA dplex, nico en condiciones nor
males, dispuestas lado a lado como las pajillas para beber dispues
tas en una caja. Debido a esta amplificacin paralela del DNA, los
cromosomas politenos son nicos entre los cromosomas de interfa
se porque son visibles al m icroscopio de luz. Como resultado de su
configuracin extendida, permiten localizar con precisin (decenas de
mtodos genmicos comparativos en estas tres especies proporcionan

una ventana notable sobre la evolucin del genoma de vertebrados.
Pez cebra (Brachydanio rerio)
kilobases) puntos de rotura cromosmicos y detectar con exactitud

clonas de DNA mediante hibridacin in situ.
elem ento P. Este elemento transponible de Drosophila permite varios
tipos de manipulacin experimental, entre ellos mutagnesls (vase
Spradling y cois., 1995) y transgnesis (vase seccin 20.2.2). La recombinacin desigual entre Insertos de elemento P adyacentes tam
bin puede ocasionar deleclones precisas.
mediante el sistema GAL4-UAS de expresin gnica condicional es po
sible restringir la expresin espacial y temporal de transgenes. Son fac
tibles selecciones de mutagnesis a gran escala y en fecha reciente se
emple tecnologa de RNAi (vase antes) a fin de inactivar en forma
transitoria genes especficos. En muchos casos (tal vez dos tercios de
los 12 000 genes de Drosophila) la prdida de la funcin no da lugar a
un fenotipo mutante, pero la expresin errnea del transgn suele pro
porcionar indicios sobre la funcin gnica al producir fenotipos negati
vos dominante/dominante. Las selecciones de una generacin para
supresores/intensificadores de fenotipos mutantes dominantes pueden
identificar genes que nteractan. Es posible usar el sistema de recombinasa flp-frt de la levadura para inducir clonas mitticas y formar as
placas homocigotas que permiten observar los fenotipos de mutacio
nes recesivas letales en etapas tardas del desarrollo. Tambin puede
utilizarse la recombinacin mittica en la seleccin de una generacin
a fin de calificar los fenotipos mutantes en clonas y recuperar mutacio
nes letales que afectan el desarrollo ulterior.
Aunque Drosophila es un invertebrado y tal vez el nmero de genes de
Drosophila representa slo la mitad de los genes humanos, existen no
obstante ciertas similitudes notables entre los genes humanos y los de
Drosophila. Gran parte de la diferencia en el nmero de genes se debe a
fenmenos de duplicacin gnica que dan por resultado familias de ge
nes ms grandes en seres humanos y una proporcin grande de genes
de Drosophila tiene homlogos humanos, Incluidos los genes subyacen
tes de muchos trastornos genticos y los de cncer. El nivel de homolo
ga posibilita tener xito en la seleccin electrnica para reconocer cDNA
humanos correspondientes a genes mutantes de Drosophila (Banfi y cois.,
1996). Muchos de los genes muy bien conservados tienen funciones im
portantes en el desarrollo temprano que, en trminos comparativos, se
comprende bien en Drosophila y muchas de las vas relevantes en el de
sarrollo inicial y en algunos otros procesos similares cruciales estn
esencialmente conservadas, desde Drosophila hasta mamferos. Como
resultado, puede emplearse Drosophila como un sistema modelo para ex
plorar la funcin gnica y los patrones de interaccin de genes que tienen
importancia directa para sistemas humanos.
PECES
Por lo general se emplean como modelos diferentes peces, en especial el
pez cebra, que es un modelo excelente del desarrollo y cada vez ms im
portante de enfermedades, el pez soplador por su genoma muy compac
to y, en fecha ms reciente, medaka, otro gran modelo de desarrollo. Los
El pez cebra es un pequeo animal de agua dulce originario de ros en la

India y comn en la actualidad en acuarios de todo el mundo. Tiene un
tiempo de generacin corto y en cada apareamiento produce una gran
cantidad de huevos. Es un modelo principal del desarrollo de vertebrados:
la fecundacin es externa, de tal manera que son accesibles todos los as
pectos del desarrollo y el embrin es transparente, lo que facilita identifi
car mutantes del desarrollo. Los genes de importancia en el desarrollo de
vertebrados suelen estar muy bien conservados y por consiguiente los
genes que controlan el desarrollo humano tienen en condiciones norma
les ortlogos reconocibles en el pez cebra. Las selecciones de mutag
nesls a gran escala proporcionaron un gran nmero de mutantes del
desarrollo valiosos y algunos de ellos se emplean como modelo de tras
tornos humanos (vase recuadro 20-6). Se ha usado asimismo la tecno
loga de interferencia de RNA (vase antes) a fin de inactivar genes
especficos.
Pez soplador, como Takifugu rubripes rubripes (vase abajo) y Tetraodon nigroviridis (vase ms adelante).
Tiene valor sobre todo en genmica comparativa (seccin 12.3). El pez

soplador posee un genoma muy compacto, casi con el mismo nmero de
232 j CAPITULO OCHO
R ecuadro 8 8. A n im a le s multicelulares m odelos

______________ fu n c i n gnica (co n tin a)
para com prender el desarrollo, las enferm edades y la
genes que los mamferos, comprim ido en un genoma de slo casi una
sptima parte del tamao de los genomas humano o del ratn. La con
servacin de exones y secuencias reguladoras importantes ayuda a iden
tificar equivalentes humanos mediante mapeo comparativo (vase Clark,
1999).
Medaka
El medaka (Oryzias latipes) es un pez de agua dulce pequeo y ovparo
que se encuentra de manera predominante en Japn. Es un modelo de
desarrollo cada vez ms importante relacionado de form a distante con el
pez cebra (los dos separados de un ancestro comn tal vez hace ms de
110 millones de aos). Al igual que el pez cebra, es muy adecuado para
los anlisis genticos y embriolgicos, con un tiempo de generacin cor
to (dos a tres meses), cepas endogmicas, mapas genticos, transgne
sis, atrapamiento de intensificadores y disponibilidad de clulas madre
(Wlttbrodt y col., 2002). Los fenotipos recuperados de selecciones del
desarrollo en medaka y el pez cebra sealan un espectro no superpuesto
de fenotipos embrionarios y letales.
POLLO
Las manipulaciones experimentales com unes en em briones de pollo

incluyen m aniobras quirrgicas e injerto de tejidos; transferencia g
nica mediada por retrovirus; electroporacin de em briones en desa
rrollo y cultivo em brionario. Adems, el pollo sum inistra un sistema
nico para el estudio de procesos celulares: la lnea de c lu las DT40.
Las clulas DT40 del pollo continan la diversificacin de sus genes
de inm unoglobulina y, com o hecho nico entre las lneas de clulas de
vertebrados disponibles, pueden llevar a cabo recom blnacin hom o
loga a un ndice que se aproxima al de la recom binacn ilegtim a. Co
mo resultado, es posible efectuar en la lnea celular cultivada delecin
gnica dirigida y anlisis de m utacin con relativa conveniencia. Se
han logrado rpidos adelantos en transgnica de pollo, tecnologa de
clula madre (CM) em brionaria y criopreservacin de esperma, clu
las de blastodisco, clulas germen prim ordiales y clulas madre em
brionarias (ME). Estas tecnologas ms recientes harn posible la
creacin de sistem as basados en pollos para crear modelos de enfer
medades humanas.
XENOPUS (RANA AFRICANA CON GARRAS)
La rana africana adquiri su nombre (xenopus, es decir, pata extraa) por
las garras afiladas en los dedos de sus patas traseras membranosas fuer
tes y grandes. Desde hace mucho tiempo es un modelo favorito de desa
rrollo embrionario y biologa celular; son accesibles todas las etapas del
desarrollo y el tamao comparativamente grande de los huevos y embrio
nes muy tempranos facilita las micromanipulaciones, incluidos las microinyecciones (mRNA, anticuerpos y oligonucletidos antisentido), injertos de
clulas y experimentos de marcado. A mediados de la dcada de 1990
(vase Beck y Slack, 2001) se desarrollaron mtodos potentes para gene
rar embriones transgnicos y se han planeado selecciones para mutagnesis impresionantes para X. tropicalis.
El pollo tiene varias ventajas com o m odelo del desarrollo. Del m ism o
modo que los mamferos, las aves son amniotas (el embrin tiene
membranas am niticas) y su desarrollo se asemeja muy de cerca al de
los mamferos. Sin embargo, mientras que un em brin de mamfero
depende de la madre para su nutricin (con intercam bio a travs de la
placenta), los embriones de aves no tienen placenta y por consiguien
te son sistemas de autodesarrollo. Debido a que el em brin de pollo se
desarrolla fuera del cuerpo, es accesible en todas sus etapas. Adems
de obtenerse con facilidad, el em brin del pollo tiene la ventaja de ser
grande y relativamente transparente, lo que permite llevar a cabo con
facilidad manipulaciones m icroquirrgicas delicadas. En consecuen
cia, representa un excelente sistema en el que es posible com binar es
tudios moleculares con embriologa habitual (vase Brown y cois.,
2003).
Fotografa de Amaya y cols., Trends Genet 1998;14:253-255, Elsevier.
Xenopus laevis (izquierda en la fotografa anterior)
X. leavis tiene un tiem po de generacin prolongado de uno a dos aos
y puede inducirse para que produzca a la vez 300 a 1 000 huevos, que
son grandes (1 a 1.3 m m ). Ha resultado un gran modelo para estable
cer los m ecanism os de las decisiones tempranas de destino, el patrn
del plan bsico del cuerpo y la organognesis. Las contribuciones en
biologa celular y bioqum ica incluyen trabajo bsico sobre replicacin
crom osm ica, ensamble de crom atina y nuclear, componentes del c i
clo celular, elementos citoesquelticos y vas de sealamiento. X. lae
vis tiene un genoma alotetraploide (se duplica un nmero muy elevado
de genes com o resultado de un fenmeno de duplicacin del genoma
que ocurri tal vez hace 30 millones de aos, aunque muchos de los
genes duplicados de manera original se perdieron desde entonces) y
una desventaja notoria es que no ha sido fcil llevar a cabo anlisis ge
nticos.
8.4
255i ^
Recuadro 8 8 . A n im a le s multicelulares m odelos para com prender el desarrollo, las enferm edades y la
f u n c i n gnica (con clusin)
Xenopus tropicalis (derecha en la fotografa anterior)
La rana X. tropicalis ms pequea tiene un tiem po de generacin com
parativamente corto ( < 5 meses) y puede inducirse para que produz
ca 1 000 a 3 000 huevos a la vez, aunque ms pequeos que los de
X. laevis. Se relaciona desde el punto de vista evolutivo m uy de cerca
con esta ltim a, pero tiene un genoma diploide y es ms dcil para los
anlisis genticos.
RATN
Es el organismo modelo que se consider ms importante para el pro

yecto del genoma humano (vase Melsler, 1996). Es la especie de mam
fero con la gentica ms desarrollada y es un modelo del desarrollo de
mamferos que se utiliza con amplitud. Su tamao pequeo y tiempo de
generacin corto hicieron posibles programas de mutagnesis a gran es
cala y cruzamientos genticos extensos, adems de que varias caracte
rsticas contribuyen al mapeo gnico y de fenotipos (vase recuadro
14-2). En virtud del nivel de conservacin de secuencias comparativa
mente alto entre las secuencias de codificacin humanas y del ratn, ca
si todos los genes humanos tienen un homlogo en el ratn fcil de
identificar. Estn conservados segmentos cromosmlcos grandes entre
el ratn y el hombre (figs. 14 -7 ,1 4 -8 ) y, por consiguiente, si se mapea a
una gran resolucin una regin del genoma de ratn es posible utilizar la
informacin para formular predicciones sobre la regin ortloga del ge
noma humano (y viceversa). Esto es en particular relevante en Investiga
cin mdica porque el ratn ortlogo y las mutantes humanas suelen
mostrar fenotipos similares, de tal manera que la clonacin posicional de
a tres de los principales centros relacionados con el proyecto del ge

noma humano: Wellcome Trust Sanger Institute, Whitehead Insti
tute/MIT y Baylor College of Medicine.
En abril del 2001, Celera anunci que su proyecto rival de secuenciacin del ratn haba proporcionado una cobertura seis veces mayor
del genoma de ratn, incluidas las secuencias de tres cepas de ratn:
129Xl/SvJ, DBA/2J y A/J. No se dispuso libremente de los datos de
la secuencia de Celera; por el contrario, se restringi el acceso a los que
estuvieron preparados para pagar los elevados honorarios de suscrip
cin. En mayo del 2002, el MSGS anunci que haba completado un
campo siete veces mayor del genoma del ratn C57BL/6J terminado
en 96% y que pudo consultarse de inmediato en internet, antes de pu
blicarse un artculo convencional en una revista en diciembre del
2002 (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002).
Se dispuso de otras versiones de los datos de secuencia del ge
noma del ratn como resultado del Ensembl proyect, una colabo
un gen de enfermedad en una especie puede tener una gran im portancia

para la otra especie (seccin 14.3.5). La capacidad para desarrollar rato
nes con modificaciones genticas predeterminadas de la lnea germen
(mediante tecnologa transgnica y blancos gnicos en clulas madre
embrionarias) es un medio potente para estudiar la expresin y funcin
gnicas y crear modelos de enfermedades humanas en el ratn. Vase el
captulo 20 para ms detalles.
RATA
Las ratas, mucho ms grandes que los ratones, son desde hace muchos
aos el mamfero de eleccin para anlisis fisiolgicos, neurolgicos, far
macolgicos y bioqumicos. Tambin pueden proporcionar sistemas ge
nticos modelos para trastornos vasculares y neurolgicos humanos
complejos, com o hipertensin y epilepsia (por diversas razones no exis
ten modelos de ratn para estas afecciones). No obstante, el anlisis ge
ntico en ratas de laboratorio est mucho menos avanzado que en
ratones, en parte debido al costo relativamente alto de los programas de
apareamiento de ratas y la dificultad actual para modificar la lnea germen
de ratas mediante blancos gnicos. Sin embargo, en fecha reciente se
elaboraron mapas genticos y fsicos de alta resolucin y en la actualidad
se dispone de la secuencia genmlca.
racin entre el European Bioinformatics Institute y el Wellcome

Trust Sanger Institute (http://www.ensembl.org/Mus musculus), a
travs de la University of California en Santa Cruz (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway?db=mm2). Los datos de la estruc
tura inicial de la secuencia sugirieron que el ratn tena el mismo
nmero de genes que el hombre (cerca de 30 000 o un poco me
nos de esta cifra; vase Mouse Genome Sequencing Consortium,
2 00 2 ), pero con algunas diferencias interesantes (vase seccin
12.4.1). Adems de proporcionar datos importantes sobre los ge
nes del ratn y la estructura de su genoma, los datos tambin han
sido valiosos en la definicin de la variacin de la secuencia y en
genm ica comparativa. Por ejemplo, ha resultado muy til la com
paracin con la secuencia del genoma humano para definir se
cuencias muy conservadas (no slo la codificacin del DNA sino
asimismo secuencias reguladoras y otras) y conocer la evolucin
del genoma (seccin 12.3.2).
234
CAPTULO OCHO
Otros proyectos del genoma de metazoarios (vase cuadro

8-4)
P ro yecto s d e l g en o m a d e la m osca. Adems de Drosophila y

proyectos del mosquito (seccin 8.4.4), se inici asimismo un
proyecto de genoma para la a b eja que es interesante por: a) sus
instintos sociales potentes y caracteres conductuales nicos
(til para los neurobilogos); b) su importancia en la salud hu
mana (las posibles consecuencias relevantes de las picaduras de
abeja y como modelo para resistencia a los antibiticos, inmu
nidad, reacciones alrgicas, etc.; y c) su importancia para la co
munidad agrcola como polinador.
P royectos d e l gen o m a d e aves. El primero en la lista es el p o llo

por su importancia como modelo de desarrollo (recuadro 8 - 8).
P royectos d e l g en o m a d e p eces. Hacia fines del ao 2002 se
haba obtenido la mayor parte de la secuencia genmica de dos
especies de p e z sop la d or, un modelo de un genoma de verte
brados compacto y del p ez cebra, un modelo del desarrollo y
cada vez ms importante de enfermedad y funcin genica (va
se cuadro 8-4 y recuadro 8 - 8 ).
P royectos d e l gen o m a d e la rana. Como se detalla en el recua
dro 8 - 8 , el X enopus es un modelo excelente del desarrollo y se
estableci el compromiso de secuenciar el genoma de Xenopus
tropicalis, que es ms tratable desde el punto de vista gentico
que Xenopus laevis, que se ha estudiado ms.
P ro yecto s d e l g en o m a d e gu sa n os. Adems de los proyectos

para nematodos que viven libremente (el proyecto terminado de
C. elegans [seccin 8.4.3] y el proyecto ms reciente para se
cuenciar una especie relacionada de modo distante, C. briggsae
[vase seccin 12.3.2]), se desarroll un importante proyecto
de colaboracin entre el Wellcome Trust Sanger Institute y la
University of Washington y la University of Edinburgh a fin de
Cuadro 8-4, Proyectos de genomas de metazoarios importantes (animales multicelulares) (vase las lecturas adicionales para
obtener fuentes de referencia electrnicas).
Clase animal Especie (nombre comn)
Tamao del genoma
Centro de coordinacin3
Ascidios
Ciona intestinalis (ascidia)
200 Mb
US DOE Joint Genome Institute
Aves
Gallus gallus (pollo)
1 200 Mb
Washington University
Peces
Brachydanio rerio (pez cebra)

Fugu rubripes (pez soplador)
Tetraodon nigroviridis (pez soplador)
1 900 Mb
400 Mb
350 Mb
Wellcome Trust Sanger Institute

International Fugu Genome Consortium
Genoscope, Paris
Ranas
Xenopus tropicalis
1 700 Mb
US DoE Joint Genome Institute
Insectos
Apis mellifera (abeja)

/letfes aegypti (mosquito de la fiebre amarilla)
Anopheles gambiae (mosquito del paludismo)
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta; regin
de eucromatina)
270
780
278
165
Baylor College of Medicine

TIGR (The Institute for Genome Research)
International (pero sobre todo Celera & Genoscope)
Celera/Drosophila Genome Center/Howard Hughes
Medical Institute
Drosophila pseudoobscura (regin de eucromatina)
125 Mb
Mamferos
Sos taurus (vaca)

Canis familiars (perro)
Mus musculus (ratn)
Pan troglodytes (chimpanc comn)
Rattus norvegicus (rata)
3
2
2
3
3

Whitehead/MIT
Mouse genome sequencing consortium/Celera
Whitehead/MIT and Washington University
Gusanos
redondos
Caenorhabditis elegans
Caenorhabditis briggsae
100 Mb
80 Mb
Wellcome Trust Sanger Institute/WashingtonUniverslty

Washington University
Erizo de mar
Strongylocentrotus purpuratus
800 Mb
Baylor College of Medicine (probablemente)
Mb
Mb
Mb
Mb
000
800
500
500
100
Mb
Mb
Mb
Mb
Mb
aLas direcciones en la red para ios principales centros de secuenciacin relacionados son las siguientes:
Baylor College of Medicine of Genome Sequencing Center
http://hgsc.bcm.tmc.edu/
Celera
http://www.celera.com /
DoE Joint Genome Institute
http://www.jgi.doe.gov/
Genoscope
http://www.genoscope.cns.fr/
TIGR (The Institute for Genome Research)
http://www.tigr.org/
Washington University Genome Sequencing Center
http://genome.wustl.edu/
Wellcome Trust Sanger Institute
http://www.sanger.ac.uk/
Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research
http://www-genome.wi.m it.edu
8.4
secuenciar cientos de miles de EST de alrededor de 20 especies de

n em a tod os parsitos. Se incluye a Ascaris lumbricoides, que es
el parsito nematodo ms comn de seres humanos y que se es
tima que infecta a 1.47 mil millones de individuos (la afeccin
puede ocasionar neumona originada por la migracin de los
gusanos a travs de los pulmones, bloqueo del tubo digestivo o
los conductos biliar o pancretico; vase http://nematode.net).
P royectos d e l gen o m a d e m am feros. En fecha reciente se ini
ciaron proyectos para secuenciar los genomas de:
el ch im p a n c, el relacionado ms de cerca con el hombre.
El inters en la secuenciacin del genoma del chimpanc
proviene de un nexo evolucionista muy prximo al hombre.
La informacin puede suministrar datos valiosos sobre en
fermedades en las que las correspondientes en chimpancs
son raras o as parece porque existen varios trastornos m
dicos que afectan a los seres humanos pero no a los chim
pancs (p. ej., la progresin de HIV a sida, paludismo
inducido por Plasmodium falciparum)-, vase Cyranoski
[2002] y Olson y Varki [2003];
la rata es un modelo valioso para investigacin cardiovascular,
psicolgica y fisiolgica. El Baylor College of Medicine anun
ci una estructura preliminar de la secuencia del genoma y la
envi al GenBank en noviembre de 2002. La secuencia incluye
90% del genoma (2 560 Mb del total estimado de 2 800 Mb;
vase http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/rat/);
la vaca, o v eja y cerd o son animales de granja valiosos;
el p e r r o es un modelo de enfermedad valioso (los perros su
fren muchas de las mismas afecciones que los seres huma
235
nos). El perro tambin es un modelo de importancia para

gentica de la conducta y se utiliza con amplitud en inves
tigacin farmacutica.
P royectos d e l g en o m a d e an im a les m a rin os sim ples.
El erizo d e m a r ha sido un sistema modelo notorio durante
muchos aos en el estudio de biologa bsica, en particular
la biologa del desarrollo. Es un deuterostoma y por consi
guiente se relaciona en trminos comparativos muy de cerca
con vertebrados y el hombre (vase fig. 12-23). Existe un
gran cmulo de informacin sobre la expresin gnica y el
erizo de mar es un modelo til para aprender la forma en
que las vas de genes y protenas regulan el crecimiento y el
desarrollo. En fecha reciente se inici un proyecto de geno
ma para Strongylocentrotus purpuratus.
Los a scid io s (llamados, asimismo, tunicados) son un grupo
de animales marinos que pasan la mayor parte de su vida
unidos a muelles, rocas o la parte inferior de botes. Pertene
cen al phylum urochordata y se relacionan en realidad ms
de cerca con los vertebrados que la mayor parte de otros
animales invertebrados. Ciona intestinalis tiene el genoma
ms pequeo de cualquier cordado manipulable por medios
experimentales y proporciona un buen sistema para explo
rar los orgenes evolucionistas del linaje cordado. Dehal y
colaboradores (2002 ) publicaron un esquema de la secuen
cia del genoma de C. intestinalis. El genoma de 117 Mb tie
ne alrededor de 16 000 genes y anlisis genmicos
comparativos con genomas de vertebrados secuenciados
han suministrado valiosa informacin sobre la evolucin de
cordados y vertebrados.
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Mapping Resource Centre en
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la Genome Web conservada en el
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Informacin electrnica sobre Proyectos de genomas para
microorganismos y organismos modelo; pueden encontrar
se en diversos sitios, que incluyen:
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http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbcomplete.html y
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Pgina en la red sobre el genoma parasitario
http://www.rna.ucla.edu/par/
The U.S. national Human Genome Research Institute's sitio
en la red
http://www.genome.gov/Pages/Research/Sequencing/
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Informacin electrnica sobre Organismos modelo, incluyen:
El sitio de organismo modelo de NIH, en
http://www.nih.gov/science/models
236 I CAPTULO OCHO
La Model Organisms Virtual Library en

http://www.ceolas.org/VL7mo/
El sitio de NCBI Model Organisms en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/model/
Glosario de organismos Modelo y otros, en
http://www.genomicglossaries.com/content/rnodelorganisms.glossary.asp
Proyecto en la red el Tree of Life, en http://tolweb.org/tree/
Listas de resmenes electrnicos de todos los Proyectos de
genomas; pueden encontrarse en diversos sitios, incluyendo:
Una lista de proyectos de genomas terminados y en curso
recopilados por Integrated Genomics en http://ergo.integratedgenomics.com/GOLD/
Una lista de proyectos de genomas terminados y en curso

recopilados por the European Bioinformatics Institute en
http://www2.ebi.ac.uk/genomes/
Indagadores del Genoma humano y bases de datos integra
das, incluyen:
Ensembl en http://www.ensembl.org
NCBI Map Viewer en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgibin/Entrez/map-search
UCSC Genome Browser en http://genome.ucsc.edu
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CAPTULO NUEVE
- . i
Organizacin del genoma humano

9.1
9.2
Organizacin general del genoma humano

Organizacin, distribucin y funcin de genes RNA humanos
9.3
Organizacin, distribucin y funcin de genes humanos que

codifican polipptidos
9.4
DNA no codificante de repeticin tndem
9.5
DNA no codificante repetido disperso
Recuadro
Recuadro
Recuadro
Recuadro
Recuadro
9-1
9-2
9-3
9-4
9-5
Variacin del nmero de copias del genoma en clulas humanas

Autonoma limitada del genoma mitocondrial
Metilacin del DNA e islotes CpG
Especificidad de anticodn de tRNA citoplsmico eucariota
Genoma humano y estadsticas de genes humanos
240
CAPTULO NUEVE
ORGANIZACIN DEL GENOMA HUMANO
9.1
Organizacin general del genom a

hum ano
9.1.1 Generalidades del genoma humano

Genoma humano es el trmino que se utiliza para describir la infor
macin gentica total (contenido de DNA) de las clulas humanas.
En realidad, comprende dos genomas: un gen o m a n u clea r complejo
con unos 30 000 genes y un gen o m a m itoco n d ria l muy simple con
37 genes (fig. 9-1). El genoma nuclear proporciona el gran volumen
de informacin gentica esencial, que en su mayor parte especifica la
sntesis de polipptidos en ribosomas citoplsmicos.
Las mitocondrias poseen ribosomas propios y los muy pocos ge
nes del genoma mitocondrial que codifican polipptidos producen
mRNA que se traduce en los ribosomas mitocondriales. Sin embar
go, el genoma mitocondrial slo especifica una porcin muy peque
a de las funciones mitocondriales especficas; el mayor volumen
de los polipptidos mitocondriales lo codifican genes nucleares y se
sintetiza en ribosomas citoplsmicos, antes de llevarse al interior
de las mitocondrias.
Las comparaciones entre seres humanos y ratones demostraron
que menos de 5% del genoma est conservado de forma notoria,
incluido 1.5% para el DNA codificante y un porcentaje un poco
mayor que comprende secuencias conservadas dentro de secuencias
no traducidas, elementos reguladores, etc. (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002; Dermitzakis y cois., 2002). Casi todo
el DNA codificante se emplea para elaborar mRNA y en conse
cuencia polipptidos, pero una minora importante (cuando menos
5% y tal vez casi 10%) de los genes humanos especifica RNA no
1 .5 %
codificante (es decir, no traducido) (gen es RNA). En fecha recien

te se identific una diversidad de genes RNA nuevos, lo que obli
g a una revaloracin de la funcin del RNA.
Las secuencias codificantes pertenecen con frecuencia a familias
de secuencias relacionadas (fam ilias d e secu en cia s d e DNA) que
pueden organizarse en grupos en uno o ms cromosomas o disper
sarse. Estas secuencias duplicadas surgieron por diversos mecanis
mos de d u p lica ci n g n ica que ocurrieron en el transcurso de la
evolucin. La secuenciacin del genoma proporcion la primera
valoracin de la duplicacin de todo el genoma y revel una canti
dad considerable de d u p lica ci n segm en ta ria especfica de prima
tes (como resultado de duplicaciones muy recientes se encuentran
bloques de secuencias relacionados muy de cerca en diferentes cro
mosomas o distintas regiones de un cromosoma aislado; seccin
12.2.5 y fig. 12-13; vase Bailey y cois., 2002).
Los mecanismos que dan lugar a genes duplicados tambin ori
ginan secuencias no funcionales relacionadas con el gen, entre ellas
seu d o gen es y fr a g m en to s g n ico s (seccin 9.3.6). Existen numero
sas copias defectuosas de genes RNA diseminadas en la totalidad
del genoma; asimismo, para algunos genes que codifican polippti
dos tambin se encuentran muchos genes relacionados: anlisis de
las secuencias terminadas de los cromosomas 21 y 22 predicen un
total cercano a 20 000 genes en el genoma (Harrison y cois., 2002;
Collins y cois., 2003).
Al igual que en otros genomas complejos, un componente muy
considerable del genoma humano est constituido por DNA no c o
difica n te. Un componente valorable est organizado en repeticio
nes tndem de cabeza a cola (--*-> ~f), pero la mayor parte consiste
en repeticiones dispersas que se originaron de transcritos de RNA
-3%
-5 %
<2 %
I I Muy conservado (codificacin)

I . I Muy conservado (otros)
I
Genoma nuclear
(24 m o l c u la s d e D N A lineal
d e d o b le c a d e n a , 3 2 0 0 M b ; - 3 0 0 0 0
genes)
I Repeticiones basadas en
transposn
d ] Heterocromatina
I I Otros no conservados
Genoma mitocondrial
(un D N A circ u la r d e d o b le c a d e n a
d e 1 6 .6 kb; 3 7 g en es)
Fig. 9-1. Organizacin del genoma humano.

La linea punteada en la parte media representa el tamao relativo del genoma mitocondrial mediante la misma escala para el genoma nuclear.
Obsrvese asimismo la diferencia notable entre los dos genomas en la extensin del DNA muy conservado (secuencia de codificacin, secuencia
reguladora, etc.) y la fraccin de DNA no codificante muy repetida.
9.1 I ORGANIZACIN GENERAL DEL GENOMA HUMANO
por retro tra n sp o sici n (las transcriptasas inversas celulares pueden

copiar transcritos de RNA para elaborar cDNA natural que puede
integrarse en cualquier parte del genoma).
9.1.2 El genoma mitocondrial consiste en un dplex

de DNA circular pequeo empacado a densidad
con informacin gentica
Estructura general y herencia del genoma mitocondrial
El genoma mitocondrial humano est definido por un tipo nico
de DNA circular de doble cadena cuya secuencia completa de nudetidos ya se estableci (Anderson y cois., 1981; vase asimismo la
base de datos del genoma mitocondrial Mitomap en http://www.
mitomap.org/). Tiene 16 569 pb de largo y 44% de extensin (G
C). Las dos cadenas de DNA tienen composiciones de bases direrentes en grado notable: la cadena pesada (H, del ingls heavy)
s rica en guaninas, la cadena ligera (L, del ingls light) es abun
dante en citosinas. Aunque el DNA mitocondrial es en especial de
oble cadena, una seccin pequea muestra una estructura de
DNA d e ca d en a trip le debido a la sntesis repetida de un segmen

to corto de la cadena pesada de DNA, el DNA 7S (vase fig. 9-2 y
Clayton, 1992, para una revisin general de la transcripcin y replicacin de DNA mitocondriales en animales). De manera carac
terstica, las clulas humanas contienen miles de copias de la
molcula de DNA mitocondrial de doble cadena, pero la cifra pue
de variar de forma considerable en diferentes tipos de clulas (va
se recuadro 9-1).
Durante la formacin del cigoto, el espermatozoo contribuye al
vulo con su genoma nuclear pero no con el mitocondrial. En con
secuencia, al genoma mitocondrial del cigoto lo determina de ma
nera exclusiva el que se encuentra de modo original en el vulo no
fecundado. Por consiguiente, el genoma mitocondrial es de heren
cia materna: los varones y las mujeres heredan sus mitocondrias de
la madre pero los varones no las transmiten a las generaciones sub
secuentes. Por esta razn, los genes o las variantes de DNA codifi
cados de forma mitocondrial suministran el patrn de genealoga
que se muestra en la figura 4-4. Durante la divisin celular mittica, las molculas de DNA mitocondrial de la clula en divisin se
segregan en una forma aleatoria a las dos clulas hijas.
C lave:
0 H, 0 L, origen y direccin
de la sntesis de las cadenas
pesada y ligera
PH, PL, origen y direccin

de la transcripcin de las
cadenas pesada y ligera
G e n e s rR N A
G e n e s tR N A
G e n e s q u e c o d ific a n
p ro ten as
ig------- "
Rg. 9-2. Genoma mitocondrial humano.

E asa D tiene una estructura de triple cadena debido a la sntesis duplicada de una tira de la cadena pesada (H, del ingls heavy). La transcripcin de
cadena pesada se origina a partir de dos promotores espaciados cercanos en la regin del asa D (agrupados por razones de claridad com o PH).
_a transcripcin de los promotores PH sigue la direccin dextrgira alrededor del crculo, pero en sentido levgiro del promotor PL de cadena ligera.
Et ambos casos se cortan los transcritos primarios grandes a fin de generar RNA para genes individuales. Todos los genes carecen de intrones y estn
agrupados muy de cerca con un caso de genes superpuestos: el gen de ATP-asa 8 cubre de modo parcial al gen de ATP-asa 6 (vase fig. 9-3). Otros
jsnes que codifican polipptidos especifican siete subundades de deshidrogenasa NADH (ND4L y ND1-ND6)', tres subunidades de oxidasa de
atocrom o c
(C01-C03) y citocrom o b (CYB).
242
CAPTULO NUEVE
R ecuadro 9-1. Variacin del nm ero de co p ia s del g en o m a en clu las hum anas
Con frecuencia, los libros de texto indican que las clulas de un organis
mo muestran poca variacin en su contenido de DNA y ello es sin duda
cierto cuando se compara con el contenido de RNA o protenas. No obs
tante, puede haber diferencias notorias en el contenido de mtDNA y el de
DNA nuclear en diferentes tipos de clulas.
Variacin del nmero de copias del genoma mitocondrial. Ciertas
clulas (p. ej., clulas de la piel diferenciadas de form a terminal) ca
recen de cualquier mitocondria y por consiguiente no tienen mtDNA.
El nmero de copias de mtDNA en otras clulas somticas vara pe
ro, de manera caracterstica, es de 1 000 a 10 000 (p. ej., los linfocitos poseen alrededor de 1 000 molculas de mtDNA). Los gametos
son excepcionales: las clulas espermatozoos tienen unos cuantos
cientos de copias de mtDNA y los oocitos tal vez 100 000, lo que
constituye ms de 30% del DNA del oocto.
Variacin del nmero de copias del genoma nuclear. Las clulas
nucleadas (dlploldes) muestran poca variacin en el contenido de
Genes mitocondriales
El genoma mitocondrial humano consiste en 37 genes. En 28 de
ellos, la cadena pesada es la cadena de sentido; en los otros nueve,
la cadena de sentido es la ligera (fig. 9-2). De los 37 genes, un to
tal de 24 especifica un producto RNA maduro; 22 molculas de
tRNA mitocondrial y dos molculas de rRNA mitocondrial; un
rRNA 23S (un componente de la subunidad grande de los ribosomas mitocondriales) y un rRNA 16S (un componente de la subu
nidad pequea de los ribosomas mitocondriales). Los 13 genes
restantes codifican polipptidos que se sintetizan en ribosomas mi
tocondriales.
Cada uno de los 13 polipptidos codificados por el genoma mi
tocondrial es una subunidad de uno de los co m p lejo s resp ira torios
mitocondriales, las enzimas de mltiples cadenas de la fo s fo r ila
ci n ox idativa que estn encargadas de la produccin de ATP. Sin
embargo, existen casi 100 diferentes subunidades polipptidas en el
sistema mitocondrial de fosforilacin oxidativa y por lo tanto la in
mensa mayora la codifican genes nucleares (vase recuadro 9-2). El
genoma nuclear codifica a todas las otras protenas mitocondriales
y se traducen en ribosomas citoplsmicos antes de llevarse al inte
rior de las mitocondrias (recuadro 9-2; fig. 1-11).
Cdigo gentico mitocondrial

El cdigo gentico mitocondrial se usa para descodificar los trans
critos de cadenas pesada y ligera a fin de proporcionar un total de
slo 13 polipptidos. Esta carga funcional muy pequea permiti
que el cdigo gentico mitocondrial derivara del cdigo gentico
universal (que retienen los genes nucleares por la necesidad de
conservar las funciones de los 30 000 genes). Hay 60 codones mi
tocondriales de sentido, uno menos que en el cdigo gentico nu
clear, y cuatro codones de detencin, dos de los cuales, UAA y
UAG, sirven asimismo como codones de detencin en el cdigo ge
ntico nuclear, pero los otros dos son AGA y AGG y especifican arginina en el cdigo gentico nuclear (vase fig. 1-22). UGA
codifica triptfano en lugar de servir como codn de detencin y
AUA especifica metionina no isoleucina.
DNA, pero la ploid a diferencial significa que en algunas clulas hay

divergencias sustanciales en el contenido de DNA: nuliploidia -c lu
las que carecen en lo absoluto de DNA, tal y com o se observa en m u
chos tipos de clulas diferenciadas de modo terminal, como
eritrocitos (que no tienen ncleo) y clulas de la piel diferenciadas de
modo terminal (sin organelos)-; haploidia -existe la mitad del conteni
do de DNA de las clulas diploides en las clulas vulo y espermato
zoo-; poliploida -algunas clulas tienen de manera natural muchas
copias del juego normal de cromosomas como resultado de re p lica
cin endom itlica (en la cual las clulas llevan a cabo varias rondas
de duplicacin de DNA pero sin ninguna divisin celular; p. ej., las c
lulas de regeneracin del hgado y otros tejidos son tetraploides de
manera natural y los megacariocitos gigantes de la mdula sea pue
den contener hasta 16 veces la cantidad de DNA de clulas diploides),
o com o efecto de fu si n c e lu la r s in c itia l (p. ej., las clulas de las
fibras musculares se form an por fusin de mltiples clulas y dan
lugar a clulas nicas con mltiples ncleos; vase fig. 3-3).
El genoma mitocondrial codifica todas las molculas de rRNA

y tRNA que necesita para sintetizar protenas, pero se basa en los
genes codificantes nucleares para proporcionar todos los otros com
ponentes (como los componentes protenicos de ribosomas mito
condriales, sintetasas de aminoacil-tRNA, etc.). Puesto que slo
existen 22 tipos diferentes de tRNA mitocondrial humano, las mo
lculas de tRNA individuales deben estar disponibles para interpre
tar varios codones distintos. Ello es posible por el b a m b oleo d e la
ter cer a b a se en la interpretacin del codn. Ocho de las 22 mo
lculas de tRNA tienen anticodones que son capaces de reconocer
familias de cuatro codones que slo difieren en la tercera base y 14
reconocen pares de codones que son idnticos en las posiciones de
las dos primeras bases y comparten una purina o una pirimidina en
la tercera base. For consiguiente, entre ellas, las 22 molculas de tR
NA mitocondrial pueden reconocer un total de 60 codones [(8 X
4) + (14 X 2)].
Adems de sus diferencias en la capacidad gentica y distintos
cdigos genticos, los genomas mitocondrial y nuclear difieren en
muchos otros aspectos de su organizacin y expresin (cuadro 9 - 1).
DNA codificante y no codificante

A diferencia de su contraparte nuclear, el genoma mitocondrial hu
mano es muy compacto: alrededor de 93% de las secuencias de
DNA representa secuencias codificantes. Todos los 37 genes mito
condriales carecen de intrones y estn empacados de forma estrecha
(en promedio uno por 0.45 kb). Las secuencias codificantes de al
gunos genes (en especial los que codifican las subunidades seis y
ocho de la ATP-asa mitocondrial) muestran cierta superposicin
(figs. 9-2 y 9-3) y en casi todos los otros casos las secuencias codifi
cantes de genes vecinos estn contiguas o separadas por una o dos
bases no codificantes. Algunos genes carecen incluso de codones de
terminacin; con la finalidad de superar esta deficiencia, tienen que
introducirse codones UAA a nivel postranscripcional (Anderson y
cois., 1981; vase la fig. 9-3).
La nica regin importante conocida que carece de algn DNA
codificante es la regin de desplazamiento del asa (D). Esta es la
regin en que se genera una estructura de DNA de cadena triple
9.1
ORGANIZACIN GENERAL DEL GENOMA HUMANO
243
---------------------------------------------------Recuadro 9-2. A utonom a lim itada del geno m a m itocondrial

C odificado por el genom a m itocondrial
C odificado por el genom a nuclear
Componentes del sistema de fosforilacin oxidativa
13 subunidades
> 80 subunidades
I Deshidrogenasa de NADH
7 subunidades
> 41 subunidades
0 subunidades
4 subunidades
1 subundad
10 subunidades
C om ponente m itocondrial
Reductasa de succinato de CoQ

i Complejo citocrom o b-c 1
V Complejo de oxidasa c de citocrom o
3 subunidades
10 subunidades
. Complejo de sintasa de ATP
2 subunidades
14 subunidades
Componentes del aparato de sntesis de protenas
24
Cerca de 80
Componentes rRNA
2 rRNA
Ninguno
Componentes tRNA
22 tRNA
Ninguno
Protenas ribosmicas
Ninguna
Cerca de 80
Otras protenas mitocondriales
Ninguna
Todas (p. ej., polimerasas de DNA y RNA

mitocondriales aunadas a muchas otras
enzimas, protenas estructurales y de
transporte, etc.)
Cuadro 9-1. Genomas nuclear y mitocondrial humanos.

Genoma nuclear
Genoma mitocondrial
Tamao
3 200 Mb
16.6 kb
Nmero de diferentes molculas de DNA
23 (en clulas XX) o 24 (en clulas XY); todo lineal
Una molcula de DNA circular
'...mero total de molculas de DNA por clula
46 en clulas dlploides, pero vara segn sea

la ploidia
Con frecuencia varios miles (pero variable;

vase recuadro 9-1)
Proteina relacionada
Varias clases de protenas histona y no histona
Gran parte sin protenas
\jm e r o de genes
- 3 0 000-35 000
37
Zensidad gnlca
- 1/100 kb
1/0.45 kb
DNA repetido
Ms de 50% del genoma, vase figura 9-1
Muy poco
Tfanscripcin
El mayor volumen de genes se transcribe

de modo individual (unidades de transcripcin
monocistrnicas)
Con transcripcin de mltiples genes de

cadenas pesada y ligera (unidades
de transcripcin policistrnicas)
n ro ne s
Se encuentra en la mayor parte de los genes
No hay
S de DNA de codificacin
-1 .5 %
-9 3 %
.s o de codn
Vase figura 1-22
Vase figura 1-22
: ecombinacin
Cuando menos una vez por cada par de meiosis

homologa
No es obvia
-terencia
Mendellana para secuencias en X y autosomas;

paterna para secuencias en Y
Materna de manera exclusiva
?:: la sntesis duplicada de una pieza corta de DNA de cadena H,

que se conoce como DNA 7S (vase fig. 9-2). La replicacin de las
hienas H y L es unidireccional y se inicia en sitios de origen espe
je o s . En la primera, es en el asa D y slo despus de sintetizarse
--i- dos tercios de la cadena H (mediante la cadena L como plan
tilla y tras desplazar la cadena H antigua) se expone el origen para
la replicacin de la cadena L. Con posterioridad, prosigue la repli
cacin de la cadena L en la direccin opuesta y emplea como plan

tilla la cadena H (fig. 9-2). El asa D contiene tambin el promotor
predominante para la transcripcin de las cadenas H y L. A dife
rencia de la transcripcin de genes nucleares, en la que casi siempre
se transcriben por separado genes individuales con promotores se
parados, la transcripcin del DNA mitocondrial se inicia desde los
promotores en la regin del asa D y contina en direcciones opuestas.
244
CAPTULO NUEVE
I----------------------A TP -asa8 8
366
1
522
53
577 9 202 9 206
6 8
P ro Lis Trp Tre Lis lie C is S e r L eu H is S e r Leu P ro P ro G ln S e r D e te n c i n
a t g -----------\ --------- c c a a a t g a a c g a a a a t c t g t t c g c t t c a t t c a t t g c c c c c a c a a t c c t a g g c c t a
ACATA $
M et
M e tA s n G lu A sn Leu F e
A la S e r F e
-I
lie A la P ro Tre lie Leu Gli Leu
Tre
17
226
I---------------------- A TP-asa 6 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Fig. 9-3. Los genes de las subunidades 6 y 8 de ATP-asa mitocondrial se superponen y traducen de manera parcial en diferentes marcos
de lectura.
Nota: los genes superpuestos comparten una cadena en sentido comn, la cadena H. Las coordenadas de la secuencia de codificacin son las siguientes:
subunidad 8 de ATP-asa, 8 366-8 569; subunidad 6 de ATP-asa, 8 527-9 204. La terminal C del gen de la subunidad 6 de ATP-asa est definida por
la introduccin postranscripcional de un codn UAA: despus de la transcripcin se corta el RNA ms all de la posicin 9 206 y se poliadenila y el
resultado es un codn UAA en el que los dos primeros nucletidos derivan de TA en las posiciones 9 205-9 206 y el tercer nucletido es la primera A
de la cola poli(A). Se sabe que otros genes humanos estn superpuestos, pero con frecuencia se transcriben a partir de cadenas opuestas.
para las dos cadenas diferentes, alrededor del crculo a fin de gene
rar grandes transcritos multignicos (vase fig. 9-2). De forma sub
secuente, se generan los RNA maduros por el corte de transcritos
multignicos.
9.1.3 El genoma nuclear consiste en 24 molculas

de DNA diferentes que corresponden a los
24 cromosomas humanos distintos
Tamao y estructura de los cromosomas humanos
De forma caracterstica, el ncleo de una clula humana contiene
ms de 99% del DNA celular (excepto algunas clulas especializa
das, sobre todo el oocito; vase el recuadro 9-1). El genoma nuclear
est distribuido entre 24 tipos distintos de molculas de DNA li
neal de doble cadena, cada una de las cuales tiene histonas y otras
protenas no histona enlazadas a ellas para conformar un cromoso
ma. Los 24 diferentes cromosomas (22 tipos de autosomas y dos
cromosomas del sexo, X e Y) pueden distinguirse con facilidad con
las tcnicas de bandeo cromosmico (fig. 2-15) y en gran parte se
clasificaron en grupos de acuerdo con el tamao y, en cierto grado,
con la posicin del centrmero (cuadro 2 - 3 ).
El DNA seleccionado para secuenciacin en el Proyecto del Ge
noma Humano no fue el genoma nuclear total, sino la p o r ci n eu crom tica , que comprende casi 3 000 Mb. Tambin existen ms de
200 kb de h etero cro m a tin a co n stitu tiv a condensada de manera
permanente y en regiones inactivas en sentido transcripcional, que
proporcionan un tamao total del genoma del orden de 3 200 Mb.
Por consiguiente, el tamao promedio de un cromosoma humano
se aproxima a 140 Mb, pero con una variacin considerable entre
los cromosomas y cantidades variables de heterocromatina consti
tutiva (cuadro 9-2). La ltima comprende segmentos de alrededor
de 3 Mb en cada centrmero adems de componentes grandes en
varios cromosomas, incluidos los brazos cortos de los cromosomas
acrocntricos 13, 14, 15, 21 y 22, el brazo largo del cromosoma Y
y las regiones grandes de los brazos largos de los cromosomas 1, 9
y 16 (que corresponden a constricciones cromosmicas secundarias-,
vase cuadro 9-2 y fig. 2-15 para una visin grfica).
Composicin de bases del genoma nuclear humano

El esquema de las secuencias del genoma humano (International
Human Cenme Sequencing Co'nsortium, 2001; Venter y cois., 2001)
sugiere un promedio de 41% de GC de la extensin del genoma
para el componente de eucromatina. Sin embargo, la composicin de
bases vara en grado considerable entre los cromosomas, de 38%
de GC para los cromosomas 4 y 13 hasta 49% en el cromosoma
19. De igual modo, vara con amplitud a lo largo de los cromoso
mas. Por ejemplo, el contenido promedio de GC en el cromosoma
17q es de 50% en las 10.3 Mb distales pero disminuye a 38% en
las 3.9 Mb adyacentes. Existen regiones de menos de 300 kb con
variaciones incluso ms amplias del contenido de GC, por ejemplo
de 33.1 a 59.3%.
Hay una correlacin clara entre la composicin de GC y el grado
de tincin con Giemsa durante el bandeo cromosmico. Por ejem
plo, 98% de las clonas de inserto grande que mapean las bandas G
ms oscuras est en regiones de 200 kb con un contenido bajo de GC
(promedio de 37%), mientras que ms de 80% de las clonas que ma
pean las bandas G ms claras se halla en regiones de alto contenido
de GC (promedio de 45%). Sin embargo, los anlisis de datos no
apoyan la existencia de iscoros estrictos, que se definen como regio
nes a gran escala de composicin homognea y se clasifican en cinco
grupos, segn sea el diferente porcentaje de composicin de GC (In
ternational Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
La proporcin de algunas combinaciones de nucletidos puede
variar en grado considerable. Por ejemplo, al igual que otros genomas
nucleares de vertebrados, el genoma nuclear humano tiene una esca
sez notable del dinucletido CpG (es decir, prximo a residuos de citosina y guanina en la misma cadena de DNA en la direccin 5' 3';
p indica enlace fosfodister). Al tomar en cuenta la cifra promedio
total de 41% de GC, las frecuencias de bases individuales son C =
G = 0.205 y, por consiguiente, la frecuencia esperada del dinucleti
do CpG es (0.205)2 = 0.042. Sin embargo, la frecuencia de CpG ob
servada se aproxima a la quinta parte. A pesar de la falta general de
CpG, ciertas regiones pequeas de DNA activas en sentido transcrip
cional tienen la densidad esperada de CpG y, de manera importante,
no estn metiladas (islotes CpG, vase recuadro 9-3).
9.1
ORGANIZACIN GENERAL DEL GENOMA HUMANO
245
Cuadro 9-2. Contenido de DNA de cromosomas humanos.

Cromosoma
Cantidad total
de 0NA (Mb)
Cantidad de
heterocromatina (Mb)
Cromosoma
Cantidad total
de DNA (Mb)
Cantidad de
heterocromatina (Mb)
279
30
13
118
16
251
14
107
16
221
15
100
17
197
16
104
15
198
17
88
176
18
86
163
19
72
148
20
66
140
22
21
45
11
10
143
22
48
13
11
148
163
12
142
51
27
Datos resumidos del International Human Genome Sequence Consortium (2001). Al utilizar estas cifras, el tamao del genoma humano total es de 3 289 Mb, pero se sabe
que esta cifra (y las cantidades totales de cromosomas individuales) incluye algunas duplicaciones artefactuales; un valor ms realista podra ser ~ 3 200 Mb.
9.1.4 El genoma humano contiene alrededor de 30 000

a 35 000 genes distribuidos de forma irregular
pero las cifras son inexactas
Nmero de genes humanos
En la actualidad se piensa que la cifra total de genes del genoma hu
mano oscila entre 30 000 y 35 000. Dado que con excepcin de 37
de ellos todos se localizan en el genoma nuclear, esto proporciona
un estimado general de 1 400 genes por cromosoma en promedio.
La gran mayora de estos genes codifica polipptidos, pero una mi
nora importante (cuando menos 5% y tal vez alrededor de 10 %)
especifica molculas de RNA no traducidas (seccin 9.2).
El International Human Genome Sequencing Consortium (2001)
v Venter y colaboradores (2001) estimaron 30 000 a 40 000 y 26 000
a 38 000 genes, respectivamente, aunque apoyaron las predicciones
ms cercanas a las cifras inferiores de estos lmites. Estos clculos
fueron mucho ms bajos que los anteriores basados en grupos de
datos incompletos (vase seccin 8.3.5), pero hay una gran incerridumbre acerca del nmero preciso de genes. En primer lugar,
existen dificultades generales para identificarlos. Cuando se public
el esquema de secuencias del genoma en el ao 2 0 0 1 , se identifi
caron con seguridad alrededor de 11 000 genes y mediante anlisis
de secuencias basados en computadora se predijeron muchos miles
ms. La prediccin de genes que codifican polipptidos basada en
computadora suele ser muy til, pero no siempre es segura (falsopositivos y falta de precisin en la identificacin de exones genuinos; vase Zhang, 2002). Es en especial mala la prediccin de genes
RNA basada en computadora; vase la seccin 8.3.5.
La cifra de genes humanos comparativamente baja fue una sor

presa. Despus de todo, en el gusano redondo de 1 mm de largo,
muy simple, Caenorhabditis elegans (que consiste slo en 959 clu
las somticas y tiene un genoma de una trigsima parte del tamao
del genoma humano), se demostr con anterioridad que posee
19 099 genes que codifican polipptidos y ms de 1 000 genes
RNA (consorcio de secuenciacin de C. elegans, 1998). Es posible
que la complejidad del genoma no siempre sea paralela a la com
plejidad biolgica (Drosophila melanogaster tiene de manera sustan
cial menos genes que C. elegans), pero los genomas secuenciados de
invertebrados (p. ej., insectos, gusanos redondos, erizo de mar)
tienden a mostrar un orden de 14 000 a 20 000 genes, en tanto que
los vertebrados (seres humanos, ratn, pez soplador, etc.) se incli
nan hacia una cifra aproximada de 30 000 a 35 000 (vase cuadro
12-4). Tambin suele explicarse la baja cifra inesperada de genes a
partir del incremento muy grande de la complejidad transcripcional que se esperara a medida que aumenta el nmero de genes, por
ejemplo de 20 000 a 30 000 (Claverie, 2001) y la complejidad adi
cional que cabe esperar por la frecuencia mayor de empalme (corte
y unin) alternativo en genomas complejos (Maniatis y Tasic,
2002; vase seccin 10.3.2).
Distribucin de genes humanos

Los genes humanos no estn distribuidos de manera uniforme en
los cromosomas. Las regiones constitutivas de heterocromatina ca
recen de genes pero incluso dentro de la porcin eucromtica del
genoma puede variar de manera sustancial la densidad gnica entre
regiones cromosmicas y asimismo en los cromosomas completos.
246
CAPTULO NUEVE
Recuadro 9-3. Metilacin del DNA e islotes CpG

Es probable que la metilacin del DNA tenga sitios biolgicos diferentes.
En algunas especies, como la levadura S. cerevisiae y el gusano redondo
C. elegans, al parecer no ocurre en absoluto; en muchas otras tiene sitios
relevantes. En bacterias, la metilacin del DNA se restringe en gran parte
a una proporcin de residuos adenina y citosina y quiz acta como un
mecanismo de defensa del husped: las endonucleasas de restriccin de
la clula husped reconocen y cortan DNA fago invasor (no metilado) en
secuencias de tecot\oc\m\en\o especificas, peto \as mismas secuencias

en el DNA husped estn metiladas de forma especifica y por consiguien
te protegidas de segmentacin (vase recuadro 5-2).
Cuando ocurre en metazoarios (animales multicelulares), la metilacin del
DNA suele incluir la metilacin de una proporcin de residuos de citosina,
con 5-m etilcitosina (Cm) resultante. En D. melanogaster, la cantidad de
metilacin de DNA es muy baja y casi toda la 5-metilcitosina se encuen
tra en dinucletidos CpT (Cmpt). En otros animales, el dinucletido CpG
es un blanco comn para la metilacin de citosina mediante metiltransferasas de citosina especfica y forma CmpG (vase figura, grupo A). Los
genomas de la mayor parte de los Invertebrados -aparte de D rosophilatienen valores moderadamente altos de CmpG que se encuentra concen
trado en dominios grandes de DNA metilado separado por dominios tam
bin grandes de DNA no metilado (m etilacin en m osaico).
Los vertebrados muestran los valores ms altos de 5-metilcitosina en el

reino animal y en este caso la metilacin est diseminada en la totalidad
del genoma. Se sabe que la metilacin del DNA tiene consecuencias im
portantes para la expresin gnica y permite que patrones particulares de
ella se transmitan de manera estable a clulas hijas (seccin 10.4.2). Se
ha sugerido asimismo que proporciona una forma de defensa de husped
contra transposones (seccin 10.4.3). Aunque la metilacin est disemi
nada en la totalidad del genoma de vertebrados, slo un porcentaje pe
queo de citosinas est metilado (alrededor de 3% en el DNA humano,
sobre todo como CmpG con un porcentaje pequeo como CmpNpG, en el
que N es cualquier nucletido).
HN
/ c\
C -C H ,
CH
NH
Tim in a
(formas de incompatibilidad con G;
reconocida de manera ineficiente por
el sistema de reparacin del DNA)
A) La citosina en los dinucletidos CpG es un blanco para metilacin en
el carbono 5 y forma 5-metilcitosina.
Desde el punto de vista qumico, la 5-metilcitosina es inestable y propen

sa a desaminacin, lo que tiene com o resultado timina (vase la figura,
grupo A). Las otras bases tambin son propensas a desaminacin (p. e j
la citosina no metilada es proclive a la desaminacin para formar uracilo). Durante periodos prolongados de la evolucin disminuy de manera
gradual el nmero de dinucletidos CpG en el DNA de vertebrados debi
do a la conversin lenta pero constante de CpG en TpG (y en CpA en la
Esta ltima se desamina de forma espontnea para formar timina (T), a la que
reconoce de manera insuficiente el sistema de reparacin del DNA y por tanto
tiende a persistir (empero, la desaminacin de citosina no metilada forma uracilo,
al que s reconoce el sistema de reparacin del DNA). El dinucletido CpG de los
vertebrados se sustituye de modo gradual por TpG y CpA.
cadena complementaria). Aunque la frecuencia total de CpG en el geno

ma de vertebrados es baja, hay tiras pequeas de DNA no metilado que
se extienden cientos de nucletdos, con frecuencia al marcar los extre

mos 5' de genes. Cuando se filtr el esquema de la secuencia del geno
se caracterizan por tener la frecuencia CpG esperada normal. Estos Islo

tes de densidad de CpG norm al (islotes CpG) son en trminos compara
tivos abundantes en GC (de manera caracterstica ms de 50% de GC) y
ma humano para eliminar secuencias de DNA no codificante repetidas

con nmero alto de copias, se identificaron alrededor de 30 000 islotes
CpG (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
9.2
ORGANIZACIN, DISTRIBUCIN Y FUNCIN DE GENES RNA HUMANOS
La primera informacin general sobre la distribucin de genes en el

genoma completo se obtuvo despus de hibridar fracciones de islo
tes CpG purificados del genoma a cromosomas en metafase. Con
base en lo anterior, se concluy que la densidad gnica debe ser al
ta en regiones subtelomricas y que algunos cromosomas (p. ej., 19
y 22) tienen abundancia de genes en tanto que otros (como X, 18)
son escasos en ellos (fig. 8-4). Las predicciones de la densidad dife
rencial de islotes CpG y gnica se confirmaron ms adelante cuan
do se publicaron esquemas de secuencias que incluan alrededor de
90% del genoma (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001 ).
La diferencia en el porcentaje de GC entre las bandas plidas y
oscuras con Giemsa indica asimismo densidades gnicas diferencia
les porque los cromosomas (p. ej., el 19) y las regiones (como las
bandas G plidas) abundantes en GC tambin son comparativa
mente abundantes en genes. Por ejemplo, el complejo de antgeno
de leucocitos humanos (HLA) ricos en genes (180 genes en un tra
mo de 4 Mb) est localizado dentro de la banda plida 6p21.3, en
tanto que una completa de 2.4 Mb de DNA que al parecer est de
dicada casi de modo exclusivo al gen nico mammoth, el gen de la
distrofina, est situada dentro de una banda G oscura.
9.2
Organizacin, distribucin y
funcin de genes RNA hum anos
Aunque la gran mayora de los genes humanos codifica polipptidos (seccin 9.3), una minora significativa especifica molculas de
RNA no codificante (esto es, no traducidas) como su producto fi
nal y tambin se describen como genes RNA (Eddy, 2001; Huttenhofer y cois., 2002; Storz, 2002; vase asimismo la base de datos de
RNA no codificante en http://biobases.ibch.poznan.pl/ncRNA/). El
genoma mitocondrial es excepcional porque 65% (24/37) de los
genes especifica molculas RNA maduras pero incluso en el geno
ma nuclear tal vez haya alrededor de 3 000 genes RNA, que cons
tituyen casi 10% del nmero total de genes (fig. 9-4).
Es probable que los estimados actuales del nmero de genes RNA
sean conservadores (por la dificultad para identificar genes RNA en
DNA secuenciado; vase seccin 8.3.5). En anlisis amplios de
transcritos de ratn (seccin 9.2.3) y en los basados en microconfiguraciones de transcritos de los cromosomas humanos 21 y 22
(Kapranov y cois., 2002) se interpret que sugieren muchos ms trans
critos que los esperados por las cifras gnicas previstas. Adems de
los genes RNA, hay muchos fragmentos de seudogenes/genes rela
cionados, en especial en los genes RNA transcritos por la polimerasa 111 de RNA.
En comn con otros genomas celulares, la mayor parte de los
genes RNA conocidos est dedicada a elaborar molculas que ayu
dan en el proceso general de expresin gnica (fig. 9-4). Algunos, de
forma notable las familias rRNA y tRNA, participan en la traduc
cin de mRNA. Muchas otras familias de RNA estn relacionadas
con la maduracin d el RNA e incluyen corte y modificacin especfica
de bases de otras molculas de RNA (mRNA, rRNA, tRNA y otras
especies de RNA). Adems, en fecha reciente se identific un n
mero notorio de otros genes RNA que pertenecen a diferentes cla
ses de RNA. Muchos tienen, o se espera que tengan, funciones
reguladoras de importancia y resaltan la diversidad funcional muy
considerable de las molculas de RNA (cuadro 9-3; seccin 9.2.3).
-2 0 0
-100
247
I snoR N A
H f sn R N A
m iR N A
I
I rR N A
[
I tR N A
-1 7 5
M
17 5
250
E3
RNA
an tisen tid o
500
Fig. 9-4. Genes RNA humanos de acuerdo con la clase.

La mejor estimacin (hacia mediados del ao 2003) era de ms de
3 000 genes RNA humanos distribuidos entre las diferentes clases que
se muestran. Nota: a) por razones operacionales (vase texto), el
esquema de las secuencias del genoma humano excluy grupos
gnicos rRNA y las cifras que se proporcionan se estimaron a partir de
otros datos; 6) debido a la dificultad para identificar genes RNA (vase
seccin 8.3.5), es posible que el nmero de algunas categoras de
RNA pequeas, como los miRNA, sean grandes subestimaciones; c) la
cifra predicha de genes RNA antlsentido se basa en datos de Collins y
colaboradores (2003) y est apoyada por anlisis equivalentes en el
ratn (vase FANT0M Consortium y el RIKEN Genome Exploration
Research Group Phase I & II Team, 2002).
9.2.1 Un total de casi 1 200 genes humanos codifican

rRNA o tRNA y estn organizados sobre todo en
grupos gnicos grandes
Genes RNA ribosmicos (rRNA)
Existen alrededor de 700 a 800 genes rRNA humanos, organizados
en particular en grupos de repeticin tndem y muchos seudogenes
relacionados. Las familias multignicas homogneas que ocurren en
arreglos tndem estn representadas menos en el esquema de se
cuencias del genoma humano (debido a la seleccin de enzimas de
restriccin utilizadas en la elaboracin de genotecas de BAC y la de
cisin para posponer la secuenciacin de BAC con huellas digitales
de baja complejidad que indican DNA de repeticin tndem). Co
mo resultado, podra suponerse el nmero preciso de genes rRNA
a partir del esquema de secuencias del genoma humano.
Adems de las molculas mitocondriales de rRNA 16S y 23S,
existen cuatro tipos de tRNA citoplsmico, tres vinculados con la
subunidad ribosmica grande (rRNA 28S, 5.8S y 5S) y uno con la
subunidad ribosmica pequea (rRNA 18S). De ellos, a los rRNA
28S, 5.8S y 18S los codifica una u tiid a d d e tra n scrip ci n n ica
(vase fig. 10 - 2 ) que est organizada en cinco grupos, cada uno con
30 a 40 repeticiones tndem, localizados en los brazos cortos de los
cromosomas humanos 13, 14, 15, 21 y 22.
Los genes rDNA 5S ocurren asimismo en configuraciones tn
dem, de las cuales la ms grande se encuentra en los cromosomas
lq4l-42, cerca del telmero. Existen 200 a 300 genes 5S verdaderos
en estos arreglos pero al parecer hay muchos seudogenes dispersos. La
245
CAPTULO NUEVE
Cuadro 9-3. Diversidad funcional del RNA humano.

Clase de RNA
Ejem plos
Funcin
A) CLASES PRINCIPALES DE RNA QUE PARTICIPAN EN LA EXPRESIN GNICA GENERAL

RNA ribosmico (rRNA)
16S rRNA
23S rRNA
28S, 5.8S, y 5S rRNA
18S rRNA
Componente de la subunldad ribosmica mitocondrial pequea (fig. 9-2)

Componente de la subunidad ribosmica mitocondrial grande (fig. 9-2)
Componentes de la subunidad ribosmica citoplsmica grande (fig. 10-2)
Componente de la subunidad ribosmica citoplsmica pequea (fig. 10-2)
RNA de transferencia (tRNA)
22 tipos de tRNA mitocondrial

49 tipos de tRNA citoplsmico
Enlace a codones en mRNA mitocondrial (fig. 9-2)

Enlace a codones en mRNA citoplsmico (fig. 9-4)
RNA nuclear pequeo (snRNA)

(participa en el empalme de RNA)
Muchos, incluidos:
U 1,U 2, U4 y U6 snRNA
U5snRNA
U4acat, U6acat, U11 y U12 snRNA
U7snRNA
Componentes de espliceosomas mayores

Componente de espliceosomas mayores y menores
Componentes de espliceosoma menor
Terminacin transcripcional de mRNA de histona
RNA nucleolar pequeo (snoRNA)

(participa en la modificacin y
procesamiento del RNA)
Ms de 100 tipos diferentes:

cerca de 80 C/D box snoRNA
cerca de 15 H/ACA snoRNA
U 3 y U8 snoRNA
Metilacin especfica de sitio del grupo OH 2 ' de rRNA

Modificacin especfica de sitio de rRNA por formacin de seudouridina
Procesamiento de rRNA
B) OTRAS CLASES DE RNA (vase tambin base de datos de RNA no codificante en http://biobases.ibch.poznan.pl/ncRNA/)
Micro-RNA
Cuando menos 200 clases

probables
Molculas de RNA regulador (seccin 9.2.3) muy pequeas

(22 nucletidos)
Inactivacin del cromosoma X

relacionado
X/S7RNA
75/XRNA
Vase seccin 10.5.6

Vase seccin 10.5.6
Impronta relacionada
Muchos, p. ej., RNAW79
Vase figura 10-24 para algunos ejemplos
Especfica de sistema nervioso
p. ej., RNA BC200
RNA antisentido
Tal vez alrededor de 1 500 tipos
p. ej., a H0XA11, MSX1, etc. (vase fig. 10-24)
Otras
Telomerasa de RNA
PC43RNA
PCGEMmm
Sf/IJRNA
TTY2RNA
7SKRNA
7SLRNA
Componente de telomerasa (seccin 2.2.5)

Antgeno 3 de cncer de prstata
Expresado en gran exceso en cncer de prstata
Coactivador especfico de varios receptores de esferoides
Familia especfica de testculo
Regulador transcripcional negativo del alargamiento de polimerasa II de RNA
Componente de la partcula de reconocimiento de seal para protenas de
transporte
principal justificacin para la repeticin de genes rRNA citoplsmicos se basa en dosis de genes: con una cifra comparativamente
grande de estos genes, la clula puede satisfacer la demanda enor
me de ribosomas citoplsmicos necesarios para la sntesis de pro
tenas.
Genes RNA de transferencia (tRNA)

Adems de los 22 genes tRNA mitocondriales, el esquema de se
cuencias del genoma humano publicado en 2001 revel un total de
497 genes nucleares que codifican molculas de tRNA citoplsmicas y 324 posibles seudogenes derivados de tRNA. Por consiguien
te, al parecer, los seres humanos tienen menos genes que especifican
tRNA citoplsmico que un gusano (584), pero ms que la mosca
(284). En metazoarios, el nmero de genes tRNA no se relaciona
con la complejidad del organismo, sino ms bien con demandas es
peciales para abundancia de tRNA en ciertos tejidos o etapas del
desarrollo embrionario (p. ej., la rana Xenopus laevis tiene oocitos
grandes que deben estar cargados cada uno con 40 ng de tRNA; la

demanda alta de tRNA se satisface al disponer de miles de genes
tRNA).
Los 497 genes tRNA citoplsmicos pueden agruparse en 49 fa
milias segn sean sus especificidades de anticodn. Aunque el c
digo gentico universal proporciona 61 codones de sentido
diferentes que deben reconocer los anticodones en molculas de
tRNA, el bamboleo en la posicin de la tercera base de los codones
significa que cuando la posicin de la tercera base en un codn es
pirimidina (U o C), un anticodn aislado puede formar un par de
bases con los dos codones alternativos. La eleccin del anticodn
para interpretar codones humanos alternativos sigue reglas genera
les para el tRNA citoplsmico eucariota (recuadro 9-4). Con base
en ello, cabra predecir un total de 46 clases diferentes de tRNA hu
mano pero, a pesar de la generalidad del bamboleo de la tercera ba
se, tres pares de estos codones [AU(U/C), UA(U/C), AA(U/C)]
son sensibles al parecer a dos anticodones cada uno y por consi
guiente hay tres clases adicionales de tRNA (vase fig. 9-5). Slo
9.2
Recuadro 9-4. Especificidad de anticodn del tRNA citoplsmico eucariota

Como en la interpretacin de codones mitocondriales (seccin 9.1.2), el
bam boleo de la te rcera base significa que no hay una correspondencia
1:1 entre los codones de mRNA citoplsmico y los anticodones tRNA que
los reconocen. En este caso, mediante un anticodn aislado pueden re
conocerse codones alternativos que difieren porque tienen una C o U en
la tercera posicin de bases. Las reglas de descodificacin para codones
de mRNA citoplsm ico son las siguientes:
codones en "cajas de dos codones" (codones que terminan con /C
que codifican un aminocido diferente en comparacin con los que
terminan con A/G). En este caso, una G en la posicin base 5 ' en el
anticodn tRNA descodifica de manera caracterstica la posicin
bamboleante U/C. Por lo tanto, no hay un tRNA con un anticodn &AA
para correspondencia con el codn UUJ! para Fe, pero el anticodn
6AA puede reconocer codones UUU y UUC en el mRNA (vase fig.
9 -5 )-;.
codones no glicina en cajas de cuatro codones" (codones en los
que U, C, A y G en la posicin bamboleante codifican el mism o am i
nocido, pero no la glicina). En este caso, la posicin bamboleante
U/C la descodifica una inosina (I) en la posicin 5 ' en el anticodn
(la inosina se produce p o r m odificacin postranscripcional de una
adenina: se sustituye el grupo amino en el carbn 6 de la adenosina
existe una correlacin muy general del nmero de genes tRNA hu

manos con la frecuencia de aminocidos (cuadro 9-4).
Aunque, al parecer, los genes tRNA estn esparcidos en la tota
lidad del genoma humano (con excepcin de los cromosomas 22 y
Y, se encuentran en todos los cromosomas), hay un agrupamiento
notable. Ms de la mitad de ellos (280 de 497) reside en el cromo
soma 6 (que contiene 140 genes tRNA, incluidos casi todos los ti
pos diferentes de gen tRNA, en una regin de slo 4 Mb en 6p2)
o el 1 (en donde estn agrupados de forma laxa muchos de los ge
nes tRNA de Asn y Glu). Adems, muchos de los otros genes tR
NA estn agrupados; por ejemplo, 18 de los 30 tRNA de Cis se
hallan en una tira de 0.5 Mb del cromosoma 7.
9.2.2 Los RNA nuclear y nucieolar pequeos estn

codificados por familias gnicas grandes
esparcidas en una gran proporcin
Adems del rRNA y el tRNA, otras dos clases mayores de RNA
participan en la ayuda de la expresin gnica general: el RNA nu
clear pequeo (snRNA) y el RNA nucieolar pequeo (snoRNA).
Los codifican familias de casi 100 genes (snRNA) o un poco ms
(snoRNA) que, aunque diseminadas, muestran cierto agrupamien
to de subfamilias.
Genes RNA nucleares pequeos (snRNA)

El conjunto heterogneo de molculas RNA nucleares pequeas
(snRNA) incluye muchas con uridina abundante y se denominan
de la forma correspondiente; por ejemplo, snRNA U3 representa el
tercer RNA nuclear pequeo rico en uridina por clasificar. Varios
son del tipo RNA espliceosmico y se requieren para la funcin de
los espliceosomas mayor y menor (vase cuadro 9-3) y una familia
de ms de 80 genes los codifica. Ms de 70 de estos genes especifi
249
v'- " .- y
m Sm m m m m tm
p o r un grupo carbonilo C = 0 ). Por ejemplo, a los codones GUS1 y

GU de la caja valina de cuatro codones los descodifica un tRNA con un
anticodn de AAC, que sin duda se modifica en JAC. Adems del pareamiento de bases con C y , la inosina tambin puede formar un
par de bases con A (y por consiguiente el anticodn |AC puede reco
nocer a cada uno de GUU, GU, GUfi). A fin de evitar una posible lec
tura traduccional errnea, en cajas de dos codones no pueden
utilizarse tRNA con inosina en la base 5 del anticodn-;
codones de glicina. Un anticodn SCC, en lugar del anticodn ICC
esperado, codifica los codones GGU y GGC.
Slo se requieren 16 anticodones para descodificar los 32 codones ter
minales en una pirimidna. Por consiguiente, el grupo mnmo de antico
dones es de 61 (el nmero de diferentes codones de sentido), menos 16
= 45. No obstante, adems de un tRNA especializado lleva un anticodn
al codn UGA (que en condiciones normales funciona como un codn de
detencin). En estados de selenio alto, esta tRNA codifica UGA slo en un
nmero muy pequeo de casos a fin de insertar el 2 1 o. aminocido, se/enocisteina, en un grupo selecto de selenoproteinas" (todos los cuales
tienen actividades de oxidorreduccin [rdox]; en mamferos, la reductasa de tiorredoxina y la peroxdasa de glutatin son de las selenoproteinas
que se encuentran de modo ms amplio).
can snRNA utilizados en el espliceosoma mayor; incluyen 44 genes

identificados que especifican snRNA U 6 y 16 que especifican snR
NA U l.
Algunas pruebas indican agrupamiento, sobre todo en el caso
de las familias snRNA U l y U2; empero, debido a la forma en que
se seleccionaron los BAC para obtener el esquema de las secuencias
del genoma (vase antes), hay una representacin menor en la se
cuencias del esquema. Se saba con anterioridad que los genes RNA
U2 se localizaban en el locus RNU2, una estructura tndem de 6 .1
kb unidades casi idnticas en 17q21-q22 que es muy variable en el
nmero de unidades repetidas (de seis a ms de 30 repeticiones).
Los genes RNA U 1 estn agrupados con alrededor de 30 copias en
el locus RNU1 en lp36.1, aunque se piensa que este agrupamien
to est organizado en forma laxa e irregular. Existe un gran nmero
de secuencias no funcionales relacionadas (seudogenes, fragmentos
gnicos, etc.); por ejemplo, se han identificado 1 135 secuencias re
lacionadas con snRNA U 6 en el esquema de secuencias (Internatio
nal Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
Genes RNA nucleolares pequeos (snoRNA)

Una familia grande de RNA nucleolares pequeos (snoRNA) se
usa en especial en el nuclolo para dirigir o gu iar modificaciones de
bases especficas de sitio en rRNA (Smith y Steitz, 1997; Filipowicz, 2000 ), pero tambin se sabe que llevan a cabo modificaciones
de bases en otros RNA estables, incluido el snRNA U 6 . Existen dos
subfamilias. La snoRNA caja C/D participa sobre todo en la gua
de las metilaciones 2'-0-ribosa especficas de sitio (hay 105 a 107 va
riedades de esta metilacin en rRNA). Los genes snoRNA H/ACA
intervienen sobre todo en la gua de seudouridilaciones especficas de
sitio (en las que se isomeriza la uridina para formar seu d ou rid in a ,
la base modificada ms comn; para el rRNA se requieren 95 seu
douridilaciones diferentes).
250
CAPTULO NUEVE
UUU
AAAO
UCU
UUC
A G AA14
AG A10
UCC
7 GGAO
Fe
UAU
AUA 1
T ir
UGU
C is
UAC
G UA11
UGC
ACAO
G CA 30
Ser
Leu
UUA ~
UAA 8
UCA
UGA 5
Detencin U A A
UUA 0
Detencin ~
UGA
U C A 0*
UUG ~
CAA 6
UCG
CGA 4
Detencin ~
UAG
CUAO
Trp
UGG
CCA 7
CUU
A A G 13
CCU
A G G 11
CAU
AUG 0
CGU
ACG 9
CAC
G U G 12
CGC
GCG 0
H is
Leu
GAGO
CUC
CCC
GGGO
A rg
Pro
CUA
CCA
UAG 2
U G G 10
G ln
CUG
CAG 6
CCG
CGG 4
AUU
A A U 13
ACU
AGU 8
CAA
U U G 11
CGA
UCG 7
CAG
C U G 21
CGG
CCG 5
AAU
AUU 1
A sn
lie
AUC
GAU 1
AUA
AGU
S er
ACUO
ACC
GGU 0
AAC
G U U 33
UAU 5
ACA
U G U 10
AAA
U U U 16
AGA
UCU 5
AUG
C A U 17
ACG
CGU 7
AAG
C U U 22
AGG
CCU 4
~ GUU
- J A A C 20
~ GCU y
A G C 25
" GAU
AUCO
GGU
GCC
GGC 0
- GAC
G U C 10
AGC
GCU 7
Tre
M et
Lis
GUC
Val
GAC 0
A sp
Gli
A la
GUA
~ UAC 5
L GUG -
C A C 19
A rg
GCA ~
U G C 10
GCG -
CGC 5
G lu
GGC
ACC 0
G C C 11
G A A U U C 14
GGA
UCC 5
- GAG C U C 8
GGG
CCC 8
Fig. 9-5. Nmero de genes tRNA humanos clasificados de acuerdo con el anticodn.
Los codones estn unidos por lneas a los anticodones (no modificados) en el lado derecho. Las lneas unidas en forma de V enlazan codones alternativos
que terminan en una U o C que pueden descodificarse por la accin de un anticodn aislado debido al bamboleo de la tercera base. El nmero siguiente
de cada anticodn es el nmero de genes humanos que codifican tRNA con ese anticodn. Por consiguiente, por ejemplo, en la parte superior del lado
izquierdo se observa que el codn de fenilalanina UUU no lo descodifica un anticodn AAA, ya que no hay genes tRNA que lleven ese anticodn. Las
adeninas sombreadas casi con seguridad se modifican como nosinas (vase recuadro 9-4). Nota: a) a pesar de la provisin de la tercera base
bamboleante, los genes nicos codifican al parecer tRNA con anticodones que quiz no se esperaba que se necesitaran (AUA, AUU y GAU); b) el
asterisco a continuacin del anticodn UCA significa que hay un tRNA poco comn que lleva este anticodn, que en ocasiones interpreta un subgrupo
pequeo de codones UGA como selenocistena en lugar de detencin; vase recuadro 9-4. Modificado de International Human Genome Sequencing
Consortium (2001), Nature 409, 860-921, con autorizacin de Nature Publishing Group.
Los snoRNA aislados especifican una, o cuando mucho dos, de

estas modificaciones. Los snoRNA se encuentran con frecuencia
dentro de los intrones de otros genes y aunque al parecer casi todos
los genes snoRNA son de copia nica y estn esparcidos, se cono
cen algunos grupos grandes, entre ellos dos que se hallan dentro de
la unidad de transcripcin grande SNURF-SNRPN tn 15q. Los l
timos genes se imprentan de manera paterna, se expresan en el ce
rebro y se considera que poseen un papel relevante en el sndrome
de Prader-Willi (vase fig. 10-24 y las referencias que incluye).
9.2.3 Los micro-RNA y otros RNA reguladores nuevos

son desafiantes preconcepciones sobre
la extensin de la funcin del RNA
Los libros de texto suelen insistir en la importancia de las protenas
como puntos finales de la expresin gnica por la amplia variedad
de sus funciones y su importancia en la regulacin de la expresin

gnica. Por lo general, las molculas de RNA se han considerado
menos importantes (el artculo de Venter y cois., 2001, del esque
ma de Celera de la secuencia del genoma, no present ningn an
lisis sobre genes RNA humanos!). No obstante, en aos recientes,
diversos descubrimientos han llevado a una revaloracin radical de
la funcin del RNA. El reconocimiento en 1982 de que algunas
molculas de RNA podran tener una funcin cataltica (y en con
secuencia actuar como una ribozima) condujo a la identificacin
de funciones catalticas en varios otros tipos de RNA. Se incluyen
aqu rRNA (datos recientes de cristalografa con rayos X indican
que el rRNA cataliza la formacin del enlace pptido, no las prote
nas; Nissen y cois., 2000) y asimismo snRNA (Valadkhan y Manley,
2001).
Se ha estudiado bien una diversidad de molculas de RNA fun
damentales, entre ellas la telom era sa d e RNA (vase seccin 2.2.5)
9.2
251
Cuadro 9-4. Distribucin de genes en familias gnicas de tRNA citoplsmico humano de acuerdo con el aminocido
especificado.
Aminocido
Frecuencia*
Nmero de genes de
tRNA correspondientes
Aminocido
Alanina
7.06%
40
Usina
5.65%
38
Arginna
5.69%
30
Metionina
2.23%
17
Aspartato
4.78%
10
Fenilalanina
3.75%
14
Asparagina
3.58%
34
Prolina
6.10 %
25
Cstena
2.25%
30
Selenocstena
< 0.0 1 %
Glutamina
4.63%
32
Serna
8.00%
26
Glutamato
6.93%
22
Treonina
5.31%
25
Glicina
6.62%
24
Triptfano
1.30%
Histidna
2.56%
12
Tirosina
2.76%
12
Isoleucna
4.43%
19
Valina
6.1 2 %
44
Leucina
9.95%
35
Frecuencia*
Nmero de genes de
tRNA correspondientes
Frecuencia promedio en la extensin del proteoma humano.
y el RNA SRP (conocido asimismo como RNA 7SL) de la p a r tcu

la d e reco n o cim ien to d e se a l (el complejo de ribonucleoprotenas que reconoce la secuencia de seal en las protenas destinadas a
enviarse fuera de la clula para permitir el paso de protenas a tra
vs de la membrana celular). En fecha ms reciente se identific
una interesante variedad de nuevas molculas de RNA humano con
funciones reguladoras conocidas o posibles. ste es un proceso con
tinuo, pero el anlisis ms amplio de transcritos de mamferos hasta
la fecha (del genoma de ratn) sugiere que un porcentaje conside
rable de transcritos corresponde a RNA no codificantes (FANTOM
Consortium y RIKEN Genome Exploration Research Group Phase I & II Team, 2002).
Micro-RNA: nuevas molculas de RNA regulador pequeas

Los micro-RNA (miRNA) son molculas de RNA muy pequeas
(cerca de 22 nucletidos de largo) que pueden funcionar como re
guladores antisentido de otros genes (Ambros, 2001; Gottesman,
2002). Derivan de precursores ms largos, unos -70 nucletidos de
largo que contienen una repeticin invertida que permite la forma
cin de horquillas de RNA de doble cadena. Un tipo de ribonucleasa III (especfica de RNA de doble cadena), que se conoce como
d ic e r , corta estos RNA precursores de horquillas. Las primeras de
estas secuencias descritas en animales, RNA lin-4 y let-7, se identi
ficaron como RNA tem p o ra l p eq u e o (stRNA) mediante anlisis
genticos en C. elegans. RNA lin-4 y let-7 se regulan durante el de
sarrollo y tambin controlan varios programas del desarrollo por s
mismos. Actan como reguladores antisentido al enlazarse a se
cuencias complementarias en la 3' UTR del mRNA de genes blan
co, inhibir la traduccin y, por consiguiente, reprimir la sntesis de
las protenas del gen blanco (fig. 9-6A). Se ha demostrado asimis
mo que otros miRNA, por ejemplo en plantas, son reguladores del

desarrollo y este hallazgo, aunado a la conservacin evolucionista
potente del miRNA, condujo a esperar funciones similares para los
miRNA de mamferos.
Se han operado varios mtodos para identificar miRNA de ma
mferos (vase Gottesman, 2002, para un resumen) y sus resultados
fueron la identificacin reciente de miRNA nuevos en seres huma
nos y ratones (Lagos-Quintana y cois., 2001, 2002; Mourelatos y
cois., 2002). Para la poca en que se escribi este libro (mediados del
2003), se estimaban alrededor 200 genes miRNA humanos. Aun
que estn diseminados en muchos cromosomas, las pruebas indican
cierto agrupamiento, en especial un grupo cuando menos de siete
genes miRNA dentro de una regin de 0.8 kb en el cromosoma 13
(Mourelatos y cois., 2002). En la actualidad se llevan a cabo esfuer
zos activos para identificar genes blanco por la probabilidad de que
los miRNA de mamferos tengan funciones reguladoras de impor
tancia.
aote; se piensa que este tipo de actividad de ribonucleasa forma parte de un

sistema gentico de vigilancia conservado que puede degradar un mRNA especifico
en respuesta a la presencia de RNA de doble cadena correspondiente al mRNA
especfico. Puede utilizarse en ciertos anlisis experimentales, que se conocen como
RNA de interferencia (RNA), para inactivar de forma especfica genes blanco
dentro de clulas al cortar el RNA largo de doble cadena producido por transgenes
introducidos de modo artificial para crear molculas de RNA antisentido de unos 22
nucletidos de largo (conocidas como siRNA, RNA de interferencia corto). Las
molculas de siRNA pueden formar pares de bases con mRNA del gen endgeno que
corresponde al transgn introducido y, en consecuencia, inhibir de manera especfica
la expresin (vase seccin 20.2.6).
252
CAPTULO NUEVE
A)
u c C
I I T
A
G A
U
G
r r
G C
c
I
c
I I I I
u
c c
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GAG U G
I I I I I
c u c G U
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lin-4
A
A
G G
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I I I i r
u u u A A
G
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C
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A
A
le t-7
C C
G U
C A
G U G
C C U C G U
C A A G U A A
C G C
G G G G C A
G U U C A U U
III
B)
l i l i l
C C A G G A U A G G C U G U
T i
l l i l i
I I f I I I
G G U U C U A U C C G G U A
I I I I I I I
m ir-26 a
lin-14 3 ' U TR
lin-28 3 UTR
lin-42 3 ' UTR
d a f-1 2 3 U TR
lin-41 3U TR
lin-415
let-7 3
------------------------------------------------------- ----------^
UUAUACAACC
GAUAUGUUGG
U
GUU
A
CUAC CUCA
GAUG GAGU
AU
5'
_ _ --------------------------------
UUAUACAACC
GAUAUGUUGG
3'
U
AUU
AU
------------------- - 200 n t
= le t-7
__ _
A
- lm-4
CUGCCUC
GAUGGAG
U
Fig. 9-6. Los micro-RNA son RNA muy cortos (21 a 22 nucletidos) que pueden funcionar como reguladores antisentido.
A) Estructura precursora del miRNA. Los stRNA lin-4 y let-7 de C. elegans pertenecen a la clase mIRNA y muestran una similitud importante con
miRNA de mamferos como el miRNA mir-26a humano. Las secuencias maduras de micro-RNA (miRNA) (sombreadas) derivan de un precursor con
repeticiones invertidas (que forman una RNA en horquilla por enlace intramolecular de hidrgeno). El corte del RNA en horquilla se lleva a cabo por un
tipo de nucleasa RN-asa III que se conoce com o dicer (mquina cortadora). En ocasiones, dos miRNA diferentes derivan del mism o precursor.
B) Regulacin antisentido por los RNA lin-4 y let-7. El mRNA de genes blanco regulado por los RNA lin-4 y le t-7 tiene regiones en sus 3 ' UTR que
muestran complementaridad muy notoria con estos miRNA. El pareamiento de bases no suele ser perfecto, como se demuestra en el pareamiento de
bases predicho entre el RNA le t-7 y sus dos secuencias blanco en la secuencia 3 ' UTR lin-41. Tomado de Banerjee y Slack (2002), Bioessays 24,
119-129, reimpreso con autorizacin de Wiley-Liss, Inc., una subsidiaria de John Wiley & Sons, Inc.
Genes que codifican molculas de RNA reguladoras

de tamao moderado a grande
Un nmero cada vez mayor de genes especifica RNA no codifican
te de tamao moderado a grande con funciones reguladoras cono
cidas o posibles (muchos pueden relacionarse con molculas de
mRNA no c o d ific a n t e porque son transcritos por polimerasa II
de RNA y se someten a recubrimiento y poliadenilacinb). Inclu
yen genes que especifican RNA 7SK, un regulador transcripcional
negativo del alargamiento de la polimerasa II de RNA (Yang y col.,
2001); RNA SRA1 (a ctiv a d o r d e l re cep to r d e esfero id es) que sir
ve como un coactivador especfico de varios receptores de esferoi
des (Lanz y cois., 1999); y X IS T , que es central para la inactivacin

d el cromosoma X (seccin 10.5.6).
Se conocen asimismo varios RNA antisentido reguladores, de
tamao moderado a grande, entre ellos el transcrito antisentido
TSIX, que regula XIST, una variedad de transcritos antisentido que
bNota: mediante comparacin, la polimerasa I de RNA transcribe los RNA 28S, 18S y
5.8S; la polimerasa III de RNA transcribe los rRNA 5S, tRNA, snoRNA y miRNA; los
snRNA son una mezcla sorprendente: algunos los transcribe la polimerasa III de RNA
y otros la polimerasa II de RNA.
9.3
ORGANIZACIN, DISTRIBUCIN Y FUNCIN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPPTIDOS
253
regulan genes improntos (seccin 10.5.5; vase fig. 10-24 para al

gunos ejemplos) y un gran nmero de otros transcritos antisentido
(Lehner y cois., 2002). Aunque no se conoce con precisin el nme
ro total de estos transcritos antisentido en el genoma humano, en
una revaloracin reciente de los genes en el cromosoma 22 huma
no se reconocieron 16 posibles genes RNA antisentido, lo que su
giere que puede haber alrededor de 1 500 genes RNA antisentido
en el genoma humano (Collins y cois., 2003). En apoyo de lo ante
rior, FANTOM Consortium y el RIKEN Genome Exploration Re
search Group Phase I & II Team (2002) predijeron en un estudio
muy amplio varios cientos de RNA antisentido en el ratn median
te las estimaciones ms conservadoras.
complejos es considerable la variacin de tamao de los genes, en

especial en el genoma humano (fig. 9-7). El tamao enorme de al
gunos genes humanos significa que la transcripcin puede tomar
tiempo y requerir alrededor de 16 horas para el gen de distrofina de
2.4 Mb (Tennyson y cois., 1995). Aunque existe una correlacin di
recta entre los tamaos del gen y el producto, hay algunas ano
malas notables. Por ejemplo, la apolipoprotena B tiene 4 563
aminocidos y la codifica un gen de 45 kb, pero la protena ms
grande que codifica el gen de distrofina de 2.4 Mb slo posee 3 685
aminocidos.
Organizacin, distribucin y
funcin de genes hum anos que
codifican polipptidos
Una minora muy pequea de genes humanos carece de intrones

(vase cuadro 9-5) y stos poseen casi siempre un tamao pequeo.
En los que tienen intrones, se observa una correlacin inversa entre
el tamao del gen y la fraccin del DNA codificante (fig. 9-7). Ello
no se debe a que los exones en genes grandes sean ms pequeos
que los de genes pequeos: el tamao promedio del exn en genes
humanos es menor de 200 pb y, aunque se conocen exones muy
grandes (vase recuadro 9-5), el tamao del exn es comparativa
mente independiente de la longitud del gen (cuadro 9-6). Por el
contrario, hay una gran variacin en las longitudes de intrones y los
genes grandes tienden a tener intrones muy grandes (la colgena de
9.3
Diversidad en la organizacin exn-intrn
9.3.1 Los genes humanos muestran una enorme

variacin de tamao y organizacin interna
Diversidad de tamao
En organismos simples, como las bacterias, los genes tienen un ta
mao comparativamente similar y suelen ser muy cortos; en los
A ) M e n o s d e 1 0 kb
B) M e n o s d e 1 0 0 kb
10 kb
10
In s u lin a 3 3 % |
30
40
50
70
60
80
90
100 kb
A lb m in a s ric a 1 2 %
100%
M H isto ria H 4 100%
In te rfe ro n a 100%
tR N A Tir
20
# 4 FRTH 4 %
i G lo b in a 5 3 8 %
f C o l g e n a a-, (II) 2 0 %
'
* A p o lip o p ro te n a B 3 3 %
- 4
c la s e I 4 6 %
R e c e p to r L D L 11 %
H id ro x ila s a d e
fe n ila la n in a 3 %
C ) M s d e 1 0 0 kb
0
100
------ 1
200 300 40 0 500 600 700 800 90 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0

1 8 0 0 1 9 0 0 2 4 0 0 2 5 0 0 kb
1-1--------- 1---------1--------- 1--------- h ------ 1--------- ---------1------------------1-------------- ^ ------j - ----- ------^ ------ 1---------1
I
i F acto r V III
i
3%
i
ii r
RTIFT
Q*2c..-41%/o i!
V
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*-N F l 4%
I
I
i
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i
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,i
i,
i
,'
,i
'
i
1
,1 |
U tro fin a 1 .4 %
Inmunoglobulina de cadena pesada*
In m u n o g lo b u lin a d e c a d e n a lig e ra
i i
i i
4 -
D istro fin a 0 .6 %
Fig. 9-7. Los genes humanos varan de tamao y contenido de exones en enorme proporcin.
Se muestra el contenido de exones como porcentaje de las longitudes de los genes indicados. Obsrvese la relacin por lo general inversa entre la
longitud del gen y el porcentaje del contenido de exones. Los asteriscos resaltan que las longitudes proporcionadas para los locus de las cadenas
pesada y ligera de Ig indicadas corresponden a organizaciones de la linea germinal. (Los genes de Ig y del receptor de clula T tienen organizaciones
nicas, que requieren reordenamientos somticos especficos de clula a fin de expresarse en linfocitos B o T, respectivamente; vase seccin 10.6.)
RTFQ, regulador transmembranoso de la fibrosis qustica; FRTH, transferasa de fosforribosilo de hipoxantina; NF1, neurofibromatosis tipo 1.
254
CAPTULO NUEVE
Cuadro 9-5. Ejemplos de genes humanos con secuencias de codificacin ininterrumpidas.

Para listas ms detalladas, vase http://exppc01.uni-muenster.de/expath/frames.htnn
Todos los 3 7 genes mitocondriales

Muchos genes RNA (en especial genes que codifican RNA pequeos, p. e casi todos los genes tRNA, pero tambin algunos RNA grandes, como RNA
XIST)
Retrogenes (vase cuadro 9-11)
Interferones
Genes de histona
Muchos genes de ribonucleasa
Genes de proteina de choque p o r calor
Muchos receptores acoplados a proteina G
Ciertos genes con cajas HMG (p. ej., SRY, muchos genes SOX)
Varios genes de receptor de neurotransm isor y receptor de hormona, p. e j receptores de dopamina D1 y D5, receptor de serotonina 5-HT1B, receptor
de angiotensina II tipo 1, receptor pptido formil, receptor de bradicinina B2, receptor adrenrgico 2a
tipo 7 y los genes titin son excepciones muy notables; vase cuadro
9-6). Pese a ello, la transcripcin de intrones largos requiere tiem
po y energa y la seleccin natural favorece intrones cortos en genes
muy expresados (Castillo-Davis y cois., 2002).
Diversidad del contenido de DNA repetido

Con frecuencia, los genes tienen componentes de DNA repetido
dentro de intrones no codificantes y secuencias de flanqueo, pero
adems se encuentran secuencias de DNA repetido de diferentes
extensiones en DNA codificante. Es comn la repeticin tndem
de secu en cia s m icro sa tlites (elementos de secuencia cortos; vase
seccin 9.4.3) y muchas reflejan tan slo frecuencias esperadas des
de el punto de vista estadstico para ciertas composiciones de bases.
Tambin es muy comn la repeticin tndem de secuencias que co
difican d o m in ios p r o te n ico s conocidos o supuestos y pueden ser
ventajosas desde el punto de vista funcional en algunos casos al pro
porcionar un blanco biolgico ms disponible. En ocasiones, la ho
mologa de secuencias entre las repeticiones puede ser muy alta; en
otras es posible que sea muy baja (vase cuadro 9-7).
9.3.2 Algunas veces estn agrupados genes similares

desde el punto de vista funcional en el genoma
humano, pero con mayor frecuencia estn
esparcidos en diferentes cromosomas
Como se comenta en la seccin 9.2, algunas familias de genes RNA
estn agrupadas. En familias gnicas que codifican polipptidos,
muchas veces se hallan genes que codifican productos idnticos, o
algunos con secuencias muy relacionadas, en uno o ms grupos que
pueden estar diseminados en varios cromosomas. Sin embargo, en
el genoma suelen estar dispersas algunas familias de genes funcio
nales que codifican productos que slo tienen com ponentes con
servados (dominios, elementos importantes, etc.). De manera
caracterstica, los genes que codifican productos funcionales rela
cionados que no muestran una homologa de secuencia muy im
portante estn esparcidos.
Genes idnticos en sentido funcional

Se sabe que dos o ms copias gnicas idnticas codifican a unos
cuantos polipptidos humanos. Con frecuencia los codifican genes
recin duplicados en un grupo gnico, por ejemplo los genes dupli
cados de globina alfa. Adems, de modo muy ocasional algunos ge
nes en diferentes cromosomas codifican polipptidos idnticos. Son
ejemplos los siguientes:
genes de histona. La base de datos de secuencias de histona NHGRI incluye una lista de un total de 86 diferentes secuencias de
histona distribuidas en 10 cromosomas distintos, aunque con
dos grupos grandes en 6 p (http://genome.nhgri.nih.gov/histones/chrmap.shtml), pero algunos miembros de la subfamilia
son idnticos aunque codificados por genes en diferentes cro
mosomas;
genes d e ubiquitina. La u biqu itina , de 76 aminocidos, es una
protena muy conservada que tiene una funcin esencial en la
degradacin de protenas y la respuesta celular de estrs. Los ge
nes humanos de ubiquitina se encuentran en locus diferentes
distribuidos en varios cromosomas. Algunos estn en una serie
de repeticiones de secuencias codificantes de longitud completa
que se someten a cotranscripcin (unidades d e transcripcin policistrnicas). Otros son monmeros (pero fusionados con genes
ribosmicos de protenas y constituyen unidades d e transcrip
cin bicistrnicas, vase Nei y cois., 2000; seccin 9.3.3).
Genes similares en sentido funcional

Una gran fraccin de los genes humanos es miembro de familias g
nicas en las que los genes individuales estn relacionados m uy d e cer
ca pero no son idnticos en su secuencia. En muchos de estos casos
los genes estn agrupados y surgieron por duplicacin gnica tn
dem, como en el caso de los diferentes miembros de cada uno de
los grupos de los genes de las globina a y (3 (vase fig. 9-11). Los
genes que codifican productos relacionados con claridad, pero que
se hallan en distintos cromosomas, suelen estar menos relacionados,
como se observa en los genes de las globina a y (3. No obstante,
9.3 | ORGANIZACIN, DISTRIBUCIN Y FUNCIN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPPTIDOS | 255
Recuadro 9-5. Genoma humano y estadsticas de genes humanos

Tamao del genoma
-3 200 Mb
Genoma nuclear
~ 3 200 Mb
Genoma mitocondrial
37 kb
Componente eucromtico
~ 2 900-3 000 Mb
Heterocromatina constitutiva
> 2 0 0 Mb (cuadro 9-2; fig. 2-15)
Fraccin muy conservada
> 1 0 0 Mb (> 3% )
DNA codificante
- 5 0 Mb (-1 .5 % )
Otros (regulador, etc.)
- 1 0 0 Mb (3%)
DNA duplicado de forma segmentaria

DNA repetido no codificante
Repeticiones basadas en transposn
Nmero de genes
> 1 5 0 Mb (> 5 % )
> 50% del genoma
- 1 400 Mb (-4 3 % ; vase cuadro 9-15)
- 3 0 000-35 000
Genoma nuclear
- 3 0 000-35 000 (seccin 9.1.3)
Genoma mitocondrial
37 (seccin 9.1.2)
Por cromosoma
Promedio de - 1 400; pero depende de la longitud y tipo de cromosoma (vase fig. 8-4);
- 6 0 por banda en una preparacin cromosmica de 550 bandas
Genes gue codifican polipptidos
- 3 0 000, pero gran inseguridad
Genes RNA
- 3 000, pero cierta inseguridad (vase fig. 9-4)
Seudogenes
- 2 0 000
Densidad gnica
-1 /1 0 0 kb en el genoma nuclear; 1/0.45 kb en el genoma mitocondrial
Tamao gnico (extensin genmica)
Promedio = 27 kb, pero enorme variacin (vase fig. 9-7).
Distancia intergnica
Promedio = cerca de 75 kb en el genoma nuclear.
Numero de islotes CpG
- 3 0 000 (en secuencias del genoma filtrado para eliminar repeticiones no codificantes)
Nmero de exones
Promedio = 9. Por lo regular se correlaciona con la longitud del gen, pero hay una amplia variacin.
Numero ms grande
Nmero ms pequeo
Tamao de exn
363 (en el gen titin)

1 (es decir, sin intrones; cuadro 9-5)
Promedio = 122 pb para exones internos con variacin de longitud comparativamente pequea,
pero los exones 3' pueden ser ms largos de forma notoria (Zhang, 1998).
Exones ms grandes
Muchas kb de largo, p. ej., el exn 26 del gen apoB (APOB) es de 7.6 kb
Exones ms pequeos
< 10 pb
Tamao de intrn
Variacin enorme; correlacin directa potente con el tamao gnico (vase cuadro 9-6);
Intrones ms grandes
Cientos de kb, p. e j el intrn 8 del gen WWOX humano es - 8 0 0 kb.
Intrones ms pequeos
Decenas de pb
Tamao de mRNA
Promedio alrededor de 2.6 kb, pero gran variacin (mRNA titin tiene > 115 kb de largo!)
5 ' UTR
Promedio alrededor de 0.2-0.3 kb
3 ' UTR
Promedio alrededor de 0.77 kb pero es probable que sea una subestimacin por menos informacin
de 3 ' UTR largas
Tamao del RNA no codificante

Tamao de polipptidos
Muy variable; de - 2 1 - 2 2 nucletidos (micro-RNA) a muchos kb, p. ej., XIST (17 kb)
Promedio alrededor de 500-550 aminocidos
Polipptido ms grande
Titin: 38 138 codones en el gen titin (pero variacin de longitud considerable)
Polipptidos mas pequeos
Decenas de aminocidos, p. ej., varias hormonas pequeas, etc.
en la familia gnica homeobox HOX, que consiste en grupos de

anos 10 genes en cada uno de cuatro cromosomas, genes indivi
duales en diferentes cromosomas pueden estar ms relacionados
entre s que respecto de los miembros del mismo grupo gnico (fig.
.2-9). Adems de lo anterior, genes que codifican isoformas especr.cas de tejido relacionadas, o isozimas especficas de compartimien
to subcelular, casi siempre se localizan en diferentes cromosomas
vase cuadro 9-8).
Genes relacionados en sentido funcional

Algunos genes codifican productos que es muy posible que no ten
gan una secuencia relacionada muy cercana, pero se relacionan con
claridad desde el punto de vista funcional. Los productos pueden
ser subunidades de la misma protena o estructura macromolecular,
componentes de la misma va metablica o del desarrollo o tal vez
se requieran para enlazarse de manera especfica entre s como los
256 1 CAPTULO NUEVE | ORGANIZACIN DEL GENOMA HUMANO
Cuadro 9-6. Tamaos promedio de exones e intrones en genes humanos.

Producto gnico
Tamao del gen (kb)
Nmero de exones
Tamao promedio
de exn (pb)
Tamao promedio
de intrn (pb)
tRNA,r
0.1
50
20
Insulina
1.4
155
480
Globina p
1.6
150
490
HLA clase 1
3.5
187
260
Albmina srica
18
14
137
1 100
Colgena tipo VII
31
118
77
190
Complemento C3
41
29
122
900
Hidroxilasa de fenilalanina
90
26
96
3 500
Factor VIII
186
26
375
7100
CFTR (fibrosis qulstlca)
250
27
227
9100
Titin
283
363
315
466
2 400
79
180
30 770
Distrofina
Cuadro 9-7. Ejemplos de DNA intragnico de codificacin repetida a gran escala.

Producto gnico
Tamao de repeticin
codificada en aminocidos
Nm. de
copias
Homologa de secuencia de nucletidos

entre copias
Involucrina
10
59
Homologa alta para 39 repeticiones centrales
Apolipoprotena? (a)
114 = repeticiones parecidas

a kringle 4a
37
Homologa alta; 24 de las repeticiones tienen una

secuencia idntica
Plasmingeno
~ 75-80
Colgena
18
Albmina srica
195
Homologa baja
Genes de protenas ricos en prolina
16-21
Homologa baja
Tropomiosina de cadena a
42
Homologa baja
Inmunoglobullna de cadena e, regin C
108
Homologa baja
Distrofina
109
24
Homologa baja
57
Homologa baja pero dominios protenicos conservados

(kringles3)
Homologa baja pero elementos de aminocidos
conservados basados en (Gli-X-Y)6
aUn kringle es una secuencia rica en cisterna que contiene tres puentes disulfuro internos y crea una estructura en forma de pretzel".
ligandos y sus receptores importantes. En casi todos estos casos, los

genes no estn agrupados y suelen hallarse en diferentes cromoso
mas (vase cuadro 9-8 para algunos ejemplos).
9.3.3 En ocasiones se encuentran en el genoma

humano genes superpuestos, genes dentro de
genes y unidades de transcripcin policistrnicas
Organizacin gnica bidireccional y genes superpuestos
de modo parcial
Los genomas simples tienen densidades gnicas altas (por lo gene
ral uno por 0.5 kb, 1 kb y 2 kb en los genomas de mitocondrias
humanas, E. coli y S. cerevisiae, respectivamente) y a menudo

muestran ejemplos de genes superpuestos de forma parcial. Pue
den utilizarse diferentes marcos de lectura, algunas veces de una
cadena en sentido comn (vase fig. 9-3). Los genes de organismos
complejos estn mucho menos agrupados (slo un gen por 100 kb
en el genoma nuclear humano) y no son tan comunes los genes su
perpuestos. Sin embargo, en ocasiones se encuentran genes veci
nos muy cercanos, algunos con sus extremos 5' separados por unos
cuantos cientos de nucletidos y que se transcriben de cadenas
opuestas. Esta o rga n iz a cin g n ica b id ire ccio n a l suele encon
trarse, por ejemplo, en los genes de reparacin de DNA y pueden
proporcionar regulacin comn del par gnico (Adachi y Lieber,
2002).
9.3
257
Cuadro 9-8. Distribucin de genes que codifican productos relacionados desde el punto de vista funcional.
Genes que codifican
Organizacin
Ejemplos
El mismo producto
Con frecuencia agrupados pero

tambin pueden estar en
diferentes cromosomas
Los dos genes de globina a en 11p (fig. 9-11); genes que codifican rRNA
(fig. 10-2); algunas subfamlias de histona
(vase httD://aenome.nhari.nih.aov/histones/chrmaD.shtmh
Isoformas o isozimas de
protena especfica de tejido
En ocasiones agrupados;
algunas veces no sintnicos
Agrupamiento de genes de amilasa pancretica y salival (1p21); no hay

sintenia de genes de actina a expresados en msculo esqueltico (1 p) y
cardiaco (15q)
Isozimas en diferentes
compartimientos celulares
Por lo general no sintnica
Isozimas citoplsmica (c) y mitocondrial (m) para diversas enzimas, p. ej.,

deshidrogenasa de aldehido (c)-9q y deshidrogenasa de aldehido (m)-12q;
cinasa de timidina (c)-17q y cinasa de timidina (m)-16q
Enzimas en la mism a va
metablica
Genes de enzimas codificantes en esteroidognesis: hidroxilasa 8q de

1 1 esteroides; hidroxilasa 1 0q de 17 esterodes; hidroxilasa 6p de 21
esteroides
Subunidades de la misma
protena
Globina a -1 6p y globina (3-11 p; cadena pesada de ferritina 11 q y

cadena ligera de ferritina 22q
Componentes de va de seal
que interactan
JAK1 -1 p; STAT1-2q
Ligando ms receptor
relacionado
Insulina 11 p y receptor de insulina 19p; interfern p-9p; interfern p

de receptor 21 q
Los g e n e s su p erp u estos d e fo r m a p a r cia l en los genomas nu

cleares compuestos de mamferos son raros y, cuando se presentan,
suelen transcribirse a partir de dos cadenas de DNA diferentes. Se
observa una agrupacin gnica fuerte en regiones subcromosmicas
con abundancia de GC y las regiones de densidad gnica en parti
cular alta muestran con frecuencia algunos casos de genes super
puestos. Por ejemplo, la regin clase III del complejo HLA en
6p21.3 tiene una densidad gnica aproximada de casi un gen por
! 5 kb y se sabe que incluye varios ejemplos de genes superpuestos
fig. 9-8A).
Genes dentro de genes

Los genes RNA nucleolares pequeos (snoRNA) son poco comunes
porque casi todos estn localizados dentro de otros genes, a menudo
algunos que codifican una protema vinculada con el ribosoma o una
protena nucleolar. Es posible que esta disposicin se conservara pa
ra permitir la produccin coordinada de protenas y componentes
de RNA del ribosoma (Tycowski y cois., 1993). Adems de los genes
noRNA, algunos otros, incluidos varios genes que codifican polipptidos, se hallan dentro de intrones de genes ms grandes. Los
eiemplos ilustrativos son el gen NF1 (neurofibromatosis tipo I; tres
genes internos pequeos transcritos de la cadena opuesta; vase fig.
9-8B); el gen F8 (factor VIII de la coagulacin sangunea; dos genes
internos transcritos en direcciones opuestas; vase fig. 11-20 ); y el
gen RB1 (susceptibilidad al retinoblastoma; un gen interno transcri
to de la cadena opuesta; vase fig. 9-19).
_ nidades de transcripcin policistrnicas

unidades de transcripcin policistrnicas (es decir, multignison comunes en los genomas simples de bacterias y asimismo
encuentran con gran frecuencia en C. elegans. El genoma mitoa d ria l humano simple (seccin 9.1.2.) y los grupos mayores del
gen rRNA (fig. 10-2) proporcionan dos ejemplos de unidades de

transcripcin policistrnica en el genoma humano. Adems, se co
nocen algunos ejemplos raros de unidades de transcripcin bicistrnicas que codifican polipptidos en el genoma nuclear: la
transcripcin se inicia a partir de un gen y contina a travs de un
gen contiguo corriente abajo para suministrar una protena precur
sora que se corta para proporcionar diferentes protenas.
Por lo regular se considera que las cadenas A y B de la insulina
derivan de una unidad de transcripcin bicistrnica (fig. 1-23), pe
ro estn relacionadas de manera estrecha desde el punto de vista fun
cional. Sin embargo, algunas veces las unidades de transcripcin
bicistrnicas generan protenas distintas desde el punto de vista fun
cional. Por ejemplo, los genes UBA52 y UBA80 crean ubiquitina y
una protena ribosmica, S27a o L40, respectivamente. Otros genes
de ubiquitina estn organizados como repeticiones tndem de se
cuencia codificante completa que forman unidades de transcripcin
policistrnicas (vase Nei y cois., 2000). En los genes de ubiquitina
no hay intrones pero en otras unidades de transcripcin bicistrni
cas se requiere empalme (corte y unin) para enlazar transcritos de
exones de un gen en los de un gen corriente abajo. La unidad de
transcripcin SNURF-SNRPN proporciona un ejemplo de dos po
lipptidos codificados por diferentes exones (Gray y cois., 1999), pe
ro tambin se utiliza para hacer transcritos de RNA no traducidos
que se improntan de forma paterna; vase la figura 10-24.
9.3.4 Las familias gnicas que codifican polipptidos

pueden clasificarse de acuerdo con el grado
y extensin de la relacin de la secuencia
en miembros de la familia
Un gran porcentaje de genes humanos que se expresan de modo ac
tivo, y codifican RNA no codificante y polipptidos, es miembro
de familias de secuencias de DNA que muestran una gran simili-
258
CAPITOLO NUEVE
A)
C4B
PBX2
G18
1C7
CYP C4A
21 Ps / G11
G5b CKIIB
G11a
RD G10
' Bf I
G9
I G15 TN-X
I G14 \ X
I / G13
/ / C2
\B 1 4 4
LTB nb6
1kBL
MICA NOB1 NOB2
PERB10 \
2
I P5-6
BAT1 PERB6 \ \ \
/ DHFRPs
MICB \
\ \ \ | / / 1 7 NOB3
I G9a | G8 \
PPIPs
1200
I
1400
1300
I
1500
T
1600
---I------- 1
1700
---- 1
----
---- 1
----
---- 1
---- n i
1900
1800
2000
(2080)
0.9 Mb: -70 genes

B)
Cadena de sentido
del gen NF1
E x n 2 6
Ex n 27
Intrn
26
3'
5' I 1 ------
5'
Cadena antisentido 3 ' L

del gen NF1
OGMP
i-------- 1
2.2 kb
EVI2B
h-
EVI2A
I10 kb
H
4 kb
Fig. 9-8. Genes superpuestos y genes dentro de genes.

A) Genes superpuestos. Los genes en la regin clase III del complejo HLA estn empacados de forma estrecha y superpuestos en algunos casos.
B) Genes dentro de genes. El intrn 26 del gen de la neurofibromatosis tipo 1 (NF1) contiene tres genes de dos exones internos cada uno transcritos de
la cadena opuesta a la utilizada para transcribir el gen NF1. Los genes son: OGMP, glucoprotena de mielina del oligodendrocito; EVI2A y EVI2B,
homlogos humanos de genes murinos que tal vez participen en la leucemognesis y se localicen en sitios de integracin viral Bcotrpicos.
tud secuencial. Sin embargo, la extensin de la secuencia comparti

da y la organizacin de los miembros de la familia pueden variar en
gran proporcin. Es posible que muchos miembros de la familia no
sean funcionales (seudogenes y fragm entos gnicos; vase ms adelan
te) y acumulen en poco tiempo diferencias de secuencias, que con
ducen a una divergencia secuencial notable.
Familias gnicas comunes

Los miembros de familias gnicas comunes muestran una gran ho
mologa de secuencias en la mayor parte de la longitud del gen o,
cuando menos, en el componente de DNA codificante. Los ejemplos
incluyen familias del gen de histona (las histonas estn muy conser
vadas y los miembros de subfamilias son virtualmente idnticos) y las
familias del gen de las globinas a y (3 (los miembros de una familia
individual muestran un alto grado de similitud secuencial).
Familias gnicas que codifican productos con dominios

grandes y muy conservados
En algunas familias gnicas hay una homologa en especial notable
dentro de regiones especficas de los genes muy conservadas; la si
militud secuencial correspondiente entre la porcin restante de la
secuencia codificante en los diferentes genes puede ser muy baja. A
menudo, estas familias codifican factores de transcripcin que tie
nen funciones importantes en el desarrollo temprano y la secuencia
conservada codifica un dominio protenico que se requiere para en
lazarse de forma especfica al DNA de genes blancos seleccionados
(vase cuadro 9-9).
Familias gnicas que codifican productos con secuencias

tpicas conservadas de aminocidos cortos
Es posible que algunos miembros de ciertas familias gnicas no se
relacionen de forma evidente a nivel de las secuencias de DNA, pe
ro no obstante codifican productos gnicos que se caracterizan por
una funcin general comn y la presencia de secuencias tpicas muy
cortas conservadas, como la caja DEAD, la secuencia Asp-Glu-AlaAsp (DEAD en el cdigo de una letra de aminocidos) o la repeti
cin WD (triptfano-aspartato); vase la figura 9-9.
Superfamilias gnicas
Los miembros de una superfamilia de genes se relacionan de mo
do mucho ms distante en trminos evolucionistas que los de una
familia de genes de dominio/secuencia tpica comn o conservada.
Codifican productos relacionados desde el punto de vista funcional
en un sentido general y slo muestran una homologa de secuencia
muy dbil en un segmento grande, sin secuencias tpicas de ami
nocidos conservadas muy importantes. Por el contrario, es posible
que haya algunas pruebas de caractersticas estructurales generales
comunes y una funcin general vinculada. Los ejemplos ilustrativos
son:
la su p erfa m ilia d e in m u n o glob u lin a (fig. 9-10): una familia
muy grande que incluye los genes de inmunoglobulina (Ig), ge
nes del receptor de clula T, genes HLA y muchos otros. Los ge
nes codifican productos divergentes en grado considerable a
nivel secuencial, pero que funcionan en el sistema inmunitario
y contienen dominios parecidos a inmunoglobulina (Ig);
9.3
259
Cuadro 9-9. Ejemplos de genes humanos con elementos de secuencia tpica que codifican dominios muy conservados.
Fam ilia gnica
N m ero de genes
Elem entos de secuencia tp ic a/d o m in io
Genes homeobox
38 genes HOX (vase fig. 12-9)

ms 214 genes homeobox hurfanos
Homeobox especifica un homeodominio de unos 60 aminocidos.

Se ha definido una amplia variedad de diferentes subclases
Genes PAX
Box pareada codifica un dominio pareado de - 1 2 8 aminocidos;

los genes PAX suelen tener adems un tipo de homeodominio conocido
como homeodominio tipo pareado
Genes SOX
18
Caja HMG parecida a SRY que codifica un dominio de unos 69 aminocidos
Genes TBX
18
Caja T que codifica un dominio de unos 170 aminocidos
Genes de dominio en horquilla
49
El dominio en horquilla tiene - 1 1 0 aminocidos de largo
Genes de dominio POU
24
El dominio POU tiene - 1 5 0 aminocidos de largo
A)
C a ja D E A D
2 2 -4 2
nh
B)
axxgxgkt
1 9 -2 9
PTR ELA
6 -9 4
1 7 -2 9
1 7 -2 3
TPGR
GG
19-51
DEAD
1 1 5 -1 9 2
SAT
2 0 -2 5
ARGXD
H R IG R C O O H
23-41
R e p e tic i n W D ( -------------------G H ------------------- W D
) n = 4 -1 6
C e n tro
Fig. 9-9. Algunas familias gnicas se definen por productos gnicos relacionados desde el punto de vista funcional que llevan secuencias
tpicas muy cortas de aminocidos conservados.
A) Secuencias tpicas en la familia caja DEAD. Esta familia gnica codifica productos relacionados con los procesos celulares que incluyen la alteracin
de la estructura secundaria del RNA, como el inicio de traslacin y empalme (corte y unin). Son obvias ocho secuencias tpicas de aminocidos muy
Dien conservadas, incluida la caja DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp). Los nmeros se refieren a los lmites de tamao que suelen encontrarse en secuencias
ntermedas de aminocidos (vase Schmid y Linder, 1992). X, cualquier aminocido. Vase la contraportada para el cdigo de aminocidos de una
letra. B) Familia repetida WD. Esta familia gnica codifica productos que participan en una diversidad de funciones reguladoras, como la regulacin
de la divisin celular, transcripcin, sealamiento transmembranoso, modificacin de mRNA, etc. Los productos gnicos se caracterizan por cuatro a 16
repeticiones tndem de WD, que consisten en alrededor de 44 a 60 aminocidos cada una y que contienen una secuencia central de longitud fija que
comienza con un dipptido GH (gii-his) y termina en el dipptido WD (Trp-Asp) precedido por una secuencia de longitud variable (vase Smith y cois.,
1999).
la su p erfa m ilia d e globin a : una familia pequea que no slo

incluye los miembros de las familias gnicas de las globinas a y
(3 (fig. 9-11) que funcionan en el transporte de oxgeno y el al
macenamiento de sangre, sino tambin genes equivalentes que
codifican globinas musculares y cerebrales, mioglobina y neuroglobina, respectivamente (vase fig. 12-4);
la su p erfa m ilia d e l recep to r a co p la d o a p r o te n a G: una fa
milia muy grande y diversa de receptores que median seales in
ducidas por ligando entre los ambientes extracelular e
intracelular a travs de la interaccin con protenas G intracelulares. Comparten una estructura comn de siete segmentos
transmembranales de hlice a , pero casi siempre tienen una si
militud secuencial baja (< 40%) entre s.
9.3.5 Los genes en familias gnicas humanas pueden

estar organizados en grupos pequeos o
esparcidos con amplitud, o ambas cosas
Las familias gnicas humanas pueden clasificarse en las que mues
tran pruebas de agrupamiento gnico cercano y las que se encuen
tran diseminadas en varios sitios cromosmicos diferentes. Sin
embargo, esta clasificacin es un poco arbitraria ya que algunas fa
milias gnicas consisten en mltiples grupos de genes en diferentes
sitios cromosmicos (vase cuadro 9-10) y otras, como la familia
de genes de histona (http://genome.nhgri.nih.gov/histones/chrmap.shtml), pueden estar dominadas por uno o dos grupos grandes
pero tambin tienen varios g en es h u rfa n o s esparcidos.
260
CAPITULO NUEVE
C adena
lig era
C adena^
pesada
bQ
c-
G !
G
\ \
\
S^~ x
I V
.^ s
v_>s
T4
T8
C adena
pesada
Q <S* v/ v
^ O
if.O
Y s - s f
V I
C^S
( <bp
%
i
/ " 'S
a o y
C J
I O
i
G l
I O
In m u n o g lo b u lin a en
la s u p e rfic ie c e lu la r
Cadena
pesada
8o
(V s,S M)
I O
i
-s S
C I
I O
I C t
Cadena
lig era
s v _ y (p2M)
A n tg e n o
H L A c la s e I
R e c e p to r
d e c lu la T
A n tg e n o
H L A c la s e I
Fig. 9-10. Los miembros de la superfamilia Ig son protenas de superficie con tipos similares de estructura de dominio.
Se ilustran unos cuantos ejemplos de la superfamilia Ig grande. Muchos miembros son dmeros que consisten en dominios variables (V) extracelulares
localizados en los extremos N y dominios constantes (C), situados en los extremos terminales C (membrana proximal). La cadena ligera de antgenos
HLA clase I, microglobulna p 2, tiene un dominio constante nico y no abarca la membrana. Se vincula con la cadena pesada transmembranosa que
tiene dos dominios variables y uno constante, lo que crea una estructura total similar a la de los antgenos HLA clase II.
10
30
20
40
i
^2
G ru p o d e g lo b in a a 16 p 1 3 .3
50
a2
Vlj1 2 Val
a-!
60
-m e
Gy
Ay
v|/(3
-m-m
G ru p o d e g lo b in a p 11 p 1 5 .5
---------------------------------
Grupo de hormona del crecimiento 17q23

h G H -N
O
C S -L
s
-
I i~
C la v e
Gen
expresado
E xp resad o ,
pe ro e s ta d o
in cierto
S eu d o g en
- o
-------- -
- i b
C S -A
h G H -V
C S -B
G aipo de albmina 4q12

A LB
AFP
20
40
A LF
60
80
G C /D B P
100
120
14 0
160
180
Fig. 9-11. Ejemplos de familias gnicas agrupadas humanas.

Los genes en un grupo tienen una secuencia relacionada de cerca y se transcriben de manera caracterstica a partir de la misma cadena. Es incierto el
estado funcional de los genes de globina 9 y genes CS-L. Las escalas en la parte superior (grupos de globina y hormona del crecimiento) y en la
inferior (grupo de albmina) aparecen en kilobases.
9.3
261
Cuadro 9-10. Ejemplos de familias multignicas agrupadas y dispersas.

Fam ilia
N m . de
copias
O rganizacin
Localizacin(es)
crom osm ica(s)
Agrupado dentro de 67 kb; un seudogen convencional

Agrupado en - 5 0 kb (vase fig. 9-11)
Agrupado en ms de 2 Mb (vase fig. 9-12)
17q22-24
16p13.3
6p21.3
A) FAMILIAS GNICAS AGRUPADAS

Fam ilias gnicas de grupo nico
Grupo gnico de hormona del crecimiento
Grupo gnico de globina a
Genes de cadena pesada HLA clase 1
Fam ilias gnicas de grupos m ltiples
Genes HOX
Familia gnica de histona
Familia gnica del receptor olfatorio
5
7
-20
38
61
> 900
Organizado en cuatro grupos en 2p, 7 ,1 2 ,1 7 (vase fig. 12-9)

Grupos de tamao moderado en unas cuantas localizaciones;
dos grupos grandes en el cromosoma 6
Alrededor de 25 grupos grandes diseminados en la totalidad
del genoma
Muchos
Muchos
B) FAMILIAS GNICAS DISPERSAS

Deshidrogenasa de piruvato
Aldolasa
2
5
PAX
NF1 (neurofibromatosis tipo I)
9
> 12
Cadena pesada de ferritina
> 15
Gen que contiene un intrn y un retrogen expresado en testculo

Tres genes funcionales y dos seudogenes en cinco cromosomas
diferentes
Los nueve son genes funcionales
Un gen funcional en 17q; otros son copias de DNA defectuoso
no procesadas (fig. 9-13)
Un gen funcional en el cromosoma 11; casi todos son
seudogenes procesados
Xp22; 4q22-q23
Muchos
Muchos
Muchos; sobre todo
pericentromricos
Muchos
Familias gnicas organizadas en un grupo aislado
Familias de genes organizadas en mltiples grupos gnicos
Se piensa que los genes en un grupo gnico individual se originan

por fenmenos de d u p lica ci n g n ica t n d em (fig. 12-3). Son ob
vias diferentes organizaciones:
Algunas familias de genes estn organizadas en mltiples grupos.

En ocasiones, estos ltimos pueden estar relacionados muy de cer
ca en el mismo cromosoma como resultado de una duplicacin re
ciente, por ejemplo los grupos invertidos que contienen los genes
SMN1 y SMN2 vinculados con la atrofia muscular espinal (vase
Frugier y cois., 2002). No obstante, con mayor frecuencia estn dis
tribuidos en dos o ms sitios cromosmicos. Son evidentes diferen
tes organizaciones. Algunas familias muestran una similitud
comparativamente alta entre genes en diferentes grupos; en otras es
menor. Un ejemplo notable es la fa m ilia gnica del receptor olfatorio
que codifica un repertorio diverso de receptores que permiten dife
renciar miles de distintos aromas. Los ms de 900 miembros de es
ta familia estn organizados en grupos grandes en ms de 25 sitios
cromosmicos diferentes y representan todos los cromosomas apar
te de los cromosomas 20 y Y (Glusman y cois., 2001).
La homologa secuencial suele ser mayor dentro de un grupo
que entre varios (comprese, por ejemplo, los miembros del gru
po de la globina a en l 6 p con los del grupo de la globina p en 1 lp;
vase fig. 12-4), pero en ocasiones, debido a seleccin funcional
fuerte, los genes en diferentes grupos pueden estar ms relaciona
dos entre s respecto de los de un mismo grupo, como en el caso de
los genes HOX(fig. 12-9).
organizacin gnica tndem. Los genes estn muy relacionados

entre s en trminos de la secuencias y la funcin, aunque cier
tos miembros de la familia tal vez no sean funcionales. Existen
muy pocos ejemplos de genes que codifican polipptidos (los
genes de poliubiquitina son un ejemplo notable), pero varias fa
milias de genes RNA (rRNA, U2 snRNA) muestran esta orga
nizacin;
grupo cerrado. Los genes no estn muy repetidos en tndem;
por el contrario, estn agrupados de manera estrecha y puede
regularlos una regin d e control d el locus nica; vase el ejemplo
de los grupos de genes de las globinas a y P en la figura 9-11.
Los genes individuales suelen mostrar una gran identidad secuencial y funcional entre s, pero muchos miembros de la fa
milia pueden ser seudogenes (seccin 9.3.6);
grupos compuestos. Sin embargo, en otras familias gnicas agru
padas la relacin fsica entre los genes en un grupo puede ser
menos cercana y es posible que un grupo de genes relacionados
tambin contengan dentro de l genes que no estn relaciona
dos en la secuencia y la funcin, lo que constituye un gr u p o g
n ico com pu esto. Por ejemplo, el complejo HLA en 6p21.3 lo
dominan familias gnicas que codifican antgenos de clases
HLA clases I y II y varios factores de complemento sricos, pe
ro miembros individuales de la familia pueden estar separados
por genes no relacionados en sentido funcional, como los
miembros de la familia gnica de la 21 -hidroxilasa de esteroides,
etctera.
Familias gnicas dispersas

Los miembros de algunas familias estn diseminados en dos o ms
sitios cromosmicos diferentes. Los genes en distintas localizacio
nes suelen divergir mucho en sus secuencias, a menos que ocurra
una duplicacin gnica relativamente reciente o una presin de se
leccin considerable para conservar las secuencias. Es posible que
los miembros de la familia se originen por:
262 t CAPTOLO NUEVE
genom as diferentes. El genoma mitocondrial original pudo pro

ceder de una bacteria aerobia con transferencia subsecuente de
muchos de los genes bacterianos originales al genoma nuclear.
Como resultado, este ltimo contiene genes duplicados, que co
difican isoformas especficas de citoplasma y especficas m itocondriales para ciertas enzimas y otros productos metablicos
fundamentales (vase cuadro 9-8 para algunos ejemplos).
acontecim ientos antiguos de duplicacin d el gen!genom a. De ma
nera caracterstica, las familias de este tipo slo contienen unos
cuantos miembros, como se observa en la familia gnica PAX, y
al parecer evolucionaron por una combinacin de aconteci
mientos de duplicacin gnica, duplicacin del genoma, o am
bas, durante un periodo prolongado del tiempo evolucionista.
Por lo general, todos los miembros de la familia, o muchos de
ellos, son funcionales y la homologa secuencial importante en
tre los productos gnicos puede restringirse a dominios cruciales
fundamentales, por ejemplo el dominio pareado de productos
del gen PAX.
m ediante sucesos d e retrotransposicin. Algunas familias gnicas se
expandieron en fecha comparativamente reciente en trminos
evolucionistas por un proceso mediante el cual el RNA transcri
to de uno o un nmero pequeo de genes funcionales se con
vierte por accin de la transcriptasa inversa celular en cDNA
natural, que a continuacin se integra en alguna parte de los
cromosomas. La mayor parte de estas copias no es funcional,
pero algunas familias gnicas tienen un gen funcional que con
tiene un intrn y una copia gnica procesada funcional (vase

seccin siguiente).
9.3.6 En familias multignicas se encuentran casi

siempre seudogenes, copias de genes truncadas
y fragmentos gnicos
Las familias de genes que codifican polipptidos (y genes RNA) se
caracterizan por copias defectuosas (seudogenes), en esencia de toda
la secuencia de un gen funcional (o cuando menos su secuencia co
dificante) o de porciones de ella, por ejemplo cop ia s tru n ca d a s que
carecen de los extremos 5' o 3' o fr a g m en to s internos, en algunos
casos un exn aislado. Se encuentra una gran variedad de diferentes
clases. Los ejemplos siguientes ilustran los tipos de copias gnicas
defectuosas que se hallan en diferentes tipos de familias gnicas.
Seudogenes no procesados en un grupo gnico

Con frecuencia, grupos gnicos individuales tienen copias defectuosas
de genes que se copiaron a nivel de DNA genm ico por du plicacin
g n ica tndem. Las copias pueden contener secuencias que corres
ponden a exones, intrones y regiones promotoras de los genes funcio
nales (seudogenes no procesados), pero suele reconocerse que son
defectuosas por la presencia de codones de terminacin inapropiados
en secuencias que corresponden a exones. Se encuentran ejemplos co
munes en los grupos de globinas a y (3 (vase fig. 9 - 11).
3' UTR
A)
L a-) a 2 a 3 T M
B)
CY v V M W -
-2.2 Mb
B
C
H = H > B K } 0 -D 0 -{ X 1 -
/ n t a a2
3' UTS
\a2
CY W A V W -
TM
3' UTS
agl _ (I3 TM CY ^ v A M W -
Fig. 9-12. Las familias gnicas agrupadas contienen con frecuencia seudogenes no procesados y genes truncados o fragmentos gnicos:
ejemplo de la familia de gen HLA clase I.
A) Estructura del mRNA de una cadena pesada HLA clase I. El mRNA de longitud completa contiene una secuencia que codifica polipptidos; los
cuadros representan diferentes dominios, como sigue: L, secuencia rpida; a ,, a 2, a 3, dominios extracelulares; TM, secuencia transmembranosa; CY,
cola citoplsmica; y una secuencia no traducida 3 ' (3' UTS). En esencia, los tres dominios extracelulares a r a 3 los codifica un exn aislado. No se
muestra la 5 ' UTS muy pequea. B) Grupo gnico de la cadena pesada de HLA clase I. El grupo se localiza en 6p21.3 y comprende alrededor de
20 genes. Incluye seis genes expresados (azul), cuatro seudogenes no procesados de longitud completa ( ) y una variedad de copias gnicas
parciales (cuadros rojos, abiertos, pequeos). Algunos de estos ltimos estn truncados en el extremo 5 ' (p. ej., el siguiente a HLA-B), otros en el
extremo 3 ' (como el siguiente a HLA-F) y algunos contienen exones nicos (p. ej., el siguiente a HLA-E).
9.3
ORGANIZACIN, DISTRIBUCIN Y FUNCIN DE GENES HUMANOS QUE CODIFICAN POLIPPTIDOS 263
Genes truncados y fragmentos de genes internos

en un grupo genico
La familia del gen HLA clase I en 6p21.3 es un ejemplo tpico de
un grupo genico caracterizado por seudogenes no procesados, co
pias de genes truncadas y fragmentos gnicos. Aunque el nmero
de genes HLA de clase I puede variar en distintos cromosomas 6 s,
el anlisis amplio de uno de ellos identific 17 miembros de la fa
milia agrupados en 2 Mb que comprendan: seis genes expresados,
cuatro seudogenes de longitud completa convencionales, cinco co
pias de genes truncadas y dos fragmentos gnicos internos peque
os (Geraghty y cois., 1992; vase fig. 9-12). La familia tambin se
origin por duplicaciones gnicas tndem y las copias de genes
fragmentados surgieron por cruzamiento desigual o intercambio de
sigual d e cromtides hermanas (seccin 11.3.2).
tambin son comparativamente inestables y propensas a duplica

cin (Eichler, 2001; Mefford yTrask, 2002). Son una contribucin
importante a la d u p lica ci n segm en ta ria especfica de primates
que constituye ms de 150 Mb del genoma humano, aunque al pa
recer el efecto de inestabilidad es en parte especfico de cromoso
mas (vase Bailey y cois., 2002; seccin 12.2.5).
En el gen NF1, estn distribuidas en siete diferentes cromoso
mas cuando menos 11 copias de fragmentos no procesados de seudogn/gen (que contienen secuencias que semejan intrones NF1 y
asimismo exones), nueve de ellas localizadas en las regiones pericen
tromricas (Regnier y cois., 1997; vase fig. 9-13). El gen PKD1 tie
ne 46 exones que abarcan 50 kb. Se replic con fidelidad una copia
del gen 5' truncado que comprende alrededor de 70% del gen
(exones 1 a 34 ms intrones intermedios) cuando menos tres veces
y se insert en un sitio ms proximal en 16pl3.1 (European
Polycystic Kidney Disease Consortium, 1994).
Seudogenes no procesados en una familia genica dispersa

Dos ejemplos ilustrativos son las secuencias relacionadas con los ge
nes NF1 (neurofibromatosis tipo I) y PKD1 (enfermedad poliqustica del rin adulto). Estos genes se localizan, de manera
respectiva, en 17ql 1.2 , cerca del centrmero (pericentrom ricd), y
16pl3.3, cerca del telmero (subtelomricd). De manera caracters
tica, las regiones pericentromricas humanas estn compuestas de
secuencias que se copiaron en poca reciente durante la evolucin
y que se hallan en varios cromosomas. Las regiones subtelomricas
Seudogenes procesados en una familia gnica dispersa

que codifica polipptidos
Las familias gnicas dispersas poseen casi siempre copias de genes
defectuosas que contienen secuencias que corresponden a los exo
nes de un gen funcional (pero no los intrones) y por lo general in
cluyen en un extremo una secuencia oligo (dA)/(dT). Estos
seudogenes procesados se copiaron a nivel d el cDNA por retrotransposicin (vase asimismo seccin 9.5.1). Las transcriptasas in-
G en N F 1 1 7 q 1 1.2; 6 0 ex o n e s
l l l l l l l l ll IIIIIII I I IIIIIII IIIIIIIIIIII IIIIIIIMI MIHHIHB

10b
27b
l * * l I I I I I I l |* * * * * ** * * * * |
'
II I I I I I I I
2 q 1 2 -q 1 3
14p11oq11
22p11< > q 11
39 -41
11
1617
l l l***l
4 f 12q11
-H+
1 8 p 1 1 .2
21 p 1 1 < > q 1 1
1 1 p 1 4 .3
13
27b
111111111111H H+h
1 5 p 1 1 .2 (2x)
Fig. 9-13. Los seudogenes no procesados esparcidos se originan a partir del gen de NF1 perlcentromrico (neurofibromatosis tipo I).
Los exones estn representados como rectngulos verticales delgados. Para conveniencia, los intrones en el gen NF1 se representan como si tuvieran
longitudes iguales. Aunque el gen NF1 tiene 60 exones, la numeracin de los exones discurre del uno al 49 con ciertos exones vecinos a los que se
asign el mism o nmero, pero distintas letras (p. ej., exones 10a, 10b y 10c). Se encuentran copias de seudogenes muy homlogos del gen NF1 en
otras ocho o ms localizaciones del genoma, sobre todo en regiones pericentromricas. En cada caso, el seudogn slo comprende una copia de una
porcin de la longitud total del gen, con algunos exones e intrones intermedios. Son aparentes los reordenamientos de los seudogenes. Algunos
causaron delecin de exones e intrones (se muestran con asteriscos). Uno particip en una inversin de tal manera que la copia 39 del exn est
invertida en comparacin con las copias de exones contiguos. Datos proporcionados gentilmente por Nick Thomas y Meena Upadhyaya, University of
Wales College of Medicine.
264
CAPTULO NUEVE
E1
E2
E3
3'
5'
5'
Tran scrip ci n y
p ro c e s a m ie n to d e R N A
E1 E2 E3
A A A A ..... A
3'
In te g ra c i n en
D N A c ro m o s o m ic o
mRNA
AAAAANn
T ra n s c rip ta s a
in v ersa
TTTTT
5'
5'
S n te sis d e la
segunda cadena
y re p a ra c i n d e D N A
E1 E2 E3
3'
3'
cDNA
5 ' ---------- A A A A A N A A A A ..... A A A A A A N n

3 ' ----------
1 1 1 1
i N' T T T T ..... T T T T T T N '
Fig. 9-14. Los seudogenes y retrogenes procesados se originan por transcripcin inversa de transcritos de RNA.
La funcin de la transcriptasa inversa podran proporcionarla las repeticiones LINE-1. El modelo de la integracin que se muestra en la figura slo es una
de varias posibilidades. En este caso, se considera la integracin como roturas tambaleantes (indicadas por flechas onduladas) en secuencias ricas en
A, pero podran recibir la asistencia de la endonucleasa LINE-1 (seccin 9.5.2). Si se incluye una secuencia abundante en A en un extremo saliente 5 ,
podra form ar un hbrido con el extremo distal de poli(T) del cDNA, lo que facilita la sntesis de la segunda cadena. Debido a las roturas tambaleantes
durante la integracin, la secuencia insertada est flanqueada por repeticiones directas cortas (secuencias en cuadros). E1-E3 representan exones; R
promotor. Las copias transpuestas no llevan un promotor y por consiguiente, en condiciones normales, no se expresan y adquieren mutaciones perjudi
ciales {seudogenes procesados). Sin embargo, algunas copias procesadas de genes que codifican polipptidos son funcionales (retrogenes), tras in
tegrarse en un sitio adyacente a un promotor funcional y estar sujetas a presin de seleccin para conservar la funcin (cuadro 9-11).
Cuadro 9 -1 1. Ejemplos de retrogenes humanos sin intrones y su homologa parental que contiene intrones.
(para mayor informacin, vase http://exppc01 .un-muenster.de/expath/frames.htm)
R e tro g e n
H o m o lo g a q u e c o n tie n e in tr n
P ro d u c to
GK2en 4q13
GK1 en Xp21.3
Cinasa de glicerol
PDHA2 en 4q22-q23
PDHA1 en Xp22
Deshidrogenasa de piruvato
PGK2 en 6p12.3
PGK en Xq13
Cinasa de fosfoglicerato
TAF1L en 9p13.3
TAF1 en Xq13.1
Factor protenico relacionado de enlace de caja TATA, 250 kDA
MYCL1 en 1p34.2
MYCL2 en Xq22-23
Homologa del oncogen v-m yc
GLUD1 en 10q23.3
GLUD2 en Xq25
Deshidrogenasa de glutamato
SNAIL1L1 en 2q33-q37
SNAIL1 en 20q13
Regulador del desarrollo relacionado con caracoles
versas celulares transcriben mRNA en cDNA natural, que a conti

nuacin se integran al DNA cromosmico (fig. 9-14) con mayor
probabilidad con ayuda de la maquinaria de transposicin LINE-1
(vase seccin 9.5.2). Los seudogenes procesados pueden ser muy
prolficos. Por ejemplo, hay 79 protenas en ribosomas citoplsmicos y una familia de 95 genes de protenas ribosmicos (16 son du
plicados), pero se identific en el genoma nuclear una asombrosa
cifra de 2 090 seudogenes procesados de este tipo (Zhang, 2002).
De forma caracterstica, los seudogenes procesados no se expre
san (por falta de una secuencia promotora), aunque se conocen al
gunos ejemplos de genes procesados expresados. En este caso, se
integr el cDNA natural en un sitio del DNA cromosmico que,
por azar, est adyacente a un promotor que puede impulsar la ex
presin de la copia del gen procesado. La presin de seleccin pue

de asegurar la expresin continua de la copia del gen procesado que
entonces se considera un retrogen. Se conoce una diversidad de re
trogenes sin intrn que tienen patrones de expresin especficos de
testculo y con frecuencia son homlogos autosmicos de un gen li
gado a X que contiene un intrn (vase cuadro 9-11). La presin
de seleccin en este caso puede ser el requerimiento para la expre
sin durante la meiosis masculina cuando son activos de modo
transcripcional los genes autosmicos, pero cuando se silencian
ambos cromosomas X y Y se condensan para formar heterocromatina. Sin embargo, algunos retrogenes funcionales son copias de ge
nes no ligados a X, como una copia del regulador del desarrollo
SNAIL1 (Locascio y cois., 2002).
9.4
DNA NO CODIFICANTE DE REPETICIN TNDEM
265
Seudogenes procesados en una familia gnica que

codifica RNA
fa m ilia s d e p r o te n a s (con base en la similitud funcional gene

ral): vase el cuadro 9-12;
Aunque el tamao de algunas familias gnicas dispersas que codifi

can polipptidos comprueba el xito de la retrotransposicin como
un mecanismo para generar copias de genes procesados, el xito de
' =s retrotransposiciones (en trminos de un nmero alto de copias)
se lleva a cabo en realidad a partir de transcritos de polimerasa III
de RNA. Por ejemplo, se considera que la familia de rep etici n Alu
vase seccin 9.5.3) surgi como seudogenes procesados copiados
iel gen de RNA que codifica SRP (llamado asimismo RNA 7SL),
un componente de la partcula de reconocim iento de seal. Los genes
como el de este ejemplo, que se transcriben mediante polimerasa
III de RNA, suelen contener un prom otor interno (fig. 10-4) que fa
cilita la expresin de copias recin transpuestas en regiones permi
sivas del genoma.
d o m in ios d e p ro ten a s: vase el cuadro 9-13. El gran nmero

de dedos de cinc testifica su importancia en una amplia varie
dad de interacciones DNA-protena;
9.3.7 Se ha iniciado la clasificacin del proteoma

humano, pero an son inciertas las funciones
precisas de muchas protenas humanas
rep eticio n es d e p ro ten a s: las ms comunes son la repeticin

beta de la protena G WD-40 (-400 compatibilidades protenicas) y la repeticin de ancirina (> 260 compatibilidades de pro
tenas).
Se ha iniciado asimismo la clasificacin funcional y el G ene O ntolo g y (GO) con sortiu m defini categoras de clasificacin funcional
de acuerdo con el componente celular en que opera la protena, su
funcin molecular y el proceso biolgico total al que contribuye
(seccin 8.3.6). Por supuesto, este es un proceso constante: an es
necesario determinar las funciones de muchos genes humanos me
diante varios mtodos. En la figura 9.15 se ilustra una clasificacin
inicial de las protenas humanas segn sean la funcin molecular y
el proceso biolgico.
9.4
La secuenciacin del genoma humano proporcion informacin
valiosa sobre el grupo predicho de protenas humanas, el proteoma
humano. Se haban asignado con anterioridad funciones protenicas en muchos genes, pero el anlisis de un gran nmero de genes
nuevos permiti extender las clasificaciones previas. Varias bases de
datos estn dedicadas a registrar caractersticas de secuencia que son
compartidas por mltiples protenas e indican funciones comunes
o relacionadas (aunque no todas las protenas pueden asignarse a las
categoras disponibles porque algunas protenas no parecen com
partir secuencias con otras). Las bases de datos que se utilizan in
cluyen a menudo la base d e d a tos In terP ro conservada por el
European Bioinformatics Institute y la base d e datos P fam preserva
da en el Wellcome Trust Sanger Institute (vase las lecturas adicio
nales). Las categoras incluyen las siguientes:
DNA no codificante de repeticin

tndem
Con frecuencia se reconoce DNA humano no codificante muy re

petido en disposiciones (o bloques) de repeticiones tndem de una se
cuencia que puede ser simple (1 a 10 nucletidos) o compleja en
grado moderado (decenas a cientos de nucletidos). Pueden obser
varse configuraciones individuales en unos cuantos sitios cromos
micos diferentes o en muchos de ellos. Segn sea el tamao de la
configuracin pueden definirse tres subclases mayores: DNA satli
te, DNA minisatlite y DNA microsatlite (cuadro 9-14). El DNA
satlite es inactivo desde el punto de vista transcripcional, al igual
que la inmensa mayora del DNA minisatlite, pero en el DNA mi
crosatlite un porcentaje considerable (aunque muy pequeo) se
localiza en DNA codificante.
Cuadro 9 -12 . Las 15 principales familias de protenas en el proteoma humano.

Datos obtenidos en enero de 2003 de la base de datos InterPro conservada por el European Bioinformatlc Institute en http://www.ebi.ac.uk/proteome/
Referencia InterPro
Nombre de la familia protenica
Protenas compatibles
IPR000272
Receptor acoplado a proteina G parecido a rodopsina
826
IPR000719
Cinasa de protena
688
IPR001909
Caja KRAB (caja relacionada con Kruppel)
314
IPR001806
Superfamilia GTP-asa Ras
192
IPR005821
Protena de transporte inico
149
IPR000387
Fosfatasa de proteina especfica de tirosina y fosfatasa de protena de especificidad doble
139
IPR001254
Proteasa de serina, familia tripsina
128
1PR000379
Esterasa/lipasa/tioesterasa, sitio activo
112
IPR007114
Superfamilia facilitadora mayor (SFM)
100
1PR001993
Transportador mitocondrial de sustrato
86
IPR001664
Protena de filamento intermedio
85
IPR001128
Citocromo P-450
84
266
CAPTULO NUEVE
Cuadro 9-13. Los 15 principales dominios protenicos en

el proteoma humano
Datos obtenidos en enero de 2003 de la base de datos InterPro en
http://www.ebi.ac.uk/proteome/
Referencia
InterPro
Nombre del dominio

protenico
Nmero total
en el proteoma
IPR007087
Dedo de cinc, tipo C2H2
28 654
IPR002126
Caderina
4131
IPR006209
Dominio parecido al tactor

de crecimiento epidrmico (EGF)
3107
IPR003006
Inmunoglobulina/complejo
de histocompatibilidad mayor
2 387
IPR002048
Banda EF de enlace de calcio
1 885
IPR001452
Dominio SH3
1 815
IPR003961
Fibronectina, tipo III
1 812
IPR000504
Regin RNP-1 de enlace de RNA

(secuencia tpica de
reconocimiento de RNA)
1 783
IPR001356
Flomeobox
1 435
IPR002965
Extensna rica en prolina
1 229
IPR001478
Dominio PDZ/DHR/GLGF
1 143
IPR001841
Dedo de cinc, RING
1 132
IPR001849
Parecido a plecastrina
1 061
IPR000210
Dominio BTB/P0Z
494
IPR005225
Dominio pequeo de protena

de enlace de GTP
189
9.4.1 El DNA satlite consiste en disposiciones muy

largas de repeticiones tndem que pueden
separarse del volumen del DNA mediante
centrifugacin de gradiente de densidad
El DNA satlite humano est constituido por configuraciones muy
grandes de DNA de repeticin tndem. La unidad repetida puede
ser una secuencia simple (slo unos cuantos nucletidos de largo)
o alguna compleja en moderada proporcin (cuadro 9-14; vase
Singer, 1982). El DNA satlite integra la mayor parte de las regio
nes heterocromticas del genoma y se encuentra de manera notoria
en la cercana de los centrmeros (h etero cro m a tin a p ericen tr o m ric). Cuando la unidad repetida es muy corta, la composicin de
bases de las unidades repetidas, y asimismo la composicin total de
bases del DNA satlite, puede variar de forma sustancial del DNA
genmico total. Como resultado, ha sido posible separar de la ma
sa de DNA tres DNA satlite humanos, los satlites I, II y III, me
diante centrifugacin de gradiente d e densidad boyante. Cada clase
satlite incluye varias diferentes familias de secuencias de DNA de
repeticin tndem (subfamilias satlite), algunas de las cuales se
comparten entre distintas clases. Los satlites II y III contienen so
bre todo repeticiones de secuencias simples pero tambin es obvia
una estructura de orden ms alto.
DNA alfoide y heterocromatina centromrica

No es posible resolver con facilidad mediante centrifugacin de
gradiente de densidad otros tipos de secuencias de DNA satlite. Se
han identificado primero por digestin del DNA genmico con
una endonucleasa de restriccin que, de modo caracterstico, tiene
un sitio de reconocimiento nico en la unidad bsica repetida. Ade
ms del tamao de esta ltima (monmero), estas enzimas produ-
A)
B)
70 f
60
6050
*50
5T
c 40
<B
p
o 30
Q.
<
1>
I 40
*->
g 30
o
20
20
10
10
i fhiJ Ikfli [Tu
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O.'S'
%
%
% %
Fig. 9-15. Clasificacin de protenas humanas y de ratn basada en sus funciones moleculares y los procesos biolgicos en que participan.
Los trminos de ontologia gnica (0G) se agruparon en una decena de categoras situadas dentro de ontologas ms grandes de funcin m o le cu lar (A)
y proceso biol gico (B). Barras azules: protenas de ratn; barras rojas: protenas humanas. Modificado a partir de Mouse Genome Sequencing
Consortium (2002), Nature 420, 520-562, con autorizacin de Nature Publishing Group.
9.4 ! DNA NO CODIFICANTE DE REPETICIN TNDEM
cen un patrn tpico de multmeros de longitud de unidad debido

i la prdida ocasional aleatoria del sitio de restriccin en algunas de
las repeticiones (Singer, 1982). El satlite alfa (o DNA alfoide)
consiste en repeticiones tndem de una unidad repetida de 171 pb
v constituye el mayor volumen de la heterocromatina centromrica. La divergencia alta de secuencias entre miembros individuales
de la familia DNA alfoide significa que existen subfamilias espec
ficas para cada uno de los cromosomas humanos (Choo y cois.,
1991).
An es necesario aclarar la funcin precisa del DNA satlite
i vase Csink y Henikoff, 1998; Henikoff y cois., 2001). El DNA
centromrico de cromosomas humanos consiste en buena medida
de varias familias de DNA satlite (vase fig. 9-16). De ellas, slo
se sabe que el satlite a se encuentra en todos los cromosomas y sus
unidades repetidas contienen con frecuencia un sitio de enlace pa
ra una protena centrmera especfica, CENP-B. Se ha demostrado
que las configuraciones satlites alfas clonadas diseminan centrmeros nuevos en clulas humanas, lo cual indica que el satlite alfa
ejerce una accin importante en la funcin del centrmero (Grimes
yCook, 1998).
9.4.2 El DNA minisatlite est compuesto de

configuraciones de tamao moderado
de repeticiones tndem y con frecuencia se
localiza en telmeros o cerca de ellos
El DNA minisatlite comprende un conjunto de disposiciones de
tamao moderado de secuencias de DNA de repeticin tndem
que estn dispersas en porciones considerables del genoma nuclear
(cuadro 9-14). Al igual que las secuencias de DNA satlite, no se
transcriben en condiciones normales (pero vase ms adelante).
Las secuencias de DNA minisatlite hipervariable son muy
polimrficas y estn organizadas en ms de 1 000 configuraciones
C
=
| S a t lite alfo id e
* S a t lite P
| S a t lite s 2 y 3
267
. ;)- S a t lite p
} rD N A
-. S a t lite P
< S a t lite s 2 y 3
^ S a t l i t e alfo id e
satlite adicional 1
y otras repeticiones
21
Fig. 9-16. Organizacin del DNA satlite en centrmeros.
Se muestran las localizaciones de diferentes clases de DNA satlite en
los cromosomas 9 y 21 (uno de los cinco cromosomas acrocntricos
autosmicos). La ilustracin se modific a partir de Tyler-Smith y
Willard (1993) Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 390-397, con autorizacin de
Elsevier.
(desde 0.1 a 20 kb de largo) de repeticiones tndem cortas (Jeffreys,

1987). Las unidades repetidas en diferentes disposiciones hipervariables cambian de tamao en grado notable, pero comparten una
secuencia central comn, GGGCAGGAXG (en la que X es cual
quier ncleotido), que es similar en tamao y contenido de G a la
secuencia chi, una seal para recombinacin generalizada en E. coli. Si bien muchas de las configuraciones se hallan cerca de telmeros, ocurren varias secuencias de DNA minisatlite hipervariable en
otros sitios cromosmicos. Aunque la gran mayora de las secuen
cias de DNA minisatlite hipervariable no se transcribe, se sabe que
se expresan algunos casos raros (p. ej., el locus MJJC1; Swallow y
cois., 1987).
An no se dilucida la importancia del DNA minisatlite hiper
variable, aunque algunas publicaciones indican que es un punto
crtico (punto caliente) para recombinacin homologa en clulas
Cuadro 9-14. Principales clases de DNA humano de repeticin tndem.

Clase
Tam ao de la unidad
de repeticin (pb)
P rin c ip al(es) lo c aliza ci n (e s)

cro m o s m ica (s); estado transcripcional
DNA satlite (a menudo estructuras dentro

de 100 kb para varias Mb de lmite de tamao)
5-171
Sobre todo en centrmeros; no se transcribe
a (DNA alfoide)
171
Heterocromatina centromrlca de todos los cromosomas
p (familia Sau3A)
68
De forma notable la heterocromatina centromrica de 1, 9 ,1 3 ,1 4 ,

15, 21, 22 y Y
Satlite 1 (abundante en AT)
25-48
Heterocromatina centromrlca de casi todos los cromosomas y

otras regiones heterocromticas
Satlites 2 y 3
La mayor parte, quiz todos los cromosomas
9-64
En los telmeros o cerca de ellos de todos los cromosomas;

la inmensa mayora no se transcribe
Familia telomrica
Todos los telmeros
Familia hipervariable
9-64
Todos los cromosomas, con frecuencia telmeros cercanos
12
Esparcido en la totalidad de los cromosomas; algunas configuraciones

pequeas de secuencia muy simple
DNA minisatlite (a menudo estructuras

dentro de los lmites de 0.1-20 kb)
DNA microsatlite (es decir, repeticiones

de secuencia simple, RSS)
(estructuras tpicas < 100 pb)
268
CAPTULO NUEVE j ORGANIZACIN DEL GENOMA HUMANO
humanas (Wahls y cois., 1990). No obstante, encontr muchas apli

caciones. Se caracterizaron varios locus individuales y se utilizan co
mo marcadores genticos, aunque la localizacin preferencial en las
regiones subtelomricas limit su uso para estudios de enlace de to
do el genoma. Un aplicacin mayor es la huella de DNA, en la cual
puede hibridarse una sonda de DNA aislada que contiene la se
cuencia central comn de forma simultnea con mltiples locus de
DNA minisatlite en todos los cromosomas, con un consecuente
patrn complejo de hibridacin especfico de individuo (vase sec
cin 18.7.1).
Otra gran familia de secuencias de DNA minisatlite se encuen
tra en las terminales de cromosomas, los telmeros. Los principales
constituyentes del DNA telomrico de los cromosomas humanos
son unidades de hexanucletidos de repeticin tndem de 3 a 20
kb, en especial TTAGGG, que se aaden mediante una enzima es
pecializada, telomerasa. Actan como amortiguadores para proteger
los extremos de los cromosomas de su degradacin y prdida y pro
porcionan un mecanismo para la replicacin de los extremos del
DNA lineal de los cromosomas; estas repeticiones simples tienen a
su cargo de manera directa la funcin del telmero (fig. 2 -6 ; sec
cin 2 .2 .5 ).
9.4.3 El DNA microsatlite consiste en configuraciones

cortas de repeticiones tndem simples y est
disperso en la totalidad del genoma humano
Los DNA microsatlites, tambin conocidos como repeticiones
de secuencias simples (RSS), son disposiciones pequeas de repe
ticiones tndem de una secuencia simple (por lo general menor de
10 pb). Estn diseminados en la totalidad del genoma, constituyen
ms de 60 Mb (2% del genoma) y se piensa que surgieron sobre to
do por deslizamiento d e replicacin (fig. 11-5). Las configuraciones
de repeticiones dinucletidas son el tipo ms comn y constituyen
alrededor de 0.5% del genoma. Son muy comunes las repeticiones
CA/TG (una por 36 kb) y con frecuencia muy polimrficas (figs.
7-7, 7-8). Tambin son muy comunes las repeticiones AT/TA (una
por 50 kb) y AG/CT (una por 125 kb), pero muy raras las repeti
ciones CG/GC (una por 10 Mb) debido a que el dinucletido
CpG es propenso a la metilacin y desaminacin subsecuente (sec
cin 9.1.3).
De las repeticiones de mononudetidos, son muy comunes las
corridas de A y T (vase fig. 9-19 para ejemplos intragnicos) y mu
cho ms raras las de G y C. En trminos comparativos, son raras
clases individuales de repeticiones tndem de trinucletidos y tetranudetidos, pero a menudo son muy polimrficas y se investigan
cada vez ms para desarrollar marcadores muy polimrficos. Vase
los cuadros 14 y 15 del International Human Genome Sequencing
Consortium (2001) para obtener informacin ms amplia.
Se desconoce la importancia del DNA microsatlite. Las repeti
ciones alternadas purina-pirimidina, como repeticiones tndem del
par de dinucletidos CA/TG, son capaces de adoptar una confor
macin de DNA alterada, Z-DNA, in vitro, pero existen pocas
pruebas de que lo lleven a cabo en la clula. Aunque por lo general
el DNA microsatlite se identifica en DNA intergnico o dentro de
los intrones de genes, se han registrado unos cuantos ejemplos den
tro de las secuencias gnicas codificantes y suelen ser puntos crti
cos de mutacin porque son propensos a deslizamiento de
replicacin (vase fig. 11-14 para algunos ejemplos) y en ciertos ca
sos limitados a expansin inestable (secciones 1 1.5.2 y 16.6.4).
9.5
DNA no codificante repetido

disperso
9.5.1 Las repeticiones derivadas de transposn

constituyen hasta > 40% del genoma humano y
surgieron sobre todo por intermediarios de RNA
Casi todos los DNA no codificantes repetidos dispersos en el geno
ma humano derivan de elementos transponibles (llamados asi
mismo transposones), secuencias movibles de DNA que pueden
migrar a diferentes regiones del genoma (Smit, 1996; Prak y Kazazian, 2000). Es posible reconocer que cerca del 45% del genoma
pertenece a esta clase (International Human Genome Sequencing
Consortium, 2001; Li y col., 2001), pero gran parte del DNA ni
co restante tambin debe derivar de copias antiguas de transposo
nes que se desviaron muy lejos para reconocerse como tales.
Muchas veces descartados con anterioridad como DNA chatarra,
cada vez existen ms pruebas que indican que estos transposones
pueden ser valiosos para las clulas de mamferos (vase Dennis,
2002).
En seres humanos y otros mamferos existen cuatro clases prin

cipales de transposones, pero slo una muy pequea minora se
transpone de modo activo. Pueden organizarse en dos grupos segn
sea el mtodo de transposicin:
retrotransposones (que tambin se abrevian como retroposones). En este caso, el mecanismo de copia utiliza transcriptasa
inversa para formar copias de cDNA de transcritos de RNA,
que semeja la forma en que se generan los seudogenes y retrogenes procesados (seccin 9.3.6). La tra n sp osicin rep lica tiva
(o copia) asegura que se haga una copia de una secuencia exis
tente despus de lo cual la copia migra y se inserta en cualquier
parte del genoma. A este grupo corresponden tres clases de
transposones de mamferos: elementos nucleares dispersos lar
gos (LINES); elementos nucleares dispersos cortos (SINES); y
elementos parecidos a retrovirus que contienen repeticiones ter
minales largas;
transposones de DNA. Los miembros de esta cuarta clase de
transposones migran por tra n sp osicin con serva d ora . No hay
copia de la secuencia; por el contrario, se corta la secuencia y a
continuacin se inserta de nueva cuenta en cualquier parte del
genoma (un mecanismo de cortar y pegar).
De acuerdo con su capacidad o imposibilidad para transponerse de
manera independiente, los elementos transponibles pueden ser au
tnomos o no autnomos (fig. 9-17). De las cuatro clases de elemen
to transponible, predominan LINES y SINES y se describen con
mayor detalle en las secciones 9.5.2 y 9.5.3, respectivamente. En
este inciso se describen de manera breve las otras dos clases.
Transposones humanos de repeticiones terminales

largas (RTL)
Los transposones RTL incluyen elementos similares a retrovirus
autnomos y no autnomos que estn flanqueados por r ep eticio
n es term in a les la rga s (RTL) (directas) que contienen elementos
reguladores transcripcionales necesarios. Los miembros autnomos
se conocen como secu en cia s retro vira les en d gen a s (o SRE) y
contienen genes g a g y p o l, que codifican una proteasa, transcripta
sa inversa, RNA-asa H e integrasa. Hay tres clases mayores de SRE
humanas (SREH) que constituyen un total de casi 4.6% del geno-
9.5 DNA NO CODIFICANTE REPETIDO DISPERSO
NO AUT NO M O
AUTNOM O
O RF1
O R F 2 (p o l)
> P
I I
H n n n iB
L IN E S
269
( A )n i
6-8 k b
(A)n
1 0 0 -3 0 0 p b
S IN E S
P a re c id o a re tro v iru s
RTL
P
R TL
g a g p o i (env)
R TL
(g a g ) R T L
(T ra n s p o s o n e s R TL)
6-11 kb
T ra n s p o s o n e s D N A f s ile s
1 .5 -3 k b
tra n s p o s a s a
6 -3 k b
____ ^
8 0 p b -3 k b
Fig. 9-17. Familias de transposones de mamferos.

Slo una proporcin pequea de los miembros de cualquiera de las familias que se muestran arriba puede ser capaz de someterse a transposicin;
muchos miembros perdieron esta capacidad y adquirieron mutaciones inactivadoras y muchos son copias truncadas cortas. Vase las figuras 9-18 y
9-19 para las estructuras tpicas de ciertos elementos humanos transponibles. Modificado a partir de International Human Genome Sequencing
Consortion (2001), Nature 409, 860-921, con autorizacin de Nature Publishing Group.
Cuadro 9-15. Principales clases y familias de DNA repetido dispersas en el genoma humano (excluido el cromosoma Y).
Clase
Familia
Nm. de copias
Fraccin dei genoma (%)
SINE
Familia Alu
~ 1 200 000
10.7
MIR
~ 450 000
2.5
MIR3
~ 85 000
0.4
Familia LINE-1
- 600 000
17.3
Familia LINE-2
- 370 000
3.3
Familia LINE-3
~ 44 000
0.3
Familias SRE
~ 240 000
4.7
MaLR
- 285 000
3.8
MER-1 (Charlie)
- 213 000
1.4
MER-2 (Tigger)
~ 68 000
1.0
Otros
~ 60 000
0.4
UNE
Elementos RTL
Transposn de DNA
Datos del International Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002.
ma humano (cuadro 9-15). Muchsimas son defectuosas y durante

millones de aos han sido en extremo raras las transposiciones. Sin
embargo, el grupo muy pequeo SREH-K muestra una conserva
cin de genes retrovirales intactos (Lower y cois., 1996) y algunos
miembros de la subfamilia SREH-K10 sufrieron transposicin en
poca comparativamente reciente de la evolucin. Los elementos

retrovirales no autnomos carecen del gen p o ly con frecuencia tam
bin del gen ga g (la secuencia interna se pierde por recombinacin
homologa entre las RTL de flanqueo). La familia MaLR de estos
elementos constituye casi 4% del genoma (cuadro 9-15).
270 CAPTULO NUEVE j ORGANIZACIN DELGENOMA HUMANO
Fsiles de transposones de DNA humano

Los transposones de DNA tienen repeticiones terminales inverti
das y codifican una tra nsposasa que regula la transposicin. Re
presentan casi 3% del genoma humano y pueden agruparse en
diferentes clases que suelen subdividirse en muchas familias con
orgenes independientes (vase Smit, 1996, y la base de datos RepBase de secuencias repetidas en http://www.girinst.org/). Existen
dos familias humanas mayores, MERI y MER2, adems de una
diversidad de familias menos frecuentes (cuadro 9-15). Casi sin ex
cepcin, todas las secuencias de transposn de DNA humano resi
dentes ya no son activas y por consiguiente son transposones fsiles.
Los transposones de DNA tienden a tener periodos de vida cortos
dentro de una especie, a diferencia de algunos otros elementos
transponibles como LINES (seccin 9.5.2). No obstante, al pare
cer, muy pocos genes funcionales humanos se originaron de trans
posones de DNA, en especial genes que codifican las recombinasas
RAG1 y RAG2 y la protena mayor de unin de centrmero
CENPB (vase asimismo Jurka y Kapitonov, 1999; Smit, 1999; In
ternational Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
9.5.2 Algunos elementos LINE-1 humanos se transponen

de modo activo y permiten la transposicin de
SINES, seudogenes y retrogenes procesados
Los elementos nucleares dispersos largos (LINE) son elementos
transponibles muy satisfactorios y tienen una historia evolucionis
ta larga. Como elementos transponibles autnomos, pueden codi
ficar los productos necesarios para asegurar la retrotransposicin,
incluida la transcriptasa inversa esencial. Los LINES humanos se
integran con tres familias relacionadas de forma distante: LINE-1
(L-l), LINE-2 y LINE-3, que comprenden en conjunto alrededor
del 20% del genoma (cuadro 9-15). Se localizan sobre todo en re
O RF1
5' UTR
A)
Elemento LINE-1
giones eucromticas y estn situados de preferencia en las bandas G

oscuras abundantes en AT (positivas a Giemsa) de cromosomas en
metafase (Korenberg y Rykowski, 1988). De las tres familias huma
nas, LINE-1 (o L-l) es la nica que an lleva a cabo de modo ac
tivo la transposicin, es predominante y constituye alrededor del
17% del genoma. Es el elemento transponible humano ms impor
tante y se encuentra asimismo en otros mamferos, incluidos los ra
tones (Ostertag y Kazazian, 2001).
El elemento LINE-1 (L-l) de longitud completa tiene alrede
dor de 6.1 kb de largo y codifica dos protenas: una protena de en
lace de RNA y una protena con actividades de endonucleasa y
transcriptasa inversa (fig. 9-18A). De manera excepcional, se loca
liza un prom otor interno dentro de la 5'UTR y por consiguiente las
copias de transcritos de longitud completa llevan consigo su pro
motor propio que puede utilizarse despus de la integracin en una
regin permisiva del genoma. Despus de la traduccin, se ensam
bla el RNA LINE-1 con sus protenas codificantes propias y se
mueve hacia el ncleo. La endonucleasa corta un dplex de DNA
en una cadena dejando un grupo OH 3 libre que sirve como ce
bador para la transcripcin inversa del extremo 3' de RNA LINE.
El sitio preferido de corte de las endonucleasas es TTTTA y por
ello la preferencia para integrar regiones con abundancia de AT. El
DNA abundante en AT tiene muy pocos genes y por lo tanto su
tendencia a integrarse en el DNA abundante en AT significa que
LINES impone una carga mutacional ms baja, lo que facilita que
su husped se ajuste a ellos.
Con frecuencia, la transcripcin inversa no prosigue durante la
integracin hasta el extremo 5' y como resultado hay inserciones
truncadas, no funcionales. Por consiguiente, casi todas las repeti
ciones derivadas de LINE son cortas, con un tamao promedio de
900 pb para todas las copias LINE-1 y slo alrededor de una en
100 copias es de longitud completa. La maquinaria LINE-1 tiene a
su cargo la mayor parte de la transcripcin inversa en el genoma y
O R F2
3' UTR
AAAAAATTTTTT-
n
i
p40
5'
B)
D m e ro A lu
T ra n s c rip ta s a in versa
y e n d o n u c le a s a
16 0
130
.3 '
AAAAAA
TTTTTT-
A A A A A A .- ll
TTTTTT-
32
Fig. 9-18. Elementos humanos de repeticin LINE-1 y Alu.

A) Elemento LINE-1. El elemento LINE-1 (L-1) de 6.1 kb tiene dos marcos de lectura abiertos: un 0RF1 de 1 kb que codifica una protena de enlace de
RNA y un 0RF2 de 4 kb que especifica una protena con actividades de endonucleasa y transcriptasa inversa. Est situado un promotor interno dentro
de una regin de DNA no traducida que antecede 0RF1 (llamada por convencin 5'UTR), en tanto que en el otro extremo hay una secuencia (A)/(T),
que a menudo se describe com o la poli(A) cola 3 '. La endonucleasa LINE-1 corta (4) una cadena de un dplex de DNA, de preferencia dentro de la
secuencia TTTT4A y la transcriptasa inversa utiliza el extremo OH 3 liberado para cebar la sntesis de cDNA. Los nuevos sitios de insercin estn
flanqueados por una duplicacin de un sitio blanco pequeo de siete a 20 pares de bases (pb). B) Repeticin Alu. Se muestra el dmero Alu estndar de
consenso con dos repeticiones similares que terminan en una secuencia parecida a (A)/(T). Tienen diferentes tamaos debido a la insercin de un
elemento de 32 pb con la repeticin ms grande. Existen asimismo monmeros Alu en el genoma humano, al igual que varias copias truncadas de
monmeros y dmeros.
9.5
rem ite la retrotransposicin de los SINE no autnomos y la crean de seudogenes y retrogenes procesados (Esnault y cois., 2000;
>?jcin 9.3.6). De las cerca de 6 000 secuencias LINE-1 de longicompleta, alrededor de 60 a 100 son capaces an de sufrir
preposicin y, en ocasiones, causan enfermedades al alterar la funn del gen despus de insertarse en una secuencia conservada importante (seccin 11.5.6).
elementos nucleares dispersos cortos (SINES) tienen alrededor de 100 a 400 pb de largo, suelen ser muy tiles para formar coonias en genomas de mamferos y dan por resultado una
diversidad de familias con un nmero de copias notorio. Algunos
>.NES humanos son especficos de primates, como la familia Alu;
:rros no estn restringidos a los primates y tambin se encuentran
en marsupiales y monotremas y se describieron como familias MIR
del ingls mammalian-wide interspersed repeat, repeticin disperen mamferos) (cuadro 9-15). Los SINES no codifican ninguna
rrotena y no son autnomos. LINES y SINES comparten secuen
22
18 19 20 2 1 \
13 14 15 16
6 7 8 9 1 0 11 12,
4 5
271
cias en su extremo 3' y se ha demostrado que SINES se desplaza

por el compaero vecino LINES (Kajikawa y Okada, 2002). Me
diante parasitacin de la maquinaria de transposicin del elemento
LINE, SINES puede alcanzar grandes nmeros de copias.
Los SINES de mamferos se originaron a partir de copias de
tRNA (en muchos casos) o RNA SRP(7SL), como sucede en la re
peticin Alu (Ullu y Tschudi, 1984) y la rep etici n B1 del ratn
(vase seccin 12.4.1). A los genes que codifican tRNA y RNA
SRP los transcribe la polimerasa III de RNA y son poco comunes
porque poseen prom otores internos (fig. 10-4). Sin embargo, el pro
motor de polimerasa III interno llevado por las repeticiones Alu no
es suficiente para la transcripcin activa in vivo y se requieren se
cuencias de flanqueo apropiadas para su activacin. Por consiguien
te, despus de la integracin se torna inactiva una copia Alu recin
transpuesta, a menos que se coloque de manera fortuita en una re
gin que permite que sea activo el promotor.
La repeticin Alu es la secuencia ms abundante en el genoma
humano y ocurre en promedio ms de una vez cada 3 kb (Interna
tional Human Genome Sequencing Consortium, 2001; Li y cois.,
2001). Existe una serie de subfamilias Alu de diferentes edades evo
lutivas con slo alrededor de 5 000 copias que se integraron en el
genoma en los ltimos cinco millones de aos desde la divergencia
9.5.3 Las repeticiones Alu ocurren ms de una vez

cada 3 kb en el genoma humano y pueden
someterse a seleccin positiva
DNA NO CODIFICANTE REPETIDO DISPERSO
23
7 2 4 2 5 2 6 27
E xo nes
RB1
U 16
Repeticiones
5'
Alu
t -
Repeticiones
U N E -1
5' -------------------1----------- {---------------------------1 ------------ ---------------------------- --------------3'

3' -------- 1----H------ -------1 -------------- I I-------------------------------------------- 1 ---------------------------5'
5'
Repeticiones
(A W (T)n
'
3
t---------------3'
-|---------I
|
/\
III II
Js
II I I I III,
|
\
III I
1 1
11
IIII I1 I 1
11
kb -|------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1------ 1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
i
18 0
Fig. 9-19. Localizaciones de las repeticiones Alu, LINE-1 y (A)/(T) dentro del gen de susceptibilidad al retinoblastoma humano, RB1.
El intrn 17 de 72 kb contiene un gen receptor acoplado a protena G, U16, que se transcribe de modo activo en la direccin opuesta al gen R B I. La
lnea superior (5' - 3 ') de cada par muestra los elementos de repeticin orientados en la direccin en sentido RB1\ la lnea inferior (3' - * 5) los muestra
en la orientacin antisentido. Hay 46 repeticiones Alu y 17 elementos UNE-1 (algunos agrupados de cerca se muestran con lneas divergentes), todos
localizados dentro de intrones. Slo dos de los elementos LINE-1 se aproximan a la longitud completa de 6.1 kb. Las secuencias (A)/(T) (n = 12 o
mayor) indicadas slo son las que se hallan fuera de las repeticiones dispersas. No se encontraron ejemplos de (C y (G ) para n = 12 o mayores.
Redibujado a partir de Toguchida y colaboradores (1993), Genomics 17, 535-543, con autorizacin de Elsevier.
272
CAPTULO NUEVE
de los seres humanos y los monos africanos (vase Batzer y Deininger, 2002). La repeticin Alu de longitud completa tiene alrededor
de 280 pb de largo y consiste en dos repeticiones tndem, cada una
de unos 120 pb de longitud seguida de una secuencia corta que es
abundante en residuos A en una cadena y residuos T en la cadena
complementaria. Sin embargo, existe asimetra entre las repeticio
nes tndem: una repeticin contiene una secuencia interna de 32
pb que falta en la otra (fig. 9-18B). Son comunes asimismo monmeros, que slo contienen una de las dos repeticiones tndem y
varias versiones truncadas de dmeros y monmeros, que propor
cionan un promedio de extensin del genoma de 230 pares de
bases.
Las repeticiones Alu poseen un contenido relativamente alto de
GC, aunque estn esparcidas en especial en la totalidad de las re
giones eucromticas del genoma, y se localizan de preferencia en las
bandas cromosmicas R abundantes en GC y asimismo en genes, en
contraste notable con la localizacin preferencia! de LINES en
DNA rico en AT (Korenberg y Rykowski, 1988). No obstante,
cuando se ubican dentro de genes estn, al igual que los elemen
tos LINE-1, confinadas en intrones y regiones no traducidas (fig.
9-19). A pesar de la tendencia a localizarse en DNA abundante en
GC, las repeticiones Alu d e transposicin reciente muestran una pre
ferencia por DNA abundante en AT semejante a las de LINE, pe
ro las Alu progresivamente ms viejas muestran una predisposicin

cada vez ms potente hacia DNA abundante en GC (International
Human Genome Sequencing Consortium, 2001).
La predisposicin en la distribucin total de Alu a regiones ri
cas en GC (y, por consiguiente, con abundancia de genes) puede
resultar de una presin de seleccin potente. Ello sugiere que las re
peticiones Alu no son tan slo parsitos del genoma sino que llevan
a cabo una contribucin til a las clulas que las contienen. Se sa
be que algunas secuencias Alu se transcriben de forma activa y es
posible que se incorporaran para una funcin til. El gen BCYRN1
que codifica un RNA citoplsmico pequeo neural, BC200, surgi
de un monmero Alu y es una de las pocas secuencias Alu que son
activas desde el punto de vista transcripcional bajo circunstancias
normales (Martignetti y Brosius, 1993). En muchas especies, los SINE se transcriben en condiciones de estrs y los RNA resultantes
enlazan una cinasa de protena especfica (PKR) y bloquean su ca
pacidad para inhibir la traduccin de protenas. Los RNA SINES
promoveran en consecuencia la traduccin de protenas bajo es
trs. Tal vez una funcin general de los SINES (Schmid, 1998) es
regular la traduccin de protenas (pueden transcribirse con rapidez
RNA SINES en grandes cantidades de miles de elementos y fun
cionar sin traduccin protenica).
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CAPTULO
DIEZ
Expresin gnica humana

Recuadro 10-1 Restriccin espacial y temporal de la expresin gnica en clulas de mamferos 276
Recuadro 10-2 Clases de elementos de secuencia de accin cis que participan en la regulacin
276
10.1
CAPTULO DIEZ
EXPRESIN GNICA HUMANA
G eneralidades de la expresin
gnica en clulas hum anas
Aunque los mecanismos de control que regulan la expresin de ge

nes humanos pueden ser ms complejos que los de eucariotas infe
riores, se aplican muchos de los mismos principios bsicos. Los
mamferos son organismos multicelulares en particular complejos y
por esa razn quiz no sorprenda que algunos de los mecanismos
que controlan la expresin genica de mamferos no se empleen en
bacterias o algunos otros eucariotas. La expresin se restringe de
manera espacial y temporal (recuadro 10-1). Aunque simplista, es
conveniente considerar tres niveles amplios a los que la regulacin
genica puede operar:
regulacin tra nscripcional d e la expresin gnica . El principal
control de la regulacin gnica en eucariotas ocurre a nivel del
inicio de la transcripcin, a travs del promotor central de un
gen, y a nivel de la incorporacin y el procesamiento de la po
limerasa de RNA importante. El enlace de factores de trans
cripcin al promotor inicia la expresin genica. Los niveles
basales de transcripcin pueden modularse por el enlace de fac
tores protenicos a otras regiones reguladoras en secuencias de
flanqueo o intrnicas cercanas;
regulacin postran scripcion a l d e la expresin gn ica . Abarca

mecanismos que operan a nivel del procesamiento de RNA, el
transporte de mRNA, la traduccin, la estabilidad del mRNA,
el procesamiento de protenas, los blancos protenicos, la esta
bilidad de protenas, etc. A nivel del procesamiento de RNA,
diferentes mecanismos como el empalme de RNA (que en rea
lidad es un mecanismo cotranscripcional) permiten que un gen
genere una diversidad de productos gnicos distintos (isoformas). La regulacin de la traduccin suele incluir el reconoci
miento de secuencias reguladoras en regiones no traducidas
por factores protenicos de accin trans;
m ecanismos epigenticos y control d e largo alcance d e la expresin
gnica. Los factores genticos dependen de cambios en la secuen
cia del DNA. Las modificaciones adicionales que son hereditarias
(de la clula a la clula hija o del padre al nio) pero que no depen
den de cambios en la secuencia d el genom a se describen como epigenticas. La mediacin del DNA es uno de los muy pocos
mecanismos epigenticos que se sabe operan en clulas de mam
feros, en las que desempean una funcin muy importante en la
regulacin gnica (Bird, 2002). Adems de actuar como un m
todo general para conservar la represin de la transcripcin, par
ticipa de manera crucial en mecanismos que operan en algunos
Recuadro 10-1. Restriccin espacial y temporal de la expresin gnica en clulas de mamferos

RESTRICCIN ESPACIAL DE LA EXPRESIN GNICA
Es necesario que los genes cuidadores se expresen esencialmente en to
dos los tipos de clulas nucleadas porque codifican un producto funda
mental indispensable para satisfacer una funcin general en todas las
clulas, por ejemplo, sntesis de protenas, produccin de energa, etc.
Sin embargo, numerosos genes eucariotas muestran patrones de expre
sin gnica especfica de tejido mucho ms restringidos. La restriccin
espacial de la expresin gnica puede ocurrir a diferentes niveles:
patrn mltiple de rgano/tejido. En algunos casos un gen puede
desempear un tipo de funcin similar en diferentes sistemas orgni
cos. Es posible que en la regulacin de genes blanco en varios siste
mas orgnicos diferentes participe una diversidad de genes que
tienen una funcin crucial en el desarrollo temprano, por ejemplo, el
gen hedgehog snico se expresa en diversas partes del sistema ner
vioso, en las extremidades en desarrollo y en alguna otra parte. En
otros casos un gen puede codificar distintas variantes (isoformas) en
diferentes tejidos mediante promotores especficos de tejido o empal
me alternativo especfico de tejido. En algunos casos stos pueden
tener diferentes funciones (seccin 10.3.2);
tejido, linaje celular o tipo de clula especficos. Algunos genes
tienen una funcin apropiada para un tipo de clula o linaje celular
particular, como el gen de globina beta que se expresa en clulas eritroides;
clulas individuales. Algunos genes especializados elaboran distintos
productos en clulas individuales que pertenecen al mismo tipo celular.
Por ejemplo, los diferentes linfocitos B en una persona expresan distin
tas molculas de anticuerpo (especficas de clulas), las diversas clu
las T producen distintos receptores de clula T y neuronas olfatorias
individuales elaboran diferentes receptores olfatorios. Nota: tambin es
posible que ocurra variacin en la expresin entre distintas clulas del
mismo tipo en un tejido como resultado de expresin monoallica alea
toria (como en la inactivacin del cromosoma X; seccin 10.5.6);
distribucin intracelular. Las protenas de diferentes genes se trans

portan a distintos sitios intracelulares (o extracelulares). En algunos ca
sos diferentes isoformas de la misma protena pueden enviarse a
distintas localizaciones intracelulares (seccin 10.3.2). Adems se re
quieren mecanismos de control gnico a fin de enviar mRNA para algu
nos genes a diferentes localizaciones intracelulares (seccin 10.2.6).
RESTRICCIN TEMPORAL DE LA EXPRESIN GNICA
Etapa del ciclo celular. Adems del silenciam iento gnico general
a gran escala conform e los crom osom as se condensan en la m itosis, algunos genes slo se expresan en momentos especficos del
ciclo celular. Por ejemplo, m uchos genes de histona slo se expre
san en la fase S (sntesis de DNA) y la expresin de varios regula
dores del ciclo celular est programada para ocurrir en etapas
especficas del mismo.
Etapas del desarrollo. En las etapas muy tempranas del desarrollo
no se observa transcripcin; en lugar de ello las clulas disponen de
RNA sintetizado con anterioridad. Ms adelante se expresan en forma
pasajera ciertos genes en etapas especficas. Algunas familias gnicas contienen miembros que se expresan en diferentes etapas del de
sarrollo, por ejemplo, los genes de globina (figs. 10 -22 ,10 -23).
Etapa de diferenciacin. Conforme las clulas se diferencian, sus
genomas se modifican y producen patrones de expresin gnica alte
rados. En algunas clulas diferenciadas terminalmente no ocurre
transcripcin. Hasta el nacimiento de Dolly, la oveja clonada, sola
pensarse que las modificaciones del genoma que dan lugar a la pro
gresin a una clula somtica adulta nucleada eran irreversibles (sec
cin 20.2.2);
Expresin inducible. Algunos genes se activan en respuesta a indi
cios ambientales o sealamiento extracelular de otras clulas (sec
cin 10.2.5). Esta expresin gnica se revierte con facilidad si el
factor inductor se suprime.
10.2
CONTROL DE LA EXPRESIN GENICA POR ENLACE DE FACTORES PROTENICOS.
genes para asegurar que en condiciones normales slo se exprese

uno de los dos alelos de la herencia paterna (expresin monoallica), inclusive aunque la secuencia nucletida del alelo no expre
sado sea idntica a la del alelo expresado. El resultado de los
mecanismos epigenticos suelen ser la perpetuacin de la altera
cin de la conformacin de la cromadna en distancias largas.
El cuadro 10-1 presenta una revisin general de los diferentes me
canismos que participan en la regulacin de la expresin de genes
humanos.
10.2
277
tas ltimas pueden ser secuencias de DNA que se encuentran en la

cercana del gen o aun dentro del mismo, o secuencias transcritas
del RNA precursor o mRNA. Los factores protenicos que partici
pan en la regulacin de la expresin gnica y que son codificados
por genes que se localizan a distancia deben migrar a su sitio de ac
cin y en consecuencia se denominan factores de accin trans. En
contraste, las secuencias reguladoras a las que se enlazan suelen ser
de accin cis porque se encuentran en la misma molcula de DNA
o RNA que el gen o transcrito de RNA que se regula.
Control mediante enlace de DNA y protena
Control de la expresin gnica

por e n la c e de facto res protenicos
de accin trans a secuencias
reguladoras de accin cis en
DNA y RNA
Gran parte del control de la expresin gnica (sea que ocurra a ni

vel del inicio de la transcripcin , el procesamiento de RNA, la tra
duccin, el transporte de RNA, etc.) comprende el enlace de
factores protenicos a secuencias reguladoras de cido nucleico. Es
En clulas eucariotas, un punto de control de la expresin gnica

mayor se encuentra a nivel del inicio de la transcripcin. Puesto que
la cromatina es una estructura muy organizada y densamente em
pacada que no permite con facilidad el acceso a polimerasas de
RNA, se requieren enzimas de rem odelacin d e la crom atina para
alterar su doblez y estructura bsica con objeto de convertirla en
una estructura ms abierta y activa que permita que la transcripcin
se realice. Se sabe que tres tipos de polimerasas de RNA diferentes
transcriben distintas clases de genes (vase cuadro 1-4) y en cada ca
so se trata de enzimas grandes, consistentes en 8 a 14 subunidades.
Cuadro 10-1. Generalidades de la regulacin de la expresin gnica en clulas humanas.

Mecanismo de expresin selectiva
Ejemplos
Transcripcional
Modificacin de historia, remodelacin de cromatina
Vase seccin 10.2.1
Enlace de factores de transcripcin especficos de tejido a elementos

de accin cis de un gen aislado
Vase cuadro 10-3
Enlace directo de hormonas, factores de crecimiento o intermedios a

elementos de respuesta en elementos de transcripcin inducibles
Elementos de respuesta cAMR elementos de respuesta de hormonas

esferoides, etc. (vase cuadro 10-4; fig. 10-10)
Uso de promotores alternativos en un gen nico
Vase figura 10-14 para el gen de distrofina y figura 10-20 para el gen
D nm tl
Postranscripcional
Empalme alternativo
Seccin 10.3.2; figuras 10-15 y 10-16
Poliadenilacin alternativa
Seccin 10.3.2; figura 10-15E
Edicin de RNA especfico de tejido
Seccin 10.3.3.; figura 10-17
Mecanismos de control traduccional
Seccin 10.2.6; figura 10-13; figura 9-6
Mecanismos epigenticos/control de largo alcance por la estructura

de la cromatina
Exclusin alllca
Reordenamientos del DNA en linfocitos B y T que producen inmunoglobulinas especficas de clula y receptores de clula T (seccin 10.6.1)
Inactivacin por el producto gnlco XIST de muchos genes en el nico
cromosoma X en el que se expresa en clulas femeninas (seccin
10.5.6)
Exclusin allica aleatoria por mecanismos desconocidos, p. e j IL-2,
IL-4, PAX5, etc. (seccin 10.5.3; recuadro 10-4)
Impronta de ciertos genes (secciones 10.5.4,10.5.5)
Control de largo alcance por la estructura de la cromatina
Competencia por intensificadores o silenciadores (p. ej., la expresin

de globina; vase secciones 10.5.2 y 10.5.5)
Efectos de la posicin (seccin 10.5.1)
Sealamiento de largo alcance dependiente de la posicin celular
Seccin 10.4.1
278
CAPTULO DIEZ
Las polimerasas de RNA transcriben genes despus del enlace

de protenas {factores d e transcripcin) a secuencias reguladoras de
DNA especficas dentro del gen o en su cercana. Los factores de
transcripcin pueden ser de dos clases:
versible de una conformacin condensada a una ms accesible me

diante la modificacin de la histona y la remodelacin cromatni
ca.
se requieren factores d e transcripcin general para la transcripcin

de la mayor parte de los promotores para una clase especfica de
polimerasa de RNA (es decir, los factores de transcripcin gene
ral son sobre todo nicos para una clase de polimerasa, aunque
las tres clases de polimerasas comparten cuando menos un fac
tor, la p roten a d e en lace d e la caja TATA). Por ejemplo, en los
genes codificadores de polippddos una polimerasa particular,
la polimerasa de RNA II, acta en conjunto con factores de
transcripcin general relacionados a fin de producir un nivel ba
sai de transcripcin;
los factores d e transcripcin especializados pueden modular nive
les de expresin basai e incluyen fa cto res d e transcripcin espe
cficos d e tejid o y factores relacionados con la transcripcin de
juegos de genes especficos. Las protenas que se enlazan a se
cuencias de DNA especficas y estimulan la transcripcin se co
nocen como activadoras (o transactivadoras). Las que tienen
un efecto antagnico, de silenciamiento de la actividad transcripcional, se denominan represoras.
Adems de los factores de transcripcin que pueden activar o repri
mir la expresin gnica tras el enlace de DNA, una variedad amplia
de protenas reguladoras afecta la expresin genica pero no se enlaza
a l DNA en s mismo, sino ms bien a los factores de transcripcin. Es
tas protenas se conocen como coactivadoras o correpresoras (segn
se unan a activadores o represores de la transcripcin; vase Lemon
yTjian, 2000 ).
Modificacin de la histona
Control mediante enlace de RNA y protena

Aparte de los factores de transcripcin, para regular la expresin g
nica se utilizan protenas de enlace de RNA. Los ejemplos mejor es
tudiados comprenden el enlace a secuencias reguladoras en
secuencias de mRNA no traducidas, que permiten controlar la tra
duccin de la expresin gnica. Asimismo cabe esperar que en el
control de la expresin gnica a nivel del procesamiento diferencial
del RNA participen interacciones especficas del enlace RNA y pro
teina, como en el caso del enlace de protenas SR y HnRNP a premRNA a fin de modular la eleccin de exones en el empalme (corte
y unin). Los ltimos mecanismos se comentan por separado en la
seccin 10.3 con objeto de ilustrar la enorme complejidad de los
mecanismos de expresin que suelen emplearse para descodificar
genes nicos y la importancia de las grandes cantidades de isoformas que pueden producirse como resultado.
10.2.1 La modificacin de la histona y la remodelacin

de la cromatina facilitan el acceso a la
cromatina mediante factores de enlace de DNA
El DNA sin actividad transcripcional est organizado en una estruc
tura cromatnica condensada que muestra una vinculacin estrecha
entre las histonas centrales y el DNA. El empacamiento denso de
los nucleosomas puede denegar el acceso a una diversidad de dis
tintas protenas necesarias para interactuar con el DNA, no slo
las protenas que participan en la expresin gnica, sino tambin
factores necesarios para la replicacin del DNA, su reparacin, etc.
La estructura local de la cromatina puede alterarse de manera re
Las histonas estn organizadas en nucleosomas de forma tal que sus

colas (en especial los extremos terminal N) salen del octmero de
histona. Las colas terminal N expuestas de las cuatro histonas cen
trales tienen una secuencia muy conservada y desempean funcio
nes cruciales en la regulacin de la estructura de la cromatina. Se
sabe bien que las histonas H3 y H4, en particular, contienen cier
tos aminocidos que estn sujetos a modificacin (vase Goll y Bestor, 2002 y fig. 10-1). Se piensa que el patrn total resultante de las
modificaciones del residuo de histona en regiones especficas de la
cromatina forma un cdigo de histona que rige un resultado final
biolgico particular (vase Berger, 2002; Turner, 2002).
La acetilacin de la histona es una de las modificaciones de la
histona (que tambin abarcan metilacin, fosforilacin y ubiquitinilacin) mejor investigadas. Varias acetiltransferasas d e histona
(HAT) catalizan la adicin de grupos acetilo (CH3CO) al grupo
amino eNH3+ en las cadenas laterales de hasta 13 de los 30 resi
duos de lisina en las colas terminales N expuestas de un octmero
de histona. Las HAT funcionan como coactivadores de la transcrip
cin. Es posible que esto se deba en parte a la prdida de cargas po
sitivas cuando las cadenas laterales de lisina cargadas se modifican,
lo que produce una afinidad reducida entre histonas y DNA. Las
histonas modificadas tambin son blancos para maquinarias de re
modelacin de la cromatina (vase ms adelante). El efecto neto
consiste en facilitar el acceso de la polimerasa de RNA y los facto
res de transcripcin a la regin promotora. Las desacetilasas d e his
tona {HDAC) tienen el efecto opuesto, eliminar grupos acetilo y
promover la represin transcripcional. Se piensa que las HDAC se
incorporan como parte de un complejo correpresor en respuesta a la
m etilacin d el DNA (seccin 10.4.3; vase fig. 10-21).
Diferentes clases de metiltransferasas dirigidas a ciertos residuos
de arginina y lisina en las histonas efectan la metilacin de la his
tona. Aunque la metilacin de la arginina de la histona participa en
la activacin de la transcripcin, la metilacin de la lisina de la his
tona puede ser una seal para la represin transcripcional, como en
la metilacin de H3K9 (histona 3, lisina en la posicin 9) que pue
de inducirse despus de la desacetilacin del mismo residuo (sec
cin 10.4.2; vase fig. 10-21).
Remodelacin de la cromatina
Los complejos de remodelacin de la cromatina dependientes de
ATP recurren a la hidrlisis del ATP para cambiar en forma tem
poral la estructura de los nucleosomas (vase Narlikar y cois., 2002).
Es posible que la remodelacin de la cromatina facilite el acceso de
varias protenas al DNA. Aun despus que el complejo de remode
lacin del DNA se disocia, los nucleosomas pueden permanecer
cierto tiempo en un estado remodelado en el que los contactos en
tre DNA e histona se tornan laxos. En algunos casos la remodelacin
incluye la alteracin de la posicin de los nucleosomas, lo que deter
mina que se deslicen a lo largo del DNA. Como resultado del desli
zamiento del nucleosoma, secuencias antes envueltas alrededor de
octmeros de histona se vuelven ms accesibles. Adems algunos
complejos de remodelacin pueden restablecer el estado de inactivi
dad transcripcional.
10.2
279
(Me)
A [r]
10
G |K i A
14
P [R j K
17 18
HISTONA
H3
23
HISTONA
H4
Clave ( a c ) A c e tila c i n
(M
M ee)) M e tila c i n
( p)
F o s fo rilac i n
Fig. 10-1. Modificaciones de las histonas H3 y H4.

Se muestran las modificaciones de residuos de la terminal N de las histonas 3 y 4 (que son parte de las colas expuestas cuando se encuentran en
el octmero de histona). Obsrvese que H3K9 (el residuo lisina en la posicin nmero 9 de la histona H3) puede acetilarse y tambin metilarse. La
acetilacion se acompaa de cromatina con actividad transcripcional pero si la regin de la cromatina se metila en CpG, las protenas que se enlazan a
CpG pueden incorporar desacetilasas de histonas que conducirn a la eliminacin de residuos acetilo y el residuo H3K9 se metila despus mediante
una metiltransferasa de histona enlazada a las protenas de unin CpG. El residuo H3K9 metilado es luego un blanco para enlace por proteina que induce
la condensacin de la cromatina (vase fig. 10-2 1 ).
Los complejos de remodelacin de la cromatina se encuentran

en diferentes variedades y cada uno contiene mltiples subunidades (por lo general >10) . Adems de dominios de ATP-asa, portan
otros dominios que interactan con histonas modificadas, lo que
perm ite la accin ordenada entre la m odificacin de la histona y la re
m odelacin d e la cromatina. Comprenden los bromodominios de la
familia SWI/SNF, que se sabe interactan con residuos de lisina
acetilados en histonas, y los cromodominios de la familia Mi-2 que
interactan con lisinas metiladas (vase Berger, 2002; Narlikar y
cois., 2002 ).
10.2.2 La transcripcin mediante polimerasas de RNAI

y III requiere tactores de transcripcin ubicuos
Las polimerasas de RNA I y III en clulas eucariotas estn dedica
das a transcribir genes para formar molculas de RNA (rRNA, tRNA, etc.) que colaboran en la expresin de los genes codificadores
de polipptidos. Los genes transcritos son genes cuidadores ya que
en esencia todas las clulas requieren rRNA y tRNA para contribuir
en la sntesis de protenas. Como resultado, se necesitan factores de
transcripcin ubicuos para asistir a las polimerasas de RNA I y III.
Transcripcin mediante polimerasa de RNA I

La polimerasa de RNA I est limitada al nuclolo y dedicada a la
transcripcin de los genes de rRNA 18S, 5.8S y 28S. Los ltimos
se encuentran organizados de manera consecutiva en una u n idad
d e transcripcin policistrn ica de 13 kb (vase fig. 10-2). Una uni

dad compuesta por la unidad de transcripcin de 13 kb y un espa
cia d or no transcrito de 27 kb adyacente se repiten en forma
tndem cerca de 30 a 40 veces en los brazos cortos de cada uno de
los cinco cromosomas acrocntricos humanos, en las regiones nucleolares organizadoras. Los cinco grupos resultantes de genes rR
NA, cada uno de los cuales tiene alrededor de 1.5 Mb de largo, se
denominan DNA ribosmico o rDNA.
La transcripcin de los genes rRNA 28S, 5.8S y 18S inicia tras
el enlace de los dos factores de transcripcin a un elemento promo
tor central en el sitio de inicio de la transcripcin y a un elem ento
d e con trol corrien te arriba localizado ms de 100 nuclotidos co
rriente arriba. Uno de los factores de transcripcin, U B F (del ingls
upstream b in din g fa ctor, factor de enlace corriente arriba) es un
homodmero y sus subunidades idnticas pueden enlazarse prime
ro al elemento promotor central y el elemento de control corriente
arriba, unindolos entre s de manera que el segundo factor, SL1
(factor selectivo 1, que en el ratn se conoce como TIF-1B, vase fig.
10-3), pueda enlazarlos. Los factores de transcripcin enlazados in
corporan despus polimerasa de RNA I para formar un complejo
de inicio.
El transcrito primario expresado a partir de la unidad de trans
cripcin nica de 13 kb es un rRNA precursor 45S que experimen
ta una variedad de reacciones de corte y modificaciones especficas
de base (efectuadas por un gran nmero de tipos de RNA nucleolares peq ue os diferentes,) a fin de generar las especies maduras de
rRNA 28S, 5.8S y 18S (vase fig. 10-2). Por consiguiente estos ge-
280
CAPTULO DIEZ
Unidad de transcripcin rDNA

1 3 k b -------
ETS
ITS1 IT S 2
5 .8 S
18S
Espaciador intergnico
H l '------- - 2 7 k b -------------\
28S
DNA
Transcrito
primario
AJ.
*
0 I
45S
*i
Y? - Q
41S
C
20S [
D
3 32S
-
5 .8 S
18S I
28S
Fig. 10-2. Las principales especies de rRNA humano se sintetizan mediante el corte de una unidad de transcripcin comn de 13 kb que es parte
de una unidad de 40 kb de repeticin tndem.
Las flechas pequeas sealadas por las letras A a D indican las posiciones del corte de precursores de RNA por endonucleasa. El corte del precursor 41S
en B genera dos productos: 20S + 32S. Tras el corte del precursor 32S en D, y la excisin del rRNa 5.8S pequeo, se realiza el enlace de hidrgeno entre
el rRNA 5.8S y un segmento central complementario del rRNA 28S. Los cerca de 6 kb de secuencias de RNA que se originan a partir de las unidades
espaciadoras transcritas internas y externas (ETS, ITS1 e ITS2) se degradan en el ncleo. S es el coeficiente de sedimentacin, una medida de tamao.
nes difieren de la inmensa mayora de los genes nucleares, que se

transcriben en forma individual. En lugar de ello, la transcripcin
de rRNA se semeja a la transcripcin de mtDNA (seccin 9.1.2;
fig. 9.2): ambos dan por resultado transcritos multignicos que
proporcionan productos relacionados funcionalmente. Sin embar
go, este uso poco habitual de los transcritos polignicos primarios
no es diferente en principio de la forma en que a veces se corta un
producto d e traduccin primario nico para generar dos o ms polipptidos relacionados en trminos funcionales (vase el ejemplo de
la insulina humana en la fig. 1-23).
Transcripcin mediante polimerasa de RNA III

La polimerasa de RNA III tambin participa en la transcripcin de
una diversidad de genes cuidadores, que codifican varias molculas
de RNA pequeas estables, como las de rRNA 5S, tRNA, RNA
7SL y algunas de las molculas de snRNA necesarias para el empal
me de RNA. Estos genes se distinguen por promotores situados
dentro de la secuencia de codificacin del gen, en lugar de corrien
te arriba de la misma. Se encuentra un promotor bipartido en ge
nes tRNA, constituido por dos secuencias bien conservadas, las
cajas A y B, pero el promotor del gen rRNA 5S consiste en un ele
mento aislado, la caja C. Se piensa que en cada caso la transcrip
cin mediante polimerasa de RNA III prosigue por el enlace de
factores de transcripcin ubicuos a los elementos promotores, se
guido del enlace subsecuente de otros factores y por ltimo de la
incorporacin de la polimerasa (fig. 10-4).
10.2.3 La transcripcin mediante polimerasa de

RNA II requiere juegos completos de secuencias
reguladoras de accin cis y factores de
transcripcin especficos de tejido
La polimerasa de RNA II tiene a su cargo la transcripcin de todos
los genes codificadores de polipptidos y tambin ciertas especies del
gen de snRNA. La polimerasa de RNA II (como las polimerasas de
RNA I y III) depende de factores de transcripcin general auxiliares
y se conocen varios que pueden tener una estructura compleja. Por
ejemplo, TFIID consiste en la protena de enlace a la caja TATA,
TBP (que tambin se relaciona con las polimerasas de RNA I y III),
adems de varios factores asociados a TBP, o protenas TAF (vase
tambin cuadro 10-2). El complejo de polimerasa y factores de trans
cripcin generales se conoce como aparato de transcripcin basal y
es todo lo necesario para iniciar la transcripcin. Los genes se expre
san de modo constitutivo a un ndice mnimo determinado por el
prom otor central (vase ms adelante) a menos que elementos regula
dores positivos o negativos adicionales (que pueden localizarse a cier
ta distancia lejana o ser componentes intrnsecos de la regin promotora
en s misma) aumenten o enciendan el ritmo de transcripcin.
Algunos de los genes que codifican polipptidos son genes cuida
dores, pero a diferencia de los genes transcritos por las polimerasas de
RNA I y III, un gran porcentaje de genes transcritos por la polimera
sa de RNA II muestra patrones de expresin restringidos a tejido o es
pecficos de tejido. Como el DNA en diferentes clulas nucleadas de
un individuo es en esencia idntico, la identidad de una clula, sea un
10.2
E lem en to de
control corriente
arriba (E C C A )
Elem en to
prom otor
central (E P C )
281
A)
G en tR N A
-100
+1
A caja
B caja
+7
G en R N A 5S
Enlace del factor de enlace

corriente arriba (FEC A ) y
factor 1 de selectividad (SL1)
+1
_________ C caja
B)
EPC
Incorporacin de polimerasa
de R N A I
Polim erasa de R N A I
Fig. 10-3. Inicio de la transcripcin por polimerasa de RNA I.

Un posible modelo considera el enlace inicial de las dos subunldades Idnti
cas del factor de enlace corriente arriba con el elemento de control corriente
arriba y el elemento promotor central. Ello fuerza el acercamiento de estas
dos secuencias y posibilita su enlace subsecuente por el factor de selectivi
dad 1 (SL1; cuatro subunidades). La estructura estabilizada permite el en
lace de otros factores (no se muestra) y despus de polimerasa de RNA I.
hepatocito o un linfocito T, por ejemplo, se define en muy gran par

te por las protenas que la clula elabora. Por tanto, adems de los fac
tores de transcripcin general ubicuos, los factores de transcripcin
especficos de tejido o restringidos a tejido regulan la expresin de
muchos genes codificadores de polipptidos mediante el reconoci
miento y la unin de elementos de secuencia de accin cis especficos.
El gran tamao de los genomas nucleares de mamferos y la nece
sidad general de sistemas de control ms complicados impuesta por la
presencia de nmeros muy grandes de genes que interactan determi
nan que los elementos de control en clulas eucariotas sean muy elabo
rados. Con frecuencia la regulacin de la expresin de genes humanos
individuales est controlada por varios juegos de elementos regulado
res de accin cis. Si bien los elementos reguladores individuales pueden
estar compuestos por mltiples elementos de secuencia corta (por lo
general de 4 a 8 nuclotidos de largo) distribuidos en unos pocos cien
tos de pares de bases, las diferentes clases de elemento regulador que
modulan la expresin de un gen aislado pueden localizarse a distancias
considerables. Es posible reconocer una diversidad de distintos tipos de
elementos de accin cis, inclusive promotores, intensificadores, silen
ciadores, elementos de enlace (aisladores) y elementos de respuesta
(vase recuadro 10-2 y figs. 10-5 y 10-6).
T F IIIB
P o lim erasa
d e R N A III
Fig. 10-4. Los genes de tRNA y rRNA 5S tienen promotores localiza

dos dentro de la secuencia de codificacin.
A) Posiciones de los elementos promotores en los genes de tRNA y
rRNA 5S. Los elementos promotores A y B en los genes de tRNA se
localizan en las secuencias que especifican el asa D y las asas Ti|)CG
respectivamente (vase estructura del tRNA en la fig. 1-7B). B) Inicio
de la transcripcin de un gen de tRNA. El enlace del factor de trans
cripcin TFIIIC a los elementos promotores permite el enlace subse
cuente del factor TFIIIB trim rico a la secuencia justo corriente arriba
del sitio de inicio de la transcripcin. En respuesta al enlace del factor
TFIIIB, se enlaza polimerasa de RNA III e Inicia la transcripcin. En los
genes rRNA 5S se observa un mecanismo similar pero en este caso se
requiere el enlace de un factor de transcripcin adicional, TFIIIA, a la
caja C y el enlace del factor TFIIIA permite el enlace subsecuente de
TFIIIB seguido por la incorporacin de TFIIIC y polimerasa de RNA III,
como sucede en los genes tRNA.
A menudo secuencias intensificadoras y silenciadoras confieren

la especificidad de tejido y la especificidad de la etapa de desarrollo
de la expresin gnica, y se identifica una diversidad de secuencias de
accin cis que factores de transcripcin especficos de tejido recono
cen de modo especfico. Por ejemplo, con frecuencia la expresin es
pecfica de clulas eritroides es sealada por una de dos secuencias:
TGACTCAG (o su complemento inverso CTGAGTCA; ambas
son reconocidas por el factor de transcripcin especfico eritroide
NF-E2) o la secuencia [A/T]GATA[A/G] (o su complemento in
verso, ambas reconocidas por la serie de factores de transcripcin
GATA. Vase la figura 10-7 para ejemplos y el cuadro 10-3 para
otros elementos especficos de tejido de accin cis).
282
CAPTULO DIEZ | EXPRESIN GNICA HUMANA
Cuadro 10-2. Composicin de la subunidad de la polimerasa de RNA II eucariota y factores de transcripcin general
relacionados.
Factor
Nmero de subunidades
Funciones
Polimerasa II
12
Cataliza la sntesis de RNA
TFIID
12
Reconoce el promotor central y proporciona una estructura central en la que el resto de la maquinaria
transcripcional general puede ensamblarse. Consiste en la protena de unin TATA (PUT) y varios facto
res relacionados con PUT (FAP)
TFIIB
Une PUT, elige el sitio de inicio e incorpora polimerasa II
TFIIA
Estabiliza la unin de TFIIB y PUT
TFIIF
Une polimerasa II y TFIIB
TFIIE
Incorpora TFIIH que contiene una helicasa y una cinasa de protena
TFIIH
Desenrolla DNA en el promotor; fosforila el dominio terminal C de la polimerasa II, lo que origina un
cambio de conformacin. La polimerasa activada se desune de los factores de transcripcin generales y
adquiere nuevas protenas para ayudarla a que se transcriba en distancias largas sin disociarse del DNA
N ota: en la nomenclatura de factores de transcripcin generales se utiliza el prefijo comn TF (factor de transcripcin) seguido de un nmero romano
para la polimerasa RNA relacionada.
Adems de promover en forma activa la transcripcin especfi

ca de tejido, algunos elementos silenciadores de accin cis confie
ren especificidad de tejido o de etapa del desarrollo bloqueando la
expresin en todos los tejidos excepto el deseado. Por ejemplo, el ele
mento silenciador restrictivo neural (NRSE) reprime la expresin
de varios genes en todos los tejidos aparte de los neurales (Schoenherr y cois., 1996). Un factor de transcripcin que se enlaza al NR
SE y que se denomina en diversas formas NRSF (factor silenciador
restrictivo neural) o REST (factor silenciador de transcripcin RE1) se expresan de manera ubicua en tejido diferente del neural y en
precursores neuronales durante el desarrollo temprano, pero ms
adelante no se expresa en neuronas ms maduras (posmitticas). Al
parecer NRSF/REST es capaz de incorporar un correpresor, coREST, que se cree que sirve para incorporar la maquinaria molecu
lar que puede inducir el silenciamiento transcripcional a travs de
regiones cromosmicas contenedoras de genes expresados neuronalmente (Lunyak y cois., 2002).
10.2.4 Los factores de transcripcin contienen

elementos estructurales conservados
que permiten el enlace de DNA
Los factores de transcripcin reconocen y enlazan una secuencia
nucletida corta, por lo general como resultado de una complementariedad extensa entre la superficie de la protena y las caractersticas
de superficie de la doble hlice en la regin de enlace. Aunque las
interacciones individuales entre aminocidos y nucletidos son d
biles (casi siempre enlaces de hidrgeno, enlaces inicos e interac
ciones hidrfobas), la regin de enlace de DNA y protena suele
caracterizarse por cerca de 20 de estos contactos, que en conjunto
aseguran que el enlace sea potente y especfico. En factores de
transcripcin humanos y otros eucariotas suele ser posible identi
ficar y localizar dos funciones distintas en diferentes partes de la
protena:
un dominio de activacin, que activa la transcripcin de los

genes blanco una vez que el factor de transcripcin se enlaz a
ellos. Se piensa que los dominios de activacin estimulan la
transcripcin por interaccin con factores de transcripcin basales a fin de ayudar a la formacin del complejo de transcrip
cin en el promotor. Aunque no tan bien estudiados como los
dominios de enlace de DNA, se sabe que algunos contienen en
abundancia residuos de aspartato y glutamato (dominios d e ac
tivacin cidd)\ otros son ricos en prolina o glutamato;
un dominio de enlace de DNA permite el enlace especfico del
factor de transcripcin a sus genes blanco. Se identifican varios
elementos estructurales conservados que muchos diferentes
factores de transcripcin con especificidades muy distintas
comparten, inclusive las secuencias tpicas cremallera de leucina, hlice-asa-hlice, hlice-giro-hlice y dedo de cinc que se
describen ms adelante. Cada una de las secuencias tpicas utiliza
hlices a (o en ocasiones hojas (i; vase fig. 1-24) para enlazar
se al surco mayor del DNA. Es claro que, aunque las secuen
cias tpicas en general proporcionan la base para el enlace de
DNA, el conjunto preciso de elementos secuenciales en el domi
nio de enlace de DNA constituye la base para el reconocimiento
especfico de secuencia necesario. Casi todos los factores de
transcripcin se enlazan a DNA como homodmeros, con la re
gin de enlace de DNA de la protena usualmente distinta de
la regin a cargo de la formacin de dmeros.
Secuencia tpica cremallera de leucina

La cremallera de leucina es una tira helicoidal de aminocidos
abundantes en residuos de leucina (que por lo general se observa
una vez cada siete residuos de aminocidos, es decir, una vez cada
dos giros de la hlice; vase fig. 10 - 8 ), que forma con facilidad un
dmero. Cada unidad monmero consiste en una hlice a antipti
ca (grupos laterales hidrfobos de los aminocidos constituyentes
10.2
283
Recuadro 10-2. C lases de elem entos de secuencia de accin c/s que participan en la regulacin de la
transcripcin de genes codificadores de polipptidos
Los PROMOTORES son combinaciones de elementos de secuencia cor
ta (por lo general, localizados en la regin inmediata corriente arriba del
gen, a menudo dentro de 200 pb del sitio de inicio de la transcripcin),
que sirven para iniciar la transcripcin. Pueden subdividirse en distintos
componentes:
Promotor central, que dirige el complejo basal de transcripcin para
que inicie la transcripcin del gen. En ausencia de elementos regula
dores adicionales permite la expresin constitutiva del gen, pero a va
lores muy bajos (basales). Por lo general los elementos promotores
centrales se localizan muy cerca del sitio de inicio de la transcripcin,
alrededor de las posiciones de nucletidos -4 5 + 4 0 (vase Butler y
Kadonaga, 2002). Como se ilustra en la figura 10-5, incluyen: la caja
TATA que se localiza en la posicin cerca de -2 5 , rodeada por se
cuencias abundantes en GC y reconocidas por la subunidad de proteina de enlace TATA de TFIID; la secuencia BRE que se encuentra
justo corriente arriba del elemento TATA y alrededor de -3 5 y que es
reconocida por el elemento TFIIB; la secuencia Inr (iniciadora) loca
lizada en el sitio de inicio de la transcripcin y enlazada por TFIID; el
elemento promotor corriente abajo o EPCA, ubicado alrededor de la
posicin + 3 0 en relacin con la transcripcin y reconocido por TFIID.
Regin promotora prxima! la secuencia que se ubica justo corrien
te arriba del promotor centra! por lo general de -5 0 a -2 0 0 pb (po
dra decirse que los elementos promotores que se encuentran ms
corriente arriba se mapean a la regin promotora distal). Casi siempre
se localizan elementos promotores no centrales adicionales en la
regin promotora proxmal (aunque pueden encontrarse tambin en
la regin promotora central). Incluyen: cajas GC (llamadas asimismo
cajas Sp1, la secuencia consenso es GGGCGG que suele encontrar
se en mltiples copias dentro de 100 pb del sitio de inicio de la trans
cripcin y est enlazada por el factor de transcripcin Sp1 ubicuo);
cajas CCAAT tpicamente localizadas en la posicin -7 5 . Las cajas
CCAAT son reconocidas por CTF (factor de transcripcin de enlace de
CCAAT, que tambin se conoce como NF-1, por factor nuclear I) y por
CBF (factor de enlace de la caja CCAAT, que tambin se conoce co
mo NF-Y, por factor nuclear Y). Obsrvese que las cajas CCAAT y GC
sirven para m odular la transcripcin basal del promotor central y ope
ran com o secuencias intensificadoras (vase seccin siguiente), en
tanto que los elementos silenciadores (vase ms adelante) tambin
pueden ser componentes Integrales del promotor.
ven hacia un lado; grupos polares ven al otro lado, vase fig. 1-24).
Las dos hlices a de los monmeros individuales se unen entre s
una distancia corta para formar un superarrollamiento (vase sec
cin 1. 5 .5) y las interacciones predominantes ocurren entre ami
nocidos hidrfobos opuestos de los monmeros individuales. Ms
all de esta regin las dos hlices a se separan, de manera que el
dmero total es una estructura en forma de Y. Se piensa que el dmero sujeta la doble hlice de un modo muy similar a como una
pinza ase una hilera de ropa tendida (vase fig. 10-9). Adems de
formar homodmeros, las protenas cremallera de leucina en ocasio
nes forman heterodmeros segn la compatibilidad de superficies
hidrfobas de los dos monmeros diferentes. Esta formacin de heterodmero constituye un mecanismo de control de combinaciones
importante en la regulacin gnica.
Los INTENSIFICADORES son elementos de control transcripcional positivo

en particular frecuentes en las clulas de eucariotas complejos como los
mamferos, pero que no existen o estn muy poco representados en euca
riotas simples, por ejemplo, la levadura (vase Martin, 2001). Sirven para
incrementar el nivel basal de transcripcin que se inicia a travs de elemen
tos del promotor centra! A diferencia de este ltimo, sus funciones son in
dependientes tanto de su orientacin como, en cierto grado, de su distancia
desde los genes que regulan. Los elementos Intensificadores pueden loca
lizarse distantes de los genes que regulan (p. e j la regin de control del
locus de la globina (3 fig. 10-23). A menudo los intensificadores se encuen
tran dentro de un tramo de slo 200 o 300 pb, varios elementos reconoci
dos por factores de transcripcin ubicuos ms varios identificados por
factores de transcripcin especficos de tejido (fig. 10-7). Adems algunos
elementos intensificadores pueden ser componentes integrales de promo
tores, como se observa en las cajas CCAAT y GC (vase antes).
Los SILENCIADORES sirven para reducir los niveles de transcripcin.
Aunque menos bien estudiados, suelen distinguirse dos clases: los silen
ciadores clsicos (tambin llamados elementos silenciadores) son ele
mentos independientes de la posicin que dirigen un mecanismo de
represin transcripcional activo; elementos reguladores negativos, que
son elementos dependientes de posicin que dan por resultado un meca
nismo de represin pasivo (vase Ogbourne y Antalis, 19998). Cuando se
estudiaron en genes humanos, se describieron elementos silenciadores
en diversas posiciones: cerca del promotor, a cierta distancia corriente
arriba y asimismo dentro de irrtrones. Sin embargo, la prueba de estas se
cuencias suele basarse en estudios in vitro de enlace de DNA y su impor
tancia in vivo an es incierta.
Los ELEMENTOS DE ENLACE (AISLADORES) son regiones de DNA, con
frecuencia abarcan de 0.5 a 3 kb, que actan para bloquear (o aislar) la
diseminacin de la influencia de agentes que tienen un efecto positivo (in
tensificadores) o negativo en la transcripcin (silenciadores, efectos re
presores similares a heterocromatina). Vase Bell y cois. (2001).
Los ELEMENTOS DE RESPUESTA modulan la transcripcin en respuesta
a estmulos externos especficos. Suelen localizarse a una distancia cor
ta corriente arriba de los elementos promotores (a menudo dentro de 1 kb
del sitio de inicio de la transcripcin). Una diversidad de estos elementos
responde a hormonas especficas (p. ej., cido retinoico u hormonas es
feroides como glucocorticoides) o a segundos mensajeros intracelulares
como AMP cclico (vase seccin 10.2.5 y cuadro 10-4).
Secuencia tpica hlice-asa-hlice

La secuencia tpica hlice-asa-hlice (HAH) se relaciona con la cre
mallera de leucina y debe diferenciarse de la de hlice-giro-hlice
(HGH) que se comenta en la seccin siguiente. Consiste en dos hli
ces ot, una corta y una larga, unidas por un asa flexible. A diferencia
del giro corto de la secuencia tpica HGH, el asa de la HAH es lo bas
tante flexible para permitir el doblamiento hacia atrs de forma que
las dos hlices pueden empacarse una contra la otra, es decir, las dos
hlices se encuentran en planos paralelos entre s, en contraste con las
dos hlices de la secuencia tpica HGH (fig. 10-8). La secuencia tpi
ca HAH media tanto el enlace de DNA como la formacin de un d
mero protenico (vase fig. 10-9) y permite la formacin ocasional de
un heterodmero. Sin embargo, en el ltimo caso se forman heterod
meros entre una protena HAH de longitud completa y una protena
284
CAPTULO DIEZ
-T F IID
CTF
CBF
T F IIB
o
...
B R E TATA C A JA
C C A A T C A JA
L o c a liza c i n
S e c u e n c ia
consenso
75
- 3 7 a - 3 2 -3 1 a - 2 6
GGG
C C A CGCCTATAAA
CCAAT
AAC
GGTT^
C C ...T C C
TT
ATT
Fig. 10-5. Localizaciones conservadas en eucariotas complejos para elementos promotores reguladores enlazados por factores de transcripcin
ubicuos.
N ota: el promotor central de genes individuales no necesita contener todos los elementos. Por ejemplo, muchos promotores carecen de una caja TATA y
utilizan en su lugar el elemento iniciador anlogo en funciones (INR). Las cajas GC tambin suelen encontrarse en promotores pero sus localizaciones
son ms variables (vase fig. 10-6 y fig. 1-13 para algunos ejemplos). BRE, elemento de reconocimiento TFIIB; DPE, elemento promotor corriente abajo.
Adaptado de Butler y Kadonga (2002) Genes Dev. 16, 2583-2592 con autorizacin de Coid Spring Harbor Laboratory Press.
S P1
PD X1
OCT1
USF
PD X1
CREB
PD X1
IEF1
PD X1
PU R 1
TBP
i---------------------- 1-----------------------1----------------------- 1---------------------- 1______________ i______________ i_______________ i

-3 5 0
-3 0 0
-2 5 0
-2 0 0
-1 5 0
-1 0 0
-5 0
+1
Fig. 10-6. El promotor del gen de insulina humano contiene una diversidad de elementos de secuencia reconocidos por factores de transcripcin
ubicuos y especficos de tejido
Las flechas indican el enlace de factores de transcripcin (hilera superior) a elementos de secuencia reguladores (cuadro) que se encuentran corriente
arriba del gen de insulina humana. Los factores de transcripcin ubicuos o que se expresan con amplitud se muestran en negro; los que se indican en
rojo son especficos de clulas beta pancreticas. El factor de transcripcin PDX1 se enlaza a cuatro elementos de secuencia de la forma C(C/T)TAATG
que se encuentran en el promotor de insulina (A1, A2, A3, A5). Abreviaturas; CRE, elemento de respuesta cAMP; NRE, elemento regulador negativo.
Cuadro 10-3. Ejemplos de secuencias de a cci n cis reconocidas por factores de transcripcin restringidos a tejidos y
especficos de tejido.
Secuencia de unin consenso
Factor de transcripcin
(A/T)GATA(A/G)
GATA-1, -2, etctera
Clulas eritroides
TGACTCAG
NF-E2
Clulas eritroides
GTTAATNATTAAC ( = elemento P)
HNF1
Hgado, rin, estmago, intestino, bazo
T(G/A)TTTG(C/T)
HNF-5
Hgado
ATGCAAAT
P0U2F2 (OTF-2)
Clulas linfoides
GCCTGCAGGC
Ker1
Queratinocitos
(C/T)TAAAAATAA(C/T)3
MBF-1
Miocitos
(C/T) TA (A/T) AAATA (A/G )
MEF-2
Miocitos
CAACTGAC
MyoD
Mioblastos + motubos
(C/A)A(C/A)AG
TCF-1
Clulas T
Patrn de expresin
10.2
TCGACCCTCTGGAACCTATCAGGGACCACAGTCAGCCAGGCAAGCACATC
- GATA-1
TGCCCAAGCCAAGGGTGGAGGCATGCAGCTGTGGGGGTCTGTGAAAACAC
4 - caja CACC
GATA-1 -
N F -E 2 -*
TTGAGGGAGCAGATAACTGGGCCAACCATGACTCAGTGCTTCTGGAGGCC
AACAGGACTGCTGAGTCATCCTGTGGGGGTGGAGGTGGGACAAGGGAAAG
- NF-E2
4 - caja CACC
GATA-1 -
GGGTG AATGGTACTGCTGATTACAACCTCTGGTGCTGCCTCCCCCTCCTG
4 - caja CACC
TTTATCTGAGAGGGAAGGCCATGCCCAAAGTGTTCACAGCCAGGCTTCAG
4 - GATA-1
Fig. 10-7. El sitio regulador de la globina alfa HS-40 contiene muchos

elementos de reconocimiento para factores de transcripcin espec
ficos de eritroides.
Obsrvese que el sitio HS-40 parece una regin de control del locus
para el grupo del gen de globina a (seccin 10.5.2).
HAH truncada que carece de la longitud total de una hlice a ne

cesaria para enlazar el DNA. El heterodmero resultante no es capaz
de enlazar apretadamente DNA. Como resultado, se piensa que los
heterodmeros HAH actan como un mecanismo de control que per
mite la inactivacin de protenas reguladoras gnicas especficas.
285
dos), una estructura que a menudo se repite en forma tndem.

Aunque se conocen varias formas distintas, las frecuentes abarcan
el enlace de un ion Zn2+ por dos residuos de cisterna y dos de histidina, o cuatro residuos de cistena, todos ellos conservados. La es
tructura resultante puede consistir luego en una hlice a y una hoja (3
unidas entre s por coordinacin con el ion Zn2+, o de dos hlices a .
En cualquiera de estos casos el principal contacto con el DNA se
efecta por la unin de la hlice a al surco mayor. Por lo general el
dedo de cinc C2H2 (Cis2/His2) comprende alrededor de 23 ami
nocidos con dedos vecinos separados por una tira de alrededor de
siete a ocho aminocidos (fig. 10 - 8 ).
10.2.5 Una diversidad de mecanismos permite

la regulacin transcripcional de la expresin
gnica en respuesta a estmulos externos
La expresin gnica de clulas eucariotas puede modificarse de ma
nera semipermanente conforme las clulas se diferencian o de mo
do temporal en una forma fcilmente reversible en respuesta a
seales extracelulares (expresin gnica inducible). Indicios am
bientales, como las concentraciones extracelulares de ciertos iones y
molculas nutricionales pequeas, el choque por temperatura, etc.,
pueden alterar mucho los patrones de expresin gnica en clulas
expuestas a cambios en estos parmetros. Los animales multicelu
lares complejos tambin presentan requerimientos fundamentales
para que las clulas se comuniquen entre s y son posibles diferen
tes modalidades de sealam iento celu la r (secciones 3.2.1 y 3.2.2).
En algunos casos la alteracin de la expresin gnica ocurre a nivel
de la transcripcin y puede ofrecer ciertas ventajas. En otros la ex
presin gnica se altera modulando la transcripcin.
Aunque la regulacin transcripcional en respuesta al seala
miento celular puede adoptar varias formas distintas, el pu nto f i
nal siem pre es e l mismo: un factor de transcripcin antes inactivo
se activa de modo especfico y luego se une a secuencias regulado
ras especficas localizadas en los promotores de genes blanco, lo
que modula su transcripcin. En la transcripcin regulada por mo
lculas de sealamiento o sus intermediarios estas secuencias re
guladoras suelen denominarse elementos de respuesta (vase
cuadro 10-4).
Secuencia tpica hlice-giro-hlice

La secuencia tpica HGH es un elemento comn que se encuentra
en homeocajas y varios otros factores de transcripcin. Consiste en
dos hlices a cortas separadas por una secuencia corta de amino
cidos que induce un giro, de modo que las dos hlices a se orien
tan de manera diferente (es decir, las dos hlices no estn situadas
en el mismo plano, a diferencia de las de la secuencia tpica HAH;
fig. 10-8). La estructura es muy similar a la secuencia tpica de enla
ce de DNA de varias protenas reguladoras de bacterifago como la
protena ero X cuyo enlace a DNA se estudi mediante cristalogra
fa de rayos X. En el caso tanto de la protena ero X como de las se
cuencias tpicas HGH eucariotas, se cree que si bien la HGH suele
mediar el enlace de DNA, la hlice ms terminal C acta como una
hlice de reconocimiento especfica porque se ajusta dentro del
surco mayor del DNA (fig. 10-9) y controla la secuencia precisa de
DNA que se reconoce.
Secuencia tpica en dedo de cinc

La secuencia tpica en dedo de cinc incluye el enlace de un ion de
cinc por cuatro aminocidos conservados para formar un asa (de
Factores de transcripcin inducibles por ligando

Hormonas hidrfobas y morfgenos pequeos como hormonas es
feroides, tiroxina y cido retinoico pueden difundirse a travs de la
membrana plasmtica de la clula blanco y enlazar receptores intracelulares en el citoplasma o el ncleo. Estos receptores (a menudo
llamados receptores nucleares d e horm onas) son factores de trans
cripcin inducibles: tras enlazarse el ligando homlogo, la protena
receptora se vincula con un elemento de respuesta de DNA espec
fico localizado en las regiones promotoras de tal vez 50 a 100 genes
blanco y activa su transcripcin.
Aunque la tiroxina y el cido retinoico no se relacionan desde
los puntos de vista estructural y biosinttico con las hormonas esteroides, sus receptores pertenecen a una superfamilia comn de re
ceptores nucleares. La familia se caracteriza por dos dominios
conservados: un dom inio d e en lace d e DNA ubicado centralmente
de unos 68 aminocidos y un dom inio d e en la ce d e ligando que tie
ne alrededor de 240 aminocidos y se sita cerca de la terminal C
(fig. 10-10). El dominio de enlace de DNA contiene dedos de cinc
y se enlaza como un dmero al reconocer cada monmero uno de
286
CAPTULO DIEZ
Asa
H lice-a
HAH
Hlice-a
Hlice-a
Hlice-a
COOH
Cremallera
de leucina
de la
hlice-a
Dedo
de Zn
><
Hlice-a
H
H
X
Fig. 10-8. Secuencias tpicas estructurales que suelen encontrarse en factores de transcripcin y en protenas de enlace de DNA.
Abreviaturas: HGH, hlice-giro-hlice; HAH, hlice-asa-hlice. Ntese que el monmero cremallera de leucina es antiptico [es decir, tiene residuos hi
drfobos (leucinas) consistentemente en una cara de la hlice, vase fig. 1-24], Dos de estas hlices pueden alinearse con sus caras hidrfobas en
oposicin para form ar una estructura superenrollada.
HGH
Dimero HAH
Dimero cremallera
de leucina
Reconocimiento
de la hlice
Fig. 10-9. Enlace a la doble hlice de elementos estructurales conservados en factores de transcripcin.
Nota: los monmeros individuales del dimero hlice-asa-hlice (HAH) y el dimero cremallera de leucina estn indicados con colores distintos para dife
renciarlos, pero pueden ser idnticos (homodmeros). Los heterodimeros HAH y los heterodmeros cremallera de leucina pueden proporcionar un nivel
ms alto de regulacin (vase texto).
los dos hexanucletidos en el elemento de respuesta. Los dos hexanucletidos son repeticiones invertidas o directas por lo general se
paradas por tres o cinco nudetidos (fig. 10-10). En ausencia de
ligando, el receptor se inactiva por represin directa de la funcin
del dominio de enlace del DNA por el dominio de enlace del ligan
do, o por el enlace a una protena inhibidora, como en el receptor
glucocorticoide (fig. 10- 11 ).
Activacin de factores de transcripcin por transduccin de

seal
A diferencia de las hormonas o morfgenos liposolubles, las mo
lculas de sealamiento hidrfilas, como las hormonas polipptidas,
no pueden difundirse a travs de la membrana plasmtica. En lugar
de ello se enlazan a un receptor especfico en la superficie celular.
10.2
CONTROL DE LA EXPRESIN GNICA POR ENLACE DE FACTORES PROTEINICOS.
287
Cuadro 10-4. Ejemplos de elementos de respuesta en la expresin gnica inducible.

Elemento de respuesta consenso (E.R.)
Respuesta a
Factor protenico que reconoce E.R.
(T/G)(T/A)CGTCA
cAMP
CREB (tambin llamado ATF)
CC (A/T) (A/T)(A/T) (A/T) (A/T) (A/T)GG
Factor de crecimiento srico
Factor de respuesta srico
TTNCNNNAAA
Interferon gamma
Stat-1
TGCGCCCGCC
Metales pesados
Mep-1
TGAGTCAG
steres de forbol
AP1
CTNGAATNTTCTAGA
Choque por calor
HSP70, etctera
Nota : vase tambin elementos de respuesta hormonal en fig. 10-10.
Despus del enlace de la molcula ligando, el receptor sufre un cam

bio de conformacin y se activa en tal forma que la seal pasa a tra
vs de otras molculas dentro de la clula (transduccin d e seal;
vase seccin 3.2.1).
Muchos receptores de superficie celular tienen una actividad de
cinasa o pueden activar cinasas intracelulares (vase cuadro 3.3), y
las vas de transduccin de seal suelen caracterizarse por la interrelacin reguladora compleja de cinasas y fosfatasas que pueden acti
var o reprimir intermediarios por fosforilacin/desfosforilacin. En
muchos casos cualquiera de estos dos ltimos procesos induce una
alteracin de la conformacin. En la activacin de una molcula de
sealamiento, la conformacin alterada con frecuencia significa que
no se inhibe ms un factor de sealamiento por alguna secuencia re
presora presente en una protena inhibidora a la que est enlazada,
o en un dominio o secuencia tpica dentro de su estructura propia.
En trminos de la activacin transcripcional, dos mecanismos
generales permiten la transmisin rpida de seales de receptores
de la superficie celular al ncleo, y ambos incluyen fosforilacin de
A)
protenas: se activan cinasas de protena y luego se translocan del

citoplasma al ncleo, donde fosforilan factores de transcripcin
blanco; factores de transcripcin inactivos almacenados en el cito
plasma se activan por fosforilacin y se translocan al interior del
ncleo. En las dos secciones siguientes se presentan ejemplos que
ilustran los dos mecanismos anteriores (vase tambin Karin y
Hunter, 1995).
Sealamiento hormonal a travs de la va del AMP cclico

El AMP cclico es un segundo mensajero importante (vase cuadro
10 - 5 ) que acta en respuesta a una diversidad de hormonas y otras
molculas de sealamiento. Se sintetiza a partir del ATP por una
enzima enlazada a la membrana, la ciclasa de adenilato. Las hormo
nas que activan esta ltima se unen a un receptor de superficie ce
lular de la clase de receptor acoplado a protena G. La unin de la
hormona con el receptor promueve la interaccin de este ltimo
con una protena G que consiste en tres subunidades, a , (3 y "y.
B)
RECEPTOR DE ESTEROIDE
ELEMENTO DE RESPUESTA
777
AGAACA nnn TGTTCT
TCTTGT nnn ACAAGA
RG
553
AGGTCA nnn TGACCT

TCCAGT nnn ACTGGA
432
AGGTCA nnnnn
TCCAGT nnnnn
RAR
AGACCA
TCTGGT
408
AGGTCA TGACCT
TCCAGT ACTGGA
Clave
Dominio de enlace de DNA
Dominio de enlace de ligando
427
RVD
AGGTCA nnn
TCCAGT nnn
AGGTCA
TCCAGT
Fig. 10-10. Receptores de esteroides y elementos de respuesta respectivos.

A) Estructura de miembros de la superfamllia del receptor nuclear. Los nmeros se refieren al tamao de la protena en aminocidos. RE, receptor
de estrgenos; RG, receptor de glucocorticoides; RF receptor de progesterona; RAR, receptor de cido retinoico; RT, receptor de tiroxina; RVD, receptor
de vitamina D. B) Elementos de respuesta. Obsrvese: a) que con frecuencia los elementos de respuesta son repeticiones hexanucletidas invertidas
perfectas, pero los elementos de respuesta del cido retinoico y la vitamina D3 son repeticiones hexanucletidas directas imperfectas; b) todos los hexanucletidos tienen la secuencia general AGNNCA con los dos nucletidos centrales (se muestran sombreados) que confieren especificidad y pertenecen
a una de las tres clases: GT, AC o AA.
288
CAPTULO DIEZ
EXPRESIN GENICA HUMANA
Glucocorticoide
la activa para que permita la liberacin de las dos subunidades con

actividad cataltica que a continuacin penetran en el ncleo y fosforilan un factor de transcripcin especfico, CREB (protena de
unin de CRE). El CREB activado despus activa la transcripcin
de genes con el elemento de respuesta cAMP (fig. 10-12A).
Activacin de NF-k B a travs de sealamiento por el factor

de necrosis tumoral
Ncleo
Activacin del gen blanco
El NF-kB es un factor de transcripcin que participa en una diver

sidad de aspectos de la respuesta inmunitaria. En estado inactivo, el
NF-/cB permanece en el citoplasma, donde se encuentra en comple
jo con una subunidad inhibidora, I k B. Sin embargo, esta ltima
puede ser un blanco para la degradacin despus de la fosforilacin.
La destruccin consiguiente de IB permite que NF-kB se trasloque
al ncleo y active sus diversos genes blanco. La fosforilacin de I/cB
se logra por una cascada de cinasas despus de que el factor de ne
crosis tumoral (TNF) se enlaza a un receptor especfico de TNF de
la superficie celular y causa la activacin del factor 2 relacionado con
el receptor de TNF (TRAF2; vase fig. 10-12B).
10.2.6 El control traduccional de la expresin gnica

puede incluir el reconocimiento de secuencias
reguladoras UTR por protenas de enlace de RNA
Despus de esta interaccin, la subunidad a de la protena G se

activa, lo que origina su disociacin y estimula la ciclasa de adenilato.
El incremento del cAMP intracelular producido por la ciclasa
de adenilato activada puede activar luego la transcripcin de se
cuencias blanco especficas que contienen un elem ento de respuesta
cAMPo CRE. Esta funcin del cAMP es mediada por la enzima ri
osa de protena A. El AMP cclico se une a la cinasa de protena y
La sntesis de protena es el principal paso final de la expresin g

nica y un punto de control importante para la regulacin. En el ini
cio de la traduccin en eucariotas participa una serie compleja de
protenas y se conocen diferentes vas para iniciar la traduccin
(vase Dever, 2002). Aunque la eleccin del codn de inicio AUG
(metionina) es fundamental, algunos genes realizan elecciones al
ternativas del codn de inicio en un mRNA, que producen isoformas que varan en su secuencia terminal N vase el ejemplo del
gen del tumor de Wilms, WT1 en la figura 10.16A-. La importan
cia de estas isoformas an no se aprecia bien.
Asimismo est demostrado que un nmero creciente de especies
de mRNA eucariotas y de mamferos contienen secuencias regula
doras en sus secuencias no traducidas, con mayor frecuencia en el
extremo 3 (vase Wickens y cois., 1997). Tambin se identificaron
varias protenas de unin de RNA eucariotas y de mamferos, y se
comprob que se enlazan a secuencias reguladoras especficas que
se encuentran en secuencias no traducidas, por lo que proporcionan
la base para el control traduccional de la expresin gnica (Siomi y
Dreyfuss, 1997). Est identificada una diversidad de dominios de
enlace de DNA e incluyen elementos que se relacionaron antes con
Cuadro 10-5. Ejemplos de mensajeros secundarios en el sealamiento celular.

Mensajero secundario
Caractersticas
AMP cclico (cAMP)
Producido a partir de ATP por la ciclasa de adenilato. Los efectos suelen mediarse a travs de la cinasa de protena
A.
Vase ejemplo de la activacin del factor CREB (fig. 10-12A)
GMP cclico (cGMP)

de vertebrados
Producido a partir de GTP por la ciclasa de guanilato. La funcin mejor caracterizada es la recepcin visual en ojos
Fosfolpidos/Ca2+
Activacin corriente abajo de receptores acoplados a proteina G y de cinasas de tirosina protenicas. La hidrlisis de
4,5-bis-fosfato de fosfatidilnositol (PIP2) proporciona diacilglicerol y 1,4.5-trifosfato de inositol (IP3) que activa la ci
nasa de proteina C y desplaza C a ^ de depsitos intracelulares.
10.2
A)
/ ^ \ __
H orm on a
CONTROL DE LA EXPRESIN GENICA POR ENLACE DE E\CTORES PROTENICOS.
k/ ~ \ R ec ep to r de
O O n horm ona
C iclasa d e adenilato
C inasa d e I r r
proteina A { i g X C )
289
f*
B)
' (g ) (g )
0
IKKK
...
0
IKKK ac tivada
Ubiquitinilacin
y degradacin
A ctivacin de genes
blanco que contienen CRE
si\
A ctivacin d e genes blanco
Fig. 10-12. Genes blanco seleccionados pueden expresarse en forma activa en respuesta a estmulos extracelulares mediante transduccin de la
seAal de los receptores de superficie celular activados.
A) Activacin de una cinasa de protena y translocacin al ncleo: el sealamiento hormonal a travs de AMP cclico-cinasa de protena A seala
una va de transduccin. El enlace de hormona a un receptor especifico de la superficie celular promueve la interaccin del receptor con una protena G.
La subunidad a de la protena G activada se disocia del receptor y estimula la ciclasa de adenilato enlazada a la membrana para que sintetice cAMR
Este ltimo se enlaza a las subunidades reguladoras de cinasa de protena A, lo que permite la liberacin de las subundades catalticas (c) que migran
al ncleo y activan el factor de transcripcin CREB (protena de enlace CRE) mediante fosforilacin. CREB activado se enlaza a elementos de respuesta
cAMP en los promotores de genes blanco. B) Activacin de un factor de transcripcin citoplsmico (NF-kB) y translocacin al ncleo. El enlace de
TNF origina un cambio en su receptor de membrana, que le permite incorporar varias protenas de sealamiento ntracelulares. Estas ltimas se incorpo
ran a su vez y activan IKKK, una cinasa que fosforia IKB, la cinasa Ik B. En condiciones normales IKB est enlazada a NFkB pero la adicin de grupos
fosfato a IKB la marca para ubiquitinilacin y degradacin. La NFkB liberada tiene una secuencia de localizacin nuclear expuesta que ahora permite que
migre al ncleo, donde activa un grupo de genes blanco.
propiedades de enlace de DNA de factores de transcripcin, como

dedos de cinc y homeodominios (Siomi y Dreyfuss, 1997).
Traslado de RNA
Puede considerarse que la interaccin entre elementos reguladores
de accin cis en el RNA y las protenas de enlace de RNA de accin
trans modifica la estructura del RNA en diversas formas: facilitan
do u obstaculizando interacciones con otros factores de accin
trans; alterando la estructura de RNA de orden ms alto; uniendo
entre s secuencias de RNA inicialmente remotas, o proporcionan
do seales de localizacin o blanco para el transporte de molculas
de RNA a sitios intracelulares especficos (trnsito de RNA). Se sa
be que mltiples mRNA eucariotas y de mamferos se transportan
como partculas de ribonucleoprotena (RNP) a sitios especficos
dentro de algunos tipos de clulas, en especial del sistema nervioso

(vase Hazelrigg, 1998). Por ejemplo, mRNA tau se localiza en las
porciones proximales de axones en lugar de dendritas, en tanto que
muchas molculas de mRNA se hallan en neuronas maduras y el
mRNA de la protena bsica de mielina se transporta con la ayuda
de cinesina a los procesos de oligodendrocitos.
El trnsito de RNA puede constituir un medio ms eficiente pa
ra localizar protenas que slo las transportan: es posible que un
mRNA aislado origine muchas molculas de protena distintas, si
se asume que puede comprometerse con ribosomas. Suelen consi
derarse varios pasos secuenciales: represin traduccional inicial,
transporte dentro de la clula, localizacin (al destino subcelular es
pecfico) y luego traduccin dependiente de la localizacin. En fe
cha reciente se identificaron secuencias reguladoras fundamentales
para varios pasos de este proceso en las secuencias no traducidas.
290
CAPITULO DIEZ
cundacin de un oocito humano, al principio no se elabora mRNA

hasta la etapa de cuatro a ocho clulas, cuando la transcripcin cig tica se activa, es decir, la transcripcin de los genes que se en
cuentran en el cigoto. Antes de esta poca las funciones celulares
son especificadas por el mRNA m aterno que se sintetiz con ante
rioridad durante la oognesis.
La extrapolacin de estudios en organismos modelo sugerira
que los oocitos almacenan una diversidad de mRNA en una forma
inactiva, que se caracteriza por tener colas oligo(A) cortas. Estos
mRNA se sometieron antes a desadenilacin y la cola oligo(A) cor
ta resultante indica que no pueden traducirse. Despus, en la fecun
dacin o ms adelante durante el desarrollo, las especies mRNA
inactivas almacenadas pueden activarse mediante poliadenilacin
citoplsmica, lo que restablece el tamao normal de la cola poli(A).
Se utiliza el mismo tipo de actividad de polimerasa poli(A) que en
la poliadenilacin estndar de mRNA recin formado (que ocurre
en el ncleo) pero adems de la seal AAUAAA, el mRNA requiere
un elem ento d e poliaden ilacin citoplsm ica abundante en uridina
corriente arriba (vase Wahle y Kuhn, 1997).
Otros dos mecanismos que regulan la traduccin de algunos
mRNA durante el desarrollo son el ocultamiento traduccional (por
el que las protenas de enlace de RNA pueden reconocer y enlazar
secuencias especficas en las 3' UTR de los mRNA, y en consecuen
cia reprimir la traduccin; vase Gray y Wickens, 1998) y la regula
cin antisentido. En este ltimo caso se sabe que algunos mRNA
son regulados por una secuencia de RNA complementaria, como
sucede en los microRNA, RNA muy pequeos que en algunos casos
regulan los genes durante el desarrollo por enlace a secuencias com
plementarias en sus 3' UTR (vase fig. 9-6 y Bannerjee y Slack,
2002; Pasquinelli y Ruvkun, 2002).
sobre todo en la 3' UTR de muchas especies de mRNA, (vase

Wickens y cois., 2002 ).
Control traduccional de la expresin genica en respuesta a

estmulos externos
El control traduccional de la expresin gnica puede permitir una res
puesta ms rpida a estmulos ambientales alterados que la alternativa
de activar la transcripcin. El metabolismo del hierro brinda dos
ejemplos muy tiles. El incremento de los valores de hierro estimula
la sntesis de la protena de enlace de hierro, ferritina, sin ningn
aumento correspondiente en la cantidad de mRNA de ferritina. En
contraste, la disminucin de las concentraciones de hierro estimula
la produccin del receptor de transferrina (RTF) sin ningn efecto
en la produccin de mRNA del receptor de transferrina. La 5 UTR
tanto del mRNA de la cadena pesada de la ferritina como la de mR
NA de la cadena ligera contiene un elemento de respuesta al hierro
(ERH) nico, una secuencia reguladora de accin cis especfica que
forma una estructura en horquilla. Varias de estas secuencias ERH
tambin se encuentran en la 3' UTR del mRNA del receptor de
transferrina (vase Klausner y cois., 1993). La regulacin se ejerce me
diante el enlace del ERH por una protena de enlace del ERH espec
fica que se activa a concentraciones bajas de hierro (vase fig. 10-13).
Control traduccional de la expresin gnica durante

el desarrollo temprano
La expresin gnica durante la maduracin del oocito y sus etapas
embrionarias ms tempranas est regulada a nivel de la traduccin,
no de la transcripcin (vase De Moor y Richter, 2001). Tras la fe
PE-ERH inactiva
B)
+Fe
PE-ERH de enlace de RNA
5' UTS
3 ' UTS c o d ific a n te ^ ^
mRNA de cadena H de ferritina !
jL
AAAAA
3' UTS
mRNA TfR
Enlace de PE-ERH
a uno o ms ERH
AAAAA
ERH en mRNA
de cadena H de
ferritina humana
Inhibicin del inicio

de la traduccin
AAAAA
Protege mRNA
de degradacin
Fig. 10-13. La protena de enlace de ERH regula la produccin de la cadena pesada de ferritina y el receptor de transferrina por enlace a elemen
tos de respuesta al hierro (ERH) en regiones no traducidas 5' o 3 .
A) Estructura del ERH en la 5 ' UTR de la cadena pesada de ferritina. B) el enlace de la protena de enlace de ERH a la ferritina y los mRNA del receptor
de transferrina tiene efectos contrastantes en la sntesis de protenas.
10.3
10.3
TRANSCRIPCIN Y PROCESAMIENTO ALTERNATIVOS DE GENES INDIVIDUALES
Transcripcin y procesam iento

altern ativo s de genes individuales
Adems del control que ejercen en la seleccin de genes especficos

i o sus transcritos) para activacin o represin, los mecanismos de
control tambin pueden seleccionar entre transcritos alternativos
especficos de un gen aislado. El uso de un promotor diferencial o
acontecimiento de procesamiento diferencial de RNA pueden pro
ducir un gran nmero de isoformas distintas y estos mecanismos y
otros desafan la definicin clsica de un gen.
10.3.1 El uso de promotores alternativos puede generar

isoformas especficas de tejido
Se sabe que varios genes de mamferos individuales tienen dos o ms
promotores alternativos, que pueden dar lugar a productos de ex
presin alternativos (isoform a s) con diferentes propiedades (vase
Avoubi y Van de Ven, 1996). Con frecuencia los promotores indi
viduales impulsan la transcripcin de versiones alternativas de un
primer exn que luego se empalma en cada caso a un juego comn
de exones corriente abajo. Sin embargo, adems algunos promoto
res alternativos se localizan en porciones ms distales de un gen
p rom oto res a ltern a tivos in tern os) e impulsan la expresin de pro
ductos truncados, como se observa en algunos promotores en el gen
de distrofina (vase ms adelante). Las isoformas pueden conferir:
especificidad de tejido (una ocurrencia frecuente porque dife
rentes promotores pueden contener distintos elementos regu
ladores; vase el ejemplo del gen de distrofina humano ms
adelante);
especificidad de etapa del desarrollo (p. ej., el gen del factor II
de crecimiento similar a insulina);
localizacin subcelular diferencial (como isoformas solubles y
enlazadas a membrana);
capacidad funcional diferencial (p. ej., en el receptor de progesterona);

regulacin gnica especfica de sexo (vase el caso del gen de
metiltransferasa D nm tl (seccin 10.4.2; fig. 10-20).
Uno de los ejemplos ms celebrados del uso del promotor diferen
cial en humanos se relaciona con el gen de distrofina gigante que
comprende un total de ms de 79 exones distribuidos alrededor de
2.4 Mb de DNA en Xp21. Es posible utilizar cuando menos siete
diferentes promotores alternativos. Tres de ellos se ubican cerca del
sitio de inicio convencional y comprenden un promotor especfico
de corteza cerebral, un promotor especfico de msculo localizado
100 kb corriente abajo y un promotor que se emplea en las clulas
de Purkinje del cerebelo y se encuentra 100 kb ms corriente aba
jo (vase fig. 10-14). El uso de estos promotores produce isoformas
grandes con un peso molecular de 427 kDa (denominadas Dp427,
en las que Dp = protena distrofina, y con frecuencia se aade un
sufijo para indicar especificidad de tejido, por ejemplo Dp427m a
fin de indicar la isoforma especfica de msculo). Las tres isoformas
Dp427 difieren en su secuencia de aminocidos del extremo termi
nal N como resultado del empleo de tres diferentes alternativas pa
ra el exn 1. Adems de los promotores alternativos que codifican
las isoformas grandes convencionales, pueden usarse cuando menos
otros cuatro promotores alternativos internos, que generan isofor
mas ms pequeas (fig. 10-14).
10.3.2 Los genes humanos son propensos a empalme

(corte y unin, splicing) y poliadenilacin
alternativos
Por lo general el uso de promotores alternativos comprende el empleo
de exones alternativos al inicio de la transcripcin, pero otros meca
nismos, en especial el empalme alternativo, contribuyen a la utiliza
cin a gran escala de exones alternativos. Nmeros inesperadamente
CNS
C1
M1
l
D p427
P1
10 15 20 R 130 40
I_I
Dp260
2 000
1 500
CNS1 45
lili lilil
r * .
r t
1 000
500
291
50 55 S1 60
G1
D p140
D p116
Dp71
2 500
70
79
Fig. 10-14. Cuando menos siete promotores distintos pueden utilizarse para generar la expresin especfica de tejido y de tipo celular del gen de
distrofina.
En a parte superior se ilustran las posiciones de los siete promotores alternativos: C, cortical; M, msculo; R Purkinje; R, retiniano ( + cerebro
- -nscuio cardiaco); CNS, sistema nervioso central (+ rin); S, clulas de Schwann; G, general (expresada casi de manera ubicua, pero no detectable
=r- msculo esqueltico por completo diferenciado). En la parte inferior se lustran las posiciones aproximadas de los exones. Nota: cada promotor utiliza
su primer exn propio (en rojo: C1, M 1, P1, CNS1, S1 y G1) junto con exones corriente abajo (en azul). Los promotores internos se localizan justo
re c e n te arriba de los exones que se indican como sigue: R, exn 30; CNS, exn 45; S, exn 56; G, exn 63. La longitud completa de las distrofinas
C. M y P se aproxima a 427 kDa (Dp427). Los promotores internos R, CNS, S y G generan isoformas progresivamente ms pequeas: Dp260, Dp140.
Dpi 16 y Dp71. Se sabe que ocurre empalme alternativo, en especial en el extremo 3 '; para mayor informacin vase http://www.dmd.nl/isoforms.lTtrr
292
CAPTULO DIEZ
bajos de genes en algunos organismos complejos {Drosophilay los hu

manos tienen, respectivamente, alrededor de 0.7 X y 1.5 X el nme
ro de genes que un gusano de 1 mm de largo simple, C. elegam)
sugieren que la complejidad biolgica podra depender en gran medi
da de la expresin alternativa de genes (Maniatis y Tasic, 2002; Roberts y Smith, 2002 ).
Empalme alternativo: prevalencia y patrones

Cuando menos 50% (y con mucha probabilidad un porcentaje
bastante ms alto) de los genes humanos sufre empalme alternativo,
por el que estn representadas diferentes combinaciones de exones
en transcritos del mismo gen durante el procesamiento del RNA.
Muchos genes pueden generar en principio numerosas isoformas a
nivel del RNA, pero no suele ser claro qu tantos de los posibles
transcritos alternativos tienen importancia biolgica (aunque la im
portancia de algunos es clara; vase ms adelante). Diversas clases
de empalme alternativo pueden ocurrir y dar lugar a combinacio
nes alternativas de exones de codificacin y de exones no codificantes,
y de va rian tes d e lo n gitu d d e l exn que comparten alguna secuencia
(vase fig. 10-15). Las consecuencias para los genes codificadores

de polipptidos son varias:
diferentes isoform as d e protenas. Esto puede llevarse a cabo
por combinaciones alternativas de exones de codificacin o va
riantes de exones codificantes que producen diferencias de
aminocidos. En ocasiones es posible elaborar protenas que
carecen de un dominio completo funcionalmente importante
o una seal de localizacin importante, con consecuencias fun
cionales significativas (vase recuadro 10-3);
diferen tes secu en cias no traducidas. Combinaciones alternati
vas de exones no codificantes y variantes de exones no codifican
tes dan por resultado diferentes secuencias 5' o 3' no traducidas
y en ocasiones distintos sitios de poliadenilacin (vase fig. 10-15).
Aunque la importancia funcional de diferir secuencias no tra
ducidas no suele ser clara, en algunos genes es un fenmeno
notable -p. ej., el mRNA del receptor de hormona del creci
miento muestra cuando menos ocho secuencias 5' UTR dife
rentes como resultado de empalme alternativo (Pekhletsky y
cois., 1992).
A) Intrn retenido
!-------
"1------- !
E) Mltiples sitios poli(A)
B) Sitios de empalme 5' com petidores
F) Exones casete
C) Sitios de empalme 3' com petidores
G) Exones mutuamente exclusivos
Fig. 10-15. Tipos de acontecim iento de em palme alternativo.

Es posible incluir u omitir (brincar) exones casete F) internos en forma independiente de otros exones (omisin de exn) en tanto que ocurren exones
mutuam ente exclusivos G) en arreglos de dos o ms exones, slo uno de los cuales puede seleccionarse a la vez para incluirse en el RNA maduro. Los
ejemplos ilustrativos de algunos de estos acontecimiento son los siguientes: exones casete, exn 5 del gen WT1 (fig. 10-16A); variantes de longitud de!
exn debidas a sitios de empalme 5 ' competidores B), variantes de! exn 9 en el gen WT1 (fig. 10-16A); exones mutuamente exclusivos, variantes para
exones 4 . 6, 9 o 17 del gen Dscam (fig. 10-16B). La eleccin de promotores alternativos tambin introduce exones 5 alternativos (vase fia. 10-14).
Adaptado de Roberts y Smith (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6,375-383 con autorizacin de Elsevier. Obsrvese que adems de! empalme alternativo, en
el genoma humano tambin se encuentran ejemplos ocasionales de empalme trans. En tanto que el empalme alternativo junta secuencias transcritas de
diferentes combinaciones de exones dentro de una unidad de transcripcin nica en una cadena de DNA nica, el empalme trans rene secuencias transcritas
de exones que pertenecen a distintas unidades de transcripcin en diferentes cadenas de DNA (vase Finta y Zaphiropoulos, 2002; Maniatis y Tasic, 2002).
10.3
TRANSCRIPCIN Y PROCESAMIENTO ALTERNATIVOS DE GENES INDIVIDUALES
El empalme (corte y unin) alternativo puede originar gran nme

ro de isoformas posibles, inclusive hasta las asombrosas 38 016 isoformas de protenas del gen de Drosophila Dscam (Schmucker y
cois., 2000; vase fig. 10-16B). Est demostrado que algunas de es
tas alternativas son reguladas de manera especfica por el desarrollo
v los tejidos. En algunos genes bien estudiados se demostr que for
mas alternativas de empalme estn en extremo bien conservadas,
como las isoformas +KTS y -KTS del gen WT1 del tumor de
Wilms (fig. 10-16A; recuadro 10-3), que se conservan en organis
mos relacionados de modo distante como el pez soplador.
Empalme alternativo: regulacin

El mejor sistema modelo que se conoce para comprender la regu
lacin del empalme es la va de la determinacin del sexo en Dro
sophila, que tambin controla la dosis gnica. Se utiliza empalme
alternativo en cada rama de esta va a fin de controlar la expresin
de reguladores transcripcionales o de protenas relacionadas con la
cromatina que influyen en la transcripcin y un control del empal
me tanto positivo como negativo es evidente (vase Lpez, 1998).
Los reguladores de empalme candidatos en clulas de mamferos
son la fa m ilia SR de protenas de unin de RNA [que tienen un
dominio terminal C preciso abundante en dipptidos serina(S) y
arginina(R)] y algunas protenas HnRNP (partcula de ribonucleoprotena nuclear heterognea). Se sabe que estas protenas pro
mueven varios pasos en el ensamble de espliceosomas y que
tambin se enlazan a secuencias intensificadoras de empalme, se
cuencias reguladoras que pueden incrementar el reconocimiento
del sitio de empalme (vase Blencowe 2002; Cceres y Kornblihtt,
2002; Fairbrother y cois., 2002).
Poliadenilacin alternativa
El uso de seales de poliadenilacin alternativa en mRNA humano
tambin es muy frecuente y se identifican diferentes tipos de polia
denilacin alternativa (vase Edwards-Gilbert y cois., 1997). En
muchos genes se encuentran dos o ms seales de poliadenilacin
en la 3' UTR y los transcritos poliadenilados de manera alternati
va pueden mostrar especificidad de tejido; en otros casos es posible
293
que se pongan en juego seales de poliadenilacin alternativa des

pus del empalme alternativo.
10.3.3 La edicin de RNA es una forma rara

de procesamiento por la que se introducen
cambios especficos de bases en el RNA
La edicin de RNA es una forma de procesamiento postranscripcional que puede incluir insercin y delecin mediada por enzimas
de nucletidos o sustitucin de nuclotidos nicos a nivel del RNA.
Al parecer la edicin de RNA con insercin o delecin es una propie
dad peculiar de la expresin gnica en mitocondrias de protozoarios
cinetoplstidos (como los tripanosomas) y mohos de limo. A me
nudo la edicin de RNA con sustitucin se utiliza en algunos sis
temas, como en las mitocondrias y los cloroplastos de plantas
vasculares en las que mRNA individuales pueden someterse a ml
tiples eventos de edicin C * U o U C.
No se dispone de pruebas de insercin o delecin en la edicin
de RNA en mamferos, pero se observa edicin con sustitucin en
un nmero limitado de genes (vase Gerber y Keller, 2001). La edi
cin de RNA que se sabe que ocurre incluye sobre todo desaminacin (eliminacin de grupos amino) de residuos de citosina o
adenina muy seleccionados (catalizada por una familia de desaminasas dependientes de RNA), pero tambin puede ocurrir transaminacin (modificacin por adquisicin de un grupo amino),
como en el caso de la edicin U -* C en el gen del tumor de Wilms
(vase fig. 10-16A). Las dos clases de edicin de RNA que se basan
en desaminacin conocidas son:
edicin C ~>U. Se observa en muy pocos genes, en especial el
gen de apolipoprotena APOB humano en el que se estudi
bien. En el hgado, el gen APOB codifica un transcrito de mR
NA de 14.1 kb y un producto de 4 536 aminocidos, apoBlOO.
Sin embargo, en el intestino una desaminasa de citosina espec
fica, APOBEC1, convierte una citosina aislada en el nuclotido
6 666 en uridina, lo que en consecuencia genera un codn de
detencin prematuro. El mRNA truncado (7 kb) codifica un
producto, apoB48, idntico en secuencia a los 2 152 primeros
aminocidos de apoBlOO (fig. 10-17). La desaminasa inducida
Recuadro 10-3. El empalme (corte y unin, splicin g ) alternativo puede alterar las propiedades funcionales
de una protena
La lista siguiente, que est muy lejos de ser completa, tiene como fin ilus
trar algunas formas en que las propiedades biolgicas de una protena
pueden alterarse como resultado del empalme alternativo. Para una infor
macin ms amplia vase Lpez (1 9 9 8 ) y Graveley (2001).
tro dedos de cinc en su terminal C y tiene hasta 24 isoformas diferen

tes. El empalme diferencial puede conducir a la inclusin u la omisin
de una secuencia que especifica tres aminocidos, KTS, que rige la
localizacin nuclear (vase fig. 10-16A).
Isoformas especificas de tejido, por ejemplo, las Isoformas tropo-
Alteracin de la funcin. Las isoformas + K T S y -K T S del produc
mlosina y calcitonina (esta ltima incluye la calcltonina expresada por

la tiroides y el pptido neural relacionado con el gen de calcitonina).
to del gen WT1 tambin difieren en su capacidad para enlazarse a se

cuencias especificas de DNA en genes blanco. Se piensa que las
primeras participan en el enlace de factores de empalme; las ltimas
pueden tener una funcin ms general enlazando dominios que alo
jan factores de transcripcin general. Otros ejemplos comprenden:
isoformas del factor de transcripcin (que activan/reprimen la trans
cripcin segn la naturaleza de los dominios incluidos o excluidos
del producto protenco; vase Lpez, 19 9 8) e isoformas que pro
mueven e inducen la apoptosis de diversos genes, como el gen Ich1 (caspasa 2).
Isoformas enlazadas con la membrana y solubles. La localizacin

de las protenas puede regularse mediante la generacin de formas
solubles de numerosos receptores de membrana, por ejemplo, HLA
clases I y II, IgM, CD8, receptor de hormona del crecimiento, IL-4, IL5, IL-7, IL, eritropoyetina, G-CSF, G-MCSF, LIF (factor inhibidor de leucina) y el receptor de sealamiento de apoptosis FAS.
Localizacin intracelular alternativa. Un ejemplo til lo proporciona

el gen del tumor de Wilms
WT1 que
especifica una protena con cua
294
CAPTULO DIEZ
p o r activacin (AID), una enzima que participa en la recombi

nacin y mutacin de DNA de inmunoglobulina, muestra un
similitud considerable con APOBEC1 pero al parecer desami
na desoxi&mzs (seccin 10 .6 );
edicin A I. La efectan miembros de la fa m ilia ADAR de
desaminasas (desaminasa de adenosina que acta en RNA) en
mRNA que codifica ciertos canales de iones controlados por li
gando, inclusive los receptores de glutamato y protenas rela
cionadas. Una adenosina se desamina para dar inosina (I), una
base que no suele encontrarse en el mRNA (el grupo amino en
el carbono 6 de la adenosina es sustituido por un grupo carbonilo C = O). La inosina se comporta como guanosina; forma
pares de bases de preferencia con citosina y durante la sntesis
de protenas es traducida como si fuera G cuando se encuentra
en un codn. En el caso del gen del receptor B de glutamato,
por ejemplo, la edicin de RNA reemplaza un codn CAG
(glutamina) por CIG, que se traduce como si fuera CGG y da
arginina. Con frecuencia este tipo de edicin que origina una
Gln >Arg se dertomina edicin Q/R (segn el cdigo de le
tras nico para los dos aminocidos relacionados).
Aunque an no se conoce con certeza todo su significado, en ma
mferos la edicin de RNA es importante para la supervivencia (p.
ej., los knock-out de genes ADAR de ratones individuales pueden
dar varios fenotipos). Es posible que surgiera en la evolucin a fin
de corregir errores a nivel del genoma, pero tambin puede propor
cionar una forma de regulacin de la expresin y medios adiciona

les para crear una diversidad de protenas.
10.4
Expresin gnica diferencial:

orgenes a travs de a s im etra y
perpetuacin hasta m ecanism os
epigenticos como m etiiacin
del DNA
El concepto de especificidad tisular de la expresin gnica humana se

estableci hace mucho tiempo. Lo que resulta menos claro es la for
ma en que estos patrones se establecieron inicialmente. Si se conside
ra que el contenido de DNA de todas las clulas nucleadas en un
organismo es casi idntico, los mecanismos genticos no explicaran
cmo se desarroll por primera vez la expresin gnica diferencial en
las clulas. Para explicar lo anterior C. H. Waddington recurri a me
canismos epigenticos de control gnico durante el desarrollo. Los
mecanismos genticos explican estados hereditarios (caracteres) que
resultan de cambios en la secuencia del DNA (mutaciones), pero los
mecanismos epigenticos describen estados hereditarios que no de
penden de la secuencia de DNA. En fecha reciente se identific que en
las clulas de los vertebrados opera una variedad de mecanismos epi
genticos, aun algunos que pueden perpetuar estados particulares de
expresin gnica en linajes de clulas somticas.
A) WT1
CUG AUG AUG
U ZF ZF ZF
ZF
1 1 2
> ' ' A A A A ACA A A A

1
3 4\5/6
9\/~
B) Dscam
Exn 4
Dominio lg
12 variantes
Exn 6
Dominio lg
48 variantes
Exn 9
Dominio lg
33 variantes
Exn 17
Dominio TM
2 variantes
Fig. 10-16. Diferencias funcionales y potencial complejidad masiva por empalme alternativo en el gen del tumor de Wilms WT1 y el gen de Dscam
de D rosophila respectivamente.
A) Empalme de WT1. Son posibles 24 isoformas debido a una combinacin del uso alternativo de tres codones de inicio diferentes en el exn 1, una
sustitucin de edicin de RNA U C en el exn 6 y dos acontecimientos de empalme alternativos: omisin variable (brinco) del exn 5 y variacin de
la longitud para el exn 9 (a causa de sitios de empalme 5' competidores para el intrn 9). La variacin del exn 9 da por resultado inclusin u omisin
de un pptido KTS. Las isoformas +KTS se localizan especficamente en sitios espliceosmicos en el ncleo y se piensa que participan en el enlace de
factores de empalme, en tanto que las isoformas -KTS se distribuyen de manera ms general en el nucleoplasma y pueden tener una funcin ms ge
neral en el enlace de dominios que alojan factores de transcripcin generales (Larsson y cois., 1995). B) Empalme de Dscam. Puede generarse un total
de 38 016 (12 x 48 x 33 x 2) isoformas posibles seleccionando variantes mutuamente exclusivas para cada uno de los exones 4, 6 y 9 que codifi
can dominios similares a inmunoglobulina y para el exn 17 que codifica una regin transmembrana (vase Schmucker y cois., 2000). Adaptado de Roberts y Smith (2002). Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 375-378 con autorizacin de Elsevier Science.
10.4
EXPRESIN GNICA DIFERENCIAL
[CAA!
\nm
Gen 5 ApoB
295
TAA
H fH
Exn 26
HGADO
INTESTINO
6 666
6 666
5 ' ------------jCAAr-------UAA
AAAA...An 3'
5 ' ------ |CAA|------ -|UAA

Edicin de
ij Traduccin
AAAA...An 3'
R N A C U
5 '---------- |UAA|----- H u AA|------ AAAA...An 3'

, Traduccin
1
NHol
2 1 52 2153
I
4 536
ICOOH
ApoB100
1
I
2152
ICOOH
Protena
ApoB48
Fig. 10-17. Edicin de RNA especfico de tejido durante el procesamiento del gen de apoliprotena B humano {flPOB).
En el codn heptico 2 1 5 3 (CAA) en las posiciones nucletidas 6 666-6 668 de la APOB el mRNA especifica glutamina. Sin embargo, en el intestino,
la edicin de RNA C -> U en la posicin 6 666 ocasiona el reemplazo del codn CAA por el codn de detencin, UAA, cuyo resultado es un producto
ms corto, ApoB48.
10.4.1 Es muy probable que la expresin gnica

selectiva en las clulas de embriones
de mamferos se desarrollara en respuesta
a fenmenos de sealamiento intercelulares
de corto alcance
La explicacin de los patrones de expresin subsecuentes especfi
cos de tejidos, de clulas y de la etapa del desarrollo requiere algu
nos mecanismos para establecer una asimetra o un eje en el vulo
fecundado o en una etapa muy temprana del desarrollo. En Dro
sophila, el huevo es inherentemente asimtrico por la transferencia
de productos gnicos de clulas nodrizas situadas de manera asim
trica. Al principio el embrin se desarrolla como un sincitio multinucleado (una clula grande) y la regionalizacin depende de la
respuesta de ncleos individuales a gradientes de largo alcance de
molculas reguladoras. Sin embargo, en mamferos la clula vulo
es hasta cierto punto pequea y el desarrollo embrionario tempra
no crea un agregado al parecer simtrico de clulas individuales. No
obstante, el desarrollo se torna asimtrico.
La generacin de asimetra en las clulas de los mamferos po
dra derivarse de indicios de posicin tempranos. Algunos aspectos
del desarrollo temprano son inherentemente asimtricos, inclusive
el punto de entrada del espermatozoo durante la fecundacin, la fi
jacin del embrin en la pared uterina durante la implantacin y la
localizacin de clulas con respecto a sus vecinas. Conforme el em
brin se desarrolla en una pelota de clulas y despus en tanto se
desarrollan estructuras ms complejas, las clulas individuales va
riarn en cuanto al nmero de clulas vecinas disponibles. Los
acontecimientos de sealamiento intercelular directo o sealamien
to intercelular de corto alcance pueden constituir un medio para
identificar la posicin de las clulas y desencadenar la expresin g

nica diferencial. Por ejemplo, si una molcula de sealamiento in
tercelular tiene un alcance de un dimetro celular, entonces las
clulas en el exterior de la blstula (seccin 3.7.2; fig. 3-13) recibi
rn diferentes seales de las que estn rodeadas por clulas vecinas
en todos los lados y los diferentes indicios de posicin pueden
traducirse en una expresin gnica diferencial. A medida que se
desarrollan sistemas celulares particulares durante, por ejemplo, la
organognesis (que se lleva a cabo sobre todo entre la cuarta y la no
vena semanas embrionarias), factores de crecimiento o diferencia
cin de tipo celular particular pueden inducir la expresin de factores
de transcripcin especficos de la etapa del desarrollo, de tejido, o de
ambos.
10.4.2 La metilacin del DNA es un factor epigentico

importante en la perpetuacin de la represin
gnica en clulas de vertebrados
Una vez que los patrones de expresin diferencial se establecen, los
mecanismos epigenticos pueden asegurar que se hereden de modo
estable cuando las clulas se dividen, proporcionando una forma de
memoria celular que se transmite a travs de linajes celulares. Los
mecanismos epigenticos pueden asegurar la herencia estable de un
estado con actividad transcripcional (conformacin de cromatina
abierta) para algunos genes o regiones del genoma blanco o, de
manera alternativa, organizar la cromatina de algunas regiones del
genoma para que adopte una forma muy condensada, sin actividad
transcripcional. Hoy en da se considera que en el desarrollo animal
operan cuando menos dos, y tal vez tres, diferentes mecanismos
epigenticos:
296
CAPITULO DIEZ
mediacin de DNA: un mecanismo epigentico en el que la

cromatina se organiza en estados cerrados, sin actividad transcripcional (vase ms adelante);
regulacin gnica policardada-tritrax. El grupo de represores
policardados y el grupo tritrax de activacin conservan la ex
presin correcta de varios reguladores del desarrollo fundamen
tales (inclusive los genes hometicos) mediante el cambio de la
estructura de la cromatina, sea a una conformacin cerrada
(reprimida en trminos de transcripcin) o abierta (con acti
vidad transcripcional); vase Mahmoudi y Verrijzer, 2001);
modificacin de la histona: un tercer mecanismo epigentico
probable que puede originar la perpetuacin de estados de ex
presin en localizaciones genmicas especficas (Turner, 2002;
vase seccin 10 .2 . 1).
En la actualidad se reconoce que la mediacin del DNA es un meca
nismo epigentico importante que interacta con la modificacin de
la histona (vase seccin 10.4.3) a fin de permitir la transmisin es
table de estados de cromatina que reprimen la expresin gnica de
una clula diploide a las clulas hijas (vase Bird, 2002). Sin embar
go, la funcin precisa de la metilacin del DNA en eucariotas an no
se comprende a la perfeccin y muestra diferencias claras de especie
(vase recuadro 9.3). Las metiltransferasas de citosina de los vertebra
dos reconocen una secuencia blanco CpG pero difieren de las meti-
<
GpC
i
<
GPC
<
Metiltransferasa
lasas bacterianas, que muestran una preferencia potente por el reco

nocimiento de un blanco de DNA hemimetilado (uno que ya est
metilado slo en una cadena). La secuencia CpG muestra simetra de
diadas y, por tanto, tras la replicacin del DNA las cadenas de DNA
recin sintetizadas recibirn el mismo patrn de metilacin CpG que
el DNA parental (fig. 10-18). En consecuencia el patrn de metila
cin de CpG puede transmitirse de modo estable a clulas hijas. La
perpetuacin de un patrn de metilacin preexistente tambin se co
noce como metilacin de conservacin y en clulas de mamferos la
efecta la metiltransferasa D nm tl.
El patrn de distribucin de 5-metilcitosinas en el genoma de
clulas somticas diferenciadas vara segn el tipo de clula pero la
metilacin de conservacin asegura que los patrones de metilacin
en linajes de clulas somticas individuales sean muy estables. No
obstante, durante el desarrollo temprano ocurren cambios notables
en la metilacin, que constituyen una forma de reprogramacin
epigentica (vase Razin y Kafri, 1994; Reik y cois., 2001; Li,
2002). Dos tipos principales de reprogramacin epigentica se ob
servan durante el desarrollo (vase fig. 10-19).
Reprogramacin en clulas germinales

Las clulas germ inales prim ordiales del embrin (clulas a partir de
las cuales se derivan los gametos) comienzan con DNA muy meti
lado, pero luego ocurre una desmetilacin progresiva durante el de
sarrollo. Para el tiempo en que las clulas germinales primordiales
penetraron en las gnadas, la desmetilacin es en gran parte com
pleta y terminar poco despus. Sin embargo, despus de la dife
renciacin gonadal y conforme las clulas germinales comienzan a
desarrollarse, ocurre n ueva metilacin. Esto conduce a una metila
cin sustancial del DNA de las clulas espermatozoo y vulo de
mamferos. El genoma del espermatozoo est metilado con ms in
tensidad que el genoma de los vulos y se evidencian diferencias es
pecficas de sexo en los patrones de metilacin, en especial en locus
improntos (vase Merteneit y cois., 1998 para referencias).
<
Reprogramacin en el embrin temprano

Duplicacin
de DNA
>
CpG)
>
<
GP
<
Fig. 10-18. Un requerimiento para que la metiltransferasa especifica

reconozca una secuencia blanco hemimetilada perpeta la metilacin
de CpG.
La secuencia CpG tiene una simetra de diada. Despus de la metila
cin del blanco hemimetilado (metilado slo en una cadena), las dos
cadenas metiladas se separarn en la duplicacin del DNA y actuarn
como plantillas para la sntesis de dos cadenas hijas no metiladas. Los
dplex hijos resultantes proporcionarn ahora nuevos blancos hemimetilados para continuar el mismo patrn de metilacin.
El genoma del oocito fecundado es un agregado de los genomas del

espermatozoo y el vulo, y tanto ste como el embrin muy tempra
no estn metilados de modo sustancial con diferencias de metilacin
en muchos genes de los alelos paternos y maternos. Despus, en las
etapas de mrula y blstula temprana en el embrin preimplantacin, la totalidad d e l gen om a se desmetila. Todava ms tarde, en la
etapa de pregastrulacin, ocurre una n ueva m etilacin amplia. Sin
embargo, la extensin de esta metilacin vara en diferentes linajes
celulares: los linajes d e clulas som ticas se median con intensidad;
los linajes derivados d e l trofohlasto (que dan lugar a la placenta, el
saco vitelino, etc.) estn submetilados; las clulas germ in ales p r i
m ordiales tem pranas no se afectan; su DNA genmico permanece
en gran medida no metilado hasta despus de la diferenciacin go
nadal (como se describi antes).
La contribucin de las diferentes metiltransferasas a la nueva me
tilacin an no se define. Las metiltransferasasDnmt3ay Dnmt3bson
candidatas firmes pero no suficientes por s mismas. En lugar de ello
parece probable que interacten con la metiltransferasa Dnmtl. El
gen D nm tl se expresa altamente en clulas germinales masculinas,
oocitos maduros y en el embrin temprano, y la expresin est suje
ta a regulacin especfica del sexo como resultado del uso de promo
tores especficos de oocitos y de espermatocitos (vase fig. 10-20 ).
10.4
D iferenciacin
gonadal
D esarrollo de
Fecundacin
clulas germ inales
M rula
EXPRESIN GNICA DIFERENCIAL
Biastocisto
tem prano
Pregastrulacin
29"
Diferenciacin
gonadal
Etapa del desarrollo
Fig. 10-19. Cambios en la metilacin del DNA durante el desarrollo de mamferos.

Las etapas del desarrollo para la gametognesis y el desarrollo embrionario temprano se expandieron con fines de claridad; las del desarrollo tardo, in
dicadas por cortes dobles, se redujeron. Obsrvense los cambios muy rpidos en la metilacin del DNA durante: a) la gametognesis: la metilacin
nueva da lugar a genomas sustancialmente metilados en el espermatozoo y el vulo (aunque con diferencias tanto en el nivel total de metilacin como
en el patrn de metilacin en estos genomas; vase texto) y b) el em brin tem prano donde ocurre una onda de desmetlacin de todo el genoma en la
etapa preimplantacn (mrula y blstula temprana) y es seguida poco despus por nueva metilacin a gran escala que se inicia en la etapa de pregas
trulacin. La ltima es en particular notable en linajes somticos y en menor extensin en linajes de trofoblastos, y da lugar a la placenta y el saco vitelino, pero no ocurre en las clulas germinales primordiales (las clulas del embrin que por ltimo originan las clulas espermatozoo y vulo).
10.4.3 La metilacin del DNA animal puede constituir

una defensa contra transposones lo mismo que
la expresin gnica reguladora
Aunque al parecer no todos los eucariotas estn sujetos a metilacin del
DNA, su funcin en clulas animales parece fundamental y el knockout dirigido del gen de metiltransferasa de citosina en ratones produce
letalidad embrionaria. Sin embargo, la funcin precisa de la metilacin
del DNA en clulas animales an no se aclara. Los conceptos actuales
se enfocan en particular en dos aspectos de las clulas animales: el ta
mao del genoma (los animales tienen genomas comparativamente
grandes con nmeros considerables de genes y tambin grandes nme
ros de familias con DNA muy repetidos que pertenecen a la clase
transposn) y el modo de desarrollo (en especial la variacin en trmi
nos del periodo de vida y el ndice de recambio celular). Dos concep
tos muy contrastantes respecto a la funcin principal de la metilacin
del DNA en clulas animales son el tema de una gran controversia: el
m odelo d e defensa d el husped y el m odelo d e regulacin gnica.
ped considera que la funcin principal de la metilacin del DNA en

clulas animales es conferir una forma de proteccin del genoma, pe
ro en este caso mediante el control de la diseminacin de transposones
(Yoder y cois., 1997). Cerca de 45% de las secuencias de DNA en el ge
noma humano puede clasificarse como perteneciente a familias de
transposones y se sabe que una fraccin pequea de estas secuencias en
el genoma humano y en otros genomas sufre transposicin activa (sec
cin 9.5). Est demostrado que las familias de transposones en los ge
nomas humano y otros estn intensamente mediadas (se cree que
alrededor de 90% de las 5-metilcitosinas se localizan en familias de retrotransposones) y por consiguiente suele considerarse que la metila
cin del DNA es un mecanismo para reprimir esta transposicin, que
si no se controla cabra esperar que daara las clulas. No obstante, da
tos recin obtenidos de un cordado invertebrado, d o n a intestinalis, al
parecer no son compatibles con el modelo de defensa del genoma:
mltiples copias de un retrotransposn aparentemente activo y de una
fraccin grande de SINE muy repetidos eran de manera predominan
te no metilados, en tanto que, en contraste, al parecer los genes esta
ban metilados (Simmen y cois., 1996).
Defensa del husped como una funcin principal

para la metilacin del DNA
Regulacin gnica como principal funcin

de la metilacin del DNA
Como la funcin de restriccin y modificacin de la metilacin del

DNA en bacterias (vase recuadro 5.2), el modelo de defensa del hus
Por lo general se piensa que la metilacin del DNA en vertebrados

es un mecanismo de silenciamiento de la transcripcin y puede
298
CAPTULO DIEZ
O ocito
pl- *
Clulas som ticas

p pp^- Esperm atocitos
------- *1-------------- ---------------------------- h - H -------------1

"ôo
^ so"^ sp
3 4
Fig. 10-20. Los promotores especficos de sexo regulan el gen de metiltransferasa D nm tl.
Al parecer el gen de metiltransferasa D n m tl es la metiltransferasa de
DNA de sostn predominante en clulas de ratn y tambin puede ser
la principal metiltransferasa nueva. Se expresa altamente en clulas
germinales del varn, oocitos maduros y en el embrin temprano. Hay
cinco exones pero con una eleccin variable entre tres diferentes posi
bilidades para el exn 1 como resultado del uso de promotores alterna
tivos (de manera muy similar a las elecciones del promotor alternativo
para las diferentes isoformas de distrofina p427; vase fig. 10-14).
Son: exn 1 sq (que se utiliza en clulas somticas), exn 1 q (que se
emplea en oocitos) y exn 1sp (que se usa en esfiermatocitos). El
exn especfico de oocitos se relaciona con la produccin de cantida
des muy grandes de metiltransferasa Dm ntl activa, que est truncada
en la terminal N y permanece en el citoplasma durante las etapas ulte
riores del crecimiento. El exn especfico de espermatocitos interfiere
con la traduccin e impide la produccin de D m ntl durante el cruza
miento en la etapa de meiosis masculina. Vase Mertineit y cois. (1998).
constituir una posicin de abandono. Las secuencias de DNA con

actividad transcripcional no deben estar mediadas (cuando menos
en las regiones promotoras). Si bien la metilacin del DNA en in
vertebrados puede servir para reprimir los transposones y otras fami
lias de secuencia repetidas, tal vez adquiri una funcin especial en
vertebrados como un mecanismo para regular la expresin de genes
endgenos y reducir el ruido transcripcional (al silenciar una frac
cin grande de genes cuya actividad no es necesaria en una clula).
El argumento contrario es que el estado de metilacin de las re
giones 5' de genes especficos de tejido no puede correlacionarse
con la expresin en diferentes tejidos y la funcin de la metilacin
en la expresin gnica se da en funciones biolgicas especializadas
que resultan de mecanismos (p. ej., impronta, etc.) que utilizan ex
presin gnica especfica de alelo (Walsh y Bestor, 1999).
Metilacin del DNA y expresin gnica

El DNA de la cromatina con actividad transcripcional y sin ella di
fiere en varias caractersticas que incluyen el grado de compactacin y la extensin de su metilacin (vase cuadro 10-6). En tanto
que la metilacin de islotes CpG corriente abajo de promotores no

bloquea la transcripcin continua a travs de estas regiones (Jones,
1999), no hay duda que las regiones promotoras metiladas se co
rrelacionan con silenciamiento transcripcional. Adems la exten
sin de la acetilacin d e la histona es un factor importante (vase
tambin seccin 10.2.1). Acetiltransferasas de histona especficas
aaden grupos acetilo a residuos de lisina cerca de la terminal N de
protenas histona e inducen una conformacin de cromatina ms
abierta; la desacetilacin de la histona promueve la represin de la
expresin gnica.
Los procesos de metilacin del DNA y la modificacin de la
histona estn relacionados (vase Li, 2002). Se cree que la repre
sin de las secuencias CpG metiladas en las regiones promotoras
es mediada por protenas que se enlazan de manera especfica a
CpG metilados. Se identifican dos de estas protenas, MeCPl y
MeCP2 (protenas de enlace de CpG metiladas 1 y 2) y est de
mostrado que la ltima es esencial para el desarrollo embrionario
y como un represor de la transcripcin. La MeCP2 silencia la ex
presin gnica en parte por la incorporacin de actividad de
HDAC, que ocasiona la remodelacin de la cromatina. La elimina
cin del grupo acetilo de H3K9 (histona 3, residuo lisina 9) va segui
da de la metilacin de H3K9 ayudada por MeCP2, y la metilacin
de la histona resultante es una seal para incorporar protenas como
HP1 que conducen a que la cromatina se condense (vase Fuks y
cois., 2 0 0 2 , referencias en la misma y fig. 10 -21 ).
10.5
Control de largo alc a n c e de la

expresin y la im pronta gnicas
10.5.1 La estructura de la cromatina puede ejercer un

control en la expresin gnica de largo alcance
A diferencia de los genes bacterianos, los de eucariotas suelen trans
cribirse individualmente. De manera caracterstica, promotores y
elementos relacionados corriente arriba controlan la expresin de
un gen aislado con un punto de inicio de transcripcin localizado
dentro de 1 kb del elemento de control. Sin embargo, algunos ele
mentos de accin cis ejercen un control de largo alcance sobre una
regin cromosmica mucho ms grande y cada vez se cuenta con
ms evidencias de la regulacin coordinada de grupos gnicos.
Asimismo estudios en que los genes se recolocan en alguna otra
parte del genoma sugieren que los cromosomas estn organizados en
dominios funcionales de expresin gnica (dominios de cromatina),
tal vez como resultado de modificaciones d e la histona (vase seccin
10.2.1). Por ejemplo, cuando se transloca genes a nuevas regiones
Cuadro 10-6. Caractersticas relacionadas con cromatina transcripcionalmente activa e inactiva.

Caracterstica
Cromatina con actividad transcripcional
Cromatina sin actividad transcripcional
Estructura de la cromatina
Conformacin abierta, extendida
Conformacin muy condensada; en particular aparente en

la heterocromatina (tanto heterocromatina facultativa como
heterocromatina constitutiva)
Metilacin de DNA
Relativamente no metilada, en especial

en regiones promotoras
Metilada, inclusive en regiones promotoras
Acetilacin de histona
Histonas acetiladas
Histonas desacetiladas
10.5
CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIN Y LA IMPRONTA GNICAS
M e t iltr a n s fe r a s a
de DNA
M e C P 2 + S in
3 /d e s a c e t ila s a
d e h is to n a
M e tiltr a n s f e r a s a
d e lis in a
299
HP1 e tc te ra
C r o m a tin a a c tiv a
(c o n d e n s a d a )
C r o m a tin a
a c tiv a (a b ie rta )
Clave
Colaacetilo
Fig. 10-21. La mediacin del DNA puede mediar la represin transcripcional mediante desacetilacin de histona y metilacin de H3K9 de histona.
Los dinuclotidos CpG son blancos para metilacin del DNA y, a su vez, los CpG metilados lo son para el enlace especifico por protenas com o MeCP2.
Esta ltima acta como un represor transcripcional e incorpora un complejo correpresor que consiste en el represor del factor de transcripcin mSin3A
y desacetllasas de histona. MeCP2 tambin puede enlazar metiltransferasa de histona de tal manera que cuando H3K9 (la lisina en la posicin 9 en la
Droteina histona 3) se desacetila, despus se metila. H3K9 metilada es un blanco para protenas heterocromatinzantes com o HP1 que ocasionan que la
cromatina se condense e nactive transcrpconalmente (vase Fuks y cois., 2003).
cromosmicas (sea como resultado de fenmenos de rotura cromoomica espontneos o en experimentos de transgnesis), suele ocurrir
_ma expresin gnica aberrante, inclusive aunque el gen completo y
tas secuencias de control necesarias en sus secuencias de flanqueo in
mediatas se conserven intactos. Se piensa que los dominios cromosmicos vecinos estn separados por aisladores (llamados tambin
elementos lmite) que actan como barreras contra los efectos de intensificadores y silenciadores distales (vase Bell y cois., 2001).
Competencia por intensificadores o silenciadores

En ocasiones el control de largo alcance de la expresin gnica pa
rece depender de la competencia entre genes agrupados por un intensificador. Al parecer esto es una caracterstica de la expresin del
;;n de globina, como se describe en la seccin 10.5.2.
Efectos de la posicin inducidos por heterocromatina

Estudios de reordenamientos cromosmicos en Drosophila demos
traron que la proximidad con centrmeros, telmeros o bloques de
heterocromatina puede suprimir la expresin gnica, tal vez por al
teracin de la estructura de un dominio de cromatina grande (efec
tos de la posicin inducidos por heterocromatina). Aunque los
tipos de efecto d e la posicin similares an no se caracterizan bien en
el hombre, en estudios de puntos de rotura cromosmicos relacio-ados con enfermedades en humanos surgieron evidencias de efec
tos de largo alcance que controlan la expresin gnica en dominios
cromosmicos grandes. Los ejemplos son puntos de rotura cromosomicos que causan aniridia y displasia campomlica pero localiza
dos a varios cientos de kilobases del locus de enfermedad afectado,
PAlX6y SOX9 (vase Kleinjan y Van Heyningen, 1998).
Los sndromes de Prader-Willi y de Angelman (vase recuadro
16-6 ) portan juntos efectos de posicin, impfonta y metilacin del
DNA. Se identific una secuencia de accin cis anloga a la regin
de control del locus de globina que rige la metilacin especfica de
radre y la expresin gnica de una regin cromosmica de tamao
megabase 15ql 1 .
Inactivacin de X
Al parecer la inactivacin del cromosoma X en mamferos es inicia
da por un gen aislado, X1ST, que se expresa de manera nica en el
cromosoma X inactivado (seccin 10.5.6). Aunque este efecto no
se comprende, debe ser mediado por algn tipo de cambio estruc
tural de la cromatina de largo alcance. Es as porque un agente difu
sible mediado por X1ST no sera capaz de afectar slo el cromosoma
X en el que el gen XISTse expresa.
10.5.2 Una regin de control de locus comn puede

coordinar la expresin de genes individuales
en grupos gnicos
Algunos grupos gnicos humanos muestran pruebas de expresin
coordinada de genes individuales en el grupo. Por ejemplo, genes
individuales en la globina a , la globina (3 y los cuatro grupos
gnicos HOX se activan de manera secuencial en una secuencia
temporal que se corresponde con su orden lineal en el cromosoma. La
expresin especfica de etapa en los genes de globina se correlacio
na con localizaciones alternativas de la produccin de hemoglobi
na durante el desarrollo. Por tanto, temprano en el desarrollo
embrionario las hemoglobinas se elaboran en una membrana extraembrionaria, el saco vitelino, pero el hgado se constituye en el
principal sitio de sntesis en el feto antes de ceder su lugar a la m
dula sea en adultos. Esta progresin del desarrollo se acompaa de
genes de encendido y apagado en cada uno de los dos grupos prin
cipales de globina, que generan formas un poco diferentes de he
moglobina (cambio de hemoglobina; fig. 10 -22 ).
Se propuso que la expresin de los genes en grupos gnicos de
globina (y en algunos grupos de genes) es coordinada por una regin
de control de locus (RCL) que se localiza a cierta distancia corrien
te arriba del grupo gnico. Las RCL son regiones de control domi
nantes definidas por su capacidad en valoraciones transgnicas: la RCL
est acoplada a un gen de prueba o un grupo de genes que despus
se transfectan y se permite que se integren en otro genoma. Cuando
lo anterior sucede, la RCL puede dirigir la expresin de alto nivel de
300
CAPTULO DIEZ
Grupo
gnico de
globina a
Grupo
gnico de
globina
Expresin
embrionaria
(en el saco vitelino)
Cambio 1,
5 a 6 semanas
de gestacin
Expresin
fetal (en hgado)
Expresin
en adulto
(en mdula sea)
Cambio 2,
justo antes
de nacer
P(+S)
Fig. 10-22. Ocurre un cambio de la hemoglobina humana en dos eta

pas precisas del desarrollo.
los genes ligados en todos los sitios de integracin examinados (y en

niveles moderadamente constantes por copia gnica). En contraste,
cuando se unen intensificadores a genes y se estudian en la misma
forma de recorrido, el gen unido puede mostrar una expresin muy
variable segn el sitio de integracin y por tanto el intensificador es
t sometido a efectos de posicin negativos. Como resultado, las RCL
semejan intensificadores porque son capaces de activar la transcrip
cin, pero tambin tienen un efecto dominante porque pueden ven
cer seales de control negativas en el sitio de integracin.
Al parecer la expresin de alto nivel impulsada por una RCL en
un sitio ectpico (cualquier sitio distinto a su localizacin normal en
el genoma) es consecuencia de dos actividades separables: el esta
blecimiento de un dominio activo de cromatina abierto y la acti
vacin gnica directa. La conformacin abierta de dominios de
cromatina con actividad transcripcional los torna ms accesibles a
corte por la enzima DN-asa I. Un hecho compatible con esta rela
cin es que suele considerarse que la RCL de globina p humana
comprende secuencias cortas de cinco sitios mayores hipersensibles a DN-asa I que se encuentran en el DNA de clulas eritroides
(pero no en e l DNA de clulas que no expresan d e modo significativo
genes d e globina). Los sitios hipersensibles a DN-asa I estn agrupa
dos en una regin de 10 kb que se localiza alrededor de 50 a 60 kb
corriente arriba del gen de globina (3, en tanto que la RCL de glo
bina a se ubica en un sitio hipersensible a DN-asa especfica eritroide, HS-40, situado 60 kb corriente arriba del gen de globina a
( fig . 10-23A).
La secuencia de DNA en estos sitios hipersensibles a DN-asa I
semeja secuencias intensificadoras porque contiene un conjunto de
sitios de unin para factores de transcripcin tanto ubicuos como
especficos de tejido (vase fig. 10 -7 ).
Aunque otros sitios hipersensibles a DN-asa I se localizan en los
promotores de los genes de globina, muestran especificidad de eta
pa del desarrollo. Por ejemplo, en el hgado fetal los promotores de
los dos genes "y, los genes |3 y 8 , estn marcados por sitios hipersen
sibles a DN-asa I, pero en la mdula sea adulta los dos genes 7 ya
no poseen actividad transcripcional y sus promotores no muestran

ms sitios hipersensibles a DN-asa I. Se cree entonces que el cam
bio en la expresin del gen de globina especfico de la etapa del de
sarrollo ocurre por competencia entre los genes de globina para
interaccin con su RCL respectiva y activacin especfica de etapa
de elementos silenciadores especficos de gen. Por ejemplo, la trans
cripcin del gen de globina e (HBE1) es estimulada de modo preferencial por la RCL vecina en la etapa embrionaria. Sin embargo, en
el feto la expresin de globina e se suprime despus de la activacin
de un silenciador y la expresin de globina 7 se torna dominante
(fig. 10-23B).
Sin las RCL respectivas, la expresin del gen de globina es insig
nificante pero la naturaleza precisa del mecanismo de control an
no se comprende con claridad. Aunque los modelos iniciales con
sideraron que la formacin de un asa del DNA intermedio lleva
elementos de RCL en contacto fsico directo con promotores espe
cficos de los genes corriente abajo a fin de activarlos, en la actuali
dad las interacciones simples entre RCL y el promotor no parecen
probables (Bulger y Groudine, 1999). Es ms sorprendente an que
en tanto que la RCL de la globina (3 humana puede inducir la aber
tura de la cromatina en sitios ectpicos, al parecer no es capaz de
realizarlo cuando se encuentra en su localizacin original en el grupo
de globina (3, donde slo puede comportarse como un intensificador de
transcripcin simple (vase Bulger y cois., 2002). Este hecho, aunado
a la apreciacin reciente de diferencias de especie importantes, in
dica que este campo es muy fluido y se aconseja al lector interesa
do que consulte la bibliografa ms reciente.
10.5.3 Algunos genes humanos muestran expresin

selectiva de slo uno de los dos alelos parentales
Los genes ligados a X en mujeres y todos los genes autosmicos son
biallicos porque en condiciones normales tanto el padre como la
madre contribuyen con un alelo cada uno. En varones que poseen
un cromosoma X y uno Y, casi todos los genes ligados al sexo son
monoallicos-. la mayor parte de los mltiples genes en X no tiene un
homlogo funcional en el cromosoma Y y se sabe que algunos de los
pocos genes del cromosoma Y son especficos de Y, como SRY, el
principal locus determinante del sexo masculino (sin embargo, se
conocen unos cuantos casos en los que se encuentran homlogos gnicos funcionales en los cromosomas X e Y; seccin 12.2.8).
Por costumbre se asume que se expresan tanto los alelos paterno
como materno de genes biallicos, a menos que una o ambas copias
hayan tenido una mutacin que afecta la expresin. Es claro que la
expresin puede ser especfica de tejido y tipo celular, pero no suele
observarse una diferencia intrnseca entre las capacidades funciona
les de los dos alelos. Sin embargo, en humanos y otros mamferos se
conocen varios genes biallicos en los que la expresin de un alelo
parental, sea el paterno o el materno, pero no ambos, est reprimi
da normalmente en ciertas clulas (lo que constituye la forma de ex
clusin allica). En estas clulas se dice que el gen importante
muestra hemicigosidad funcional: slo una mitad del producto gnico mximo se obtiene normalmente incluso aunque las secuencias
de ambos alelos parentales sean compatibles a la perfeccin con la expre
sin gnica normal y aun idnticas. En algunos casos la exclusin al
lica puede ser una propiedad de clulas o tejidos seleccionados, en
tanto que en otras clulas del mismo individuo suelen expresarse
con normalidad ambos alelos.
10.5
10
A)
CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIN Y LA IMPRONTA GN1CAS
20
30
40
HS-40
V 51 V a2 V a l
-------------------RCL
HS4
50
HS3
HS2
Gy
Ay
60
70
301
kb
Grupo de
g lob ina a
vP
Grupo de
globina p
Y
RCL
Fig. 10-23. La expresin gnica en los grupos del gen de globina y p puede controlarse mediante regiones de control de locus comunes.
A) Organizacin de los grupos del gen de globina a y p. Las regiones de control de locus (RCL) consisten en uno o ms sitios hipersensibles a
DN-asa I especficos eritroides (HS-40, etc.) localizados corriente arriba del grupo. Las flechas indican la direccin de la transcripcin de los genes ex
presados. El estado funcional del gen de globina theta es incierto: se expresa, pero la globina e no se incorpora en ninguna molcula de hemoglobina.
B) Regulacin propuesta de la expresin gnica por la RCL de globina fi. Las flechas de color rojo fuerte indican un intensificador potente por la
RCL en los genes indicados, lo que resulta en un nivel de expresin alto; las flechas rojas punteadas indican efectos correspondientemente dbiles.
Este modelo es motivo de cierta controversia; vase texto.
Aunque al principio se consider una rareza, la expresin monoallica de genes biallicos se demuestra en un nmero cada vez
mayor de genes humanos. Es posible que participen una diversidad
de mecanismos de expresin distintos as como dos clases amplias
de mecanismos (vase Chess, 1998; Ohlsson y cois., 1998):
exclusin allica segn e l p a d re d e origen (impronta). En algu
nos casos la eleccin de cul de las dos copias heredadas se expre
sa no es aleatoria. Esto significa que para algunos genes el alelo
cuya expresin se reprime siempre es el de herencia paterna; en
otros siempre es el alelo de herencia materna (seccin 10.5.4);
exclusin allica in dep en d ien te d el p a d re d e origen. En este ca
so la decisin en cuanto al alelo que se reprime de ambos al
principio es aleatoria, pero ms adelante ese patrn de exclu
sin allica se transmite de manera estable a las clulas hijas
despus de la divisin celular. Puede participar una diversidad
de mecanismos (recuadro 10-4).
10.5.4 La impronta genmica incluye diferencias en la

expresin de alelos segn el padre de origen
Varias observaciones en mamferos sugirieron que los genomas ma
terno y paterno de un individuo no son equivalentes (recuadro
10-5). Aunadas a las diferencias genticas entre el DNA del genoma del espermatozoo y el genoma del oocito, se observan diferen
cias epigenticas. Una distincin importante en ambos es la
cantidad total de metilacin del DNA (el genoma del espermato
zoo est metilado de modo ms extenso que el genoma del oocito)
y el patrn de metilacin del DNA en clases especficas de secuen
cias del DNA. Por ejemplo, la secuencia LINE1 est muy metilada
en espermatozoos, pero slo en parte en el oocito (vase Razin y
Kafri, 1994; Yoder y cois., 1997). Algunos locus gnicos individua
les presentan tambin diferencias importantes entre la extensin de
la metilacin de alelos paternos y maternos. Por ejemplo, el alelo
paterno del gen H 19est intensamente metilado; el alelo materno
est submetilado.
Como lo sugieren las observaciones del recuadro 10-5, las dife
rencias entre los genomas paterno y materno dan lugar a variacio
nes en la expresin entre los alelos paterno y materno. La impronta
genmica (tambin llamada impronta gam tica o parental) en ma
mferos describe la situacin en que no hay equivalencia en la ex
presin de alelos en ciertos locus gnicos, segn el padre de origen
(Reik y cois., 2001; Sleutels y Barlow, 2002). En todos (o al menos
algunos) los tejidos en que se expresa el gen, la expresin del alelo
de herencia paterna o el alelo de herencia materna est reprimida
en forma consistente, lo que resulta en una expresin monoallica.
302 1 CAPTULO DIEZ
Recuadro 10-4. Mecanismos que dan por resultado expresin monoallica a partir de genes biallicos en
clulas humanas
M e c a n is m o
E je m p lo s d e g e n e s im p o rta n te s y lo c a liz a c i n c e lu la r d e la e x p re s i n m o n o a l lic a
A. Exclusin allica segn e l padre de origen

Im p ro n ta g e n m ic a
U n n m e ro p e q u e o de g e n e s (v a s e L e c tu ra s a d ic io n a le s p a ra d e ta lle s de l Im p rin te d
G ene C a ta lo g u e , C a t lo g o de g e n e s im p ro n to s ). A u n q u e la s lo c a liz a c io n e s c e lu la re s d e
p e n d e n d e l s itio en q u e se e x p re s e u n ge n in d iv id u a l, c a b e s e a la r q u e a lg u n o s g e n e s im
p ro n to s m u e s tra n e x p re s i n m o n o a l lic a en c ie rto s tip o s c e lu la re s , p e ro b ia l lic a e n o tro s
(c u a d ro 1 0 -7 )
B. Exclusin allica aleatoria (independiente d e l padre de origen)

E x c lu s i n a l lic a p o r
in a c tiv a c i n d e X
L im ita d o a c ie rto s g e n e s lig a d o s a X s lo e n m u je re s . E x p re s i n del a le lo de l c ro m o s o m a

X n o in a c tiv a d o s lo en la s c lu la s en q u e s e e x p re s a n g e n e s (s e c c i n 1 0 .5 .6 ).
E x c lu s i n a l lic a d e s p u s de l
re o rd e n a m ie n to p ro g ra m a d o
de l D N A
E x p re s i n d e l g e n d e in m u n o g lo b u lin a en lin fo c ito s B; e x p re s i n de l g e n re c e p to r d e c lu la

T en lin fo c ito s T (s e c c i n 1 0 .6 .3 )
E x c lu s i n a l lic a p o r m e c a n is m o s
d e s c o n o c id o s
G e n e s de l re c e p to r o lfa to rio en n e u ro n a s ; g e n e s de l re c e p to r de c lu la N K, c ie rto s g e n e s

d e in te rle u c in a (112, IL 4 )\ X IS T (en c lu la s d e l e m b ri n fe m e n in o te m p ra n o ); PA X 5 (e n c
lu la s B m a d u ra s y p ro g e n ito re s te m p ra n o s )
Recuadro 10-5. Falta de equivalencia de los genomas materno y paterno

Adems de la diferencia obvia de los cromosomas del sexo X/Y, la falta de
equivalencia (no equivalencia) entre autosomas que se heredan en forma
paterna y materna y los cromosomas X est indicada por las observacio
nes que se listan en seguida:
DIPLOIDA UNIPARENTAL INDUCIDA POR MEDIOS EXPERIMENTALES
EN RATONES
Es posible extraer el proncleo masculino de un oocito de ratn fecunda
do y reemplazarlo por un segundo proncleo femenino a fin de generar un
ginogenote (en ocasiones denominado parlenoqenote todos los 38 cro
mosomas son de origen materno). Si, por el contrario, el proncleo feme
nino se reemplazara por un segundo proncleo masculino se formara un
androgenote. A pesar de tener cromosomas diploides normales, estos
embriones no se desarrollan y mueren antes de mediados de la gestacin.
Los ginogenotes muestran varias deficiencias en estructuras extraembrionarias pero un embrin hasta cierto punto normal; en contraste, en androgenotes el embrin est afectado con mayor gravedad que las estructuras
extraembrionarias (vase Bestor, 1998 para referencias).
DIPLOIDA UNIPARENTAL QUE OCURRE DE MANERA NATURAL
EN HUMANOS (vase tambin seccin 2.5.4)
Los conceptus uniparentales humanos no son raros. Los conceptus androgenticos se desarrollan como molas hida tidilo rm es que consisten
en masas de vellosidades corinicas y otras estructuras de la placenta hi
drpicas, pero carecen de tejidos embrionarios. Los conceptus ginogenticos originan quistes dermoides que se desarrollan hacia teratom as d e l
ovario, consistentes en una masa de tejidos adultos bien diferenciados
pero desorganizados que suele incluir huesos, diente, cartlago, piel y
otros tejidos pero casi siempre carece de cualquier estructura extraembrionaria.
Puede considerarse que los abortos triploides representan una combina
cin de un genoma diploide heredado de un padre y un genoma haploide
normal del otro. El fenotipo es diferente segn el padre que contribuye al

genoma diploide.
DISOMA UNIPARENTAL (vase tambin seccin 2.5.4)
Algunos conceptus tienen un cariotipo normal 46,XX o 46,XY pero es po
sible que hayan heredado dos copias del mism o cromosoma de slo uno
de los dos padres. El resultado pueden ser fenotipos anormales que difie
ren segn el origen parental del cromosoma importante. Por ejemplo, in
dividuos 46,XX o 46,XY que heredan ambas copias del cromosoma 15 de
su padre desarrollan el sndrome de Angelman; si ambas copias del cro
mosoma 15 son de herencia materna, producen el sndrome de PraderWilli (vase recuadro 16-6).
LAS MUTACIONES SUBCROMOSMICAS CAUSAN FENOTIPOS
ANORMALES DIFERENCIALES SEGN EL PADRE DE ORIGEN
La delecin de ciertas regiones cromosmicas produce un fenotipo
diferente cuando ocurre en el cromosoma materno o paterno. El me
jor ejemplo es la delecin de 15q12, que en el cromosoma paterno
produce sndrome de Prader-Willi y en el cromosoma materno causa
sndrome de Angelman (vase recuadro 16-6).
Ciertos caracteres humanos son autosm icos dominantes pero
slo se m anifiestan cuando se heredan de un padre. Aunque en al
gunas fam ilias los tum ores glm icos se heredan con carcter autosm ico dominante, slo se expresan en personas que heredan el
gen de su padre. El sndrome de Beckwth-W iedemann (MIM
130650) a veces es dominante pero slo lo expresan quienes lo
heredan de su madre. Las figuras 4-5D y 4-5E muestran ejemplos
de genealogas.
La prdida de alelos en muchos cnceres (cap. 17) incluye de prefe
rencia el alelo paterno.
10.5 | CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIN Y LA IMPRONTA GNICAS
El mismo patrn de expresin monoallica puede transmitirse con

fidelidad a las clulas hijas despus de la divisin celular. Sin em
bargo, como la secuencia nucletida del alelo cuya expresin est
reprimida puede ser compatible con la expresin gnica (y aun ser
idntica a la del alelo expresado), ste es un fenmeno epigentico
y no gentico.
Prevalencia y evolucin de la impronta

La mayor parte de los genes humanos no est sujeta a impronta; de
otra manera no se veran tantos caracteres mendelianos simples. Se
realizaron encuestas sistemticas a fin de identificar las regiones
cromosmicas improntas en el ratn. A diferencia de los humanos,
todos los cromosomas del ratn son acrocntricos y es posible que
translocaciones robertsonianas permitan que ocurran cruzamientos
que producen descendencia con ambas copias de un cromosoma
particular derivado de un solo padre (disom a uniparental, DUP;
seccin 2.5.4). Esto revela que la DUP de ciertos cromosomas no
tiene efecto fenotpico; en otros produce fenotipos anormales. En
ocasiones los fenotipos anormales son complementarios para dife
rentes orgenes parentales, por ejemplo, con frecuencia se observa
crecimiento excesivo en la DUP materna y retraso del crecimiento
en la DUP paterna. Para algunos cromosomas la DUP es letal.
La diseccin ms amplia a nivel cromosmico y gentico mues
tra que la impronta es una propiedad de un nmero limitado de
genes individuales o de regiones cromosmicas pequeas. Ahora
se sabe que casi 60 genes son improntos en humanos y ratones,
inclusive genes que especifican polipptidos y genes codificadores
de RNA no codificante funcional (vase Tycko y Morrison,
2002). Las funciones fisiolgicas conocidas de estos genes pueden
mostrar una variacin considerable, pero las evidencias indican
que un nmero considerable de genes controla el crecimiento y
los caracteres neuroconductuales. Se conocen dos grupos mayores
de genes improntos en el genoma humano: una regin de 1 Mb
en 11 p 15.5 (que comprende la regin del sndrome de BeckwithWiedeman) que contiene cuando menos ocho genes improntos
vase Maher y Reik, 2002), y un grupo de 2.2 Mb en la regin
15ql 1-ql3 (que abarca las regiones de los sndromes de PraderWilli y Angelman) que alberga ms de 10 genes improntos (Me
suro y col., 2001; fig. 10-24).
La gran mayora de los genes improntos conocidos es autosmica. No obstante, el gen XIST que tiene una funcin importan
te en el establecimiento de la inactivacin del cromosoma X (vase
sccin siguiente) puede considerarse un ejemplo de un gen im
pronto ligado a X ya que la expresin del alelo de herencia mater
na se reprime de manera preferencial en el trofoblasto. Asimismo
ratrones diferenciales de conducta en el sndrome de Turner sugie
ren un gen impronto ligado a X que afecta la funcin cognosciti
va. Las nias con sndrome de Turner carecen de un cromosoma Y
z-ero tienen slo un cromosoma X. Si este ltimo se hereda de la
madre, es usual una conducta social disruptiva; si se hereda del pa
ire, la nia muestra una conducta ms cercana a la normal (Skui y cois., 1997).
Se sabe que ocurre impronta en plantas de semillas, algunos in
sectos y mamferos. A juzgar por el fenotipo, no se observa un
erecto mayor de la impronta en algunos organismos modelo como
Drosophila, C. elegans y el pez cebra, aunque puede existir la posi
303
bilidad de impronta en Drosophila. Los mamferos son raros en la

forma en que los embriones dependen por completo del flujo de
nutrimentos de la placenta materna. Ya que en la regulacin del
crecimiento fetal participan muchos genes improntos, una expli
cacin considera un conflicto del genoma parental: el genoma pa
terno se propaga por s mismo mejor mediante la creacin de un
embrin que extrae de modo agresivo nutrimentos de la madre; el
genoma materno suprime lo anterior para proteger a la madre y
guardar ciertos recursos para la descendencia futura. Como se ob
serva en los casos de diploida uniparental (vase recuadro 10-5),
los genes paternos se expresan de preferencia en el trofoblasto y las
membranas extraembrionarias, en tanto que los genes maternos lo
hacen en el embrin.
10.5.5 El mecanismo de la impronta genmica no est

claro pero la metilacin del DNA parece ser un
componente fundamental
Para confirmar la impronta de un gen es necesario identificar a un
individuo que es heterocigoto para una secuencia variable presente
en el mRNA maduro; a continuacin el mRNA de diferentes teji
dos puede controlarse para expresin monoallica o biallica y de
terminarse el origen de cada alelo al tipificar a los padres. En ciertos
genes este tipo de anlisis demostr que la impronta se limita slo
a ciertos tejidos o algunas etapas del desarrollo (vase cuadro 10-7).
Por consiguiente la impronta permite un nivel extra de control de
la expresin gnica, pero su funcionamiento no puede reducirse a
una historia uniforme simple.
Suele encontrarse que los genes improntos estn organizados en
grupos gnicos, que alojan elementos de control de la impronta,
elementos reguladores de accin cis que actan en distancias largas.
Dentro de uno de estos grupos aislados es usual encontrar ciertos
genes que muestran expresin preferencial paterna en estrecha pro
ximidad con otros que muestran expresin preferencial materna
(vase fig. 10-24 para ejemplos). Los elementos mayores de control
de la impronta estn restringidos a regiones de DNA pequeas que
se conocen como centros de impronta. En el caso de la regin del
sndrome de Prader-Willi (PWS)/sndrome de Angelman (AS) en
15ql 1-ql 3 se defini un centro de improntacin corriente arriba
del extremo 5' del gen SNURF-SNRPN y extendindose hacia el
mismo. Posee dos elementos de control de la impronta: el elemen
to PWS-SRO en el promotor y el extremo 5 de SNURF-SNRPN,
que tiene a su cargo el establecimiento y la conservacin de la im
pronta paterna, y el elemento ylS-SiO localizado cerca de 35 kb
corriente arriba de SNURF-SNRPN, que se encarga de la impron
ta materna (vase Perk y cois., 2002).
Asimismo los grupos gnicos improntos suelen contener genes
que especifican RNA no traducido cuya expresin a menudo se co
rrelaciona con represin de genes cercanos codificadores de poli
pptidos. El grupo PWS/AS proporciona muchos ejemplos, pero se
conocen otros, como el gen H19 en 1 1p 15.5. Aunque las funcio
nes de genes RNA improntos cercanos a genes improntos codifica
dores de polipptidos se desconocen de manera general, se espera
que sean reguladoras y se cuenta con evidencias directas cuando
menos en un caso: se demostr que el gen del ratn Air regula el
Igf2r impronto (gen receptor del factor II de crecimiento tipo in
sulina; vase Rougeulle y Heard, 2002; Sleutels y col., 2002).
304
CAPTULO DIEZ
||
G e n R N A e x p re s a d o
p a te rn a m e n te
11 E xpresado patern am ente
mu il
iil
Cl
II
E xpresado m aternam ente
E xpresado M lic a m e n te
II
P W S -S R O
I I A S -S R O
I____
A
U n id a d d e tr a n s c r ip c i n S N U R F -S N R P N e x te n d id a
>
HBII-52
um L
$
$
li ni i nu 111 r
UBE3A
Cl
Fig. 10-24. Grupo del gen impronto en 15q11-q13 relacionado con el sndrome de Prader-Willi/sndrome de Angelman.
Las flechas muestran la direccin de la transcripcin. Los genes improntos que codifican polipptidos incluyen UBE3A y ATP10C, que se expresan de
manera preferencial del cromosoma 15 materno, y MKRN3, NDN y MAGEL2, que se expresan de manera preferencial del cromosoma 15 paterno. Ade
ms la unidad de transcripcin compleja SNURF/SNRPN (> 148 exones; y se extiende ms de 460 kb para superponerse en el gen UBE3A y quizs en
el gen ATP10C) es impronta. Codifica dos protenas (la protena SNURF, codificada por los exones 1 a 3, y la protena espliceosmica SNRPN codificada
por los exones 4-10) as com o ciertos transcritos de RNA (no se muestran aqu, pero en la bibliografa se conocen com o IPW, PAR5, UBE3AS, etc.) y
puede regular los genes UBE3A y ATP10C como un regulador RNA antisentido. Aunado a esta complejidad se localiza un total de 79 secuencias snoRNA
dentro de los intrones de la unidad de transcripcin SNURF/SNRPN, que comprende una copia de cada uno de HBII-436, HBII-13, HBII-437 (un probable
seudogn), dos copias idnticas pero separadas de HBII-438, 27 copias de HBII-85 y 47 copias de HBII-52 (se muestran como lneas verticales gran
des comparadas con las lneas verticales pequeas para los exones SNURF/SNRPN; vase Runte y cois., 2001). Casi todas estas copias (excepto HBII437) se expresan paternamente, en especial en el cerebro, y pueden tener un efecto directo en el sndrome de Prader-Wili (Gallagher y cois., 2002). Cl,
centro de improntacin. Adaptado de Runte y cois. (2001) Hum. Mol. Genet. 10 (23): 2687-2700, con autorizacin de Oxford Universty Press.
Las observaciones anteriores sugieren que debe disponerse de

algn mecanismo para diferenciar entre alelos heredados de la ma
dre y el padre: conforme los cromosomas pasan a travs de las l
neas germinales masculina y femenina deben adquirir cierta
impronta para sealar una diferencia entre alelos paternos y mater
nos en el organismo en desarrollo. Un componente fundamental,
cuando menos para conservar el estado impronto, es la mediacin

del DNA especfica de alelo: todos los genes improntos se caracte
rizan por regiones con abundancia de CG de metilacin diferencial
y est demostrado que la impronta de varios genes improntos est
alterada en el ratn mutante deficiente en el gen de metiltransferasa de citosina D nm tl, la principal metilasa de sostn.
Cuadro 10-7. Ejemplos de la regulacin de tejidos y la etapa del desarrollo de genes improntos en mamferos.
Gen
A lelo reprim ido
D iferen cias en los patrones de expresin
IGF2 (factor de crecimiento 2 similar a insulina)
Materno
Impronto en muchos tejidos pero expresin biallica en cerebro, hgado

adulto, condrocitos, etctera
PEG1/MEST
Materno
Impronto en el tejido fetal pero expresado de manera biallica en sangre

de adultos
UBE3A (ligasa 3 de protena ubquitina)
Paterno
Impronto slo en cerebro; expresado biallcamente en otros tejidos
KvLOTl (canal de potasio)
Paterno
Impronto en varios tejidos pero expresado en forma biallica en el corazn
WT1 (gen de tumor de Wilms)
Paterno
Con frecuencia impronto en clulas de placenta y cerebro pero expresin

biallica en rin
10.5
CONTROL DE LARGO ALCANCE DE LA EXPRESIN Y LA IMPRONTA GNICAS
Se sabe que, intrigantemente, D nm tl tiene exones especficos

z t sexo (seccin 10.4.2; fig. 10-20). En oocitos esto da lugar a un
producto protenico truncado de terminal N especfico de oocito,
q _ie podra metilar de manera especfica los alelos maternos de ge
nes como el receptor del factor II de crecimiento similar a insulina.
El exn de D nm tl especfico de espermatocito interfiere con la tra
duccin del mRNA de D nm tl y la forma en que podran adquirir
se los patrones de metilacin especficos paternos es menos clara.
Cabra esperar que durante el desarrollo la impronta se heredara de
manera estable cuando menos durante muchas rondas de duplica
cin del DNA (pero vase ms adelante). Es claro que debe existir
tambin un mecanismo para borrar las improntas durante la lnea
jerminal, que se requieren cuando, por ejemplo, un varn transmi
te un alelo que hered de su madre (vase fig. 10-25). Una forma
en que lo anterior podra lograrse es la desmetilacin que ocurre en
ei embrin temprano y que deja las clulas germinales primordia
les en esencia desmetiladas (vase fig. 10-19).
10.5.6 La inactivacin del cromosoma X en mamferos

comprende la represin de la expresin gnica
de accin c/s de muy largo alcance
Naturaleza de la inactivacin del cromosoma X
La inactivacin del cromosoma X es un proceso que ocurre en to
dos los mamferos y resulta de la inactivacin selectiva de alelos en
uno de los dos cromosomas X en mujeres (Lyon, 1999). Constituve un mecanismo de compensacin de dosis que supera diferencias
305
de sexo en la relacin esperada de la dosis de genes autosmicos (A)

con la dosis de genes del cromosoma X Los varones con un cro
mosoma X tienen un alelo slo para genes ligados a X y por tanto
son constitucionalm ente hem icigotos para los genes ligados a X En
consecuencia hay una diferencia de sexo en la relacin de la dosis
gnica A:X (2:1 en varones pero 1:1 en mujeres). Las relaciones de
dosis son importantes porque los productos de los genes ligados a
X deben interactuar con los productos de genes autosmicos en
una diversidad de vas metablicas y del desarrollo importantes, y
las cantidades de producto para gen es sensibles a dosis fundamenta
les estn bajo regulacin estrecha.
Para contrarrestar la diferencia de sexo en la dosis gnica A:X, las
clulas de la mayor parte de los mamferos femeninos experimentan
un ajuste compensador: uno de los dos cromosomas X parentales se
inactiva. La inactivacin de X comprende la modificacin de la es
tructura de la cromatina que produce una estructura heterocromatinizada, condensada, el corpsculo d e B arr (que puede verse a lo largo
de la parte inferior de la envoltura nuclear en clulas femeninas). Ca
si todos los genes del cromosoma X inactivado estn sometidos a al
gn mecanismo que conduce a que se tornen transcripcionalmente
inactivos. Por consiguiente, mediante la inactivacin de uno de los
dos cromosomas X parentales, los mamferos hembra se convierten
en hem icigotos fu n cion ales para la mayor parte de los genes ligados a
X. No todos los genes se inactivan en el cromosoma X inactivado; los
pocos que escapan a la inactivacin de X abarcan los que tienen un
homlogo funcional en el cromosoma Y y algunos genes en los que
la dosis gnica no parece importante (vase seccin 12.2.8 para ejem
plos de genes que escapan a la inactivacin de X).
! Gametos;
Clulas somticas
especfica de sexo
Fig. 10-25. La mprontacin genomica (gamtca) requiere el borramiento de la impronta en la lnea germinal.
El diagrama ilustra el destino de un cromosoma que lleva dos genes, A y B, que se someten a mprontacin: A est im pronto en la lnea germinal feme
nina, B lo est en la lnea germinal masculina, como se indica con asteriscos. Como resultado, en clulas somticas diploides A se impronta cuando se
presenta en un cromosoma heredado de la madre y B se impronta cuando se encuentra en un cromosoma heredado del padre. Un cromosoma indivi
dual puede pasar a travs de las lneas germinales masculina y femenina en generaciones sucesivas: un varn puede transm itir un cromosoma hereda
do de su madre y una mujer, un cromosoma heredado de su padre, como lo indican los gametos en el dibujo de la derecha. Como resultado, debe
haber un mecanismo por el que la impronta antigua se borra de la lnea germinal antes de establecer una nueva mprontacin especfica de sexo.
306
CAPTULO DIEZ
Programacin de la inactivacin del cromosoma X

Aunque en etapas muy tempranas del desarrollo ambos cromoso
mas X son activos, la inactivacin de X inicia conforme las clulas
comienzan a diferenciarse de los linajes totipotente y pluripotente,
lo que ocurre en la etapa tarda de blstula en ratones y con mucha
probabilidad tambin en humanos. En cada clula que da lugar al
feto femenino se elige para la inactivacin uno de los dos cromoso
mas X parentales, pero la decisin para inactivar el cromosoma X
de herencia paterna (XP) o el X materno (Xm) suele ser aleatoria y
por consiguiente vara de clula a clula [nota: las clulas trofoblsticas y los mamferos marsupiales son distintos: el cromosoma XP
se inactiva de manera preferencial, un ejemplo de impronta restrin
gida a tejido, y en individuos con una translocacin X:autosoma el
resultado final es que el cromosoma X normal se inactiva en forma
consistente]. Es necesario borrar el patrn de inactivacin de X de
generacin en generacin y se sabe que, quiz como parte de este
mecanismo, el cromosoma X se inactiva de modo pasajero tanto en
varones como en mujeres durante la gametognesis.
Una vez que una clula progenitora en el embrin temprano se
comprometi a inactivar el cromosoma XP o el Xm, el patrn de
inactivacin muestra herencia clonal: todos los descendientes de la
clula dentro del linaje celular resultante llevan el mismo patrn de
inactivacin de X que la clula progenitora (vase fig. 10-26A). Es
to significa que todos los mamferos hembra son mosaicos y compren
den mezclas de lneas celulares en las que se inactiva X paterno y
lneas celulares en las que se inactiva X heredado de la madre. El pa
trn de color del pelaje en mosaico del gato calic (fig. 10-26B)
ilustra lo anterior.
Mecanismo de inactivacin del cromosoma X

El proceso de inactivacin del cromosoma X es complejo y en el
inicio de la inactivacin y en el mantenimiento de la misma parti
cipan mecanismos moleculares precisos (vase Avner y Heard,
2001; Brockdorff, 2002). Dos elementos de accin cis importantes
se definieron en trminos genticos:
el centro de inactivacin de X (Xic), que controla el inicio y la
propagacin de la inactivacin de X. La presencia de Xic es
esencial para la inactivacin de X: un cromosoma X que lleva
Xic puede experimentar inactivacin, pero no uno que carece
del mismo. Xic tambin es importante para contar cromoso
mas. En individuos raros con un nmero anormal de cromo
somas X (45,X; 47,XXX; 47.XXY, etc.), un cromosoma X
permanece activo sin importar qu tantos de ellos existan. En
contraste, en individuos triploides cualquiera de los cromoso
mas X o ambos permanece activo y los dos cromosomas X si
guen activos en tetraploides. Cierto tipo de mecanismo de
conteo asegura que un cromosoma X permanezca activo por ca
da dos grupos de autosomas. La funcin de Xic depende de un
XIST, un gen que especifica un RNA funcional no codificante
(vase ms adelante), pero si bien XIST (Xist) es esencial para
iniciar la inactivacin del cromosoma X, no se requiere para
conservar A estado de inactivacin;
el elemento de control de X (Xce), que afecta la eleccin del
cromosoma X que permanece activo y del inactivo. Es posible
que ocurra un sesgo de inactivacin de X (del 50:50 normal de
X inactivo con el activo) en mujeres heterocigotas para alelos
Xce (es ms probable que un cromosoma X con un alelo Xce

potente sea activo que uno con un alelo Xce dbil). Xce es dis
tinto de Xic y de XIST y de mapas telomricos a ellos, pero la
base molecular an no se aclara.
Despus que el centro de inactivacin de X se mape en Xql3 hu
mano, anlisis de esta regin descubrieron un gen extraordinario:
XIST (llamado Xist en roedores). XIST muestra expresin monoa
llica y se expresa de manera nica del cromosoma X inactivo. Su
transcrito primario experimenta empalme y poliadenilacin para
generar un RNA no codificante maduro de 17 kb. Al parecer es la
principal seal para diseminar el estado de inactividad transcripcio
nal a lo largo del cromosoma X del que se sintetiza, y de alguna ma
nera la diseminacin de este producto RNA limitada por cis acta
para cubrir el cromosoma X inactivado en distancias muy largas. Se
piensa que el RNA incorpora despus algunos factores protenicos
que organizan la cromatina en una conformacin de inactividad
transcripcional cerrada (Brockdorff, 2002).
Otro gen extraordinario, TSIX (llamado TsiX en roedores) tie
ne una unidad de transcripcin que se superpone en la totalidad del
gen XIST, pero en la cadena antisentido. Este gen compaero se ex
presa en clulas madre embrionarias no diferenciadas y en embrio
nes tempranos, y se propuso que controla la expresin de XIST en
cis al inicio de la inactivacin de X (vase Avner y Heard, 2001;
Brockdorff, 2002).
10.6
Organizacin y expresin nicas

de genes de Ig y RCT
Como se muestra en la figura 9-10, los receptores de inmunoglobulinas (Ig) y los receptores de clula T (RCT) son heterodmeros.
Las clulas humanas contienen tres genes de Ig: uno, IGH, especi
fica la cadena pesada y dos, IGK e IGL, codifican cadenas ligeras
alternativas kappa ( k ) y lambda (\) respectivamente. Los cuatro ge
nes de RCT humanos codifican, de manera respectiva, las cuatro
variedades diferentes de cadena del RCT: a y |3 que forman el heterodmero comn a(3, ms "y y 5 que forman el heterodmero ms
raro 7 8 .
La organizacin y la expresin de estos siete genes difieren en
muchas formas de las de otros genes. Ello se debe a que cada per
sona necesita producir un nmero enorme (del orden de unos 2.5
X 10 variedades diferentes) de Ig y RCT elaborados por linfocitos
B y T respectivamente. Estas clulas son los principales agentes del
sistem a inm unitario d e adaptacin y necesitan reconocer una miriada de antgenos extraos y en consecuencia ser capaces de mon
tar una defensa contra un gran nmero de patgenos distintos. Sin
embargo, una clula B o T individual es monoespecfica: slo pro
duce un tipo de heterodmero Ig o RCT con un sitio de unin de antgeno nico y por tanto es especfica para un antgeno particular. La
poblacin de diferentes clulas B y T en cualquier individuo posibi
lita la sntesis de tantos tipos diferentes de estas molculas. Al pro
porcionar un repertorio grande de Ig y RCT, las posibilidades de
ser capaz de reconocer y enlazar muchos tipos diferentes de antge
no extrao aumentan de modo considerable.
Los genes de Ig y RCT en la mayor parte de las clulas son inac
tivos pero ocurre una mezcla extraordinaria de estos genes en clu
las B y T respectivamente a fin de activarlos. Cuando esto sucede,
se crean nuevas combinaciones codificantes que permiten que un
10.6 i ORGANIZACIN Y EXPRESIN NICAS DE GENES DE IG Y RCT
A)
30"
Oogonia
Espermatogonia
Cigoto
te m pra no
/
/\
/\
/ \ / \ / \ / \
(J )
<X>
Ejemplo de X
paterno inactivado
/
B la sto cisto
tardo
Ejemplo de X
materno inactivado
/\
/\
/\/\/\/\
/\/\/\/\
Todas las clulas

descendientes tienen X
paterno inactivado
(inactivacin estable)
Todas las clulas

descendientes tienen X
materno inactivado
(inactivacin estable)
La inactivacin aleatoria
de X materno o paterno en
diferentes clulas da por
resultado mosalcismo
Fig. 10-26. Inactivacin del cromosoma X en mamferos.

A) Proceso de inactivacin de X. Los dos cromosomas X son activos
B)
en el cigoto femenino XX temprano, pero alrededor de la ltima etapa

del blastocisto se realiza una eleccin aleatoria en cada clula a fin de
inactivar X paterno o materno. La eleccin que toma una clula se pre
serva en todos sus descendientes. Una mujer XX adulta tiene poblacio
nes clnales de clulas con X paterno o materno inactivados. X
inactivo se reactiva en oocitos un tiempo antes de la meiosis. Durante
la espermatognesis se inactivan en forma pasajera tanto el crom oso
ma X como el Y. Adaptado de Migeon (1994) Trends Genet. 10, 230235, con autorizacin de Elsevier Trends Journals. B) Gato calic
(iconcha de tortuga y blanco). Este gato (que siempre es hembra) tie
ne un cromosoma X con un gen para el color del pelaje negro y otro
cromosoma X con un gen que especifica el color del pelaje naranja.
Resultan placas de pelambre de diferentes colores a causa de la inacti
vacin clonal de X. Las placas de pelambre blanco se deben a un gen
separado.
individuo aislado produzca una variedad extraordinaria de Ig y

RCT. En vertebrados se aplican cuatro mecanismos de mezclado de
DNA principales:
recom binacin d e VDJ o V], un m ecanism o disem inado. Las
regiones variables tanto de Ig como de RCT son especificadas
por dos o tres tipos de segmentos gnicos, siempre un segmen
to gnico V (regin variable) y uno J (regin de unin), y en
algunos casos tambin un segmento gnico D (regin de diver

sidad). Cada uno de estos segmentos gnicos se encuentra en
mltiples copias en el DNA de la lnea germinal (vase cuadro
10-8 y seccin 10.6.1). Sin embargo, el DNA de clulas B y c
lulas T maduras experimenta recombinacin de DNA especfi
ca de clulas de manera que lleva consigo una combinacin
especfica de un segmento V, D y J, o de un segmento de V V
308
CAPTULO DIEZ
J, que crean un exn VDJ o un exn V] respectivamente (va

se seccin 10 .6 . 1);
h ip e rm u ta c i n s o m tic a , u n m ecan ism o m a y o r en h u m a n o s y

ratones. Se presenta una diversidad adicional de Ig cuando se
introducen mutaciones de punto en la regin V o en los exones VJ y VDJ debido a una reparacin de DNA propensa a error;
conversin g n ic a , u n m ecan ism o m a y o r en conejos y pollo s. La

diversidad de Ig tambin puede resultar cuando tiras de se
cuencia nucletida se copian de segmentos de seudogen (Vi/j) co
rriente arriba dentro de la secuencia de segmentos del gen V en
exones VJ y VDJ;
re c o m b in a c i n d e c a m b io d e clase, u n m ecan ism o d is e m in a d o .
Unidades de transcripcin que consisten en varios exones espe

cifican la regin constante de las Ig. En las cadenas pesadas de
la Ig, varias unidades de transcripcin distintas especifican las
distintas clases de cadena pesada, como C|x (IgM), C 8 (IgD),
C 7 (IgG), etc. Durante la maduracin de las clulas B la re
combinacin intracromtide dentro del gen de cadena pesada
acerca tipos especficos de unidad de transcripcin de regin
constante a los exones VDJ (seccin 10.6.2).
En fecha muy reciente se demostr que los acontecimientos de hiper
mutacin somtica, conversin gnica y recombinacin de cambio
de clase (todos los cuales pueden ocurrir en una sola especie, aunque
algunos mecanismos prevalecen en forma particular en especies par
ticulares) son controlados en su totalidad por un gen nico que co
difica desaminasa de desoxicitidina inducida por activacin (AID;
vase Petersen-Mahrt y cois., 2002).
10.6.1 Reordenamientos del DNA en clulas B y T

generan exones especficos de clulas que
codifican regiones variables de Ig y de RCT
Los genes que codifican las tres cadenas de Ig (una cadena pesada y
dos tipos de cadena ligera) y las cuatro cadenas de RCT (a, (3, 7 y 8 )
se localizan en diferentes cromosomas y muestran una organizacin
extraordinaria. En cada caso la regin variable es especificada por
dos o tres diferentes segmentos gnicos que se encuentran en nume

rosas copias distintas que se repiten de manera secuencial en el
DNA de la lnea germinal (vase cuadro 10-8 y fig. 10-27). Los seg
mentos gnicos comprenden:
segmentos de gen V (regin variable). Los segmentos de gen
V codifican la mayor parte de la regin variable;
segmentos del gen J (regin de unin). Los segmentos del gen
J codifican la reg in de u n i n , una parte pequea en el extre
mo terminal C de la regin variable;
segmentos del gen D (regin de diversidad). Los segmentos del
gen D codifican una regin d e d iv e rs id a d pequea cerca de los
extremos terminal C de la regin variable de las cadenas pesa
das de Ig, las cadenas (3 de RCT y las cadenas 8 de RCT.
El reordenamiento nico de los segmentos gnicos en los grupos de
genes de Ig y RCT indica la forma muy poco usual en que los linfocitos B y T se someten a recombinaciones somticas a fin de ac
tivar genes de Ig o RCT antes no funcionales y a continuacin
expresar productos funcionales de ellos. Efectan lo anterior reu
niendo combinaciones especficas de segmentos gnicos V + D +
J (en el caso de los genes que codifican la cadena pesada Ig, (JRCT
y 8 RCT) o de segmentos gnicos V + J (en los otros cuatro genes).
Una vez que se ensamblan, las unidades V + J o V + D + Js e
comportan como exones funcionales (vase ms adelante). Para cada
uno de los siete genes, la eleccin entre los mltiples segmentos gn i
cos V, (D) o J que se juntan, vara d e linfocito en linfocito y por con
siguiente los exones VJ y los exones VDJ recin creados son
especficos de clula (vase fig. 10-28). Como resultado, las clulas B
y T individuales producen diferentes Ig y RCT. En consecuencia,
en un sentido, cada individuo es un mosaico con respecto a la or
ganizacin de los genes de Ig y RCT en linfocitos B y T, e inclusive
los gem elos idnticos diferirn genticam ente.
Una vez que un exn VDJ o VJ se ensambla, se crea un gen fun
cional Ig o RCT. A continuacin el nuevo exn VDJ o VJ propor
cionar el primer exn para este gen y los exones en la cercana de
la unidad de transcripcin C aportarn los exones corriente abajo.
En el caso del gen de cadena pesada de la Ig hay varias unidades de
Cuadro 10-8. Genes humanos de Ig y RCT.

Nmero de segmentos gnicos V, D, J
Gen
Localizacin
Nmero de unidades de transcripcin C
IGH
14q32.3
123-19a
27
11
IGK
2p12
76
IGL
22q11
70-71a
7 -1 1a
7-11
TRA
14q11.2
4 9 (+ 5 )b
61
TRB
7q34
64-67a
14
TRG
7p15-p14
12-15a
TRD
14q11.2
1 (+ 5 )b
Nota: los nmeros incluyen secuencias no funcionales (seudogen); vase la figura 10-27 para un ejemplo del gen IGH.
aEI nmero vara en diferentes haplotipos. bClnco segmentos del gen V se comparten entre los genes TRA y TRD vecinos. Para representaciones pictricas vanse los
nombres del gen Individual en diversas bases de datos como Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology en www.intoblogen.fr/services/chromcancer/
Genes/Genellste.html
10.6
ORGANIZACIN Y EXPRESIN NICAS DE GENES DE IG Y RCT
Regin V
900 kb
309
Regin DJC
350 kb
CEN
TEL
>
'C^Cs C^C y,
123 a 129 segmentos VH

(casi todos son no funcionales,
pero se sabe que hasta 46 son funcionales)
26
segm entos
Du
9 segm entos J H I
+ 1 D,H
^^1^2 C74
CE c a2
11 segm entos C H
Fig. 10-27. Mltiples segmentos gnicos en el gen de cadena pesada de la Ig, IGH, en 14q32.
El gen se extiende 1 250 kb del extremo telom rico de 14q32.3 (izquierda) al extremo centromrico (derecha). Hay 123 a 129 segmentos gnicos VH
(dependientes del haplotipo), de los que se sabe que casi todos son segmentos seudognicos no funcionales, 27 segmentos gnicos DH, nueve seg
mentos gnicos JH y 11 unidades de transcripcin C (cada una de las cuales contiene varios exones). Para mayores detalles vase http://www.nfoblogen.fr/services/chromcancer/Genes/lgHID40.html
transcripcin C funcionales diferentes con propiedades biolgicas

distintas. Sin embargo, al principio el empalme incluye el exn
VDJ y los exones de las unidades de transcripcin Cp y C8 veci
nas, y el empalme alternativo puede resultar en sntesis de la ca
dena p, o 8 que se incorpora en las inmunoglobulinas IgM e IgD
(fig. 10-28). No obstante, conforme la clula C madura, recombi
naciones somticas subsecuentes originan la unin del exn VDJ
ensamblado con anterioridad a diferentes unidades de transcrip
cin C a fin de producir cadenas pesadas y , a o e para incorpo
rarse en IgG, IgA o IgE (cambio d e clase d e cadena pesada; vase
texto; fig. 10-29).
Los mecanismos genticos que conducen a la produccin de
exones VJ y VDJ funcionales suelen incluir deleciones a gran esca
la de las secuencias que separan los segmentos gnicos selecciona
dos (muy probablemente por recombinacin intracromtide en
una forma muy similar a la que se indica en la figura 10-29B) y en
algunos casos inversiones de la secuencia intermedia. Secuencias de
seal de recombinacin conservadas flanquean los extremos 3' de
cada segmento V y J y los extremos 5' y 3' de cada segmento del
gen D. Permiten la unin de V a J, o D a J seguida por V a DJ pe
ro nunca V a V o D a D, etctera.
Los fenmenos de recombinacin son dirigidos por una recombinasa V(D)J, un complejo que contiene dos protenas especficas de
linfocitos RAG1 y RAG2, as como enzimas que ayudan a reparar el
DNA daado en todas las clulas. RAG1 y RAG2 hacen roturas de
doble cadena en las secuencias de la seal de recombinacin, y las ro
turas se reparan juntando segmentos gnicos V, D y J apropiados en
tanto se excluyen secuencias intermedias. Aunque por lo general la
recombinacin especfica de sitio es precisa, la recombinacin que
ocurre en los genes de Ig y RCT en las clulas B y T, de manera res
pectiva, no es precisa deliberadamente. En lugar de ello suele perder
se un nmero variable de nucletidos de los extremos de los
segmentos gnicos recombinantes y tambin pueden insertarse uno
o ms nucletidos elegidos de manera aleatoria, lo que crea diversi
ficacin de unin. Esto incrementa muchsimo la diversidad de se
cuencias de codificacin de regin variable.
10.6.2 El cambio de clase de cadena pesada comprende

la unin de un exn VDJ aislado a unidades de
transcripcin de regin constante alternativas
Aunque una clula B slo produce un tipo de molcula Ig, la clase
(o isotipo) de la cadena pesada puede cambiar durante el desarro
llo: dentro de un linaje aislado, los descendientes de una clula ori
ginal pueden producir una Ig con el mismo sitio de unin de
antgeno que antes pero utilizando una clase diferente de cadena
pesada (cambio de clase o cam bio d e isotipo). Este cambio incluye
la unin diferencial del mismo exn VDJ que se enlaz por dos re
combinaciones somticas sucesivas (vase fig. 10-28) a unidades de
transcripcin de regin constante alternativas.
El cambio de clase abarca una recombinacin intracromtide
cuyo resultado es la unin de un exn VDJ a una unidad de trans
cripcin de regin constante ms distal (unin VDJ-C). Incluye la
progresin siguiente:
a) sntesis in icia l d e IgM slo p o r clulas B vrgen es inm adu
ras. Esto ocurre temprano en el desarrollo de la clula B por
que el empalme de RNA une la secuencia transcrita del exn
VDJ y los exones de la unidad de transcripcin Cp vecina (fig.
10-29A);
b) sntesis p osterior tanto d e IgM com o d e IgD p o r clulas B
vrgenes maduras. Ms adelante en el desarrollo de la clula B,
pero en una etapa en que estas clulas an son inm unolgicam en te vrgen es (es decir, an rio se expusieron a un antgeno
extrao), ocurre un cambio de clase parcial y las clulas B pro
ducen ahora tanto IgD como IgM. Ello ocurre porque ahora el
empalme alternativo de RNA adicional tambin puede juntar
la secuencia transcrita del exn VDJ y los exones de la unidad
de transcripcin C8 vecina (fig. 10-29A). Casi toda la produc
cin de IgM e IgD est dedicada a elaborar receptores de unin
de membrana, pero la exposicin a antgeno extrao estimula
r la secrecin de anticuerpo IgM soluble en una respuesta inmunitaria primaria dbil;
310
CAPTULO DIEZ
Cadena pesada
Vi
V2
V3
V4
D., D 2 D 3 D .
Ji J
C ,
Cg
C y3
C y,
Ca
DNA Unin D-J
Vi V2 V3 V4
Vn D ,D 2 D3J2J3 J4 J CL1 C5
C.,
Ca2
C5 Cy3 Cy,
Ca2
DNA
Unin V-D-J
1
Vi
*1
VoDo
2 , j 3 jJo2
DNA
'^ . ''- ''E m p a l m e de RNA
mRNA
! ]
Polipptido
I_I
IC
Traduccin
Fig. 10-28. Recombinacin de VDJ especfico de clulas como preludio para la elaboracin de una cadena pesada de Ig.
Dos recombinaciones somticas secuenciales producen la primera unin D-J y luego un exn maduro VDJ. En este ejemplo, el segundo de 129 seg
mentos V diferentes (V2) se fusiona con el tercer segmento de la regln D (D3) y el segundo segmento de la regin J (J2) para producir un exn V2D3J2
funcional, pero como la eleccin es especfica de la clula, un llnfocito B vecino puede tener, por ejemplo, un exn V ^ D ^ J , funcional. Una vez que el
exn VDJ se ensambla, el gen puede transcribirse utilizando el exn VDJ com o primer exn, con los exones subsecuentes provistos por las unidades de
transcripcin C ms cercanas. A fin de iniciarlo, las unidades de transcripcin ( V y C8 estn ms cercanas y los primeros tipos de cadena pesada Ig
que se elaboran son la cadena |x y despus m- ms 5, las cadenas pesadas caractersticas de IgM e IgD respectivamente. Sin embargo, conforme la c
lula B madura, recombinaclones somticas subsecuentes ocasionan la unin del exn VDJ ensamblado con anterioridad a diferentes unidades de trans
cripcin C (cam bio de clase de cadena pesada, vase el texto y la fig. 10-29).
c) sntesis le IgG, IgE o IgA p o r clulas B maduras. Tras la ex

posicin a antgenos extraos, las clulas B desarrollan procesos
para refinar la afinidad de unin de Ig (maduracin de afinidad)
de manera que puedan responder con mayor efectividad a un
antgeno extrao en una ocasin futura (cuando sern capaces de
secretar grandes cantidades de anticuerpo soluble con una afini
dad muy alta por el antgeno extrao en una respuesta de inmunitaria secundaria potente). Fenmenos de hipermutacin
somtica/conversin gnica, etc. apoyan la maduracin de afini
dad. En la clase de clula B madura el cambio ahora ocurre por
un mecanismo diferente e incluye un fenmeno de recombina
cin que permite la unin a nivel del DNA del mismo exn VDJ
a cualquiera de las unidades de transcripcin Oy, Ce o C a. El
mecanismo abarca delecin de la secuencia intermedia median
te recombinacin intracromtide (fig. 10-29B). Las molculas Ig
secretadas por clulas B maduras pueden enlazarse a diferentes
tipos de clulas que tienen receptores especializados para la por
cin de la cola (Fe) del anticuerpo soluble. Estos receptores Fe
enlazan de manera selectiva diferentes tipos de Ig:
*
IgG: adems de activar el sistema de complemento, la IgG

puede ser enlazada especficamente por receptores Fe en
m acrfagos y neutrfilos, clulas fagocticas potentes;
IgA: un tipo de receptor Fe nico para el epitelio secretorio

transporta anticuerpos IgA de modo que constituyen la
principal clase de anticuerpo en las secreciones, inclusive sa

liva, lgrimas, leche y secreciones respiratorias e intestinales;
IgE: receptores Fe en clulas cebadas y basfilos unen IgE

con afinidad muy alta. Las molculas IgE unidas funcio
nan despus como receptores de antgenos adquiridos en
forma pasiva. El enlace subsecuente de antgeno estimula
r la clulas cebadas o los basfilos para que secreten una
diversidad de citocinas e histamina. Adems las clulas ce
badas secretarn factores que atraen y activan eosinfilos
que tambin tienen receptores Fe que unen molculas IgE
y pueden destruir varios tipos de parsitos.
10.6.3 La monoespecificidad de las Ig y los RCT se debe

a exclusin allica y de cadena ligera
Las clulas humanas poseen tres genes de Ig funcionales (IGH que
codifica la cadena pesada y dos genes, IG K e IGL, que codifican las
cadenas ligeras kappa y lambda intercambiables en trminos fun
cionales), y puesto que esto ocurre tanto en homlogos materno
como paterno, seis genes estn potencialmente disponibles para
elaborar cadenas de Ig. Sin embargo, una clula B individual es
monoespecfica: slo produce un tipo de molcula Ig con un tipo
aislado de cadena pesada y un tipo nico de cadena ligera. Ello se
debe a dos razones:
10.6
ORGANIZACIN Y EXPRESIN NICAS DE GENES DE IG Y RCT
Y
A)
Transcritos
primarios de
clula B
tempranos
VDJ C u C s
DNA de clulas
B tempranas
311
.
4
Empalmado
alternativamente
para dar mRNA
I* o 5 IgM o IgD
Cambio
de clase
(en este
caso a
IgG)
Corte y reunin
de cadenas diferentes
VDJ
e . C.^4 CE C,
DNA de clulas B maduras

que producen IgG
Transcritos primarios
de clula B madura
Empalmado para
dar 7 m RNAIgG
Fig. 10-29. El cambio de clase de la cadena pesada de la Ig es mediado por recombinacin intracromtide.
A) Cambio tem prano (parcial) a IgD. La clase de cadena pesada inicial es IgM porque el empalme de RNA junta las secuencias transcritas del exn
VDJ y los exones de la unidad de transcripcin C/x vecina. Sin embargo, a medida que las clulas B vrgenes maduran, el empalme alternativo de RNA
une las secuencias del exn VDJ y los exones de la unidad de transcripcin C8, y conduce a la produccin adicional de IgD. B) Cam bio tardo a IgA,
IgG e IgE. En este caso el cambio de clase ocurre por recombinacin intracromtide, en la que el mismo exn VDJ es llevado cerca de las unidades de
transcripcin de regin constante inicialmente ms distales: una unidad de transcripcin Ca, C-y (como se ilustra aqu) o una unidad de transcripcin
Ce. La nueva combinacin VDJ-C se expresa para dar IgA, IgG o IgE.
exclusin allica. Puede sintetizarse una cadena ligera o una ca

dena pesada a partir de un cromosoma materno o un cromoso
ma paterno en cualquier clula B, pero no d e ambos homlogos
parentales. Como resultado, hay expresin m onoallica en el locus del gen de cadena pesada en clulas B. Este fenmeno se
aplica tambin a grupos de genes de RCT;
exclusin de cadena ligera. Una cadena ligera que se sintetiza
en una clula B aislada puede ser una cadena K o una cadena
\, pero nunca ambas. Como resultado de este requerimiento
aunado al de la exclusin allica, hay una expresin monoal
lica en uno de los dos grupos gnicos de cadena ligera funcio
nales y no hay expresin en el otro.
Al parecer la decisin respecto a cul de los dos alelos de cadena pesa

da debe utilizarse para formar una cadena pesada y cul de los cuatro
posibles genes de cadena ligera se emplear para formar una cadena li
gera es aleatoria. Es muy probable que, en cada precursor de clula B,
se intenten reordenamientos de DNA productivos en todos los seis ge
nes de Ig pero es factible que las posibilidades de ordenamientos pro
ductivos en ms de un gen de cadena ligera o ms de un gen de cadena
pesada no sean altas. Sin embargo, al parecer hay cierto tipo de regu
lacin p o r retroalim entacin negativa adicional; un reordenamiento
funcional en uno de los alelos de cadena pesada suprime los reordena
mientos que ocurren en el otro alelo y un reordenamiento funcional
en cualquiera de los cuatro genes capaces de codificar una cadena li
gera suprime los reordenamientos que ocurren en los otros tres.
CAPTULO
ONCE
Inestabilidad del genoma humano:

mutacin y reparacin del DNA
11.1
Generalidades de mutacin, polimorfismo y reparacin del DNA
11.2
11.3
Mutaciones simples
Mecanismos genticos que producen intercambios de secuencias
entre repeticiones
11.4
Mutaciones patgenas
11.5
Potencial patgeno de secuencias repetidas
11.6
Reparacin del DNA
Recuadro
Recuadro
Recuadro
Recuadro
11-1
11-2
11-3
11-4
Clases de polimorfismo gentico y variacin de secuencias

Mecanismos que afectan la frecuencia de alelos en la poblacin
Clases de sustitucin de una base en el DNA que codifica polipptidos
Diferencias de sexo en la tasa de mutacin y el problema de la evolucin
impulsada por varones
316
11.1
CAPTULO ONCE
INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIN Y REPARACIN DEL DNA
Generalidades de mutacin, polimorfismo

y reparacin del DNA
Como en otros genomas, el DNA del genoma humano no es una

entidad esttica. Por el contrario, est sujeto a una variedad de cam
bios hereditarios (mutacin). Las anormalidades cromosmicas a
gran escala incluyen prdida o ganancia de cromosomas o rotura y
nueva unin de cromtides (vase seccin 2.5). Las mutaciones a
menor escala pueden agruparse en diferentes clases segn el efecto
en la secuencia del DNA en la forma siguiente:
sustituciones de bases: incluyen el reemplazo de por lo gene
ral una base; en casos raros se reemplazan al mismo tiempo va
rias bases agrupadas como resultado de una forma de
conversin gnica (seccin 11.3.3);
deleciones: se eliminan uno o ms nucletidos de una secuencia;
inserciones: se insertan uno o ms nucletidos en una secuencia.
Las mutaciones tambin pueden clasificarse con base en si com
prenden una secuencia de DNA aislada (m utaciones simples; seccin
11.2) o el intercambio entre dos secuencias allicas o no allicas
(seccin 11.3). Cada una de las tres clases de mutacin indicadas
pueden originarse por mutaciones simples o intercambios de se
cuencias.
Surgen nuevas mutaciones en individuos aislados, sea en clulas
somticas o en la lnea germinal (seccin 3.1.3). Si una mutacin
en la lnea germinal no deteriora de manera importante la capaci
dad de un individuo para tener descendencia que transmita la mu
tacin, puede diseminarse a otros miembros de una poblacin
(sexual). Por tradicin la variacin de la secuencia allica suele des
cribirse como un polimorfismo de DNA si ms de una variante
(alelo) en un locus se observa en una poblacin humana con una
frecuencia mayor de 0.01 (que es ms alta de la que podra conser
varse slo por mutacin recurrente). Sin embargo, existe una diver
sidad de tipos de polimorfismo que varan desde cambios de
nucletidos nicos a modificaciones a muy gran escala (recuadro
11- 1) .
En el DNA genmico humano la heterocigosidad media

(tambin denominada d iv ersid a d p r o m ed io d e n u cle tid os) es del
orden de 0.08%; alrededor de 1 de cada 1 250 bases difiere en pro
medio entre las secuencias allicas. Esta cifra se estim al inicio
promediando datos de un nmero limitado de estudios de secuenciacin de un locus (vase Przeworski y cois., 2000). Los valores de
heterocigosidad varan mucho en diferentes locus y ciertos genes
son excepcionalmente polimrficos, en especial algunos genes HLA
(vase fig. 12-29), pero el anlisis de grupos de datos de polimor
fismos de nucletido nico (PNU) humano global disponible en
fecha reciente confirma el valor medio de heterocigosidad de
0.08% (Reich y cois., 2002). No obstante, como los ndices de mu
tacin son comparativamente bajos, la inmensa mayora de las di
ferencias entre secuencias allicas dentro de un individuo es
hereditaria en lugar de resultado de mutaciones nuevas.
Aunque las mutaciones son el combustible crudo que impul
sa la evolucin, tambin pueden ser patgenas (secciones 11.4,
11.5). Es posible que sean la causa directa de una anormalidad
fenotpica o que ocasionen un incremento en la susceptibilidad
a una enfermedad. En consecuencia el valor casi siempre bajo de
las mutaciones puede considerarse como un equilibrio entre per
mitir la novedad evolutiva ocasional a expensas de causar enfer
medad o muerte en una proporcin de los miembros de una
especie.
Con frecuencia las mutaciones surgen como errores de copiado

durante la replicacin del DNA. Aunque la fidelidad de la replicacin del DNA in vivo es muy alta en condiciones normales, incor
poraciones errneas ocurren a una frecuencia baja y dependen de
las energas libres relativas del pareamiento de bases correcto e in
correcto. Cambios muy pequeos en la geometra de la hlice pue
den estabilizar pares de bases G-T (con dos enlaces de hidrgeno;
cabe sealar la ocurrencia frecu en te d el paream iento d e bases G-U en
e l RNA; vase fig. 1-7B). A fin de reducir el ndice de error de in
corporacin errnea, muchas polimerasas de DNA contienen una
exonucleasa integral
que puede desempear una a ctiv id a d
d e lectu ra d e p r u eb a s (vase cuadro 1-2). Cuando una base inco
rrecta se inserta durante la sntesis de DNA, esta ltima no puede
proceder. En lugar de ello la actividad de exonucleasa 3 ,_>5' elimi
na un nucletido a la vez de la terminal hidroxilo 3' hasta obtener
una terminal con un pareamiento de bases correcto, lo que permi
te que la sntesis de DNA prosiga de nuevo. Sin embargo, aun en
tonces el tamao del genoma humano origina demandas enormes
en la fidelidad de cualquier polimerasa de DNA: una secuencia de
seis mil millones de nucletidos necesita replicarse con precisin
cada ocasin aislada en que clula humana se divide.
El DNA tambin est sujeto a un ataque qumico espontneo
importante en la clula y al dao causado por la exposicin a radia
cin ionizante natural y a metabolitos reactivos. Por tanto, con ob
jeto de reducir al mnimo el ndice de mutaciones, es necesario
contar con sistemas de rep a ra cin d e l DNA eficaces que identifi
quen y corrijan muchas anormalidades en la secuencia del DNA
(seccin 11.6). Adems los errores que surgen en la secuencia del
mRNA durante la expresin gnica se someten a mecanismos de
vigila n cia d e l RNA que aseguran la eliminacin de los mRNA que
tienen codones de terminacin inapropiados (seccin 11.4.4).
11.2
M utaciones sim ples
11.2.1 Las mutaciones que se deben a errores

en la replicacin y la reparacin del DNA
son frecuentes
La exposicin a una variedad de mutgenos que se encuentran en su
ambiente externo o que se generan en el medio intracelular puede
inducir mutaciones en el DNA de una persona. Por ejemplo, Dubrova y colaboradores (1996, 2002) publicaron que en la mutacin
inducida por radiacin la tasa normal de mutacin de la lnea ger
minal para locus minisatlite hipervariables se duplic como conse
cuencia de la exposicin intensa a la lluvia radiactiva del accidente
de Chernobyl. Sin embargo, en circunstancias normales la mayor
fuente de mutaciones es con mucho la mutacin endgena, que in
cluye errores espontneos en la replicacin y la reparacin del DNA.
Es posible estimar que durante un tiempo de vida humana prome
dio se llevan a cabo divisiones celulares del orden de 1017: son necesa
rias alrededor de 2 X 10 11 divisiones para generar las cerca de 1014
clulas del adulto y mitosis adicionales para permitir la renovacin ce
lular en ciertos tipos de clulas, en especial las epiteliales (vase Cairns,
1975). Ya que cada divisin celular requiere la incorporacin de
6 X 10 "1nuevos nucletidos, la replicacin del DNA sin errores en un
tiempo de vida promedio demandara un proceso de reparacin de la
replicacin del DNA cuya precisin fuera lo suficientemente conside
rable para que el nucletido correcto se insertara en la cadena de DNA
en crecimiento en cada una de las cerca de 6 X 1026 ocasiones.
11.2
MUTACIONES SIMPLES
317
R ecuadro 11-1. C lases de polimorfismo gentico y variacin de secuencias

Las diferencias en los fenotipos individuales se deben en gran parte a
variacin gentica y se conoce una diversidad de tipos de polim orfism os
genticos y de variacin de secuencias a gran escala. Sin embargo, por
ultimo el efecto en el fenotipo se expresa a nivel de protenas o del RNA.
Los cambios en el DNA que codifica polipptidos pueden dar lugar a cam
bios de aminocidos que causan polimorfismos de protenas Adems
de los polim orfism os de DNA y de las protenas que se estudiaron durante
muchos aos existen diferencias cuantitativas mal comprendidas en la
expresin a nivel del transcrito. La variacin de expresin de genes
humanos aflleos puede deberse a cambios en el DNA regulador, que
incluyen secuencias que gobiernan la transcripcin y el empalme. Este
tipo de variacin de secuencias puede sustentar la susceptibilidad a
enfermedades frecuentes pero slo hasta fecha reciente se desarrollaron
mtodos cuantitativos para valorar la variacin allica en la expresin
gnica humana (Yan y cois., 2002). A continuacin se describen las
clases usuales de polimorfismos de DNA y la variacin de secuencias a
gran escala.
Polimorfismo de nucletido nico (PNU)
Como lo sugiere el nombre, incluye un nucletido aislado. En la mayor
parte de los PNU se sustituye slo un nucletido por un nucletido dife
rente (sustitucin de nucletido), pero el trmino incluye tambin cam
bios que com prenden inserciones o flgleciones de nucletidos
(polimorfismos indel simples). Por lo general los PNU slo tienen dos
alelos. Algunos PNU producen cambios en los sitios de restriccin {po
limorfismo de sitio de restriccin, seccin 7.1.3). Ya que el DNA de
codificacin slo constituye alrededor de 1.5% del genoma humano, ca
si todos los PNU se encuentran en DNA no codificante, com o secuen
cias dentro de intrones e intergnicas. No obstante, la localizacin
cromosmica de los PNU est muy lejos de ser uniforme: a menudo las
regiones crom osm icas grandes con muy pocos PNU se encuentran ad
yacentes a regiones grandes que contienen muchos PNU (vase seccin
11.2.6). Para la tipificacin de los PNU, vase la seccin 7.1.3.
Polimorfismo simple de nmero variable de repeticin tndem (NVRT)
Polimorfismo NVRT suele describir alelos en locus que contienen tiras
repetidas en forma tndem de una secuencia simple. Abarca las clases:
microsatlites = polimorfismo RSS (repeticin de secuencia simple)
en los que la secuencia simple es de uno a varios nucletidos de largo y
la longitud del arreglo vara de menos de 10 a ms de 100 nucletidos, y
polimorfismo minisatlite de DNA que incluye arreglos que con fre
cuencia abarcan cientos de nucletidos y consisten en repeticiones tn
dem de una secuencia entre nueve y varias decenas de nucletidos de
largo. Los locus NVRT suelen tener mltiples alelos y algunos minisatlite
hipervariables muestran una variacin extraordinaria (p. ej., el locus
MS32 tiene un valor de heterocigosidad de 0.975).
Ambos tipos de polim orfism o se encuentran muy rara vez en DNA que
codifica polipptidos. Las excepciones comprenden los polimorfismos
RSS sin cambio de marco, muy raros, y el polim orfism o minisatlite que
se expresa en contadas ocasiones, por ejemplo, se sabe que el locus
MUC1 en 1q21 codifica una glucoprotena altamente polimrfica que se
halla en varios tejidos epiteliales y lquidos corporales como resultado de
una variacin extensa de repeticiones codificadas por minisatl'rtes
(Swallow y cois., 1987). Adems algunos de estos polim orfism os pueden
localizarse muy cerca de genes y afectar su expresin. Un ejemplo notable
es el NVRT INS, un minisatlite polim rfico ubicado 596 pb corriente
Conservar este nivel de fidelidad de replicacn del DNA resulta

imposible; de hecho la fidelidad de la replicacin de polimerasas de
DNA observada es mucho menor que sta y ocurren errores de repli
cacin no corregidos con una frecuencia cercana a 10 9 a 10 11 por
arriba del sitio de inicio de traduccin del gen de insulina que consiste en
un nmero variable de repeticiones tndem basadas en la secuencia con
senso ACAGGGGTGTGGGG. Al parecer diferentes alelos confieren una
susceptibilidad diferencial a la diabetes tipo I, tal vez por los efectos difer
enciales en la expresin del gen de insulina (seccin 15.6.4.)
Polimorfismo de repeticin de transposn
Casi 45% del genoma humano est compuesto por repeticiones basadas
en transposn (seccin 9.5.1). La inmensa mayoria ya no es activa, pero
algunos transposones LINE1, Alu y basados en LTR an tienen actividad
de transposn. Como resultado de las transposiciones evolutivas
recientes, algunos locus son polim rficos. Por ejemplo, muchos miem
bros de las subfamilias Alu Vb9, Yc1 y Yc2 se insertaron en el genoma
humano en fecha tan cercana que alrededor de un tercio de los elemen
tos analizados es polim rfico para la presencia/ausencia de la repeticin
Alu en diversas poblaciones humanas (Roy-Engel y cois., 2001).
Polimorfismo de nmero variable de repeticin tndem (NVRT) a gran
escala
Las repeticiones tndem a gran escala son propensas a variacin en el
nmero de coplas com o resultado de cruzamiento desigual o intercam
bios desiguales de cromtides hermanas que producen un tipo de
polim orfism o de NVRT a gran escala. Los ejemplos incluyen repeticiones
satlite alfa en centrmeros y varios genes RNA de repeticin tndem
como los genes rRNA y los snRNA U2 en el locus RNU2 en 17q21-q22
(de seis a ms de 30 repeticiones de unidades de 6.1 kb casi idnticas).
Algunos grupos gnicos que codifican polipptidos comprenden repeti
ciones tndem grandes que son propensas a este tipo de polim orfism o,
por ejemplo, el grupo de 21-hidroxilasa/complemento C4 (seccin
11.5.3).
Polimorfismo de inversin
La secuenciacin de la porcin eucromtica del genoma humano revel
muchos ejemplos de secuencias con nmeros de copias bajos a moder
ados con homologa secuencial muy alta (> 95 % ) entre las secuencias
relacionadas. En algunas repeticiones con nmero de copias bajo, la
homologa secuencial muy alta se extiende decenas de cientos de kb
com o resultado de duplicacin segmentaria (especfica de primates)
evolutivamente reciente; vase seccin 12.2.5. Estas secuencias pueden
predisponer a recombnacin desigual y producir translocaciones y delecones, duplicaciones e inversiones a gran escala. Aunque las deleciones
y algunas duplicaciones suelen acompaarse de enfermedad y por lo
general se extienden a intervalos megabase (pero subcitogentcas), tam
bin pueden ocurrir polim orfism os de inversin a gran escala que no con
tribuyen en form a directa a enfermedades (seccin 11.5.5).
Polimorfismos cromosmicos y variantes secuenciales a gran escala
Algunos polim orfism os comprenden cambios muy grandes del DNA no
codificante de manera que es posible distinguir los alelos mediante anli
sis citogenticos tradicionales. A menudo el bandeo C (que identifica heterocromatina, vase recuadro 2-2) revela variacin del tamao para
bloques especficos de heterocromatina com o se observa en los crom o
somas 9 ,1 6 y Y. En la poblacin normal con frecuencia se encuentra una
inversin pericentromrica grande en el cromosoma 9. Las inversiones
ocasionales con puntos de rotura aparentemente fuera de las secuencias
de heterocromatina tambin pueden ser muy frecuentes en la poblacin
normal.
nucletido incorporado (vase Cooper y cois., 2000). Como el DNA

codificante de un gen humano promedio tiene alrededor de 1.65 kb,
ocurrirn en forma espontnea mutaciones en el DNA de codifica
cin con una frecuencia promedio cercana a 1.65 X 10 6 a 1.65 X
318 | CAPTULO ONCE
10 8 por gen por divisin celular. En consecuencia durante las alre

dedor de 1016 mitosis que se efectan en un tiempo de vida huma
no promedio, cada gen ser un locus para unas 108 a 10lu mutaciones
(pero para cualquier gen, slo una minora muy pequea de clulas
llevar una mutacin). En muchos casos una mutacin gnica perju
dicial en una clula somtica no tendr consecuencias: la mutacin
puede causar letalidad en esa clula aislada, pero no tendr conse
cuencias para otras clulas. Sin embargo, en algunos casos la muta
cin puede conducir a una continuacin inapropiada de la divisin
celular y causar cncer (vase cap. 17).
bles a desaminacin espontnea para dar timina (recuadro 9-3). Al

parecer, como resultado de lo anterior, el dinucletido CpG es un
punto crtico para mutacin en genomas de vertebrados: su ndice
de mutacin es cerca de 8.5 veces mayor que el del dinucletido
promedio (vase Cooper y cois., 2000) y las transiciones CpG- ^
TpG son el tipo ms frecuente de mutaciones de punto patgenas.
Es probable que otros factores que favorecen las transiciones sobre
las transversiones incluyan reparacin diferencial de bases con pareamiento errneo por actividades de lectura de pruebas depen
diente de secuencia de las polimerasas de DNA relevantes.
11.2.2 La frecuencia de sustituciones de bases

individuales es no aleatoria de acuerdo
con la clase de sustitucin
11.2.3 La frecuencia y la gama de mutaciones en el

DNA codificante difieren de las del DNA no
codificante
Las sustituciones de bases son una de las mutaciones ms frecuen

tes y pueden agruparse en dos clases. Las transiciones son sustitu
ciones de una pirimidina por una pirimidina (C*+T) o una purina
por una purina (A+*G). Las trajisversiones son sustituciones de
una pirimidina por una purina o de una purina por una pirimidi
na. Cuando se sustituye una base por otra, siempre hay dos posi
bles elecciones para la transversin, pero slo una para transicin
(vase fig. 11-1). Por tanto cabra esperar que las transversiones fue
ran el doble de frecuentes que las transiciones.
Como la sustitucin de alelos en una poblacin requiere miles
y aun millones de aos para completarse, no es posible observar en
forma directa las sustituciones de nucletidos. Siempre se suponen
por comparaciones de pares de molculas de DNA que comparten
un origen comn, como ortlogos en diferentes especies. Cuando
lo anterior ocurre, se encuentra que el ndice de transicin en genomas de mamferos es inesperadamente ms alto que los ndices
de transversin. Por ejemplo, Collins y Jukes (1994) compararon
337 pares de ortlogos de humanos y roedores, y encontraron que
la tasa de transicin excedi la de transversin en una relacin de
1.4:1 para sustituciones que no condujeron a un aminocido alte
rado y en una proporcin mayor de 2:1 en las que dieron por re
sultado un cambio de aminocido.
Las transiciones pueden favorecerse sobre las transversiones en
el DNA de codificacin porque por lo general producen una se
cuencia polipptida ms conservada (vase ms adelante). En el
DNA tanto codificante como no codificante de vertebrados, el ex
ceso de transiciones contra las transversiones se debe cuando menos
en parte a la frecuencia comparativamente alta de transiciones C~>T,
que resultan de inestabilidad de residuos de citosina que ocurren en
el dinucletido CpG. En estos dinucletidos la citosina suele med
iarse en el tomo de carbono 5 y las 5-metilcitosinas son suscepti-
En el DNA de los individuos muchas mutaciones se generan en

esencia de manera aleatoria. Como resultado el DNA de codifica
cin y el DNA no codificante son casi igual de susceptibles a mu
tacin. Sin embargo, es claro que las principales consecuencias de
la mutacin se restringen en gran parte a cerca de 1.5% del DNA
del genoma humano que se sabe que es DNA de codificacin y el
otro 3% aproximado de secuencias muy conservadas (inclusive se
cuencias reguladoras, etc.). Las mutaciones que ocurren dentro del
DNA de codificacin pueden agruparse en dos clases:
Fig. 11-1. En teora puede esperarse que las transversiones sean el

doble de (recuentes que las transiciones.
Flechas rojas, transversiones; flechas negras, transiciones.
mutaciones sinnimas (silenciosas), que no cambian la se

cuencia del producto gnico. Esto slo se aplica al DNA que co
difica polipptidos. Una mutacin sinnima origina un cambio
en el codn pero no produce un aminocido alterado por la de
generacin del cdigo gentico. N ota: algunas mutaciones que
parecen silenciosas tal vez no lo sean porque afectan el empal
me (al activar un sitio de empalme crptico o modificar una se
cuencia intensificadora de empalme exnica; seccin 11.4.3);
mutaciones no sinnimas que cambian la secuencia del pro
ducto gnico, que puede ser un polipptido o un RNA no co
dificante (= no traducido) funcional.
Se piensa que las mutaciones silenciosas verdaderas en genomas de
mamferos son mutaciones neutrales (que no confieren ventaja o
desventaja al organismo en cuyo genoma se originan). En contras
te, las mutaciones no sinnimas pueden agruparse en tres clases: las
que tienen un efecto perjudicial, las que carecen de algn efecto y
las que ejercen un efecto benfico (p. ej mejora de la funcin g
nica o interaccin intergnica). Es probable que casi todas las mu
taciones no sinnimas nuevas tengan un efecto perjudicial en la
expresin gnica y por consiguiente ocasionen enfermedad o letali
dad. Sin embargo, la frecuencia de este tipo de mutacin en la po
blacin es mucho muy reducida gracias a la selecci n n a tu ra l (vase
recuadro 11-2). En consecuencia el total de mutaciones en el DNA
de codificacin es mucho menor que el del DNA no codificante y
las secuencias del DNA de codificacin (y las secuencias reguladoras
importantes, etc.) muestran un grado ms o menos alto de conser
vacin evolutiva.
La p r esi n d e selecci n (las selecciones impuestas por seleccin
natural) reduce tanto la frecuencia total de mutaciones sobre
vivientes en el DNA de codificacin como la gama de muta
ciones que se observa. Por ejemplo, las deleciones/inserciones
de uno o varios nucletidos son frecuentes en el DNA no co
dificante pero destaca el hecho que no se encuentren en el
DNA de codificacin. Esto a menudo se debe a que estas mu
taciones ocasionarn un cambio en el marco de lectura traduc-
11.2
MUTACIONES SIMPLES
319
Recuadro 11-2. Mecanismos que afectan la frecuencia de alelos en la poblacin

Los individuos de una poblacin difieren entre s, sobre todo com o resul
tado de la variacin gentica hereditaria. La frecuencia de cualquier alelo
mutante en una poblacin depende de varios factores, que abarcan selec
cin natural, deriva gentica aleatoria e intercambios secuenciales entre
secuencias no allicas.
va gentica aleatoria puede ocasionar cambios considerables en las fre

cuencias de alelos (vase figura). En ausencia de una nueva mutacin y
otros factores que afectan la frecuencia de alelos, como la seleccin, los
alelos que se someten a deriva gentica aleatoria se fijarn por ltimo (el
punto al que la frecuencia de alelo en la poblacin es 0 o 100%).
SELECCIN NATURAL
Seleccin natural es el proceso por el que parte de la variacin gentica
heredada dar por resultado diferencias entre individuos en cuanto a su ca
pacidad para sobrevivir y reproducirse con xito. La reproduccin diferen
cial se debe a divergencias entre los individuos en cuanto a su capacidad
para efectuar la reproduccin (que se afecta por parmetros como morta
lidad, salud y xito en el apareamiento) y producir una descendencia salu
dable (diferencias en fertilidad, fecundidad y viabilidad de la descendencia).
La aptitud de un organismo es una medida de la capacidad de los indivi
duos para sobrevivir y reproducirse de manera satisfactoria. En los mode
los ms simples se considera que la aptitud de un individuo est
determinada slo por su constitucin gentica y se supone que todos los
locus contribuyen de modo independiente a la aptitud de un individuo, de
manera que es posible tratar por separado cada locus. En consecuencia
tambin puede hablarse de aptitud de un genotipo.
Generacin
Frecuencia
de alelo
0 .5 /0 .5
0 .5 /0 .5
0 .4 /0 .6
La gran mayora de las nuevas mutaciones no sinnimas en el DNA de co

dificacin reduce la aptitud de sus portadores. Por consiguiente se selec
cionan contra la poblacin y se eliminan de la misma (seleccin negativa
o purificante). En ocasiones una nueva mutacin puede ser tan apta co
mo el mejor alelo en la poblacin; esta mutacin es neutral desde el pun
to de vista de la seleccin. Muy rara vez una nueva mutacin confiere una
ventaja selectiva e incrementa la aptitud de su portador. Esta mutacin se
someter a seleccin positiva (o ventajosa), que cabria esperar que fo
mentara su diseminacin a travs de una poblacin. Si se consideran lo
cus con dos alelos que poseen diferentes aptitudes, el heterocigoto puede
tener una aptitud intermedia entre los dos tipos de homocigotos. En este
caso la modalidad de seleccin es codominante y la seleccin ser direccional, lo que resultar en un incremento del alelo ventajoso. Sin embargo,
en algunos casos es posible que una nueva mutacin no sea ventajosa en
homocigotos sino slo en heterocigotos (ventaja de heterocigoto). Esta
situacin, en la que el heterocigoto tiene una aptitud ms alta que el homocigoto mutante y el homocigoto normal, es una forma de seleccin ba
lanceada que se conoce como seleccin sobredominante (vase el
ejemplo de la fibrosis qustica en el recuadro 4-8).
0 .4 /0 .6
0 .7 /0 .3
0 .7 /0 .3
DERIVA GENTICA ALEATORIA

Los cambios en la frecuencia de alelos pueden ocurrir por simple azar
(deriva gentica aleatoria). Aun si todos los individuos de una poblacin
tienen la misma aptitud de manera que la seleccin natural no pueda ope
rar, las frecuencias de alelos cambiarn por un muestreo aleatorio de ga
metos. El muestreo ocurre porque slo una pequea proporcin de los
gametos disponibles en cualquier generacin se transmite alguna vez a la
generacin siguiente (no todos los individuos de una poblacin se repro
ducirn por las circunstancias o eleccin). Inclusive si no hubiera un ex
ceso de gametos (de modo que cada individuo aislado contribuye con
dos gametos a la generacin siguiente), ocurrira muestreo porque los he
terocigotos pueden producir dos tipos de gametos que portan diferentes
alelos pero los dos gametos que se transmiten a la generacin siguiente
pueden llevar, por azar, el mism o alelo.
La deriva gentica tiene poco efecto en poblaciones grandes. Ello se debe
a que aunque slo se transmite una fraccin pequea del total de game
tos, se transmiten los gametos suficientes para ser, con mucho, estads
ticamente representativos de todos los gametos en la poblacin. Sin
embargo, cuando los tamaos de la poblacin son pequeos (p. e j como
resultado de aislamiento geogrfico), el nmero de gametos que se trans
mite a la generacin siguiente ser ms pequeo en proporcin y la deri
El muestreo aleatorio de gametos en poblaciones pequeas puede

conducir a cambios considerables en las frecuencias de alelos.
Modificado de Bodmer y Cavalli-Sforza (1976) Genetics, Evoiution and Man.
INTERCAMBIO DE SECUENCIAS INTERLOCUS
En algunas familias gnicas, genes individuales codifican en esencia el
mism o producto, pero puede haber intercambios de secuencias que ocu
rren entre las diferentes copias gnicas. Por ejemplo, rRNA 5.8S, 18S y
28S humanos son codificados por unidades de transcripcin repetidas en
form a tndem (vase fig. 10-2) y muestran una propensin particular a
intercambios de secuencias entre las diferentes repeticiones. La frecuen
cia de un tipo de repeticin puede aumentar en la poblacin como resul
tado de los intercambios de secuencias entre distintas repeticiones
(vase fig. 11-8 para una ilustracin del principio general). En casos en
los que mltiples locus producen productos idnticos, todos los genes
pueden considerarse de manera efectiva como el equivalente de alelos.
aunque no en el sentido mendeliano (que por lo general permite un mxi
mo de dos alelos en la clula diploide). Por consiguiente la frecuencia de
una repeticin especfica ( alelo ) puede determinarse en parte por la fre
cuencia con que participa en intercambios de secuencia.
320
CAPTULO ONCE
cional (mutacin de cambio de marco) mediante la introduc

cin de un codn de terminacin prematuro y causando prdi
da de la expresin gnica. Aun si las inserciones/deleciones no
originan una mutacin de cambio de marco, con frecuencia
afectan la funcin genica, por ejemplo, como resultado de la
eliminacin de una secuencia de codificacin fundamental. Por
el contrario el DNA de codificacin se caracteriza por una fre
cuencia comparativamente alta de sustitucin de bases no alea
toria que ocurre en localizaciones que conducen a efectos
mnimos en la expresin genica (vase seccin siguiente).
11.2.4 La localizacin de sustituciones de bases en el

DNA de codificacin es no aleatoria
Las sustituciones de nucletidos que ocurren en el DNA no codi
ficante no suelen tener un efecto neto en la expresin gnica. Las
excepciones comprenden algunos cambios en los elementos pro
motores o alguna otra secuencia de DNA que regula la expresin
gnica o que se requiere para el empalme (fig. 1-15). Las sustitucio
nes que se observan en las secuencias del DNA de codificacin que
especifica polipptidos muestran un patrn de sustituciones no
aleatorio en exceso por la necesidad de conservar la secuencia polipptida y la funcin biolgica. En principio las sustituciones de ba
ses pueden agruparse en tres clases segn su efecto en el potencial
de codificacin (vase recuadro 11-3).
Las diferentes clases de sustitucin de bases que se presentan en
el recuadro 11-3 muestran tendencias diferenciales a localizarse en
la primera, segunda o tercera posiciones de bases de codones. A
causa del diseo del cdigo gentico, diferentes grados de degene
racin caracterizan distintos sitios. Las posiciones de bases en co
dones que especifican aminocidos pueden agruparse en tres
clases:
los sitios no degenerados son posiciones de bases en las que
las tres posibles sustituciones pertenecen a la variedad no si
nnima. Abarcan la posicin de la primera base de todos los
codones con excepcin de ocho, la posicin de la segunda ba
se de todos los codones y la posicin de la tercera base de dos
codones, AUG y UGG (vase fig. 11-2). Si se consideran las
frecuencias de codones observadas en genes humanos, com
prenden alrededor de 65% de las posiciones de bases en co
dones humanos. El ndice de sustitucin de bases en sitios no
degenerados es muy bajo y compatible con una presin de se
leccin conservadora potente para evitar cambios de amino
cidos (vase ms adelante);
los sitios degenerados cudruples son posiciones de bases en
las que las tres posibles sustituciones son sinnimas y se en
cuentran en la posicin de la tercera base de varios codones
(vase fig. 11-2). Comprenden alrededor de 16% de las posi
ciones de bases en codones humanos. La tasa de sustitucin en
sitios cudruples es muy similar a la que ocurre dentro de intrones y seudogenes, compatible con la suposicin de que las
sustituciones sinnimas son neutrales desde el punto de vista
de la seleccin (seccin 11.2.5);
los sidos degenerados dobles son posiciones de bases en las
que una de las tres posibles sustituciones es sinnima. Suelen
encontrarse en las posiciones de la tercera base de codones,
pero tambin en la posicin de la primera base en ocho codo
nes (vase fig. 11-2). Comprenden alrededor de 19% de las
posiciones de bases en codones humanos. Como cabra espe
rar, la tasa de sustitucin de los sitios degenerados dobles es

intermedia: slo una de las tres posibles sustituciones, una
transicin, conserva el mismo aminocido. Las otras dos po
sibles sustituciones son transversiones que, por la forma en
que el cdigo gentico evolucion, suelen ser sustituciones
conservadoras. Por ejemplo, en la posicin de la tercera base
del codn de glutamato GAA, una transicin A- *C es silen
ciosa, en tanto que las otras dos transversiones (A-*C; A>T)
dan como resultado la sustitucin por un aminocido muy si
milar, aspartato.
El diseo del cdigo gentico y el grado al que un aminocido tie
ne funciones similares a otro afectan las m u ta b ilid a d es d e a m i
n o cid o s relativas. Ciertos aminocidos pueden desempear
acciones fundamentales que no es posible sustituir con facilidad
por otras. Por ejemplo, con frecuencia la cisterna participa en el en
lace disulfuro que puede tener una funcin de importancia crucial
en el establecimiento de la conformacin de un polipptido (vase
fig. 1-25). Como ningn otro aminocido tiene una cadena lateral
con un grupo sulfhidrilo, la presin de seleccin es potente para
conservar los residuos de cisterna en muchas localizaciones y la cis
terna es uno de los aminocidos menos mutables (cuadro 11-1). En
contraste, algunos otros aminocidos, como serina y treonina, tie
nen cadenas laterales muy similares y sustituciones tanto en la po
sicin de la primera base de codones (ACX>UCX, en la que X =
cualquier nuclotido) como en las posiciones en la segunda base
(ACPy>AGPy, en la que Py =pirimidina) que pueden originar sus
tituciones en serina treonina. Quiz como resultado, la serina y
la treonina se encuentran entre los aminocidos ms mutables (cua
dro 11-1).
11.2.5 Las tasas de sustitucin varan de manera

considerable entre diferentes genes y entre
distintos componentes gnicos
Tasa de sustitucin neutral
La reciente disponibilidad de secuencias bosquejo de los genomas
humano y del ratn permiti analizar las tasas de divergencia y sus
titucin de secuencias en la extensin del genoma (Mouse Genome
Sequencing Consortium, 2002). Como punto de referencia se esti
m la tasa de sustitucin neutral a partir de alineamientos de DNA
no funcional. Ello se logr al identificar secuencias repetidas ances
trales (repeticiones no codificantes basadas en transposn que se
juzg se haban insertado en el DNA genmico del ancestro comn
y que se fijaron antes de la divergencia de humanos y ratones). Fue
factible identificar un total de 165 Mb de secuencias repetidas an
cestrales (las secuencias ortlogas se determinaron mediante alinea
cin de DNA no repetido adyacente).
La identidad de secuencias total en secuencias repetidas ances
trales se estim en 66.7%. La identidad de secuencias en sitios
degenerados cuatro veces (vase seccin previa), otro grupo de se
cuencias en potencia no funcionales, fue de 67%. Estos valores tan
similares condujeron a estimaciones de 0.46 a 0.47 sustituciones
por sitio para la tasa de sustitucin neutral (Mouse Genome Sequen
cing Consortium, 2002). Con base en las diferencias en la tasa de
mutacin en los linajes que condujeron a los humanos y los rato
nes modernos (seccin 11.2.6), se estim que esto refleja una tasa
de sustitucin neutral aproximada de 2 X 10 ; por sitio por ao
en el linaje humano.
11.2
MUTACIONES SIMPLES
321
becuadro 11-3. C lases de sustitucin de una base en el DNA que codifica poli
tiempo en tiempo la sustitucin de un nucletido aislado dentro de un
a o n de codificacin altera el empalme de RNA y ocasiona una expresin
jr 'ic a defectuosa. Esto puede suceder en varias formas: mediante acticin de un sitio de empalme crptico dentro de un exn (fig. 1 1 - 1 2 ), por
r o ta c i n de nucletidos en las secuencias del donador y el aceptor de
- p a lm e justo adyacentes a las seales GT y AG conservadas (fig.
1-15), o por alteracin de secuencias internas que regulan el empalme,
en especial intensificadores de empalme exnico (seccin 11.4.3). Otras
sustituciones de base nica pueden clasificarse como sinnimas (silen: sa s) o no sinnimas, en las que un codn est mutando para causar
un cambio de la secuencia de aminocidos.
j
SUSTITUCIONES SINNIMAS (SILENCIOSAS)

El resultado de la sustitucin es un nuevo codn pero especifica el misTio aminocido. Constituyen el cambio que se observa con mayor fre
cuencia en el DNA de codificacin (porque casi siempre son mutaciones
neutrales y no estn sujetas a presin de seleccin). Las sustituciones
silenciosas se presentan sobre todo en la posicin de la tercera base de
un codn porque la tercera base bamboleante significa que el codn al
terado a menudo especifica el m ism o aminocido que antes. Sin embar
go, a veces la sustitucin incluye la posicin de la primera base, como
se observa en algunos codones de leucina (C UAU UA, U G oU U G ) y
arginina (AGA<=>GA, AGG<=>GG).
MUTACIONES SIN SENTIDO
Representan una forma de sustitucin no sinnima en la que un codn
que especifica un aminocido se reemplaza por un codn de detencin.
Puesto que estas mutaciones casi siempre se acompaan de una dis
minucin notable de la funcin gnica, la presin de seleccin asegura
que en condiciones normales sean raras. El polipptido humano prome
dio es especificado por alrededor de 500 a 550 codones, un tamao que
cabra esperar que incluyera ms de 20 codones de terminacio:: si nc

hubiera restricciones funcionales.
MUTACIONES EN SENTIDO ERRNEO
Son sustituciones no sinnimas en las que el codn alterado especifica
un aminocido distinto. Pueden clasificarse en dos subgrupos:
sustituciones conservadoras, cuyo resultado es el reemplazo de un
aminocido por otro qumicamente similar a l. Con frecuencia el
efecto de estas sustituciones en la funcin de la proteina es mnimo
porque la cadena lateral del nuevo aminocido puede tener funciones
similares a la del aminocido que reemplaza (vase nota de pie mas
adelante). Para reducir al mnimo el efecto de la sustitucin del nu
cletido, al parecer el cdigo gentico evolucion de tal manera que
los codones que especifican aminocidos relacionados se vinculan
en s mism os. Por ejemplo, los pares de codn Asp (GAC, GAT) y Glu
(GAA, GAG) aseguran que la tercera base bamboleante en el codn
GAX (en la que X es cualquier nucletido) tenga un efecto mnimo. Sin
embargo, algunos cambios en la posicin del primer codn tambin
pueden ser conservadores, por ejemplo UX (Leu)G U X (Val):
sustituciones no conservadoras dan por resultado el reemplazo de
un aminocido por otro con una cadena lateral distinta (vase cua
dro). En ocasiones se introduce una diferencia de carga; otros cam
bios pueden incluir reemplazo de cadenas laterales polares por otras
no polares y viceversa. Las sustituciones de bases en las posiciones
del primero y el segundo codones pueden producir sustituciones no
conservadoras, por ejemplo, GX (Arg)-*G X (Gli), CQX (Pro), CjJX
(Leu) o CAX (Gln/His), etc. (donde X = cualquier nucletido).
D istancias fisicoqum icas entre pares de am inocidos.

Arg
Leu
Pro
Tre
Ala
Val
Gli
lie
Fen
Tir
Cis
His
Gln
Asn
Lis
Asp
Glu
Met
Trp
110
145
74
58
99
124
56
142
155
144
112
89
68
46
121
65
80
135
177
Ser
102
103
71
112
96
125
97
97
77
180
29
43
86
26
96
54
91
101
Arg
98
92
96
32
138
22
36
198
99
113
153
107
172
138
15
61
Leu
38
27
68
42
95
114
110
169
77
76
91
103
108
93
87
147
Pro
58
69
59
89
103
92
149
47
42
65
78
85
65
81
128
Tre
64
60
94
113
112
195
86
91
111
106
126
107
84
148
Ala
109
29
50
55
192
84
96
133
97
152
121
21
88
Val
135
153
147
159
98
87
80
127
94
98
127
184
Gli
21
33
198
94
109
149
102
168
134
10
61
lie
22
205
10
116
158
102
177
140
28
40
Fen
83
99
143
85
160
122
36
37
Tir
174
154
139
202
154
170
196
215
Cis
24
68
32
81
40
87
115
His
46
53
61
29
101
130
Gln
23
42
142
174
Asn
101
56
95
110
Lis
45
160
181
Asp
126
152
Glu
67
Met
194
94
La cuantificacin del grado de similitud entre dos aminocidos se basa en propiedades como polaridad, volumen molecular y composicin qumica, y ios nmeros granass
significan mayor disimilitud. En el cuadro anterior, tomado de Grantham (1974), los pares ms similares son: Leu o lie (5), Met lie (10) y Met Leu (15): .os pares ~s
disimiles son Cis Trp (215), Cis Fen (205) y Cis Lis (202).
322
CAPTULO ONCE
UUA
UUG
Fen
Fen
Leu
Leu
17.1
20.4
7.3
12.7
UCU
UCC
UCA
UCG
Ser
Ser
Ser
Ser
CUU
CUC
CUA
CUG
Leu
Leu
Leu
Leu
12.9
19.5
7.0
40.1
CCU
CCC
CCA
CCG
Pro
Pro
Pro
Pro
AUU
AUC
AUA
AUG
lie
lie
lie
M et
15.8
21.3
7.2
22.3
ACU
ACC
ACA
ACG
Tre
Tre
Tre
Tre
GUU
GUC
GUA
GUG
Val
Val
Val
Val
10.9
14.6
7.0
28.7
GCU
GCC
GCA
GCG
Ala
Ala
A la
Ala
UUU
uuc
14.7
17.5
11.9
4.5
UAU
UAC
(UAA
(UAG
17.3
CAU
CAC
CAA
CAG
His
His
Gin
Gin
15.0
11.9
34.4
CGU
CGC
CGA
CGG
Arg
Arg
Arg
Arg
AAU
AAC
AA
AAG
Asn
Asn
L is
Lis
16.7
19.3
24.0
32.5
AGU
AGC
AGA
AGG
Ser
Ser
Arg
Arg
GAU
GAC
GAA
GAG
Asp
Asp
Glu
Glu
GGU
GGC
GGA
GGG
G li
G li
G li
G li
2 0 . 0
16.7
7.0
12.9
19.1
14.9
6 . 2
18.6
28.4
16.0
7.6
T ir 1 2 . 1
T ir 15.5
DETENCIN)
DETENCIN)
1 0 . 6
2 2 . 1
25.7
29.0
40.3
UGU
UGC
(UG A
UGG
C ls 1 0 . 1
C is 12.4
DETENCIN)
Trp 13.0
4.7
1 0 . 8
6.3
1 1 . 8
1 2 . 0
19.4
11.7
1 1 . 6
1 0 . 8
2 2 . 6
16.4
16.4
C la v e
N S itio n o d e g e n e ra d o
N S itio d e g e n e ra d o d o b le
N S itio d e g e n e ra d o c u d ru p le
Fig. 11-2. Frecuencias de codn en genes humanos y localizaciones de sitios degenerados dobles y cudruples.
Las frecuencias de codn observadas se presentan como valores de cada 1 000 (p. e j UUU = 17.1/1 000 o 0.0171). Se derivaron de la base de
datos Codon Usage (http://www.kazusa.or.ip/codon/) e incluyeron el muestreo de 21 930 294 codones del GenBank Release 131.0 (15 de agosto de
2002). Nota: aunque ocho de las 61 posiciones de primera base son degeneradas dobles, alrededor de 96% de todas las posibles sustituciones en la
posicin de primera base no es sinnimo. De las sustituciones en la posicin de segunda base, 100% no es sinnimo y en la posicin de la tercera
base, cerca de 33%.
Cuadro 11-1. Mutabilidad relativa de aminocidos.

(Ala = 100; datos obtenidos de Collins y Jukes, 1994)
Tre
116
Asp
84
Ser
114
Lis
77
His
107
Glu
76
Asn
107
Pro
67
Met
102
Leu
58
Ala
100
Gli
57
Gln
99
Fen
55
Val
98
Tir
53
Arg
94
Trp
31
lie
92
Cis
29
Tasa de sustitucin en diferentes componentes gnicos

Las comparaciones de ms de 14 000 pares de secuencias gnicas
ortlogas en humanos y ratones tambin enfatizaron las diferencias
en la tasa de sustitucin dentro de diferentes componentes gnicos
(Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002; vase fig. 11-3 para
una representacin visual basada en un subgrupo de los datos). Co
mo cabra esperar, las regiones codificantes son las ms conservadas
(85% de identidad de secuencia o 0.165 sustituciones por sitio de

nucletido) pero las secuencias de intrn estn mucho menos con
servadas (68.6% de identidad secuencial, que se acerca al total de
69.1% de identidad de secuencias en las comparaciones de secuen
cias en toda la extensin del genoma). Las regiones no traducidas
muestran una conservacin intermedia (5UTR, 75.9%; 3' UTR,
74.7%) igual que los 200 pb de flanqueo corriente arriba (regin
promotora, 73.9%) y 200 pb corriente abajo (70.9%).
Tasa de sustitucin en diferentes genes y dominios

Los diferentes genes estn conservados en distintas extensiones. Aun
que por lo general la tasa de sustitucin en sitios sinnimos est has
ta cierto punto preservada, la tasa de sustitucin no sinnima puede
variar mucho. Si se utiliza K s para indicar el nmero de sustituciones
por sitio sinnimo y Kpara el de sustituciones por sitio no sinni
mo, los genes que se someten a seleccin negativa (purificacin) ten
drn Ka
Ks . Los genes sometidos a seleccin positiva para
reemplazo de aminocidos tambin pueden mostrar KA< Ks porque
es posible que la seleccin positiva slo opere en unos cuantos sitios
cruciales y es compensada por la seleccin de purificacin en un gran
nmero de otros sitios. Cuando el Mouse Genome Sequencing Consor
tium (2002) examin ms de 12 000 pares de genes ortlogos huma
nos y de ratn encontr que el valor mediano de KA/KS es de 0.115.
En un extremo se encuentran protenas cuyas secuencias estn
en extremo bien conservadas porque se requieren para funciones
cruciales de la clula y especifican protenas como actinas, calmodulina, histonas, protenas ribosmicas, ubiquitinas, etc. Por ejem-
11.2
Primer exn
Exones medios
MUTACIONES SIMPLES
323
ltimo exn
100
95
90
85
80
75
70
65
- > i
60
55
50
200 pb
UTR 5'
Intrn
Intrn
Corriente arriba
UTR 3'
200 pb
Corriente abajo
Posicin dentro del genoma
Fig. 11-3. Variacin en la conservacin de secuencia en humanos y ratones a travs de un gen tpico.
La tasa de sustitucin de nucletidos vara en diferentes componentes de un gen, como lo muestra la alineacin de ms de 3 000 RefSeq de mRNA
humanos y secuencias genmicas corriente arriba/corriente abajo contra secuencias ortlogas de ratn. Adaptado de Mouse Genome Sequence
Consortium (2002). Nature 420, 520-562, figura 25A con autorizacin de Nature Publishing Group.
po, las protenas ubiquitinas de humanos, ratones y Drosophila

muestran una identidad de secuencias de 100% y la comparacin
con la ubiquitina de la levadura revela una identidad de secuencias
de 96.1%. Estos genes no estn protegidos de manera especial de
mutaciones porque la tasa de sustitucin sinnima de codn es t
pica de la de muchos genes que codifican protenas. Lo que los dis
tingue es la tasa en extremo baja de sustitucin no sinnima de
codones en comparacin con otros genes (vase cuadro 11-2 para
algunos ejemplos).
Los genes que muestran las tasas ms altas de sustitucin no si
nnima de codones incluyen muchos relacionados con los sistemas
de defensa y respuesta inmunitaria de mamferos (cuadro 11-2),
igual que seis de ocho dominios protenicos comunes relacionados
con los valores KA/Ks m is altos (Mouse Genome Sequencing Consor
tium, 2002, cuadro 13). La relacin KA/KS alta en estos casos indi
ca que se encuentran bajo una seleccin de purificacin reducida,
un incremento de seleccin positiva o ambos. El incremento de la
seleccin positiva podra indicar una lucha competitiva entre un
husped mamfero y sus patgenos, en la que cada uno est bajo
una presin potente para responder a innovaciones en el otro geno
ma. Los mismos seis de ocho dominios con los valores Ky/K ms
altos se encuentran en protenas secretadas y los dominios secreta
dos tienen relaciones KA/K mucho ms altas que los dominios nu
cleares y citoplsmicos (cuadro 11-3). Al parecer los dominios
catalticos tienen relaciones KA/KS comparativamente bajas.
11.2.6 La tasa de sustitucin puede variar

en las diferentes regiones cromosmicas
y en distintos linajes
Tasa de sustitucin y heterocigosidad en diferentes regiones
cromosmicas
Por diversas razones, la tasa de sustitucin en el genoma mitocondrial es mucho ms alta que en el DNA del genoma nuclear (sec
cin 11.4.2), pero la ltima muestra una variacin regional muy
considerable. El bosquejo de secuencias del genoma humano y del

ratn brind una oportunidad ideal para estimar lo anterior. Me
diante el uso de secuencias de repeticin ancestrales alineadas (va
se seccin previa) y sitios degenerados cuatro veces alineados, el
Mouse Genome Sequencing Consortium (2002) calcul la tasa apa
rente de sustitucin neutral para unas 2 500 ventanas de 5 Mb su
perpuestas a travs del genoma humano. La variacin regional fue
evidente cuando se compararon las tasas promedio en diferentes
cromosomas. La tasa de sustitucin es ms baja en el cromosoma X
y se observan diferencias importantes entre los autosomas (fig. 114A). Ya que el cromosoma X transcurre dos tercios de su vida en
mujeres, la tasa de sustitucin baja puede reflejar diferencias en el
nmero de divisiones de las clulas germinales en varones y muje
res (recuadro 11-4).
Tambin la variacin subcromosmica en la tasa de sustitucin
(lo mismo que en los ndices de deleciones e inserciones) es muy
obvia, como en el caso del cromosoma 22 humano (fig. 11-4B). Es
to refleja en parte la composicin de bases: aunque al parecer la ta
sa de sustitucin es ms alta en regiones de contenido muy alto o
bajo de G + C, la relacin es compleja. Con el mapa de recombi
nacin de alta resolucin deCode Genetics del genoma humano
(Kong y cois., 2002) como referencia se identific asimismo una
correlacin entre la tasa de sustitucin y la de recombinacin, y una
densidad de polimorfismo de nucletido nico (PNU) (vase fig.
11-4C). Si bien la heterocigosidad promedio en el genoma huma
no es del orden de 1 de cada 1 250 bases (Reich y cois., 2002), la
densidad de PNU puede variar de modo considerable en diferentes
partes del genoma y cuando se promedia a travs de ventanas de
200 kb, las tasas de heterocigosidad muestran una variacin hasta
de 10 veces (International SNP Map Working Group, 2001). En una
resolucin ms fina las regiones mesurables del genoma humano
que abarcan ms de decenas de miles de pares de bases al parecer
tienen tasas intrnsecamente altas y bajas de variacin de secuen
cias. En estas regiones slo una proporcin pequea (hasta 25%) de
la variacin parece deberse a la tasa de mutacin local; el contribu
yente mayor es la historia genealgica compartida (Reich y cois.
2002).
324
CAPITULO ONCE
Cuadro 11-2. Tasas de sustituciones sinnimas y no sinnimas en genes que codifican protenas en mamferos.
Gen
Nmero de codones comparados
Tasa no sinnima ( x 109)
Tasa sinnima ( x 109)
Actina a
376
0.01
2.92
Proteina ribosmica S14
150
0.02
2.16
Proteina ribosmica S17
134
0.06
2.69
Aldolasa A
363
0.09
2.78
HPRT
217
0.12
1.57
51
0.20
3.03
G lob in aa
141
0.56
4.38
Globina p
146
0.78
2.58
Albmina
590
0.92
5.16
ig v H
100
1.10
4.76
Hormona del crecimiento
189
1.34
3.79
Ig k
106
2.03
5.56
Interfern p,
159
2.38
5.33
Interfern y
136
3.06
5.50
Insulina
Datos de comparaciones de humanos y roedores extrados del cuadro 4-1 de Grauer y Li (2000).
Tasas de sustitucin en humanos comparadas con ratones

El bosquejo de las secuencias humana y de ratn tambin hizo po
sible analizar la forma en que las tasas de sustitucin pueden variar
en diferentes linajes. Como se consider que las sustituciones sin
nimas eran efectivamente neutrales desde el punto de vista de res
tricciones de selectividad, hace ms de 30 aos se sugiri el concepto
del reloj molecular constante (por el que un determinado gen o un
producto del mismo se somete a una tasa constante de evolucin
molecular). Sin embargo, desde entonces varias lneas de evidencia
argumentaron contra un reloj molecular constante (vase Ayala,
1999, y el cuadro 11-2 que muestra diferencias aparentes en la tasa

de sustituciones sinnimas de codn y tambin en el caso de susti
tuciones no sinnimas de codn).
Para valorar las tasas relativas de sustituciones de nucletidos en
dos linajes que conducen a las especies A y B actuales, muchos es
tudios utilizan una prueba de tasa relativa con una especie C de
referencia relacionada en forma distante (que se sabe que se ramifi
c temprano en la evolucin, antes de la divisin A-B). A fin de cal
cular el valor K, la frecuencia de sustituciones sinnimas, se
emplean comparaciones de pares de bases de ortlogos en A y C, y
en B y C. Los valores KAc y Kbq proporcionan entonces una medida
Cuadro 11-3. Conservacin de secuencias y tasas de sustitucin de genes ortlogos y DNA que codifica dominios en humanos
y ratones.
Regiones ortlogas
Identidad de aminocidos (%)
Ka
Ks
Ka/Ks
Protena de longitud completa
78.5
0.071
0.602
0.115
Regiones protenicas que contienen dominio
93.5
0.032
0.601
0.061
Regiones protenicas sin dominio
71.1
0.090
0.586
0.155
Todos los dominios predichos
95.1
0.024
0.627
0.062
Dominios catalticos
96.6
0.015
0.578
0.033
Dominios no catalticos
94.9
0.026
0.635
0.068
Dominios nucleares
98.6
0.008
0.655
0.050
Dominios secretados
88.9
0.058
0.694
0.091
Dominios citoplsmicos
96.7
0.015
0.587
0.041
KA, tasa de sustitucin no sinnima; Ks, tasa de sustitucin sinnima. Datos resumidos del cuadro 12 del Mouse Genome Sequencing Consortium
(2002) Nature 420, 520-562, con autorizacin de Nature Publishing Group.
11.2
MUTACIONES SIMPLES
325
A)
0.60
0.55
o
Cl
v>
<D
C
0.50
'
0.45
V)
D
0.40
0.35
7 8 9 10111213141516171819202122 X
Cromosoma humano
B)
-------Densidad de PNU
-------Tasa de recombinacin
o
a
9
c
O
o
.s
M
3
w
0.4 01__ _______ ___ ___________
0______ 15 20 25 30 35 40 45 50
Posicin en el cromosoma humano 22 (Mb)
15 20 25 30 35 40 45 50
Posicin en el cromosoma humano 22 (Mb)
Fig. 11-4. Variacin en las tasas de sustitucin entre cromosomas humanos y regiones subcromosmicas.
Se muestra la variacin en el nmero estimado de sustituciones por sitio dentro de sitios degenerados cudruples (azul; t ) y en sitios de repeticin
ancestrales (rojo; tAR) para diferentes cromosomas humanos A) y el cromosoma 22 humano largo B). Las lineas de guiones en A) Indican promedios
de la extensin del genoma (obsrvese el nmero de sustituciones claramente alto en sitios degenerados cudruples en el cromosoma 19 humano pero
tasas de sustitucin bajas en el cromosoma X) C). Correlacin de la tasa de sustitucin en repeticiones ancestrales (tAR) a travs del cromosoma 22 con
densidad de PNU y tasa de recombinacin. Adaptado de Mouse Genome Sequence Consortium (2002) Nature 4 2 0 ,520-562, figuras 29A y 30A con
autorizacin de Nature Publishing Group.
de las tasas relativas de mutacin en los linajes que conducen a es

pecies A y especies B. Pruebas de este tipo sugieren que la tasa de
mutacin en linajes que conducen a los primates es ms baja que
la de linajes de roedores, y ms baja an en el linaje que lleva a los
humanos de los das modernos (p. ej., Wu y Li, 1985; Li y Tanimura, 1987). Sin embargo, estudios ms recientes (p. ej., Kumar
y Subramanian, 2002) refutaron este concepto, a menudo con ba
se en imprecisiones percibidas en la filogenia de mamferos.
Con objeto de buscar posibles diferencias en las tasas de muta
cin en los linajes humano y del ratn, el Mouse Genome Sequencing
Consortium (2002) investig la divergencia de 18 subfamilias de re
peticiones ancestrales humanas y de ratn que fueron activas poco
antes de la divergencia entre el humano y el ratn. Miles de copias
distribuidas de modo ubicuo en cada una de las subfamilias se com

pararon dentro de cada genoma para valorar la divergencia de una se
cuencia consenso y de esa manera fue posible reducir al mnimo la
variacin regional en las tasas de sustitucin. Como se observa en los
ejemplos representativos del cuadro 11-4, las repeticiones ancestrales
con menor divergencia en las subfamilias humanas muestran alrede
dor de 16% de divergencia de una secuencia consenso (o unas 0.17
sustituciones por sitio), en tanto que las repeticiones en cada una de
las subfamilias del ratn variaron cuando menos 26 a 27% (alrede
dor de 0.34 sustituciones por sitio). Si se asume que la divergencia
entre el humano y el ratn ocurri hace cerca de 75 millones de aos,
tal vez las tasas promedio de sustitucin fueron de 2.2 X 10 ' en el
linaje humano y 4.5 X 10 en el linaje de ratn. Estas cifras son las
326 I CAPTULO ONCE
Recuadro 11-4. Diferencias de sexo en la tasa de mutacin y el problema de la evolucin impulsada por varones
Desde que Haldane observ por primera vez que casi todas las muta
ciones que ocasionan hemofilia se originaban en la lnea germinal mas
culina, se asumi que las mutaciones humanas se heredan de manera
preferencial a travs de la lnea paterna, lo que condujo al concepto de
evolucin impulsada por el varn (vase Li y cois., 2002). Se adoptaron
dos enfoques principales para estimar las tasas relativas de mutacin en
las lneas germinales masculina y femenina: mtodos moleculares evolu
tivos y observacin directa de mutaciones que causan enfermedad.
mutacin son poco frecuentes, porque incluye mutaciones de ganancia

de funcin en genes (FGFR2, FGFR3 y RET) que codifican protenas que
pertenecen a la misma familia protenica. Adems algunos tipos de
mutacin no muestran esta predisposicin paterna. Por ejemplo, la gran
mayora de las deleciones nuevas a gran escala en el gen de distrofina al
parecer surge en la oognesis (Grimm y cois., 1994; vase tambin ms
adelante) y las deleciones grandes que incluyen el gen de neurofibromina
suelen presentarse en la oognesis (Lpez Correa y cois., 2000).
Mtodos moleculares evolutivos
Las diferencias de sexo en la tasa de mutaciones pueden deberse a dis

tintos factores (vase Hurst y Ellegren, 1998; Li y cois., 2002). En muta
ciones premeiticas (mutaciones hereditarias que ocurren en una de las
divisiones de la clula germinal anterior a la meiosis) es probable que
un factor contribuyente de importancia sea la gran diferencia de sexo en
el nmero de divisiones de la clula germinal humana. En mujeres, el
nmero de divisiones celulares desde el cigoto hasta el ooclto fecundado
es constante porque todos los ooctos se formaron alrededor del quinto
mes del desarrollo y slo se requieren dos divisiones celulares adi
cionales para formar el cigoto (vase figura, panel A). Se piensa que el
nmero de divisiones sucesivas de las clulas femeninas desde el cigoto
hasta el vulo maduro se aproxima a 24, una cifra cercana a la divisin
estimada de la clula masculina de 30 a 31 necesaria desde el cigoto
hasta la espermatogonia madre en la pubertad. Se requieren seis divi
siones celulares subsecuentes para la espermatognesis pero ms ade
lante el ciclo de esta ltima ocurre aproximadamente cada 16 das o 23
ciclos por ao (figura, panel B). Como se ilustra en la figura, el nmero
de subdivisiones celulares necesarias para producir el espermatozoo
depende de la edad. Hacia la pubertad, las clulas germinales masculinas
habrn experimentado 30 divisiones mitticas y el espermatozoo puede
producirse despus de seis divisiones ms. El espermatozoo puede pro
ducirse luego de manera continua porque las clulas madre se dividen
cada 16 das ( = 23 divisiones por ao). Por tanto s la pubertad se pre
senta, por ejemplo, a los 15 aos, el nmero de divisiones de la clula
germinal necesario para producir espermatozoos en un varn de n aos
= 36 + [23 x ( n - 1 5 ) ] , o alrededor de 265 divisiones para un varn de
25 aos de edad y casi 840 divisiones en un varn de 50 aos de edad.
Por lo general incluyen una comparacin de genes homlogos ligados

a X y ligados a Y con ortlogos en otra especie a fin de estim ar el ndi
ce de mutaciones sinnim as para el gen del crom osom a X (Ksx) y el gen
del crom osom a Y (Ksy). A diferencia de los autosomas, los crom oso
mas del sexo pasan diferentes cantidades de tiempo en los dos sexos.
Las secuencias del crom osom a Y que se localizan fuera de la regin
seudoautosmica pasan todo su tiempo en varones; las secuencias del
crom osom a X pasan en promedio dos tercios del tiempo en mujeres y
un tercio en varones (las mujeres tienen dos cromosomas X; los varo
nes slo uno). Si se utiliza a para representar la relacin de la tasa de
mutacin de varones con la tasa de mutacin en mujeres, esto equiva
le a establecer la tasa de mutacin de varones en alfa en relacin con
una tasa de mutacin en mujeres de uno. Por consiguiente en la mayor
parte de las secuencias del cromosoma Y el ndice de mutacin es a.
En las secuencias del crom osom a X es 2/3 x 1 (la tasa de mutaciones
en mujeres) ms 1/3 x a (la tasa de mutacin en varones) = 2/3 +
a/3 . Por consiguiente la relacin observada KSX/KSY = (2/3 + a /3 )/a y
por tanto puede utilizarse para estim ar a. A menudo esto resulta en es
timados de alrededor de 4 a 6 para alfa en comparaciones que incluyen
primates (vase LI y cois., 2002; Makova y LI, 2002), aunque algunos
estudios proporcionan valores cercanos a dos, un valor no tan distinto
de las comparaciones equivalentes en roedores en los que hay menos
divisiones de las clulas germinales. En consecuencia es posible que
las mutaciones no dependan tanto de los errores de replicacin com o
se pensaba.
Observacin directa de mutaciones que causan enfermedad
Resulta claro que las mutaciones estimadas en este caso son un subgrupo especial. Se analizan muestras de un paciente con una mutacin
nueva y los dos padres (por lo general el padre que pas el cromosoma
deficiente se identifica mediante tipificacin para marcadores que flan
quean de cerca el gen de la enfermedad). En casi todos los casos la
mutacin se transmiti a travs de la lnea germinal, pero si slo se tipi
fica una muestra de sangre, las mutaciones pueden incluir algunas muta
ciones poscigticas (que no se encuentran en el espermatozoo o el
vulo sino que surgen tras la formacin del cigoto).
Los datos disponibles apuntan hacia una predisposicin por lo general
grande a favor de mutaciones paternas, cuando menos en mutaciones de
punto simple (vase Crow, 2000; Li y cois., 2002 y cuadro 11-5). Sin
embargo, las predisposiciones de sexo ms notables en las tasas de
tasas prom edio desde la divergencia humano-ratn y se piensa que la

tasa actual de sustitucin por ao en el genoma del ratn es mucho
ms alta (vase Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002). Las
mismas comparaciones permitieron estimar la tasa de ocurrencia de
inserciones y deleciones pequeas (<50 pb). Ambas especies mostra
ron una prdida neta de nucletidos (las proporciones de bases eliminadas:bases insertadas estuvieron en los lmites de 2:1 a 3:1), pero la
prdida total fue cuando menos el doble de alta en el ratn.
Cabe esperar que los errores en la replicacin/reparacin del DNA durante

las divisiones de la clula germinal proporcionen casi todas las muta
ciones de punto simples y por tanto puede esperarse que la tasa de
mutacin en un varn sea sustancialmente mayor que la de mujeres y que
resulte notable un efecto de la edad paterna (vase, p. e j Crow, 2000).
Sin embargo, es posible que haya mayor disposicin para que ciertas
clases de mutaciones hereditarias ms complejas ocurran durante la
meiosis (mutaciones meiticas) y no durante las muchas divisiones de
las clulas germinales anteriores a la meiosis. Por ejemplo, con frecuen
cia grandes deleciones por cruzamiento desigual ocurren en la meiosis
(seccin 11.3.2.). En el caso de las deleciones a gran escala en genes
ligados a X, como la distrofina que no tiene un homlogo del cromosoma
Y, una predisposicin importante hacia la mutacin meitica significara
que la mayor parte de las deleciones surgira en la oognesis.
11.3
M ecanism os genticos que

producen intercam bios de
secuencias entre repeticiones
Aunadas a las mutaciones simples muy frecuentes, hay varias clases de

mutaciones que incluyen el intercambio de secuencias entre secuencias
allicas o no allicas, que a menudo comprenden secuencias repetidas.
11.3 | MECANISMOS GENTICOS QUE PRODUCEN INTERCAMBIOS DE SECUENCIAS.
32"
Recuadro 11-4. (C o n tin u ac i n )
A>
5 meses
in tero
22 divisiones
mit ticas
Nacimiento
Madurez
sexual
2 divisiones
meiticas
Fecundacin
in
Segundo cuerpo polar
Cigoto
B)
Clula germinal primordial

asculina
30 divisiones
mitticas
15 aos
Pubertad
Una divisin de
clulas madre
cada 16 das
>. 4 divisiones
mitticas
Clave
S
Clula madre
Clula gonial
Clula meitica
Muerte celular
por apoptosis
2 divisiones
meiticas
Espermatides
Espermatozoos
Diferencia de sexo en las divisiones de la clula germinal.

A) La oognesis humana slo ocurre durante la vida fetal y cesa al momento del nacimiento. Se piensa que el nmero total de divisiones celulares se
aproxima a 24. B) La espermatognesis humana contina durante toda la vida adulta y los espermatozoos se originan de clulas madre que se autorrenuevan por la va de la espermatogonia. Por consiguiente el nmero de divisiones de la clula germinal depende mucho de la edad. Modificado de Vogel
y Motulsky (1996) Human Genetics. Probiems and Approaches, 3rd ed, con autorizacin de Springer Verlag. 1996, Springer-Verlag.
328
CAPTULO ONCE
ocurrir en el caso de unidades repetidas que son muy cortas (microsatlites), intermedias (minisatlites) o grandes. Diferentes mecanismos
genticos explican el polimorfismo de NVRT que depende del tama
o de la unidad de repeticin (vase las dos secciones siguientes).
Por ejemplo, el DNA de repeticin tndem es propenso a polimorfis

mos de delecin/insercin en los que los diferentes alelos varan en el
nmero de copias integrales de la repeticin tndem. Estos p olim orfis
m os d e n m ero va ria b le d e rep etici n t n d em (NVRT) pueden
Cuadro 11-4. Repeticiones ancestrales que variaron con mayor rapidez en el linaje del ratn que en el linaje humano.
Ratn
Humano
Clase de
sustitucin
Tasa de
divergencia
Tasa de
sustitucin
Tasa de
divergencia
Tasa de
sustitucin
Relacin
ajustada
L1MA6
LINE1
0.28
0.35
0.16
0.184
1.98
L1MA7
LINE1
0.28
0.35
0.16
0.181
1.98
L1MA8
LINE1
0.27
0.34
0.15
0.172
1.96
L1MA9
LINE1
0.28
0.35
0.18
0.201
1.86
MLT1A
MaLR
0.31
0.39
0.21
0.242
1.73
MLT1A0
MaLR
0.30
0.38
0.19
0.219
1.80
MLT1A1
MaLR
0.29
0.37
0.19
0.214
1.78
MER20
DNA
0.29
0.37
0.19
0.222
1.76
MER33
DNA
0.27
0.33
0.18
0.211
1.63
Tigger6a
DNA
0.29
0.37
0.18
0.211
1.85
Subfamilia
Resumido del Mouse Genome Sequencing Consortium (2002) Nature 420, 520-562. Los datos que se muestran son representativos de 10 de 18
subfamilias de repeticiones ancestrales del cuadro 6 del artculo de Nature.
Cuadro 11-5. Sesgo hacia mutaciones heredadas del padre que causan enfermedades humanas.
Enfermedad
Gen
Nmero de mutaciones
paternas
Nmero de mutaciones
maternas
Relacin de mutaciones
paternas/maternas ( a )
PLP
MECP2
27
13.5
Acondroplasia
FGFR3
40
Inf.
Sndrome de Apert
FGFR2
57
Inf.
Sndromes de Crouzon y Pfeiffer
FGFR2
22
Inf.
Sndrome de Denys-Drash
WT1
Inf.
RET
Neoplasia endocrina mltiple 2A
RET
10
Inf.
Neoplasia endocrina mltiple 2B
RET
25
Inf.
Neurofibromatosis tipo 2
NF2
13
10
1.3
Enfermedad de Von Hippel-Lindau
VHL
1.3
204
19
10
Ligada a X dominante
Enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher
Sndrome de Rett
Autosomica dominante
Total
Datos resumidos de Li y cois. (2002). Curr. Opin. Genet. Dev.
12, 650-656, con autorizacin de Elsevier.
11.3 1 MECANISMOS GENTICOS QUE PRODUCEN INTERCAMBIOS DE SECUENCIAS.
iOms las repeticiones dispersas tambin pueden predisponer a

jeiedones/duplicaciones por una variedad de mecanismos genticos.
Eaos temas se estudian en particular en el contexto de mutaciones de
^-crmedad y por consiguiente se presentan en la seccin 11.4.
11.3.1 El deslizamiento de la replicacin puede causar

polimorfismo de nmero variable de repeticin
tndem (NVRT) en repeticiones tndem cortas
(microsatlites)
--:inque las tasas de mutacin de la lnea germinal en locus microtlites varan, suelen ser de 10 3 a 10 4 por locus por generacin
vase Ellegreen, 2000). Se sabe que los alelos de nueva longitud en
ucrosatlites (CA)/(TG) y en locus marcadores tetranucletidos se

mimaron sin intercambio de marcadores de flanqueo. Lo anterior
significa que no se generaron por cruzamiento desigual (vase ms
delante). En lugar de ello, ya que se observ que nuevos alelos muuntes difieren del alelo parental original en una unidad de repeti
cin aislada, el mecanismo ms probable para explicar la variacin
ele longitud es una forma de intercambio de informacin de secuen
cias que comienza por p a rea m ien to err n eo d e ca d en a deslizada.
Esto ocurre cuando el pareamiento normal entre las dos cadenas com
plementarias de una hlice doble se altera por la vacilacin de las re
peticiones en las dos cadenas, que conduce al pareamiento incorrecto
de repeticiones. Aunque puede considerarse que el pareamiento err
neo de cadena deslizada se observa en DNA no replicante, el DNA de
replicacin puede ofrecer ms oportunidades para deslizamiento y en
consecuencia el mecanismo suele denominarse deslizamiento de re
plicacin o deslizamiento de polimerasa (vase fig. 11-5). Adems
del pareamiento errneo entre repeticiones tndem, se cree que la re
plicacin por deslizamiento genera deleciones y duplicaciones grandes
por pareamiento errneo entre repeticiones no contiguas y se sugiri
que es un mecanismo mayor para la evolucin de la secuencia del
DNA y el genoma (Levinson y Gutman, 1987; vase tambin Dover,
1995). El potencial patgeno de las repeticiones tndem cortas es con
siderable (secciones 11.5.1, 11.5.2).
329
alelo (fig. 11-6). Sin embargo, por lo general los intercambios de

cromtides hermanas iguales no pueden producir variacin gen
tica porque las cromtides hermanas tienen secuencias de DNA
idnticas.
El cruzamiento desigual (CDI) es una forma de recombinacin
homloga no allica en la que el cruzamiento tiene lugar entre secuen
cias no allicas en cromtides no hermanas de un par de homlogos
(fig. 11-7). A menudo las secuencias en las que el cruzamiento se lle
va a cabo muestran una homologa de secuencia muy considerable
que quizs estabiliza el pareamiento errneo de los cromosomas. El in
tercambio anlogo entre cromtides hermanas se denomina inter
cambio desigual de cromtide hermana (IDCH; vase fig. 11-7).
Tanto el CDI como el IDCH ocurren de manera predominante
en regiones del genoma que muestran repeticiones tndem de una
secuencia de tamao moderado a grande con gran homologa entre
las repeticiones (p. ej., en grupos de rDNA, DNA satlite comple
jo, etc.). En estos casos el muy alto grado de homologa de secuen
cia entre las diferentes repeticiones puede facilitar el pareamiento
anormal de repeticiones no allicas en cromtides no hermanas o
cromtides hermanas -el pareamiento errneo de cromtides con
una cromtide fuera de registro con la otra mediante un nmero in
tegral de unidades repetidas-. Si la rotura y la reunin del cromoso
ma se producen en tanto el pareamiento errneo de cromtides se
realiza en esta forma, habr un intercambio recproco de secuencias
que causa insercin en una cromtide y una delecin de igual tama
o en la otra (que puede ser patgena). Estos intercambios tambin
pueden conducir a ev o lu ci n co n certa d a al ocasionar que una va
riante de secuencia particular se disemine en la totalidad de un arre
glo de repeticiones tndem, lo que conduce a la homogenizacin de
las unidades repetidas (vase fig. 11-8).
Si bien el CDI y el IDCH son en particular frecuentes en DNA
de repeticin tndem, tambin pueden iniciarse por pareamiento
errneo entre repeticiones que estn separadas por una cantidad
considerable de secuencias intermedias. Por ejemplo, el pareamien
to errneo de repeticiones Alu no allicas o de otras repeticiones
dispersas puede ocurrir ocasionalmente y dar lugar a la formacin
de un locus duplicado en forma tndem de un locus original de co
pia nica (fig. 11-9).
11.3.2 Las unidades grandes de DNA de repeticin

tndem son propensas a insercin/delecin
como resultado de cruzamiento desigual o de
intercambios desiguales de cromtides hermanas
11.3.3 Los acontecimientos de conversin gnica

pueden ser ms o menos frecuentes en DNA
de repeticin tndem
Recombinacin homologa describe la recombinacin (cru z am ien

to) que ocurre en la meiosis o, rara vez, la mitosis entre secuencias de
DNA idnticas o muy similares y suele incluir la rotura de cromti
des no hermanas de un par de homlogos y la reunin de fragmen
tos para generar nuevas cadenas recombinantes. El intercambio de
cromtides hermanas es un tipo anlogo de intercambio de secuen
cia que comprende la rotura de cromtides hermanas individuales y
la reunin de fragmentos que al inicio se encontraban en diferentes
cromtides del mismo cromosoma. En condiciones normales tanto la
recombinacin homologa como el intercambio de cromtides her
manas abarca intercambios iguales -el corte y la reunin de las cro
mtides se presentan en la misma posicin en cada cromtide-.
Como resultado los intercambios se efectan entre secuencias allicas y en posiciones correspondientes dentro de los alelos. En el cru
zamiento igual intragnico entre dos alelos puede resultar un nuevo
alelo que es un gen de fusin (o gen hbrido) que comprende un
fragmento terminal de un alelo y la secuencia restante del segundo
Conversin gnica describe una transferencia no recproca de infor

macin de secuencias entre un par de secuencias de DNA no alli
cas (conversin gnica interlocus) o de secuencias allicas (conversin
gnica interallicd). Una del par de secuencias que interactan, el
d on a d or, permanece sin cambio alguno. La otra secuencia de
DNA, el acep tor, cambia por el reemplazo de alguna de sus secuen
cias o la totalidad de ellas por una secuencia copiada de la secuen
cia donadora (fig. 11-10). Por consiguiente el intercambio de
secuencias es direccional; la secuencia donadora modifica la secuen
cia aceptora, pero lo contrario no pasa.
Un posible mecanismo de conversin gnica considera la for
macin de un heterodplex entre una cadena de DNA del gen do
nador y una cadena complementaria del gen aceptor. Tras la
formacin del heterodplex, la conversin de un segmento del gen
aceptor puede ocurrir mediante reparacin incompatible -enzi
mas de reparacin del DNA reconocen que las dos cadenas de los
heterodplex no son compatibles a la perfeccin y corrigen la se-
330
CAPTULO ONCE
Replicacin normal
5'
3'
1
CAG

G TC
2
CAG
i
G TC
3
CAG

GTC
3'
GTC
GTC
G TC
CAG
CAG
CAG
l
CAG
CAG
CAG
El deslizamiento retrgrado causa insercin

5'
3'
CAG
->
CAG
GTC
GTC
GTC
3
CAG CAG
2
CAG
GTC -
G TC
3
CAG -
4
CAG -
CAG
CAG
3'
GTC
6
5
CAG
El deslizamiento antergrado causa delecin
I
5'
CAG
CAG
CAG
Fig. 11-5. El pareamiento errneo de cadena deslizada durante la replicacin del DNA puede causar inserciones o deleciones.
Se piensa que las repeticiones tndem cortas son en particular propensas a pareamiento errneo de cadena deslizada ( = pareamiento errneo de las
cadenas de DNA complementarias de una doble hlice de DNA de cadena nica). Los ejemplos muestran la form a en que el pareamiento errneo de
cadena deslizada puede ocurrir durante la replicacin; la cadena inferior representa una cadena de DNA parental y la superior indica la cadena comple
mentaria recin sintetizada. En estos casos el deslizamiento incluye una regln sin pareamiento (se muestra com o una burbuja) que contiene una o ms
repeticiones de la cadena recin sintetizada (deslizamiento retrgrado) o de la cadena parental (deslizamiento antergrado), que causan, respectiva
mente, una insercin o una delecin en la cadena recin sintetizada. N ota: es concebible que el pareamiento errneo de la cadena deslizada tambin
produzca inserciones/deleciones en el DNA no replicante. En estos casos se requieren dos reglones sin pareamiento, una que contienen repeticiones de
una cadena de DNA y la otra que incluye repeticiones de la cadena complementaria (vase Levinson y Gutman, 1987). Una enzima de reparacin
incompatible podra introducir entonces una insercin o delecin para corregir la falta de pareamiento.
cuencia del DNA de la cadena aceptora para que sea perfectamen

te complementaria en la regin convertida con la secuencia de la
cadena del gen donador (vase fig. 11-10).
La conversin gnica est bien descrita en hongos en los que es
posible recuperar y estudiar los cuatro productos de la meiosis (an
lisis de ttrada). Esto no puede realizarse en humanos y mamferos.
No es factible demostrar sin ambigedad la conversin gnica en or

ganismos superiores porque nunca puede distinguirse de aconteci
mientos de cruzamiento doble, por ejemplo (aunque cabra esperar
que los cruzamientos dobles que ocurren en proximidad muy cerca
na fueran en extremo improbables). No obstante, existen numero
sos casos en genomas de mamferos en los que un alelo en un locus
11.4 j MUTACIONES PATGENAS
XX
A-
TT
B-
331
CEN
GDI X
Cruzamiento homlogo
igual en ) (
n m
r t +1 l o i r t n
Gen de
fusin
Intercam bio desigual

de crom tides
hermanas
(IDCH)
Cruzamiento
desigual
(CDI)
Gen de fusin
i ??_____ X
D-
# ' ----
Fig. 11-6. El cruzamiento homlogo igual puede originar genes de

fusin.
c -M
CH
I > - Q
D c b ----- (
> D
V e
El ejemplo muestra la form a en que un cruzamiento intragnico igual

que ocurre entre alelos en cromtides no hermanas puede originar
genes de fusin nuevos compuestos de segmentos adyacentes de los
dos alelos. Obsrvese que los intercambios similares entre genes en
cromtides hermanas producen novedad gentica porque cabria espe
rar que las secuencias gnicas en las cromtides hermanas que interactan sean idnticas.
muestra un patrn de mutaciones que semeja con firmeza las que se

encuentran en alelos en otro locus de la misma especie, lo que su
giere intercambios similares a la conversin gnica entre locus.
Aunque las comparaciones simples de dos secuencias pueden ser
sugestivas, la prueba de conversin gnica es ms abrumadora
cuando un nuevo alelo mutante puede compararse directamente
con su secuencia progenitora. Ciertos locus muy mutables condu
cen por s mismos a este tipo de anlisis. En particular algunos lo
cus minisatlite hipervariables tienen tasas de mutacin de lnea
germinal altas (a menudo de 1% o mayores por gameto) y con fre
cuencia las repeticiones individuales muestran diferencias de nucletido que permiten reconocer subclases de repeticin. Las
mutaciones de lnea germinal pueden estudiarse mediante la detec
cin y la caracterizacin de alelos minisatlite mutantes en gametos
individuales. Para hacerlo se condujeron anlisis por PCR de ml
tiples alcuotas diluidas de DNA aislado del espermatozoo de un
individuo (PRC de fondo comn pequeo,), en los que cada al
cuota se calibr para que contuviera unas cuantas, tal vez 100, mo
lculas informativas (Jeffreys y cois., 1994).
Los productos de la PCR recuperados de fondos comunes indi
viduales se tipifican para identificar cualquier nueva mutacin que
d como resultado un alelo nuevo cuya longitud muestra una dife
rencia suficiente para distinguirlo del alelo progenitor. Los anlisis
de los patrones de mutacin de la lnea germinal en tres de estos lo
cus no reconocieron intercambios identificadores de flanqueo y
mostraron que la mayor parte de las mutaciones que ocurren en es
tos locus es polar, e incluye la ganancia preferencial de unas cuan
tas repeticiones en un extremo de un arreglo de repeticin tndem.
Se observa una predisposicin a la ganancia de repeticiones y la
prueba se obtuvo del intercambio no recproco de secuencias entre
Fig. 11-7. El cruzamiento desigual y el intercambio desigual de

cromtides hermanas causan inserciones y deleciones.
Los ejemplos ilustran el pareamiento desigual de cromtides dentro de
una disposicin de repeticin tndem. El cruzamiento desigual com
prende pareamiento desigual de cromtides no hermanas seguido de
rotura y nueva unin de cromtides. El intercambio desigual de
cromtides hermanas incluye pareamiento desigual de cromtides her
manas seguido de rotura y nueva unin de la cromtide. Para mayor
simplicidad, se muestra que las roturas de las cromtides ocurren
entre repeticiones, pero por supuesto pueden presentarse dentro de
repeticiones. Nota: ambos tipos de intercambios son recprocos: una
de las cromtides participantes pierde parte del DNA, en tanto que la
otra gana un poco.
alelos, que sugiri conversin gnica interallica (Jeffrey y cois.,

1994). Tambin se encontraron evidencias de conversin gnica interlocus en genes humanos, en especial en el gen de 21 -hidroxilasa
de esteroide (vase seccin 11.5.3).
11.4
M utaciones patgenas
Por lo general las mutaciones perjudiciales afectan la expresin g

nica, ya sea por alteracin directa de una secuencia de codificacin
o mediante la modificacin de secuencias intragnicas o extragnicas importantes para la expresin gnica (vase cuadro 16-1 para
las diferentes formas en que la expresin gnica puede alterarse por
mutacin). Casi todas las mutaciones patgenas registradas se
identifican en secuencias de codificacin (sobre todo sustituciones
no sinnimas, mutaciones antisentido e inserciones/deleciones de
cambio de marco). A causa de esta mutabilidad ms o menos alta,
el dinucletido CpG suele localizarse en puntos crticos para mu
tacin patgena en el DNA de codificacin (vase Cooper y cois.,
2000). Otros puntos crticos comprenden repeticiones tndem
dentro del DNA de codificacin (vase ms adelante). Entre las
332 j CAPITULO ONCE | INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIN Y REPARACIN DEL DNA
(1 /4 )
i......r
Mutacin ( )
~1 T~
R,
CDI
Ganancia de
repeticin mutante
X
I 1
i i ( 2/5 )
I
Prdida de
repeticin normal
Diseminacin de la
mutacin a muchos
miembros de la
poblacin de manera
que en este locus casi
todas las clulas tienen
una repeticin mutante
de cada cuatro
repeticiones (= 1/4)
I ~T
CDI
I----- (2/4)
I----Ganancia de
repeticin mutante
T . r . r . i i (3/5)
~i
Prdida de
repeticin normal
.. .t ~t....a
i .
(3'4)
etctera
Fig. 11-9. La duplicacin gnica tndem puede deberse al cruza

miento desigual o al intercambio desigual de cromtides hermanas
facilitados por repeticiones dispersas cortas.
La flecha doble de la parte inferior indica la extensin de la duplicacin
gnica tndem de un segmento que contiene secuencias del gen A y
de flanqueo. Un grado alto de homologa secuencial e n te repeticiones
no allicas cortas (R1R2) podria facilitar el pareamiento errneo original
de cromtides. Ntese que el mismo mecanismo puede producir deleciones a gran escala (vase fig. 16-3).
1................ >1------ (4/4)
Fig. 11-8. El cruzam iento desigual en una disposicin de repeticin

tndem puede dar por resultado homogenizacin de secuencia.
Obsrvese que la diseminacin inicial de la variante de secuencia nue
va a la misma posicin en los cromosomas de otros miembros de una
poblacin sexual puede ocasionar deriva gentica aleatoria (vase
recuadro 11-2). Una vez que la mutacin alcanza una frecuencia de
poblacin razonable (panel izquierdo) puede diseminarse a otras posi
ciones dentro del arreglo (panel derecho). Esto puede ocurrir por
ganancia sucesiva de repeticiones mutantes com o resultado del cruza
miento desigual (o intercambios desiguales de cromtides hermanas) y
la prdida ocasional de repeticiones normales. Por ltim o la repeticin
mutante puede reemplazar la secuencia de repeticin original en todas
las posiciones dentro del arreglo y dar lugar a homogenizacin de
secuencia para la repeticin mutante. Se piensa que el resultado de
esta homogenizacin de secuencia es la evolucin concertada espec
fica de especie para secuencias de DNA repetidas. CDI, cruzamiento
desigual.
mutaciones intragnicas no codificantes son importantes las muta

ciones en sitios de empalme y las que se efectan en elementos con
servados de las secuencias no traducidas. Las mutaciones de
secuencias no codificantes extragnicas incluyen mutaciones en los
elementos promotor y otros de control.
11.4.1 La tasa de mutacin perjudicial es alta en

homnidos
La tasa mutacional de mutaciones neutrales (las que no son perju
diciales ni ventajosas para el organismo que las porta) es fcil de
estimar si se deriva primero la tasa de cambio de alguna secuencia
que se supone neutral (seccin 11.2.5). En contraste, suele ser ms
difcil medir la tasa de mutacin perjudicial y no se contaba con

estimaciones convincentes para ningn vertebrado hasta un estu
dio publicado por Eyre-Walker y Keightley (1999). Ellos investi
garon cambios de aminocidos en 46 protenas que ocurrieron en
la lnea ancestral humana tras su divergencia de la del chimpanc.
Si todas las sustituciones no sinnimas eran neutrales, cabra espe
rar 231 nuevas sustituciones en su muestra de 46 genes (con base
en una tasa promedio de mutacin neutral de 0.0056 sustitucio
nes no sinnimas por nucletido y un total de 41 471 nucletidos
investigados). Por el contrario, slo se observaron 143 sustitucio
nes no sinnimas; se supuso que las restantes 88 de estas sustitu
ciones esperadas se eliminaron por seleccin natural porque eran
perjudiciales.
Eyre-Walker y Keightley (1999) estimaron una tasa perjudicial
de 1.6 mutaciones por persona por generacin bajo el supuesto de
60 000 genes humanos. El nuevo clculo basado en la estimacin
ms reciente de 30 000 genes con una secuencia de codificacin
promedio de 1.6 kb proporciona una tasa perjudicial cercana a
0.84 de cada 2.2 mutaciones de DNA de codificacin por persona
por generacin. El DNA de codificacin constituye menos de
I.5% del genoma humano y a partir de una tasa de mutacin pro
medio estimada de alrededor de 2.5 X 10 8 mutaciones por sitio
nucletido, se calcul que la cifra total de mutaciones que ocurre
en el genoma diploide humano se aproxima a 175 por generacin
(Nachman y Crowell, 2000).
II.4 .2 El genoma mitocondrial es un punto crtico para

mutaciones patgenas
A causa del tamao muy grande del genoma humano, casi todas las
mutaciones tienen lugar en secuencias de DNA nuclear. En com
paracin, el genoma mitocondrial es un blanco pequeo de muta
cin (alrededor de 1/200 000 del tamao del genoma nuclear). A
diferencia de los genes nucleares, los mitocondriales se encuentran
11.4
en miles de copias en cada clula somtica humana. Algunas clu-is. como las cerebrales y las musculares, tienen requerimientos de
jsforilacin oxidativa muy altos y por consiguiente ms mitocon.iras. El oocito es excepcional, ya que posee alrededor de 100 000
molculas de mtDNA, mucho ms que las clulas somticas.
En individuos normales alrededor de ~99.9% de las molculas
e mtDNA es idntico (homoplasmia). Sin embargo, si una nueva
mutacin surge y se disemina en la poblacin de mtDNA, habr dos
genotipos de mtDNA muy frecuentes (heteroplasmia). S se consi
dera que una mutacin en el DNA mitocondrial debe surgir en una
molcula aislada de mtDNA, la intuicin indica que cabra antici
par que las posibilidades de que una mutacin aislada de mtDNA se
fijara seran muy bajas y la tasa de mutacin tambin baja de mane
ra correspondiente. A partir de lo anterior puede esperarse que la
proporcin de enfermedad clnica por una mutacin patgena en el
genoma mitocondrial debe ser en extremo baja. Por el contrario, la
frecuencia de trastornos mitocondriales es bastante alta (seccin
16.6.6) y el genoma mitocondrial puede considerarse como un pun
to crtico (punto caliente) de mutacin. Esto tambin es cierto pa
ra el DNA mitocondrial animal en genera], en el que se informa que
las mutaciones se fijan a un ndice casi 10 veces mayor que en se
cuencias equivalentes en el genoma nuclear (Brown y cois., 1979).
Las explicaciones para el impacto patgeno y la mutabilidad al
tos del mtDNA son varias. Noventa y tres por ciento del mtDNA
es DNA codificante (pero slo 1.6% del DNA nuclear). Se piensa
que los intermediarios de oxgeno reactivo formados por la cadena
respiratoria causan un dao oxidativo sustancial al mtDNA (que, a
diferencia del DNA nuclear, no est protegido por histonas). Tam
bin es necesario que el mtDNA efecte muchas ms rondas de re
plicacin que el DNA cromosmico. Las mitocondrias carecen de
un mecanismo adecuado de reparacin del DNA y aunque en la ac
tualidad se conocen varios sistemas de reparacin del mtDNA bien
caracterizados, algunas mutaciones frecuentes no pueden repararse,
inclusive los dmeros de timidina (seccin 11.6).
El problema de la forma en que las mutaciones del mtDNA se
fija n requiri la explicacin de un cuello de botella de mtDNA en
el desarrollo. Tanto el nmero de clulas germinales como el de mi
tocondrias por clulas fluctan mucho durante la oognesis. Por
consiguiente el feto femenino de tres semanas contiene el orden de
50 clulas germinales primordiales, cada una con unas 10 mitocon
drias por clula, pero despus el nmero de clulas se expande con
rapidez, de modo que alrededor de la novena semana el feto tendr
ms de medio milln de oogonias con 200 mitocondrias cada una.
Se piensa que el cuello de botella ocurre en una fase muy tempra
na entre la etapa de la clula germinal primordial y la etapa de oogonia cuando un nmero muy pequeo de clulas germinales
primordiales migra a la gnada y molculas mutantes de mtDNA
pueden fijarse por derivacin aleatoria y tal vez mediante seleccin
(vase p. ej., Jenuth y cois., 1996; Chinnery y cois., 2000).
11.4.3 Casi todas las mutaciones por empalme

[splicing) alteran una secuencia conservadora
necesaria para el empalme normal, pero algunas
ocurren en secuencias que no suelen requerirse
para empalme
Muchos genes se someten de manera natural a formas alternativas
de empalme (corte y unin) de RNA. Adems las mutaciones pue
den producir una forma aberrante de empalme de DNA que es pa
MUTACIONES PATGENAS
333
tgena. En ocasiones esto conduce a la exclusin de secuencias de

exones completos del RNA maduro (omisin d e exn; vase ms
adelante) o la retencin de intrones completos. En otros casos el pa
trn de empalme anormal excluye parte de un exn normal o pro
duce nuevas secuencias exnicas. Las mutaciones de punto que
alteran una secuencia conservada que en condiciones normales se re
quiere para el empalme de RNA son comparativamente frecuentes.
Sin embargo, en ocasiones es posible inducir el empalme aberrante
de un gen mediante la mutacin de otros elementos secuenciales
que semejan secuencias d e donador d e em palme (= sitio de empalme
5') o aceptor d e em palm e (= sitio de empalme 3) pero que no sue
len participar en el empalme.
Las mutaciones que alteran secuencias son importantes

para el empalme
Las secuencias conservadas importantes para el empalme incluyen:
los dinucletidos G Ty AG en esencia invariables, que se localizan
en el inicio (5') y el final (3') de un intrn respectivamente; las se
cuencias intrnicas y exnicas justo adyacentes a las secuencias en
el donador de em palm e y el aceptor d e empalme, inclusive la va d e
polipirim idina que precede al final de un intrn, y el sitio d e rami
fica cin d e em palm e (fig. 1-15). Adems se sabe que el empalme se
regula a travs de secuencias intensificadoras d e em palm e (regulacin
positiva) y secuencias silenciadoras d e em palm e (regulacin negati
va), que se encuentran tanto dentro de exones como de intrones.
Las secuencias intensificadoras de empalme exnico (LEE)
son secuencias discretas pero degeneradas de unos 6 a 8 nudetidos de largo que enlazan protenas reguladoras de empalme
(Blencowe, 2000; seccin 10.3.2). Estn presentes en casi todos,
s no es que la totalidad, de los exones (tanto de manera constitu
tiva como empalmadas en forma alternativa) y en fecha reciente
se predijo un grupo de 10 secuencias tpicas IEE para exones hu
manos, algunas importantes para regular el reconocimiento del
donador o el aceptor de empalme (Fairbrother y cois., 2002). Las
secuencias silenciadoras de empalme exnico (SSE) y otros si
lenciadores de empalme se comprenden mucho menos bien (Fair
brother y Chasn, 2000).
Las mutaciones que alteran secuencias importantes para el em
palme pueden tener las distintas consecuencias siguientes:
reten ci n d e in tr n : que se debe a falla completa del empal
me. Es ms probable cuando el intrn es pequeo y la secuen
cia vecina carece de sitios de empalme legtimos alternativos o
sitio s d e em p a lm e crp tico s (secuencias que semejan las se
cuencias del sitio de empalme de consenso pero que el apara
to de empalme no suele utilizar; vase fig. 11-11A). Se
requiere empalme para la salida eficiente de mRNA de los ge
nes que contienen intrones (Lou y Reed, 1999) y por tanto la
retencin de secuencias intrnicas en mRNA suele significar
que se retuvo mRNA en el ncleo para evitar el contacto con
la maquinaria de traduccin (si se traduce, habra la posibili
dad de aminocidos inapropiados o de un cambio del marco
de lectura traduccional);
o m isi n d e ex n : el aparato de empalme emplea un sitio de
empalme legtimo alternativo. El resultado de las mutaciones
de una secuencia donadora de empalme suele ser la omisin
del exn corriente arriba; con frecuencia la mutacin del
aceptor de empalme conduce a la omisin de exn corriente
abajo (fig. 11 -11A). Sin embargo, cabe sealar que tambin
son posibles otros resultados finales, inclusive el uso de sitios
334
CAPTULO ONCE
A)
A1
C)
Donador
la!
. . . T
A
Donador
............... ..
X HHHBHBHi I
Aceptor
Aceptor
C o n v e rs i n | a l lic a
A1
In v a s i n d e c a d e n a y
fo rm a c i n d e h e te ro d p le x
G*
A2/A1/A2
B)
C o n v e rs i n
in te rlo c u s
B/A/B
* * * * T Ksmk G mmm C * * * * * * *
a A mammC mm a G
mh
Fig. 11-10. La conversin gnica comprende intercambios de secuencias no recprocos.

A) Conversin gnica interallica. Obsrvese la naturaleza no recproca del intercambio de secuencias: la secuencia donadora no se altera pero la
secuencia aceptora se modifica por incorporacin de la secuencia copiada de la secuencia donadora. B) Conversin gnica interlocus. Se facilita por
un grado alto de homologa secuencial entre secuencias no allicas, como en las repeticiones tndem. C) Reparacin incompatible de un heterodplex.
Es uno de los varios posibles modelos para explicar la conversin gnica. El modelo considera invasin por una cadena de ia secuencia donadora para
form ar un heterodplex con la cadena complementaria de la secuencia aceptora, desplazando por consiguiente la otra cadena del aceptor. Las enzimas
de reparacin incompatible reconocen las bases pareadas de modo errneo en el heterodplex y corrigen las incompatibilidades, de manera que la
secuencia aceptora se convierte para ser perfectamente complementaria en secuencias a la cadena donadora. La replicacin subsecuente de la
cadena aceptora y el sellamiento de las muescas termina la conversin.
de empalme crpticos exnicos o intrnicos alternativos

(vase ms adelante), y por tanto no siempre es fcil prede
cir el resultado final -por ejemplo, vase Takahara y cois.,
(2002)-. Son factibles varios resultados finales cuando el
exn se omite. Si el nmero de nucletidos en el exn no
puede dividirse por tres, un cambio de marco introducir un
codn de terminacin prematura, que a menudo resulta en
un transcrito de RNA inestable y no en un polipptido. Si la
omisin del exn no causa un cambio de marco, la ausencia
de los aminocidos que normalmente se codifican suele pro
ducir un poliptpido no funcional anormal segn la impor
tancia de estos aminocidos para la funcin, la estructura, o
ambos, de la protena.
Las mutaciones de secuencias no suelen ser importantes

para el empalme de RNA
Los sitios de empalme crpticos (o latentes) semejan de manera
coincidental las secuencias de sirios de empalme autnticos pero
no suelen emplearse en el empalme a menos que: a) una mutacin
altere de manera directa la secuencia de modo que el aparato de
empalme la reconoce ahora como un sitio de empalme (activacin
directa), y b) ocurra una mutacin en un sitio de empalme autn
tico y d lugar a falla de un donador o aceptor de empalme, en cu
yo caso el aparato de empalme busca otras posibles alternativas y
selecciona un sitio de empalme crtico (activacin indirecta, vase
la seccin respecto a omisin d e exn antes). Como las secuencias
11.4
MUTACIONES PATGENAS
335
(A)
Empalme normal
SA
SD
SD
p *i
co
Retencin de intrn
i
i
(
m
[SA]
ISAl
co
u n
I< I
cn
2 + intrn 2 + 3
(B)
Activacin del sitio de empalme crptico
Activacin del aceptor de empalme crptco en el intrn 1
sa
Exn 2 extendido
Activacin del donador de empalme crptico en el exn 2
Exn 2 acortado
Fig. 11-11. Las mutaciones de empalme surgen por alteracin de seales de empalme conservadas o por activacin de sitios de empalme crpticos.
A) Alteracin de seales de empalme conservadas. La mutacin en secuencias del donador o el aceptor de empalme (vase fig. 1-15 para secuen
cias consenso) puede dar por resultado: a) retencin del intrn en la que hay una falla de empalme y no se extirpa una secuencia de intrn intermedia;
b) omisin de exn en la que el espliceosoma une entre s los sitios donador y aceptor de empalme de exones no vecinos. Nota: en ocasiones una
mutacin de sitio de empalme causa activacin indirecta de un sitio de empalme crptico alternativo (que por lo general no se utiliza en el empalme), de
preferencia al emplear otro sitio de empalme legtimo; vase, p. e j Takahara y cois. (2002). B) Activacin directa de sitios de empalme crpticos.
Una mutacin puede activar en forma directa un sitio de empalme crptico al cambiar su secuencia para que se tom e ms parecida a la secuencia con
senso del donador o el aceptor de empalme. El sitio de empalme crptico alterado puede ahora ser reconocido y utilizado por el espliceosoma. Vase las
figuras 1 1 - 1 2 y 11-13 para ejemplos de activacin de un sitio de empalme crptico exnico y uno intrnico respectivamente.
336
CAPTULO ONCE
donadora y aceptora de empalme individuales a menudo muestran

cierta variacin en las secuencias consenso que se muestran en la
figura 1-15, suelen observarse sitios de empalme crpticos dentro
de los genes. Si el mRNA alterado no se traduce, el uso de un si
tio de empalme crptico titrnco introducir nuevos aminocidos;
el empleo de un sitio de empalme crptico exnico ocasionar una
delecn de DNA de codificacin (fig. 11-1 IB).
Para ejemplos elaborados de la activacin de un donador de em
palme crptico dentro de un exn y un aceptor de empalme crptico
dentro de un intrn vase las figuras 11-12 y 11-13 respectivamente.
El primero es un recordatorio que advierte que las mutaciones al pa
recer silenciosas pueden ser patgenas. Cabe sealar que en algunos
casos las mutaciones que ocurren dentro de exones pero no en sitios
de empalme crpticos tambin pueden inducir omisin de dicho
exn (vase seccin siguiente).
11.4.4 Las mutaciones que introducen un codn

de terminacin prematuro a menudo dan
por resultado un mRNA inestable, pero otros
resultados finales son posibles
Varias clases de mutaciones pueden introducir un codn de termi
nacin prematuro (mutaciones de term inacin d e cadena). Las mu
taciones sin sentido producen un codn de terminacin prematuro
mediante la simple sustitucin de un codn normal con un codn
de detencin. Las inserciones y deleciones en el cambio de marco
tambin suelen introducir un codn de terminacin prematuro no
muy lejos corriente abajo del sitio de mutacin. Esto se debe a que
no existe una presin de seleccin para evitar codones de detencin
en los otros marcos de lectura traduccionales y por consiguiente,
con base en las frecuencias de nucletidos establecidas, suele encon
trarse cuando menos un codn de detencin dentro de una tira de
100 nucletidos corriente abajo del sitio de mutacin. Una varie
dad de mutaciones en el sitio de empalme tambin puede introdu
cir un codn de terminacin prematuro, por ejemplo, por omisin

de un exn aislado que contiene varios nucletidos que no pueden
dividirse por tres. Las mutaciones de terminacin de la cadena tie
nen diversas consecuencias potenciales para la expresin gnica:
mRNA inestable. Es con mucho la consecuencia ms frecuen
te. Un mRNA que lleva un codn de terminacin prematuro
cuando menos 50 nucletidos corriente arriba de la ltima
unin de empalme suele degradarse con rapidez in vivo por una
forma de vigilancia d el RNA que se conoce como decaimiento
de mRNA mediado sin sentido (DMSS); vase Lykke-Andersen y colaboradores (2001); Maquat (2002). Ello puede evitar
las posibles consecuencias letales de la formacin de un polipptido truncado que podra interferir con funciones vitales de la
clula;
p o lip p tid o tru n ca d o. El DMSS asegura que rara vez ocurran
in vivo polipptidos truncados, pero depende del empalme. Por
consiguiente es posible que las mutaciones sin sentido en 1 de
alrededor de 5% de los genes humanos que carecen de intrones
(cuadro 9-5) produzcan polipptidos truncados. Puede ser di
fcil predecir el efecto de los polipptidos truncados y depen
der, entre otras cosas, de la extensin del truncamiento, la
estabilidad del producto polipptido y su capacidad para inter
ferir con la expresin de alelos normales;
om isin d e exn. En un pequeo subgrupo de mutaciones sin
sentido los posibles efectos perjudiciales en la expresin gnica
pueden mitigarse por un proceso denominado empalme alte
rado asociado sin sentido (EASS); vase Wang y colaborado
res (2002). En este caso el patrn de empalme normal se altera,
por ejemplo, por omisin de exn, de manera que el codn de
detencin se brinca y se produce un mRNA estable que ca
rece de mutacin. Algunos autores piensan que la existencia de
EASS implica que debe haber cierto mecanismo de traduccin
nuclear que permite que los codones se lean antes de exportar
se el mRNA al citoplasma. Sin embargo, una explicacin alter-
Exn 16
G lu
Gl
Lis
Gli
Lis
Tre
S e r P ro A s p
\
Lis
G ln
Lis
G ln S e r P ro G ln
L . GAG GGC AAA GGC AAA ACA AG C C C T GAT AAG CAA AAG CAG TC C CCA CAG
Exn 17
|nt r n 1 6
P ro G ln P ro
e r S e r A sp
gt---------- ag C( C A C A G C C T G G C A G C T C T G A T .......
\ \ l \' ' 1 1 1 /
AGGGTAAAG
Nuevo sitio donador de empalme
" ' i '"

Exn 16
Intrn 16
... G A G G g ta a a g G lu A ;
Exn 17
-a g C C A C A G C C T G G C A G C T C T G A ... .
la
Tre A la T rp
G ln Leu D E T E N C I N
Fig. 11-12. Cuando una mutacin silenciosa no es silenciosa.

Este ejemplo muestra una mutacin que se identific en un paciente con distrofia muscular de la cintura de los miembros LGMD2A. La mutacin se
encontr en el gen 3 de calpana, un locus conocido por esta forma de distrofia muscular, pero ocurri en la posicin de la tercera base de un codn y al
parecer era una mutacin silenciosa. Conducira al reemplazo de un codn de glicina (GGC) por otro codn de glicina (GGT). Sin embargo, se piensa que
la mutacin es patgena. La sustitucin causa la activacin de una secuencia donadora de empalme crptico (AGGGAAAAG) dentro del exn 16 que
origina un empalme aberrante con prdida de la secuencia de codificacin del exn 16 y la introduccin de un cambio de marco. Vase Richard y
Beckman (1995). Nota: otra posibilidad de mutaciones sinnimas patgenas son las que ejercen su efecto mutando una secuencia intensificadora de
empalme exnico (seccin 11.4.3).
11.5 | POTENCIAL PATGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS
Exn 1
Exn 2
gt
Exn 3
-CCCTTCCCACGSitio de
empalme crptico
IL
33
_\ \ \ \ 1 1 1 / ^
- CCCTTCCCAGG ' i I I I I \\ \
Sitio de empalme
crptico activado
Exn 2A
g t --------------- CCCTTCCCA G
ag
Fig. 11-13. Las mutaciones pueden causar empalme anormal de RNA por activacin de sitios de empalme crpticos.
Activacin de una secuencia aceptara de empalme crptico localizada dentro de un intrn (comprese la fig. 11-12 que ilustra la activacin de un sitio
donador de empalme crptico dentro de un exn). Una mutacin puede ocasionar la alteracin de una secuencia que no es importante para el empalme
de RNA de manera que crea un nuevo sitio de empalme alternativo. En el ejemplo que se ilustra, se considera que la mutacin cambia un nucletido ais
lado en el intrn 1. El nucletido se presenta dentro de una secuencia de sitio de empalme crptico que est estrechamente relacionada con la secuencia
consenso aceptora de empalme (vase fg. 1-15), pero no tiene el dinucletido AG conservado. La mutacin supera esta diferencia, mediante la acti
vacin del sitio de empalme crptico para que compita con el sitio aceptor de empalme natural. Si lo utiliza el aparato de empalme, resulta un exn nue
vo, exn 2A, que contiene la secuencia adicional que puede o no producir un cambio de marco.
nativa para la mayor parte, si no es que la totalidad, de los ca

sos de EASS es que la mutacin sin sentido altera un in ten sifi c a d o r d e em p a lm e ex n ico (vase seccin 11.4.3; y Maquat,
2002 para conceptos alternativos respecto a la forma en que el
EASS se activa).
11.5
Potencial patgeno de secuencias

repetidas
El genoma humano tiene una proporcin muy alta de secuencias de

DNA repetidas (secciones 9.5 y 9.6), que son propensas a variacin
en el nmero de copias y el intercambio de secuencias (cuadro 11-6).
Una disminucin del nmero de repeticiones suele causar una delecin patgena, pero la expansin por duplicacin de secuencias
tambin puede ser patgena (vase Mazzarella y Schlessinger, 1998).
Ciertas regiones cromosmicas, en especial las subtelomricas y pericentromricas, alojan grandes tramos de DNA duplicado y la ines
tabilidad de estas regiones puede predisponer a enfermedad (vase
Eichler, 1998). Tambin es posible que las repeticiones dispersas
produzcan mutaciones patgenas por una diversidad de mecanis
mos (cuadro 11-6).
11.5.1 El pareamiento errneo de cadena deslizada

de repeticiones tndem cortas predispone
a deleciones patgenas e inserciones
de cambio de marco
Las inserciones y deleciones en el DNA de codificacin son raras
porque suelen introducir un cambio de marco traduccional. Sin
embargo, en ocasiones ocurre por azar una serie de repeticiones

tndem de un nmero pequeo de nucletidos en la secuencia de
codificacin para un polipptido. Como los locus microsatlite, es
tas repeticiones son propensas a mutacin por pareamiento errneo
de cadena deslizada. En consecuencia el nmero de copias de repe
ticiones tndem est sujeto a fluctuaciones, introduciendo una delecin o una insercin de una o ms unidades repetidas. Si la
mutacin se presenta en el DNA que codifica un polipptido, con
frecuencia la delecin resultante tendr un efecto profundo en la
expresin gnica. En condiciones normales las deleciones de cam
bio de marco suprimen la expresin gnica y pueden ser frecuentes.
Aun si la delecin no produce un cambio de marco, las deleciones
de uno o ms aminocidos pueden ser patgenas (fig. 11-14). Tam
bin cabr esperar que las inserciones pequeas de cambio de marco
conduzcan a la prdida de expresin gnica y a menudo la insercin
es una repeticin tndem de las secuencias que la flanquean. Sin em
bargo, con frecuencia no cabra anticipar que las inserciones sin cam
bio de marco sean patgenas, a menos que la insercin ocurra en una
regin de importancia crtica y desestabilice una estructura esencial o
impida de alguna manera la funcin gnica.
11.5.2 La expansin inestable de repeticiones tndem

cortas puede causar una diversidad de
enfermedades, pero el mecanismo mutacional
no se comprende bien
Ciertas repeticiones tndem cortas dentro de un gen o en la cerca
na inmediata del mismo pueden expandirse a longitudes conside
rables y afectar la expresin gnica, lo que causa enfermedades. A
veces una repeticin expandida en forma moderada que origina
338 i CAPTULO ONCE | INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIN Y REPARACIN DEL DNA
Cuadro 11-6. Las secuencias de DNA repetidas a menudo contribuyen a la patognesis.

Tipo de mutacin
Mecanismos y ejemplos
Delecin
Pareamiento errneo de cadena deslizada (vase fig.

11-5). Ejemplos en la figura 11-14
Insercin de cambio de marco
Pareamiento errneo de cadena deslizada
Expansin de tripleto repetido
Inicialmente por pareamiento errneo de cadena

deslizada?; expansin subsecuente a gran escala por
un mecanismo desconocido
Delecin intragnica
CDI/IDCHa (vase fig. 11-7)
Delecin gnica parcial o total

CDI/lDCHa (fig. 11-7)
Ejemplos en la figura 11-16
Alteracin de la secuencia gnica

Conversin gnica (fig. 11-10)
Ejemplos en las figuras 11 -16 y 11 -17
Repeticiones directas cortas
Delecin
Pareamiento errneo de cadena deslizada o

recombinacin intracromtide?
Elementos repetidos dispersos (p. ej.,

repeticiones Alu)
Delecin/replicacin
CDI/IDCH3 (vase seccin 11.5.4)
Repeticiones invertidas
Inversin
Intercambio intracromtide, p. ej., factor VIII (vase fig.

1 1 -20)
Repeticiones largas con nmero de copias bajo
Delecin/duplicacin a gran escala
CDI/IDCH3 (vase cuadro 11-7 y fig. 11-19)
Elementos transposables activos
Insercin intragnica por retrotransposones
Retrotransposicin. Para ejemplos vase seccin 11.5.6
Tipo de DNA repetido

R epeticiones tndem
Repeticiones muy cortas entre los genes
Repeticiones intragnicas de tamao moderado
Repeticiones tndem grandes que contienen

genes completos
Repeticiones dispersas
aCDI, cruzamiento desigual; IDCH, intercambio desigual de cromtide hermana.
una enfermedad puede ser del todo estable y propagarse a travs de

varias generaciones sin cambiar de tamao. Sin embargo, en otros
casos la repeticin expandida es inestable. El descubrimiento de que
las enfermedades humanas pueden ser ocasionadas por una expan
sin a larga escala de repeticiones de trinucletidos muy inestables
result un hecho muy inesperado (los estudios en otros organismos
no revelaron precedentes de este fenmeno), pero en la actualidad la
lista de ejemplos en humanos es considerable (vase cuadro 16-6).
Aunque son factibles 64 posibles secuencias de trinucletidos,
cuando se toleran permutaciones cclicas (CAG) = (AGC) =
(GCA) y se leen de cualquier cadena [SfCAG), en una cadena
= 5'(CTG)n en la otra], slo hay 10 repeticiones de trinucletidos
diferentes a nivel del DNA genmico (fig. 11-15). Adems de la ex
pansin inestable de la repeticin de tripletos, la mayor parte de los
alelos de enfermedades en el gen B de cistatina que causa epilepsia
mioclnica progresiva incluye la expansin de una repeticin de 12
nucletidos (C)4G(C)4GCG (Lalioti y cois., 1997). Como se deta
lla en el cuadro 16-6, los genes que contienen repeticiones tndem
cortas en expansin inestables corresponden a las dos clases mayo
res siguientes segn el tamao de la expansin y su localizacin:
ex p an sion es m od era d a s (CAG)n q u e resu ltan en tra yectos
d e p oliglu ta m in a . El codn CAG especifica glutamato. Los l
mites no patgenos, estables, son de 10 a 30 repeticiones; los
alelos patgenos inestables suelen tener entre 40 y 200 repeti
ciones. El trayecto de poliglutamina expandido da lugar a que
la protena se agregue dentro de ciertas clulas y las destruya;
ex pansiones d e rep etici n no co d ifica n tes m u y gra n d es. Va

rios tipos de repeticiones (p. ej., CGG, CCG, CTG, GAA) que
se encuentran en secuencias no codificantes (el promotor o las
regiones no traducidas o secuencias intrnicas) sufren expan
siones muy grandes. Las expansiones inhiben la expresin de
genes muy cercanos y originan prdida de la funcin. Por lo ge
neral los alelos no patgenos, estables, tienen 5 a 50 repeticio
nes; los alelos patgenos inestables poseen varios cientos a miles
de copias (vase cuadro 16-6). N ota: algunas expansiones muy
grandes de repeticiones tndem no codificantes cortas slo afec
tan la estructura del cromosoma, y originan sitios fr giles, pe
ro no producen enfermedad (tal vez porque no se localizan cerca
un gen importante). Los ejemplos incluyen FRAXF y FRA16A
(ambas debidas a expansin de CCG).
En cada caso las repeticiones por debajo de una cierta longitud um
bral son estables en la mitosis y la meiosis, pero se tornan en extre
mo inestables arriba de la longitud umbral. Las repeticiones
inestables casi nunca se transmiten sin cambio del padre al hijo.
Aunque pueden ocurrir tanto expansiones como contracciones, se
observa una predisposicin a las primeras. A menudo el cambio
promedio de tamao depende del sexo del padre transmisor y tam
bin de la longitud de la repeticin.
La naturaleza del mecanismo de expansin an no se compren
de con claridad (vase Djian, 1998; Sinder y cois., 2002). Se consi
dera que el pareamiento errneo de cadena deslizada (vase fig.
11-5) es un probable componente del mecanismo de expansin,
11.5
141
GCC
AT
{CFTR)
I
141
GCC
329
CCA
ATTG
{FIX)
329
CCA
114
A CTTAT
I
I
GAT
142
143
144
ATT
TTT
GGC
POTENCIAL PATGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS
145
I""".
I
35
C T T ..........
AAT
A T T T T * G G C C T T ______
330
331
332
CTT G TT
330
116
AATAG
117
II
T C T TA T C T T
118
ATG
168
114
GAT
115
116
117
T C T TA T
ll
AA C
C A A ......
37
II
38
39
II''
CAA
171
169
170
17
G **
18
{HBB)
I
172
C T T .......
171
* T
I
C TT
19
20
r "" i
G G C AAG G TG AAC G TG
AAC
118
39
f"
TAC
170
AAAGGTG
{XPAC)
38
I
A T **A C
ATA
16
169
GAA
119
I
I I
I i
i
ATA G A T
AGT
GAA
{APC)
CGA
37
ATA
GAC
168
332
*A C
|._36
35
TCA
CGA
331
CTT G * *
115
333
GAC
i I
GAC
j3
{CFTR)
'jjjl
142
143
144
145
I
II
II
II
I
36
TCA
339
21
AAC
EL
16
i
i
GGC * * *
17
18
* * * AAC GTG
19
...... I
AAC
Fig. 11-14. Las repeticiones tndem cortas son puntos crticos de delecin/insercin.
Las seis deleciones que se lustran son ejemplos de deleciones patgenas que se observan en unidades de repeticin tndem de 1 a 6 pb. Las deleciones de 3 y 6 pd no causan cambios de marco y se piensa que la patognesis se debe a eliminacin de uno o dos aminocidos que tienen importan
cia crtica para la funcin polipptida.
relacionadas) son:
CFTR,
Nota: en
ia delecin de 6 pb, la repeticin tndem original no es perfecta. Los genes (y las enfermedades
regulador transmembrana de fibrosis qustica;
de complementacin de xerodermia pigmentosa C;
HBB, globina
FIX, factor IX
(hemofilia B);
APC, poliposis
adenomatosa dei colon;
XPAC, grupo
0 (talasemia p ). Aunque no se ilustra aqu, a menudo las inserciones pequeas son
repeticiones tndem de secuencias que las flanquean.
puesto que se observ que al parecer las repeticiones interrumpidas

son estables y slo las repeticiones homogneas son inestables. Por
ejemplo, en la ataxia espinocerebelosa tipo 1, uno o dos tripletos
CAT interrumpieron 123/126 repeticiones CAG de tamao nor
mal, en tanto que 30/30 alelos expandidos (CAG) no contenan
alguna interrupcin (Chung y cois., 1993). No obstante, an no se
aclara por qu los cambios en la longitud estn predispuestos a ex
pansin. El conocimiento de la expansin de repeticiones inesta
bles progresa con rapidez; para mayor informacin se aconseja al
lector consultar una revisin reciente.
mtides hermanas) entre un gen funcional y un seudogn rela

cionado puede dar por resultado la delecin del gen funcional o
la formacin de genes de fusin que contienen un segmento de
rivado del seudogn. De manera alternativa el seudogn puede
actuar como una secuencia donadora en acontecimientos de con
versin gnica e introducir mutaciones perjudiciales en el gen
funcional.
El ejemplo clsico de patognesis por intercambios entre gen y
seudogn es la deficiencia de 21-hidroxilasa de esteroides en la que
ms de 95% de las mutaciones patgenas se origina como resultado
A A C /G T T
A A G /C T T
A A T /A T T
11.5.3 Las familias de repeticin tndem y de genes

agrupados pueden ser propensas a cruzamiento
desigual patgeno y a acontecimientos
semejantes a la conversin gnica
Muchos grupos gnicos de humanos y mamferos contienen seudogenes no funcionales que pueden relacionarse en forma cerca
na con miembros de genes funcionales. Los intercambios de
secuencia interlocus entre seudogenes y genes funcionales pue
den ocasionar una enfermedad por eliminacin o alteracin de
algunas o la totalidad de las secuencias de un gen funcional. Por
ejemplo, el cruzamiento desigual (o intercambio desigual de cro-
A G G /C C T
A T C /G A T
A C C /G G T C A G / C T G
A C G /C G T C C G /C G G
A C T /A G T
Fig. 11-15. Las 10 posibles repeticiones de trinucietidos.

Se muestran ambas cadenas de DNA. Todas las otras repeticiones de
trinucietidos son permutaciones cclicas de una u otra de stas
(vase texto).
340
CAPITULO ONCE | INESTABILIDAD DEL GENOMA HUMANO: MUTACIN Y REPARACIN DEL DNA
-3 0 kb------*
30 kb
C4A
21A
C4B
21B,
\|/21 -OH
Pareamiento desigual de cromtides

hermanas o no hermanas
C4A
21A
C4B
21B
i
C4A
21A
C4B
21B
CDI/IDCH
Conversin gnica|
~ 25% de mutaciones
patolgicas en el gen 21-OH
~ 75% de mutaciones
patolgicas en el gen 21-OH
21A
1 XX2
Micro
conversin
27B
Rotura y nueva
unin (1 o 2)
C4A 21A/21B
Gen de fusin 21-OH (inactivo)
C4A
21A
Gen 21-OH mutante

que contiene mutaciones
inactivadoras del seudogen
Delecin del gen 21-OH
Clave:
....... Mutaciones inactivadoras (vase fig. 11-17)
Fig. 11-16. Casi todas las mutaciones del gen de 21-hidroxilasa se deben a intercambio de secuencias con un seudogn relacionado de manera
cercana.
Los genes duplicados del complemento C4 y los genes de 21-hidroxilasa de esferoides se localizan en repeticiones tndem de 30 kb que muestran
alrededor de 97% de identidad de secuencia. Tanto los genes C4A como C4B se expresan para dar productos del complemento C4; el gen CYP21B
(21B) codifica un producto 21-hidroxilasa, pero el gen CYP21A (21A) es un seudogn. Alrededor de 25% de las mutaciones patolgicas en el locus de
21-hidroxilasa incluye una delecin de 30 kb que resulta de cruzamiento desigual (CDI) o intercambio desigual de cromtides hermanas (IDCH). Las
mutaciones restantes son mutaciones de punto en las que ocurre conversin gnica a pequea escala del gen CYP21B -u n segmento pequeo del gen
CYP21A que contiene mutaciones perjudiciales se copia e inserta en el gen CYP21B- reemplazando un segmento corto de la secuencia original (vase
fig. 11-10C para un posible mecanismo). Los posibles acontecimientos de conversin gnica son, como CDI e IDCH, cebados por pareamiento desigual
de las repeticiones tndem en cromtides hermanas o no hermanas.
de intercambios de secuencias entre el gen de 21-hidroxilasa fun

cional, CYP21B, y un seudogn relacionado de modo muy cerca
no, CYP21A. Los dos genes se encuentran en segmentos de DNA
de repeticin tndem de unas 30 kb de largo que tambin contie
nen otros genes duplicados, en especial los genes del complemento
C4, C4A y C4B. Las deleciones patgenas grandes siempre ocasio
nan la eliminacin de alrededor de 30 kb de DNA (que correspon
den a la longitud de una unidad de repeticin) que contienen la
secuencia gnica CYP21B (vase fig. 11-16). Tambin se observan
deleciones no patgenas de la misma longitud porque algunas ve
ces la unidad de repeticin C4A + CYP21A est eliminada (y por
tanto el gen funcional CYP21B se conserv), y los genes C4/21OH muestran una forma de polimorfismo de locus NVRT a gran
escala con diferentes alelos que contienen una, dos, tres o cuatro de
las unidades de 30 kb (Collier y cois., 1989).
Casi la totalidad de 75% de las mutaciones de punto patgenas
se copia de mutaciones perjudiciales en el seudogen, lo que sugiere
un mecanismo de conversin gnica (vase figs. 11-16 y 11-17). El
anlisis de una de estas mutaciones que surgi de novo sugiere que
el trayecto de conversin tiene un mximo de 390 pb (Collier y cois.,
1993). Asimismo se encuentran acontecimientos de conversin g
nica en los genes C4 duplicados y ambos se expresan en forma nor
mal. Un acontecimiento que tal vez prepara las conversiones en el
grupo gnico CYP21-C4 es el pareamiento desigual de cromtides
de manera que una unidad CYP21A-C4A se parea con una unidad
CYP21B-C4B (vase fig. 11-17).
11.5
Localizacin de
la mutacin
POTENCIAL PATGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS
Secuencia gnica
normal 21 -OH
(CYP21B )
Secuencia del
seudogen 21 -OH
(CYP21A)
Secuencia del
gen mutante 21 -OH
Intrn 2
CCCACTCC
Exn 3
(codones 110-112)
GGA GAC TAC

Gli
Asp Tir
Exn 4
(codn 172)
ATO
lie
Exn 6
(codones 235-238)
AC GTG GAG ATG

lie
Val
Glu Met
AAC GAG GAG AAG
Exn 7
(codn 281)
CAC GTG CAC

His Val
His
CAC TTG
Exn 8
(codn 318)
CAC CAG GAG

His Gin
Glu
CTG TAG GAG
CTG TAG GAG

Leu DETENCIN
Exn 8
(codn 356)
CTG CGG CCC

Leu Arg
Pro
CTG TGG CCC
CTG TGG CCC

Leu Tri
Pro
ATC
lie
TC
Ser
TGT
Cis
541
CCCAGCTCC
CCCAGCTCC
G (..... ...,)TC
G(...........)TC
ATC
ATC
lie
Val
AAC TGT
CAC
AAC TGT
Asn Cis
AAC GAG GAG

Asn Glu Glu
CAC TTG
His Leu
Lis
CAC
His
Fig. 11-17. Las mutaciones de punto patgenas en el gen de 21-hidroxilasa de esteroides se originan por copiado de secuencias del seudogen de
21-hidroxilasa.
Se piensa que el copiado incluye un mecanismo similar a la conversin gnica (vase figs. 11-16 y 11-10C).
11.5.4 A menudo las repeticiones dispersas

predisponen a deleciones y duplicaciones
grandes
Repeticiones directas cortas
En varios casos los puntos finales de deleciones estn marcados por
repeticiones directas muy cortas. Por ejemplo, los puntos de rotura
en numerosas deleciones patgenas en mtDNA ocurren en repeticio
nes directas cortas perfectas o casi. La ms frecuente de stas es una
delecin de 4 977 pb que se identific en mltiples pacientes con sn
drome de Kearns-Sayre, una encefalopata que se caracteriza por oftalmopleja externa, ptosis, ataxia y cataratas. La delecin ocasiona la
eliminacin de las secuencias intermedias entre dos repeticiones de
13 pb perfectas y la prdida de secuencias de una de las repeticiones
(fig. 11-18). El genoma mitocondrial es deficiente en recombinacio
nes y Shoffner y colaboradores (1989) postularon que estas delecio
nes surgen por un mecanismo de deslizamiento de replicacin similar
al que se observa en repeticiones tndem cortas (fig. 11-5). Las du
plicaciones parciales del genoma mitocondrial tambin son caracte
rsticas distintivas de ciertas enfermedades, en especial el sndrome de
Kearns-Sayre. Los extremos de las secuencias duplicadas, como los de
las deleciones comunes, suelen estar marcados por repeticiones direc
tas cortas y al parecer los mecanismos de duplicacin y delecin se re
lacionan muy de cerca (vase Poulton y Holt, 1994).
La repeticin Alu como un punto critico de recombinacin

Algunas deleciones e inserciones a gran escala pueden generarse por
pareamiento de repeticiones dispersas no allicas, seguido de rotura y
nueva unin de fragmentos de cromtides. Por ejemplo, la repeticin
Alu ocurre alrededor de una vez cada 3 kb y se sugiere que el parea
miento errneo entre esas repeticiones es una causa frecuente de de
leciones y duplicaciones. Ciertos genes grandes tienen muchas
secuencias Alu internas en sus intrones o secuencias no traducidas,

lo que los expone a deleciones y duplicaciones internas frecuentes.
Por ejemplo, la repeticin Alu ocurre una vez cada 1.5 kb en el gen
del receptor de lipoprotena de densidad baja de 45 kb. Es probable
que una frecuencia muy alta de deleciones patgenas en este gen in
cluya una repeticin Alu, por lo general en ambos puntos finales, y
duplicaciones intragnicas patgenas ocasionales comprenden tam
bin repeticiones Alu (vase Hobbs y cois., 1990). Tales observaciones
sugieren una funcin general para las secuencias Alu en la promocin
de recombinacin y acontecimientos similares a esta ltima. Es pro
bable que las duplicaciones gnicas iniciales en la evolucin de fami
lias multignicas agrupadas hayan incluido un acontecimiento de
cruzamiento desigual entre repeticiones Alu u otros elementos de re
peticin dispersos. Sin embargo, cabe sealar que algunos genes con
abundancia de Alu no parecen ser locus para las recombinaciones
mediadas por Alu frecuentes.
Repeticiones largas con nmero de copias bajo

La secuenciacin de la porcin eucromtica del genoma humano
revel mltiples ejemplos de secuencias con un bajo nmero de co
pia dispersas que mostraban homologa de secuencia muy alta (con
frecuencia >95% de identidad secuencial) que a menudo se exten
da en decenas a cientos de kilobases. Por lo general las secuencias
repetidas de este tipo experimentaron duplicaciones evolutivamen
te recientes, especficas de primates denominadas d u p lica cion es
segm en ta ria s (seccin 12.2.5). La homologa secuencial muy alta
en estas regiones largas predispone a una recombinacin desigual
entre las repeticiones (tambin llamadas d u p licon es). Cuando estas
repeticiones relacionadas de manera cercana se encuentran en dife
rentes cromosomas, es posible que predispongan a translocacin. Si
se presentan en el mismo cromosoma a menudo predisponen a re
combinacin homologa desigual (= no allica) que puede causar
deleciones y duplicaciones a gran escala.
342
CAPTULO ONCE
C C T C C G T A G A C C T A A C C A -------------A = 7 6 6 4 p b --------------C C T C C T A G A C C T A A C C T
-A = 7 7 2 3 p b -
TCACAGCCC
TCACAGCCC
f !
A A C A A C C C C C ------ A = 4 4 2 0 p b A A C A A C C C C C
A = 7 521 p b
AGGCGACC
- A = 7 565 pb
CCTCCAT-
A C C T C C C T C A C C A ------- A = 4 9 7 7 p b
_L
6 000
_L
7 000
_L
8 000
9 000
_L
10 000 11 000 12 000 13 000 14 000 15 000 16 000 17 000
Fig. 11-18. Las repeticiones directas cortas marcan los puntos finales de muchas deleciones patgenas en el genoma mitocondrial.
Nota: como las mitocondrias son deficientes en recombinacin, un posible mecanismo para explicar las deleciones es el pareamiento errneo de cadena
deslizada (vase texto).
Las deleciones mediadas por duplicn, y en menor grado las du

plicaciones, que se extienden en intervalos de megabases suelen ser pa
tgenas (Stankiewcz y Lupski, 2002; vase cuadro 11-7 y fig. 11-19)
y ocasionan prdida de la funcin gnica o una dosis gnica alta
inapropiada para los genes sensibles a dosis contenidos en los inter
valos. Estos reordenamientos no suelen resolverse mediante anlisis
citgenos estndar y con frecuencia se clasifican (desde un punto de
vista cromosmico) como microdeleciones y microduplicaciones. A
causa de la prevalencia ampliamente diseminada de las duplicacio
nes segmentarias en el genoma humano, es posible que la contribu
cin de los duplicones a la patognesis sea muy considerable
(Stankiewicz y Lupski, 2002).
11.5.5 Las inversiones patgenas pueden producirse

mediante recombinacin intracromtide entre
repeticiones invertidas
En ocasiones se localizan repeticiones invertidas apretadas con una
gran identidad de secuencias dentro de un gen o cerca del mismo.
El alto grado de similitud secuencial entre repeticiones invertidas
puede predisponer al pareamiento de las repeticiones por un meca
nismo que incluye el retrodoblamiento de una cromtide sobre s
misma. La rotura subsecuente de la cromtide en las repeticiones de
pareamiento errneo y la reunin pueden resultar despus en una
inversin, en gran parte de la misma manera que los mecanismos
Cuadro 11-7. Las repeticiones con nmero de copias bajo pueden predisponer a deleciones y duplicaciones patgenas a gran escala
Gen(es)
Localizacin
cromosomica
Tipo de
reordenamiento
Tamao
(kb)
Tamao de
duplicn (kb)
Infertilidad masculina (AZFa)
DBY, USP9Y
Yq11.2
Del
800
10
Infertilidad masculina (AZFc)
RBMY, DAT?
Yq11.2
Del
3 500
229
Sndrome de Williams Beuren
ELN, GTF2I
7q11.23
Del
1 600
320
Sndrome de Prader-Willi
15q12pat
Del
3 500
500
Sndrome de Angelman
UBE3A
15q12mat
Del
3 500
500
Sndrome de Smith Magenis
17p11.2
Del
3 700
200
Sndrome de DiGeorge/VCF
TBX1,?
22q1 1.2
Del
3 000/1 50CI
225-400
Neuropata perifrica (CMT1A)
PMP22
17p12
Dup
1 400
24
Neuropata perifrica (HNPP)
PMP22
17p12
Del
1 400
24
Carcter/sndrome
Resumido de Stankiewicz y Lupski (2002). Curr. Opin. Genet. Dev. 1 2 ,312-319, con autorizacin de Elsevier.
11.5 | POTENCIAL PATGENO DE SECUENCIAS REPETIDAS
Centrmero
543
Telmero
NPHP1
Deleciones -29 0 kb
Inversiones
WBS
Deleciones comunes ~1.6 Mb
BP1
BP2
BP3A
BP3B
BP4
Deleciones clase I - 4 Mb
PWS/AS
Deleciones clase II - 4 Mb
SMS-REP
proximal
SMS-REP
medio
SMS-REP
distal
SMS
Deleciones raras
Deleciones comunes ~4 Mb
LCR22-A
LCR22-B
LCR22-C
LCR22-D
*
DGS/
Deleciones raras -1 .5 Mb
VCFS
Deleciones comunes ~3 Mb
Fig. 11-19. Estructura compleja de repeticiones de copia baja (RCB) seleccionadas relacionadas con enfermedad en humanos.
Obsrvese la estructura compleja de las RCB que consiste tanto en repeticiones directas (puntas de flecha en la misma direccin) como repeticiones
invertidas (puntas de flecha en direcciones opuestas). Las abreviaturas de enfermedad son: NPHP1, nefronoftisis juvenil familiar 1; WBS, sndrome de
Williams-Beuren; PWS/AS, sndrome de Prader-Willi/sndrome de Angelman; SMS, sndrome de Smith-Magenis; DGS/VFCS, sndrome de DiGeorge/sndrome velocardiofaclal. Reproducido de Stankiewicz y Lupski (2002) Trends Genet. 18, 74-82, con autorizacin de Elsevier.
naturales que se utilizan para la produccin de algunas cadenas li

geras K de inmunoglobulina.
El ejemplo clsico de inversiones patgenas es una mutacin que
explica ms de 40% de los casos de hemofilia grave/A. El intrn 22
del gen del factor VIII, F8, contiene un islote CpG a partir del cual
se transcriben dos genes internos: F8A en la direccin opuesta a la
del gen husped F8, y F8B en la misma direccin que F8 (vase fig.
11-20). F8A pertenece a una familia gnica con otros dos miembros
cercanamente relacionados que se localizan varios cientos de kilobases corriente arriba del gen F8 y se transcriben en la direccin opues
ta a F8A. En consecuencia la regin entre el gen F8A y los otros dos
miembros es susceptible a inversiones -el gen F8A puede parearse
con cualquiera de los otros dos miembros de la misma cromtide, y
la rotura y la reunin subsecuentes de la cromtide en la regin de
las repeticiones pareadas producen una inversin que altera el gen
del factor VIII (Lakich y cois., 1993, vase fig. 11-20).
Varios ejemplos de duplicaciones que surgen a travs de una du

plicacin segmentaria (seccin 12.2.5) y otras repeticiones con nme
ro de copias bajo a moderado predisponen, asimismo, a inversiones,
pero estas ltimas no son directamente patgenas porque el resultado
de los puntos de rotura no es una expresin gnica aberrante (a dife
rencia del ejemplo en los genes del factor VIII). En lugar de ello pue
den generarse polim orfism os d e in versin a gran escala como en el
caso de los duplicones en el locus de Williams-Beuren (Osborne y
cois., 2001) y repeticiones del receptor olfatorio muy homologas (Giglio y cois., 2001).
11.5.6 La transposicin de secuencias del DNA no es

rara y puede causar enfermedad
Una proporcin de elementos dispersos repetidos de maneras mode
rada y alta son capaces de transponerse a travs de un RNA interme-
344
CAPTULO ONCE
F8
F8B
F 8 A * F 8 A **
1 2 3 .......................................................................... 22
23
26
TEL^ -----+ ------------ ^ ------ I l M I I I I I I I I I I I I I I I I I I l i l i-----------CEN
Islote CpG
-1
F8A
Pareamiento errneo
de repeticiones F8A -fc'
1 2 3 ......................................................................... 2 2 2 3 ....... 26
H I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I * r 1 1 CEN
X
---------------------------------------------------------------- i------- <-------------- TEL
Rotura ( )
y nueva unin
de cromtide
TEL ---- - -------- 1 I I I I I I I I I 1-1
I I I I I I I I I I------------------------- ------- M
5' de F8
invertido
Fig.
i l -------- CEN
3' de
F8
11-20. Las inversiones que alteran el gen del factor VIII resultan de la recombinacin intracromtide entre repeticiones invertidas.
El intrn 22 del gen del factor VIII (F8) contiene un islote CpG a partir del cual se transcriben dos genes internos: F8B en la mism a direccin (un exn
nuevo se empalma en los exones 23-26 de F8) y el gen F8A que se transcribe de la cadena opuesta. F8A* y F8A** son secuencias relacionadas en
forma muy cercana con F8A pero localizadas alrededor de 500 kb corriente arriba y transcritas de la cadena opuesta. El grado a to de identidad secuencial
entre los tres miembros de la familia gnica F8A significa que el pareamiento del gen F8A con uno de los otros dos miembros en la mism a cromtide
puede ocurrir por formacin de una retroasa de la cromtide. La rotura y reunin subsecuente de la cromtide puede ocasionar una inversin de la
regin entre el gen F8A y el otro miembro pareado de la familia, lo que produce una alteracin del gen del factor VIII (vase Lakich y cois., 1993).
dio (seccin 9.5). La expresin del gen defectuoso por transposicin

del DNA es comparativamente rara y slo representa un pequeo
componente de la patologa molecular. Sin embargo, se registran va
rios ejemplos de deficiencia gentica debida a inactivacin insercional mediante retrotransposones. Por ejemplo, en un estudio se
encontr que la hemofilia A surge en dos de cada 140 pacientes no
relacionados como resultado de la insercin nueva de una repeticin
LINE-1 (Kpn) dentro de un exn del gen del factor VIII. Se cono
cen otros ejemplos de inactivacin insercional por un elemento Alu
que se transpone en forma activa. Adems se registran varios otros
ejemplos de patognesis a causa de la insercin intragnica de secuen
cias de DNA no definidas. Vase Kazazian para referencias (1998).
11.6
R eparacin del DNA
El DNA de las clulas sufre una gran variedad de daos, en parte

en respuesta a agentes extracelulares, pero en mayor extensin co
mo resultado de mecanismos endgenos, inclusive hidrlisis qu
mica espontnea, interaccin intracelular con grupos de oxgeno
reactivo y errores en la replicacin y la recombinacin.
Agentes extracelulares que causan dao al DNA

R ad ia cin ion iz a n te: los rayos gamma y X pueden ocasionar
roturas de cadena nica o doble en el DNA;
luz u ltra v io leta : en especial los rayos UV-C (~260 nm), que
el DNA absorbe con firmeza, pero tambin los rayos UV-B de
longitud de onda ms larga que penetran la cubierta de ozono.

La UV produce enlace cruzado entre timinas adyacentes en una
cadena de DNA para formar un dmero qumico estable (fig.
11-21C);
su sta n cia s q u m ica s a m b ien ta les: comprenden hidrocarburos
(p. ej., algunos de los que se encuentran en el humo del ciga
rrillo), ciertos productos de plantas y microbianos (como las
aflatoxinas que se producen en cacahuates con moho) y sustan
cias qumicas que se utilizan en la quimioterapia del cncer.
Los a gen tes a lq u ila n tes pueden transferir un grupo alquilo (un
hidrocarburo aliftico como un grupo metilo) a bases y ocasio
nar enlace cruzado entre bases en diferentes cadenas de DNA
o dentro de una cadena.
Mecanismos endgenos que causan dao al DNA

D ep u rin a cin (fig. 11-21 A). Todos los da se pierden alrede
dor de 5 000 adeninas o guaninas de cada clula humana nucleada por fisin espontnea del enlace base con azcar.
D esanim acin (fig. 11-21A). Cada da se desaminan de mane
ra espontnea cerca de 100 citosinas en cada clula humana nucleada para producir uracilo (que forma de preferencia pares de
bases con adenina y conduce a que la maquinaria de replicacin
de DNA inserte una A cuando encuentra U en la cadena plan
tilla). Con menor frecuencia se desaminan espontneamente
adeninas para dar hipoxantinas.
Especies de ox geno rea ctivo. Las especies de oxgeno reactivo
incluyen el anin superxido, 0 2~, que es tanto un ion como
11.6
un ra d ica l lib re (un grupo de tomos de los que uno contie

ne un electrn non en su cubierta de electrones ms externa;
sta es una configuracin en extremo inestable y los radicales
reaccionan rpidamente con otras molculas o radicales a fin
de lograr la configuracin estable de cuatro pares de electrones
en su cubierta ms externa). Las especies de oxgeno reactivo
pueden formarse por efecto de la radiacin ionizante en algu
nas molculas celulares pero tambin como un producto acce
sorio inevitable de la respiracin celular (algunos electrones
que pasan a travs de la cadena respiratoria se apartan de la
va principal y reducen de modo directo molculas de oxgeno
en el anin superxido). Las especies de oxgeno reactivo ata
can anillos de purina y pirimidina en la clula.
E rrores en la rep lica ci n d e l DNA. La lectura de pruebas in
correcta ocasiona la incorporacin de bases no compatibles;
por ejemplo, a menudo se inserta uracilo en forma incorrecta
en el DNA en lugar de timina.
E rrores en la rep lica ci n y la recom b in a ci n producen rotu
ras de cadena que quedan en el DNA.
Todas estas lesiones deben repararse para que las clulas sobrevivan.
La reparacin del DNA rara vez comprende slo contrarrestar el
cambio que caus el dao (rep a ra cin d irecta ). Casi siempre se
extirpa una tira del DNA que incluye el(los) nucletido(s) daado(s) y la brecha se llena con nueva sntesis (rep a ra cin d e ex ci
sin). Los cerca de 130 genes humanos que participan en la
reparacin del DNA (vase Wood y cois., 2001 y suplemento en
http://www.cgal.icnet.uk/DNA Repair Genes.html#DR) y las en
fermedades graves que afectan a personas con sistemas de repara
cin deficientes (vase ms adelante) enfatizan la importancia de
los sistemas de reparacin del DNA eficaces.
11.6.1 La reparacin del DNA suele incluir cortar y

eliminar, y sintetizar de nuevo un rea completa
de DNA que rodea el dao
Para afrontar estas tres formas de dao, las clulas humanas son ca
paces de efectuar cuando menos cinco tipos de reparacin del
DNA (para revisiones, vase el nmero de octubre de 1995 de
Trends in Biochem ical Sciences y Lindahl y Wood, 1999).
Reparacin directa: revierte el dao del DNA

Este mecanismo, que rara vez se utiliza, suele relacionarse con tres
genes. El mejor caracterizado de ellos codifica la metiltransferasa de
0 6-metilguanina-DNA, que puede eliminar grupos metilo de gua
ninas que se metilaron de manera incorrecta. (Nota: en las bacte
rias pueden eliminarse dmeros de timina en una reaccin de
fotorreactivacin que depende de luz visible y una enzima, fotoliasa, pero aunque los mamferos poseen enzimas relacionadas con la
fotoliasa, las emplean para un propsito muy diferente: controlar el
reloj circadiano; Van der Horst y cois., 1999.)
Reparacin de excisin de bases (REB): utiliza enzimas

glucosidasa para eliminar bases anormales (fig. 11-22A)
La REB corrige gran parte del tipo ms frecuente de dao del
DNA (del orden de 20 000 bases alteradas en cada clula n u clea da del cuerpo humano cada da). Los humanos tienen cuando
menos ocho genes codificadores de diferentes glucosilasas de
REPARACIN DEL DNA
545
DNA, cada una de las cuales tiene a su cargo la identificacin y :a

eliminacin de un tipo especfico de dao de bases (vase cuadro
11-8). Despus de eliminar la base, una endonucleasa, endonucleasa AP, y una fosfodiesterasa cortan la estructura bsica azcar-fosfato en la posicin de la base faltante y eliminan el residuo
azcar-fosfato. La brecha se llena con nueva sntesis mediante una
polimerasa de DNA y la muesca restante se sella con ligasa de
DNA III. El mismo proceso se usa para reparar la despurinacin
espontnea.
Reparacin de la excisin de nucletidos (REN): elimina

dmeros de timina y productos qumicos grandes
(fig. 11-22B)
La REN difiere de la REB porque emplea diferentes enzimas e in
clusive, donde slo hay una base anormal aislada por corregir, su
nucletido se elimina junto con muchos otros nucletidos adya
centes; es decir, la REN elimina un parche grande alrededor del
dao. La figura 11-22 ilustra el proceso. Los defectos en la repa
racin de la excisin de nucletidos ocasionan la enfermedad autosmica recesiva xerodermia pigmentosa (XP; Lambert y cois.,
1998). Mediante estudios de fusin celular se definieron siete
grupos complementarios, XPA a XPG. Los pacientes con XP son
hipersensibles a la luz ultravioleta. La piel expuesta al sol desarro
lla miles de pecas, muchas de las cuales progresan a cncer de la
piel.
La reparacin posreplicacin (recombinacin homologa) se

requiere para roturas de doble cadena (Haber, 1999)
El mecanismo usual es un proceso similar a la conversin gnica
(reparacin recom binacional), en la que una cadena nica del cro
mosoma homlogo invade el DNA daado. De manera alternativa
los extremos rotos se renen sin considerar su secuencia, una me
dida desesperada que quiz cause mutaciones. La maquinaria eucariota para reparacin mediante recombinacin est menos bien
definida que los sistemas de reparacin por excisin. Los genes hu
manos que participan en esta va incluyen NBS (mutado en el sn
drome de rotura de Nijmegen; vase seccin 13.5.2), BML
(mutado en el sndrome de Bloom; MIM 210 900) y los genes de
susceptibilidad a cncer de mama BRCA2 y BRCA1 (seccin
17.5.1).
Reparacin incompatible: corrige pares de bases

incompatibles causados por errores en la replicacin del DNA
Las clulas deficientes en la reparacin incompatible tienen tasas
de mutacin 100 a 1 000 veces ms altas que las normales, con
una tendencia particular al deslizamiento de replicacin en carre
ras homopolimricas (fig. 11-5). En humanos, los mecanismos
incluyen cuando menos cinco protenas y los defectos causan
cncer de colon no polipsico hereditario (seccin 17.5.3 y fig.
17-12).
Con excepcin de la reparacin directa, todos estos sistemas
requieren exonucleasas y endonucleasas, helicasas, polimerasas y ligasas, que suelen actuar en complejos multiprotenicos que com
parten algunos componentes. La seleccin de las vas individuales
se apoya en gran m edida en la con servacin m u y p o ten te de los me
canismos de reparacin a travs de toda la vida. No slo los meca
nismos de reparacin sino tambin las estructuras protenicas y las
346
CAPTULO ONCE
B)
A)
0i
^
Guanina
H 0
Guanina
N ....
CHo
NH,
o = p -o -
0 = P -0 '
/N
H ,0
0^
P ^ N
G
T
Uracilo
C)
NH
ch2
ch2
A*
Nuevas
cadenas
NH,
0
1
Mutante
OH
0
1
Citosina
No base
C G l
Replicacin
1
I
O
G -------------- *
0 = p -0 -
0 = P -0 -
-H ,
N "4^ 0
Fig. 11-21. Dao del DNA por modificaciones qumicas de nucletidos.

A) Ejemplos de despurinacln (arriba) y desaminacin (abajo). B) Forma en que la modificacin quimica causa una mutacin. En este ejemplo se
produjo un uracilo por desaminacin de un residuo de citosina. Si no se repara, la replicacin del DNA insertar una adenina en la cadena complementaria
y por consiguiente el efecto neto es el de una transicin C-+T. La reparacin es posible por la va de la reparacin de excisin de base (fig. 11 -21 A). El
efecto neto de una despurinacin es una delecin de nucletido nico cuya base se elimin. C) Un dimero de timidina: enlaces covalentes (rojo) unen
carbonos de bases timina vecinas. Los dmeros de timidina pueden repararse por la va de la reparacin de excisin de nucletido (fig. 11-21B).
Cuadro 1 1 -8 . Glucosilasas de D N A humanas (vase Wood y cois., 2 0 0 1 ).

Gen
Enzim a
Base m ayor alte ra d a lib erad a
UNG
N-glucosilasa de uracilo
SMUG1
Glucosiiasa de uracil-DNA monofuncional selectiva de cadena nica
MBD4
Protena 4 de dominio de enlace metil-CpG
G opuesta a U o T en secuencias CpG
TDG
Glucosiiasa de tmina-DNA
G opuesta a U, T o etenoC
0GG1
Glucosiiasa 1 de 8-oxoguanina-DNA
C opuesta a 8-oxoG
MYH
Homlogo MutY
Una 8-oxoG opuesta
NTHL1 (NTH1)
9a. endonucleasa 1 similar a III
Pirimidinas con anillo saturado o fragmentado
MPG
Glucosiiasa de N-metilpurina-DNA
3-meA, etenoA, hipoxantina
secuencias gnicas suelen conservarse desde E. coli hasta el hombre.

Un inconveniente de la conservacin es la nomenclatura gnica
confusa, que en ocasiones se refiere a enfermedades humanas (XPA,
etc.), a veces a mutantes de levadura (genes RAD) y en otros casos a
sistemas de complementacin de clulas de mamferos (ERCC,
complementacin cruzada de reparacin de excisin): por ejemplo,
XPD, ERCC2 y RAD3 son el mismo gen en el hombre, el ratn

y la levadura. Por lo general los eucariotas tienen sistemas mlti
ples que corresponden a cada sistema nico en E. coli, de mane
ra que, por ejemplo, la reparacin de la excisin de nucletido
requiere seis protenas en E. coli pero cuando menos 30 en ma
mferos.
11.6
=G
T
C
A
G
t
A
T
C
C
REPARACIN DEL DNA
5*~
G
=T
C
N u c le a s a
H e lic a s a d e D N A
G
(c o r ta a c ie r ta d is ta n c ia
e n c u a lq u ie r la d o d e
la s b a s e s m u ta d a s )
+ iig a s a d e D N A
T
A
C
C
<>
Fig. 11-22. Vas de reparacin por excisin de base y de nucletido.

Las estructuras bsicas de azcar y fosfato se muestran en forma de hileras verticales sombreadas y el enlace de hidrgeno mediante lineas rojas.
A)
Reparacin por excisin de base. En este caso
una glucosllasa de DNA especifica elimina un uracilo despus de la desaminacin de una citosina
(fig. 11-21 A) y a continuacin la molcula de azcar y fosfato residual se elimina por la accin secuencial de endonucleasa AP y una fosfodiesterasa.
La polimerasa de DNA inserta una desoxicitidina (dCMP) y la Iigasa de DNA sella la hendidura. B)
Reparacin por excisin de nucletido
En este caso
el dmero de pirmidina se reconoce como una lesin voluminosa; una nucleasa dentro de un complejo multienzimtico hace cortes alejados a cierta
distancia en ambos lados de la cadena que contiene la mutacin y una helicasa elimina el segmento intermedio para dejar una hendidura grande (que en
realidad puede ser de 20 nucletidos o ms en lugar de la hendidura pequea que se muestra aqu). La hendidura se repara mediante la insercin
secuencial de residuos de dNMP mediante polimerasa de DNA seguida de sellado por Iigasa de DNA.
11.6.2 Los sistemas de reparacin del DNA comparten

componentes y procesos con la maquinaria de
transcripcin y recombinacin
Del mismo modo que comparten componentes entre s, muchos
sistemas de reparacin comparten componentes con la maquina
ria de replicacin, transcripcin y recombinacin del DNA. Se
requieren polimerasas y ligasas de DNA tanto para la replicacin
como para la nueva sntesis de DNA despus de extirpar (exci
sin) un defecto. La maquinaria de recombinacin participa en
la reparacin de roturas de doble cadena. El vnculo con la trans
cripcin es en particular intrigante (Lehmann, 1995). El factor
de transcripcin general TFIIH es un complejo multiprotenico
que incluye las protenas XPB y XPD. El TFIIH existe en dos
formas. Una de ellas se relaciona con la transcripcin general y la
otra con la reparacin, tal vez la reparacin de DNA con activi
dad transcripcional. Este sistema es deficiente en dos enfermeda
des raras, el sndrome de Cockayne (CS; MIM 216 400) y la
tricotiodistrofia (TTD; MIM 601 675). En clnica, y en biolo
ga celular, tanto el CS como la TTD superponen el XP, y en al
gunos casos dependen de los mismos genes, pero los pacientes
con CS y TTD poseen defectos del desarrollo que quizs indi
quen una transcripcin defectuosa y no tienen la susceptibilidad
a cncer de los pacientes con xerodermia pigmentosa (XP).
11.6.3 A menudo la hipersensibilidad a agentes que

daan el DNA produce un deterioro de la
respuesta celular al dao del DNA en lugar de
una reparacin defectuosa del DNA
Muchas enfermedades humanas que comprenden hipersensibilidad
a agentes que daan el DNA, o un nivel muy alto de dao del DNA
celular, no se deben a defectos en los sistemas de reparacin del
DNA en s mismos, sino a una respuesta celular defectuosa al dao
del DNA. Las clulas normales reaccionan al dao del DNA dete
niendo el progreso a travs del ciclo celular en un punto de control
hasta que el dao se repara, o desencadenando apoptosis si el dao
es irreparable. Parte de la maquinaria para efectuar lo anterior incluye
la protena ATM. La funcin de la ATM se describe en la seccin
17.5.1. De manera breve, detecta el dao del DNA y libera la seal a
la protena p53, el guardin del genoma. Las personas con ATM no
funcional tienen ataxia telangiectasia (MIM 208 900; Lambert y cois.,
1998). Sus clulas son hipersensibles a la radiacin, manifiestan inesta
bilidad cromosmica y un riesgo alto de afeccin maligna, pero la ma
quinaria de reparacin del DNA en s misma est intacta. La anemia
de Fanconi (vase MIM 227 650) es otro grupo heterogneo de enfer
medades (cuando menos cinco grupos complementarios) que produ
cen respuestas defectuosas al dao del DNA sin defectos especficos en
la reparacin de este ltimo.
348
CAPTULO ONCE
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CAPTULO
DOCE
Lugar del hombre

en el rbol de la vida
352
CAPTULO DOCE I LUGAR DEL HOMBRE EN EL RBOL DE LA VIDA
Quienes apoyan el punto de vista de Theodosius Dobzhansky, se

gn el cual nada en biologa tiene sentido s no es a la luz de la
evolucin, se apoyan en los torrentes de datos que fluyen de los di
ferentes proyectos del genoma. Las comparaciones de secuencias a
travs de genomas completos son en la actualidad el soporte prin
cipal de una nueva disciplina, la gen m ica com parativa, y han co
menzado a proporcionar nuevas informaciones poderosas sobre el
lugar del hombre en el rbol de la vida.
Por supuesto, los orgenes evolucionistas del genoma humano
(y de todos los genomas) son tan antiguos como la vida misma, pe
ro este captulo no tiene el propsito de suministrar una revisin
general de la gentica molecular evolucionista. Por esta razn no se
incluyen muchas reas fascinantes, como la evolucin temprana del
cdigo gentico (p. ej., Knight y Landweber, 2000) o la idea de que
el RNA era la molcula de informacin primaria antes de que la su
perara el DNA (como Joyce, 2002).
Por el contrario, este captulo tiene como fin enfocarse en la for
ma en que los anlisis comparativos de los genomas actuales pro
porcionaron luz en el origen evolucionista del DNA y los genes
humanos. Gran parte de los datos procede de comparaciones de ge
nomas de mamferos y otros animales, aunque en ocasiones se uti
liza la comparacin con genomas ms distantes con objeto de
explicar ciertas huellas d e la evolucin, como el origen de los intrones y el DNA mitocondrial. Los datos comparativos suministran
informacin sobre el carcter nico del hombre comparado con
modelos de mamferos, en especial el ratn (un modelo importan
te para comprender el desarrollo humano temprano y asimismo en
fermedades del hombre) y los primates, los relacionados vivos ms
cercanos. En una seccin final se consideran los orgenes recientes
y las relaciones de las poblaciones humanas.
12.1
Evolucin de la estru ctu ra gnica

y genes duplicados
De manera caracterstica, los genes y las protenas eucariotas son

ms grandes y complejos que los de organismos simples. El tama
o ms grande de los genes en eucariotas se debe sobre todo a la
presencia de intrones grandes y el tamao promedio del intrn sue
le reflejar la complejidad genmica (y biolgica). Asimismo, de for
ma tpica, como resultado de diferentes mecanismos, las secuencias
de codificacin eucariotas son ms largas que las de procariotas. La
duplicacin intragnica permite que se expandan y con frecuencia se
diversifiquen las longitudes de las secuencias de codificacin. La re
com binacin intergnica rene diferentes combinaciones de domi
nios protenicos (mdulos estructurales o funcionales discretos). Se
piensa que la ubicacin cercana de intrones en los genes de genomas complejos representa la relevancia de permitir que se expandan
y modifiquen las secuencias de codificacin durante la evolucin.
12.1.1 Es probable que los intrones espliceosmicos se

originaran de intrones del grupo II y aparecieran
por primera vez en las clulas eucariotas iniciales
Despus del descubrimiento de genes divididos en 1977 se discu
ti con gran intensidad la importancia de los intrones espliceosmi
cos (vase recuadro 12-1). Los intrones que se hallan en genomas

complejos suelen ser grandes comparados con los de otras especies
y no estn tan bien conservadas las secuencias del intrn. No obs
tante, los intrones contienen secuencias esenciales desde el punto
de vista funcional que participan en la regulacin gnica y durante
la evolucin se conservaron de manera considerable algunos intro
nes cortos. Los genes que se expresan en alto grado tienen intrones
muy cortos (tal vez por la seleccin para el procesamiento rpido
de mRNA). Cualquiera que sea la funcin propuesta de los intro
nes (p. ej., tolerar la recombinacin a fin de permitir la novedad
evolucionista como se comenta en la seccin 12.1.3), no puede ser
general: una pequea minora de genes en organismos complejos
carece de intrones (vase cuadro 9-5).
La evolucin de intrones espYiceosmicos es \m i t m At OTitroversia (vase Logsdon, 1998; Lynch y Richardson, 2002). Hoy
en da se acepta en gran parte que los intrones espliceosmicos no
se originaron antes que aparecieran las clulas eucariotas (ningu
no de los cientos de genomas procariotas secuenciados contiene
la caracterstica de los intrones actuales o pasados en los genes que
codifican protena). Por el contrario, es muy probable que aparecie
ran por primera vez muy temprano en la evolucin de las clulas
eucariotas: el nico grupo eucariota temprano diferente en el que no
se encontraron son los parabaslidos como las tricomonas que, pese
a ello, tienen parte de la estructura de empalme (corte y unin)
necesaria.
Es probable que los intrones espliceosmicos se originaran de
intrones del grupo II de autoempalme, que se procesan por meca
nismos similares (vase recuadro 12-1; Lynch y Richardson,
2002). Los intrones espliceosmicos no pueden llevar a cabo em
palme por s mismos y requieren cinco molculas separadas de
snRNA y muchas protenas, pero los del grupo II son intrones co
hesivos que se autoempalman. No obstante, se sabe que algunos in
trones funcionales del grupo II se fragmentaron en diferentes
componentes, lo que semeja un poco el sistema de procesamiento
espliceosmico disperso. Algunos intrones del grupo II tambin
pueden codificar su transcriptasa inversa y actuar como elementos
mviles. Por consiguiente, es posible que los espliceosomas se ori
ginaran de un intrn del grupo II dentro de un organelo tempra
no (ya se estableci bien la transferencia de secuencias del DNA de
organelos al DNA nuclear; vase recuadro 12-4). Quiz la frag
mentacin subsecuente en diferentes componentes se llev a cabo
durante un extenso periodo.
Desde que aparecieron por primera vez los intrones espliceo
smicos se integraron de forma peridica en genes (y en algunos
casos se eliminaron) durante la evolucin. Algunos tienen con
claridad orgenes antiguos. Por ejemplo, se conserv muy bien la
colocacin de los dos intrones principales en la superfamilia de
la globina, lo que sugiere que los dos intrones se integraron en
estas posiciones en un gen de globina antiguo tal vez hace ms
de 800 millones de aos (fig. 12-1). Tambin es posible encon
trar posiciones de intrones excepcionalmente bien conservadas
en ortlogos relacionados de manera distante. Por ejemplo, el
gen de la enfermedad de Huntington humana tiene 67 exones
que abarcan 170 kb. El gen equivalente en el pez globo (que se
diferenci de los seres humanos hace ms de 400 millones de
aos) slo tiene 23 kb de largo, pero tambin posee 67 exones
con una conservacin casi perfecta de las posiciones de intrones
12.1
EVOLUCIN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS
353
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Recuadro 12-1. Grupos de intrones

____ :_______ ,_________________ __... ' i
Los intrones son entidades heterogneas con distintas capacidades fun
cionales y diferencias estructurales notables, que incluyen enormes varia
ciones de longitud (en contraste con los exones que al parecer tienen una
longitud mucho ms homognea; vase cuadro 9 -6 ). Segn sea la exten
sin de la que dependen de factores extrnsecos para comprometerse en
el empalme de RNA y la naturaleza de la reaccin de empalme, pueden
clasificarse en diferentes grupos de intrones como sigue:
Intrones esplceosmicos: son los intrones convencionales de clu

las eucariotas. Se transcriben en RNA en el transcrito primario y du
rante el procesamiento de RNA los cortan a nivel del RNA los
espliceosomas.
Al parecer, para la funcin gnica slo son importan

tes unas cuantas secuencias cortas [las que se encuentran en unio
nes de empalme y el sitio de ramificacin o en su proximidad (fig.
1 -1 5 ), aunadas a intensificadores y silenciadores de empalme (sec
cin 1 1 .4.3 )]. Como resultado, los intrones espliceosmicos pueden
tolerar grandes inserciones y ser muy largos (en ocasiones ms de
un 1 M b). Es probable que los intrones espliceosmicos surgieran en
una poca comparativamente reciente en la evolucin y tal vez evolu
cionaron de intrones de grupo II (vase seccin 1 2 .1.1 ). Al tolerar la
insercin de elementos movibles, facilitaron la mezcla de exones.
(Baxendale y cois., 1995). Sin embargo, algunos otros intrones es

pliceosmicos tienen al parecer un origen evolucionista ms re
ciente. Por ejemplo, la localizacin de intrones en numerosas
familias gnicas individuales (p. ej., actinas, miosinas, tubulinas)
no est bien conservada.
12.1.2 Los genes complejos pueden evolucionar

mediante duplicacin intragnica, muchas
veces como resultado de duplicacin exnica
Al igual que otros genes de eucariotas, los genes humanos suelen
mostrar pruebas de duplicacin intragnica de DNA que puede ser
importante. Por ejemplo, se sabe que muchos genes codifican polipptidos cuyas secuencias estn compuestas por completo o en gran
parte de repeticiones grandes, con una homologa de secuencia en
tre las repeticiones muy alta en algunos casos (vase cuadro 9-7).
Mediante la repeticin de un dominio designado con anterioridad
es posible elaborar polipptidos ms grandes con una variedad de
ventajas evolucionistas. Los genes humanos que codifican la ubiquitina, UBB y UBC, codifican protenas multimricas largas que
consisten en repeticiones tndem de una unidad protenica de ubiquitina completa que se cortan para generar mltiples copias de
ubiquitina (tres en el caso de UBB; nueve en el de UBC).
Aparte del caso poco comn de los genes de ubiquitina, la du
plicacin intragnica incluye con frecuencia cierta forma de
duplicacin de exn, de tal manera que se duplica un dominio
protenico particular (fig. 12-2). Alrededor del 10% de los genes de
seres humanos, Drosophila melanogaster y Caenorhabditis elegans
. . >.
Intrones de grupos I y li: tienen una estructura secundaria im portar

te y son intrones de autoempalme (pueden catalizar su autoexcision
sin necesidad de un espliceosoma). Se encuentran en bacterias y eu
cariotas, pero estn muy restringidos en su distribucin y se hallan
sobre todo en genes rRNA y tRNA y en unos cuantos genes que co
difican protenas situados en ciertos tipos de mitocondrias, cloroplastos y bacterifagos. Ambos grupos tambin pueden actuar como
elementos movibles y los intrones movibles de grupos II codifican
una actividad parecida a la transcriptasa inversa, que es muy similar
a la de los elementos LINE-1. Los intrones del grupos I y II difieren en
la identidad de seales de empalme conservadas y la naturaleza de la
reaccin de empalme (p. ej., los intrones grupo I son la nica clase
de intrn que requiere un nuclesido de guanina libre; vase Bonen y
Vogel, 2001).
Intrones de tipo archaea: slo se encontraron en genes tRNA y rR

NA en archaea. Carecen de una estructura interna conservada y, a di
ferencia de los intrones grupos I y II, no se autoempalman. Aunque
requieren protenas para el mecanismo de empalme, en comparacin
con los intrones espliceosmicos, no necesitan molculas de RNA de
accin trans para la reaccin de empalme (corte y unin).
tiene exones duplicados (Letunic y cois., 2002) y pueden asumirse

varias ventajas:
extensin estructural. La repeticin de dominios puede ser en
particular ventajosa dado que se trata de protenas que poseen
una funcin estructural mayor. Un ejemplo ilustrativo lo pro
porcionan los 41 exones del gen COL1A1, que codifica la par
te de la colgena a 1(1) que forma una triple hlice; cada exn
codifica en esencia un nmero integral de copias (una a tres)
de una secuencia tpica de 18 aminocidos que est compues
ta de seis repeticiones tndem de la estructura Gli-X-Y en la
que X y Y son aminocidos variables.
diversidad a travs d e la divergen cia d e dom inio. En casi todos
los casos, los fenmenos de duplicacin intragnica fueron se
guidos de una divergencia sustancial de las secuencias de nucletidos entre las diferentes unidades de repeticin. Es probable que
esta divergencia proporcione la oportunidad de adquirir diferen
tes funciones, aunque relacionadas. En ocasiones, el grado de di
vergencia de secuencias entre las repeticiones es de tal ndole que
es posible que la estructura repetida no sea obvia a nivel de la se
cuencia, como se observa en los dominios de la inmunoglobulina (fig. 9-10).
d iversid a d a travs d e em palm e altern a tivo (vase p. ej., Letu
nic y cois., 2002). Un tipo de empalme alternativo produce di
ferentes isoformas al seleccionar una secuencia exnica de un
grupo de exones duplicados que se incluyen en el producto del
empalme. Puesto que las secuencias de los exones duplicados
pueden mostrar diferencias pequeas, este tipo de empalme
alternativo produce una serie de isoformas relacionadas. Mu-
354
CAPTULO DOCE
LUGAR DEL HOMBRE EN EL RBOL DE LA VIDA
la finalidad de evitar cambios de marco en el marco de lectura traduccional, la duplicacin se limita a exones sim tricos o grupos de
exones simtricos (recuadro 12-2).
0.14 kb
0.11 kb
12.1.3 La mezcla de exones puede traer consigo nuevas

combinaciones de dominios protenicos
1.5 kb 0.63 kb 1.8 kb
T
1
30
6 7 6 8 1 0 7 108
5.7 kb
48
151
N e u ro g lo b in a
0.32 kb 2.4 kb

1 2!5[126
5126 1
18C
80190
C ito g lo b in a
Fig. 12-1. La insercin de un intrn antiguo se sugiere por la conser

vacin de la posicin del intrn en la superfamilia de globina.
Los cuadros representan polipptidos maduros. Los nmeros incluidos
en los cuadros son las posiciones de aminocidos. Obsrvese la
conservacin casi siempre potente de las posiciones del intrn que
indica que un gen de globina ancestral tuvo dos intrones (se muestra
en azul), tal vez hace ms de 8 0 0 millones de aos (vase fig. 1 2 -4 ).
Los intrones adicionales en la secuencia de neuroglobina recin
identificada (roja) y las secuencias de citoglobina (prpura) tal vez se
insertaron hace muchsimo tiempo. Ntese que la expansin de la
protena de citoglobina incluy una expansin de la regin terminal N
de unos 17 aminocidos y de la regin terminal C de casi 23
aminocidos (vase Pesce y cois., 2 002).
chos genes humanos experimentan este tipo de empalme pero

el gen de Drosophila Dscam es el ejemplo ms notable (vase
fig. 10-16).
La duplicacin intragnica de exones puede explicarse por una di
versidad de mecanismos que incluyen cruzamiento desigual, o in
tercambio desigual de cromdtides hermanas (vase Long, 2001). Con
En toda la naturaleza slo se conocen unos cuantos miles de do

minios protenicos conservados, pero en especies metozoricas
muchas protenas contienen dominios que se encuentran en otras
protenas (Li y cois., 2001). La fibronectina, una protena de ma
triz extracelular grande, contiene mltiples dominios repetidos co
dificados por exones individuales o pares de exones y es un buen
ejemplo de la duplicacin tpica de exn. Uno de los dominios re
petidos, que hoy en da se conoce como dominio de fibronectina
tipo I, se encontr con posterioridad en el activador del plasmingeno tisular. Del mismo modo que la fibronectina, el activador del
plasmingeno tisular tambin contiene otros dominios que inclu
yen uno parecido al factor de crecimiento epidrmico (EGF) ca
racterstico del precursor EGF y dos dominios kringle que se
encontraron en otros polipptidos, como prourocinasa y plasmi
ngeno (fig. 12-2).
No es raro que los exones sim tricos individuales o grupos de
exones sim tricos codifiquen a los dominios protenicos (recuadro
12-2). Algunas observaciones sugieren la posibilidad de mezclado
de exones entre genes: los exones o grupos de exones que codifi
can dominios completos se copian e insertan en otros genes (va
se Patthy, 1999; Kaessmann y cois., 2002). Es muy probable que
el mecanismo de mezclado de exones incluya retrotransposicin
asistida por el elemento LINE (vase seccin 12.1.6).
12.1.4 La duplicacin gnica tuvo un papel crucial en

la evolucin de organismos multicelulares
La mutacin es el motor de la evolucin. En procariotas, los tiem
pos de duplicacin cortos y las poblaciones grandes permiten que
se establezcan con rapidez mutaciones que confieren una ventaja en
la supervivencia (en respuesta a cambios del ambiente). Sin embar
go, en animales multicelulares los cambios en genes importantes
con frecuencia son perjudiciales y por lo general hay una presin de
seleccin conservadora potente para mantener la secuencia de un
gen. Por consiguiente, a fin de propagar mutaciones en organismos
complejos se requiere duplicacin gnica.
En cada duplicacin gnica, una de las dos copias del gen es un
excedente del requerimiento y por consiguiente puede divergir en
poco tiempo (debido a la ausencia de presin de seleccin para con
servar la funcin). Incluso si no existen problemas con los efectos
de la dosis gnica, una copia adicional de un gen suele adquirir mu
taciones perjudiciales y se degenera en un seudogen no funcional, o
se pierde por procesos de recambio del DNA (que pueden suceder
durante las escalas de tiempo evolucionistas cuando no es impor
tante una secuencia de DNA). No obstante, en algunos casos mu
ta la copia del gen divergida para producir un producto funcional
con propiedades alteradas que puede ser selectivamente ventajoso y
conservado (fig. 12-3). Las alteraciones en las secuencias de codifi-
12.1 EVOLUCIN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS I 355
Posible cdigo
Fibronectina
C lav e p a ra los exones:
Dominio d e fibronectina tipo I
Precursor del factor

de crecim iento epidrm ico
11
A ctivador del
plasm ingeno tisular
Dominio de fibronectina tipo III que se

encuentra en muchos receptores de
superficie celular y otras protenas de
matriz extracelular
Kringle; 38
I coDominio
p ias en protena ApoA
inio d e fibronectina tipo I
I EItamdom
bin s e encu en tra en factores
Prourocinasa
d e coagulacin san gunea

Dominio del factor d e
crecim iento epidrm ico
Dominio desco nocid o
Fig. 12-2. Duplicacin de exones y mezcla de exones.

Se encuentra una duplicacin conspicua de exones en los genes humanos de fibronectina
FN1 tiene
(FN1) y
del factor del crecimiento epidrmico
(EGF). El gen
12 copias de un exn que codifica el dominio tipo I de fibronectina y 15 copias de un par de exones, que especifican juntos el dominio tipo III
de fibronectina; el gen
EGF tiene
nueve copias de un exn que especifica un dominio EGF. La mezcla de exn significa que los exones que codifican
estos dominios se encuentran en muchos otros genes como los que codifican el activador del plasmingeno tisular y prourocinasa. Vase la figura 12-7
para un posible mecanismo de la mezcla de exones.
Recuadro 12-2.
Fases
sim tricas de exones e intrones
No todos los exones contienen DNA de codificacin. Hay exones no co

dificantes porque en ocasiones los intrones se localizan dentro de se
cuencias no traducidas, como las secuencias UTR 5 ' y UTR 3 ' de genes
que codifican poiipptidos. Los intrones, que cortan DNA de codificacin
en diferentes exones codificantes, permiten la diversificacin mediante
duplicacin exnica y mezcla de exones. Es posible distinguir tres fases
de intrn segn sea el punto de insercin en el DNA de codificacin (va
se figura): fase 0 (entre la tercera base de un codn y la primera base del
codn siguiente); fase 1 (entre la primera y segunda bases de un codn);
fase 2 (entre la segunda y tercera bases del codn).
1
5'
Vai
UTS
HBB
ATG
G T G --
Los exones de codificacin pueden clasificarse de acuerdo con las fases

de los intrones que los flanquean. Los exones simtricos (con un nme
ro total de nucletidos divisible exactamente por tres) estn flanqueados
por intrones de la misma fase y por consiguiente pueden clasificarse co
mo: 0 -0 ,1 -1 o 2-2 , segn sea la fase de los intrones de flanqueo. Los
exones no simtricos (en los que el nmero de nucletidos no es divisi
ble exactamente por tres) pueden clasificarse como 0 - 1 ,0 - 2 ,1 - 0 , etc. La
elaboracin de una copia de un exn por duplicacin exnica y mezcla de
exones suele limitarse a exones simtricos o a grupos de exones no si
mtricos vecinos que no ocasionan un cambio de marco si se duplicaran
o copiaran dentro de otro gen, por ejemplo exones contiguos 0 - 1 y 1 - 0 .
31
30
A
\
(
Leu
Gli Ar 2
2.
G G C --A G L - ag |G- C T G 29
105
146
Ot Leu
His
104
Arg
--A G G
g t ------ a g
C C C -- ---C A C
3 ' UTS
t a a I
Fase 0
Fase 2
81
5' UTS
INS
Jgt
agj
80
ATG
1 al
CAG G |g t--a g |T G
110
3 ' UTS
A A C TAG
Fase 1
Ejemplos de fases de intrn en los genes de globina i e insulina.
Los nmeros arriba de los genes se refieren a posiciones codn/aminocido. HESB, gen de la globina p humana. INS, gen de la insulina en seres huma
nos. Nota: el exn 2 del gen de la globina p podra clasificarse como un exn 2 -0 no simtrico que est flanqueado por intrones de diferentes fases, en
este caso un intrn de fase 2 corriente arriba y un intrn de fase 0 corriente abajo.
356
CAPITULO DOCE
Presin de
seleccin
! --------- Funcin
A ' original
Lenta
Duplicacin
gnicaV
Divergencia
de secuencia
I ila '* - Funcin

A2
Rpida
\|/A
relacionada
Sin
funcin
Fig. 12-3. La duplicacin gnica puede generar diferentes variedades de genes funcionales pero con gran frecuencia el resultado es la formacin
de un seudogen.
La duplicacin del gen A crea dos copias gnicas equivalentes. Es necesario aplicar presin de seleccin slo a una copia del gen (arriba) a fin de
conservar la presencia del producto del gen funcional original. La otra copia (abajo) contina su expresin pero, en ausencia de presin de seleccin
para conservar su secuencia, acumula mutaciones (asteriscos rojos) relativamente pronto. Puede adquirir mutaciones perjudiciales y tornarse en un
seudogn no funcional (v|A) que al final se elimina del genoma. Sin embargo, en algunos casos, las diferencias mutacionales pueden conducir a
un patrn de expresin distinto u otra propiedad que es ventajosa en trminos selectivos (A2).
Cuadro 12-1. Clases de globina y genes de globina humana.

Protena
Funcin
Estructura
Polipptido(s)
Gen(es)
Localizacin gnica
Hemoglobina* (Hb)
Transporte de 0 2 en la
sangre. Portland, Gower
1 y Gower 2 son formas
embrionarias tempranas.
Alrededor de las ocho se
manas de gestacin, el
hgado fetal sintetiza de
manera predominante
HbF y un poco de HbA.
El 70% de la Hb en recin
nacidos es HbF, pero ha
cia el final del primer ao
disminuye a 1 % a medida
que predomina la HbA.
HbA2 es una Hb minorita
ria en nios y constituye
< 3% de la Hb del adulto
Heterotetrmero
Portland (J 2 -y2)
Gower 7( 2 e2)
Gower 2( a 2 e2)
HbF = Hb fetal ( a 27 2)
HbA = Hb del adulto (a 2 p 2)
HbA Hb del adulto ( a 2 p 2)
HbA2(a 2 S2)
Globina alfa
Globina zeta ()
HBA1 ,HBA2
HBZ
16p13.3, grupo de globina a

16p13.3, grupo de globina a
Globina
Globina
Globina
Globina
HBB
HBG1.HBG2
HBD
HBE1
11 p15.5,
11 p15.5,
11 p15.5,
11 p15.5,
Mioglobina
Transporte y alm acena

miento de 0 2 en msculo
Monmero
Mioglobina
MB
22q13.1
Neuroglobina
Se expresa de
dominante en
nervioso en el
nistra oxgeno;
multifuncional
modo pre
el sistema
que sumi
puede ser
Monmero
Neuroglobina
NGB
14q24
Citoglobina
Se expresa en casi todos

los tejidos; se desconoce
la funcin exacta
Monmero
Citoglobina
CYGB
17q25.3
beta
gamma
delta
psilon (e)
grupo
grupo
grupo
grupo
de
de
de
de
globina
globina
globina
globina
p
(3
p
p
*Nola: el polipptido globina theta sintetizado por el gen HBQ1 en el grupo de globina a (vase fig. 9-11) no se incorpora en la molcula de Hb y se desconoce su funcin, si
acaso tiene alguna.
12.1
nacin podran requerir cierto tiempo para establecerse, pero las

modificaciones en las secuencias reguladoras suelen proporcionar
?ronto caractersticas de expresin nuevas. El producto gnico re
saltante podra expresarse en diferentes tejidos o distintas etapas del
desarrollo y adaptarse despus al nuevo ambiente (vase el ejemplo
ce los genes de globina; seccin 12.1.5).
En los genomas complejos son comunes genes duplicados y
pueden surgir con suma rapidez en una escala del tiempo evolucio
35
nista: un gen promedio se duplica alrededor de una vez cada 100

millones de aos (Lynch y Conery, 2000). Se originan por una va
riedad de mecanismos diferentes. Algunos causan duplicaciones li
mitadas, que incluyen con frecuencia genes nicos y se consideran
en las secciones 12.1.5 y 12.1.6. Otros crean duplicaciones a gran
escala y del genoma completo y se comentan en el contexto de la
evolucin del cromosoma y el genoma (seccin 12.2). En el recua
dro 12-3 se describen los principales mecanismos.
R ecuadro 12-3. M ecanismos y paralogia de la duplicacin gnica

La duplicacin gnica en genomas de metazoarios significa que los ge
nes homlogos (genes con identidad de secuencia importante que sugie
re una relacin evolucionista cercana) pueden ser de uno de dos tipos
(vase figura). Los ortlogos son genes que se encuentran en diferentes
genomas y que se relacionan de forma directa por la descendencia de un
ancestro comn. Los parlogos son genes que se encuentran en un mis
mo genoma como resultado de duplicacin genica. Diversos mecanis
mos pueden provocar duplicacin gnica.
lateral). Esto significa

transferencias gnicas antiguas entre diferentes genomas (Brown,
2 003). El International Human Gene Sequencing Consortium (2001)
sugiri que cientos de genes humanos se originaron quiz por trans
ferencia gnica horizontal de bacterias en algn punto del linaje de
vertebrados. Aunque en la actualidad se sabe que no es correcto
(vase recuadro 1 2 -4 ), al parecer cuando menos parte de los genes
nucleares humanos se origin por transferencia gnica horizontal an
tigua despus de la adquisicin de un genoma protomitocondrial
(seccin 1 2 .2 . 1 ).
Transferencia gnica horizontal (esto es,
Duplicacin gnica tndem. Genes nicos pueden sufrir duplicacin

tndem como resultado de acontecimientos de cruzamiento desigual
o intercambios desiguales de cromtides hermanas (fig. 1 1 -9 ). Las
familias gnicas humanas agrupadas se originan de manera caracte
rstica por duplicaciones tndem secuenciales (p. ej los grupos de
los genes de las globinas a y 0 ; vase seccin 12.1.5). Los mismos
mecanismos pueden dar lugar a duplicaciones a gran escala, que In
cluyen segmentos que contienen varios genes, pero las duplicaciones
a muy grande escala son relativamente raras, en parte por la posibi
lidad ms alta de efectos de dosis gnica, etctera.
Duplicacin gnica mediada por retrotransposicin (es decir,
Duplicacin segmentaria. Una proporcin notable del genoma huma

no consiste en bloques de secuencias relacionados de modo cerca
no en diferentes localizaciones genmicas que muestran > 90% de
identidad secuencial en segmentos que abarcan longitudes de cientos
de kilobases. En apariencia, este tipo de duplicacin sucedi en una
fase reciente durante la evolucin. Vase la seccin 12.2.5.
Poliploida. La duplicacin del genoma completo tiene la atraccin de

ofrecer de inmediato copias gnicas para mutacin a fin de trabajar
sin incurrir en problemas debido a diferencias en la dosis gnica. Los
genomas de varias especies sufrieron con claridad poliploida, pero
existen controversias acerca de la extensin a la que ello model la
evolucin de los genes humanos (seccin 12.2.3).
trans
posicin duplicativa).
Es posible que contribuya en buena medida.

Aunque con frecuencia tiene como consecuencia copias sin intrones
de un gen que contena un intrn, en ocasiones tambin puede copiar
secuencias de intrn (seccin 1 2 . 1 .6 ).
G lo b in a
G en a n ces tral
D u p lic a c i n g n ic a
(/
0C ) cCc/D>
O
o
o
o
(O
B
3 3
E E
3 <1>
O
< *o
- - M io g lo b in a -------- C toglobina
P a r lo g o s
E s p e c ia c l n
S e r h u m an o
R at n
M io g lo b in a --------i C toglo bina
M io g lo b in a -------- C toglobina
O rt lo g o s
Homlogos, ortlogos y parlogos.

Se piensa que la mioglobina y la ctoglobina se originaron a partir de una duplicacin gnica que ocurri hace unos 500 millones de aos. Vase la fi
gura 12 -4 para las relaciones con los otros genes de globina.
358
CAPTULO DOCE
LUGAR DEL HOMBRE EN EL ARBOL DE LA VIDA
12.1.5 La superfamilia de la globina evolucion por un

proceso de duplicaciones gnicas, conversiones
de genes y prdida/inactivacin gnica
Evolucin de las cinco clases de gen de globina
Las globinas son protenas que contienen porfirina y enlazan ox
geno de manera reversible y por consiguiente son importantes en
el sistema respiratorio. Corresponden a cuatro clases funcionales
(vase cuadro 12-1): la hemoglobina y mioglobina bien estudia
das y la neuroglobina y las citoglobinas identificadas en fecha
ms reciente (vase Pesce y cois., 2002). Las hemoglobinas trans
portan oxgeno en la sangre y son heterotetrmeros que consisten
en dos cadenas de globina idnticas codificadas por miembros de
la fa m ilia d el gen d e globina a en el cromosoma 16 y dos codifi
cadas por miembros de la fa m ilia gn ica d e globina i en el cro
mosoma 11. Un gen en el cromosoma 22 codifica la mioglobina.
Es monomrica y se halla en clulas musculares en las que facilita
la difusin de oxgeno a las mitocondrias. El gen de neuroglobi
na en el cromosoma 14 codifica un monmero y se expresa en el
cerebro en donde aumenta la disponibilidad de oxgeno a los te
jidos cerebrales (Burmester y cois., 2000). El gen de citoglobina
recin identificado se expresa de modo ubicuo; se desconoce su
funcin.
La homologa secuencial entre los polipptidos de globina su
giere que esta familia se form por una serie de fenmenos de
duplicacin gnica, algunos antiguos y otros ms recientes. Por
consiguiente, los polipptidos de la globina de las diferentes loca
lizaciones cromosmicas suelen relacionarse en grado distante en
tre s, lo que sugiere duplicaciones gnicas antiguas (aunque las
familias de las globinas a y P estn relacionadas con claridad ms
de cerca entre s respecto de la mioglobina, neuroglobina o cito
globina). El grado de homologa secuencial entre las diferentes
globinas, aunado a la observacin de las posiciones de los intrones
casi siempre conservadas (fig. 12-1), sugiere que las cuatro fami
lias proceden de un gen de globina ancestral nico por una serie
de duplicaciones desde hace alrededor de 800 a 450 millones de
aos (fig. 12-4).
Con posterioridad, los genes ancestrales de las globinas o y (3
sufrieron una serie de duplicaciones adicionales; algunas de ellas
sucedieron en poca muy reciente (vase fig. 12-4). Por ejemplo,
los dos genes de la globina a humana HBA1 y HBA2 codifican
productos idnticos y los productos de los dos genes de la globi
na y , HBG1 y HBG2, difieren slo por un aminocido. En otros
casos, los genes duplicados dentro de un grupo divergen ms en
la secuencia, tal vez porque los fenmenos de duplicacin rele
vantes ocurrieron hace algn tiempo. Algunas duplicaciones origi
naron los seudogenes convencionales. Es posible que en el futuro
se degeneren en seudogenes cada uno de los dos genes humanos
de la globina a y los dos genes de la globina "y.
Evolucin de los grupos gnicos de la globina

de mamferos
Anlisis comparativos de secuencias de los grupos del gen de la
globina p en diferentes mamferos revelan organizaciones gni
cas un poco diferentes. Los distintos tipos de duplicacin de un

gen aislado tuvieron lugar en diversos linajes y asimismo existen
pruebas de prdida gnica, fusin de genes y conversin gnica (in
tercambios de secuencias no recprocos en los que se utiliza una
secuencia copiada de un gen donador para reemplazar alguna se
cuencia de un gen aceptor; vase el mecanismo en la fig. 11-10).
Por ejemplo, los seres humanos tienen un gen de la globina P y
uno de globina 6 pero dos genes de globina y ; el ratn tiene dos
genes de globina (3, dos genes de globina parecidos a la e, pero
slo un gen de la globina y (fig. 12-5). En el linaje que condu
jo a las cabras actuales, la prdida temprana de un gen de la glo
bina y fue seguida de una triplicacin a gran escala (tal vez como
resultado de dos fenmenos sucesivos de recombinacin desiguales,
el primero de los cuales produjo una duplicacin). Al parecer, la
conversin gnica ha sido frecuente. Por ejemplo, es aparente la con
versin de la globina 8 por la globina (3, sea en linajes humanos o
en los de la cabra (fig. 12-6).
Los tipos anteriores de acontecimientos pueden explicarse
por intercambios de secuencia simples que ocurrieron en este
grupo.
Si se toma en cuenta que los marsupiales como la zarigeya s
lo tienen dos genes en este grupo, un gen de globina (3 y un gen
de globina 6, existe la posibilidad de que el grupo gnico de glo
bina P actual surgiera de un gen de globina nico que sufri una
duplicacin inicial que gener un protogn de globina parecido a
P y un protogn de globina parecido a e y a continuacin se du
plic de manera adicional para generar los cinco tipos de genes en
este grupo (fig. 12-6). La identidad de secuencia perfecta inicial de
secuencias duplicadas en tndem las hace propensas a intercam
bios de secuencia adicionales por cruzamiento desigual (que pue
de dar lugar a ms duplicacin gnica, prdida de genes y genes de
fusin) y conversin gnica. Sin embargo, al final las secuencias
duplicadas varan, a menos que la presin de seleccin conserva
dora mantenga la secuencia y, aunque hay una homologa de se
cuencias considerable entre las secuencias individuales del gen de
1.6 kb, existe mucho menos entre las secuencias de flanqueo ms
largas.
Evolucin de la expresin diferencial del gen de globina

En condiciones normales, la duplicacin gnica tndem significa
que se duplican las secuencias reguladoras y las de codificacin. La
divergencia de secuencias subsecuente en regiones reguladoras de
accin cis puede conducir a una expresin alterada, desde los pun
tos de vista espacial (p. ej., en diferentes tejidos) y temporal (co
mo en distintas etapas del desarrollo). Esto puede ser una ventaja
evolucionista muy potente de duplicacin gnica. Debido a que las
secuencias reguladoras con frecuencia estn constituidas por ele
mentos de secuencia muy pequeos, la mutacin puede dar por re
sultado una rpida expresin divergente. Al expresar las mismas
copias esencialmente del mismo gen en diferentes compartimientos
espaciales o temporales es posible que las copias gnicas adquieran
distintas funciones: los diversos ambientes proporcionan una pre
sin de seleccin diferencial que origina que varen las secuencias
de codificacin como esfuerzo para adaptarse de manera ptima a
los distintos ambientes.
12.1 | EVOLUCIN DE LA ESTRUCTURA GENICA Y GENES DUPLICADOS
359
G lobina an cestral
14q
Neuroglobna
17q
I
Citoglobina
22q
16p
-D -
H----- 11p
I
Mloglobina
-H
-I64 .1 %
7 9 .5 %
9 9 .3 % 7 1 .2 %
9 3 .2 %
H
4 3 .2 %
Fig. 12-4. Evolucin de la supertamilia de la globina.

Las globinas que se codificaron dentro de un grupo gnico muestran mayor grado de identidad secuencial que las codificadas en los diferentes cromosomas
(en las que los valores de identidad secuencial son menores del 30%, excepto para las comparaciones entre los grupos gnicos de las globinas
ay
p).
Los grupos gnicos de las globinas a y p se diversificaron despus por duplicaciones gnicas en tndem. Algunas de las duplicaciones fueron muy
recientes: los genes
HBA1 y HBA2 codifican
globinas
idnticas;
HBG1 y HBG2 codifican
20
40
globinas -y que difieren slo por un aminocido.
60
100
80
120
1 4 0 kb
I
e
G rupo d e la g lo b n a -p
C a b ra
I
e
G a la g o
Ser
hum ano
e11 \|/(3X
y \|/r|
| - { F
elv \jfpz
pA
evl \)/pY
ev
pF
Gy
\|ni
I -------------- 0 H
y \j/5
ID
y
R at n
e111
-HOHe
C o n e jo
pc
v|/bh1
v|/bh3 b1
IH O O -1
ybhO
b2
I-
\|fbh2
Fig. 12-5. El grupo del gen de la globina p muestra considerables diferencias en la organizacin de familias gnicas ortlogas de mamferos.
El gran nmero de genes en el grupo de la globina p de la cabra refleja un acontecimiento de triplicacin en tndem. Los cuadros en blanco indican
seudogenes. Redibujado a partir de Hardison y Miller (1993),
Mol.Biol.Evol. 10:73-1 02,
1993, Oxford University Press.
360
CAPTULO DOCE | LUGAR DEL HOMBRE EN EL RBOL DE LA VIDA
ey
vfiho ph vph2 yph3
(31
32
R atn
Fig. 12-6. La evolucin del grupo gnico de la globina p de mamferos incluy duplicaciones gnicas frecuentes, conversiones y prdida o inactiva
cin gnica.
Obsrvese que
adems de la duplicacin y prdida gnicas, hay frecuentes ejemplos en los que la secuencia de un gen muestra pruebas de que se
copi de la secuencia de otro gen. Esto se describe en trminos generales como conversin en esta figura, pero es posible que en algunos casos se
incluyan otros mecanismos aparte de la conversin gnica. Por ejemplo, la conversin de
en (3 en el linaje que conduce a conejos pudo Incluir un
fenmeno de cruzamiento desigual del tipo que con mayor probabilidad dio lugar a la produccin del gen 4<h3 en el linaje del ratn. Redibujado a
partir de Tagle y cois. (1992), Genomics 1 3 :7 4 1-7 60 , con autorizacin de Elsevier.
La superfamilia de la globina proporciona algunos ejemplos.

Las duplicaciones gnicas antiguas de un gen de globina ances
tral generaron copias que se sometieron a divergencia en secuen
cias reguladoras, lo que suscit que se expresaran en diferentes
tejidos (p. ej., sangre, msculo, sistema nervioso). Las copias g
nicas se adaptaron a sus ambientes y condujeron a una gran di
vergencia de secuencias de los productos y formaron, de manera
respectiva, hemoglobina, mioglobina y neuroglobina, cada una
de las cuales tiene una funcin central de enlace de oxgeno. De
puraciones subsecuentes en las globinas determinaron que la he
moglobina introdujera diferentes variedades de globina, que se
expresaron en etapas particulares del desarrollo y tal vez se tor
naron ms especializadas. Por ejemplo, es posible que las cade
nas de globina e, y 7 sean en especial adecuadas para enlazar

oxgeno en el ambiente comparativamente malo en oxgeno del
desarrollo temprano, en tanto que las cadenas de globina a y (3
tal vez sean los polipptidos preferidos en el ambiente de tejidos
adultos.
12.1.6 La retrotransposicin puede permitir la mezcla

de exones y contribuye de manera considerable
a la evolucin gnica
La retrotransposicin, el proceso por el cual se elabora una copia de
cDNA natural a partir de un transcrito de RNA y a continuacin se
inserta en una nueva localizacin cromosmica, ha sido un medio
12.1
muy potente en la modelacin del genoma humano. Ms de 40% de

este ltimo consiste en repeticiones derivadas de retrotransposones y
un porcentaje pequeo de estas repeticiones se transpone de forma
activa (seccin 9.5.1). Los dispositivos de retrotransposicin contri
buyeron de manera notoria a la evolucin gnica al elaborar copias
de exones, traspasarlas de una localizacin en el genoma a otra y pro
porcionar un mecanismo para que se duplicaran ciertos genes.
361
Tran scrip ci n L1
l
E1
E2
pA
L1
pA
E3
1
7
"
L1
1 G en A
E3
'A A A A A A A R N A
Mezcla de exones por transduccin mediada por LINE

Los elementos LINE-1 (L-l) no pertenecen a la clase RTL de re
trotransposones y pueden sufrir transposicin de modo autnomo
(seccin 9.5.2). En condiciones experimentales se demostr que los
elementos LINE-1 se insertan en el intrn del gen, hacen una co
pia del exn corriente abajo y a continuacin transponen esta co
pia del exn dentro de otro gen (Moran y cois., 1999). Esto se debe
quiz a que la estructura de retrotransposicin LINE-1 tiene una
especificidad dbil para su extremo 3', lo que determina que pase
por alto las seales reguladoras en ese extremo. Una vez que inser
ta un elemento LINE-1 en un gen, la transcripcin de la repeticin
LINE-1 deriva con frecuencia su secuencia poli (A) propia dbil y
utiliza en lugar de ello una seal poli(A) corriente abajo del gen
husped. Al llevarlo a cabo, puede hacer una copia de un exn que
suele fijarse dentro de otro gen despus de otro fenmeno de retrotransposicin (transduccin de 3 ' mediada por LINE-1; vase fig.
12-7). Por consiguiente, es posible que este mecanismo sea la base
de la mezcla de exones que al parecer ha sido importante en la evo
lucin gnica (seccin 12.1.3).
T ra n s c rip ta s a in v ersa L1
+ e n d o n u c le a s a
l
c D N A hbrido
L 1 /E 3
In s erto en
d ife re n te
lo c a liza c i n (gen B)
G en B
E1
|
L1
E3
E2
Fig. 12 -7 . Elementos de transposicin pueden mediar la mezcla de

exones entre genes. La familia de la secuencia LINE-1 (L-1) contiene
miembros que se transponen de forma activa en el genoma humano.
Duplicacin gnica mediante retrotransposicin
Los elementos de LINE-1 poseen seales poli(A) dbiles y por

consiguiente la transcripcin puede continuar despus de esta seal
La retrotransposicin de secuencias gnicas es un acontecimiento

comn en la modelacin de genomas complejos. El copiado de
un RNA empalmado (cortado y unido) de un gen que contiene un
intrn significa que se eliminan las secuencias que contienen el in
trn y cuando el RNA que se copia es un mRNA, la secuencia co
piada carece de cualquier secuencia promotora. Como resultado,
la retrotransposicin de secuencias mRNA copiadas tiene como
resultado tpico la formacin de seu d ogen es procesa dos inactivos
(fig. 9-14). Sin embargo, en ocasiones esta copia de cDNA se in
tegra cerca de un promotor funcional y puede someterse a presin
de seleccin a fin de conservar la funcin gnica para transfor
marse en un retrogen. Los ejemplos comunes son las copias autosmicas procesadas ligadas a X que producen protenas requeridas
en sentido funcional durante la espermatognesis. En el transcur
so de esta ltima, se condensan los cromosomas X y Y para formar
el corpscido XY inactivo desde el punto de vista transcripcional,
pero la copia de un gen autosmico puede proporcionar el pro
ducto gnico necesario. Se conocen asimismo retrogenes derivados
de genes no enlazados a X; vase seccin 9.3.6 y cuadro 9-11.
Hasta fecha muy reciente se pensaba que la duplicacin gni
ca por retrotransposicin se limitaba tan slo a copiar secuencias
hasta que se alcanza otra seal poli(A) cercana, como en el caso del
gen A en la parte superior. La copia de RNA resultante puede contener
un transcrito no tan slo de las secuencias LINE-1, sino asimismo de un
exn corriente abajo (en este caso E3). El complejo LINE-1 de la
transcriptasa inversa puede actuar a continuacin en la secuencia
poli(A) extendida para producir una copia de cDNA que contiene
secuencias LINE-1 y E3. La transposicin subsecuente hacia una
nueva localizacin cromosmica puede propiciar la insercin del exn
3 en un gen diferente (gen B). Vase Moran y colaboradores (1999).
exnicas. Sin embargo, los anlisis de un nuevo gen quimrico

(Courseaux y Nahon, 2001) demostraron que en ciertas situacio
nes pueden copiarse secuencias intrnicas por una va indirecta.
Lo anterior es posible cuando la cadena antisentido de un gen que
contiene un intrn produce un transcrito de RNA maduro que in
cluye la secuencia complementaria a las secuencias del intrn del
gen transcrito de la otra cadena. Como hoy en da se sabe que los
transcritos de RNA antisentido son muy frecuentes en el genoma
humano, algunas veces las copias retrotranspuestas pueden condu
cir a la duplicacin de genes que contienen el intrn.
362
CAPTULO DOCE
LUGAR DEL HOMBRE EN EL ARBOL DE LA VIDA
E n d o c ito s is
Transferencia
g n ic a
G e n o m a n u c le a r
a n c e s tr a l en
p r o to e u c a rio ta
G enom a
m ito c o n d ria l
a n c e s tra l e n
c lu la p ro c a r io ta
Fig. 12-8. Es probable que el genoma mitocondrial humano se originara despus de la endocitosis de una clula procariota por una clula eucariota precursora.
En este ejemplo particular, la clula endocitante no tiene un ncleo, pero algunos modelos representan la endocitosis por una clula protoeucariota
con un ncleo. Se presupone que despus de la endocitosis los genes del genoma de la procariota se transfirieron al precursor del genoma nuclear y
dejaron un genoma mitocondrial muy reducido. Vase Doolittle (1 9 9 8 ) para la descripcin de un posible mecanismo de transferencia gnica.
12.2
Evolucin de crom osom as

y genom as
12.2.1 Es posible que el genoma mitocondrial se

originara despus de la endocitosis de
una clula procariota por un precursor
de la clula eucariota
Adems del ncleo, las mitocondrias tienen un genoma, al igual
que los cloroplastos de las clulas de plantas. La organizacin y
expresin de los genomas mitocondrial y de cloroplastos mues
tran grandes similitudes con los de clulas procariotas (vase ms
adelante), lo que sugiere que las clulas eucariotas se originaron
despus que un precursor de la clula eucariota (p rotoeu cariota)
englob algn tipo de clula procariota (el sim b ion te). Se piensa
que este proceso confiri una ventaja selectiva a la nueva clula
resultante y se denomin endosimbiosis (fig. 12-8).
En la hiptesis del endosimbionte se presupone que el genoma
de la clula procariota englobada dio lugar al genoma mitocon
drial de la actualidad. Las clulas procariotas actuales (bacteria y
archaed) contienen de manera caracterstica una o unas cuantas
megabases de DNA e incluyen varios cientos o miles de genes, pero
los genomas mitocondriales son mucho ms pequeos. Por ejemplo,
el genoma mitocondrial humano posee alrededor de 16 kb con
slo 37 genes y la inmensa mayora de las protenas y funciones mi
tocondriales la especifican genes nucleares (vase seccin 9-1.2).
Por consiguiente, es probable que muchos de los genes que existan
de modo original en la clula englobada se transfirieran al genoma
de la clula husped por tra n sferen cia g n ica h o riz o n ta l o la tera l
(Doolittle, 1998). Es posible que las transferencias gnicas hori
zontales fueran extensas durante las etapas tempranas de la evolu
cin celular.
Las identidades de las clulas que participaron en la endocito
sis que dio lugar a las mitocondrias son an un tema de cierta dis
cusin. En la hiptesis inicial se presupuso que la clula husped
tena algunas caractersticas eucariotas, pero hiptesis ms recien

tes consideran como husped a una clula archaea. La hiptesis
del hidrgeno propone que los eucariotas surgieron por el englobamiento de una proteobacteria alfa que produca hidrgeno por
un husped anaerobio, dependiente de hidrgeno, de tipo archaea.
Una variante, la h ip tesis sin trfica , sugiere que el simbionte pro
ductor de hidrgeno fue una proteobacteria 8. Se consider que
el husped de tipo archaea haba sido estrictamente autotrfico
(capaz de sintetizar sus compuestos orgnicos a partir de molculas
simples del ambiente, en lugar de confiar, como los hetertrofos, en
la ingestin de compuestos orgnicos sintetizados por otros orga
nismos). Pese a ello, a fin de evitar ciclos insustanciales de metabolitos en su citoplasma, el husped perdi ms adelante su va
autotrfica y surgi un hetertrofo irreversible que contena mito
condrias ancestrales pero ya no dependa ms del hidrgeno. A con
tinuacin, muchos de estos organismos adoptaron una respiracin
basada en oxgeno ms eficiente y evolucionaron las mitocondrias
aerobias.
Las hiptesis de hidrgeno/sintrofismo se basaron en observa
ciones de ciertos eucariotas que carecen de mitocondrias: Giardia,
parabaslidos como Trichomonas, Entamoeba y unos cuantos cilia
dos y hongos. La clasificacin filogentica ms aceptada coloca a
Giardia y Trichomonas como los microorganismos que divergieron
ms temprano del linaje eucariota (recuadro 12-4; fig. 12-22). Los
parabaslidos, y asimismo algunos cilados y hongos amitocondriales, tienen organelos especializados llamados h id rogen osom a s, que
fermentan el piruvato y producen hidrgeno. El hidrogenosoma
carece de cualquier genoma que pueda ayudar a rastrear sus orge
nes; empero, el anlisis filogentico de protenas dirigidas a hidro
genosomas indica una posible va evolucionista compartida con las
mitocondrias y el hidrogenosoma en s mismo puede ser un mitocondrin derivado. Los eucariotas que carecen de mitocondrias
poseen tambin enzimas metablicas parecidas a las bacterianas
(adems de otros genes tipo bacteriano conocidos). De igual mo
do, tal vez es importante que en tanto que la mayor parte de los
12.2
EVOLUCIN DE CROMOSOMAS Y GENOMAS
363
Recuadro 1 2-4. rbol universal de la vida y transferencia gnica horizontal

La filogentica molecular (clasificacin de organismos de acuerdo con
la relacin de protenas o cidos nucleicos) produjo un choque importan
te a finales de la dcada de 1970: anlisis de rRNA revelaron que un gru
po de bacterias que producen metano era muy diferente respecto de otras
bacterias. Las archaebacteria -c o m o se las denomin prim ero-tam bin
tenan al parecer caractersticas celulares poco comunes y mostraban
una relacin cercana con eucariotas en muchos aspectos de la transfe
rencia de informacin (replicacin de DNA, reparacin de DNA, transcrip
cin, traduccin, etc.). Como resultado, cada vez se acept ms la
necesidad de reemplazar la divisin previa de vida en procariotas y euca
riotas por una divisin alternativa en tres dominios.
Bacterias: son los procariotas que se encuentran con frecuencia,
Archaea: procariotas similares a eucariotas en sus procesos de trans
que
habitualmente se han estudiado bien (p. ej., bacterias gramnegativas
y grampositlvas, cianobacterlas, etc.).
ferencia de informacin. Muchas veces se aislan de ambientes extre

mos (p. ej., manantiales termales, concentracin salina muy alta, pH
extremo, y otros), pero tambin se sabe que ocurren en hbitats ms
usuales, entre ellos suelos y lagos, y se han encontrado en abundan
cia en el tubo digestivo de vacas, termitas y vida marina, en los que
producen metano.
Eucariotas: de ellos se imagin que las bacterias divergieron primero

del ltimo ancestro comn universal (vase figura). Se piensa que las
mitocondrias y los cloroplastos se originaron por endocitosis de cier
tas clulas procariotas por precursores de clulas eucariotas y la
transferencia subsecuente de muchos de los genes del genoma endocitado al genoma husped, una form a de transferencia gnica ho
Si bien, al parecer la TGH tuvo un papel crucial en la evolucin del ge

noma en el pasado, se conocen varios ejemplos recientes de TGH de
ocurrencia natural, en especial entre diferentes especies bacterianas p
ej., plsmidos y transferencia de genes patognicos y de resistencia a
los antibiticos mediada por fago). Puede ocurrir asimismo TGH entre genomas eucariotas (p. ej., entre diferentes especies Drosophila a travs de
transposones de DNA). El International Human Genome Sequencing Con
sortium ( 2 0 0 1 ) lleg asimismo a la conclusin asombrosa de que algunos
cientos de genes humanos evolucionaron por TGH de bacterias en algn
punto del linaje de vertebrados. Los genes humanos muestran homologas
claras con genes bacterianos sin encontrarse en apariencia en algunos genomas de invertebrados (D. melanogaster, C. elegans). Sin embargo, en
la actualidad se sabe que la conclusin es incorrecta porque anlisis filogenticos extensos identificaron homlogos en otros invertebrados y, por
consiguiente, los genes humanos pueden explicarse en trminos de des
cendencia a travs de ancestros comunes -la ausencia de homlogos en
varias especies puede atribuirse a prdida de genes en algunos linajes
(vase Brown, 2003 para consultar ms referencias).
El rbol universal de vida que se muestra en esta figura est muy lejos de
aceptarse de forma unnime y lo han objetado estudios de varios otros
grupos de datos de secuencias de protenas. De manera inevitable, es di
fcil la clasificacin filogentica si es necesario tomar en cuenta la trans
ferencia gnica horizontal comn, ya que diferentes grupos gnicos
pueden dar resultados filogenticos contradictorios. En consecuencia,
hoy en da se aplican los mtodos del genoma completo para la elabo
racin del rbol. Este campo es dinmico y se aconseja a los lectores
consultar las revisiones recientes.
rizontal (TGH).
E u c a rio ta s
A nim ales
Plantas
M ohos de limo
B a c te ria s
Hongos
M icro sp o rid io s
A rc h a e a
Entam oeba
E u rya rch a eo ta
A p ic o m p le x a (co m o Plasm odium)
Grampositivos Korarchaeota
Grampositivos G + C
\
_______- V---------bajo
G+ C
C re n a rc h a e o ta
5/e Purpurios
/'
Eugiena
' C in e to p las to (co m o Trypanosoma)
P ara b a s a lia (co m o Trichomonas)
Purpurios^
y/|3 Purpurios
Esp iro q u etas F u s o b ac teria s
F le x ib a c te r/b a c te ro id e s C ia n o b a c te ria a
M e ta m o n d a (co m o Giardia)
a
T e rm otogalos
c.
Therm usAquifex -
P rd id a m ito condrial
Clave:
Posibles orgenes d e organelos
------- C lo ro p lasto s
-------M ito c o n d ria s
U ltim o a n c e s tro
c o m n u n iv ers al
rbol universal de vida basado en la filogenia de rRNA.
Adems de participar en la formacin de los genomas mitocondriales y de cloroplastos, se observa transferencia gnica horizontal en otros casos, por
ejemplo, entre espiroquetas y archaea (flecha a); bacterias grampositlvas bajas en G + C y archaea (flecha b); y entre bacterias termoflicas y archaea
(flecha c). Reproducido a partir de Brown (2 0 0 3 ), Nature Rev. Genet.4 :1 2 1 -1 3 2, con autorizacin del Nature Publishing Group.
364
CAPTULO DOCE
eucariotas utiliza histonas para compactar su DNA nuclear, los

nicos procariotas que tienen histonas y nucleosomas son las Euryarchaeota, la divisin de Archaea que incluye los metangenos que
consumen hidrgeno. Vase Brown (2003) para detalles ms am
plios y una hiptesis adicional.
12.2.2 La presin de seleccin reducida caus

la divergencia del cdigo gentico mitocondrial
El cdigo gentico mitocondrial humano es apenas diferente del
cdigo gentico universal que se utiliza en genomas celulares y
mitocondriales de plantas (fig. 1-22). Aunque es idntico a los
cdigos genticos de otros genomas mitocondriales de mamfe
ros, muestra asimismo algunas diferencias con el cdigo genti
co no universal en las mitocondrias de otros eucariotas, como
Drosophila y las clulas de levadura.
Se piensa que el cdigo gentico mitocondrial divergi como
resultado de una presin de seleccin reducida. El genoma, del
genoma procariota endocitado, que dio lugar al genoma mito
condrial, pudo contener de manera original cuando menos varios
cientos y tal vez miles de genes. Al igual que todos los genomas
grandes, debi someterse a una presin de seleccin conservado
ra potente a fin de conservar el cdigo gentico universal (altera
ciones ligeras en el cdigo pudieron propiciar la falta de funcin
gnica).
Con posterioridad, se transfirieron genes del genoma mito
condrial precursor al genoma nuclear, tal vez por procesos sucesi
vos de lisis de organelos, incorporacin del DNA en el genoma
nuclear, prdida de copias de organelos y fijacin de la prdida
gnica por derivacin gentica (vase Doolittle, 1998). A medida
que disminuy de forma constante el potencial de codificacin
por la transferencia de genes al genoma nuclear, debi observarse
una presin de seleccin cada vez menor para conservar el cdigo
gentico original.
Por ltimo, result un genoma sumamente agotado (slo 13
genes en el genoma mitocondrial humano codifican polipptidos). Debido a que slo debi participar un nmero muy peque
o de poliptidos, la presin de seleccin para conservar el
cdigo gentico universal debi relajarse y pudo tolerarse un cierto
grado de derivacin del codn normal sin provocar consecuen
cias desastrosas. Asimismo, es probable que los codones que se
alteraron (vase fig. 1-22) se utilizaran de modo extenso en si
tios en los que pudieron ser perjudiciales las sustituciones de
aminocidos.
Por supuesto, el proceso de agotamiento del genoma mitocon
drial fue lento y continu durante toda la evolucin metazorica.
Como resultado, los distintos organismos muestran diferencias
en los genes conservados por el genoma mitocondrial (por esta
razn en algunas especies difiere el cdigo gentico mitocon
drial). Sin embargo, en trminos comparativos, los genomas mi
tocondriales de las plantas conservaron muchos genes y por
consiguiente en este caso no fue posible la derivacin del cdigo
gentico universal.
12.2.3 Es posible que la evolucin de los genomas de

vertebrados incluyera duplicacin del genoma
completo
La duplicacin del genoma que tiene como resultado polip loida
es un medio eficaz para incrementar el tamao y versatilidad del ge
noma. Se dispone de manera simultnea de copias para todos los
genes, lo cual evita problemas de dosis gnica diferencial. Varias es
pecies son poliploides de modo natural o se sabe que son poliploides degenerados, incluida la mayor parte de las plantas de
floracin, muchos peces, la levadura Saccharomyces cerevisiae, Xenopus la evisy cuando menos un mamfero, la rata vizcacha roja tetraploide (vase Otto y Whitton, 2000; Wolfe, 2001). La tetraploida
constitucional es rara y letal en seres humamos, pero estos ltimos y
otros organismos diploides tienen algunas clulas poliploides natu
rales como resultado de duplicaciones cromosmicas secuenciales
por mitosis sin divisin celular intermedia o por fusiones celulares
(seccin 3.1.4).
Debido a que varias especies sufrieron con claridad duplicacin
del genoma, es obvio que no son raros los fenmenos de poliploidizacin. Esta observacin, aunada a las comparaciones de las ca
ractersticas gnicas en vertebrados e invertebrados, sugiere la
posibilidad de que todos los vertebrados se sometieran cuando me
nos a una ronda de duplicacin del genoma durante la evolucin.
Despus de la duplicacin del genoma, y de un estado tetraploide
transitorio, cabra esperar que reordenamientos cromosmicos a
gran escala subsecuentes causaran divergencia de cromosomas y
restablecieran la diploida, pero ahora con el doble del nmero de
cromosomas.
La relajacin de la presin de seleccin en muchas de las copias
gnicas despus de la duplicacin del genoma dara por resultado
que la gran mayora adquiriera mutaciones perjudiciales y se torna
ra seudogenes. Ms adelante, debido a la falta de cualquier presin
de seleccin para conservarlos, podra esperarse que las copias gni
cas defectuosas se eliminaran del genoma por varios mecanismos de
recambio de DNA (vase Lynch y Conery, 2000). Por esta razn,
es posible que algn tiempo considerable despus del aconteci
miento de duplicacin del genoma, la prueba de duplicacin pre
via de toda la extensin del genoma fuera escasa; cabra esperar que
se conservaran slo los muy pocos genes duplicados que continua
ron con actividad funcional.
Las proposiciones iniciales de acontecimientos de tetraploidizacin antiguos durante la evolucin de los vertebrados consideraron
dos rondas de duplicacin del genoma, la hiptesis 2R (vase Wolfe,
2001). Gran parte de las pruebas que apoyan la hiptesis 2R se basa
en la observacin de que genes esenciales y grupos gnicos en inver
tebrados como Drosophila tienen tres a cuatro equivalentes en verte
brados. Los ejemplos importantes incluyen los cuatro grupos gnicos
Hox comunes (fig. 12-9), los cuatro grupos gnicos paraHox (cromo
somas humanos 13ql3-14, Xql3-q22, 4ql 1-12, 5q31-33) y los gru
pos de MHC (los cromosomas humanos Iq21-q25, 6p21.3-p22.2,
9q33-q34, 19pl3.1-pl3.4; vase Abi-Rached y cois., 2002). En cada
uno de estos casos, hay un grupo gnico nico en Amphioxus, el in
vertebrado ms cercano relacionado con los vertebrados.
12.2
AbdB
365
A bdA Ubx
Drosophila
14
13
12
11
10
Am phioxus
A -11
A -1 3
A -1 0
A -9
A -7
A -6
A -5 A -4 A -3 A -2
A-1
HO XA
B -9
B -8
B -7
B -6
B -5 B -4
B -3 B -2
B-1
HOXB
C -1 3
C -1 2
C -11
C -1 0
C -9
C -8
C -6
C -5 C -4
HOXC
D -1 3
D -1 2
D -11
D -1 0
D -9
D -4
D -8
D -3
D-1
HOXD
Fig. 12-9. La organizacin de los grupos gnicos Hox en mamferos y Amphioxus sugiere la posibilidad de una o dos rondas de duplicacin ances
tral del genoma.
Los seres humanos y otros mamferos poseen cuatro grupos que contienen nueve a 11 genes
Hox tpicos,
pero Amphioxus, el invertebrado que se considera
el relacionado ms de cerca con los vertebrados tiene 14 de esos genes. Se piensa que el orden lineal de los genes en un grupo rige el orden temporal en que
se expresaron durante el desarrollo y asimismo sus lmites de expresin anteriores a lo largo del eje anteroposterior (vase fig. 3-10). Los cuadros sombreados
indican grupos de paraloga que consisten en genes con patrones de expresin muy similares y tal vez funciones parecidas. Aunque los cuatro grupos
comunes
Hox de
mamferos muestran conservacin general potente del orden gnico, los grupos de paraloga indican quiz que hubo prdida gnica de
lo que pudo ser un grupo ancestral con 13 o 14 genes. Un reordenamiento en el linaje de
Despus de los proyectos del genoma, fue evidente que los ver
tebrados tienen alrededor de 30 000 a 35 000 genes, cerca del do
ble del nmero de genes que se encuentra en invertebrados en lugar
de la diferencia cudruple muy esperada. Un amplio anlisis recien
te del esquema de la secuencia del genoma humano que efectuaron
McLysaght y colaboradores (2002) sugiri que tiene muchos ms
genes duplicados de los que cabra esperar por el azar. Casi 25% de
los genes humanos tiene parlogos claramente relacionados y las
comparaciones con ortlogos en D. melanogaster y C. elegans indi
can que hace alrededor de 350 a 600 millones de aos se llev a ca
bo un brote de actividad de duplicacin gnica, consistente cuando
menos con una ronda de duplicacin del genoma completo.
12.2.4 Durante la evolucin de los genomas de

mamferos hubo numerosos reordenamientos
cromosmicos mayores
Durante la evolucin del genoma de mamferos se observaron reor
denamientos cromosmicos a gran escala frecuentes y es posible se
parar la evolucin de los cromosomas de la del fenotipo. Un
ejemplo tpico lo proporcionan dos especies de muntjac (un tipo de
Drosophila condujo a la separacin de
los genes en dos subgrupos.
venado pequeo). El muntjac chino y el indio (fig. 12-10) se rela

cionan de modo tan estrecho que pueden aparearse y producir des
cendencia que, empero, no es viable. El muntjac chino tiene 46
cromosomas pero, como resultado de varios acontecimientos de fu
sin cromosmica, el muntjac indio slo posee seis cromosomas en
hembras y siete en machos.
Si bien el ejemplo anterior es extraordinario, durante la evolucin
de los mamferos ocurrieron con regularidad reordenamientos cro
mosmicos de importancia. Al parecer, son en particular frecuentes
las inversiones; un poco menos las translocaciones. Los centrmeros
(que estn compuestos de secuencias en evolucin rpida) pueden
cambiar posiciones. Cuando se comparan los cromosomas humanos
con los de los relacionados vivos ms cercanos, los grandes monos,
hay similitudes muy notorias en los patrones de bandeo cromosmico (Yunis y Prakash, 1982). Los reordenamientos ms frecuentes han
sido inversiones (incluidas inversiones pericntricas y paracntricas!
y adems hubo ciertas translocaciones (vase seccin 12.4.2 y figuras
12-27, 12-28).
Si bien es sencillo identificar cromosomas ortlogos en especies
relacionadas muy de cerca, las comparaciones cromosmicas entre
especies relacionadas de forma ms distante suelen mostrar que slo
366
CAPTULO DOCE
Fig. 12-10. Muntjac chino e indio.

El primero (Muntiacus reevesi; fotografa de la izquierda) y el segundo
pero tienen cariotipos muy diferentes (vase texto).
(Muntiacus muntjak\ fotografa de
se conservan segmentos cromosmicos pequeos. La conservacin

del orden lineal de los genes (conservacin de sintenia) suele limi
tarse por consiguiente a segmentos cromosmicos pequeos. Con
objeto de estimar la conservacin de la sintenia, mtodos previos
mapearon genes ortlogos a cromosomas en las dos especies, pero
I 5
la derecha) se relacionan de forma muy estrecha,
los proyectos genmicos proporcionaron mapas ms detallados de

la conservacin de la sintenia. Vase en la figura 12-11 la conserva
cin de la sintenia humana y del ratn.
Los 342 segmentos cromosmicos que comparten seres huma
nos y ratones significan que en prom edio la conservacin de la sin-
j
5
I S S I bs i i s . s .
lll-
'
lili!
2
H um anoB
1 2
l i l i ;
7

4 5 6 7
10
11
12
1
g
'
i
l
13
14
l
15
l
16
"
'
s
17
18
i
19
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X
Fig. 12-11. La conservacin de sintenia en seres humanos y el ratn suele limitarse a segmentos cromosmicos pequeos.
Los segmentos y bloques > 300 kb de tamao con sintenia conservada en cromosomas humanos estn superpuestos en los 20 cromosomas del ratn
(arriba). Cada color corresponde a un cromosoma
humano particular.
Los 3 4 2 segmentos estn separados entre s por lneas blancas muy delgadas
dentro de los 217 bloques de color consistente. Los cromosomas X estn representados como bloques sintnicos recprocos y nicos y los cromosomas
17 y 20 humanos corresponden por completo a una porcin de los cromosomas 11 y 2 del ratn (pero con reordenamlentos extensos hacia 16
segmentos cuando menos en el primer caso). Otros cromosomas muestran pruebas de reordenamiento intercromosmico mucho ms extenso. Figura
reproducida del Mouse Genome Sequencng Consortium (2002),
Nature 4 2 0 :5 2 0 -5 6 2 ,
con autorizacin del Nature Publishing Group.
12.2
A)
36"
C e n tro m ric a s
T e lo m rica s
Fig. 12-12. Ejemplos de duplicaciones segmentarias recientes en el genoma humano.

A) Duplicaciones segmentarias en 22q. Las lneas horizontales representan secuencias sucesivas de 1 Mb del extremo centromrico (arriba a la
izquierda) al extremo telomrico (abajo a la derecha). Las barras negras indican brechas de secuencia. Las secuencias que participan en duplicaciones
intercromosmicas (rojo) se limitan sobre todo a las regiones ms centromricas y telomricas. Las duplicaciones intracromosmicas se muestran en
azul. Adaptado de Eichler (20 0 1 ), Trends Genet 11:661-669, con autorizacin de Elsevier. B) homologas intercromosmicas para secuencias del
cromosoma 2 humano. Ei cromosoma 2 se muestra como una barra horizontal roja en la parte media. Los otros 11 cromosomas (barra horizontal
verde) contienen segmentos que son muy homlogos de las secuencias del cromosoma 2 (enlazados por lneas verticales de colores). Reproducido
de Venter y cois. (2 0 0 1 ),
Science 2 9 1 :1 3 0 4 -1 3 5 1 ,
con autorizacin de la American Association fo rth e Advancement of Science.
tenia se extiende a un poco menos de 10 Mb y que las secuencias

de la mayor parte de cromosomas individuales humanos y del ra
tn tiene ortlogos en una variedad de diferentes cromosomas en
la otra especie. Una excepcin notable es el cromosoma X: la in
mensa mayora de secuencias en el cromosoma X humano posee
ortlogos en el cromosoma X del ratn (porque la inactivacin de
X en mamferos evolucion para asegurar una relacin de dosis gnica 2:1 eficaz para genes autosmicos:enlazados a X; vase sec
cin 12.2.8). Sin embargo, incluso en el caso del cromosoma X ha
habido numerosas inversiones que revolvieron el orden gnico en
tre seres humanos y ratones y el anlisis de las longitudes y el n
mero de segmentos de sintenia conservados en los autosomas
corresponde a un proceso de rotura cromosmica aleatoria (Mouse Genome Sequencing Consortium, 2002).
12.2.5. Duplicacin segmentaria en linajes de primates

e inestabilidad evolucionista de secuencias
pericentromricas y subtelomricas
Una de las mayores sorpresas que surgieron de la secuenciacin del
genoma humano fue la extensin de duplicaciones segmentarias
recientes en trminos evolucionistas, una forma importante de du
plicacin subgenmica que puede conducir a reordenamientos eromosmicos. En la actualidad se piensa que alrededor de 5% de las
secuencias del genoma humano est representado en copias dupli
cadas dispersas con > 90% de identidad secuencial que se extien
de en segmentos de 1 kb hasta varios cientos de kb de longitud
(Bailey y cois., 2002; Samonte y Eichler, 2002; vase fig. 12-12).
Pueden mencionarse las siguientes:
368
CAPTULO DOCE
d u p lica cion es in tracrom osm ica s que tienden a ocurrir en regio

nes eucromticas. Cuando la identidad secuencial excede 95%
y se extiende 10 kb o ms, estos elementos de secuencias suelen
predisponer a deleciones, duplicaciones e inversiones a gran es
cala, muchas de las cuales se acompaan de enfermedades (sec
ciones 11.5.4, 11.5.5).
saico que combinan mdulos de secuencias de una variedad dife

rente de localizaciones cromosmicas. Al parecer, ciertas regiones
del genoma, en especial las pericentromricas, aceptan con facili
dad copias de secuencias de otras regiones del genoma y las inter
cambian con otras de estas regiones (vase fig. 12-13).
d u p lica cion es in tercrom osm ica s que tienden a estar localizadas

en regiones pericentromricas o subtelomricas. Las duplica
ciones pueden incluir genes o porciones de ellos, que suelen
dar lugar a copias gnicas no funcionales esparcidas (fig. 9-13),
transcritos quimricos y quiz nuevos genes. Al parecer, las du
plicaciones intercromosmicas de primates son un poco menos
frecuentes que las intracromosmicas (Samonte y Eichler,
12.2.6 Los cromosomas X y Y humanos muestran

regiones importantes de homologa secuencial,
incluidas las regiones seudoautosmicas comunes
2002).
La seleccin del genoma del ratn para secuencias relacionadas

muy de cerca con las secuencias humanas duplicadas de modo seg
mentario revela de manera caracterstica secuencias de copia nica.
Por consiguiente, las duplicaciones segmentarias humanas se origi
naron en poca comparativamente reciente: en apariencia, los
acontecimientos de duplicacin segmentaria han sido constantes
en el linaje de primates durante los ltimos 40 millones de aos y
es posible que casi todos sucedieran en los ltimos 12 millones de
aos (Samonte y Eichler, 2002). Sin embargo, la duplicacin seg
mentaria no es especfica de primates: en el ratn tuvieron lugar
duplicaciones pericentromricas recientes no relacionadas (Thomas
y cois., 2003). No se comprende bien el mecanismo de la duplica
cin segmentaria, pero casi siempre da lugar a estructuras en mo
En mamferos, pares de cromosomas autosmicos homlogos son

idnticos desde el punto de vista estructural (homomrfico); se pre
supone que el pareamiento de cromosomas en la meiosis se facilita
por el grado alto de identidad secuencial entre homlogos, aunque
por un mecanismo que no se comprende. En contraste, los cromo
somas X y Y de seres humanos y otras especies de mamferos son heteromrficos. El cromosoma X humano es submetacntrico y
contiene ms de 160 Mb de DNA, en tanto que el Y es acrocntri
co y mucho ms pequeo (incluye alrededor de 50 Mb de DNA).
El cromosoma X humano contiene numerosos genes de importan
cia; en notable contraste, el cromosoma Y slo posee alrededor de
50 genes (cuadro 12-2) y la mayor parte del cromosoma Y se com
pone de heterocromatina constitutiva, inerte desde el punto de vis
ta gentico. Sin embargo, cabe sealar que muchos de los genes en
la porcin no recombinante del cromosoma Y participan en la es
permatognesis y la determinacin del sexo (cuadro 12-2) y que el
cromosoma X al parecer tambin contiene en abundancia genes re
lacionados con el sexo y la reproduccin (p. ej., Wangy cois., 2001).
Locus donadores
Distribucin de transposicin
Locus aceptor
Duplicacin
com pleta
Fig. 12-13. Modelo de duplicacin segmentaria.

Las copias de secuencias moderadamente largas a grandes (segmentos de 1 a 2 0 0 kb) se originan por duplicacin de secuencias a partir de ciertas
regiones en el genoma (locus donador) y se transponen al Integrarse en cualquier otra parte del genoma
(transposicin duplicativa).
Como se muestra,
pueden insertarse en regiones receptoras comunes diferentes secuencias donadoras de regiones muy distintas. Los diferentes acontecimientos de
transposicin duplicativa ocurren de manera independiente con el tiempo y dan lugar a bloques ms grandes de secuencias duplicadas que tienen
una estructura
en mosaico.
Las porciones de esta estructura en mosaico pueden a su vez duplicarse y copiarse a otras regiones del genoma. Los
reordenamlentos (deleciones e Inversiones) alteran de forma subsecuente la estructura de estas regiones. Reproducido de Samonte y Eichler (2 0 0 2 ),
Nature Rev. Genet.
3:6 5 -7 2 , con autorizacin de Nature Publishing Group.
12.2
369
Cuadro 12-2. Clasificacin funcional de genes del cromosoma Y humano.

Categora gnica
Genes
Funcin(es)
conocida/posible
Especificidad
de expresin
Mltiples copias
en Y?
Tiene homlogo Homlogo X

X activo?
inactivado en
mujeres?
Seudoautosmica
M uchos*
Tan diversa como genes

autosmicos haya
Diversa
No
S (excepto
SYBL1, HSPRY3
Clase 1 RNY
RPSRY, ZFY,
USP9Y, DBY,
UTY, TB4Y,
SMCY, EIF1AY
Cuidadores
Amplia
No
Si-
No
Clase 2 RNY
TY1, TSPY,
PRY TTY2,
CDY, XKRY,
DAZ, BPY2
Espermatognesis
Testculo
Si-
No
N/A
Clase 3 RNY
SRY
RBMY
AMELY
VCY
PCDHY
Determinacin masculina
Espermatognesis
Desarrollo dental
Desconocida
Desconocida
Testculo
Testculo
Yema dental
Testculo
Cerebro
No
S
No
Si
No
S
SiS
S
S
S
S
Tal vez
N/A
No
(RNY, regin no recomblnante del cromosoma Y; N/A, no aplicable).

Cuando menos 17, de los cuales 13 se encuentran en la regin seudoautosmica mayor (vase fig . 12-15).
A pesar de ser distintos a nivel morfolgico, los cromosomas

X y Y muestran regiones sustanciales de homologa, incluida una
diversidad de homologas Xp-Yq y Xq-Yp, y tambin homologas
Xp-Yp y Xq-Yq. Estas homologas permitieron identificar una di
versidad de pares de genes X-Y (vase fig. 12-14). La existencia de
estas homologas sugiere que los dos cromosomas evolucionaron
a partir de un par de cromosomas homomrficos ancestrales. Es
evidente que los dos cromosomas sufrieron con posterioridad una
divergencia notoria y las secuencias que estn cerca en un cromo
soma pueden tener equivalentes muy espaciados en el otro. Los
cromosomas X y Y tambin son capaces de parearse durante la
meiosis masculina y en consecuencia pueden intercambiar se
cuencias en la misma forma en que lo llevan a cabo los homlo
gos autosmicos. No obstante, los intercambios meiticos son de
extensin muy reducida y se limitan a regiones seudoautosmicas pequeas en las puntas del cromosoma (por consiguiente, es
tas secuencias no estn ligadas a X o Y y de ah el trmino
seudoautosmica). En los seres humanos existen dos regiones seudoautosmicas.
La regin seudoautosmica mayor (PAR-1) se extiende 2.6 Mb
en las puntas extremas de los brazos cortos de X y Y y se sabe
que contiene cuando menos 13 genes (Ried y cois., 1998; Gianfrancesco y cois., 2001). Es el sitio de un cruzamiento obligado
durante la meiosis masculina que se piensa que es necesario pa
ra la segregacin meitica correcta. Esta regin muy pequea es
inestable en cuanto a la evolucin (vase ms adelante) y con
tiene secuencias muy recombingenas (la frecuencia promedio
de recombinacin del sexo es de 28%, una cifra que, para una
regin de slo 2.6 Mb, es alrededor de 10 veces la frecuencia de
recombinacin normal). Por supuesto, la elevada cifra se debe
sobre todo al cruzamiento obligatorio en la meiosis masculina

que tiene como resultado una frecuencia de cruzamiento que se
aproxima al 50%. Se ha demostrado que el lmite entre la re
gin seudoautosmica mayor y la regin especfica del sexo se
mapea dentro del gen del grupo sanguneo XG y el gen deter
minante del varn SRYslo ocurre a unos 5 kb del lmite PAR1 en el cromosoma Y (fig. 12-15).
La regin seudoautosmica menor (PAR2) abarca 330 kb en
las puntas extremas de los brazos largos de X y Y y slo contie
ne cuatro genes (Ciccodicola y cois., 2000; Charchar y cois.,
2003). El cruzamiento entre X y Y en esta regin no es tan co
mn como en PAR-1 y no es necesario ni suficiente para el xi
to en la meiosis masculina.
12.2.7 Los cromosomas del sexo humanos evolucionaron

de autosomas y divergieron debido a la supre
sin regional peridica de recombinacin
En muchos animales se desarrollaron de manera independiente
cromosomas del sexo precisos con linajes evolucionistas desiguales,
incluidos no slo los mamferos sino las aves (en las que las hem
bras son ZW, el sexo heterogamtico, y los machos ZZ, el sexo homogam tic) y ciertas especies de peces, reptiles e insectos. Se piensa
que en cada caso los diferentes cromosomas del sexo se iniciaron
como autosomas virtualmente idnticos, excepto que uno de ellos
evolucion a un locus mayor determinante del sexo (el locus SRYen
seres humanos, localizado a 5 kb del lmite PAR-1 en el Y). La evo
lucin subsecuente dio por resultado que los dos cromosomas se
tornaran cada vez ms diferentes hasta que, en muchas especies, se
redujo un cromosoma del sexo (el Y en mamferos, el W en aves) a
370
CAPITOLO DOCE
r G YG 2
r ARSD
ARSE J
PRKX
STS
KAL1 >
AM ELX
TB 4X
E IF1A X
ZFX
D FFR X
DBX
C ASK
U TX
U B E 1X
SRY
RPS4Y
ZFY
SMCX
PRKY
AM ELY
r ARSEP
i
A R S D P -A
L G Y G 2P - s p
DFFRY
c
DBY
0 CASK P
UTYJ
TB 4YJ I
hr
k a l p -y
stspj
SMCY
EIF1A Y
RPS4X
RBMY
C la v e :
R eg i n s e u d o a u to s m ic a
C e n tro m e ro
Parte del crom osom a X especfica de sexo
RBMX
S O X3
P orcin del c ro m o s o m a Y e u c ro m tic a

no re c o m b in a n te
Porcin del cromosoma Y heterocromtica
no re c o m b in a n te
Fig. 12-14. Los cromosomas X y Y humanos muestran varias regiones de homologa que indican un origen evolucionista comn.
Las reglones seudoautosmicas en las puntas de Xp
Yp son idnticas (vase la fig. 1 2 -1 5 ), al igual que las de las puntas Xq
recombinantes restantes muestran varios pares de genes XY claramente homlogos aunados al par
S0X3-SRY (que tiene
Yq. Las reglones no
un dominio HMG comn). Los
nmeros uno a cuatro en el cromosoma X corresponden a diferentes estratos evolucionistas (vase el texto). Algunos de los homlogos del cromosoma
Y degeneraron a seudogenes (el smbolo termina en una R por ej
ARSEP ARSDP, etc.).
con autorizacin de la American Association for the Advancement of Science.
Reproducido a partir de Lahn y Page (1999),
Science 286:964-967,
12.2
Lim ite
P A R -1 , regin s e u d o a u to s m ic a m a y o r
PPP2R3B
TEL PGPL SHOX
I_____
O rt lo g o s
d e rat n +
ANT3
CSF2RA
I
DHRSXY
\IL3RAASMTL
XE7
A SM T Tramp
i___ __
Cromosoma de sexo especfico
ARSE ARSF
M IC2 5' XG !3 ' XG
ARSD^
J l u J l
divdiv -
PPP2R3B
TEL PGPL I SHOX
371
div
ANT3
CSF2RA
\IL3RAIASMTL
XE7
-MJftJL____
O rt lo g o s
d e ratn
div
J
A S M T Tramp
M IC2 5 ' x d SRY
m ___ M_
div
div
O rt lo g o s
d e ratn
RPS4Y
.JHt___
Fig. 12-15. Organizacin e inestabilidad evolucionistas de la principal regin seudoautosmica humana (PAR-1).
La regin PAR-1 de
2.6 Mb
es comn en las puntas de Xp (arriba a la izquierda)
-y Yp
(abajo a la izquierda; TEL, telmero) y contiene cuando menos 13
genes. Adyacentes a PAR-1 se encuentran las partes largas especficas del sexo de X y Y de las cuales se muestran los genes inmediatamente adyacentes
a PAR-1 a la derecha de la lnea limtrofe. El lmite PAR-1 ocurre dentro del gen del grupo sanguneo XG en el cromosoma X. En el cromosoma Y hay
un homlogo del gen XG truncado: el promotor y los escasos primeros exones se presentan en la regin seudoautosmica, pero con posterioridad son
secuencias especficas del cromosoma Y no relacionadas, por ejemplo
SRY, RPS4Y.
Los genes incluidos en PAR-1 y en las regiones vecinas especficas
de sexo (que fueron parte de una regin seudoautosmica anterior) se conservaron mal durante la evolucin y con frecuencia no se detectan ortlogos
en el ratn ( - ) o con una divergencia muy alta (div).
un cromosoma pequeo, con abundancia de secuencias repetidas

pero slo con muy pocos genes funcionales. Al parecer existe una
presin evolucionista para adoptar la medida de tener dos cromo
somas del sexo diferentes desde los puntos de vista estructural y
funcional.
Orgenes autosmicos y plasticidad de regiones

seudoautosmicas
Durante la evolucin no se conservaron bien las regiones seudoau
tosmicas. En el ratn no hay un equivalente de PAR2, e incluso
en algunos primates, y los ortlogos de los genes PAR2 del ratn
conocidos son autosomas o se mapean cerca del centrmero del
cromosoma X. Tambin existen diferencias de especies muy impor
tantes en PAR-1. En los seres humanos el lmite de PAR-1 ocurre
dentro del gen XG, que al parecer no tiene un ortlogo en el ratn
(fig. 12-5). La regin seudoautosmica equivalente del ratn (PAR)
de slo 0.7 Mb de largo, y localizada en la punta del brazo largo del
X, muestra una homologa secuencial muy pequea con PAR-1 hu
mano (Perry y cois., 2001). El lmite de PAR en el ratn se encuen
tra dentro del gen M idi (antes Fxy), cuyo ortlogo humano MIDI
se ubica de manera ms proximal dentro de la regin especfica del
cromosoma X. El gen de sulfatasa de esteroides, Sts, es el nico otro
gen que se halla en el PAR del ratn, pero el homlogo humano se
sita alrededor de 3.5 Mb proximal a PAR-1 en el cromosoma X.
Tres de los genes PAR-1 humanos tienen ortlogos autosmicos en
el ratn y otros genes PAR-1 humanos poseen ortlogos autosmi
cos en algunos otros mamferos. Por consiguiente, se asume que la
regin PAR-1 evolucion mediante la adicin repetida de segmen

tos autosmicos en la regin seudoautosmica de uno de los cro
mosomas del sexo, antes de recombinarse con el otro cromosoma
del sexo (Graves y cois., 1998).
Se piensa que PAR-1 y reas contiguas son regiones inestables
en trminos comparativos. Los intercambios frecuentes de DNA
dan por resultado una alta incidencia de fusiones gnicas, dupli
caciones de exones y mezcla de exones (vase Ried y cois., 1998).
Muchos de los genes PAR-1 y genes en regiones especficas de se
xo cercanas (que antes fueron regiones seudoautosmicas; vase
ms adelante) no parecen tener ortlogos detectables en el ratn
(mediante el anlisis de la secuencia del genoma del ratn dispo
nible o por valoracin de hibridacin). Los que tienen ortlogos
se someten a menudo a divergencia secuencial en extremo rpida
como se observa en el determinante mayor del varn SRY, que se
localiza a slo 5 kb del lmite de PAR-1 y el gen de la sulfatasa de
esteroides, STS.
Orgenes autosmicos para Xp humano y estratos

evolucionistas en el cromosoma X
La comparacin de genes en mamferos relacionados en grado dis
tante indica que gran parte del brazo corto del cromosoma X huma
no se adquiri en poca reciente por translocacin de un autosoma
X. Los mamferos suelen dividirse en dos subclases: prototeria (los
mamferos monotremos o que ponen huevos) y teria, que a su vez
se subdivide en dos subclases: metateria (marsupiales) y euteria, un
grupo que incluye mamferos placentarios. Se ha encontrado que
372
CAPTULO DOCE
muchos genes euterianos ligados a X estn ligados a X en marsupia

les. Sin embargo, los genes que se mapean a una parte grande de Xp
humano (distal a Xp 11.3) tienen ortlogos en autosomas de marsu
piales y monotremos. Debido a que la divergencia prototeriana fue
anterior a la divisin metateriana-euteriana (vase fig. 12-24), la ex
plicacin ms sencilla es que se transloc cuando menos una regin
autosmica grande al cromosoma X en un momento temprano del
linaje euteriano.
Aparte de las regiones PAR-1 y PAR2 compartidas, hay todava
alrededor de 20 pares de genes X-Y que son reliquias de la identi
dad de secuencia extensa que existi alguna vez entre los cromoso
mas X y Y ancestrales. En los pares X-Y, casi todos los genes en X
se localizan en Xp pero las secuencias equivalentes se encuentran al
parecer en la totalidad de la porcin eucromtica de Y (fig. 12-14).
Sin embargo, hay una diferencia regional clara en la divergencia secuencial de los pares X-Y. Al tomar a
(el nmero medio de sus
tituciones sinnimas por sitio sinnimo; vase seccin 11.2.5)
como una medida de la divergencia secuencial, pueden agruparse
los pares X-Y en cuatro clases de divergencias de secuencias (y por
consiguiente de edad) que corresponden a regiones lineales a lo lar
go del cromosoma X (Lahn y Page, 1999; vase cuadro 12-3).
Los datos del cuadro 12-3 indican que las edades de los pares de
genes X-Y disminuyen en forma gradual a medida que se prosigue
a lo largo de la porcin no recombinante de X, desde el extremo del
brazo largo (Xq distal) hasta el extremo del brazo corto (Xp distal).
Son obvios cuando menos cuatro estratos evolucionistas, que corres
ponden a los cuatro juegos de genes en la figura 12-14 y se piensa
que la recombinacin entre X y Y se suprimi a nivel regional, pri
mero en el estrato uno, hace alrededor de 240 a 320 millones de
aos (poco despus de la divergencia de los linajes que condujeron
a los mamferos y las aves; vase fig. 12-24 para informacin filo-
gnica). Con posterioridad, la supresin de la recombinacin se

dispers en pasos discretos hasta el estrato dos, a continuacin al
tres y por ltimo al cuatro. La forma ms probable en que se supri
mi la recombinacin fue tal vez por inversiones (que se sabe que
son capaces de suprimir recombinacin en regiones amplias en ma
mferos) y que tal vez ocurrieron en el cromosoma Y (p. ej., una in
versin especfica de Y explicara por qu el lmite PAR-1 cruza un
gen que est intacto en el cromosoma X pero alterado en Y; vase
fig. 12-5). En la figura 12-16 se ilustra una secuencia de los proba
bles acontecimientos que explican la forma en que evolucionaron
los cromosomas del sexo.
12.2.8 La diferenciacin del cromosoma del sexo

dio por resultado degeneracin progresiva del
cromosoma Y e inactivacin del cromosoma X
Es posible que el cromosoma Y humano est en camino
de extinguirse pero an hay un futuro para los varones!
La evolucin de los sistemas de determinacin del sexo fue crucial
para el desarrollo de organismos multicelulares complejos por la
novedad gentica proporcionada por recombinacin. Despus de
establecerse un locus determinante del sexo mayor durante la evo
lucin es esencial suprimir la recombinacin en la regin que contie
ne ese locus (a fin de conservar las diferencias de sexo). En contraste
con el cromosoma X humano que puede recombinarse en toda su
longitud con un cromosoma X compaero en la meiosis femenina, el
cromosoma Y humano suele considerarse como un cromosoma en
esencia asexual (no recombinante).
La gentica de poblacin predice que un cromosoma no recom
binante debe degenerarse por un proceso conocido como depura
Cuadro 12-3. Los genes homlogos ligados a X y Y pueden agruparse en cuatro categoras de divergencia de secuencias que
corresponden a la localizacin del gen enlazado a X en el cromosoma X (vase fig. 12-14).
Par gnico X-Y
(*se u d o g n )
D ivergencia de DNA
Ks
(% )
Grupo 1
Par gnico X-Y

(*se u d o g n )
Dive
Ks
(% )
Grupo 2
RPS4X/Y
0.97
18
UBE1X/Y
0.58
16
RBMX/Y
0.94
29
SMCX/Y
0.52
17
S0X3/SRY
1.25
28
Grupo 3
Grupo 4
TB4X/Y
0.29
GYG2/GYG2P*
0 .1 1
EIF1AX/Y
0.32
ARSD/ARSDP*
0.09
ZFX/Y
0.23
ASRE/ARSEP*
0.05
DFFRX/Y
0 .33
11
PRKX/Y
0.07
DBX/Y
0.36
12
STS/STSP*
0 .1 2
11
CASK/CASKP*
0.24
15
KALI/KALP*
0.07
UIXIY
0.26
12
AMELX/Y
0.07
12.2
cin de Muller. Si la tasa de mutacin es razonablemente alta, la

ausencia de recombinacin significa que pueden acumularse de
manera gradual mutaciones perjudiciales en genes de ese cromoso
ma durante las escalas de tiempo evolucionistas largas (no existe la
posibilidad de restablecer el cruzamiento en lugar de una secuencia
alela que carece de la mutacin perjudicial). Los alelos mutantes
pueden derivar a una fijacin como cromosomas Y con la prdida
de pocos mutantes por azar, o pueden transportarse de forma ca
sual junto con un alelo favorable en una regin protegida de re
combinacin.
Una vez que se acumulan mutaciones en el cromosoma Y no recombinante y causan prdida de funcin gnica, no hay una pre
sin selectiva para conservar el segmento de DNA importante. Los
mecanismos de recambio de DNA aseguran que el cromosoma se
contraiga de manera gradual, pero inexorable, por una serie de de
leciones. Como resultado, es posible que el cromosoma Y humano
se encamine a la extincin. Sin embargo, continuar la masculinidad por el cambio a un sistema de determinacin del sexo alterna
tivo. Es muy probable que sea conferido tan slo por una relacin
de dosis gnica X:autosoma y los individuos XO sern varones (co
mo en el caso de Drosophil).
Desarrollo necesario de la Inactivacin del cromosoma X

La evolucin del sistema de determinacin del sexo en mamferos
tambin est entremezclada de manera inextricable con la evolu
cin del mecanismo de inactivacin de X para compensacin de
dosis (seccin 10.5.6; vase Ellis, 1998). En respuesta a una des
truccin a gran escala de las secuencias del cromosoma Y, tal vez
hubo presiones para incrementar la expresin gnica en el cromo
Cromosomas del sexo,

surgimiento de RNY
(la regin SRY detiene la
recombinacin) hace
-290-350 M aos
P ar de
au to so m as
A utoso m as
en aves
Segunda expansin
principal de RNY
(RBMY, RPS4Y) hace
-2 30-300 M aos
soma X. Sin embargo, ello conducira a una expresin gnica exce

siva en el cromosoma X en mujeres que podra causar una aptitud
reducida. Como resultado, evolucion una forma de compensacin
de dosis gnica por la cual se eligi un cromosoma X aislado para
ser inactivado en clulas femeninas (inactivacin d eX ).
La explicacin de la inactivacin del cromosoma X es actuar
como un mecanismo de compensacin de dosis para los genes del
cromosoma X que no tienen homlogos en el cromosoma Y. No
obstante, una pequea minora de genes humanos ligados a X tie
ne homlogos fu n cionales en el cromosoma Y. Debido a que estos
genes no muestran diferencias de sexo en la dosis gnica, cabra
esperar que escaparan a la inactivacin de X. Todos los genes
PAR-1 estudiados escapan a la inactivacin de X. Los genes PAR2
son diferentes. Los dos genes ms telomricos, IL9R y CXYorfl,
escapan a la inactivacin, pero los dos genes proximales, SYBL1 y
HSPRY3, los inactiva X. La discrepancia aparente se debe a un
mecanismo compensador de inactivacin de Y para estos genes:
cuando se presentan en el cromosoma Y, SYBL1 y HSPRY3 se
metilan y no se expresan.
Adems de los genes en las regiones seudoautosmicas, tal vez
una quinta parte del total de genes en el cromosoma X elude la
inactivacin (vase Carrel y cois., 1999). Los genes que la eluden
tienden a concentrarse en grupos, sobre todo en Xp, y muchos
de ellos al parecer derivan de adiciones autosmicas recientes a
los cromosomas del sexo. Los genes que no tienen un homlogo
funcional en el cromosoma Y, pero que escapan a la inactivacin,
suelen ser aquellos en los que no son un problema las diferencias
de dosis 2:1. Pueden ocurrir asimismo diferencias de especie pa
ra los patrones de expresin no seudoautosmicos. Por ejemplo,
los genes no seudoautosmicos humanos ZFX, RPS4X y UBE1
Cuarta expansin
Tercera expansin
La translocacin
principal de RNY
principal de RNY
,D v w ,
expande PARp hace (CASKP, DBY, EIF1AY,
(SMCY,, iUBE1Y) hace = ^ 1 3 0 M a o s
TB4Y,, UTY, ZFY)
TB4Y
-1 30-170 M aos
hace -8 0 -1 3 0 M aos
XY
XY
X Y en
m o n otrem os
3"3
X Y en
m arsupiales
XY
Quinta expansin
principal de RNY
(AMELY, ARSDP,
'
p qyqop
La translocacin
X a Y establece
PCDHY
t i ? ? 2P
KALP, PRKY)
hace -3 -4 M aos
hace -3 0 -5 0 M aos
XY
XY
I
i
X Y en no
a n trop oides
p lacentarios
XY
S er hum ano
X Y en
antrop oides
no hom nidos
Fig. 12-16. Evolucin del cromosoma del sexo humano.

La figura muestra el encogimiento total del cromosoma Y y la expansin en forma de bloques de su regin no recombinante (RNY), tal vez como resultado
de inversiones sucesivas a gran escala. En trminos evolucionistas, se colocan entre parntesis los nuevos genes RNY y las ramas filogenticas se indican
con flechas. Las regiones verdes son recombinantes con libertad; las rojas son especificas del cromosoma X y las azules especficas de Y (RNY). La regin
amarilla representa la secuencia que contiene
PCDHX/Y (protocaderina X/Y) que se transloc de X a RNY
(para mayor sencillez se omitieron otras posibles
translocaciones). El diagrama no es un dibujo a escala y se suprimieron los centrmeros, ya que sus localizaciones son inciertas en muchas etapas de la
evolucin. PAR-1, regin seudoautosmica mayor. Adaptado de Lahn y cois. (2001),
Nature Rev. Genet. 2:207-216,
con autorizacin de Nature Publishing Group.
374
CAPTULO DOCE
escapan a la inactivacin, pero los homlogos murinos Zfic, Rps4

y UbelX (que a diferencia del gen humano UBE1 tiene un ho
mlogo en Y) se someten a inactivacin de X. En genes ligados
a X en los que la dosis gnica debe en apariencia controlarse de
modo estrecho, la inactivacin de X evolucion como una adap
tacin para la decadencia de un gen homlogo ligado a Y (Jegalian y Page, 1998).
12.3
Filogentica m olecular y
genm ica com parativa
La filogentica molecular describe el uso de comparaciones de ci

do nucleico o protenas a fin de establecer las relaciones evolucio
nistas entre organismos o poblaciones. Por supuesto, lo anterior
complementa los mtodos filogenticos habituales basados en ca
ractersticas anatmicas y morfolgicas de organismos vivos e infor
macin reunida del registro de fsiles.
Hasta fecha reciente, cuando los bilogos moleculares evolu
cionistas compararon secuencias de DNA (o las secuencias protenicas deducidas), utilizaban de ordinario las secuencias cuando
mucho de unos cuantos sitios genmicos. Sin embargo, la filoge
nia basada en grupos de datos de secuencias muy pequeas pue
de ser errnea y suministrar resultados diferentes. Por ejemplo, las
comparaciones de protenas relacionadas con la transcripcin,
traduccin, replicacin y reparacin del DNA resaltan las simili
tudes entre archaea y eucariotas, en tanto que las comparaciones
de protenas que participan en el metabolismo celular agrupan a
archaea con bacterias. Cuando se llevaron a cabo esfuerzos para
obtener una perspectiva ms amplia, se basaron en mapas genti
cos comparativos (O'Brien y cois., 1999) o cariotipificacin com
parativa. Por supuesto, los proyectos de genomas cambiaron todo
lo anterior y permitieron examinar la perspectiva completa de las
secuencias del genoma total y naci una nueva ciencia: la gen
mica comparativa.
La informacin sobre secuencias que ha surgido de los proyec
tos de genomas proporciona perfiles de DNA mucho ms defini
tivos y representativos en los que puede deducirse la filogenia. Al
determinar las secuencias de una serie completa de genomas (cap.
8) se obtienen informaciones mucho ms profundas sobre la for
ma en que se modelaron los genomas durante la evolucin. Por su
puesto, los datos ayudan asimismo a comprender la forma en que
se relacionan entre s los genomas actuales e identificar secuencias
relevantes conservadas.
de secuencias para derivar calificaciones cuantitativas que describen

la extensin de la relacin entre las secuencias.
La comparacin de secuencias de igual longitud fija casi
siempre es directa si hay una homologa de secuencias razonable
mente alta. Sin embargo, muchas veces las secuencias del cido
nucleico que se comparan habrn sufrido antes deleciones o in
serciones y en consecuencia se requieren mtodos matemticos
rgidos para el alineamiento de las secuencias. Se han diseado
algoritmos complementarios. El mtodo de similaridad de Needleman y Wunsch (1970) busca llevar al mximo el nmero de nucletidos compatibles; el mtodo de distancia de Waterman y
colaboradores (1976) se dirige a reducir al mnimo el nmero de
incompatibilidades. Programas de computadora como Clustal lle
van a cabo mltiples alineamientos de secuencias (Jeanmougin y
cois., 1998).
Una vez que se alinean las secuencias, es posible elaborar r
boles evolucionistas. Con mayor frecuencia se representan como
diagramas en los que se emplean combinaciones de lneas (ramas)
y nudos. Los diferentes organismos (secuencias) que se comparan
se localizan en nudos externos pero se unen a travs de ramas a
nudos in teriores (intersecciones entre las ramas) que representan
formas ancestrales para dos o ms organismos. Un rbol con raz
(o cladograma) supone la existencia de un ancestro comn (re
presentado por el tronco o la raz del rbol) e indica la direccin
del proceso evolucionista (fig. 12-17). La raz del rbol puede de
terminarse al comparar las secuencias con una secuencia fu e r a d el
gru p o (alguna que se relaciona de modo obvio en la evolucin pe
ro de manera distante con la secuencia en estudio). Un rbol sin raz
presupone que no hay un ancestro comn y slo muestra las rela
ciones evolucionistas entre los organismos. Cabe sealar que el n
mero de posibles rboles con raz suele ser mucho mayor que el de
rboles sin raz.
B)
Nudos
N udos
e x te rn o s
12.3.1 La filogentica molecular utiliza alineamientos de

secuencias para elaborar rboles evolucionistas
Con la finalidad de elaborar un rbol evolucionista es necesario
comparar secuencias de cido nucleico (o en ocasiones las secuen
cias protenicas supuestas; las secuencias del cido nucleico son ms
informativas, pero en comparaciones de genes relacionados de for
ma muy distante suelen usarse secuencias de protenas). Si dos o
ms secuencias muestran un grado suficiente de similitud (hom olo
ga d e secuencia) puede asumirse que derivan de una secuencia an
cestral comn. A continuacin es posible utilizar los alineamientos
Fig. 12-17. rboles evolucionistas sin raz y con ella.

A) rbol sin raz. El rbol tiene cinco
unidos por lneas
(ramas) que se
nudos externos (A, B, C, D y E)

nudos internos. Este
intersectan en
rbol especifica slo las relaciones entre los organismos en estudio,

pero no define la va evolucionista. B) rbol con raiz. Desde un nudo
Interno particular,
la raz (se
muestra con R en rojo), hay una va
evolucionista nica que conduce a cualquier otro nudo, como la va

a D (lnea roja punteada).
12.3
FILOGENTICA MOLECULAR Y GENMICA COMPARATIVA
Elaboracin de rboles evolucionistas

Para elaborar rboles evolucionistas se recurre a una variedad de
mtodos diferentes, pero muchos utilizan un mtodo de distancia
de matriz. En el primer paso se calcula la distancia evolucionista
entre todos los pares de secuencias en el grupo de datos y se los dis
pone en un cuadro (matriz). ste puede expresarse como el nme
ro de diferencias de nucletidos o sustituciones de aminocidos
entre las dos secuencias o el nmero de diferencias de nucletidos
(aminocidos) por sitio de nucletido (aminocido) (vase fig. 1218A para observar un ejemplo).
A)
3"5
Una vez que se calcula la matriz de diferencias de pares, el si

guiente paso consiste en enlazar las secuencias de acuerdo con la dis
tancia evolucionista entre ellas. Por ejemplo, en un mtodo se
conectan con una raz entre ellas dos miembros del par de secuen
cias que tienen la calificacin de distancia ms pequea. Para el pa
so siguiente de la matriz de distancia se emplea la media de las
distancias de cada miembro de este par a un tercer nudo y se repite
el proceso hasta que se colocan todas las secuencias en el rbol. Es
to siempre tiene como resultado un rbol con raz, pero mtodos va
riables, como el de relacin d e vecino, pueden crear rboles sin raz.
La suposicin crtica es de un reloj m olecular constante (la tasa de
S e c u e n c ia 1
G TATAGG G GATATACTG AG AG CTATTTACA
S e c u e n c ia 2
G TATTG GCG ATATTCCG AG ACCTATTTACT
S e c u e n c ia 3
G TATTG GCCATATTCCG AG ACCTATTTACT
S e c u e n c ia 4
G TATAGGCGATATACCGAGACCTATTTACT
Distancia de matriz
0.20
0 .2 3 3 0 .1 3 3
0 .2 0 0 .0 6 7
--------
B)
1 2 3 4 5 6 7 8
0.10
9 10 111213141516 1718 19 20 21 22 2324 2526 2728 29 30
GTATAGGGGATATACTGAGAGCTATTTACA
GTATTGGCGATATTCCGAGACCTATTTACT
GTATTGGCCATATTCCGAGACCTATTTACT
GTATAGGCGATATACC GAG ACCTATTTACT
x
; j_v
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314 1516 2 9 29 20 5 251411 21 8 16 7 3018
GTATAGGGGATATACTTGCAACATGCTGAA
GTATTGGCGATATTCCTGCATCTTCCCGTA
GTATTGGCCATATTCCTCCATCTTCCCGTA
GTATAGGCGATATACCTGCAACATCCCGTA
Fig. 12-18. Elaboracin de un rbol evolucionista por el mtodo de matriz de distancia y verificado mediante
A)
Elaboracin del rbol.
bootstrapping.
Se utilizan mltiples alineamientos de secuencias para calcular las distancias evolucionistas entre pares de secuencias.
Las secuencias uno y dos difieren en 6 /3 0 (= 0 .2 0 ) posiciones de nucletidos; tres y cuatro varan en 3 /3 0 (= 0 .1 0 ) posiciones. Estos y otros valores
de diferencia a nivel de pares se incluyen en una matriz de distancia y los programas de computadora utilizan los datos para valorar las relaciones de
secuencias y elaborar un rbol evolucionista. Los mtodos de matriz de distancia necesitan incluir estimaciones estadsticas de la cantidad de sustituciones
mltiples que pudieron ocurrir (una sustitucin simple A - * T pudo resultar en realidad de una sustitucin sucesiva A -> C - * T). B) Anlisis bootslrap.
Del grupo de datos original se selecciona un subgrupo (aqui los sitios 17 a 3 0 ) para descartarse, pero se conserva el resto (sitios 1 a 16). Los sitios
originales 17 a 30 se reemplazan por un grupo de datos del mismo tamao de
nuevo
alineamiento de seudosecuencia en
sitios elegidos al azar de
los 30 sitios originales, con lo cual se crea un
el que algunos de los sitios originales son repetidos ( 2 , 9 , 5 , 1 4 , 1 1 , etc.) y otros faltan (17, 21, 23, etc.).
El proceso se repite unas 1 000 veces para generar 1 000 alineamientos de seudosecuencia y en cada caso se elaboran rboles evolucionistas y se
comparan (referencia) con el original para proporcionar un
valor bootstrap (vase
el texto).
376
CAPTULO DOCE
mutaciones es constante en diferentes linajes) que a menudo tal vez

no es correcta (seccin 11.2.6). El mtodo de unin de vecino es
una variante que no requiere que todos los linajes divergieran en can
tidades iguales por unidad de tiempo. Por consiguiente, es en espe
cial adecuado para grupos de datos que comprenden linajes con tasas
de evolucin muy variables (vase fig. 12-31 para un ejemplo de un
rbol elaborado con este mtodo).
Las alternativas de los mtodos de distancia de matriz incluyen
los mtodos de parsimonia mxima y probabilidad mxima. El
mtodo de parsimonia mxima busca emplear el nmero mnimo
de pasos evolucionistas. Considera todos los posibles rboles evo
lucionistas que expliquen las relaciones de secuencias observadas,
pero a continuacin elige los que requieren menos cambios. Los
mtodos de posibilidad mxima crean todos los posibles rboles y
a continuacin recurren a estadsticas para valorar cul es el rbol
probable. Lo anterior puede ser posible para un nmero pequeo
de secuencias, aunque en grandes nmeros de secuencias la canti
dad de rboles generados se torna tan considerable que se utilizan
mtodos heursticos (mtodos que proporcionan una respuesta en
una longitud de tiempo computable, si bien por el cual tal vez no
sea ptima la respuesta) a fin de seleccionar un subgrupo de rbo
les por crear.
Valoracin de la precisin de un rbol evolucionista

Una vez que se deriv un rbol evolucionista, pueden usarse m
todos estadsticos para obtener una medicin de su confiabilidad.
Un mtodo difundido es el de bootstrapping, una forma de simu
lacin de Monte-Cario. De manera caracterstica, se elimina una
submuestra de los datos y se reemplaza por un grupo equivalente
de datos generados de modo aleatorio y se analiza la seudosecuencia resultante para observar si an es vlido el patrn evolucionis
ta sugerido (fig. 12-18B). El nuevo muestreo aleatoriza los datos,
pero si hay una relacin clara entre dos secuencias la aleatorizacin
no la borra. Por otra parte, si es falso un nudo que conecta las dos
secuencias en el rbol original, puede desaparecer en la aleatoriza
cin porque el proceso de aleatorizacin cambia las frecuencias de los
sitios individuales. El bootstrapping incluye con frecuencia nuevo

muestreo de subgrupos de datos 1 000 veces. El valor bootstrap
ms alto suele proporcionarse como porcentaje, de tal manera que
un valor de 100 significa que las simulaciones apoyan por comple
to la interpretacin original. Valores de 95 a 100 indican un nivel
alto de seguridad en un nudo predicho. Valores bootstrap menores
de 95% no significan que sea errneo el agrupamiento original de
secuencias, sino que los datos disponibles no proporcionan un
apoyo convincente. Vase la figura 12-31 para cotejar algunos
ejemplos.
12.3.2 Los nuevos programas de computadora alinean

secuencias a gran escala y del genoma completo
para asistir el anlisis y la identificacin
evolucionistas de secuencias conservadas
Los datos sobre secuencias que surgen de los proyectos del genoma
son, por supuesto, slo el inicio de una larga campaa para estudiar
lo que significan. Debido al enorme tamao de los grupos de datos,
se requirieron nuevos programas de computacin para hacer posi
bles alineamientos de secuencias a gran escala y del genoma com
pleto. Los nuevos programas han sido inestimables para ayudar a
identificar secuencias bien conservadas y comprender relaciones
evolucionistas.
Anlisis comparativo de secuencias a gran escala para

Identificar secuencias conservadas
Un desafo importante en los proyectos del genoma es identificar
genes RNA, secuencias reguladoras y otras secuencias importan
tes funcionalmente que no elaboran protenas. No es fcil anali
zar las secuencias de un genoma completo (porcentaje bajo de
DNA de codificacin) porque los programas de computadoras no
predicen con facilidad genes RNA y secuencias reguladoras (son
ms fciles los genes que codifican polipptidos; hay marcos de
lectura abiertos largos y grandes cantidades de datos de secuencias
K IF3
S e r h u m a n o /p e rro
S e r h u m a n o /ra t n
i AL 4 J
IJIn mu IV\ ru nS i l i l i
IL -4
R a t n /p e rro
^ - 1 ..!.... aftll J ....,
h JlJU n m .m V W .y r n P i n 1 m i L
ill III* ^\ .1M 111
11nA------tJ' . In I i IIi M AiblUs

.
JU
fin Av i
I----------&i
is. MM/* ira
a
u J : 11 , , it 1 Kk t\. L kA^ti
A
h
n i. - IL
1 1 iA
/i (M
li A u
Fig. 12-19. Alineamiento de la secuencia VISTA de una secuencia genmica de 50 kb que contiene las secuencias gnicas humanas KIF3 e IL4
con secuencias ortlogas en el perro (D) y el ratn (M).
Se muestran secuencias conservadas en relacin con sus posiciones en el genoma humano (ejes horizontales) y sus identidades porcentuales (50 a
100% ) se indican en los ejes verticales. Las localizaciones de los exones de codificacin (rectngulos azules en la parte superior) y la UTR 3 ' de
KIF3
(rectngulo turquesa) se muestran arriba del perfil. Las flechas horizontales indican la direccin de la transcripcin para cada gen. Los picos de secuencias
muy conservadas incluyen secuencias de codificacin (azul) y asimismo secuencias no codificantes (rojo) de funcin desconocida. Adaptado de
Dubchak y cois. (2000),
Genome Res.
10:1 3 04 -13 0 6 , con autorizacin de Coid Spring Harbor Laboratory Press.
12.3
FILOGENTICA MOLECULAR Y GENMICA COMPARATIVA
en genes y sus productos de expresin para compararlos con

ellos). Una alternativa consiste en buscar secuencias muy conser
vadas y contrastar diferentes secuencias genmicas en intervalos
grandes. Diferentes programas de computadora, como VISTA
(http://www-gsd.lbl.gov/vista) y Pipmaker (http://bio.cse.psu.edu/pipmaker/) permiten alineaciones de secuencias a gran escala
y expresan los resultados en un formato grfico (vase fig. 12-19
para observar un ejemplo).
Como resultado de anlisis comparativos de mamferos (sobre
todo seres humanos y ratones) en la actualidad se piensa que la can
tidad de secuencias muy conservadas en el genoma humano es de
alrededor de 5%, del cual se cree que slo 30% (-1.5% del geno
ma total) es DNA que codifica polipptidos. Muchos anlisis com
pararon secuencias humanas y de ratn pero quiz sea necesario
comparar algunas secuencias reguladoras que participan en la ex
presin gnica especfica de primates con una gama de frecuencias
de primates.
Se han comparado asimismo los genomas de organismos mode
los con secuencias genmicas de especies del mismo gnero relacio
nadas en grado distante. Por ejemplo, los nematodos C. elegansy C.
briggsae derivaron de un ancestro comn hace 100 millones de aos
y en la actualidad es posible interrogar ambas secuencias genmicas
mediante ENSEMBL (en http://www.ensembl.org/). Un proyecto
de genoma de Drosophila pseudoobscura (http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/projects/drosophila/) permitir compararlo con las secuencias
del genoma de D. melanogaster.
Alineamientos de secuencias del genoma completo

de mamferos
Los genomas complejos contienen una proporcin amplia de se
cuencias que evolucionaron de modo neutral. Debido a la falta de
presin de seleccin, estas secuencias divergieron en poco tiempo.
A fin de obtener mayor informacin sobre la evolucin de genomas, los programas de computadoras deben ser capaces de alinear
secuencias que evolucionaron de manera neutral cuando menos en
una gran proporcin de los genomas que se comparan. Esto se lo
gr para los genomas humano y del ratn mediante una modifica
cin del programa BLASTZ (Schwartz y cois., 2003) y se dispone
de alineaciones d e secu en cias d e l gen om a com pleto hum ano y d el
ratn junto con ilustraciones de su utilidad en http://bio.cse.psu.
edu/genome/hummus/
Las alineaciones del genoma completo mostraron que alrededor
del 40% de las secuencias del genoma humano se alinean con las del
ratn y que las secuencias de DNA muy repetidas pueden dividirse
en dos clases. Las repeticiones especificas d e lin a je se introdujeron
por transposicin despus de la divergencia de los seres humanos y
los ratones de un ancestro comn (dentro de los ltimos 80 a 100
millones de aos aproximadamente). Las repeticiones antiguas con
servadas se retuvieron del ancestro comn y es posible identificar y
alinear repeticiones ortlogas humanas y del ratn aunque tienen >
80 a 100 millones de aos. Los datos tambin revelan diferencias
en la relacin de dos clases de repeticiones. En seres humanos,
24.4% del genoma (o alrededor del 53% de las repeticiones disper
sas) es especfico de linaje pero en el ratn constituye el 32.4% del
3~
genoma o casi 85% de las repeticiones dispersas (alrededor de 39%

del genoma del ratn). Las repeticiones ancestrales se reemplazaron
en gran parte en el genoma del ratn y constituyen slo alrededor
del 5% del genoma; en personas, 22% del genoma est compuesto
de repeticiones ancestrales. La diferencia indica las variaciones en
las tasas de sustitucin de nucletidos en los dos genomas (seccin
11.2 .6).
12.3.3 El nmero de genes suele ser proporcional a

la complejidad biolgica
La secuenciacin del genoma revel algunas sorpresas y a primera
vista es posible que el nmero de genes tal vez no sea paralelo a la
complejidad biolgica tanto como se esperaba. Quin hubiera an
ticipado que el hombre slo tiene alrededor de 1.5 veces el nme
ro de genes que se encuentran en un gusano nematodo de 1 mm
de largo que slo contiene alrededor de 1 000 clulas o que este gu
sano pequeo posee al parecer miles de genes ms que la mosca de
la fruta mucho ms compleja? No obstante, si se consideran los ge
nomas secuenciados se reconoce una tendencia clara: los genomas
de vertebrados tienen en general el doble del nmero de genes que
se encuentran en genomas de invertebrados, que a su vez tienen
muchos ms genes que los organismos unicelulares (cuadro 12-4).
Por lo general, el nmero de genes de metazoarios aumenta se
gn sea la especializacin, pero en tanto que la duplicacin gnica
proporcion un refuerzo importante al desarrollo de metazoarios
complejos, algunas especies, por ejemplo D. melanogaster, tienen
un nmero sorprendentemente bajo de genes duplicados. Es im
portante considerar que los genes tambin pueden perderse del li
naje durante la evolucin.
Como se observa en el cuadro 12-4, la densidad gnica dismi
nuye a medida que se pasa de genomas simples a genomas metazoricos complejos. Eso apunta hacia el surgimiento de intrones en
eucariotas tempranos y una tendencia creciente a acumular DNA
repetido dentro de intrones y regiones intergnicas a medida que se
tornan ms complejos los genomas. Por consiguiente, por ejemplo,
alrededor de 45% del genoma humano est compuesto de repeti
ciones basadas en transposones, pero el valor correspondiente para
el ratn es de 37% y los valores equivalentes en D. melanogaster y
C. elegans son ms bajos en proporcin considerable.
12.3.4 Las comparaciones de proteomas revelan

la extensin de la especializacin progresiva
de protenas
Cuando se determinaron por vez primera las secuencias genmicas
de organismos modelos estudiados en extenso, como E. coli y la le
vadura S. cerevisiae, fue una sorpresa encontrar que se identific un
nmero notable de genes cuyas funciones se desconocan. En el es
quema de secuencias del genoma humano casi la mitad careca de
una funcin conocida, un recordatorio importante de que an exis
te un camino largo antes de comenzar a comprender en verdad el
genoma humano. De los restantes, alrededor de la mitad participa
en transduccin de seales o enlace de cido nucleico (fig. 12-20).
Cuadro 12-4. Nmero y densidad gnicos en genomas simples y complejos.

Genomas unicelulares
Genoma
Genomas multicelulares
Tamao
del genoma
(lmites)
Nmero
gnico
Densidad
gnica
PROCARIOTAS
Bacterianos
3 .10 Mb
Promedio
1 por 1.09 kb
(n = 97)
[0 .5 8 -9 .1 1 Mb]
= 2 840
Archaea
2 .2 3 Mb
Promedio
(n = 16)
[ 1 .6 6 - 5 .7 Mb]
EUCARIOTAS UNICELULARES
Microsporidianos
E. cuniculi
2 .9 M b **
Hongos unicelulares
S. cerevisiae
14
S. pombe
14
Mb
Mb
por
1 .0 2
Genoma
kb
Densidad
genica
117 M b*
97 Mb
~ 1 por 7 kb
- 1 por 5 kb
Invertebrados
Ascidiano (C. intestinalis)
Nematodo (C. elegans)
Mosca de la fruta
(D. melanogaster)
Mosquito
2 200
Tamao del genoma Nmero

(o nmero de
gnico
Mb secuenciado*)
(A. gambiae)
16 0 0 0
19 000
123 M b*
14 000
278 Mb
14 000
- 1
115 M b*
25 500
- 1 por 4 .5 kb
365 Mb
2500 M b*
31 000
- 1
por
30 000?
- 3 0 000
- 1
por 80 kb
por 1 0 0 kb
- 1 por 9 kb
por 2 0 kb
Planta
2 000
300
4 800
6
**
1 por 1.45 kb
Mastuerzo (A
thaliana)
1 por 2 . 2 kb
1 por 2.9 kb
Vertebrados
Protozoarios
P. falciparum
P. Y. yoeli
(T. rubripes)
(M. musculus)
Pez soplador
23 Mb
23 Mb
5 300
5 900
1 por 4.3 kb
1 por 3 .9 kb
Ratn
Ser humano
2900 M b *
- 1
12
kb
*N o representa el tamao del genoma completo porque excluye repeticiones tndem muy repetidas que es difcil clonar y secuenciar, pero s el nmero
total de genes.
* *E I tamao pequeo del genoma y el nmero escaso de genes reflejan el estado intracelular obligado de los microsporidios.
Las comparaciones de las protenas predichas a partir de la se

cuencia del genoma humano contra las predichas de los genomas
secuenciados de varios organismos modelo proporcion cierta in
formacin sobre el despliegue gnico durante la evolucin (fig.
12-21 y cuadro 12-5). Alrededor de 20% de las protenas huma
nas muestra homologa de secuencia con protenas distribuidas
con amplitud que se encuentran en eucariotas y procariotas. Ca
si 1% de las protenas carece de un homlogo en otros genomas
animales estudiados. Sin embargo, en esa poca haba pocas en
tradas de bases de datos de primates no humanos y por consi
guiente es posible que el 1% resulte ser especfico de primates en
lugar de especfico de seres humanos (cuando mucho, se espera
que slo un nmero muy pequeo de genes humanos sea espec
fico de personas).
La disponibilidad de genomas completos de diferentes especies
tambin permite una forma de protemica comparativa en la cual
se interrogan todas las secuencias de protenas conocidas o predichas
codificadas por los diferentes genomas para la presencia de domi
nios, secuencias tpicas u otros componentes de subsecuencias de
protenas especficas. El principal recurso es InterPro (recurso inte
grado de familias, dominios y sitios de protenas), una amalgama de
varias bases de datos de secuencias de protenas conservada por el
European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/interpro/).
Los datos de InterPro se proporcionan en diversas formas, que in

cluyen listas que catalogan las frecuencias de familias de protenas
especficas, dominios protenicos y repeticiones de protenas dentro
de los proteomas de genomas secuenciados (vase http://www.ebi.
ac.uk/proteome/).
Cuando se comparan las 25 principales entradas InterPro hu
manas (basadas en prevalencia) a travs de diferentes tipos de genomas eucariotas, no existen varias categoras, no slo para la levadura
unicelular S. cerevisiae (11/25) sino tambin para la planta A. thaliana (6/25) y en menor extensin para animales invertebrados
(3/25 de C. elega nsy 2/25 de D. melanogaster, vase cuadro 12-5).
Esto depende en parte de la especializacin del vertebrado, como
los genes del sistema inmunitario. Los genes del receptor olfatorio
son con claridad importantes en ratones y seres humanos y aunque
no existen contrapartes directas en los otros organismos, la princi
pal entrada InterPro para C. elegans es el quimiorreceptor 7TM de
nematodos que puede funcionar como un receptor olfatorio. Tam
bin hay diferencias de especies mayores en las categoras de fre
cuencias de entradas InterPro, incluso en personas y ratones, al
igual que en la prevalencia de receptores olfatorios, dedos de cinc
tipo C2H2 y cajas KRAB (dominios que se hallan en protenas de
dedos de cinc tipo C2H2) y receptores acoplados a protena G ti
po rodopsina (cuadro 12-5).
12.4 j QU CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO?
3~9
Adherencia celular (577,1.9% )

D iversos (1 3 1 8 ,4 .3 % ) \ Acompaante (159, 0.5%)
Protena viral (100, 0.3%) I \
Proteina estructural citoesqueltica (876, 2.;
\
\
Matriz extracelular (437,1.4% )
Protena de transferencia/portador (203, 0.7%) \
\
Inmunoglobulina (264, 0.9%)
Factor de transcripcin (1 850, 6.0%)
'
L 1
Enzima de cido nucleico (2 308, 7.5%)
/ Canal inico (406,1.3% )

M o to ra (3 7 6 ,1 .2 % )
Protena estructural del msculo (296,1.0% )
P rotooncogen (902, 2 .9 % )
Protena selecta de unin de calcio (34,1.0% )
Transportador intracelular (350,1.1% )
Transportador (533,1.7% )
Molcula de sealamiento (376,1.2% )

R ec ep to r (1 543, 5 .0 % )
C inasa (868, 2 .8 % )
Molcula reguladora selecta (988, 3.2%)
Transferasa (610, 2.0%)
Sintasa y sintetasa (313,1
Oxdorreductasa (656, 2.1 %)
Liasa (117, 0.4%)
Ligasa (56, 0.2%)
Isomerasa (163, 0.5%)
C ateg o ras GO
Hidrolasa (1 227, 4.0%)
Funcin molecular desconocida (12 809, 41.7%)

C ateg o ras phanter
Fig. 12-20. Clasificacin funcional preliminar de genes humanos que codifican polipptidos.
Funciones conocidas o predichas de 26 383 genes humanos que codifican polipptidos humanos. La clasificacin se basa en las categoras de funcin
molecular G0, como se muestra en los crculos externos (clasificacin Gene Ontology; vase seccin 8 .3 .6), o las categoras de funcin molecular
Celera 's Panther (crculo
interno). Reproducido a partir de Venter y cois. (2 0 0 1 ),
Science 29 1 :13 0 4 -1 3 5 1 ,
con autorizacin de la American Association
for the Advancement of Science.
12.4
Qu convierte al hom bre en ser

humano?
De dnde proviene el hombre?, qu hace al hombre un ser humano?

Preguntas fundamentales como las anteriores son algunas que se res
pondern mejor una vez que se tengan inventarios de genomas com
pletos, listas de genes y productos gnicos de seres vivientes. Los
proyectos del genoma se iniciaron en 1995 para obtener secuencias
genmicas y los 10 a 20 primeros aos del nuevo milenio deben ser
testigos de un surgimiento enorme de genomas secuenciados, anota
ciones detalladas sobre genes e informacin amplia de proteomas y
productos de RNA. Anlisis comparativos de los datos disponibles co
menzaron a proporcionar un cmulo de detalles moleculares sobre las
secuencias del cido nucleico y las protenas inferidas que comparte el
hombre con otras especies y la forma en que difiere de ellas.
Por supuesto, es posible llevar a cabo comparaciones a diferen
tes niveles y los seres humanos pueden colocarse en una diversidad
de grupos filogenticos. En una serie evolucionista de grupos ms
especializados en grado progresivo, el hombre es eucariota, metazoario, bilateriano, celomato, deuterostoma, cordado, craneado, verte
brado, gnatostoma, amniota, mamfero euteriano, primate cararrino,
hominoide y homnido, etc. (vase fig. 12-22 a 12-24 y asimismo el
recuadro 12-5 para cotejar glosario).
La universalidad del cdigo gentico, la enorme conservacin
evolucionista de las reacciones bioqumicas elementales y los proce
sos esenciales para la funcin celular y el grado alto de conservacin
de algunos procesos del desarrollo fundamentales en clulas de metazoarios son caractersticas que resaltan la relacin cercana de los se
res humanos con especies que son muy distintas desde el punto de
vista morfolgico y relacionadas apenas en sentido evolucionista.
Por supuesto, tambin existen diferencias. Los metazoarios ms
complejos tienden a mostrar genomas ms complejos con ms ge
nes y dominios protenicos y ms DNA repetido. Tambin puede
haber diferencias considerables entre distintas especies en varias ca
ractersticas vinculadas con la expresin gnica. Los ejemplos inclu
yen los siguientes:
380
CAPTULO DOCE
operones'. la transcripcin de genes eucariticos tiende a regular

se de manera independiente, a diferencia del control coordina
do en operones bacterianos, pero una fraccin grande de genes
de C. elegans est organizada en operones que semejan operones
bacterianos (pero son distintos de modo operacional).
m etilacin d el DNA (que est muy lejos de ser universal en metazoarios; vase recuadro 9-3).
impronta genm ica (una caracterstica importante de la expre
sin gnica en mamferos pero que al parecer no ocurre en or
ganismos como Drosophila, C. elegans, etc.).
adaptaciones d e vertebrados, por ejemplo genes vinculados con
sistemas inmunitarios, hormonas, etctera.
adaptaciones d e mamferos, como genes relacionados con el sis
tema XY de determinacin del sexo, inactivacin del cromoso
ma X, placentacin, etctera.
Desde luego, los seres humanos tambin se diferencian de otros
mamferos y sus primos, los grandes monos. La secuenciacin re
ciente de los genomas del ratn y la rata y la secuenciacin en cur
so de los genomas del chimpanc (Olson y Varki, 2003), y otros
primates, proporcionarn informacin relevante sobre la constitu
cin y la forma en que difieren del hombre.
12.4.1 Qu diferencia a los seres humanos

de los ratones?
CpG (-27 000 en DNA humano de repeticin libre) que en el ra

tn (15 000). Las regiones de sintenia ser humano-ratn conserva
da tienen en promedio cerca de 10 Mb de largo (vase fig. 12-21).
Repeticiones dispersas
Gran parte de la diferencia en el tamao del genoma humano-ratn se debe a la cantidad ms alta de DNA repetido en el genoma
humano: las repeticiones basadas en transposones constituyen alre
dedor de -45% del genoma humano, pero slo -37% del ratn. La
cantidad de secuencias LINE humana excede un poco la de secuen
cias LINE del ratn. Aunque las secuencias LINE se heredaron del
ancestro comn de seres humanos y ratones, hubo un recambio
ms alto de secuencias LINE en el genoma del ratn. En ambos ge
nomas slo se transpuso de manera activa el elemento LINE-1; pe
se a ello, si bien la clara mayora de las secuencias LINE-1 actuales
del ratn sufri transposicin despus de la divergencia del ser hu
mano y el ratn, se retuvo la mayor parte de las secuencias huma
nas LINE-1 del ancestro comn. Las repeticiones LINE-1 estn
conservadas en personas y ratones (y en todos los mamferos), en
Sin homologa
animal
Un comentario reciente sobre la secuenciacin del genoma del ra

tn sugiri que el mejor amigo del hombre ya no es el perro sino
el ratn. Sin duda, el ratn es el modelo de mamfero ms impor
tante (para sus ventajas, vase el recuadro 8-8) y en algunas reas
suele confiarse en la extrapolacin de estudios en ratones (p. ej.,
el estudio de la expresin gnica durante el desarrollo). Empero,
por supuesto, el ratn es an un m odelo y cada vez se reconocen
ms las diferencias entre seres humanos y ratones. Casi todas las
observaciones siguientes derivaron del Mouse Genome Sequencing
Consortium (2002), que se abrevia MGSC en las referencias cru
zadas posteriores.
Aspectos generales de la organizacin del genoma

El tamao del genoma eucromtico del ratn es de 2 500 Mb, un
poco ms pequeo que el de 2 900 Mb del genoma eucromtico hu
mano. La diferencia se debe sobre todo a la mayor cantidad de DNA
repetido (vase ms adelante). Como resultado, los tamaos de intrones son alrededor de 16% ms cortos en los genes del ratn en
promedio. Las distancias intergnicas son casi siempre ms peque
as pero hay una gran variacin regional. Los tamaos del exn y el
DNA de codificacin (del orden de 500 a 550 codones en prome
dio) son muy similares en personas y ratones y asimismo el nmero
de exones en genes ortlogos. El contenido total (G + C) del geno
ma del ratn es 42%, apenas mayor que el contenido de 41% (G +
C) del genoma humano. No obstante, este ltimo tiene una frac
cin mayor en grado significativo de contenido de DNA (G + C)
(MGSC, 2002; fig. 7) y, por consiguiente, muchos ms islotes de
Fig. 12-21. Distribucin taxonmica de homlogos de protenas

humanas y de ratn predichas.
Muchas de las protenas del hombre son de origen evolucionista antiguo
y slo menos de una cuarta parte se origin desde que aparecieron
los vertebrados. Obsrvese que las bases de datos de secuencias an
se llenan con nuevas secuencias y se espera que haya un nmero muy
pequeo de genes especficos en verdad humanos. Adaptados del
International Human Genome Sequencing Consortium (2001),

autorizacin del Nature Publishing Group.
con
12.4 1 QU CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO?
381
Cuadro 12-5. Ocurrencia comparativa en metazoarios de familias protenicas, dominios y repeticiones seleccionados.
H. sapiens
(28 525 protenas)
M. musculus
D. melanogaster
(20 804 protenas) (13 446 protenas)
C. elegans
(20 377 protenas)
A. thaliana
(25 936 protenas)
S. cerevisiae
(6 202 protenas)
Familia protenica,
dominio o repeticin
Protenas
Lugar
compatibles
Protenas
Lugar Protenas
Lugar
compatibles
compatibles
Protenas
Lugar
compatibles
Protenas
Lugar
compatibles
Protenas
Lugar
compatibles
Dedo de Zn, tipo C2H2
946
482
360
246
11
191
20
54
10
Inmunoglobulina/
complejo mayor de
histocompatibilidad
883
674
160
120
26
51
110
Ninguno
N/A
Superfamilia GPCR
parecida a rodopsina
826
1 375
86
26
403
836
Ninguno
N/A
Parecida a
inmunoglobulina
804
655
144
10
100
35
1 920
Ninguno
N/A
Cinasa de protena
687
486
263
507
1 047
118
Receptor olfatorio
477
980
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Cinasa de protena
serina/treonina
472
319
205
286
816
113
Repeticin W D -40 de
proteina G beta
386
243
10
188
166
17
267
12
101
Dedo de Zn, RING
367
222
13
121
15
173
16
466
39
16
Dominio parecido a EGF
357
10
286
101
21
202
13
34
175
Ninguno
N/A
Regin de enlace
342
de RNA RNP-1 (secuencia
tpica de reconocimiento
de RNA)
11
234
12
166
160
18
299
10
58
Parecido a plaquestrina
331
12
188
18
79
35
90
46
31
197
29
25
Subtipo de
inmunoglobulina
327
13
191
16
79
35
28
161
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Extensin abundante
en prolina
324
14
185
19
147
150
19
186
21
Cinasa de protena
tirosina
314
15
216
15
132
12
192
14
360
26
28
N/A
Caja KRAB
314
15
119
32
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Mano-EF de enlace
de calcio
298
17
220
14
128
13
134
23
220
16
17
46
Dedo de Zn, subtipo

C2H2
286
189
91
48
1161
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
25
29
116
Dominio SH3
280
19
189
17
80
33
70
64
1 075
Andrina
259
20
162
20
94
23
110
27
114
38
19
42
Inmunoglobulina tipo C-2
259
20
145
26
111
17
67
67
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Homeobox
254
22
238
11
107
19
106
30
95
53
125
Fibronectina tipo III
232
23
157
22
71
42
54
78
1 075
584
Inmunoglobulina tipo V
223
24
249
713
N/A
Ninguno
N/A
Ninguno
N/A
Repeticin abundante
en leucina
212
25
146
25
108
18
65
509
183
69
El nmero de diferentes protenas bajo los nombres de las especies se basa en juegos de proteoma no redundantes de entradas SWISS-PROT, TrEMBL y Ensembl. La columna de la izquierda indica las 25 principales entradas humanas (de acuerdo con el nmero de protenas compatibles) en la base de datos InterPro. Bajo los nombres de las especies se encuentran un nmero de diferentes protenas compatibles y el lugar que ocupan. Datos obtenidos (marzo, 2003)
del European Bioinformatics Institute a travs de http://www.ebi.ac.uk/proteome
382
CAPTULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL RBOL DE LA VIDA
B acterias
____4 0 0 0 r
m illones d e aos
A rch a ea
E ucariotas
38 0 0
m illones d e aos
Euglenozoarios
_2200
m illones d e aos
I__200
m illones d e aos
Taxa, e tc te ra
E je m p lo s
M e ta m o n a d a s
G iardia lam blia
Parabasilido s
Trichom on as
Euglnidos
E uglena gracilis
C in e to p ls tid o s
Leishm ania m a jo r
T ryp anosom a b ru c e i
T ryp anosom a cru z
C iliados
P a ra m e c u im tetraurelia
T e tra h ym en a therm o p h ila
A p ic o m p le xa
P la sm o d iu m falciparum
18 0 0
m illones d e aos
Alveolados
A lgas rojas
A lgas y
A lgas verdes
p lantas
_ 1600
m illones d e a os
Am oebozoarios
P lantas
A rab id o p sis thaliana
Entai
E n ta m o eb id ae
E n ta m o e b a histolytica
H
ti
D in
ictiostelida
D ictyostelium disco id eu m
M icrosp oridianos
.1 5 0 0
m illones d e aos Hongos
Tafrinom icotina
S c h izo s ac ch a ro m yc es p o m b e
S ac aro m ico tin a
S ac c h a ro m y a s cerevisiae
C an d id a albicans
S o rd iaro m iceto s
N eu ro s p o ra crossa
E urotiom icetos
Aspergillus nidulans
C o an o flag e lad o s
M e ta zo a rio s (vase fig. 12-23)
Fig. 12-22. Filogenia eucariota simplificada.
Nota: los coanoflagelados
(o flagelados con collar) se consideran los relacionados protistas vivientes ms cercanos de las esponjas, los metazoarios
ms primitivos (los coanoflagelados son casi idnticos en forma y funcin a los coanocitos, o clulas en collar, de esponjas).
gran parte debido a la presin de seleccin conservadora para

mantener la secuencia de la secuencia ORF-2 grande que especi
fica la transcriptasa inversa.
Muchas de las diferencias entre el hombre y el ratn en el con
tenido de repeticiones entremezcladas se deben a la cantidad ms
alta de DNA SINE en el genoma humano. Ninguno de los elemen
tos SINE se hered de un ancestro comn (a diferencia de los ele
mentos LINE, los elementos LTR y los transposones DNA; vase
MGSC, 2002, cuadros 5 y 6). En tanto que slo un SINE aislado,
la repeticin Alu, es activo en el genoma humano, se desarrollaron
cuatro familias SINE en el ratn, con base cada una en la retrotransposicin LINE-1. De ellas, las repeticiones B2, ID y B4 deri
varon como copias de cDNA de genes tRNA pero la repeticin B1,
al igual que la Alu, procedi de RNA 7SL (fig. 12-25). Sin embar
go, las repeticiones B1 y Alu tienen una divergencia significativa en

la secuencia.
Divergencia en las secuencias gnica y protenica

Al parecer, alrededor de 80% de las protenas de ratn tiene ort
logos 1:1 en el genoma humano y las identidades secuenciales sue
len encontrarse entre el 70 a 100%. No obstante, tal vez alrededor
de 10% de las protenas ortlogas humanas y de ratn muestra di
vergencia de secuencias ms extremas (fig. 12-26). Se sabe que
muchas de las protenas que evolucionaron en menos tiempo fun
cionan en la defensa/inmunidad del husped, por ejemplo los ge
nes MHC, o en los procesos de reproduccin. Las protenas de
reproduccin que evolucionan con rapidez incluyen la protena 2
12.4 I QU CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO:
583
E je m p lo s /
e s p e c ie s
Taxn o
filo , e tc te ra
Porifranos
Esponjas
C n id a ria n o s
M e d u s a , co ra les ,
anm onas de m ar
P la te lm in to s
G u s a n o s p la n o s (tenias)
M o lu s c o s
P u lp o
A n lid o s
G u s a n o s d e tie rra
A rtr p o d o s
D. m elanogaster
A nopheles gam biae
N e m a to d o s
C. elegans
C. briggsae
Diploblastos (dos capas germinales)
T
R
1
Tres ca p as L
germ inales,
bilaterales y
sim tricas
(BILATERA)
P
1
O
H
L
A
S
T
0
1 0 00
m illo n e s
d e a os
P
R
O
T
O
s
T
0
M
A
O
L o fo tro c o zo a n o s
E c d is o z o a n o s
H e m ic o rd a d o s
D
F
U
T
E
R
O
S
T
U
M
A
S
U ro c o rd a d o s
C e fa lo c o rd a d o s
C ra n e a d os
E q u in o d e rm o s
Erizo d e m ar, e s trella

d e m ar, p la n ta s m a rin as
T u n icad o s
(u ro co rd ad o s )
Ciona Intestinalis
C e fa lo c o rd a d o s
Am phioxus
H ip e ro tre ta s
P e z cic l s to m o
V e rte b ra d o s
V a s e fig. 1 2 -2 4
Fig. 12-23. Filogenia metazorica simplificada.
Nota: la divisin
el tunicado
C. elegans y D. melanogaster
Strongylocentrotus purpuratus,
profostoma-deuterostoma fundamental que ocurri hace alrededor de 1 000 millones de aos significa que
estn relacionadas de modo ms distante con los seres humanos que algunos otros invertebrados como el erizo de mar
Ciona intestinalis y el cefalocordado Amphioxus.
de transicin (divergencia de secuencias de aminocidos de 68%

entre seres humanos y ratones), glucoprotenas 2 y 3 de la zona pe
lcida (divergencia de 43 y 33%, respectivamente), acrosina (diver
gencia de 38%) y protaminas P15 y P2 especficas de espermatozoo
(divergencia de 41 y 36%, respectivamente). Se ha identificado se
leccin positiva, (darwiniana) (seleccin para sustitucin de ami
nocidos a fin de promover la diversidad) para varios de estos tipos
de protenas (vase p. ej., Swanson y cois., 2001).
Divergencia en el nmero gnico

An es necesario establecer el nmero total de genes humanos y el
ratn, pero se espera que sean muy similares. Sin embargo, mu
chas protenas humanas y del ratn pertenecen a familias gnicas
que se sometieron a expansin diferencial cuando menos en uno
de los dos genomas, con una falta de relacin 1:1 rgida resultan
te. Por supuesto, cuando vara el nmero de genes en una familia
gnica puede ser difcil identificar ortlogos verdaderos, en espe
cial si hay una divergencia de secuencias considerable. Un ejemplo
establecido desde hace mucho tiempo es el complejo mayor de his-
tocompatibilidad (MHC) en el que no es fcil identificar ortlo

gos entre los locus MHC tpicos (HLA en personas, H-2 en rato
nes) y en los que existen diferencias notorias en el nmero de locus
MHC no comunes.
Un caso extremo es la familia gnica del receptor olfatorio. El
ratn tiene alrededor de 1 200 genes funcionales, ms de tres veces
el nmero de genes humanos funcionales (Young y cois., 2002); es
to representa diferentes grados y repertorios de deteccin olfatoria
entre ratones y seres humanos. Se conoce un grupo adicional de 25
genes especficos del ratn; 14 contienen genes que participan en la
reproduccin del roedor (MGSC, 2002; cuadro 16) y cinco inclu
yen genes relacionados con la defensa e inmunidad del husped.
Como los roedores y primates muestran algunas diferencias nota
bles en la fisiologa de la reproduccin, es posible que los caracte
res reproductivos sean la causa de las presiones evolucionistas
potentes y que la exigencia de innovacin estimulara expansiones
diferenciadas de la familia gnica.
La prdida gnica durante la evolucin tambin puede condu
cir a diferencias en el nmero de genes, no slo en familias gnicas
agrupadas sino asimismo en genes esparcidos. Por consiguiente, al
384
CAPITULO DOCE LUGAR DEL HOMBRE EN EL ARBOL DE LA VIDA
gunos genes humanos no parecen tener un ortlogo en linajes de

roedores, en especial los genes de la regin seudoautosraica mayor
y la regin prxima especfica del cromosoma del sexo (fig. 12-15).
La mutacin en algunos de estos genes causa enfermedad, como el
gen seudoautosmico SHOX (sndrome de Leri-Weill, displasia
mesomlica de Langer) y el gen del sndrome de Kallman, KAL1,
localizado en Xp (se han identificado homlogos en C. elega nsy D.
melanogaster, pero al parecer se eliminaron genes equivalentes de li
najes de los roedores).
Divergencia en la expresin gnica

Las diferencias en la expresin de genes ortlogos entre el hombre
y el ratn incluyen muchos ejemplos de variaciones en el procesa
miento del RNA y el uso alternativo de promotores, diferencias en
el patrn de inactivacin del cromosoma X y variaciones en la improntacin. Adems, incluso cuando se conservan de forma nota
ble genes ortlogos a nivel protenico, no es raro que los patrones

de expresin espaciotemporal muestren diferencias notorias (Fougerousse y cois., 2000).
12.4.2 Qu diferencia al ser humano de sus

relacionados ms cercanos, los grandes monos?
Hace casi siglo y medio, Thomas Huxley identific de forma co
rrecta al chimpanc y el gorila como los relacionados ms cercanos
del hombre. Desde entonces, los genetistas evolucionistas se con
centraron en el problema de la tricotoma: cul de las dos especies
es la que se relaciona de modo ms cercano con el hombre? o ha
habido una divergencia simultnea de los linajes humano, del
chimpanc y el gorila (tricotoma)? Casi todos los datos sobre se
cuencias de nucletidos (p. ej., Satta y cois., 2000) apoyan una re
lacin ms cercana entre seres humanos y chimpancs (incluidos
Pan troglodytes, el chimpanc comn, y Pan paniscus, el chimpanc
G ru p o s y
e je m p lo s
Vertebrados no
~m andibulados
L a m p re a s
P e c e s ca rtila g in o s o s
Vertebrados
"m andbulados-
Tiburones, mantarrayas,
rayas
P e z te le o s to
l 450
P e z lo b o , p e z c e b ra ,
m edaka
A n fib io s
Xenopus
R ep tiles y av es
-360
Pollo
-310
M a m fe ro s p ro to te ria n o s (m o n o trem o s )
-170
M a m fe ro s m e ta te ria n o s
(m a rsu p iales )
130
-20
P la tip u s , e c h id n a
C an g u ro
O v e ja , c a b ra s
G anado
65
C e rd o s
r85
-95 '
C a b a llo s
75
P erros
-45
i_
G a to s
C o n ejo s
R a ta s
40
I__
R ato n e s
90
Monos del Nuevo Mundo
(p. ej., marmosetas)
C lave:
~3|5 i-------- Mono!

Monos del Viejo Mundo
(p. ej., macacos)
Lor
O ra n g u t n
M a m fe ro s eu te rian o s
G o rila
P rim a tes ca tarrin o s
H om n idos
C h im p a n c , b o n o b o
S e r h u m an o
Fig. 12-24. Filogenia de vertebrados simplificada.

Los nmeros en los nudos muestran los tiempos estimados de divergencia en millones de aos.
12.4 | QU CONVIERTE AL HOMBRE EN SER HUMANO?
385
D u p lic a c i n
o
a
b
AAAAAAA
TTTTTTT
B1
d V
R NA7SL
M o n m e ro iz q u ie rd o
M onm ero
AAAAAAA
AAAAAAA
TTTTTTT
D m e ro A lu
a
D e re c h o
v c
dy
TTTTTTT
b
3 2 pb
E xcisin
<-
Fig. 12-25. Las repeticiones Alu y B1 evolucionaron de copias procesadas del gen RNA 7SL.
La homologa extensa de las secuencias de repeticin Alu hasta los extremos de la secuencia RNA 7SL sugiere que se integr una copia poliadenilada
del gen RNA 7SL en alguna parte del genoma mediante un acontecimiento de retrotransposlcin (vase fig. 9-14 para el tipo general de mecanismo). En
algunos casos, las copias integradas fueron capaces de producir transcritos de RNA propios. En una etapa muy temprana se perdi un segmento interno
(entre c y d). De manera subsecuente se elimin (delecin) un segmento central de 32 pb que contena las regiones que flanqueaban la delecin original
(c + d) para proporcionar una unidad de repeticin relacionada. La fusin de los dos tipos de unidad dieron como resultado la repeticin dimrlca tpica
Alu, con el monmero de la izquierda (5 ') sin una secuencia de 32 pb y el monmero de la derecha (3 ') con la secuencia de 32 pb.
Obsrvese que en
el genoma humano tambin se encuentran mltiples copias de monmeros Alu. En el ratn sucedi al parecer un proceso similar de copiado del gen
RNA 7SL con delecin subsecuente de una unidad interna grande (entre a y b), seguida de duplicacin tndem de las regiones de flanqueo (a + b).
60
5 0 .4
50
40
<0
O
O)
O
O 3 0
c.
o
m
<0
L
2 5 .7
Fig. 1 2 -2 6 . Divergencia proteinica entre seres humanos y roedores.
20
Se ha clasificado una muestra de 1 880 ortlogos de humanos y

roedores (publicada primero por Makalowski y Boguski, Proc Nati Acad
1 2 .7
Sci USA 95: 9 4 0 7-94 1 2 ; 1998) en grupos de acuerdo con el nivel
10
de divergencia de la secuencia de aminocidos entre ortlogos. Las
7 .3
protenas ms conservadas (p. ej., calmodulina, protenas ribosmicas,
3.1
0 -5
O
histonas, y otras) participan en procesos celulares crticos.
, 0 .0 8
10
20
30
40
50
60
D iv e r g e n c ia d e s e c u e n c ia d e a m in o c id o s (% )
Las protenas de evolucin ms rpida se relacionan con la defensa
70
del husped/inmunidad o la reproduccin (vase el texto).
386
CAPTULO DOCE
Recuadro 1 2 - 5 . G lo s a r io de grupos y conceptos filogenticos m etazoricos com unes

......... ....................................................................
Para mayor informacin, vase la pgina de la red Tree of Ufe (http://tolMamferos euterianos: mamferos placentarios,
I
en oposicin a mamfe
web.org/tree/phylogeny.html) y otras fuentes filogenticas en las lecturas

adicionales. Vase las figuras 1 2-22 a 12-24 para las filogenias simplifi
cadas de eucariotas, metazoricas y de vertebrados.
ros monotremos (q.v.) y metaterianos (q.v.).
Amniotas: vertebrados que forman un amnios; incluyen reptiles, aves y
Peces ciclstomos: se relacionan de cerca con vertebrados, pero son in

vertebrados porque el notocordio no se convierte en una columna vertebral.
mamferos, pero no peces ni anfibios.
Antropoides: hominoides (q.v.) y monos.

Ascidianos: vase ascidios (p. ej.,
do (q.v.).
de los vertebrados, aunque las lampreas son vertebrados sin mandbulas.
Homnidos: seres humanos y ancestros parecidos al hombre.
Ciona intestinalis),
un tipo de tunica
Blaterianos: metazoarios simtricos bilaterales, incluidos los equinoder

mos, que tienen larvas simtricas bilaterales; poseen tres capas germina
les y en la actualidad son sinnimos de triploblastos (q.v.).
Catarrhine, primates: hominoides (q.v.) ms monos del Viejo Mundo.
Cefalocordados (es decir, branquiostomas o lancetas), cordados, que
carecen de crneo o columna vertebral (p. ej.,
Gnatostomas: vertebrados mandibulares que constituyen la mayor parte
Amphioxus).
Hominoides: seres humanos, grandes monos (chimpanc comn, bonobo, gorila, orangutn) y simios menores (gibones); comprese con antro
poides (q.v).
Mamferos metaterianos: marsupiales.
Monotremos: mamferos que ponen huevos.
Monos del Nuevo Mundo (Platyrrhini): monos que estn limitados a am
bientes de bosques tropicales en el sur de Mxico, Centroamrica y Sudamrica.
Cordados: animales que tienen una etapa embrionaria en la cual poseen un
Monos del Viejo Mundo (Cercopithecidae ): monos que se encuentran
notocordlo, un cordn neural tubular dorsal y bolsas de agallas farngeas;

Incluyen urocordados (q.v.), cefalocordados (q.v.) y craneados (q.v.).
en una gran variedad de ambientes en el sur de Asia y Asia occidental,

Medio Oriente y frica.
Cnidarianos (celenterados): medusa, corales, anmonas de mar (todas

simtricas y radiales con dos capas germinales).
comn.
Celomados: organismos con un celoma o cavidad corporal interna llena
Primates platirrinos: monos del Nuevo Mundo (q.v.).
con liquido que est recubierta por completo con mesodermo, en com
paracin con los acelomatos (p. ej tenias) y seudocelomatos (p. ej., nematodos que tienen una cavidad corporal llena con lquido pero que no
est recubierta del todo con mesodermo); se dividen en dos grupos, protostomas (q.v.) y deuterostomas (q.v.).
Clade: un grupo de organismos que incluye todos los descendientes de

un ancestro comn ltimo (es decir, taxn monofiitico).
Craneados: animales con crneo, esto es, vertebrados ms el pez ciclstomo.
Deuterostomas: de palabras griegas que significan segunda boca, como
los cordados (q.v.) y equinodermos (q.v.); son animales en los que el
biastoporo (la abertura de la cavidad digestiva primitiva hacia el exterior
del embrin) se localiza en la parte posterior del embrin y se constituye
en el ano; con posterioridad se abre la boca opuesta al ano; comprese
con protostomas (q.v.).
Phylum: un grupo de especies que comparte una organizacin corporal
Mamferos prototerianos: monotremos (q.v).

Protostomas: de palabras griegas que significan primera boca\ son orga
nismos en los que la boca se origina a partir del biastoporo (abertura de
la cavidad digestiva primitiva hacia el exterior del embrin); con posterio
ridad se abre el ano opuesto a la boca; incluye moluscos, anlidos y ar
trpodos; comprese con deuterostomas (q.v.).
Radiados: animales simtricos y radiales con slo dos capas germinales;

diploblastos (q .v).
Taxn: grupo de organismos que se reconoce a cualquier nivel de la cla
sificacin.
Peces teleostos: un grupo mayor de peces seos (en oposicin a los pe

ces con un esqueleto cartilaginoso, como tiburones, mantarrayas y ra
yas); se caracterizan porua mandbula superior del todo movible, aletas
rayadas y una vejiga natatoria.
Diploblastos: metazoarios slo con dos capas germinales: ectodermo y

endodermo, como cnidarianos (q.v.) y ctenofora (medusas cardadas);
son simtricos y radiales y por consiguiente este grupo se clasifica con
frecuencia con el trmino de radiados (q.v.).
Triploblastos: metazoarios con tres capas germinales; son simtricos bi

laterales y de ah el sinnimo bilaterianos (q.v.).
Equinodermos (p. ej., erizo de mar, estrella marina): son animales marinos
zo de mar).
simtricos y radiales pero, debido a que tienen tres capas germinales,
Urocordados: cordados (q.v.) que tienen un notocordio limitado a la re

gin caudal (es decir, tunicados).
son
triploblastos y por lo tanto se clasifican como blaterianos (q.v.).
pigmeo o bonobo). El clade (es decir, agrupamiento) Homo-Pan es

t apoyado asimismo por anlisis de punto de rotura cromosmica
que muestran que en el ancestro de humanos, chimpancs y bonobos comunes debi transponerse 0.1 Mb de fragmento autosmico dentro del cromosoma Y.
La divergencia de los linajes ser humano-chimpanc y ser humano-gorila ocurri hace alrededor de cinco a seis millones de arios
y siete millones de aos, respectivamente, y condujo a una diversi
dad de diferencias genticas (vase Gagneux y Varki, 2001; Olson
y Varki, 2003). La divergencia hacia especies separadas (especiacin)
debi recibir el impulso inicial de diferencias citogenticas peque-
Tunicados: incluyen erizo de mar y salpas (p. ej.,
Ciona ntestinalis, el eri
as, por ejemplo inversiones (que suprimen la recombinacin en

mamferos), mutaciones en genes fundamentales que regulan la
formacin de gametos o la regulacin del desarrollo embrionario
temprano, o ambas cosas.
Organizacin del genoma

Las comparaciones citogenticas comunes resaltan la conservacin
muy potente de patrones de bandeo cromosomico homnidos (ser
humano y grandes monos) (Yunis y Prakash, 1982). Al parecer, las
principales diferencias estructurales parecen limitadas, incluidas
12.5
varias inversiones pericntricas y paracntricas, la fusin reciente

de dos cromosomas para formar el cromosoma 2 humano y una
translocacin recproca entre los cromosomas del gorila que co
rresponde a los cromosomas humanos 5 y 17 (vase fig. 12-27).
Las secuencias centromricas muestran una evolucin muy rpida
y aunque se conserva una secuencia satlite alfa en todos los cro
mosomas humanos y de los grandes monos, hay una divergencia
muy notable de secuencias, muy probablemente como resultado
de evolucin concertada de las repeticiones en linajes individuales.
Estudios de mapeo comparativos ms recientes con HFIS multi
color (vase fig. 12-28) confirmaron la conservacin potente de
sintenia y permitieron proponer un cariotipo ancestral para hominoides (Muller y Wienberg, 2001).
El muestreo de secuencias sugiere que alrededor de 95% del genoma del chimpanc puede alinearse de manera directa con las se
cuencias humanas correspondientes y que en estas regiones
alineadas la divergencia de secuencias es en promedio de 1.2%; el
5% no alineado se debe a deleciones/inserciones (vase Olson y
Varki, 2003, para las diferencias). A pesar de la identidad de se
cuencias muy alta (de DNA no codificante y DNA de codifica
cin), es posible reconocer algunas subfamilias Alu (Sbl, Sb2) y
retrotransposones LTR especficos de seres humanos.
Diferencias gnicas
Cuando se comparan las secuencias ortlogas humanas y de chim
pancs, el DNA de codificacin muestra de forma caracterstica
99% o ms de identidad secuencial. En algunos casos, alelos espe
cficos de ciertos genes humanos estn relacionados ms de cerca
con ortlogos en chimpancs en comparacin con otros alelos hu
manos. Por ejemplo, en el locus humano HLA-DR(3, la secuencia
de los alelos HLA-DRB1 *0302 y HLA-DRB1 *0701 es claramente
ms cercana a ciertos alelos del gen ortlogo del chimpanc PatrDRB de lo que estn entre s (fig. 12-29). Estas observaciones son
consistentes con un origen antiguo de esos alelos divergentes, en
trminos comparativos, anterior a la divergencia entre el hombre y
el chimpanc.
Se conocen genes especficos de primates, incluidos algunos de
origen evolucionista reciente y otros que al parecer se sometieron a
seleccin positiva para sustitucin de aminocido (Courseaux y
Nahon, 2001; Johnson y cois., 2001). Es probable que los genes es
pecficos humanos sean muy raros, aunque la duplicacin y la pr
dida gnicas -en especial en familias gnicas agrupadas- tienen
como resultado diferencias en el nmero de genes entre personas y
los grandes monos. Sin embargo, en la actualidad existen pocas
pruebas de diferencias funcionales entre genes humanos y de chim
pancs: la nica distincin bioqumica conocida es el agotamiento
global en seres humanos de un cido silico especfico, el cido Nglucolilneuramnico que se expresa (en una forma regulada por el
desarrollo y especfica de tejido) en chimpancs, bonobos y los
otros grandes monos. La diferencia se debe a una delecin de cam
bio de marco en el gen del cido ,/V-acetilneuramnico CMP, que
ocurri en el linaje humano hace alrededor de dos millones de
aos, justo antes del inicio de la expansin rpida del cerebro
(Chou y cois., 2002).
EVOLUCIN DE LAS POBLACIONES HUMANAS
38"
El gen FOXP2 del dominio en horquilla es el primer gen que se

relacion con las caractersticas humanas slo del habla y el lengua
je. Se conserv muy bien durante la evolucin y nicamente mues
tra tres sustituciones de aminocidos entre personas y ratones. No
obstante, dos de estas sustituciones se observan slo en humanos
(los grandes monos tienen los mismos aminocidos que el ratn) y
se ha sugerido que se seleccionaron de modo positivo durante la
evolucin humana reciente (Enard y cois., 2002a). Es posible que
afectaran la capacidad de una persona para controlar los movimien
tos bucofaciales necesarios para el habla.
En fecha reciente se propusieron dos mtodos sistemticos pa
ra identificar la base molecular de las caractersticas nicas de los
seres humanos. El primero compara la expresin gnica de huma
nos y primates a escala de toda la extensin del genoma median
te perfiles de RNA basados en microordenamientos y perfiles
bidimensionales de protenas basados en electroforesis. Los datos
preliminares muestran que los patrones de expresin especficos
de especie son intensos en el caso del cerebro (Enard y cois.,
2002b). El segundo mtodo consiste en seleccionar las secuen
cias del genoma humano para regiones que experimentaron una
seleccin potente en la lnea humana. La seleccin potente para
un nuevo alelo favorable puede causar un ba rrid o selectivo (a
medida que aumenta la frecuencia del nuevo mutante, tambin
se barren regiones cromosmicas adyacentes para fijacin); el re
sultado incluye regiones de diversidad de nucletidos muy baja.
En estas regiones se identific una variedad de genes humanos y
son blancos para la identificacin de diferencias genticas entre
los seres humanos modernos y los chimpancs (Diller y cois.,
2002).
12.5
Evolucin de las poblaciones

hum anas
La investigacin acerca de la forma en que evolucionaron las po

blaciones humanas va ms all de una simple curiosidad sobre el
pasado del hombre. Tambin puede exhumar pruebas de la adap
tacin a nivel molecular y ayudar a interpretar y predecir desequili
brios de enlace, con las consecuencias para estudios de asociacin de
enfermedades.
Hasta que tuvieron xito los anlisis del DNA, la investigacin
de la evolucin de la poblacin humana dependi de estudios ar
queolgicos y paleontolgicos. El fsil homnido registrado en fri
ca apareci hace alrededor de cuatro millones de aos en el Plioceno
temprano (poca geolgica de 5.3 a 1.8 millones de aos), con re
presentantes del gnero Australopithecus de Etiopa y Tanzania. El
Homo erectus surgi hace ms de un milln de aos en el Pleistoceno (la poca comprendida entre 1.8 y 0.8 millones de aos) y dio
lugar al gnero humano. Algunos autores apoyan la posibilidad de
que otra especie, Homo heidelbergensis, descendiera del Homo erec
tus y diera origen a su vez al Homo sapiens y Homo neanderthalensis
(vase Stringer, 2002). Desde el punto de vista anatmico, los hu
manos modernos (Homo sapiens sapiens) comenzaron a aparecer ha
ce 120 000 a 100 000 aos y coexistieron con los hombres de
Neanderthal hasta que este ltimo se extingui hace unos 30 000
aos.
388
CAPITULO DOCE
Fig. 12-27. Los patrones de bandeo cromosmico humanos son muy similares a los de otros grandes simios.
Los ideogramas son de preparaciones en profase tarda de 1 000 bandas de ser humano (H), chimpanc (C), gorila (G) y orangutn (0 ). El cromosoma 2
humano surgi por fusin de dos cromosomas de primates. El cromosoma humano
es en extremo similar a sus ortlogos -la s nicas diferencias visibles
con facilidad son heterocromatina telomrica adicional en el brazo corto del ortlogo del chimpanc y en ambos brazos del ortlogo del gorila-. Los ortlogos
del cromosoma 5 humano muestran diferencias notorias. El ortlogo del chimpanc sufri una inversin pericntrica (puntos de rotura correspondientes a
5p13 y 5q13) y el ortlogo de gorila se someti a translocacin recproca con un cromosoma correspondiente al cromosoma humano 17. Reimpreso con
autorizacin de Yuns y Prakash (1982),
Science 2 1 5 :1 52 5 -1 5 3 0 .
1982, American Association forthe Advancement of Science.
La variacin del DNA proporciona un mtodo alternativo pa

ra reconstruir la historia reciente de las poblaciones humanas. Pue
den utilizarse diferentes marcadores de DNA. Por lo general se
emplean el DNA mitocondrial y secuencias del cromosoma Y no
recombinantes porque, a diferencia de otros marcadores, no son
propensos a recombinacin y es posible seguir linajes de manera
directa a travs de las lneas materna (mtDNA) o paterna (cromo
soma Y). Por supuesto, es difcil que sean representativos del genoma y por consiguiente tambin se han estudiado secuencias
autosmicas y ligadas a X.
Adems de la variacin en el muestreo de DNA en diferentes
poblaciones de seres humanos modernos, es posible recuperar
DNA de huesos de especmenes arqueolgicos. Aunque las se

cuencias de DNA recuperadas tienen longitudes cortas, pueden
amplificarse mediante PCR y analizarse con secuenciacin o genotipificacin. El proceso de degradacin establece lmites de tiem
po, pero con un gran cuidado es posible extraer DNA an tiguo de
especmenes hasta de unos 50 000 aos de edad o ms. El DNA
recuperado de un espcimen de Neanderthal de 30 000 a 100 00C
aos de edad tuvo una secuencia mtDNA claramente diferente en
comparacin con la de los hombres modernos: alrededor de tres
veces la variacin promedio que se encontr entre distintos seres
humanos, pero casi la mitad de la diferencia promedio entre per
sonas y chimpancs (Krings y cois., 1997). Aunque los datos son
12.5
K j < ' \
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389
20
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X
Fig. 12-28. Codificacin por barras de cromosomas de primates como un medio para revelar diferencias estructurales.
Los perfiles de bandeo a color de especies cruzadas
(Rx-HFIS) muestran
alineamiento de cromosomas ortlogos de primates con los cromosomas
humanos 1 -22 y X. Los juegos de cromosomas (con la numeracin segn el homlogo humano) se muestran de izquierda a derecha: humano,
chimpanc, gorila, orangutn y macaco. A fin de mejorar las comparaciones se muestran los cromosomas 2p/2q, 7 /2 1 ,1 4 /1 5 y 20 /22 , que son
cromosomas nicos en seres humanos o el macaco junto con los homlogos de los grandes simios. Este tipo de anlisis sugiri un cariotipo preliminar
ancestral para hombres y grandes simios. Reproducido a partir de Muller y Wienberg (2002),
por fuerza limitados, sugieren que los hombres de Neanderthal se

extinguieron sin contribuir con ningn mtDNA a los seres huma
nos modernos y al parecer los linajes que condujeron a los Nean
derthal y los humanos modernos divergieron hace alrededor de
500 000 aos.
12.5.1 Las pruebas genticas sugieren un origen

reciente de los seres humanos modernos
en poblaciones africanas
Cuando se aplicaron los estudios de variacin del DNA a poblacio
nes modernas, se advirti con claridad un origen reciente de los
hombres modernos en poblaciones africanas (vase Excoffier, 2002;
Templeton, 2002) y ello se ajusta a la mayor diversidad gentica
observada en poblaciones africanas (vase seccin siguiente). Una
proposicin inicial, el modelo del origen africano reciente (OAR)
(tambin conocida como hiptesis unirregional), sugiri que la es
pecie humana evolucion a partir de una poblacin africana peque
a que de modo subsecuente coloniz todo el mundo, tras
suplantar a los primeros homnidos hace unos 100 000 a 150 000
aos (alrededor de la poca en la que surgieron los hombres anat
micamente modernos; vase fig. 12-30).
El modelo OAR se bas al principio en estimaciones de la va
riacin del haplotipo en mtDNA humano. La transmisin mater
Hum. Genet.
109:85-94, con autorizacin de Springer-Verlag.
na de mtDNA y la ausencia de recombinacin significa que es po

sible aplicar con facilidad anlisis de coalescencia (recuadro 12-6)
a fin de estimar la fecha del ancestro comn que transmiti, la se
cuencia de DNA en estudio a todos los individuos de la muestra.
Con este tipo de conducta pueden seguirse las secuencias de mtDNA
de todos los seres humanos modernos hasta un solo individuo, la
Eva mitocondrial. Los anlisis muestran que este individuo exis
ti hace unos 100 000 a 150 000 aos (5 000 a 7 000 generacio
nes ms o menos) y los datos sugieren con firmeza que ella vivi en
el este de frica (vase ms adelante). Por supuesto, la Eva mito
condrial no fue la nica persona que viva en el planeta en esa po
ca: haba tal vez 10 000 individuos que vivieron en esa poca pero,
a diferencia de Eva, sus secuencias de mtDNA no se transmitieron a la
poblacin humana actual (vase recuadro 12-6).
El modelo del OAR fue motivo de controversias porque se sabe
que el precursor inmediato del hombre, Homo erectus, se dispers
fuera de frica hace ms de un milln de aos. Por consiguiente, el
modelo exige que slo un subgrupo africano de Homo erectus d lu
gar a los seres humanos modernos. Aunque basado al principio en
estimaciones incorrectas, el modelo del OAR se apoya por datos re
cientes ms seguros. La filogenia basada en mtDNA que se muestra
en la figura 12-31 proporciona un ejemplo del mtodo general. El
punto crucial es que las ramas ms profundas (las que divergieron
ms temprano de la raz y, en consecuencia, las ms antiguas en tr
minos evolucionistas) conducen de forma exclusiva a variantes que
390
CAPTULO DOCE
1
H L A -D R B 1 *0 3 0 2
H L A -D R B 1 *0 7 0 1 I
100
_ ~
200
...............................
III lili I I I
I II I
..
II
Zl
I
III
H L A -D R B 1 *0 3 0 2 I
P a tr-D R B 1 * 0 3 0 5 I
270
I IIII
.....................
............. I
................. l.l......................
III
I..
Z l
III
....-J
H L A -D R B 1 *0 7 0 1 [
P a tr-D R B 1 *0 7 0 2 [
Fig. 12-29. Algunos alelos humanos muestran mayor divergencia secuencial respecto de cuando se comparan de forma individual con genes
ortlogos de chimpanc.
HLA-DRB1*0302 y HLA-DRB1*0701 muestran un total de 31 diferencias (13%). La comparacin

(Patr-DRB1) identifica pares de humanos y de chimpancs relacionados
muy de cerca, como HLA-DRB1*0701 y Patr-DRB1*0702 (slo dos diferencias de aminocidos de 270). Esto sugiere que algunos alelos HLA actuales
fueron anteriores a la divisin ser humano-chimpanc. Redibujado a partir de Klein y cois. (1993), Scientific American 269 :6 75 -68 0 , con autorizacin de
De un total de 270 posiciones de aminocidos, los alelos
de cualquiera de los alelos con los alelos en el locus ortlogo del chimpanc
Scientiflc American Inc.
se encuentran en la poblacin africana que sugieren con solidez que

la Eva mitocondrial vivi en frica. Los tres mtodos de reconstruc
cin (p. ej., la unin del vecino ms cercano que se muestra en la
fig. 12-31) permiten estimar en trminos estadsticos el tiempo que
se requiri para que todas las secuencias de mtDNA que existen en
la actualidad coalescieran en la secuencia mtDNA ancestral nica.
Algunos paleontlogos apoyan un modelo alternativo de evolu

cin multirregional. En ste se considera que los humanos moder
nos surgieron de manera gradual y simultnea de poblaciones de
Homo erectus dispersadas en diferentes continentes con un flujo gnico importante entre los distintos grupos. Anlisis estadsticos ms
recientes de rboles de haplotipo objetan asimismo un modelo de
Fig. 12-30. Diseminacin del Homo sapiens fuera de frica oriental postulada por el modelo recent alrican origin (origen africano reciente) (hiptesis
unirregional).
Las fechas (en aos antes del presente) Indican las fechas estimadas del arribo de seres humanos modernos a los sitios indicados apoyados por registros
recent african origin

Where do we come from? The molecular evidence for human
paleontolgicos y arqueolgicos. Las fechas de migracin fuera de frica sugeridas por estudios genticos apoyan que el modelo
vara entre 50 000 y 2 0 0 000 aos. Figura adaptada a partir de Klein y Takahata (2 0 0 2 ),
descent, con autorizacin
de Springer-Verlag, Berln.
12.5
391
Recuadro 12-6. Anlisis de coalescencia

En gentica evolucionista, coalescencia es lo opuesto a divergencia. Du
rante la direccin evolucionista normal, del pasado al presente, los genes
y las secuencias de DNA divergen a partir de una secuencia ancestral co
mn. El objeto del anlisis de coalescencia es comenzar desde la diversi
dad gentica que existe en la actualidad en algn locus y regresar a travs
de la evolucin. Por supuesto, es mucho ms fcil trabajar en retrospec
tiva si slo se siguen las lneas materna o paterna y por consiguiente los
anlisis de coalescencia son comparativamente directos para mtDNA (l
nea materna) y secuencias del cromosoma Y no recombinantes (lnea pa
terna), ya que no hay recombinacin que cause confusin.
Despus de reunirse muestras de diversas poblaciones, los anlisis de coa
lescencia buscan establecer el punto en que todas las diferentes variedades
de secuencias modernas de DNA que se hallan en las muestras reunidas
coalescen hacia una secuencia ancestral nica que se encuentra en el an
cestro comn ms reciente (ACMR). Implcita en el concepto de coales
cencia est la desigualdad de la descendencia: todos los seres humanos
modernos y sus genes descienden de individuos ancestros que contienen
genes ancestrales, pero no todas las personas que vivieron en el pasado tu
vieron descendientes. Por consiguiente, es posible conectar diferentes lina
jes a distintos ACMR (vase figura). Por ltimo, toda la variacin gentica
que se halla en un locus en los humanos modernos debe rastrearse hasta
un Individuo aislado, como la Eva mitocondrial en el caso del mtDNA.
Es importante advertir que los distintos locus coalescen en distintos ances
tros comunes ms recientes (ACMR). Los cerca de tres mil millones de cro
mosomas Y humanos en el planeta coalescen en la actualidad hacia un
cromosoma Y nico de un individuo aislado que vivi en el pasado, el cro
mosoma Y de Adn. Es posible que no viviera al mismo tiempo que la Eva
mitocondrial porque la via evolucionista que tom este cromosoma V fue
diferente de la que tom el DNA mitocondrial de Eva. La recombinacin
presenta problemas para anlisis de coalescencia de secuencias autosmlcas, a menos que se consideren locus especficos. Sin embargo, tiende a
ocurrir recombinacin en ciertas reas del genoma en lugar de otras y el
genoma autosmico humano es al parecer un mosaico de los llamados
bloques de haplotipos (segmentos tpicos de 5 a 200 kb de longitud, en
tanto que las tres a siete variantes constituyen la mayor parte de la varia
cin gentica que se observa en seres humanos modernos; vase Paabo,
2003). Los bloques de haplotlpo tienden a ser ms cortos en poblaciones
africanas y por lo tanto un tamao promedio a nivel de especie para un blo
que haplotlpo puede ser del orden de 10kb. Cada uno de los bloques de
haplotipo autosmico posee su historia evolucionista y por consiguiente mi
les de otros ACMR habrn contribuido al DNA gentico de los hombres mo
dernos, adems de la Eva mitocondrial y el cromosoma Y de Adn.
OAR simple. Al tiempo que confirma el papel dominante que tu

vo frica en la modelacin del fondo comn gnico moderno,
Templeton (2002) sugiere que los seres humanos se expandieron
fuera de frica ms de una vez y se interparearon en una base re
gional (vase Excoffier, 2002, para cotejar varios modelos).
12.5.2 La diversidad gentica humana es baja y se debe

sobre todo a variacin dentro de las poblaciones
ms que entre ellas
Los estudios demuestran de manera consistente que la diversidad
gentica en seres humanos es baja comparada con otras especies, in
cluidos ratones y monos, lo que sugiere que el linaje humano sufri
un cuello d e botella d e p ob lacin reciente en trminos evolucionis
A n c e s tro c o m n
m s re c ie n te
El anlisis de coalescencia busca rastrear el gen o linajes de secuen

cia de DNA hasta que coalescen en un mismo individuo.
Los diferentes linajes de genes o secuencias de DNA especficos en las po
blaciones que existen hoy en da (generacin G0, hilera inferior) pueden ras
trearse al final hasta varios ancestros comunes recientes en generaciones
previas (G-1 a G -17). El linaje de ramificacin ms temprano es E, que di
vergi hacia ocho generaciones (G- 8 ; de los linajes F-H). Todos los linajes
coalescen en un ancestro comn ms reciente (ACMR) hace 13 generacio
nes (G-13). Todos los crculos en blanco representan casos en los que no
se transmiti la secuencia gen/DNA en estudio a la generacin actual.
tas. El patrn de variacin no es uniforme: las poblaciones no afri

canas muestran de modo caracterstico un subgrupo de la variacin
gentica que se encuentra en poblaciones africanas.
Un ejemplo notable es la variacin que se observa en el minisa
tlite de insulina, que se vincula con susceptibilidad a diabetes y
otros fenotipos. Un estudio reciente de tres poblaciones africanas y
tres no africanas identific un total de 22 linajes muy divergentes
de alelos relacionados. No fue factible encontrar intermedios es
tructurales entre estos linajes en las poblaciones que existen en la
actualidad, lo que sugiere un cuello de botella dentro del ancestro
de todos los seres humanos (Stead y Jeffreys, 2002). La diferencia
entre la diversidad en las poblaciones africanas y no africanas es ex
traordinariamente grande: los 22 linajes se identificaron en .Africa,
pero slo tres se encontraron en poblaciones no africanas, algo que
es consistente con un origen comn fuera de frica (cuadro 12-6i.
392
CAPTULO DOCE
0 .000 5
- 1 Chukchi
2 A ustraliano
3 A ustraliano
4 P im ano
5
italiano
6 Tierra alta PN G
7 C o sta PN G
8 T ie rra alta PN G
9 G eorgiano
10 A lem n
11 U zb e co
12 Saam
13 T rta ro crim eano
14 H olands
15 Francs
16 Ingls
17 S am oano
18 C oreano
19 C hino
20 Indio asiatico
21 Chino
2 2 C o sta PN G
23 A ustraliano
------------24 Evenki
25 Buriat
26 Khirgiz
27 W arao
28 W arao
29 Inuit siberiano
30 G uarani
N o africano
A fricano
33 M k a m b a
4 6 Biaka
4 7 M b e n ze le
52 San
53 San
C h im p an c
Fig. 12-31. Las filogenias de mtDNA sugirieron un origen africano reciente de los seres humanos modernos.
sta es una filogenia de unin de vecino basada en esencia en secuencias del genoma completo mtDNA (sin contar el asa D) de 53 individuos (las
poblaciones de origen se proporcionan a la derecha), mediante el chimpanc como grupo externo. Los datos se sometieron a bootstrappend con 1 000
rplicas (los valores
bootstrappend se
muestran en rojo en los nudos). Los individuos de descendencia africana se encuentran abajo de la lnea horizontal
central; los no africanos arriba. El nudo marcado con un asterisco se refiere al ancestro comn ms reciente del conjunto ms joven que contiene individuos
africanos y no africanos. Este anlisis sugiri que los seres humanos modernos surgieron de poblaciones africanas tal vez hace alrededor de 50 000
aos, un momento un poco ms reciente de lo que sugirieron muchos anlisis similares. Figura reproducida de Ingman y cois. (2000),
Nature 408:708-713,
12.5
393
Cuadro 12-6. Mayor diversidad gentica en poblaciones africanas que en poblaciones no africanas en el minisatlite de insulina
Linaje
Poblaciones no africanas
Reino Unido
Kazajistn
Japn
Costa de Marfil
71.6
85.0
94.9
NIA
23.0
11.3
1116
5.4
3.8
Poblaciones africanas
Zimbabue
Kenia
19.2
118.8
15.5
4.2
5.8
1.4
7.1
0.8
3.2
1.4
3.6
1.3
0.7
0.7
1.4
3.6
9.6
8.0
9.5
20.5
17.4
20.2
8.3
5.1
3.6
3.2
0.7
3.6
2.6
5.8
2.6
2.9
2.4
1.9
5.8
9.5
4.5
.7
3.6
.6
4.3
CO
1.3
1.4
1 .2
1.4
13.0
9.5
1.9
4.3
2.4
0.6
3.6
0.7
1 2 .8
Un sistema de alta resolucin para analizar las distribuciones de repeticiones variables en el locus INS VNTR identificaron 22 linajes muy divergentes de alelos relacionados. Las
frecuencias de linaje se expresan como porcentajes. Slo se encontraron tres de los linajes en poblaciones no africanas (el smbolo indica ausencia de alelos vinculados con
linaje). En contraste notable, se reconocieron todos los 22 tipos de linaje en frica en donde las diferentes poblaciones mostraron mucha mayor variabilidad. La representacin
excesiva del linaje I no africano puede deberse a seleccin positiva. Reproducido a partir de Stead y Jeffreys (2002), Am. J. Hum. Genet. 71:1273-1284, con autorizacin de
University of Chicago Press.
A pesar de las diferencias entre las poblaciones que se observan en

el cuadro 12-6, estudios genticos demuestran de manera slida que la
gran mayora de la variacin gentica humana deriva de diferencias
dentro de poblaciones, no tanto entre ellas. En el ms amplio de estos
estudios se hall que las diferencias entre los individuos dentro de la
poblacin constituan 93 a 95% de la variacin gentica humana, en
tanto que slo 3 a 5% se explicaba por las diferencias entre grupos ma
yores de poblacin distintos (Rosenberg y cois., 2002). Si bien cada
persona individual tiene una historia biolgica nica, las historias bio
lgicas del hombre estn tan superpuestas que es muy engaoso divi
dir a las personas en categoras biolgicas. Por consiguiente, el concepto
de raza como una categora discreta definida p or la biologa es irracional
porque no es posible definir estas categoras en sentido biolgico.
El estudio de Rosenberg y colaboradores (2002) fue un nuevo

punto de partida, un esfuerzo para definir la estructura gentica de
poblaciones humanas sin utilizar a priori inform acin sobre el ori
gen geogrfico d e los individuos estudiados. Sin esta informacin, se
identificaron cinco grupos genticos mayores que corresponden a
cinco regiones geogrficas mayores: frica subsahariana; frica sa
hariana y Eurasia (Europa, Oriente Medio y Asia central y del sur);
Asia del este; Amrica (amerindios) y Oceana. Por consiguiente,
hay consenso acerca de la asignacin geogrfica y gentica. No
obstante, como se describi, dos genes de dos individuos en cual
quiera de estas regiones geogrficas slo es en prom edio 4% ms si
milar que dos genes seleccionados de individuos que pertenecen a
la misma regin.
394
CAPTULO DOCE | LUGAR DEL HOMBRE EN EL RBOL DE LA VIDA
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P AR T E
TRES
Mapeo e identificacin
de genes patolgicos
y mutaciones
13
M apeo g e n tico d e ca ra cteres m en d elia n os
399
14
Id en tifica ci n d e g en es p a to l g ico s en seres hu m an os
417
15
M apeo e id en tifica ci n d e g en es q u e co n fieren su scep tib ilid a d

a en ferm ed a d es com p leja s
43 7
16
P atologa m olecu la r
465
17
G entica d e l c n cer
489
18
P ru eba s g en tica s en in d ivid u os y p o b la cio n es
511
CAPTULO
TRECE
Mapeo gentico de caracteres

mendelianos
400
13.1
CAPITULO FRECE
MAPEO GENTICO DE CARACTERES MENDELIANOS
Recombinantes y no recombinantes
lo tanto, un cruzamiento produce 50% de recombinantes entre

los locus que lo flanquean.
Las recombinaciones rara vez separan locus situados muy cerca
entre s en un cromosoma, dado que slo un cromosoma localiza
do en el espacio pequeo entre los dos locus crea recombinantes.
Por consiguiente, los grupos de alelos en el mismo segmento
cromosmico pequeo tienden a transmitirse en bloque a travs
de una genealoga. Este lote de alelos se conoce como haplotipo.
Los haplotipos marcan segmentos cromosmicos identificables
que pueden seguirse a travs de genealogas y poblaciones cuando
no se rompen por recombinacin. En la figura 13-9 se muestran
ejemplos.
Cuanto ms distantes se encuentren dos locus en un cromoso
ma, ms probable es que un cruzamiento los separe. En consecuen
cia, la fraccin de recombinacin es una medida de la distancia
entre dos locus. Las fracciones de recombinacin definen la distan
cia gentica, que no es lo mismo que la distancia fsica. Dos lo
cus que muestran 1% de recombinacin se definen como separados
un centiMorgan (cM) en un mapa gentico.
En principio, el mapeo genrico en seres humanos es exactamente

el mismo que el mapeo gentico en cualquiera otro organismo diploide que se reproduce de forma sexual. El objetivo es descubrir la
frecuencia con que se separan dos locus mediante recombinacin
meitica. Considrese que una persona es heterocigota en dos locus
(genotipo A jAj Bj Bj ) y que los alelos Aj y B, provienen de un pa
dre y A2 y B2 del otro. Cualquiera de los gametos de ese individuo
que lleva una de estas combinaciones parentales ( A ^ o A2B2) no
es recombinante para esos dos locus, en tanto que los gametos que
llevan AiB2 o A2Bt son recombinantes (fig. 13-1). La proporcin
de gametos que son recombinantes es la fraccin de recombinacin
entre los dos locus A y B.
13.1.1 La fraccin de recombinacin es una medicin

de la distancia gentica
Cuando dos locus se encuentran en diferentes cromosomas, se se
gregan de manera independiente. Considrese la espermatogne
sis en un sujeto II,, en la figura 13-1, al final de la meiosis I;
cualquiera que sea el espermatozoo que recibe el alelo At, existe
50% de posibilidad de que reciba el alelo Bj y 50% de que reci
ba el B2. Por consiguiente, en promedio, 50% de los gametos es
recombinante y 50% no recombinante. La fraccin de recombi
nacin es de 0.5. Si los locus son sintnicos, es decir, si se en
cuentran en el mismo cromosoma, entonces cabe esperar siempre
que se segreguen juntos, sin recombinantes. Sin embargo, esta ex
pectativa simple ignora el cruzamiento meitico. Durante la pro
fase de la meosis I, los pares de cromosomas homlogos hacen
sinapsis e intercambian segmentos (fig. 2-11). En cualquier cru
zamiento particular slo participan dos de las cuatro cromtides.
Un cruzamiento que ocurre entre las posiciones de los dos alelos
crea dos cromtides recombinantes que llevan A,B2 y A2Bj y de
jan las dos cromtides no recombinantes que no participaron. Por
C b
Ap A p
B2 b 2
13.1.2 Sin embargo, las fracciones de recombinacin

no exceden de 0.5 por muy considerable que sea
la distancia fsica
Un acontecimiento de recombinacin aislado produce dos crom
tides recombinantes y dos no recombinantes. Cuando los locus es
tn muy separados es posible que haya ms de un cruzamiento
entre ellos. Los cruzamientos dobles pueden incluir dos, tres o cua
tro cromtides, pero en la figura 13-2 se muestra que el efecto to
tal, promediado en todos los cruzamientos dobles, proporciona
50% de recombinantes. Los locus muy alejados en el mismo cro
mosoma podran estar separados por tres o ms cruzamientos. Una
vez ms, el efecto total es suministrar 50% de recombinantes. Las
fracciones de recombinacin nunca exceden de 0.5 por muy distan
tes que se encuentren los locus.
A 2 A-j
-O
o A, A1
b2 b1
B 2 b-.
o
A 2A!
Bi B1
- o
A, At
B i B-,
t 2 o1
B2
A2 A1
B2 B|
NR
"
A i A,
Bi B,
Ai A 1
B2
NR
"zr
A2A1
B2 B i
A i A,
Bi B,
NR
NR
2a 1
B, B,
A2A 1
B2 Bt
NR
Fig. 13-1. Recombinantes y no recombinantes.

En esta familia se han segregado los alelos en dos locus (locus A, alelos
y A2; locus B, alelos B-i y B2). Los cuadros a colores Indican combinaciones
de alelos que pueden seguirse a travs de la genealoga. En la generacin III se pueden distinguir personas que recibieron espermatozoo no recombinante
(A 1 B 1 o A 2 B2)
recombinante (A 1 B2 o A2 B1) de su padre. Debido a que el Individuo ll2 es homocigoto en estos dos locus no es posible Identificar cul
de los Individuos en la generacin III se desarroll de oocitos no recombinantes o recombinantes.
13.1 RECOMBINANTES Y NO RECOMBIN
R e c o m b in a n te
nico
R e c o m b in a n te s d o b le s
Dos cad en as
Tres c a d e n a s
C u a tro c a d e n a s
B)
C)
D)
A)
<
5N
<
Ai
B iva len te s
en p ro fa s e
d e m e io s is I
x j
><
Bi
401
Bi r
B|
B1]
B2
4
C ro m tid e s
en g a m e to
C lave:
N N o re c o m b in a n te
N R RN
NN NN
RN RN
RR RR
R R e c o m b in a n te
e n tre lo c u s A y B
Fig. 13-2. Recombinantes nicas y dobles.

Cada cruzamiento incluye dos de las cuatro cromtides de los dos cromosomas homlogos sinapsados. Un cromosoma lleva alelos
en los dos
locus; el otro lleva alelos A 2 y B2. A) Un solo cruzamiento genera dos cromtides recombinantes y dos no recombinantes (50% de recombinantes). B) Los
tres tipos de cruzamiento doble ocurren en proporciones aleatorias, de tal forma que el efecto promedio de un cruzamiento doble es suministrar 50% de
recombinantes.
13.1.3 Las funciones de mapeo definen la relacin

entre la fraccin de recombinacin y la
distancia gentica
w = 1/4 ln (1 + 2 0 )/ (1 -2 0 )
o
0 = 1/2 [exp (4w) 1] / [exp (4w) + 1]
Debido a que las fracciones de recombinacin nunca exceden de

0.5, no son tan slo aditivas a travs de un mapa gentico. Si una
serie de locus A, B, C, ... se localiza a intervalos de 5 cM en un ma
pa, el locus M puede estar a 60 cM del locus A, pero la fraccin de
recombinacin entre A y M no es 60%. La relacin matemtica en
tre la fraccin de recombinacin y la distancia en el mapa gentico
se describe por la funcin de mapeo. Si los cruzamientos sucedie
ron de modo aleatorio a lo largo de un bivalente y no se influyeron
entre s, la funcin de mapeo apropiada es la fu n cin d e Haldane:
En el mapeo de mltiples puntos se requiere una funcin de mapeo

(seccin 13.4) a fin de convertir los datos generales en la fraccin de
recombinacin en un mapa gentico. Broman y Weber (2000) em
plearon un grupo muy grande de datos de enlace con objeto de
estimar la mejor funcin de mapeo para seres humanos. Calcula
ron que la probabilidad de un cruzamiento doble verdadero entre
marcadores d separados cM se aproxima a (0.0114d-0.0154)4.
Para d = 10 cM esto slo funciona en 0.01%. El lector interesa
do debe consultar el libro de Ott (vase las lecturas adicionales)
para un comentario ms amplio sobre funciones de mapeo.
w = 1/2 ln (1 20)
o
6 = 1/2 [1 exp (2w)]
13.1.4 Cuentas de quiasmas y longitud total del mapa
en la que w es la distancia en el mapa y 0 la fraccin de recombi

nacin; como es usual, ln significa el logaritmo de la base e y exp
representa e a la potencia de. Sin embargo, se sabe que la presen
cia de un quiasma inhibe la formacin de un segundo quiasma cer
cano. Este fenmeno se llama interferencia. Existe una diversidad
de funciones de mapeo que hacen posibles diferentes grados de in
terferencia. Una funcin para el mapeo humano que se utiliza con
amplitud es la fu n cin d e Kosambi:
Cada cruzamiento durante la meiosis produce dos cromtides recombinantes y dos no recombinantes y suministra 50% de recombinacin
entre marcadores de flanqueo. Por consiguiente, un cruzamiento con
tribuye con 50 cM a la longitud total del mapa gentico. Al contar los
quiasmas bajo el microscopio y multiplicar el nmero por clulas por
50 es posible estimar la longitud total del mapa en cM. La meiosis
masculina puede estudiarse en biopsias testiculares; la cuenta prome
dio de quiasmas es de 50.6 por clula (Hultn y Lindsten, 1973: s .
402
CAPTULO TRECE
13-3A), si se toma en cuenta una longitud de mapa de 2 530 cM. La

meiosis I femenina se lleva a cabo a las 16 a 24 semanas de la vida fe
tal y es muy difcil observarla, pero en fecha reciente una tcnica nue
va hizo posible contar los quiasmas (Tease y cois., 2002). Se utilizan
anticuerpos fluorescentes para marcar los sitios en que se localiza una
protena, MLH1, que es parte de la maquinaria de recombinacin
(fig. 13-3B). Los quiasmas son ms frecuentes en la meiosis femenina
(lo que se ejemplifica en la regla de Haldane que seala que el sexo heterogamtico tiene la cuenta ms baja de quiasmas). La cuenta autosmica promedio en ovarios de un feto hembra abortado fue de 70.3
y ello proporciona una longitud de mapa de 3 515 cM. Estas longi
tudes de mapa derivadas de manera citolgica pueden compararse con
las mejores estimaciones del mapeo gentico de 2 590 (varn) y 4 281
cM (mujer) (Kong y cois., 2002). Como hecho nico, el cromosoma
Y, fuera de la regin seudoautosmica (seccin 2.3.3), carece de ma
pa gentico porque no est sujeto a sinapsis y cruzamiento durante la
meiosis normal.
13.1.5 Mapas fsicos y genticos: distribucin

de recombinantes
Los mapas fsicos muestran el orden de caractersticas a lo largo del
cromosoma y su distancia en kilobases o megabases; los mapas ge
nticos muestran su orden y la probabilidad de que se separen me
diante recombinacin. Si bien el orden de caractersticas debe ser
igual en ambos mapas, las distancias slo corresponden si la pro
babilidad de recombinacin por megabase de DNA es constante
para todas las localizaciones cromosmicas. De hecho, las proba
bilidades de recombinacin varan en grado considerable segn
sean el sexo y la localizacin cromosmica. Los individuos pueden
variar en cuanto al nmero promedio de cruzamientos por meio
&t
i.
j t
sis y, si es as, poseen entonces tambin diferentes longitudes de

mapa gentico.
Hoy en da que se cuenta con la secuencia del genoma huma
no, es posible situar de forma fsica marcadores microsatlites o
SNP en las bases de datos de secuencias mediante la bsqueda de
compatibles de los cebadores de PCR usados. Por consiguiente, es
posible estimar la distribucin de recombinacin a lo largo de un
cromosoma sea de manera directa bajo el microscopio (fig. 13-3) o
tras relacionar distancias en el mapa gentico con separaciones fsi
cas de marcadores. Ambos mtodos muestran que la recombinacin
no es aleatoria.. Existe ms recombinacin hacia los telmeros de los
cromosomas en varones, en tanto que en mujeres las regiones centromricas tienen recombinantes, pero no en varones (vase fig. 13-4
y Kong y cois., 2002). Como se mencion, la interferencia afecta ei
espaciamiento de recombinantes dobles. Como regla emprica, 1
cM = 1 Mb, pero existen desiertos de recombinacin hasta de 5
Mb de largo con recombinaciones promediadas por sexo menores
de 0.3 cM por Mb, y junglas de recombinacin con > 3 cM por
Mb. La desviacin ms extrema la muestra la regin seudoautos
mica en la punta de los brazos cortos de los cromosomas X y Y (va
se seccin 12.2.7). Los varones tienen un cruzamiento obligatorio
dentro de esta regin de 2.6 Mb, de tal manera que es de 50 cM de
largo. En consecuencia, para esta regin en varones 1 Mb = 19 cM,
en tanto que en mujeres 1 Mb = 2.7 cM.
Trabajos recientes sugieren asimismo que la recom binacin no es
aleatoria a nivel de las secuencias de DNA. Como se describe en la
seccin 15.4.3, los cromosomas humanos consisten al parecer en
bloques conservados, de manera caracterstica de 20 a 50 kb de lar
go, separados por puntos crticos de recombinacin. Alrededor del
I *
0
< **. A
H L
'
Fig. 13-3. Cruzamientos en la meiosis masculina y femenina.

A) Meiosis masculina: espermatocito en metafase I.
Obsrvese el
pareamiento extremo con extremo de los cromosomas
Xy Y Los
quiasmas marcan
las posiciones de los cruzamientos dentro de cada bivalente (flechas). B) Meiosis femenina en paquitena. Los puntos brillantes de anticuerpo MLH1
fluorescente marcan las posiciones de los cruzamientos. Fotografas cortesa del profesor Maj Hultn, Birmingham. A partir de Hultn y Tease (2003),
13.1 i RECOMBINANTES Y NO RECOMBINANTES
403
O cM
A)
O cM
9 6 .5 c M
C ro m o s o m a 13
125 cM
O cM
B)
O cM
C ro m o s o m a 18
9 5 .5 c M
118 cM
O cM
C)
O> cC M
M
i
C ro m o s o m a 21
5 3 .5 c M
6 1 .5 c M
Fig. 13-4. La distribucin de recombinantes es no aleatoria y especfica de sexo.

Hstogramas que ilustran las distribuciones de quiasmas en espermatoctos (azul) y focos MLH1 en oocitos (rojo) en los cromosomas 1 3 ,1 8 y 21.
Cada par de cromosoma est dividido en intervalos de 5% de longitud. Estos patrones de distribucin de cruzamiento tambin se muestran para cada
cromosoma como mapas de recombinacn. Tales mapas destacan los patrones diferentes de nmeros y distribuciones de cruzamiento en clulas
grmenes masculina y femenina y el efecto consiguiente en el mapa de recombnacin. Tomado de Hultn y Tease (2 0 0 3 ), con autorizacin de Nature
Publshing Group.
404
CAPTULO TRECE
O)
co
ce
50
CQ
__I__
100
kb
15 0
oo
Q.
200
Fig. 13-5. La recombinacin se concentra en puntos criticos pequeos.

Distribucin a nivel del DNA de recombinacin en varones en una regin del complejo mayor de histocompatibilidad. El 95% de toda la recombinacin
ocurre en puntos criticos muy localizados. Modificado a partir de Jeffreys y colaboradores (2 0 0 1 ),
Nal Genet.
2 9 :2 1 7-2 22 , con autorizacin de Nature
Publishing Group.
95% de todas las recombinaciones ocurre en estos puntos crticos

de 1 a 2 kb (fig. 13-5; Jeffreys y cois., 2001). Ms an, el examen
detallado de unos cuantos de estos puntos crticos que efectu A. J.
Jeffreys sugiri que la recombinacin siempre se inicia dentro de 10
pb del mismo punto. Infortunadamente, la secuencia de DNA en
estos puntos no tiene ninguna caracterstica especial obvia que ex
plique esta conducta.
13.2
M arcadores genticos
13.2.1 El mapeo de genes de enfermedades humanas

requiere marcadores genticos
Si se considera que la mayora de los genetistas se interesa en las en
fermedades, es conveniente contar con un mapa que muestre el or
den y la distancia de todos los genes patolgicos. La calificacin de
la fraccin de recombinacin entre pares de enfermedades sera una
forma obvia para elaborar este mapa, pero en seres humanos no es
posible e l m apeo enferm edad-enferm edad. Como se observ (fig.
13-1), el mapeo gentico requiere heterocigotos dobles. Las perso
nas heterocigotas para dos enfermedades diferentes son en extremo
raras. Incluso si se encuentran, es probable que no tengan hijos o no
sean adecuadas para anlisis genticos en alguna otra forma. Por es
ta razn, el mapeo gentico humano depende de marcadores. Un
marcador es cualquier carcter mendeliano polim rfico que pu ede uti
lizarse para seguir un segmento cromosmico a travs de una genealoga.
Es til si es posible calificar con facilidad el marcador y usar sin gran
costo material disponible con facilidad (clulas sanguneas en lugar
de una biopsia de cerebro), pero el aspecto crtico radica en que de
be ser polimrfico lo suficiente para que una persona seleccionada

al azar tenga una buena posibilidad de ser heterocigoto. En el re
cuadro 13-1 se resume el desarrollo de marcadores genticos huma
nos, desde los grupos sanguneos hasta la generacin actual de
microsatlites de DNA y polimorfismos de nucletido nico.
El mapeo d e marcadores de enfermedad, si no es un ejercicio efec
tuado a ciegas, requiere mapas estructurales de marcadores. Se ela
boran mediante un mapeo de marcador-marcador. Aunque en teora
es posible detectar enlace entre locus separados 40 cM, la cantidad
de datos necesaria para ello es prohibitiva. Son suficientes 10 meiosis para proporcionar pruebas de enlace si no hay recombinantes,
pero se requeriran 85 meiosis para obtener una prueba igualmen
te potente de enlace si la fraccin de recombinacin fuera de 0.3
(vase recuadro 13-3 para una gua de estos clculos). La obtencin
de suficiente material familiar a fin de estudiar ms de 20 a 30
meiosis puede ser muy difcil para una enfermedad rara. Por consi
guiente, el mapeo exige marcadores separados a intervalos no ma
yores de 10 a 20 cM a travs del genoma. Si se toman en cuenta
las longitudes del genoma antes calculadas y la posibilidad de una
informacin imperfecta (vase ms adelante), se requiere un mni
mo de varios cientos de marcadores. Un logro importante en las
etapas iniciales del proyecto del genoma humano fue generar ms
de 10 000 marcadores microsatlites muy polimrficos y a conti
nuacin colocarlos en mapas estructurales (Broman y cois., 1998).
Estos mapas hicieron posible el notable progreso del mapeo de en
fermedades mendelianas en la dcada de 1990. Los estudios de re
lacin de enferm edades ms recientes (seccin 15.4) necesitan
mapas de marcadores mucho ms densos y esta necesidad la resol
vi el desarrollo de varios millones de marcadores de polimorfis
mo de nucletido nico (SNP).
13.2 j MARCADORES GENTICOS
405
Recuadro 13-1. Desarrollo de m arcadores genticos humanos

Tipo de marcador
Nm. de locus
Caractersticas
Grupos sanguneos
1 9 1 0-19 6 0
-2 0
Quiz se requieran sangre fresca, antisueros raros

No siempre es posible deducir el genotipo por el fenotipo debido a la
dominancia
No es fcil la localizacin fsica
Variantes de movilidad electrofortica de

protenas sricas
1 9 6 0-19 7 5
~30
Quiz se necesiten suero fresco, valoraciones especializadas

No es fcil la localizacin fsica
Por lo general polimorfismo limitado
Tipos de tejido HLA
1 (haplotipo)
19 7 0-
Un grupo enlazado
Muy informativo
Slo puede estudiar para enlace a 6 p 2 1 .3
RFLP de DNA (figs. 7-5A , 7 -6 )

1975-
> 10 5 (potencialmente)
Dos marcadores de alelos, heterocigosidad mxima de 0.5

Inicialmente requera
Southern blotting, en
la actualidad PCR
Localizacin fsica fcil

NVRT de DNA (minisatlites) (fig. 7-5B )
1985-
Muchos alelos, muy informativo

Tipo mediante
Southern blotting

Tiende a agruparse cerca de los extremos de cromosomas
NVRT de DNA (microsatlites) (fig. 7 -7 )
(repeticiones di-, tri- y tetranucletidas)
19 8 9-
Muchos alelos, muy informativo

Puede tipificar mediante PCR multlplex automatizada
Distribuido en la totalidad del genoma
SNP de DNA
(polimorfismos de nucletido nico)
> 4 x 10 6
Menos informativo que microsatlites

Puede tipificarse a muy grande escala mediante equipo automatizado
sin electroforesis en gel
NVRT, nmero variable de repeticiones tndem.
13.2.2 El contenido de informacin de

heterocigosidad o polimorfismo mide el
grado de informacin de un marcador
Para anlisis de enlace se requiere meiosis informativa (vase
recuadro 13-2). Los ejemplos en el recuadro muestran que la
meiosis no es informativa con un marcador determinado si el
padre es homocigoto para el marcador y asimismo en la mitad
de los casos en que ambos padres tienen el mismo genotipo heterocigoto. Para la mayor parte de los propsitos, la heterocigo
sidad media de un marcador (la posibilidad de que una persona
seleccionada de manera aleatoria sea heterocigota) se utiliza co
mo la medida de informatividad. Si hay alelos marcadores
Ai AjjA^... con frecuencias gnicas p\, p 2, p y --, entonces la pro
porcin de personas que son heterocigotas es 1 (p\ + p 2 +
p2 +...) (seccin 4.5.1). Una medicin ms complicada, pero
que se emplea rara vez, el contenido de informacin de poli
morfismo (CIP) , es til para casos en los que una persona es
heterocigota pero no informativa, como la genealoga B en el re
cuadro 13-2.
13.2.3 Los polimorfismos de DNA son la base de todos

los marcadores genticos actuales
Al inicio de la dcada de 1980, los polimorfismos de DNA propor
cionaron, por primera vez, un grupo de marcadores extenso lo sufi
ciente y espaciado de manera adecuada en la totalidad del genoma
para permitir una bsqueda de enlace en todo del genoma. Los mar
cadores de DNA tienen la ventaja adicional de que es posible tipifi
car a todos con la misma tcnica. Ms an, puede determinarse su
localizacin cromosmica mediante el mapeo hbrido por radiacin
(recuadro 8-4) o al investigar la secuencia del genoma humano para
una compatibilidad con el cebador de PCR usado para calificar el
marcador. Esto permite que los mapas genticos basados en DNA se
refieran en forma cruzada con mapas fsicos y evita la situacin frus
trante que surgi cuando se mape por primera vez el gen de la fibrosis qustica (CFTR) buscado durante mucho tiempo. Se estableci
el enlace con un polimorfismo protenico de la enzima paraoxonasa.
pero se desconoca la localizacin cromosmica del gen de sta. El
desarrollo de marcadores de DNA hizo posible iniciar el mapeo s
nico humano de manera formal.
406
CAPITULO TRECE
Recuadro 13-2. Meiosis informativa y no informativa

Una meiosis es informativa de enlace cuando es posible identificar si el gameto es recombinante o no. Considrese la meiosis masculina que produ
ce la contribucin paterna al nio en las cuatro genealogas de abajo. El padre tiene un padecimiento dominante que hered junto con el alelo A, mar
cador. Transmiti este padecimiento a su hija; pero, es posible indicar o no si el espermatozoo era recombinante entre el gen para el trastorno y el
locus marcador?
A> B -
-O
A i A,
A 2A 2
Al A2
B)
A j A*
A, A,
Ai A2
C )B -
-O
Aj A2
A, A 2
A j A,
D> I
-O
A j A
A;l A 4
A 2A 4
A) Esta meiosis
no es informativa: no pueden distinguirse los alelos marcadores en el padre homocigoto. B) Esta meiosis no es informativa: el nio pu
do heredar A, del padre y A2 de la madre, o viceversa. C) Esta meiosis es Informativa y no recombinante: el nio hered A, del padre. D) Esta meiosis es
informativa y recombinante: el nio hered A2 del padre.
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin

(RFLP)
La primera generacin de marcadores de DNA fueron los polimor
fismos de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP). De
manera inicial, estos ltimos se tipificaron tras preparar Southern
blots a partir de productos digeridos de restriccin del DNA de
prueba e hibridarlos con sondas radiomarcadas (vase fig. 7-5). Es
ta tecnologa requiri mucho tiempo, dinero y DNA, y determin
que la investigacin del genoma completo fuera una empresa heroi
ca. Hoy en da, esto representa menos problemas porque los RFLP
suelen tipificarse mediante reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Se amplifica una secuencia que incluye el sitio de restric
cin variable, se incuba el producto con la enzima de restriccin
apropiada y a continuacin se corre en un gel para verificar si se
cort (fig. 7-6). Una gran desventaja es su baja informatividad. Los
RFLP slo tienen dos alelos: el sitio existe o no se encuentra. La heterocigosidad mxima es de 0.5. El mapeo de enfermedades me
diante RFLP es frustrante porque con gran frecuencia una meiosis
fundamental en una familia resulta no informativa.
Minisatlites
Los marcadores minisatlites NVRT (nmero variable de repeticiones
tndem) fueron un gran adelanto. Los NVRT (seccin 7.1.3) tienen
muchos alelos y una heterocigosidad elevada. Casi todas las meiosis son
informativas. Sin embargo, los problemas tcnicos de Southern blotting
y las sondas radiactivas an son un obstculo para el mapeo fcil y los
NVRT no estn difundidos de manera uniforme a travs del genoma.
Microsatlites
El advenimiento de la PCR permiti por fin el mapeo con relativa ra
pidez y facilidad. Los minisatlites son muy largos para amplificarse
bien y por consiguiente los medios estndar para el anlisis de enlace
de PCR son los microsatlites. Se trata en esencia de repeticiones
(CA). Las repeticiones de trinucletidos y tetranucletidos han reem

plazado de forma gradual a las repeticiones de dinucletidos como los
marcadores de eleccin porque proporcionan resultados ms claros.
Las secuencias de repeticin de dinucletidos son en particular pro
pensas a deslizamiento de replicacin durante la amplificacin en
PCR (seccin 11.3.1), de tal manera que cada alelo suministra una es
calera pequea de bandas repetidas en un gel, lo que dificulta su lec
tura (vase fig. 7-8). Se ha consagrado mucho esfuerzo a producir
grupos compatibles de marcadores microsatlites que pueden ampli
ficarse juntos en una reaccin de PCR mltiple, con objeto de pro
porcionar tamaos de alelos no superpuestos poder correrse en la
misma lnea del gel. Con el marcado fluorescente en varios colores es
posible calificar tal vez 10 marcadores en una muestra en una sola l
nea de un gel automatizado.
Polimorfismos de nucletido nico (SNR por sus siglas en

ingls)
Despus de 10 aos de desarrollar cada vez ms marcadores polimrficos, puede parecer molesto que la generacin ms reciente de
marcadores la constituyan los polimorfismos de nucletido ni
co de dos alelos. Incluyen los RFLP comunes, pero tambin poli
morfismos que no parecen crear o suprimir un sitio de restriccin.
La ventaja de los SNP radica en que permiten una genotipificacin
de rendimiento ultraelevado y densidades de marcador altas (Wang
y cois., 1998). Las bsquedas de genes de susceptibilidad a enferme
dades (cap. 15) requieren la calificacin de nmeros enormes de
genotipos con marcadores espaciados de modo muy cercano. No
existen suficientes microsatlites en el genoma para proporcionar la
densidad necesaria para un marcador por 10 kb o menos. Ms an,
los microsatlites se califican mediante electroforesis en gel y ello li
mita el rendimiento. Un consorcio internacional de acadmicos e
industriales cre una base de datos pblica de ms de cuatro millo
nes de SNP (dbSNP, accesible a travs de la pgina web de NCBI)
y se desarrollan mtodos para calificar SNP sin electroforesis en gel
a una escala en extremo grande (seccin 18.4.2).
13.3
13.3
M apeo de dos puntos
13.3.1 No siempre es fcil calificar recombinantes en

genealogas humanas
Una vez que se renen familias en las que se segrega una enfermedad
mendeliana y se tipifican con un marcador informativo, cmo se sa
be cundo se encuentra enlace? Esta pregunta tiene dos aspectos:
MAPEO DE DOS PUNTOS
40"
uno no recombinante. Ya no es posible identificar ms los recom

binantes en forma precisa, incluso si la primera alternativa parece
mucho ms probable que la segunda. La figura 13-6C aade ms
complicaciones an (no obstante, si sta es una familia con una enfer
medad rara, ningn investigador deseara descartarla). Se requiere al
gn mtodo para extraer la informacin de enlace de algn conjunto
de estas familias imperfectas.
1. Cmo es posible encontrar la fraccin de recombinacin?

2. Qu prueba estadstica debe utilizarse para constatar si la frac
cin de recombinacin es significativamente diferente de 0.5, el
valor esperado en la hiptesis nula de no enlace?
13.3.2 El anlisis computadorizado de la calificacin

lod es el mejor medio para analizar genealogas
complejas para enlace entre caracteres
mendelianos
En algunas familias es posible responder la primera pregunta de forma

muy simple al contar recombinantes y no recombinantes. La familia
que se muestra en la figura 13-1 es un ejemplo. Hay dos recombinan
tes en siete meiosis y la fraccin de recombinacin es de 0.28. En la
figura 13-6A se muestra otro ejemplo. El heterocigoto doble que es in
formativo para enlace (individuo IIj en las figuras 13-1 y 13-6A) es de
fase conocida: se sabe qu alelos se heredaron de cul de los padres y
por consiguiente es posible calificar sin ambigedades cada meiosis
como recombinante o no recombinante. En la figura 13-6B, el indi
viduo II] es de nueva cuenta doble heterocigoto, pero en esta ocasin
es de fase desconocida. Entre los hijos de ella puede haber cinco no
recombinantes y un recombinante, o bien hay cinco recombinantes y
En la genealoga que se muestra en la figura 13-6B no es posible iden

tificar sin ambigedad recombinantes y contarlos. Sin embargo, es
posible calcular la probabilidad total de la genealoga, con las presu
posiciones alternativas de que los locus estn enlazados (fraccin de re
combinacin = 0) o no enlazados (fraccin de recombinacin = 0.5).
La relacin de estas dos probabilidades proporciona las posibilidades
de enlace y el logaritmo de las posibilidades es la calificacin lod.
Morton (1955) demostr que las calificaciones lod representan la es
tadstica ms eficiente para valorar genealogas para enlace y deriv
frmulas para proporcionar la calificacin lod (como una funcin de
0) para varias estructuras de genealogas estndar. El recuadro 13-3
muestra la forma en que se lleva a cabo lo anterior para estructuras
A)
B)
Fig. 13-6. Reconocimiento de recombinantes.

Tres versiones de una familia con una enfermedad autosmica dominante, tipificada por un marcador A. A) Todas las meiosis son de fase conocida. Es
posible identificar sin ambigedad IIIH II 5 como no recombinantes y lll6 como recombinante. B) La misma familia pero con fase desconocida. La madre,
ll-t, pudo heredar cualquier alelo marcador A, o A 2 con la enfermedad; por consiguiente, su fase es desconocida. Ilh-llls son no recombinantes y lll6 es
recombinante; o Ilh-llls son recombinantes y lll6 no es recombinante. C) La misma familia despus del rastreo de familiares. Ill7 y lll8 heredaron tambin
el alelo marcador
junto con la enfermedad de su padre -pero no fue posible estar seguro si el alelo A] del padre es idntico por descendiente al alelo
A] en su hermana II,-. Es posible que haya dos copias del alelo A, entre los cuatro alelos marcadores de abuelos. La probabilidad de ello depende de la
frecuencia gnica del alelo A). En consecuencia, esta genealoga contiene informacin de enlace, que es problemtico extraer.
408
CAPTULO TRECE
Recuadro 13-3. Calculo de calificaciones lod para las familias de la figura 13-6
Dado que los locus estn en verdad enlazados, con fraccin de recom
binacin 0 , la probabilidad de que una meiosis sea recombinante es
y la de que sea no recombinante es
- .
Si los locus de hecho no estn enlazados, la probabilidad de que una

meiosis sea recombinante o no es 1 / 2 .
Familia B:
Ib es de fase desconocida.
Si ella hered At con la enfermedad, hay cinco no recombinantes y una
recombinante.
Si ella hered A 2 con la enfermedad, hay cinco recombinantes y una no
recombinante.
Familia A:
La probabilidad total es 1/2[(1 - 0 ) 5 -0 /(1 /2 )6] + 1 /2 [ ( 1 - 0 ) - O 5/(1 /2 )6].

Ello permite cualquier fase posible, con igual probabilidad previa.
Hay cinco no recombinantes y un recombinante.

La probabilidad total, dado el enlace, es (1 - 0 ) 5 -0.
La probabilidad, dado el no enlace, es (1 /2 )6.
La calificacin lod,
La relacin de probabilidad es (1 - 0 ) 5 -0 /(1 /2 )6.
La calificacin lod, Z, es el logaritmo de la relacin de probabilidad.
0
Z
Familia C:
O
- infinito
0.1
0 .5 7 7
0.2
0 .6 23
0.3
0 .5 09
0 .4
0 .2 99
0.5
0
simples. Dado que se trata de una funcin de la fraccin de recombi

nacin, se calculan las calificaciones lod para una gama de valores 0.
La fraccin de recombinacin ms probable es el valor al cual es m
xima la calificacin lod. En un grupo de familias, la probabilidad to
tal de enlace es el producto de las probabilidades en cada familia
individual y por consiguiente las calificaciones lod (puesto que son lo
garitmos) pueden aadirse a travs de familias.
Es difcil calcular la calificacin lod completa para la familia de la
figura 13-6C. Con la finalidad de calcular la probabilidad de que III7
y Illg sean recombinantes o no recombinantes, es necesario tomar en
cuenta las probabilidades calculadas para cada posible genotipo de
Ii, I2 y II3, ponderadas por la probabilidad de ese genotipo. Para I
e I2, las probabilidades de genotipo dependen de las frecuencias gnicas y los genotipos observados de II], III7 y III8. A continuacin
se calculan las probabilidades de genotipo para II3 mediante reglas
mendelianas simples. Con excepcin de los casos muy simples, el
anlisis de enlace humano depende por completo de programas de
computadora que incluyen algoritmos para manejar estos rboles
de ramificacin de probabilidades de genotipos, dados los datos de
genealoga y un cuadro de frecuencias gnicas.
13.3.3 Calificaciones lod de + 3 y -2 2 son los criterios

para enlace y exclusin (para una prueba nica)
El resultado del anlisis de enlace es un cuadro de calificaciones
lod en diversas fracciones de recombinacin, al igual que dos cua
dros en el recuadro 13-3. Los lod positivos proporcionan pruebas
en favor de enlace y los lod negativos son pruebas contra l. Ob
srvese que slo las fracciones de recombinacin entre 0 y 0.5 son
significativas y que todas las calificaciones lod son cero a 0 = 0.5
(debido a que en este caso miden la relacin de dos probabilidades
idnticas y log10(l) = 0). Los resultados pueden graficarse para
trazar curvas como las de la figura 13-7.
As, en relacin con las dos preguntas que se plantearon al ini
cio de esta seccin, es factible ver ahora que la fraccin de recom bi
nacin ms probable es aqulla en la que la calificacin lo d es ms alta.
Si no hay recombinantes, la calificacin lod es mxima a 0 = 0. Si
hay recombinantes, Zllega al mximo en la fraccin de recombina
cin ms probable (0.167 = 1/6 para la familia de la figura 13-6A,
pero difcil de predecir para la figura 13-6B).
infinito
Z, es
el logaritmo de la relacin de probabilidad.
0.1
0.2
0 .3
0.4
0.5
0 .2 7 6
0 .3 23
0 .2 2 2
0 .0 7 6
En este punto los investigadores cambiaron a la computadora.
La segunda pregunta se vincula con el umbral de significancia.

En este caso la respuesta es sorprendente a primera vista. Z =3.0 es
el umbral para aceptar enlace, con un 5% de posibilidad de error.
Puede rechazarse enlace si Z < 2.0. Valores de Centre 2 y +3
no son concluyentes. Para la mayor parte de las estadsticas, se uti
liza p < 0.05 como el umbral de significancia, pero Z = 3.0 corres
ponde a 1 000:1 razones de probabilidades [logio(l 000) = 3.0], El
motivo por el que se elige este umbral tan rgido se basa en la im
probabilidad inherente de que dos locus, elegidos al azar, deban en
lazarse. Con 22 pares de autosomas de los cuales elegir, no es
probable que se localizaran en el mismo cromosoma (sintenia) e,
incluso si estuvieran, los locus bastantes separados en un cromoso
ma no estn enlazados. El sentido comn indica que si algo es in
herentemente improbable, se requiere una prueba potente para
convencerse de que es cierto. Este sentido comn puede trasladar
se a una calculadora bayesiana (vase recuadro 13-4), que mues
tra que la probabilidad 1 000:1 corresponde de hecho precisamente
al p - 0.05 umbral convencional de significancia. La misma lgica
sugiere un umbral lod de 2.3 para establecer enlace entre un carc
ter ligado a X y un marcador del cromosoma X (probabilidad pre
via de enlace = 1/10).
Es difcil deducir de manera analtica los intervalos de con
fianza, pero un intervalo de apoyo aceptado con amplitud se ex
tiende a fracciones de recombinacin en las que la fraccin lod es
una unidad abajo del valor mximo (la regla lod-1). Por consi
guiente, la curva 2 en la figura 13-7 proporciona prueba acepta
ble de enlace (Z > 3) con la fraccin de recombinacin ms
probable de 0.23 y un intervalo de apoyo de 0.17 a 0.32. La cur
va es ms aguda cuanto mayor es la cantidad de datos, pero en ge
neral los picos son muy amplios. Es importante recordar que las
distancias de mapas genticos humanos suelen ser estimaciones
muy imprecisas.
Las calificaciones lod negativas excluyen enlace para la regin en
la que Z < 2. La curva 3 en la figura 13-7 excluye la distancia de
12 cM en cualquiera de los lados del marcador. Si bien los mapas
gnicos esperan una calificacin lod positiva, las exclusiones no de
jan de tener valor. Indican en dnde no se encuentra la enfermedad
(mapeo de exclusin). Ello puede descartar un posible gen candi
dato y si se elimina suficiente genoma, slo pueden permanecer
unas cuantas posibles localizaciones.
13.4 | EL MAPEO DE MLTIPLES PUNTOS ES MS EFICIENTE QUE EL MAPEO DE DOS PUNTOS
409
13.3.4 Para investigaciones en el genoma completo

debe utilizarse un umbral de significancia de
toda la extensin del genoma
En estudios de enfermedades se tipifican familias marcador por
marcador hasta obtener lod positivos. El umbral apropiado para
significancia es una calificacin lod, de tal manera que slo hay una
posibilidad de 0.05 de que surja un resultado falsopositivo en cual
quier parte durante una bsqueda del genoma completo. Como se
muestra en el recuadro 13-4, una calificacin lod de 3.0 correspon
de a una significancia de 0.05 en un punto aislado. Pero si se utili
zaron 50 marcadores, la posibilidad de un resultado falso positivo es
mayor en comparacin con emplear slo un marcador. Un proce
dimiento rgido (correccin de Bonferroni) es multiplicar el valor p
por 50 antes de valorar su significancia. El umbral de calificacin
lod para un estudio en el que se utilizan n marcadores sera 3 +
log(n), que es una calificacin lod de 4 para 10 marcadores, 5 para
OO, y as de forma sucesiva. Sin embargo, lo anterior es en exceso
riguroso. Los datos de enlace no son independientes: si se excluye
una localizacin, entonces aumenta la probabilidad previa de que
el carcter se mapee en otra localizacin. Se ha propuesto el umbral
para un nivel de significancia en la extensin d el genom a de 0.05, pe
ro una respuesta que se acepta con amplitud para caracteres mendelianos es de 3.3 (Lander y Schork, 1994). Para caracteres no
mendelianos, vase la seccin 15.3.4. En la prctica, calificaciones
lod menores de 5, sea con un marcador o muchos de ellos, deben
considerarse provisionales.
13 .4
Fig. 13-7. Curvas de calificacin lod.

Grficas de calificacin iod contra la fraccin de recombinacin de un
El m apeo de m ltiples puntos

es m s e fic ie n te que el m apeo
de dos puntos
13.4.1 El enlace de mltiples puntos puede localizar

un locus de enfermedad en un marco estructural
de marcadores
grupo hipottico de experimentos de enlace. Curva 1, prueba de enlace

(Z > 3) sin recombinantes. Curva 2, prueba de enlace (Z > 3), con
fraccin de recomblnacin ms probable de 0.23. Curva 3, enlace ex
cluido (Z < - 2 ) para fracciones de recombinacin abajo de 0.12; no
El anlisis de enlace puede ser ms eficiente si se analizan de for

ma simultnea datos para ms de dos locus. El anlisis m ultilocus
es en especial til para establecer el orden cromosmico de un
concluyente para fracciones de recomblnacin ms grandes. Curva 4,

no concluyente en todas las fracciones de recomblnacin.
Se ha discutido la probabilidad de que dos locus estuvieran enlazados (la probabilidad previa de enlace), pero se aceptaron con amplitud estimados al
rededor de uno en 50.
Hiptesis
Locus enlazados
Locus no enlazados
(fraccin de recombinacin = 0 )
................ ....... *.... 11........ . ........ . ................ ..... ......
'
(fraccin de recombinacin = 0.5)
-------------- ------- ----- ------------ ------ ------------------
Probabilidad previa
1 /5 0
4 9 /5 0
Probabilidad condicional: 1 000:1 probabilidades de enlace

(calificacin lod Z (0) = 3.0 )
1 000
Probabilidad de unin (previa x condicional)
20
Debido a la probabilidad previa baja de que dos locus elegidos de modo aleatorio estuvieran enlazados, se requirieron pruebas de 1 000:1 probabilida
des en favor de enlace a fin de dar probabilidades totales de 20:1 en favor de enlace. Esto corresponde al umbral convencional p = 0 .0 5 de signifi
cancia estadstica. El clculo es un ejemplo del uso de la frmula de Bayes para combinar probabilidades (vase recuadro 18 -4 y fig. 18-1 5 ). Vase
tambin el texto para la descripcin de la calificacin lod.
410
CAPTULO TRECE
grupo de locus enlazados. Los genetistas experimentados utilizan

desde hace mucho tiempo cruzam ientos d e tres puntos para este
propsito. La clase recombinante ms rara es la que requiere una
doble recombinacin. En el cuadro 13-1 es aparente de inmedia
to el orden gnico A-C-B. Este procedimiento es ms eficiente
que la estimacin de las fracciones de recombinacin para inter
valos A-B, A-C y B-C por separado en una serie de cruzamientos
de dos puntos. Como ideal, en un anlisis de enlace debe selec
cionarse para todo el genoma y se emplea el grupo de datos com
pleto para calcular la probabilidad en cada localizacin a travs
del genoma.
Una segunda ventaja del mapeo de mltiples locus en seres hu
manos es que ayuda a superar los problemas originados por la informatividad limitada de marcadores. Algunas meiosis en una
familia podran ser informativas con el marcador A y otras no in
formativas para A pero s con el marcador B cercano. Slo los an
lisis de enlace simultneos de la enfermedad con marcadores A y B
extraen la informacin completa. Esto es menos importante para
los mapeos en los que se utilizan marcadores microsatlites muy in
formativos en lugar de RFLP de dos alelos, pero resurge cuando se
usan polimorfismos de nucletido nico (SNP).
13.4.2 Mapas de marco estructural marcador: familias

CEPH
Es en particular til la potencia de mapeo de mltiples puntos pa
ra ordenar locus a fin de elaborar mapas d el marco estructural mar
cador. Sin embargo, la ordenacin de locus en estos mapas no es
un problema corriente. Hay n\l2 posibles rdenes para marcado
res n y los mapas actuales tienen cientos de marcadores por cro
Cuadro
1 3 -1 .
Ordenacin gnica mediante cruzamientos

en tres puntos.
Clase de
descendencia
Posicin de la
recombinacin (x)
Nmero
ABC/abc
No recombinante
853
abc/abc
ABc/abc
(A, B C ) - x - C
abC/abc
Abc/abc
A x (B, c)
47
B - x - ( A , C)
95
aBC/abc
AbC/abc
aBc/abc
Se estableci un cruzamiento entre heterocigotos de ratones y tres lo
cus enlazados (ABC/abc) y triples homocigotos (abc/abc). La clase
ms rara de descendencia es aquella cuya produccin requiere dos
cruzamientos. De los 1 0 0 0 animales, 142 (95 + 4 7 ) son recombi
nantes entre A y B, 52 (47 + 5) entre A y C y 100 (95 + 5 ) entre B
y C. Slo cinco animales son recombinantes entre A y C pero no
entre A y B, de tal manera que stos deben tener cruzamientos do
bles, A - x - C - x - B . Por consiguiente, el orden del mapa es A - C - B
y las distancias genticas son aproximadamente
A (5 c M )C (1 0 c M )B.
mosoma. Antes de completar la secuencia del genoma humano,

esto result una dificultad notoria para marcadores de mapas. En
ocasiones fue necesario emplear ms computacin inteligente que
fuerza bruta para tener xito en el orden correcto. Incluso sin da
tos de secuencia a gran escala, fue inmensamente til la informa
cin del mapeo fsico. Pueden usarse marcadores que es posible
tipificar mediante PCR como sitios de secuencia marcados (SSM;
recuadro 15-4) y localizarse de forma fsica, sea mediante base de
datos o de modo experimental con hbridos por radiacin (recua
dro 8-4). El resultado es un marco estructural de marcadores fija d o
d e manera fsica.
El mapeo de marcadores de enfermedad adolece de la necesi
dad de utilizar cualquier familia que pueda encontrarse en la que
se segrega la afeccin de inters. Estas familias rara vez poseen es
tructuras ideales. Con gran frecuencia, el nmero de meiosis es in
deseablemente pequeo y algunas son de fase desconocida. El
mapeo marcador-marcador puede evitar estos problemas. Es posi
ble estudiar marcadores en cualquier familia, de tal forma que pue
dan elegirse familias que tienen muchos nios y estructuras ideales
para enlace, como la familia de la figura 13-1. La elaboracin de
mapas de marco estructural marcador se benefici en grado consi
derable por un conjunto de familias (las familias CEPH) reunidas
de manera especfica para este propsito por el Centre dtude du
Polymorphisme Humain (en la actualidad Fondation Jean Dausset)
en Pars. Lneas celulares inmortalizadas de cada individuo asegu
ran una dotacin permanente de DNA y desde entonces se descar
taron muestras confusas y no paternidad al tipificar con muchos
marcadores. Como ejemplo, el mapa CHLC de 1998 (Cooperative Human Linkage Center) se basa en los resultados de la califica
cin de ocho familias CEPH con 8 325 microsatlites, que dieron
por resultado ms de un milln de genotipos (Broman y cois.,
1998).
13.4.3 Mapeo de marcador de enfermedad de mltiples

puntos
Para un marcador de enfermedad el mapeo del punto inicial es el
mapa del marco estructural de marcadores. Esto se da por hecho y
el objetivo es localizar el gen patolgico en uno de los intervalos del
marco estructural. Los programas como Linkmap (parte del paque
te Linkage) o Genehunter (seccin 13.6.2) pueden cortar el locus de
enfermedad a travs del marco estructural marcador tras calcular la
probabilidad total de los datos de genealoga para cada posicin. El
resultado (fig. 13-8) es una curva de calificacin lod comparada
con la localizacin en el mapa. Este mtodo tambin es til para el
mapeo de exclusin: si la curva permanece abajo de una calificacin
lod de 2 a travs de la regin, entonces se excluye el locus de en
fermedad de esa regin.
La naturaleza al parecer cuantitativa de la figura 13-8 es sospe
chosa en alto grado. Las alturas mximas de los picos dependen de
forma crucial de las distancias genticas precisas entre los marcado
res, que slo suelen conocerse en forma muy general. Ms an, nin
guna de las funciones de mapeo (seccin 13.1.3) en programas de
enlace se aproxima incluso a las complejidades reales de la distribu
cin de quiasmas (fig. 13-4). No obstante, a menos que el mapa
marcador sea radicalmente errneo, es an cierto que el pico ms
alto marca la localizacin ms probable. Si el marco estructural
marcador est fijado de modo fsico, como se describi, se estable
ce entonces el medio para buscar el DNA del intervalo candidato e
identificar el gen de la enfermedad.
13.5
13.5
MAPEO FINO MEDIANTE GENEALOGAS EXTENDIDAS Y HAPLOTIPOS ANCESTRALES
Mapeo fino m ediante genealogas

extendidas y haplotipos
ancestrales
La resolucin del mapeo depende del nmero de meiosis -cuanto

ms meiosis se analicen mayor es la posibilidad de que un aconte
cimiento de recombinacin reduzca la regin de enlace-. El tama
o pequeo de la mayor parte de las familias humanas limita de
manera considerable la resolucin factible de alcanzar en estudios
de familias. Pese a ello, algunas veces es posible utilizar estructuras
familiares extendidas para el mapeo de alta resolucin. En algunas
sociedades, las personas estn muy conscientes de los miembros del
grupo y pueden verse a s mismas como parte de estas familias muy
extendidas. Incluso en sociedades en las que las personas limitan su
sentimiento familiar a los relacionados inmediatos, al final cada
uno se vincula y en ocasiones es posible identificar segmentos cromosmicos ancestrales compartidos entre individuos no relacionados.
Las enfermedades autosmicas recesivas conducen por s mismas a
estos anlisis, ya que puede transmitirse un alelo mutado durante
muchas generaciones; para la mayor parte de las enfermedades do
minantes o ligadas a X, el recambio de alelos mutantes es muy r
pido para permitir que se comparta en familias extensas (seccin
4.5.2). Aun si se asume que no es posible identificar a portadores
de una enfermedad recesiva mapeada, el lmite de mapeo lo estable
ce el nmero de personas afectadas relacionadas en grado distante
que heredaron la enfermedad de un ancestro comn.
13.5.1 El mapeo de autocigosidad puede mapear con

eficiencia padecimientos recesivos en familias
endogmicas extendidas
Autocigosidad es un trmino que se emplea para indicar la homocigosidad para marcadores idnticos p o r descendiente heredados de
w
oo
O
J
T
co
co
Q
r-
tco
CM CNJ
55
55
co co
QQ
411
un ancestro comn reciente. Las personas con trastornos recesivos

raros en familias consanguneas tal vez sean autocigotas para mar
cadores relacionados con el locus de enfermedad. Supngase que
los padres son primos segundos; cabra esperar que compartieran
1/32 de todos sus genes por su ancestro comn y un nio sera autocigoto en slo 1/64 de todos los locus. Si ese nio es homocigoto para un alelo marcador particular, ello podra deberse a la
autocigosidad o tal vez a la penetracin en la familia de manera in
dependiente de una segunda copia del mismo alelo. Cuanto ms ra
ro sea el alelo en esta poblacin, mayor es la probabilidad de que la
homocigosidad represente autocigosidad. Para un alelo infinita
mente raro, un nio afectado homocigoto nico que nace de pri
mos segundos genera una calificacin lod de log10(64) = 1.8. Si
existen otros dos hermanos afectados que tambin son homocigotos para el mismo alelo raro, la calificacin lod es de 3.0 (log10(64
X 4 X 4); la probabilidad de que el hermano pudiera heredar el
mismo par de haplotipos parentales, incluso si no se relacionan con
la enfermedad, es de uno en cuatro).
En consecuencia, familias endogmicas muy pequeas pueden
generar calificaciones lod importantes. El mapeo de autocigosidad
es un medio en especial potente si es posible encontrar familias con
mltiples personas afectadas por el mismo padecimiento recesivo
en dos o ms consanguneos enlazados por endogamia. Es posible
hallar familias adecuadas en pases del Medio Oriente en los que es
comn la consanguinidad (endogamia). El mtodo se aplica con
gran xito a la localizacin de genes para la prdida de la audicin
autosmica recesiva (Guilford y cois., 1994; fig. 13-9). La heteroge
neidad de locus extensa (fig. 4-3) determina que sea imposible ana
lizar la prdida de la audicin recesiva en conjuntos de familias de
ncleos pequeos.
Una aplicacin audaz de autocigosidad en una poblacin del
norte de Europa permiti que Houwen y colaboradores (1994) mapearan el raro padecimiento recesivo, colestasis intraheptica recuo^r
T -C O
CMCVJ
COCO
coco
QQ
CO
CO
Fig. 13-8. Mapeo de mltiples puntos en varones.

El eje horizontal es un mapa de marco estructural de marcadores y el eje vertical es la calificacin lod del anlisis de una familia con sndrome de
Waardenburg. La calificacin lod se calcula para cada posible localizacin del locus de enfermedad. Las calificaciones lod descienden hasta valores
muy negativos cerca de la posicin del locus que muestra recombinantes con la enfermedad. El pico ms alto marca la localizacin ms probable: as
probabilidades en favor de esta localizacin se miden por el grado al que sobresale de sus rivales el pico ms alto. Modificado a partir de Hughes y
colaboradores (1994), Nat. Genet. 7:509-512, con autorizacin de Nature Publishing Group.
412
CAPTULO TRECE
MAPEO GENTICO DE CARACTERES MENDELLANOS
rrente benigna, tras recurrir slo a cuatro individuos afectados (dos

hermanos y dos personas al parecer sin nexo) de una villa holande
sa aislada. Estudio finlandeses publicaron asimismo aplicaciones
similares de autocigosidad. Cuanto ms remoto es el ancestro com
partido, menor es la proporcin del genoma que se comparte por
virtud de ese ancestro comn y por consiguiente mayor la impor
tancia de demostrar que los pacientes comparten un segmento
idntico por descendiente. Empero, al mismo tiempo, cuanto ms
remoto es el ancestro comn, mayores son las posibilidades de que
un segundo alelo independiente penetre en la familia desde el exte
rior y, por consiguiente, menor es la probabilidad de que la homocigosidad represente autocigosidad, sea para una enfermedad o los
marcadores. Con un ancestro comn remoto, como en el estudio de
Houwen y colaboradores, todo depende de encontrar a las personas
con un padecimiento recesivo muy raro que son homocigotos para un
alelo marcador raro o, con mayor probabilidad, haplotipo. La poten
cia del estudio de Houwen parece casi milagrosa, pero es importante
recordar que esta metodologa slo se aplica a enfermedades y pobla
ciones en las que la mayora de las personas afectadas es descendiente
de un ancestro comn que era portador.
13.5.2 La identificacin de segmentos ancestrales

compartidos permiti el mapeo de alta
resolucin de los locus para la fibrosis qustica
y el sndrome de rotura de Nijmegen
La fibrosis qustica (FQ) es una enfermedad muy rara en pases no
europeos en donde las estructuras familiares son ms susceptibles de
mapeo de autocigosidad y, por lo tanto, el mapeo de la FQ depende
de ncleos familiares desafortunados raros con ms de un nio afec
tado. Al utilizar lo anterior, se mape la FQen 7q31.2, pero despus
de emplear todas las recombinantes disponibles, la regin candidata
an era demasiado grande (esto sucedi a fines de la dcada de 1980
cuando la clonacin posicional era trabajo de hroes). Al aducir que
las mutaciones de FQ podran ser en su mayor parte muy antiguas
(no slo no hay seleccin contra heterocigotos, sino que con proba
bilidad existe seleccin positiva en su favor; vase seccin 4.5.2), los
investigadores buscaron identificar segmentos cromosmicos ances
trales compartidos en cromosomas de FQ de pacientes no relacio
nados. La reparticin estara indicada por el hallazgo en repetidas
ocasiones del mismo haplotipo de alelos marcadores. El fenmeno se
1
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IV
5 7
2 1
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13
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D2S365
D2S170
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C h r
4 5
D2S305
D2S310
D2S144
D2S171
AFMb346ye5
AFMa052yb5
D2S158
D2S174
D2S365
D2S170
T
/"'l.
7
2
2
3
4
5
2
3
7
5
2 1
4
2
3
6
2
5
1
5
3
6
2
5
2 2
66
5
1
1
5
3
6
2
5
2
6
2
2
2
2
2
1
2
3
3
3
5
1
1
5
3
6
2
5
2
6
5
1
1
5
3
6
2
3
7
6
5
1
1
5
3
6
2
5
2
6
17
b 1lai
2
2
2
2
2
1
2
3
3
3
5
1
1
5
3
6
2
5
2
6
2
2
1
5
3
6
2
3
7
6
h
5
1
1
5
3
6
2
3
7
6
6
3
2
3
2
2
2
6
7
2
1 4
5
1
1
5
3
6
2
3
7
6
5
1
1
5
3
6
2
5
2
6
5
1
1
5
3
6
2
3
7
6
6
1
1
5
3
6
2
5
2
6
5 5
1 1
1 1
5 5
3 3
6 6
2 2
3 5
7 2
Fig. 13-9. Mapeo de autocigosidad.

Una familia endogmica mltiple grande en la que varios miembros sufren sordera congnita profunda recesiva autosmica (smbolos llenos). El color
marca un haplotipo de marcadores del cromosoma 2 que se segrega con la sordera. Los marcadores AFMa052yb5 y D2S158 son homocigotos en
todas las personas afectadas y las no afectadas. El gen de sordera debe encontrarse en alguna parte entre los dos marcadores que flanquean stos
(AFMb346ye5 y D2S174). Modificado a partir de Chab y colaboradores (1996), Hum. Motee. Genet. 5:155-158, con autorizacin de Oxford University
Press.
13.4
EL MAPEO DE MLTIPLES PUNTOS ES MS EFICIENTE QUE EL MAPEO DE DOS P I NTOS
denomina desequilibrio de enlace {DE); vase una descripcin rr.i

amplia en la seccin 15.4. El cuadro 13-2 muestra datos tpicos de
dos marcadores dentro de la regin candidata de fibrosis qusrica
(FQ). Los cromosomas que no son de FQ muestran una seleccin
aleatoria de haplotipos, pero los cromosomas de FQ tienden a llevar
Xi,K2. La relevancia de este hecho radica en que el DE es un fen
meno de lmite muy corto (los segmentos ancestrales compartidos
son cortos por recombinacin recurrente) y en consecuencia sealan
a los investigadores la localizacin exacta del gen de FQ elusivo.
Un gen que se clon en fecha ms reciente, que rige el sndrome
de rotura de Nijmegen (SRN; MIM 251 260), muestra una aplica
cin ms detallada del mismo principio. El SRN es una enfermedad
autosmica recesiva muy rara que se caracteriza por rotura cromosmica, retraso del crecimiento, microcefalia, inmunodeficiencia y pre
disposicin a1 cncer. La causa que se sospecha es un defecto de la
reparacin del DNA. El anlisis de enlace convencional en ncleos pe-
Cuadro 13-2. Relacin allica en la fibrosis qustica.

Alelos
marcadores
Cromosomas
de FQ
Cromosomas
normales
X,,K,
49
Xi ,K2
147
19
X2, K-|
70
x2, k2
25
Datos de la tipificacin para los marcadores de RFLP XV2.C (alelos X,

y X2) y KM19 (alelos K, y K2) en 114 familias britnicas con un nio
con fibrosis qustica (FQ). Los cromosomas que llevan la mutacin de
la enfermedad FQ tienden a llevar el alelo X, de XV2.c y el alelo K2
de KM19. Datos de M nson y cote. (1989).
10
11
74 haplotipos dieron el alelo de enfermedad de SR N
M a rca d o r
413
12
13
14
15
16
--------
___ ___
!
........................
_ _
...................
........................................... 1___ .... ....................... ............. .
Fig. 13-10. Haplotipo ancestral en pacientes europeos con sndrome de rotura de Nijmegen.
Los pacientes con SRN en apariencia no relacionados quiz heredaron con frecuencia un segmento cromosmico en 8p21 de un ancestro comn. Se
definieron los haplotipos mediante 16 marcadores, que se muestran en orden cromosmico a travs de la parte superior del cuadro. El color rosa marca
las localizaciones con alelos idnticos a los del supuesto haplotipo ancestral. Los alelos no ancestrales se codifican en amarillo cuando difieren del alelo
ancestral slo en uno o dos pares de bases y pudieron derivar del alelo ancestral por mutacin; los alelos codificados en gris difieren en grado sustan
cial del alelo ancestral y tal vez resultaron de recombinacin. Los blancos marcan locus en los que no hay datos. Slo en los locus 11 y 12 no existen
alelos recombinantes (gris), lo que sugiere que el gen NBS se mapea en esta posicin. Datos de Varn y cois., 1998.
414
CAPTULO TRECE
quefios de familias localiz el locus del SRN en el cromosoma 8p21,

pero despus de utilizar todos los recombinantes la regin blanco an
no abarcaba 8 Mb entre los marcadores D8S271 y D8S270. A conti
nuacin se tipific a 51 pacientes en apariencia no relacionados y sus
padres para una serie de marcadores microsatlites espaciados a travs
de la regin candidata. Esto gener 102 haplotipos de SRN. De stos,
74 parecan derivados de un haplotipo ancestral comn, quiz de ori
gen eslavo (fig. 13-10). La regin ms conservada incluy los marca
dores 11 y 12 de la figura 13-10, que luego marcaron la probable
localizacin del gen NBS. De modo subsecuente se clon a partir de
esta localizacin un gen que codifica una nueva protena y mostr lle
var mutaciones en personas con sndrome de rotura de Nijmegen.
Como se predijo, todos los enfermos con el haplotipo comn tenan
la misma mutacin, en tanto que los que tenan haplotipos indepen
dientes tuvieron mutaciones independientes (Varn y cois., 1998).
El desequilibrio de enlace (DE) es una herramienta central en
los esfuerzos para identificar genes susceptibles para enfermedades
complejas y se comentan con detalle en la seccin 15.4.
13.6
de localizar un gen de enfermedad, pero puede representar dificul

tades, entre ellas las siguientes:
vulnerabilidad de errores;
lmites computacionales sobre las genealogas que pueden ana
lizarse;
problemas con la heterogeneidad de locus;
lmites sobre la ltima resolucin adquirible;
necesidad de especificar un modelo gentico preciso y detallar
la modalidad de herencia, las frecuencias gnicas y la penetrancia de cada genotipo.
13.6.1 Los errores en la genotipificacin y los

diagnsticos errneos pueden generar
recombinantes falsas
Con marcadores muy polimrficos, los errores comunes como geles de lectura errnea, muestras cambiadas o falta de paternidad,
tienen casi siempre como resultado la adjudicacin de un nio a un
genotipo incompatible con los padres. El programa de anlisis de
enlace se detendr hasta que se corrijan dichos errores. Los errores
que introducen posibles genotipos, pero equvocos, son un gran
problema, en especial el diagnstico equivocado del estado de en
fermedad de una persona. Estos errores incrementan la longitud de
los mapas genticos al introducir recombinaciones falsas: si se asig
n a un nio el alelo parental errneo, parecer ser un recombinante.
El anlisis de calificaci n lod

estn d ar no est exento de
problem as
El anlisis estndar de la calificacin lod es un mtodo sumamente

potente para seleccionar el genoma en segmentos de 20 Mb a fin
Lo cu s
M a rc a d o r 1
C ro m o s o m a s
h o m lo g o s
d e un trip le
h e te ro c ig o to d e
fa s e c o n o c id a
E n fe rm e d a d
F re c u e n c ia
e s p e ra d a
+
02 = 0 -0 5
--1
T ip o d e g a m e to
b2
01 = 0 -0 5
M a rc a d o r 2
G a m e to s
M a p a g e n tic o
1
- -2
-1
- -2
- -1
- -2
-1
--
-- + - -D
- + - -D
- -D - - +
-D -
--1
-2
- -2 - - 1
-1
- -2
N o re c o m b in a n te
- -1
R e c o m b in a n te s
m a rc a d o r-m a rc a d o r
0-1 + 0g
= 0-9
0-1
--
R e c o m b in a n te s
d o b le s a p a re n te s
< 0102
< 0 0025
Fig. 13-11. Los recombinantes dobles aparentes sugieren errores en los datos.
Debido a la interferencia (seccin 13.1.3), la probabilidad de un recombinante doble verdadero con marcadores separados 5 cM es pequea, bastante
menor de 0.05 x 0.05 = 0.0025. Los recombinantes dobles aparentes suelen sealar un error en la tipificacin de los marcadores, un error en el
diagnstico clnico o heterogeneidad de locus, de tal manera que la afeccin en este caso no se mapea en el locus D sino en cualquiera otra parte del
genoma. La mutacin en uno de los genes o mosaicismo germinal son causas ms raras.
13.6
EL ANLISIS DE CALIFICACIN LOD ESTNDAR NO EST EXENTO DE PROBLEMAS
Pueden ayudar anlisis de mltiples locus, ya que las recombinacio

nes falsas aparecen como recombinantes dobles cercanas (fig. 13-11).
Como se observ en la seccin 13.1.3, la interferencia determina
que sean muy poco probables los recombinantes dobles cercanos.
Cuando se elaboran mapas de marco de estructura marcador, las
rutinas para revisar errores valoran la extensin a la que puede acor
tarse el mapa y omitir cualquier resultado de una prueba aislada
(vase Broman y cois., 1998). Se sospechan resultados que alargan
de forma significativa el mapa (es decir, aaden recombinantes).
Los errores en el orden de los marcadores en mapas de marcos
estructurales marcadores solan causar dolores de cabeza (los recombinantes nicos podan parecer dobles), pero este problema se
ha atenuado a medida que se revisan de forma cruzada mapas ge
nticos y la secuencia fsica.
13.6.2 Las dificultades computacionales limitan las

genealogas posibles
Como se coment en la seccin 13.3.2, el anlisis de enlace huma
no depende de programas de computacin que utilizan algoritmos
para manejar rboles de ramificacin de probabilidades de genotipo
y toman en cuenta los datos de genealoga y las frecuencias gnicas.
El Liped fue el primer programa de uso general y el Mlink (parte de
un paquete llamado Linkage) empleaba el mismo algoritmo bsico,
el algoritmo Elston-Stewart, pero lo extenda a datos de mltiples
puntos. El algoritmo Elston-Stewart puede manejar de modo arbi
trario grandes genealogas, pero el tiempo de computacin aumen
ta en grado exponencial con el nmero cada vez mayor de posibles
haplotipos (ms alelos, ms locus, o ambos). Esto limita la capaci
dad de Mlink para analizar datos de mltiples puntos. Se dispone de
un algoritmo alternativo, el algoritmo Lander-Green, capaz de mane
jar cualquier nmero de locus (el tiempo de computacin aumenta
de manera lineal con el nmero de locus), pero tiene problemas de
memoria con genealogas grandes. Este algoritmo se instituy en el
Genebunter (Kruglyak y cois., 1996) y los programas Merlin (Abecasis y cois., 2002). Dichos programas son en particular adecuados
para analizar bsquedas en el genoma completo de genealogas de
tamao moderado.
La teora general del anlisis de enlace se comenta de manera ex
celente en el libro de Ott (vase las lecturas adicionales), en tanto
que el libro de Terwilliger y Ott (vase las lecturas adicionales) est
lleno de consejos prcticos indispensables para cualquiera que lleve
a cabo anlisis de enlace en seres humanos.
13.6.3 La heterogeneidad de locus siempre es un

posible error en el mapeo de genes humanos
Como se comenta en la seccin 4.1.4, es comn que las mutacio
nes en varios genes no enlazados produzcan el mismo fenotipo cl
nico. Puede ser difcil mapear incluso un padecimiento dominante
con familias grandes si hay heterogeneidad de locus dentro del
conjunto de familias estudiadas. Se requirieron aos de trabajo colaborativo para demostrar que la esclerosis tuberosa se deba a mu
taciones en cualquiera de dos locus, TSC1 (MIM 191 100) en
9q34 y TSC2 (MIM 191 092) en 16p 13. Con padecimientos rece
sivos se multiplican las dificultades por la necesidad de combinar
415
muchas familias pequeas. En estos casos, la principal solucin es

el mapeo d e autocigosidad (vase seccin 13.5.1).
G enehunteru H om ogy programas relacionados (vase Terwilliger
y Ott en las lecturas adicionales) pueden comparar la probabilidad
de los datos sobre las suposiciones alternativas de homogeneidad
(todas las familias se mapean para la localizacin que se estudia) y
heterogeneidad (una proporcin a de familias no enlazadas) de lo
cus y suministran un estimado de probabilidad mxima de a.
13.6.4 El mapeo meitico tiene una resolucin limitada

La resolucin de mapeo depende del nmero de meiosis analizado.
Las familias humanas son muy limitadas para este propsito; por
ejemplo, el conjunto de familias CEPH (seccin 13.4.2) puede pro
porcionar una resolucin promedio de slo unos 3 Mb. Una solu
cin consiste en usar espermatozoos. Los varones pueden tener muy
pocos nios para mapeo de alta resolucin, pero producen con efec
tividad cantidades ilimitadas de espermatozoos. Es posible calificar
los espermatozoos individuales como recombinantes o no recombi
nantes para pares de marcadores amplificables mediante reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR). Este mtodo no puede emplearse
para mapear enfermedades, pero suministra al investigador la capa
cidad tcnica necesaria para llevar a cabo el mapeo marcador-marcador a cualquier resolucin deseada. Lien y colaboradores (2000)
describen una aplicacin tpica. La existencia de puntos crticos de
recombinacin muy localizados (fig. 13-5) se comprob tras medir
fracciones de recombinacin tan bajas como 0.00001 (Jeffreys y
cois., 2001). Por supuesto, esto proporciona slo informacin en la
recombinacin masculina.
13.6.5 Con los mtodos descritos en este captulo

no es posible mapear caracteres cuya
herencia no es mendeliana
Los mtodos de anlisis de calificacin lod que se describen en este cap
tulo requieren un modelo gentico preciso. Es necesario especificar la
modalidad de herencia, las frecuencias gnicas y la penetrancia de
cada genotipo. Para los caracteres mendelianos no suele ser un pro
blema proporcionar cifras plausibles. La penetrancia puede requerir
un poco de meditacin. Si no se permite que personas no afectadas
sean posiblemente portadores gnicos no penetrantes, o que las
personas afectadas sean tal vez fenocopias, entonces este individuo
se calificara como recombinante. Por otra parte, si la penetrancia se
establece muy baja hay una disminucin de la potencia para detec
tar enlace, porque se adquiere una hiptesis menos precisa. Sin em
bargo, para enfermedades complejas comunes, como diabetes o
esquizofrenia, los problemas son mucho menos factibles de tratarse.
Cualquier modelo gentico no es ms que una hiptesis -no se
tiene la idea real de las frecuencias o la penetrancia de los genes
de cualquier alelo de susceptibilidad o incluso la modalidad de
herencia-. Lo anterior determina que sea muy razonable aplicar
los mtodos descritos en este captulo a esas enfermedades. No
obstante, la identificacin de los com ponentes genticos d e suscepti
bilidad a enferm edades complejas es en la actualidad una parte im
portan te d e la investigacin en gentica humana. En el captulo 15
se incluyen las formas en que es posible llevar a cabo lo anterior.
416
CAPTULO TRECE
Ott J (1999) Analysis of Human Genetic Linkage, 3a. ed. Johns
Hopkins University Press, Baltimore, MD.
Terwilliger J, Ott J (1994) Handbook for Human Genetic Linkage.

Johns Hopkins University Press, Baltimore, MD.
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CAPTULO
CATORCE
Identificacin d e gen es patolgicos

hum anos
14.1
14.2
Principios y formas de identificar genes patolgicos

Conductas independientes de la posicin para identificar genes
de enfermedad
14.3 Clonacin posicional
14.4 Uso de anormalidades cromosmicas
14.5 Confirmacin de un gen candidato
14.6 Ocho ejemplos ilustran diversas formas de identificar genes
de enfermedades
Recuadro 14-1
Recuadro 14-2
Recuadro 14-3
Recuadro 14-4
Recuadro 14-5
Mapeo de transcritos: mtodos de laboratorio que complementan los anlisis

de bases de datos para identificar secuencias expresadas entre clonas
genmicas
Mapeo de genes del ratn
Indicadores de la presencia de anormalidades cromosmicas
Efectos de la posicin: un peligro latente en la identificacin de un gen
patolgico
Hibridacin genmica comparativa para detectar desequilibrios cromosmicos
submicroscpicos
418 | CAPTULO CATORCE
IDENTIFICACIN DE GENES PATOLGICOS HUMANOS
Un ttulo ms preciso aunque menos elegante para este captulo se

ra identificacin de determinantes genticos de fenotipos huma
nos. Los mtodos que se describen pueden tambin aplicarse a la
identificacin de determinantes de enfermedades o variaciones nor
males, como cabello rojo o ceguera a los colores rojo y verde. No
todos los factores son por fuerza genes, entendidos como secuen
cias que codifican protenas. Por definicin, deben tener un efecto
en el fenotipo, pero puede tratarse de cierta accin indirecta en el
nivel de expresin de un gen que codifica una protena o el proce
samiento o estabilidad de su mRNA. La funcin de la patologa
molecular es comprender por qu una variante de una secuencia de
DNA determinada causa un fenotipo particular (cap. 16); en este
captulo se comenta la forma de identificar la variante correcta.
Es importante no confundir frases como el gen para la fibro
sis qustica, el gen para la diabetes, y otras ms. Muchos genes
humanos se descubrieron por primera vez al investigar las afec
ciones consecutivas a mutaciones en ellos y quiz se requieran
aos antes de comprender su funcin normal. De ah el inters
de esta forma de nominarlos; tampoco se describira el refrigera
dor domstico como un aparato para arruinar los alimentos
congelados. Los genes llevan a cabo una labor en las clulas; si
no se cumple esa funcin, o se realiza de forma errnea, el resul
tado puede ser una enfermedad.
Pocos temas han avanzado con tanta rapidez como la identifica
cin de genes patolgicos en seres humanos. Antes de la dcada de
1980 se haban reconocido muy pocos genes humanos como el lo
cus de enfermedad. Los escasos xitos iniciales incluyeron unas
cuantas anormalidades con una base bioqumica conocida en la que
fue posible purificar el producto gnico. En la dcada de 1980 los
adelantos tecnolgicos del DNA recombinante hicieron posible
una nueva conducta, que en ocasiones recibi el errtico nombre de
gentica inversa. El nmero de genes de enfermedades reconoci
do comenz a aumentar y estos xitos iniciales fueron en verdad he
roicos, ganados con esfuerzo. Con el advenimiento de la PCR para
estudios de enlace y seleccin de mutaciones esto se facilit mucho
ms. En la actualidad, cuando los proyectos del genoma humanos
y otros permiten disponer de una vasta gama de recursos, la capa
cidad para identificar el gen de una enfermedad mendeliana depen
de casi por completo de contar con las familias adecuadas. No
obstante, an es muy difcil reconocer factores que confieren sus
ceptibilidad a trastornos complejos comunes.
14.1
Principios y form as de id en tificar

genes patolgicos
Existen muchas formas diferentes de identificacin (fig. 14-1), pero

todos los caminos convergen en un gen candidato. De una manera u
otra, se reconoce un gen candidato y despus, para confirmar la hi
ptesis, el investigador lo selecciona para mutaciones en pacientes
con la afeccin.
Los genes candidatos pueden identificarse sin referencia a su lo
calizacin cromosmica (seccin 14.2); empero, ms a menudo se
seala primero una regin cromosmica y luego se identifican los
genes candidatos que se hallan dentro de esa regin (seccin 14.3).
Hoy en da, con la disposicin de un buen catlogo (aunque in
completo) de todos los genes humanos, se facilita en grado notorio
la labor de reconocer candidatos, aunque todava puede ser muy la
borioso trabajar con base en una lista de candidatos y buscar mu
taciones.
La informacin posicional reduce la lista de posibles candidatos

de un total de 300 000 genes humanos a tal vez unos 10 a 30 en una
regin candidata. Este hecho es relevante porque a pesar de la dili
gencia con la que se intenta adivinar los probables genes, en la ac
tualidad la capacidad para llevarlo a cabo es muy limitada. Una y
otra vez, cuando por fin se reconoce un gen de enfermedad, an es
un gran misterio la razn por la que las mutaciones provocan esa
anormalidad particular. Por qu la prdida de la funcin de la pro
tena FMR1, que participa en el transporte de RNA del ncleo al ci
toplasma, causa retraso mental y macroorquidismo (sndrome de X
frgil, MIM 309 550)?, por qu ciertas mutaciones en la protena
de enlace TATA (vase seccin 1.3.4) producen ataxia espinocerebelosa (AEC17; cuadro 16-6)?
14.2
Conductas independientes
de la posicin para id en tificar
genes de enferm edad
Desde el punto de vista histrico, los primeros genes de enferme

dades se identificaron mediante mtodos independientes de la po
sicin, tan slo porque no exista informacin de mapeo y no se
dispona de tcnicas para generarla. En estas circunstancias, el can
didato deba sugerirlo el conocimiento del producto gnico: globina p$ para la enfermedad de clulas falciformes; hidroxilasa de
fenilalanina para fenilcetonuria, y as de modo sucesivo. Hoy en
da, los estudios que provienen de una direccin bioqumica o bio
lgica celular pueden todava identificar productos protenicos de
genes desconocidos. Se requiere algn mtodo para pasar de la pro
tena al DNA.
14.2.1 Identificacin de un gen de enfermedad por el

conocimiento del producto protenico
Las tcnicas protenicas modernas permiten identificar o secuenciar
de modo parcial cantidades incluso muy pequeas de una protena
mediante espectrometra de masa (Mann y cois., 2001 y seccin
19.4.2) y microsecuenciacin qumica (Bartlett, 2001). Si es posi
ble resolver la secuencia del cDNA que codifica esos aminocidos,
es factible sintetizar una sonda oligonucletida y utilizarla para se
leccionar genotecas a fin de recuperar el cDNA. El problema es la
degeneracin del cdigo gentico casi todos los aminocidos pue
den codificarse por uno de varios codones-. La sonda debe ser un
oligonucletido degenerado, un conjunto de todas las posibles se
cuencias, seleccionado para que sea compatible con una parte de la
secuencia de aminocidos en la que el nmero de posibles permu
taciones no es demasiado grande. Debido a que slo uno de los oligonucletidos de la mezcla corresponde a la secuencia autntica, es
importante conservar bajo el nmero de diferentes oligonucletidos para incrementar la posibilidad de identificar el blanco correc
to. En este caso son muy tiles el triptfano y la metionina, ya que
slo tienen un codn. Se evitan tanto como sea posible la arginina,
leucina y serina, que poseen seis codones cada una.
La seleccin de una genoteca puede ser tediosa cuando se emplea
una sonda degenerada, dado que los resultados se influyen en grado
considerable por las condiciones de la hibridacin. Una alternativa
ms rpida consiste en usar oligonucletidos degenerados de forma
parcial como cebadores de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Es posible reducir el nmero de permutaciones factibles al
ligar el cDNA blanco a un vector y utilizar un cebador especfico de
14.2
CONDUCTAS INDEPENDIENTES DE LA POSICIN PARA IDENTIFICAR GENES DE ENFERMEDAD
B1
A1
C1
H o m lo g o
c a n d id a to
m apeado?
R eg i n
c ro m o s o m ic a
c a n d id a ta ?
R evisar bases
d e dato s para
genes
L o c a liza d o
co n xito?
C2
'
D2
D3
Id e n tific a r
n u e vo s g e n e s
hum anos
P o s ib le
g en
c a n d id a to
B4
Pensar otra
vez sobre el
modo de herencia,
heterogeneidad
Clonar los
puntos de rotura
cromosmicos
D eleciones o
translocaciones
crom osm icas
>f
E2
H o m lo g o
c a n d id a to
c lo n a d o ?
E1
>
J J
B3
A3
D1
M a p eo gentico:
bsqued a del
genom a
B2
R eu n ir
fam ilia s
p a ra m a p e o
419
D4
Se caracteriz
por
com pleto?
E3
Pensar otra
. vez sobre
genes candidatos:
ir a A3, B2, D3
R e s o lv e r la
s e c u e n c ia y
e s tru c tu ra
c o m p le ta s
C5
Organismos
modelo
Bsqueda en
base de datos
E5
D5
R eu n ir a
p a c ie n te s no
re la c io n a d o s
B uscar
m u ta c io n e s
Informacin
clnica
Trabajo de
laboratorio
Fig. 14-1. Forma de identificar un gen de enfermedad humana.
Se encontraron
mutaciones
patognicas?
________________________
No existe una va nica de xito, pero el paso fundamental consiste en llegar a un gen candidato factible, que a continuacin puede estudiarse para mu
taciones en la persona afectada. Obsrvese la interrelacin entre el trabajo clnico, el trabajo de banco de laboratorio y el anlisis por computadora. La
investigacin de bases de datos es cada vez ms crucial a medida que se acumula informacin de proyectos de genomas.
vector y otro especfico de protena degenerada. Sin embargo, es ne

cesaria cierta suerte para obtener el producto de la PCR deseado, en
lugar de ninguno o de una revoltura de productos irrelevantes.
Una va alternativa, si se dispone de la protena aun en cantida
des diminutas, supone elaborar un anticuerpo a la protena y utili
zarlo para encontrar el gen. Desde el ao de 1982 se recuper el
mRNA que codifica a la hidroxilasa de fenilalanina mediante inmunoprecipitacin de polisomas que sintetizaron la protena en un
sistema sin clulas (Robson y cois., 1982). Hoy en da es posible
crear una genoteca de expresin de cDNA al clonar cDNA man

comunado en un vector de expresin (seccin 5.6.1). Las clulas
husped que contienen clonas con el gen deseado deben producir
la protena, o cuando menos partes de ella, y puede identificarse
tras seleccionar filtros de colonias de la genoteca con un anticuer
po apropiado. En este caso, todo depende de la especificidad del
anticuerpo y la esperanza de que la protena no sea txica para la
clula husped. La exhibicin de ago (seccin 5.6.2) perfeccionara
el mtodo alternativo.
420
CAPTULO CATORCE
14.2.2 Identificacin del gen patolgico a travs de un

modelo animal
Muchos genes de enfermedades humanas se identificaron con ayu
da de modelos animales, si bien casi siempre despus de revisar la
informacin posicional. Es posible que un mutante de ratn y una
afeccin humana similar en sentido fenotpico se mapeen en las lo
calizaciones cromosmicas correspondientes (mediante la Parrilla
Oxford, vase fig. 14-7). A continuacin, si se clona el gen del ra
tn, su homlogo humano se constituye en un candidato natural.
De manera alternativa, se identifica en el ratn un gen patolgico
y en seguida se asla el homlogo humano; ste puede mapearse
mediante hibridacin de fluorescencia in situ (seccin 2.4.2) y se
transforma en un gen candidato para cualquier mapeo de enferme
dad en esa localizacin. sta es la manera en que se identific el gen
M ITFcomo causa del sndrome de Waardenburg tipo 2 (MIM 193
510; Hughes y cois., 1994).
Es raro que un gen reconocido en un modelo animal se pruebe
de forma directa en pacientes humanos sin ninguna confirmacin
posicional que indique que se trata de los individuos apropiados
para el estudio, pero uno de estos casos es SOXIO. Este gen se
identific mediante laboriosa clonacin posicional del ratn con
mutacin dom inante de megacolon (Dom). Los ratones Dom son un
modelo de enfermedad de Hirschsprung humana que se ha estudia
do durante mucho tiempo (seccin 15.6.2). Los sujetos con una
combinacin de enfermedad de Hirschsprung, anormalidades pig
mentarias y prdida de la audicin (sndrome de Waardenburg ti
po IV, SW4, MIM 277 580) se asemejaron de manera especial a los
ratones. El sndrome de Waardenburg tipo IV (SW4) es muy raro
y en condiciones normales ocurre en familias muy pequeas, lo que
imposibilita su mapeo, de tal manera que se estudi un grupo de
pacientes con esta afeccin para mutaciones de SOXIO sin ningn
conocimiento previo del sitio en que podra mapearse la anormali
dad. El intento reditu beneficios cuando se encontraron mutacio
nes en SOXIO, aunque no en todos los individuos (Pingault y cois.,
1998).
14.2.3 Identificacin de un gen de enfermedad

mediante el conocimiento de la secuencia
de DNA independiente de la posicin
Por lo regular, esto surge sobre todo cuando el investigador consi
dera los trastornos que pueden atribuirse a mutaciones de un gen
particular conocido. Los candidatos independientes de la posicin
tambin se generan mediante experimentos de arreglos de expre
sin, en los cuales se comparan muestras de mRNA de pacientes y
testigos para crear una lista de genes cuya expresin est alterada en
la enfermedad.
Definir la
regin
candidata
Obtener clonas
de todo el DNA
de la regin
Una aplicacin interesante del conocimiento de la secuencia del

DNA independiente de la posicin es el intento de clonar genes que
contienen repeticiones expandidas de trinucletidos novedosas. Co
mo se muestra en la seccin 16.6.4, stas ocasionan varios trastornos
neurolgicos hereditarios. Con frecuencia, tales padecimientos mues
tran anticipacin, es decir, la afeccin se presenta a una edad ms
temprana y con mayor gravedad en generaciones sucesivas. Si una
anomala en investigacin muestra cualquiera de estas caractersticas,
merece la pena seleccionar el DNA de los sujetos afectados para ex
pansiones repetidas de tripletos. El mtodo de deteccin de expansin
repetida de Schalling y colaboradores (1993) permite detectar repeti
ciones expandidas en DNA genmico no fraccionado de personas
afectadas y se han desarrollado mtodos para clonar cualquier repeti
cin expandida reconocida (Koob y cois., 1998). Este mtodo se em
ple en una forma por completo independiente de la posicin a fin de
identificar una nueva expansin repetida que participa en una forma
de ataxia espinocerebelosa (AEC8) (Koob y cois., 1999).
14.3
Clonacin posicional
En la clonacin posicional se identifica un gen patolgico sin co

nocer nada, excepto su localizacin cromosmica aproximada. El
primer xito con este mtodo fue el reconocimiento del gen para la
enfermedad granulomatosa crnica ligada a X (Royer-Pokora y cois.,
1985). Un campo de prueba importante para los mtodos de clo
nacin posicional fue la distrofia muscular de Duchenne (DMD,
MIM 310 200). Aos de investigacin cuidadosa de los cambios
histopatolgicos en el msculo afectado haban fracasado para re
velar la base bioqumica de esta afeccin (DMD). Al inicio de la
dcada de 1980 varios grupos compitieron para clonar el gen de
DMD mediante diferentes conductas. El trabajo pionero de stos,
que venci dificultades tcnicas formidables para clonar un gen sin
precedente, fue tal vez la mayor inspiracin para casi todos los es
fuerzos subsecuentes de clonacin posicional. Este trabajo lo revi
saron bien Worton y Thompson (1988).
La conclusin satisfactoria de este trabajo en 1986 marc el ini
cio de una nueva era de triunfo para la gentica molecular huma
na. Se aislaron uno tras otro los genes subyacentes de trastornos
graves, como la fibrosis qustica, enfermedad de Huntington, en
fermedad poliqustica del rin del adulto y cncer colorrectal fa
miliar. La lgica de la clonacin posicional sigue el esquema que se
indica en la figura 14-2. Sin embargo, antes de disponerse de los
mapas marcadores, las clonas y secuencias actuales, la clonacin po
sicional poda ser una labor desesperadamente difcil. Hacia 1995
slo se haban identificado con este mtodo alrededor de 50 genes
de enfermedades hereditarias. La naturaleza frustrante de la clona
cin posicional la resume un investigador en la figura 14-3.
Identificar todos
los genes en
la regin
Prioridad a la
seleccin de
mutacin
Estudiar genes
candidatos
para mutaciones en
personas afectadas
Fig. 14-2. Lgica de la clonacin posicional.

La figura ilustra la progresin lgica de la clonacin posicional; empero, hasta que se dispuso de los datos de secuencia y los mapas marcadores de al
ta resolucin actuales, los investigadores intentaron todas las formas de mtodos abreviados para reducir la labor de clonacin posicional pura.
14.3
CLONACIN POSICIONAL
421
R egi n c a n d id a ta
La ta M ara es
una fenocopia. Tres
m eses perdidos
y adicin d e 1 M b
al intervalo.
El c o n tig u o
tie n e un orificio.
A a d ir o tros
tre s m eses.
B uen in te n to
p e ro s te es un
p o lim o rfis m o
b e n ig n o . 6 5 ex o n e s
m s p a ra seleccio n ar.
M u y m a l, g en
err n e o : seis
g e n e s m s p a ra
estudiar. O tro s
seis m e se s.
El gen
Fig. 14-3. Va difcil de la regin candidata al gen.

Observacin de un investigador de las frustraciones de una clonacin posicional. Cortesa de Richard Smith, University of lowa.
14.3.1 El primer paso consiste en definir la regin

candidata tanto como sea posible
La dificultad de la clonacin posicional depende en buena medida
del tamao de la regin candidata, de tal manera que la primera
prioridad es reducirlo cuanto ms sea posible. Para anomalas mendelianas, lo anterior depende en particular del nmero de meiosis
disponibles para estudio. El lmite de resolucin se alcanza cuan
do se mapea el ltimo recombinante entre marcadores espaciados
de modo cercano. Esto se decide tras inspeccionar haplotipos en lu
gar del anlisis por computadora (fig. 14-4). Al emplear la regla
emprica de 1 cM = 1 Mb (seccin 13.1.5), un conjunto de fami
lias con 100 meiosis informativas puede localizar una enfermedad
mendeliana en una regin candidata de 1 Mb.
Cuando las recombinaciones aisladas definen los lmites de la re
gin candidata, es importante considerar las posibles causas de error
(seccin 13.6.1). Son imprescindibles diagnsticos clnicos meticu
losos. Los recombinantes esenciales son ms seguros si ocurren en
personas no afectadas de modo ambiguo (un individuo no afectado
podra ser portador de un gen no penetrante). Los recombinantes
dobles aparentes son sumamente sospechosos. En ocasiones, a pe
sar de las buenas calificaciones lod positivas, parece haber recombi
nantes en los que se intentaron todos los marcadores. Muchas veces
esto indica que una de las familias en el estudio no se mapea en esa
regin. De manera alternativa, es posible que los marcadores estn

ordenados de manera incorrecta en el mapa gentico.
Para fenotipos no mendelianos, el anlisis de enlace es mucho
menos preciso y las regiones candidatas son de forma caracterstica
de 20 cM o ms (cap. 15). Es demasiado grande para buscarse sin
indicios adicionales y por esa razn se insiste en utilizar el desequi
librio de enlace a fin de reducir la bsqueda (seccin 15.4). Inclu
so para enfermedades mendelianas, el desequilibrio de enlace puede
ser una herramienta muy valiosa para mapeo fino, como se obser
v en la fibrosis qustica y el sndrome de rotura de Nijmegen (sec
cin 13.5.2).
14.3.2 Es necesario establecer un contiguo de clonas a

travs de la regin candidata
En el recuadro 8-5 se describen las tcnicas para elaborar contiguos.
En los primeros das la formacin de contiguos representaba un gran
esfuerzo. El artculo que describe la identificacin del gen de la fi
brosis qustica (Rommens y cois., 1989) resume tal vez el ejemplo
ms impresionante de esta fase inicial. El uso de seleccin por hibri
dacin de genotecas para reconocer clonas sucesivas superpuestas
(caminata cromosmica) fue penosamente lento con la disponibi
lidad de entonces de genotecas de fagos de inserto pequeo y csmidos y se complement con la tcnica, hoy en da obsoleta, del
422
CAPTULO CATORCE
A)
0
2
8
6
3
2
1
8
6
5
2
6
2
2
8
6
3
2
1
8
6
5
2
6
2
2
3 1
5 6
4
3
6
5
5
7
8
S84
S105
S234
S129
S354
S79
8
3
8
2
7
10
10
4
6
4
1
6
8
3
8
2
7
10
10
3
2
3
5
8
8
3
8
2
7
10
3
2
2
1
6
2
2
6
5
2
6
2
2
7
5
4
6
6
2
3
6
5
5
7
8
6
5
2
6
2
2
7
4
4
2
5
4
S84
S105
S234
S129
S354
S79
Fig. 14-4. Definicin de la regin candidata mnima mediante inspeccin de haplotipos.

Las dos genealogas muestran un trastorno de la piel de herencia dominante, la enfermedad de Darier-White (M IM 124 20 0 ) que se haba mapeado con
anterioridad en 12q. Se destaca el haplotipo marcador 12q que segrega con la enfermedad. Los cuadros en gris indican los haplotipos inferidos en la
persona muerta. En el individuo II-6 de la genealoga A, la recombinacin mapea el gen patolgico distal a D 12584;
D12S105 no
es informativo porque
1-1 fue evidentemente homocigoto para el alelo 5 (comprese los genotipos de II-3 y II-7). La recombinacin que se muestra en 111-1 sugiere que el gen
de la enfermedad se mapea proximal a
D12S129,
pero es necesario confirmarlo porque la interpretacin depende de que se infieran de manera correcta
los genotipos de 11-1 y II-2 y de que 111-1 no sea portador de un gen no penetrante. La recombinacin en el individuo II-4 de la genealoga B proporciona
la confirmacin. Los datos combinados localizan el gen de Darier en el intervalo entre
(19 9 4 ),
Genomics 24,
D12S84 y D12S129.
Modificado a partir de Crter y colaboradores
3 7 8 -3 8 2 . 1 9 9 4 con autorizacin de Elsevier.
brincado cromosmico (Poustka y cois., 1987). En la actualidad es

posible descargar contiguos elaborados con facilidad a partir de ba
ses de datos de secuencias del genoma humano, aunque siempre es
necesario revisar estos ensambles antes de confiar en ellos.
14.3.3 Un mapa de transcritos define todos los genes

dentro de la regin candidata
Una vez que se establece un contiguo, el paso siguiente es catalogar
todos los genes de su interior. A medida que mejora el conocimien
to del genoma humano, es ms probable cada vez que la causa de
cualquier enfermedad que se investiga sea una mutacin de un gen
conocido. Se utiliza una bsqueda general del genoma, como Ensembl (http://www.ensembl.org) o el buscador general Santa Cruz
(http://genome.cse.ucsc.edu) para mostrar y analizar todos los genes
definidos y posibles en la regin candidata (fig. 14-5; vase asimis
mo la seccin 8.3.6 y Wolfsberg y cois., en las lecturas adicionales).
Por impresionantes que sean estas exhibiciones, es importante no
confiar por completo en ellas. Tales herramientas muy complicadas
deben usarse como coadyuvantes del pensamiento y no para susti
tuirlo. Es necesario complementarlas mediante un estudio personal
a fondo de primera mano de la regin mediante una combinacin
de trabajo de computadora y experimental. El artculo de Reymond y colegas (2002) ilustra las variedades de anlisis adicionales
que pueden instituirse.
Las bsquedas por computadora intentan obtener ms informa
cin de bases de datos de la que pueden extraer los programas de
bsqueda general del genoma. Los programas de bsqueda gnica

son malos para encontrar exones pequeos, exones con sitios de
empalme poco comunes o predisposiciones de codn, o bien genes
con regiones no traducidas 5' o 3' demasiado largas. Es posible que
los marcadores de secuencia expresados (MSE) que se elaboran con
exones pequeos empalmados no sean compatibles con su secuen
cia genmica. Anlisis por computadora ms amplios pueden enfo
carse en reconocer homologas. La comparacin de las secuencias
humana y del ratn puede revelar secuencias adicionales conserva
das que sugeriran cierta funcin. Es posible que las bsquedas uti
lizadas para anotacin automtica del genoma pasen por alto
homologas dbiles a posibles ortlogos o parlogos. Tal vez surja
una investigacin ms directa, impulsada por hiptesis, con indica
dores relevantes de la funcin gnica.
El trabajo experimental implica una revisin doble para equivo
caciones en el ensamble de secuencias, como subclonas ordenadas
de forma errnea o equivocaciones del ensamble gnico, por ejem
plo omisin o exones falsos, genes cortados o concatenados, etc.
Con la finalidad de comprobar que se crean los productos del ta
mao predicho, se utilizan cebadores compatibles con diferentes
partes de la secuencia genmica. El fracaso en la amplificacin su
giere un ensamble errneo de la secuencia genmica. La PCR-RT
con cebadores de diferentes posibles exones suele valorar si puede
amplificarse del todo el producto previsto y, de ser factible, si con
tiene los exones intermedios esperados. Puede revelar empalme
alternativo no sospechado o exones adicionales. Es posible usar
RACE-5' (seccin 7.2.3) a fin de extender secuencias gnicas, en
14.3
423
_E21U _
Benda cromosomi c a t
DNfl (contiguos)
CLONACIN POSICIONAL
AL 136223 > >
< fiL 049643
fiL353716 >
< fiL 035567
riarcadon es
>
fiL133375 >
RL355365 >
II
i l l
D6S322E
06E1374
D6S2I78
PFHa272zb5
0615S 2
06S1S59
D6S1883
D6S216S
> AL359613 >
>
I
D8S1790
Genes
l <9HS78
*-RD l TBCC
L NOVEL
l 9NU69
*-015057
9HS78
l 89NLF6
l 92S14
l NH_1382% l HEP l NRPL2

l NOUEL
l SNHT l 896GH7 l PTK7
LTORC5l PPP2RSD LKLC3_HUHftN
L 0 * 7 5 3 0 4 .1
^PEX^ LS96EU6.
LC fl6 7 5 3 0 3 .1
1Y076_HUt1flN
LCftB75302.1
l P.F
1-043598 LLC22fl7
L NOVEL L896JH2
l SWNU8
l 075188
l N0VEL
l !9NXY3
lN
l 89B54l <
l TOP4
L
LqWT(i9
Leyenda gnica
I GEHCS PHEDICHOG EHSOBL (COHOCIDOS)

i Goes cum n s ew l
I GEHES PREDICHE EHGEHBL (HUEUOS)
Fig. 14-5. Uso de un buscador general de genoma para la lista de genes en una regin candidata.
Este esquema parcial del buscador general del genoma Ensembl (www.ensembl.oroi muestra genes confirmados y predichos en una regin de 1 Mb del
cromosoma 6p21.1. El click en un gen muestra informacin sobre la secuencia, estructura y homologas gnicas. Vase la seccin 8.3.6 para detalles
ms amplios de este sistema.
especial si no hay un buen codn de inicio (un ATG en una secuen

cia consenso de Kozak; vase seccin 1.5.1) en el exn ms remoto
corriente arriba. Por supuesto, si no se sabe nada sobre el patrn de
expresin del gen predicho, la falta de amplificacin puede signifi
car tan slo que se estudia el tejido o la genoteca de cDNA equvo
cos. No obstante, si se encuentra en los MSE cualquiera de las
posibles secuencias gnicas, habr informacin sobre la genoteca de
cDNA de la que se aisl el marcador de secuencia expresado
(MSE). En donde se transcriben genes adyacentes en la misma di
reccin, puede hacerse una prueba PCR-RT para observar si ambos
podran ser en verdad parte del mismo gen.
Adems de estas revisiones experimentales sobre anotaciones de
bases de datos, pueden efectuarse investigaciones directas para
transcritos. Los mtodos generales para identificar secuencias trans
critas desconocidas del interior de un contiguo de clonas genmicas
se comentan con detalle en la seccin 7.2 y se resumen en el recua
dro 14-1. Hasta fecha muy reciente no se dispona de bases de datos
para revisar, de tal manera que estos mtodos constituyeron la prime
ra lnea de mapeo de transcritos.
Siempre que es necesario seleccionar genotecas de cDNA, surge
la pregunta acerca de cules deben utilizarse. Muchas veces, la
anomala que se estudia sugiere una investigacin particular. Por
consiguiente, cuando se analiza una enfermedad neuromuscular es
sensato seleccionar primero genotecas de cDNA muscular. Sin em
bargo, el tejido que muestra la anormalidad no siempre es el que
tiene la expresin ms potente, de tal modo que si una genoteca

fracasa, siempre merece la pena seleccionar otras. El cerebro fetal es
una eleccin comn porque posee un nmero en particular alto de
secuencias expresadas.
14.3.4 Son prioritarios los genes de la regin candidata

para pruebas de mutacin
De la lista de genes que mapean la regin candidata, es necesario
elegir un gen que muestre expresin o funcin apropiadas, o am
bas. De manera alternativa o adicional, como se comenta ms ade
lante, podra buscarse homologa a algn otro gen humano o no
humano que tenga una expresin o funcin adecuadas o que pre
sente mutantes con fenotipos relacionados.
Patrn de expresin apropiado

Un gen candidato adecuado debe tener un patrn de expresin
compatible con el fenotipo de la enfermedad. La expresin no ne
cesita restringirse al tejido afectado, ya que hay muchos ejemplos de
genes que se expresan ampliamente que causan una enfermedad es
pecfica de tejido (seccin 16.7.1), pero el gen candidato debe ex
presarse cuando menos en ese tiempo y en el sitio en que se observa
la anomala. Por ejemplo, es probable que los defectos del tubo
neural incluyan genes que se expresan durante la tercera y cuarta se-
R ecuadro 14-1. Mapeo de transcritos: mtodos de laboratorio que complementan los anlisis de bases de
datos para identificar secuencias expresadas dentro de clonas genmicas
En la seccin 7.2 se describen mtodos para mapear transcritos. En resumen, incluyen los siguientes:
atrapamiento de exones con objeto de encontrar secuencias genmi

cas flanquedas por seales de empalme funcional (fig. 7-10).
seleccin de genotecas de cDNA que utilizan como sondas clonas
zoo blotting con la finalidad de buscar secuencias conservadas de

modo evolucionista (fig. 7-9).
genmicas de una regin candidata.

seleccin de cDNA para deteccin ultrasensible de cDNA derivados
de la regin candidata (fig. 7-11).
identificacin de islotes de CpG para buscar las regiones de DNA submetilado que se encuentra con frecuencia cerca de genes (recuadro 9-3).
424
CAPTULO CATORCE
manas del desarrollo embrionario humano, poco antes de la neurulacin o durante ella. La expresin de genes candidatos puede estu
diarse mediante PCR-RT, Northern blotting o anlisis seriado de
expresin genica (ASEG, seccin 19.3.2). Gran parte del trabajo
preliminar puede hacerse en bases de datos (base de datos dbEST o
SAGE, ambas accesibles a travs de la pgina NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov/) ms que en el laboratorio. La hibridacin in situ
contra mRNA en cortes de tejidos (seccin 6.3.4) o la inmunohistoqumica con anticuerpos marcados proporcionan el cuadro ms
detallado de patrones de expresin. Los estudios suelen efectuarse
en tejidos de ratn, en especial para etapas embrionarias. No siem
pre se justifica la presuposicin comn de que los seres humanos y
el ratn poseen patrones de expresin similares y se han estableci
do recursos centralizados de cortes de embriones humanos en eta
pas para llevar a cabo anlisis equivalentes en estos ltimos cuando
es necesario.
Funcin apropiada
Cuando se conoce la funcin de un gen en la regin candidata, pue
de ser obvio si se trata de un buen candidato o no para la enferme
dad -la rodopsina y la fibrilina (seccin 14.6.4) proporcionan
ejemplos.En genes novedosos, el anlisis de secuencia suministra a
menudo indicios sobre la funcin: pueden identificarse dominios
transmembranosos, secuencias tpicas de cinasa de tirosina, etc. Es
posible que ello sea suficiente para dar prioridad a un gen como can
didato, si se toma en cuenta la enfermedad. Por ejemplo, se sabe que
el transporte inico es esencial para el funcionamiento del odo in
terno, de tal manera que un gen del canal inico sera un candidato
natural en la clonacin posicional de un gen de la sordera.
Los genes candidatos tambin pueden sugerirse con base en una
relacin funcional cercana con un gen que participa en un padeci
miento similar. Los genes podran relacionarse mediante codificacin
de un receptor y su ligando o de otros componentes que interactan
en la misma va metablica o del desarrollo. Por ejemplo, como se
describe en la seccin 15.6.2, algunos de los genes que intervienen en
la enfermedad de Hirschsprung se identificaron con esta lgica.
Homologa para un gen parlogo importante (humano)

Algunas veces un gen en la regin candidata es un homlogo cer
cano de un gen conocido (un parlogo en seres humanos u ortlo
go en otras especies). Si las mutaciones en el gen homlogo causan
un fenotipo relacionado, el nuevo gen se constituye en un candida
to apremiante. Por ejemplo, una vez que se reconoci la fibrilina
como el gen mutado en el sndrome de Marfan (seccin 14.6.4), se
mape el gen parlogo, FBN2, en 5q. Tambin se mape en la mis

ma regin 5q un padecimiento relacionado, la aracnodactilia contractural congnita (ACC, MIM 121 050). Poco tiempo despus se
demostraron mutaciones de FBN2 en personas con esta afeccin
(Putnam y cois., 1995).
Homologa para un gen ortlogo importante (organismo

modelo)
Durante la ltima dcada fue cada vez ms claro qu tan lejos se ex
tienden las homologas estructural y funcional a travs incluso de
especies relacionadas de manera muy distante. Casi punto a punto,
cada gen del ratn tiene un equivalente humano exacto y es proba
ble que lo mismo sea cierto en otras especies de mamferos menos
estudiadas. Ms sorprendente an es que resulta posible detectar
homologas extensas entre genes humanos y genes del pez cebra,
Drosophila, el gusano nematodo Caenorhabditis elegans e incluso la
levadura. Un medio muy potente para conceder prioridad a los can
didatos entre un grupo de genes humanos es por tanto observar lo
que se sabe sobre los genes homlogos en estos organismos modelo
bien estudiados, como se describe en la seccin 19.2. Estos datos po
dran incluir el patrn de expresin y el fenotipo de mutantes. Steinmetz y colaboradores (2002) ilustran una seleccin sistemtica de
mutantes en levaduras para posibles genes de enfermedades en seres
humanos. Los ratones son en especial tiles para estas investigacio
nes y ms adelante se considera con mayor detalle su uso.
Incluso ms que las secuencias gnicas, con frecuencia estn
muy conservadas las vas, de tal manera que puede emplearse el co
nocimiento de una va del desarrollo o el control en Drosophila o
una levadura para predecir el trabajo probable de vas en seres hu
manos -aunque a menudo los mamferos tienen varias vas parale
las que corresponden a una va nica en organismos inferiores-. En
contraste, es menos probable que correspondan de cerca fenotipos
mutantes. Un ejemplo notable es la mutante apterous sin alas de
Drosophila. Es posible que un gen humano, Lhx2, complemente la
funcin deficiente del mutante, de tal modo que las moscas desa
rrollan alas normales (fig. 14-6). Es necesario tener una va del de
sarrollo virtualmente idntica a la de Drosophila, pero se utiliza para
un propsito diferente. Otro ejemplo lo representa el sndrome
branquiootorrenal (seccin 14.6.3).
14.3.5 Importancia especial de los mutantes de ratn

Las homologas fenotpicas del ser humano y el ratn suministran
indicios en particular valiosos para identificar genes de enfermedad
humana por varias razones:
A)
Fig. 14-6. Los seres humanos tienen un gen para hacer que crezcan las alas de las moscas.
El defecto en moscas mutantes apterous A) puede corregirse mediante el gen de la mosca de tipo silvestre B) o el gen humano LHX2 C). Tomado de
Rincn-Limas y colaboradores (1999), Proc. NatlAcad. Sci. USA 96:2165-2170, con autorizacin. 1999 National Academy of Sciences, USA.
14.4
los programas de mutagnesis sistemtica generan nmeros

muy grandes de mutantes de ratn (Justice, 2000; Brown y BaUing, 2001);
es ms probable que las mutaciones de genes ortlogos pro
duzcan fenotipos similares en personas y ratones que en seres
humanos y moscas o gusanos. No obstante, las similitudes tal
vez no sean tan cercanas como se deseara (seccin 20.4.6);
USO DE ANORMALIDADES CROMOSMICAS
425
cional. La capacidad para crear knockouts totales o condiciona

les, y manipular mediante ingeniera mutaciones especficas en
un organismo relacionadas bastante de cerca con las de seres
humanos, determina que el ratn sea una herramienta muy po
tente para explorar la funcin gnica humana.
14.4
Uso de anorm alidades

crom osm icas
con frecuencia se traslada con facilidad informacin fenotpica del ratn a la informacin del candidato posicional. El mapeo retrocruzado (vase recuadro 14-2) permite mapear con
rapidez y precisin en el ratn. Por consiguiente, se ha mapeado la mayor parte de los mutantes en el ratn o pueden mapearse sin demasiados problemas. Una vez que se conoce la
localizacin cromosmica de un gen de inters en el ratn o el
ser humano, casi siempre es posible predecir la localizacin de
ese gen en la otra especie. La figura 14-7 ilustra la correspon
dencia general entre ubicaciones cromosmicas del ratn y se
res humanos, basada en genes ortlogos que se mapearon en
ambas especies. La compatibilidad cruzada de secuencias genmicas humanas y del ratn proporciona un cuadro muy deta
llado de la relacin entre cromosomas de personas y ratones
(Gregory y cois., 2002; fig. 14-8);
En ocasiones, las anormalidades cromosmicas proporcionan un

mtodo alternativo para localizar un gen patolgico, en lugar del
anlisis de enlace. En padecimientos espordicos, como muchos
dominantes graves, las aberraciones cromosmicas pueden sumi
nistrar el nico mtodo para llegar a un gen candidato (seccin
14.6.1). Con buena suerte, es posible que incluso sealen de forma
directa la localizacin precisa en vez de definir una regin candidata, como en el enlace. Son en especial tiles las anormalidades equi
libradas (translocaciones o inversiones). En la identificacin de
estos pacientes tienen un papel crucial los clnicos atentos (recua
dro 14-3). Las deleciones submicroscpicas y las translocaciones
crpticas son cuando menos tan valiosas como las anormalidades
cromosmicas vecinas.
las secuencias exnicas y las estructuras exn-intrn suelen estar

muy bien conservadas entre genes ortlogos humanos y del ratn.
Esto significa que una vez que se asla un gen humano o de ratn,
pueden disearse sondas o cebadores para seleccionar genotecas
de DNA de otras especies a fin de identificar el gen ortlogo;
14.4.1 Son interesantes los pacientes con una

anormalidad cromosmica equilibrada
y un fenotipo inexplicable
luego de identificar un gen candidato en seres humanos, pue

den elaborarse mutantes de ratn para permitir el anlisis fn-
No cabra esperar que una translocacin e inversin equilibradas,

con nada adicional o faltante, tuvieran algn efecto fenotpico en
Recuadro 14-2. Mapeo de genes del ratn

Se dispone de varios mtodos para el mapeo fcil y rpido de fenotipos
o clonas de DNA en ratones. Junto con la capacidad para crear ratones
transgnicos (cap. 20), determinan que el ratn sea en especial til para
establecer comparaciones con seres humanos. Los mtodos incluyen los
siguiente:
Cruzamientos interespecficos (Mus m usculus/M us spretus o Mus castaneus)
Las especies tienen diferentes alelos en muchos locus polim rficos, lo
que facilita reconocer el origen del alelo marcador. Esto se aprovecha en
dos formas:
elaboracin de mapas de marco estructural sealador. Varios labora
torios produjeron grandes grupos de ratones Fz con retrocruzamiento. Es posible asignar con rapidez cualquier marcador o gen clonado
a un segmento crom osm ico pequeo definido por dos puntos de ro
tura de recombinacin en el conjunto de ratones de retrocruzamiento. Por ejemplo, el retrocruzamiento colaborador europeo se produjo
a partir de un cruzamiento de M. spretus/musculus (C57BL). Se pro
dujeron mediante retrocruzamiento con spretus 500 ratones F2 y 500
por retrocruzamiento con C57BL. Se califican en cada ratn todos los
microsatlites en el rea del mapa de armazn estructural.
mapeo de un nuevo fenotipo. Debe efectuarse un cruce especfico pa
ra llevar a cabo este mapeo pero, a diferencia de los seres humanos,
es posible aparear cualquier nmero de ratones F2 a fin de mapear la
resolucin deseada. Son ms fciles de aparear los cruces de Musculus x castaneus que musculus x spretus.
Cepas endogmicas recombinantes

Se obtienen mediante endogamia sistemtica de la progenie de un cruza
miento, por ejemplo las cepas de BXD que se utilizan en extenso son un
grupo de 26 lneas derivadas de ms de 60 generaciones de endogamia
a partir de la progenie del cruzamiento C57B176J x DBA/2J. Proporcionan
abastecimientos ilimitados de un grupo de cromosomas con puntos de
recombinacin fijos. Se dispone de DNA como un recurso pblico y las
cepas funcionan de modo similar a la forma en que las familias CEPH lo
llevan a cabo en seres humanos (seccin 13.4.2). Las cepas endogmi
cas recombinantes son en particular adecuadas para mapear caracteres
cuantitativos (vase seccin 15.6.8), que pueden definirse en cada cepa
parental y promediarse con un nmero de animales de cada tipo recombinante. En comparacin con ratones de cruzamientos interespecficos,
suele ser ms difcil encontrar un marcador en una regin determinada
que distingue las dos cepas originales y la resolucin es ms baja por las
cifras ms pequeas.
Cepas congnicas
Son idnticas excepto en un locus especfico. Se producen mediante re
trocruzamiento repetido y pueden emplearse para valorar el efecto de
cambiar tan slo un factor gentico en un fondo comn constante.
Silver (1995) proporciona una revisin general de la gentica del ratn

(vase las lecturas adicionales) y Copeland y Jenkins (1991) d e sc rib a
los usos de cruzamientos interespecficos.
426 | CAPTULO CATORCE
Ortlogos totales: 7 762

Total m apeado en am bas especies: 7 1 4 3
1
1
210 2
184 97
4
5
14
7
8
186 252 7
15
56
73
82
31
11
60
25
15
51
16
17
18
15
16
39
1
32
88
124
23
84
52
28
28
31
1
1
31
127
1
11
46
75
42
107
98
82
90
65
60
137
11
32
427 2
25
66
31
19
77
1
18
82
44
22
31
28
15
25
20
9
10
118
26
11
30
12
10
13
14 X
21
15 |
37
16
40
17
18
48
19
16
20
21
15
22
22
1
1
71
17
40
1
32
21
32
MT
55
31
44
1
UN
97
14
XY
63
10
61
22
150
21
14
1
202 71
19
205
188 1
18
19
17
36
30
14
31
24
106 1
22
79
161
20
14
1
9
13
55
14
12
42
73
14
11
138
11
_ ,,
, ,
.
R a t n , la b o ra to rio
10
106 2
12
3
147 132
14
22
10
13
57
12
157 9
19
60
1
2
303
XY
XY
UN 1
MT
UN
37
X;Y
m
X;Y
16p
16p
1
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
XY
UN
MT
R a t n , la b o ra to rio
Fig. 14-7. Conservacin de sintenia entre los mapas genticos humano y del ratn.
La Oxford Grid (Parrilla Oxford) resume la relacin entre los cromosomas humanos y del ratn. Las celdillas estn codificadas por color de acuerdo con
el nmero de ortlogos mapeados. Es obvia la distribucin no aleatoria. Casi siempre es posible predecir la localizacin de un gen humano si se conoce
su situacin en el ratn, o viceversa. Esta figura proporciona una lista general; la informacin detallada se encuentra en una base de datos accesible en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/Homology (DeBry y Seldin, 1996). Figura reproducida con autorizacin de Mouse Genome Database, Mouse Genome
Informatics, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine (http://www.informatics.jax.org).
el portador. Si una persona con una anormalidad cromosmica al

parecer equilibrada es anormal desde el punto de vista fenotpico,
existen tres explicaciones posibles:
el hallazgo es una coincidencia;
el reordenamiento no est de hecho equilibrado: hay una pr
dida o ganancia de material no observadas;
uno de los puntos de rotura del cromosoma causa la enfermedad.
Una rotura cromosmica puede provocar un fenotipo de prdida
de funcin si altera la secuencia de codificacin de un gen o la se
para de una regin reguladora cercana. De manera alternativa, po
dra ocasionar una ganancia de funcin, por ejemplo mediante el
empalme de exones de dos genes juntos para crear un nuevo gen

quimrico (este hecho es raro en una enfermedad hereditaria, pero
comn en la tumorignesis; vase cap. 17). En cualquiera de los ca
sos, el punto de rotura proporciona un indicio valioso sobre la lo
calizacin fsica exacta del gen patolgico. La posicin precisa del
punto de rotura se define con mayor facilidad al utilizar hibrida
cin fluorescente in situ (HFIS; fig. 14-9). Un ejemplo de la poten
cia de este mtodo es la identificacin del gen del sndrome de
Sotos (seccin 14.6.1). Sin embargo, el indicio posicional no es in
falible: algunas veces los puntos de rotura alteran la expresin de un
gen situado cientos de kilobases lejos y afectan la estructura de do
minios de eromarina a gran escala (recuadro 14-4).
14.4
mm
f t
M m u9
'
: :
1 M
mm
m r-m
mm
mtm
M m u4
USO DE ANORMALIDADES CROMOSMICAS
42~
copia funcional activa del gen. Hay alrededor de dos docenas de

mujeres en el mundo que sufren DMD por translocaciones del au
tosoma X. Cada translocacin incluye un punto de rotura autosmico diferente, pero el punto de rotura de X siempre ocurre en
Xp21. El estudio de estas mujeres complement el trabajo inicial
sobre enlace en el mapeo del gen de DMD en Xp21 y una de ellas,
con una translocacin X;21, suministr uno de los medios para clo
nar el gen de DMD (vase ms adelante).
Un reordenamiento que sita la bsqueda despus del gen cer
cano a una secuencia conocida proporciona una va inmediata pa
ra el gen desconocido. Muchos genes en organismos modelos se
clonaron mediante mutaciones inducidas por la insercin de un
transgn o un elemento movible. En seres humanos, en un ataque
al gen de DMD se utiliz este mtodo. Una de las mujeres raras con
DMD (vase antes) tena una translocacin Xp;21p. Al conocer
que 21p est ocupado por reordenamientos de genes rRNA repeti
dos (seccin 9.2.1), el grupo de Worton prepar una genoteca genmica y emprendi la bsqueda de clonas que contenan rDNA y
secuencias del cromosoma X. Esto condujo al aislamiento de clo
nas XJ (unin de X), que se reconocieron dentro del gen de distrofina, en el intrn 7 (Worton y Thompson, 1988).
No debe soslayarse la segunda posible explicacin, ya mencio
nada. Los estudios de pacientes que tienen una anormalidad en
apariencia equilibrada y un fenotipo nuevos mostraron que la ma
yora posee en realidad un reordenamiento cromosmico comple
jo, que muchas veces incluye una delecin submicroscpica. La
prdida incluso de una megabase de DNA no sera visible en pre
paraciones citogenticas estndar. Deleciones ms grandes de unas
cuantas kilobases pueden detectarse mediante HFIS (vase fig.
14-12); las ms pequeas en portadores heterocigotos de translo
cacin se estudian mejor mediante PCR despus de segregar el
cromosoma derivado en un hbrido de clula somtica (vase re
cuadro 8-4).
H sa 6
Fig. 14-8. Segmentos conservados entre el cromosoma humano 6

(Hsa6) y los cromosomas de ratn (Mmu).
Se han identificado 20 bloques de sintenia conservada mediante com
paracin de las secuencias genmicas humanas y del ratn. Las lneas
de guiones indican bloques invertidos en relacin con los diagramas
cromosmicos del ratn. Las barras azules en el centro del ideograma
cromosmico representan los contiguos incluidos en el anlisis. Re
producido a partir de Gregory y colaboradores (2002), Nature
418:743-750, con autorizacin de Nature Publishing Group.
Incluso si un punto de rotura de translocacin altera un gen, se

pierde la funcin slo en una de las dos copias del gen. No hay un
efecto fenotpico a menos que una reduccin del 50% del valor del
producto cause problemas (haploinsuficiencia, seccin 16.4.2). Un
caso especial es el de las translocaciones d el autosoma X en mujeres
por inactivacin de X. La inactivacin es aleatoria, pero las clulas
que inactivan el X translocado sufren a menudo desequilibrios ge
nticos letales (fig. 14-10), de tal manera que una mujer portadora
de una de estas translocaciones posee por completo clulas que tie
nen inactivado el X normal. Si el punto de rotura de la transloca
cin altera un gen en el cromosoma X, la mujer queda sin una
14.4.2 Los pacientes con dos trastornos mendelianos,

o uno mendeliano junto con retraso mental,
pueden tener una delecin cromosmica
Las deleciones cromosmicas tienen menos valor para identificar
genes que las anormalidades equilibradas porque la regin comple
ta eliminada se convierte en el foco de investigacin, en lugar de un
punto de rotura especfico. No obstante, las deleciones han sido
fundamentales en la identificacin de varios genes mayores de en
fermedad, incluido el triunfo sobresaliente inicial, la identificacin
del gen de la distrofina.
En este caso, el punto de inicio fue un nio, BB, que tena
DMD y una delecin Xp21 citogentica visible. Se utiliz un pro
cedimiento de clonacin de sustraccin tcnicamente muy difcil
para aislar clonas del DNA normal que correspondieran a las se
cuencias eliminadas en BB (Kunkel y cois., 1985). A continuacin
se emplearon clonas individuales de DNA en la genoteca de sus
traccin como sondas en hibridacin Southern blot contra muestras
de DNA de personas normales y pacientes con distrofia muscular
de Duchenne (DMD). Una clona, pERT87-8, reconoci delecio
nes en DNA en casi 7% de pacientes con DMD normales desde el
punto de vista citogentico. Asimismo, detect polimorfismos que
mediante estudios de familias se demostr que estaban enlazados de
forma estrecha con la DMD. Estos resultados mostraron que
pERT87-8 se hallaba mucho ms cerca del gen de DMD que cual
quier clona aislada con anterioridad (de hecho, fue dentro del gen.
428 CAPTULO CATORCE 1 IDENTIFICACIN DE GENES PATOLGICOS HUMANOS
Recuadro 14-3.
I
In d icad o res
de la presencia de anormalidades cromosmicas
Los clnicos pueden contribuir de manera notable a identificar genes de

enfermedades al hallar a personas que padecen anormalidades cromos
micas causales.
Una anormalidad citogentica en un paciente con la presentacin
clnica estndar
Cuando ya se mape el gen de una enfermedad a una cierta localizacin
y a continuacin se encuentra a un sujeto con ese trastorno que tiene una
alteracin cromosmica que afecta esa mism a localizacin, es muy pro
bable que la anormalidad cromosmica causara el padecimiento.
Los pacientes con translocaciones o inversiones equilibradas suelen
tener puntos de referencia localizados dentro del gen de enfermedad
o muy cerca de l. La clonacin de sus puntos de rotura puede pro
porcionar la va ms rpida para identificar el gen patolgico.
En deleciones intersticiales es posible situar los puntos de rotura a
cierta distancia del gen de la enfermedad, pero si el segmento elimi
nado es ms pequeo que la regin candidata actual, la definicin de
los puntos de rotura ayuda a ubicar el gen.
A)
La mayora de estos individuos muestra mutaciones nuevas. Algunos in

vestigadores piensan que llevar a cabo el anlisis cromosmico en todos
los enfermos con mutaciones nuevas es un gasto de investigacin que
merece la pena.
Retraso mental adicional
Un paciente puede tener una enfermedad mendeliana tpica, adems de
retraso mental muy grave. Es posible que sea coincidental, pero estos ca
sos pueden deberse a deleciones que eliminan el gen patolgico aunado
a genes vecinos adicionales. Las grandes deleciones cromosmicas ca
si siempre causan retraso mental grave, que refleja la participacin de
una elevada proporcin de los genes en el desarrollo del cerebro fetal.
Cuando el sujeto evidencia una mutacin nueva, se justifican los anlisis
citogentico y molecular.
Sndromes de gen contiguo
Muy rara vez, un paciente parece sufrir varios trastornos genticos dife
rentes al mism o tiempo. Es posible que se trate tan slo de mala suerte,
pero algunas veces se debe a la delecin simultnea de un grupo de ge
nes contiguos. Los sndromes de gen contiguo se describen en la sec
cin 16.8.1; se definieron en particular bien en los trastornos ligados a X.
B)
8cen
lf
8 p te r
C)
d e r(8 )
d e r(1 6)
16
Sonda
c ro m o s o m a s + v e
8 , d e r(8 )
8, d e r(1 6)
8 , der(8)
8 , d e if l 6)
8 , d e r(1 6)
8, d e r(8 ), d e r(1 6 )
Fig. 14-9. Uso de la hibridacin de fluorescencia in situ para definir un punto de rotura de translocacin.
A) Translocacin t(8;16)(p22;q21) definida de forma citogentica. B) Mapa fsico de una parte de la regin del punto de rotura en un cromosoma normal
8 que muestra las localizaciones aproximadas de siete clonas. C) Resultados de experimentos de HFIS sucesivos. El punto de rotura se encuentra dentro
de la secuencia representada en la clona D. En condiciones normales, este resultado se confirmara mediante clonas del cromosoma 16.
en el intrn 13). Se aislaron otras sondas genmicas cercanas me

diante caminata cromosmica y a continuacin se buscaron secuen
cias conservadas con zoo b lottin g y se utilizaron para seleccionar
genotecas de cDNA muscular. Si se toma en cuenta la escasez de
mRNA de distrofina y, como se sabe hoy en da, el tamao peque
o y la localizacin muy diseminada de los exones, dista mucho de
ser fcil encontrar clonas de cDNA, aunque al final se reconocieron
clonas y luego se caracteriz la totalidad del gen de la distrofina (va

se fig. 10-14).
Un ejemplo ms reciente del empleo de deleciones se relaciona
con el gen PHEXque est mutado en el dominio ligado a X del ra
quitismo resistente a vitamina D (MIM 307 800). El gen se haba
mapeado a un intervalo pequeo en Xp, pero la demostracin de
deleciones submicroscpicas en cuatro de 150 varones afectados
14.5
CONFIRMACIN DE UN GEN CANDIDATO
429
Recuadro 14-4. Efectos de la posicin: un peligro latente en la identificacin de un gen patolgico

En general, los genes parecen estar dispuestos ms o menos de forma
aleatoria en los cromosomas y no importa la disposicin o el orden exac
tos. Sin embargo, en Drosophila se sabe bien que la configuracin local de
cromatina a escala de megabase puede afectar la expresin gnica (en
particular, se silencian genes si se colocan dentro de la heterocromatina o
cerca de ella). Al parecer, sucede lo mismo en ratones y seres humanos.
dificacin de un gen. Se conocen varios ejemplos en seres humanos de

puntos de rotura de translocacin que afectan la expresin de un gen has
ta una megabase de distancia. En la seccin 10.5.1 se mencionan ejem
plos de aniridia (MIM 106 210) y el gen PAX6, adems de displasia
campomlica (MIM 211 970) y el gen SOX9.
Estudios de expresin transgnica (seccin 20.2.3) muestran que la

expresin gnica especfica de tejido correcta puede depender de se
cuencias localizadas cientos de kilobases alejadas de la secuencia de co
Por consiguiente, los puntos de rotura de translocacin equilibrada no se

localizan en todos los casos dentro del gen, o incluso muy cerca de l, y
ello reduce su valor como herramientas para la clonacin de genes de en
fermedades.
D os co p ia s activas
d e X p distal
P arte del au to so m a
in activad o
M u e rte celular
Un gen d e distrofina
activo
DMD
Inactivacin
Inactivo
a leato ria d e X
Inactivo
Un X ac tivo
Dos autosom as activos
X
X /A
N o hay gen d e distrofina

activo
P o rtad o r d e una tran s lo ca ci n

recproca eq u ilib ra d a del
au to s o m a X
Fig. 14-10. Ocurre inactivacin de X no aleatoria en mujeres con DMD y translocaciones del autosoma Xp21.
La translocacin es equilibrada, pero el punto de rotura del cromosoma X altera el gen de distrofina (cuadro rojo). La inactivacin de X es aleatoria,
aunque las clulas que inactivan el X translocado mueren por desequilibrio gentico letal. El embrin se desarrolla por completo a partir de clulas en las
que est inactivado X normal, lo que crea a una mujer con un gen de distrofina no funcional. El fracaso resultante para producir cualquier distrofina causa
distrofia muscular de Duchenne.
permiti enfocar la atencin en una parte pequea de la regin candidata (HYP Consortium, 1995). Las deleciones son en particular
tiles en padecimientos ligados a X porque en los varones afectados
no hay interferencia del cromosoma normal.
Por lo general se piensa que las microdeleciones causan un gran
nmero de sndromes genticos inexplicables. Debido a que la re
gin eliminada es pequea, seran en especial valiosas para identifi
car los genes relacionados con el trastorno. Sin embargo, hasta
fecha reciente no haba una forma de investigarlas de manera siste
mtica. Por fortuna, el desarrollo de tcnicas sensibles de hibrida
cin genmica comparativa de alta resolucin (recuadro 14-5)
solucionar este problema. Es importante confirmar las deleciones
que se sospechan mediante HFIS (vase fig. 14-12) o electroforesis
en gel de campo pulsado y Southern blotting (el fracaso de la PCR
para crear un producto puede deberse a un cambio de secuencia en

el sitio de enlace del cebador en lugar de una delecin).
14.5
Confirm acin de un gen candidato
Los genes candidatos deben estudiarse de modo individual para ve

rificar si existen pruebas adecuadas que comprueben que las muta
ciones en ellos causan la enfermedad en cuestin. La demostracin
de que es probable que un gen candidato sea el locus de la anorma
lidad puede llevarse a cabo por varios medios:
Seleccin de mutacin. La seleccin para mutaciones especmcai
del paciente en el gen candidato es con mucho el mtodo m u di
fundido, puesto que es aplicable y rpido en trminos comroia-
430
CAPTULO CATORCE
tivos. En el captulo 16 se comentan las razones por las que pue

den encontrarse mutaciones particulares en ciertas afecciones y en
el captulo 18 se describen los mtodos para estudiar las mutacio
nes. l a identificacin de mutaciones en varios individuos afecta
dos no relacionados sugiere con solidez que se eligi el candidato
correcto, pero la prueba formal exige estudios adicionales.
Restablecimiento del fenotipo normal in vitro. Si se demues
tra en clulas de pacientes un fenotipo mutante, es posible veri
ficar si la transfeccin de un alelo normal de un gen candidato,
clonado en un vector de expresin (seccin 5-6.1), es capaz de
rescatar al mutante y restablecer el fenotipo normal. No todos
los fenotipos mutantes son reversibles, de tal forma que el resul
tado negativo no excluye en todos los casos a ese candidato.
Produccin de un modelo de ratn de la enfermedad (sec
cin 20.4.3). Una vez que se identifica un posible gen de enfer
medad, puede elaborarse un modelo de ratn transgnico, si no
existe ya una mutante importante. La prdida de fenotipos de
funcin puede modelarse mediante knockout con el envo gnico dirigido a la lnea germen del ratn (seccin 20.4.4). Para fe
notipos con ganancia de funcin es necesario introducir el alelo
de la enfermedad en la lnea germen del ratn. Se espera que los
ratones mutantes muestren cierta semejanza con los seres huma
nos que sufren la enfermedad, aunque esta expectativa no siem
pre se satisface incluso cuando se identifica el gen correcto.
14.5.1 Seleccin de mutacin para confirmar un gen

candidato
La seleccin de una mutacin suele ser directa para enfermedades
en las que una buena proporcin de pacientes lleva mutaciones in
dependientes. De manera caracterstica, son trastornos autosmicos dominantes o ligados a X graves de inicio temprano en los que
el fenotipo de la enfermedad resulta de la prdida de funcin gnica. Como se explica en la seccin 16.3.2, si se estudia el gen correc
to mediante uno o ms de los procedimientos de seleccin de
mutacin que se describen en la seccin 18.3, un grupo de muestras
de personas no relacionadas por lo general evidencia una diversidad
de mutaciones diferentes. Afortunadamente, ello incluye algunas
con un efecto perjudicial evidente en la expresin gnica, como
mutaciones sin sentido, cambios de marco, etc. La figura 16-1
muestra un ejemplo. Es necesario revisar testigos normales a fin de
comprobar que cualquiera de los cambios no son variantes comu
nes en la poblacin.
En otras circunstancias, es posible que sea ms difcil identificar
mutaciones e interpretar la seleccin de una mutacin.
Heterogeneidad de locus inesperada. Con frecuencia, las
mutaciones en varios genes diferentes pueden proporcionar fe
notipos casi idnticos, de tal modo que un grupo de muestras

de pacientes no seleccionados puede tener mutaciones patog
nicas en diferentes genes. Si el gen candidato que se estudia es
el causante slo de una proporcin pequea de los casos, casi
ninguna de las muestras revela mutacin en ese gen. Como ideal,
se usan slo muestras de familias con enlace demostrado con la
regin candidata, pero tal vez ello no sea factible: los tamaos de
familias con trastornos recesivos y algunos dominantes suelen
ser muy pequeos para los anlisis de enlace independientes y
en algunos trastornos dominantes graves la mayora de los in
dividuos se presenta como casos espordicos sin un antecedente
familiar.
Homogeneidad mutacional. Si la mayora de los sujetos al pa
recer no relacionados evidencia el mismo cambio de secuencia,
puede tratarse de la mutacin patognica o tal vez una varian
te rara en desequilibrio de enlace potente con la mutacin ver
dadera. Se requiere una prueba funcional que indique que el
cambio es patognico.
Las mutaciones no son patognicas de manera imprecisa.
Quiz sea difcil identificar mutaciones en sentido errneo co
mo patognicas, en oposicin a que sean variantes neutrales ra
ras sin un efecto mayor en la expresin gnica. En el recuadro
16-4 se proporcionan algunos lincamientos a fin de ayudar a
decir si un cambio de secuencia es patognico.
P u ed e ser d ifc il en co n tra r m u ta cion es. Aparte del problema
prctico de seleccionar un gen grande con muchos exones, al
gunas mutaciones no pueden identificarse al estudiarse me
diante PCR el DNA genmico. Por ejemplo, la deteccin de
grandes inversiones que alteran el gen del factor VIII (seccin
11.5.5 y fig. 11-20) o la mutacin CFTR3 849 + 10 kb C >
T que activa un sitio de empalme crptico profundo dentro de
un intrn (seccin 16.4.1) requiere Southern blotting o PCRRT, respectivamente.
14.5.2 Una vez que se confirma un gen candidato, el

paso siguiente es comprender su funcin
La identificacin del gen relacionado con una enfermedad gentica
abre el camino a varias lneas de investigacin. La capacidad para
identificar mutaciones debe conducir de inmediato a una mejora
del diagnstico y la asesora, como se describe en el captulo 18. El
conocimiento de la anomala molecular (la razn por la cual el gen
mutado causa la enfermedad; vase cap. 16) tambin debe suminis
trar informacin sobre trastornos vinculados y al final un trata
miento ms eficaz.
Una segunda lnea de indagacin se refiere a la funcin normal
del producto gnico. Hasta que se identific el gen de la DMD no
Recuadro 14-5. Hibridacin genmica comparativa (HGC) para la deteccin de desequilibrios cromosmicos
submicroscpicos
Se recurre a la hibridacin genmica comparativa (HGC) a fin de detec
tar monosomas o trisomias parciales, o bien deleciones o amplificaciones
cromosmicas. Como se describe en la seccin 17.3.3, la HGC se basa
en la competencia que el DNA de prueba y el DNA testigo establecen por
hibridar un blanco. Este ltimo puede ser una diseminacin de cromoso
mas normales en un portaobjetos para microscopio, con utilizacin de
mtodos estndar para hibridacin de fluorescencia in situ (seccin 6.3.4)
o un grupo de clonas BAC definidas dispuestas en un portaobjeto (HGC de

configuracin). Las regiones cromosmicas o las clonas BAC en las que
es diferente el nmero de copias en las pruebas y muestras testigo se
muestran como reas o puntos de seal fluorescente de color diferente
(fig. 17-3). La HGC de configuracin tiene la posibilidad de permitir selec
ciones en la extensin del genoma para microdeleciones y microduplicaciones en individuos con trastornos congnitos.
14.6 OCHO EJEMPLOS ILUSTRAN DIVERSAS FORMAS DE IDENTIFICAR GENES DE ENFERMEDADES
los casos son espordicos; los individuos afectados rara vez se re

producen y no existen buenas genealogas para mapeo de enlace.
Se ha identificado a un paciente con sndrome de Sotos con una
translocacin equilibrada en 46,XX,t(5;8)(q35;q24.1). Se reco
nocieron mediante HFIS PAC/BAC y clonas csmidas que abar
caban el punto de rotura (como en la fig. 14-9). La secuenciacin
alrededor del punto de rotura revel un homlogo de secuencia
genmica parcial con el gen del ratn N sdl. Se clon y caracteri
z el gen humano NSD1 y se demostr que estaba alterado por
translocacin (fig. 14-11). Esto pudo tratarse de una coinciden
cia. La prueba de que NSD1 era el gen mutado en el sndrome
de Sotos se obtuvo al demostrar mutaciones de punto en cuatro de
38 pacientes independientes con la enfermedad y microdeleciones
(fig. 14-12) en 20 de 30 (Kurotaki y cois., 2002). Sin embargo, ca
be sealar que los genes pueden afectarse por un reordenamiento
cromosmico, incluso cuando no se alteran de forma fsica (recua
dro 14-4), de tal manera que no siempre es tan directo el descubri
miento de una translocacin que causa una anormalidad.
se saba nada sobre la forma en que el mecanismo contrctil de las

clulas musculares est fijado al sarcolema. El anlisis de dominios
funcionales y secuencias tpicas y la investigacin de homlogos
manipulables de forma experimental en el ratn, la mosca de la fru
ta, los nematodos y la levadura son herramientas potentes para es
ta labor. Dichos temas amplios se comentan en los captulos 19 y
20, respectivamente; una anticipacin importante de la clase de in
formacin que es posible conseguir mediante la bsqueda en bases
de datos puede obtenerse en Hereditary Hearing Loss Homepage
(http://www.uia.ac.be/dnalab/hhh/), que describe el gen que se
identific mediante clonacin posicional de un locus autosmico
dominante de prdida de la audicin (DFNA1) en una familia
grande de Costa Rica (vase OMIM, entrada 124 900):
El producto de la protena humana DFNA1, DIAPH1, p l4 0 m Dia del ratn y Drosophila diaphanous son homlogos de la pro
tena B n ilp de Saccharomyces cerevisiae. Las protenas estn muy
conservadas. Los genes que codifican estas protenas son miem
bros de la familia gnica formina, que incluye asimismo al gen del
ratn de deformacin de la extremidad, Drosophila cappuccino, el
gen de Aspergillus nidulans sepA y los genes de Schizosaccharomyces p o m b efu sl y cdcl2 . Estos genes participan en la citocinesis y
establecimiento de la polaridad celular. Todas las forminas com
parten dominios de enlace de Rho en sus regiones terminales N,
tiras de poliprolina en la regin central de cada secuencia y domi
nios de homologa de formina en las regiones terminales C.
14.6
14.6.2 Mapeo de transcritos puros: sndrome

de Treacher-Collins
El sndrome de Treacher-Collins (STC; MIM 154 500) es un tras
torno autosmico dominante del desarrollo craneofacial con un fe
notipo variable que incluye anormalidades de los odos externo y
medio, hipoplasia de la mandbula y complejo cigomtico, adems
de paladar hendido. El enlace se estableci de forma inicial en 1991
con marcadores en 5q31-q34. Debido a que los marcadores en di
cha regin conocidos en esa poca no eran muy informativos, se
aislaron y utilizaron nuevos microsatlites para depurar la regin
candidata a 5q32-33.1. Se elabor un mapa gentico hbrido por
radiacin combinado a travs de este intervalo y en 1994 el grupo
pudo ensamblar un contiguo de cromosoma artificial de levadura
(YAC). Este ltimo se convirti en un contiguo csmido y se us
la seleccin de genotecas de cDNA y atrapamiento de exones para
generar un mapa de transcripcin. Se identificaron en la regin cr
tica cuando menos siete genes. Rondas adicionales de aislamiento
Ocho ejem plos ilustran diversas

form as de id en tific a r genes
de enferm edades
14.6.1 Identificacin directa de un gen a travs de una

anormalidad cromosmica: sndrome de Sotos
El sndrome de Sotos (MIM 117 550) se distingue por crecimien
to excesivo, caractersticas dismrficas y retraso mental. Casi todos
C ro m o s o m a 8
d er(5)
i b K i m m u IB M
G O D L L ftA I i f
tel
P A C /B A C
RP3-378023
RP1-32C5
RP1-251C21
RP3-469e8
> CTC-2301 a4
RP1-118m12
C6B i
c2B !
C s m id o
i c6A
c4D
CTC-549a4 (AC008570)
CTC-286c20 (AC027314)
S e c u e n c ia g e n m ic a
JA Z
431
FG FR 4
G en
12
Fig. 14-11. Una translocacin 5;8 equilibrada altera el gen NSD1 en un paciente con sndrome de Sotos.
Reproducido a partir de Kurotaki y colaboradores (2002), Nat. Genet. 30;365-366, con autorizacin de Nature Publishing Group.
432
CAPTULO CATORCE
pero an no se sabe con exactitud por qu las mutaciones causan el

sndrome de Treacher-Collins.
14.6.3 Secuenciacin y bsqueda de homlogos a gran

escala: sndrome branquiootorrenal
Fig. 14-12. Microdelecin de NSD1 demostrada mediante hibrida

cin de fluorescencia in situ en un paciente con sndrome de Sotos.
Se identificaron los dos homlogos del cromosoma 5 mediante una
sonda de HFIS roja que reconoce una secuencia en 5pter. La sonda
HFIS verde es una BAC de 5qter que contiene el gen NSD1; esta
secuencia carece de una copla del cromosoma 5. Reproducido a partir
de Kurotaki y colaboradores (2002), Nat. Genet. 30:365-366, con
autorizacin de Nature Publlshing Group.
de marcador y anlisis cruzado proporcionaron un cuadro confuso de

recombinaciones superpuestas, pero condujeron al final al aisla
miento de un cDNA incompleto candidato de una genoteca placentaria. Las pruebas Northern blottin gy zoo blootingmostraron que
el gen se expresaba de modo amplio y estaba conservado a travs de
la especie, pero las bsquedas en bases de datos no revelaron homo
logas de importancia. Se determin la estructura exn-intrn y el
anlisis de mutacin demostr diferentes mutaciones en cinco pa
cientes no relacionados.
El aislamiento del gen TCOF1 (Treacher-Collins Syndrome
Collaborative Group, 1996) ilustra la clonacin posicional en su
forma ms pura. No se reconocieron anormalidades cromosmicas
de consideracin (hubo cuatro sujetos con STC que tenan trans
locaciones o deleciones cromosmicas, pero los marcadores de ca
da uno de los puntos de rotura no mostraron enlace con STC en
estudios de familias, de tal manera que tal vez todos estos casos fue
ron coincidentes). No hay desequilibrio de enlace: este hecho no es
de sorprender, ya que 60% de los casos corresponde a mutaciones
nuevas. La regin candidata es abundante en genes, de modo que
haba muchos posibles candidatos y el gen que se identific al final
no tiene caractersticas que lo tornaran en un candidato en particu
lar prometedor. El producto del gen es una fosfoprotena nucleolar,
El sndrome autosmico dominante branquiootorrenal (BOR;

MIM 113 650: fstulas branquiales, malformacin de los odos ex
terno e interno con prdida de la audicin; hipoplasia o ausencia de
riones) se mape en 8ql3 con base en un indicio de un paciente
afectado que tena un reordenamiento del cromosoma 8. Se depur
el intervalo inicial de 7 cM a 470 a 650 kb mediante mapeo adi
cional y el descubrimiento de una delecin cromosmica submicroscpica en el sujeto mencionado. Se aislaron clonas P1 y PAC
mediante la seleccin de genotecas genmicas con marcadores den
tro de la regin candidata o cerca de ella y se llenaron las brechas
en los contiguos mediante caminata cromosmica. La va cubier
ta mnima a travs de la regin candidata incluy tres clonas P1 y
tres PAC.
Se decidi identificar los genes en el contiguo mediante se
cuencias a una gran escala. Al contrastar la secuencia con EMBL
y GenBank, las bases de datos de protenas y cido nucleico re
velaron homologa entre parte de la secuencia obtenida y el gen
del desarrollo de ausencia d e ojos {eya) de Drosophila. Se busc la
secuencia genmica para marcos de lectura abiertos que se tradu
jeron y compararon con la secuencia de aminocidos de eya. Es
to hizo posible identificar siete posibles exones que mostraron
69% de identidad y 88% de similitud a nivel del aminocido con
la posible protena eya. A continuacin se aisl el cDNA huma
no de una genoteca de mRNA fetal total de nueve semanas y se
demostraron siete mutaciones en el gen, denominadas EYA1 en
42 pacientes con sndrome BOR no relacionados (Abdelhak y
cois., 1997).
A medida que se completen ms las bases de datos de secuen
cias genmicas, el tipo de anlisis que se llev a cabo aqu se cons
tituir en el mtodo estndar. Como en este caso, es posible que las
homologas con genes en organismos relacionados de forma distan
te sean ms aparentes en la secuencia de aminocidos que en la se
cuencia de DNA o el fenotipo. En esta etapa no se reconoci la
funcin del producto del gen ni tampoco fue obvio por qu el fe
notipo de Drosophila consiste en disminucin o ausencia de ojos
compuestos, en tanto que los seres humanos no tienen problemas
oculares. Como sucede con frecuencia con la clonacin posicional,
la identificacin del gen fue tan slo el inicio para comprender el
sndrome.
14.6.4 Candidatos posicionales definidos mediante

funcin: rodopsina y fibrilina
El gen del fotopigmento humano rodopsina (RHO) se clon en
1984 y se mape en 3q21-qter en 1986. Entre los trastornos que
incluyen degeneracin hereditaria de la retina se encuentran las di
versas formas de retinitis pigmentosa (RP), que se caracterizan por
prdida visual progresiva que resulta de la aglomeracin del pig
mento retiniano. Aunque RHO fue un posible gen candidato para
algunas formas de RP, se sabe que slo uno de muchos genes que
codifican protenas participan en la fototransduccin. Sin embar
go, en 1989 el anlisis de enlace en una familia irlandesa grande
con RP mape su gen de enfermedad en 3q en la cercana del fotopigmento humano rodopsina {RHO). ste era ahora un gen can-
14.6 OCHO EJEMPLOS ILUSTRAN DIVERSAS FORMAS DE IDENTIFICAR GENES DE ENFERMEDADES
c^dato importante y en el transcurso de un ao se identificaron

ntaciones especficas de pacientes (vase entrada OMIM 180
380).
El fenotipo del sndrome de Marfan (SM, MIM 154 700:
crecimiento excesivo de huesos largos; articulaciones laxas; luxa
cin de los cristalinos; riesgo de aneurismas articos) sugiri
cierta anormalidad en el tejido conjuntivo. El anlisis de enlace
.ape el gen del SM en 15q. Cuando se localiz el gen para la

rrotena de tejido conjuntivo fibrilina en 15q21.1 mediante hi
bridacin in situ, se constituy en un candidato posicional obvio.
Poco tiempo despus se demostraron mutaciones en pacientes
ion SM (vase McKusick, 1991, para un comentario de los ante
cedentes).
14.6.5 Un candidato posicional identificado a travs de

la comparacin de mapas humanos y de ratn:
PAX3 y sndrome de Waardenburg
El sndrome de Waardenburg tipo 1 (SW1, MIM 193 500) ilus
tra el valor de las comparaciones entre ser humano y ratn. En la
gura 4-5C se muestra la genealoga de este padecimiento autosmico dominante pero variable. Las anormalidades pigmenta
rias y la prdida de la audicin caractersticas del SW1 se deben
a la ausencia de melanocitos en las partes afectadas, incluido el
odo interno, en donde se requieren melanocitos en las estras
vasculares de la cclea a fin de que se desarrolle la audicin nor
mal. El anlisis de enlace, asistido mediante la descripcin de
una anormalidad cromosmica en un paciente afectado, localiz el
gen del SW1 en la parte distal de 2q. Esta regin cromosmica
tiene una sintenia conservada fuertemente con parte del cromoso
ma 1 del ratn. En este punto surgi un probable homlogo del
ratn. El ratn mutante Splotch (Sp) sufre anormalidades pigmen
tarias secundarias a la ausencia de melanocitos en placas. Esto qui
z resulta de un defecto de la cresta neural embrionaria. A pesar de
varias diferencias entre los dos fenotipos, pareca bastante proba
ble que Sp y SW 1 eran consecutivos a mutaciones en genes ort
logos.
No se haba identificado ningn gen, pero surgi un candidato
posicional cuando se mape el gen murino Pax-3 en la cercana del
locus Sp. Pax-3 codifica un factor de transcripcin que se expresa
en embriones de ratones en el sistema nervioso en desarrollo, que
incluye la cresta neural. La secuencia de Pax-3 murino fue casi
idntica a la secuencia limitada publicada antes para una clona ge
nmica humana no mapeada, HuP2. Estas observaciones llevaron
a la seleccin de mutacin de Pax-3 y HuP2 y a la identificacin de
mutaciones en el ratn Splotch y seres humanos con SW 1 (revisado
por Strachan y Read, 1994). Debido a que los genes subyacentes
eran ortlogos con claridad, se cambi el nombre del gen HuP2 por
PAX3.
14.6.6 Interferencia de la funcin in vitro: anemia

de Fanconi
La anemia de Fanconi es un trastorno recesivo con anomalas
congnitas muy diversas, en especial aplasia radial y predisposi
cin a insuficiencia de la mdula sea y afeccin maligna, en par
ticular leucemia mielgena aguda. El problema subyacente es un
defecto de la capacidad para reparar DNA daado. Este defecto
433
puede observarse en cultivos celulares en la forma de hipersensibilidad a agentes de enlace cruzado de DNA como diepoxibutano.
Experimentos de fusin celular permitieron dividir a los pacientes
con Fanconi cuando menos en ocho grupos de complementacin
(A-H): cuando se fusionaron, se complementaron entre s clulas
de sujetos en diferentes grupos, en tanto que las de enfermos en el
mismo grupo permanecieron defectuosas. Tras estudiar las clonas
de una genoteca de cDNA en cuanto a su capacidad para curar la
sensibilidad celular a diepoxibutano de un paciente con anemia de
Fanconi del grupo C, Strathdee y colegas (1992) pudieron aislar el
gen de la anemia de Fanconi del grupo C (AFGC; MIM 227 645).
Una conducta similar identific despus los genes de los grupos A
(AFGA) y G (AFGG). En otras aplicaciones de la clonacin funcio
nal se utiliz la capacidad de cromosomas o clonas transferidos pa
ra corregir el crecimiento incontrolable de lneas de clulas
tumorales a fin de ayudar a localizar y despus identificar genes supresores de tumor (seccin 17.4).
14.6.7 Interferencia de funcin in vivo: miosina 15

y sordera DFNB3
Algunas veces se identific un gen de enfermedad del ratn me
diante el rescate del fenotipo mutante con un transgn de DNA ti
po silvestre de una regin candidata. Esta medida se utiliz por
primera vez para reconocer un gen reloj (Antoch y cois., 1997) y en
fecha ms reciente fue un paso crucial en la identificacin del gen
de la sordera humana DFNB3 (Probst y col., 1998; fig. 14-13). El
mapeo comparativo demostr que DFNB3 se hallaba en una posi
cin en seres humanos correspondiente a la localizacin del gen de
la sordera shaker-2 en el ratn. El ratn transgnico shaker-2 se
construy al usar BAC tipo silvestre de la regin candidata shaker2. Se identific un BAC que corrigi el fenotipo y result que con
tena un gen de miosina no convencional, myo 15. A continuacin
se aisl el gen humano M YOl5 con base en su homologa cercana
al gen del ratn, se confirm su posicin dentro de la regin can
didata DFNB3 y en seguida se demostraron mutaciones en DFNB3
en personas afectadas.
14.6.8 Interferencia del patrn de expresin: otoferlina

Las genotecas de cDNA de genes que se expresan de forma espe
cfica en el odo interno del ratn son herramientas tiles para
identificar genes candidatos de la sordera. Las genotecas se pro
ducen mediante hibridacin sustractiva de una genoteca de cD
NA del odo interno contra una o ms genotecas inespecficas, a
fin de intentar extraer genes que se expresan en una variedad de
tejidos -un truco tcnico (Swaroop y cois., 1991)-. Ya se observ el
anlisis de enlace que mape el gen de la sordera no sindrmico
DFNB9 (fig. 13-8). Durante la clonacin posicional subsecuente
(Yasunaga y cois., 1999), una secuencia gnica parcial de una re
gin crtica mostr 90% de identidad de aminocidos y 97% de
similitud con una clona de la genoteca del odo interno del ra
tn. El gen, que se denomin otoferlin, se caracteriz por com
pleto y la seleccin de mutacin revel una mutacin sin sentido
en la familia.
Una conducta alternativa pudo consistir en identificar homlo
gos humanos de las clonas del ratn y mapearlos mediante HFIS
(seccin 2.4.2). A continuacin habran sido candidatos posicionales para cualquier gen de sordera mapeado en la posicin corres
pondiente.
434
CAPTULO CATORCE
R at n sh a k e r-2
s h 2 /s h 2
Sordo; la disfuncin - >

vestibular causa
circunduccin y
sacud ida d e la ca b eza
-
Utilizar cruzam ientos de ratn
para m apear sh2 en la regin
de 1 cM del cromosoma 11 del ratn
Las clonas BAC aisladas

recubren la regin candidata
del ratn tipo silvestre
ste corresponde a 17p11.2

en seres humanos, la regin candidata
para el gen de sordera DFNB3
sh2/sh2 p a ra c re a r rato n e s
R at n silve stre
In y e c ta r h u e vo s fe c u n d a d o s
tra n s g n ic o s
BAC 425 p24

co rrig e el
d e fe c to sh2
I8 9 2 F
N 890Y
K 1300X
M u ta c io n e s M Y 0 1 5
id e n tific a d a s en tres
p a c ie n te s D FN B 3
no re la c io n a d o s
1. Gen M Y015 humano

aislado mediante
cebadores diseados
a partir del ratn
2. U sar hbridos d e clulas
som ticas para revisar si
m a p e a en 17 p 1 1.2
C674Y
S e c u e n c ia B A C 4 2 5 p 2 4
M u ta c i n m yo15
id e n tific a d a en
el rat n sh2
El anlisis por co m p u tad o ra

identifica un nuevo gen
d e m iosina, myo15
Fig. 14-13. Complementacin funcional en ratones transgnicos como una herramienta para identificar un gen de enfermedad humana.
Se identific una mutacin del ratn shaker-2 al reconocer una clona de tipo silvestre que corrigi el defecto. Las familias humanas con un fenotipo
similar que se mapea en la localizacin cromosmica correspondiente mostraron mutaciones en el gen ortlogo.
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CAPTULO
QUIN CE
M apeo e identificacin d e gen es

que confieren susceptibilidad
a enferm edades com plejas
15.1
15.2
15.3
15.4
15.5
15.6
15.7
Decidir si un carcter no mendeliano es gentico: funcin

de los estudios de familia, gemelos y adopcin
El anlisis de segregacin permite analizar los caracteres que se
encuentran en cualquier parte del espectro entre puramente mendeliano
y slo polignico
Anlisis de enlace de caracteres complejos
Estudios de asociacin y desequilibrio de enlace
Identificacin de alelos de susceptibilidad
Ocho ejemplos que ilustran el xito variable de la diseccin gentica
de enfermedades complejas
Generalidades y resumen
Recuadro 15-1
Recuadro 15-2
Recuadro 15-3
Recuadro 15-4
tica, recuadro 1
Correccin de la relacin de segregacin

Mediciones de desequilibrio de enlace
Prueba de desequilibrio de transmisin (PDT) para determinar
si el alelo marcador M1 se relaciona con una enfermedad
Tamaos de muestras necesarios para encontrar un locus de
susceptibilidad a una enfermedad por el estudio del genoma completo
mediante el uso de pares de hermanos afectados (PHA) o la prueba
de desequilibrio de transmisin (PDT)
Enfermedad de Alzheimer, prueba de ApoE y discriminacin
438 CAPITULO QUINCE j MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
reducir la regin candidato por medio del estudio de relaciones

de poblacin;
nos o que se acompaan de una anormalidad cromosmica. Sin

embargo, con los caracteres no mendelianos, sea continuos (cuan
titativos) o discontinuos (dictomos), es necesario probar las
afirmaciones de determinacin gentica. El medio obvio para
abordarlo es demostrar que el carcter se presenta en familias. El
grado de agrupamiento familiar de una enfermedad puede expre
sarse mediante la cantidad X.&e l riesgo para el fa m iliar R d e un pro
bando afectado comparado con el riesgo en la poblacin. Es posible
calcular valores separados para cada tipo de familiar, por ejemplo,
\s, para hermanos. Las propiedades matemticas de \R fueron de
rivadas por Risch (1990a). El cuadro 15-1 muestra datos manco
munados de varios estudios de esquizofrenia. El agrupamiento
familiar es evidente por los valores elevados de . y, como cabe es
perar, tales valores disminuyen de nuevo a 1 para relaciones ms
distantes.
identificar las variantes de secuencias de DNA que confieren

susceptibilidad y definir su accin bioqumica.
15.1.2 Importancia del ambiente familiar compartido
En todo el mundo la principal contribucin gentica a la morbi

lidad y la mortalidad la hace el componente gentico de las en
fermedades frecuentes. En consecuencia una labor central de la
investigacin mdica se relaciona con la identificacin de los ge
nes. Una secuencia lgica para investigar cualquier enfermedad
compleja sera:
realizar estudios de familia, gemelos o adopcin a fin de com
probar que la susceptibilidad es gentica cuando menos en parte;
utilizar anlisis de segregacin para estimar el tipo y la fre
cuencia de alelos de susceptibilidad;
mapear locus de susceptibilidad mediante anlisis de enlace,
por lo general de pares de hermanos afectados;
A continuacin se desarrollan estos pasos, seguidos del comentario

de ocho enfermedades especficas para ilustrar lo que puede ocurrir
en la prctica. Por ltimo se comenta la pregunta an abierta de si
este paradigma completo para identificar factores de susceptibili
dad es la clave del futuro de la gentica mdica o si, como algunos
afirman, no es probable que tenga xito en general.
15 .1
D ecidir si un c a r c te r no
m endeliano es gentico:
funcin de los estudios de
fa m ilia , gem elos y adopcin
15.1.1 El valor lambda es una medida de agrupamiento

familiar
Nadie discutira la participacin de genes en un carcter que pro
porciona de manera consistente patrones de genealoga mendelia-
Los genetistas nunca deben olvidar que los padres proporcionan

a sus hijos tanto su ambiente como sus genes. Muchos caracteres
se presentan en familias a causa del am biente fa m ilia r compartido
por ejemplo, si el lenguaje nativo de la persona es ingls o chi
no-. Por consiguiente siempre es necesario preguntar si el am
biente compartido puede explicar un carcter familiar. Esto tiene
importancia especial en atributos conductuales, como el IQ o la
esquizofrenia, que dependen cuando menos en parte de la crian
za. No es posible ignorar inclusive los caracteres fsicos o los de
fectos de nacimiento: una familia podra compartir una dieta
poco usual o algn medicamento tradicional que tal vez cause de
fectos del desarrollo. Se requiere algo ms que una tendencia fa
miliar para demostrar que un carcter no mendeliano est
controlado genticamente. La bibliografa mdica no siempre
consigna estas influencias con la claridad necesaria. El cuadro 15-5
muestra lo que puede ocurrir si el ambiente familiar compartido
se ignora.
Cuadro 15-1. Riesgo de esquizofrenia entre familiares de esquizofrnicos: resultados mancomunados de varios estudios
Familiar
Nm. con riesgo3
Riesgo, %
xb
Padres
8020
Hermanos
9920.7
10.1
12.6
Hermanos, un padre afectado
5.6
623.5
16.7
20.8
1577.3
12.8
16
Descendencia, ambos padres afectados
134
46.3
58
Medios hermanos
499.5
4.2
5.2
Descendencia
Tos, tas, sobrinos, sobrinas
6386.5
2.8
3.5
Nietos
739.5
3.7
4.6
Primos
1600.5
2.4
aLos nmeros con riesgo se corrigieran para permitir que algunos familiares en riesgo estuvieran abajo o justo en la edad de riesgo de esquizofrenia (es
decir, 15 a 35 aos de edad).
t o s valores X se calcularon con base en una incidencia en la poblacin de 0.8%.
Datos obtenidos por McGuffin (1984).
15.1
DECIDIR SI UN CARCTER NO MENDELIANO ES GENTICO.
15.1.3 Los estudios de gemelos adolecen de muchas

limitaciones
Francis Galton, quien estableci gran parte de la base de la genti
ca cuantitativa, seal el valor de los gemelos para la gentica. Los
gem elos m onocigticos (MC) son clonas genticam ente idnticas y
siempre sern concordantes (ambas iguales) para cualquier carcter
heredado genticamente. Esto es cierto con independencia del mo
do de herencia o del nmero de genes relacionados; las nicas ex
cepciones son los caracteres que dependen de cambios genticos
somticos poscigticos (el patrn de inactivacin X en mujeres, el
repertorio de genes funcionales de inmunoglobulina y del receptor
de clula T, etc.). Los gem elos dicigticos (DC) comparten la m itad de
sus genes en prom edio, como cualquier par de hermanos. En conse
cuencia los caracteres genticos deben mostrar una concordancia
ms alta en gemelos MC que en DC y en muchos caracteres as es
(cuadro 15-2).
Sin embargo, una concordancia ms alta en gemelos MC que
en los DC no prueba un efecto gentico. Para iniciar, la mitad de
los gemelos DC es de sexo diferente, en tanto que todos los gemelos
MC son del mismo sexo. Aun si la comparacin se restringe a ge
melos DC del mismo sexo (como en los estudios que se muestran
en el cuadro 15-2) podra decirse que, cuando menos para caracte
res conductuales, es ms probable que los gemelos MC sean muy
similares, se vistan y traten igual y, por tanto, compartan ms de su
ambiente que los gemelos DC.
Los gemelos MC que se separan al nacer y se cran en ambien
tes por completo separados constituiran un experimento ideal
(Francis Crick sugiri de manera irnica que una vez que nacen ge
melos deben donarse a la ciencia para este propsito). En aos pre
tritos estas separaciones eran ms frecuentes de lo que cabra esperar
porque a veces el nacimiento de gemelos era el golpe de gracia para
una madre con una carga excesiva. Pueden hacerse programas de te-
Cuadro 15-2. Estudios de gemelos en esquizofrenia.

Estudio
Pares MC
concordantes
Pares DC
concordantes
Kringlen, 1968
14/55 (21/55)
Fischer, 1969
5/21 (10/21)
10-19%
Tienari, 1975
3/20 (5/16)
3/42
Farmer, 1987
6 /1 6 (1 0 /2 0 )
1/21 (4/31)
Onstad, 1991
8/24
1/28
4-10%
Los nmeros muestran concordancias en pares, es decir, cuentas del

nmero de pares concordantes ( + / + ) y discordantes ( + / - ) indagados
a travs del probando afectado. Las cifras entre parntesis se obtienen
utilizando una definicin ms amplia de afectado que incluye fenotipos
limtrofes. La concordancia tambin puede calcularse a nivel de pro
bando contando dos veces un par si ambos eran probandos. Esto pro
porciona valores ms altos para la concordancia monocigtica (MC).
Se piensa que las concordancias a nivel de probando son ms compa
rables con otras medidas de agrupamiento familiar. Slo en los estu
dios de Onstad y Farmer se emplean los criterios diagnsticos estndar
actuales, DSM-lll. Para referencias, vase Onstad y colaboradores
(1991) y Fischer y colaboradores (1969).
439
levisin fascinantes acerca de gemelos que se reunieron despus de 40

aos de separacin y descubrieron que tenan trabajos similares, usa
ban ropas parecidas y gustaban de la misma msica. Sin embargo, los
gemelos separados pueden tener muchos inconvenientes como ma
terial de investigacin:
cualquier investigacin se basa siempre en nmeros pequeos
de personas discutiblemente excepcionales;
con frecuencia la separacin no fue total: a menudo estuvieron
separados algn tiempo despus de nacer y fueron reunidos por
familiares;
hay un sesgo de indagacin: todos desean saber en cuanto a
gemelos separados muy similares, pero los muy diferentes no
son una noticia que merezca la pena;
inclusive en principio, la investigacin en gemelos separados no
puede diferenciar causas ambientales intrauterinas de las genti
cas. Esto puede ser importante, por ejemplo, en estudios de
orientacin sexual (el gen homosexual), en los que algunas
personas sugieren que las hormonas maternas pueden afectar el
feto in tero a fin de influir en su orientacin sexual futura.
En consecuencia, por toda su fascinacin anecdtica, la contribu
cin de los gemelos separados a la investigacin gentica humana
es hasta cierto punto poca.
15.1.4 Estudios de adopcin: el estndar ideal para

desenmaraar factores genticos y ambientales
Cuando la separacin de gemelos no es un medio prctico para de
senmaraar el ambiente hereditario del familiar, la adopcin es mu
cho ms prometedora. Es posible disear dos estudios:
encontrar personas adoptadas que sufrieron una enfermedad
particular que se sabe que se presenta en familias y preguntarles
si la padeca su familia biolgica o su familia adoptiva;
encontrar a los padres afectados cuyos nios se adoptaron lejos
de la familia y preguntarles si este hecho salv a los nios de la
enfermedad familiar.
Un estudio celebrado (y controversial) de Rosenthal y Kety (va
se Lecturas adicionales) utiliz el primero de estos diseos para
estudiar factores genticos en la esquizofrenia. Los criterios diag
nsticos empleados en este estudio recibieron crticas; tambin se
sostuvo (disput) que no todos los diagnsticos se establecieron
en realidad en forma ciega. Sin embargo, un nuevo anlisis inde
pendiente en el que se aplicaron criterios diagnsticos del DSMIII (Kendler y cois., 1994) alcanz las mismas conclusiones. El
cuadro 15-3 muestra los resultados de una extensin posterior de
este estudio (Kety y cois., 1994).
El principal obstculo en estudios de adopcin es la fa lta de in
form acin de la fam ilia biolgica, que a menudo empeora por lo in
deseable de abordarlos con preguntas. Slo unos cuantos pases
cuentan con registros de adopcin eficientes. Un problema secun
dario es la colocacin selectiva, en la que la agencia de adopcin, en
el inters del nio, elige una familia que es probable que se aseme
je a la biolgica. Aunque resulta indudable que los estudios de
adopcin son el estndar ideal para controlar qu tanto un carcter
est determinado genticamente, como son tan difciles, se realizan
sobre todo slo para padecimientos psiquitricos en los que los ar
gumentos de naturaleza-crianza son en particular contenciosos.
440 | CAPTULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
Cuadro 15-3. Un estudio de adopcin en esquizofrenia.

Casos de esquizofrenia
entre familiares biolgicos
Casos de esquizofrenia
entre familiares adoptivos
Casos ndice (47 esquizofrnicos crnicos adoptados)
44/279 (15.8%)
2 /111 (1 .8%)
Adoptados testigo (compatibles por edad, sexo, estado social
5/234 (2.1%)
2/117(1.7% )
de la familia adoptiva y nmero de aos institucionalizados)

El estudio incluy a 14 427 personas adoptadas de 20 a 40 aos de edad en Dinamarca, 47 de las cuales se diagnosticaron como esquizofrnicos
crnicos.
Los 47 se compararon con 47 sujetos testigo no esquizofrnicos del mism o grupo de adoptados. Datos de Kety y colaboradores (1994).
15.2
El anlisis de segregacin perm ite

analizar los caracteres que se
encuentran en cualquier parte
del espectro entre puram ente
m endeliano y slo polignico
Como se observa en la figura 4-6, los caracteres puramente mendelianos y los slo polignicos constituyen los extremos opuestos de
un continuo. Entre ellos se encuentran los caracteres oligognicos
regidos por unos cuantos locus de susceptibilidad mayor, que tal
vez operan contra un fondo polignico y pueden estar sujetos a
muchas influencias ambientales. El anlisis de segregacin es el
principal mtodo estadstico para analizar la herencia de cualquier
carcter. Puede brindar evidencias a favor o en contra de un locus
de susceptibilidad mayor y definir cuando menos en parte sus pro
piedades. Los resultados pueden ayudar a guiar estudios futuros de
enlace o de asociacin.
15.2.1 El sesgo de indagacin suele ser un

problema con datos familiares: el ejemplo
de padecimientos autosmicos recesivos
Puesto que los estudios de enfermedades se basan en la reunin de
casos y familias, el primer paso consiste en considerar los sesgos que
el mtodo de indagacin puede imponer en los datos crudos. El
anlisis de segregacin requiere grandes grupos de datos y es muy
sensible a sesgos sutiles en la manera en que se renen los datos. Un
ejemplo mendeliano puede ilustrar lo anterior. Supngase que se
desea demostrar que un padecimiento es autosmico recesivo. Po
dra reunirse a un grupo de familias y revisarse que la relacin de
segregacin (la proporcin de nios afectados) es de uno en cua
tro. A primera vista esto parecera una labor trivial, a condicin de
que el padecimiento no sea muy raro. Pero de hecho la proporcin
esperada de nios afectados en la muestra no es de uno en cuatro.
El problema es el sesgo de indagacin.
Si se asume que no hay una forma independiente de reconocer
a los portadores, los familiares se identificarn a travs del nio
afectado. Por consiguiente las familias que se muestran sombreadas
en la figura 15-1 no se indagarn y la relacin de segregacin ob
servada en las familias de dos nios reunidas no es de 1/4 sino de
8/14. Las familias con tres nios, que se estudian en la misma for
ma, daran una relacin de segregacin distinta: 48/111. La rela
cin para cualquier tamao de familia determinado puede
estimarse a partir de la distribucin binomial truncada, una ex
pansin binomial de (1/4 + 3/4)" en la que el ltimo trmino (nin
guno afectado) se omite. Los datos experimentales para este sesgo
pueden corregirse de modo simple por el mtodo de Li y Mantel
que se muestra en el recuadro 15-1.
El ejemplo anterior presupone una indagacin truncada com
pleta: los autores renen a todas las familias de cierta poblacin de
finida que tienen cuando menos un nio afectado, pero ste no es
el nico medio posible de reunir familias. Podran investigarse los
nios afectados tomando los 100 primeros observados en una cl
nica muy ocupada (de manera que podran haberse averiguado mu
chos ms de la misma poblacin si se efectuara por ms tiempo).
Bajo estas condiciones es el doble de probable que una familia con
dos nios afectados se capte como si fuera una con slo un nio
afectado y es cuatro veces ms probable una con cuatro afectados.
La seleccin aislada, en la que la probabilidad de ser investigado es
proporcional al nmero de nios afectados en la familia, introduce
un sesgo de indagacin diferente y demanda una correccin esta
dstica distinta (vase recuadro 15-1). Los autores observaron que
resolver una relacin d e segregacin requiere datos que se reunieron en
concordancia con un esquema explcito de indagacin, de modo que
pueden aplicarse las correcciones apropiadas.
15.2.2 El anlisis de segregacin compleja es un

mtodo general para estimar la mezcla ms
probable de factores genticos en datos
mancomunados de familias
El anlisis de datos de los familiares de un conjunto grande de
personas afectadas por una enfermedad familiar pero no mendeliana no es una labor simple. Podran actuar factores tanto gen
ticos como ambientales; es posible que los factores genticos sean
polignicos, oligognicos o mendelianos con cualquier modali
dad de herencia, o una combinacin de ellos, en tanto que los
factores ambientales pueden incluir variables tanto familiares co
mo no familiares. En el anlisis de segregacin compleja se per
mite una gama completa de posibles mecanismos, frecuencias
15.2 I EL ANLISIS DE SEGREGACIN PERMITE ANALIZAR LOS CARACTERES
IZ H rO
EH-
S -T -
IZ h r-
-h 1
H - r -
E H r-
E H rK 2
0 -r-

t c 1)'
Total d e nios : A A 2-
A a 1- |
aa
A A 2.
Aa ^
aa ^
32
In d a g a d o s :
32
32
C o rre c c i n (L i-M a n te l): p = (R - S )/(T - S) = (8 - 6 )/(1 4 - 6) = = 0 .2 5

8
Fig. 15-1. Indagacin sesgada de familias con un padecimiento autosmico recesivo (indagacin truncada completa).
Ambos padres son portadores de un padecimiento autosmico recesivo. En total, un nio en cuatro est afectado -pe ro si las familias se Indagan a
travs de nios afectados, slo se captarn las familias que se muestran en el rea sombreada y la proporcin de nios afectados es 8 de cada 14 -, La
relacin verdadera se recupera mediante la correccin de Li-Mantel (recuadro 15-1).
gnicas, penetraciones, etc., y la computadora efecta un anli

sis de probabilidad mxima para encontrar la mezcla de valores
parmetro que proporciona la mayor probabilidad total para los
datos observados. El recuadro 15-4 muestra un ejemplo. Igual
que con el anlisis de calificacin lod (cap. 13), la pregunta es
qu tanto ms son probables las observaciones en una hiptesis
comparada con otra.
En el ejemplo del cuadro 15-4 se compar la capacidad de mo
delos especficos (espordico, polignico, dominante, recesivo) pa
ra explicar los datos con la posibilidad calculada mediante un
modelo general (modelo mixto) en el que la computadora pudo

optimar con libertad la mezcla de causas de gen nico, polignicas
y ambientales aleatorias. Todos los modelos se restringieron por in
cidencias totales, relaciones de sexo y probabilidades de indagacin
estimadas a partir de los datos reunidos. Un modelo dominante de
locus nico no es mucho peor que el modelo mixto para explicar
los datos (x = 2.8; p = 0.42), en tanto que los modelos que asu
men ausencia de factores genticos, herencia polignica pura o he
rencia recesiva pura se comporten muy mal. Si se argumenta que
las explicaciones simples son preferibles a las complicadas, el anlisis
Recuadro 15 -1. Correccin de la relacin de segregacin

Indagacin del truncado completo:
p = (R -S )/(T-S )
Seleccin nica:
p = (R -N )/(T-N )
p = relacin de segregacin verdadera (no sesgada)

R = nmero de nios afectados
S = nmero de nios nicos afectados (los nicos nios afectados en la familia)
T = nmero total de nios
N = nmero de hermanos
442 | CAPTULO QUINCE
MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
sugiere la existencia de una susceptibilidad dominante mayor en

la enfermedad de Hirschsprung. Varios de esos factores estn iden
tificados en la actualidad (seccin 15.6.2).
Sin importar la habilidad del programa de anlisis de segrega
cin, slo puede maximizar la posibilidad mediante los parmetros
que se le proporcionan. El resultado puede ser engaoso si se omi
te un factor mayor. Los datos de McGuffin y Huckle ilustran bien
este hecho (cuadro 15-5). Ellos interrogaron respecto a clases de es
tudiantes mdicos cuyos familiares asistieron a escuelas de medici
na. Cuando alimentaron los resultados a travs de un programa de
anlisis de segregacin, ste present resultados que parecan favore
cer la existencia de un gen recesivo para quienes asistieron a la escue
la de medicina. Aunque divertido, no se realiz como una broma, ni
tampoco con objeto de desacreditar el anlisis de segregacin. Los
autores no permitieron que la computadora considerara el probable
mecanismo verdadero: el ambiente familiar compartido. La siguien
te mejor alternativa de la computadora fixe vlida en trminos mate
mticos pero no realista desde la perspectiva biolgica. El punto
importante que McGuffin y Huckle estudiaron es que muchas posi
bles trampas en el anlisis de segregacin de caracteres conductuales
humanos y los anlisis no cuidadosos pueden generar efectos genti
cos falsos.
15.3
Anlisis de enlace de c a ra c te re s
com plejos
15.3.1 El anlisis de calificacin lod estndar no suele

ser apropiado para caracteres no mendelianos
El anlisis de calificacin lod estndar se denomina paramtrico
porque requiere un modelo gentico preciso, que detalle la moda
lidad de herencia, las frecuencias gnicas y la penetrancia de cada
genotipo. En tanto se dispone de un modelo vlido, el enlace para
mtrico constituye un mtodo en extremo potente para explorar el
genoma en segmentos de 20 Mb a fin de localizar un gen de enfer
medad. Aunque la especificacin de un modelo adecuado no debe
ser un gran problema para caracteres mendelianos, los padecimien
tos no mendelianos son mucho menos manejables.
El problema crucial de los criterios diagnsticos

Un problema importante consiste en establecer criterios diagnsti
cos que sean relevantes para el anlisis gentico. Las caractersticas
de un paciente que forman parte del sndrome y las que son coincidentales suelen ser bastante obvias en los sndromes mendelianos.
Diferentes caractersticas pueden tener distintas penetrancias, pero
Cuadro 15-4. Anlisis de segregacin complejos.

M odelo
Mixto
1.00
7.51
9.6
x 10-6
0.01
0.15
Espordico
Polignico
1.00
Locus recesivo mayor
0 .0 0
8.22
3.8
x 10~3
Locus dominante mayor
1.00
7.56
1.2
x 1 0 '5
1.00
0.19
x2
334
<1
x 10~5
78
<1
x 105
35
<1
x 10~5
2.8
0.42
Los datos son de familias descubiertas a travs de un probando con enfermedad de Hirschsprung de segmento largo. Los parmetros que pueden variar
son t (la diferencia en el riesgo entre personas homocigotas para los alelos de susceptibilidad baja y de susceptibilidad alta de un gen de susceptibilidad
mayor, medidos en unidades de desviacin estndar de riesgo), d (el grado de dominancia de cualquier alelo de enfermedad mayor), q (la frecuencia gnica
de cualquier alelo de enfermedad mayor), H (la proporcin de varianza total en el riesgo debida a herencia polignica, en adultos), z (la relacin de herencia
en nios con herencia en adultos) y x (proporcin de casos debidos a nueva mutacin). Un locus mayor aislado que codifica susceptibilidad dominante ex
plica los datos, as como un modelo general en el que se permite una mezcla de todos los mecanismos. Datos de Badner y colaboradores 1990.
Cuadro 1 5 -5 . Un gen recesivo para asistir a la escuela de medicina?

M odelo
Mixto
0.087
4.04
0.089
0.008
Espordico
Polignico
Locus recesivo mayor
0.845
0.00
7.62
0.88
x2
163
<1
14.4
0.005
0.11
N.S.
x 10~5
Datos de McGuffin y Huckle (1990) de una encuesta de estudiantes de medicina y sus familias. El significado de los smbolos es el mism o que el del
cuadro 15-4. "Afectado se define como asistir a la escuela de medicina. Al parecer el anlisis apoya la herencia recesiva ya que explica tan bien los da
tos como el modelo no restrictivo. El objeto de este trabajo es ilustrar cmo el anlisis de datos familiares puede producir resultados falsos si se ignora
el ambiente familiar compartido (vase texto).
15.3 I ANLISIS DE ENLACE DE CARACTERES COMPLEJOS
443
Una vez que los criterios diagnsticos se acuerdan, un mtodo pa

ra el anlisis gentico es buscar un subgrupo de familias en las que
el padecimiento se segregue en una forma casi mendeliana. El an
lisis de segregacin se utiliza para definir los parmetros de un mo
delo gentico en estas familias, que luego se emplea en un anlisis
de enlace estndar (paramtrico). Estas familias pueden surgir en
tres formas:
(Risch 1990a, b, c). Los mtodos de segmento compartido pue

den emplearse dentro de familias (seccin 15.3.3) o en poblaciones
completas (seccin 15.4).
Es importante distinguir los segmentos idnticos por descen
diente (IPD) de los idnticos por estado (IPE). Los alelos IPD
son copias demostrables del mismo alelo ancestral (casi siempre parentai). Los alelos IPE se ven idnticos, y de hecho pueden serlo, pero su
ancestro comn no es demostrable y por consiguiente deben tratar
se matemticamente en trminos de frecuencia de poblacin en lu
gar de probabilidad mendeliana de herencia del ancestro comn
definido. La figura 15-2 ilustra la diferencia. Para alelos muy raros
no son probables dos orgenes independientes, de manera que IPE
por lo general implica IPD, pero esto no es cierto para alelos comu
nes. Los microsatlites multialelos son ms eficientes que los mar
cadores de dos alelos para definir IPD y los haplotipos multialelos
multilocus son aun mejores porque cualquier haplotipo puede ser
raro. El anlisis de segmento compartido puede efectuarse con da
tos de IPE o IPD, a condicin de que se utilice el anlisis apropia
do. El IPD es el ms potente, pero requiere muestras de ms
familiares. En una genealoga compleja con varias personas afecta
das puede emplearse informacin del marcador para calcular la
probabilidad de que un par de familiares afectados comparta haplo
tipos idnticos por descendiente (IPD) (Arnos y cois., 1990).
es probable que cualquier enfermedad compleja sea heterognea,

de manera que la reunin de familias bien puede incluir alguna
con padecimientos mendelianos no diferenciables en cuando a
fenotipo de la mayora no mendeliana;
15.3.3 Anlisis de segmento compartido en familias:

anlisis de par de hermanos afectados y
miembro de la genealoga afectada
los componentes del sndrome son los que se cosegregan en un pa

trn mendeliano. Este control de la realidad no existe en los pade
cimientos no mendelianos. Se realizan grandes esfuerzos, sobre
todo en enfermedades psiquitricas, con objeto de establecer cate
goras diagnsticas que sean vlidas, en el sentido de que dos inves
tigadores independientes concuerden en si se aplic o no cierta
designacin a un paciente determinado. Pero una designacin diag
nstica puede ser vlida sin ser biolgicamente significativa. Por lo
general los criterios diagnsticos son arbitrarios desde el punto de
vista biolgico, sobre todo en fenotipos psiquitricos y conductuales. Adherirse a ellos permite que estudios diferentes sean compara
bles, pero no garantiza que se est haciendo la pregunta gentica
adecuada.
Anlisis de enlace en familias casi mendelianas
las familias casi mendelianas puede representar casos en los que,

por azar, la mayora de las personas ya presenta muchos deter
minantes de la enfermedad, de modo que el balance se tipifica
por la segregacin mendeliana de slo uno de los mltiples fac
tores de susceptibilidad;
el patrn casi mendeliano puede ser falso: apenas agregaciones
al azar de personas afectadas dentro de una familia.
En el primer caso tiene un valor intrnseco valioso identificar el
subgrupo mendeliano, pero no siempre arroja alguna luz sobre las
causas de la enfermedad no mendeliana. Esto ocurri con el cncer
de mama (seccin 15.6.1) y la enfermedad de Alzheimer (seccin
15.6.3). En el segundo caso, los locus mapeados tambin son fac
tores para el padecimiento comn no mendeliano la enfermedad
de Hirschsprung (seccin 15.6.2) proporciona ejemplos-. Por lti
mo el trabajo inicial en la esquizofrenia ejemplific el tercer caso al
proporcionar una calificacin de seis que en la actualidad suele
considerarse sospechosa (vase Byerley, 1989). Este desastre fue su
ficiente para persuadir a la mayora de los investigadores a cambiar
al anlisis no paramtrico.
15.3.2 El anlisis de enlace no paramtrico no requiere

un modelo gentico
Los mtodos de anlisis de enlace sin modelo o no paramtricos
buscan alelos o segmentos cromosmicos que los individuos afec
tados comparten. Algunas de las ideas bsicas que sustentan estos
mtodos se establecieron en tres artculos de Neil Risch en 1990
Si se toma un segmento cromosmico al azar, se espera que pares

de hermanos compartan 0 , 1 o 2 haplotipos parentales con fre
cuencias de /4, /2 y U respectivamente. Sin embargo, si ambos
hermanos estn afectados por una enfermedad gentica, entonces
es probable que compartan cualquier segmento cromosmico que
porte el locus de la enfermedad. Si todas las personas con la en
fermedad llevan un alelo mutante a este locus, entonces compar
tirn cuando menos un haplotipo parental si la enfermedad es
A ,1 A.
m2
A1 A3
- o
A1 A3
Ai A2
a2a
A1 A2
Ai A3
A1 A2
Fig. 15-2. identidad por estado (IPE) e identidad por descendiente

(IPD ).___________________________________ __
Los dos pares de hermanos comparten el alelo A,. El primer par de her
manos tiene dos copias independientes de A^ (IPE pero no IPD): el segun
do par de hermanos comparte copias del mismo alelo paterno A, (IPD
La diferencia slo es aparente si se conocen los genotipos parentales.
444 j CAPTULO QUINCE ! MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
AD
AD
BC
BD
Fig. 15-3. Anlisis de par de hermanos afectados.
A) Por segregacin aleatoria los pares de hermanos comparten 0,1 o 2 haplotipos parentales 1/4,1/2 y 1A de las veces respectivamente. B) pares de hermanos
que son afectados por un padecimiento dominante comparten una o dos copias del segmento cromosmico parental importante. C) Pares de hermanos
afectados ambos por un padecimiento recesivo necesariamente comparten los dos haplotipos parentales para el segmento cromosmico importante.
El haplotipo arriba del azar compartido por pares de hermanos afectados identifica segmentos cromosmicos que contienen genes susceptibles.
dominante y dos si es recesiva (fig. 15-3). Esto permite una for

ma simple de anlisis de enlace. Los pares de hermanos afecta
dos (PHA) se tipifican para marcadores y se buscan regiones
cromosmicas en las que la reparticin es mayor que las relacio
nes al azar 1:2 :1 de compartir 2, 1 o O haplotipos idnticos por
descendiente. Si los pares de hermanos se estudian slo para iden
tidad por estado, la reparticin esperada en la hiptesis nula debe
calcularse como una funcin de las frecuencias gnicas. El anlisis
PHA puede realizarse sin hacer ninguna suposicin respecto a la
gentica de la enfermedad y suele ser ms fcil reunir pares de her
manos afectados que familias extensas. El anlisis de mltiples
puntos se prefiere sobre el anlisis de punto nico porque extrae
con mayor eficiencia la informacin acerca de la reparticin IPD a
travs de la regin cromosmica. El programa M A P M AKER /SlBS de
Kruglyak y Lander (1995) se utiliza con amplitud para analizar da
tos de PHA de mltiples puntos y proporciona calificaciones lod
no paramtricas (LNP).
Un inconveniente del anlisis de PHA es que las regiones can
didato que identifica suelen ser imposiblemente grandes para clo
nacin posicional. Pocas recombinantes separan hermanos, de tal
manera que comparten segmentos cromosmicos parentales gran
des ya sea por azar o por una susceptibilidad compartida. Es crucial
que el anlisis complejo de enfermedad no tiene procesos anlogos
al juego final del mapeo mendeliano, en el que se estudian marca
dores cada vez ms cercanos hasta que ya no hay ms recombinan
tes. Si un factor de susceptibilidad no es necesario ni suficiente para
la enfermedad, entonces no todos los pares de hermanos afectados
compartirn el segmento cromosmico importante. Ms an, pa
res de hermanos comparten muchos segmentos por azar. No obs
tante, a su causa de sencillez y potencia, el mapeo de PHA es uno
de los principales medios para buscar genes que confieren suscepti
bilidad a enfermedades frecuentes no mendelianas (vase seccin
15.6). Sham y Zhao detallaron las matemticas de los anlisis de
PHA (vanse Lecturas adicionales).
Programas como G E N E H U N TE R (seccin 13.6.2) extienden el
anlisis de segmento compartido a otras relaciones. Los progra
mas calculan la extensin a la que los familiares afectados com
parten alelos idnticos por descendiente y comparan el resultado

a travs de todos los miembros de la genealoga afectados con la
hiptesis nula de segregacin mendeliana simple (los marcadores
deben segregarse de acuerdo con relaciones mendelianas a menos
que la segregacin por enlace o relacin se distorsione). La com
paracin puede usarse para computar una calificacin lod no paramtrica.
15.3.4 Los umbrales de significancia son una

consideracin importante en el anlisis
de enfermedades complejas
Si bien la mayor parte de los genes mendelianos que se localiza
ron mediante calificaciones lod significativas se clon despus
con xito, la historia del anlisis de enfermedades complejas se
caracteriza por una sucesin de resultados no reproducibles. Ca
da una de las regiones candidato definidas en estudios indepen
dientes de la misma enfermedad coincidieron muy rara vez.
Risch y Botstein (1996) delinearon una historia tpica, la de la
psicosis maniacodepresiva, y Altmller y colaboradores (2001)
reafirmaron el concepto en un metaanlisis de 101 estudios de
enlace en 31 enfermedades complejas. Cualquiera que sea la cau
sa exacta de estos problemas en casos individuales, una amenaza
clara es la dificultad para decidir cundo considerar significativos
los resultados.
Los problemas para decidir umbrales apropiados de significancia
son en parte tcnicos y en parte filosficos. La distincin entre sig
nificancia de punto sensato (o nominal) y de extensin del genoma ya se coment (seccin 13.3.4).
el valor p del punto sensato de una estadstica de enlace es la
probabilidad de exceder el valor observado en la posicin es
pecificada en el genoma, si se asume la hiptesis nula de no
enlace;
el valor p de extensin del genoma es la probabilidad de que
el valor observado se exceda en cualquier parte del genoma, con
base en la hiptesis nula de no enlace.
15.4
ESTUDIOS DE ASOCIACIN Y DESEQUILIBRIO DE ENLACE
n un estudio del genoma completo el umbral de significancia

irropiado es un valor en el que la probabilidad de encontrar una
positiva falsa en cualquier pa rte d el genom a es de 0.05. Argumentos
Tericos (Lander y Kruglyak, 1995) sugieren umbrales de califica
ron lod de la extensin del genoma de 3.6 para pruebas IPD de
rires de hermanos afectados y de 4.0 para pruebas IPE. Los estu
dios de enfermedades complejas suelen estimar sus umbrales de sigrrficancia mediante simulacin. Por lo general se generan 1 000
-tricas de la reunin de familias mediante computadora con genorros marcadores aleatorios, pero basados en frecuencias de alelos,
Tracciones de recombinacin, etc., correctas. Se efecta una bsqreda de la totalidad del genoma en cada grupo de datos simulado
v se observa la calificacin lod mxima. El umbral de significancia
rt .i extensin del genoma se toma como una calificacin que me
ros de 5% de las rplicas excede.
En respuesta al fracaso frecuente para replicar localizaciones
ir.rmadas de genes de susceptibilidad a enfermedad, Lander y
Kruglyak (1995) propusieron la serie de umbrales del cuadro
15-6. Obsrvese que un valor p de punto sensato de 1 X 10~
- o equivale a una calificacin lod de 5.0 -las dos medidas no
son iguales:
una calificacin lod de 5 significa que los datos son 105 veces
ms probables en la hiptesis de enlace determinada que en la
hiptesis nula;
un valor p de 10~5 significa que la calificacin lod indicada s
lo se exceder una vez en 105 veces, con base en la hiptesis
nula.
?ira una discusin respecto a los criterios de Lander y Kruglyak,
. jase la seccin de correspondencia del nmero de abril de 1996 de
Sature Genetics.
15.4
Estudios de asociacin y
desequilibrio de e n lace
Asociacin no es un fenmeno especficamente gentico; es slo

ma afirmacin estadstica respecto a la coocurrencia de alelos o feroripos. El alelo A se asocia con la enfermedad D si la persona que
tiene D tambin tiene A con una frecuencia mucho mayor (o tal

vez menos frecuente) de lo que podra predecirse a partir de las fre
cuencias individuales de D y A en la poblacin. Por ejemplo, HLADR4 se encuentra en 36% de la poblacin britnica general pero
en 78% de las personas con artritis reumatoide.
15.4.1 Por qu suceden asociaciones?

Una asociacin de poblacin puede tener mltiples causas posibles,
no todas genticas:
causa directa: tener un alelo A torna a la persona susceptible a
la enfermedad D. Es posible que la posesin de A no sea nece
saria ni suficiente para que una persona desarrolle D, pero au
menta la probabilidad;
seleccin natural: podra ser ms probable que las personas que
tienen la enfermedad D sobrevivan y tengan nios si tambin
tienen el alelo A;
estratificacin de poblacin: la poblacin contiene varios
subgrupos genticamente distintos y tanto la enfermedad co
mo el alelo A son en particular frecuentes en un subgrupo.
Lander y Schork (1994) dan el ejemplo de la asociacin en el
rea de la Baha de San Francisco entre HLA-A1 y la capaci
dad para comer con palillos chinos. HLA-A1 es ms frecuen
te entre chinos que entre caucsicos;
error tipo 1: por lo general los estudios de asociacin valoran
un nmero grande de marcadores para asociacin con una en
fermedad. Inclusive sin ningn efecto verdadero, 5% de los
resultados ser significativo en el nivel p = 0.05 y 1% en el ni
vel p = 0.01. Los valores p crudos necesitan corregirse para el
nmero de preguntas hechas (seccin 15.4.4). Antes los inves
tigadores a menudo aplicaban correcciones inadecuadas e in
formaban asociaciones que no pudieron replicarse en estudios
subsecuentes;
desequilibrio de enlace (DE): el objetivo de los estudios de
asociacin en la enfermedad compleja es descubrir asociaciones
causadas por DE entre el marcador y la enfermedad. El fen
meno de DE se comenta ms adelante y el recuadro 15-2 des
cribe la manera de medir tal desequilibrio.
Cuadro 15-6. Criterios sugeridos para informar enlace (Lander y Kruglyak, 1995). Las cifras para los valores p y las
calificaciones lod son de Altmller y colaboradores (2001).
Nmero esperado de ocurrencias por azar
en una examen del genoma completo
Lmites de valores
aproximados
Lmites de calificaciones
lod aproximadas
Sugestiva
7 x 1 0 ^ -3 x 105
2 .2 -3 5
Significativa
0.05
2 x 1 0-54 x 107
3,6-5.3
Altamente significativa
0.001
< 3 x 10-7
> 5 .4
Confirmada
0.01 en un estudio de una regin candidato

que dio un enlace significante en un estudio
independiente previo
Categora de enlace
445
446
CAPTULO QUINCE
Recuadro 15-2. Mediciones de desequilibrio de enlace

Si dos locus tienen alelos A,a y B,b con frecuencias pAi pa, pB y pb, hay
cuatro posibles haplotipos AB, Ab, aB y ab. Asmase que las frecuencias
de los cuatro haplotipos sean pAB, pAb, paB y pab. Si no hay desequilibrio
de enlace (DE), pAB = pApB, etc. El grado de partida desde esta asocia
cin aleatoria puede medirse mediante D = pABpab- pabpaB.
Como una medicin del DE, los D adolecen de la propiedad de que su va
lor absoluto mximo depende tanto de las frecuencias gnicas en los dos
locus como de la extensin del desequilibrio. Entre las mediciones prefe
ridas se encuentran:
O' = (PAB-PAPsI/Dmx. donde Dmx es el valor mximo de |pAB- p ApB|
posible con las frecuencias de alelos dadas.
15.4.2 Asociacin es un principio muy distinto de

enlace, pero donde la familia y la poblacin se
fusionan, el enlace y la asociacin se funden
En principio enlace y asociacin son fenmenos por completo dis
tintos. Enlace es una relacin entre locus, pero asociacin es una re
lacin entre alelos o fenotipos. Enlace es una relacin especficamente
gentica en tanto que asociacin, como se mencion, es slo una
observacin estadstica que puede tener varias causas.
El enlace no produce por s mismo ninguna asociacin en la po
blacin general. Por ejemplo, aunque el locus marcador STR45 es
t enlazado con el locus de distrofina, la distribucin de los alelos
STR45 en un grupo de pacientes con distrofia de Duchenne no re
lacionados es justo la misma que en la poblacin general. Sin em
bargo, dentro de una familia en la que una mutacin de distrofina
est segregndose, cabra esperar que la persona afectada compar
tiera el mismo alelo STR45 porque los locus estn enlazados de ma
nera estrecha. Por consiguiente el enlace crea asociaciones dentro de
familias, pero no entre personas no relacionadas. No obstante, si dos
personas supuestamente no relacionadas con la enfermedad D en
realidad heredaron su enfermedad de un ancestro comn distante,
tambin pueden tender a compartir alelos ancestrales particulares
en locus enlazados en forma cercana a D. En la seccin 13.5.2 se
muestran ejemplos de este fenmeno.
Los ancestros comunes son importantes porque todas las perso
nas los tienen. Si se retrocede lo suficiente, todos los humanos es
tn relacionados. En la medida en que una poblacin es una familia
extendida, han de existir asociaciones a nivel de la poblacin que se
deben a DE entre genes de susceptibilidad a enfermedades ances
trales y marcadores enlazados de modo cercano. Un clculo grueso
sugiere que en el Reino Unido dos personas no relacionadas com
partiran ancestros no ms de 22 generaciones antes. Si son por
completo exogmicas, tendrn 2 = 4 millones de ancestros cada
uno en ese tiempo. Veintids generaciones representan alrededor
de 500 aos y en 1500 la poblacin britnica se acercaba a 4 millo
nes (fig. 15-4).
Supngase que cada una de las dos personas no relacionadas
hereda un alelo de susceptibilidad de enfermedad de su ancestro co
mn. Durante las mltiples generaciones y las muchas meiosis que
las separaron de su ancestro comn, la recombinacin repetida ha
A 2 =
(P a b
P a P b )2/ (P A P a P B P b )
D' es la que ms se utiliza. Varia entre 0 (no DE) y 1 (asociacin com

pleta), y depende menos de D en las frecuencias de alelos. Como regla
emprica, D' > 0.33 a menudo se considera como el nivel de umbral de
DE arriba del cual sern aparentes asociaciones en el tamao usual del
grupo de datos. La proliferacin de medidas alternativas sugiere que nin
guna es ideal (Devlin y Risch, 1995). Estas medidas se desarrollaron en
particular para pares de locus, en tanto que la mayor parte de los estu
dios del genoma completo usan anlisis de mltiples puntos. Estos datos
deben observarse para haplotipos conservados y no slo analizarse para
DE a nivel de pares.
br reducido el segmento cromosmico compartido a una regin

muy pequea. Slo se compartirn los alelos en locus estrechamen
te enlazados al locus de susceptibilidad a la enfermedad. Para que un
locus muestre una fraccin de recombinacin theta (0) con el locus
de susceptibilidad, una proporcin 0 de cromosomas ancestrales
perder la asociacin cada generacin y una proporcin (1-0) la re
tendr. Despus de n meiosis, una fraccin (10)n de los cromoso
mas conservar la asociacin. La media vida de DE entre locus
separados 1 cM y 2 cM es de 69 y 34 meiosis respectivamente, ya
que (0.99)6"1= (9.98)34 = 0.5. Antes se calcul que los ancestros
de dos personas britnicas no relacionadas se fusionaron por
completo 22 generaciones atrs. Ese clculo se simplific de mane
ra gruesa porque se supuso que toda la poblacin britnica fue una
Fecha
C la v e
Nm. de ancestros (generacin de 25 aos)
------- Poblacin britnica (aproximada)
Fig. 15-4. Fusin en un fondo comn gnco.

Una persona por completo exogmica tiene 2" ancestros hace n gene
raciones. Si toda la poblacin britnica fuera del todo exogmica, dos
personas actuales no relacionadas" compartiran todos los mismos
ancestros en 1500. En realidad, por supuesto, la poblacin no es com
pletamente exogmica y las dos personas tendrn una superposicin
potente pero no fondos comunes idnticos de ancestros en 1500.
15.4 I ESTUDIOS DE ASOCIACIN Y DESEQUILIBRIO DE ENLACE
44-
Fg. 15-5. Desequilibrio de enlace alrededor del locus de la enfermedad de Huntington.

S10, S125, etc. son abreviaturas de los marcadores de DNA D4S10, D4S125, etc., que se muestran en sus posiciones en el mapa en relacin con el locus HD.
La distancia total representada es de 2 500 kb. Para algunos locus, existen varios PRLF diferentes, que en ocasiones muestran una asociacin allica muy
distinta, por ejemplo, marcador S95 (vase texto). Tomado de Krawczak y Schmidtke (1998) DNA Fingerprinting, 2a ed. BIOS Scientific, Publishers, Oxford.
unidad libremente interendogmica durante los ltimos 500 aos.

Sin embargo, proporciona un primer estimado grueso de que las
asociaciones allicas que reflejan segmentos ancestrales comparti
dos pudieran comenzar a notarse para locus dentro de 1 cM entre
s en la poblacin britnica. Clculos ms complicados utilizan una
distribucin Poisson de acontecimientos de recombinacin e incor
poran suposiciones respecto a la estructura y la historia de la pobla
cin (Kruglyak, 1999). Un determinante fundamental es el tiempo
de coalescencia, el nmero de generaciones anteriores al ancestro
compartido ms reciente (vase recuadro 12-6). Sin embargo, la varianza fortuita amplia y la confiabilidad en detalles desconocidos de
la historia de la poblacin determinan que inclusive los clculos
ms elaborados no sean seguros. Lo que se requieren son datos y en
fecha reciente ha sido posible disponer de cantidades crecientes de
datos reales.
15.4.3 Muchos estudios muestran islotes de

desequilibrio de enlace separados por
puntos crticos de recombinacin
El gen de la fibrosis qustica se identific ascendiendo un gradien
te de DE hasta llegar a un mximo (seccin 13.5.2). Sin embargo,
la investigacin de otras enfermedades mostr pronto que los gra
dientes uniformes de DE eran la excepcin ms que la norma. En
la enfermedad de Huntington (fig. 15-5) es posible observar casos
de una asociacin potente con un marcador ms distante y una aso
ciacin dbil con un marcador ms cercano. Aun ms curioso re
sulta que el marcador D4S95, enlazado en forma cercana al locus
HD, detecta PRLF con tres enzimas, Tacj[, M bol y Accl. Los resul
tados confirmados en varios estudios independientes mostraron

una asociacin potente con un alelo particular Accl y uno particu
lar Mbol, pero ninguna asociacin con cualquier alelo Taq\. Estos
patrones desconcertantes deben reflejar una historia compleja, con
acontecimientos de recombinacin al azar en poblaciones fundado
ras pequeas y tal vez un origen ms reciente de algunos polimor
fismos marcadores que ciertas mutaciones de enfermedad.
En fecha reciente se publicaron varios estudios sistemticos de
DE marcador-marcador a travs de segmentos cromosmicos im
portantes (Gabriel y cois., 2002b y las referencias que incluye). Un
hallazgo frecuente es que el DE no declina de manera uniforme
con la distancia. Por el contrario, los cromosomas contienen una
serie de islotes de DE de relativamente largo alcance que estn se
parados con precisin entre s (fig. 15-6). En todos los islotes pue
den extenderse DE tiles por 50 kb (en europeos; menos en
africanos) pero aun los marcadores espaciados en forma muy cer
cana en diferentes islotes no muestran DE entre s. El examen de
tallado de unas cuantas regiones confirm que los lmites de islotes
son en realidad puntos crticos de recombinacin. Es posible que
ello muestre el mosaico de segmentos cromosmicos ancestrales
que caracteriza la herencia compartida del hombre. Si fuera posible
definir la estructura de DE del islote de una poblacin a travs del
genoma completo, entonces sera factible identificar un grupo de
marcadores (SNP-hap) para establecer haplotipos en cada islote
que despus podran estudiarse en cuanto a su vnculo con cual
quier enfermedad. Se sugiere que la mayor parte de los islotes slo
tendr cuatro a seis haplotipos comunes diferentes en cualquier po
blacin (Gabriel y cois., 2002b). Se encuentran en curso esfuerzos a
gran escala para definir estas estructuras mediante el mapeo exten
so marcador-marcador (vase www.genome.gov/10005336).
448 j CAPTULO QUINCE
15.4.4 Diseo de estudios de asociacin

La bsqueda de asociaciones en la poblacin es una opcin atrac
tiva para identificar genes de susceptibilidad a enfermedad. Los
estudios de asociacin son ms fciles de conducir que los anli
sis de enlace porque no se requieren familias con mltiples casos
ni estructuras familiares especiales. En algunas circunstancias la
asociacin tambin puede ser ms potente que el enlace para de
tectar alelos de susceptibilidad dbil (vase ms adelante). Sin
embargo, es importante pensar con cuidado respecto al diseo ex
perimental.
Eleccin del mtodo para estudiar la asociacin

Aunque la eleccin del grupo testigo es crucial en cualquier estudio
de asociacin, por mucho que se intente equiparar los testigos con
los casos resulta imposible estar por completo seguro de no haber
pasado por alto nada. En consecuencia, cuando se encuentra una
asociacin, siempre existe la preocupacin de que se deba a testigos
equiparados de modo inadecuado y no a desequilibrio de enlace
con un locus de susceptibilidad. La combinacin de esta incertidumbre y una pltora de resultados no factibles de reproducirse (en
especial para asociaciones HLA-enfermedad) condujeron a que los
genetistas humanos dejaran de preferir los estudios de casos y testi
gos durante el decenio de 1980.
En fecha reciente se desarroll un grupo de mtodos que evita
en gran parte este problema. En conjunto, estos mtodos pueden
denominarse estudios de asociacin con testigos internos. El
mtodo ms popular es la prueba de desequilibrio de transmi
sin (PDT; Schaid, 1998). La PDT se inicia con parejas que tie
nen uno o ms descendientes afectados. No tiene importancia si

cada padre est afectado o no. Para estudiar si el alelo marcador
M, se relaciona con la enfermedad, se eligen los padres que son
heterocigotos para M . La prueba slo compara el nmero de ca
sos en los que este padre transmite
a la descendencia afecta
da con el nmero en el que transmite su otro alelo (recuadro
15-3). La estratificacin de la poblacin no afecta el resultado.
Se desarroll una PDT extendida (PDTE; Sham y Curts, 1995)
a fin de manejar datos de marcadores multiallicos como microsatlites. La PDT puede utilizarse cuando slo se dispone de un
padre, pero ello suele sesgar el resultado (Schaid, 1998). Cuan
do no se cuenta con padres (un problema frecuente en las enfer
medades de inicio tardo), en una variante alternativa, la PDT de
hermanos, se buscan diferencias en las frecuencias del alelo mar
cador entre los hermanos afectados y los no afectados (Spielman
y Ewens, 1998).
Se discute un poco si la PDT es una prueba de enlace o de aso
ciacin. Ya que pregunta respecto a alelos y no locus, es sobre todo
una prueba de asociacin. El alelo asociado puede ser en s mismo
un factor de susceptibilidad o encontrarse en desequilibrio de enla
ce con un alelo de susceptibilidad en un locus cercano. La PDT no
puede detectar enlace en ausencia de desequilibrio -un punto que
debe recordarse cuando se consideran esquemas para emplearla en
exploraciones del genoma completo.
En la actualidad se prefieren de nuevo los estudios convencio
nales de casos y testigos como una alternativa a la PDT. Tales estu
dios necesitan menos muestras que la PDT y son ms fciles de
realizar para enfermedades de inicio tardo en las que rara vez se
dispone de los padres. Se piensa que el riesgo de asociaciones falsas
debidas a estratificacin de la poblacin se ha exagerado y es posi-
WTC82P:
WTC16P'
7WTC7P
WTC72P:
WTC75P
WTC58Pj
VTC1Q4P=
WTC81P:
VTC110P!
WTC91P5
TC49WP:
WTC21P-
WTC96PIWTC12PWTC89P9WTC1PWTC53PI.
Fig. 15-6. Patrones de desequilibrio de enlace en dos regiones cromosmicas.

En cada cuadro est representado el mismo grupo de marcadores, en orden cromosmico, en los ejes X y Y. El color de la coordenada cartesiana para
cada par de marcadores muestra la potencia de DE a nivel de pares segn la escala en el centro. El programa GOLD llena el espacio entre puntos mediante
interpolacin. Si el DE fuera slo una funcin de distancia, cada cuadro mostrarla un color rojo uniforme en la diagonal, sombreando a travs del azul
uniforme por puntos muy alejados en la diagonal. Obsrvese el patrn bsico de islotes aislados de DE, pero con un gran cmulo de detalles complicados.
Panel izquierdo, parte del cromosoma 2; panel derecho, parte del cromosoma 13. Cortesa del doctor William Cookson, Oxford.
15.4 I ESTUDIOS DE ASOCIACIN Y DESEQUILIBRIO DE ENLACE
449
Recuadro 15-3. P ru eb a de desequilibrio de transmisin (PDT) para determinar si el alelo marcador M, se

re la cio n a con una enfermedad
1) Se indagan los probandos.
2) Los probandos y sus padres se tipifican para el marcador.
3) Los padres que son heterocigotos para el alelo marcador M, se selec
cionan. Pueden estar o no afectados.
ble revisar los datos para posibles efectos de la estratificacin si se

comparan las frecuencias de alelo en una gama de locus no enlaza
dos en los casos y los testigos (Pritchard y Rosenberg, 1999). El di
seo ptimo del estudio, segn Risch y Teng (1998), consiste en
usar pares de hermanos afectados como casos con dos testigos no
relacionados.
Cualquiera que sea la prueba de asociacin que se utilice, es im
perativo abordar el problema de mltiples pruebas. Una correccin
completa Bonferroni (en la que el valor umbral p se divide por N,
el nmero total de preguntas hechas) es demasiado conservadora
para valores grandes de N. El umbral preferido de significancia es
p' = 1 (1 p )N(Emahazion y cois., 2001). Cardn y Bell (2001)
discuten con detalle no matemtico algunos problemas generales del
diseo de los estudios de asociacin; vase Lecturas adicionales.
Seleccin de marcadores
Los marcadores de eleccin para estudios de asociacin son los po
limorfismos de nucletido nico (SNP, recuadro 13-1), por dos
razones:
a diferencia de los microsatlites, son suficientemente numero
sos (> 1 por kb en promedio) para definir islotes de DE y pue
den calificarse por varios mtodos de rendimiento ultra alto
(seccin 18.4.2).
los SNP son menos mutables que los microsatlites. Si es cier
to, como suele sugerirse, que la susceptibilidad a enfermedades
frecuentes est determinada sobre todo por variantes de DNA
antiguas comunes, sera necesario utilizar marcadores que son
estables durante una escala de tiempo prolongada para identifi
car los haplotipos ancestrales.
Para regiones cromosmicas y poblaciones en las que el patrn de
desequilibrio de enlace se conoce (como las que se ilustran en la fig.
15-6), se seleccionaran marcadores para definir haplotipos en cada
islote de desequilibrio. Si no se cuenta con tal conocimiento, todo
es conjetura. Cuanto ms antiguo es un alelo de enfermedad en la
historia humana mayor es la densidad de SNP necesarios para de
tectarla (Kruglyak, 1999; Wright y cois., 1999). Algunos investiga
dores apoyan los SNP localizados dentro de genes y en especial los
que se encuentran en secuencias de codificacin (cSNP) porque
argumentan que es ms probable que estas variantes sean las deter
minantes de susceptibilidad reales. Es cierto que en la actualidad
nadie conoce la estrategia ptima para seleccionar un marcador.
Diversas enfermedades en distintas poblaciones tienen diferentes
Asmase que a es el nmero de veces que un padre heterocigoto trans

mite M, a la descendencia afectada y bel nmero de ocasiones que se
transmite el otro alelo.
La estadstica de la PDT es ( a - b ) 2/(a + b ). sta tiene una distribucin \ 2
con 1 grado de libertad, a condicin de que los nmeros sean razonable
mente grandes.
historias y es posible que cada estudio individual requiera una es

trategia a la medida.
Eleccin de la poblacin de estudio

Una pregunta contenciosa es si los estudios de asociacin sern
ms fructferos en poblaciones aisladas. Se espera que las poblacio
nes derivadas de un nmero pequeo de fundadores muestren una
diversidad de haplotipos limitada y valores ms altos de desequili
brio de enlace. El concepto de que ser ms fcil identificar alelos
que causan enfermedad en locus de susceptibilidad en poblaciones
aisladas se basa en el proyecto de DeCode en Islandia y proyectos
similares en alguna otra parte (Gulcher y cois., 2001). Dichas po
blaciones bien pueden mostrar desequilibrio potente y de largo al
cance alrededor del locus para las enfermedades mendelianas raras
que caracterizan a la poblacin (p. ej., enfermedades finlandesas
en Finlandia), pero ese desequilibrio slo existe en cromosomas
que llevan el alelo de enfermedad, que tal vez se derivaron todos
de un ancestro compartido nico. Para variantes ms frecuentes,
datos empricos no muestran un desequilibrio mucho mayor (Varilo y cois., 2000; Pritchard y Przeworski, 2001). Puede ser ms im
portante disponer de un gran nmero de posibles sujetos con
buenos expedientes mdicos que la estructura de la poblacin -lo
que constituye el pensamiento que respalda el proyecto BioBank
en el Reino Unido, que pretende reunir datos mdicos, del estilo
de vida y del DNA de 500 000 britnicos de 45 a 69 aos de edad
y seguir su salud en forma prospectiva.
Las poblaciones del Africa subsahariana muestran una diver
sidad gentica ms alta que las europeas, compatible con la hip
tesis de los orgenes humanos fuera de Africa, y datos limitados
sugieren que el desequilibrio de enlace es de corto alcance en
africanos (Reich y cois., 2001). Por otra parte, poblaciones deri
vadas mediante mezcla reciente pueden mostrar desequilibrio de
enlace muy potente (p. ej., las poblaciones Lemba, un hbrido
Bantu-semtico estudiado por Wilson y Goldstein, 2001). En
teora, si las dos poblaciones fuente tuvieran incidencias muy di
ferentes de una enfermedad comn, la poblacin mixta podra
utilizarse para mapear los determinantes con bastante eficiencia
(como en un cruzamiento de ratn), pero la idea an no se estu
dia en la prctica. En resumen, todava no se aclara si alguna po
blacin presenta ventajas especiales para estudios de asociacin
en enfermedades complejas. Para excelentes comentarios de estos
problemas, vanse Wright y colaboradores (1999) y Peltonen y
colaboradores (2000).
450 s CAPTULO QUINCE
Genotipos o haplotipos?
Cuando se estudian individuos en lugar de familias, los datos cru
dos consisten en genotipos, pero los anlisis de asociacin requie
ren haplotipos. Estos ltimos se deducen a partir de los genotipos
mediante un anlisis por computadora de expectacin-maximizacin (Long y cois., 1995), pero en principio resulta imposible
efectuar lo anterior con 100% de seguridad; el nico medio por
completo seguro es tipificar hbridos de clulas somticas que
contienen cromosomas haploides (Douglas y cois., 2001). Algu
nos argumentan que ste es un error fundamental en el diseo de
los estudios de asociacin actuales a gran escala. Los optimistas
piensan que los estudios funcionarn porque casi todos los islotes
de DE (seccin 15.4.3) slo comparten un nmero pequeo de
haplotipos, que pueden identificarse en forma adecuada y segura
a partir de datos de genotipo. Ser interesante observar quines
estn en lo correcto.
Enlace comparado con asociacin: practicando el juego

de nmeros
Un artculo importante de Risch y Merikangas (1996) sugiri que
la asociacin puede ser ms potente que el enlace para detectar alelos de susceptibilidad dbil. Los autores compararon la potencia del
enlace (par de hermanos afectados, PHA) y la prueba de asociacin
(PDT) con objeto de identificar un marcador enlazado en forma
estrecha a un locus de susceptibilidad a enfermedad. Calcularon el
nmero de tros de PHA o de PDT (nios y ambos padres afecta
dos) necesarios para distinguir un efecto gentico de la hiptesis
nula, con una potencia y un nivel de significancia determinados. El
recuadro 15-4 ilustra su mtodo (para detalles ms amplios consl
tese el artculo original) y el cuadro 15-7 muestra los resultados t
picos de la aplicacin de su frmula. La conclusin es clara. El
anlisis de PHA requerira muestras grandes no factibles para de
tectar el locus de susceptibilidad que confiere un riesgo relativo me

nor cercano a tres, en tanto que la PDT podra detectar alelos que
dan un riesgo relativo menor de dos con tamaos de muestras ma
nejables. Por cualquiera de los mtodos sera muy difcil encontrar
alelos de susceptibilidad que confieren un riesgo relativo menor de
1.5. Sin embargo, cabe sealar que su resultado incorpora varias su
posiciones -en particular asume un alelo de susceptibilidad ances
tral nico en el locus de enfermedad. Cualquier heterogeneidad
allica degradara con rapidez la ejecucin de una prueba de asocia
cin, en tanto que no afectara la potencia de una prueba de enla
ce. En la actualidad se cuenta con algunos datos que ilustran lo
anterior (seccin 15.6.6).
15.4.5 Enlace y asociacin: tcnicas complementarias

El enlace y la asociacin proporcionan datos complementarios
en muchas formas. El enlace opera en lmites cromosmicos lar
gos y puede explorar la totalidad del genoma en unos cuantos
cientos de pruebas. Un estudio tpico de 250 pares de hermanos
afectados con 300 marcadores demandara generar 1.5 a 3 X 10
genotipos (lo que depende de que los padres se tipificaran o no).
ste es un trabajo de unas cuantas semanas para un laboratorio
bien automatizado y consolidado. Por otra parte, los autores ob
servaron que el desequilibrio de enlace es un fenmeno de corto
alcance, con islotes de DE de 20 a 50 kb de tamao por lo gene
ral. Un estudio de PDT del genoma completo de 300 tros (ni
o y ambos padres afectados), incluso cuando se estudia un SNP
aislado en cada islote, requerira 108 genotipos, si se consideran
islotes promedio de 25 kb de tamao. Aunque las tecnologas en
surgimiento ofrecern en poco tiempo este rendimiento, el cos
to an ser atemorizante. Por consiguiente los estudios de aso
ciacin deben dirigirse a regiones candidato predeterminadas.
Aunque esto puede sugerirse por referencia a modelos animales o
Recuadro 15-4. Tamaos de muestras necesarios para encontrar un locus de susceptibilidad a una enfermedad
por el estudio del genoma completo mediante el uso de pares de hermanos afectados (PHA) o
la prueba de desequilibrio de transmisin (PDT)
Risch y Merikangas (1996) calcularon los tamaos de muestras necesa
rios para distinguir un efecto gentico de la hiptesis nula con potencia
(1-(3) y nivel de significancia alfa. Aunque este recuadro resume sus fr
mulas y ecuaciones, debe consultarse el artculo original para las deriva
ciones y los detalles.
m- = 2 Y -1 y a 2 = 4Y (1 - Y ) . El umbral de significancia en la extensin

del genoma (probabilidad de una positiva falsa en cualquier parte del ge
noma = 0.05; las pruebas para com partir IPD) requiere una calificacin
lod de 3.6, que corresponde a a = 3 x 10 5, y Z = 4.014. Para una
potencia de 80% para detectar un efecto, 1 - p = 0.2 y Z ^ B = -0 .8 4 .
Una pieza estndar de estadstica ndica que el tamao necesario de la mues

tra M est determinado por (Zq -o -Z ! _b)2/ Ij.2, donde Z se refiere a la des
viacin normal estndar. La n media y la varanza o-2 se calculan como
funciones de la frecuencia del alelo de susceptibilidad (p) y el riesgo re
lativo 7 conferido por una copla del alelo de susceptibilidad. El modelo
asume que el riesgo relativo para que una persona porte dos alelos de
susceptibilidad es y 2, que el marcador utilizado siempre sea informativo
y que no haya recombinacin con el locus de susceptibilidad.
Para la PDT, la probabilidad de que un padre ser heterocigoto para el ale

lo en cuestin es h = pq (-y+1)/(p-y+q). P(trA), la probabilidad de que es
te padre heterocigoto transmitir el alelo de alto riesgo al nio afectado, es
= 7/(1 + 7 ). X = Vh(7 - 1 )/(7 + 1 ), y a 2 = 1 - [h(7 - 1)2/(7 - 1 )2]. Como
se coment, para una seleccin final del genoma que incluye 1 000 000 de
pruebas, a = 5 x 10"8, Z = 5.33 y, como antes, Z,_p = -0 .8 4 .
Para la PHA, el alelo esperado que comparte el locus de susceptibilidad

es determinado por V = (1 + w ) /( 2 + w ), donde w = [pq(-y1 )2/(p -/+ q ).
En el cuadro 15-7 los valores Za, Z ^ , | y a 2 se utilizan para calcular ta

maos de muestras sustituyendo en la frmula M = {Za - a l ^ ) 2/ ^ 2. Pa
ra la PDT la respuesta es la mitad porque cada tro padre-hijo permite dos
pruebas, una en cada padre.
15.6
OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL XITO VARIABLE DE LA DISECCIN GENTICA.
genes conocidos, de manera alternativa suele definirse mediante

estudios de enlace. Como se coment, las regiones candidato de
finidas por estudios de PHA suelen ser imprcticamente grandes
para clonacin posicional de genes de susceptibilidad. En conse
cuencia el diseo natural de un estudio consiste en iniciar una
seleccin de la extensin del genoma mediante enlace, tal vez en
pares de hermanos afectados, y a continuacin, una vez que la lo
calizacin inicial se logra, reducir la regin candidato por mapeo
de desequilibrio de enlace.
15.5
Id en tificacin de aleios de
susceptibilidad
En enfermedades mendelianas puede ser difcil encontrar el gen co

rrecto, pero suele ser obvio cuando se logra el xito. Los pacientes
tienen mutaciones ambiguas, que no se encuentran en testigos, en
un gen cuya posicin casi siempre se defini mediante anlisis de
enlace. Para enfermedades complejas es muchsimo ms difcil dis
tinguir factores de susceptibilidad verdaderos de polimorfismos de
DNA sin importancia. Hay tres razones para ello:
puesto que la mutacin de un gen nico no es necesaria ni su
ficiente para causar la enfermedad, algunos testigos presenta-
Cuadro 15-7. Tamaos de muestra para una potencia de

80% a fin de detectar enlace o asociacin significativos en
una bsqueda en toda la extensin del genoma.
Anlisis de PHA
Anlisis de PDT
P(trA)
0.01
0.534
2 530
0.830
747
0.1
0.634
161
0.830
108
1.5
1.2
N-ASP
N-TDT
0.5
0.591
355
0.830
53
0.01
0.509
33 797
0.750
1 960
0,1
0.556
953
0.750
251
0.5
0.556
953
0.750
150
0.1
0.518
9167
0.667
696
0.5
0.526
4 254
0.667
340
0.1
0.505
115 537
0.600
2 219
0.5
0.510
30 660
0.600
950
0.1
0.501
3 951 997
0.545
1 1 868
0.5
0.502
696 099
0.545
4 606
-y es el riesgo relativo para individuos del genotipo Aa comparados con

aa; p es la frecuencia del alelo de susceptibilidad A. Para anlisis de
pares de hermanos afectados (ASP), Y es el alelo esperado com parti
do y N-ASP el nmero de pares necesarios para significancia, basado
en pruebas IBD (_ = 3 x 10.5). Para pruebas de desequilibrio de trans
misin (TDT), P(trA) es la probabilidad de que un padre Aa transmita A
a un nio afectado, y N-TDT es el nmero de tros padres-hijo necesa
rios para significancia. Segn Risch y Merikangas (1996).
451
rn inclusive un alelo de susceptibilidad verdadera y algunos

pacientes no. Adems los principales determinantes de sus
ceptibilidad pueden ser diferentes en distintas poblaciones;
la naturaleza dispersa del DE, con la coexistencia de algunas co
rrelaciones de largo alcance con falta de correlacin de corto al
cance, significa que a pesar de la alta resolucin terica de los
estudios de asociacin, en realidad rara vez puede tenerse la
confianza de estar buscando justo en el sitio adecuado para el
determinante de susceptibilidad. Ms an, no hay una forma
gentica de identificar el determinante verdadero entre un gru
po de alelos que se encuentran en su totalidad en desequilibrio
potente entre s;
es posible que las variantes genticas que causan susceptibili
dad a enfermedades frecuentes no sean mutaciones obvias.
Aunque se conocen excepciones, las enfermedades mendelia
nas suelen deberse a mutaciones que inactivan por completo
un gen, o cuando menos tienen un efecto mayor en su expre
sin (cap. 16), y no suele ser difcil resolver si una variante de
secuencia del DNA candidato lo llevara a cabo. Es ms proba
ble que la susceptibilidad a enfermedades frecuentes dependa de
una combinacin de cambios muy sutiles en la expresin de va
rios genes, ninguno de los cuales es patgeno en forma aislada,
y todos los cuales pueden ser muy frecuentes en la poblacin sa
na. La susceptibilidad puede modelarse mejor como un locus de
carcter cuantitativo (LCC, vase seccin 15.6.8) que como
un factor binario (presente/ausente). Los factores de suscepti
bilidad pueden ser polimorfismos en DNA no codificante que
tienen cierto efecto pequeo en la actividad promotora, el em
palme o la estabilidad de mRNA. Por ejemplo, el alelo
UCSNP-43 G que se relacion con la susceptibilidad a la dia
betes tipo 2 (seccin 15.6.5) se encuentra a profundidad den
tro de un intrn del gen candidato y tiene una frecuencia de
0.75 en testigos no afectados.
Para un comentario meditado del problema (en el contexto de la
diabetes tipo 2) vase la revisin de Altshuler, Daly y Kruglyak
(2000).
15.6
Ocho ejem plos que ilustran

el xito v ariab le de la diseccin
g entica de enferm edades
com plejas
No se cuenta con una historia unificada en el anlisis gentico de

enfermedades complejas. Los autores no intentan resumir el estado
actual de jugar a travs de todo el campo: cada enfermedad es dife
rente. Los lectores interesados en una enfermedad especfica deben
recurrir a PubMed para encontrar una buena revisin actualizada
del padecimiento que elijan. Las ocho enfermedades que se resu
men en este captulo se escogieron para ilustrar algunos de los te
mas recurrentes de la investigacin de una enfermedad compleja.
Los autores no se concentraron en presentar historias de xito. En
algunos casos hay muy poco progreso que informar. La falta de xi
to es casi tan interesante como el xito si se toman en cuenta los
grandes esfuerzos relacionados en cada caso.
452 | CAPTULO QUINCE | MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
15.6.1 Cncer de mama: la identificacin de un

subgrupo mendeliano condujo a adelantos
mdicos importantes, pero no explica
las causas de la enfermedad espordica
frecuente
Aunque los cnceres comunes suelen ser espordicos, la existencia de
familias con cncer se conoce desde hace mucho tiempo. Cuando
varios familiares sufren el mismo cncer raro, como los schwanno
mas vestibulares (vase NF2, MIM 101 000), es fcil sospechar un
sndrome mendeliano, y la investigacin de estas familias condujo
a identificar los genes supresores de tumor que se describen en la
seccin 17.4. Puesto que el cncer de mama es frecuente -el riesgo
durante toda la vida para una mujer inglesa es de 1 en 12-, cuan
do varios familiares tienen cncer de mama es menos claro si se tra
ta slo de mala suerte o de una verdadera familia con cncer. Sin
embargo, un antecedente familiar fuerte de cncer de mama tam
bin se relaciona con una edad de inicio excepcionalmente tempra
na, con cncer de mama aunado a cncer de ovario, tumores
A nlisis d e
se g reg aci n
c o m p lejo
bilaterales frecuentes y a veces varones afectados. La investigacin

de estas familias condujo a la identificacin de los genes BRCA1 y
BRCA2.
Un anlisis de segregacin a gran escala de 1 500 familias (Newman y cois., 1988) apoy el concepto de que 4 a 5% del cncer de
mama, en particular los casos de inicio temprano, podra atribuir
se a factores hereditarios. Se reunieron anlisis de enlace en familias
con patrones de genealoga casi mendelianas (fig. 15-7; vase MIM
113 705 para detalles del trabajo de enlace). Un locus de suscepti
bilidad, denominado BRCA1, se mape a 17 q21 en 1990. La edad
media al momento del diagnstico en familias enlazadas con 17q
fue antes de los 45 aos. Las familias con inicio ms tardo tuvie
ron calificaciones lod negativas. En 1994 una bsqueda de enlace
en 15 familias grandes con cncer de mama no enlazadas con 17c
identific un locus BRCA2 en 13 q l2 (vase MIM 600 185). Lue
go sobrevino uno carrera turbulenta para identificar los dos genes
mapeados. BRCA1 se clon en 1994 y BRCA2en 1995; vanse en
tradas MIM 113 705 y 600 185 para detalles. Pareca que BRCA1
podra explicar 80 a 90% de familias tanto con cncer de manu
Alelo de enfermedad dominante, frecuencia - 0.01

Riesgo
Por edad Por edad Tiempo

40
55
de vida
Portador del gen 0.37
0.66
0.82
No portador
0.028
0.081
0.004
23 fam ilias de m ltiples casos seleccionadas
M odelo de susceptibilidad gen tica (4% de fam ilias)
A nlisis d e calificacin lod
G en BRCAI
24 exones
1 863
am inocidos
Locus en 17q21
(Z = 3 .2 8 - 5.98 con D 17S84)
214 familias de mltiples casos

seleccionadas (estudio internacin a.
de colaboracin)
R egin c a n d id a to d e BRCAI
Fig. 15-7. Forma en que se encontr el gen BRCA1.

La clonacin posicional estndar identific de manera satisfactoria un gen que confera susceptibilidad a una enfermedad frecuente -pe ro slo a un
subgrupo mendeliano de la enfermedad-, Al parecer BRCA1 tiene poca funcin en el cncer de mama espordico comn.
15.6 1 OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL XITO VARIABLE DE LA DISECCIN GENTICA. . . [ 453
como de ovario, pero una proporcin mucho menor de familias

con cncer de mama nada ms. El cncer de mama en varones se
observ sobre todo en familias con BRCA2.
Ambos genes codifican protenas nuevas grandes que al final
resultaron ser coactivadores transcripcionales, con funciones adi
cionales en la reparacin del DNA (vase seccin 17.5.1). Se com
portan como genes supresores de tumor, porque las mutaciones
heredadas causan prdida de funcin (seccin 16.3) y los tumores
de casos familiares pierden el alelo de tipo silvestre. Sin embargo, la
historia del cncer de mama ofrece un contraste notable con el cn
cer de colon. En este ltimo, el gen APC, que se identific median
te el estudio de una forma mendeliana rara de la enfermedad,
tambin suele estar mutado en las formas espordicas frecuentes
(seccin 17.5.4). En contraste BRCA1 y BRCA2 rara vez estn
inactivados en el cncer de mama espordico. Ms an, las muta
ciones en estos dos locus explican slo 20 a 25% del riesgo familiar
de cncer de mama (Pharoah y cois., 2002). Una encuesta de 257
familias con cuatro casos o ms de cncer de mama (Ford y col.,
1998) sugiri que de las que tenan cuatro o cinco casos de cncer
de mama en mujeres pero sin cncer de mama en ovario o cncer de
mama en varones, tal vez 67% no incluy mutaciones BRCA1/2.
Nathanson y Weber (2001) describieron la bsqueda de ms genes
de susceptibilidad. El anlisis de segregacin es compatible con que
la susceptibilidad restante es polignica y se identific un alelo de
riesgo comn de penetracin baja: una mutacin en el gen de cinasa del ciclo celular CHEK2 se encontr en 1.1% de los testigos pe
ro en 5% de pacientes con cncer de mama (CHECK2-Breast
Cncer Consortium, 2002).
Los datos iniciales sugirieron que una mujer que porta una mu
tacin BRCA1 tiene 85 a 90% de posibilidad de desarrollar cncer
de mama y 40% de riesgo de cncer de ovario. El riesgo de cn
cer de mama (pero no de ovario) para una mujer con una muta
cin BRCA2 es similar. Sin embargo, estos anlisis se basaron en
mujeres de las familias grandes que se utilizaron para el mapeo.
Ms adelante, cuando se encontraron mutaciones en mujeres no
seleccionadas por antecedente familiar, se observaron mucho
ms casos no penetrantes entre sus familiares. Tres mutaciones
particulares (185delAG y 5382insC en BRCA1, 6174delT en
BRCA2) son ms frecuentes en mujeres judas ashkenazi. Un es
tudio de familiares de mujeres ashkenazi con cncer de mama,
no seleccionadas con base en el antecedente familiar, sugiri un
riesgo de 36% durante la vida de las portadoras de estas muta
ciones en lugar de 85 a 95% que suele sealarse (Fodor y cois.,
1998). Una caracterstica general de la investigacin de una en
fermedad compleja que estima de manera inicial la penetrancia,
la gravedad y el riesgo para los familiares, definidos en los con
juntos de familias empleadas para la identificacin original del
locus de susceptibilidad, exagera el riesgo en la poblacin general
(Gring y cois., 2001). Este hecho tiene implicaciones importan
tes para la seleccin de poblacin. Es probable que las mutacio
nes definidas en estudios familiares iniciales tengan un efecto
mucho menos notable en casos en que se precisan mediante selec
cin y adems bien pueden existir mutaciones de penetrancia ba
ja que podran no advertirse en el estudio inicial pero revelarse
mediante la seleccin de poblacin.
15.6.2 Enfermedad de Hirschsprung: una enfermedad

oligognica
La enfermedad de Hirschsprung (HSCR) es una ausencia congni
ta de ganglios en la totalidad o alguna parte del intestino grueso o
colon. La consecuente falta de actividad peristltica produce un
megacolon muy distendido que es letal para el neonato a menos
que el segmento afectado se extirpe. Amiel y Lyonnet (2001) revi
saron la gentica de la enfermedad de Hirschsprung (HSCR). La
HSCR es parte de un sndrome en 18% de los casos y 12% ms
presenta anomalas cromosmicas. El restante 70% tiene HSCR
aislada, un padecimiento multifactorial tpico, a menudo familiar
pero no mendeliano. El resultado del anlisis de segregacin ya se
coment (cuadro 15-4). Los mtodos de clonacin posicional cl
sica tuvieron xito para identificar varios locus en la HSCR.
Una anormalidad cromosmica: se observaron dos pacientes
con HSCR que tenan deleciones visibles de 1Oql lq21. El oncogn RET se encuentra en la regin eliminada y codifica una
cinasa de receptor de tirosina que se expresa en las clulas apro
piadas. Result que alrededor de 50% de los familiares y 15 a
35% de los pacientes espordicos con HSCR aislada tienen una
mutacin RET, pero tambin algunos familiares no afectados.
Las variantes conocidas de RET no explican la totalidad del
efecto del locus RET en la susceptibilidad; tal vez variantes no
codificantes tambin desempeen una funcin (Gabriel y cois.,
2002a). Vase la patologa molecular interesante de las muta
ciones de RET en la seccin 16.6.2.
Enlace y un modelo de ratn: un segundo locus de suscep
tibilidad se mape en el cromosoma 13q en una genealoga
menonita muy numerosa con mltiples consanguinidades; la
presencia de HSCR en varios pacientes no relacionados con dcleciones de 13q apunt asimismo hacia esta regin. De manera
independiente, el gen del receptor de endotelina B (ednrli) del
ratn se knocked como parte de una investigacin de la partici
pacin de las endotelinas en el control del tono vascular. Resul
t inesperado que el knockout tiene el fenotipo de un modelo de
ratn de HSCR bien estudiado, piebald-lethal ( s l\). En el hom
bre, EDNRB se encuentra en la regin candidato de HSCR en
13q y poco tiempo despus se demostr una mutacin en la ge
nealoga menonita. Como hecho interesante, una vez que la
mutacin familiar se defini (como W276C), se encontr que
no era necesaria ni suficiente. La penetrancia fue especfica de
sexo y distinta para cada genotipo: 0.13 (M), 0.09 (F) para
W/W, 0.33 (M), 0.08 (F) para W/C, y 0.85 (M), 0.60 (F) pa
ra C/C, lo que ilustra el carcter oligognico de la enfermedad
de Hirschsprung. Merece la pena leer los informes de este tra
bajo (Puffenberger y cois., 1994a, b) como una ilustracin de las
complejidades de la identificacin de genes en una enfermedad
oligognica hasta cierto punto frecuente.
Pruebas directas de genes candidato: puesto que tanto RET
como EDNRB codifican receptores, los genes que codifican sus
ligandos (GDNF, NT Ny EDN3) fueron genes de susceptibili
dad candidatos naturales. En un nmero pequeo de familias se
demostraron mutaciones en cada uno; otra familia tena una
454 I CAPTULO QUINCE j MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
mutacin en el gen ECE1 que codificaba una enzima necesaria

para la maduracin proteoltica de la endotelina 3. Se identific
un gen candidato adicional, SOXIO, cuando el gen subyacente
en otro modelo de ratn de HSCR, megacolon dominante, se clo
n pero dio por resultado que los humanos con mutaciones
SOXIO tuvieran sndromes complejos en lugar de HSCR tpica.
Las mutaciones en SMAD1P1 en 2q22 son frecuentes en pacien
tes con HSCR y retraso mental.
Mapeo de locus de susceptibilidad restantes: aunque RET es
el gen principal, la penetrancia es incompleta y dependiente del
sexo (65% en varones, 45% en mujeres). Los otros genes identi
ficados son importantes en familias ocasionales, pero no contri
buyen de manera significativa a la susceptibilidad total. Gabriel
y colaboradores (2002a) realizaron anlisis de enlace sistemti
cos, a partir de los cuales concluyeron que las variaciones en el
locus RET, que interactan con variacin en locus desconocidos
en 3p21 y 19ql2, aunadas a un modificador dependiente de
RET en 9q31, explicaran toda la susceptibilidad gentica a la
enfermedad de Hirschsprung (HSCR). Sin embargo, en la ge
nealoga menonita mencionada, al parecer la susceptibilidad es
t determinada por una interaccin entre alelos en los locus RET
y EDNRB, junto con un locus no identificado en 16q23 (Carrasquillo y col., 2002). Como hecho curioso no se observ nin
guna asociacin sugestiva con los locus 3p21 a 19ql2, ni con
21q22.3, que antes se inform que estaban asociados dentro de
esta genealoga.
La HSCR aislada surge como una enfermedad oligognica (Amiel
y Lyonnett, 2001). Si la clonacin posicional y los estudios funcio
nales apoyan este anlisis, la HSCR bien podra ser la primera de
estas enfermedades que se analiza por completo. Un contribuyente
importante de este xito es el valor muy alto, 187, de \s (Gabriel y
cois., 2002a).
15.6.3 Enfermedad de Alzheimer: los factores genticos

son importantes tanto en la forma frecuente
de inicio tardo como en las formas mendelianas
raras de inicio temprano, pero son genes
diferentes que actan de maneras distintas
La enfermedad de Alzheimer (EA) (AD; MIM 104 310) afecta a
alrededor de 5% de las personas mayores de 65 aos y a casi 20%
de las de ms de 80. Ocurre una prdida progresiva de la memo
ria, seguida de alteraciones de la conducta emocional y deterioro
cognoscitivo general. Las necropsias del cerebro revelan prdida
de neuronas con muchas placas que contienen amiloide. Las
neuronas en degeneracin incluyen maraas neurofibrilares ca
ractersticas. Rara vez inicia a una edad mucho menor. Las carac
tersticas clnicas y anatomopatolgicas son idnticas en la EA de
inicio temprano y la de inicio tardo, pero a veces la enfermedad
de inicio temprano es mendeliana y autosmica dominante, en
tanto que la EA de inicio tardo no es mendeliana y slo muestra
un agrupamiento familiar moderado. El anlisis de calificacin
lod estndar permiti mapear y despus clonar los tres genes, APP
en 21 q21, presenilina-1 en 14q24 y presenilina-2 en 1q42 (vase
MIM, 104 300, 104 311 y 600 579 respectivamente) en familias
dominantes de inicio temprano. Aunque las mutaciones en estos
tres locus slo explican alrededor de 10% de los casos de EA que
inician antes de los 65 aos de edad, se observan en particular en
las familias raras afectadas por EA dominante muy penetrante de
inicio notablemente temprano. Cualquier persona que desee in
formacin respecto a lo que esta enfermedad significa para una
familia debe leer Hannab' s Heirs de Daniel Pollen (vase Lecturas
adicionales).
Las familias de inicio tardo de mltiples casos no mostraron evi
dencias de enlace con los locus relacionados con la enfermedad de
inicio temprano, pero s enlace con el cromosoma 19. Por ltimo el
locus de susceptibilidad se identific como APOE (apolipoprotena
E, MIM 107 741), localizado en 19ql3.2. Se conocen tres alelos con
frecuencias (en caucsicos) de 0.08 (E2), 0.77 (E3) y 0.15 (E4). Tan
to la EA familiar de inicio tardo como la espordica se relaciona con
firmeza con el alelo E4, mientras que E2 se vincula con resistencia a
la enfermedad de Alzheimer (EA). En estudios seccionales cruzados
de personas mayores de 65 aos los pacientes E3/E4 tuvieron alrede
dor de tres veces el riesgo y los de E4/E4 casi 14 veces, en compara
cin con homocigotos E3. Al parecer ApoE explica cerca de 50% de
la susceptibilidad a la EA de inicio tardo. Por consiguiente, en con
traste con el cncer de mama, no slo las formas mendelianas raras
sino tambin la forma espordica frecuente tienen un grado impor
tante de determinacin gentica. Un estudio longitudinal (Meyer y
col., 1998) sugiri que E4 puede regir la edad de inicio ms que la
susceptibilidad. Una vez que la EA comienza, su progreso no es dis
tinto en personas con E4 o sin l. Si bien no hay discusin en cuan
to a la relacin de E4 con EA de inicio tardo, el mecanismo an no
se aclara. Los determinantes E2/E3/E4 son sustituciones de los ami
nocidos R112C y R158C; investigaciones intensivas no revelaron
ningn determinante de susceptibilidad verdadero en el desequili
brio de enlace con E4.
Estudios de enlace y asociacin ms amplios proporcionaron
una pltora de otras regiones de susceptibilidad candidatas. Emahazion y colaboradores (2001) hicieron una lista de ellas y publica
ron un estudio de asociacin a gran escala utilizando SNP de 60
regiones o genes candidatos. Los resultados, despus de corregir los
valores p crudos para pruebas mltiples, apenas identificaron
APOE y fueron negativos para todos los otros candidatos. Los au
tores emplean estos datos para destacar lo difcil que ser confirmar
o refutar las asociaciones sostenidas en enfermedades complejas.
Por lo general los estudios de seguimiento no replicaron una loca
lizacin inicial: con cunta frecuencia esto se debe a que el infor
me inicial fue un error tipo 1 y qu tan a menudo a que el estudio
de seguimiento careca de potencia? Con base en la tendencia es
tadstica de los estudios a estimar en exceso el efecto de cualquier
locus verdadero que identifican (Gring y cois., 2001), no resulta
fcil decidir qu tanta potencia requerira un estudio de segui
miento para refutar un enlace.
La historia ApoE tambin es muy importante para las discusio
nes acerca de las posibles implicaciones sociales y ticas de la iden
15.6
OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL XITO VARIABLE DE LA DISECCIN GENTICA.. .
tificacin del alelo de susceptibilidad para una enfermedad frecuen

te (vase Recuadro de tica 1).
15.6.4 Diabetes mellitus tipo 1: an es la pesadilla

de los genetistas?
El primer paso para comprender la gentica de la diabetes consisti
en distinguir los diferentes tipos de esta afeccin (cuadro 15-8). Las
diabetes tipo 1 y tipo 2 son enfermedades diferentes, con causas
distintas, evoluciones diversas y gentica distinta. La diabetes tipo
455
1 (DT1, diabetes dependiente de insulina; vase MIM 222 100) se

debe a la destruccin autoinmunitaria de las clulas (3 pancreticas,
suele afectar a personas jvenes y stas requieren tratamiento con
insulina toda la vida. Se observa un agrupamiento familiar bastan
te fuerte (\s =15, concordancia de gemelos MC, cerca de 30%).
En el decenio de 1970 se estableci una asociacin con ciertos alelos HLA.
En el Reino Unido, alrededor de 95% de los pacientes con DT1
tiene antgenos HLA-DR3, DR4, o ambos, en comparacin con 45
a 54% de la poblacin general. HLA constituye cerca de 40% de la
tica, recuadro I . Enfermedad de Alzheimer, prueba de ApoE y discriminacin

La identificacin de genotipos susceptibles a enfermedades frecuentes da lugar
a problemas ticos y sociales que ApoE lustra bien. Los patrones y las ase
guradoras presionarn para el uso amplio de las pruebas, y ello conduciria a
una discriminacin Injusta en el empleo, el cuidado de la salud y el seguro?
Empleo. Los patrones tienen un Inters legitimo en la capacidad en cur
so de una persona para realizar el trabajo, pero muy poco Inters en lo
que pudiera suceder en un tiempo de 10 aos. Slo los trabajos que re
quieren que el patrn invierta intensamente en entrenamiento especializa
do son una excepcin parcial a ello. En el Reino Unido sera legal que un
patrn discriminara a una persona sana por su riesgo de desarrollar una
enfermedad en alguna fecha posterior.
Cuidado de la salud. En pases con sistemas mdicos especializados no
se presenta el problema de discriminacin en el cuidado de la salud. Don
de el acceso depende de seguros privados, el problema regresa al aspec
to de la discriminacin en seguros.
Seguro. El seguro comercial se basa en el principio de mutualidad; el ase
gurador asigna al solicitante a un fondo comn de riesgo y la prima refleja
el riesgo al que el solicitante contribuye al fondo comn. En plizas de se
guros suscritas de manera individual siempre habr un conflicto entre la
justicia actuarial y la justicia moral. Es justo que se penalice a un solici
tante por una constitucin gentica que no est bajo su control? No obs
tante, la mayora de las personas no tiene problemas con compaas que
asignan diferentes tarifas para varones y mujeres. La solucin obvia es
comprobar que el seguro basado en mutualidad no se utiliza para sufragar
las necesidades de una vida civilizada, como el cuidado bsico de la salud,
sino que se limita a productos que la persona puede elegir comprar o no
como parte de sus elecciones normales en las sociedades consumidoras.
y C. El inters de las aseguradoras es evitar la antlseleccin. sta surge

cuando los proponentes utilizan el conocimiento secreto para obtener una
ventaja injusta. Alguien que sabe en secreto que tiene un riesgo alto adquie
re una pliza especialmente considerable en trminos estndar, en tanto que
alguien que sabe que tiene un riesgo bajo decide no molestarse con un se
guro. Por tanto las aseguradoras desean conocer tanto como sea posible del
solicitante respecto a pruebas preexistentes importantes; la nica razn le
gtima para hacer que un solicitante se someta a pruebas extra es cuando se
sospecha que, de hecho, ya se las hizo en secreto.
El criterio de lo que es importante" es distinto para pruebas clnicas y de
aseguradoras. En una prueba clnica til el resultado debe ser predecible
para cada individuo. Para la aseguradora, en principio, slo es necesario
disponer de una prueba para distinguir grupos con riesgos promedio muy
diferentes -un a labor mucho menos exigente. sta es la diferencia entre
desviacin estndar y error estndar de la media. AP0E4 no es necesa
ria ni suficiente para la enfermedad de Alzheimer (EA). Casi la mitad de
las personas con APOE4 nunca desarrollar EA, sin Importar cunto tiem
po vivan, en tanto que muchos pacientes con EA carecen de AP0E4. La
incertidumbre no permite ni la confirmacin de un diagnstico clnico ni
pruebas de prediccin tiles en personas sanas. El American College of
Medical Genetics y la American Society of Human Genetics recomiendan
no utilizar la prueba ApoE para el diagnstico clnico de rutina o pruebas
de prediccin en la enfermedad de Alzheimer (EA) (ACMG/ASHG Working
Group, 1995). La nica indicacin clnica para la genotipificacin ApoE en
la enfermedad de Alzheimer sera que un medicamento caro utilizado pa
ra el tratamiento de pacientes con Alzheimer slo fuera eficaz para cier
tos genotipos ApoE o en especial perjudicial en ciertos genotipos. El
problema crucial para el seguro consiste en saber si los genotipos ApoE
definen fondos comunes con riesgos suficientemente diferentes para que
las pruebas sean importantes. Segn los actuarios Macdonald y Pritchard
(2001), la pregunta bsica, con unas cuantas calificaciones, es no".
Aunque resulte que la prueba ApoE no origine problemas de poltica pbli
ca mayores, es posible que lleguen otras pruebas que s requieran control
social. Las tres caractersticas de una prueba que originara alarmas son:
Fondo comn
de riesgo A
prima $ 1.00
Fondo comn
de riesgo B
prima $1.50
Fondo comn
de riesgo C
prima $3.00
Al contrario de la creencia popular, las aseguradoras tienen muy poco Inte

rs en que las personas se sometan a pruebas genticas. En el ejemplo ilus
trado la compaa aseguradora no recibe un beneficio por el uso de pruebas
genticas para dividir el fondo comn de riesgo A en los fondos comunes B
predecir un riesgo que ya no es evidente en el estilo de vida o el an

tecedente familiar (esto excluye, por ejemplo, pruebas para enferme
dad de Huntington);
el padecimiento debe ser suficientemente frecuente y la prueba lo
bastante predecible para que la aseguradora no corra el riesgo de ig
norarla, pero la prueba no debe estar disponible como parte del ser
vicio clnico rutinario;
deben estar disponibles pruebas confidenciales privadas y utilizarlas
con amplitud.
456 j CAPITULO QUINCE
predisposicin gentica, pero varios haplotipos diferentes se relacio

nan con susceptibilidad o resistencia. El desequilibrio de enlace po
tente dentro del complejo mayor de histocompatibilidad dificulta
la identificacin del principal determinante de susceptibilidad. Se
encontr que todos los haplotipos que se acompaan de un riesgo
bajo de diabetes llevan un alelo en el locus DQB1 en el que el ami
nocido 57 es cido asprtico, en tanto que los haplotipos de alto
riesgo tienen alelos DQB1 con algn otro aminocido en esta po
sicin (Todd y cois. 1987). En un estudio, 96% de diabticos pero
slo 20% de testigos fueron homocigotos no Asp en la posicin 57
de DQB1. Es probable que un factor de resistencia est definido
por un antgeno epitopo que incluye Asp-57 que varias molculas
diferentes de HLA comparten. La idea del epitopo compartido sue
le aplicarse tambin a otras enfermedades autoinmunitarias relacio
nadas con HLA, con un xito mixto.
Asimismo, el trabajo inicial en la DT1 identific un segundo
locus de susceptibilidad, IDDM2, cerca de INS, el gen estructural
para insulina. El mapeo de desequilibrio de enlace revel el deter
minante real como una repeticin minisatlite de 14 pb corriente
arriba del gen. La susceptibilidad se vincul con repeticiones cor
tas (unidades de repeticin 26 a 63). Las repeticiones largas (140
a 210 unidades) determinan que el gen de insulina se transcriba
a un nivel bastante ms alto en el timo en desarrollo; se argumen
ta que esto incrementa la eficiencia de la delecin de las clonas de
clulas T reactivas a insulina durante el desarrollo del sistema inmunitario y reduce el riesgo de un ataque autoinmunitario.
Tanto el trabajo HLA-DQB como los hallazgos INS subrayan la
probable diferencia entre el tipo de cambios genticos sutiles
que pueden sustentar la susceptibilidad a una enfermedad fre
cuentes y los cambios gruesos que se observan en enfermedades
mcndelianas.
Varios grupos siguen con firmeza la estrategia de exmenes de
enlace del genoma completo seguidos de mapeo de desequilibrio
de enlace dentro de las regiones candidato. El artculo del European Consortium (2001) proporciona referencias de los principales
estudios de enlace y el cuadro 15-9 incluye una lista de las princi
pales regiones implicadas hasta la fecha. A fin de evitar el efecto
potente de HLA de ocultar seales ms dbiles, los datos para el
genotipo HLA suelen estratificarse antes de buscar enlace a otros
locus. Las regiones definidas mediante estudios de PHA son muy
amplias y, ms an, el locus verdadero puede situarse bastante le
jos del pico de calificacin mxima, lo que determina que sea muy
difcil conocer cuntos locus de susceptibilidad distintos se en
cuentran en 2q y 6q, por ejemplo. En teora la contribucin total
de cada locus puede medirse mediante la expresin de su \s como
una fraccin de la Xs total para D Tl (Risch, 1990a), de manera
que es posible saber cunto queda por explicar. Sin embargo, la
prctica usual de emplear el mismo grupo de datos para definir
una regin candidato y luego calcular \s proporciona estimaciones
muy poco confiables (Gring y cois., 2001). Tal vez HLA e INS ex
pliquen 50% de la susceptibilidad, pero la contribucin total de
los otros locus del cuadro 15-9 se desconoce.
Varias caractersticas de la DTl parecen favorecer la investiga
cin gentica. Con bastante frecuencia (tres por mil) es posible
reunir grupos grandes de pacientes para estudio. Los enfermos
son jvenes y sus padres suelen estar disponibles para anlisis de
pruebas de desequilibrio de transmisin (PDT). El diagnstico
no es ambiguo y se cuenta con un buen modelo animal, el ratn
NOD (no obeso diabtico), en el que la enfermedad tambin es
polignica. Por todas estas razones, y a causa de sus costos finan
ciero y personal considerables, durante decenios la D Tl se ha in
vestigado de manera intensa mediante enlace, estudios de gen
candidato y organismo modelo. Si se considera el progreso hasta
cierto punto modesto logrado hasta la fecha, tal vez sea tiempo de re
sucitar la antigua descripcin de la diabetes como la pesadilla de
los genetistas.
Cuadro 15-8. Clasificacin clnica de la diabetes.

Diabetes tipo 1
Diabetes tipo 2
DJIM
Inicio juvenil
Inicio en la madurez ( > 40 aos)
Inicio juvenil
0.4% de la poblacin britnica
6% de la poblacin estadounidense
Rara
Requiere Insulina
Por lo general controlable con hipoglucemiantes orales
Como la diabetes tipo 2
Ausencia de obesidad
Asociacin potente con obesidad
Ausencia de obesidad
Familiar:
Familiar:
Familiar:
Concordancia de MC 30%
Concordancia de gemelos MC 40 a 100%
autosmica
riesgo de hermanos 6 a 10 %
riesgo de hermanos 30% (puede ser subclnica)
dominante?
Se relaciona con
Sin relacin con HLA
Sin relacin con HLA
HLA-DR3 y DR4
DJIM (diabetes juvenil de Inicio en la madurez) es una form a Infrecuente mendeliana, rara, para la que se identificaron varios genes (vase MIM
600496). Adems la diabetes puede ser parte de varios sndromes raros.
15.6 j OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL XITO VARIABLE DE LA DISECCIN GENTICA.
457
Cuadro 15-9. Principales locus de susceptibilidad a diabetes tipo 1 sugeridos por anlisis de pares de hermanos afectados
(PHA) o prueba de desequilibrio de transmisin (PDT).
Lo cu s
M IM n m .
L o c a liz a c i n
E stado
IDDM1
222100
6p21
x s = 3.1; el determinante es HLA-DBQ
IDDM2
125852
1 1 p15
\ s - 1.3; el determinante es un NVRT corriente arriba del gen INS
IDDM4
600319
1 1 q13
\ s = 1.6; enlace significativo en resultados combinados de tres selecciones (596 familias)
IDDM5
600320
6q24-q27
\ s = 1 .2; observada en cuatro estudios
IDDM6
601941
18q21
Pruebas de PHA y PDT en un estudio
IDDM7
600321
2q31-q33
\ s = 1.3; observado en tres estudios de PHA. Desequilibrio de enlace con gen candidato CTLA4,
ID DM 12
600388
2q33
p = 5 x 10 5 pero slo en algunas poblaciones
IDDM8
600883
6q25-q27
\ s = 1.8; no claramente distinto de IDDM5
ID DM 10
601942
10 p1 1 -q1 1
Datos de PHA y PDT de tres estudios
ID DM 13
601318
2q34
Igual que ID D M 7 ,12, o ambos?
IDDM15
601666
6q21
Confirmado (a travs de un efecto difcil de separar de HLA)
Datos de las entradas OMIM y artculos citados en las mismas; los valores \ s son de Lou y colaboradores (1995).
15.6.5 Diabetes tipo 2: dos factores de susceptibilidad,

uno muy frecuente para ser indetectable
mediante enlace; el otro muy complejo y
slo en ciertas poblaciones
La diabetes mellitus no dependiente de insulina o tipo 2 (DT2)
es la forma ms usual de este trastorno heterogneo, que afecta a
cerca de 135 millones de personas en todo el mundo. La DT2 es
resultado de una combinacin de deterioro de la secrecin de in
sulina y disminucin de la respuesta de rgano final; los factores de
riesgo que se conocen incluyen edad, obesidad y falta de ejercicio.
En muchos pases desarrollados 10 a 20% de las personas mayores
de 45 aos de edad est afectado y ciertas poblaciones tienen inci
dencias en particular altas.
Se informaron asociaciones entre DT2 y cuando menos 16 va
riantes genticas distintas (resumidas por Altshuler y cois., 2000a).
Un estudio muy grande de Altshuler y colaboradores slo replic
una. Un alelo comn (p = 0.15) del gen PPARGst vincul con dis
m inucin del riesgo de DT2 en varias cohortes (razn de posibili
dades = 0.8). Como el alelo de riesgo mayor t s tan frecuente (p =
0.85) tal vez nunca se detecte mediante anlisis de enlace. PPARG
no es un gen candidato que cause sorpresa: codifica un receptor nu
clear hormonal que regula la adipognesis y es un blanco de los me
dicamentos de la tiazolidinediona que se utilizan para el tratamiento
de la diabetes tipo 2 (DT2).
Altmller y colaboradores (2001) detallaron 10 exmenes del
genoma completo e informaron un enlace importante de 25 locus
en 15 cromosomas diferentes. Como es usual, los hallazgos no se
replicaron bien entre estudios. Un locus, NIDDM1 en 2q37, se
identific en mexicoestadounidenses y al parecer interacta con un
locus en el cromosoma 15 para incrementar la susceptibilidad en
este grupo (vase Horikawa y cois., 2000 para referencias). El artculo

de Horikawa y colaboradores describe la identificacin de una com
binacin particular de SNP dentro del gen calpana 10 (CAPN10) en
2q37 como el determinante de susceptibilidad en mexicoestadou
nidenses. Para mencionar una editorial que merece mucho la pena
leer, el estudio proporciona una visin sin precedentes en el borde
de corte de la clonacin posicional para caracteres complejos y en
sea lecciones de importancia duradera respecto a lo difcil que
puede ser encontrar genes para enfermedades frecuentes (Altshuler y cois., 2000b).
El trabajo se inici reduciendo la regin candidato a una re
gin de 7 cM en 2q37. En trminos fsicos esto correspondi a
un contiguo de 1.7 Mb (las tasas de recombinacin tienden a ser
ms altas cerca de telmeros, seccin 13.1.5). Se estudi una serie
de polimorfismos a partir de esta regin, no slo para la asociacin
con DT2, sino tambin para la asociacin con la prueba para enla
ce. La justificacin consisti en que aunque slo un subgrupo de
casos estaba enlazado al locus 2q37, sos deben ser los nicos que
llevan el determinante de susceptibilidad. Anlisis iniciales sugirie
ron una regin blanco de 66 kb, que en el examen contena tres ge
nes, CAPN10, RNPEPL1 y GPR35, y 179 variantes de secuencia
(en un grupo de 10 diabticos mexicanos). Lo anterior condujo a
identificar una variante, UCSNP-43, en la que el genotipo homocigoto G/G mostr asociacin con la prueba para enlace y quiz
tambin con diabetes (razn de posibilidades, 1.54; intervalo de
confianza, 0.88 a 2.41). Luego dio inicio la bsqueda de haplotipos que fueran: a) ms frecuentes en los grupos de pacientes con
mayor evidencia de enlace 2q37; b) compartidos por pares de her
manos afectados con mayor frecuencia de la esperada, y c) vincula
dos con riesgo ms alto de diabetes. Una combinacin heterocigota
de dos haplotipos (definidos mediante tres SNP dentro de intrones
458 j CAPITULO QUINCE | MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
C en
1 25 marcadores SNP alrededor del locus NIDDM1 Tel
Fig. 15-8. Genotipos de pacientes con diabetes tipo 2 en el locus calpana-10.

Cada hilera resume los resultados de un paciente con 25 SNP (columnas). Azul: homocigoto para alelo comn; rojo: heterocigoto; amarillo: homocigoto
para alelo raro; blanco: no hay datos. Los pacientes se disponen desde la parte superior hasta la inferior en orden de prueba decreciente de enlace a
NIDDM1. Obsrvese cmo cambian los colores de la parte central del diagrama, el sitio del gen CAPN10, desde la parte superior hasta la Inferior, pero
no los colores de otras partes. Esto muestra cmo ciertos genotipos en el locus CAPN10 se asocian con la evidencia para enlace. Adaptado de Cox NJ
(2001) Hum. Mol. Genet. 10. 2301-2305 con autorizacin de Oxford Unlversity Press.
del gen CAPN10) satisfizo todos los criterios. Ningn haplotipo en

la forma homocigota tuvo un factor de riesgo. Por consiguiente el
determinante de susceptibilidad en NIDDM1 parece ser una com
binacin heterocigota particular de SNP no codificante que interacta con un factor no identificado en el cromosoma 15. La figura
15-8 pretende brindar una impresin visual de lo que significa
asociacin con evidencia para enlace.
Qu tanta confianza puede tenerse en que este proyecto impre
sionante identificara en realidad el factor de susceptibilidad de
NIDDMP. Los estudios de seguimiento arrojan resultados conflic
tivos (resumidos por Fullerton y cois., 2002); es cierto que no se ob
serva asociacin universal entre el genotipo de susceptibilidad
propuesta y DT2 en todo el mundo. Calpain 10 fue un candidato
inesperado; sin embargo, se public un efecto de UCSNP-43 en la
transcripcin del gen y se sugiri un posible efecto corriente abajo
en el recambio de glucosa estimulado por insulina. En conjunto,
este estudio impulsa a tener una gran precaucin respecto a la iden
tificacin de factores de susceptibilidad de una enfermedad com
pleja. En el lado positivo, se identific un gen candidato nuevo; en
el lado negativo, est lejos de ser claro que se haya identificado la
variante real que causa susceptibilidad y tampoco est claro cmo
podra resolverse esta incertidumbre. Otros factores de riesgo de
una enfermedad frecuente sern igual de oscuros y complejos? Re
sultarn especficos de poblaciones particulares? La labor heroica de
Horikawa y colaboradores proporciona cuando menos muchos da
tos para pensar.
15.6.6 Enfermedades inflamatorias del intestino:

un gen de susceptibilidad preciso identificado
La colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn son formas de en
fermedades inflamatorias del intestino (Eli) que en total afectan de
una a tres personas por mil en el mundo occidental. Estudios de fa
milias y gemelos apoyan una susceptibilidad gentica para cada en
fermedad con ciertos componentes compartidos. El valor de \s es
de 20 a 30 para EC y de 8 a 15 para CU. Anlisis de enlace de pa
res de hermanos y familia realizados por muchos grupos definieron
varias regiones con enlace confirmado o replicado (IBD1, 16pl2q l3; IBD 212pl3; IBD3 6p; IBD 414ql l-q l2 ; Z&D5 5q31) y mu
chos otros de enlace sugestivo (para referencias, vase OMIM
entrada 266 600). Se confirm en particular el enlace a IBD1 con
una calificacin lod mxima de 5.79 en familias con EC (pero no
CU) en un estudio mancomunado muy grande de 613 familias con
1 298 hermanos afectados con EC, CU, o ambas (IBD Internatio
nal Genetics Consortium, 2001).
En fecha reciente tres grupos identificaron un gen relacionado
con IBD1 (Hugot y cois., 2001; Oguray col., 2001; Hampe y cois.,
2001). Ogura y colaboradores clonaron CARD15 (NOD2) como
un regulador de la respuesta inflamatoria N F-kB. Lo probaron en
Eli porque se mape al locus de IBD1 y desde el punto de vista
biolgico fue un candidato prometedor de enfermedad inflamato
ria del intestino (Eli). En contraste, Hugot y colaboradores siguie
ron una va de asociacin de enlace puro. La regin candidato se
15.6 | OCHO EJEMPLOS QUE ILUSTRAN EL XITO VARIABLE DE LA DISECCIN GENTICA. . . | 459
redujo mediante enlace y luego se efectuaron estudios de asocia

cin. Cabe destacar que el resultado de la PDT que condujo a
CARD15 slo fue significativo limtrofe (/>= 0.05) y aunque se re
plic en una muestra independiente con p < 0.01, en esta ocasin
la asociacin fue con un alelo diferente del marcador! De hecho
la observacin cuidadosa de sus datos sugiere que una bsqueda
aleatoria basada en microsatlites para asociacin en una cohorte
grande no hubiera proporcionado resultados positivos. Por lti
mo asociaciones potentes, aunque no espectaculares, destacaron
una regin genmica de la que clonaron los 10 genes CARD15 no
publicados.
El principal factor de susceptibilidad en IBD1 es una inser
cin de base aislada, 3 020insC, en la parte terminal C del gen
CARD15- Hampe y colaboradores demostraron una asociacin
PDT muy fuerte entre pacientes con EC y esta mutacin. La inser
cin tiene una frecuencia de 0.08 en pacientes con EC, 0.02 en tes
tigos y 0.02 en enfermos con CU, lo que demuestra que es un
factor de susceptibilidad para EC pero no para colitis ulcerosa. El
riesgo relativo de EC se aproxima a 3 para heterocigotos y a 23 pa
ra homocigotos. La insercin produce una protena truncada en 33
aminocidos que afecta una regin con importancia demostrable
en la activacin de NF-kB.
Este trabajo destaca tres puntos. Primero, demuestra que la
empresa es posible: los genes de susceptibilidad pueden identifi
carse, cuando menos en ocasiones, mediante un mtodo genti
co. Segundo, resalta la necesidad de estudios de familias a gran
escala. Por ltimo, los resultados dbiles de PDT para marcado
res de enlace en el estudio de Hugot y colaboradores, comparados
con los resultados muy potentes que observaron Hampe y cola
boradores cuando estudiaron la mutacin de insercin de mane
ra directa, ensean una leccin importante acerca de los estudios
de asociacin. No sorprende que otras mutaciones en el gen
CARD15 tambin contribuyan a la susceptibilidad de la EC.
Otras dos cSNP, G908R y R702W (numeradas de manera distin
ta por Hugot y cois.), se asocian fuertemente con EC y una varie
dad completa de cambios en sentido errneo raros en el gen
CARD15 es ms frecuente en pacientes con EC que en testigos.
Aun en presencia de desequilibrio de enlace, cada mutacin se
acompaar de su haplotipo individual propio. Esta heterogenei
dad allica es por completo esperada -pero origina restricciones
graves en las posibilidades de localizar un gen de susceptibilidad
dentro de una regin candidato mediante una estrategia basada
en asociacin.
15.6.7 Esquizofrenia: los problemas especiales de

los trastornos psiquitricos o conductuales
Los genetistas que estudian una enfermedad psiquitrica o con
ducta antisocial enfrentan dos problemas adicionales, adems de
todas las dificultades inherentes al estudio de cualquier enferme
dad compleja.
a) A rgumentos respecto a naturaleza-crianza. Como el ambiente
familiar compartido es una explicacin tan plausible para la
tendencia a que se presenten problemas psiquitricos o con
ductuales en familias, se requiere un estndar muy alto de
pruebas para hacer afirmaciones acerca de factores genticos.

Los cuadros 15-1 a 15-3 resumen algunas de las evidencias
de estudios de familias, gemelos y de adopcin para la esqui
zofrenia. Muy a menudo los argumentos de naturaleza y
crianza son tan slo sustitutos de argumentos polticos y se
elaboran con todo el decoro y la objetividad de las polticas
pblicas. Ambos lados basan su pasin en la premisa falsa de
que si un padecimiento es gentico, entonces no puede me
jorarse con ninguna intervencin social. Por consiguiente las
personas de la izquierda favorecen la causa ambiental y las de
la derecha apoyan causas genticas. En la actualidad parte
del acaloramiento de los argumentos respecto a psiquiatra se
elimin, pero los genetistas buscan una conducta antisocial
que an atrae una posicin virulenta y patrocinadores no
bienvenidos.
b) Criterios diagnsticos. Como se comenta en la seccin 15.3.1,
los criterios diagnsticos constituyen otra rea muy difcil en
gentica psiquitrica. La esquizofrenia no debe considerarse
una enfermedad sino, igual que la epilepsia, un sndrome que
se reconoce por un conjunto de signos y sntomas que tienen
una patognesis diversa (Trimble, 1996). Los criterios acorda
dos, como DSM-IV, se basan en el mejor juicio de psiquiatras
experimentados respecto a lo que constituye el ncleo esencial
del padecimiento -pero finalmente son arbitrarios-. Es posi
ble que la personalidad esquizoide sea una manifestacin de
los genes que tornan a las personas susceptibles a la esquizofre
nia DSM-IV? O, existe quizs una susceptibilidad gentica
general a una enfermedad psictica y tambin debe incluirse la
enfermedad bipolar y depresiva? Con frecuencia los anlisis ge
nticos utilizan dos o ms grupos de criterios distintos, uno es
trecho y uno amplio, a fin de observar cul proporciona la
mejor calificacin. De otra manera los investigadores pueden
buscar enlace a un fenotipo intermedio, algo que no es esqui
zofrenia pero que pudiera formar parte de la susceptibilidad y
ser ms simplemente determinado en forma gentica -tal vez
cierta variante fisiolgica o neuropsicolgica-.
La esquizofrenia, como un padecimiento familiar hasta cierto punto
frecuente y muy aflictivo, suele ocupar un lugar alto en la lista de prio
ridades de los investigadores genticos. Altmller y colaboradores
(2001) listan 10 estudios del genoma completo efectuados desde
1994 y se conocen muchos estudios adicionales de genes o regiones
candidato individuales. Los candidatos tpicos son genes codifica
dores de protenas que participan en la neurotransmisin o que se
afectan por frmacos que se utilizan para el tratamiento de la esquizo
frenia. Las mltiples genealogas grandes afectadas no son raras y a
menudo se emplean para estudios de enlace. La eleccin de estas fa
milias tiene implicaciones para el anlisis: el programa Genehunter,
que se usa con ms frecuencia para enlace de enfermedad compleja,
no puede manejar genealogas grandes (seccin 13.6.2) y determina
que muchos investigadores utilicen anlisis paramtricos de califica
cin lod (seccin 13.3.1), pero con una diversidad de modelos gen
ticos alternativos. Aunque realizar lo anterior es del todo vlido,
introduce grados adicionales de libertad y por tanto disminuye la
potencia del estudio. En combinacin con el uso de mltiples crite
rios diagnsticos (vase antes), esto determina que la estimacin de
460
CAPTULO QUINCE MAPEO E IDENTIFICACIN DE GENES
la significancia de los resultados sea excepcionalmente falsa. No obs

tante, mltiples modelos pueden ser realistas en trminos biolgicos;
es por completo factible que un alelo de riesgo en un locus confiera
susceptibilidad dominante a una enfermedad definida de manera am
plia, en tanto que un alelo en otro locus puede conferir susceptibili
dad recesiva a la esquizofrenia definida slo de manera estrecha.
En la actualidad uno o ms estudios muestran pruebas de enla
ce a casi una docena de regiones cromosmicas, pero an no se
identifica con claridad algn alelo de susceptibilidad. Un candida
to prometedor es el alelo de valina de un polimorfismo Metl58Val
en el gen COMT (catecol-O-metiltransferasa). En trminos biol
gicos es un candidato plausible y a pesar de ciertos estudios negati
vos varios otros informaron una asociacin y resultados de la PDT
positivos. Por ejemplo, Weinberger y colaboradores (2001) encon
traron una frecuencia de 52% en testigos y de 60% en esquizofr
nicos con una razn de posibilidades de 1.5 para homocigotos. Sin
embargo, aun si se confirma, este factor slo explicara 4% de la varianza del riesgo. La entrada OMIM 181 500 proporciona vncu
los para discusiones de las principales regiones candidato, en tanto
que los estudios de Gurling y colaboradores (2002), Camp y cola
boradores (2001), Weinberger y colaboradores (2001) y Lewis co
laboradores (2003) brindan un buen cuadro de los problemas y
algunos de los mtodos que se utilizan para intentar y descubrir la
gentica de esta enfermedad trgica. Los problemas planteados en
este inciso se aplican por igual a una gama de otros fenotipos psi
quitricos y conductuales humanos.
15.6.8 Obesidad: anlisis gentico de un carcter

cuantitativo
Como un problema emotivo contencioso, la obesidad rivaliza con
la esquizofrenia, con una escuela de pensamiento que prevalece en
tre personas delgadas que culpa a una mala autodisciplina y laxitud
moral y la parte fuerte que culpa a una predisposicin constitucio
nal. La obesidad es una preocupacin de salud pblica importante
en pases desarrollados y es de gran inters para compaas de bio
tecnologa, que ven la fortuna que pueden hacer con una pldora
eficaz para la delgadez. Para los propsitos actuales, el principal in
ters en la obesidad es como ejemplo de un carcter cuantitativo
(Barsh y cois., 2000).
La medicin simple del peso no constituye una buena variable
cuantitativa para el anlisis porque confunde a las personas delga
das altas con las personas gordas bajas. El ndice de masa corporal
(IMC; peso en kg/estatura en m2) es una medida mucho ms ade
cuada. El IMC medio en Estados Unidos era de 22 kg/m2 en 1983.
Otros investigadores intentan usar medidas ms cercanas de la fi
siologa subyacente, por ejemplo, el porcentaje de tejido adiposo o
la concentracin srica de leptina. En cada caso podran utilizarse
ciertos lmites para definir la obesidad, como IMC 25 a 29 kg/m
= grado 1, IMC 30 a 40 kg/m" = grado II e IMC > 40 = grado III,
con ajustes para la edad y el sexo. Sin embargo, esta conducta es ar
bitraria y conduce a la prdida de datos. Es mucho mejor analizar
en forma directa la variable cuantitativa para identificar un locus
de carcter cuantitativo (LCC). Estas medidas cuantitativas son el
pan de cada da de la reproduccin de animales y plantas. La tcni
ca usual para el anlisis del LCC en genealogas humanas es el an

lisis de enlace varianza-componente. Almasy y Blangero (1998)
describieron la base matemtica del mtodo. En esencia, como en
el anlisis convencional de calificacin lod, se calcula una califica
cin lod a partir de la relacin de la posibilidad de los datos en dos
hiptesis alternativas. En este caso los datos son covarianzas entre
familiares para el fenotipo cuantitativo y las hiptesis alternativas
consisten en que existe o no un LCC en la localizacin cromosmica en cuestin. Las covarianzas pueden ajustarse para variables
de confusin como edad y sexo. En la hiptesis de la existencia de
un LCC, su efecto se predice a partir de la identidad por descen
diente del segmento cromosmico en el par de familiares, segn lo
evidencian los datos marcadores. El mtodo de mltiples puntos
descrito por Almasy y Blangero proporciona un intervalo de con
fianza para la localizacin del LCC y un estimado de su efecto.
Aunque el IMC se analiza como un LCC en lugar de la obesidad
como un carcter dictomo, an es preferible concentrarse en per
sonas en los extremos de la distribucin a fin de llevar al mximo
la potencia estadstica.
OMIM tiene 44 entradas que comprenden obesidad en el t
tulo o sinopsis clnica, inclusive la obesidad espectacular rara que
abarca componentes de las vas que regulan el consumo de alimen
tos -la hormona leptina, el receptor de leptina, la pro-opiomelanocortina y el receptor de la melanocortina-4-. Sin embargo, la
mayor parte de la obesidad no es mendeliana. De hecho los sn
dromes con obesidad inevitable tienen poco inters: el objetivo de
la investigacin de la obesidad es descubrir los mecanismos que
tornan susceptibles o resistentes a las personas a la obesidad indu
cida por dieta, en lugar de aquellos que controlan el peso corporal
p o r s mismos -un punto importante cuando se consideran mode
los animales-. Esta lnea de pensamiento sugiere que el mejor di
seo de investigacin slo tendra en cuenta a personas, obesas o
de otra ndole, que viven con alimentos chatarra y no hacen ejer
cicio. Pueden captarse a la salida de un sitio de alimentos rpidos
en automvil.
Como siempre la primera labor es revisar si hay algn compo
nente gentico en la causa. La obesidad tiende a presentarse en fa
milias, pero ello fcilmente podra ser un efecto de un ambiente
familiar compartido. Sin embargo, estudios en gemelos y de adop
cin sugieren que alrededor de 70% de la varianza en el IMC pue
de atribuirse a factores genticos. Anlisis de segregacin sugieren
que 20 a 65% de la varianza de IMC en la poblacin podra deber
se a uno o dos genes recesivos mayores (resumidos por Feitosa y
cois., 2002). Altmller y colaboradores (2001) publicaron una lista
de cinco exmenes del genoma total informados antes de diciem
bre del ao 2000; Feitosa y colaboradores (2002) y Deng y colabo
radores (2002) elaboraron dos informes ms recientes. Los dos
ltimos muestran curvas de calificacin lod para cada cromosoma
que ilustran con claridad el problema general de la falta de replicacin de los resultados. Como con muchas otras enfermedades com
plejas, la pregunta fundamental es si el fracaso para replicarlas
indica que el informe inicial fue errneo o que el estudio de segui
miento no tena potencia. En el caso de la obesidad tambin mere
ce la pena indicar que algunos de los mejores datos pueden estar
ocultos en los expedientes de compaas de biotecnologa, que no
se revelarn hasta que se logre algo patentable.
15.7 i GENERALIDADES Y RESUMEN
15.7
G eneralidades y resum en
15.7.1 Por qu es tan difcil?

La identificacin de factores de susceptibilidad resulta mucho
ms difcil de lo que las personas imaginaban hace 10 aos. Weiss
y Terwilliger (2002) preguntan de manera pertinente qu por
centaje de proyectos de mapeo del gen de enfermedades comple
jas, cuyas proposiciones acordadas prometieron una potencia de
80%, ha tenido xito real para identificar los genes de enferme
dad que se asuma que existan en los datos? La respuesta est
muy por debajo de 80% de que algo seguramente est mal. Su ar
tculo debe leerlo cualquier persona que piense que es fcil inves
tigar una enfermedad compleja. No obstante, cualquier aventura
importante hacia lo desconocido se acompaa siempre de argu
mentos doctos apremiantes que demuestran por qu nunca pue
de funcionar -que luego se comprueba que son errneos-. La
opinin de la mayora es que los fracasos se debieron a falta de
potencia y pueden remediarse con cohortes de pacientes ms
grandes, una genotipificacin ms efectiva y una prueba estads
tica ms potente.
461
Una vez que se eligen los SNP apropiados para estudio, el princi
pal problema es la heterogeneidad allica. Las enfermedades infla
matorias del intestino (seccin 15.6.6) ilustran a la perfeccin la
forma en que los estudios de potencia de asociacin se hunden
rpidamente tan pronto existe ms de un alelo de susceptibilidad
comn en un locus de riesgo. Los clculos de Risch y Merikangas (1996), que influyeron tanto en el impulso de estudios de
PDT al frente de la investigacin de enfermedades complejas,
consideran un alelo de susceptibilidad aislado en el locus de en
fermedad. Es importante recordar que sus clculos se aplican a
ese alelo y no a la influencia total del locus en la enfermedad. El
grado de heterogeneidad allica en un locus de susceptibilidad
surge como un determinante fundamental del xito o el fracaso.
La mayor parte de los alelos de susceptibilidad antiguos la cons
tituyen polimorfismos comunes (la hiptesis de enfermedad co
mn-variante comn), o un conjunto heterogneo de mutaciones
raras recientes, como la mayor parte de las enfermedades mendelianas? Se conocen argumentos para ambas posiciones (Reich y Lander, 2001; Pritchard, 2001; Wright y cois., 2003). El jurado an est
preparado.
El problema central debe ser la heterogeneidad
15.7.2 Si todo funciona y se identifican alelos

de susceptibilidad, entonces qu?
Para el enlace, el anlisis de un par de hermanos afectados es un

mtodo en extremo robusto. El hecho de que tengan tan pocas
calificaciones lod importantes y que los estudios se repliquen
tan rara vez entre s (Altmller y cois., 2001) slo puede deber
se a heterogeneidad de locus. Es evidente que la susceptibilidad
a la mayor parte de las enfermedades complejas est determina
da por muchos locus menores y no por unos cuantos locus ma
yores. El anlisis de pares de hermanos se limita a detectar
factores de susceptibilidad bastante fuertes. Los clculos del
cuadro 15-7 muestran que para gamma ^ 2 el exceso de com
partir alelos por pares de hermanos afectados es muy pequeo y
la deteccin requerira nmeros muy considerables. Altmller y
colaboradores (2001) compararon 101 estudios del genoma
completo para observar si podra aprenderse alguna leccin de
la forma en que tuvieran xito, pero no pudieron identificar
ninguna regla de oro adems de pensamientos obvios como el
tener una muestra grande por analizar. Una consideracin adi
cional es que la susceptibilidad en poblaciones diferentes puede
tener distintas causas genticas. Por ejemplo, en una encuesta de
483 pacientes japoneses con enfermedad de Crohn (Yamazaki y
cois., 2002) se encontraron pocas evidencias de mutaciones en
CARD15, que es un gen de susceptibilidad mayor entre euro
peos (vase seccin 15.6.6).
Los estudios de asociacin, el otro medio principal para la in
vestigacin, dependen del desequilibrio de enlace. Cada vez es
ms claro que en tanto no se tengan buenos mapas de desequili
brio a lo largo de las lneas de la figura 15-6 no se contara con una
base racional para seleccionar los marcadores que deben utilizar
se. No obstante, tambin es claro que, al contrario de los clculos
de Kruglyak (1999), en muchos casos el desequilibrio es lo bas
tante extenso para proporcionar una posibilidad razonable de xi
to de los estudios de asociacin de SNP en las escalas actuales.
En el supuesto de que puede hacerse funcionar, la identificacin

de factores de susceptibilidad para una enfermedad debe au
mentar el conocimiento de su patognesis. Aunque ello no con
duce de manera automtica a una mejora del tratamiento -es
posible que un padecimiento permanezca incurable inclusive si
se comprende bien y en ocasiones la teraputica puramente sin
tomtica es muy eficaz- comprender la patologa debe permitir
establecer conductas para el tratamiento ms razonables y diri
gidas. Los pacientes con genotipos distintos pueden tener dife
rencias en la patologa subyacente y por tanto en la respuesta a
diversos frmacos.
Es mucho menos claro si la identificacin de factores de riesgo
conducir a una preven cin efectiva. Los adelantos tcnicos en la
genotipificacin de alto rendimiento permitirn seleccionar a la
poblacin con mayor facilidad, pero siempre es imperativo pre
guntarse si esta seleccin ser eficaz para el costo y aceptable des
de el punto de vista tico. Los condiciones necesarias se comentan
con detalle en la seccin 18.3. El punto nico ms esencial, de ma
yor importancia an que cualquier problema tcnico, es que la
identificacin de una persona con riesgo debe conducir a cierta ac
cin til. En general se habla de cambios en el estilo de vida. La
teraputica farmacolgica profilctica slo se justificar si es posi
ble dirigirla a un nmero pequeo de personas con riesgo alto y
estos grupos son caractersticos de enfermedades mendelianas ms
que complejas. Pharoah y colaboradores (2002) tambin estable
cen el punto importante de que en los casos en que se identifican
personas con riesgo alto mediante genotipificacin de mltiples
locus, las intervenciones que se basan en mecanismos especficos
de predisposicin tal vez slo aborden una pequea parte especfi
ca de su riesgo adicional.
La capacidad para definir la susceptibilidad gentica contri
buir de modo considerable a identificar factores de estilo de vida
462
CAPITULO QUINCE j MAPEO EIDENTIFICACIN DE GENES
importantes. stos podran determinarse con mucho mayor facilidad

en una cohorte que se sabe que es susceptible genticamente en su
totalidad. Las opiniones respecto al impacto que ese conocimiento
podra tener difieren con amplitud. Las dos posiciones extremas po
dran caricaturizarse como las posturas con la cabeza en las nubes y
la cabeza en la arena (fig. 15-9). La postura con la cabeza en las nu
bes asume que no slo podran identificarse cambios en el estilo de
vida muy protectores sino que tambin la persona seguira el conse

jo para adoptarlos. Esto parece un poco optimista si se considera
la epidemia actual en la mayor parte de los pases desarrollados de
una enfermedad por completo prevenible causada por el tabaquis
mo, la obesidad y la falta de actividad. No obstante, no debe colapsarse hacia el pesimismo: el esfuerzo habr valido la pena si es posible
prevenir con efectividad inclusive una enfermedad frecuente.
"V
c y
WO FUNCIONAR!
E U R E K A !
LA MEDICINA PEISI GIO XXI CAMBIAR

VE "DIAGNSTICO
+ TRATAMIENTO" A
"PREDICCIN + M O P 6 U
>
PREVENTIVO"
LA MAYOR PARTE
V e LOS FACTORES
VB RIES<30 MO TIEUE
UTIUPAP PREPICTIVA...
LA PREDICCIN
^RARA VEZ COUVUCe
I A UKiA PREVEMCIW
EFECTIVA,
Fig. 15-9. Cabeza en las nubes y cabeza en ia arena: imgenes contrastantes del impacto que la Identificacin de factores de susceptibilidad para
una enfermedad compleja ejerce sobre la medicina del siglo xxi.
Cartoon by Maya Evans.
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CAPTULO
D IECISIS
Patologa m olecular
466
16.1
CAPTULO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
Introduccin
La patologa molecular trata de explicar por qu un cambio gentico

determinado debe dar por resultado un fenotipo clnico particular.
En el captulo 11 se revisaron la naturaleza y los mecanismos de las
mutaciones (que se resumen de manera breve en el recuadro 16-1);
este captulo se relaciona con los efectos en el fenotipo. La patologa
molecular debe resolver el efecto de una mutacin en la cantidad o
funcin del producto gnico y explicar por qu el cambio es pat
geno o no para cualquier clula, tejido o etapa del desarrollo en par
ticular.
Con base en la complejidad de las interacciones genticas, no
sorprende que la patologa molecular sea una ciencia muy imper
fecta. Los mayores xitos hasta la fecha se dan en el conocimiento
del cncer, en el que el fenotipo por explicar proliferacin celular
incontrolable- es hasta cierto punto simple, y en las hemoglobinopatas en las que la patologa es un resultado muy directo de una
anormalidad de la globina-. En la mayor parte de las enfermedades
genticas las caractersticas clnicas son el resultado final de una ca
dena larga de causas y el grial de la patologa molecular, y nunca se
obtendr la correlacin genotipo-fenotipo porque en realidad
aun las enfermedades mendelianas simples no son simples en lo
absoluto (Scriver y Waters, 1999; Dipple y McCabe, 2000; Weatherall, 2001). Estas revisiones, en especial la de Scriver y Waters, se
recomiendan firmemente (vanse Lecturas adicionales).
A pesar de todas las dificultades, los humanos tienen una gran
ventaja para quienes estudian la patologa molecular: se sabe mu
cho ms acerca de los fenotipos humanos que de cualquiera otro
organismo. No slo es ms probable que se note una variante sutil
en un humano que en una mosca o un gusano, sino que los siste
mas de cuidados de la salud en todo el mundo actan como una
seleccin de mutaciones gigantesca y continua. Es probable que
cualquier fenotipo humano que ocurre con una frecuencia mayor
de 1 en 109 ya est descrito en alguna parte en la bibliografa. Ms
an, se conocen muchas mutaciones distintas en casi todos los ge
nes de enfermedad identificados. No es posible realizar experimentos
en humanos o aparearlos a voluntad, pero brindan oportunidades
nicas para observar los efectos fenotpicos de muchos cambios di
ferentes en un gen determinado. Conforme el nfasis del Proyecto
del Genoma Humano progres de catalogar genes a conocer su
funcin, el estudio de la patologa molecular avanz a la etapa cen
tral. Los estudios en humanos generan hiptesis, que luego deben
probarse en animales. Por tanto, la investigacin de muchos genes
en humanos que ocurren de manera natural se complementan con
estudios de mutaciones naturales especficas o por ingeniera en
animales (vase cap. 20).
16.2
La no m enclatura conveniente de
alelos A y a oculta una inm ensa
diversidad de secuencias de DNA
Cuando se describe el genotipo de un portador de fibrosis qustica

como Ag, lo que se quiere indicar con a es cualquier secuencia gnica CFTR mutada de tal manera que no produce un canal de clo
ruro funcional. Se describieron ya ms de 750 de estos alelos
diferentes. De igual forma A indica cualquier secuencia funcional;
la secuencia real de DNA de genes A en personas no relacionadas
no siempre ser 100% idntica. Para asesora gentica y anlisis de
genealogas es el nivel ms til de descripcin, pero para patologa
molecular es necesario observarlo ms de cerca. El recuadro 16-1
contiene un breve resumen de los mltiples tipos de cambios de
secuencias de DNA que se observan en mutaciones patgenas y el
recuadro 16-2 resume las convenciones para describirlos.
Un problema en patologa molecular es que no se cuenta
con una base de datos amplia que incluya una lista de todas las
mutaciones humanas conocidas. La Human Mutation Database
(www.hgmd.org) tiene listados tiles para varios genes pero no es
amplia, en tanto que OMIM slo es un intento bastante indi
ferente e inconsistente de listar alelos mutantes. A esta informa
cin no puede accederse a travs de PubMed porque las revistas
de investigacin no suelen publicar informes de mutaciones
nuevas en genes bien estudiados. En la actualidad se realizan in
tentos para remediarlo a travs de HUGO Mutation Database
Initiative (vase www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/ para deta
lles y muchos enlaces tiles).
16.3
Una prim era clasificacin

de m utaciones con prdida
de funcin com paradas con
m utaciones con ganancia
de funcin
16.3.1 El aspecto importante para la patologa

molecular no es la secuencia de una alelo
mutante sino su efecto
En estudios genticos es importante conocer las secuencias de un ale
lo mutante (cap. 18), pero en patologa molecular es necesario cono
cer lo que sucede en consecuencia. Un gen mutado podra tener toda
clase de efectos sutiles en un organismo, pero una primera pregunta
valiosa es si produce una prdida o una ganancia de funcin.
Recuadro 16-1. P rin cip a les clases de mutacin

Deleciones, varan de un pb a megabases
Inserciones, inclusive duplicaciones
Sustituciones de base nica;
mutaciones de sentido errneo, sustituyen un aminocido con otro
en el producto gnico;
mutaciones sin sentido, reemplazan un codn aminocido con un
codn de detencin;
mutaciones de sitio de empalme, crean o destruyen seales para
empalme de exn-intrn
Cambios de marco, pueden producirse por deleciones, inserciones o

errores de empalme.
Mutaciones dinmicas, son repeticiones tndem que suelen cambiar de
tamao en la transmisin a nios
Vanse cuadro 16-1 para algunos ejemplos y captulo 11 para ms deta
lles y comentarios respecto a los mecanismos.
16.3
UNA PRIMERA CLASIFICACIN DE MUTACIONES. . . ! 467
Recuadro 16-2. Nomenclatura para describir cambios de secuencia

Vanse www.dmd.nl/mutnomen.html y Den Dunnen y Antonarakis (2001)
para detalles completos.
Sustituciones de aminocidos
Comenzar con 'p .' para Indicar la protena si es necesario. Utilizar los
cdigos de una letra: A, alanina; C, cisterna, D, cido asprtico; E, cido
glutmico; F, fenilalanina; G, glicina; H, histidina; I, isoleucina; K, lisina;
M, metionina; N, asparagina; R prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, serina; T, treonina; V, valina; W, triptfano; Y, tirosina; X significa un codn
de detencin. Tambin los cdigos de tres letras son aceptables.
No hay cero. Dar al nucletido el nmero seguido por el cambio. Para

cambios dentro de intrones, cuando slo la secuencia de cDNA se cono
ce completa, especificar el nmero de intrn mediante IVSn o el nmero
de la posicin del exn ms cercano.
g.1162GÂ: reemplaza la guanina en la posicin 1165 por adenina.
g.621+1G ->T o IVS4+1G-T: sustituye G por T en la primera base del
intrn 4; el exn 4 termina en nt 621.
Deleciones e inserciones
P.R117H o Arg117His: reemplaza arginina 117 por histidina (la metioni

na de inicio es el codn 1 ).
Utilizar del para deleciones e ins para inserciones. Como arriba, en cambios
del DNA la posicin o intervalo del nucletido va primero, para cambios de
aminocidos primero se incluye el smbolo del aminocido.
P.G542X o Gli542Stop: glicina 542 sustituida por un codn de detencin.
p.F508del: delecin de la fenilalanina 508.
Sustitucin de nucletido
c.6232_6236del o c.6232_6236delATAAG: delecin de cinco nucletidos (que pueden especificarse) a partir de nt 6232 del cDNA.
Comenzar con 'g .' (genmico) o 'c .' (cDNA) si es necesario. La A del
codn de inicio ATG es + 1 ; la base precedente es - 1 .
En las mutaciones con prdida de funcin el producto no

tiene funcin o sta es reducida.
En las mutaciones con ganancia de funcin el producto ha
ce algo positivamente anormal.
El recuadro 16-3 muestra una forma de describir estos efectos.
Las mutaciones con prdida de funcin suelen producir fenoti
pos recesivos. En casi todos los productos gnicos la cantidad pre
cisa no es crucial y puede obtenerse alrededor de la mitad de la
normal. Por consiguiente la mayor parte de los errores innatos del
metabolismo es recesiva. Sin embargo, en algunos productos gni
cos 50% del valor normal no es suficiente para una funcin nor
mal y la haploinsuficiencia produce un fenotipo anormal, que en
consecuencia se hereda en una forma dominante (vase seccin
16.4.2). Asimismo en ocasiones un polipptido mutante no fun
cional interfiere con la funcin del alelo normal en una persona heterocigota y da un efecto dominante negativo (un antimorfo en la
terminologa del recuadro 16-3; vase seccin 16.4.3).
Las mutaciones con ganancia de funcin suelen causar fenoti
pos dominantes porque la presencia de un alelo normal no impide
que el alelo mutante se comporte de manera anormal. Con fre
cuencia esto incluye un sistema de control o sealamiento que se
comporta de modo inapropiado -seala cuando no debe o no su
prime un proceso cuando debera hacerlo-. A veces la ganancia de
funcin consiste en que el producto realiza algo nuevo p. ej., una
protena que contiene una repeticin poliglutamina extendida que
forma agregados anormales-.
Algunas mutaciones no pueden clasificarse con facilidad como
prdida o ganancia de funcin. Un canal de iones abierto en for-
g.409_41 OinsC: insert C entre nt 409 y 410 del DNA genmico.
ma permanente perdi la funcin de cerrar o gan la funcin de

abertura inapropiada? Un alelo mutante negativo dominante per
di su funcin pero tambin efecta algo positivamente anormal.
Una mutacin puede cambiar el balance entre varias funciones de
un producto gnico. No obstante, la distincin entre prdida y ga
nancia de funcin es el primer elemento esencial para pensar res
pecto a patologa molecular.
16.3.2 Una prdida de funcin es probable cuando las

mutaciones de punto en un gen producen el
mismo cambio patolgico que las deleciones
Las pruebas puramente genticas, sin estudios bioqumicos, a me
nudo sugieren si un fenotipo se debe a prdida o ganancia de fun
cin. Cuando un fenotipo clnico es resultado de prdida de funcin
de un gen cabra esperar cualquier cambio que inactive el producto
gnico para producir el mismo resultado clnico. Es necesario en
contrar mutaciones de punto que tienen el mismo efecto que las
mutaciones que eliminan o alteran el gen. El sndrome de Waardenburg tipo 1 (MIM 193500: prdida de la audicin y anormali
dades pigmentarias) constituye un ejemplo. Como se muestra en la
figura 16-1, las mutaciones causales en el gen PAX3 incluyen susti
tuciones de aminocidos, cambios de marco, mutaciones de empal
me y en algunos pacientes delecin completa del gen. Como todos
estos acontecimientos producen el mismo resultado clnico, su cau
sa debe ser una prdida de funcin de PAX3. De igual forma las en
fermedades originadas por repeticiones de trinucletidos inestables
(seccin 16.6.4), X frgil y ataxia de Friedreich en ocasiones son
causadas por otros tipos de mutacin en sus genes respectivos, lo
Recuadro 16-3. Nomenclatura para describir el efecto de un alelo

Alelo nulo o amorfo: alelo que no produce un producto
Neomorfo: alelo con actividad o producto nuevo
Hipomorfo: alelo que produce una cantidad o actividad reducida de pro

ducto
Antimorfo: alelo cuya actividad o producto antagoniza la actividad del

producto normal
Hipermorlo: alelo que produce una cantidad o actividad mayor de pro

ducto
468
CAPTULO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
que seala una prdida de funcin, en tanto que la enfermedad de

Huntington nunca se observa con ningn otro tipo de mutacin,
lo que sugiere una ganancia de funcin.
las enfermedades en las que se observa una relacin muy direc

ta con el producto gnico en s mismo, en lugar de una conse
cuencia ms remota del cambio gentico, pueden definirse en
trminos de un producto variante particular, como la enferme
dad de clulas falciformes (vase recuadro 16-4);
16.3.3 Una ganancia de funcin es probable cuando

slo una mutacin especfica en un gen produce
una patologa determinada
algn mecanismo molecular especfico puede ha cer un cambio

en cierta secuencia en un gen con mucho mayor probabilidad
que cualquiera otro cambio; por ejemplo, la expansin CGG
en el sndrome de X frgil (seccin 16.6.4);
puede haber un efecto fundador; p. ej-, ciertas mutaciones de
enfermedad son frecuentes entre judos ashkenazis y tal vez re
flejen mutaciones presentes en un nmero bastante pequeo de
fundadores de la poblacin ashkenazi actual (Motulsky, 1995);
Es probable que la ganancia de funcin requiera un cambio

mucho ms especfico que la prdida de funcin. La gama mutacional en padecimientos con ganancia de funcin debe ser co
rrespondientemente ms restrictiva y el mismo padecimiento no
ha de producirse por delecin o alteracin del gen. Los ejemplos
usuales incluyen la enfermedad de Huntington (seccin 16.6.4)
y la acondroplasia (MIM 100 800: enanismo por miembros
cortos). Casi todos los acondroplsicos tienen el mismo cambio
de aminocido, G380R, en el receptor del factor de crecimiento de
fibroblastos FGFR3. Otras sustituciones en la misma protena
producen otros sndromes (seccin 16.7.3). Por razones que se
desconocen, la tasa de mutaciones de G380R es en extremo alta, de
manera que la acondroplasia es una de las anormalidades genti
cas ms frecuentes a pesar de que requiere un cambio de secuen
cias de DNA muy especfico.
Aunque la homogeneidad mutacional es un indicador de ganan
cia de funcin, hay otras razones por las que una mutacin aislada
puede constituir la mayor parte de todos los casos de una enfermedad:
la seleccin que favorece heterocigotos (seccin 4.5.3) incremen

ta los efectos fundadores y a menudo ocasiona que una o unas
cuantas mutaciones especficas sean frecuentes en una poblacin.
16.3.4 Puede ser difcil decidir si el cambio en una

secuencia de DNA es patgeno
No todas las variantes de secuencia que se observan en una perso
na afectada son patgenas Cmo es posible decidir si un cambio
de secuencia descubierto es la mutacin patgena que se busca o
una variante innocua? Los criterios, en orden descendente de confiabilidad, son:
Q 254X
451 + 1 G > T
4 5 2 -2 A > G
M u ta c io n e s tru n c a n te s
8 7 4 -8 7 5 in s G
Sin s e n tid o
E m p a lm e
+ In s /d e ln
^ + ++
+
+ +
+
3
10
H h
u
A 1 9 6 T -1
M u ta c io n e s no tru n c a n te s
R 271C
__
I
S e n tid o err n e o
+ D e le c i n en m a rc o
___
I Dominio pareado I
I H o m e o d o m in io
Fig. 16-1. Mutaciones con prdida de la funcin del gen PAX3.

Se muestran los 10 exones del gen como cuadros, con los intrones de conexin; no estn en escala. Las reas sombreadas indican la secuencia que
codifica los dos dominios de enlace de DNA de la protena PAX3. Obsrvese que las mutaciones que destruyen por completo la estructura de la protena
PAX3 (se dibujan arriba del diagrama gnico) estn dispersas cuando menos sobre los seis primeros exones del gen, pero las mutaciones de sentido
errneo (se muestran abajo del diagrama del gen) estn concentradas en dos regiones, la parte 5 ' del dominio pareado y la tercera hlice del
homeodominio. Se piensa que A196T afecta el empalme. Las otras mutaciones mencionadas se comentan en el cuadro 16-1. La mutacin 874-875insG
introduce un sptimo G en un grupo de seis G; puede surgir de manera Independiente varias veces e ilustra la frecuencia hasta cierto punto alta del
pareamiento errneo de cadena deslizada (seccin 11.3.1).
16.4
1) estudios funcionales que muestran que el cambio es patgeno;

2) precedente: ese cambio se observ antes en pacientes con esta
enfermedad (y no en testigos tnicamente comparables);
3) una mutacin nueva, que no est presente en los padres, en una
persona con una enfermedad nueva-,
4) un cambio de secuencia nuevo que no se encuentra en un gru
po de, por ejemplo, 100 testigos normales;
5) la naturaleza del cambio de secuencia (vase recuadro 16-5).
Los estudios funcionales son el estndar ideal; ninguno de los otros
criterios es por completo seguro. Como se explic, para fenotipos con
ganancia de funcin es probable que la causa sea muy especfica.
Cualquier cambio de secuencia diferente de la mutacin estndar
tal vez no sea patgeno, cuando menos para la enfermedad en cues
tin. Los padecimientos con prdida de funcin originan mucho
ms preguntas de interpretacin.
16.4
M utaciones con prdida de

funcin
16.4.1 Muchos cambios distintos en un gen pueden

causar prdida de funcin
No sorprende que las formas de reducir o abolir la funcin de un
producto gnico sean muchas (cuadro 16-1). Algunas de ellas se co
mentan en la seccin 11.4. Las hemoglobinopatas (recuadro 16-4)
ejemplifican especialmente bien muchos de estos mecanismos. De
hecho las globinas podran utilizarse para ilustrar casi todos los pro
cesos que se describen en este libro. Se recomienda a los lectores
consultar una revisin como la de Weatherall y colaboradores
(2001; vase Lecturas adicionales) para obtener una descripcin pa
ralela de patologa molecular.
El recuadro 16-5 presenta ciertos lineamientos para considerar
el resultado probable de una mutacin en el producto gnico.
MUTACIONES CON PRDIDA DE FUNCIN [ 469
Las deleciones e inserciones pequeas tienen un efecto mucho ms

drstico en el producto gnico si introducen un cambio de marco
(es decir, si aaden o eliminan varios nucletidos que no son un ml
tiplo exacto de tres). Las deleciones en el gen de distrofina consti
tuyen ejemplos notables (fig. 16-2). En general las deleciones con
cambio de marco producen la distrofia muscular de Duchenne gra
ve, en la que no se produce distrofina, en tanto que las mutaciones
sin cambio de marco causan la forma ms leve de Becker, en la que
existe distrofina pero es anormal.
Por lo general las mutaciones sin sentido (las que generan codones de terminacin prematura) funcionan como alelos nulos por
que desencadenan una declinacin de mRNA mediada sin
sentido (Hentze y Kulozik, 1999). Es raro que el mRNA se traduz
ca para producir una protena truncada. La declinacin mediada
sin sentido es usual siempre que un codn de terminacin prema
tura se encuentra cuando menos 50 nucletidos corriente arriba de
la ltima unin de empalme. Vase Likke-Andersen y colaborado
res (2001) para detalles del mecanismo.
A menudo las mutaciones d e em palme (splicing) se consideran s
lo como mutaciones que alteran las secuencias GT...AG conserva
das en los extremos de intrones. De hecho una variedad mucho
ms alta de cambios de secuencia puede afectar el empalme, pero es
difcil predecir estos efectos. Por tanto muchas mutaciones que afec
tan el empalme no se reconocen a menos que se realicen estudios
de PCR-RT y esta clase de mutacin se diagnostica mucho menos.
Es posible observar varios ejemplos entre las mutaciones de globina (3 que se incluyen en el cuadro 18-5. Tres tipos de cambio de se
cuencia causan empalme aberrante:
alteraciones de los sitios de empalme normales: el empal
me (splice, corte y unin) (seccin 11.4.3) no slo requiere la
secuencia cannica GT...AG, sino tambin un contexto de se
cuencia definida de manera menos rgida que rodea el sitio. Los
cambios aqu pueden alterar la relacin de diferentes isoformas
de empalme en lugar de abolir el empalme por completo; p.
ej., el polimorfismo 5T/7T/9T en el intrn 8 del gen CFTR
(vase MIM 602 421) altera la proporcin de transcritos que
Recuadro 16-4. Hemoglobinopatas

Las hemoglobinopatas ocupan un sitio especial en la gentica clnica por
muchas razones. Son con mucho las enfermedades mendelianas impor
tantes ms frecuentes en el mundo. Las globinas ilustran aspectos esen
ciales de la evolucin del genoma (figs. 12-4 a 12-6) y de enfermedades
en poblaciones. Es probable que los controles del desarrollo en las globi
nas se comprendan mejor que los de cualquier otro gen humano (figs. 1022, 10-23). Se describen ms mutaciones y enfermedades para las
hemoglobinas que para cualquier otra familia gnca. Los sntomas clni
cos son consecuencia muy directa del mal funcionamiento de la prote
na, que es fcil estudiar con 15 g por 100 mi de sangre, de modo que la
relacin entre los acontecimientos moleculares y clnicos es ms clara en
las hemoglobinopatas que en la mayor parte de las otras enfermedades.
Las hemoglobinopatas se clasifican en tres grupos principales:
Talasemias, que son causadas por cantidades inadecuadas de las
cadenas a o (3. Los alelos se dividen en los que no producen pro
ducto (a, (3o) y en los que elaboran cantidades reducidas del m is
mo ( a + , |3+ ). Los defectos subyacentes incluyen los de todos los
tipos que se detallan aqu y en la seccin 16.4 (vase tambin cua
dro 18-5).
Hemoglobinas anormales con cambios de aminocidos, que ocasio

nan una diversidad de problemas, de los que la enfermedad de clulas
falciformes es la que mejor se conoce. La mutacin E6V reemplaza un
aminocido polar por uno neutral en la superficie externa de la molcu
la de globina (3. Esto origina un incremento en la adherencia intermole
cular, que conduce a la agregacin de desoxihemoglobina y la
deformacin de los glbulos rojos. Las clulas falciformes tienen un
tiempo de supervivencia menor (que da lugar a anemia) y tienden a
ocluir capilares, lo que origina isquemia e infarto de rganos corriente
abajo del bloqueo. Otros cambios de aminocidos pueden causar ane
mia, cianosis, policitemia (nmero excesivo de glbulos rojos), metahemoglobinemia (conversin del hierro del estado ferroso al frrico), etc.
Persistencia hereditaria de hemoglobina fetal, causada por un de
fecto en el cambio normal de hemoglobina fetal a la del adulto, pue
de ser un modificador importante de los efectos clnicos de las otras
dos clases de mutantes.
Vase Weatherall y colaboradores (2001; Lecturas adicionales) para una
revisin amplia.
470 i CAPTULO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
Cuadro 16-1. Once formas de reducir o suprimir la produccin de un producto gnico funcional.
C a m b io
E je m p lo
Delecin:
a) todo el gen
Casi todas las mutaciones de talasemia a (fig. 16-3)
b) parte del gen
60% de la distrofia muscular de Duchenne (fig. 16-2)
Insercin de una secuencia en el gen
Insercin de secuencias repetidas LINE-1 (vase seccin 11.5.6) dentro del gen
F8 en la hemofilia A
Alterar la estructura gnica:

a) mediante una translocacin
b) por una inversin
Translocaciones del autosoma X en mujeres con distrofia muscular de Duchenne

(fig. 14-10)
Inversin en el gen F8 (fig. 11-20)
Prevenir la actividad del promotor:

a) mediante mutacin
Mutacin de globlna (3 g.-29A-*G (cuadro 18-5)
b) por metilacin
Gen CDKN2A en muchos tumores (seccin 17.6.1)
Desestabilizacin del mRNA:

a) mutacin del sitio de poliadenilacln
Mutacin de globina a g.AATAAA->AATAGA
b ) por declinacin del RNA mediada sin sentido
Globina |3 p.Q39X
Prevencin del empalme correcto (seccin 11.4.3)

a) inactivacin del sitio de empalme donador
Mutacin P/IX3g.451 + 1G -*T (fig. 16-1)
b) inactivacin del sitio de empalme aceptor
Mutacin PAX3g.452-2A-*G (fig. 16-1)
c) alteracin de un intensificador de empalme exnico
Exn SMN2 7 g.C6T (Cartegni y Krainer, 2002)
d) activacin de un sitio de empalme crtico (puede ser profundo

dentro de un intrn)
LGMD2A G624G (fig. 11-12)

Mutacin de globina p IVS1-110G*A (cuadro 18-5)
C /7 fl3 8 4 9 + 1 0 k b C - T (cuadro 18-6)
Introduccin de un cambio de marco en la traduccin
Mutacin PAX3g.874_875nsG (fig. 16-1)
Conversin de un codn en un codn de detencin
Mutacin PAX3p.Q254X (fig. 16-1)
Sustitucin de un aminocido esencial
Mutacin PAX3p.R271C (fig. 16-1)
Prevencin del procesamiento postranscripcional
Propptido terminal N de colgena resistente a corte en el sndrome de Ehlers

Danlos VII (seccin 16.6.1)
Prevencin de la localizacin celular correcta del producto
Mutacin p.F508del en fibrosis qustica
Recuadro 16-5. Lineamientos para estimar la significancia de un cambio de secuencia de DNA

Las deleciones de todo el gen, las mutaciones sin sentido y los cam
bios de marco destruyen casi con certeza la funcin.
puede ayudar a sugerir los residuos que son crticos. Por ejemplo, las
mutaciones de sentido errneo de la figura 16-1, que causan prdida
de la funcin, se concentran en los dominios de enlace de DNA fun
damentales de la protena PAX3.
Las mutaciones que cambian los nucletidos GT...AG conservados

que flanquean la mayor parte de los intrones afectan el empalme y
por lo general suprimirn la funcin gnica. Muchos otros cambios de
secuencia pueden afectar el empalme pero en formas mucho ms di
fciles de predecir (vase ms adelante).
Es ms factible que el cambio de un aminocido afecte la funcin si

ese aminocido se conserva en genes relacionados (ortlogos o pa
tlogos).
Es ms probable que una mutacin de sentido errneo sea patgena

si afecta una parte de la protena que se sabe que es funcionalmente
importante. El modelo de computadora de la estructura protenica
Es ms probable que las sustituciones de aminocidos afecten la fun

cin si no son conservadoras (sustitucin de un aminocido polar por
otro no polar o de uno cido por otro bsico; vase recuadro 11-3).
16.4
MUTACIONES CON PRDIDA DE FUNCIN | 471
N --H
h-------------- H
Fig. 16-2. Oeleciones en la parte central del gen de distrofna en pacientes con distrofia muscular de Duchenne o de Becker.
Los cuadros numerados representan los exones 45 a 55. Los nmeros arriba de cada cuadro muestran el efecto que tiene la delecin del exn en el
marco de lectura (0 sin efecto, -1 cambio de 1 nucletido retrgrado, + 1 cambio de 1 nucletido antergrado). Las barras rojas muestran deleciones
en pacientes con DMD letal, las barras en azul indican deleciones en pacientes con DMB ms leve. En general las deleciones de cambio de marco
causan DMD y las neutrales de marco producen DMB. Las excepciones se indican mediante lneas de guiones. Las posibles razones de las excepciones
incluyen deleciones que terminan dentro de un exn, acciones de genes modificadores o efectos ambientales, o tal vez errores clnicos o de laboratorio.
Datos del sitio de red (website) Leiden Muscular Dystrophy w w w.dm d.nl, que deben consultarse para obtener informacin ms completa de los datos
bsicos. La figura 18-6 muestra cmo se caracterizan estas deleciones en el laboratorio.
brincan el exn 9. Es probable que estos efectos contribuyan

con frecuencia a una enfermedad gentica, en especial quiz
susceptibilidad a enfermedades frecuentes (Nissim-Rafinia y
Kerem, 2002);
alteraciones de intensificadores o silenciadores de empalme:
estas secuencias importantes pero mal definidas pueden locali
zarse en exones o intrones (Nissim-Rafinia y Kerem, 2002). Cartegni y Krainer (2002) proporcionan un ejemplo en particular
claro de una mutacin que altera un intensificador de empalme
snico;
activacin de sitios de empalme crptico: las sustituciones
de bases al parecer innocuas pueden dar lugar a que una se
cuencia antes inactiva se utilice como sitio de empalme. El si
tio crptico puede encontrarse en un exn o un intrn. La
figura 11-12 muestra un ejemplo. Si el sitio est situado a
profundidad en un intrn, la mutacin podra pasarse por al
to sin estudios de PCR-RT; p. ej., la mutacin CFTR 3849 +
lOkbC -* T activa un sitio de empalme crptico situado 10 kb
dentro del intrn 19.
16.4.2 En la haploinsuficiencia una reduccin de 50%

del nivel de la funcin gnica causa un fenotipo
anormal
Las mutaciones con prdida de funcin tienden a ser recesivas porque
a menudo los heterocigotos funcionan en forma perfectamente nor
mal. Esto a veces se debe a que asas de retroalimentacin en la trans
cripcin o el nivel de actividad de la protena compensan la dosis
reducida, pero en muchos casos la clula y el organismo son capaces
de funcionar de modo normal con apenas 50% del nivel de la accin
gnica. Hasta cierto punto pocos genes muestran haploinsuficiencia;
el cuadro 16-2 presenta algunos ejemplos. Otros cuantos genes mues
tran otras formas de sensibilidad de dosis (vase fig. 16-3 y 16-8).
Sera razonable preguntarse por qu debe haber sensibilidad de
dosis para cualquier producto gnico Por qu la seleccin natural
no manej mejor las cosas? Si un gen se expresa de modo que dos
copias produzcan una cantidad apenas suficiente del producto, la
seleccin de variantes con valores ms altos de expresin debe con
ducir a la evolucin de un organismo ms robusto, sin un precio
472
CAPTULO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
\ |/ a
\|/a
a l ex I
a | a
alai
a l
N o rm a l
a|
C a r c te r d e
ta la s e m ia -a +
A n e m ia leve
(ta l-a +)
R e p e tic i n X
R e p e tic i n Z
; ; C ruzam iento
\i entre repeticio' nes alineadas
errneam ente
E n fe rm e d a d
HbH
H id ro p e s a
feta l
Fig. 16-3. Deleciones de genes de globina a en la talasemla a

Las copias normales del cromosoma 16 llevan dos genes de globina a activos y un seudogn inactivo dispuesto en tndem. Los bloques repetidos
(marcados X y Z) pueden alinearse de modo errneo y permitir un cruzamiento desigual. El diagrama muestra cruzamiento desigual entre las
repeticiones Z mal alineadas que produce un cromosoma que slo lleva un gen a activo. Los cruzamientos desiguales entre repeticiones X tienen un
efecto similar. Los cruzamientos desiguales entre otras repeticiones (no se muestran) suelen producir cromosomas que llevan un gen a no funcional.
Por consiguiente los individuos pueden tener cualquier nmero de 0 a 4 o ms genes de globina a. Las consecuencias se tornan ms graves conforme
el nmero de genes a disminuye. Vase Weatherall y colaboradores (Lecturas adicionales) para detalles.
obvio que pagar. La respuesta es que en la mayor parte de los casos

esto en realidad sucedi -sta es la razn por la que relativamente
pocos genes son sensibles a dosis-. Sin embargo, ciertas funciones
gnicas son sensibles a dosis de manera inherente. Incluyen:
productos gnicos que son parte de un sistema de sealamien
to cuantitativo cuya funcin depende de la ocupacin parcial o
variable de un receptor, sitio de unin de DNA, etctera;
productos gnicos que compiten entre s para determinar un
cambio de desarrollo o metablico;
productos gnicos que cooperan en interacciones con estoiquiometra fija (como las globinas a y p, y muchas protenas
estructurales).
En cada caso el producto gnico se ajusta contra algo ms en las c
lulas. Lo que interesa no es el valor absoluto correcto del producto,
sino los valores relativos correctos de productos que interactan. Los

efectos son sensibles a cambios en todos los compaeros que inte
ractan y en consecuencia estos padecimientos dominantes suelen
mostrar una expresin muy variable (vase seccin 16.6.3). Los ge
nes cuyos productos actan en esencia solos, como muchas enzimas
del metabolismo solubles, rara vez muestran efectos de dosis.
Adems en algunos casos en que una clula slo con una copia
funcional de un gen apenas puede satisfacer la demanda de un pro
ducto gnico que se requiere en grandes cantidades. Un ejemplo pue
de ser la elastina. En personas heterocigotas para una delecin o una
mutacin con prdida de la funcin del gen de elastina no se afectan
los tejidos que slo requieren cantidades moderadas de elastina (piel,
pulmn), pero la aorta, que demanda mucha ms elastina, a menu
do muestra una anormalidad (estenosis artica supravalvular) que tal
vez requiera una intervencin quirrgica (vase seccin 16.8.1).
Cuadro 16-2. Fenotipos probablemente causados por haploinsuficiencia.

Vase texto para detalles
P a d e c im ie n to
M IM #
Gen
N ota s
Sndrome de Alagille
118450
JAG1
Vase seccin
Exostosis mltiple
133700
EXT1
Vase cuadro
Neuropata tomaculosa
162500
PMP22
Vase seccin
Estenosis artica supravalvular
185500
ELN
Vase esta seccin
Sndrome trico-rino-farngeo
190350
TRPS1
Vase cuadro
193500
PAX3
Vase seccin
Sndrome de Waardenburg tipo
16.8.1
16-8
16.6.2
16-8
16.3.2
16.5 ! MUTACIONES CON GANANCIA DE FUNCIN
16.4.3 Las mutaciones en protenas que actan como

dmeros y multmeros a veces producen efectos
dominantes negativos
Un efecto dominante negativo ocurre cuando un polipptido mu
ante no slo pierde su funcin, sino tambin interfiere con el
producto del alelo normal en un heterocigoto. Algunas personas
argumentaran que estas son mutaciones con ganancia de funcin,
no prdida de funcin, pero ste es slo un argumento sobre pala
bras. Las mutaciones dominantes negativas producen efectos ms
graves que los alelos nulos simples del mismo gen. Las protenas es
tructurales que forman estructuras multimricas son en particular
vulnerables a efectos dominantes negativos. Las colgenas represen
tan un ejemplo clsico.
Las colgenas fibrilares, las principales protenas estructurales
del tejido conjuntivo, estn constituidos por hlices triples de cade
nas polipptidas, en ocasiones homotrmeros, a veces heterotrmeros,
que se ensamblan en una disposicin de enlace cruzado empacada
de modo estrecho para formar fibrillas rgidas. En cadenas polipp
tidas recin sintetizadas (preprocolgena), los polipptidos en la
terminal N y la terminal C flanquean una secuencia de repeticin
regular (Gli-X-Y)n, en la que X o Y suelen ser prolina y la otra es
cualquier aminocido. Tres cadenas de preprocolgena se vinculan
y se tuercen en una triple hlice bajo el control del propptido de
la terminal C. Tras la formacin de la triple hlice, los propptidos
de la terminal N y la terminal C se cortan y eliminan. Un polipp
tido que forma complejos con cadenas normales pero despus des
troza la triple hlice puede reducir el rendimiento de la colgena
funcional a bastante menos de 50% (fig. 16-4). La patologa mo
lecular de mutaciones de la colgena es muy abundante y se estu
dia ms adelante (vanse seccin 16.6.1 y cuadro 16-7).
Las protenas no estructurales que se dimerizan u oligomerizan
tambin muestran efectos dominantes negativos. Por ejemplo, los
factores de transcripcin de la familia b-HLH-Zip (fig. 10-9) unen
DNA como dmeros. Las mutantes que no se dimerizan suelen cau
sar fenotipos recesivos, pero las mutantes que son capaces de se
cuestrar molculas funcionales al interior de dmeros inactivos dan
fenotipos dominantes (Hemesath y cois., 1994). Los canales inicos
en membranas celulares proveen otro ejemplo de estructuras mul
timricas sensibles a efectos dominantes negativos (seccin 16.6.1).
16.4.4 La modificacin epigentica puede abolir la

funcin gnica aun sin un cambio
de secuencia de DNA
Los cambios que son hereditarios (de la clula a la clula hija o del pa
dre al nio) pero que no dependen de cambios en las secuencias del
DNA se denominan epigenticos (seccin 10.1). Un grupo de minirrevisiones en el nmero del 1 de mayo de 1998 de Cell (Vol. 93, pp.
301 a 337) analiza muchas de las diversas facetas de la epigentica. Los
efectos epigenticos son en particular claros en el cncer (Jones y Baylin, 2002). Para los propsitos de este captulo el principal mecanis
mo epigendco de inters es la mediacin del DNA. Para detalles
ms amplios respecto a este tema, vase la revisin de Bird (2002).
Como se mencion (seccin 10.4.2), las bases de citosina en el
DNA humano que se encuentran cerca de la guanina (un dinucletido CpG) a menudo estn metiladas en el carbono 5 y la
metilacin original de CpG puede transmitirse en forma estable
cuando el DNA se replica (fig. 16-5). Estos patrones de metilacin
son seales importantes para controlar la transcripcin de genes
473
(seccin 10.4.3). La inactivacin de X depende cuando menos en

parte de la metilacin del DNA y la transmisin epigentica del pa
trn de metilacin asegura que se inactive la misma X en las clu
las madre y las hijas. La metilacin inapropiada puede causar una
prdida de funcin patgena heredable. Por ejemplo, en muchos
tumores la funcin del gen supresor de tumor p l6 (CDKN2A) se
suprime por metilacin del promotor en lugar de mutacin de su
secuencia de DNA (seccin 17.4.3). Por el contrario, se piensa que
la desmetilacin inapropiada inicia la expresin de oncogenes en
tumores.
Los genes con improntas (secciones 4.3.4, 10.5.4) son un ejem
plo en especial intrigante de modificacin epigentica. Su expresin
est controlada por patrones de metilacin que difieren segn el ori
gen parental del gen. Cuando el funcionamiento inadecuado del
mecanismo de improntacin o el origen parental no es el esperado,
puede ocurrir una prdida de funcin o una expresin inapropiada
en genes intactos. Los genes con improntas ocurren en el grupo que
contiene genes improntos tanto maternos como paternos, algunos
de los cuales slo estn improntos en ciertos tejidos. Con frecuencia
ambas cadenas de DNA poseen el potencial de transcribirse -uno de
los transcritos es un mRNA y el otro un RNA antisentido no tra
ducible grande (> 100 kb),pero la transcripcin de una cadena im
pide la de la otra. Por tanto la patologa molecular de enfermedades
humanas por improntacin es fascinante pero muy complicada. El
recuadro 16-6 describe las enfermedades humanas por improntacin
que mejor se conocen, los sndromes de lrader-Willi y de Angelman; para mayor informacin de otras enfermedades vanse OMIM
130650 (sndrome de Beckwith-Wiedemann), OMIM 139320
(GNAS) y las revisiones de Reik y Walter (2001) y Rougeulle y
Heard (2002).
16.5
M utaciones con g anancia de

funcin
El cuadro 16-3 contiene una lista de varios mecanismos que pueden

producir un fenotipo con ganancia de funcin.
16.5.1 La adquisicin de una funcin nueva es rara en

enfermedades hereditarias pero frecuente en el
cncer
Realizar cambios aleatorios en un gen es muy similar a detener su
trabajo, pero es muy improbable que proporcionen una funcin
novedosa. El nico mecanismo que suele generar genes funcionales
nuevos es cuando un reordenamiento cromosmico une exones
funcionales de dos genes distintos (fig. 17-4A). Sin duda esta mez
cla de exones fue importante en la evolucin; en patologa molecu
lar se observa ms a menudo cuando conduce a cncer. Muchos
reordenamientos cromosmicos especficos de tumor adquiridos
producen genes quimricos con actividades nuevas que llevan a la
proliferacin celular incontrolada (vase cuadro 17-3). Un caso ra
ro de una mutacin de punto hereditaria que confiere una funcin
nueva en una protena es el alelo Pittsburgh en el locus P I (MIM
107 400; fig. 16-6).
16.5.2 La expresin excesiva puede ser patgena

La expresin excesiva gruesa de ciertos genes es frecuente en clulas
cancerosas. Los mecanismos por los que los cambios genticos so-
474 | CAPTULO DIECISIS I PATOLOGA MOLECULAR
COL1A2
COL1A1
locus
17q
OI leve
OI grave
Normal
iti H
locus
M utacin
m ayor
M utacin en
sen tid o errneo
7q
Y Y
H cH
'O
'</> E
i I
o . C
X
LU
n m olculas
de
p ro co lg en a
(tres c ad en as)
Y Y
Y Y
,
y
n cadenas
n cadenas
n cadenas
2n c a d e n a s
n cadenas
n cadenas
+ n cadenas
no rm ales
m u tan te s
S S W
^ m olculas
d e pro co lg en a
norm al
I m olculas d e
pro co lg en a
+
v/\/\/\
\S \/\/\
^ c a d e n a s a2 (d eg rad ad as
2?4 m olculas d e
pro co lg en a anorm ales
S ustitucin en la parte
term inal N d e la triple
hlice: alteracin m enor
del em p aq u e
S ustituci n en la p a rte
term inal C d e la triple
hlice: alteracin m ayor
del em p aq u e
Fig. 16-4. Efectos dominantes negativos de mutaciones del gen de colgena

Las fibrillas de colgena estn constituidas por arreglos de unidades de procolgena de triple hlice. La procolgena tipo I comprende dos cadenas
codificadas por el gen C0L1A1 y una codificada por C0L1A2. Las mutaciones nulas en cualquier gen tienen un efecto menos grave que las mutaciones
que codifican polipptidos que estn incorporados en la triple hlice y destruyen su funcin.
mticos producen expresin excesiva incluyen reduplicacin gnica

masiva o transposicin de un gen que suele expresarse a un nivel ba
jo en un ambiente cromatnico muy activo. Este hecho se comenta
con mayor amplitud en la seccin 17.3.3.
Con frecuencia las enfermedades hereditarias no se deben a ex
presin excesiva constitucional de un gen aislado. La duplicacin
del gen DSS en Xp21.3 causa reversin del sexo masculino a feme
nino, tal vez como resultado directo de duplicacin de la dosis
(Bardoni y col., 1994). En el gen de protena de mielina perifrica
PMP22, un incremento en la dosis gnica de dos a tres copias es su
ficiente para producir la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
(vase ms adelante y fig. 16-8). Es probable que estos incremen
tos moderados en la expresin gnica rara vez sean patgenos, aunque

un grado similar de sensibilidad a la dosis de genes no identificados
debe explicar muchas caractersticas de las trisomas cromosmicas
(seccin 16.8.2). La actividad excesiva de un producto gnico anor
mal, con transcripcin y traduccin normal del gen, puede produ
cir efectos similares.
16.5.3 Los cambios cualitativos en el producto de un

gen pueden causar ganancia de funcin
Aunque las ganancias de funcin de verdad nuevas son muy ra
ras en enfermedades hereditarias, las mutaciones activadoras que
16.6
PATOLOGA MOLECULAR: DEL GEN A LA ENFERMEDAD
modifican las respuestas de sealamiento celular muy a menudo

producen fenotipos dominantes. Los receptores hormonales aco
plados a la protena G proveen buenos ejemplos. Muchas hor
monas ejercen sus efectos en clulas blanco por enlace a los
dominios extracelulares de receptores transmembrana. El enlace
del ligando da lugar a que la cola citoplsmica del receptor cata
lice la conversin de una protena G inactiva (enlace GDP) en
una forma activa (enlace GTP) y ello releva la seal adicional
mente al estimular la ciclasa de adenilato. Algunas mutaciones
ocasionan que los receptores activen la ciclasa de adenilato inclu
sive en ausencia de ligando.
En la pubertad precoz masculina familiar (MIM 176 410: ini
cio de la pubertad cerca de los cuatro aos de edad en los nios
afectados) se encuentra un receptor de hormona luteinizante
con actividad constitucional.
La hiperplasia tiroidea autosmica dominante puede deberse a
una mutacin activadora en el receptor de hormona estimulan
te de la tiroides (vase MIM 275 200).
La condrodistrofia metafisaria de Jansen (MIM 156 400: un
trastorno del crecimiento) puede ocasionarla un receptor de
hormona paratiroidea con actividad constitucional.
Una protena Gsa constitucionalmente activa (parte del recep
tor que acopla protena G) causa el sndrome de McCune-Albright o displasia fibrosa poliostsica (DFP) (PFD, MIM 174
800). La DFP se conoce como un padecimiento somtico s
lo en mosaicos -las mutaciones constitucionales podran ser le
tales-. Segn los tejidos que portan la lnea celular mutante, el
resultado es displasia fibrosa poliostsica, manchas de caf con
leche, precocidad sexual y otras endocrinopatas hiperfncionales. Las mutaciones con prdida de funcin del mismo gen
suelen causar una enfermedad distinta, la osteodistrofia here
ditaria de Albright (vase cuadro 16-5).
16.6
Patologa m olecular: del gen a la

enferm edad
El punto inicial del pensamiento acerca de la patologa molecular

puede ser un gen o una enfermedad. Estas dos conductas se consi
deran por separado en esta seccin y la siguiente, aunque, por su
puesto, el conocimiento total de la patologa molecular rene
ambas.
16.6.1 En mutaciones con prdida de funcin el efecto

fenotpico depende del nivel residual de funcin
gnica
Los cambios de secuencias del DNA que se describen en el cuadro
16-1 pueden ocasionar grados variables de prdida de funcin. Mu
chas sustituciones de aminocidos no tienen efecto, o muy poco, en
tanto que algunas mutaciones suprime por completo la funcin.
Una mutacin puede presentarse en una o ambas copias de un gen.
A menudo las personas con padecimientos autosmicos recesivos
son heterocigotas compuestas, con dos mutaciones diferentes. Si
las dos mutaciones causan prdida de funcin, pero en grados dife
rentes, el alelo menos grave regir el grado de funcin residual.
La figura 16-7 representa cuatro posibles relaciones entre el ni
vel de funcin gnica residual y el fenotipo clnico.
475
5' >
3' <
CpG
GpC
: : CpG :r"
GpC
~> 3'
? 5'
Duplicacin de DNA
M
5'
3'
CpG
___
GpC~
C p G ~ . ...... ....... 3'
GpC~
+
5' m m s'/ !.3'
CpG
:--g.^ M a n p G v:-';.aasBiv^ 3'
11 GpC -
GpC
~<T 5'
I
5' >
CpG
M etilasa
d e s o s t n
CpG
> 3'
' 5
3
5' 3
3' <~
'-;*s.fe;C p G S B a;v-;;:'vH;!g C p G
GpC
- - - i a s g = q > 3'
GpC
5'
M
Fig. 16-5. Herencia del patrn de metilacin CpG.
La metilasa de sostn reconoce CpG hemimetilado en DNA recin
replicado, lo que permite que el patrn de metilacin CpG se herede
(vase seccin 10.4.2 y Bird, 2002).
A. Un padecimiento recesivo simple. Las personas heterocigotas

para una mutacin que suprime del todo la funcin gnica son
normales en cuanto a fenotipo, a condicin de que el alelo res
tante no sea muy defectuoso.
B. Un padecimiento dominante causado por haploinsuficiencia. En realidad esta situacin simple es rara. Si una reduccin
de 50% en el producto gnico causa sntomas, una disminu
cin ms grave quiz tenga efectos ms graves.
C. Un padecimiento recesivo de gravedad gradual. Entre mlti
ples ejemplos se encuentran:
mutantes en el gen de la fosforribosiltransferasa de guanina
e hipoxantina (HPRT) ligado a X. La extensin de la acti
vidad de la enzima residual en mutantes se correlaciona
bien con el fenotipo clnico de varones afectados (cuadro
16-4);
nmeros de copias reducidos de un gen de globina a produ
cen efectos cada vez ms graves. Como se muestra en la fi
gura 16-2, la mayora de las personas tiene cuatro copias del
gen de globina a (aa/ aa). Las personas con tres copias
(aa/ a) son sanas; quienes poseen dos (sea la fase a l a o
a a /~) sufren talasemia a leve; las que slo tienen un gen
(a-/) padecen la enfermedad grave, en tanto que la ausen
cia de todos los genes a (- / ) causa hidropesa fetal mortal.
D. Varios fenotipos. La disminucin de la funcin residual de un
gen puede extender el fenotipo y tal vez causar un padecimien
to con un nombre clnico distinto. Segn la posicin de los
umbrales, pueden surgir varias situaciones diferentes:
476
CAPITOLO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
Recuadro 16-6. Patologa m olecular de los sndrom es de Prader-W illi y d e A ngelm an

Los sndromes de Prader-Willi (SPW) y de Angelman (SA) se deben a pro
blemas con genes diferencialmente con improntas en 15q11-q13. Ejem
plifican la patologa m olecular com plicada que se relaciona con
agrupaciones de genes con improntas (Nicholls y Knepper, 2001).
Sndrome de Prader-WIII (SPW) (MIM 176 260: retraso mental, hipotona, obesidad notable, hipogenitalismo masculino) lo ocasiona la fal
ta de funcin de genes que slo se expresan del cromosoma paterno.
Sndrome de Angelman (SA) (MIM 105 830: retraso mental, falta de
habla, retraso del crecimiento, hiperactividad, risa inapropiada) se de
be a falta de funcin de un gen enlazado de manera cercana que se
expresa slo del cromosoma materno. Algunos nios con SA tendrn
dos copias funcionales de los genes del SPW, y viceversa, pero esta
expresin excesiva no parece tener ningn efecto fenotpico.
A veces el mecanismo de improntacin es errneo. Ambos crom oso

mas 15 homlogos llevan el mism o patrn de metilacin especfico
del padre, aunque estudios de marcador muestran que se originan de
diferentes padres. Estos casos interesantes son causados por dele
ciones pequeas que definen elementos de control de improntacin
de SPW y SA no superpuestos.
El SA puede deberse por completo a falta de expresin del gen UBE3A
ya que algunos casos hereditarios tienen estructura e improntacin
cromosmica normales, pero mutaciones de punto en este gen. El
SPW es ms complejo. El cromosoma paterno codifica un transcrito
inmenso (hasta 460 kb y 148 exones) con mltiples formas de em
palme. Los 10 primeros exones codifican dos protenas, SNURF y
SNRPN, en tanto que los exones corriente abajo carecen de marcos
de lectura abiertos pero algunos de los intrones codifican RNA nucleolares pequeos (snoRNA) que forman parte de la maquinaria de
empalme. La ausencia de snoRNA puede ocasionar los sntomas del
sndrome de Prader-Willi (SPW). La parte corriente abajo del transcri
to se superpone en el gen UBE3A de la cadena opuesta y tal vez ac
ta como un RNA antisentido, io que previene la transcripcin de
UBE3A del cromosoma paterno (Runte y cois., 2001).
Como se muestra en el cuadro, una variedad de acontecimientos puede

conducir a falta de una copia paterna (SPW) o materna (SA) de las 15 se
cuencias del cromosoma importante.
La causa ms frecuente son deleciones nuevas de 4 a 4.5 Mb entre
repeticiones de flanqueo 15q11-q13. Las deleciones en el crom oso
ma paterno causan SPW: las deleciones de la misma regin en el cro
mosoma materno producen SA.
Disoma uniparentai, se detecta cuando los estudios de marcador de
ONA muestran que una persona con cromosomas aparentemente nor
males hered ambos homlogos de un par particular (nmero 15 en
este caso) de un padre. La causa usual es trisoma de rescate. Un
conceptus con trisoma 15 se desarrolla hasta una etapa multicelular;
en condiciones normales moriria, pero si una no disyuncin mittca
al azar (seccin 2.5.2) produce una clula con slo dos copias del
cromosoma 15 en una etapa del desarrollo lo bastante temprana, esa
clula puede proseguir para form ar un nio completo que sobrevive.
Casi todos los conceptus con trisoma 15 son 15M15M15P. Una oca
sin de cada tres, la prdida aleatoria de un cromosoma 15 producir
un feto con disoma uniparentai materna, 15M15M. Cuando cualquier
cromosoma 15 paterno falta, el feto tendr sndrome de Prader-Willi.
Orgenes de los sndromes de Prader-Willi y Angelman

Acontecimiento
Proporcin
de SPW
Proporcin
de SA
Deleciones
~ 75%
75%
Disoma uniparentai
~ 20%
3%
Errores de improntacin
~ 2%
5%
Mutaciones de punto
No se observan
15% (en el genUBE3A)
Cuadro 16-3. Mecanismos de mutaciones de ganancia de funcin.

Disfuncin
Gen
Enfermedad
MIM nm.
Expresin excesiva
PMP22
Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
118200
Receptor encendido permanentemente
GNAS
Enfermedad de McCune-Albright
174800
Adquisicin de nuevo sustrato (alelo Pittsburgh)
Pl
Deficiencia de antitripsina a !
107400
Canal inico abierto de modo inapropiado
SCN4A
Paramiotona congnita
168300
Multmeros con estructura anormal
C0L2A1
Osteognesis imperfecta
Varios
Agregacin de protenas
HD
Enfermedad de Huntington
143100
Gen quimrico
BCR-ABL
Leucemia mieloide crnica
151410
Varios padecimientos recesivos relacionados pueden deberse

a reducciones sucesivas de la funcin gnica en un locus ais
lado. Por ejemplo, la matriz extracelular es rica en proteoglucanos sulfatados, como el sulfato de heparn y el sulfato de
condroitina, y los defectos en el transporte de sulfato inter
fieren con el desarrollo esqueltico. Las mutaciones con pr-
dida de funcin del transportador de sulfato DTDSTocasio

nan cuatro displasias esquelticas autosmicas recesivas rela
cionadas: displasia diastrfica (MIM 226 600), displasia
epifisaria mltiple 4 (MIM 226 900), atelosteognesis II
(MIM 256 050) y acondrognesis tipo IB (MIM 600 972)
de acuerdo con la extensin de la prdida (Karniski, 2001).
16.6
477
Fig. 16-6. Mutacin hereditaria que ocasiona la adquisicin de una funcin nueva por una protena
La metionina 358 en el centro reactivo de la antitripsina a ! acta como un seuelo para elastasa. La elastasa corta el enlace pptido entre Met358 y
Ser359, y da lugar a que los dos residuos se separen 65 , como se muestra aqu (esferas verdes). La elastasa es atrapada e inactivada. La variante
Pittsburgh tiene una mutacin de sentido errneo M358R que reemplaza el seuelo de metionina con arginina. Esto destruye la afinidad por la elastasa
pero crea un seuelo para trombina. Como una antitrombina nueva con actividad constitutiva, la variante Pittsburgh produce un trastorno hemorrgico
letal. Imagen de la University of Geneva ExPASy molecular biology World Wide Web server.
(MIM 220 400: problemas cardiacos y prdida de la audi

cin) en homocigotos. Sin embargo, una mutacin dominante
negativa en el mismo gen produce el sndrome de RomanoWard que se hereda en forma dominante (MIM 192 500:
arritmia cardiaca). En oocitos de Xenopus transfectados, los
canales inicos Romano-Ward tienen alrededor de 20%
de la actividad normal, pero los canales inicos de pacientes
Una prdida de 50% tal vez no tenga efecto; una prdida un

poco mayor, causada por efectos dominantes negativos, pue
de producir un padecimiento dominante; en tanto que la
prdida total de funcin ocasiona un padecimiento recesivo
ms grave. Las mutaciones con prdida de funcin simples
del canal KVLQT1 K+ no tienen efecto en heterocigotos, pe
ro originan el sndrome recesivo de Jervell y Lange-Nielsen
Sin efecto
E nferm edad
A) L
Sin efecto
E nferm edad
B) i
Sin efecto
E nferm edad
Leve ----------------------- G rave
C)
Sin efecto
100
Efecto en el sistema A , E fecto en el sis te m a A + B
50
Nivel d e funcin g n ic a residu al (%)

Fig. 16-7. Cuatro posibles relaciones entre prdida de la funcin y el fenotipo clnico.
Vase seccin 16.6.1 para el comentario.
478
CAPTULO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
JLN carecen por completo de funcin (Wollnik y col,,

1997).
Las mutaciones en el mismo gen pueden producir dos o ms
padecimientos dominantes, el ms leve por haploinsuficiencia
simple y las formas ms graves mediante efectos dominantes
negativos. Esto ocurre en los genes COL1AI o C0L1A2que
codifican colgena tipo I (fig. 16-4). Las mutaciones en es
tos genes suelen producir osteognesis imperfecta (OI: enfer
medad de huesos frgiles). Los cambios de marco y las
mutaciones sin sentido producen OI tipo 1, la forma ms le
ve, en tanto que en las sustituciones de aminocidos en uni
dades repetidas Gli-X-Y se observan los tipos ms graves de
OI, II, III y IV. La relacin genotipo-fenotipo es muy sutil.
Las sustituciones de glicina por un aminocido ms volumi
noso en la unidad Gli-X-Y tienen un efecto dominante ne
gativo al interrumpir el empacamiento estrecho de la hlice
triple de colgena. La hlice se ensambla a partir del extremo
terminal C y la sustitucin de glicina cerca de ese extre
mo tiene un efecto ms grave que las sustituciones cercanas
al extremo terminal N. La omisin del exn 6 (de COL 1Al
o C0L1A2) tiene un efecto muy diferente. El sitio de corte
del propptido terminal N se pierde y se produce una col
gena anormal que ocasiona el sndrome de Ehlers-Danlos
tipo VII (MIM 130 060; laxitud de la piel y las articulacio
nes). Una funcin diferente se perdi y dio por resultado un
fenotipo distinto.
16.6.2 Las mutaciones con prdida de funcin y

ganancia de funcin en el mismo gen causarn
diferentes enfermedades
Ya se coment que las mutaciones con prdida de funcin en el gen
PAX3 ocasionan las anormalidades del desarrollo del sndrome de
Waardenburg tipo 1 (fig. 16-1). Un fenotipo por completo diferen
te se observa cuando una translocacin cromosmica adquirida
crea un gen quimrico nuevo por fusin de PAX3 a otro gen de fac
tor de transcripcin, FKHR, en una clula somtica. La ganancia de
funcin de este factor de transcripcin hbrido origina el desarrollo
del tumor de la niez rabdomiosarcoma alveolar (cuadro 17-3).
Un ejemplo notable se relaciona con el gen RET (Mani y cois.,
2001). RET codifica un receptor que abarca la membrana celular.
Cuando su ligando (GDNF) se enlaza al dominio extracelular indu
ce la dimerizacin de los receptores, que luego transmiten la seal al
interior de la clula por medio de mdulos de cinasa de tirosina en
su dominio citoplsmico. Una variedad de mutaciones con prdida
de funcin -cambios de marco, mutaciones sin sentido y sustitucio
nes de aminocidos que interfiere con la maduracin postraduccional

de la protena RET- son una causa de enfermedad de Hirschsprung
(MIM 142 623; estreimiento rebelde por ausencia de ganglios en
tricos en el intestino; vase seccin 15.6.2). Ciertas mutaciones en
sentido errneo muy especficas en el gen RET se observan en un
grupo del todo distinto de enfermedades, el carcinoma medular de
la tiroides familiar y la neoplasia endocrina mltiple tipo 2 relacio
nada pero ms extensa. stas son mutaciones con ganancia de fun
cin que producen receptores que reaccionan en exceso al ligando o
que tienen actividad constitucional y dimerizan inclusive en ausen
cia de ligando. Como hecho curioso, algunas personas con mutacio
nes en sentido errneo que afectan la cistena 618 o 620 sufren tanto
cncer de la tiroides como enfermedad de Hirschsprung prdida y
ganancia de funcin simultnea. Esto recuerda que la prdida de
funcin y la ganancia de funcin no son simples cantidades num
ricas; las mutaciones pueden tener diferentes efectos en los distintos
tipos de clulas en que un gen se expresa.
El cuadro 16-5 incluye una lista de varios casos en que las mu
taciones en un gen aislado pueden originar ms de una enferme
dad. Por lo general la ganancia de funcin mutante produce una
protena de calidad anormal. En ocasiones un efecto de dosis sim
ple puede ser patgeno -un ejemplo es el gen de la protena de mielina perifrica PMP22-. Cruzamientos desiguales entre secuencias
repetidas en el cromosoma 17pl 1 crean duplicaciones o deleciones
de una regin de 1.5 Mb que contiene el gen PMP22 (fig. 16-8).
Los portadores heterocigotos de la delecin o duplicacin tienen
una copia o tres copias respectivamente de este gen. Las personas
que slo tienen una copia sufren neuropata hereditaria con parli
sis por presin o neuropata tomaculosa (MIM 162 500), en tanto
que, como ya se mencion, las personas con tres copias padecen
una neuropata clnicamente diferente, la enfermedad de CharcotMarie-Tooth 1A (CMT1A; MIM 118 220).
16.6.3 La variabilidad entre familias es evidencia de

genes modificadores o efectos al azar
Muchos padecimientos mendelianos son clnicamente variables
aun entre los miembros afectados de la misma familia que llevan
justo la misma mutacin. La variabilidad intrafamiliar debe ser
causada por cierta combinacin de los efectos de otros genes no en
lazados (genes modificadores) y por efectos ambientales (inclusive
acontecimientos al azar). Como se coment, los fenotipos que de
penden de haploinsuficiencia son en especial sensibles a los efectos
de modificadores (seccin 16.4.2). El sndrome de Waardenburg es
un ejemplo tpico: la figura 16-1 muestra evidencias de que este pa
decimiento dominante se debe a haploinsuficiencia y la figura 4-5C
presenta una variacin intrafamiliar tpica.
Cuadro 16-4. Consecuencias de la disminucin de la funcin de la fosforribosiltransferasa de guanina e hipoxantina (HPRT).

Actividad de HPRT (% del normal)
Fenotipo
> 60
Normal
8-60
Neurolgicamente normal: hiperuricemia (gota)
1.6-8
Problema neurolgico (coreoatetosis)
1.4-1.6
Sndrome de Lesch-Nyhan (coreoatetosis, automutilacin) pero inteligencia normal
< 1.4
Sndrome clsico de Lesch-Nyhan (MIM 308 000; coreoatetosis, automutilacin y retraso mental)
16.6 I PATOLOGA MOLECULAR: DEL GEN A LA ENFERMEDAD
479
Cuadro 1 6 -5 . Ejemplos de genes que causan ms de una enfermedad.

Gen
Localizacin
Enfermedades
Smbolo
MIM nm.
PAX3
2q35
Sndrome de Waardenburg tipo
WS1
193500
Rabdomiosarcoma alveolar
RMS2
268220
Fibrosis qustica
CF
279700
Neoplasia endocrina mltiple tipo 2A
MEN2A
171400
Neoplasia endocrina mltiple tipo 2B
MEN2B
162300
Carcinoma medular de la tiroides
FMTC
155420
HSCR
142623
Neuropata de Charcot-Marie-Tooth tipo 1A
CMT1A
118220
Neuropata tomaculosa
HNPP
162500
Paramiotona congnita
PMC
168300
Parlisis hiperpotasmica peridica
HYPP
170500
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
CJD
123400
Insomnio fatal familiar
FFI
176640
Osteodistrofia hereditaria de Albright
AH0
103580
Sndrome de McCune-Albright
PFD
174800
Sndrome de feminizacin testicular
TFM
313700
Atrofia muscular espinobulbar
SBMA
313200
CFTR
7p31,2
Ausencia bilateral de conductos deferentes

RET
PMP22
SCN4A
10q11.2
17p11.2
17q23.1-q25.3
Miotona congnita que responde a acetazolamida

PRNP
GNAS
AR
20p12-pter
20q13.2
Xcen-q22
La variabilidad intrafamiliar es un gran problema en asesora ge

ntica porque las familias que consideran la procreacin desean sa
ber con qu tanta gravedad se afectarn. En consecuencia hay una
motivacin tanto clnica como cientfica para identificar genes mo
dificadores. El conocimiento de las interacciones bioqumicas del
producto gnico primario o los estudios en ratones en los que el
anlisis gentico necesario es factible suelen sugerir los genes modi
ficadores candidato (Nadeau, 2001). El trabajo de Easton y colabo
radores (1993) respecto a la neurofibromatosis tipo 1 (MIM 162
200) muestra la forma en que el anlisis estadstico de fenotipos cl
nicos dentro de familias grandes puede proporcionar evidencias de
genes modificadores. Tampoco debe ignorarse la funcin del azar
puro, sobre todo en padecimientos con un fenotipo en placas. Los
ejemplos comprenden la despigmentacin en placas en el sndrome
de Waardenburg y los nmeros variables de neurofibromas o pli
pos en la neurofibromatosis tipo 1 y la poliposis adenomatosa del
colon (MIM 175 100) respectivamente.
Un ejemplo de la forma en que un modificador pudiera actuar
proviene de una familia interesante con herencia de albinismo ocular
al parecer dignico (Morell y cois., 1997). La tirosina es una enzima
fundamental de los melanocitos; su deficiencia conduce a albinismo
oculocutneo (MIM 203 100). Una variante frecuente del gen de tirosinasa, R402Q, codifica una enzima con actividad reducida, pero la
actividad residual es suficientemente alta para que inclusive los homocigotos tengan una pigmentacin normal. Sin embargo, en la familia
publicada por Morell y colaboradores las personas que portaban una o
dos copias de R402Q mostraron albinismo ocular (una forma leve de
albinismo oculocutneo) cuando tambin tenan una mutacin en

MITF, un gen que participa en la diferenciacin de los melanocitos.
Las mutaciones en MITF solas no causan albinismo ocular.
16.6.4 Repeticiones en expansin inestables: una

nueva causa de enfermedad
Las repeticiones de nucletidos en expansin inestables (mutacio
nes dinmicas) fueron un mecanismo de enfermedad por comple
to nuevo y sin precedente cuando se descubrieron por primera vez
en 1991. El cuadro 16-6 muestra los ejemplos que se conocen en la
actualidad. Originan dos preguntas mayores:
cul es el mecanismo de la inestabilidad de la expansin? Esto
se comenta en la seccin 11.5.2;
por qu las repeticiones expandidas causan enfermedad? Este
problema se analiza en este inciso.
Una caracterstica de las enfermedades originadas por repeticiones
dinmicas es la anticipacin -es decir, la edad de inicio es menor,
la gravedad mayor, o ambas, en generaciones sucesivas-. Vase la
seccin 4.3.3 para una nota de advertencia respecto a la anticipa
cin. En algunos casos alelos de tamao intermedio no son patge
nos pero s inestables y se expanden con facilidad hasta alelos de
mutacin completa (p. ej-, las repeticiones FRAXA de 50 a 200
unidades); en otros casos estos alelos slo se expanden de manera
muy ocasional (p. ej., alelos HD con 29 a 35 repeticiones). Las ex
pansiones patgenas corresponden a dos clases principales:
480
CAPTULO DIECISIS PATOLOGA MOLECULAR
Norm al
E n ferm ed ad d e
C harcot-M arie-T ooth (CMT1A)
_ | -------------- U ----------- 1------------- m ------------------ y
N eu ro p ata to m a c u lo sa
(HNPP)
------------------[
] -------------
H etero cigo to p a ra du plicacin

d e 1.5 Mb
H eterocigo to p a ra delecin
H om ocigoto p a ra du plicacin
d e 1.5 M b -en ferm edad g rave
Mutacin de punto con
C lave:
PMP22
Mutacin de punto activante
I--------------1 Lmites d e regin

du plicada d e 1.5 Mb
Fig. 16-8. Efectos de la dosis gnica con el gen PMP22

Casi todos los pacientes con enfermedad de Charcot-Marie-Tooth son heterocigotos para una duplicacin de 1.5 Mb en 17p11.2, que incluye el gen
para protena de mielina perifrica, PMP22 (cuadro a color). Un paciente homocigoto para la duplicacin padeci la enfermedad muy grave. Algunos
enfermos slo tienen dos copias del gen PMP22, pero una copia lleva una mutacin activante. La delecin o la mutacin de prdida de funcin del gen
PMP22 se observa en pacientes con neuropata tomaculosa (Patel y Lupski, 1994).
repeticiones muy expandidas fuera de secuencias de codificacin;

expansiones moderadas de repeticiones CAG que codifican
vas de poliglutamina en el producto gnico.
Repeticiones muy expandidas fuera de secuencias de

codificacin
En el sndrome de X frgil y en la ataxia de Friedreich, una repeticin
demasiado expandida origina prdida de funcin porque suprime la
transcripcin. Lo mismo sucede en la expansin 12-mer en la epilep
sia mioclnica juvenil. En cada caso la enfermedad a veces se debe
a mutaciones con prdida de funcin diferentes, ms convenciona
les en el gen. Estas mutaciones producen el fenotipo clnico idntico
a expansiones, aparte (posiblemente) de no mostrar anticipacin.
Otras repeticiones muy expandidas similares, como FRA16A (repeti
cin CCG expandida) o FRA16B (una expandida minisatlite de 33
pb) no son patgenas, quiz porque no se localizan cerca de un gen
importante. Tal vez las repeticiones suprimen la transcripcin me
diante la alteracin de la estructura cromatnica local. En X frgil, es
to conduce a metilacin del promotor.
La expansin grande en la distrofia miotnica es distinta. Pues
to que nunca se ha encontrado otra mutacin en un paciente con
distrofia miotnica, debe haber algo muy especfico respecto a la
accin de la repeticin CTG. En fecha reciente se aclar que la prin
cipal accin patgena (en DM1 y DM2) se da a travs del enlace
de mRNA y el secuestro de protenas de enlace de CUG que se re
quieren para el empalme correcto de otros transcritos. El empalme
aberrante conduce a prdida del canal de cloruro especfico de
msculo, entre otros transcritos (revisado por Tapscott y Thornton,
2001). Tambin debe haber otros efectos porque el sitio de expan

sin forma parte del islote CpG del gen adyacente, S1X5 (MIM
600 963) y la expansin reduce la expresin de este gen.
Al parecer el gen SCA8 (Koob y cois., 1999) codifica un RNA no
traducido que acta como un regulador antisentido de un gen en
la otra cadena del DNA (similar a los transcritos improntos que se
mencionan en la seccin 16.4.4). La forma en que la expansin
produce la enfermedad se desconoce -de hecho no es del todo cier
to que este cambio sea patgeno.
Expansiones modestas de repeticiones CAG dentro de

regiones de codificacin que codifican vas de poliglutamina
dentro del producto gnico
Las caractersticas comunes de ocho enfermedades causadas por
expansin de una repeticin CAG inestable dentro de un gen in
cluyen:
enfermedades neurodegenerativas de inicio tardo y, excepto
por la enfermedad de Kennedy, todas se heredan en forma do
minante;
an no se encuentra otra mutacin en el gen que cause la en
fermedad;
el alelo expandido se transcribe y traduce;
la repeticin de trinucletidos codifica una va de poliglutami
na en la protena;
un umbral crtico del tamao de la repeticin abajo del cual es
ta ltima no es patgena; cuando se excede, la repeticin cau
sa enfermedad;
16.6
481
Cuadro 16-6. Enfermedades causadas por repeticiones expandidas de nucletidos inestables.

Enfermedad
MIM nm. Modalidad

de herencia
Localizacin Localizacin
del gen
de la
repeticin
Secuencia
repetida
Repeticin
estable
nm.
Repeticin
Inestable
nm.
1. Expansiones de repeticiones muy grandes fuera de secuencias de codificacin:

X frgil sitio A (FRAXA)
309550
Xq27.3
5'UTR
(CGG)n
6-54
200-1000+
X frgil sitio E (FRAXE)
309548
Xq28
Promotor
(CCG)n
6-25
200+
Ataxia de Friedreich (FA)
229300
AR
9q13-q21.1
Intrn 1
(GAA)n
7-22
200-1700
Distrofia miotnica 1 (DM1)
160900
AD
19q13
3'UTR
(CTG)n
5-35
50-4000
Distrofia miotnica 2 (DM2)
602668
AD
3q21
Intrn 1
(CCTG)n
12
75-11 000
Ataxia espinocerebelosa 8
603680
AD
13q21
RNA no traducido (CTG)n
16-37
11 0-5 00+
Ataxia espinocerebelosa 11
604432
AD
15q14-21
Intrn 9
(ATTCT)n
10-22
Hasta 22 kb
Epilepsia mioclnica
juvenil (JME)
254800
AR
21q22.3
Promotor
(CCCCGCCCCGCG)n 2-3
40-80
2. Expansiones moderadas de repeticiones CAG en secuencias de codificacin:

Enfermedad de Huntington (HD) 143100
AD
4p16.3
Codificacin
(CAG)n
6-35
3 6 -1 0 0 +
Enfermedad de Kennedy
313200
XR
Xq21
Codificacin
(CAG)n
9-35
38-62
SCA1
164400
AD
6p23
Codificacin
(CAG)n
6-38
39-83
SCA2
183090
AD
12q24
Codificacin
(CAG)n
14-31
32-77
Enfermedad de
Machado-Joseph (SCA3)
109150
AD
14q32.1
Codificacin
(CAG)n
12-39
62-86
SCA6
183086
AD
19p13
Codificacin
(CAG)n
4-17
21-30
SCA7
164500
AD
3p12-p21.1
Codificacin
(CAG)n
7-35
37-200
SCA17
607136
AD
6q27
Codificacin
(CAG)n
25-42
47-63
Atrofia dentatorrubropalidoluisiana (DRPLA)
125370
AD
12p
Codificacin
(CAG)n
3-35
49-88
SCA, ataxia espinocerebelosa
cuanto ms grande es la repeticin, por arriba del umbral, ms

temprana es la edad promedio de inicio (no es posible establecer
predicciones en pacientes individuales, pero se observa una co
rrelacin estadstica clara).
(gen HOXD13, MIM 186 000). stas no son mutaciones dinmi

cas y no pertenecen a las repeticiones expandidas inestables clsicas.
La mutacin del receptor de andrgeno en la enfermedad de Ken

nedy provee evidencias claras que indican que las enfermedades por
repeticin de CAG comprenden una ganancia de funcin especfi
ca. Las mutaciones con prdida de funcin en este gen se conocen
bien y causan insensibilidad al andrgeno o sndrome de feminiza
cin testicular (MIM 300 068), una falla de la diferenciacin sexual
masculina. En contraste, la expansin de poliglutamina ocasiona
una enfermedad neurodegenerativa muy distinta, aunque con frecuen
cia los pacientes tambin muestran feminizacin menor. El meca
nismo patgeno que comparten abarca formacin de agregados
protenicos (vase ms adelante).
Adems de las repeticiones expandidas inestables clsicas, algu
nas enfermedades pueden deberse a expansiones repetidas de trinucletidos ms cortas y bastante estables. Los ejemplos incluyen
distrofia muscular bucofarngea (gen PABP2, MIM 602 279), seudoacondroplasia (gen COMP, MIM 600 310) y simpolidactilia
Una PCR aislada establece el diagnstico en enfermedades por

repeticin de poliglutamina. Las expansiones muy grandes en la
distrofia miotnica requieren Southern blotting. La X frgil se diag
nostica con un mtodo de Southern blotting que depende tanto del
tamao como del estado de metilacin del gen FRAXA. Para deta
lles ms amplios y fotografas de gel, vase la seccin 18.4.3 y la fi
gura 18-12.
Diagnstico de laboratorio de repeticiones expandidas
16.6.5 La agregacin de protenas es un mecanismo

patgeno frecuente en enfermedades por
ganancia de funcin
En fecha reciente se evidenci que la formacin de agregados pro
tenicos es una caracterstica que varias enfermedades neurolgicas
que se inician en adultos comparten, inclusive las enfermedades
482
CAPTULO DIECISIS
PATOLOGA MOLECULAR
por poliglutamina antes descritas y las de Alzheimer, Parkinson,

Creutzfeldt-Jakob y el grupo heterogneo conocido como amiloidosis. Aunque la historia completa todava no se esclarece, surge un
tema comn. Molculas protenicas globulosas semejan gotas de
aceite, con los residuos hidrofbicos en el interior y grupos polares
en el exterior. El doblez correcto es un proceso crtico y muy espe
cfico, y entre todas las posibles secuencias protenicas se seleccio
nan protenas que ocurren de manera natural, en parte por su
capacidad para doblarse de manera correcta. Las protenas mutantes
pueden ser ms propensas al doblamiento errneo. Las molculas
mal dobladas con grupos hidrofbicos expuestos pueden agregarse
entre s o con otras protenas; esto resulta un poco txico para las
neuronas y puede serlo para otras clulas. En ocasiones parece que
un cambio de conformacin puede propagarse a travs de una po
blacin de molculas protenicas, que se convierten de una confi
guracin natural estable en una nueva forma con diferentes
propiedades en un proceso tal vez anlogo a la cristalizacin. La
conducta de las protenas prin (Prusiner y cois., 1998) es el ejem
plo ms notable. El doblez errneo puede iniciarse con un doblez
errneo al azar de una molcula con estructura normal recin sin
tetizada (casos espordicos), una secuencia mutante con una mayor
propensin al doblez errneo (una enfermedad gentica) o una
molcula doblada errneamente adquirida en alguna forma del am
biente (casos infecciosos). Por consiguiente esta va final compartida
une entre s un grupo de enfermedades con orgenes muy distintos
(Perurz y Windle, 2001; Bucciantini y cois., 2002).
16.6.6 La heteroplasmia y la inestabilidad complican la

relacin entre genotipo y fenotipo en las
mutaciones mitocondriales
Las mutaciones de punto, las deleciones o las duplicaciones que supri
men la funcin de genes en el genoma mitocondrial densamente em
pacado (fig. 9-2) se relacionan con una gama amplia de enfermedades
degenerativas que incluyen sistema nervioso central, corazn, mscu
lo, sistema endocrino, rifiones e hgado. Las clulas contienen muchas
molculas de mtDNA. Pueden ser homoplsmicas (cada molcula de
mtDNA es igual) o heteroplsmicas (una poblacin mixta de DNA
mitocondrial normal y mutante). A diferencia del mosaicismo, la
heteroplasmia puede transmitirse de la madre al nio a travs de un
vulo heteroplsmico. Con frecuencia tanto las mutaciones como la
heteroplasmia parecen evolucionar con el tiempo en un individuo.
La misma persona puede llevar tanto deleciones como duplicaciones
y es posible que la proporcin cambie con el tiempo (Poulton y cois.,
1993).
A menudo se observa el mismo cambio de secuencia en perso
nas con diferentes sndromes y es muy difcil establecer correlacio
nes fenotipo-genotipo. Por ejemplo, 50% de las personas con
neuropata ptica hereditaria de Leber (MIM 535 000: prdida s
bita irreversible de la visin) tienen una sustitucin G-A en el
nucletido 11 778 del genoma mitocondrial. Casi todos estos pa
cientes son homoplsmicos, pero alrededor de 14%, con la misma
gravedad de la afeccin, es heteroplsmico. Aun en familias homoplsmicas el padecimiento es muy variable; la penetrancia total es
de 33 a 60% y 82% de los individuos afectados lo constituyen va
rones (Wallace y cois., 2001). Las posibles razones de la mala corre
lacin incluyen:
la heteroplasmia puede ser especfica de tejido y es posible que
el que se examine (por lo general sangre o msculo) no sea el
tejido crtico en la patognesis;
el mtDNA es mucho ms variable que el DNA nuclear y algu

nos sndromes pueden depender de una combinacin de la
mutacin informada con otras variantes no identificadas;
al parecer algunas enfermedades mitocondriales son de natura
leza cuantitativa: se acumulan cambios mutacionales pequeos
que reducen la capacidad de la mitocondria para generar ener
ga y a cierto umbral de dficit surgen sntomas clnicos;
muchas funciones mitocondriales son codificadas por genes
nucleares (vase recuadro 9-2), de manera que la variacin nu
clear puede ser una causa importante o modificar el fenotipo
mitocondrial.
La base de datos MITOMAP de mutaciones mitocondriales (www.mitomap.org) contiene una buena discusin general, aunada a cua
dros de datos extensos que muestran tan slo lo considerable que es
el desafo de predecir fenotipos.
16.7
Patologa m olecular: de la
enferm edad al gen
Con mucha frecuencia el punto de inicio del pensamiento acerca

de la patologa molecular es una enfermedad en lugar de un gen.
Este enfoque proporciona un punto de vista alternativo de las co
rrelaciones genotipo-fenotipo. El mensaje total es que no se debe
ser inocente cuando se especula respecto al defecto gnico subya
cente a un sndrome mendeliano.
16.7.1 Es posible que el gen subyacente a una

enfermedad no sea el obvio
Las mutaciones que conducen a deficiencia de una protena
no siempre se encuentran en el gen estructural que codifica
la protena
La agammaglobulinemia (falta de inmunoglobulinas, que conduce
a inmunodeficiencia clnica) suele ser mendeliana. Es natural supo
ner que la causa seran mutaciones en los genes de inmunoglobulina, pero estos ltimos se localizan en los cromosomas 2, 14 y 22, y
las agammaglobulinemias no se mapean en estos sitios. Muchas
formas son ligadas a X. Si se recuerdan los mltiples pasos nece
sarios para cambiar un polipptido recin sintetizado en una pro
tena que funciona en forma correcta (seccin 1.5), esta falta de
correspondencia uno a uno entre la mutacin y el gen de la prote
na estructural no debe ser una gran sorpresa. Las fallas en el proce
samiento del gen de inmunoglobulina, en la maduracin de la
clula B o en el desarrollo total del sistema inmunitario producirn
inmunodeficiencia.
En ocasiones un defecto gnico puede ocasionar mltiples

defectos enzimticos
La enfermedad de clula I o mucolipidosis II (MIM 252 500) se
caracteriza por deficiencias de mltiples enzimas lisosmicas. El
principal defecto no se encuentra en el gen estructural para ningu
na de estas enzimas sino en una enzima, la 1-fosfotransferasa de Nacetilglucosamina, que fosforila residuos de maosa en molculas
de la enzima glucosilada. La fosfomanosa es una seal que dirige las
enzimas a lisosomas; cuando falta, los lisosomas carecen de una se
rie completa de enzimas.
16.7
PATOLOGA MOLECULAR: DE LA ENFERMEDAD AL GEN
A menudo las mutaciones slo afectan un subgrupo de los

tejidos en que el gen se expresa
El patrn de expresin especfico de un gen es un mal indicador de
prediccin de los efectos clnicos de las mutaciones. No es proba
ble que los tejidos en que un gen no se expresa sufran patologa pri
maria, pero lo contrario no es cierto. Por lo general slo se afecta
un subgrupo de tejidos de expresin. El gen HD se expresa con
amplitud, pero la enfermedad de Huntington slo afecta regiones
limitadas del cerebro. El gen de retinoblastoma (seccin 17.6.1) se
expresa de modo ubicuo, pero slo la retina suele afectarse por
mutaciones heredadas. Esto tambin se observa con firmeza en
trastornos lisosmicos. Se requiere la expresin gnica en un tipo
de clula aislada, el macrfago, que se encuentra en muchos teji
dos. Sin embargo, no todos los tejidos que contienen macrfagos
son anormales en los pacientes afectados. No es difcil encontrar
explicaciones:
los genes no siempre se expresan slo en los tejidos en que se
requieren. A condicin de que la expresin no cause dao, pue
de haber poca presin de selectividad para suspender la expre
sin, inclusive en los tejidos en que la expresin no confiere
beneficio;
la prdida de una funcin gnica afectar algunos tejidos mu
cho ms que otros, a causa las funciones y necesidades metablicas variables de diferentes tipos de clulas y los grados
variables de redundancia funcional en la red de interacciones
dentro de una clula. Adems del recambio celular que es err
neo en el cncer, es probable que el concepto del gen celador
de la gentica del cncer (seccin 17.7.2) sea aplicable a mu
chas otras funciones y disfunciones celulares;
cualquier ganancia de funcin puede ser patolgica para cier
tos tipos celulares y perjudicial para otros; vase el ejemplo del
gen RET (seccin 16.6.2).
16.7.2 La heterogeneidad de locus es la regla en lugar

de la excepcin
Heterogeneidad de locus describe la situacin en que la misma
enfermedad puede ser causada por mutaciones en varios genes di
ferentes. Es importante pensar en la funcin biolgica del produc
to gnico, y las molculas con que interacta, en lugar de esperar
una relacin uno a uno entre genes y sndromes. Como se comen
ta en la seccin 4.2.4, los sndromes clnicos suelen resultar de fa
lla o mal funcionamiento de una va del desarrollo o fisiolgica; de
igual forma, muchas estructuras y funciones celulares dependen
de agregados protenicos de mltiples componentes. Si se requiere
el funcionamiento correcto de varios genes, entonces las mutacio
nes en cualquiera de ellos pueden causar el mismo fenotipo, o uno
muy similar.
Una vez ms las colgenas (fig. 16-4; seccin 16.6.1) brindan
buenos ejemplos. Ya se coment que la colgena tipo I, la principal
colgena de piel, huesos, tendones y ligamentos, est formado por
triples hlices que comprenden dos cadenas a ( l) y una a(2). Las
mutaciones en cualquiera de los genes COL1A1 o COL1A2 causan
el mismo trastorno, osteognesis imperfecta dominante. La colge
na tipo II forma fibrillas en cartlago y otros tejidos, inclusive el
vitreo del ojo. Est constituida por hlices homotrimricas de cade
nas COL2A1. Diferentes mutaciones en el gen C0L2A1 producen
una gama de superposiciones de displasias esquelticas que abarcan
483
el sndrome de Stickler, la displasia espondiloepifisaria y la displasia de Kniest. Un fenotipo similar puede resultar de mutaciones en
la colgena tipo XI, un componente menor de la fibrilla tipo II.
En todos estos casos el sndrome que se produce depende del efec
to total en las fibrillas finales de colgena, en lugar del gen que es
t mutado.
16.7.3 Mutaciones en diferentes miembros de una

familia gnica pueden producir una serie de
sndromes relacionados o superpuestos
Las mutaciones en miembros de una familia gnica con funciones
parcialmente superpuestas pueden producir un grupo de fenoti
pos parcialmente superpuestos que resultan difciles de diferenciar
en la clnica. Las mutaciones que afectan los receptores del factor
de crecimiento de fibroblastos ilustran este hecho. Los 10 factores de
crecimiento de fibroblastos rigen procesos importantes del desa
rrollo a travs de cuatro receptores de superficie celular, FGFR1 a
4. Casi todos los tejidos expresan mltiples FGFR, inclusive va
riantes empalmadas de cada uno. Los FGFR son receptores de cinasas de tirosina que actan en forma similar a la protena RET
descrita: la transduccin de seal requiere dimerizacin del recep
tor y esto puede comprender homodmeros o heterodmeros. Las
mutantes de FGFR podran producir un equilibrio alterado de
las formas de empalme, cambiar el equilibrio de homodmeros y
heterodmeros, reducir el sealamiento por un efecto negativo do
minante o producir dmeros con actividad constitucional. Por tan
to existe la posibilidad de efectos genticos complejos.
Varias mutaciones especficas de los genes de receptor originan
una serie de trastornos dominantes del crecimiento esqueltico (fig.
16-9). Las mutaciones en FGFR2 en 10q26 se encuentran en los
sndromes de Crouzon, Jackson-Weiss, Pfeiffer y Apert, en tanto
que distintas mutaciones especficas en FGFR3 en 4p l6 producen
acondroplasia, displasia tanatofrica tipos 1 y 2, hipocondroplasia,
sndrome de Crouzon con acantosis nigricans y craneosinostosis
coronal de Muencke. Algunos pacientes con sndrome de Pfeiffer
tienen una mutacin en FGFR1. Para las descripciones clnicas, re
ferencias y una introduccin a la patologa molecular de estos
sndromes, vanse OMIM y Wilkie (1997). La naturaleza muy es
pecfica de las mutaciones sugiere una ganancia de funcin y est
demostrado que las mutantes de acondroplasia, displasia tanatof
rica y de Crouzon producen receptores con grados variables de
activacin constitutiva (independiente del ligando) cuando se transfectan en ciertos tipos de clulas (Naski y cois., 1996).
16.7.4 Las clasificaciones clnica y molecular son

herramientas alternativas para pensar acerca
de las enfermedades y cada una es vlida en su
esfera
Los trastornos del tejido conjuntivo que se deben a mutaciones del
gen de colgena, un tema recurrente en este captulo, ilustran la di
ferencia entre las clasificaciones clnicas y moleculares de las enfer
medades (cuadro 16-7).
Todas las enfermedades mendelianas pueden clasificarse con
base molecular, primero por el locus relacionado y segundo por
el alelo mutante particular en ese locus.
Las enfermedades genticas tambin pueden clasificarse clni
camente segn sus sntomas y pronstico. Las categoras clnicas
484
CAPTULO DIECISIS PATOLOGA MOLECULAR
que se definen en esta forma tal vez no correspondan con exac

titud a una clasificacin molecular, pero pueden ser ms tiles
para la asesora y el tratamiento de pacientes.
Los nombres clnicos no son slo convenciones. Evolucionan confor
me el conocimiento de la gentica subyacente avanza -las enfermeda
des se agrupan entre s (distrofias musculares de Duchenne y de
Becker) o se dividen (cncer de mama BRCA1 del cncer de mama es
pordico)-. Para establecer el diagnstico molecular es esencial una cla
sificacin molecular y puede posibilitar una asesora ms precisa -p.
ej., slo el anlisis molecular podra mostrar que los padres no afecta
dos que tienen ms de un nio afectado por osteognesis imperfecta
son mosaicos germinales en lugar de portadores de una forma recesi
va de osteognesis imperfecta (OI)-. Sin embargo, una clasificacin
molecular plena no siempre tiene utilidad clnica; p. ej., aunque la
OMIM incluye una lista de 11 locus que causan sndromes de Usher
(sordera-ceguera recesiva), en clnica slo es til para distinguir tres ti
pos, cuya gravedad es variable. Por consiguiente una clasificacin
molecular ilumina en lugar de superar la clasificacin clnica.
16.8
Patologa m olecular de trastornos

crom osm icos
16.8.1 Los sndromes de microdelecin unen la brecha

entre sndromes de gen nico y cromosmicos
Si el genoma humano de 3 000 Mb contiene 30 000 genes, una delecin de alrededor de una megabase, que es muy pequea para ob
servarse bajo el microscopio, an puede incluir una docena ms de

genes. El anlisis de FISH y el arreglo-HGC (secciones 2.4.2,
17.3.3) revelan nmeros crecientes de estas anormalidades cromosmicas submicroscpicas (cuadro 16-8). Desde el punto de vista
de la patologa molecular, corresponden a tres clases:
Sndromes de gen nico, en el que todos los efectos fenotpicos se deben a delecin (o en ocasiones duplicacin) de un gen
nico. Por ejemplo, el sndromes de Alagille (MIM 118 450)
se observa en pacientes con una microdelecin en 20pl 1. Sin
embargo, 93% de los enfermos con Alagille no tiene una dele
cin, sino que por el contrario incluye mutaciones de punto en
el gen JAG1 localizado en 2 0 p ll. En todos los casos la causa
del sndrome es haploinsuficiencia para JAG1.
Sndromes de gen contiguo, que se observan sobre todo en
varones con deleciones del cromosoma X. El caso clsico fue el
nio 'BB' que sufra distrofia muscular de Duchcnne (DMD
(MIM 310 200), enfermedad granulomatosa crnica (MIM
306 400) y retinitis pigmentosa (MIM 312 600), aunadas a re
traso mental (Francke y cois., 1985). Tena una delecin cromosmica en Xp21 que elimin un grupo de genes contiguos y de
manera incidental brind a los investigadores los medios para
clonar los genes cuya ausencia ocasion dos de sus enfermeda
des, DMD y la enfermedad granulomatosa crnica (seccin
14.4.2). Otro grupo de sndromes de gen contiguo muestra de
leciones de punto de Xp. Deleciones cada vez ms grandes eli
minan ms genes y aaden ms enfermedades al sndrome
(Ballabio y Andria, 1992). Las microdeleciones son hasta cier
to punto frecuentes en algunas partes del cromosoma X (p. ej~
FGFR1
8p11
FGFR2
10q25
A CA
T2
T1
FGFR3
4 p 1 6
Seal
pptida
Regin
cida
ti
TM
Cinasa
Cinasa 2
Fig. 16-9. Correlaciones entre fenotipo y genotipo en mutaciones FGFR.

Se muestran tres de los cuatros receptores de factor de crecimiento de fibroblasto altamente homlogo. Cada cinasa de tirosina receptora tiene tres
dominios extracelulares similares a inmunoglobulina (obtenidos por puentes S-S), un dominio transmembrana (TM) y dominios de cinasa de tirosina
intracelulares pareados. Las mutaciones de sentido errneo muy especficas se relacionan con una serie de displasia esquelticas (acondroplasia A,
hipocondroplasia C, displasia tanatofrica tipos 1 y 2, T1 y T2) y sndromes de craneosinostosis (Apert Ap, Crouzon C, Jackson-Weiss JW, Muencke U
Pfeiffer P). Otras mutaciones pueden ocasionar la enfermedad cutis girata de Beare-Stevenson (CA) y algunas mutaciones en el dominio Ig3 de FGFR2
se vinculan con sndromes de Crouzon, Jackson-Weiss y Pfeiffer en diferentes familias.
16.8 I PATOLOGA MOLECULAR DE TRASTORNOS CROMOSMICOS
Xp21, Xq proximal) pero raras o desconocidas en otros (como

Xp22.1-22.2, Xq28). La delecin de ciertos genes individuales
y las deleciones visibles en regiones abundantes en genes seran
letales sin duda.
Sndromes de aneuploida segmentaria. Las microdeleciones
autosmicas rara vez son sndromes de gen contiguo verdade
ros. Por lo general el fenotipo en heterocigotos depende slo de
un subgrupo de los genes eliminados, los que son sensibles a
dosis (fig. 16-10). Varios sndromes bien definidos se producen
por microdeleciones nuevas recurrentes (Budarf y Emanuel,
1997). Las regiones propensas a delecin estn flanqueadas por
485
repeticiones largas, que permiten recombinaciones alineadas de

modo errneo (fig. 11-7). A menudo las repeticiones contienen
secuencias transcritas que pueden hacer una estructura cromatnica ms abierta y propensa a combinacin. Las inversiones
de algunas de estas regiones de tamao megabase ocurren como
polimorfismos no patgenos comunes que pueden predisponer
a la eliminacin por pareamiento errneo de las repeticiones de
flanqueo (Giglio y cois., 2001).
Resulta muy difcil identificar qu genes en la regin eliminada
causan qu partes del fenotipo de estos sndromes de microdelecin. Tres estrategias son posibles:
Cuadro 16-7A. Clasificacin clnica de las enfermedades del tejido conjuntivo que se mencionan en el texto y en el cuadro 16-7B.
Enfermedad
MIM nm.
Caractersticas
0I tipo I (dividida segn hallazgos

dentales en IA, IB, IC)
166200 (166240)
Fragilidad sea leve a moderada; esclerticas azules; estatura normal; prdida de la

audicin (50%)
OI tipo II
166210
Fragilidad sea muy grave; letal perinatal
OI tipo III
(166230)
Fragilidad sea moderada a grave; deformacin progresiva; estatura muy corta; con
frecuencia prdida de la audicin
OI tipo IV (dividida segn hallazgos

dentales en IVA, IVB)
166220
Fragilidad sea leve a moderada; esclerticas normales; estatura variable
DEE
183900
Estatura baja, cuello corto, displasia espondiloepifisaria
Sndrome de Stickler
108300
DEE leve, paladar hendido, miopa intensa, prdida de la audicin
Displasia de Knest
156550
Estatura baja desproporcionada; cuello corto; DEE, etctera
SED tipo VII
130060
Articulaciones y piel laxas
01, osteogenesis imperfecta (enfermedad de huesos frgiles); DEE, displasia espondiloepifisaria; SED, sndrome de Ehlers-Danlos.
Cuadro 16-7B. Clasificacin molecular de las enfermedades del tejido conjuntivo que se mencionan en el texto y en el cuadro
16-7A.
Gen
Localizacin
Mutaciones
Sindrome
C0L1A1
17q22
Alelos nulos
0 l tipo I
Deleciones parciales; sustituciones en la terminal C
01 tipo II
Sustituciones en la terminal N
01 tipos I, III o IV
Delecin del exn 6
SED tipo VII
Mutaciones de empalme; deleciones de exn
01 tipo I
Mutaciones en la terminal C
01 tipos II, IV
Sustituciones en la terminal N
01 tipo III
Delecin del exn 6
SED tipo VII
Mutaciones de punto
DEE
Mutacin sin sentido
Sindrome de Stickler
Defecto en la conversin
Displasia de Kniest
Sentido errneo
Acondrognesis II, displasia espondilometaepifisaria
Mutacin de empalme
Sindrome de Stickler
C0L1A2
C0L2A1
C0L11A2
7q22.1
12q13
6p21.3
486
CAPTULO DIECISIS ! PATOLOGA MOLECULAR
encontrar a las personas que tienen un componente del sndro

me heredado como padecimiento mendeliano causado por
mutacin de un gen nico dentro de la regin candidato;
encontrar a las personas que tienen microdeleciones ms pe
queas de lo normal y que slo muestran caractersticas parcia
les del sndrome;
eliminar la regin correspondiente en el ratn: cruzar los rato
nes con la delecin con ratones transgnicos para genes indivi
duales de la regin y correlacionar el fenotipo con la extensin
de la haploinsuficiencia restante.
El sndrome de Williams (SWL) (WLS; MIM 194 050) constituye
un buen ejemplo de los problemas. Las personas con SWL tienen
una cara reconocible, retraso del crecimiento, durante la lactancia
pueden padecer hipercalcemia que pone en peligro la vida y a me
nudo presentan estenosis artica supravalvular (EASV). Adems
suelen tener retraso mental moderado, casi del mismo grado que el
de las personas con sndromes de Down, pero poseen un perfil cog
noscitivo y una personalidad muy caractersticos. Son muy socia
bles y con frecuencia muy musicales, hablan notablemente bien
pero tienen una incapacidad especfica para manipular formas, (ha
bilidad constructiva visuoespacial). El SWL se debe a una delecin
de 1.6 Mb, resultado de la recombinacin entre repeticiones de
flanqueo, en especial en personas heterocigotas para una inversin
comn de la regin total (Osborne y cois., 2001). Se identificaron
alrededor de 20 genes en la regin eliminada (Tassabehji y cois.,
1999). La identificacin de los genes importantes entre todos los
eliminados en el SWL podra mostrar un camino para identificar
determinantes genticos de la cognicin y la conducta humanas
normales.
Como se mencion (seccin 16.4.1), la estenosis artica supra
valvular (EASV) puede deberse a delecin o alteracin del gen de
elastina. Este gen se encuentra dentro de la regin crtica de Wi-
lliams y sin duda la haploinsuficiencia para elastina es la causa de la

estenosis artica supravalvular que se observa en el sndrome de
Williams. Aunque es posible que las caractersticas faciales tambin
se deban a una deficiencia de esta protena de tejido conjuntivo, re
sulta obvio que no es el caso porque las personas con mutaciones
de elastina simples suelen tener EASV pero no presentan la cara de
Williams. Hasta la fecha ninguna otra caracterstica del sndrome
se atribuye convincentemente a ninguno de los otros genes en la re
gin. Al parecer las personas con deleciones parciales de la regin
tienen slo EASV o el sndrome completo. Una pregunta interesan
te es si sera factible reconocer en ratones el fenotipo de Williams.
Tambin otros sndromes por microdelecin se relacionan con con
ductas especficas y por tanto el descubrimiento de los genes
constitutivos de estos sndromes es un rea de gran inters e inves
tigacin en la actualidad.
16.8.2 Los principales efectos de las aneuploidas

cromosomicas pueden deberse a desequilibrios
de dosis en unos cuantos genes identificables
Es probable que las monosomas y las trisomas deban sus fenoti
pos caractersticos a unos cuantos efectos gnicos mayores super
puestos en muchas alteraciones menores del desarrollo. Los genes
en que 50% de aumento de la dosis tiene un efecto mayor deben
ser muy raros y por consiguiente ha de ser posible identificar los
pocos genes que causan las principales caractersticas, por ejemplo,
del sndrome de Down (SD). Estudios de pacientes con transloca
ciones muestran que la regin crtica de SD se encuentra en
21 q22.2; las trisomas de otras partes del cromosoma 21 no ocasio
nan SD. En esta regin se identificaron cuando menos dos genes
candidato para las caractersticas del sndrome de Down: DYRK,
un gen cuyos homlogos en Drosophila y en el ratn (minicerebro)
Cuadro 16-8. Sndromes relacionados con microdeleciones cromosomicas.

Los sndromes causados por haploinsuficiencia de un gen aislado suelen observarse en pacientes que no tienen una microdelecin, sino una mutacin
de punto en el gen
Sindrome
MIM num.
Localizacin
Tipo de anomala
Wolf-Hirschhorn
194190
4p16.3
Aneuploida segmentaria
Maullido de gato
123450
5p15.2-p15.3
Williams
194050
7q11.23
Langer-Giedon
150230
8q24
Gen contiguo (TRPS1, EXT1)
WAGR
194072
11 p13
Gen contiguo (PAX6, WT1)
Prader-Willi
176270
15q11 -q13
Aneuploida segmentaria (ausencia de copia paterna)
Angelman
105830
15q11 -q13
Ausencia de UBE3A materno
Rubinstein-Taybi
180849
16p13.3
Haploinsuficiencia para CBP
Miller-Dieker
247200
17p13.3
Gen contiguo {LIS1, YWHAE, etc.)
Smith-Magenis
182290
17p11.2
Alagille
118450
20p12.1
Haploinsuficiencia para JAG1
Di George/VCFS
192430
22q11.21
WAGR, tum or de Wilms, aniridia, anormalidades congnitas, retraso mental; VCFS, sndrome velocardiofacial.
BIBLIOGRAFA
Varones con deleciones del

cromosoma X
487
Pacientes heterocigotos Paciente sin

para deleciones autosmicas delecin
M apa
Mapa X
autosmico
Xi +
A,
X2
A2
X3
A3
X4
A4
A5
A6
a7
A,8
Fenotipo
del paciente:
X6
+
X,
+
X4
Flg. 16-10. Sndromes de microdelecin ligados a X y autosmicos.

En el cromosoma X, la delecin de los genes X, o X5 es letal en varones. Los pacientes 1 a 3 muestran una serie anidada de sndromes de gen contiguo,
en tanto que el paciente 4 tiene un sndrome de gen contiguo diferente. En el autosoma, slo el gen A5 es sensible a dosis. Los pacientes 5 a 7, con
deleciones de diferente tamao, muestran el mism o fenotipo del paciente 8, que es heterocigoto para una mutacin de punto con prdida de la funcin
en el gen A5.
producen defectos del aprendizaje sensibles a dosis (Aitafaj y cois.,

2001) y DSCAM, una molcula de adherencia celular que se expre
sa en el sistema nervioso en desarrollo y en el corazn (Barlow y
cois., 2001).
La monosoma y trisoma del cromosoma X despiertan inters
particular porque la inactivacin de X debera tornarlos asintomticos en tejidos somticos. Sin embargo, no todos los genes ligados
a X estn inactivados. Las anormalidades esquelticas del sndrome
de Turner son causadas por haploinsuficiencia para SHOX, un gen

homeobox en la regin seudoautosmica Xp/Yp (seccin 2.3.3, fig.
12-15) (Clement-Jones y cois., 2000). Es probable que otras carac
tersticas somticas surjan de haploinsuficiencia de otros genes que
escapan a la inactivacin de X y que tienen una contraparte Y fun
cional (vase fig. 12-14). Puesto que slo se conocen 18 de estos ge
nes (Lahn y Page, 1997), la lista de posibles candidatos parece
manejable.
Dipple KM, McCabe ERB (2000) Phenotypes of patients with
'simple' Mendelian disorders are complex traits: thresholds,
modifiers and system dinamics. Am. J. Hum. Genet. 66, 17291735.
Scriver CR, Waters PJ (1999) Monogenic traits are not simple:
lessons from phenylketonuria. Trends Genet. 15, 267-272.
Weatherall DJ (2001) Phenotype-genotype relationships in mono

genic disease: lessons from the thalassaemias. Nature Rev. Ge
net. 2, 245-255.
Weatherall DJ, Clegg JB, Higgs DR, Wood WG (2001) The he
moglobinopathies. En: The Metabolic and Molecular Basis of In
herited Disease, 8a. ed. Edn (eds CR Scriver, AL Beaudet, WS Sly,
D Valle). McGraw Hill, New York, pp. 4571-4636.
CAPTULO
DIECISIETE
Gentica del cncer

Recuadro 17-1
Dos formas de establecer una serie de mutaciones sucesivas ms probables
491
490
17.1
CAPTULO DIECISIETE
GENTICA DEL CNCER
Introduccin
El cncer es tanto una enfermedad como la etapa final natural de

cualquier organismo multicelular. Todas las personas estn familia
rizadas con la idea darwiniana bsica que seala que una poblacin
de organismos cuya capacidad de reproduccin muestra variacin
hereditaria evolucionar por seleccin natural. Los genotipos que
se reproducen ms rpido o con mayor extensin llegarn a domi
nar las generaciones posteriores, slo para ser sustituidos a su vez
por reproductores ms eficientes an. El factor determinante pue
de ser un incremento en la tasa de mortalidad o una disminucin
de la misma. Justo lo mismo se aplica a la poblacin de clulas que
constituye un organismo multicelular como el hombre. El naci
miento y la muerte celulares estn controladas genticamente y si
la m utacin som tica crea una variante que prolifera con mayor ra
pidez, la clona mutante tender a hacerse cargo del organismo. Por
consiguiente el cncer puede considerarse como un proceso evolu
tivo natural.
Los cnceres son el resultado de una serie de mutaciones som
ticas y en ciertos casos tambin de una predisposicin hereditaria.
Pueden clasificarse segn los tejidos de origen (los carcinomas de
rivan de clulas epiteliales, las leucemias y los linfomas de precur
sores de clulas sanguneas, etc.) y la histologa que se observa al
microscopio (fig. 17-1). El uso reciente de arreglos de expresin
para mostrar el patrn total de expresin gnica en un tumor (va
se fig. 17-18) promete refinar an ms la clasificacin. Estas divi
siones son importantes para establecer el pronstico y el
tratamiento, pero no explican cmo evolucion el cncer. El obje
tivo de la gentica del cncer es comprender la va mutacional y se
lectiva de mltiples pasos que permiti que una clula somtica
normal originara una poblacin de clulas cancerosas proliferantes
e invasoras. Conforme se descubren acontecimientos moleculares
fundamentales, los patlogos disponen de nuevos indicadores pro
nsticos.
La gentica del cncer puede ser muy confusa. Cada tumor es
individual. Existen tantos genes diferentes que adquieren mutacio
nes en uno u otro tumor y a continuacin interactan en formas
tan complejas que es fcil perderse en un mar de detalles. En este
captulo se intentar evitar confusiones mediante la concentracin
en los principios de la tumorignesis, como se comprende en la ac

tualidad, en lugar de catalogar genes y mutaciones.
1 7 .2
Evolucin del cncer
Como ya se describi, las clulas se encuentran bajo una presin se

lectiva potente para evolucionar a clulas tumorales. Pero si bien los
tumores tienen mucho xito como clulas, como organismos son
fracasos desesperados. No dejan descendientes ms all de la vida de
su husped. Por tanto, a nivel del organismo total, hay un seleccin
potente para mecanismos que evitan que una persona muera por un
tumor, cuando menos hasta que tuvo xito y cri a sus hijos. En
consecuencia el hombre est regulado por dos grupos opuestos de
fuerzas selectivas. No obstante, la seleccin para tumorignesis es a
corto trmino, en tanto que la seleccin para resistencia es a largo
plazo. La evolucin de una clula somtica normal en un tumor ma
ligno ocurre durante la vida de una persona y tiene que comenzar de
nuevo con cada nuevo individuo. Sin embargo, un organismo con
un buen mecanismo antitumoral lo transmite a su descendencia, en
la que contina en evolucin. Mil millones de aos de evolucin do
taron al hombre de mecanismos de engrane y superposicin compli
cados para protegerlo contra tumores, cuando menos durante su
vida reproductiva. Las posibles clulas tumorales se reparan y regre
san de nuevo a la lnea o bien a destruirse por s mismas (apoptosis).
Ninguna mutacin aislada puede evitar estas defensas y convertir
una clula normal en otra maligna. Hace mucho tiempo los estudios
de la dependencia del cncer en la edad sugirieron que se requieren
en promedio seis a siete mutaciones sucesivas para convertir una c
lula epitelial normal en un carcinoma invasor. En otras palabras, una
clula normal puede convertirse en un tumor maligno slo si la mi
tad de una docena de defensas independientes es incapacitada por
mutaciones (fig. 17-2).
La posibilidad de que una clula aislada sufra seis mutaciones
independientes es insignificante, lo que sugiere que el cncer debe
ser cada vez ms raro. Sin embargo, dos mecanismos generales
pueden permitir que la progresin ocurra (recuadro 17-1). No
obstante, como la acumulacin de todas estas mutaciones requie
re tiempo, el cncer es sobre todo una enfermedad de la vida pos-
Fig. 17-1. Histologa de tum ores.

Etapas en el desarrollo de un carcinoma. Tres cortes histolgicos de mucosa bucal, teidos con hematoxilina y eosina, que muestran las etapas del
desarrollo de cncer bucal. A) Epitelio normal. B) Epitelio displsico, que es un cambio potencialmente premaligno. El epitelio muestra crecimiento y
maduracin desordenados, clulas anormales e incremento de mitosis. C) Cncer originado del epitelio superficial que invade los tejidos conjuntivos
subyacentes. Los islotes del tum or (carcinoma) muestran diferenciacin desordenada, clulas anormales y mayor nmero de mitosis atpicas. Los
anatomopatlogos utilizan estos cambios de la arquitectura tisular para identificar y graduar los tumores. Cortesa del doctor Nalin Thakker.
17.3
Mutacin num. 1
Mutacin nm. 2
Crecimiento selectivo
de la clona con
mutacin nm. 1
ONCOGENES
491
Mutacin nm. 3
Crecimiento selectivo
de la clona con
mutaciones 1+2
Continuacin de la
evolucin mediante
seleccin natural
Fig. 17-2. Evolucin del cncer en mltiples etapas.

Cada mutacin sucesiva proporciona a la clula una ventaja en el crecimiento, de manera que forma una clona expandida, que en consecuencia presentan
un blanco ms grande para la mutacin siguiente.
reproductiva, cuando la presin selectiva para mejorar an ms las

defensas es poca.
Si se consideran los genes que son blanco de estas mutaciones,
es posible distinguir dos categoras amplias, aunque, como sucede
siempre en biologa, hay ms medios para pensar respecto al cncer
que clasificaciones sin argumentos exclusivas.
Oncogenes (seccin 17.3). Son genes cuya actividad normal
promueve la proliferacin celular. Las mutaciones de ganancia
de funcin en clulas tumorales crean formas que muestran ac
tividad excesiva o inapropiada. Un alelo mutante aislado pue
de afectar el fenotipo de la clula. Las versiones no imitantes se
denominan con propiedad protooncogenes.
Genes supresores de tumor (ST) (seccin 17.4). Los produc
tos de los genes ST inhiben acontecimientos que conducen al
cncer. Las versiones mutantes en las clulas de cncer perdie
ron su funcin. Algunos productos gnicos de ST impiden la
progresin inapropiada del ciclo celular, otros desvan clulas
hacia la apoptosis, en tanto que varios mantienen estable el genoma y las tasas de mutacin bajas para asegurar la replicacin,
la reparacin y la segregacin precisas del DNA celular. Es ne
cesario investigar ambos alelos de un gen ST a fin de cambiar
la conducta de la clula.
Por analoga con un autobs, es posible imaginar que los oncoge
nes son el acelerador y los genes supresores de tumor, el freno. La
presin del acelerador (una ganancia de funcin dominante de un
oncogen) o la falla de todos los frenos (una prdida recesiva de
funcin de un gen ST) determinarn que el autobs corra fuera
de control.
17.3
Oncogenes
17.3.1 Histeria de los oncogenes

Los oncogenes se descubrieron en el decenio de 1960 cuando se reco
noci que ciertos cnceres de animales (en especial leucemias y linfomas) eran causados por virus. Algunos de los virus tenan genomas
DNA hasta cierto punto complicados (virus SV40, papilomavirus),
pero otros eran retrovirus de transformation aguda con genomas RNA
muy simples. El genoma de un retrovirus estndar posee slo tres uni
dades de transcripcin: gag, protenas de codificacin interna; poL, co
dificacin de polimerasa, y env, codificacin de protenas de envoltura
(cada transcrito se corta para codificar varias protenas). El descubri
miento de que las propiedades transformantes de los retrovirus que se
transforman en forma aguda se deban por completo a que posean un
gen extra, el oncogen, despert una gran excitacin. Durante poco
tiempo algunos investigadores entusiasmados esperaban explicar la to
talidad del cncer mediante la infeccin con virus que llevan oncoge
nes cuya accin podra bloquearse una vez que se identificaran.
Algn tiempo despus los investigadores descubrieron que los
oncogenes virales eran copias de genes celulares normales, los p ro
tooncogenes, que se incorporaron de manera accidental en las part
culas retrovirales. Las versiones virales eran activadas de alguna
manera y ello les permita transformar clulas infectadas. La mayor
parte de los cnceres del hombre no depende de virus, pero de cual
quier modo sus protooncogenes residentes se activaron. A finales del
decenio de 1970 se desarroll una valoracin para detectar oncoge
nes celulares activados. Clulas de fibroblastos del ratn NIH-3T3
se transfectaron con fragmentos de DNA aleatorios de tumores hu-
Recuadro 1~-1. Dos formas de estab lec er una serie de m utaciones sucesivas m s probables
El cambio de una clula epitelial normal en una clula cancerosa maligna
tal vez requiera seis mutaciones especficas en la clula. Si una tasa de
mutacin tpica es de 10 7 por gen por generacin celular, resulta cada
vez menos probable que una clula sufra tantas mutaciones (que es la ra
zn por la que la mayoria de los humanos est viva). La probabilidad de
que esto suceda a cualquiera de las 1013 clulas en una persona es 1013
x 1 0 42 o 1 en 1029. No obstante, el cncer ocurre por una combinacin
de dos mecanismos:
algunas mutaciones incrementan la proliferacin celular y crean una
poblacin blanco de clulas expandida para la siguiente mutacin
(fig. 17-2);
algunas mutaciones afectan la estabilidad de la totalidad del genoma,

a nivel del DNA o cromosmico, e incrementan el ndice total de m u
taciones.
Como los cnceres dependen de estos dos mecanismos, se desarrollan
en etapas, a partir de hiperplasia de tejido o crecimientos benignos, en
tanto que las clulas de tumores malignos suelen anunciar su inestabili
dad genmica por sus cariotpos caprichosos (fig. 17-10).
492 I CAPTULO DIECISIETE
GENTICA DEL CNCER
manos. Algunas de las clulas se transformaron y fue factible aislar

el DNA humano causal de las transformadas elaborando una biblio
teca genmica de fagos y seleccionando para la repeticin humana
especfica Mu. Los oncogenes identificados en los fragmentos de
transformacin incluyeron muchos ya conocidos por estudios vira
les. Vase Bishop (1983; Lecturas adicionales) para las descripciones
de este trabajo inicial respecto a retrovirus y oncogenes celulares.
17.3.2 Funciones de los oncogenes

El conocimiento funcional de los oncogenes inici en 1983 cuan
do se descubri que el oncogen viral v-sis (el prefijo v- denota un
oncogen viral) se derivaba del gen del factor B del crecimiento de
rivado de plaquetas celular normal (PDGFB). La expresin excesi
va no controlada de un factor de crecimiento sera una causa obvia
de hiperproliferacin celular. En la actualidad se conocen las fun
ciones de muchos oncogenes celulares (en sentido estricto, protooncogenes) (cuadro 17-1). Por fortuna result que controlaban
justo la clase de funciones celulares que cabra predecir que estaban
alteradas en el cncer. Es posible distinguir cuatro clases amplias;
factores de crecimiento secretados (p. ej., SIS)]
receptores de superficie celular (como ERBB y FMS);
componentes de sistemas de transduccin de seal intracelulares (p. ej., la familia RAS y ABL);
protenas nucleares de enlace de DNA, inclusive factores de
transcripcin (como MYC, JUN)\
componentes de la red de ciclinas, cinasas dependientes de ciclinas e inhibidores de cinasa que rigen la progresin a travs
del ciclo celular (como MDM2).
Si los oncogenes se definen como genes que sufren mutaciones ac
tivadores dominantes en tumores, en la actualidad se conocen un
poco ms de 100.
17.3.3 Activacin de protooncogenes

Algunas de las mejores ilustraciones de la patologa molecular en
accin las proporcionan las diversas formas en que los protoonco-
genes pueden activarse (cuadro 17-2). La activacin comprende

una ganancia de funcin, que puede ser cuantitativa (un incremen
to en la elaboracin de un producto no alterado) o cualitativa (sn
tesis de un producto modificado sutilmente como resultado de una
mutacin, o un producto nuevo a partir de un gen quimrico crea
do por un reordenamiento cromosmico). Estos cambios son do
minantes y por lo general slo afectan un alelo aislado del gen.
Blume-Jensen y Hunter (2001) presentaron ejemplos adicionales
que ilustran los mecanismos que se describen a continuacin.
Activacin por amplificacin

Muchas clulas cancerosas contienen mltiples copias de onco
genes con estructura normal. Con frecuencia los cnceres de ma
ma amplifican ERBB2 y a veces MYC; un gen relacionado
NMYC suele amplificarse en los neuroblastomas y rabdomiosarcomas en etapa tarda. Es posible que haya cientos de copias ex
tra. Pueden existir como corpsculos de cromatina pareados
pequeos, separados de los cromosomas (dim inutos dobles), o in
serciones en cromosomas normales (regiones que se tien d e m a
nera hom ognea, RTH). Los acontecimientos genticos que los
producen pueden ser muy complejos porque suelen contener se
cuencias derivadas de varios cromosomas distintos (revisado por
Pinkel, 1994). Se observan amplificaciones gnicas similares en
clulas expuestas a regmenes de seleccin artificial potentes -por
ejemplo, los genes de reductasa de dihidrofolato amplificados en
clulas seleccionadas para resistencia al metotrexato-. En todos
los casos el resultado es un incremento considerable del nivel de
expresin gnica.
La amplificacin de oncogenes en tumores puede estudiarse
mediante hibridacin genm ica comparativa (HGQ (Forozan y cois.,
1997). El anlisis tambin revela cualquier regin de prdida o
aneuploida de alelos, que puede indicar genes supresores de tumor
(vase ms adelante). En la prueba de HGC se utiliza una mezcla
de DNA de clulas normales testigo y tumorales en hibridacin
competitiva. Las dos muestras se marcan con fluoros rojo y verde,
mezclados, y se emplean como una sonda de hibridacin. Se obser
va la relacin de la seal de hibridacin roja con la verde. La HGC
puede realizarse en dos formas:
Cuadro 1 7 -1 . Oncogenes virales y celulares.

Enfermedad viral
v-onc
c-onc
Localizacin
Funcin
Sarcoma simiano
v-sis
PDGFB
22q13.1
Subunidad
Eritroleucemia de polios
v-erbb
EGFR
7p12
Receptor del factor de crecimiento epidrmico
Sarcoma felino de McDonough
v-fms
CSF1R
5q33
Receptor del factor estimulante de colonias de macrfagos
Sarcoma de la rata de Harvey
v-ras
HRAS
11 p15
Componente de la transduccin de seal de la proteina G
Leucemia del raton de Abelson
v-abl
ABL
9q34.1
Cinasa de tirosina protenica
Sarcoma 17 aviario
v-jun
JUN
1p32-p31
Factor de transcripcin AP-1
Mielocitomatosis aviaria
v-m yc
MYC
8q24.1
Factor de transcripcin de enlace de DNA
Osteosarcoma del raton
v-fos
FOS
14q24.3-q31
Factor de transcripcin de enlace de DNA
Bdel factor de crecimiento derivado de plaquetas
En ocasiones los genes virales se designan v-src, v-m yc, etc., y sus correspondientes celulares c-src, c-m yc, etc. Las formas de los genes c-onc en
clulas normales se denominan con propiedad protooncogenes. En la actualidad es frecuente ignorar estas distinciones y utilizar slo el trmino onco
genes para los genes normales. Las versiones anormales pueden describirse como oncogenes activados.
17.3
ONCOGENES
493
Cuadro 1 7 -2 . Cuatro formas de activacin de (proto)-oncogenes.

M e ca n ism o de activacin
Oncogn
Tum or
Amplificacin
ERBB2
Cncer de mama, ovario, gstrico, pulmonar de clula no

pequea, de colon
NMYC
Neuroblastoma
HRAS
Cncer de vejiga, pulmn, colon, melanoma
KIT
Tumores estromticos gastrointestinales, mastocitosis
Reordenamiento cromosmico que crea un nuevo gen quimrico
[Many]
Vase cuadro 17-3
Translocacin a una regin de cromatina con actividad transcripcional
MYC
Translocacin al locus de cadena pesada de la inmunoglobulina

por t(8;14) en el linfoma de Burkitt
Mutacin de punto
hibridacin genmica comparativa (HGC) estndar (fig. 17-3A)

que hibrida las muestras mezcladas a dispersiones de cromoso
mas normales en portaobjetos para microscopio (hibridacin de
fluorescencia in situ, seccin 2.4.3). La relacin de la seal de
HFIS roja con la verde se grafica a todo lo largo de cada cromo
soma y se eliminan regiones en las que la relacin se desva del
1:1 esperado, medido por un intervalo de confianza. Segn la di
reccin de la desviacin, esto marca regiones de amplificacin o
de prdida de alelos en el tumor. La alteracin ms pequea vi
sible con esta tcnica tiene alrededor de 3 Mb;
el reordenamiento-HGC (fig. 17-3B) utiliza DNA microarreglado en lugar de cromosomas para la hibridacin. El DNA en cada
punto se hace mediante PCR-DOP (seccin 5.2.4) de una clona
BAC a partir de una localizacin cromosmica definida. Ello
puede ofrecer una resolucin mucho ms alta, limitada slo por
el nmero de BAC en el arreglo. La mejor en la actualidad son
3 000 BAC para una resolucin de 1 Mb. Una ventaja adicional
sobre la HGC convencional es que cualquier secuencia amplifica
da o eliminada se identifica de inmediato a nivel de las secuencias
del DNA, en lugar de localizaciones por bandeo cromosmico.
Activacin por mutacin de punto

Las tres familias gnicas RAS, HRAS, KRAS y NRAS, que median el
sealamiento mediante receptores acoplados a protena G (Lowy y
Willumsen, 1993), se activan en una gran variedad de tumores. El
enlace de ligandos a los receptores desencadena el enlace de GTP a
la protena RAS, y GTP-RAS transmite la seal de manera progre
siva en las clulas (vase fig. 3-5). Las protenas RAS tienen activi
dad de GTP-asa y GTP-RAS se convierte con rapidez en GDP-RAS
inactivo. Las mutaciones de punto activadoras especficas en genes
HAS suelen encontrarse en las clulas de una diversidad de tumores
que incluye los cnceres de colon, pulmn, mama y vejiga. La pro
tena RAS mutante tiene una actividad de GTP-asa reducida, de
manera que GTP-RAS se inactiva ms lentamente y da lugar a una
respuesta celular excesiva a la seal proveniente del receptor.
Activacin mediante una transtocacin que crea un gen

quimrico nuevo
Este mecanismo es raro en carcinomas (tumores epiteliales) pero fre
cuente en tumores hematolgicos y sarcomas. El mejor ejemplo que
se conoce es el cromosoma Philadelphia (Ph), un cromosoma acro-
cntrico pequeo que se observa en 90% de los pacientes con leucemia

mieloide crnica. Este cromosoma es un producto de una transloca
cin recproca equilibrada 9;22. El punto de rotura en el cromosoma
9 se encuentra dentro de un intrn del oncogen ABL. La translocacin
une la parte 3' de la secuencia genmica ABL con la parte 5' del gen
BCR (del ingls reakpoint dbster regin, regin de punto de rotura
del grupo,) en el cromosoma 22 y crea un gen de fusin nuevo (Chissoe y cois., 1995). Este gen quimrico se expresa para producir una cinasa de tirosina relacionada con el producto ABL pero con propiedades
de transformacin anormales (fig. 17-4A).
En la actualidad se reconocen muchos puntos de rotura espec
ficos de tumor y se identifican muchos oncogenes clonndolos
(cuadro 17-3). En el sitio de red Cncer Genome Anatomy Project
(Mitelman y cois., 2002) es posible buscar una base de datos de unas
40 000 aberraciones cromosmicas en el cncer.
Activacin por transtocacin en una regin efe cromatina

con actividad transcripeiona
El linfoma de Burkitt es un tumor de la niez frecuente en regio
nes paldicas de Africa Central y Papua Nueva Guinea. Se piensa
que los mosquitos y el virus Epstein-Barr desempean cierta fun
cin en la causa, pero la activacin del oncogen MYC es un hecho
central. En 75 a 85% de los pacientes (fig. 17-4B) se observa una
translocacin cromosmica caracterstica, t(8;l4) (q24;q32). El
resto tiene t(2;8)(pl2;q24) o t(8;22)(q24;ql 1). Cada una de las
translocaciones coloca el oncogen MYC cerca de un locus de inmunoglobulina, IG H en 14q32, IG K en 2pl2 o IGL en 22ql 1. A di
ferencia de las translocaciones especficas de tumor que se muestran
en el cuadro 17-3, las translocaciones del linfoma de Burkitt no
crean genes quimricos nuevos. Por el contrario, ponen el oncogen
en un ambiente de cromatina que se transcribe de manera activa en
clulas B que producen anticuerpo. Por lo general el exn 1 (que
no es codificante) del gen MYC no se incluye en el material translocado. Con la supresin de sus controles normales corriente arri
ba y su colocacin en un dominio cromatnico activo, MYC se
expresa en un nivel alto inapropiado. Sin embargo, es posible que
no sea todo lo que sucede. Estas translocaciones se producen por la
accin dirigida en forma errnea de las recombinasas especiales que
participan en el reordenamiento del gen V-D-J de inmunoglobulina (seccin 10.6) y a menudo el gen MYC translocado contiene
mutaciones de punto nuevas inducidas como pane del mecanismo
para generar una diversidad de anticuerpos.
494
CAPTULO DIECISIETE GENTICA DEL CNCER
A)
Anlisis HGC-AR
B)
0.5 1.0 1.5
O O
o o
# 9 O O 9

o
o c o
099009
00099
OOOOC
99
90
0 0990
QOO
o ooeooo o
ooco 0 0
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0 900
O OOo o o o
O

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o o

90 O 9
0880C 6 f t e
9 9
9 9 9
090
0000O0Q0009
09 O ' C O
0 0 6 0 0 9 * 0
o o o
o c
=
Dim(2p15p15) Nueva
Confirmada mediante FISH, 4-5 Mb
o c
Anlisis HGC-AR
oc
O o O
9 6 0 0 6 6
O
OO OO O
O O : O O
oo ooo
c :: o c e
f
Enh(1 q21 q21) Nueva
O
O
G
O

9 9 9 9 9 9 0 0 0
Confirmado por anlisis de banda G
09 9 9
:
-
9
99
9 0 9 9 0 9 9 9
0 0 00 O
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9
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O '' O S
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c*o o
oc o
v v. O O
Fig. 17-3. Hibridacin genmica comparativa (HGC).

A) HGC crom osom ica. Anlisis de HGC de alta resolucin de muestras de dos nios dism rficos y con retraso mental cuyos cromosomas bandeados
G parecan normales. La lnea amarilla es el trazo de HGC y la lnea negra el intervalo de confianza de 99% para una relacin 1:1. El primer caso tiene
una delecin nueva pequea que se confirm mediante hibridacin de fluorescencia in situ (FISH); el segundo caso tiene una duplicacin nueva que
puede observarse en retrospectiva en los cromosomas bandeados G. Imgenes cortesa del doctor Claes Lundsteen, Copenhagen. B) Arreglo-HGC.
Fragmentos de PCR-DOP de 321 BAC manchados en un portaobjetos, que a continuacin se hbrido para una mezcla de DNA de una lnea de clulas de
tum or de mama (marcado verde) y DNA de referencia normal (marcado rojo). Los BAC que contienen DNA que se amplifica en el tum or se ven verdes,
los que contienen DNA iluminado en el tum or se ven rojos y los que se encuentran donde el tum or no cambi se ven amarillos. Cada grupo se mancha
por triplicado para permitir variaciones en la eficiencia de la hibridacin. Cortesa del doctor J. Veltman, Nijmegen.
Muchos otros reordenamientos cromosmicos que se producen

por el mismo mecanismo colocan uno u otro oncogen en la cercana
de un gen de mmurioglobulina (IGG) o un gen de receptor de clu
la T ( TCR) (Snchez-Garca, 1997). Estos reordenamientos son ca
ractersticos de leucemias y linfomas, pero no de tumores slidos.
1 7 .4
Genes supresores de tum or
17.4.1 El paradigma del retinoblastoma

Stanbridge (1990; vase Lecturas adicionales) describi la base del
conocimiento de los genes supresores de tumor (ST). Un hecho
sobresaliente temprano fue el trabajo de Knudson en 1971 res
pecto al retinoblastoma (revisado por Knudson, 2001). Es un
cncer agresivo de la niez que se desarrolla a partir de retinoblastos, una poblacin pasajera de clulas que se dividen con rapidez,
se diferencian mal y que, en la analoga del autobs que ya se co

ment, conducen de manera peligrosa y por consiguiente se
transforman con relativa facilidad. Alrededor de 40% de los casos
es familiar. Se heredan como un carcter dominante incompleta
mente penetrante (MIM 180 200). Los casos familiares suelen ser
bilaterales, en tanto que las formas espordicas siempre son uni
laterales. Knudson seal que la distribucin por edad de inicio
de casos bilaterales era compatible con una mutacin nica, en
tanto que los casos espordicos seguan cinticas de dos golpes.
Razon que todos los retinoblastomas incluan dos golpes, pe
que en los casos familiares se heredaba un golpe (fig. 17-5). Un
estudio elemental realizado por Cavenee y colaboradores (1983)
comprob la hiptesis de Knudson y estableci el paradigma pa
ra las investigaciones de laboratorio de genes supresores de tumor
(ST).
Cavenee y colaboradores tipificaron material tumoral extirpado
por medios quirrgicos de pacientes con retinoblastoma espordi-
ro
17.4 I GENES SUPRESORES DE TUMOR
A)
d e r (9)
22
Ph1
B)
der (8)
14
der (14)
BCR
ABL
- - R - -B C R
IGH
M Y c - - y - - - - - - - /G H
ABL-
II
I
s' h * i * ii I limn
5'
495
Hi
5 i----- mm ii mi mi
3'
5'
1
3'
MYC
3'
~2
.T
T.
5'
, C1
C3
3'
Gen de fusin
myc
8 .5 kb B C3 R /A B L m R N A
Protena de fusin p210

(cinasa de tirosina con actividad constitucional)
3'
C2
C1
G2
C3
IgH
Aumento de la expresin de protena

MYC con estructural normal
(el exn 1 no es codificante)
Fig. 17-4. Reordenamientos cromosmicos que activan oncogenes.

A) Activacin por cambio cualitativo en t(9;22) en la leucemia mieloide crnica. El gen de fusin BCR-ABL quimrico en el cromosoma Philadelphia
codifica una cinasa de tirosina que no responde a controles normales. Vase Chissone y colaboradores (1995) para mayores detalles. B) Activacin por
cambio cuantitativo en t(8;14) en el iinfoma de Burkitt. El gen MYC del cromosoma 8 est translocado en el gen de cadena pesada de inmunoglobulina.
En clulas B esta regin se transcribe de manera activa, lo que conduce a expresin excesiva de MYC.
co, utilizando una serie de marcadores del cromosoma 13 (se saba

que en ocasiones el retinoblastoma se relacionaba con cambios cro
mosmicos en 13ql 4). Cuando compararon los resultados en
muestras de sangre y tumor del mismo paciente, observaron varios
casos en los que el DNA constitucional (sanguneo) era heterocigoto para uno o ms marcadores, pero al parecer las clulas tumorales eran homocigotas. Razonaron que lo observado era uno de los
"golpes de Rnudson: prdida de una copia funcional de un gen supresor de tumor. Estudios ulteriores confirmaron esta interpreta
cin al demostrar que en casos hereditarios siempre se perda el
alelo de tipo silvestre en esta forma. Mediante la combinacin de
anlisis citogenticos con estudios de marcadores de diferentes re
giones de 13q, Cavenee y colaboradores pudieron sugerir varios
mecanismos para la prdida (fig. 17-6).
Este trabajo tuvo dos implicaciones mayores. Primero, sugiri
que los cnceres espordicos y los familiares podan compartir me
canismos moleculares. Segundo, insinu dos formas de encontrar
genes ST:
mapeo y clonacin posicional de los genes que causan cnceres
familiares;
estudio de tumores para prdidas de material cromosmico es

pecfico.
El cuadro 17-4 incluye una lista de algunos de los genes ST que se
identificaron por medio de estudios de cnceres familiares raros.
Complicaciones del paradigma del retinoblastoma

En retrospectiva, el retinoblastoma es un ejemplo en extremo pre
ciso de un mecanismo de dos golpes, tal vez porque, como se men
cion, los retinoblastos son clulas poco comunes. Varios otros
cnceres siguen muy de cerca el ejemplo del retinoblastoma. APC,
NF2y PTC (cuadro 17-4) son ejemplos en los que se identific un
gen ST mediante la investigacin de un cncer familiar raro que re
sult importante en el cncer espordico correspondiente, pero no
siempre sucede as.
Al parecer algunos cnceres siguen diferentes vas evolutivas en
casos familiares y espordicos. Por ejemplo, BRCA1 slo se inac
tiva en 10 a 15% de los cnceres de mama espordicos y estos tu
mores forman un subgrupo molecular identificable preciso de
cnceres de mama. La inactivacin, cuando ocurre, no se debe a
496
CAPTULO DIECISIETE } GENTICA DEL CNCER
Cuadro 17-3. Genes quimricos producidos por reordenamientos cromosmicos especficos de cncer.
Tumor
Reordenamiento
Gen quimrico
Naturaleza del producto quimrico
LMC
t(9;22)(q34;q11)
BCR-ABL
Cinasa de tirosina
Sarcoma de Ewlng
t(1 1 ;22)(q24;q12)
EWS-FU1
Sarcoma de Ewing (variante)
t(21 ;22)(q22;q12)
EWS-ERG
Melanoma maligno de partes blandas
t(12;22)(q13;q12)
EWS-ATF1
Tumor de clula redonda pequea desmoplsico
t(1 1 ;22)(p13;q12)
EWS-WT1
Liposarcoma
t(12;16)(q13;p11)
FUS-CHOP
LMA
t(16;21)(p11;q22)
FUS-ERG
Carcinoma papilar de la tiroides
inv(1)(q21;q31)
NTRK1 -TPM3(TRK oncogn)
Cinasa de tirosina
Leucemia linfoblastoide aguda preclula B
t(1 ;19)(q23;p13.3)
E2A-PBX1
LLA
t(X;11)(q13;q23)
MLL-AFX1
LLA
T(4;11)(q21;q23)
MLL-AF4
LLA
t(9;11)(q21;q23)
MLL-AF9
LLA
t(1 1 ;19)(q23;q13)
MLL-ENL
Leucemia promieloctica aguda
t(15;17)(q22;q12
PML-RARA
Factor de transcripcin + receptor de

cido retinoico
Rabdomiosarcoma alveolar
t(2;13)(q35;q14)
PAX3-FKHR
LMC, leucemia mielolde crnica; LMA, leucemia mielgena aguda; LLA, leucemia linfoblastoide aguda.
Obsrvese cmo el mismo gen puede participar en varios reordenamientos diferentes. Para mayores detalles vase Rabbitts (1994).
Tumor
Clula som tica en una

persona normal
p e rs o n a n o rm a l; to d a s la s c lu la s
s o m tic a s e n u n a p e rs o n a c o n
re tin o b la s to m a fa m ilia r
Fig. 17-5. Hiptesis de dos golpes de Knudson.

Supngase que hay un milln de clulas blanco y que la probabilidad de mutacin es 1CT5 por clula. El retinoblastoma espordico requiere dos golpes
y afectar a una persona en 10 0 00 (106 x 10 ~5 x 10~5 = 10 -4 ), en tanto que la form a familiar slo necesita un golpe y ser muy penetrante, puesto
que (106 x 10 5 > 1). Vase Knudson (2001) para una tratamiento ms complejo.
los mecanismos cromosmicos que se observan en el retinoblas

toma (fig. 17-6) sino a metilacin del DNA (seccin 17.4.3).
Con frecuencia algunos genes pierden la funcin de un alelo en
tumores, pero el alelo que se conserva parece por completo fun
cional. En ocasiones esto se debe a que el segundo alelo es inactivado por metilacin, que no se detecta mediante alguno de los
mtodos experimentales utilizados, pero algunos casos parecen
ser acontecimientos genuinos de un golpe. Es razonable postular
que hay genes en los que la haploinsuficiencia es suficiente (sec
cin 16.4.2) para proporcionar una ventaja en el crecimiento.
Ms rara vez, existen algunos casos en los que se observan tres

golpes. En la poliposis adenomatosa familiar (seccin 17.5.3
ciertas mutaciones de la lnea germen son dbiles y confieren
un fenotipo atenuado con menos plipos. Los adenomas de es
tos pacientes suelen tener dos mutaciones somticas adems de
la mutacin hereditaria. Una mutacin somtica inactiva el ale
lo de tipo silvestre. Esto proporciona a las clulas una ventaja
en el crecimiento, pero adquieren una ventaja adicional por
una delecin cromosmica que elimina el alelo APC de la lnea
germinal parcialmente funcional.
17.4
GENES SUPRESORES DE TUMOR
497
Marcador A 1 - - - - 2
R B -------+
Marcador B 1 -- -- 2
Fig. 17-6. Mecanismos de prdida del alelo de tipo silvestre en el retinoblastoma.

A) Prdida de la totalidad del cromosoma por falta de disyuncin mittica. B) Prdida seguida de duplicacin para dar (en este caso) tres copias del
cromosoma Rb. C) Recombinacin mittica proximal al locus Rb (CO, seguida por segregacin de ambos cromosomas que llevan Rb a una clula hija (C2);
sta fue la primera demostracin de la recombinacin mittica en humanos, o de hecho en mamferos. D) Delecin del alelo de tipo silvestre. E) Mutacin
de punto patgena del alelo de tipo silvestre (adaptado de Cavenee y cois., 1983). Las figuras inferiores muestran los resultados de la tipificacin del DNA
normal (N) y tumoral (T) de los dos marcadores A y B localizados como se muestra. Obsrvense los patrones de prdida de heterocigosidad.
Cuadro 17-4. Cnceres familiares raros causados por mutaciones del gen supresor de tumor (ST).
Enfermedad
MIM num.
Localizacin en el mapa
Gen
Poliposis adenomatosa del colon familiar
175100
5q21
APC
Cncer de colon no polipsico hereditario
120435,12036
2p16,3p21.3
MSH2, MLH1
Cncer de mama-ovario
113705
17q21
BRCA1
Cncer de mama (inicio temprano)
600185
13q12-q13
BRCA2
Sndrome de Li-Fraumeni
151623
17p13
TP53
Sndrome de nevo de clula basal de Gorlln
109400
9q22-q31
PTC
Ataxia telangiectasia
208900
11q22-q23
ATM
Retinoblastoma
180200
13q14
RB
Neurofibromatosis 1 (enfermedad de Von Recklinghausen) 162200
17q12-q22
NF1
Neurofibromatosis 2 (schwannomas vestibulares)
101000
22q12.2
NF2
Melanoma familiar
600160
9p21
CDKN2A
Enfermedad de Von Hippel-Lindau
193300
3p25-p26
VHL
Pueden encontrarse referencias de los genes de enfermedades en

ciona una lista ms larga.
OMIMbajo el nmero citado. El cuadro 1 de Futreal y colaboradores (2001) propor
498
CAPTULO DIECISIETE
GENTICA DEL CNCER
Fig. 17-7. Cambios genticos en tumores.

A) Prdida de heterocigosidad. La muestra de tejido normal (N) es heterocigota para el marcador D8S522 (flechas), en tanto que la muestra de tumor
(T) perdi el alelo superior. Las bandas ms altas en el gen son bandas de conform acin , bandas subsidiarias producidas por secuencias de cada
alelo dobladas de modo alternativo. Fotografa cortesa del doctor Nalin Thakker, St. M arys Hospital, Manchester, UK. B) In estab ilidad m icro sa tlite en
cnceres de colon no pollpsico hereditario. Anlisis de secuenciador de fluorescencia de cinco microsatlites en tumores CCNPH. Los trazos negros
provienen de DNA constitucional, los rojos de DNA del tum or del m ism o paciente. Las flechas indican nuevos alelos en los tumores. BAT26 y BAT40
son carreras (A)n, D2S123, D8S255 y D13S175 son repeticiones de dinucletido (CA)n. Cortesa de Yvonne Wallis, West Midlands Regional Genetics
Laboratory, Birmlngham, UK.
21 carcinomas bucales de clula escam osa

D 8S264
D 8S262
D 8S518
D 8S277
D 8S265
D 8S552
D 8S511
D 8S549
D 8S254
D 8S 261
D 8S280
LP L
D 8S258
D 8S282
D 8S560
D 8S298
D 8S133
D 8S87
\
D 8S283
\ ------ D 8 S 2 5 9
\ | ------ D 8 S 2 5 5
'------ D 8 S 5 3 8
L o c a liz a c io n e s
de TSG?
Fig. 17-8. Posibles genes supresores de tumor en el cromosoma 8p.

La rejilla muestra resultados de la tipificacin de DNA constitucional y tumoral de una serie de pacientes con tumores bucales, utilizando varios
marcadores (D8S264, etc.) de las localizaciones indicadas en el cromosoma 8p (Wu y cois., 1997). El color rosa indica prdida de heterocigosidad
(LoH); las marcas verdes, retencin; las amarillas, pruebas que proporcionaron resultado equvocos; las grises, pruebas que muestran inestabilidad
microsatlite, y las reas blancas indican cuando los marcadores no fueron informativos por homocigosidad constitucional. Obsrvese el patrn
complejo de LoH en estos tumores, que es tpico de estos estudios. Los datos sugieren la presencia de tres genes ST distintos en 8p.
17.5 I ESTABILIDAD DEL GENOMA ; 499
17.4.2 La seleccin de prdida de heterocigosidad

(LoH) se utiliza con amplitud para intentar
identificar las localizaciones de genes
supresores de tumor (ST)
Cavenee y colaboradores (1983) observaron cmo los cambios ge
nticos somticos en el retinoblastoma causaban LoH en marcado
res cercanos al locus RB. Estudios en otros cnceres confirman el
cuadro general, aunque los mecanismos cromosmicos pueden ser
diferentes (Thiagalingam y cois., 2001). Por tanto si se seleccionan
muestras pareadas de sangre y tumor (por lo general tumores es
pordicos) con marcadores espaciados a travs del genoma se tie
ne la esperanza de descubrir las localizaciones de genes ST (fig.
17-7).
La prueba de LoH ha sido una labor mayor en la investigacin del
cncer durante el ltimo decenio, pero an se est muy lejos de pre
guntar si los resultados justifican el esfuerzo. Para obtener resultados
significativos es necesario seleccionar un panel grande de tumores con
marcadores espaciados en forma cercana. Se emplean marcadores microsatlite muy polimrficos para minimizar el nmero de casos no
informativos en los que el DNA constitucional es homocigoto para el
marcador o de otro modo puede usarse el arreglo-HGC (fig. 17-3B).
Puesto que las clulas de cncer avanzado pueden mostrar LoH en
tanto como una cuarta parte de todos los locus, se requieren muestras
grandes para separar los cambios especficos del fondo general. Los re
sultados sugieren la presencia de un nmero muy grande de genes ST
-la figura 17-8 muestra un ejemplo tpico- y a pesar de los intentos
para seguir estos estudios mediante clonacin posicional se obtiene
una tasa de xitos baja.
C ontam in aci n
dei e stro m a
Clulas
tumorales
LoH
aparente
La figura 17-9 ilustra un error en la interpretacin de los datos de

prdida de heterocigosidad (LoH). Un problema general adicional es
que los tumores suelen tener cariotipos muy anormales con innume
rables anomalas numricas y estructurales (fig. 17-10). Casi nunca
se cuenta con informacin de los cariotipos de los tumores que se uti
liza en estudios de LoH, pero la presentacin de los resultados como
en la figura 17-8 conduce con facilidad a una suposicin no preten
dida de deleciones intersticiales especficas que afectan un cromoso
ma por otra parte normal. De hecho la LoH es un producto de la
inestabilidad cromosmica y la reparacin deficiente de roturas de
DNA de doble cadena que son tan caractersticas de clulas tumorales. Es posible que algunas de las prdidas observadas sean productos
accesorios de patrones especficos de inestabilidad cromosmica, ms
que seleccin para la prdida de un gen ST.
17.4.3 Con frecuencia los genes supresores de tumor

son silenciados epigenticamente por metilacin
Los genes ST pueden silenciarse por delecin (que se refleja por la
prdida de heterocigosidad) o mutaciones de punto, pero un tercer
mecanismo muy frecuente es la metilacin del promotor (vase sec
cin 10.4). De manera global el DNA de la clula tumoral es hipometilado en comparacin con el DNA de clulas normales, pero
casi en cada tipo de neoplasia humana se encuentra metilacin de
dinucletidos CpG especficos en los promotores de genes y se re
laciona con silenciamiento transcripcional inapropiado del gen. Jo
nes y Baylin (2002) listan muchos ejemplos. En algunos genes ST
la metilacin ocurre como una alternativa frecuente a la mutacin
de punto, en tanto que en otros (por ejemplo, RASSFlA en 3p21,
HIC1 en 17pl3.3) la metilacin es el nico mecanismo conocido
para la prdida de funcin especfica de tumor. Las tcnicas estn
dar para seleccin de mutaciones pasan por alto estos cambios, de
manera que es probable que su importancia an se subestime.
1 7 .5
Estabilidad del genom a
\|TSG1
La inestabilidad del genoma es una caracterstica casi universal de

las clulas cancerosas. La inestabilidad puede ser de dos tipos:
\|/TSG2
inestabilidad cromosmica (INC), la forma ms usual. Por lo

general las clulas tumorales tienen cariotipos notablemente
anormales (fig. 17-10), con mltiples cromosomas extra y faltantes, muchos reordenamientos, etc.;
TSG
inestabilidad microsatlite (MIN), una inestabilidad a nivel

del DNA que se observa en unos cuantos tumores, en especial
algunos carcinomas de colon (fig. 17-7B).
Fig. 17-9. Una posible trampa en la interpretacin de datos de LoH.

El acontecimiento verdadero en este tum or es la delecin homocigota
de TSG. A causa de la amplificacin de material estromtico
contaminante (lneas plidas), los datos de LoH muestran retencin de
heterocigosidad en el locus TSG, con LoH en dos regiones de flanqueo
(rosa). El patrn sugiere la existencia de dos locus supresores de
tum or falsos, PTSGI y 'PTSG2. La situacin verdadera se revelara
mediante hibridacin de fluorescencia in situ o con una prueba
nmunohistoqumica para el producto del gen TSG.
Es probable que la inestabilidad sea necesaria para permitir que una

clula acumule suficientes mutaciones (recuadro 17-1). Algunos au
tores argumentan que la inestabilidad es slo un producto accesorio
incidental de la evolucin de un tumor y que el nmero de divisio
nes celulares en poblaciones epiteliales es suficiente para que se acu
mule el nmero necesario de mutaciones, inclusive con tasas estndar
de mutacin. Sin embargo, los tumores suelen mostrar INC o INM,
pero no ambas, y esto sugiere que la inestabilidad no es una caracte
rstica al azar, sino un resultado de seleccin.
17.5.1 Inestabilidad cromosmica

Las mltiples anormalidades cromosmicas que se observan en c
lulas tumorales son sobre todo aleatorias, aunque proporcionan
500
CAPITULO DIECISIETE
GENETICA DEL CANCER
I I
14
15
16
i
17
18
Fig. 17-10. Cariotipo multicolor con FISH (M-FISH) de una lnea de clulas derivadas de leucemia mieloide humana.
Obsrvense las numerosas anormalidades numricas y estructurales (puntas de flecha) reveladas por el pintado cromosmico completo de 24 colores.
stas incluyen t(5;15), der(7)t(7;15), der(8)ins(8;11), der(11)t(8;11), t(1 1 ;17) y der(Y)t(Y;12) -la ltima se muestra mal en esta clula. Imagen cortesa
del doctor Lyndal Karney, Institute of Molecular Medicine, Oxford, UK, de Tosi y colaboradores, 1999, reimpreso con autorizacin de Wlley-Liss Inc.,
una subsidiaria de John Wiley & Sons, Inc.
material para una seleccin ms amplia de variantes de crecimien

to ms rpido. Pueden surgir en tres formas.
Las clulas tumorales pierden el punto d e control d el huso (Jallepalli y Lengauer, 2001; vase ms adelante). Es probable que lo
anterior sea el principal origen de muchas anormalidades nu
mricas.
Las clulas tumorales son capaces de proseguir a travs del ci
clo celular a pesar de tener un DNA daado. Las anormalida
des cromosmicas estructurales pueden ser un producto
accesorio de intentos de replicacin del DNA o de mitosis con
DNA daado.
Los tumores tambin pueden replicarse hasta el punto en que
los telmeros son muy cortos para proteger los extremos de los
cromosomas, lo que conduce a cierta clase de anormalidades
estructurales (vase ms adelante).
Punto de control del huso

El punto de control del huso debe prevenir la segregacin cromosmica en la mitosis hasta que todos los cromosomas estn unidos
de manera correcta a las fibras del huso. El mecanismo molecular
no se comprende bien. Aunque se identifican unos cuantos genes
candidato, se sabe que lo nico que suele estar mutado en las clu
las cancerosas es el gen APCque participa en la poliposis del colon.
El APC codifica una protena multifamiliar muy grande que tal
vez participe en una diversidad de procesos celulares. En el colon se
observa INC aun adenomas muy tempranos, y las clulas APC~~
tienen husos mitticos anormales que conducen a inestabilidad cromosmica.
Sistema de sealamiento de dao del DNA

Las clulas reparan en forma constante todas las clases de dao de
su DNA. La respuesta normal a dicho dao es la detencin del ci
clo celular en tanto el dao se repara y una caracterstica que mu
chos cnceres comparten es la prdida de dicho control. Los
sistemas complejos asombrosos que detectan y sealan el dao del
DNA se conservan en gran parte desde la levadura hasta el hombre
(Zhou y Elledge, 2000). Participa una maquinaria multiprotenica
llamada BASC (BRCA1, del ingls associated genom e surveillance
complex: complejo relacionado de vigilancia del genoma) aunada a
un grupo de otras protenas. Varios genes supresores de tumor bien
conocidos ponen en funcionamiento esta maquinaria:
ATM es un componente de BASC y se encuentra en una parte
temprana del mecanismo que detecta el dao. Esta protena muy
grande releva la seal a una diversidad de blancos corriente aba
jo. La prdida de la fondn de ATM causa ataxia telangiectasia
(AT, MIM 208 900). Los homocigotos afectados sufren una pre
disposicin a varios cnceres, inmunodeficiencia, inestabilidad
cromosmica y ataxia cerebelosa. Los portadores heterocigotos
de ciertas mutaciones ATM especficas tienen mayor riesgo de
cncer de mama;
complejos nibrina con protenas MRE11 y RAD50. Los com
plejos forman parte de BASC y tal vez desempean tambin
otras funciones. La falta de nibrina ocasiona el sndrome de ro
tura de Nijmegen (MIM 251 260). Esta afeccin se asemeja
mucho a la AT desde el punto de vista clnico, pero incluye microcefalia y retraso del crecimiento en lugar de ataxia. La clo
nacin del gen NBS se describe en la seccin 13.5.2;
17.5 | ESTABILIDAD DEL GENOMA
BRCA1, el producto del primer gen que se implica en el cn

cer de mama familiar (seccin 15.6.1), es otra protena muy
grande con mltiples dominios funcionales que forma parte de
BASC. La proteina BRCA1 tambin funciona en la recombi
nacin, la remodelacin de cromatina y el control de la trans
cripcin (Scully y Livingston, 2000).
BRCA2 es una protena que no tiene similitud con BRCA1 pe
ro comparte muchas funciones. Adems de ser la causa de al
gunos cnceres de mama hereditarios, una clase particular de
mutaciones de BRCA2 ocasiona la forma B/D1 de la anemia de
Fanconi (vase MIM 227 650), un sndrome autosmico rece
sivo de anormalidades congnitas, insuficiencia progresiva de la
mdula sea, hipersensibilidad celular al dao del DNA y pre
disposicin a cncer.
Al parecer las clulas con defectos en estas protenas son en parti
cular deficientes para reparar roturas de cadena doble. Es posible
que otros tipos de dao no confen tan intensamente en la detec
cin mediante ese sistema para su reparacin.
Telmeros y estabilidad cromosomica

Como se comenta en la seccin 2.2.5, los extremos de los cromo
somas humanos estn protegidos por una secuencia repetida
(TTAGGG)n, que se conserva por un sistema enzimtico especial
que contiene RNA, la telomerasa. La telomerasa se encuentra en la
lnea germinal humana pero no en la mayor parte de los tejidos so
mticos y la longitud del telmero declina 50 a 100 pb con cada
generacin celular. En cultivo prolongado, las clulas normales lle
gan a un punto de envejecim iento en el que dejan de dividirse. Los
fibroblastos deficientes en p53 y la proteina del retinoblastoma
pRb, o que alojan oncoprotenas virales, continan ms all del en
vejecimiento y producen crisis. Casi todas las clulas mueren, pero
las nicas con IO7 o casi que sobreviven muestran anormalidades
cromosmicas mutables, adquirieron telomerasa y se tomaron in
mortales. Tal vez la crisis represente el punto en que los telmeros
son tan cortos que ya no pueden proteger los extremos cromosmicos contra el reordenamiento.
Por tanto una causa de las anormalidades cromosmicas nota
bles que se observan en clulas tumorales puede ser el agotamiento
de telmeros hasta el punto de crisis a travs de divisiones celulares
excesivas (Maser y DePinho, 2002). Sin embargo, ello no explica la
inestabilidad constante porque, de una manera u otra, las clulas
tumorales siempre adquieren la capacidad para conservar sus tel
meros y replicarse de manera indefinida. Ochenta y cinco a 90%
de los cnceres metastsicos plenamente manifiestos tiene un por
centaje mayor de telomerasa; el resto utiliza un mecanismo distin
to. denominado ALT y basado en recombinacin.
17.5.2 Reparacin de defectos del DNA e inestabilidad

a nivel del DNA
Como se coment, las clulas reparan en forma constante el dao
Je su DNA (Hoeijmakers, 2001) y los defectos en la maquinaria de
'r aracin subyacen a una diversidad de trastornos genticos con
propensin a cncer. Los principales defectos son:
defectos en la reparacin de excisin de nucletidos: las rotu
ras de cadena nica y los enlaces cruzados en el DNA que se
daaron por radiacin ionizante, luz UV o mutgenos qumi
cos deben repararse antes de la siguiente ronda de replicacin
501
(seccin 11.6.1). Se observan defectos en algunas de las en

zimas de reparacin en varios sndromes con propensin a
cncer, en particular las diversas formas de xerodermia pig
mentosa (XP; vase MIM 278 700). Los pacientes con XP
son homocigotos para la prdida hereditaria de mutaciones
funcionales y no son capaces de reparar el dao del DNA
causado por la luz UV. Son en extremo sensibles a la luz so
lar y desarrollan muchos tumores en la piel expuesta;
defectos en la reparacin de excisin de bases: la reparacin de
fectuosa de la excisin de una base rara vez se observa en cn
ceres humanos, pero una forma de cncer de colon se debe a
defectos en la enzima de reparacin MYH (Al-Tassan y col.,
2002 );
defectos en la reparacin de roturas de cadena doble: las rotu

ras de cadena doble se reparan mediante recombinacin homo
loga o unin no homologa de extremos (Hoeijmakers, 2001).
Ambos requieren la maquinaria ATM-NBS-BRCA1-BRCA2
mencionada;
defectos en la reparacin de errores de replicacin: se detecta
ron durante estudios de cncer de colon, como se describe ms
adelante.
17.5.3 Cncer de colon no polipsico hereditario e

inestabilidad microsatlite
Casi todo el cncer de colon es espordico. Los casos familiares co
rresponden a dos categoras:
La poliposis adenomatosa familiar (PAF o PAC; MIM 175
100) es un padecimiento autosmico dominante en el que el
colon se cubre con cientos o miles de plipos. Estos ltimos
(adenomas) no son malignos, pero si no se extirpan es casi se
guro que uno o ms de ellos evolucione a carcinoma invasivo.
La causa es una mutacin hereditaria en el gen supresor de tu
mor (APQ (cuadro 17-4).
El cncer de colon no polipsico hereditario (CCNPH)
(HNPCC; MIM 120 435, 120 436) tambin es autosmico
dominante y de alta penetrancia; no obstante, a diferencia de
la FAP, no existe una fase precedente de poliposis. Los genes del
CCNPH se mapearon en dos localizaciones, 2pl5-p22 y
3p21.3.
Estudios de prdida de heterocigosidad en tumores de CCNPH
arrojaron resultados novedosos e inesperados. En lugar de carecer
de los alelos que se encuentran en el DNA constitucional, los espe
cmenes de tumor al parecer contenan alelos extra, nuevos, de los
marcadores microsatlite utilizados. La figura 17-7B muestra un
ejemplo. La LoH es una propiedad de regiones cromosmicas par
ticulares, pero la inestabilidad microsatlite (MIN) en CCNPH es
general. Aunque muchos tumores muestran inestabilidad ocasional
de uno o unos cuantos microsatlite (vase, por ejemplo, fig. 17-8),
la inestabilidad de alta frecuencia (definida de manera conveniente
como > 29% de todos los marcadores estudiados, vase Tomlinson
y cois., 2002) define una clase de tumores MIN+con caractersticas
clinicopatolgicas precisas.
En un ejemplo maravilloso de pensamiento lateral Fishel y cola
boradores (1993) relacionaron el fenmeno de MIN+con los llama
dos genes mutadores en K coli y levaduras. Estos genes codifican un
sistema de correccin de errores que controla el DNA recin sinteti
zado para pares de bases incompatibles o asas pequeas de insercin-
502 CAPTULO DIECISIETE | GENTICA DEL CNCER
Cuadro 17-5. Genes relacionados con la reparacin del

error de replicacin del DNA.
E. co li
Humanos
MutS
MSH2
2p16
35%
MSH3
5q11-q12
0%?
MSH6
2p16
5%a
MLH1
3p21.3
60%
MLH3
14q24.3
0%?
PMS2
7p22
Muy baja
MutL
Localizacin
en el hombre
% de CCNPH
aCCNPH atpico de inicio tardo y cncer endometrial.

Vase Jiricny y IMystrom-Lahti (2000) para detalles.
delecin. Las mutaciones en los genes MutHLS que codifican el sis

tema de E. coli conducen a un incremento general de 100 a 1 0 0 0 ve
ces en las tasas de mutacin. Fishel y colaboradores clonaron un
C a d e n a recin sin te tiza d a
hM utS a (MSH2 + MSH6)
o c o o o c
Movimiento
impulsado por ATP
(1) R eg reso
(2) R esin te sis
hM utL a (MLH1 + PM S2)
Fig. 17-12. Genealoga atpica del sndrome de Li-Fraumeni.

Las afecciones malignas tpicas del sndrome de Li-Fraumeni incluyen
cncer de mama bilateral diagnosticado a los 40 aos de edad (I-2);
tum or cerebral a los 35 aos de edad (11-1); sarcoma de tejido blando
a los 19 aos de edad y cncer de mama a los 33 aos (II-3); cncer
de mama a los 32 aos edad (II-5); osteosarcoma a los ocho aos de
edad (III-3); leucemia a los dos aos de edad (III-4); sarcoma de tejido
blando a los tres aos de edad (III-5). 1-1 tuvo cncer de colon
diagnosticado a los 59 aos de edad -s e asume que ste no se relaciona
con el sndrome de Li-Fraumeni-, Genealoga de Malkin (1994).
homlogo humano de uno de estos genes, MutS, y demostraron que

se mapea en la localizacin 2p de uno de los genes de CCNPH y que
estaba mutado constitucionalmente en algunas familias con
CCNPH. En todas se implicaron seis homlogos de los genes de E.
coli en la reparacin incompatible humana (Jiricny y Nystrom-Lah
ti, 2000); vase cuadro 17-5 y figura 17-11.
Los pacientes con CCNPH son constitucionalmente heterocigotos para una mutacin de prdida de funcin, casi siempre en
MLH1 o MSH2. Sus clulas normales an tienen un sistema de re
paracin funcional incompatible y no muestran el fenotipo MIN+.
En un tumor, la segunda copia se pierde por uno de los mecanismos
que se muestran en la figura 17-6. Se observa inestabilidad microsatlite en 10 a 15% de los carcinomas colorrectales, endometriales y
del ovario, pero rara vez en otros tumores.
17.5.4 p53 y apoptosis
E x o n u clea sa
P o lim erasa
F a c to re s d e replicacin
Fig. 17-11. Mecanismo de reparacin incompatible.

Los errores de replicacin pueden producir pares de bases incompatibles
o pequeas asas de insercin/delecin. Son reconocidas por hMutSa,
un dmero de las protenas MSH2/MSH6, o en ocasiones por el dmero
MSH2/MSH3 hMutSp. Las protenas se translocan a lo largo del DNA,
o enlazan el dmero MLH1/PMS2 hM utLa, a continuacin ensamblan el
reparosoma completo que retrocede y sintetiza de nuevo la cadena
recin sintetizada. Vase Jiricny y Nystrom-Lahti (2000).
Un contribuyente mayor a la inestabilidad del genoma es la prdi

da o la mutacin de TP53, el gen que codifica el factor de trans
cripcin p53. Es probable que esta prdida sea el cambio gentico
aislado ms frecuente en el cncer. Esto refleja la importancia cen
tral de p53, que se resumi como el guardin del genoma (Vousden, 2000). Como ya se seal, el ciclo celular se detiene en clulas
con DNA daado. Si el dao no es reparable se desencadena apop
tosis. El p53 desempea una funcin crucial en estos procesos. En
condiciones normales los valores de p53 en un clula son bajos por
que la protena se degrada con rapidez. Las seales de una gama
completa de sensores celulares de estrs, inclusive los sensores de
dao, conducen a la fosforilacin y la estabilizacin de p53. Ello in
crementa la transcripcin dependiente de p53 de genes, como
p 2 jW A f i/ c i r i
inhibe el ciclo celular, y PUMA y PIG3 que con
trolan la apoptosis. Las clulas tumorales que carecen de p53 pue
den continuar replicando DNA daado y no sufren apoptosis. Sin
17.6 I CONTROL DEL CICLO CELULAR | 503
embargo, cabe sealar que la prdida de p53 es un acontecimiento

hasta cierto punto tardo en el desarrollo tumoral (vase por ejem
plo, la fig. 17-17); es evidente que las etapas ms tempranas de la
evolucin del tumor no se previenen mediante p53.
Es posible eliminar (knocked out) p53 mediante delecin, muta
cin o por la accin de un inhibidor como el producto gnico
MDM2 (que enlaza p53 y lo marca para su degradacin; MDM2
tambin enlaza pRb, vase ms adelante) o la protena E6 del papilomavirus. TP53 se mapea en 17pl2 y es una de las regiones ms
frecuentes de prdida de heterocigosidad en una gama amplia de tu
mores. Con gran frecuencia las neoplasias que no pierden TP53 tie
nen versiones mutadas del mismo. A fin de completar el cuadro de
TP53 como un gen supresor de tumor (ST) se encuentran mutacio
nes constitucionales en TP53 en familias con el sndrome de LiFraumeni que se hereda en forma dominante (MIM 151 623). Los
miembros de la familia afectados sufren mltiples tumores prima
rios, que suelen comprender sarcomas de tejido blando, osteosarcomas, tumores de mama, cerebro y corteza suprarrenal, y leucemia
(fig. 17-12)
Fig. 17-14. Puntos de control del ciclo celular.
17.6
Control del ciclo celu lar
Toda clula tiene tres conductas para elegir en cualquier poca: per
manecer esttica, dividirse o morir (apoptosis). Algunas tambin
tienen la opcin de diferenciarse. Las clulas eligen una de estas op
ciones en respuesta a seales internas y externas (fig. 17-3A). Los
oncogenes y los genes supresores de tumor desempean funciones
fundamentales en la generacin y la interpretacin de estas seales.
A)
E sta sis
D iferenciacin
M itosis
A p o p to sis
B)
S e a le s
R e s p u e s ta s
R e s p u e s ta s
Una serie de controles impide que la clula pase a la fase S o mitosis

con DNA daado no reparado, o inicie la anafase de la mitosis hasta
que todos los cromosomas estn unidos de modo correcto a las fibras
del huso. Es probable que haya un punto de control de dao del DNA
adicional durante la fase S.
Aunque la vida sera muy simple si la seal y la respuesta se unie

ran por una va lineal nica (fig. 17-13B), al parecer nunca sucede
as. En lugar de ello la conducta de la clula est controlada por ra
mificacin mltiple, superposicin y vas parcialmente redundantes
(fig. 17-13C). Es probable que estas redes complicadas sean necesa
rias para conferir estabilidad y resistencia a la maquinaria en extre
mo compleja de una clula. Desde el punto de vista experimental es
muy difcil descubrir el circuito gentico preciso de los controles, en
parte por su complejidad y adems porque en experimentos de
transfeccin o knockoutts difcil distinguir los efectos directos de los
indirectos. Se espera que la expresin de microarreglos proporcione
la clave de este problema.
Para clulas como las cancerosas que deciden dividirse, el pro
greso a travs del ciclo est sujeto a varios puntos de control (fig.
17-14). Los tres principales son:
el punto de control G1-S: la replicacin de DNA se bloquea en
presencia de un dao no reparado del DNA; el dao irrepara
ble conduce a apoptosis. Tal vez hay un punto de control de
dao adicional independiente dentro de la fase S;
el punto de control G2-M: el ingreso de las clulas a la mitosis
se bloquea a menos que la replicacin del DNA y la reparacin
de cualquier dao estn completas;
Fig. 17-13. Opciones que tiene una clula y forma en que las elige.
punto de control del huso: se describe en la seccin 17.5.1.
A) En respuesta a seales Internas y externas, una clula elige entre

estasis, mitosis, apoptosis y en ocasiones diferenciacin. B) Una clula
Imaginaria en la que las seales se enlazan a respuestas mediante
17.6.1 Punto de control G1-S
vas lineales no ramificadas de estimulacin (-) o inhibicin ( h ). Las

clulas humanas no funcionan como sta. C) En las clulas reales las
seales avanzan hacia una red compleja de interacciones parcialmente
redundantes, cuyo resultado final no es fcil predecir por medios
analticos.
La figura 17-15 muestra parte del circuito de este punto de control.

Se piensa que es particularmente crtico porque est inactivado en
la mayor parte de las clulas tumorales. Tres genes supresores de tu
mor fundamentales, RB, TP53 y CDKN2A, son elementos centra
les en la carcinognesis y unos de los genes que se alteran con ms
frecuencia en clulas tumorales. Cada uno desempea una funcin
504
CAPTULO DIECISIETE GENTICA DEL CNCER
Respuesta al
dao del DNA
p16INK4A
D ao irreparable:
desencadena apoptosis
D ao rep arab le:

pausa para reparacin
Fig. 17-15. Controles en la progresin del ciclo celular e integridad genmica mediada por los productos gnicos fifi, TP53 y CDKN2A (INK4A).
Estos controles forman cuando menos parte del punto de control del ciclo celular G1 -S. Vase Harbour y Dean (2000) para detalles.
en cnceres hereditarios. De hecho es probable que todas las clu

las tumorales deban inactivar tanto los brazos Rb como p53 del sis
tema a fin de que las clulas deriven los controles usuales del ciclo
y eviten estimular apoptosis en respuesta al dao de DNA no repa
rado o el sealamiento de crecimiento excesivo.
Funcin de pRb, el producto gnico RB

El gen RB se identific por su participacin en el retinoblastoma
(seccin 17.4.1), pero se expresa en forma amplia y ayuda a contro
lar el ciclo de todas las clulas. En las clulas normales el producto
gnico, una protena nuclear de 110 kDa, se inactiva por fosforila
cin y se activa por desfosforilacin. El pRb activo (desfosforilado)
enlaza e inactiva el factor E2F de transcripcin celular, cuya fun
cin se requiere para la progresin del ciclo celular (fig. 17-15; pa
ra mayores detalles vase Harbour y Dean, 2000). Dos a cuatro
horas antes que la clula entre en la fase S, pRb se fosforila. Esto li
bera la inhibicin de E2F y permite que la clula proceda a la fase
S. La fosforilacin est regida por una cascada de ciclinas, cinasas
dependientes de ciclinas e inhibidores de la cinasa de ciclina. Varias
oncoprotenas virales (adenovirus E1A, antgeno SV40-T y prote
na E7 de papilomavirus humano) se unen y secuestran o degradan
pRb, lo que favorece la progresin del ciclo celular.
Funcin de p16INK4A y p14ARF, los productos del gen

CDKN2A
El gen notable CDKN2A (antes llamado MTS1 o INK4A) en 9pl3
codifica dos protenas no relacionadas en trminos estructurales (fig.
17-16). Los exones la , 2 y 3 codifican la protena INK4A o pl6.
Un segundo promotor inicia la transcripcin ms corriente arriba en
el exn 1(3. El exn 113 se empalma en los exones 2 y 3, pero el mar
co de lectura se cambia, de manera que una protena p l4 o ARF (del
ingls Alternative Reading Frame, marco de lectura alternativo) no re
lacionada en lo absoluto se codifica (el homlogo del ratn es pl9).
Ambos productos gnicos funcionan en el control del ciclo ce

lular (fig. 17-15). p 16 acta corriente arriba de la protena RB pa
ra regular el punto de control del ciclo celular Gl-S. Las cinasas
dependientes de ciclina inactivan pRb mediante fosforilacin, pero
p l6 inhibe la cinasa CDK4/6. Por consiguiente la prdida de fun
cin de p 16 conduce a la prdida de funcin de RB y a un ciclo ce
lular inapropiado. El otro producto del gen CDKN2A, p 14, media
la detencin de G1 al desestabilizar la protena MDM2, el produc
to del oncogn MDM2 que est amplificado en muchos sarcomas
(Pomeranz y cois., 1998). La MDM2 enlaza p53 e induce su degra
dacin. En consecuencia p l4 acta para conservar el nivel de p53.
La prdida de funcin de p l4 conduce a valores muy altos de
MDM2, destruccin excesiva de p53 y por tanto prdida de con
trol del ciclo celular.
Aunque algunas familias con melanoma mltiple muestran mu
taciones hereditarias de CDKN2A, que suelen afectar slo p l6, son
mucho ms frecuentes las mutaciones somticas. La delecin homocigota del gen inactiva tanto los brazos RB como p53 del con
trol del ciclo celular y ste es un acontecimiento muy usual en la
tumorignesis. Algunos tumores tienen mutaciones que afectan
p l6 pero no p l4 (p. ej., inactivacin del promotor l a por metilacin). Esos tumores tambin tienden a poseer mutaciones de p53,
lo que demuestra la importancia de inactivar ambos brazos del sis
tema de control como se muestra en la figura 17-15.
17.7
In tegracin de los datos: vas

y capacidades
Como se coment al inicio de este captulo, la gentica del cncer

puede ser muy confusa. Demasiados genes, muchas mutaciones,
una infinidad de combinaciones... cada tumor es nico. Pero lo que
todos comparten es que cada neoplasia es el producto de la seleccin
para un grupo especfico de capacidades definibles y que, cuando se
piensa en trminos de vas en lugar de genes individuales, slo hay
17.7
INTEGRACIN DE LOS DATOS: VAS Y CAPACIDADES
cm y con focos de carcinoma), para transformarse en carcino

mas, que por ltimo dan metstasis-,
Transcrito
p16INK4A
Transcrito
p14arf
-*
U)
o>
9
pss Secuencia de
codificacin p16
en la PAF, una copia de APC en 5q21 est mutada constitucio

nalmente. Como hecho interesante, las mutaciones hereditarias
rara vez slo inactivan la protena APC, por lo general producen
una protena truncada que ejerce una accin negativa dominan
te (vase seccin 16.4.3). Es evidente que la inactivacin simple
de un alelo APC no dara la ventaja de crecimiento necesaria.
Las lesiones detectables ms tempranas, los focos crpticos abe
rrantes, carecen por completo de de expresin APC. Alrededor
de una clula epitelial en 10S evoluciona a un plipo, una tasa
compatible con el acontecimiento determinante de prdida del
segundo alelo APC,
Secuencia de
codificacin p14 ^
No traducido
Fig. 17-16. Los dos productos del gen CDKN2A.

El gen (que tambin se conoce como MTS e INK4A) codifica dos
protenas no relacionadas por completo. p16INK4A se transcribe de
exones 1a, 2 y 3, y p14ARF de exones 1 p, 2 y 3 -pe ro con un marco
de lectura diferente de los exones 2 y 3 -, Los dos productos gnicos
son activos en los brazos RB y p53 del control del ciclo celular
respectivamente, como se muestra en la figura 17-15.
un nmero limitado de formas para nombrar estas capacidades. Hahn

y Weinberg (2002) intentaron listar todas estas vas y dibujaron un
mapa de ruta del cncer.
17.7.1 Vas en el cncer colorrectal

El conocimiento de la evolucin tumoral se desarroll mejor en
cnceres colorrectales, porque es posible estudiar todas las etapas
del desarrollo del tumor en el colon resecado de pacientes con poliposis adenomatosa familiar. La figura 17-17 muestra estos pasos.
Es posible elaborar esquemas similares pero ms rudimentarios pa
ra otros tumores en los que los datos no son tan abundantes. El es
quema se basa en una serie de observaciones:
los carcinomas malignos se desarrollan de epitelio normal del
colon a travs de focos crpticos aberrantes microscpicos hasta
crecimientos epiteliales benignos llamados adenomas. Estos l
timos pasan por las etapas temprana (< 1 cm de tamao), in
termedia (> 1 cm pero sin focos de carcinoma) y tarda (> 1
Prdida o m utacin
de APC en el gen de ST
(5q)
E p ite lio
n o rm a l
505
H ip o m e tila c i n
de DNA
E p ite lio
h ip e rp ro life ra tiv o
A c tiv a c i n de
oncogen KRAS
(12p)
alrededor de 50% de los adenomas intermedios y tardos, pero

slo cerca de 10% de los tempranos, tiene mutaciones en el on
cogen KRAS (un relacionado de HRAS, cuadro 17-1). Por con
siguiente es posible que a menudo se requieran mutaciones de
KRAS para la progresin de adenomas tempranos a interme
dios;
alrededor de 50% de los adenomas y carcinomas tardos mues
tra prdida de heterocigosidad 18q. Este hecho es ms o menos
raro en adenomas tempranos e intermedios. Parece probable
que el gen importante sea SMAD4 (que tambin se conoce co
mo MADH4) en lugar del candidato inicial, DCC (vase White, 1998);
los cnceres colorrectales, pero no los adenomas, muestran una
frecuencia muy alta de prdida o mutaciones de TP53.
El esquema de la figura 17-17 pretende mostrar la serie ms usual
de mutaciones, pero no todos los cnceres de colon siguen esta va.
Slo cerca de 60% de estos cnceres tiene mutaciones de APC. Sin
embargo, los tumores que carecen de mutaciones APC suelen te
ner mutaciones activantes en la catenina |3, el principal blanco
de la accin de APC corriente abajo (Fodde y cois., 2001). Ms
adelante en la progresin, los tumores de la PAF tienden a perder
el cromosoma 18q, pero los del CCNPH son cromosmicamente
estables y no pierden 18q. En ambos casos quizs la presin selec
tiva sea la prdida del sealamiento beta inhibidor del crecimien
to por el factor de transformacin del crecimiento (TGF). En la
Prdida o m u taci n
del gen ST en 18q
(SMAD4?)
_ A denom a
te m pra no
P rd id a o m u ta c i n
d e TP53 en el ge n d e ST
(17 p)
A denom a
interm edio
, A denom a .
tardo
C a rc in o m a
Fig. 17-17. Un modelo para el desarrollo del cncer de colon en mltiples pasos.
Vase el texto para mayores detalles. ste es sobre todo un medio para pensar respecto a la form a en que se desarrollan los tumores, ms que una
descripcin firm e. Es probable que cada cncer colorrectal se haya desarrollado a travs de las mismas etapas histolgicas, pero los cambios
genticos subyacentes son ms variados. Segn Fearon y Vogelstein (1990), la figura ilustra una secuencia de acontecimientos en particular frecuente.
Smith y colaboradores (2002) dudaron de la validez de este modelo porque, en su serie de 106 tumores, slo siete tuvieron mutaciones en los tres,
APC, KRAS y p53.
506
CAPTULO DIECISIETE
GENTICA DEL CNCER
PAF esto ocurre por prdida del efector corriente abajo SMAD4
localizado en 18q. En el CCNPH, 90% de los tumores MIN+ tie
ne mutaciones de cambio de marco en una carrera (A)8 en el gen
del receptor II de TGFji. A menudo los tumores del CCNPH tie
nen mutaciones de cambio de marco en el gen AXIN2, que codi
fica otro componente de la va APC-fi-catenina. Por tanto detrs
de la heterogeneidad de acontecimientos moleculares, hay un cua
dro mucho ms regular de vas que deben inactivarse para que un
tumor se desarrolle.
17.7.2 Un tumor con xito debe adquirir seis

capacidades especficas
Una revisin importante y muy recomendable de Hanahan y
Weinberg (2002) (vanse Lecturas adicionales) sugiere otra forma
de concebir la evolucin de un tumor. Los autores sugieren que los
factores fundamentales en la transicin de una clula normal a una
clula cancerosa maligna son la adquisicin de seis capacidades es
pecficas. La clula debe tornarse:
independiente de seales externas de crecimiento;
insensible a seales externas anticrecimiento;
capaz de evitar la apoptosis;
apta para la replicacin indefinida;
hbil para la angiognesis sostenida;
capaz de invadir y dar metstasis tisulares.
Es posible que las metstasis no sean una capacidad seleccionada de
manera especfica. La aptitud para dar metstasis no es claramente
ventajosa para ninguna clula y puede ser un efecto incidental del
desarreglo genmico general de clulas tumorales avanzadas. Las
otras cinco capacidades resultan de seleccin especfica. Se sabe has
ta cierto punto poco respecto a la angiognesis, pero ya se comenta
ron los sitios de oncogenes activados, la alteracin del control del
ciclo celular, la mutacin p53 y la reactivacin de la telomerasa a fin
de obtener las cuatro primeras de estas capacidades. Cada aptitud
puede adquirirse por una diversidad de cambios genticos distintos,
pero en cada caso la adquisicin requiere ciertas vas especficas pa
ra activarse o inactivarse. Las capacidades no siempre se adquieren
en el mismo orden en diferentes tumores, pero los requerimientos
para inestabilidad genmica y expansiones clnales sucesivas en eta
pas intermedias (recuadro 17-1) imponen cierta regularidad en el
proceso.
La primera mutacin de la evolucin en mltiples pasos de
un tumor es crtica porque debe conferir cierta ventaja para el
crecimiento en una clula por otra parte normal que tiene intac
tas todas sus defensas. Segn la hiptesis d e l cela d or (Kinzler y
Vogelstein, 1996), en una poblacin celular en renovacin deter
minada un gen particular tiene a su cargo la conservacin de un
nmero constante de clulas. La mutacin de un celador conduce
a un desequilibrio permanente entre la divisin y la muerte celu
lares, en tanto que las mutaciones de otros genes no tienen efec
to a largo trmino si el celador funciona de modo correcto. De
acuerdo con esta teora, los genes supresores de tumor identifica
dos en estudios de cnceres mendelianos son los celadores del te
jido participante: NF2 para clulas de Schwann, VHL para
clulas renales, etc. En el caso de la APC tal vez sea importante
que esta protena no slo regula el valor de la catenina |3, un con
trolador principal del crecimiento celular, sino que tambin pue
de desempear una funcin fundamental en el punto de control
del huso (seccin 17.5.1). Ya se seal que aun en etapas muy tem
pranas los adenomas muestran inestabilidad cromosmica. Es fac
tible que una mutacin aislada de APC (del tipo derecho) confiera
ya una ventaja para el crecimiento en el epitelio del colon, en tan
to que la mutacin de un gen aislado BRCA1/2 no proporciona
ventaja al epitelio ductal. Ello explicara por qu la mutacin APC
es tan frecuente en el cncer de colon espordico, pero las mutacio
nes BRCA1/2 son raras en el cncer de mama espordico (Lamlum
y cois., 1999). An no se aclara con qu tanta frecuencia se ajustan
a la teora del celador cnceres como los de prstata o pulmn, que
carecen de formas mendelianas.
17.8
Para qu sirve todo este

conocim iento?
A la luz de las ideas expuestas en este captulo resulta fcil observar

que es disparatado hablar de una curacin del cncer. Sin embar
go, los nuevos conocimientos conducen ya a un progreso impor
tante en tres reas: deteccin, diagnstico y tratamiento.
La deteccin del cncer presintomtico suele basarse en exa
men fsico, estudios (mamografa, etc.), valoraciones bioqumicas
(antgeno especfico de prstata) o mtodos invasivos (colonoscopia, etc.). Por razones que an no aclaran por completo, los
tumores eliminan DNA. Mtodos de PCR sensibles pueden
amplificar DNA tumoral de la orina (en el cncer vesical), las
heces (en el cncer de colon), la saliva o el esputo (en el cncer
bucal o pulmonar) o de la sangre en una diversidad de cnceres
(Sidransky, 2002). Por fortuna los estudios de este DNA para
mutaciones en TP53, APC, etc., metilacin de promotor espe
cfica o inestabilidad microsatlite permitirn una deteccin
ms eficaz y no invasiva.
Como se mencion al inicio de este captulo, los mtodos
histolgicos tradicionales de identificacin del tumor y la
asignacin de la etapa se complementan cada vez ms (pero
no se sustituyen) mediante mtodos moleculares (Lakhani y
Ashworth, 2001). Lo anterior registra un mayor avance en
leucemias, en las que la definicin de los reordenamientos
cromosmicos proporciona indicadores importantes de pro
nstico y tratamiento (vase, por ejemplo, Armstrong y cois.,
2002). Hasta fecha reciente la complejidad de los cambios
en tumores slidos desafiaba un anlisis sencillo, pero el perfilamiento de la expresin empieza a proveer clasificaciones
tiles de subtipos, una vez ms, con implicaciones para el
pronstico y el tratamiento. La figura 17-18 muestra ejem
plos de aplicaciones recientes de arreglos de expresin en el
cncer.
Los primeros tratamientos basados en el conocimiento de cam
bios moleculares especficos ya se establecieron. El herceptn,
un anticuerpo monoclonal contra el receptor ErbB2 de cinasa
de tirosina, es una teraputica eficaz en cnceres de mama que
presentan amplificaciones del gen ERBB2, pero no para los que
carecen de esta caracterstica (De Bono y Rowinsky, 2002).
Gleevec (Imatinib, ST-1571) es un inhibidor especfico de la
protena de fusin BCR-ABL (fig. 17-4A) que logra resultados
notables en leucemia mieloide crnica (Savage y Antman, 2002).
stas son las primeras nuevas modalidades de frmacos antican
cerosos diseadas a partir del conocimiento de los acontecimien
tos moleculares en tumores.
17.8 i PARA QU SIRVE TODO ESTE CONOCIMIENTO?
507
Fig. 17-18. Ejemplos del uso de arreglos de expresin para caracterizar tumores.
A) Identificacin del tejido de origen. Los patrones de expresin de 148 genes (hileras) clasifican 100 tumores (columnas) por origen. Pr, prstata; Bl,
vejiga/urter; Br, mama; Co, colorrectal; Ga, gastroesofgico; Ki, rin; Li, hgado; Ov, ovario; Pa, pncreas; LA, adenocarcinoma de pulmn; LS,
carcinoma de clula escamosa del pulmn. Rojo = presin gnica aumentada, azul = expresin disminuida. Tomado de Su y colaboradores (2001).
Cncer Research 61, 7388-7393, con autorizacin de The American Association for Cncer Research. B) Distincin de dos tipos de linfoma de clula
B grande difuso. El agrupamiento de la expresin gnica distingue tumores similares a centro germinal de tumores activados tipo B (barras de color
naranja y azul). La supervivencia a los cinco aos en los dos grupos es de 76 y 16%, respectivamente. Reproducido de Alizadeh y colaboradores
(2000), con autorizacin de Nature Publishing Group. C) Sensibilidad a frmacos quimioteraputicos. Los perfiles de expresin de 6 817 genes en
60 lneas de clulas tumorales se correlacionaron con la respuesta a 232 medicamentos. La figura muestra los patrones de expresin gnica (hileras)
en 30 lneas celulares (columnas) que predicen sensibilidad o resistencia a un frmaco, la citocalasina D. Tomado de Staunton y colaboradores (2001),
con autorizacin de National Academy of Sciences, USA. D) Prediccin del resultado clnico del cncer de mama. Los patrones de expresin de
25 000 genes se calificaron en 98 cnceres de mama primarios. La figura muestra perfiles de 70 genes marcadores de pronstico (columnas) en 78
cnceres (hileras). Todas los pacientes se sometieron a Intervencin quirrgica y radioterapia; las lneas amarillas dividen a los que se predijo (mediante
dos criterios alternativos) que requeran quimioterapia adicional (arriba de la linea) de los que no necesitaban este tratamiento desagradable. Datos
reproducidos de Vant Veer y colaboradores (2002) con autorizacin de Nature Publishing Group.
508
CAPTULO DIECISIETE
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CAPTULO
DIECIOCHO
Pruebas genticas en individuos

y poblaciones
512
18.1
CAPTULO DIECIOCHO | PRUEBAS GENTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES
Introduccin
Los genetistas no tienen el monopolio del diagnstico basado en

DNA. Por ejemplo, la PCR es una herramienta central de micro
bilogos y bilogos para identificar patgenos. Hematlogos, onclogos y otros histopatlogos utilizan pruebas de DNA como base
para establecer diagnsticos. Sin embargo, para los propsitos de
este captulo, las pruebas genticas se definen como pruebas para
factores mendelianos. Los factores pueden indicar el riesgo de una
persona de desarrollar o transmitir una enfermedad (mendeliana o
no), o emplearse con objeto de identificar a una persona e indicar
su relacin con alguien ms.
Siempre que sea posible los autores recurrirn a dos de las en
fermedades mendelianas ms frecuentes, fibrosis qustica (FQ) y
distrofia muscular de Duchenne (DMD) con el fin de ilustrar los
diversos mtodos de pruebas. Ambas incluyen genes grandes con
heterogeneidad allica extensa, pero adems la FQ y la DMD con
llevan grupos de problemas diagnsticos de DNA bastante diferen
tes (cuadro 18-1). Entre ellos, muestran muchos de los problemas
relacionados con las pruebas para enfermedades mendelianas. Co
mo siempre, esta obra se concentrar en los principios y no en los
detalles prcticos. El lector interesado en procedimientos especfi
cos encontrar informacin respecto a la mejor prctica para el
diagnstico de laboratorio de las enfermedades mendelianas ms
usuales en http//:www.cmgs.org. sta se acord en reuniones de
trabajo de consenso de la UK Clinical Molecular Genetics Society.
El libro de Elles y Mountford (vase Lecturas adicionales) describe
mtodos de pruebas para una gama ms amplia de padecimientos.
Cuando un clnico lleva una muestra de DNA de un paciente a
un laboratorio de pruebas diagnsticas, son tres las posibles pre
guntas que el laboratorio podra intentar resolver:
El paciente tiene alguna mutacin o algn gen que explicaran
su enfermedad? Esta pregunta es incontestable ahora y lo ser
en el futuro. La prueba gentica tiene que ser dirigida. Aun si
es posible secuenciar el genoma entero de una persona como
un procedimiento diagnstico, sin una lista especfica de can
didatos no se tiene un medio para decidir cul de los varios mi

llones de diferencias entre las secuencias del DNA de dos per
sonas podra ser la causa de una enfermedad.
El paciente tiene alguna mutacin en ese gen particular que pu
diera causar su enfermedad? En la seccin 18.3 se estudian las
medidas estndar para responder esta pregunta, en tanto que
en la seccin 18.5 se expone una conducta alternativa, el ras
treo gnico.
El paciente tiene una delecin de tres bases del codn de fenilalanina 508 en su gen CFTFS En la seccin 18.4 se conside
ran las circunstancias en que este tipo de preguntas puede
hacerse y los medios paras responderlas.
18.2
Eleccin del m a te ria l para

pruebas: DNA, RNA o protenas
El estudio gentico casi siempre se efecta mediante PCR con los

mtodos que se describen en la seccin 5.2. Las pocas aplicaciones
de Southern blotting comprenden pruebas para reordenamientos o
alteraciones gnicas mayores y mutaciones completas en X frgil y
en la distrofia mi tnica (seccin 16.6.4). La sensibilidad de la
PCR permite emplear una gran variedad de muestras de tejidos, in
clusive:
muestras de sangre: son la fuente de DNA de adultos que ms
se utiliza;
enjuagues o raspados bucales: puesto que no son invasivos, se
prefieren en especial para programas de seleccin de poblacio
nes. Los enjuagues bucales proveen suficiente DNA para unas
cuantas docenas de pruebas y por lo general la amplificacin
del genoma completo (seccin 5.2.4) permite efectuar pruebas
ms extensas en una muestra aislada;
muestras de biopsia de vellosidades corinicas: constituyen
la mejor fuente de DNA fetal (mejor que los especmenes de
amniocn tesis);
Cuadro 18-1. Contraste gentico de la fibrosis qustica y la distrofia muscular de Duchenne.

Fibrosis qustica
Distrofia muscular de Duchenne
Autosmica recesiva
Recesiva ligada a X
Mutaciones de prdida de funcin
Mutaciones de prdida de funcin
Gen muy grande:

DNA genmico, 250 kb
27 exones
mRNA de 6.5 kb
Gen gigante:
DNA genmico, 2 400 kb
79 exones
mRNA de 14 kb
Casi todas las mutaciones son cambios de nucletido nico
65% de las mutaciones corresponde a deleciones que incluyen uno o ms exones

completos
5% es duplicaciones
30% de mutaciones sin sentido, sitio de empalme, etctera
Las mutaciones en sentido errneo son muy raras
Las nuevas mutaciones son en extremo raras
Las nuevas mutaciones son muy frecuentes
El mosaicismo no es un problema
El mosaicismo es frecuente
Poca recombinacin intragnica
Punto crtico de recombinacin (12% entre marcadores en cualquier extremo del gen)
Las pruebas genticas en DMD y FQ requieren diferentes grupos de enfoques.
18.3 | ESTUDIO DE UN GEN PARA MUTACIONES
una o dos clulas extradas de embriones en etapa de ocho

clulas, para el diagnstico preimplantacin despus de la fe
cundacin in vitro;
cabello, semen, etc., para investigaciones criminales;
especmenes anatomopatolgicos archivados, para tipifica
cin de personas muertas cuando no se guard DNA o para el
estudio de tumores en busca de cambios genticos. Slo se
cuencias cortas de 250 pb o menos pueden amplificarse con se
guridad a partir de especmenes de tejidos fijados;
tarjetas Guthrie: son tarjetas en las que se enva una gota de
sangre seca a un laboratorio a fin de efectuar seleccin neona
tal para fenilcetonuria (FCU) en el Reino Unido y en otras par
tes. Puesto que para la prueba de seleccin no se usa toda la
gota de sangre, las tarjetas, si se conservan, son fuentes posibles
de DNA de un nio muerto.
El RNA tiene ventajas sobre el DNA, pero es ms difcil de

obtener y manejar
La prueba mediante PCR-RT (vase seccin 5.2.1) ofrece varias
ventajas cuando es necesario estudiar un gen para mutaciones des
conocidas. El estudio del DNA suele incluir amplificacin y pruebas
de cada exn por separado, y esto puede ser una labor importante
en un gen con muchos exones. Puesto que casi todos los mtodos
de seleccin de mutaciones (cuadro 18-2) permiten estudiar frag
mentos ms grandes que el exn de tamao promedio, es factible
examinar un producto de la PCR-RT con un nmero ms pequeo
de reacciones. Asimismo slo la PCR-RT puede detectar con segu
ridad el empalme aberrante, que a menudo resulta difcil de prede
cir a partir de un cambio en una secuencia de DNA, o que quiz se
deba a la activacin de un sitio de empalme crptico profundo den
tro de un intrn (vase seccin 16.4.1). No obstante, obtener RNA
y trabajar con l es mucho menos cmodo. Las muestras deben ma
nejarse con gran cuidado y procesarse con rapidez a fin de evitar
que el mRNA se degrade, y quizs el gen de inters no se exprese
en tejidos a los que se accede con facilidad. Adems como muchas
mutaciones originan mRNA inestable (vase secciones 11.4.4,
16.4.1), cabe esperar que el producto de la PCR-RT de una perso
na heterocigota slo muestre el alelo normal.
Las valoraciones funcionales de protenas desempean una

funcin en las pruebas genticas
Una valoracin funcional basada en protenas podra clasificar los
productos de una serie allica muy heterognea en dos grupos sim
ples -funcional y no funcional- lo que, despus de todo, es la pre
gunta esencial en la mayor parte de los diagnsticos. El problema
con las valoraciones funcionales es que son especficas para una
protena particular. En contraste, la tecnologa de DNA es genri
ca. Esto tiene ventajas obvias para el laboratorio de diagnstico y
adems fomenta el desarrollo tcnico porque cualquier tcnica nue
va puede aplicarse a muchos problemas.
18.3
Estudio de un gen para

m utaciones
En la gran mayora de las enfermedades, por ejemplo FQ y DMD,

se observa una heterogeneidad allica extensa (vase seccin
513
16.3.2). Por consiguiente los estudios diagnsticos suelen incluir

investigaciones para mutaciones que pudieran encontrarse dentro o
cerca del (los) gen(es) importante(s). El cuadro 18-2 lista varios m
todos tiles y ms adelante se describen con brevedad. Para detalles
de laboratorio vase las obras de Cotton, Edkins y Forrest o de Elles
y Mountford (Lecturas adicionales).
La investigacin de la totalidad de un gen candidato para variacio
nes de secuencias en una serie grande de pacientes revelar muchas va
riantes distintas. Puede ser muy difcil decidir cul de ellas es patgena
o no (y en consecuencia representa la mutacin que se busca). El re
cuadro 16-5 contiene algunos lincamientos para intentar decidirlo.
18.3.1 Mtodos basados en secuenciacin

Ahora que los secuenciadores de fluorescencia automatizados cons
tituyen el equipo estndar de laboratorio, la secuenciacin se torna
cada vez ms atractiva como el principal medio para buscar una
mutacin (fig. 18-1). Otros mtodos de examen sirven sobre todo
para reducir la carga de secuenciacin al definir el amplicn que de
be secuenciarse. Conforme la secuenciacin se tom ms barata y
sencilla, la necesidad de reducir la carga disminuy y varios mto
dos alternativos dejaron de emplearse. En la actualidad se recurre a
las alternativas de secuenciacin directa sobre todo porque son r
pidas (cromatografa lquida desnaturalizante de alta ejecucin,
dHPLC), baratas (polimorfismos de conformacin de cadena ni
ca, SSCP) o proporcionan cierta informacin especial (prueba de
truncamiento de protena, PTT, y PCR cuantitativa).
Como la secuenciacin genera ms datos que otros mtodos, el
requerimiento para anlisis es mayor. Se cuenta con programas que
informan en forma automtica las diferencias entre la secuencia es
tudiada y una estndar a condicin de que la secuencia sea de bue
na calidad. Esta ltima es crtica para evitar artefactos y detectar
con seguridad sustituciones de bases en heterocigotos.
Para la secuenciacin de DNA genmico, cada exn suele am
plificarse por separado, con quiz 20 pb de intrn de flanqueo. Es
to resulta ineficiente porque el tamao promedio del exn en genes
humanos (145 pb) es bastante menor que las 500 a 800 pb que
pueden leerse en una buena carrera de secuenciacin. Las posibles
soluciones comprenden utilizar PCR-RT o PCR de enlace de exn
(PCR meta, Wallace y cois., 1999; fig. 18-2). Ms adelante se descri
be la resecuenciacin basada en microarreglos (seccin 18.4.1).
18.3.2 Mtodos basados en la deteccin de

compatibilidades errneas o heterodplex
Muchas pruebas emplean las propiedades de heterodplex para de
tectar diferencias entre dos secuencias. Casi todas las mutaciones
ocurren en la forma heterocigota (aun en padecimientos autosmicos recesivos, es probable que la persona afectada que nace de pa
dres no consanguneos sea un heterocigoto compuesto, con dos
mutaciones diferentes). Los heterodplex pueden formarse me
diante el simple calentamiento del producto de la prueba de PCR
del heterocigoto a fin de desnaturalizarlo seguido del enfriamiento
lento. Para mutaciones en homocigotos, o ligadas a X en varones,
es necesario aadir cierto DNA de tipo silvestre como referencia.
Varias propiedades de los heterodplex pueden aprovecharse:
a menudo los heterodplex tienen una movilidad anormal en
gel de poliacrilamida no desnaturalizantes (fig. 18-3A, panel
inferior). Se supone que los gel especiales (Hidrolink,
MDE) mejoran la resolucin. ste es un mtodo en particu
514
CAPTULO DIECIOCHO
PRUEBAS GENTICAS EN INDIVIDUOS Y POBLACIONES
Cuadro 1 8 -2 . Mtodos para estudiar un gen en busca de mutaciones.

El cuadro resume las ventajas y las desventajas de cada mtodo para su empleo en un servicio de diagnstico de rutina. Vase seccin 18.3 para detalles.
Mtodo
Ventajas
Desventajas
Southern blot, hibridacin a sonda de

cDNA
El nico medio para detectar deleciones y reorde

namientos mayores
Laborioso, caro
Requiere varios p.g de DNA
Secuenciacin
Detecta todos los cambios

Caracterizacin completa de mutaciones
Costoso
Movilidad de heterodplex en gel
Muy simple
Barato
Secuencias slo < 2 0 0 pb

Sensibilidad limitada
No revela la posicin del cambio
dHPLC
Rpido, rendimiento alto

Cuantitativo
Equipo costoso
SSCP
Simple, barato
Secuencias slo < 2 0 0 pb

DGGE
Sensibilidad alta
La eleccin de los cebadores es fundamental

Cebadores costosos
Corte qumico de compatibilidad errnea
Sensibilidad alta
Muestra la posicin del cambio
Sustancias qumicas txicas

Experimentalmente difcil
PTT
Sensibilidad alta para mutaciones de terminacin

de cadena
Muestra la posicin del cambio
Slo mutaciones terminales de cadena

Costoso, dificultades tcnicas
Suele requerir RNA
PCR cuantitativa
Detecta deleciones en heterocigotos
Costoso
Microarreglos
Rpido
Rendimiento alto
Puede detectar y definir todos los cambios
Costoso
Gama limitada de genes
dHPLC, cromatografa lquida desnaturalizante de alta ejecucin; SSCR polim orfism o de conformacin de cadena nica; DGGE, electroforesis en gel de
gradiente desnaturalizante: PTT, prueba de truncamiento de protena.
lar simple. Si se estudian fragmentos no mayores de 200 pb de lar

go, es factible detectar inserciones, deleciones y la mayor parte
de las sustituciones de bases nicas (Keen y cois., 1991);
los heterodplex tienen perfiles de desnaturalizacin anormales.
Esto se aprovecha en la cromatografa lquida desnaturalizan
te de alta ejecucin (dHPLC, fig. 18-4A) y la electroforesis en
gel de gradiente desnaturalizante (DGGE, fig. 18-3B). En
ambos casos la movilidad de un fragmento cambia de modo no
table cuando se desnaturaliza. Estos mtodos requieren ajustar
se a la secuencia particular de DNA en estudio y por tanto son
ms adecuados para el anlisis rutinario de un fragmento deter
minado en muchas muestras. La dHPLC proporciona un ren
dimiento alto, que se adapta bien a su uso. La DGGE requiere
cebadores especiales con una extensin 5' poli (G;C) (una pin
za GC); vase Sheffield y cois. (1992). Una vez que se optimizan,
estos mtodos tienen una sensibilidad alta;
las bases con compatibilidad errnea en heterodplex son sen
sibles a cortes mediante sustancias qumicas o enzimas. El de
corte qumico de compatibilidad errnea (CCM) (fig. 18-4B)
es un mtodo sensible para detectar mutaciones, con las venta
jas de que puede analizar fragmentos muy grandes (ms de 1 kb
de tamao) y de que la localizacin de la compatibilidad errnea
est indicada por el tamao de los fragmentos generados. Sin

embargo, utiliza sustancias qumicas muy txicas, en particular
tetrxido de osmio (aunque puede sustituirse por permangana
to de potasio), y es experimentalmente muy difcil. Una alter
nativa es el corte enzimtico de compatibilidades errneas
(ECM) en el que se recurre a enzimas como la resolvasa de fa
go T4 o la endonucleasa VII para lograr el mismo resultado sin
las sustancias qumicas txicas. Por desgracia, la calidad de los
gel producidos deja mucho que desear en manos de la mayora
de las personas.
De todos estos mtodos, la mayor parte de los laboratorios de diag
nstico slo dispone de la dHPLC en la actualidad.
18.3.3 Mtodos basados en anlisis de conformacin

de cadena nica
El DNA de cadena nica tiende a doblarse y formar estructuras
complejas estabilizadas mediante enlaces intramoleculares dbiles,
sobre todo enlaces de hidrgeno de pares de bases. Las movilidades
electroforticas de estas estructuras en gel no desnaturalizantes no
slo dependen de la longitud de sus cadenas sino tambin de sus
conformaciones, que la secuencia de DNA rige. Los SSCP se detec-
18.3 ESTUDIO DE UN GEN PARA MUTACIONES
A) Paciente
Testigo
B) Testigo
515
18.3.4 Mtodos basados en traduccin: prueba de

truncamiento de protena (PTT)
La PTT (fig. 18-5) es una prueba especfica para mutaciones de
cambios de marco, sitio de empalme o sin sentido que originan un
codn de terminacin prematuro (Van der Luijt y cois., 1994). El
material de inicio es un producto de la PCR-RT o en ocasiones un
exn grande aislado en DNA genmico, como el exn 15 de 6.5 kb
del gen APC o el exn 10 de 3.4 kb del gen BRCA1. La descompo
sicin de mRNA mediada sin sentido (seccin 16.4.1), que en con
diciones normales impide la produccin de una protena truncada,
no ocurre porque en la valoracin no hay empalme de exn con
exn. Las ventajas e inconvenientes de la PTT consisten en que s
lo detecta ciertas clases de mutacin. No sera til para fibrosis
qustica, en la que la mayor parte de las mutaciones no es truncan
te. Pero las mutaciones en sentido errneo son raras en la distrofia
muscular de Duchenne (DMD), la poliposis adenomatosa del co
lon o el cncer de mama relacionado con BRCA1 y el hallazgo de
cualquiera de estos cambios bien puede ser una coincidencia y no
patgeno. La PTT tiene varias ventajas en estas enfermedades. Ig
nora sustituciones de bases silenciosas o en sentido errneo y (co
mo los mtodos de corte de compatibilidad errnea, pero a
diferencia de los SSCP) revela el sitio aproximado de cualquier mu
tacin. Se desarrollaron diversas variantes para obtener resultados
ms limpios, que por lo general incorporan un paso de inmunoprecipitacin -pero la PTT an es una tcnica exigente que no resulta
fcil de efectuar bien.
18.3.5 Mtodos para detectar deleciones
Fig. 18-1. Deteccin de mutacin mediante secuenciacin.

A) una sustitucin de base en ei exn tres. El pico doble (flecha) muestra
una mutacin heterocigota g.332C->T (p.P67L). B) delecin de una
base 3659delC en el exn 19. La secuenciacin corriente abajo de la
delecin es confusa y refleja superposicin de secuencias de los dos
alelos en este heterocigoto. Los cambios se confirmaran mediante
secuenciacin de la cadena inversa. Cortesa del doctor Andrew
Wallace, St Marys Hospital, Manchester, Reino Unido.
tan mediante amplificacin de las muestras de DNA (que pueden

ser los productos de la PCR-RT), desnaturalizacin, enfriamiento
con rapidez y cargndolas en un gel de poliacrilamida no desnatu
ralizante (fig. 18-3A). Los cebadores pueden ser radiomarcados o
bien los productos no marcados detectarse con tincin argntica. El
patrn preciso de bandeo que se observa depende mucho de los decalles de las condiciones. Deben correrse muestras testigo para que
sea posible observar diferencias del patrn de tipo silvestre. Puesto
que el SSCP es muy barato y posee una sensibilidad razonable (al
rededor de 80%) para fragmentos hasta de 200 pb de largo (Sheffield y cois., 1993), an se utiliza con amplitud. Es posible combinar
SSCP y anlisis de heterodplex en un mismo gel, como en la figu
ra 18-3A. Un SSCP detallado, la huella didesoxi, analiza cada
banda en una escalera de secuenciacin por SSCP y se afirma que
tiene una sensibilidad de 100% (Sarkar y cois., 1992).
La deteccin de deleciones de homocigotos o hemicigotos es senci

lla: la secuencia eliminada no se amplifica por PCR. Es importante
considerar explicaciones alternativas para la falta de amplificacin:
es posible que se deba a fracaso tcnico de la PCR o a una sustitu
cin de bases en uno de los sitios de enlace del cebador. Las de
leciones pueden confirmarse con el empleo de cebadores alternativos
o por Southern blotting. Alrededor de 60% de las mutaciones de la
DMD lo constituyen eliminaciones de uno o ms exones (vase fig.
16-3). En varones afectados, dos reacciones de PCR multiplex (que
se muestran en la figura 18-6 y una prueba de exones en la parte 5'
del gen) revelarn 98% de las deleciones. En casi todas estas lti
mas se elimina ms de un exn. Es necesario confirmar las delecio
nes que al parecer afectan exones no contiguos y las de un exn
aislado.
El estudio de mujeres para observar si portan una delecin de
distrofina es ms difcil en conjunto e ilustra los problemas especia
les que las deleciones de uno o ms exones completos en heterocigotos implican. Estas deleciones no son detectables cuando el DNA
genmico se amplifica exn por exn y se estudia por medio de se
cuenciacin, anlisis heterodplex o SSCP porque el alelo mutante
no provee un producto. HFIS o HGC-arreglo permiten diagnosti
car deleciones de tamao megabase (fig. 17-3). Se requieren alter
nativas para deleciones a escala de exn. La secuenciacin o el
anlisis de PTT de productos de la PCR-RT deben captar cual
quier cosa excepto una delecin gnica completa, pero la descom
posicin del mRNA mediada sin sentido puede tornar invisible el
transcrito mutante y en una prueba diagnstica no siempre es fcil
implementar mtodos basados en RNA.
Se cuenta con varios sistemas de PCR cuantitativa que pueden
detectar deleciones heterocigotas en el DNA genmico. La reaccin
516
CAPITULO DIECIOCHO
Oligo externo
^
a)
b)
Exn A
E xn A
O lig o s e n la z a d o re s
d e P C R -m e ta
Exn C
Exn B
Oligo interno
c)
d)
Exn A
Exn A
I
I
Exn B
Exn C
Exn B
Exn C
Fig. 18-2. Principia de la PCR de enlace de exn (PCR meta).

Es una tcnica para superar la disparidad entre el tamao promedio de los exones humanos (145 pb) y el tamao ptimo del producto para la
secuenciacin (500 a 800 pb), en tanto conserva las ventajas de estudiar el DNA genmico. a) Dos a cinco exones (con ca. 20 pb de intrn de flanqueo,
no se muestran para claridad) se amplifican mediante PCR con cebadores que portan enlazadores compatibles especficos en sus extremos 5 .
b) Conforme los cebadores se agotan, se forman concatmeros, guiados por los enlazadores. c) El concatmero deseado se amplifica en una segunda
ronda de PCR con cebadores diseados de manera especfica, d) El producto puede disearse para que tenga cualquier combinacin de exones
dispuestos en cualquier orden. Vase Wallace, Wu y Elles (1999).
se limita a la fase exponencial temprana (fig. 5-2) cuando la canti

dad de producto indica la de la plantilla. La acumulacin de pro
ducto se mide en tiempo real por fluorescencia y se compara con
un estndar interno o paralelo. La seal fluorescente puede ser ge
nerada por un colorante de enlace especfico de DNA de cadena
doble, como SYBR Verde, o mediante el corte de un oligonucletido especfico de secuencia marcado con un colorante y un apaga
dor (valoracin TaqMan). Una alternativa a la PCR de tiempo
real es el mtodo de Armour MAPH (hibridacin multiplex con
sonda amplificable) (2000) (recuadro 18-1). La MAPH permite un
grado alto de multiplex (pueden compararse dosis de cuando me
nos 50 secuencias cortas en un solo experimento), no requiere son
das marcadas en forma especial ni maquinaria costosa, y es bastante
adecuada para desarrollarse en un laboratorio modesto.
Si est segregndose una delecin en una familia, la tipificacin
de mujeres para mapear microsatlites dentro de la delecin puede
revelar no maternidad aparente, en la que una madre no transmi
ti el alelo marcador a su hija a causa de la delecin (fig. 18-7). En
estas familias la no maternidad demuestra que una mujer es una
portadora, en tanto que la heterocigosidad (en la hija o la hermana
de una portadora de la delecin) indica que una mujer no es por
tadora. Se identificaron varios marcadores adecuados para este pro
psito en puntos crticos de delecin en los intrones. El mtodo
funciona mejor en familias con un varn afectado en el que la de
lecin puede definirse primero.
18.3.6 Mtodos para detectar patrones de metilacin

del DNA
La importancia de la metilacin del DNA en el control de la expre
sin gnica se describi en la seccin 10.4.2. La metilacin excesiva
o deficiente de dinucletidos CpG es un mecanismo patgeno fre
cuente en el cncer (seccin 17.4.3) y la expresin gnica impronta
(seccin 16.4.4). Puesto que los productos de la PCR nunca se me
dian, ninguno de los mtodos descritos hasta el momento brinda in
formacin de los patrones de metilacin en una muestra de DNA.
Dos mtodos principales se utilizan para verificar la metilacin:
Digestin mediante enzima de restriccin. La HpaW slo cor
ta CCGG no metilado, en tanto que la Msp\ corta cualquier
CCGG sea metilado o no. Por consiguiente los sitios CpG
metilados dan lugar a que las dos enzimas provean diferentes
fragmentos de restriccin. De otro modo, una plantilla de
PCR que contiene un CCGG puede digerirse con una Hpall
antes de la amplificacin; si el sitio no est metilado, la plan
tilla se corta y la PCR no producir producto alguno.
Secuenciacin con bisulfito (Thomassin y cois., 1999). Cuando
se trata DNA de cadena nica con bisulfito de sodio, la citosina, pero no la 5-metil citosina (5-MeC), se convierte en uracilo. Despus del tratamiento con bisulfito el DNA se amplifica
por PCR (con cebadores compatibles con la secuencia modifi
cada) y se somete a secuenciacin convencional. La citosina y
18.4 ! PRUEBAS PARA UN CAMBIO DE SECUENCIA ESPECIFICADO j 517
B)
A)
1 2
3 4
7 8
Fig. 18-3. Seleccin para mutaciones del gen CFTR.

A) heterodplex y anlisis SSCP. El exn 3 se amplific mediante PCR para DNA genmico. Tras la desnaturalizacin, las muestras se cargaron en un
gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Parte de cada producto se reasoci para proporcionar DNA de doble cadena. ste corre ms rpido en el gel
y da las bandas heterodplex que se observan en el grupo inferior. El DNA de cadena nica corre con ms lentitud en el mismo gel (panel superior). Las
hileras 1 y 2 muestran el patrn tpico de la secuencia de tipo silvestre. Pueden observarse patrones variantes en las hileras 3 a 8. La secuenciacin
revel mutaciones de G85E, L88S, R75X, P67L, E60X y R75Q respectivamente. Cortesa del doctor Andrew Wallace, St M arys Hospital Manchester.
B) electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante. Los exones del gen CFJf se amplifican mediante PCR en uno o ms segmentos y se corren en
geles de poliacrilamida a 9% que contienen un gradiente desnaturalizante de urea y formaldehdo. La banda de cualquier amplicn que contiene una
variante de heterocigoto suele cortarse en cuatro subbandas (flechas). En las hileras que se muestran, el sujeto A (hilera izquierda en cada panel) tiene
una variante en el amplicn 6 y el sujeto B (hileras derechas) tiene variantes en los amplcones 17 y 24. La caracterizacin de las variantes demostr
que el sujeto B era heterocigoto para R1070Q (exn 17). Otras variantes no fueron patgenas. Cortesa del doctor Hans Scheffer, University of
Groningen, Pases Bajos.
la 5-MeC en el espcimen original se muestran como timina y

citosina, respectivamente, en la secuencia del producto de la
PCR. Este mtodo requiere controles muy cuidadosos para
proporcionar datos seguros.
1 8 .4
Pruebas para un cam bio de

secuencia especificado
Las pruebas para la presencia o ausencia de un cambio de secuencia

conocido son un problema diferente y mucho ms sencillo que el es
tudio de un gen para la presencia de cualquier mutacin. Las mues
tras pueden genotipificarse siempre mediante secuenciacin, pero la
convencional no es un mtodo eficiente si slo la posicin de un nucletido aislado est controlndose. El cuadro 18-3 resume algunos
de los principales mtodos de genotipificacin. Las compaas de
biotecnologa desarrollaron como equipos muchas variantes de estos
mtodos y otros. Las aplicaciones tpicas comprenden:
diagnstico de enfermedades con heterogeneidad allica limi
tada (vase cuadro 18-4);
diagnstico en una familia. Quiz se necesiten mtodos de

examen de una mutacin para definir la mutacin familiar,
pero una vez que se caracteriza, por lo general slo es necesa
rio estudiar a otros miembros de la familia para esa mutacin
particular;
en investigacin, para estudiar muestras testigo. Un problema
usual en la clonacin posicional es que un paciente presente un
cambio de secuencia en un gen candidato. A continuacin sur
ge la pregunta, este cambio es patgeno (y confirma que el gen
candidato es el gen de enfermedad) o puede ser un polimorfis
mo no patgeno? Un mtodo usual consiste en seleccionar un
panel de muestras testigo normales para la presencia del cam
bio. Collins y Schwartz (2002) consideran el problema del n
mero de testigos que deben estudiarse;
genotipificacin de SNP. Aunque el objetivo en este caso no es
encontrar una mutacin patgena como en la forma anterior,
el problema es idntico: estudiar una muestra de DNA para
una variante de secuencia predefinida. La tipificacin median
te SNP es la principal aplicacin de los mtodos de genotipifi
cacin de rendimiento muy alto (seccin 18.4.2).
518
CAPTULO DIECIOCHO
A)
?
g
CS
O
c
t
Q
O
m
n
<
Tiempo (min)
B)
Tamao del fragmento

140 210 280 350 420 49 0 56 0 630 70 0 77 0 84 0 910 98 0 1 0 5 0 1 1 2 0
Fig. 18-4. Examen para mutacin.

A) Examen para mutacin de DIVID mediante cromatografa lquida desnaturalizante de alta ejecucin (dHPLC). El exn 6 del gen de distrofina da un
patrn distinto en un varn afectado (trazo en azul) y un testigo normal (trazo en rojo). La secuenciacin revel la mutacin del sitio de empalme
73 8 + IG ^T . Puesto que es un padecimiento ligado a X, en varones la prueba de DNA debe combinarse con una cantidad igual de DNA normal con el fin
de permitir que se formen heterodplex. Cortesa del doctor Richard Bennett, Childrens Hospital Boston, MA, USA. B) Examen para mutacin mediante
corte qumico de compatibilidades errneas. Producto de la PCR meta con fluorescencia que contiene los exones 6 a 10 del gen NF2. Pista superior:
muestra del paciente; se descubre una mutacin por empalme heterocigota en el ntrn 6 de 600-3c->g mediante corte por hdroxilamina del producto
de la PCR meta de 1 032 pb en fragmentos de 8 1 3 + 2 3 9 pb. Pista inferior: muestra testigo. Cortesa del doctor Andrew Wallace, St M ary's Hospital,
Manchester, Reino Unido.
18.4.1 Se dispone de muchos mtodos simples para

genotipificar una variante especificada
Pruebas para la presencia o ausencia de un sitio
de restriccin
Una mutacin por sustitucin de bases que crea o suprime un sitio
de reconocimiento de una enzima de restriccin permite realizar
una prueba directa simple de PCR para la mutacin (fig. 7-6). Aun
que se conocen cientos de enzimas de restriccin, casi todas reco

nocen sitios palindrmicos simtricos y muchas mutaciones de
punto no afectarn esas secuencias. Adems los sitios para enzimas
de restriccin raras y ocultas no son adecuados para emplearse en
diagnsticos rutinarios porque las enzimas son caras y a menudo de
mala calidad. Sin embargo, en ocasiones puede introducirse un si
tio de restriccin diagnstico mediante una forma de mutagenesis
de PCR (seccin 5.5.3) con el uso de cebadores elegidos con cui
dado. La figura 18-8 muestra un ejemplo.
18.4
PRUEBAS PARA UN CAMBIO DE SECUENCIA ESPECIFICADO
Segmento de DMD 1EF
519
Segmento de DMD 2CD
Fig. 18-5. Examen de la mutacin de DMD mediante la prueba de truncamiento de protena (PTT).
Una reaccin acoplada de transcripcin-traduccin se utiliza para producir productos polipptidos marcados codificados para un segmento de mRNA.
Los segmentos que contienen codones de terminacin prematura producen polipptidos truncados. En este caso se us PCR-RT para examinar la totalidad
del gen de distrofina en 10 segmentos superpuestos en una serie de pacientes con distrofia muscular de Duchenne (DMD). Los polipptidos de carrera
ms rpida identifican segmentos que contienen codones de terminacin y el tamao del producto anormal indica la posicin del codn de
detencin dentro del segmento. Imagen cortesa del doctor J. T. den Dunnen y D. Verbove (Leiden, Pases Bajos); para mayores detalles vase
http://www.dm d.nl.
Fig. 18-6. Seleccin multiplex para deleciones de distrofina en varones.

A) Productos de amplificacin multiplex con PCR de nueve exones, utilizando muestras de 10 nios no relacionados con distrofia muscular de Duchenne/Becker. Los cebadores de la PCR se disearon de manera que cada exn, con alguna secuencia de flanqueo de intrn, proporcione un producto de
PCR de tamao diferente. Cortesa dei doctor R. Mountford, Liverpool Women's Hospital, Reino Unido. B) Interpretacin: las lneas slidas muestran
exones eliminados en forma definitiva; las lneas de guiones indican la posible extensin de la delecin en direccin hacia exones no estudiados. No se
observa delecin en las muestras 7 y 9; estos pacientes pueden tener mutaciones de punto o deleciones de exones que no se examinaron en esta
prueba. Las tamaos de exn y el espaciamiento no estn a escala. Comprese con la figura 16-3.
520 i CAPTULO DIECIOCHO
iRSaltl
Recuadro 18-1. H ibridac in m ultiplex con sond a am p lificab le (M A P H )

Es un mtodo muy verstil para comparar la dosis gnica de un nmero
de secuencias. El DNA genmico del paciente se gotea en un filtro de nai
lon pequeo ( 2 x 3 m m ) y se hbrida a una mezcla de 40 sondas, cada
una especfica para un exn del gen de distrofina. Tras el lavado cuidado
so, el filtro se coloca en una mezcla de PCR en la que se utiliza un par
aislado de cebadores que se unen a una secuencia que se encuentra al
final de cada sonda. Un cebador puede marcarse con fluorescencia para
realizar el anlisis en un secuenciador gnico.
i i
Las sondas se disean de tal manera que sea posible distinguir los exones mediante la longitud del producto de la PCR y cuantificarse por el ta
mao del pico en un secuenciador de fluorescencia o por las intensidades
relativas de bandas en un gel manual. Como todas las sondas se am pli
fican con el mism o par de cebadores, se evitan los problemas de una am
plificacin desigual que abundan en las PCR multiplex.
Para detalles ms amplios de MAPH vanse Armour y colaboradores
(2000) y el sitio de red MAPH www.nott.ac.uk/-pdzjala/m aph/m aph.html
13
.
I j J l J I i J
B U 41B:34_B0S_041.f*a/
i u
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Paciente con duplicaci n
1a
II
k 1
A A
a aAaM Aa
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Paciente con deleci n
L i l i l l i l i A j l I i M
L A
fi
A A
A a L a M
li
AA
B U 45B:42_B06_M5.f /
Testigo
J t ijjj L
BB 57B:50_B07_D57.f#a/
lIiilJl
lili
t i hk
KAA
A /I A
a aLaaa
il
Aa
Se indican los exones duplicados/elim inados (deleci n)
Uso de MAPH para detectar deleciones y duplicaciones de exones del gen de distrofina.
La comparacin de los tamaos de los picos con el trazo testigo permite observar la duplicacin de los exones 10 y 13 (y tal vez 11 y 12, que no se
estudiaron en este multiplex) en el trazo superior, y la delecin del exn 18 en el trazo central. Imagen cortesa de los doctores J. T. den Dunnen y S.
White Leiden, Pases Bajos; para mayores detalles vase http://www.dmd.nl
A)
B)
STR45
Alelo 1 -
Fig. 18-7. Portadores de delecin en una familia con DMD revelados mediante no maternidad aparente.
A) Genealoga. B) Resultados de la tipificacin con el marcador intragnico STR45. El nio afectado 111-1 tiene una delecin que incluye STR45 (el carril 7
del gel es el blanco). Su madre II-2 y su ta II-3 no heredaron el alelo de STR45 de su madre 1-2, lo que muestra que la delecin se transmite en la
familia. Al parecer I-2 es homocigoto para este marcador altamente polimrfico (carril 2), pero de hecho es homocigoto. La otra ta II-4 y su hermana III-2
son heterocigotas para el marcador y por tanto no portan la delecin.
18.4
PRUEBAS PARA UN CAMBIO DE SECUENCIA ESPECIFICADO
Uso de hibridacin de oligonucletido especfico de alelo

(ASO)
Bajo condiciones de hibridacin adecuadamente rgidas, estas sondas
sintticas cortas slo se hibridan con una secuencia compatible a la
perfeccin (seccin 6.3.1). La figura 6-11 muestra el uso de la hibri
dacin dot-blot con sondas de ASO para detectar la sustitucin de
base nica que causa la enfermedad de clulas falciformes. Con fines
diagnsticos suele emplearse un procedimiento dot-blot inverso. Por
ejemplo, en una seleccin para una serie de mutaciones de fibrosis
qustica definidas se usara una serie de ASO especficos para cada
alelo mutante, goteados en una membrana aislada que despus se h
brida con el DNA de prueba marcado amplificado mediante PCR.
El mismo principio de dot-blot inverso se aplica a una escala
masivamente paralela en chips de DNA. Cientos a miles de sondas
oligonucletidas de 20 a 25 mer se anclan a un apoyo slido en po
siciones definidas (seccin 6.4.3). El DNA en estudio se amplifica
por PCR, se marca con fluorescencia y se hibrida al arreglo, solo o
(de preferencia) en competencia con una secuencia de referencia ti
po silvestre marcada con un color distinto. Cada sonda individual
del chip se comporta como una prueba de ASO para una secuen
cia especfica en el DNA de prueba, pero sobre todo los chips pue
den explorar toda la secuencia de un gen e informar cualquier
sustitucin de bases (fig. 18-9A). Las eficiencias de deteccin son
excelentes en homocigotos, pero menos seguras en heterocigotos.
Las inserciones slo se detectan si se disearon de antemano oligonucletidos para detectar una insercin especfica.
Una vez preparado todo, los sistemas de chip resultan rpidos y
fciles de emplear, aunque lejos de ser baratos. Sin embargo, es ne
cesario definir con anterioridad la gama de mutaciones a detectar y
disearlas dentro del chip. Por tanto su principal funcin en la de
teccin de una mutacin puede ser para el examen inicial de mues
tras a fin de captar las mutaciones frecuentes; para los casos difciles
se recurre a otros mtodos.
Amplificacin mediante PCR especfica de alelo (prueba

ARMS)
El principio de la ARMS (sistema de amplificacin de mutacin re
sistente) se muestra en la figura 5-4. Se llevan a cabo reacciones de
PCR pareadas. En ambas reacciones un cebador (el comn) es el
mismo, el otro se presenta en dos versiones un poco diferentes, una
especfica para la secuencia normal y la otra especfica para la se
cuencia mutante. Suelen incluirse cebadores testigo adicionales pa
ra amplificar alguna secuencia no relacionada de cada muestra a fin
de controlar la correcta realizacin de la PCR. La localizacin del
cebador comn puede elegirse para que proporcione productos de
diferente tamao para distintas mutaciones, de manera que los pro
ductos de la PCR de reacciones multiplex forman una escalera en
un gel. Con el diseo cuidadoso del cebador tambin pueden pre
pararse cebadores especficos de mutacin para que provean pro
ductos distinguibles. Por ejemplo, pueden marcarse con diferentes
marcadores fluorescentes u otros, o proporcionarse extensiones 5'
de tamaos diversos. La PCR multiplex especfica de mutacin es
muy adecuada para seleccionar grandes cantidades de muestras pa
ra un grupo determinado de mutaciones (fig. 18-10).
Valoracin de ligadura de oligonucletido (OLA)

En la prueba de OLA para mutaciones por sustitucin de bases se
preparan dos oligonucletidos que se hibridan a secuencias adya
521
centes en el blanco, con la unin establecida en la posicin de la

mutacin. La ligasa de DNA no unir de manera covalente los dos
oligonucletidos a menos que estn perfectamente hibridados
(Nickerson y cois., 1990). Son posibles varios formatos para la prue
ba, por ejemplo, una ELISA o, como en la figura 18-11, para an
lisis en un secuenciador de fluorescencia.
Minisecuenciacin mediante extensin del cebador

La minisecuenciacin utiliza el principio de la secuenciacin Sanger
(fig. 7-2), pero slo aade un nucletido aislado. El extremo 3' del ce
bador de secuenciacin est situado justo corriente arriba del nucle
tido a genotipificar. La reaccin mixta contiene polimerasa de DNA
aunada a cuatro trifosfatos didesoxinucletido marcados de manera
distinta (ddNTP). La prueba de DNA acta como una plantilla para
la adicin de un didesoxinucletido marcado aislado al cebador. De
una manera u otra, el nucletido aadido al cebador se identifica (p.
ej., corriendo el cebador extendido en un secuenciador de fluorescen
cia) y ello permite identificar la base en la posicin de inters.
La minisecuenciacin puede adaptarse con facilidad a un for
mato basado en arreglos (APEX, extensin de cebador arreglada;
Tonisson y cois., 2002) para revisar la secuencia completa de un gen
en busca de sustituciones de bases en una operacin (fig. 18-9B).
18.4.2 Mtodos para genotipificacin de alto

rendimiento
Las compaas de biotecnologa desarrollan mltiples sistemas con
objeto de resolver el desafo de la genotipificacin de cantidades
muy considerables de SNP para estudios de relacin con enferme
dades (seccin 15.4.5). Weaver (2000) elabor una lista de un gran
nmero de tales sistemas. El mtodo gentico subyacente suele ser
extensin de un cebador (minisecuenciacin), hibridacin de oli
gonucletido especfico de alelo o enlace de oligonucletido, como
se describi antes, pero formateado para permitir la automatizacin
y un rendimiento muy alto. Muchos sistemas intentan combinar
esta tecnologa gentica con los desarrollos en microlquidos de la
boratorio en un chip. Los ejemplos de otros mtodos comprenden
la pirosecuenciacion y la espectrometra de masa (recuadro 18-2).
18.4.3 Pruebas genticas para enfermedades por

repeticin de tripletos
Las repeticiones expandidas que causan mltiples enfermedades neurolgicas (cuadro 16-6) incluyen un grupo especial de pruebas espe
cficas de mutacin (fig. 18-2). En las enfermedades por repeticin
de poliglutamina, como la de Huntington (HD), una reaccin de
PCR aislada establece el diagnstico. Algunas de las otras afecciones
por repeticin expandida son un poco ms difciles por dos razones.
Las mutaciones completas pueden tener cientos o miles de repeticio
nes y no se amplifican con facilidad mediante PCR, en especial por
que la mayor parte de estas repeticiones tiene un contenido alto de
GC. Los alelos normales y premutacin proporcionan productos
de PCR limpios, pero en mutaciones completas quiz se requiera
Southern blotting. Adems, a diferencia de la HD, las mutaciones
causan sobre todo enfermedad por prdida de funcin y algunos indi
viduos afectados tienen deleciones o mutaciones de punto que podran
no advertirse con el solo estudio de la repeticin. Las distrofias miotnicas son las nicas enfermedades de expansin grande que pare
cen por completo homogneas desde el punto de vista mutacional.
522
CAPTULO DIECIOCHO
Cuadro 18-3. Mtodos de pruebas para una mutacin especificada.

Mtodo
Comentarios
Digestin de restriccin de DNA amplificado mediante PCR;

verificar el tamao de los productos en un gel
Slo cuando la mutacin crea o suprime un sitio de restriccin natural (fig. 7-6) o uno
con ingeniera mediante el uso de cebadores de PCR especiales (fig. 18-8)
Hibridacin de DNA amplificado mediante PCR a oligonucletidos especficos de alelo (ASO) en una dot-blot o un
chip gnico
Mtodo general para mutaciones de punto especificadas; los arreglos grandes permiten
seleccionar para casi cualquier mutacin
PCR mediante cebadores especficos de alelo (prueba

ARMS)
Mtodo general para mutaciones de punto; el diseo del cebador es fundamental (fig.
18-10)
Puede adaptarse a la tecnologa de chip
Puede brindar lecturas cuantitativas de tiempo real por medio de tecnologa TaqMan
Valoracin de ligadura de oligonucletido (OLA)
Mtodo general para mutaciones de punto especificadas (fig. 18-11)
PCR con cebadores localizados en cualquier lado de un

punto de rotura de transtocacin
La amplificacin satisfactoria muestra la presencia de la delecin sospechosa o el reor

denamiento especificado
Revisar el tamao de la repeticin expandida
Enfermedades por repeticin dinmica (seccin 16.6.4)

Las expansiones grandes requieren Southern blots,
las ms pequeas pueden hacerse mediante PCR sola
Pyrosequencing
Mtodo de alto rendimiento (recuadro 18-2)
SNAPshot
Minisecuenciacn mediante extensin de cebador (seccin 18.4.1)
Espectrometra de masa
Mtodo de alto rendimiento (recuadro 18-2)
Cuadro 1 8 -4 . Ejemplos de enfermedades que muestran una gama limitada de mutaciones.

Vase la seccin 16.3 para un comentario ms amplio de las razones por las que algunas enfermedades muestran una gama limitada de mutaciones en
tanto que otras tienen una heterogeneidad allica extensa
Entermedad
Causa
Comentarios
Enfermedad de clulas falciformes
Slo esta mutacin particular produce el fenotipo de

clula falciforme
p.E6V en el gen HBB

Vase figura 6-11
Acondroplasia
Slo G380R produce este fenotipo particular; tasa

de mutaciones muy alta
Dos cambios distintos, ambos producen

p.G380R en el gen FGFR3 (fig. 16-9)
Enfermedad de Huntington, distrofia

miotnca
Mutaciones de ganancia de funcin
Repeticiones expandidas inestables

Vase seccin 16.6.4
X frgil
Mecanismo molecular comn: expansin de una re

peticin inestable
Vase seccin 16.6.4; se observan otras muta

ciones, pero son raras
Enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
(HMSN1)
Mecanismo molecular comn: recombinacin entre

repeticiones alineadas de manera errnea
Duplicaciones de 1.5 Mb en 17p11.2 (fig.

16.8); tambin ocurren mutaciones de punto
Talasemias a y p
La seleccin para heterocigotos origina que diferen

tes mutaciones ancestrales sean comunes en distin
tas poblaciones
Vase fig. 16-2 (talasema a ) y cuadro 18-5

(talasema (3)
Enfermedad de Tay-Sachs
Efecto fundador en judos ashkenazis; ventaja de he

terocigoto antiguo
Dos mutaciones HEXA comunes en ashkenazis:

insercin de 4 pb en el exn 11 (73%); sitio de
empalme donador en el exn 11 G-*C (15%)
Fibrosis qustica
Mutaciones ancestrales comunes en poblaciones

del norte de Europa, ventaja de heterocigoto antiguo
Vanse cuadro 18-6 y seccin 4.5.3
18.5
Normal
Mutante
-In tr n -- | --Exn
DNA genmico
5' --
Cebador de PCR
3'-<f ---------
Producto de PCR 5' --
g t g
Intrn-----------------------
3'
5' GTGffiGTATT 3'
C A T GA
5'
3 ' < r ----------------
g ta tt
G T G A G T A C T l 3'
Seal
RASTREO GNICO | 523
Producto digerido con Seal

N
C A T GA I 5'
' --------- G T G T A C T 3'
Fig. 18-8. introduccin de un sitio de restriccin diagnstica artificial.

Una mutacin A->T en el sitio de empalme del intrn 4 del gen FACC no crea ni suprime un sitio de restriccin. El cebador de la PCR se detiene un poco
antes de esta base alterada, pero posee una compatibilidad errnea de base nica (G en rojo) en una posicin no critica que no impide que se hibride a
las secuencias normal y mutante y amplifique ambas. La compatibilidad errnea en el cebador introduce un sitio de restriccin AGTACT para Seal en el
producto de la PCR de la secuencia normal. Se muestra el producto digerido mediante Seal de los pacientes homocigoto normal (N), heterocigoto (H) y
homocitogo mutante (M). Cortesa de la doctora Rachel Gibson, Guys Hospital, Londres, Reino Unido.
18.4.4 El origen geogrfico es una consideracin

importante para algunas pruebas
La gentica de poblacin de enfermedades recesivas a menudo
est dominada por efectos fundadores o por los efectos de la ven
taja de heterocigotos. La resultante diversidad limitada de muta
ciones en una poblacin puede facilitar bastante las pruebas
genticas. La talasemia 3 y la fibrosis qustica son ejemplos ade
cuados. En estos dos padecimientos se describi un nmero muy
considerable de mutaciones distintas en el gen importante, pero
en cada uno unas cuantas mutaciones explican la mayor parte de
los casos en cualquier poblacin particular. En la talasemia P no
es necesario estudiar el DNA para diagnosticar a portadores o
personas afectadas -la hematologa ortodoxa lo efecta a la per
feccin- pero ste es el mtodo de eleccin para el diagnstico
prenatal. Diferentes mutaciones predominan en poblaciones dis
tintas (cuadro 18-5). A condicin de que se cuente con muestras
de DNA de los padres y se conozcan sus orgenes tnicos, casi
siempre es posible encontrar las mutaciones parentales por me
dio de una combinacin pequea de pruebas especficas, tras las
cuales el feto puede revisarse con facilidad.
En la fibrosis qustica, la mutacin F508del es la ms frecuen
te en todas las poblaciones europeas y se piensa que su origen es
antiguo. Sin embargo, la proporcin de todas las mutaciones que
son F508del vara y por lo general son ms altas en el norte y el
oeste de Europa, y ms bajas en el sur. Las pruebas para mutacio
nes de FQ se dividen en dos fases. Primero se busca un nmero
limitado de mutaciones especificadas, siempre F508del entre ellas,
con los mtodos que se describen en la seccin 18.4. Como se
muestra en el cuadro 18-6, no hay un lmite natural obvio en tr
minos de disminucin de los resultados obtenidos en pruebas
para mutaciones especficas. Cuando esta fase no revela la muta
cin, entonces, si los recursos lo permiten, puede instituirse una
seleccin para mutaciones desconocidas con el mtodo que se
describe en la seccin 18.3 o, de otro modo, recurrirse al ras
treo gnico (fig. 18-13). El impacto de esta diversidad en las pro
posiciones para seleccin de poblaciones se estudia ms adelante
(vase fig. 18-18).
Cuando una enfermedad recesiva es particularmente comn en

una cierta poblacin, con una frecuencia sorprendente resulta de
berse a ms de una mutacin. Un ejemplo es la enfermedad deTaySachs entre judos ashkenazis, en la que se observan dos mutaciones
HEXA comunes (cuadro 18-4). Es difcil explicar esta situacin ex
cepto si se asume que hubo una ventaja heterocigota sustancial en
alguna poca cuando la poblacin fundadora era pequea.
18.5
R astreo gnico
El rastreo gnico fue el primer tipo de mtodo diagnstico de DNA

que se utiliz con amplitud. Emplea el conocimiento de la locali
zacin del locus de la enfermedad en el mapa, pero no el conoci
miento del gen de la afeccin real. Por tanto es el nico mtodo
disponible para genes que se mapearon pero no se clonaron. Casi
todas las enfermedades mendelianas que constituyen el trabajo dia
rio del laboratorio de diagnstico pasaron a travs de una fase de
rastreo gnico y despus a las pruebas directas una vez que los ge
nes se clonaron. La enfermedad de Huntington, la fibrosis qustica
y la distrofia miotnica son ejemplos familiares. Sin embargo, el
rastreo gnico puede tener una funcin aun cuando ya se clon un
gen. En el ambiente de laboratorio de diagnstico no siempre es
eficaz para el costo buscar de manera cuidadosa un gen grande con
mltiples exones para encontrar cada mutacin. Ms an, ninguno
de los mtodos de estudio de mutaciones que se describen en la
seccin 18.3 es 100% sensible, de modo que siempre se presentan
casos en los que no es posible encontrar la mutacin. En estas cir
cunstancias el mtodo de seleccin es el rastreo gnico con marca
dores enlazados. Los requisitos para el rastreo gnico son:
1. mapeo adecuado de la enfermedad, de manera que puedan
usarse marcadores que se sabe que estn enlazados en forma es
trecha con el locus de enfermedad;
2. la estructura genealgica y la disponibilidad de muestras deben
permitir determinar la fase (vase a continuacin);
3. diagnsticos clnicos confirmados en forma inequvoca y ningu
na incertidumbre respecto a la localizacin del gen de enferme
dad en el mapa.
524
CAPTULO DIECIOCHO
A) Tipo silvestre AGGTCGTATCCATGCCTTACAGTCCAGG

Mutante A > C
AGGTCGTATCCCTGCCTTACAGTCCAGG
Tipo silvestre
Clula
Oligo
10A
A G G TC G TA T a C aT G C C T T A C
Compatibilidad Hyb
errnea
1
+
Mutante
Compatibilidad Hyb
errnea
2
-
10G
A G G T C G T A T g C aT G C C T T A C
10C
A G G T C G T A T C C aT G C C T TA C
++
10T
AG G T C G T A T tC a T G C C T T A C
11A
G G T C G T A T C aa T G C C T T A C A
11G
G G TCG TATCj) aT G C C TTA C A
11C
G G T C G T A T C C aTG C C TT A C A
+ i-
11T
G G T C G T A T C aaTG C C TT A C A
12A
G TC G TA TC C aTG C C TTA C A G
++
12G
G TC G TA TC C gTG C C TTA C A G
12C
G TCG TATCC CTG CC TTAC AG
++
12T
G TC G TATC Ct_T G C C TTA C A G
13A
T C G TAT C C a aG C C TTA C A G T
13G
TCGTATCCagGCCTTACAGT
13C
TCGTATCCacGCCTTACAGT
13T
TCGTATCCaTGCCTTACAGT
++
Tipo silvestre
Clula
A
G
10
11
13
10
Mutante
11
12
13
C
T
B) Tipo silvestre
DNA blanco
Cebador 1
Cebador 2
CTAGTTCGACGAGGTCGTATCCATGCCTTACAGTCCAGG
CTAGTTCGACGAGGTCGTATCCCTGCCTTACAGTCCAGG
Nucletido aadido
5' CTAGTTCGACGAGGTCGTA 3'
ddT-rojo
5' TAGTTCGACG AGGTCGTAT 3'
ddC-azul
C eb ad o r3
5' AGTTCGACGAGGTCGTATC 3'
Cebador 4
5' GTTCGACGAGGTCGTATCC 3'
ddC-azul
Cebador 5
5' TTCGACGAGGTCGTATCCA 3'
No se aadi marcador
ddG-amarillo (v. dbil)
Cebador 6
5'
T C G A C G A G G T C G T A T C C A*
ddC-azul
Cebador 7
5' CGACGAGGTCGTATCC ATG 3
ddC-azul (dbil)
Cebador 8
5' GACGAGGTCGTATCCATGC
C ebador9
5' ACGAGGTCGTATCCATGCC 3'
ddC-azul
ddT-rojo
3'
Cebador 10
5' CGAGGTCGTATCCATGCCT 3'
Cebador 11
5' GAGGTCGTATCCATGCCTT
3'
ddT-rojo
ddA-verde
Fig. 18-9. Arreglos de olgonucletidos para deteccin de mutacin.

A) Principios de la deteccin de una mutacin mediante hibridacin. Los olgonucletidos estn arreglados en grupos de cuatro, cada uno de los cuales
corresponde a las cuatro posibles bases en una posicin determinada (sombreada). Las compatibilidades errneas con la secuencia de tipo silvestre se
muestran en el cuadro interior en rojo y las compatibilidades correctas en el cuadro superior en azul. La secuencia mutante tiene una sustitucin A-*C
en la posicin 12 (rojo). Cuando las secuencias de tipo silvestre o mutante se hibridan al arreglo, el nmero de compatibilidades errneas y la potencia
de la hibridacin se muestran a la derecha. El cuadro ilustra el aspecto. La figura 7-4 presenta un ejemplo real. B) Principios de un arreglo de minisecuenciacin. Cada clula del arreglo contiene un oligonucletido compatible con parte de la secuencia blanco. Los oligos se anclan por sus extremos 5 .
Despus de la hibridacin a la secuencia blanco se usan como cebadores para la extensin de una base aislada, utilizando PT didesoxi marcados con
color. Una compatibilidad errnea en el extremo 3 ' impide la extensin; las compatibilidades errneas de una o dos bases desde el extremo proporcio
nan una reaccin dbil.
18.5
RASTREO GENICO
525
18.5.1 El rastreo gnico incluye tres pasos lgicos

El recuadro 18-3 ilustra la lgica esencial del rastreo genico. Puede
aplicarse a enfermedades con cualquier modalidad de herencia.
Siempre existe cuando menos un padre que pudo haber pasado el
alelo de la enfermedad al probando y que pudo o no haberlo hecho
en realidad. El proceso siempre sigue los mismos tres pasos:
Fig. 18-10. Prueba ARMS multiplex para detectar 29 mutaciones de

fibrosis qustica.
Cada prueba se estudia con cuatro reacciones de PCR multiplex espe
cficas de mutacin (A a D). Dentro de un multiplex cada producto es
de un tamao diferente. Si una de las 29 mutaciones est presente, se
observa una banda extra. La identidad de la mutacin es revelada por
la posicin de la banda en el gel y el carril que la contiene. Cada tubo
amplifica tambin dos secuencias testigo -s o n las bandas superior e
inferior en cada carril del gel-; difieren entre los carriles de tal manera
que cada multiplex lleva su patrn caracterstico propio. Obsrvese que
los alelos normales de mutaciones F508del (banda en el carril B) no se
valoran. Las muestras 1, 2 y 3 no exhiben bandas especficas de muta
cin. En la muestra 4 las bandas extra en los carriles A y D muestran la
presencia de F508del y 1898+1G ->A respectivamente, que indican que
este DNA proviene de un heterocigoto compuesto. Cortesa del doctor
Michelle Coleman, St. Marys Hospital, Manchester, Reino Unido; datos
obtenidos mediante el equipo Elucigene de Orchid Biosciences.
35
40
45
50
55
1. distinguir los dos cromosomas en el (los) padre(s) importante(s),

es decir, encontrar un marcador enlazado de modo cercano pa
ra el que hay un heterocigoto;
2. determinar la fase, esto es, averiguar el cromosoma que porta el
alelo de enfermedad;
3. estudiar qu cromosoma recibi la persona que consulta.
La figura 18-13 ilustra un rastreo genico para una enfermedad autosmica recesiva. Las genealogas resaltan la necesidad tanto de
una estructura genealgica apropiada (debe disponerse de DNA del
nio afectado) como de tipos de marcador informativo. Aun si el
nio afectado est muerto y es posible obtener la tarjeta Guthrie
(seccin 18.2), puede extraerse suficiente DNA para tipificacin
mediante PCR de una gota de sangre seca. En la actualidad la informatividad del marcador no es un gran problema. Con ms de
10 000 microsatlites altamente polimrficos mapeados en la to
talidad del genoma humano, siempre debe ser posible encontrar
marcadores informativos que estn situados cerca del locus de en
fermedad.
60
65
70
75
80
Fig. 18-11. Uso de la valoracin de ligadura de oligonucletido para estudiar 31 mutaciones de fibrosis qustica conocidas.
Despus de la PCR multiplex, se realiza una OLA multiplex. Los oligonucletidos de ligaduras se disean de modo que el tamao y el color del marcado
permitan distinguir los productos para cada mutacin y su contraparte normal. Se observa un producto de ligadura del sitio de mutacin de empalme
621 + 1g -t. La persona puede ser un portador o un heterocigoto compuesto con una segunda mutacin que no es una de las 31 detectadas por este
equipo. Cortesa del doctor Andrew Wallace, St. M arys Hospital, Manchester, Reino Unido; datos obtenidos por medio del equipo de ABI Biosystems.
526 ; CAPTULO DIECIOCHO
Recuadro 18-2. Dos m tod o s para la g eno tipificacin de alto ren dim iento
Pyrosequencing. Es un mtodo para examinar tiras muy cortas de se
cuencias adyacentes a un punto de inicio definido. Su principal aplicacin
se da en la tipificacin de SNR en la que slo una de dos bases se se
cuencia. Pyrosequencing emplea una combinacin ingeniosa de enzimas
para acoplar la liberacin de pirofosfato, que ocurre cuando se aade
dNTP a una cadena de DNA en crecimiento, con la emisin de luz median
te luciferasa (Fakhrai-Rad y cois., 2002). El mtodo se desarroll en un
aparato que puede analizar en form a automtica 10 000 muestras al da.
Puesto que la produccin es cuantitativa, es posible estimar las frecuen
cias allicas de un SNP en un anlisis aislado de una muestra mancomu
nada grande.
(DNA)n
dNTP
Polimerasa
(DNA)n+1
Luz
18.5.2 La recombinacin establece un lmite

fundamental en la precisin del rastreo gnico
Como el marcador de DNA que se utiliza para el rastreo gnico no
es la secuencia que causa la enfermedad, siempre es posible hacer
una prediccin errnea si la recombinacin separa la enfermedad y
el marcador. La fraccin de recombinacin, y por consiguiente la
tasa de error, puede estimarse a partir de estudios de familias me
diante anlisis de enlace estndar (cap. 13). Casi en cualquier afec
cin debe haber una eleccin adecuada de marcadores que muestren
menos de 1% de recombinacin con el locus de enfermedad. Lo an
terior se deduce de las observaciones que indican que un nucletido
en 300 es polimrfico y que los locus separados 1 Mb muestran cer
ca de 1% de recombinacin (seccin 13.1.5). En condiciones idea
les se usa un marcador intragnico, por ejemplo, un microsatlite
dentro de un intrn. Ms adelante se menciona el problema espe
cial del punto crtico de recombinacin en la distrofia muscular de
Duchenne.
Nunca puede descartarse una recombinacin entre el marcador
y la enfermedad, aun en marcadores enlazados de manera muy es
trecha, pero es posible reducir en forma considerable la tasa de error
si se emplean dos locus marcadores, situados en lados opuestos del
locus de enfermedad. Con estos marcadores de flanqueo o de
puente, una recombinacin entre cualquier marcador y la enferme
dad tambin producir un recombinante de marcador con marca
dor, que puede detectarse (p. ej., III-l, fig. 18-14). Si se observa un
recombinante marcador con marcador en la persona que consulta,
entonces no es factible efectuar una prediccin respecto a la heren
MALDI-TOF MS (del ingls, matrix-assisted lser desorption/lonization tim e-of-flight mass spectrom etry, espectrometra de masa de tiempo de
vuelo de desorcin/ionizacin con lser asistida por matriz). La espectro
metra de masa (EM) mide la relacin masa:carga de iones mediante su
aceleracin en un vaco hacia un blanco y programando su vuelo o m i
diendo qu tan lejos se desvan los iones por un campo magntico
(vase recuadro 19-7 para detalles ms am plios). El problema del uso
de EM en el anlisis de molculas grandes com o DNA o protenas con
siste en obtener iones de vuelo libre. La tcnica de desorcin/ionizacin
con lser asistida por matriz (DILAM) soluciona este problema al incluir
la macromolcula en una mancha pequea de una sustancia que absor
be la luz, que luego se vaporiza con un im pulso lser breve (M onforte y
Becker, 1997). El tiempo de vuelo hacia el blanco es proporcional a la
raz cuadrada de la relacin masa:carga.
Si se aplica al DNA, la tcnica puede medir la masa hasta de 20 kDa con
una precisin de 0.3% . La EM puede utilizarse com o una alternativa
mucho ms rpida de la electroforesis en gel para medir oligonucletidos
hasta de 100 nucletidos de largo. Las aplicaciones tpicas incluyen el
anlisis de productos de las reacciones de secuenciacin de Sanger o la
calibracin de microsatlites. Para oligonucletidos pequeos, la preci
sin es suficiente para deducir la composicin de bases directamente a
partir de la masa exacta. De otro modo los SNP pueden analizarse me
diante la extensin del cebador utilizando ddNTP de masa marcada. Las
gotas de DNA a analizar pueden arreglarse en una placa y el aparato
ioniza en form a automtica cada gota a la vez. Los sistemas actuales
pueden genotipificar decenas de miles de SNP por da y, com o la Pyrosecuencing, es posible hacer un fondo comn de las muestras para me
dir en form a directa las frecuencias de alelo.
cia de la enfermedad pero cuando menos se evita una prediccin

falsa. A condicin de que no se observe un recombinante marcador
con marcador, el nico riesgo residual es el de recombinantes do
bles. La verdadera probabilidad de un recombinante doble es muy
baja a causa de interferencia (seccin 13.1.3). Por tanto el riesgo de
error por una recombinacin inadvertida es mucho ms pequeo
que el de una prediccin errnea debida a error humano en la ob
tencin y el procesamiento de las muestras de DNA. Tal vez un
riesgo mayor es la heterogeneidad de locus inesperada, de manera
que el locus de enfermedad verdadero en la familia en realidad es
diferente del locus que se rastrea.
18.5.3 Clculo de los riesgos en el rastreo gnico

A diferencia de las pruebas directas de mutacin, el rastreo gnico
siempre incluye un clculo. Los factores que deben considerarse en
la estimacin del riesgo final comprenden:
probabilidad de una recombinacin enfermedad con marcador
y marcador con marcador;
incertidumbre, a causa de estructura genealgica imperfecta o
informatividad limitada de los marcadores respecto a quin
transmiti qu alelo marcador a quin (vase fig. 13-5C para
un ejemplo);
incertidumbre, en cuanto a que alguien en la genealoga porte
un alelo de enfermedad recin mutado (vase fig. 4-8 para un
ejemplo de este problema en la DMD).
Se dispone de dos mtodos alternativos para realizar el clculo.
18.5
RASTREO GNICO
527
C)
A)
EcoR I
Tam ao de
m a rc a d o re s "]
c /X I
(C G G )n
E coR I
0 x 1 .9
- mm
m
<2.
(C A G )n
n m e ro re p e tid o :
86
U m b ra l
d e a le lo s
n o rm a le s
55 - i
44 3 7 _ -
34
16 -4
m m
" ,IB I
1
ubi
*
7
sup
NM
10
B)
J = r
-o
10kb
9kb
Fig. 18-12. Diagnstico de laboratorio de enfermedades por repeticin de trinucletidos.
_______________________________________________ ____
A) Enfermedad de Huntington. Un fragmento del gen que contiene la repeticin (CAG)n se amplific mediante PCR y se corri en un gel de poliacrila
mida. Las bandas se revelaron mediante tincin argntica. La escala muestra los nmeros de repeticiones. Los carriles 1, 2, 6 y 10 son de una perso
na no afectada; los carriles 3 ,4 , 5, 7 y 8 son de un paciente afectado. El carril 5 es un caso de inicio juvenil; su padre (carril 4) tena 45 repeticiones
pero ella tiene 86. El carril 9 es un feto afectado, que se diagnostic antes del nacimiento. Cortesa del doctor Alan Dodge, St M arys Hospital, Manchester, Reino Unido. B) Distrofia miotnica. Southern b lo t de DNA digerido mediante fc o R I. Las bandas de 9 o 10 kb (flechas) son variantes norma
les. El abuelo paterno tiene cataratas pero ningn otro signo de distrofia miotnica. Su banda de 10 kb parece ser muy ligeramente expandida, pero no
inambiga en la prueba de este gel nicamente. Su hijo tiene una banda de 10 kb normal y otra expandida en definitiva; ella padece distrofia miotnica
clsica de inicio en el adulto. Su hijo tiene una expansin masiva y la form a congnita grave de la enfermedad. Cortesa del doctor Simn Ramsden,
St M ary's Hospital, Manchester, Reino Unido. C) X frgil. El DNA de X inactivado en una mujer, y de cualquier X que porta la mutacin completa, est
metilado. El DNA se digiere con una combinacin de EcoRI y la enzima sensible a metilacin c/XI, se somete a Southern blotted e hbrida a 0x1.9 o
una sonda similar. La X en un varn normal (carril 1) y la X normal activa en una mujer (carriles 2, 3, 4, 6) dan un fragmento pequeo (marcado N).
Los alelos premutacin no metilados (P) dan una banda un poco ms grande en los carriles 4 y 5 (portadores femeninos de premutacin) y el carril 7
(un varn transm isor normal). Las secuencias de X metilado (inactivo) no se cortan con Ec/XI y dan una banda mucho ms grande (NM), en tanto que
la secuencia plenamente expandida y metilada da una banda dispersa muy grande (F) por mosaicismo somtico. Cortesa del doctor Simn Ramsdem, St M arys Hospital, Manchester, Reino Unido.
528
CAPTULO DIECIOCHO
Cuadro 18-5. Principales mutaciones de talasemia 3 en diferentes paises.

En cada pas son frecuentes ciertas mutaciones por una combinacin de efectos fundadores y seleccin que favorece heterocigotos.
Poblacin
Mutacin
Frecuencia (%)
Efei
Efecto clnico
Cerdea
Codn 39 (C -T )
Codn 6 (delA)
Codn 76 (del C)
Intrn 1-110 (G -A )
Intrn 2-745 (C -G )
95.7
2.5
0.7
0.5
0.4
+
+
Grecia
Intrn 1-110 (G -A )
Codn 39 (C -T )
Intrn 1-1 (GA)
Intrn 1-6 (TC)
Intrn 2-745 (C -G )
43.7
17.4
13.6
7.4
7.1
+
+
China
Codn 41/42 (deiTCTT)

Intrn 2-654 (C -T )
Codn 71/72 (insA)
- 2 8 (AG)
Codn 17 (A -T )
38.6
15.7
12.4
11.6
10.5
Paquistn
Codn 8/9 (insG)

Intrn 1-5 (GC)
619-pb Delecin
Intrn 1-1 (G -T )
Codn 41/42 (deiTCTT)
28.9
26.4
23.3
8.2
7.9
+
+
Afroamericanos
- 2 9 (A -G )
- 8 8 (C -T )
Codn 24 (TA)
Codn 6 (delA)
60.3
21.4
7.9
0.8
+
+
+
Datos cortesa del doctor J. Od, Weatherall Institute of Molecular Medicine, Oxford, Reino Unido.
Cuadro 18-6. Distribucin de mutaciones de CFTR en 300 cromosomas FQ en el noroeste de Inglaterra.

Mutacin
Exn
Frecuencia (%)
F508del
G551D
G542X
G85E
N1303K
621 + 1G -T
1898+1 G -A
W1282X
Q493X
10
11
11
3
21
4
12
79.9
1154insTC
3 8 4 9 + 1 0 kb (C -T )
R553X
V520F
R117H
R1283M
R347P
E60X
Desconocido/privado
21
10
7
Intrn 19
10
10
4
20
7
3
2.6
1.5
1.5
1.2
0.9
0.9
0.9
0.6
0.6
0.6
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
7.0
Frecuencia acumulativa (%)

79.9
82.5
84.0
85.5
86.7
87.6
88.5
89.4
90.0
90.6
91.2
91.5
91.8
92.1
92.4
92.7
93.0
100
Es probable que F508del y otras cuantas mutaciones hasta cierto punto frecuentes sean antiguas y que se diseminaran a travs de seleccin que favore
ci a heterocigotos; las otras mutaciones quiz sean recientes, raras y muy heterogneas. FQ es ms homognea en esta poblacin que en la mayor de las
otras. Vase recuadro 16-2 para la nomenclatura de mutaciones. Datos cortesa del doctor Andrew Wallace, St Marys Hospital, Manchester, Reino Unido
18.5
RASTREO GNICO
529
Recuadro 18-3. Lgica del rastreo gnico

Las tres etapas de la investigacin de una enfermedad autosmica dominante de inicio tardo fueron, por una razn u otra, pruebas directas de la im po
sibilidad de mutacin.
A)
B)
C)
0-rO
2-4
2-4
ii
jtr
-o
2-1
III
i- r - Q
111-2 (flecha), que est embarazada, desea una prueba presintomtica

para demostrar si hered el alelo de la enfermedad. El primer paso es
indicar aparte los dos cromosomas de su madre. Se encuentra un
marcador, enlazado cercanamente con el locus de enfermedad, para
el que 11-3 es heterocigoto.
A continuacin debe establecerse la fase, es decir, indagar el alelo
marcador en 11-3 que est segregndose con el alelo de enfermedad.
1-2 se tipifica para el marcador. 11-3 debe haber heredado el alelo mar
cador 2 de la madre que por tanto marca su cromosoma no afectado.
Su cromosoma afectado, heredado de su padre muerto, debe ser el
que porta el alelo marcador 1.
Clculos bayesianos (vase recuadro 18-4)

El teorema de Bayes constituye un mtodo general para combinar
probabilidades dentro de una probabilidad total final. La teora y el
procedimiento se muestran en el recuadro 18-4 y en la figura 18-15
se presenta un clculo como ejemplo. En el libro de Bridge (Lectu
ras adicionales), que los lectores interesados deben consultar, pue
de encontrarse un grupo muy detallado de clculos que abarca casi
todas las situaciones concebibles en el diagnstico con DNA.
Aunque los clculos bayesianos proporcionan una respuesta r
pida en genealogas simples, pueden tornarse muy complicados en
genealogas ms complejas. Pocas personas se sienten por completo
seguras de su capacidad para estudiar una genealoga compleja co
rrectamente, aunque el intento es un ejercicio mental valioso para
seleccionar o elegir los factores que contribuyen al riesgo final. Una
alternativa es utilizar un programa de anlisis de enlace.
Empleo de programas de enlace para calcular riesgos

genticos
A primera vista puede parecer sorprendente que un programa dise
ado para calcular calificaciones lod tambin calcule riesgos gen
ticos -pero de hecho ambos se relacionan de modo cercano (fig.
18-16)-. Los programas de anlisis de enlace son herramientas pa
ra un propsito general a fin de calcular la posibilidad de una ge
nealoga con base en ciertos datos y suposiciones. Para calcular la
posibilidad de enlace se calcula la relacin:
2-1
2-1
-D
1-3
2-1
2-3
1-1
1-3
C. La tipificacin de III-2 y de su padre permite averiguar el alelo mar
cador que recibi de la madre. Si ella es 2-1 o 2-3, es una buena
noticia: hered el alelo 2 marcador de su madre, que es el alelo de
la abuela materna. SI ella tipifica 1-1 o 1-3, las noticias son malas:
hered el cromosoma del abuelo paterno, que porta el alelo de en
fermedad.
Obsrvese que lo importante es el patrn de segregacin en la familia
y no el genotipo marcador actual: si III-2 tiene el mism o genotipo mar
cador, 2-1, que su madre afectada, son buenas y no malas noticias pa
ra ella.
posibilidad de datosIenlace, fraccin de recombinacin 8

posibilidad de datos |sin enlace (0 = 0.5)
Con objeto de estimar el riesgo de que un probando porte un gen

de enfermedad, se calcula la relacin:
posibilidad de datos |el probando es un portador, fraccin de recombinacin 0
posibilidad de datos |el probando no es un portador, fraccin de recombinacin 0
Como en el recuadro 18-4, la lnea vertical |significa supngase.
18.5.4 Problemas especiales en la distrofia muscular

de Duchenne
La distrofia de Duchenne implica una gama muy amplia de proble
mas para el laboratorio de diagnstico. Por fortuna dos tercios de
las mutaciones son deleciones, que son fciles de identificar en va
rones (fig. 18-7) aunque muy desafiantes en mujeres. Es difcil pre
cisar las duplicaciones en ambos sexos y sin duda se diagnostican
menos. Treinta a 35% de mutaciones en punto implica problemas
importantes. Explorar un gen tan grande (2.4 Mb,79 exones) para
mutaciones de punto es una posibilidad atemorizante y por esta ra
zn a menudo se utiliza el rastreo gnico. Sin embargo, la DMD
presenta problemas especiales para el rastreo gnico porque la fre
cuencia de recombinacin es extremo alta a travs del gen. Aun los
marcadores intragnicos muestran 5% en promedio de recombina
cin con la enfermedad. Por consiguiente resulta prudente usar
marcadores de flanqueo, como en la figura 18-14.
530
CAPTULO DIECIOCHO
A)
B)
-o
50% de posibilidad de homocigoto normal
C)
D)
2-1
2-2
2-1
1-1: homocigoto normal (error =8 2)

2-1: portador (error = 20)
2-2: afectado (error = 4 6)
Fig. 18-13. Rastreo gnico para el diagnstico prenatal de una enfermedad autosmica recesiva.
Cuatro familias tienen un nio afectado con una enfermedad recesiva. El estudio directo de la mutacin no es posible (sea porque no se clon el gen o
porque no fue factible encontrar las mutaciones). A) No se puede establecer un diagnstico si no se cuenta con una muestra del nio afectado. B) Si to
das las personas tienen el mismo genotipo heterocigoto para el marcador, el resultado no tiene utilidad clnica. C) Si los padres son homocigotos para el
marcador, no puede hacerse prediccin alguna con este marcador. D) Prediccin exitosa. Las tasas de error que se muestran son ei riesgo de predecir
un embarazo no afectado cuando el feto est afectado, o viceversa, si el marcador empleado muestra una fraccin de recombinacin theta (6) con el
locus de enfermedad. Estos ejemplos resaltan la necesidad tanto de una estructura genealgica apropiada (debe disponerse de DNA del nio afectado)
como de tipos de marcador informativos.
Los problemas no terminan ah. Se observa una frecuencia alta

de mutaciones nuevas. Los clculos de equilibrio de seleccin-mu
tacin del recuadro 4-7 muestran que para cualquier padecimiento
recesivo mortal ligado a X (f = 0), un tercio corresponde a mutacio
nes nuevas. En consecuencia la madre de un nio aislado con
DMD slo tiene dos de tres posibilidades de ser portadora. Esto
tiene dos consecuencias desafortunadas:
complica mucho los clculos del riesgo que son necesarios pa
ra interpretar los resultados del rastreo gnico. El lector intere
sado debe consultar la obra de Bridge (Lecturas adicionales)
para ejemplo de los clculos;
como se muestra en la figura 4-8, el primer portador de una
mutacin en una genealoga de DMD suele ser un mosaico
(varn o mujer). Esto origina inclusive ms problemas tanto
para estimar el riesgo como para interpretar los resultados de
las pruebas directas.
Estos factores, aunados a un curso clnico en particular inquietan
te de la enfermedad, el riesgo de recurrencia elevado en familias y
la frecuencia alta de DMD en la poblacin significan que la DMD
quizs an sea la ms difcil de todas las enfermedades para quienes
proporcionan servicios genticos.
1 8 .6
Seleccin de poblacin
La seleccin de poblacin se deriva de manera natural de la capaci

dad para estudiar en forma directa la presencia de una mutacin.
Por tradicin se establece una distincin entre seleccin y diagns
tico. Una prueba de seleccin define un grupo de riesgo alto, que
A :5
B :6
A : 5-1
B : 3-7
Fig. 18-14. Rastreo gnico en la distrofia muscular de Duchenne

mediante marcadores de flanqueo.
La familia se tipific para dos polim orfism os A y B que flanquean el lo
cus de distrofina. III-2 puede heredar DMD slo si ella tiene una recom
binacin entre el marcador A y DMD, y otra entre DMD y el marcador
B. Si las fracciones de recombinacin son eA y eB respectivamente,
entonces la probabilidad de un recombinante doble es del orden de
eAeB, que por lo general estar bastante abajo de 1%. 111-1 tiene una re
combinacin entre el locus marcador A y DMD.
18.6
despus se somete a una prueba diagnstica definitiva. Las pruebas

de DNA son muy distintas porque no hay una seleccin separada
ni pruebas diagnsticas. Sin embargo, las propuestas para introdu
cir cualquier prueba de seleccin en la poblacin deben satisfacer
los mismos criterios (cuadro 18-7), sin considerar la tecnologa em
pleada.
18.6.1 Los programas de seleccin aceptables deben

ajustarse a ciertos criterios
Qu lograr la seleccin?
La funcin aislada ms importante de cualquier programa de selec
cin es proveer cierto resultado final til. Es bastante inaceptable in
dicar de modo inesperado a las personas que tienen el riesgo de algo
desagradable a menos que ese conocimiento les permita realizar al
go respecto al riesgo. Las propuestas para seleccionar genes que con
fieren susceptibilidad a cncer de mama o ataques cardiacos deben
estimarse con rigidez contra este criterio. Las pruebas de prediccin
para enfermedad de Huntington podran aparentar que rompen es
ta regla -pero slo se ofrecen a personas que se sabe que tienen un
riesgo alto de HD y que experimentan tal angustia por la incertidumbre que solicitan una prueba de prediccin y a pesar de la ase
sora insisten en que se les indiquen todas las desventajas-.
Como ideal el resultado final til es el tratamiento, como en
la seleccin prenatal para fenilcetonuria. El incremento de la vi
gilancia mdica slo es un resultado final til si mejora de mane
ra considerable el pronstico. Uno de los mayores riesgos de la
seleccin muy entusiasta es que puede transformar a una persona
sana en una enferma. Un caso especial es la seleccin para estado
de portador, en la que el resultado final es la posibilidad de evitar
el nacimiento de un nio afectado. Las personas que no desean
aceptar el diagnstico prenatal y la terminacin de embarazos
afectados no consideraran lo anterior un resultado final til y en
general no deben seleccionarse, aunque algunas parejas valoran el
hecho de saberlo.
SELECCIN DE POBLACIN j 531
Un marco estructural tico para seleccin

Un comit de distinguidos genetistas, clnicos, abogados y telogos
estadounidenses discuti los problemas ticos de la seleccin gen
tica de la poblacin y se refiere el lector a su informe para encon
trar un estudio muy detallado (Andrew y cois., 1994). Aunque en la
naturaleza de los problemas ticos no existen soluciones, emergen
ciertos principios:
Cualquier programa debe ser voluntario y los sujetos tienen
que tomar la decisin de optar ingresar en l.
Los programas deben respetar la autonoma y la privacidad del
sujeto.
No debe presionarse a la persona que califica positiva en la
prueba para que tome ningn curso de accin particular. Por
ejemplo, en pases con sistemas de cuidados de la salud basados
en seguros no sera aceptable que las compaas de seguros pre
sionaran a las parejas portadoras para que acepten un diagns
tico prenatal y terminen embarazos afectados.
La informacin ha de ser confidencial. Aunque esto parecera
obvio, puede ser un problema difcil -a todas las personas les
gustara pensar que quienes conducen camiones pesados o jets
jumbo se les hicieron pruebas para todos los posibles riesgos-.
Las sociedades con sistemas de cuidados de la salud basados en
seguros tienen problemas particulares respecto a la confiden
cialidad de los datos genticos porque las compaas de segu
ros argumentaran que penalizan a personas con riesgo bajo al
no cargar las primas a personas de riesgo alto.
18.6.2 La especificidad y la sensibilidad miden el

desempeo tcnico de una prueba de seleccin
Los problemas tcnicos en la seleccin de poblaciones son muy
simples en comparacin con los problemas ticos. El desempeo de
una prueba puede medirse por su sensibilidad, especificidad y va
lor de prediccin positiva (fig. 18-17).
Recuadro 18-4. Uso del teorem a de B ayes para co m b in ar p robabilidades

Una exposicin formal del teorema de Bayes es:
babilidad condicional es la probabilidad de la informacin, con base

en la hiptesis, es decir P(E | Hi) [no la probabilidad de que la hipte
sis brinde la informacin, P(Hi| E)]. Las probabilidades condicionales
para las diferentes hiptesis no siempre suman uno;
P(H i|E) = P (H i).P (E |H i)/I[P (H i).P (E |H )]

P(H) significa la probabilidad de la iava hiptesis y la lnea vertical, su
pngase", de tal manera que P(E | Hi) significa la probabilidad de la evi
dencia (E), con base en la hiptesis Hi. Es probable que un ejemplo aclare
lo anterior. Los pasos para realizar un clculo bayesiano son:
a) establecer un cuadro con una columna para cada una de las hipte
sis alternativas. Incluir todas las alternativas;
b) asignar una probabilidad previa a cada alternativa. Las probabilida
des previas de todas las hiptesis deben sumar uno. En esta etapa no
es importante preocuparse por la informacin exacta a utilizar para
decidir la probabilidad previa, en tanto sea compatible a travs de las
columnas. No se estar usando toda la informacin (de otra manera
no tendra caso efectuar el clculo porque ya se contada con la res
puesta) y cualquier informacin no empleada en la probabilidad pre
via puede usarse despus;
c) con un tem de la informacin no incluido en las probabilidades pre
vias, calcular una probabilidad condicional para cada hiptesis. Pro
d) si hay ms puntos de informacin que an no se incluyeron, el paso

(c) se repite tantas veces com o sea necesario hasta que se emplee
toda la informacin una vez y slo una. El resultado final es un nme
ro de lneas de probabilidades condicionales en cada columna;
e) dentro de cada columna, multiplicar entre s la prioridad y todas las
probabilidades condicionales. Esto proporciona una probabilidad de
unin, P(Hi), P(E|H). Las probabilidades de unin no necesariamen
te suman uno a travs de las columnas;
f)
s slo hay dos columnas, las probabilidades de unin pueden usar

se de modo directo como razones de posibilidades. De otro manera
las probabilidades de unin pueden incrementarse para obtener las
probabilidades finales que suman uno. Ello se realiza mediante la di
visin de cada probabilidad de unin por la suma de todas las proba
bilidades de unin, I (P(Hi).P(E j Hi)].
532
CAPTULO DIECIOCHO
Valor predictivo de una prueba

Tal vez de manera inesperada, los resultados positivos falsos de una
prueba pueden implicar un problema ms importante que los ne
gativos falsos. Aun si es posible eliminarlos despus mediante una
prueba diagnstica, muchas personas se habrn preocupado de mo
do innecesario por resultados positivos falsos. El cuadro 18-8 mues
tra que si una prueba tiene una tasa importante de positivas falsas,
entonces el valor de prediccin es demasiado bajo excepto cuando
se estudian padecimientos muy frecuentes. En este sentido las prue
bas de DNA pueden Ser muy adecuadas para la seleccin de pobla
cin porque, en comparacin con las pruebas bioqumicas que
utilizan umbrales arbitrarios, deben arrojar muy pocos positivos
falsos.
Hiptesis: lll2 es
Probabilidad previa
Un portador
1/2
No es portador
1/2
Condicional (1): resultado del DNA 0.05
0.95
Condicional (2): datos de CK
0.7
Probabilidad de unin
0.0175
0.475
Probabilidad final
0.0175/0.4925
0.475/0.4925
= 0.036
= 0.964
Fig. 18-15. Un clculo bayesiano del riesgo gentico.

III-2 desea conocer su riesgo de ser un portador de DMD, que afect a
su hermano 111-1 y a su to 11-1. La prueba de cinasa de creatinina sri
ca (un indicador de dao muscular subclnico frecuente en portadores
de DMD) dio razones de posibilidades de portador:no portador de
0.7:1. Un marcador de DNA que muestra un promedio de 5% de re
combinacin con DMD dio los tipos que se muestran. Este clculo del
riesgo, segn los lineamientos que se incluyen en el recuadro 18-4,
proporciona el riesgo global de portador de la paciente de 3.6%.
Sensibilidad de una prueba

Una prueba debe captar una proporcin razonable de su blanco
pretendido (es decir, la sensibilidad debe ser alta). Si bien el va
lor predictivo de las pruebas de DNA parece alentador, la sensi
bilidad suele depender del grado de heterogeneidad allica. A
menos que una enfermedad muestre una homogeneidad ex
traordinaria (cuadro 18-4), no resulta prctico hacer pruebas
para toda mutacin concebible, en especial en un programa de
seleccin de poblacin de rendimiento grande. Por lo general
slo se estudiar un subgrupo de mutaciones. La figura 18-18
ilustra la forma en que la eleccin de las mutaciones puede afec
tar el resultado final de un programa de seleccin de portador
de fibrosis qustica (FQ).
Es claro que el solo estudio de la mutacin ms comn F508del
no producir un programa aceptable. Ms nios afectados naceran
de parejas negativas en el programa de seleccin de los que se de
tectaran por la seleccin. Sea o no que este programa resulte eficaz
para el costo en trminos financieros, con toda seguridad sera ina
ceptable desde el punto de vista social. Es difcil definir lo que
constituye un programa aceptable. Una sugerencia se enfoca en pa
rejas
(esto es, parejas con un portador conocido y el com
paero negativo en todas las pruebas). El compaero an podra ser
un portador de una mutacin rara. Ten Kate sugiri que un progra
ma de seleccin aceptable es aqul en el que el riesgo de estas pare
jas +/ no es ms alto que el de la poblacin general antes de la
seleccin. La seleccin para FQ de europeos del norte requerira
una sensibilidad aproximada de 95%.
18.6.3 Organizacin de un programa de seleccin

gentica
Si se asume que el programa propuesto parece aceptable desde el
punto de vista tico y eficaz para el costo, a quin debe seleccio
narse? Tres ejemplos destacan algunas de las opciones.
Seleccin neonatal: seleccin para fenilcetonuria

Fig. 18-16. Empleo de programas de anlisis de enlace para calcu
lar riegos genticos.
Con base en la informacin de cualquiera de dos de estos sujetos,
el programa puede calcular el tercero. Para anlisis de enlace, se
proporciona al programa A) y B) y se calcula C). Para calcular riesgos
genticos, se proporciona al programa B) y C) y se calcula A).
Todos los nios del Reino Unido se someten a pruebas para fenilcetonuria unos cuantos das despus del nacimiento. Una gota de
sangre de una puncin en el taln se rene en una tarjeta (la tarje
ta Guthrie) durante una visita a la casa y se enva a un laboratonc
central. El valor sanguneo de fenilalanina se mide mediante cro
matografa o por una prueba de crecimiento bacteriano. sta es k
prueba de seleccin. Los nios cuyo valor excede un umbral so"
18.7
EL PERFIL DE DNA PUEDE UTILIZARSE PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS Y DETERMINAR RELACIONES
533
Cuadro 18-7. Requerimientos para un programa de seleccin de poblacin.

Requerimiento
Ejemplos y comentarios
Un resultado positivo debe conducir a alguna accin til
Tratamiento preventivo; por ejemplo, dieta especial para FCU

Revisin y eleccin de opciones de reproduccin en la seleccin de portador para FQ
El programa completo debe ser aceptable desde los puntos

de vista social y tico
Los sujetos deben optar con consentimiento informado

La seleccin sin asesora es inaceptable
No debe haber presin para terminar embarazos afectados
La seleccin no debe considerarse discriminadora
La prueba ha de tener sensibilidad y especificidad altas
Las pruebas con muchas negativas falsas reducen la confianza en el programa

Las pruebas con muchas positivas falsas, aun si despus se eliminan mediante una
prueba diagnstica definitiva, pueden crear valores inaceptablemente altos de ansiedad
en personas normales
Los beneficios del programa tienen que superar sus costos
No es tico utilizar en forma ineficiente presupuestos para cuidados de la salud limitados
llamados para una prueba diagnstica definitiva. Por ltimo resul

ta que slo una proporcin pequea tiene fenilcetonuria. El bene
ficio que reciben los recin nacidos con el tratamiento diettico
justifica la falta de consentimiento informado (Smith, 1993).
Seleccin prenatal: seleccin para talasemia 3

Las pruebas hematolgicas convencionales, ya sea antes del matri
monio o en la clnica antenatal, permiten a los portadores de tala
semia |3. A las parejas de portador con portador puede ofrecrseles
diagnstico prenatal mediante anlisis del DNA. En el Reino Uni
do dos grupos tnicos tienen una incidencia alta de talasemia: los
chipriotas y los paquistanes. Aunque los chipriotas aceptaron con
rapidez la seleccin, la aceptacin ha sido ms lenta entre paquista
nes. La comparacin ilustra los complejos problemas sociales que
rodean la seleccin gentica y la importancia del antecedente
cultural (Gil y Modell, 1998). Como hecho importante, estu
dios a largo plazo de la comunidad chipriota muestran cmo es
posible medir el xito de la seleccin no por las cuentas de fetos
afectados abortados, sino por el nmero de parejas que tienen fa
milias normales. Antes de contar con una seleccin muchas pa
rejas chipriotas portadoras optaban por no tener nios; ahora
utilizan la seleccin y tienen familias normales (Modell y cois.,
1984). Es posible que algn da el diagnstico preimplantacin
o los trasplantes de clulas madre fetales se constituyan en alter
nativas a la terminacin de embarazos afectados cuando menos
para las personas adineradas en pases ricos.
Seleccin de poblacin para portadores: propuestas para

fibrosis qustica
En la actualidad es tcnicamente factible y merece la pena desde el
punto de vista econmico someter a seleccin a poblaciones del
norte de Europa para detectar portadores de fibrosis qustica (FQ).
Las encuestas en el Reino Unido sugieren que la mayor parte de las
parejas de portador con portador optara por el diagnstico prena
tal y valorara la oportunidad de asegurarse que no tendrn nios
afectados. Este concepto podra cambiar si el tratamiento se torna
ra ms eficaz, por ejemplo, mediante la teraputica gnica.
Si se piensa introducir un programa de seleccin es necesario

considerar dos grupos de preguntas: cuntas mutaciones debe es
tudiar el laboratorio? y a quin debe ofrecerse la prueba? El pro
blema originado por la heterogeneidad allica ya se coment (vase
fig. 18-18). En cuanto a quines deben seleccionarse, el cuadro 18-9
muestra algunas posibilidades que se consideran en el Reino Uni
do. La forma de organizacin del suministro de cuidados de la sa
lud en cada pas determinar de manera natural los lmites de las
posibilidades. Resultados preliminares de estudios piloto controla
dos sugieren que ninguno de los mtodos tuvo los efectos negati
vos (aumento de ansiedad) que se predijeron en ocasiones.
18.7
El perfil de DNA puede utilizarse

para id en tificar individuos y
d eterm in ar relaciones
El trmino p e r fil d e DNA se refiere al uso general de pruebas de

DNA con el fin de establecer identidad o relaciones. La huella
de DNA se reserva para la tcnica inventada por Jeffreys y cois.
(1985) que emplea sondas para mltiples locus. Para mayores
detalles respecto a esta rea total, el lector debe consultar el li
bro de Evett y Weir (1998; vase Lecturas adicionales).
No
A fectad o a fe c ta d 0
+ve en la
p ru e b a
-v e en la
p ru eb a
S ensib ilid ad d e la p ru e b a = a /(a + c)

E specificidad d e la p ru e b a = d /(b + d)
Valor d e p red icci n po sitiva = a /(a + b)
Fig. 18-17. Sensibilidad y especificidad de una prueba de seleccin.
534
CAPTULO DIECIOCHO
Cuadro 18-8. Una prueba que se conduce bien en el laboratorio puede ser intil para seleccionar poblacin.
Prevalencia del
padecimiento
Positivas verdaderas
en la poblacin
seleccionada
Positivas verdaderas
detectadas
mediante seleccin
Negativas verdaderas
en la poblacin
seleccionada
Positivas falsas
detectadas
mediante seleccin
Valor predictivo
de la prueba
1/1 000
1 000
990
999 000
9 990
0.09
1/10 000
100
99
999 900
9 999
0.0098
1/100 000
10
10
999 990
10 000
0.001
En un estudio de laboratorio de un grupo de 100 afectados y 100 personas testigo esta prueba hipottica fue 99% precisa: arroj un resultado positivo
para 99% de positivos verdaderos y uno negativo para 99% de negativos verdaderos. El cuadro muestra los resultados de la seleccin de un milln de
personas. La vasta mayora de las personas positivas en la prueba la conforman positivas falsas. Es improbable que esta prueba sea socialmente acep
table o econmicamente viable para ninguna enfermedad mendeiiana (sta suele afectar a menos de una persona en mil).
18.7.1 Para el perfil suele emplearse una diversidad de

polimorfismos de DNA diferentes
Huella de DNA mediante sondas minisatlite
Estas sondas contienen la secuencia central comn de una secuen
cia repetida esparcida hipervariable GGGCAGGAXG descubierta
por Jeffreys y colaboradores (1985) en el gen de mioglobina. La se
cuencia se encuentra en muchos minisatlites esparcidos en el genoma en cada uno de los cuales el nmero de repeticiones tndem
vara entre los individuos. Cuando se hibridan a Southern blots, las
sondas proporcionan una huella de bandas especfica del individuo
(fig. 18-19). La huella de DNA revolucion la prctica forense, pe
ro en la actualidad es obsoleta a causa de dos problemas:
el procedimiento Southern blot requiere varios microgramos
de DNA, que corresponden al contenido de tal vez un mi
lln de clulas;
no es posible indicar qu pares de bandas en una huella repre
sentan alelos. Por consiguiente, cuando compara dos huellas de
DNA, el investigador equipara cada banda en forma individual
mediante la posicin y la intensidad. La distancia continua
mente variable a lo largo del gel tiene que dividirse en varias
secciones. Las bandas que se encuentran dentro de la misma
seccin se consideran compatibles. A continuacin, por ejem
plo, si son 10/10 bandas compatibles, las razones de posibili
dades de que el sospechoso sea la fuente de la muestra, en lugar
de una persona aleatoria de la poblacin, son 1:pu>, donde p es
la posibilidad de que una banda de una persona aleatoria sea
compatible con una banda determinada (se simplific al asu
mir que p es la misma para cada sector e ignorando la necesi
dad de compatibilidad tanto en la intensidad como en la
posicin). Inclusive para p = 0.2, p1 slo es 10 1. Es imperati
vo usar los mismos criterios de secciones para juzgar la compa
tibilidad entre dos perfiles y a fin de calcular p. Los criterios
pueden ser arbitrarios dentro de ciertos lmites, pero deben ser
consistentes.
Perfil de DNA mediante marcadores microsatlites

En el perfil de locus nico se emplean polimorfismos microsatli
tes (seccin 9.4.3), por lo general repeticiones de trinucletidos o
tetranucletidos que pueden tipificarse mediante PCR. En teora es
posible tipificar aun una clula aislada que qued en la escena de
un crimen. Los alelos pueden definirse sin ambigedad por el n

mero de repeticiones precisas, lo que evita el problema de las sec
ciones. El conocimiento de la frecuencia gnica de cada alelo en la
poblacin permite realizar un clculo exacto de la probabilidad de
paternidad, de que el sospechoso no sea el violador, etc. Los geno
tipos combinados en 10 a 15 locus muy polimrficos no enlazados
suelen mostrar la suficiente singularidad para que sean definitivos
de una manera u otra. Variaciones menores (VAM) dentro de uni
dades repetidas de algunos microsatlites hacen posible discriminar
una variedad casi infinita de alelos, de modo que los genotipos en
un locus aislado bastaran para identificar a un individuo (Jeffreys
y col., 1991), pero el mtodo de tipificacin de VAM an es un
estudio de investigacin.
Uso del cromosoma Y y polimorfismos mitocondriales

El cromosoma Y y los polimorfismos de DNA mitocondrial son en
especial tiles para rastrear relaciones con personas muertas porque
en cada caso un individuo hereda el genotipo completo de un an
cestro aislado definible. Un ejemplo interesante fue la identifica
cin de los restos del zar de Rusia y su familia, asesinados por los
bolcheviques en 1917, mediante la comparacin de perfiles de
DNA de restos exhumados con familiares distantes vivos (Gil y
cois., 1994).
18.7.2 El perfil de DNA puede usarse para determinar la

cigosidad de gemelos
En el estudio de caracteres no mendelianos (cap. 15), y en ocasio
nes en asesora gentica, es importante saber si un par de gemelos
es monocigtico (MC, idntico) o dicigtico (DC, fraterno). Los
mtodos tradicionales dependen de la valoracin de la semejanza
fenotpica o del estado de las membranas al nacer (los gemelos con
tenidos en un corion siempre son MC, aunque lo contrario no es
cierto). Los errores en la determinacin de la cigosidad incrementan
en forma sistemtica las estimaciones de heredabilidad de caracte
res no mendelianos, porque gemelos DC muy similares se consideran
de modo errneo como MC, en tanto que gemelos MC muy dife
rentes se califican en forma equivocada como DC.
Los marcadores genticos proporcionan una prueba de cigosi
dad mucho ms segura. Race y Sanger (vase Lecturas adicionales
resumieron la bibliografa extensa, pero hoy en da obsoleta, refe
rente al uso de grupos sanguneos para este propsito. El perfil de
DNA es ahora el mtodo de eleccin. La sonda de huella de Jeffreys
18.7 | EL PERFIL DE DNA PUEDE UTILIZARSE PARA IDENTIFICAR INDIVIDUOS Y DETERMINAR RELACIONES 1 535
10 000 personas seleccionadas
Fig. 18-18. Carta de flujo para la seleccin de poblacin de fibrosis qustica (FQ).
Resultados de la seleccin de 10 000 personas, 1:23 de las cuales es un portador. Si una persona tiene una prueba positiva, a continuacin se estudia
a su cnyuge. Las figuras en negro muestran los resultados del empleo de una prueba que detecta 70% de las mutaciones de FQ (es decir, prueba para
F508del solamente); las figuras en rojo indican los resultados de una prueba con 90% de sensibilidad. Los cuadros de color rosa representan casos que
podran considerarse xitos para el programa de seleccin (sin considerar la accin que tomen despus), los cuadros grises representan fracasos. OPN,
diagnstico prenatal.
Cuadro 18-9. Posibles formas de organizar la seleccin de poblacin para portadores de fibrosis qustica (F Q ).
Grupo estudiado
Ventajas
Desventajas
Recin nacidos
Se organiza con facilidad
Sin consecuencias durante 20 aos

Muchas familias olvidaran el resultado
No es tico estudiar a nios
Quienes salen de la escuela

Informar a las personas antes que inicien relaciones
Dificultad para llevarla a cabo ticamente

Riesgo de estigmatizacin de portadores
Parejas de listas de mdicos
La pareja es una unidad de riesgo

Resaltar la funcin de los mdicos
en la medicina preventiva
Permitir tiempo para tom ar decisiones
Dificultad para controlar la calidad de la asesora
Mujeres en clnicas antenatales

Resultados rpidos
Efecto de bomba para portadores

Quiz no se disponga del compaero
Presin de tiempo en el laboratorio
Voluntarios adultos
( centro de FQ para quienes pasan )
Pocos problemas ticos
Mala estructura para asesora

No dirigida a los que la utilizan apropiadamente
Uso ineficiente de recursos?
536
CAPTULO DIECIOCHO
brinda una impresin inmediata: las muestras de gemelos MC se

ven como la misma muestra cargada dos veces y los especmenes de
gemelos DC muestran diferencias. Cuando se utilizan marcadores
de locus nico, si los gemelos dan los mismos tipos, entonces se
calcula la probabilidad para cada locus de que los gemelos DC ten
gan el mismo tipo. Si se tipificaron los padres, se siguen los princi
pios mendelianos; de otra manera debe calcularse la probabilidad
de que la tipificacin de gemelos DC sea la misma para cada posi
ble pareamiento parental y sopesarse con la probabilidad de ese pareamiento calculado a partir de frecuencias gnicas en la poblacin.
Las probabilidades resultantes (no enlazadas) para cada locus se
multiplican a fin de proporcionar una probabilidad total P[ de que
los gemelos DC daran los mismos resultados con todos los marca
dores empleados. La probabilidad de que los gemelos sean MC es
entonces:
Pm = m i [m + ( l - m ^ ! ]
A)
B)
M C F1 F2
O
O
X
o
til
O
>
O
w
a
co
LLi
T- CM rt
mS
* 5
en la que m es la proporcin de gemelos en la poblacin que son

MC (alrededor de 0.4 para pares de sexo igual). El apndice 4 de Vogel y Motulsky (Lecturas adicionales) presenta clculos de muestra.
18.7.3 El perfil de DNA puede emplearse para descartar

o establecer la paternidad
Excluir la paternidad es muy simple: si el nio tiene un alelo mar
cador que no se encuentra en la madre ni en el supuesto padre en
tonces, excluyendo nuevas mutaciones, el presunto padre no es el
biolgico. Demostrar la paternidad es imposible en principio -nunca ser factible demostrar que no existe otro hombre en el mundo
que pudiera haber dado al nio ese grupo particular de alelos mar
cadores.Todo lo que puede hacerse es establecer una probabilidad
de no paternidad que es lo bastante baja para satisfacer a las cortes
y tal vez al posible padre.
Para este propsito suelen utilizarse con amplitud sondas de
huella de DNA (fig. 18-19). Como se explic, las bandas deben
seccionarse segn un esquema arbitrario pero consistente con obje
to de decidir si cada banda no materna en el nio se ajust o no a
una banda en el supuesto padre. Los microsatlites de locus nico
permiten un clculo ms explcito de las razones de posibilidades
(fig. 18-20). Una serie de 10 marcadores de locus nico muy polimrficos no relacionados arroja razones de posibilidades abruma
doras que favorecen la paternidad si todas las bandas corresponden.
18.7.4 El perfil del DNA es un medio potente para las

investigaciones forenses
El perfil del DNA para propsitos forenses sigue los mismos prin
cipios de las pruebas de paternidad. Materiales hallados en la esce
na del crimen (manchas de sangre, cabellos o un frotis vaginal de
una vctima de violacin) se tipifican y comparan con una muestra
de DNA del sospechoso. Una de las aplicaciones ms potentes del
perfil de DNA es evitar abusos de la justicia al demostrar que un
sospechoso no es el criminal. Si las muestras no corresponden, el sos
pechoso se descarta sin considerar cualquier prueba circunstancial
que indique lo contrario.
Cuando todos los genotipos corresponden, la corte necesita sa
ber la razn de posibilidades de que el criminal sea el sospechoso en
lugar de un miembro al azar de la poblacin. Por supuesto las razo
nes de posibilidades seran muy distintas si la alternativa fuera el
hermano o el gemelo idntico de un sospechoso. El destino de la
Fig. 18-19. Usos legal y forense de la huella de DNA.

La huella de DNA revolucion la prctica forense, aunque ahora ha sido
superada por el perfil mediante polim orfism os de locus nico mltiple.
A) Una prueba de paternidad. Se muestran las huellas de la madre (M),
el nio (C) y dos posibles padres (F1, F2). La huella de DNA de F1
contiene todas las bandas paternas que se encuentran en el nio, en
tanto que F2 slo tiene una de las bandas paternas. B) Un caso de vio
lacin. La huella del sospechoso 1 es compatible a la perfeccin con
la muestra del semen 1 en un frotis vaginal de la victima. Como resul
tado de esta prueba se hicieron cargos al sospechoso 1 de violacin y
se le encontr culpable. Fotografa cortesa de Cellmark Diagnostics,
Abingdon, Oxfordshire, Reino Unido.
prueba de DNA en las cortes brinda informacin fascinante respec

to a la diferencia entre las culturas cientfica y legal. Supngase que
el perfil de DNA de un sospechoso es compatible con la muestra
de la escena del crimen. An existen cuando menos tres obstculos
para el uso racional de los datos del DNA:
El jurado puede no creer, o tal vez elegir ignorar, los datos del
DNA, como sucedi en el juicio de O. ]. Simpson [vase Weir
(1995) para un relato fascinante de este caso]. Quiz decidan
que el DNA incriminador se plant.
Un abogado inescrupuloso puede intentar llevar al jurado ha
cia un argumento de falsa probabilidad, la llamada falacia del
fiscal. sta consiste en confundir la probabilidad de que el sos-
BIBLIOGRAFA
Ai A 2
_______ _______ I
I Padre
I I supu esto
A3 A4
A 1A 3
Fig. 18-20. Empleo de marcadores de locus nico para una prueba

de paternidad.
Las razones de posibilidades de que el supuesto padre, en lugar de un
miembro aleatorio de la poblacin, sea el verdadero son 1 / 2:q3, donde
q3 es la frecuencia gnica de A3. Se utilizara una serie de n marcado
res no enlazados y si no se excluyera la paternidad, las razones de po
sibilidades seran (1/2)n:qA.qB.qc...qN.
pechoso sea inocente, a partir de la compatibilidad, con la pro

babilidad de un compatible, lo que conduce a considerar que
el sospechoso es inocente. El jurado debe tomar en cuenta la
primera probabilidad y no la segunda. Como se muestra en el
recuadro 18-5, las dos son muy diferentes.
Pueden surgir objeciones respecto a algunos de los principios
con los que se calcularon las probabilidades basadas en DNA:
a) el principio multiplicativo, de que las probabilidades totales
puedan obtenerse al multiplicar las probabilidades indivi
537
duales para cada alelo o locus, depende de la suposicin de

que los genotipos son independientes. El clculo sera err
neo si en realidad la poblacin consistiera en grupos de
reproduccin aislados, cada uno de los cuales tuviera geno
tipos que fueran muy constantes dentro de un grupo pero
muy diferentes entre grupos. Este hecho es importante por
que el principio multiplicativo es el que permite establecer
estas posibilidades excesivamente definidas;
b) para marcadores de un locus aislado, la probabilidad depen
de de las frecuencias gnicas. Los laboratorios de perfiles de
DNA conservan bases de datos de frecuencias gnicas, pero
stas se determinaron en un grupo tnico apropiado para
el caso que se estudia?
Si se lleva a extremos, el argumento de la independencia de los geno
tipos implica que la prueba de DNA podra identificar que el crimi
nal pertenece a un grupo tnico particular, pero no mostrara qu
miembro del grupo cometi el crimen. Estos problemas son objeto
de discusiones muy extensas, sobre todo en las cortes estadouniden
ses. El argumento es vlido en principio, pero el problema es si en la
prctica implica una diferencia suficiente para que importe. Est cla
ro que en general no es as. Sera irnico que las cortes, al observar
testigos expertos opuestos que brindan razones de posibilidades de
identificacin correcta que difieren un milln de veces (105: 1 com
parado con 10 :1), decidieran que la prueba de DNA es desesperanzadoramente insegura y en lugar de ello confiaran en la identificacin
ocular del testigo (razones de posibilidades de identificacin correcta
50:50).
Recuadro 18-5. La falacia del fiscal

El perfil de DNA del sospechoso es compatible con una muestra de la es
cena del crimen. Esto lo hace culpable? Considrense dos probabilida
des distintas:
la probabilidad de que el sospechoso sea inocente, con base en la
compatibilidad;
la probabilidad de una compatibilidad, tomando en cuenta que el sos
pechoso es inocente.
A partir de la notacin bayesiana (recuadro 18-4) con M = compatible,
G = el sospechoso es culpable, I = el sospechoso es nocente, la prime
ra probabilidad es Pt |M , y la segunda es PM|I. La falacia del fiscal con
siste en argumentar que la probabilidad importante es PM|I cuando de
hecho es P||M . El clculo siguiente muestra qu tan diferentes son estas
dos probabilidades.
Si el sospechoso fuera culpable, las muestras necesariamente seran
compatibles: PM | G = 1. Supngase que los argumentos genticos de
poblacin dicen que hay una posibilidad de 1 en 10 6 de que una perso
na seleccionada de modo aleatorio tenga el m ism o perfil que la mues
tra del crimen: PM|I = 1 0 6. Asmase que la persona culpable pudo
haber sido uno de 107 varones en la poblacin. Si no existe alguna otra
prueba que lo implique, slo es un miembro aleatorio de la poblacin y

la probabilidad previa de que sea culpable (antes de considerar la prue
ba de DNA) es PG= 1 0 -7 . La probabilidad previa de que sea inocente
es P, = 1 - 1 0 ' 7, = 1.
El teorema de Bayes indica que
P||M = (P|Pm |I)/[(P |P m |I) + (Pg Pm |G)]

= 10~6/( 1 0 ~ 6 + 10 7)
= 1 .0 / 1.1
= 0.9
Ya se vio que
PM11 = 1 0 6 ison muy diferentes!
Las cortes se engaan a s mismas al ignorar la prueba abrumadora de
DNA, pero este clculo tambin muestra que la prueba de DNA por s m is
ma no podra condenar con seguridad a alguien cuando no existe otra
prueba contra l, a menos que PM 11 fuera bastante menor de 10~6. Es
necesario considerar lo anterior cuando se planea seleccionar a todos los
varones en una ciudad grande para encontrar a un violador.
B rid g e PJ (1997) The Calculation of Genetic Risks - Worked Exam
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PARTE
CUATRO
Nuevos horizontes:
en el siglo XXI
Ms all del proyecto del genoma: genmicafuncional, protemica
y bioinformtica
541
20
Manipulacin gentica de clidas y animales
577
21
Nuevas conductas para el tratamiento de enfermedades
611
19
CAPTULO
DIECINUEVE
Ms all d el p royecto d el genom a:

genm ica fu n cion al, protem ica
y bioinform tica
542 | CAPTULO DIECINUEVE I MS ALL DEL PROYECTO DEL GENOMA
19.1
G eneralidades de genm ica

funcional
19.1.1 La informacin obtenida de la fase estructural

del Proyecto del Genoma Humano es de uso
limitado sin una anotacin funcional
El objetivo final de la fase estructural del Proyecto del Genoma
Humano fue proporcionar la secuencia completa del genoma: ]de
todos los tres mil millones de pares de bases de ella! Como se co
menta en el captulo 8, en febrero de 2001 se publicaron dos bos
quejos de secuencias (International Human Genome Sequencing
Consortium, 2001; Venter y cois., 2001) y hacia mediados del ao
2003 se dispuso de secuencias terminadas. Aunque es indudable
que constituyen un logro sin paralelo en biologa, las secuencias no
son por s mismas particularmente informativas. En esencia son
apenas cordones largos de las cuatro letras A, C, G y T. Los datos
de las secuencias deben explorarse a fin de extraer informacin til
para encontrar la forma en que esta secuencia del genoma ayuda a
construir un ser humano funcional.
Una de las primeras labores posteriores a la secuenciacin en
cualquier proyecto de genoma es identificar todos los genes pues
to que representan las principales unidades funcionales del geno
ma. En el Proyecto del Genoma Humano se identificaron muchos
genes en estudios previos. Otros se predijeron con base en su es
tructura, su conservacin en otros genomas o en el hecho de que
eran compatibles con marcadores de secuencia expresados (MSE)
(seccin 8.3.5). El nmero exacto de genes humanos an se des
conoce, pero casi todas las estimaciones actuales concuerdan en
una cifra cercana a 30 000. Por tanto todava est muy lejos de en
samblarse un catlogo gnico completo y preciso del genoma hu
mano. Sin embargo, incluso si se dispusiera de este recurso, no
representara nada ms que una lista de componentes. Puesto que
antes de comenzar a comprender cmo forman estos componen
tes un ser humano es necesario saber lo que realizan, la siguiente
labor consiste en determinar las funciones precisas de cada uno de
los genes del genoma humano, un proceso que se conoce como
anotacin funcional.
19.1.2 Las funciones de genes individuales pueden

describirse a niveles bioqumico, celular
y del organismo completo
En realidad la funcin de un gen es la funcin de su(s) producto(s).
Casi todos los genes codifican protenas, pero una parte muy gran
de (vase fig. 9-4) elabora molculas de RNA no codificante. Las
funciones de los productos de los genes humanos pueden clasificar
se en tres niveles:
Bioqumico. Por ejemplo, una protena puede describirse como
una cinasa o una protena de enlace de calcio. Esto indica poco res
pecto a su funcin ms amplia en el organismo.
Celular. Proporciona informacin acerca de la localizacin intracelular y las vas biolgicas. Por ejemplo, es posible determi
nar que una protena se localiza en el ncleo y que se requiere
para reparar el DNA aun si su funcin bioqumica precisa se
desconoce.
Organismo. Suele informar dnde y cundo se expresa un gen, y
su funcin en la enfermedad. Por ejemplo, el gen HD produce
dos transcritos mayores, uno de los cuales se enriquece en el ce

rebro y codifica una protena llamada huntingtina. Las mutacio
nes que incrementan el nmero de residuos de glutamina en esta
protena ms all de un cierto lmite causan la enfermedad de
Huntington (seccin 16.6.4). Queda por establecer las funciones
bioqumicas y celulares precisas del producto gnico en personas
sanas.
Se requiere informacin a estos tres niveles para obtener un cua
dro perfecto de la funcin de los genes humanos. El recuadro 19-1
muestra como ejemplo la clasificacin funcional del gen humano pa
ra la glucocinasa. Un gran adelanto reciente en genmica funcional es
el establecimiento de vocabularios precisos para describir la funcin
gnica a travs de todos los genomas. Un ejemplo es el sistema Gene
Ontology (Gene Ontology Consortium, 2000; 2001; vase http://www.
geneontology.org/). Otros sistemas tiles incluyen los que emplea la
Kyoto Encyclopedia of Genes y el ms antiguo y empleado de todos,
el sistema Enzyme Commission para la clasificacin de enzimas.
19.1.3 Las relaciones funcionales entre los genes

deben estudiarse a niveles del transcriptoma
y el proteoma
Aun si fuera factible identificar y asignar una funcin a cada gen del
genoma, esto no demostrara la manera en que los productos gnicos coordinan las actividades biolgicas necesarias para formar un
ser humano vivo. Una situacin anloga sera la descripcin funcio
nal detallada de todos los componentes de un vehculo. El perno
sostiene el motor al chasis; ste es parte de la columna de conduc
cin y ste es un interruptor elctrico que opera las luces indicado
ras, pero cmo funciona en realidad el vehculo? Para apreciar el
modo en que las funciones de miles de genes se combinan para ge
nerar un ser humano deben estudiarse de manera directa los pro
ductos gnicos. Aunque discutible, el gran propsito de la biologa
molecular durante los ltimos 30 aos ha sido determinar las fun
ciones de los genes y enlazarlos en vas y redes para explicar cmo
funcionan los seres vivientes. Sin embargo, en fecha reciente el en
foque cambi de la conducta reduccionista del estudio de genes y
sus productos, uno a la vez, a una conducta holstica en la que
muchos o de hecho todos los productos gnicos se estudian al mis
mo tiempo. Este anlisis global de la funcin gnica es la base de la
genmica funcional.
Un concepto central en genmica funcional es la expresin del
genoma para producir el transcriptoma y el proteoma. El trans
criptoma es el conjunto completo de mRNA en una clula par
ticular y representa la produccin combinada de transcripcin,
procesamiento y recambio de RNA (Velculescu y cois., 1997). Lo
anterior es esencial para definir el proteoma, el conjunto comple
to de protenas en una clula particular (Wasinger y cois., 1995).
Es importante reconocer que el transcriptoma y el proteoma son
mucho ms complejos que el genoma. Un gen aislado puede pro
ducir muchos mRNA diferentes mediante empalme alternativo,
uso alternativo del sitio promotor o de poliadenilacin y estrate
gias de procesamiento especiales como la edicin de RNA (seccin
10.3.3). Las protenas que se sintetizan a partir de estos mRNA
pueden modificarse de diversos modos, por ejemplo, mediante
corte proteoltico, fosforilacin o glucosilacin. A diferencia del
genoma, que es idntico en la mayor parte de las clulas, el trans
criptoma y el proteoma son muy variables. La transcripcin, el
19.2 | ANOTACIN FUNCIONAL MEDIANTE COMPARACIN DE SECUENCIAS
543
Recuadro 19-1. Funcin de la glucocinasa

Nombre gnico: GCK
Posicin en el genoma: 7p15
Nombre de la proteina: glucocinasa
Funcin bioqumica: cinasa, sustrato de glucosa
Funcin celular: metabolismo de la glucosa, va de gluclisis
Funcin en el organismo: se expresa de manera especfica en clulas be
ta pancreticas y hepatoctos, principal regulador de la secrecin de in
sulina controlada por glucosa, las mutaciones con prdida de funcin
causan diabetes, las mutaciones con aumento de funcin pueden produ
cir hiperinsullnismo.
procesamiento de RNA, la sntesis y la modificacin de protenas

pueden regularse de manera que el transcriptoma y el proteoma
difieren mucho entre los distintos tipos de clulas y en respuesta a
cambios en su ambiente. El anlisis a nivel del transcriptoma o el
proteoma proporciona una imagen inmediata de la clula en ac
cin, que demuestra la abundancia de todos los RNA y las prote
nas bajo un grupo especfico de circunstancias. Tanto la
comprensin de las caractersticas ms importantes del transcrip
toma y el proteoma en diferentes tipos de clulas como el estudio
de cmo cambian en la salud y la enfermedad permiten construir
las funciones individuales de los genes dentro de un cuadro mu
cho ms grande.
19.1.4 Las tcnicas de anlisis de alto rendimiento

y la bioinformtica son tecnologas que hacen
capaz la genmica funcional
La genmica funcional se benefici del desarrollo de una gama
completa de estrategias experimentales novedosas para investigar la
funcin gnica a una escala global. En algunos casos se adoptaron
las tcnicas que se utilizan en el anlisis de alto rendimiento. Por
ejemplo, las tcnicas simples de hibridacin gen por gen (seccin
7.3.2) se sustituyeron con los mtodos de arreglo de DNA y muestreo de secuencias que pueden emplearse para perfilar la expresin
global. En otros casos se inventaron tecnologas del todo nuevas,
como la seleccin de interaccin mediante el sistema de levadura de
dos hbridos (vase ms adelante). Como estos experimentos origi
nan grandes grupos de datos, el apoyo de la bioinformtica es esen
cial y la revolucin genmica funcional recibe el impulso tanto del
desarrollo de nuevos algoritmos y el establecimiento de nuevas ba
ses de datos como de los adelantos experimentales. La bioinform
tica es necesaria para comparar secuencias y estructuras, modelar
estructuras e interacciones, analizar datos de expresin global y
compartir informacin mediante bases de datos accesibles, fciles
de usar. Las tcnicas bioinformticas existentes se adaptaron para
nuevos usos (p. ej., los algoritmos de agrupamiento que se emplean
en el anlisis filogendco se modificaron para explorar datos de ex
presin gnica) y se crearon nuevas tcnicas para aplicaciones espe
cficas (como los algoritmos que buscan en bases de datos de
protenas con base en los datos de la espectrometra de masa). Es
tas tecnologas novedosas y sus aplicaciones se comentan en el res
to de este captulo.
Como sucede en muchas protenas, las funciones bioqumicas y celula

res de la glucocinasa no muestran su funcin reguladora importante a ni
vel de todo el organismo. De hecho en el genoma humano se codifican
varias otras enzimas con actividades bioqumicas y celulares idnticas,
pero cada una tiene un patrn de expresin distinto y una funcin diferen
te de nivel ms alto. Por el contrario, el patrn de expresin y los datos
de enfermedades indican la Importancia de la glucocinasa en la regula
cin de la produccin de Insulina y los valores de la glucemia, pero no
identifican su actividad bioqumica precisa.
19.2
Anotacin funcional m ediante

com paracin de secuencias
19.2.1 La comparacin de secuencias permite asignar

funciones tentativas a los genes
La anotacin funcional mediante la bsqueda de homologa
es una extensin del hallazgo de genes
Una diversidad de mtodos experimentales puede usarse para de
tectar genes en el DNA genmico (vase seccin 7.2). Sin embargo,
a causa de la gran cantidad de datos de secuencias que se obtuvieron
en los proyectos del genoma, la anotacin inicial se realiza con algo
ritmos de computadora que pueden procesar las secuencias con mu
cha rapidez. Como se seala en la seccin 8.3.5, estos algoritmos
predicen la existencia de genes a partir de los principios iniciales o
identifican secuencias homologas de genes conocidos mediante la
bsqueda en bases de datos. El recuadro 8-7 describe con mayor
amplitud los mtodos para efectuar lo anterior.
Los genes homlogos tienen secuencias similares porque se de
rivan de un ancestro evolutivo comn. Una relacin evolutiva sue
le indicar que las dos secuencias no slo se relacionan en cuanto a
la estructura sino tambin en la funcin. Por tanto el medio ms
sencillo para asignar una funcin a un gen nuevo consiste en bus
car secuencias relacionadas que ya se anotaron. Por lo general las com
paraciones se realizan a nivel de protenas porque las secuencias de
aminocidos estn ms restringidas en trminos evolutivos que las
de nuclotidos, de manera que las comparaciones de secuencias
protenicas son ms sensibles.
La potencia de la anotacin funcional basada en la bsqueda
de homologa depende de muchos factores, inclusive el grado de
similitud entre la secuencia interrogada y cualquier acierto en la
base de datos, la confiabilidad de la informacin funcional que ya
se encuentra en las bases de datos y el grado al que la conserva
cin de la secuencia y la estructura se corresponden con la funcin
conservada. Una secuencia buscada particular puede proporcionar
varias compatibilidades con diferentes grados de similitud. En al
gunos casos es posible alinear secuencias compatibles en toda su
longitud, lo que indica que las secuencias slo variaron por la acu
mulacin de mutaciones de punto (fig. 19-1). Si las secuencias
son muy similares, tal vez representen genes homlogos que de
sempean funciones idnticas en distintas especies y que acumu
laron mutaciones a causa de la especiacin. Como se comenta en
544 | CAPITULO DIECINUEVE
MS ALL DEL PROYECTO DEL GENOMA
el recuadro 12-3, estos genes se conocen como ortlogos, de los

que los genes de globina (3 de humanos y ovejas podran ser un
ejemplo. Las anotaciones funcionales basadas en ortlogos pueden
ser muy precisas. Un grado ms bajo de similitud indicara que los
genes son homlogos pero que variaron en trminos funcionales.
Estos genes se conocen como patlogos y surgieron por duplica
cin y divergencia gnicas dentro de un genoma (vase recuadro
12-3). Los genes humanos para la mioglobina y la globina P son
ejemplos de parlogos. En estos casos las predicciones funcionales
pueden ser seguras a nivel bioqumico (ambas protenas son trans
portadoras de oxgeno) pero tal vez sus funciones especficas a nivel
celular y del organismo sean muy diferentes. Casi siempre mayor si
militud estructural implica mayor similitud funcional y que la fun
cin bioqumica est ms conservada que la funcin a nivel celular
y del organismo.
En muchos casos las bsquedas en bases de datos no proporcio
nan aciertos que son comparables con la secuencia buscada en toda
su longitud. En lugar de ello se identifican alineamientos parciales
en varias protenas que por otra parte no parecen relacionadas (fig.
19-2). Esto refleja la naturaleza modular de las protenas y el hecho
de que diferentes dominios protenicos pueden desempear funcio
nes distintas (seccin 12.1.3). Los genes compatibles no variaron s
lo por la acumulacin de mutaciones de punto, sino tambin por
acontecimientos ms complejos, como la recombinacin entre ge
nes y segmentos gnicos que condujo al mezclado de exones (sec
cin 12.1.3). Las protenas humanas que participan en la
coagulacin sangunea constituyen un ejemplo til de este proceso
(Kolkman y Stemmer, 2001; vase fig. 12-3).
La anotacin funcional basada en homologa conlleva varios

peligros latentes
El principio de la anotacin funcional basada en la bsqueda de
homologa consiste en que la estructura conservada siempre indica
preservacin de la funcin. Sin embargo, esta suposicin no es se
gura en varios casos (Orengo y cois., 1999):
presencia de secuencias de baja complejidad, es decir, secuen
cias que se encuentran en muchas protenas con funciones en
extremo diversas. Por ejemplo, dominios transmembrana, do
minios de dimerizacin;
secuencias multifuncionales, esto es, secuencias que efec
tan diferentes funciones en distintas protenas. Por ejem
plo, las secuencias que forman un doblez de hidrolasa o/(5 se
encuentran tanto en el sitio cataltico de seis clases diferentes de
enzimas como en la molcula de adherencia celular neurotactina;
incorporacin gnica, o sea, la adquisicin de una funcin
nueva por un producto gnico existente. Por ejemplo, muchas
enzimas que participan en procesos metablicos generales se in
corporaron como cristalinas, las protenas refringentes en el
cristalino del ojo. Aunque esto se logr mediante la simple mo-
I I
f ilil "
I M
I
T1
lili
II
Fig. 19-2. La bsqueda de similitud con una secuencia protenica

determinada tambin puede identificar protenas homologas que
muestran alineaciones parciales con la secuencia interrogante.
Fig. 19-1. La bsqueda de similitud con una secuencia de protenas

determinada puede identificar protenas homologas cuyas secuen
cias se alinean con la secuencia buscadora (Q) en toda su longitud.
Estas secuencias variaron slo por la acumulacin de mutaciones de
punto, que pueden ser sustituciones de aminocidos (representadas
por las lneas blancas) o inserciones y deleciones pequeas. Por lo
general cuanto ms divergentes sean el buscador y la respuesta, ms
probable es que las funciones estn menos conservadas.
En este ejemplo la protena de bsqueda (Q) comprende tres dominios

distintos que se muestran en colores diferentes. Las respuestas pueden
compartir uno, dos o los tres de estos dominios, pero tambin poseer
dominios adicionales que no se encuentran en la protena buscadora
(cuadros rojos). Puede haber duplicaciones de dominio como se observa
en las respuestas primera y tercera. La respuesta final muestra el caso
especial de permutacin, en el que el orden de los dominios se cambia.
Esto suele reflejar duplicacin de genes seguida de fusin gnica y
erosin final. Las mutaciones de punto acumuladas en relacin con la
secuencia de interrogacin se muestran como lneas blancas.
19.2 | ANOTACIN FUNCIONAL MEDIANTE COMPARACIN DE SECUENCIAS [ 545
dificacin de sus niveles de expresin, otros mecanismos de

incorporacin comprenden el cambio de la forma en que las
protenas constituyen complejos y modifican su localizacin
intracelular.
Otro posible peligro de la bsqueda de homologa es que las
anotaciones siempre se basan en experimentos e interpretaciones de
otras personas. Sin embargo, todas las bases de datos, sin que im
porte con qu tanto cuidado se atiendan, incluyen una proporcin
importante de errores. Basar la funcin de un gen nuevo en estos
datos tal vez no slo sea incorrecto sino que tambin propaga el
error (Brenner, 1999).
19.2.2 Mtodos de bsqueda consenso pueden

extender el nmero de relaciones homologas
identificadas
Los mtodos estndar de bsqueda de homologas que recurren a
algoritmos de la familia BLAST (vanse cuadro 8-2 y recuadro 8-7)
son adecuados para detectar secuencias protenicas relacionadas de
manera cercana ya sea en toda su longitud o en uno o ms domi
nios. No obstante, estos algoritmos se tornan menos robustos y
muchas relaciones evolutivas pueden no advertirse cuando el grado
de similitud secuencial es menor de 30 a 40%.
Una manera de mejorar la bsqueda de homologa consiste en
utilizar un mtodo de bsqueda consenso como PSI-BLAST
(BLAST position-specific iterated, iterado especfico de posi
cin), que emplea una bsqueda reiterativa basada en perfiles de
secuencias (Altschul y cois., 1997). La figura 19-3 ilustra el princi
pio. El proceso inicia del mismo modo que una bsqueda BLAST
normal pero los aciertos iniciales se combinan en un perfil repre
sentativo que luego se aplica en una segunda ronda de bsqueda.
Cualquier acierto adicional se combina con el perfil y el proceso
se repite para un nmero predeterminado de repeticiones o hasta

que no se identifican nuevos aciertos. Est demostrado que este
mtodo identifica tres veces ms relaciones evolutivas que la bs
queda de homologa estndar. Es posible obtener una sensibilidad
adicional si se comparan patrones y perfiles generados por la ali
neacin de protenas relacionadas en forma distante y la deriva
cin de secuencias tpicas cortas conservadas o de perfiles ms
largos que corresponden a dominios funcionales (Eddy, 1998). Se
cuenta con varias bases de datos de secuencias secundarias que
contienen secuencias tpicas de dominio y perfiles derivados de
las bases de datos de secuencias primarias (cuadro 19-1). Estas ba
ses de datos pueden explorarse con una secuencia de bsqueda a
fin de identificar dominios protenicos conservados en secuencias
relacionadas de modo muy distante.
19.2.3 Las similitudes y diferencias entre genomas

indican secuencias conservadas e importantes
desde el punto de vista funcional
Con base en el comentario anterior es obvio que los genes de espe
cies diferentes relacionados de manera cercana (ortlogos) pueden
utilizarse para asignar funciones bastante precisas a genes no carac
terizados. Los ortlogos no suelen ser idnticos porque se acumulan
mutaciones separadas en cada linaje evolutivo despus del aconteci
miento de especiacin. Por consiguiente el grado de similitud en
tre ortlogos brinda una medida til del tiempo evolutivo y puede
emplearse para elaborar rboles filogenticos (cap. 12). La gen
mica comparativa aprovecha las similitudes y diferencias entre
genomas para derivar informacin estructural, funcional y evolu
tiva (seccin 12.3.2). Se basa en el principio de que las similitudes
genticas entre especies se extienden mucho ms all que el nivel
gnico. Cabra esperar que especies relacionadas de modo cercano
Total d e to d a s las s e c u e n c ia s en las b a s e s d e d a to s

Total d e s e c u e n c ia s h o m o lo g as con
el b u s c a d o r ()
Total d e s e c u e n c ia s h o m o lo g as d e te c ta d a s
m ed ian te b s q u e d a BLAST inicial
E xtensin d e relacio n es evolutivas o b te n id a s
d e u n a s e g u n d a b s q u e d a BLAST con
un o d e los a c ie rto s originales (+) c o m o
bu scador
Fig. 19-3. P rincipio de PSI-BLAST.

El crculo externo representa el contenido total de la base de datos de secuencias. Un subgrupo de estas secuencias ser homlogo a la secuencia de
bsqueda (punto), aunque el grado de relacin evolutiva se debilita cuanto ms se aleje la secuencia del centro. Mediante BLAST estndar se detectar
un crculo pequeo interno de secuencias relacionadas con el buscador. En PSI-BLAST cada uno de estos aciertos de esta primera bsqueda se rene
en un perfil que se utiliza en una segunda bsqueda a fin de extender el nmero de secuencias homologas identificadas. El proceso puede repetirse para
un nmero predeterminado de rondas de bsqueda o hasta que no se encuentran ms aciertos.
546
CAPTULO DIECINUEVE
Cuadro 19-1. Bases de datos secundarias de secuencias protenicas que pueden utilizarse para identificar elementos conserva
dos y dominios de protenas. InterPro es un sistema de referencia cruzada importante que permite que cada base de datos se
investigue con un buscador nico
Database
Contenido
URL
PR0SITE
Patrones de secuencia relacionados con familias de protenas y perfiles de

secuencia ms largos que representan dominios protenicos completos
http://ca.expasy.org/prosite
PRINTS, BLOCKS
Regiones muy conservadas en mltiples alineamientos de familias de protenas.

Se denominan secuencias tpicas en PRINTS y bloques en BL0CKS
http://bioinf.man.ac.uk/dbbrowser/PRINTS
http://www.blocks.fhcrc.org
Pfam, SMART, ProDom
Conjunto de dominios protenicos
http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam
http://www.smart.embl-heldelberg.de/
InterPro
Una herramienta de bsqueda que integra la informacin de otras bases

de datos secundarias
http://www.ebi.ac.uk/interpro
tuvieran genes y genom as similares de acuerdo con el grado de si

militud de la divergencia evolutiva de la especie (Nadeau y Sankoff, 1998). Como las similitudes son aparentes a nivel de
secuencias pero tambin al nivel grueso de la organizacin del ge
noma, a menudo especies relacionadas muestran sintenia conser
vada (un orden gnico conservado).
La sintenia tiene utilidad potencial para el mapeo y la clona
cin gnicos porque la informacin del mapa de una especie pue
de utilizarse para localizar y clonar genes de otra. En el genoma
humano, el esfuerzo masivo puesto en la elaboracin de mapas
genticos de alta densidad (cap. 8) redita en ms de una forma
en la actualidad, puesto que las pruebas de sintenia conservada
entre humanos y otros vertebrados se emplean para mapear y clo
nar genes equivalentes de otros mamferos. Es valioso identificar
ortlogos animales de genes de enfermedades humanas porque
puede llevar a comprender por qu los humanos son susceptibles
a ciertas enfermedades y en consecuencia ayudar a prevenirlas y
crear nuevos medicamentos. Por ejemplo, casi ningn mamfero
es susceptible al HIV. La identificacin de ortlogos de los genes
humanos que confieren susceptibilidad a la enfermedad (p. ej.,
CCR5, que codifica el correceptor de HIV que se muestra en la
superficie de clulas T) podra proveer informacin para trata
mientos novedosos.
Otra aplicacin de la genmica comparativa es la identificacin
de elementos gnicos reguladores. Como se seala en el captulo
20, la identificacin de los elementos promotores e intensificadores
necesarios para la expresin gnica normal es un trabajo laborioso,
que incluye valoraciones de la expresin artificial en clulas culti
vadas y animales transgnicos. Un posible inconveniente consiste
en comparar genes ortlogos en especies relacionadas y buscar las
secuencias tpicas ms conservadas fuera de la regin de codifica
cin del gen. Slo secuencias con una funcin muy conservada es
taran representadas en ambos genomas, en tanto que otras deben
haber variado de manera significativa durante el tiempo de evolu
cin (Hardison y cois., 2000; Werner, 2003). A este respecto el pez
soplador japons Takifugu rubripes constituye un modelo excelen
te porque aunque tiene el genoma ms pequeo de todos los ver
tebrados (400 MB), contiene alrededor del mismo nmero de
genes que el genoma humano (Elgar y cois., 1996; Aparicio y cois.,
2002).
19.2.4 La genmica comparativa puede aprovecharse

para identificar y caracterizar genes de
enfermedades en humanos
El uso de la bsqueda de homologa para asignar funciones a genes
humanos suele dar por resultado asignaciones funcionales superfi
ciales como fosfatasa o protena que abarca la membrana. La ge
nmica comparativa puede aprovecharse con objeto de enriquecer
la informacin obtenida de la bsqueda de homologa ya que no
slo las funciones de protenas individuales tienden a conservarse
sino tambin las vas, las redes y los complejos enteros entre genomas relacionados.
Estas similitudes pueden expresarse a nivel del organismo com
pleto aun en organismos relacionados de modo distante. Por ejem
plo, se estima que alrededor de 30% de los genes de enfermedades
humanas conocidos tiene homlogos en la levadura. El gen SGS1
de la levadura codifica una helicasa de DNA que es homloga de
un gen humano, WRN, que muestra defectos en el sndrome de
Werner (MIM 2777000). sta es una enfermedad de envejeci
miento prematuro. Las personas con la enzima defectuosa parecen
normales durante sus primeros aos, pero envejecen de manera no
table en la edad madura y adquieren el aspecto marchito de octo
genarios hacia los 25 aos de edad. Las caractersticas frecuentes de
la enfermedad comprenden aterosclerosis, osteoporosis, diabetes y
cataratas. Se piensa que los sntomas de la enfermedad se relacio
nan en cierta forma con la incapacidad de las clulas de Werner pa
ra dividirse en cultivo tantas veces como las clulas normales, es
decir, ocurre un envejecimiento celular temprano. Aunque es dif
cil examinar el vnculo entre la actividad de helicasa y el envejeci
miento celular en humanos, las clulas de levadura con un gen
SGSI inactivo tambin muestran envejecimiento acelerado y ofre
cen la posibilidad de efectuar estudios funcionales de la enferme
dad de humanos en clulas de levadura.
La conservacin de la funcin gnica entre humanos y anima
les es an mayor que entre los humanos y la levadura. Ms de
60% de los genes de enfermedades en humanos tiene correspon
dientes en la mosca y el gusano, lo que revela un ncleo de casi 1
500 familias gnicas conservadas en todos los animales. La va de
sealamiento de insulina est conservada por completo en hu
manos y nemtodos de manera que los gusanos mutantes con de
19.2
ANOTACIN FUNCIONAL MEDIANTE COMPARACIN DE SECUENCIAS
547
terioro del sealamiento de insulina son modelos tiles de dia

betes tipo II. Gracias a sus propiedades similares a microbios,
estas mutantes de nemtodos pueden seleccionarse con miles de
posibles medicamentos para identificar compuestos que norma
lizan la fisiologa de la enfermedad insensible a la insulina. Las
mutantes de C aenorhabditis elegans proporcionan modelos de
muchas otras enfermedades que abarcan trastornos neurolgicos,
cardiopatas congnitas y afecciones renales. En el captulo si
guiente se considera ms a fondo la utilidad de los modelos ani
males de enfermedad.
19.2.5 Una minora inflexible de genes resiste

la anotacin funcional mediante bsqueda
de homologa
El primer genoma de un organismo modelo mayor que se secuenci por completo fue el de la levadura Saccharomyces cerevisiae
(Dujon, 1996). Antes de disponer de las secuencias, sola pensar
se que la mayor parte de los genes de la levadura se haba identi
ficado por medios experimentales y que la secuencia del genoma
revelara cuando mucho unos cuantos cientos de genes adiciona
les. En consecuencia los cientficos se sorprendieron cuando en
contraron que el genoma de la levadura contena ms de 6 000
genes, de los que antes slo se conoca 30%. La bsqueda de ho
mologa asign funciones a otro 30% de los genes aunque las
anotaciones variaron mucho en cuanto a su utilidad. Aunque en
algunos casos se identificaron funciones tanto bioqumicas como
celulares, en muchos genes slo pudieron predecirse funciones
bioqumicas generales. Esto dej 40% de los genes sin alguna
asignacin funcional. Tales genes podran dividirse en dos catego
ras (fig. 19-4):
genes hurfanos. Son genes predichos no equiparables con
ninguna otra secuencia en las bases de datos;
familias hurfanas. Son genes predichos con homlogos en las
bases de datos, pero los homlogos en s mismos tienen una
funcin desconocida.
La inseguridad de las predicciones gnicas complica la situacin
en el genoma humano. En el genoma de la levadura fue dudoso
menos de 10% de las predicciones gnicas, pero la cifra en el ge
noma humano es mucho mayor: tal vez del orden de 25%. Ms
an, si bien se identificaron muchos genes humanos, quiz la es
tructura predicha no sea precisa (p. ej., es posible que falten exo
nes, que existan exones definidos de manera incorrecta y exones
fantasma, o que genes adyacentes se hayan fusionado). Con base
en lo anterior, el resultado final de los proyectos del genoma hu
mano es sorprendentemente similar a los resultados obtenidos en
el proyecto de la levadura. Con anterioridad se conoca alrededor
de un tercio de los genes de la lista y estaban representados en la
base de datos RefSeq, un conjunto muy depurado de transcritos
de genes humanos. Otro tercio se predijo con base en la homolo
ga de MSE o de otras secuencias y el tercio restante se predijo
desde el inicio, slo a partir de criterios estructurales. Algunas de
las predicciones de las ltimas categoras sern positivas falsas (p.
ej., compatibilidades con seudogenes y elementos transposables),
Fig. 19-4. Distribucin de genes de levadura por estado de anotacin

en el resultado del proyecto del genoma de Saccharomyces cerevisiae.
En total, 30% de los 6 000 genes se identific con anterioridad, a 30%
fue factible asignarle funciones mediante la bsqueda de homologa,
33% correspondi a hurfanos o miembros de familias hurfanas y
7%, indicado por ??, lo constituan marcos de lectura abiertos dudo
sos. Las anotaciones funcionales basadas en homologa variaron de
informativas por completo (funcin bioqumica y fisiolgica estableci
da) o informativas en parte (tal vez funcin bioqumica establecida) a
superficiales (quiz relacionada con el metabolismo de nitrgeno).
en tanto que se omitirn muchos genes a causa de la sensibilidad

baja de los algoritmos de prediccin gnica iniciales. Casi todos
los genes antes identificados y los que se predijeron con base en
homologa se anotaron en trminos funcionales cuando menos a
nivel bioqumico, en tanto que una minora representa familias
hurfanas. Slo a una proporcin pequea de los genes predichos
mediante mtodos iniciales se les asign una funcin. Se cree que
alrededor de 60% de los genes humanos contiene dominios protenicos que estn representados en las bases de datos de secuen
cias secundarias, lo que deja 40% sin asignar. Dentro de esta
categora se conoce la funcin de tal vez 10% de los genes, pero
no pertenecen a las familias de protenas grandes, en tanto que un
tercio de los genes no tiene asignacin funcional en lo absoluto y
se trata de hurfanos genuinos.
Para estos genes hurfanos, la bsqueda de homologa no
brinda informacin funcional y las predicciones funcionales de
ben basarse en pruebas alternativas. Los mtodos disponibles pa
ra anotacin funcional comprenden lo siguiente y se estudian en
el resto de este captulo:
anlisis de perfiles de expresin del mRNA;
anlisis de perfiles de expresin de protenas;
comparacin de estructuras protenicas;
anlisis de interacciones de protenas;
anlisis de fenotipos o fenocopias mutantes en organismos
modelo.
548
19.3
CAPTULO DIECINUEVE
Perfil global del mRNA

(transcriptm ica)
19.3.1 El anlisis del transcriptoma revela cmo

los cambios en los patrones de expresin gnica
coordinan las actividades bioqumicas de
la clula en la salud y la enfermedad
Los patrones de expresin proveen informacin accesoria
til respecto a las funciones de genes individuales y
tambin pueden destacar relaciones entre ellos
Las anotaciones funcionales basadas en comparaciones secuenciales y estructurales pueden ser informativas, pero en muchos casos
slo sugieren una categora bioqumica amplia, como cinasa o
protena de enlace de DNA. Se requieren experimentos ms
amplios para determinar las funciones de los genes a nivel celular
y del organismo completo, as como para investigar la forma en
que las actividades de productos gnicos individuales se coordi
nan. El perfil de expresin de un gen puede revelar mucho acer
ca de su funcin en el cuerpo y ayudar a identificar relaciones
funcionales con otros genes. La expresin de muchos genes est
restringida a clulas especficas o a estructuras en desarrollo y
muestra que los genes tienen funciones particulares en esos sitios.
Otros genes se expresan en respuesta a estmulos externos. Por
ejemplo, podran encenderse o apagarse en clulas expuestas a se
ales endgenas, como factores del crecimiento o molculas am
bientales, por ejemplo, sustancias qumicas que daan el DNA.
En estos casos no es irrazonable suponer que la funcin de los ge
nes se relaciona de cierta manera con la percepcin de esas sea
les o la respuesta de las clulas a las mismas. Es posible que los
genes con perfiles de expresin similares participen en procesos
iguales y por tanto demostrar que un gen hurfano tiene un per
fil de expresin similar a un gen caracterizado tal vez permita
asignarle una funcin con base en la culpa por asociacin. Ms
an, la mutacin de un gen puede afectar los perfiles de expresin
de otros, lo que ayuda a relacionar esos genes en vas y redes fun
cionales. Bien podra ser el caso si el gen mutado codificara un
factor de transcripcin ya que la funcin anormal de este ltimo
influira en todos los genes que controla.
El anlisis del transcriptoma proporciona mayor alcance

para relacionar genes y sus productos dentro de vas
y redes funcionales, as como nuevas oportunidades
para el desarrollo de frmacos
El anlisis de expresin suele efectuarse con base gen por gen y
los mtodos que se utilizan (p. ej., northern blots, PCR-RT, hi
bridacin in situ, etc.) se opriman para el estudio de genes indi
viduales (vase seccin 7.3). Algunas tcnicas son factibles de
una multiplicidad moderada, por ejemplo, es bastante fcil esta
blecer 10 a 20 PCR, pero el anlisis altamente paralelo que in
cluye cientos o incluso miles de genes resulta imposible a causa
del tiempo necesario para establecer reacciones individuales y por
supuesto del costo de realizarlo. Aun en este caso, las ventajas del
anlisis completo del transcriptoma son claras. Por ejemplo, se

deseara buscar genes con patrones de expresin alterada en el as
ma, la esclerosis mltiple o las enfermedades inflamatorias del
intestino. En lugar de seleccionar unos cuantos genes candidato
a analizar cuya expresin podra afectarse por la enfermedad, es
posible buscar todos los genes al mismo tiempo y por consi
guiente identificar cada gen aislado cuyo perfil de expresin est
modificado. Aunque algunos de estos genes podran estar ya bien
caracterizados, quizs otros sean genes hurfanos, lo que permi
te asignarles funciones tentativas. Este anlisis ofrece tambin
beneficios prcticos e inmediatos. Por ejemplo, los genes que se
incrementan de manera especfica en el estado patolgico po
dran representar blancos farmacolgicos tiles, en tanto que los
que disminuyen tal vez codifiquen protenas susceptibles de em
plearse con fines teraputicos. El inters por realizar el anlisis
global de la expresin gnica contribuy al desarrollo de tecno
logas novedosas que permiten la vigilancia simultnea de miles
de transcritos y la comparacin de su abundancia en diferentes
muestras. Se dispone de dos plataformas principales. Una se ba
sa en la secuenciacin y comprende el muestreo de secuencias de
DNA de poblaciones de cDNA representativas. ste puede con
siderarse un sistema abierto porque est abierto para el anlisis
el transcriptoma completo. El otro se basa en hibridacin e in
cluye el uso de microarreglos de DNA. ste puede considerarse
un sistema cerrado porque slo es posible medir las secuencias
representadas en el arreglo. Es necesario eliminar un mito comn
antes de considerar estas tecnologas y el modo en que se utili
zan. Aunque los mtodos de anlisis del transcriptoma suelen
describirse como perfil transcripcional, es importante recono
cer que no se mide la tasa de transcripcin sino el nivel de mR
NA en estado constante, que tambin considera la tasa de
descomposicin de mRNA.
19.3.2 El muestreo secuencial directo es un mtodo

estadstico para determinar la abundancia
relativa de diferentes transcritos
El muestreo de genotecas de cDNA permite establecer
perfiles globales de expresin gnica
Es probable que el medio ms directo para estudiar el transcripto
ma sea secuenciar en forma aleatoria clonas captadas de genotecas
de cDNA y contar el nmero de veces que cada secuencia apare
ce. La abundancia de cada clona representa la abundancia del
transcrito correspondiente en la muestra original. Si se secuencian
suficientes clonas, el anlisis estadstico proporciona una gua
gruesa de los valores relativos de expresin gnica (Audic y Claverie, 1997). Este enfoque suele usarse para identificar genes que se
expresan diferencialmente pero es laborioso porque se requieren
secuenciaciones a gran escala. Un posible camino corto es tomar
muestras de secuencias muy cortas, que se conocen como caracte
rsticas de secuencia, y leer muchas de ellas al mismo tiempo. A
fin de aprovechar lo anterior se desarrollaron varias tcnicas (re
cuadro 19-2); la de mayor impacto hasta la fecha es el anlisis seria
do de expresin gnica (SAGE), que se discute con ms amplitud a
continuacin.
19.3
PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCRIPTMICA)
549
Recuadro 19-2. Tcnicas de m uestreo de secuencias para el anlisis global de la expresin gnica
Muestreo aleatorio de genotecas de cDNA
Clonas captadas de modo aleatorio se secuencian e investigan contra ba
ses de datos a fin de identificar los genes correspondientes. La frecuen
cia con que cada secuencia est representada proporciona una guia
general de la abundancia relativa de diferentes mRNA en la muestra ori
ginal (Audlc y Claverie, 1997). Es un mtodo muy laborioso, en particu
lar cuando es necesario comparar varias genotecas de cDNA.
Anlisis de bases de datos de marcadores de secuencia expresados
(MSE)
Los MSE son caractersticas generadas por la secuenciacin de un paso
de clonas de cDNA aleatorias. Si se cuenta con datos de MSE para una
genoteca determinada, es posible estimar la abundancia de diferentes
transcritos determinando la representacin de cada secuencia en la base
de datos (p. ej., vase Vasmatzis y cois., 1998). ste es un mtodo rpi
do y ventajoso porque puede efectuarse por completo n silico, pero se
basa en la disponibilidad de datos de MSE para muestras importantes.
PCR de exhibicin diferencial
Este procedimiento se dise para identificar con rapidez secuencias de
cDNA que se expresan de manera diferencial en dos o ms muestras
(Liang Y Pardee, 1992). El mtodo no tiene la resolucin suficiente para
abordar la totalidad del transcriptoma en una reaccin, de manera que se
generan poblaciones de fragmentos de cDNA marcado mediante PCR-RT
con un cebador oligo-dT con un extremo saliente de dos bases y un ce
bador arbitrario. El empleo de diferentes combinaciones de cebadores
produce fondos comunes de fragmentos de cDNA que representan subfracciones del transcriptoma. A continuacin los productos de la amplifi
cacin equivalentes de dos muestras (es decir, productos que se
amplifican con la misma combinacin de cebador) se corren lado a lado
en un gel de secuenciacin y los cDNA expresados diferencialmente se
revelan mediante diferencias cuantitativas en las intensidades de la ban
da. Esta tcnica se dirige a genes que se expresan de manera diferencial,
El anlisis seriado de expresin gnica (SAGE) comprende

el muestreo de marcadores de secuencias cortas que estn
unidos entre s en un concatmero largo
La primera tcnica de muestreo de secuencias de alto rendimiento
que se desarroll fue el anlisis seriado de expresin gnica, o SA
GE (Velculescu y cois., 1995), que se basa en dos principios:
un marcador de una secuencia de nucletidos corta puede iden
tificar de manera nica el transcrito de un gen individual a con
dicin de que tenga una posicin definida dentro del transcrito.
Por ejemplo, aunque el nmero total de genes humanos se
aproxima a 30 000, un marcador de secuencia de slo 9 pb pue
de, en principio, distinguir 49 (262 144) transcritos distintos.
En la prctica se utilizan marcadores de secuencia de 12 a 15
pb, que brindan una discriminacin an mayor;
la concatamerizacin de los marcadores de secuencia corta per
mite analizar con eficiencia mltiples transcritos en una forma
seriada. Los marcadores de diferentes transcritos pueden unirse
de manera covalente entre s dentro de una misma clona y la
clona secuenciarse a continuacin para identificar los distintos
marcadores en ella. En una reaccin de secuenciacin es posible
valorar hasta 100 transcritos diferentes.
pero los resultados positivos falsos son frecuentes y es necesario recu

rrir a otros mtodos para confirmar los perfiles de expresin predichos.
Anlisis seriado de expresin gnica (SAGE)
En esta tcnica se renen caractersticas de secuencia muy corta (mar
cadores de secuencia) de muchos cDNA mediante el aprovechamiento
de las propiedades especiales de enzimas de restriccin tipo lis (vanse
texto principal y fig. 19-5). Los marcadores se ligan entre s para form ar
concatmeros largos y estos ltimos se secuencian. La representacin
de cada transcrito est determinada por el nmero de veces que un mar
cador particular se cuenta. Aunque el SAGE es exigente desde el punto
de vista tcnico, es mucho ms eficiente que el muestreo estndar de cD
NA porque permite contar 50 a 100 marcadores en cada reaccin de se
cuenciacin (Velculescu y cois., 1995).
Secuenciacin de caracterstica masivamente paralela (MPSS)
Como el SAGE, en la tcnica de MPSS se utilizan enzimas de restriccin
tipo II para reunir marcadores de secuencia corta de muchos cDNA. Sin
embargo, a diferencia del SAGE (en el que los marcadores se clonan en
serie), la MPSS se basa en el anlisis paralelo de miles de cDNA fijados
a mcrocuentas en una celdilla de flujo (Brenner y cois., 2000). El princi
pio del mtodo consiste en utilizar una enzima de restriccin de tipo II a
fin de exponer un extremo saliente de cuatro bases en cada cDNA. Hay
16 posibles secuencias de cuatro bases, que se detectan mediante hibri
dacin de un grupo de 16 diferentes oligonucletidos adaptadores. Cada
adaptador hibrida un oligonucletido descodificador diferente definido por
un marcador fluorescente especfico. El adaptador contiene un sitio para
una enzima de restriccin tipo lis, que permite exponer otras cuatro bases y
el proceso se repite. Las imgenes de las microcuentas despus de cada
ronda de corte de hibridacin permiten leer miles de secuencias de cDNA en
trozos de cuatro nucletidos. Igual que con el SAGE, el nmero de veces que
cada secuencia se registra puede usarse para determinar valores relativos
de expresin gnica.
Para realizar el anlisis de SAGE se extrae primero el poli(A)+RNA de la fuente a investigar y se convierte en cDNA mediante un
oligo (dT) cebador biotinilado. Los acontecimientos subsecuentes
se delinean en la figura 19-5. El cDNA se corta primero con una
enzima de restriccin como N lalll que corta frecuentemente por
que tiene un sitio de reconocimiento de 4 pb (sta se denomina en
zima de anclaje). Los fragmentos de la terminal 3' liberados, que
estn fijados a la biotina, se enlazan a cuentas de estreptovidina. El
cDNA enlazado a estreptovidina se corta en dos fracciones y estas
ltimas se ligan por separado en masa a dos adaptadores de oligo
nucletidos de doble cadena, A y B. Cada adaptador tiene un ex
tremo saliente compatible con el generado por la enzima de anclaje
y, justo adyacente a ste, el sitio de reconocimiento de 5 pb para
una enzima de restriccin tipo I I , como Fokl. Estas enzimas po
seen la propiedad poco usual de reconocer una secuencia especfica
pero cortar el DNA fuera de esta secuencia un nmero particular
de pares de bases corriente abajo. Por tanto el corte con esta lla
mada enzima marcadora genera una secuencia caracterstica cor
ta, que se define como un marcador SAGE, fijado al adaptador.
Asimismo cada uno de los dos adaptadores contiene el sitio de
reasociacin para un cebador de PCR distinto. En la etapa si
guiente del proceso los dos fondos comunes de marcadores de
adaptador se mezclan y ligan para producir dimarcadores (dos
550
CAPTULO DIECINUEVE
marcadores SAGE unidos entre s) flanqueados a cada lado por

uno de los adaptadores. Luego se utiliza PRC para amplificar estas
molculas. Los dimarcadores se liberan de los productos de ampli
ficacin cortndolos con la enzima de anclaje original y los dimar
cadores purificados se ligan entre s y se clonan. En seguida se
secuencian insertos de los vectores de clonacin y esto permite leer
los marcadores en serie. Los niveles relativos de transcritos se dedu
cen a parrir de la frecuencia con que el marcador ocurre.
En el experimento original, Velculescu y colaboradores (1995)
informaron la recuperacin de 840 marcadores de secuencias de
cDNA pancretico. De ellos, 498 representaron 77 transcritos
diferentes y los ms abundantes de stos fueron producidos por
genes que se sabe que tienen funcin pancretica (p. ej., la procarboxipeptidasa Al estaba representada 64 veces y el tripsingeno
pancretico 2 en 46 ocasiones). La ventaja particular del SAGE es
que los datos son digitales y por tanto es muy fcil comparar las fre
cuencias del marcador a travs de los diferentes experimentos, aun
si se realizaron en distintos laboratorios en pocas diferentes. Se es
tablecieron varias bases de datos para el depsito y la comparacin
de datos del anlisis seriado de expresin gnica (SAGE). Ahora la
tcnica es ms til con las adaptaciones que permiten emplear can
tidades muy pequeas de material de inicio (vase Velculescu y Volgelstein, 2000).
19.3.3 Los microarreglos de DNA recurren a

valoraciones de hibridacin multiplex
para medir la abundancia de miles
de transcritos en forma simultnea
Aunque los dos tipos principales de microarreglo de DNA
se elaboran de diferentes modos, los principios del anlisis
de expresin son similares para cada dispositivo
Los microarreglos de DNA son dispositivos en miniatura en los
que muchas secuencias diferentes de DNA pueden inmovilizarse en
forma de rejilla. Existen dos tipos principales, uno que se elabora
mediante el manchado mecnico de molculas de DNA en un por
taobjeto de vidrio recubierto y otro que se produce por la sntesis
de oligonucletidos in situ (Schena y cois., 1995; Lockhardt y cois.,

1996; vase seccin 6.4.3). Ambos dispositivos pueden describirse
como microarreglos, pero un trmino ms especfico para el ltimo
es chip oligonucletido de alta densidad. Hay muchas fuentes
comerciales de arreglos manchados y se dispone de instalaciones in
ternas para muchos laboratorios. En contraste, los chips de oligo
nucletidos de alta densidad slo los produce la compaa
estadounidense de biotecnologa Afymetrix Inc. y se expenden co
mo GeneChips (chips gnicos).
Aunque manufacturados en formas por completo distintas, los
principios del anlisis de expresin son muy semejantes en los dos
dispositivos (Harrington y cois., 2000). El anlisis de expresin se
basa en hibridacin multiplex utilizando una poblacin compleja
de molculas de DNA o RNA marcados (fig. 19-6). Para ambos
dispositivos, una poblacin de molculas de mRNA de una fuente
particular se transcribe en forma inversa en masa para formar una
poblacin compleja representativa de cDNA. En los microarreglos
manchados, la mezcla de la reaccin incluye un nucletido conju
gado con fluorforo de tal manera que toda la poblacin de cD
NA se marque. En los GeneChips, una poblacin de cDNA no
marcado se convierte en un cRNA marcado (RNA complementa
rio) mediante la incorporacin de biotina, que despus se detecta
con avidina conjugada a un fluorforo. A continuacin la pobla
cin compleja de cidos nucleicos marcados se aplica al arreglo y se
permite que se hibride. Cada carcter o gota individual del arreglo
contiene 106 a 109 copias de la misma secuencia de DNA y por
consiguiente no es probable que se sature del todo en la reaccin de
hibridacin. Bajo estas condiciones la intensidad de la seal de hi
bridacin en cada blanco del arreglo es proporcional a la abundan
cia relativa de cDNA o cRNA particular en la mezcla, que a su vez
refleja la abundancia del mRNA correspondiente en la poblacin
fuente original. En consecuencia los valores relativos de expresin
de miles de transcritos diferentes pueden vigilarse en un experi
mento.
El anlisis de expresin con cada tipo de dispositivo es similar
en principio, pero algunas diferencias prcticas importantes refle
jan la naturaleza de las caractersticas en el arreglo (cDNA u oli
gonucletidos) y la especificidad de la reaccin de hibridacin.
En los microarreglos manchados, cada carcter est representado
Fig. 19-5. Seleccin multiplex de expresin gnica mediante el mtodo SAGE.

La base del mtodo es reducir cada molcula cDNA en un marcador de secuencia corta representativa (alrededor de nueve nucletidos de largo). A
continuacin marcadores individuales se unen entre s (concatamerizacin) dentro de una clona de DNA larga aislada como se muestra en la parte ms
inferior del diagrama, en la que los nmeros que se encuentran arriba de los marcadores de secuencia representan un cDNA especfico del que se
deriv el marcador. La secuenciacin de la clona proporciona informacin de los diferentes marcadores de secuencia que pueden identificar la presencia
de secuencias correspondientes de mRNA. Este ltimo se convierte en cDNA por medio de un cebador oligo (dT) con un grupo de biotina unido y
el cDNA biotinilado se corta con una nucleasa de restriccin que corta frecuentemente (la enzima de anclaje, AE; en este ejemplo es Nlalll que corta
justo despus de G en la secuencia de 4 pb CATG). Luego los fragmentos del extremo 3 ' resultantes que contienen un grupo biotina se recuperan de
modo selectivo enlazndolos a cuentas recubiertas con estreptavidina, separadas en dos fondos comunes y despus ligadas en forma individual a uno
de dos enlazadores de oligonucletidos de doble cadena: A y B. Los dos enlazadores difieren en la secuencia excepto que tienen un extremo saliente
3 CTAG y, adyacente a l, un sitio de reconocimiento comn para una nucleasa de restriccin tipo lis que servir como enzima marcadora (EM). En
este ejemplo es Fok\ que reconoce la secuencia GGATG (delineada en un recuadro), pero corta en 9/13 nucletidos corriente abajo. El corte con Fok\
genera un marcador de secuencia de 9pb de cada mRNA y los fragmentos de los fondos comunes separados pueden unirse entre s para formar
dimarcadores que despus se concatenan com o se muestra.
19.3 ! PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCRIPTMICA) ! 551
Sitio EA
P ob lacin d e cDNA
1
h e te ro g n e a c o n sitio
p a ra n u c le a sa d e
restitu ci n e sp ec fica
(enzim a d e anclaje, EA)
EA
- AAAAAA ^
-T T T T T T -
= =
- 1
-A A A A A A ^
-T T T T T T -@
EA
-A A A A A A ^
-T T T T T T -
1. C o rte co n enzim a d e anclaje,

p. ej., Nlalll
2. E nlace a c u e n ta s d e e stre p ta v id in a
-A A A A A A
-T T T T T T ~ ( B ^
GTAC-
--------A A A A A A
--------T T T T T T - ( b ) ^
G TAC -
- 2 - aaaaaa
GTAC ------- T T T T T T - ^ e
D ividido en d o s
L igada a
enlazador
Ligada a
e n la z a d o r'
s
G GATG CATG
CCTAC
GGATG CATG
CCTAC
j ^ p . ej., fra g m en to nm . 1
4 p. ej., fra g m en to nm . 3
ET
ET
GG ATG CATGCCTACG TAC-
- AAAAAA
- TTTTTT
G G ATG CATG CCTACGTAC-
- AAAAAA
- TTTTTT-
C o rtar con
e n zim a m arc a d o ra , ET
I p. ej., Fok I
C o rtar con
enzim a m arc a d o ra , ET
p. ej., Fok l
1
G G ATG C ATG CCTACG TAC
1. Ligar
2. A m plificar co n c e b a d o re s
e sp e c fic o s p a ra A y B
I_____ IL
EA
GG ATG C ATG
C C T A C G T A C A A A A A < W \ A
TAG d e
9 n u cle tid o s
EA
CATGe
GTAC*
GGATG CATG
aC C T A C G T A C
EA
I______ II--------------------------1
EA
DITAG
1. C o rtar co n enzim a d e anclaje

2. A islar d im arc ad o re s
3. C o n c aten a r
y 4. C lonar
207 111
DITAG
IE
98
DITAG
DITAG
37 256 15 321
Z3-............. *
DITAG
SECUENCIA
DITAG
TAG d e
9 nu cle tid o s
552
CAPTULO DIECINUEVE
por una especie aislada de cDNA de doble cadena, de varios cien

tos de pares de bases de largo, que tiene que prepararse mediante
PCR de una genoteca de clonas o un recurso similar (fig. 19-6A).
En el caso de los chips de oligonucletidos, cada carcter est re
presentado por un oligonucletido corto de cadena nica, de 20
a 25 nt de longitud, que se sintetiza en el chip durante la manu
factura. No es necesario conservar una genoteca de clonas porque
los oligonucletidos pueden sintetizarse con base en cualquier
grupo de secuencias deseado, inclusive las almacenadas en bases
de datos pblicas o de patente (fig. 19-6B). Una ventaja de este
procedimiento consiste en que permite captar secuencias de oli
gonucletidos para distinguir entre transcritos relacionados de
manera cercana. Con las caractersticas del cDNA hay un riesgo
importante de hibridacin cruzada entre genes homlogos o va
riantes de empalme alternativas. Sin embargo, una desventaja es
triba en que se requiere conocer las secuencias que se eligen para
su inclusin en un chip oligo. Por el contrario, es posible generar
microarreglos de cDNA a partir de clonas annimas en genotecas
de cDNA. Aunque la especificidad de la hibridacin en microarreglos de cDNA es alta gracias a la longitud de la secuencia de
cDNA que representa cada carcter (fig. 19-6C), en los chips de
oligonucletidos la especificidad de hibridacin es ms baja. Por
tanto cada gen est representado por 20 oligos diferentes que ca
minan a lo largo de la secuencia (fig. 19-6D). Existen 20 oligos
compatibles a la perfeccin con la secuencia blanco (compatibi
lidad perfecta u oligos PM, del ingls perfect match) y 20 que
incluyen una base incompatible (incompatibilidad u oligos
MM, del ingls mismatch) a fin de controlar para hibridacin no
especfica. Para determinar la seal de un gen particular, las sea
les de todos los 20 oligos PM se aaden juntas y las seales de to
dos los 20 oligos MM se restan del total. Los microarreglos de
cDNA tambin comprenden caracteres de control negativos con
objeto de normalizar para el fondo o hibridacin no especfica.
Asimismo los dos tipos de dispositivo presentan caractersticas de
control positivo, que por lo general representan genes que se ex
presan de manera constitutiva, como la actina. De otro modo
pueden incluirse genes bacterianos entre las caractersticas testigo
y las muestras hacerse en picos con cantidades apropiadas de

DNA bacteriano.
La expresin gnica diferencial entre muestras puede

demostrarse mediante la comparacin a travs de arreglos
o por hibridacin doble a un arreglo aislado utilizando
poblaciones de cDNA marcadas con diferentes fluorforos
Uno de los principales obstculos tcnicos en un experimento de an
lisis de expresin basado en arreglos es la reproducibilidad de datos
entre arreglos diferentes. Esto es en particular molesto cuando se
requiere realizar anlisis comparativos (p. ej., para identificar genes
que se incrementan en la enfermedad) porque se torna confuso si
las diferencias se deben a la variabilidad experimental o a cambios
genuinos en la expresin gnica. Este problema se complica cuan
do los experimentos se efectan en laboratorios distintos con arre
glos elaborados por instalaciones diferentes. Se necesitan controles
rgidos a fin de normalizar los datos de expresin para la variacin
experimental cruzada.
Una forma en la que los problemas anteriores pueden evitar
se es hibridar poblaciones de cDNA marcadas con diferentes
fluorforos al mismo arreglo de manera simultnea. Como se co
ment, bajo condiciones no saturantes, la seal de cada carcter
representar la abundancia relativa de cada transcrito en la mues
tra. Si se utilizan dos muestras, entonces la relacin de las sea
les de cada fluorforo proporciona una comparacin directa de
los valores de expresin entre muestras normalizadas completa
mente para variaciones en la relacin entre seal y ruido inclusi
ve dentro del arreglo. El arreglo se explora en dos longitudes de
onda de emisin y se recurre a una computadora con objeto de
combinar las imgenes y tornarlas de color falso. Por lo general
un fluorforo se representa en verde y el otro en rojo. Las carac
tersticas que representan genes que se expresan de modo diferen
cial se muestran en verde o en rojo, en tanto que las que indican
genes expresados de manera equivalente se muestran en amarillo
(fig. 19-6C).
Fig. 19-6. Anlisis de expresin con microarreglos de DNA.

A) Se producen microarreglos manchados mediante impronta robtica de molculas de cDNA amplificadas en portaobjetos de vidrio. Cada mancha o
carcter corresponde a un fragmento gnico contiguo de varios cientos de pares de bases o ms. Oligonucletidos presintetizados tambin pueden
mancharse en portaobjetos (no se muestra). B) Se manufacturan chips de oligonucletidos de alta densidad mediante un proceso de sntesis combina
toria qumica dirigida por luz para producir miles de secuencias diferentes en un arreglo muy ordenado en un chip de vidrio pequeo. Los genes estn
representados por 15 a 20 pares distintos de oligonucletidos (PM, perfectamente compatibles y MM, incompatibles) en el arreglo. C) En arreglos man
chados suelen efectuarse valoraciones de expresin comparativa marcando de manera diferencial dos muestras de mRNA o cDNA con diferentes fluor
foros. stas se hibridan a caracteres en el portaobjetos de vidrio y despus se examinan para detectar ambos fluorforos de manera independiente. Los
puntos de colores marcados x, y y z en la parte inferior de la imagen corresponden a los genes hipotticos presentes en concentraciones mayores en
la muestra 1 (x), valores mayores en la muestra 2 (y) y valores similares en las muestras 1 y 2 (z). D) En Affymetrix GeneChips el cRNA biotinilado se
hbrida al arreglo y se tie con un fluorforo conjugado con avidina. La seal se detecta por exploracin con lser. Grupos de oligonucletidos pareados
para genes hipotticos se encuentran en valores mayores en la muestra 1 (x), valores mayores en la muestra 2 (y) y valores similares en las muestras
1 y 2 (z). Modificado de Harrington y colaboradores (2000) con autorizacin de Elsevier Science.
19.3 1 PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCRIPTMICA) | 553
M icroarreglo d e DNA m an ch a d o
A)
DNA
'
A rreglo d e o llg o n u cle tid o s d e a lta d e n sid a d
B)
B a se d e
___
d a to s p b lica I
Ô
S elecci n d e se c u e n c ia \
A m plificacin m ed ia n te PC R
O blea
d e vidrio
/ S ln te sls d e oligom ero
Purificacin
Im pronta ro b tica
A
_ _ _ y
A
G en X
G en X
C)
RNA 1
+ flor
RNA 2
+ flor
D)
RNA 1
+ biotina '
RNA 2
+ biotina
H ibridar
Lavar
Teir
Teir
. OOGOO
oooooo
-- oooo
_3 0 ;
oo o o o
/ Im ag en 2
Im agen 1 \
Im agen
com binada en
program a de
com putadora
o
o
oo
o
o
o
o
O- o
o
-o
o o
r im i
I M I i i T T l l 11 I T T I v
B B l 1 l 1 n
T
z i Hl i y U U M H B H B H B H z
o
Q___________
I m agen 2
Im agen 1
\ /
D atos c o m b in ad o s en p ro g ram a d e c o m p u tad o ra
554
CAPTULO DIECINUEVE
19.3.4 El anlisis de datos de arreglos de DNA incluye

la creacin de una matriz de distancia y
el agrupamiento de puntos de datos relacionados
utilizando algoritmos reiterativos
El anlisis de datos de expresin gnica en muchas
condiciones diferentes puede mostrar enlaces funcionales
entre genes
Los datos crudos de experimentos de microarreglos son intensi
dades de seal que deben normalizarse (corregirse para efectos de
fondo y variacin interexperimental, vase antes) y revisarse pa
ra errores causados por contaminantes y valores extrnsecos ex
tremos (Yang y cois., 200). Los datos se resumen como un cuadro
de intensidades de seal normalizadas en el que las hileras del
cuadro representan genes individuales y las columnas indican di
ferentes condiciones bajo las que se midi la expresin gnica.
En los casos simples, el cuadro tiene dos columnas (p. ej., mues
tra testigo y muestra de enfermedad) y stas pueden representar
las intensidades de seal de las dos muestras que se hibridan al
mismo tiempo al arreglo. Sin embargo, no hay un lmite terico
en cuanto al nmero de condiciones que pueden emplearse.
Por ejemplo, la expresin gnica puede estudiarse en una serie
de puntos de tiempo del desarrollo o en una serie de puntos de
tiempo tras el inicio de una infeccin viral, o cuando clulas cul
tivadas se expusieron a una gama de frmacos y otras sustancias
qumicas.
La siguiente etapa del anlisis comprende el agrupamiento de
genes con perfiles de expresin similares (Altman y Raychaudhuri, 2001; Quackenbush, 2001). Por lo general el anlisis es ms ri
guroso cuanto mayores sean las condiciones en las que la
expresin gnica se estudia. La figura 19-7 muestra el anlisis de
tres genes en tres condiciones. Al inicio los genes A y B parecen
relacionados en trminos funcionales porque los perfiles de expre
sin son similares bajo las condiciones 1 y 2, en tanto que el gen
C parece diferente. Sin embargo, si se consideran las condiciones
C1
A
C2
2 y 3 en el anlisis y se omite la condicin 1 ahora parece que las

funciones de los genes A y C se relacionan a expensas del gen B.
Las comparaciones en muchas condiciones ayudan a eliminar re
laciones falsas que pueden conducir a anotaciones falsas. En tan
to que el anlisis de una matriz simple 3 X 3 puede efectuarse
visualmente, los datos de expresin que incluyen miles de genes y
decenas de condiciones deben examinarse con la ayuda de compu
tadoras. Se utilizan dos tipos de algoritmo para explorar los datos
de expresin gnica: uno en el que se agrupan datos similares en
forma jerrquica y otro en el que los grupos se definen en una
manera no jerrquica.
Agrupamiento jerrquico
El enfoque general del agrupamiento jerrquico consiste en esta
blecer una matriz de distancia que lista las diferencias en los va
lores de expresin entre cada par de caracteres en el arreglo. A
continuacin se agrupan en forma progresiva los que muestran las
diferencias ms pequeas, expresadas como la funcin de distan
cia d. Los mtodos de agrupamiento aglomerativo inician con la
clasificacin de cada gen representado en el arreglo como un gru
p o nico (es decir, un grupo que contiene un gen). Se busca la dis
tancia de matriz, los dos genes con los valores de expresin ms
similares (la funcin de distancia ms pequea) se definen como
vecinos y luego se funden en un grupo nico. El proceso se repite
hasta que slo queda un grupo. La forma en que se calcula el va
lor de expresin del grupo fusionado para el propsito de compa
raciones adicionales presenta variaciones.
En el mtodo del vecino ms cercano (enlace nico), la dis
tancia se reduce al mnimo. Es decir, donde dos genes i y j se fu
sionan en un grupo nico ij, la distancia entre ij y el siguiente gen
ms cercano k se define como el ms bajo de los dos valores d(i,k)
y d(j,k). El mtodo de enlace promedio utiliza el promedio entre
d(i,k) y d(j,k). En el mtodo del vecino ms lejano (enlace com
pleto) la distancia se lleva al mximo. Estos mtodos generan dendogramas con estructuras diferentes (fig. 19-8). Con menos frecuencia
puede emplearse un algoritmo de agrupamiento divisivo en el que un
grupo aislado que representa todos los genes en el arreglo se corta
progresivamente en grupos separados.
C3
A
A
B
C
D
A
B
C
D
Fig. 19-7. Este ejemplo simple muestra la importancia de vigilar el

anlisis de expresin gnica en varias condiciones.
Fig. 19-8. Anlisis de datos de microarreglos con el uso de los per

files de expresin hipotticos de cuatro genes (A a D).
Los perfiles de expresin de los genes A y B parecen similares bajo las

condiciones 1 y 2 (es decir, ambos permanecen estticos), en tanto
que el gen C parece estar disminuido bajo la condicin 2. Ello sugiere
Los mtodos de agrupamiento jerrquico producen diagramas de

ramificacin (dendrogramas) en los que genes con los perfiles de
expresin ms similares se agrupan entre s, pero mtodos de
agrupacin alternativos producen dendrogramas con distintas
que los genes A y B se relacionan funcionalmente y que C es distinto.

Sin embargo, si los perfiles se observan bajo las condiciones 2 y 3, y
se ignora la condicin 1, parecera que los genes A y C se relacionan
funcionalmente y que B es diferente. El anlisis de las tres condiciones
sugiere que no existe relacin entre ninguno de los genes.
topologas. El patrn de la izquierda es caracterstico de la topologa

producida por el agrupamiento del vecino ms cercano (enlace nico)
en tanto que el patrn a la derecha es tpico de la topologa que el
agrupamiento del vecino ms lejano produce (enlace completo).
19.3 | PERFIL GLOBAL DEL mRNA (TRANSCR1PTM1CA) j 555
Agrupamiento no jerrquico
Una desventaja del agrupamiento jerrquico es que toma tiempo
y demanda grandes recursos. Como alternativa, los mtodos no
jerrquicos dividen los datos de expresin en un cierto nmero de
agrupamientos predefinidos y por consiguiente el anlisis se ace
lera en forma considerable, en especial cuando el grupo de datos
es muy grande. En el m tod o d e a gru p a m ien to d e m ed ia s k, varios
puntos que se conocen como centros de agrupamiento se definen
al inicio del anlisis y cada gen se asigna al centro de agrupamien
to ms apropiado. Con base en la membresa de cada grupo, se
calculan de nuevo las medias, es decir, los centros de agrupamien
to se recolocan. Despus se repite el anlisis de manera que todos
los genes se asignan a los nuevos centros de agrupamiento. Este
proceso se repite hasta que la membresa de los diversos agrupa
mientos ya no cambia. Los mapas de autoorganizacin son simi
lares en concepto pero el algoritmo se refina mediante el uso de
una red neural.
19.3.5 Los arreglos de DNA se utilizan para estudiar

la expresin gnica global en lneas de clulas
humanas, biopsias de tejidos y modelos animales
de enfermedad
La comparacin de muestras sanas y enfermas puede
emplearse para identificar marcadores de enfermedad
y posibles blancos farmacolgicos
Los arreglos de DNA se usan con amplitud para caracterizar el
transcriptoma humano y el estudio de enfermedades tal vez sea la
aplicacin prctica ms importante de esta tecnologa. La compa
racin de tejido sano y enfermo, representado por lneas celulares,
biopsias de tejido o modelos animales, permite identificar los genes
que se expresan de modo especfico en el estado patolgico o de
manera especial en el no patolgico. Genes individuales especficos
de enfermedad pueden constituir marcadores diagnsticos tiles.
Los genes especficos de enfermedad pueden codificar protenas cu
ya presencia o actividad contribuye a los sntomas de la afeccin y
constituyen posibles blancos para la intervencin teraputica. De
igual forma, si los productos de uno o ms genes estn ausentes en
la enfermedad, las protenas en s mismas pueden representar agen
tes teraputicos tiles.
El estudio de McCaffrey y colaboradores (2000) es un ejemplo
informativo de la conducta anterior. Estos investigadores utiliza
ron GeneChips Affymetrix para comparar los perfiles de expresin
de arterias normales y arterias extirpadas de pacientes con lesiones
ateroesclerticas. Demostraron que un gen particular, EGR1, esta
ba aumentado cinco veces en el estado patolgico. Este gen codi
fica un factor de transcripcin que controla genes que codifican
factores de crecimiento y otras molculas de sealamiento, mo
lculas de adherencia celular y protenas que regulan la coagula
cin sangunea. Estas protenas corriente abajo desempean
funciones con implicaciones obvias en el depsito de clulas abun
dantes en colesterol en la superficie interna de las arterias y por
tanto EGR1 es un blanco farmacolgico til.
Los anlisis multiplex pueden proporcionar perfiles de

transcripcin tiles para distinguir enfermedades muy
similares y descubrir nuevas subcategoras de enfermedad
Los marcadores aislados no son tiles para el diagnstico de todas
las enfermedades, en particular las que se relacionan de modo cer
cano (p. ej., diferentes tipos de cncer). En estos casos es posible
emplear arreglos para derivar perfiles transcripcionales de 50 a 100
genes que ofrecen mayor discriminacin. Este procedimiento se
denomina prediccin d e clase cuando las categoras de la enferme
dad se conocen. Se espera que los resultados del experimento se
ajusten a un cierto nmero de categoras definidas con anteriori
dad y por esta razn el anlisis de datos se describe como super
visado.
Un ejemplo de este mtodo es el uso de arreglos para diferenciar
entre leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia linfoblastoide
aguda (LLA). Aunque las enfermedades son similares, responden a
diferentes tratamientos y por consiguiente el diagnstico correcto es
esencial para el xito en la teraputica. Casi siempre se utiliza
una combinacin de tcnicas, que incluyen deteccin de marca
dores protenicos, tincin diferencial, anlisis citogentico e ins
peccin visual de clulas en frotis sanguneo. Ninguna de las
pruebas es 100% precisa y en algunos casos pruebas separadas
proporcionan resultados contradictorios. Golub y colaboradores
(1999) usaron arreglos manchados que representaban alrededor
de 7 000 genes humanos para examinar 38 muestras de mdula
sea. Con el algoritmo de mapas de autoorganizacin comenta
do identificaron de manera correcta cada muestra como repre
sentativa de LMA o de LLA con base en el perfil de alrededor de
50 genes.
En algunos casos el perfil de expresin de muestras de enferme
dad identifica subcategoras de la enfermedad antes desconocidas
(descubrimiento de clase). Como las categoras no se definen al inicio
del experimento, este tipo de anlisis se define como no supervisa
do. Por ejemplo, por medio de un microarreglo de cDNA, Alizaden y colaboradores (2000) identificaron dos subtipos diferentes de
linfoma no Hodgkin (vase fig. 17-18). Slo 40% de los pacientes
con esta enfermedad se benefici con el tratamiento farmacolgico
y hasta fecha reciente no se conoca una forma de predecir quines
responderan a la teraputica. Sin embargo, al parecer los dos nue
vos subtipos de la enfermedad corresponden a los tipos del pade
cimiento que responde y que no lo hace. Asimismo Bittner y
colaboradores (2000) pudieron identificar dos subtipos distintos
de melanoma cutneo.
Lneas celulares y modelos animales pueden utilizarse

para estudiar perfiles de expresin gnica bajo mltiples
condiciones o en mltiples puntos de tiempo
51 bien las biopsias permiten comparar perfiles de expresin gni
ca en la salud y la enfermedad, las lneas celulares y los modelos
animales ofrecen la mayor versatilidad para estudiar diferentes
condiciones o distintos puntos de tiempo. Por ejemplo, Zhu y co
laboradores (1998) infectaron fibroblastos de prepucio humano
cultivados con citomegalovirus y analizaron los perfiles de expre
sin gnica en varios puntos de tiempo despus de la infeccin
556 1 CAPTULO DIECINUEVE
utilizando un microarreglo de cDNA que contena 6 000 genes.

Demostraron que durante la infeccin estaban incrementados
ms de 250 genes, inclusive varios que se sabe que modulan la
respuesta inmunitaria. Tambin usaron lneas celulares para estu
diar el efecto de los factores de crecimiento y las citocinas (p. ej.,
Der y cois., 1998) y la transfeccin con oncogenes (como Khan y
cois., 1999). Una extensin de este mtodo es el uso de lneas ce
lulares humanas a fin de analizar repuestas a frmacos, sustancias
qumicas y toxinas. En ocasiones estos experimentos revelan en
laces funcionales inesperados entre genes. Por ejemplo, Iyer y co
laboradores (1999) estudiaron el transcriptoma de clulas con
agotamiento srico despus de la adicin de suero fresco y mos
traron la induccin de diferentes clases de genes en distintos pun
tos de tiempo despus de la revitalizacin. Los primeros genes
que se expresaron fueron los genes de respuesta de proliferacin,
como JU N y FOS, pero en puntos de tiempo posteriores muchos
de los genes inducidos fueron los que participan en la cicatriza
cin de heridas, como FGF7 y VEGF.
19.4
Protem ica
19.4.1 La protemica comprende el anlisis de la

expresin de protenas y de la estructura
y las interacciones protenicas
El anlisis del proteoma muestra la forma cmo los
cambios en la abundancia de protenas particulares
coordinan las actividades bioqumicas de la clula
Si bien es muy til analizar el transcriptoma para caracterizar la fun
cin gnica, no debe olvidarse que los productos finales de la mayor
parte de los genes son protenas. La protemica permite estudiar de
modo directo estos productos y ello es importante porque expone dos
limitaciones del anlisis del transcriptoma.
Primero, en parte a causa de la regulacin postranscripcional,
no todos los mRNA en la clula se traducen, de manera que el
transcriptoma puede incluir productos gnicos que no se encuen
tran en el proteoma. De igual modo las tasas de sntesis y recambio
de protenas difieren entre los transcritos y por tanto la abundan
cia de un transcrito no siempre corresponde a un exceso de la pro
tena codificada (Gygi y cois., 1999b). Por estas razones es posible
que el transcriptoma no represente con precisin el proteoma des
de los puntos de vista cualitativo o cuantitativo.
Segundo, a menudo la actividad de las protenas depende de
modificaciones postraduccionales que no pueden predecirse a par
tir del nivel del transcrito correspondiente. Muchas protenas se
encuentran en la clula como molculas inertes, que necesitan ac
tivarse mediante procesos como corte proteoltico o fosforilacin.
En casos en que la variabilidad en la abundancia de una variante
postraduccional especfica es importante, ello significa que slo la
protemica provee la informacin necesaria para establecer una re
lacin entre la expresin y la funcin gnicas. Por ejemplo, la pro
tena de sealamiento estatmina se encuentra en valores altos en
varios cnceres, inclusive leucemias de la niez, pero slo la forma
fosforilada de la protena es un marcador til de la enfermedad. En
consecuencia es necesario estudiar directamente el proteoma para

comprender por completo las molculas funcionales presentes en
la clula.
El anlisis de la estructura y las interacciones de las

protenas puede aportar informacin funcional importante
Como la transcriptmica, la protemica puede usarse con objeto
de vigilar la abundancia de diferentes productos gnicos. Es posible
comparar la expresin de todas las protenas de la clula entre
muestras relacionadas, lo que permite identificar protenas con pa
trones de expresin similares y destacar los cambios importantes
que ocurren en el proteoma, por ejemplo, durante la enfermedad o
la respuesta a estmulos externos particulares. En ocasiones esto se
denomina protemica de expresin. Sin embargo, otra dimensin
importante de la protemica es que a menudo permite establecer
las funciones mediante la investigacin de las interacciones pro
tenicas. Las protenas cumplen sus actividades en las clulas interactuando con otras molculas. Por consiguiente el establecimiento
de interacciones especficas entre protenas puede ayudar a asignar
funciones individuales y relacionar protenas dentro de vas y redes.
Es posible derivar ms informacin de interacciones de las prote
nas con molculas pequeas (que pueden actuar como ligandos,
cofactores, sustratos, moduladores alostricos, etc.) y cidos nuclei
cos. El anlisis de interacciones de las protenas se superpone con el
anlisis de su estructura. El conocimiento de la estructura tridi
mensional de una protena puede ayudar a predecir interacciones
con otras protenas y con molculas ms pequeas, lo que quiz sea
muy til en el desarrollo de medicamentos eficaces. La compara
cin de estructuras protenicas tambin proporciona un medio adi
cional para determinar relaciones evolutivas entre genes e investigar
sus funciones.
19.4.2 La protemica de expresin floreci a travs

de la combinacin de dos plataformas de
tecnologa mayores: la electroforesis en gel
bidimensional (EG2D) y la espectrometra
de masa
El proteoma contiene decenas de miles de protenas que varan en
abundancia en cuatro o ms rdenes de magnitud. Como los ci
dos nucleicos, las protenas pueden detectarse e identificarse me
diante interacciones moleculares especficas, en la mayor parte de
los casos con anticuerpos u otros iigandos como sonda. Sin embar
go, a diferencia de los cidos nucleicos, no se dispone de un pro
cedimiento para clonar o amplificar protenas raras. Ms an, las
propiedades fsicas y qumicas de las protenas son tan diversas que
no es posible utilizar anlogos de una metodologa universal ni
ca para hibridacin a fin de estudiar el proteoma completo en un
solo experimento. Por tanto, aunque el desarrollo de chips de pro
tenas como equivalentes directos de microarreglos de DNA des
pierta un inters importante (recuadro 19-3), en la actualidad se
requieren plataformas de tecnologa alternativas para el anlisis de
la totalidad del proteoma.
Hoy en da la protemica de expresin se basa en la tecnolo
ga de separacin y exhibicin, en la que mezclas protenicas
19.4 I PROTEMICA j 557
Recuadro 19-3. Chips de protenas

Los microarreglos de DNA son tiles para analizar el genoma completo
porque todas las molculas de DNA son quimicamente similares y pueden
hibridarse en una valoracin. En contraste, las protenas son muy diversas
desde el punto de vista qumico. Algunas son acidas, en tanto que otras
son bsicas; algunas son cargadas o polares, mientras que otras son hi
drfobas y muchas sufren modificacin postraduccional que altera an
ms sus propiedades qumicas y fsicas. Por esta razn es difcil producir
chips de protenas de verdad universales . Sin embargo, durante los lti
mos aos se lograron muchos adelantos en la tecnologa de chips de pro
tenas que culminaron con la creacin de un chip del proteoma completo
para la levadura Saccharomyces cerevisiae (Zhu y cois., 2001). Se descri
ben varios tipos de chip de protenas (vase Zhu y Snyder, 2003).
Chips de anticuerpos. Consisten en grupos de anticuerpos y se em
plean para detectar y cuantificar protenas especficas en una mezcla
compleja. Pueden conceptuarse com o dispositivos de inmunovaloracin de alto rendimiento en miniatura.
Chips de antigenos. Son los contrarios de los chips de anticuerpo; es
tos dispositivos contienen antgenos de protenas en grupos que se uti
lizan para detectar y cuantificar anticuerpos en una mezcla compleja.
Chips de protenas universales (arreglos funcionales). Pueden
contener cualquier tipo de protena ordenada en la superficie y usar
complejas se separan en sus componentes de modo que puedan

captarse rasgos interesantes (p. ej., protenas que se encuentran en
un espcimen de enfermedad pero no en una muestra sana equi
parable) para la caracterizacin ms amplia. La separacin suele
efectuarse mediante electroforesis en un gel bidimensional
(EG2D), una tcnica que se desarroll hace ms de 25 aos y que
tiene la potencia de resolver hasta 10 000 protenas en un solo gel
(Gorg y cois., 2000; Herbert y cois., 2001). Hasta hace pocos aos
el principal cuello de botella en la protemica era la caracterizacin
de las protenas separadas, que estn representadas por manchas
annimas. Como se coment, una forma en que las protenas
pueden identificarse y cuantificarse es usando anticuerpos u otras
sondas especficas. Sin embargo, este mtodo slo puede aplicar
se a un nmero pequeo de protenas en cualquier experimento
aislado y confa en la disponibilidad de dichas sondas. El adelan
to cientfico lleg con el desarrollo de tcnicas de anotacin basa
das en espectrometra de masa, que pueden aplicarse a cualquier
protena e implementarse a gran escala (Griffn y cois., 2001;
Mann y cois., 2001). Ello requiere innovaciones en el diseo de
instrumentos y nuevos mtodos bioinformticos de bsqueda en
bases de datos con informacin de masa pptida (Aebersold y
Mann, 2003).
La electroforesis en gel bidimensional (EG2D) es la principal

plataforma para la separacin de protenas en protemica
pero no est exenta de limitaciones
Se conocen muchos mtodos distintos para separar protenas y
todos explotan las propiedades qumicas o fsicas particulares que
difieren de una protena a otra, por ejemplo, masa, tamao, car
ga, solubilidad y afinidad por diferentes ligandos. Como cabra es
perar, la resolucin es mayor cuanto ms propiedades se utilicen
se para detectar y caracterizar interacciones especficas protenaprotena y protena-ligando. Es posible recurrir a varios mtodos de
deteccin, que incluyen marcado de protenas en solucin o deteccin
de cambios en las propiedades de superficie del chip, esto es, me
diante resonancia de plasmn de superficie. Esta categoria compren
de arreglos de lectina, que se emplean para detectar y caracterizar
glucoproteinas.
Chips de captura de protenas. No contienen conjuntos de protenas
o protenas ordenadas sino otras molculas que interactan con pro
tenas como agentes de captura amplios o especficos. Los ejemplos
Incluyen aptmeros de oligonucletidos y chips que contienen pol
meros moleculares im prontos como agentes de captura especficos,
o los chips de protenas de patente manufacturados por compaas
como BIAcore Inc. y Ciphergen Biosystems Inc., que utilizan agentes
de captura amplios basados en la diferenciacin de sustancias qumi
cas superficiales para simplificar las mezclas protenicas complejas.
Arreglos en solucin. La ltima generacin de chips de protenas se
liber del formato de arreglo bidimensional para incrementar su flexi
bilidad y capacidad de manejo. Estos dispositivos pueden basarse,
por ejemplo, en microesferas codificadas o nanopartculas de oro co
dificadas con barras.
en cualquier tcnica de separacin. El principio de la EG2D con

siste en separar protenas con base en su carga y masa, y cada se
paracin se realiza en una dimensin diferente (Gorg y cois., 2000;
Herbert y cois., 2001). Una muestra compleja de protenas se car
ga en un gel de poliacrilamida desnaturalizante y se separa en la
primera dimensin mediante enfoque isoelctrico. En esta tcni
ca las protenas migran en un gradiente de pH hasta que llegan a
su punto isoelctrico (la posicin en que su carga es neutral con
respecto al pH local). El procedimiento estndar consiste en pre
parar un g e l d e g r a d ien te d e p H in m oviliz a d o ( GPI), en el que
se fijan grupos amortiguadores a la matriz de poliacrilamida, que
impiden que se mezclen y tornen inestables durante las carreras en
el gel largo. A continuacin el gel se equilibra en el detergente dodesilsulfato sdico, que se enlaza de manera estoiquiomtrica a la
estructura bsica de las protenas desnaturalizadas y confiere una
carga negativa masiva que cancela con efectividad cualquier dife
rencia de carga entre protenas individuales. Por tanto la separa
cin en la segunda dimensin depende de la masa de la protena;
las protenas ms pequeas se mueven con mayor facilidad a tra
vs de los poros del gel. Luego el gel se tie y las protenas se des
cubren como un patrn de manchas (fig. 19-9).
Aunque la EG2D tiene una resolucin alta y es la tcnica que
ms se emplea en protemica para separar protenas, su utilidad tie
ne varias limitaciones en cuanto a representacin, sensibilidad, reproducibilidad y conveniencia (sobre todo en trminos de su
adecuacin para la automatizacin). Varias clases de protenas estn
menos representadas en gel estndares, inclusive protenas muy b
sicas, protenas con mala solubilidad en amortiguadores acuosos y
protenas de membrana. Quiz sea necesario fraccionar antes la
muestra protenica y usar diferentes detergentes y amortiguadores
para extraer distintas clases de protenas a fin de separarlas con efec
tividad. La sensibilidad de la EG2D depende del lmite de deteccin
558
CAPTULO DIECINUEVE
PH b ajo
pH bajo
r --------^
------------------------------------------------------- >
--
Equilibrar en SDS
Transferir el gel de enfoque a gel SDS
Aplicar cam po elctrico ortogonal
---------------------------------------------
Aplicar cam po elctrico
o*
o
m
< #
* "
pH alto
pH alto
Fig. 19-9. Principio de la electroforesis en gel bidimensional.

Una mezcla compleja de protenas se carga en el extremo bsico de un gel de isoelectroenfoque (a menudo un gel en tubo o una tira premoldeada, que
comprende una matriz de poliacrilamlda con un gradiente de pH inmovilizado). Un campo elctrico se aplica a travs del gel y las protenas migran hacia
sus puntos isoelctricos, donde el valor pl equivale al pH circundante y la carga neta es cero. Esto separa las protenas con base en su carga (las
protenas cidas se muestran en rojo y las bsicas en amarillo, con sombras de naranja que indican protenas con valores pl intermedios). Aunque el gel
tamiza las protenas segn su tamao, las carreras largas en el gel aseguran que todas las protenas lleguen a sus puntos isoelctricos y el sistema se
equilibra. A continuacin el gel de enfoque se equilibra en SDS, que se enlaza con una relacin de masa constante con todas las protenas desnaturalizadas
y se fija a un poliacrilamida SDS estndar. Luego las protenas se separan con base en el tamao (indicado por crculos de dimetros diferentes) y las
ms pequeas de stas migran ms all a travs del gel que las ms grandes.
para protenas muy escasas y esto se abord con el desarrollo de

reactivos de tincin muy sensibles conocidos como colorantes SYP R O que pueden detectar manchas protenicas en lmites de nanogramos. Tambin la resolucin del gel influye la sensibilidad
porque es difcil detectar manchas que representan protenas esca
sas cuando las que representan protenas abundantes las ocultan.
Estos problemas pueden tratarse mediante fraccionamiento previo
para eliminar protenas abundantes y simplificar la muestra inicial
que se carga en el gel, e incrementando la resolucin de la separa
cin. En el ltimo caso es posible aumentar la distancia de separa
cin con el uso de gel de formato muy grande, pero una alternativa
ms conveniente consiste en emplear gel zoom para isoelectroen
foque, es decir, un gel con un lmite de pH muy reducido (fig. 1910). Las imgenes obtenidas de gel zoom pueden unirse entre s en
una computadora para analizar el proteoma completo.
Una de las principales limitaciones de la EG2D radica en que
no es muy adecuada para la automatizacin, que el anlisis de al
to rendimiento de muchas muestras requiere. Fue necesario crear
programas de computadora para el reconocimiento y la cuantificacin de las manchas, algoritmos que pueden comparar manchas
protenicas a travs de mltiples gel y robots que pueden captar
manchas interesantes y procesarlas para espectrometra de masa
(EM). Muchas de las dificultades que la EG2D presenta pueden
abordarse mediante el desarrollo de mtodos de separacin alter
nativos basados en cromatografa lquida de alta presin multidi-
mensional (CLAP). Estos mtodos son ms rpidos y sensibles,

no demandan el teido de protenas, permiten una cuantificacin
ms precisa, pueden resolver protenas que estn menos represen
tadas en la EG2D y son mucho ms fciles de automatizar e in
tegrar con el anlisis corriente abajo. Aunque carecen del aspecto
visual de los gel teidos, es posible que los mtodos de cromato
grafa lquida desplacen la EG2D como la principal plataforma
para la separacin de protenas en protemica (Lesney, 2001;
Wang y Hanash, 2003).
La espectrometra de masa es el nico mtodo universal

para la anotacin de alto rendimiento de protenas annimas
La espectrometra de masa (EM) se utiliza para determinar las
masas precisas de molculas en una muestra o anilato particula
res. El principio de la anotacin protenica mediante EM es el uso
de masas moleculares precisas como trminos de bsqueda para
explorar bases de datos (Mann y cois., 2001; Aebersold y Mann,
2003). ste puede completarse ms rpido que el mtodo de anota
cin alternativa, la secuenciacin directa de protenas mediante
degradacin Edman, y es fcil automatizarlo para analizar mues
tras de alto rendimiento. Es importante cuando se considera la ne
cesidad de procesar miles de manchas de un gel 2D o cientos de
fracciones de CLAP.
19.4
PROTEMICA
559
mediante digestin con proteasas, pueden utilizarse para identifi

car las protenas correlacionando las masas determinadas de ma
nera experimental con las predichas a partir de secuencias de
bases de datos. Hay tres formas diferentes de anotar una protena
por medio de EM (fig. 19-12):
Huella de masa pptida (HMP). Una mezcla de una protena simple (casi siempre una mancha aislada de un gel 2D) se
digiere con tripsina a fin de generar un conjunto de pptidos
trpticos. stos se someten a DILAM-EM con un analizador
de tiempo de vuelo (TDV) (recuadro 19-4), que regresa un gru
po de espectros de masa. Estos espectros se emplean como un
buscador de indagacin contra la base de datos SWISS-PROT.
El algoritmo de indagacin efecta digeridos virtuales de tripsi
na de todas las protenas en la base de datos y calcula las masas
de los pptidos trpticos predichos. Despus intenta equiparar
estas masas predichas con las determinadas por medios experi
mentales.
24 cm
Bsqueda de fragmento inico. Se recurre a este mtodo si

la HMP no tiene xito. Dos fragmentos pptidos trpticos se
analizan mediante espectroscopia de masa tndem (EM/EM;
recuadro 19-4), durante la cual los pptidos se rompen en
fragmentos aleatorios. Los espectros de masa de estos frag
mentos pueden usarse para buscar contra bases de datos de
MSE (marcadores de secuencia expresados), que no pueden
buscarse con datos de HMP porque los pptidos intactos sue
len ser muy grandes. Cualquier acierto en MSE puede em
plearse luego en una bsqueda BLAST a fin de identificar
posibles homlogos de longitud completa. Un algoritmo espe
cializado llamado MS-BLAST es til para manejar las caracte
rsticas de secuencia corta obtenidas de iones de fragmentos
pptidos.
de lmites de pH amplios (pH 3 a 12) en tanto que la inferior es un

gel de lmite de pH estrecho, que rene las protenas en los limites de
pH 5 a 6. Obsrvese que en el gel de lmites ms amplios casi todas
las protenas se agrupan en la parte meda, lo que seala el hecho
de que los valores pl de la mayor parte de las protenas se encuentra
en los lmites de 4 a 7. Reproducido de Orengo y colaboradores (2002)
Bioinformatics. Publicado por BIOS Scientlflc Publishers.
Secuenciacin nueva de escaleras pptidas. En esta tcni

ca los fragmentos pptidos generados por EM/EM se arre
glan dentro de un grupo anidado que difiere de longitud en
un aminocido aislado. La comparacin de las masas de es
tos fragmentos con tablas estndar de aminocidos permite
deducir la secuencia del fragmento pptido nuevo, aun cuan
do no se disponga de una secuencia precisa comparable en la
base de datos. El mtodo de secuenciacin nueva se compli
ca en la prctica por la presencia de dos series de fragmentos,
uno anidado en la terminal N y el otro anidado en la termi
nal C. Las dos series pueden distinguirse mediante la fijacin
de marcadores de masa diagnsticos a cualquier extremo de la
protena.
Hasta fecha reciente no era factible aplicar la EM a molculas

candes, como protenas y cidos nucleicos, porque se rompan
;n fragmentos aleatorios durante el proceso de ionizacin. Los
mtodos de a u to io n iz a ci n , como la desorcin/ionizacin con
.ser asistida por matriz (DILAM) y la ionizacin por electropulverizacin (IEP) (vase recuadro 19-4), permiten ionizar estas
molculas sin fragmentarlas (fig. 19-11). Las masas de protenas,
o con ms frecuencia los fragmentos pptidos derivados de ellas
En un mtodo general la HMP se intenta primero y si no tiene xi

to, suelen probarse otros mtodos menos precisos. La HMP es ms
adecuada para analizar proteomas simples como el proteoma de la
levadura, que muestran pocas variantes de empalme y modificacio
nes postraduccionales. El anlisis del fragmento inico es ms per
tinente para analizar proteomas complejos y el algoritmo puede
modificarse para considerar las masas de modificaciones postraduc
cionales conocidas. Sin embargo, resulta imposible explicar todas
las variantes a nivel secuencia! (p. ej., polimorfismos) o de modifi
cacin protenica (como glucanos complejos). En estos casos la se
cuenciacin nueva puede proporcionar caractersticas de secuencia
Fig. 19-10. Potencia de resolucin de gel con lmite de pH estrecho.

Ambas imgenes representan protenas de hgado de ratn separadas
mediante electroforesis en gel bidmensonai y tincin argntica para
revelar puntos de protenas individuales. La imagen superior es un gel
560
CAPTULO DIECINUEVE
V a s d e p p tid o s io n iz a d o s
R e fle c to r
Fig. 19-11 Principio de EM DILAM-TDV.

El analifo (por lo general un conjunto de fragmentos de pptidos trpticos) se mezcla con un compuesto matriz y se coloca cerca de la fuente de un
lser. El lser calienta los cristales de analito/matriz y ocasiona la expansin del analito hacia la fase gaseosa sin fragmentacin importante. A
continuacin los iones viajan a travs de un tubo de vuelo hacia un reflector, que los dirige a un detector. El tiempo de vuelo (el tiempo necesario para
que los iones lleguen al detector) depende de la relacin carga/masa y permite registrar la masa de cada molcula en el analito.
H u e lla d e m a s a
p p tid a
In c o m p a tib ilid a d
e x a c ta
L is o z im a h u m a n a
LG M DG YR
G IS IA N W M C L A K
W ESGYNTR
D ig e s ti n p o r
trPsina
L iso zim a h u m an a
L iso zim a d e o ve ja
L a c to a lb m in a d e rata
-V S t
C o n ju n to d e a c ie r to s
de M SE
G IS L A N
G IS L A N W
G IS L A N W M
G IS L A N W M C
E s c a le ra
p p tid a
G IS L A N W M C L
G IS L A N W M C L A
G IS L A N W M C L A K
Fig. 19-12. Anotacin de protenas mediante espectrometra de masa.

Muestras de protenas individuales (p. ej., manchas de gel 2D) se digieren con tripsina, que corta en el lado terminal C de residuos de Usina (K) o de
arginina (R) en tanto el siguiente residuo no sea prolina. Los pptidos trpticos pueden analizarse como molculas Intactas mediante DILAM-TDV y las
masas utilizarse como buscadores de indagacin contra las bases de datos de protenas. Se recurre a algoritmos que toman secuencias protenicas, las
cortan con la misma especificidad de corte que la tripsina y comparan las masas tericas de estos pptidos con las masas experimentales obtenidas
por espectrometra de masa. Como ideal, las masas de varios pptidos deben identificar la misma protena original, en este caso la lisozima humana. Es
posible que no haya aciertos si la protena no se encuentra en la base de datos o, con ms probabilidad, se halla sujeta a modificacin postraduccional
o artefactual durante el experimento. En estas circunstancias puede emplearse espectrometra de masa tndem-ESI para fragmentar los iones. Las
masas de los fragmentos inicos pueden usarse para buscar en bases de datos MSE y obtener compatibilidades parciales, que quiz conduzcan a la
anotacin correcta. De otra manera es posible recurrir a masas de escaleras pptidas para determinar secuencias protenicas nuevas.
19.4 j PROTEMICA
561
Recuadro 19-4. Espectrometra de masa en protemica

ESPECTRMETRO DE MASA
ANALIZADORES DE MASA
Un espectrmetro de masa tiene tres componentes. El ionizador que

convierte el analito en iones en fase de gas y los acelera hacia el anali
zador de masa, que separa los iones segn su relacin masa/carga en
su camino al detector inico, que registra el impacto de iones individua
les y lo presenta como un espectro de masa del analito.
Los dos tipos ms simples de analizador de masa que se usan en pro

temica son los analizadores cuadrupolo y de tiempo de vuelo (TDV).
Un analizador cuadrupolo consiste en cuatro varillas de metal, que estn
conectadas elctricamente en pares y llevan voltajes opuestos que el
operador puede controlar. El espectro de masa se obtiene al variar la di
ferencia de potencial que se aplica a travs de la corriente inica, lo que
permite que los iones de diferentes relaciones masa/carga se dirijan al
detector. Un analizador de tiempo de vuelo mide el tiempo que los iones
necesitan para viajar a travs de un tubo de vuelo hasta el detector, un
factor que depende de la relacin masa/carga.
Mtodos de ionizacin blanda

La ionizacin de molculas grandes sin fragmentacin y degradacin se
conoce como ionizacin blanda. En protemica se utilizan con amplitud
dos de estos mtodos. La desorcin/ionizacin lser asistida por matriz
(DILAM) comprende mezclar el analito (los pptidos trpticos derivados
de una muestra particular de protenas) con un compuesto de matriz que
absorbe la luz en un solvente orgnico. La evaporacin del solvente pro
duce cristales de analito/matriz, que se calientan mediante un pulso cor
to de energa lser. La desorcin de la energa lser com o calor origina la
expansin de la matriz y el analito hacia la fase de gas. A continuacin el
analito se ioniza y se acelera hacia el detector. En la ionizacin de electropulverizacin (IEP), el analito se disuelve y la solucin se impulsa a
travs de un capilar estrecho. Una diferencia de potencial, aplicada a tra
vs de la abertura, ocasiona que el analito emerja com o una pulverizacin
fina de partculas cargadas. Las gotitas se evaporan conforme los iones
penetran en el analizador de masa.
ESPECTROMETRA DE MASA TNDEM (EM/EM)

Comprende el uso de dos o ms analizadores de masa en serie. Se des
criben varios instrumentos EM/EM que incluyen los dispositivos cuadru
polo triple y el hbrido cuadrupolo/tiempo de vuelo. Los analizadores de
masa estn separados por una celdilla de colisin que contiene gas Iner
te y ocasiona que los iones se disocien en fragmentos. El primer analiza
dor selecciona un ion pptido particular y lo dirige hacia la salida de
colisin, donde se fragmenta. El segundo analizador obtiene un espectro
de masa para los fragmentos. Estas dos funciones pueden combinarse
en instrumentos ms complicados, com o los analizadores de atrapa
miento de iones y el ciclotrn inico de transformacin Fourier.
factibles de utilizar como buscadores para indagacin a fin de iden

tificar secuencias homologas en las bases de datos.
La espectrometra de masa (EM) tambin puede emplearse

para analizar protenas que se expresan de modo diferencial
El objetivo de muchos experimentos protemicos es identificar
protenas cuya abundancia difiere de manera significativa a tra
vs de dos o ms muestras. Una forma en que puede lograrse
consiste en examinar gel 2D e identificar manchas que muestran
variacin cuantitativa; se cuenta con varios paquetes de progra
mas de computadora para ayudar en estas investigaciones com
parativas. Una alternativa consiste en marcar protenas de dos
muestras diferentes mediante conjugacin con Cy3 y Cy5, y se
rrarlas en el mismo gel (vanse Patten y Beecham, 2001; Rabi
l a d , 2002; fig. 9-13). Este mtodo, que se conoce como
lectroforesis en gel de diferencia (EGDI), aprovecha el miso principio que la expresin gnica diferencial con microarreijos de DNA que se comenta en la seccin 19.3.3. Otra forma
de abordar el problema es marcar protenas de diferentes
s con marcadores de afinidad codificados con istopos
MACI: Gygi y cois., 1999a; Sechi y Oda, 2003). Una espectromnria de masa puede distinguir y cuantificar con facilidad dos
cias del mismo compuesto marcadas de modo isotpico que
k b qumicamente idnticas y pueden copurificarse. En conse^-jinria se cre un mtodo de MACI que utiliza un derivado yoa:acam ida biotinilado con objeto de marcar de manera
circova mezclas de protenas en sus residuos de cistena. El
Trjir^dor de biotina permite la purificacin de afinidad de los
jccndos de cistena marcados despus de protelisis con tripsi l El reactivo MACI se encuentra en las formas pesada (d8)
"Sgera (dO) marcadas isotpicamente, que pueden emplearse
Fig. 19-13. Demostracin del principio de electroforesis en gel de

diferencia.
Muestras idnticas de protenas de la bacteria Erwinla carotovora se mar
caron con Cy3, y Cy5, pero en la muestra Cy5 el pico se Increment con
ocho veces las concentraciones normales de dos protenas de estudio,
mioglobina y conalbmina. Las protenas que abundan por igual en las
muestras aparecen en amarillo porque las seales Cy3 y Cy5 tienen la
misma intensidad en la imagen superpuesta. Las tres soformas de conal
bmina y las dos soformas de mioglobina, con mayor abundancia en la
poblacin marcada con Cy5, aparecen como puntos rojos. Reproducido
de Lilley y colaboradores (2001), con autorizacin de Elsevier Science.
562 | CAPTULO DIECINUEVE
para marcar de modo diferencial fondos celulares bajo condicio

nes distintas (p. ej., salud y enfermedad). Tras el marcado, las
clulas se combinan y lisan, y las protenas se aslan de manera
que ambas muestras experimentan prdidas por purificacin
iguales. Las intensidades de istopos se comparan para pptidos
conforme penetran en el espectrmetro de masa. Si son equiva
lentes, entonces no ocurri aumento o disminucin y la protena
no tiene un inters inmediato. Cuando las intensidades difieren se
efecta un cambio en la expresin protenica y la protena es de in
ters. La cantidad de las dos formas se mide y la forma dO se frag
menta del pptido y se identifica mediante bsqueda en base de
datos.
19.4.3 La protemica de expresin se usa para estudiar

cambios en el proteoma relacionados con
enfermedad y toxicidad
La protemica puede revelar marcadores de enfermedad
y posibles blancos farmacolgicos no identificados por
anlisis del transcriptoma
La abundancia variable de protenas especficas en muestras sa
nas y patolgicas, o en las que representan la progresin de la
enfermedad, puede ayudar a descubrir marcadores tiles y nue
vos blancos farmacolgicos. Por ejemplo, se identificaron varias
protenas que se expresan en valores anormales en el cncer de
mama, inclusive ANCP (antgeno nuclear de clulas en prolifera
cin, un componente de la polimerasa de DNA) y varias prote
nas de choque por calor (Franzen y cois., 1996). Asimismo se
demostr que estas ltimas se incrementan en el cncer colorrectal, en tanto que la enzima ciclooxigenasa 2 y la protena de enla
ce de cidos grasos disminuyen de modo significativo (Stulik y
cois., 1999). Varios marcadores, que comprenden tipos diferentes
de queratina, se expresan conforme el cncer vesical progresa de
la etapa temprana de epitelio transicional al carcinoma de clula
escamosa plena. Estos pueden usarse como marcadores para valo
rar el grado de diferenciacin y por tanto graficar la progresin de
la enfermedad. Sin embargo, cabe sealar que es necesario tener
cuidado durante la manipulacin de las muestras porque las can
tidades diminutas de protenas extradas de las manchas en gel
2D se contaminan con facilidad con cabello y piel, que tambin
son ricos en queratina!
Aunque las aplicaciones de la protemica y la transcriptmica
de expresin son similares, la protemica tiene la ventaja de que
muestrea las molculas funcionales existentes de las clulas y consi
dera modificaciones postraduccionales. Ya se mencion la estatmina
como un ejemplo -esta protena de sealamiento est incrementa
da en la leucemia infantil, pero slo la forma fosforilada se relacio
na con la enfermedad. La protemica tambin ofrece ventajas
para analizar lquidos corporales, que no contienen mRNA. Por
ejemplo, Celis y colaboradores (2000) mostraron que una protena
llamada psoriasina est aumentada en la orina de pacientes con
cncer vesical y puede emplearse como marcador diagnstico tem
prano de la enfermedad.
La toxicoprotemica ayuda a establecer la base de las

respuestas adversas a frmacos
Como se comenta en el captulo 21, las personas tienen diferen
tes reacciones a los frmacos a causa de variaciones polimrficas
tanto en los receptores de los mismos como en las enzimas y las
protenas de transporte que determinan la forma en que los me
dicamentos se absorben, metabolizan y excretan. La protemica
puede desempear una funcin importante en la prediccin y la
investigacin de respuestas adversas a frmacos al indicar cambios
en el proteoma que se observan despus del tratamiento farmaco
lgico. Si se considera que los frmacos son molculas que interactan directamente con protenas y modifican su conducta,
muchas respuestas a ellos no afectarn la abundancia de mRNA y
en consecuencia no ejercern un efecto en el transcriptoma.
Como ejemplo considrese el medicamento inmunosupresor
ciclosporina A. Este frmaco se utiliza de manera amplia para
prevenir el rechazo despus de injertos o trasplantes de rganos,
sobre todo en nios. Uno de los principales efectos secundarios
de la ciclosporina A es la toxicidad renal, que casi 40% de los pa
cientes experimenta. La toxicidad se acompaa de prdida urinaria
de calcio y produce calcificacin de los tbulos renales. El anlisis
protomico de riones de rata, y despus de humanos, de indivi
duos no tratados y de quienes recibieron ciclosporina A mostr
una diferencia notable en la concentracin de una protena parti
cular, la protena de enlace de calcio calbindina (Aaicher y cois.,
1998). Esta protena fue mucho menos abundante en los riones
de humanos y ratas tratados con ciclosporina A y de inmediato
sugiri el mecanismo nefrotxico de la ciclosporina A. Como he
cho interesante la calbindina no se agota en monos tratados con
ciclosporina A y por tanto no sufren los mismos efectos farmaco
lgicos adversos que los humanos. En consecuencia el estudio de
la forma en que los monos metabolizan la ciclosporina A puede
conducir a identificar un mecanismo para evitar la toxicidad en
humanos.
19.4.4 Las estructuras de las protenas proveen

informacin funcional importante
Es posible que la estructura de una protema se conserve
aun cuando las secuencias divergieron hasta el grado en
que ya no es posible reconocer una relacin homologa
Al inicio de este captulo se seal cmo secuencias similares de
protenas suelen tener estructuras similares y por consiguiente
funciones similares. La funcin de la protena (o por ende un do
minio) depende de su estructura terciaria, que tambin se cono
ce como su doblez. ste forma los sitios de enlace, los dominios
de interaccin y las bolsas catalticas que desempean la activi
dad bioqumica de la protena. Dentro de estas estructuras, un
nmero pequeo de residuos de aminocidos puede ser indis
pensable para algunas reacciones qumicas especficas, por ejem
plo, residuos dentro del sitio activo de una enzima que
reaccionan con el sustrato. Sin embargo, la mayor parte de los
aminocidos de una protena tiene una funcin estructural y
19.4_[ PROTEMICA j 563
ayuda a mantener estos residuos crticos en las posiciones correc

tas. Por tanto la evolucin acta sobre todo en la estructura de
una protena y no en sus secuencias, y suelen tolerarse muchos
cambios a nivel secuencial en tanto el doblez se conserve. El re
sultado global es que durante la evolucin la estructura de la pro
tena se conserva mejor que las secuencias.
La consecuencia prctica de la conservacin estructural consis
te en que la comparacin de estructuras protenicas puede revelar
relaciones evolutivas distantes y por tanto ayudar a asignar funcio
nes a protenas no caracterizadas inclusive cuando todo trazo de si
militud secuencial desapareci. Un ejemplo es la caracterizacin de
AdipoQ, una protena de funcin inicialmente desconocida que los
adipocitos secretan. El anlisis estructural de esta protena muestra
una relacin clara y sin ambigedad con la familia del factor de ne
crosis tumoral (TNF) de las quimiocinas y en consecuencia seala
que la AdipoQ tambin es una protena de sealamiento. La figu
ra 19-14 muestra la relacin estructural entre AdipoQ y TNF-a,
junto con un alineamiento secuencial mltiple de cinco miembros
de la superfamilia basado en las estructuras conservadas (Shapiro y
Scherer, 1998).
Se dispone de algoritmos para comparar estructuras

protenicas a nivel de pares
El ejemplo comentado sugiere que un medio ms o menos direc
to para anotar cualquier gen hurfano sera obtener la estructura
de la protena hipottica codificada y compararla con las estructu
ras conocidas en una forma anloga a la comparacin de secuen
cias. A fin de lograrlo, se requerira obtener la estructura de la
protena hipottica (recuadro 19-5) y utilizar recursos bioinformticos para comparar esta estructura con estructuras protenicas
conocidas. El mayor depsito de estructuras protenicas es el Protein Databank (PDB) del Research Collaboratory of Structural
Biology at Rutgers University (http://www.rcsb.org). Los datos se
guardan como expedientes planos con las coordenadas de posi
cin de cada tomo en forma tubular. Esto se conoce como for
mato de expediente PDB.
Varios programas de computadora de acceso libre en Internet
convierten expedientes de PDB en modelos tridimensionales (p.
q , Rasmol, MolScript, Chime). Ms an, est escrito un nmero
;rm de de algoritmos que permiten comparar estructuras proteniSillitoe y Orengo, 2002). Por lo general funcionan con base en
o de dos principios, aunque algunos programas ms recientes
r
- -han elementos de ambos:
d
comparacin intermolecular: las estructuras de dos protenas

K superponen y el algoritmo intenta minimizar la distancia enc ios tomos superpuestos (fig. 19-15A). La funcin que se
73 para medir la similitud entre las estructuras suele ser la
i-arcin media de la raz cuadrada (DMRC), que es la raz
r_iirada de la distancia cuadrada promedio entre tomos equiuentes (fig. 19-15A). La DMRC disminuye conforme las esnacmras protenicas se tornan ms similares y es de cero si dos
r ~jcruras idnticas se superponen. Los ejemplos de estos algonrmos comprenden Comp-3D y ProSup;
comparacin intramolecular: las estructuras de dos protenas

se comparan lado a lado y el algoritmo mide las distancias in
ternas entre tomos equivalentes dentro de cada estructura, e
identifica lincamientos en los que estas distancias internas son
ms cercanamente compatibles (fig. 19-15B). Un ejemplo de
este algoritmo es DALI. Entre los algoritmos que emplean am
bos mtodos se encuentran COMPARER y VAST.
La genmica estructural (protemica estructural) pretende

resolver las estructuras de un grupo representativo
de protenas que cubren el espacio doblado
El genoma humano contiene cerca de 30 000 genes, pero muchos
de ellos pueden agruparse en familias (parlogos) con secuencias si
milares. Como se seal, secuencia similar implica una estructura
similar y por tanto es probable que los diferentes miembros de ca
da familia gnica codifiquen protenas con el mismo doblez. Aun
las familias gnicas que no muestran homologa secuencial impor
tante pueden codificar protenas con estructuras similares, como se
coment antes para AdipoQ y la familia de TNF. Si se toma en
cuenta la complicacin de mltiples protenas de dominio, se es
tima que existen menos de 1 000 dobleces protenicos diferentes.
Esto significa que si una protena representativa de cada familia
de dobleces puede resolverse en trminos estructurales, quiz sea
factible anotar todos los genes hurfanos con el uso de datos es
tructurales.
Varios programas piloto se iniciaron alrededor del mundo a fin
de resolver estructuras protenicas a una escala global como intento
de cubrir el espacio doblado y obtener las estructuras de un grupo
representativo de protenas (Brenner, 2001; Norin y Sundstrom,
2002; Zhang y Kim, 2003). En la mayor parte de estos proyectos el
anlisis cristalogrfico con rayos X de alto rendimiento se realiza con
la tcnica de dispersin anmala de m ultilongitud de onda (DAM)
(vanse recuadro 19-5 y Heinemann y cois., 2001). Un tema que es
tos programas comparten es un efecto de embudo, en el que una
proporcin de protenas se pierde en la etapa de anlisis. Por cada
25 protenas que se expresan, slo cinco proporcionan cristales y
apenas una genera datos de difraccin tiles. Aunque algunos de los
programas se concentran en protenas humanas o patgenas con im
portancia para las enfermedades, casi todos incluyen protenas de
bacterias con genomas pequeos (p. ej., Haemophilus influenzae) o
de termfilos (como M ethanococcus jannaschii, Methanobacterium
thermoautotrophicum). Ello se debe a que las bacterias con genomas
pequeos tambin tienen proteomas pequeos pero deben contener
an representantes de todas las familias protenicas, en tanto que las
protenas de termfilos deben ser ms estables cuando se expresan en
E. coli. La produccin de estos programas piloto sugiere que alrede
dor de 70% de las protenas hipotticas contiene dobleces conocidos
y en teora podran anotarse con base en los datos estructurales, en
tanto que 30% incluye dobleces por completo nuevos cuyas funcio
nes se desconocen. Las complicaciones abarcan la dificultad para es
tablecer definiciones rigurosas de estructuras protenicas y el efecto
de mueca rusa, en el que se observa una gama continua de estruc
turas intermedias entre distintos tipos de dobleces. Estos problemas
se discuten en el recuadro 19-6.
564
CAPTULO DIECINUEVE | MS ALL DEL PROYECTO DEL GENOMA
A)
B)
------
A'
-----
B'
------ ---- -------------
-------------
A C R P 30 AYMYRSAFSVGLETRVTV PNVPIRFTKIFYNQQN HYDGSTGKFYCNIPGLYYFSYHITV

YMKDVKVSLFKK
C 1qA
G ATQ KVAFSALRTINSPLR PNQ VIRFEKVITNANE NYEPRNGKFTCKVPGLYYFTYHASS
RGNLCVNLVRK
T N F a RTPSDKP VAHWANPQAEGQ LQWLNRRANALLANGV ELRD N Q LW P S E G LY LIY SQVLFKGQGCP
S T H V L L T H T IS R IA V
TN Fp
TLKP AAHLIGDPSKQNS LLWRANTDRAFLQDGF SLSN NSLLVPTSGIYFVYSQW FSGKAYSPKATSSPLYLAHEVQLFSS
C D 40L GDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQW AEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTF CSNREASSQAPFIASLCLKSPG
A
A C R P 30
C1 qA
A'
E----------------------------------------- F
----------------
----------------
B'
G
-----------
D
H
---------------
DKAVLFTYDQYQ
EKNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGDGDHNGLYADNVNDSTFTGFLLYHDTN
GRDSMQKW TFC
D YAQ NTFQ VTTG G W LKLEQ EE W H LQ A TD KN S LLG IEG AN S IFTG FLLFP D M D A
T N F a SYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPW YEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQV
Y FG 11AL
T N F |3 QYPFHVPLLSSQKMVY
C D 40L
RFERILLR AAN TH S
--------------------
PGLQEPWLHSMYHGAAFQLTQGDQLSTHTDGIPHLVLSPSTV
SAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFT
------------------
---------
FFGAFAL
S FGLLKL
-----------
Fig. 19-14. Anotacin funcional basada en la similitud estructural en la que no es posible detectar homologa de secuencia.
A) Comparacin de un diagrama en listn de AdpoQ y TNFa. La similitud estructural es equivalente a la que se observa dentro de la familia de TNF. B)
Alineacin de secuencia basada en la estructura entre varios miembros de la familia TNF (CD40L, TNFa y TNFa) y dos miembros de la familia C1q
(c1qA y AdpoQ). Los residuos altamente conservados (que se encuentran en cuatro de las protenas por lo menos) estn sombreados y las flechas
indican regiones de cadena 0 en las protenas. Puesto que la similitud de secuencia entre las protenas AdipoQ y TNF es baja (p. ej., 9% de identidad
entre AdipoQ y TNFa), las bsquedas BLAST no identificaran una relacin. Sin embargo, la alineacin estructural muestra patrones de residuos
conservados que podran emplearse para reconocer miembros nuevos de la familia entre genes hurfanos (vase seccin 19.2.2). Reproducido de
Shapiro y Scherer (1998) con autorizacin de Elsevler Science.
19.4 j PROTEMICA j 565
A)
dm rc
B)
= x/
Fig. 19-15. Comparacin de estructuras protenicas; los crculos representan tomos C a en cada residuo de aminocido y las lneas indican la va
de la estructura bsica polipptida en el espacio.
A) La comparacin intermolecular incluye la superposicin de estructuras de protenas y el clculo de las distancias entre tomos equivalentes en las
estructuras superpuestas (se presentan como flechas bidireccionales). Estas distancias se usan para calcular la raz cuadrada media de la desviacin
(DMRC), con la frmula que se muestra (R es la DMRC, d es la distancia entre el par /th de tomos Ca superpuesto y N es el nmero total de tomos
alineados). Un valor de DMRC pequeo computado en muchos residuos es evidencia de una estructura terciaria conservada significativamente. B) La
comparacin intermolecular comprende el anlisis lado a lado con base en distancias comparativas entre tomos equivalentes dentro de cada estructura
(se muestran como lneas de guiones codificados por color).
19.4.5 Existen muchas maneras distintas para estudiar

interacciones de protenas individuales
La funcin de una protena puede no ser obvia aun despus de un
estudio amplio de su secuencia, estructura y perfil de expresin. En
estos casos podra tener ventajas identificar las protenas con que
interacta de manera especfica, en especial si resultan ser protenas
bien estudiadas cuyas funciones se conocen. Por ejemplo, si se de
muestra que una protena nueva y no caracterizada interacta con
otras protenas necesarias para el empalme de RNA, entonces es
probable que la nueva protena participe en el mismo proceso. De
este modo pueden relacionarse protenas dentro de redes funciona
les en la clula.
Se cuenta con un gran nmero de mtodos para estudiar las
interacciones de protenas individuales, entre ellos tcnicas gen
ticas, bioqumicas y fsicas (vase Phizicky y Fields, 1995). En
tanto que slo es posible aplicar mtodos genticos a organismos
modelo como Drosophila y levaduras, mtodos bioqumicos y f
sicos pueden aplicarse directamente a clulas humanas. Un mto
do bioqumico clsico es la cromatografa de afinidad, en la que
una protena seuelo particular se inmoviliza en la matriz de apo
yo de una columna de cromatografa y se aade el lisado celular.

Las protenas que interactan con el seuelo quedan retenidas en
la columna en tanto que otras protenas se eliminan por lavado.
Las protenas que interactan pueden eludirse si la concentracin
salina del amortiguador se incrementa. Otro mtodo bioqumico
es la coinmunoprecipitacin, una tcnica en la que anticuerpos
especficos para una protena seuelo particular se aaden en for
ma directa al lisado celular y ocasionan la precipitacin del com
plejo de anticuerpo y protena seuelo. Cualquier protena que
interacta con el seuelo se coinmunoprecipita. Tanto la croma
tografa de afinidad como la coinmunoprecipitacin pueden em
plearse para aislar complejos protenicos enteros, lo que permite
identificar los diferentes componentes mediante EM (seccin
19.4.2). sta es una de las principales plataformas tecnolgicas en
protemica de interaccin. Se usa en forma amplia para caracte
rizar complejos protenicos como ribosomas, complejos que pro
mueven la anafase, el complejo de poro nuclear y los complejos de
sealamiento, y en fecha reciente se aplic a una escala genmica
(p. ej., Gavin y cois., 2002; Ho y cois., 2002; vase fig. 19-16). Las
interaciones especficas con cada complejo pueden estudiarse me
diante enlace cruzado qumico.
566
CAPITULO DIECINUEVE [ MS ALL DEL PROYECTO DEL GENOMA
Recuadro 19-5. Determinacin de estructuras de protenas

RECONOCIMIENTO DE LAS ESTRUCTURAS PROTENICAS MEDIANTE
CRISTALOGRAFA DE RAYOS X
La cristalografa de rayos X aprovecha el hecho de que los rayos X son
dispersados, o difractados, de cristales de protenas y la naturaleza de la
dispersin depende de la organizacin de los tomos dentro del cristal.
Los rayos X difractados pueden interferir de manera positiva o negativa
entre s, lo que genera patrones llamados reflexiones en un detector.
que los tomos de luz que suelen encontrarse en las protenas. La com
paracin de las reflexiones generadas por varios cristales isom orfos dife
rentes (un proceso denominado reemplazo mltiple de isomorfos)
permite estudiar las posiciones de los tomos pesados y deducir la fase
de difraccin en el cristal no sustituido.
Tcnicas alternativas aprovechan el fenmeno de dispersin anmala,
en el que se generan distintos patrones de difraccin cuando tomos de
metal en un cristal proteinico son golpeados por rayos X cuya longitud de
onda es cercana a su lmite de absorcin. La magnitud de la dispersin
anmala vara con la longitud de onda de los rayos X incidentes, de m o
do que un tipo de cristal que contiene metal a varias longitudes de onda
distintas puede bombardearse y obtenerse diferentes patrones de difrac
cin a partir de los cuales se calcula la fase de dispersin. sta es la ba
se de tcnicas como SIRAS (restitucin isomorfa nica con dispersin
anmala) y MAD (dispersin anmala de longitud de onda mltiple).
En la ltima tcnica la protena se expresa en bacterias y se incorpora el
aminocido sustituido por el metal selenometionina. En cada caso las di
ferencias en las intensidades de las reflexiones causadas por la disper
sin anmala son muy pequeas, de modo que las fuentes de radiacin
de sincrotrn y un registro preciso de la reflexin son esenciales. Por l
tim o el mapa de densidad electrnica se elabora hacia un modelo estruc
tural. Ello requiere una pieza de Informacin ms crucial la secuencia
de aminocidos porque es difcil distinguir cadenas laterales de am i
nocidos slo con datos de difraccin.
RECONOCIMIENTO DE ESTRUCTURAS DE PROTENAS MEDIANTE
ESPECTROSCOPIA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR
Imagen de difraccin de rayos X de una fosfatasa proteinica

Cortesa de Daniela Stock, MRC Laboratory of Molecular Biology,
Cambridge, Reino Unido.
A partir de estos datos es posible elaborar mapas de densidad electrni
ca mediante una funcin matemtica conocida como transformacin
Fourier. Cuanto ms datos se utilicen en la transformacin Fourier, ms
refinado y preciso es el modelo estructural resultante. La determinacin
estructural precisa requiere un cristal bien ordenado que difracte con po
tencia los rayos X. Esto puede ser un cuello de botella Importante en la
determinacin estructural porque es en extremo difcil desarrollar crista
les de protenas, aun con la disponibilidad de estaciones de cristalizacin
automatizadas, que permiten llevar a cabo miles de reacciones en para
lelo bajo condiciones ligeramente distintas. Aunque para el anlisis es
tructural puede emplearse una fuente convencional de rayos X, se
prefieren las fuentes de radiacin de sincrotrn porque producen rayos
X de mucho mayor intensidad.
La elaboracin de mapas de densidad electrnica a partir de datos de di
fraccin se basa en tres tipos de informacin: la longitud de onda de los
rayos X incidentes (que ya se conoce) y la am plitud y la fase de los ra
yos X dispersados. No obstante, slo la amplitud de la dispersin puede
determinarse con base en el patrn de reflexiones. La fase debe calcular
se por medio de experimentos de difraccin adicionales con cristales
isomorfos, es decir, cristales de la misma estructura pero que Incorpo
ran tomos ms pesados que producen patrones de difraccin alternati
vos. El medio estndar para lograrlo consiste en sumergir los cristales en
una solucin salina de un metal pesado de manera que los tomos de es
te ltimo se difundan al interior de los espacios antes ocupados por el
solvente. Los tomos de metal difractan los rayos X con mayor potencia
Algunas protenas no pueden cristalizarse, pero es posible utilizar espec

troscopia de resonancia magntica nuclear (RMN) para conocer sus
estructuras si son hasta cierto punto pequeas. Aunque hasta fecha re
ciente la tcnica se limitaba a protenas de 15 kDa o menos, adelantos en
el anlisis de datos permiten ahora estudiar protenas hasta de 100 kDa
de tamao. La tcnica aprovecha el hecho de que algunos ncleos at
micos tienen la propensin a cambiar entre estados de giro magntico en
un campo magntico aplicado cuando se exponen a ondas de radio de
una cierta frecuencia. Cuando los ncleos regresan a sus orientaciones
originales, emiten ondas de radio que pueden medirse. La frecuencia de
las ondas de radio emitidas depende del tipo de tomo y su contexto qu
mico. Por ejemplo, los ncleos de hidrgeno en un grupo metilo produci
rn una seal distinta a la de un anillo aromtico. La variacin de la
naturaleza de las ondas de radio aplicadas permite asimismo determinar
qu tan cerca se encuentran entre s en el espacio dos ncleos, inclusive
si no estn unidos por enlaces qumicos covalentes. Esto se conoce co
mo efecto nuclear Overhauser (ENO).
A partir de un espectro de RMN bidimensional, que incluye informacin
de ENO, es factible estudiar los ncleos que estn unidos entre s de ma
nera covalente y cules se encuentran juntos en el espacio. En combina
cin con la secuencia de aminocidos de la protena, lo anterior permite
elaborar una lista de restricciones de distancia que describe primero los
elementos estructurales secundarios de la protena (stos tienen relacio
nes de distancia muy especficas, vase seccin 1.5.5) y a continuacin
posibilita el desarrollo de modelos de la estructura terciaria. Por lo gene
ral diversas variantes de la estructura terciaria se ajustan a los datos de
distancia igual de bien, de modo que stos se depositan como un ensam
ble de modelo en lugar de una estructura precisa, como en el caso de la
cristalografa de rayos X.
PREDICCIN DE LA ESTRUCTURA PROTEINICA
Aunque la tecnologa para resolver estructuras de protenas est muy
adelantada, an es un proceso de labor intensiva y costoso. Un mtodo
alternativo aunque un poco menos preciso consiste en predecir las es
tructuras proteinlcas con mtodos de bioinformtica (Jones, 2000). En la
19.4 | PROTEMICA i 567
Recuadro 19-5. Determinacin de estructuras de protenas (co n tin u aci n )

actualidad es posible predecir estructuras secundarias en protenas hipo
tticas con bastante precisin pero las estructuras terciarias requieren
una estructura de plantilla en la que el modelo pueda basarse.
La estructura secundarla de una protena puede predecirse de acuerdo
con la propensin de ciertos aminocidos a ocurrir en estructuras secun
darias particulares. Algunos aminocidos, como el glutamato, tienen una
propensin helicoidal (es decir, son ms abundantes en hlices a). Otros,
como la valina, muestran una propensin a cadenas (o sea, abundan ms
las cadenas y hojas 0). La glicina y la prolina son poco usuales porque
rara vez se encuentran en estructuras secundarias. De hecho suelen ha
llarse en los extremos de hlices y cadenas, y al parecer actan como
terminadores estructurales . La presencia de un cordn de residuos con
propensin helicoidal o de cadena indica con firmeza la presencia de es
ta estructura en la protena. Sin embargo, las predicciones de la estruc
tura secundaria basadas en protenas nicas no son seguras porque hay
ejemplos individuales de todos los aminocidos que aparecen en todos
los tipos de estructuras secundarias. Las alineaciones mltiples pueden
eliminar esta incertidumbre al identificar bloques de residuos conserva
dos que apoyan la formacin de hlices o cadenas. Los algoritmos ms
complicados, com o PSI-PRED (Jones, 2000), utilizan alineaciones m lti
ples y tambin incorporan informacin evolutiva y estructural de bases de
datos para incrementar la exactitud de sus predicciones.
19.4.6 Seleccin de interaccin de alto rendimiento

con mtodos basados en genotecas
Sera til si los mtodos de seleccin de interaccin de alto rendi
miento proporcionaran un enlace directo entre las protenas y los
genes que las codifican. Esto se abord mediante el desarrollo de
mtodos basados en genotecas para seleccin de interacciones.
Aunque en principio cualquier genoteca de expresin de cDNA es
tndar podra seleccionarse con un seuelo protenico en lugar de
una sonda de DNA, en la prctica resulta laborioso porque la mis
ma genoteca debe seleccionarse muchas veces a fin de caracterizar
las interacciones de diferente seuelos. Dos tecnologas nuevas se
usan para seleccionar interacciones protenicas y se comentan a
continuacin.
La seleccin de interacciones mediante la exhibicin de

fago incluye la separacin y la bsqueda de interacciones
entre protenas seuelo inmovilizadas en los fosos de platos
de microttulo y protenas interactuantes que se expresan en
la superficie del bacterifago recombinante
La exhibicin de fagos es una forma de clonacin de la expresin
en la que fragmentos extraos de DNA se insertan en un gen de
protena de recubrimiento de bacterifago (vanse seccin 5.6.2 y
Burton, 1995). El gen recombinante puede expresarse despus co
mo una protena de fusin, que se incorpora en el virin y se mues
tra en la superficie del fago (fig. 19-17). El fago de fusin se
enlazar a cualquier protena que interacta con el componente ex
trao que aparece en su superficie. La seleccin de interaccin se
Las estructuras terciarias son mucho ms difciles de predecir que las secun
darias porque son millones de millones las diferentes formas en las que cual
quier cadena lineal determinada de aminocidos podria doblarse. Si se
incorporan suficientes molculas del solvente en el modelo para que sea rea
lista, el sistema se torna muy complejo para su estudio sin cierto conoci
miento de la conducta de protenas conocidas. Por esta razn los mtodos
de prediccin ab initio no tienen un uso prctico. Sin embargo, si se dispo
ne de la estructura de una proteina relacionada de manera cercana, puede
usarse como una plantilla para formar un modelo estructural de la secuen
cia que se busca. Esto se conoce como modelado comparativo o modelado
de homologa y suele actuar si las dos secuencias muestran > 25% de iden
tidad. Relaciones ms distantes pueden modelarse mediante asociacin, en
la que la secuencia de una protena hipottica se compara con las del Protein
Data Bank como intento para encontrar dobleces compatibles. A menudo es
posible encontrar dobleces comparando el ncleo protenico, que est muy
conservado, pero las asas externas son en extremo variables. Tal vez puedan
encontrarse asas similares en otras protenas mediante un llamado algorit
mo de ahorro de partes. Por consiguiente el modelo estructural se elabora
como una serie de piezas de secuencias compatibles con estructuras cono
cidas. El paso final tanto en el modelado de asociacin como en el compara
tivo es el refinamiento del modelo, que comprende mover cadenas laterales
a fin de evitar colisiones y minimizar la energa libre total de la estructura.
realiza creando una genoteca de exhibicin de fagos en la que cada

protena del proteoma se muestra en la superficie del fago. Luego
los fosos de placas de microttulo se cubren con las protenas seue
lo de inters y la genoteca de exhibicin de fago se coloca con pi
petas en cada foso. El fago con protenas que interactan en su
superficie permanecer unido a la superficie del foso, en tanto que
los que tienen protenas que no interactan se eliminan por lavado.
Una ventaja particular de la tcnica es que el fago conservado, que
muestra las protenas de interaccin, puede eludirse de los fosos y
emplearse para infectar E. coli, lo que resulta en la amplificacin
masiva de la secuencia de cDNA correspondiente, que luego pue
de obtenerse y usarse para identificar las protenas que interactan
buscando en bases de datos. Las desventajas de la exhibicin de fa
go incluyen el formato de valoracin in vitro y el hecho de que s
lo es posible mostrar secuencias pptidas cortas en la superficie del
fago sin alterar su ciclo de replicacin. Estas dos caractersticas de
la tcnica pueden impedir que ocurran interacciones especficas.
Adems de la seleccin de interaccin, la exhibicin de fago
tambin es til para varias otras aplicaciones que comprenden:
ingeniera de anticuerpos. La exhibicin de fago proporciona
una fuente alternativa potente de anticuerpos (entre ellos anti
cuerpos humanizados). Puede evitar la inmunizacin y aun la
tecnologa de hibridoma (Winter y cois., 1994; vase seccin
21.3.4);
ingeniera general de protenas. La exhibicin de fago es un
coadyuvante potente de programas de mutagnesis aleatorias
como un medio para seleccionar variantes deseadas de la genoteca de mutantes.
REB1
S T 0!
TF<
RNR2
HHF2
RAD53
RP03
RRP43 a m a
oumanRP
SHE4
DIS3 _ _ _ _
SAM1
RRP45
SRP1
SKI7
;NM05
GCN1
ECM16
CTR9
Fig. 19-16. Red de interacciones proteinicas en la levadura descubierta durante el anlisis sistemtico de complejos protenicos
por espectrometra de masa.
La grfica representa la compleja red de protenas de la levadura, establecida mediante enlace de complejos que comparten cuando menos una protena
(los complejos que comparten ms de nueve protenas se omitieron con fines de claridad). En el dibujo superior las funciones celulares de los complejos
individuales se codifican por colores como sigue: rojo, ciclo celular; verde oscuro, sealamiento; azul oscuro, transcripcin, conservacin del DI\IA y la
estructura cromatnica; rosa, protena y transporte de RNA; naranja, metabolismo de RNA; verde claro, sntesis y recambio de protenas; pardo, polaridad
y estructura celulares; violeta, metabolismo intermedio y de energa; azul claro, biognesis y trnsito en la membrana. El dibujo inferior es un ejemplo de
un enlace complejo (TAP-C212) con otros dos complejos (TAP-C77 y TAP-C110) mediante componentes compartidos (las lneas rojas indican interacciones
fsicas conocidas). Segn Gavin y colaboradores (2002) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of proten complexes.
Nature 41 5 ,1 4 1 -1 4 7 con autorizacin de Nature Publishing Group and Cellzome AG.
19.4
PROTEMICA
569
Fago tipo silvestre

Q u protenas nteractan
con la proteina X?
Insertar fragm entos gnicos que

codifican interactores candidatos
en el gen de cubierta protenica
Protenas presa exhibidas
en la superficie del fago
GENOTECA DE EXHIBICION
DE FAGO
Aplicar PROTEINA X a la superficie
de una m em brana o foso de microttulo
Mezclar
Recuperar fago enlazado, secuenciar y caracterizar inserto gnico extrao.

Fig. 19-17. El principio de la exhibicin de fago como se aplica a la seleccin de interaccin de alto rendimiento (para el principio general, vase
fig. 5-22).
Las protenas seuelo, para las que se buscan interactores, pueden inmovilizarse en la superficie de fosos de microttulos o membranas. Todas las otras
protenas del proteoma se expresan luego en la superficie de bacterifagos, mediante clonacin dentro de un gen de la protena de cubierta del fago, para
crear una genoteca de exhibicin de fagos. A continuacin los fosos o las membranas se inundan con la genoteca de fagos. Para cualquier protena
seuelo determinada (X), el fago que lleva las protenas que nteractan se retendr, en tanto que las que muestran protenas que no interactan se
eliminarn por lavado. El fago enlazado puede eludirse con un amortiguador muy salino y utilizarse para infectar E. coli, lo que produce una gran cantidad
de partculas de fago que contienen la secuencia de DNA de la protena de interaccin.
El sistema de levadura de dos hbridos tiene el rendimiento

ms alto de cualquier tecnologa de seleccin de interaccin
e incluye el ensamble de un factor de transcripcin funcional
de componentes separados
El mtodo de genoteca que ms se utiliza para seleccionar la interac
cin es el sistema de levadura de dos hbridos, tambin denomina
do sistema de atrapamiento de interaccin (Fields y Sternglanz,
1994). Adems de identificar protenas que se unen a una protena
en estudio, este mtodo tambin puede emplearse para delinear do
minios o residuos cruciales para la interaccin. Las protenas que in
teractan fsicamente se detectan por su capacidad para ensamblar
un factor de transcripcin activo y por consiguiente activar un gen
rastreador, un marcador seleccionable, o ambos. La clave del mto
do de dos hbridos es la observacin de que los factores de trans

cripcin comprenden dos dominios separados: un dominio de
unin de DNA y un dominio de transactivacin. En casi todos los
factores de transcripcin naturales, los dominios de unin y activa
cin de DNA son parte del mismo polipptido (vase seccin
10.2.4). Sin embargo, tambin puede ensamblarse un factor de
transcripcin activo a partir de dos protenas interactuantes que por
tan dominios separados. El objeto del sistema de dos hbridos y las
tcnicas derivadas es utilizar una protena blanco como seuelo para
reconocimiento especfico mediante una protena de interaccin que
se fusiona con un componente del factor de transcripcin necesario.
Para implementar el sistema de dos hbridos se emplean mto
dos estndar de DNA recombinante con objeto de producir un gen
de fusin que codifica la protena seuelo en estudio acoplada al
Recuadro 19-6. Clasificacin estructural de protenas

La anotacin funcional basada en estructuras de las protenas demanda
un sistema riguroso y estandarizado para clasificar diferentes estructu
ras. Se cuenta con varios esquemas de clasificacin jerrquica que divi
den las protenas primero en clases generales con base en la proporcin
de varias estructuras secundarias que contienen y despus en grupos ca
da vez ms especializados basados en la forma en que estas estructuras
estn dispuestas (Pearl y Orengo, 2002). Estos esquemas se implementan en bases de datos como SCOP (Structural Classi!catin ofProteins),
CATH (Class, Architecture, Topology, Homologous superfamily) y FSSP
(Fold classi!ication based on Structure-Structure alignment ofP roteins).
Estas bases de datos difieren en el modo en que las clasificaciones se ela
boran. Por ejemplo, el sistema FSSP se implemento a travs de compara
ciones estructurales automatizadas por completo utilizando el programa
DALI. CATH es semiautomtico y emplea comparaciones automticas que
se depuran en forma manual. SCOP es un esquema de clasificacin ma
nual y se basa tanto en relaciones evolutivas como en criterios geomtri
cos. No sorprende que la misma protena pueda clasificarse de manera
diferente cuando se usan esquemas alternativos (Hadley y Jones, 1999).
a lfa
lis t n
b e ta
o v e ja
a lfa -b e ta
ro llo
Aunque hay un acuerdo general amplio en los niveles superiores de la je

rarqua, surgen problemas cuando se buscan clasificaciones ms detalla
das porque ello depende de los umbrales que se utilizan para reconocer
grupos de dobleces en los diferentes esquemas de clasificacin.
Los problemas adicionales que originan confusin en la clasificacin es
tructural de protenas incluyen:
los llamados superdobleces, que se encuentran en muchas protenas
con estructuras terciarias diversas. Es necesario distinguir entre es
tructuras homologas (que se derivan de un ancestro evolutivo co
mn) y estructuras anlogas (que evolucionaron por separado pero
convergieron);
variaciones en la estructura de dobleces entre diversos miembros de
la mism a familia protefnica, que puede conducir a la falta de recono
cimiento de relaciones homologas;
el efecto de mueca rusa, que describe un continuo de estructuras
entre grupos de dobleces. La asignacin de una estructura a una ca
tegora particular se torna entonces muy subjetiva.
pocos SS
p r o p u ls o r 4
h e m o p e x in a
1hxn
1hxn
1hxn
Ejemplo de clasificacin estructural jerrquica en la base de datos CATH
dominio de enlace de DNA de un factor de transcripcin (fig. 1918). Las clulas transformadas con este gen se aparean a clulas
transformadas con una genoteca de genes de fusin en la que las se
cuencias de cDNA estn acopladas a la secuencia de codificacin
del dominio de transactivacin (constructos [formaciones] pre
sa). Las clulas blanco tambin se modifican por ingeniera para
que lleven un gen rastreador, un gen marcador seleccionable, o am
bos, que se activan por medio del factor de transcripcin de ensam
ble. Las interacciones se prueban en las clulas de levadura diploide
resultantes. Si el seuelo y la presa no interactan, los dos dominios
del factor de transcripcin permanecen separados y los genes mar
cadores se inactivan. No obstante, si el seuelo y la presa interac
tan, el factor de transcripcin se ensambla y los genes marcadores
se activan despus facilitando la identificacin visual, la propaga
cin selectiva, o ambas, de la clula de levadura que contiene pro

tenas de interaccin. A partir de estas clulas es posible identificar
la secuencia de cDNA del constructo seuelo.
La seleccin de levadura de dos hbridos se desarroll para ana
lizar protenas individuales (seuelos nicos), pero en los ltimos
aos esta tcnica se aplica en una escala cada vez mayor, culminan
do con estudios exhaustivos de todas las 40 000 000 de interaccio
nes protenicas posibles en la levadura (Uetz y cois., 2000; Ito y cois..
2000, 2001). Se emplean dos variantes de esta tcnica: una en la que
se producen grupos definidos de seuelo y presa, y se cruzan de ma
nera sistemtica (mtodo de matriz), y otra en la que la presa o tan
to el seuelo como la presa se representan por fragmentos de cDNA
aleatorios (mtodo aleatorio de genoteca) (fig. 19-19). El mtodc
de matriz es exhaustivo y sistemtico, pero menos confiable que e
19.4
PROTEMICA | 571
Recuadro 19-6. Clasificacin estructural de protenas (co n tin u aci n )
1 tadC
1 cg2a
1 rlr
Efecto de m ueca rusa

Cuatro protenas que muestran variacin estructural continua en el espacio doblado. Cada una de las protenas comparten cuando menos 74 residuos es
tructuralmente equivalentes con su vecino ms cercano, pero las dos protenas del extremo slo mostraron 54 residuos estructuralmente equivalentes
cuando se compararon en forma directa. Clave: 1cg2 A, carboxipeptidasa G2; 1tadC, transducina-K; 1tph1, somerasa de fosfato de triosa; 1rlr, protena
R1 de reductasa de oligonucletido. Basado en Domnguez y colaboradores, 2000, FEBS Letters 476,9 8-1 02, figura 2.
de genoteca porque cada protena del proteoma est representada

por una formacin aislada que debe producirse por separado me
diante PCR. El mtodo de genoteca implica menos trabajo y ofrece
ventajas porque cada presa est representada por mltiples clonas
superpuestas. Ello reduce la posibilidad de negativas falsas porque se
dispone de las mismas formaciones seuelo y tambin reduce el gra
do de positivas falsas porque los aciertos independientes con dife
rentes formaciones que representan la misma presa incrementan el
nivel de confianza que se atribuye a cualquier interaccin detectada.
Sin embargo, en general los resultados de selecciones a gran escala
deben interpretarse con cautela ya que se producen resultados posi
tivos y negativos falsos a causa de una diversidad de factores (vase

Legrain y cois., 2001 para una revisin). Si bien la mayor parte de los
estudios globales de dos hbridos se dirige a microbios, un progra
ma piloto reciente demostr que la tcnica tambin es aplicable a
proteomas de mamferos (Suzuki y cois., 2001).
Adems de los sistemas bsicos de dos hbridos, se cuenta con
mtodos derivados con aplicaciones ms especializadas. Abarcan los
siguientes:
El sistema de un hbrido, que se utiliza para detectar interac
ciones entre protenas y secuencias especficas de DNA o RNA.
PR IN C IPIO
XI
'
U n fa c t o r d e tra n s c rip c i n tie n e

d o s d o m in io s fu n c io n a le s
.... ^
Q u p ro te n a s in te ra c t a n
c o n la p ro te in a X ?
P R C T IC A ^
...u n d o m in io q u e s e e n la z a a D N A ... y un d o m in io
q u e a c tiv a tra n s c rip c i n
Estos dominios deben llevarse entre si para activar un gen
E n o tra s c e p a s d e le v a d u ra , e x p re s a r
T O D A S L A S O T R A S P R O T E N A S
c o m o h b rid o s c o n el d o m in io d e
a c tiv a c i n tra n s c rip c io n a l.
E s to p ro d u c e u n a g e n o te c a d e P R E S A S
En u n a c e p a d e levadura,
e x p re s a r la P R O T E N A X
c o m o un hbrido co n el
d o m in io d e e n la c e d e DNA.
ste es el S E U E L O
C ru z a m ie n to s is te m tic o
G e n o te c a d e c e p a s d e d o s h b rid o s q u e e x p re s a n el s e u e lo y u n a p r e s a p a rtic u la r
x T
P o lim e ra s a
de RNA
______ ^
v fw iA A ,
Si el se u elo y la p re s a no in te rac t an ,
el g en en es tu d io no se a c tiv a
L a p ro te in a A in te ra c t a
c o n la P R O T E N A X
S e c u e n c ia r y c a ra c te r iz a r el
g e n p a r a P R O T E N A A
Si el se u elo y la p re s a in te rac t an ,
el g en en es tu d io se a c tiv a
Fig. 19-18. Principio y prctica del sistema de levadura de dos hbridos.

Por lo general los factores de transcripcin comprenden dos dominios funcionalmente independientes, uno para enlace de DNA y otro para activacin
transcripcional. stos no tienen que estar unidos entre s de manera covalente, pero pueden ensamblarse para formar una protena dimrica. Este principio
se aprovecha para identificar interacciones protenicas. Las protenas seuelo se expresan en una cepa de levadura como una fusin con un dominio de
enlace de DNA y las presas candidato se expresan en otra cepa como fusiones con un dominio de transactivacin. Cuando las dos cepas se aparean,
slo se ensamblan factores funcionales de transcripcin si el seuelo y la presa interactan. Esto puede detectarse mediante la inclusin de un gen
rastreador activado por el factor de transcripcin hbrido. A pesar de la simplicidad del principio, la tcnica es propensa a problemas de seguridad y
reproducibilidad. Surgen positivas falsas a causa de autoactivacin espontnea (el seuelo o la presa pueden activar el gen rastreador por s mismas),
seuelos y presas adherentes (protenas que interactan de manera especfica con muchas otras) e interacciones irrelevantes (interacciones al azar
entre protenas que nunca se encontraran entre s bajo circunstancias normales, como las que suelen encontrarse en compartimientos separados).
Pueden surgir negativas falsas ocasionadas por errores de la PCR en el producto elaborado y por condiciones fisiolgicas (la valoracin se realiza en el
ncleo, de manera que es posible que las protenas y otros compartimientos no se doblen o ensamblen en form a apropiada).
Los sistemas de tres hbridos, que se emplean para estudiar in

teracciones protenicas ms complejas, aun interacciones que
comprenden tanto RNA como protenas (seuelo y gancho).
na. La interaccin puede vigilarse probando la degradacin de la

protena seuelo por ubiquitina o mediante la liberacin de una
protena funcional como un factor de transcripcin.
El sistema de dos hbridos inverso, que se usa para detectar la

alteracin de interacciones de protenas transformando la leva
dura con un gen suicida que es activado por el factor de trans
cripcin ensamblado de forma correcta.
El sistema de incorporacin SOS, en el que se incorporan a la

membrana las protenas que interactan y completan una va de
sealamiento esencial. La protena seuelo se fija a la membra
na plasmtica de una clula de levadura que carece de actividad
CDC25; los 25 mutantes de levadura cd c no son viables pero
pueden rescatarse mediante SOS ortlogo humano en tanto la
El sistema de corte de ubiquitina, en el que las interacciones

protenicas unen entre s las dos mitades de la protena ubiquiti
19.4
A)
P re sa P1 P2 P3 P4 P5
Seuelo
B1
B2
B3
B4
B5
P re sa
Seuelo
B1
B2
B3
B4
B5
B)
S e u e lo
G e n o te c a d e fra g m e n to s d e pres a
B1
B2
B3
P1 P 2 P 3 P 4 P5
a
B
PROTEMICA | 573
CO-'-'
< n !(3 2 >
<n>
P ro ten as
F ra g m e n to s
se le c c io n a d o s
(presa)
D o m in io d e
in te ra c c i n
Fig. 19-19. Mtodos de seleccin de matriz y de genoteca para elaborar mapas de interaccin de protenas a gran escala.
A) M todo de m atriz. El mism o conjunto de protenas (1 a 5) se utiliza como seuelo (B1 a B5) y como presa (P1 a P5). Los resultados pueden
dibujarse en una matriz. Los autoactivadores (p. ej., B4) y las protenas presa adherentes (p. e j P2 interacta con muchos seuelos) se identifican y
descartan. El resultado final se resume como una lista de interacciones que pueden ser heterodmeros (p. ej., B2 a P3) u homodmeros (como B5 a
P5). B) M todo de seleccin de genoteca. Identifica el dominio de interaccin para cada protena presa que interacta con un seuelo determinado.
Las protenas presa adherentes se identifican como fragmentos de protenas que suelen seleccionarse a pesar de la protena seuelo. Reproducido de
Legran y colaboradores (2001) con autorizacin de Elsevier Science.
protena est localizada en la membrana. Pueden valorarse me

diante la expresin de una genoteca de presas como hbridos
SOS. Este sistema es til para estudiar las interacciones de fac
tores de transcripcin, que autoactivaran el gen rastreador en
un sistema convencional de dos hbridos.
Los sistemas de dos hbridos de mamferos, que pueden valorar
interacciones entre protenas con modificaciones postraduccionales autnticas.
19.4.7 El desafi de la protemica de interaccin es

ensamblar un mapa de interaccin funcional
de la clula
Los datos de interaccin de protenas proporcionan informacin
funcional til y, en la escala de la extensin del proteoma, quiz
permitan que todas las protenas en las clulas se liguen dentro de
vas y redes funcionales. La asimilacin y la presentacin de estos
datos es importante y con este propsito en mente se establecieron
varias bases de datos (cuadro 19-2). Estos datos se derivan sobre
todo de EM a gran escala y de selecciones de dos hbridos, pero es
posible que exista una cantidad muy considerable de datos relacio
nados respecto a interacciones de protenas individuales ocultos
en la bibliografa cientfica si se retroceden muchos aos (vanse
las lneas azules en la fig. 19-16). La extraccin de esta informa
cin y su integracin con la obtenida de experimentos recientes
de alto rendimiento sern un desafo. Como hecho relevante, se
desarrollaron varias herramientas bioinformticas para rastrear en
! bibliografa e identificar palabras clave que indiquen interac
ciones protenicas de manera que los analizadores humanos pue

dan escrutar bases de datos de interaccin (Xenarios y Eisenberg,
2001).
Un segundo problema consiste en que no es simple representar

redes de interaccin de protenas, por lo que un desafo importan
te es la presentacin clara de los datos (fig. 19-16). Sin embargo,
como cabra esperar, protenas con una funcin general similar (p.
ej., transporte de membrana, reparacin de DNA, metabolismo de
aminocidos) tienden a interactuar ms entre s y no con prote
nas no relacionadas en trminos funcionales. En consecuencia es
posible simplificar mapas complejos, como se muestra en la figu
ra 19-20, si las protenas relacionadas funcionalmente se agrupan
en focos que representan procesos celulares bsicos. Cabe sealar
que estos procesos en s mismos estn enlazados en varias formas,
por ejemplo, las protenas que controlan la estructura de la cromatina tienen ms interacciones con las que participan en la repara
cin y la recombinacin de DNA que las que se relacionan con el
metabolismo de aminocidos y la degradacin de protenas. Este
tipo de presentacin permite mostrar interacciones protenicas
de manera jerrquica y tambin proporciona un punto de refe
rencia que abre la posibilidad de determinar interacciones nue
vas. Tres cuartas partes de todas las interacciones protenicas
ocurren dentro del mismo grupo de protenas funcionales, en
tanto que la mayor parte de las otras tiene lugar con grupos fun
cionales relacionados. Una interaccin inesperada entre prote
nas que participan en procesos no relacionados debe considerarse
con sospecha y estudiarse mediante valoraciones genticas, bio
qumicas y fsicas.
574 | CAPTULO DIECINUEVE MS ALL DEL PROYECTO DEL GENOMA
Cuadro 19-2. Seleccin de bases de datos que incluyen informacin sobre interacciones de protenas
Base de datos y comentarios
URL
Biomolecular Interaction Network Database (BIND)

Lista de interacciones individuales proteina-proteina, vas y complejos.
Tambin una lista de interacciones de protenas con otras molculas.
http://www.bind.ca
Database o Interacting Proteins (DIP)

Lista de varios miles de interacciones proteina-proteina.
http://dip.doe-mbi.ucla.edu
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). Un recurso extenso sobre vas de sealamiento y
metablicas que tambin incluye una seccin dedicada a la estructura de protenas complejas.
http://www.genome.ad.jp/kegg/
M e ta b o lis m o d e a m in o c id o s
F u s i n d e
m e m b ra n a \
D e g r a d a c i n .
d e p ro te n a
M e io s is
M it o s is -
S n te s is d e D N A
R e c o m b in a c i n
E s tru c tu ra
c e lu la r
D o b le z d e la p ro te n a
T ra n s lo c a c i n d e p ro te in a
E s tr s c e lu la r
M e ta b o lis m o d e
c id o s g ra s o s
y e s te r le s lip id o s
M e ta b o lis m o d e
c a rb o h id r a to s
T ra n s c rip c i n P o l I
T ra n s c rip c i n P o l III
Fig. 19-20. Mapa de interaccin de grupo funcional simplificado del proteoma de la levadura.
Los datos se derivan de un mapa complejo de interacciones Individuales, obtenido principalmente de selecciones de dos hbridos. Cada lnea Indica que
hay 15 o ms interacciones entre las protenas de los grupos conectados. Las conexiones con menos de 15 interacciones no se muestran porque
ocurre un nmero pequeo de interacciones entre casi todos los grupos y a menudo tienden a ser falsas, es decir, basadas en resultado positivos falsos.
Slo se Incluyeron protenas de levadura con anotacin completa y se sabe que muchas protenas pertenecen a varias clases funcionales. Reproducido
de Tucker y colaboradores (2001) con autorizacin de Elsever Science.
19.4.8 La informacin de interacciones protenicas con

ligandos pequeos puede mejorar el conocimiento
de los procesos biomoleculares y proveer una
base racional para el diseo de frmacos
Adems de las interacciones proteina-proteina (vase antes) y las de
protena-cido nucleico, las protenas interactan con un gran n
mero de molculas pequeas que funcionan como ligandos, sustra
tos, cargas (en protenas de transporte), cofactores y moduladores
alostricos. En todos los casos estas interacciones ocurren porque la
superfcie de la protena y la molcula de interaccin son comple
mentarias en cuanto a forma y propiedades qumicas, lo que signifi
ca que el enlace conduce a una reduccin de la energa libre. La base
del diseo de frmacos es la identificacin de molculas que interac
tan de modo especfico con protenas blanco y cambian sus activi
dades en las clulas. Casi todos los frmacos actan a nivel de prote
nas y al hacerlo interactan con la protena, y alteran su actividad de
una manera fisiolgicamente benfica. Los efectos secundarios rela
cionados con los frmacos suelen reflejar interacciones inespecficas
con otras protenas que producen acciones perjudiciales. Cuanto ms
se aprende respecto a la estructura y las interacciones de las protenas
con molculas pequeas, ms informacin puede utilizarse para di
sear frmacos con mayor eficacia y especificidad.
Es posible investigar interacciones de protena y ligando me
diante la seleccin de alto rendimiento de un gran nmero de
compuestos qumicos, pero la cantidad de trabajo puede reducir
se si se intenta primero modelar estas interacciones para definir
compuestos guia adecuados. Si la estructura de la protena blanco
se conoce (vase antes), puede recurrirse a programas de computadora
denominados algoritmos de atraco a fin de seleccionar bases de
[ BIBLIOGRAFA
datos de estructuras qumicas e identificar posibles ligandos de in

teraccin con base en su complementariedad. Estos algoritmos in
tentan fijar molculas pequeas dentro de sitios de enlace a partir
de informacin de restricciones estricas y energas de enlace. Los
ejemplos incluyen AUTODOCK, LIGIN y GRAMM. Las bases
de datos clnicos pueden seleccionarse no slo con un sitio de en
lace (bsqueda de interacciones moleculares complementarias) sino
tambin con otro ligando (bsqueda de interacciones moleculares
idnticas). Este proceso de diseo racional de frmacos condujo
a la produccin de varios medicamentos bien conocidos, como relenza y captopril.
19.5
Resumen
Los proyectos de genoma producen grandes cantidades de datos

de secuencias que deben explorarse por medio de computadoras
575
para identificar genes y elementos reguladores. Una vez que se

dispone de los genes, es necesario determinar sus funciones y c
mo interactan los diversos productos gnicos entre s. En este
captulo se coment la forma en que el anlisis de secuencias y es
tructural puede utilizarse para obtener alguna informacin res
pecto a la funcin de las protenas y cmo el desarrollo de
tecnologas de alto rendimiento para el anlisis del transcriptoma
y proteoma ayuda a relacionar estas funciones entre s. Un com
ponente de la genmica funcional que an no se aborda es el uso
de mutantes para estudiar funciones gnicas. Puesto que ello in
cluye la modificacin gentica de clulas y animales, el tema se
pospuso hasta el siguiente captulo, que considera el modo en que
la manipulacin de genes puede emplearse para estudiar la fun
cin y la regulacin gnica, y construir modelos de enfermedades
humanas.
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CAPTULO
VEINTE
M anipulacin gen tica d e clulas

y anim ales
578 CAPTULO VEINTE
20.1
MANIPULACIN GENTICA DE CLULAS Y ANIMALES
G eneralidades de la tecnologa
de tran sferen cia gnica
Las clulas cultivadas y los animales experimentales se aprovechan

con amplitud como sistemas modelo para estudiar los aspectos
bioqumicos, fisiolgicos y del desarrollo en la salud y la enferme
dad en humanos. En pocas recientes estos estudios se beneficia
ron de manera importante de la tecnologa de transferencia
gnica, que permite introducir secuencias especficas de DNA en
el genoma de clulas animales (transgnesis). Antes de contar
con las tcnicas de transferencia gnica, la nica forma en que la
gentica de las clulas y los animales poda alterarse era mediante
mutagnesis, un proceso que comprende el uso de radiacin o sus
tancias qumicas potentes para generar modificaciones aleatorias
en el genoma.
Una de las ventajas que la tecnologa de transferencia gnica
ofrece consiste en que permite aadir secuencias de DNA nuevas
preparadas in vitro al genoma. Estas secuencias adicionales pueden
ser genes que otorgan nuevas funciones {ganancia d e funcin) o ele
mentos que inhiben la expresin de genes endgenos (prdida de
funcin). En otro nivel, la tecnologa de transferencia gnica permi
te modificar el genoma en una form a precisa y predeterm inada, de
manera que pueden disearse mutaciones e introducirse en genes
particulares in vivo (envo dirigido de genes). Aunada a mtodos
complicados para regular la expresin de genes, la tecnologa de
transferencia gnica incrementa mucho la capacidad para estudiar
y controlar el modo en que los genes funcionan y para elaborar mo
delos de enfermedades en ratones.
La transferencia gnica a clulas de mamferos cultivadas se do
cument por primera vez al inicio del decenio de 1960, cuando se
observ que las clulas humanas captaban e incorporaban DNA
genmico fragmentado de su medio de cultivo (Szybalska y Szybalski, 1962). Aunque se requiri algn tiempo para descubrir los
factores que rigen la transferencia de DNA, la introduccin de
DNA en muchos tipos de clulas ya era un procedimiento rutina
rio hacia principios del decenio de 1970. Casi al mismo tiempo se
produjeron los primeros animales transgnicos. stos contienen
la misma secuencia de DNA adicional en cada clula y se generan
extendiendo los principios de la transferencia gnica a clulas que
contribuyen a la lnea germinal de los animales. Los primeros ani
males transgnicos fueron ratones que contenan parte de la se
cuencia de DNA SV40 (virus simiano 40), producidos mediante
la simple inyeccin de DNA en las cavidades del blastocele de em
briones antes de la implantacin (Jaenisch y Mintz, 1974). Desde
entonces se desarrollaron procedimientos seguros para la modifi
cacin gentica de ratones y muchas otras especies, inclusive orga
nismos modelo invertebrados (moscas de la fruta y nematodos) as
como peces, ranas, aves, ratas y varios mamferos domsticos y ga
nado. En fecha ms reciente tuvo un impacto mayor otro mtodo
experimental que comprende la manipulacin gentica de anima
les. En 1997 se anunci una nueva era en gentica cuando se pu
blic el primer xito en la clonacin de mamferos (Wilmut y
cois., 1997). Esto incluy la transferencia del ncleo de una clula
adulta al interior de un oocito enucleado (transferencia nuclear
de clulas somticas) y luego la tecnologa se aplic como una va
alternativa para la produccin de animales modificados gentica
mente.
En la primera parte de este captulo se describen los principios
y mtodos de la transferencia gnica, y las estrategias para la mani
pulacin gentica de animales. En el resto del captulo y en el 21 se
comenta la forma en que se aplican estos mtodos, dirigidos a las

siguientes reas de investigacin biomdica.
Estudio de la expresin y la funcin gnicas (el presente ca
ptulo). Las clulas de animales cultivadas se emplean con am
plitud para investigar la funcin gnica y la regulacin de la
expresin de genes. La razn para ello es simple: las clulas ani
males proporcionan el fondo gentico correcto y un contexto
bioqumico para el estudio de genes de animales. Este contex
to no puede duplicarse con precisin mediante sistemas expe
rimentales in vitro. La capacidad para aadir genes o eliminar
o alterar en forma selectiva genes especficos en animales pro
porciona una base potente para el anlisis funcional en el con
texto del organismo completo.
Aplicaciones en genmica funcional (este captulo). Es posi
ble estudiar las funciones gnicas a una escala global mediante
la creacin de genotecas mutantes insercionales de la extensin
del genoma, genotecas de atrapamiento de genes y el desarro
llo de tcnicas de knockdown de genes de alto rendimiento ba
sadas en la interferencia de RNA (seccin 20.2.6). Estas
tcnicas se aplican a una gama de animales modelo desde el nematodo Caenorhabditis elegans\v3&xiL el ratn, y tambin a clu
las humanas en cultivo; complementan las diversas estrategias
genmicas funcionales y se estudian en el captulo 19.
Creacin de modelos de enfermedad (este captulo). La na
turaleza proporcion algunos modelos animales de enfermeda
des y otros se generaron mediante mutagnesis aleatoria, pero
no d e una manera predeterminada. La tecnologa de transferen
cia gnica permite crear genotipos mutantes especficos en ani
males y en consecuencia incrementa la posibilidad de semejar
enfermedades humanas a niveles gentico y fenotpico. En una
extensin ms limitada, tambin posibilita modelar la patog
nesis en clulas cultivadas.
Produccin de protenas recombinantes (cap. 21). Las c
lulas cultivadas y los animales transgnicos se utilizan como
biorreactores para producir protenas recombinantes. Los
sistemas de mamferos muestran ventajas particulares para
producir protenas humanas teraputicas porque las prote
nas recombinantes experimentan modificacin postraduccional autntica.
Desarrollo del potencial para teraputica gnica (cap. 21).
Es posible que la transferencia de genes a clulas humanas per
mita corregir o mejorar defectos genticos.
20.2
Principios de la tran sferen cia

gnica
20.2.1 La transferencia gnica puede utilizarse para

nuevas secuencias de DNA funcionales en
clulas animales cultivadas, en forma
pasajera o estable
La transferencia gnica se emplea para aadir genes nuevos y fun
cionales a clulas animales, lo que a menudo significa que las clu
las adquieren la capacidad de expresar una o ms protenas nuevas.
Ello se describe como ganancia de funcin. La secuencia adicional
de DNA se conoce como transgen, aunque puede contener uno,
dos o incluso ms genes reales. En ocasiones se denomina DNA
20.2 j PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GENICA | 579
extrao pero es errneo porque resulta perfectamente aceptable in

troducir copias extra de un gen endgeno y en realidad este mto
do puede ser muy til para estudiar la funcin gnica. Es posible
aplicar de manera general, y se prefiere, el trmino alternativo
DNA exgeno. Los transgenes pueden introducirse en clulas
cultivadas por medio de una diversidad de mtodos de transporte
virales y no virales, que se resumen en el recuadro 20-1.
El destino del transgen es importante. En algunos casos se con
serva de manera pasajera en las clulas husped, en tanto que en
otros se constituye en una parte permanente del genoma. El desti
no del transgn depende de las propiedades del virus cuando la
transferencia gnica mediada por virus se usa. Algunos slo son
adecuados para expresin pasajera, mientras que otros son capaces
de causar infecciones latentes y la expresin del transgen a largo
trmino puede ser posible. Los retrovirus son inusuales porque
una copia de DNA del genoma viral se integra en el genoma del
husped poco despus de una infeccin. Por consiguiente es posi
ble recurrir a retrovirus recombinantes para crear lneas celulares
transformadas de modo estable.
La introduccin de DNA mediante transfeccin en clulas de
animales cultivadas casi siempre se realiza en forma de plsmidos
bacterianos que no pueden replicarse en animales. Aunque es po
sible que una gran proporcin de las clulas capte el DNA al
principio, poco despus se descompone y cualquier expresin
transgnica es pasajera. La longevidad del plsmido depende de la
calidad del DNA y la lnea de clulas husped. El DNA de plsmi
dos de buena calidad persiste uno a dos das en un gran porcenta
je de clulas, pero en algunos casos tal vez dure mucho ms (p. ej.,
el DNA plsmido puede permanecer hasta 80 h en la lnea
HEK293). En una proporcin muy pequea de clulas transfectadas, parte del DNA plsmido se integra en el genoma y produce
una transformacin estable. ste es un acontecimiento tan raro
que deben emplearse estrategias de seleccin potentes a fin de
identificar las transformaciones estables. La estrategia general con
siste en incluir un gen marcador seleccionable en el plsmido o
cotransfectar las clulas con dos plsmidos, uno que contiene el
transgn primario y otro que comprende un marcador seleccionable. El gen con el marcador estable confiere a las clulas una pro
piedad que les permite sobrevivir en presencia de un agente
selectivo, como un antibitico, que destruye clulas no transforma
o s (recuadro 20-2). En esta forma pueden obtenerse lneas celuu es transformadas de modo estable.
De manera alternativa pueden transfectarse clulas con un vec
tor plsmido que contiene un origen de replicacin viral, en cuyo
ciso el transgen se conserva y replica epismicamente. En algunos
it-iores, el origen facilita la replicacin rpida, incontrolable, del
rem id o , lo que conduce a valores pasajeros altos del transgn, pe*: i continuacin destruye las clulas. Se observa as en clulas
I OS transfectadas con plsmidos que portan un origen de replicano n SV40. En contraste, los vectores que contienen el origen de rer-lici n latente del virus Epstein-Barr (EBV) se conservan en un
z __nero moderado de copias y, si se incluyen marcadores selecciotiz.es apropiados, pueden usarse para obtener lneas de clulas
-.'Tormadas en forma estable.
En resumen, pueden utilizarse mtodos de aporte gnico tanto
cates como no virales para introducir nuevos genes en clulas animius de manera pasajera o estable. La transformacin estable pueie -C-crarse mediante integracin retroviral, conservacin epismica
i .30 trmino de un vector de replicacin o integracin de DNA
a: epicante en uno de los cromosomas de la clula husped.
20.2.2 La produccin de animales transgnicos requiere

la transferencia gnica estable a la lnea germinal
Aunque los mtodos antes comentados resultan adecuados para la
transformacin de clulas en un plato de cultivo, es ms difcil exten
der esta tecnologa a animales completos. Es imposible introducir de
manera uniforme DNA en todas las clulas de un animal adulto. Por
consiguiente, para producir un animal por completo transgnico
(uno que contiene el mismo transgn en el mismo contexto en cada
clula), ste debe desarrollarse a partir de un cigoto transgnico. Esto
se logra mediante la transferencia gnica estable a la lnea germ inal y
puede efectuarse en una de dos formas (fig. 20-1):
Directa, mediante la introduccin selectiva de DNA en clulas
germinales, los gametos derivados de las mismas o en el huevo
justo despus de la fecundacin. Si el DNA se integra antes de
la primera divisin del cigoto, cada clula resultante del animal
contendr el mismo transgen.
Indirecta, por medio de introduccin no selectiva de DNA en
el embrin antes que la lnea germinal se forme. En esta etapa
las clulas embrionarias son totipotentes, o cuando menos pluripotentes, lo que significa que pueden formar cualquiera de
los tipos de clulas del embrin en desarrollo. Como el DNA
se integra despus de la primera divisin del cigoto, slo algu
nas de las clulas del embrin incorporarn el transgen. Sin
embargo, si esas clulas contribuyen a la lnea germinal del em
brin se producirn gametos transgnicos y la generacin sub
secuente de animales ser transgnica.
El cuadro 20-1 resume los mtodos de transferencia gnica en ani
males y en seguida se comentan en detalle.
La transferencia gnica directa a clulas precursoras de la

lnea germinal es el procedimiento estndar para producir
moscas de la fruta transgnicas
La introduccin de DNA en clulas germinales puede ser un medio
muy til para acceder a esta lnea celular porque conduce a la produc
cin de gametos transgnicos. Este mtodo no se emplea en mamfe
ros ya que, aunque las clulas germinales primordiales de mamferos son
hasta cierto punto aciles de aislar, cultivar y transfectar, resulta difcil
inducir las clulas modificadas para que contribuyan a la lnea germi
nal cuando se reintroducen en un animal husped. Sin embargo, la
modificacin directa de clulas germinales es el mtodo rutinario pa
ra producir moscas de la fruta transgnicas. En Drosophila melanogaster la integracin cromosmica eficiente se logra con secuencias de un
elemento transposable que se conoce como elemento P. El transgen se
inserta entre las dos secuencias terminales del elemento P y luego
se inyecta en el polo plasmtico de un embrin joven, que es el sitio
donde se encuentran los ncleos del polo celular (clulas precursoras
de la lnea germinal). La enzima transposasa que se requiere para la
transposicin del elemento P se suministra mediante la inyeccin con
currente de un plsmido y esto facilita la integracin aleatoria del
transgen en el genoma de uno o ms de los ncleos del polo celular.
Slo una copia del transgen suele incorporarse.
El DNA puede mezclarse con espermatozoos o ncleos de

estos ltimos e introducirse en huevos no fecundados
La modificacin directa de gametos es otra forma de generar ani
males transgnicos. Se disearon dos mtodos muy distintos: apor-
580 i CAPTULO VEINTE I MANIPULACIN GENTICA DE CLULAS Y ANIMALES
Recuadro 20-1. Mtodos de transferencia gnica a clulas animales en cultivo

Cuatro clases generales de metodologa de transferencia genica pueden
aplicarse a clulas animales cultivadas, pero las que ms se utilizan son la
transduccin y la transfeccin. Pueden emplearse variaciones de estos m
todos a fin de introducir DNA en clulas humanas in vivo (seccin 21.5).
TRANSDUCCIN. Es una transferencia gnica mediada p o r virus, es
decir, el DNA extrao se empaca dentro de una partcula viral. Los vi
rus animales evolucionaron en varias formas para introducir su DNA
o RNA en clulas y por esta razn muchos virus se aprovechan co
mo vectores de transferencia gnica. Incluyen:
a) virus que facilitan la expresin transgnica pasajera de alto nivel,
por ejemplo, adenovirus, virus Sindbis, virus del Bosque Semliki,
virus de vaccinia, baculovirus (en clulas de insectos, que apo
yan la replicacin de baculovirus);
b) virus que se conservan en un estado epismico latente y facilitan
la expresin transgnica estable a largo plazo, com o virus Epstein-Barr, virus del herpes simple, baculovirus (clulas de mam
feros, que no apoyan la replicacin de baculovirus);
c) virus que se integran en el genoma y pueden usarse para trans
form acin estable permanente, por ejemplo, retrovrus, virus adenorrelacionados.
TRANSFECCIN. Comprende el uso de artimaas qumicas o fsi
cas a fin de inducir a las clulas para que capten DNA del medio de
cultivo y por ltimo el DNA encuentra su camino al ncleo. Cabe se
alar que, en sistemas bacterianos, transfeccin se refiere a la cap
tacin de DNA viral (fago) desnudo en tanto que transform acin
denota la captacin de DNA plsmido genmco desnudo. En clu
las animales transfeccin denota la captacin de cualquier DNA
desnudo en tanto que transform acin suele referirse a un cambio
estable y permanente del genotipo si se utiliza en el contexto de
transferencia gnica. Existen numerosos mtodos de transfeccin
diferentes que incluyen:
a) transfeccin qumica. Cuando se mezcla DNA con cloruro de cal
cio en presencia de un amortiguador de fosfato se forma un pre
cipitado de fosfato de calcio y DNA fino. ste se asienta en la
membrana plasmtica de clulas cultivadas y es captado por endocitosis. El DNA tambin puede form ar complejos solubles con
otras sustancias qumicas, entre ellas DEAE-dextrn (dietilaminoetil-dextrn) o el detergente polibreno. Las clulas que no se re
cubren con fosfato del calcio pueden responder mejor a estas
alternativas;
b) transfeccin mediada por liposomas (fig. 21-8). El DNA puede
encapsularse en vesculas lpidas artificiales conocidas como lipo
somas que se fusionan con la membrana plasmtica y depositan
su carga en el citosol. Es posible incrementar la eficiencia de la
transfeccin si el liposoma se deriva de envolturas virales, que a
menudo contienen protenas que fortalecen la fusin con la mem
brana. stas vesculas se denominan virosomas. De otra manera
pueden emplearse membranas celulares reales como vehculo de
transporte. sta es la base de la fusin del protoplasto, en la que
protoplastos bacterianos cargados con DNA se centrifugan en c
lulas de mamferos cultivadas y la fusin con las mismas se indu
ce utilizando poletilenglicol (PEG). Una tcnica similar recurre a
eritrocitos fantasma (eritrocitos sin hemoglobina);
te de DNA mediado por espermatozoo e integracin mediada por

enzima de restriccin.
El aporte de DNA mediado por espermatozoo aprovecha el
hecho de que la cabeza de los espermatozoos se enlaza de modo es-
c) lipofeccin. A diferencia de la transfeccin mediada por liposo

mas, en la que el DNA se encapsula en una vescula lpida, la //'pofeccin comprende la formacin de un complejo DNA-lpido
(lipoplex) que es captado con eficiencia por endocitosis. Por
consiguiente la lipofeccin tiene ms en comn con la transfec
cin qumica que la transfeccin mediada por liposoma. En fecha
ms reciente se popularizaron vehculos de transporte gnico ba
sados en polmero catinico Ipoiiplexos). Son tan eficientes co
mo lo lipoplexos pero tienen la ventaja de que pueden utilizarse
con polmeros especficos para modificar las propiedades fsicas
del vehculo de transporte. Est demostrado que en algunos ca
sos es factible form ar complejos con propiedades diferentes a
distintas temperaturas, lo que permite la liberacin controlada de
DNA (Yokayama, 2002). Esto podra tener gran utilidad para la
transferencia gnica in vivo a sitios particulares en el cuerpo
(cap. 2 1);
d) electroporacin. En este mtodo se someten clulas a un pulso
elctrico breve que ocasiona la aparicin de poros pasajeros, de
tamao de nanmeros, en la membrana plasmtica. S el DNA es
t presente en la solucin amortiguadora a una concentracin su
ficiente, se captara a travs de estos poros;
e) endocitosis mediada por receptor (lig. 21-9). En este mtodo se
fija DNA al ligando de un receptor de superficie celular que se recicla mediante endocitosis. El DNA se libera durante el procesa
miento del receptor. En circunstancias normales el endosoma que
contiene el complejo receptor-ligando-DNA se fusiona con un lisosoma y el DNA se degrada, pero esto puede evitarse medante
la inclusin de pptidos adenovirales en el complejo de transfec
cin ya que stos alteran endosomas. Este mtodo puede usarse
para dirigirse a tipos de clulas especficos con base en su espe
cificidad de receptor.
TRANSFERENCIA DIRECTA. Comprende la introduccin fsica direc
ta de DNA en las clulas. El ejemplo obvio es la microinyeccin, que
en ocasiones se usa en clulas cultivadas que son resistentes a otros
mtodos de transferencia gnica pero suele aplicarse a huevos, cigo
tos o embriones tempranos de animales. Otro mtodo de transferen
cia directa es el bombardeo de partculas, que incluye la aceleracin
de microproyectles recubiertos con DNA a alta velocidad hacia el in
terior de las clulas. Aunque puede emplearse en clulas cultivadas,
es un procedimiento de eleccin para la transfeccin de clulas en
cortes de tejidos y tambin puede aplicarse a la transferencia gnica
in vivo (seccin 21.5.4).
TRANSFERENCIA GNICA BACTERIANA. Por lo general comprende
el uso de bacterias nvasoras, vivas, que se lisan dentro de la clula
animal y liberan su cargamento de DNA (Higgins y Portnoy, 1998).
En el caso de las especies de Salmonella ocurre lisis en una vescu
la fagoctica, en tanto que en otras especies (p. e j Listeria m onocytogenes y Shigeila flexneri) la lisis ocurre despus que la bacteria
escapa de la vescula. Asim ism o las bacterias pueden unirse a la su
perficie celular y transferir DNA a travs de un pilo. En Agrobacterium tumefaciens se utiliza este mtodo para transferir DNA a plantas
y tambin puede infectar clulas de animales cultivadas (Kunik y
cois., 2001).
pontneo a DNA in vitro. Por tanto se utilizan espermatozoos co

mo vehculos para transporte aunque e l gen om a d e l gam eto en s:
m ismo no se m odifica. La IICE (inyeccin intracitoplsmica de
espermatozoos) es un tratamiento para la infecundidad que con-
20.2 PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GNICA I 581
Recuadro 20-2. M arcadores seleccionabies para clulas animales

CATEGORAS DE GEN MARCADOR SELECCIONABLE
GENES MARCADORES AMPLIFICABLES
Un gen marcador seleccionable confiere una propiedad que permite que

las clulas transformadas establemente sobrevivan y crezcan en presen
cia de un agente particular que destruye o restringe el crecimiento de las
clulas no transformadas. Esto se conoce como seleccin positiva por
que se seleccionan clulas con base en que portan el gen marcador (son
positivas para el gen marcador). La seleccin positiva es esencial para
aislar las muy pocas clulas en un plato de cultivo que se transformaron
de manera estable durante la transfeccin con DNA no replicante. Las cla
ses principales de gen marcador seleccionable son dos: marcadores seleccionables endgenos y marcadores seleccionabies dominantes,
Si el agente selectivo que se elige es un inhibidor competitivo del produc

to del gen marcador, entonces puede recurrirse a la seleccin gradual
para amplificar el gen marcador y lograr una expresin transgnica de al
to nivel. Este sistema funciona porque el locus transgnico en clulas
transform adas establemente suele contener mltiples copias tndem
del marcador seleccionable y del transgen primario. Si la concentracin del
agente selectivo se incrementa, se seleccionan las clulas con los nme
ros de copias ms altos porque expresan el marcador a los valores ms
altos. Estas clulas pueden experimentar acontecimientos de recombina
cin que incrementan de modo adicional el nmero de copias y median
te el aumento progresivo de la presin de seleccin se seleccionan
clulas con arreglos transgnicos amplificados masivamente. La amplifi
cacin es un proceso aleatorio y el transgen primario se coamplifica jun
to con el gen marcador. Un ejemplo de este marcador es el gen del ratn
dhrf, que codifica la enzima reductasa de dlhidrofolato. sta puede am
plificarse mediante seleccin gradual con el inhibidor competitivo metotrexato.
Los marcadores seleccionabies endgenos son genes que se en

cuentran en el genoma de las clulas husped. Por consiguiente la
seleccin slo puede aplicarse a clulas que carecen de una copia
funcional de ese gen. Un ejemplo es el gen TK que la enzima cinasa
de tim id ina codifica. Esta enzima convierte la timidina libre en monofosfato de tim idina como parte de la va de salvamento de nuclesidos. En circunstancias normales la va de salvamento no es
esencial porque tambin pueden sintetizarse nucletidos de timidina
nuevos a partir del monofosfato de uridina. Sin embargo, la clula se
torna dependiente de la actividad de TK si la va nueva se bloquea con
el inhibidor am inopterina. Por tanto si las clulas T K ' (que carecen
de un gen TK funcional) se desarrollan en un medio HAT (que contie
ne aminopterina y timidina), slo las clulas transformadas en forma
estable con un gen marcador TK son capaces de sobrevivir.
Los marcadores seleccionabies dominantes no se encuentran en el
genoma de la clulas husped y confieren una propiedad por comple
to nueva, como la resistencia a antibiticos. La ventaja de estos mar
cadores consiste en que pueden emplearse en cualquier tipo de clula,
es decir, no se requieren mutantes. Por ejemplo, el neogn de coli
codifica la enzima fosfotransferasa de neomicina. sta inactiva anti
biticos aminoglucsidos como G418 y permite que las clulas trans
formadas establemente se seleccionen mediante la sola adicin de
GENES MARCADORES CONTRASELECCIONABLES

Un marcador contraseleccionable confiere una propiedad que destruye
clulas transformadas de manera estable, en tanto permite que las no
transformadas sobrevivan. Esto se conoce com o seleccin negativa
porque las clulas se seleccionan con base en que carecen del gen mar
cador (son negativas para el gen marcador). Estos marcadores son tiles
para ablacin celular si se expresan bajo el control de promotores restrin
gidos. Tambin se emplean para identificar tipos particulares de modifi
cacin gentica, por ejemplo, para diferenciar entre los acontecimientos
de envo dirigido de genes y los de integracin aleatoria en clulas ME
(seccin 20.2.4). Algunos marcadores contraseleccionables destruyen
clulas en forma directa (p. ej., ricino, toxina diftrica), en tanto que otros
requieren la presencia de un agente selectivo (p. ej., puede usarse TK pa
ra seleccin negativa en presencia de anlogos txicos de timidina como
ganciclovir).
G418 al medio de cultivo.
siste en inyectar cabezas de espermatozoos en el citoplasma del vu

lo. La IICE se emplea para introducir cabezas de espermatozoos re
cubiertas con DNA plsmido en huevos de mamferos. En el
primero de estos experimentos se fijaron espermatozoos de ratn en
plsmidos que contenan el gen para la protena verde fluorescente
(PVT) y se inyectaron en oocitos aislados. Casi todos los huevos in
yectados mostraron actividad de PVF, pero slo 20% produjo rato
nes transgnicos, lo que sugiri que el transgn no se integr en el
genoma celular en la mayor parte de los casos (Perry y cois., 1999).
La misma tcnica se aplic en monos rhesus; no obstante, aunque
varios embriones mostraron actividad de PVF pasajera, no se en
contr que alguno fuera transgnico.
La integracin mediada por enzima de restriccin (IMER)
es l mtodo establecido para producir ranas transgnicas. A dife
rencia de la transferencia gnica mediada por espermatozoos, el ge
noma del gameto se modifica durante el procedimiento de
transferencia. Se aslan ncleos de espermatozoos, se descondensan
v se mezclan con DNA plsmido. Despus se tratan con cantidades
limitadas de una enzima de restriccin para introducir muescas. En
seguida los ncleos descondensados se trasplantan en huevos no fe
cundados, donde las muescas se reparan y se produce la integracin
del DNA plsmido en el genoma. El procedimiento de transferen

cia debe completarse con rapidez porque los ncleos son muy fr
giles (Kroll y Amaya, 1996).
La microinyeccin de DNA en el huevo fecundado es un

medio establecido para producir ratones transgnicos y
se usa para la valoracin de expresin pasajera en peces
y anfibios
Aunque se producen ratones transgnicos mediante la inyeccin de
DNA en el citoplasma de los huevos fecundados, una tcnica ms
eficiente, y ya establecida, consiste en introducir DNA directamen
te en el proncleo masculino justo despus de la fecundacin. La
figura 20-2 muestra el mtodo. El transgen microinyectado se inte
gra de manera aleatoria en el DNA cromosmico, por lo general en
un sitio y como mltiples copias (no es raro encontrar 50 copias o
ms como concatmeros cabeza a cola). El transgen puede integrar
se de inmediato, en cuyo caso el ratn resultante es transgnico. Sin
embargo, es ms usual que el DNA se integre despus de una a dos
divisiones celulares y en estas circunstancias el ratn resultante es
un mosaico que contiene clulas tanto transformadas como no
582
CAPTULO VEINTE
Fig. 20-1. Mltiples vas por las que es posible producir ratones genticamente modificados.
Los cuadros unidos por lneas interrumpidas muestran el ciclo de vida del ratn y representan todas las etapas en que es posible efectuar una modificacin
gentica: clulas germinales, gametos, cigoto, blastocisto y adulto. La parte inferior de la figura muestra otro ratn como una fuente de clulas donadoras
para transferencia nuclear y procedimientos de trasplante celular. Las flechas rojas indican el ingreso de DNA exgeno. Las flechas gruesas sealan los
mtodos de transferencia gnica que ms se utilizan en ratones.
Cuadro 20-1. Transferencia gnica a animales: resumen de blancos y mtodos para transformar la lnea germinal
Clulas blanco
Mtodo
Clulas germinales
Transfeccin de clulas germinales primordiales cultivadas (mamferos)

Inyeccin en el embrin en el sitio de desarrollo de la clula germinal (Drosophila)
Espermatozoos
Fijacin de
DNA a cabezas de espermatozoos (mamferos)

DNA en ncleos de espermatozoos descondensados (Xenopus)
Introduccin de
Huevo/cigoto
Microinyeccin en el citoplasma del huevo (aves, anfibios, peces, C. elegans)

Mlcroinyeccin pronuclear (mamferos)
Transferencia retroviral (mamferos, primates)
Transferencia nuclear
Blastocisto
Microinyeccin en el blastocele (mamferos)

Transferencia de clulas ME (ratn)
Transferencia retroviral (mamferos, aves)
Clulas ME (seguidas p o r transferencia celular)
Transfeccin: adicin transgnica

Transfeccin: envo dirigido de genes
Transferencia retroviral
Clulas somticas (seguidas p o r transferencia nuclear)
Transfeccin: adicin transgnica

Transfeccin: envo dirigido de genes
Transferencia retroviral
20.2
transformadas. Cuando las clulas transformadas contribuyen a la

lnea germinal, el transgn se pasa a la generacin de ratones si
guiente y esto puede verificarse mediante PCR, Southern blotting o
una prueba para expresin de transgen. La transmisin a la lnea
germinal puede lograrse hasta en 40% de huevos de ratn microinyectados. Por desgracia, aunque la tcnica se aplica a otros mamfe
ros, la tasa de transmisin es mucho ms baja (< 1%). Ello se debe
en parte a la dificultad para manejar los huevos y en otra a las tasas
de supervivencia ms bajas.
La microinyeccin tambin se utiliza para introducir DNA en
huevos de peces y anfibios pero, a diferencia de lo que ocurre en ma
mferos, este DNA tiende a persistir en estado epismico y experi
mentar replicacin extensa. El DNA plsmido inyectado puede
incrementarse 50 a 100 veces en las etapas tempranas del desarro
llo. Se piensa que esto indica que no ocurre transcripcin durante
el desarrollo temprano de peces y anfibios, de manera que hay una
acumulacin extensa de enzimas y protenas necesarias para la
replicacin del DNA. La consecuencia es que es posible usar los
huevos de peces y ranas como sistemas de expresin pasajera. Sin
embargo, parte del DNA se integra y, si la transmisin a la lnea
P ro n cleo
PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GNICA
583
germinal se establece, entonces pueden producirse lneas transgnicas. Aunque este mtodo no se aplica en ranas por los intervalos de
generacin prolongados, es el procedimiento estndar para produ
cir peces transgnicos.
Aunque la transferencia gnica retrovirai se emplea para

producir mamferos y aves transgnicos, su principal
aplicacin es crear mosaicos en el desarrollo
Es posible transferir genes a clulas no seleccionadas de embriones
muy tempranos utilizando vectores retrovirales porque despus de la
infeccin una copia de DNA del vector se integra de modo estable
en el genoma del husped. La infeccin de embriones de ratn an
tes de la implantacin mediante retrovirus murinos recombinantes
o inyeccin de retrovirus en embriones de ratn postimplantacin
temprana ocasiona la transformacin estable de algunas clulas y por
tanto la produccin de mosaicos que pueden originar descendencia
transgnica. Se logran resultados similares en pollos por medio de
retrovirus aviario. No obstante, a causa de varias limitaciones de la
transferencia gnica retrovirai (la cantidad limitada de DNA extra-
P ro ncleo
Fig. 20-2. Desarrollo de ratones transgnicos mediante microinyeccin pronuclear.

Se construyen pipetas de vidrio muy finas con equipo especializado: una, la pipeta de sostn, tiene un dimetro que puede ajustarse a parte de un oocito
'ecundado y por consiguiente conservarlo en su sitio, en tanto que la pipeta de microinyeccin posee una punta muy fina que se utiliza para perforar el
Docto y despus el proncleo m asculino (porque es ms grande). A continuacin una solucin acuosa del DNA de deseado se lleva directamente
dentro del proncleo con la pipeta. Las clonas de DNA Introducidas pueden integrarse en el DNA cromosmlco en muescas y form ar transgenes, que
suelen contener mltiples coplas de cabeza a cola. Despus de extraer la micropipeta, los oocitos sobrevivientes se reimplantan en los oviductos de
* -rubras adoptivas seudogestantes (que se aparearon con un macho vasectomizado; el acto de apareamiento puede iniciar cambios fisiolgicos en la
'- b ra que estimulan el desarrollo de ios embriones implantados). Los ratones recin nacidos que resultan del desarrollo de los embriones implantados
revisan mediante PCR en cuanto a la presencia de la secuencia de DNA deseada (Gordon, 1992).
584
CAPTULO VEINTE
o que puede incorporarse y la tendencia de los transgenes retrovirales a sufrir silenciamiento) esta tcnica no se utiliza con amplitud
para generar ratones o aves transgnicos. Por el contrario, se prefie
re para producir mosaicos que pueden usarse para estudiar la expre
sin y la funcin gnicas en el desarrollo de vertebrados. En fecha
ms reciente la inyeccin de retrovirus recombinantes en el espacio
perivitelino de oocitos aislados permiti producir ganado transgnico (Chan y cois., 1998) y el primer primate transgnico obtenido al
guna vez, un mono rhesus llamado ANDi (Chan y cois., 2001).
La transfeccin de clulas madre embrionarias permite

producir ratones transgnicos
Las clulas madre embrionarias (ME) de ratn se derivan de em
briones de 3-5 a 4.5 das poscoito y surgen de la masa celular inter
na del blastocisto (vase recuadro 20-3). Las clulas ME pueden
cultivarse in vitro y es fcil transfectarlas con los mtodos que se
describen en el recuadro 20-1. Sin embargo, permanecen pluripotentes y contribuyen extensamente a todos los tejidos de un ratn,
inclusive la lnea germinal, cuando se reinyectan en un blastocisto
husped y se reimplantan en una madre adoptiva seudogestante. El
embrin en desarrollo es una quimera que contiene dos poblacio
nes de clulas derivadas de diferentes cigotos, los del blastocisto y
las clulas ME implantadas. ste difiere del mosaico en que las c
lulas pueden ser genticamente distintas pero derivadas del mismo
cigoto (fig. 4-10). Si el blastocisto y las clulas ME se derivan de ra
tones con diferentes colores de pelambre, la descendencia quimri
ca puede identificarse con facilidad por sus pelajes en parches. La
transmisin del transgn a la lnea germinal tambin puede confir
marse seleccionando la descendencia de apareamientos entre qui
meras (por lo general machos) y hembras con un pelambre de color
recesivo al de la cepa de la que las clula ME se derivaron (vase fig.
20-3).
Una de las ventajas de las clulas ME radica en que pueden
mantenerse de manera indefinida en cultivo y por tanto tienen to
das las conveniencias relacionadas con las clulas cultivadas. Es po
sible transformar millones de clulas con tcnicas de transfeccin

simples y verificar la modificacin gentica deseada en la etapa de
cultivo celular con marcadores seleccionables como neo (recuadro
20-2). En contraste, los otros procedimientos comentados requie
ren el procesamiento manual de huevos o embriones individuales,
de manera que slo es posible efectuar un nmero pequeo de ex
perimentos. Adems, como no hay forma de seleccionar los huevos
y los embriones transformados, la integracin del transgen debe ve
rificarse en los ratones resultantes. Sin embargo, la mayor ventaja
de las clulas ME es su propensin a la recorribinacin homloga,
que permite la modificacin gentica mediante el envo dirigido de
genes (seccin 20.2.5). En fecha reciente se derivaron lneas de c
lulas ME de pollos y humanos (vanse recuadro 20-3 y comentario
en la seccin 21.3.3), pero an no es posible derivar lneas de clu
las ME seguras, vigorosas, a partir de mamferos domsticos.
La transferencia nuclear puede emplearse para producir

mamferos domsticos modificados genticamente, pero su
tasa de xito es muy baja
Las principales tcnicas tiles para generar ratones transgnicos
(microinyeccin pronuclear y transfeccin de clulas ME) no son
eficientes o prcticas en la mayor parte de otros mamferos. Por
esta razn se desarrollaron mtodos alternativos basados en la tec
nologa de transferencia nuclear, que consiste en reemplazar
el ncleo de un oocito con el ncleo de una clulas somtica, que el
oocito reprograma despus y se torna capaz de recapitular la totali
dad del desarrollo a pesar del estado diferenciado de la clula dona
dora.
La tecnologa no es nueva en s misma. Se ha recurrido a ella por
ms de 50 aos para generar anfibios clonados y ha permitido pro
ducir mamferos clonados a partir de clulas embrionarias desde fi
nales del decenio de 1980. En 1995 se demostr por primera vez
que era factible clonar mamferos a partir de ncleos de clulas cul
tivadas (Campbell y cois., 1996) y el primer mamfero clonado a
partir de una clula adulta se produjo en 1997 (Wilmut y cois.,
Recuadro 20-3. Aislamiento y manipulacin de clulas madre em brionarias de mamferos

El embrin propiamente dicho de mamferos se deriva de la masa de c
lulas internas (MCI) de un blastocisto (seccin 3.7.3). Evans y Kaufman
(1981), y Martin (1981) aislaron por primera vez las clulas madre (ME)
embrionarias de ratn de blastocistos. El procedimiento consiste en co
locar un embrin preimplantacin de 4.5 das (blastocisto) en una monocapa de clulas nutrientes, que proporcionan tanto una matriz para la
fijacin como factores protenicos secretados que inhiben la diferencia
cin de clulas ME recin formadas. Tras la fijacin del blastocisto, las
clulas de la MCI proliferan. En un tiempo apropiado la MCI se extrae f
sicamente con una micropipeta, se dispersa en grupos pequeos de c
lulas y se siembran nuevas clulas nutrientes. Las colonias se examinan
al microscopio para buscar la morfologa caracteristlca. A continuacin
se captan, dispersan en clulas nicas y se siembran de nuevo en capas
nutrientes. Por ltimo las clulas con una morfologa uniforme pueden
aislarse y establecerse lneas celulares. El trmino clula M E' se intro
dujo para diferenciar estas clulas madre derivadas de embriones de las
clulas del carcinoma embrionario (CE), que se derivaron de teratocarcinomas. En general las clulas ME tienen un potencial de desarrollo me
nos restringido que las clulas del carcinoma embrionario (CE). Las dos
clases de clulas son pluripotentes y las clulas ME pueden originar to
dos los tipos de clulas adultas, inclusive las de la lnea germinal. Sin em
bargo, no son totipotentes en el mism o sentido que el oocito fecundado:

si se implantan en un tero no son capaces de originar un embrin. En al
gunos casos se informa que las clulas CE contribuyen a la lnea germi
nal en quimeras, pero cuando se inyectan clulas ME de ratn en un
blastocisto aislado de una cepa diferente y se implantan en una madre
adoptiva seudogestante contribuyen a quimeras y en particular a la lnea
germinal en una form a ms consistente. Esta propiedad es la que ha he
cho que las clulas ME de ratn sean tan valiosas para la investigacin.
No obstante, cabe sealar que las clulas ME que se utilizan para formar
con xito quimeras de lnea germinal se derivan de una cepa de ratn ais
lada (129) en combinacin con una cepa de embrin husped nica
(C57BIV6). En esta combinacin, las clulas ME son vigorosas y contri
buyen a la lnea germinal.
Los investigadores buscaron durante muchos aos clulas ME en otros
mamferos y aunque stas se aislaron de varias otras especies adems
del ratn, el gran xito en la formacin de quimeras de lnea germinal en
el ratn no fue paralelo. En fecha reciente se aislaron clulas madre em
brionarias humanas del blastocisto (Thomson y cois., 1998) y se deriva
ron de clulas germinales primordiales (Shamblott y cois., 1998). Las
aplicaciones mdicas potenciales de las clulas ME humanas y las impli
caciones ticas de su uso se comentan en el captulo 2 1 .
20.2
PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GNICA 585
129
B lasto cisto
a islad o
a
C lu las ME cu ltiv ad as
M asa d e clu las

in te rn a s
R eim plantar
en m ad re
a d o p tiv a
^
Envo dirigido
d e g e n e s o insercin
d e tra n sg e n
Iny ectar d en tro
C 57B 10/J
C 57B 10/J
de la cavidad del
blastocisto de una
cepa de ratn diferente
C lu las ME m o d ificad as
g e n tic a m e n te
Q uim era
A paream iento
Ratn
que contiene
(heterocigoto)
modificacin
gentica en todas
las clulas
nucleadas
Fig. 20-3. Clulas ME modificadas genticamente para transferir DNA extrao o mutaciones especficas en la lnea germinal del ratn.
Se cultivaron clulas de la masa celular interna despus de extirpar los oviductos y aislar blastocistos de una cepa de ratn adecuada (129). Estas clulas
madre embrionarias (ME) retienen la capacidad de diferenciarse en distintos tipos de tejidos en el ratn adulto. Las clulas ME pueden modificarse
genticamente cuando estn en cultivo mediante la insercin de DNA extrao o por la introduccin de una mutacin sutil. Las clulas ME modificadas
pueden inyectarse luego en blastocistos aislados de otra cepa de ratn (p. ej., C57B10/J, que tiene un color de pelambre negro que es recesivo al color
agut de la cepa 129) y despus implantarse en una madre adoptiva seudogestante de la misma cepa que el blastocisto. El desarrollo subsecuente del
blastocisto introducido produce una quimera que contiene dos poblaciones de clulas (inclusive clulas de la linea germinal) que se derivan de cigotos
diferentes (por lo general lo evidencia la presencia de placas de pelambre de diferentes colores). El retrocruzamiento de quimeras puede producir
ratones que son heterocigotos para la modificacin gentica. El interapareamiento subsecuente de mutantes heterocigotos genera homocigotos.
1997). La figura 20-4 resume el procedimiento que siguieron Wilmut y colaboradores. En el experimento original slo 29 de un to
tal de 434 oocitos se desarrollaron hasta la etapa transferible y slo
uno de ellos se desarroll hasta el trmino la famosa oveja conoci
da como Dolly (vase fig. 20-4B)-. El xito en la clonacin de ani
males adultos forz a aceptar que las modificaciones del genoma
que en alguna poca se consideraban irreversibles pueden revertir
se y que es posible reprogramar los genomas de clulas adultas me
diante factores oocitarios para tornarlas totipotentes de nuevo. Es
indudable que la clonacin de animales, en especial la de ratones,

beneficiar la investigacin del control de la expresin gnica du
rante el desarrollo y los procesos bsicos de la diferenciacin som
tica, la mutacin somtica y los procesos del envejecimiento y la
reparacin (Wakayama y cois., 1998). En el captulo 21 se estudian
los beneficios mdicos prcticos y las implicaciones ticas de la clo
nacin de animales y humanos, pero por el momento el mtodo s
lo se considera como otra forma de generar animales transgnicos.
El hecho esencial es que si el ncleo donador se obtiene de una c
586
CAPITULO VEINTE
lula que se transfect y contiene un transgen adicional, entonces el

animal que se desarrolla a partir del oocito manipulado ser transgnico. Esto lo demostraron por primera vez Schnieke y colabora
dores (1997) quienes transfectaron fibroblastos de oveja cultivados
con el gen humano para factor de coagulacin sangunea IX y pro
dujeron una oveja transgnica clonada llama Polly que contena la
protena recombinante en su leche. De igual forma se produjeron
ovejas clonadas a partir de clulas somticas cultivadas cuyo genoma se alter mediante el envo dirigido de genes (vanse ms ade
lante y McCreath y cois., 2000).
20.2.3 El control de la expresin transgnica es una

consideracin importante en cualquier
experimento de transferencia gnica
La presencia de un transgen en una clula o animal transgnico no es
suficiente por s misma para producir un producto funcional. A fin
de que lo anterior ocurra, el transgn tambin debe expresarse. Por
consiguiente el control de la expresin gnica tiene una importancia
fundamental en la tecnologa de transferencia gnica. La expresin
transgnica se regula mediante las secuencias que se encuentran en el
elemento de expresin y, cuando el transgen se integra, tambin por
factores intrnsecos al genoma del husped. En general el aspecto ms
importante del diseo del constructo es la estructura del promotor,
que se comenta ms adelante. Sin embargo, la expresin robusta re
quiere asimismo un sitio de poliadenilacin y tal vez otras considera
ciones, como la optimacin del sitio de inicio de la traduccin y la
inclusin de una seal dirigida a protenas adecuada.
El promotor transgnico define los patrones espacial y

temporal bsicos de la expresin
Los experimentos de transferencia gnica en lneas celulares suelen be
neficiarse del uso de promotores constitutivos muy activos, que dan
lugar a que el transgen se exprese en forma potente y constante. Estos
promotores suelen derivarse de virus, que evolucionaron para expre
sar sus genes en muchos tipos de clulas diferentes. Los elementos re
guladores que ms se utilizan en clulas de mamferos comprenden el
promotor e intensificador temprano SV40, el promotor e intensificador de repeticin terminal larga (RTL) del virus del sarcoma de Rous
y el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano. Mu
chos vectores de expresin disponibles en el comercio los incluyen.
En animales transgnicos, a menudo es deseable la expresin del
transgen en tejidos o etapas particulares del desarrollo. De igual
forma, en lneas celulares quiz sea necesario restringir la expresin
del transgen a etapas particulares del ciclo celular o encender el
transgen slo cuando la clula se diferencia. El patrn de expresin
deseado puede lograrse mediante el enlace del transgen a un pro
motor especfico de clula o especifico de etapa apropiado. Por
ejemplo, el gen de enolasa especfico de neurona slo se expresa en
neuronas maduras. Un elemento regulador corriente arriba de 1.8 kb
de largo es suficiente para conferir la expresin del transgen especfi
co de neurona en ratones transgnicos e incrementar la expresin es
pecfica del transgen en neuroblastos cultivados en diferenciacin
(Forss-Petter y cois., 1990; Sakimura y cois., 1995).
El control mximo de la expresin del transgen tanto en lneas ce
lulares como en animales lo ejercen promotores inducibles, que
pueden encenderse y apagarse por el control del aporte de un ligan
do qumico particular. Por lo general con este ligando se modifican
las estructuras de los factores de transcripcin que estos promotores
regulan. Se utilizan varios promotores inducibles de manera natural

que incluyen el promotor de metalotionena del ratn y el promotor
de RTL del virus del tumor mamario del ratn, ambos inducibles
mediante dexametasona (una hormona sinttica). Adems el promo
tor de metalotionena puede inducirse mediante iones de metales pe
sados, como Zn2+. El ligando inductor puede aadirse al medio de
clulas cultivadas y administrarse a los animales en el agua que be
ben. Por lo general las fugas, es decir, un valor de expresin de fon
do alto, y los valores hasta cierto punto bajos de induccin
obstaculizan el uso de estos promotores endgenos. Tambin pueden
ocurrir efectos indeseables originados por la coactivacin de genes
endgenos que responden al mismo ligando y en animales transgni
cos es posible que las tasas de captacin y eliminacin del ligando en
distintos rganos sean diferenciales. Sin embargo, en fecha ms re
ciente se desarrollaron sistemas prometedores que utilizan compo
nentes heterlogos. Por ejemplo, el opern E, coli tet es la base de la
expresin inducible regulada por tetraciclina (fig. 20-5A) que permi
te la produccin de lneas celulares transformadas muy inducibles y
de animales transgnicos (vase Saez y cois., 1997). Se disearon otros
sistemas basados en el opern de coli lac y la hormona de Drosophila ecdisona. De manera alternativa la expresin inducible puede lo
grarse mediante dimerizacin inducida qumicamente (DIQ), en
la que un factor de transcripcin funcional se ensambla a partir de
dos componentes en presencia de un ligando equivalente (Belshaw y
cois., 1996). Una desventaja de todos estos sistemas de expresin es
que la induccin ocurre a nivel de la transcripcin, de manera que
puede haber un retraso importante antes que una respuesta a la in
duccin se observe y un retraso similar entre la eliminacin del estmu
lo inductor y el regreso al estado basai. Cuando la induccin y la
descomposicin rpidas son esenciales, se cuenta con sistemas indu
cibles que actan a nivel de las protenas. En uno de estos sistemas el
transgen blanco se expresa como una fusin con el receptor de estro
geno, que en condiciones normales se secuestra en un complejo inac
tivo con Hsp90 (fig. 20-5B). En presencia de estrgeno, o su anlogo
tamoxifeno, el receptor de estrgeno se libera y la proteina a la que
est fusionado puede activarse (Littlewood y cois., 1995).
Los efectos de la posicin y la estructura del locus influyen

la expresin de transgenes integrados
Una observacin frecuente es que los animales transgnicos deriva
dos de manera independiente que llevan el mismo elemento trans
gnico no siempre muestran el mismo nivel o patrn de expresin
del transgen. Esto se debe a que la integracin transgnica ocurre
de manera aleatoria, por lo que tanto la posicin como la estructu
ra del locus transgnico varan. Los efectos de la posicin se origi
nan por la influencia de elementos reguladores locales y la
estructura de la cromatina. Por ejemplo, el transgn puede integrar
se cerca de un intensificador que modifica su patrn de expresin
o dentro de un dominio de heterocromatina que suprime la expre
sin por completo. Es posible que la estructura del locus transgni
co tambin influya en la expresin. Por ejemplo, si dos copias del
transgen se disponen como una repeticin invertida, entonces pue
de generarse RNA en horquilla que conduce a interferencia del
RNA (vase seccin 20.2.6). Varios otros aspectos de la estructura
del locus pueden desencadenar defensas celulares contra DNA in
vasor y conducir a silenciamiento transgnico por metilacin nue
va del DNA. Estos fenmenos son menos evidentes en lneas
celulares transformadas porque stas se seleccionan con base en su
capacidad para expresar con potencia un gen marcador.
20.2 PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GENICA | 587
A)
Clulas d e glndula m am aria

d e oveja d e 6 a o s d e edad
Aislar oocitos ovulados
Aislar y cultivar
las clulas
Eliminar
crom osom as
Cultivar en m edio
sin suero
O ocito
renucleado
Transferir a oveja adoptiva <r
B)
Fig. 20-4. La oveja Doily fue el resultado final del primer intento exi
toso de clonacin de mamferos a partir de clulas adultas.
A) estrategia experimental seguida por Wilmut y colaboradores (1997).
Los ncleos donadores se derivaron de una lnea celular establecida de
clulas de glndula mamaria adulta. La transferencia nuclear se realiz
mediante la fusin de clulas somticas individuales con oocitos nucleados con detencin en metafase II. Las clulas donadoras se privaron de
suero antes de utilizarlas, lo que las forz a salir del ciclo celular y entrar
en un estado de latencia que se conoce como G0 en el que slo ocurre
una transcripcin mnima. Puesto que en condiciones normales los hue
vos se fecundan mediante espermatozoos sin actividad transcripcional
cuyos ncleos tal vez son programados portadores de transcripcin y
otras protenas de cromatina disponibles en el huevo, el ncleo G0 puede
representar el estado basal ideal para la reprogramacin. Cabe sealar
que en otros experimentos de clonacin se usaron diferentes estrategias
para introducir el ncleo donador en el huevo. Por ejemplo, en la clona
cin de ratones adultos exitosa publicada por Wakayama y colaboradores
(1998) se recurri a una aguja muy fina para tomar el ncleo de la clula
donadora con contaminacin mnima por citoplasma de la misma. La c
lula donadora se microinyect rpidamente, pero con mucha suavidad,
dentro del oocito enucleado. B) Dolly con su primera cria, Bonnie. Foto
grafa original proporcionada por el Roslin Institute.
588 | CAPTULO VEINTE
Los efectos de la posicin pueden bloquearse con

elementos reguladores que actan de manera dominante
y elementos transgnicos grandes
Casi todos los transgenes son secuencias de cDNA controladas por
elementos reguladores cortos. Cada vez es ms evidente que en tan
to que estos elementos definen los requerimientos mnimos para la
expresin y la funcin gnicas, no proporcionan el complemento
total de secuencias necesario para la expresin gnica robusta en un
contexto genmico. Se comprob que ciertos elementos regulado
res actan como interruptores maestros para establecer dominios
de cromatina abiertos y proteger los genes de la influencia de ele
mentos reguladores y de la estructura de la cromatina en dominios
vecinos. Con frecuencia estos elementos se hallan dentro de intrones y en sitios distantes. Por consiguiente es posible evitar los efec
tos de la posicin mediante la incorporacin de estos elementos en
transgenes o por constructos genmicos grandes como transgenes
en lugar de cDNA mnimos.
Resulta difcil definir con precisin los elementos que estable
cen dominios de cromatina, pero algunos, como los elementos
limtrofes, las regiones de fijacin de matriz y las regiones de con
trol del locus, suelen usarse con cierto xito en transgenes (sec
cin 10.5). A fin de estudiar estos efectos de largo alcance con
mayor precisin e investigar la expresin y la regulacin de genes
humanos en el contexto de sus elementos reguladores de accin
cis, fue necesario establecer condiciones que permitieran trans
ferir molculas de DNA grandes. Los principales adelantos in
cluyen:
desarrollo de ratones transgnicos YAC (Lamb y Gearhart,
1995). El primer informe que se public describi ratones
transformados con un YAC de 670 kb que contena el gen de
fosforribosiltransferasa de hipoxantina y guanina humano
{HPRT) (Jakobovits y cois., 1993). Esta tcnica es til para
modelar enfermedades humanas causadas por desequilibrios
de dosis a gran escala (seccin 20.4.5) y tiene otras aplicacio
nes, como la produccin de anticuerpos humanos autnticos
en ratones (Mndez y cois., 1997; para un mtodo general,
vase la fig. 20-6). Es posible producir transgnicos YAC
mediante fusin celular, microinyeccin o transfeccin con
liposomas;
el desarrollo de ratones transcromosmicos (Tomizuka y cois.,
1997). stos contienen cromosomas humanos o fragmentos
cromosmicos y se generan mediante transferencia gnica me
diada por microclulas (recuadro 8-4).
20.2.4 La transferencia gnica tambin es til para

producir mutaciones definidas y alterar la
expresin de genes endgenos
Hasta la fecha la tecnologa de transferencia gnica se consider s
lo desde la perspectiva de aadir funciones a clula animales. Otra
forma en la que esta tecnologa puede emplearse, y tal vez sea su
mayor contribucin a la investigacin biomdica, es para suprimir
o alterar de manera selectiva las funciones de genes endgenos. Es
to no slo es un medio potente para investigar la funcin gnica
(seccin 20.3.2) sino tambin una va til para crear modelos de
enfermedades que simulan con precisin las enfermedades corres
pondientes en humanos (seccin 20.4.4). Las formas en que la
transferencia gnica puede usarse para modificar la funcin de ge
nes endgenos son tres:
Envo dirigido de genes. Este mtodo recurre a la recombina

cin homologa para reemplazar una secuencia de un gen end
geno con una secuencia relacionada y por consiguiente
introduce una mutacin definida en un sitio preseleccionado
del genoma. A menudo esta tcnica se emplea slo para alterar
genes con un casete insercional grande, lo que genera mutacio
nes nulas que se conocen como k nock outs gnicos. Sin em
bargo, las estrategias modificadas permiten formas ms
complicadas de manipulacin gentica, inclusive la introduc
cin de mutaciones sutiles y el reemplazo de un gen con otro.
Inhibicin de la expresin gnica. En este mtodo se utiliza
la metodologa de transferencia gnica estndar a fin de aadir
una nueva secuencia de DNA a la clula. No obstante, en lu
gar de codificar una protena que confiere una nueva funcin
en la clula, el producto de este transgn slo funciona para in
hibir la expresin de un gen endgeno. Estos productos gni
cos, que comprenden RNA antisentido, RNA de doble cadena,
RNA de interferencia pequeo, ribosomas, anticuerpos y pro
tenas dominantemente de interferencia, tambin pueden in
troducirse en forma directa en lugar de expresarse a partir de
un transgen, aunque en este caso los efectos son pasajeros en
lugar de permanentes.
Mutagnesis insercional. En este mtodo el transgn se integra
(de modo aleatorio) en un gen existente y suprime su funcin.
Como el envo dirigido de genes, esta tcnica altera la funcin
gnica al introducir una mutacin, pero en este caso esta ltima
no es definida ni se dirige (blanco) a un sitio particular. Es po
sible identificar mutaciones en genes especficos mediante selec
cin a gran escala (seccin 20.3.3).
20.2.5 El envo dirigido de genes permite producir

animales que portan mutaciones definidas en
todas las clulas
El envo dirigido de genes incluye la recomblnacin
homologa in vivo entre un gen endgeno y una secuencia
de DNA exgeno contenida en un vector de envo dirigido de
genes
Las interacciones entre el DNA introducido en clulas animales y
el genoma del husped suelen ocasionar la integracin aleatoria del
DNA exgeno en sitios de muescas y roturas cromosmicas preexis
tentes. Sin embargo, si el DNA exgeno semeja de cerca un gen en
dgeno, puede ocurrir una interaccin distinta en la que las
secuencias exgenas y endgenas se alinean y experimentan recom
binacin homologa. Este proceso, que se conoce como envo di
rigido de genes, permite crear mutaciones definidas en sitios
preseleccionados en el genoma husped. Por tanto puede conside
rarse como una forma de mutagnesis artificial in vivo dirigida a un
sitio (en oposicin a los diversos mtodos de mutagnesis in vitro
dirigida a un sitio que se describen en las secciones 5.5.2, 5.5.3).
La recombinacin homologa es un proceso muy raro en clulas
de mamferos y ocurre con una frecuencia cercana a IO4 a 105 ve
ces menor que la integracin aleatoria. La frecuencia de la recom
binacin homologa depende tanto de la longitud de la regin de
homologa (la parte del vector de envo dirigido de genes que se ali
nea con el gen endgeno) como del grado de similitud con el gen
blanco. Por tanto, la clona de DNA introducida, que se modific
para incluir la mutacin deseada, suele ser una secuencia larga que
20.2 ! PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GENICA
A)
589
tetR
T etraciclina o doxiciclina
"( T *R #
TetR
P
G en b lan co
G en b lan co
P
tetO
B)
tetO
--------------------------------------------------------------------
X
ER
INACTIVO
ER-X
ACTIVO
Fig. 20-5. Sistemas de expresin inducible.

A) Sistema bsico de expresin inducible por tetraciclina. La expresin constitutiva del represor Tet de E. coli (TetR) inactivar cualquier transgen blanco
que contenga la secuencia del operador tetO, a la que el represor se enlaza. Sin embargo, en presencia de tetraciclina o su anlogo doxiciclina, la con
formacin estructural del represor se altera y ya no puede enlazarse ms al operador, lo que ocasiona que el gen se desreprima. Ntese que los efectos
de toxicidad que reflejan la expresin constitutiva de alto nivel del represor limitan el uso de este sistema en algunas clulas. Para resolver este problema
se desarrollaron sistemas ms complicados en los que el represor Tet se convirti en un activador (el sistema tTA) o en los que el enlace depende de la
tetraciclina en lugar de ser abolido por ella (el sistema tTA inverso). Vase Saez y cois. (1997) para una revisin de estos sistemas. B) Sistema de expresin
inducible por estrgenos. Una proteina (X) expresada como una fusin con el receptor de estrgeno (RE) suele ser inactiva porque se secuestra en un
complejo con la proteina de choque por calor 90 (Hsp90). Sin embargo, en presencia de estrgeno la protena de fusin se libera del complejo y la
actividad de la proteina X se restablece. ste es un sistema ventajoso porque la induccin es muy rpida y slo requiere la disociacin de un complejo
protenico y no la transcripcin seguida de sntesis de protenas.
590
CAPTULO VEINTE
1. A islar YAC q u e c o n tie n e n s e c u e n c ia s d e

IgH h u m an o
y lo cu s d e c a d e n a IgK
( = )
2. P erm itir q u e los YAC d e c a d a lo cu s e x p erim en ten

reco m b in aci n h o m o lo g a e n c lu la s d e levadura
p a ra g e n e ra r YAC co n in se rto s g ra n d e s
4. C ruzar e s to s ra to n e s c o n la c e p a DI
q u e tie n e lo cu s d e
IgH ( ) e IgK ( t = ) e n d g e n o s
knocked out m ediante envo dirigido de genes
yK2 x DI
-+ >
*+-
P o r ejem plo, IgH d e YAC h u m an o d e 1 Mb

3. F u sio n ar e sfe ro p la sto s d e c lu la s d e lev ad u ra
q u e c o n tie n e n IgYAC g ra n d e c o n c lu la s ME d e rat n
H acer
tra n sg n ic o s
5. C ru zar yH2; DI c o n yK2; DI
R at n c o n tra n slo c u s Ig h u m a n o s n ico s

Fig. 20-6. Uso de transgenes YAC para producir un ratn con un repertorio de anticuerpos humanos.
Los YAC que contienen secuencias Ig se obtienen seleccionando genotecas de YAC con sondas de Ig apropiadas. La recuperacin de YAC con insertos
comparativamente pequeos implic la necesidad de construir en form a artificial YAC ms grandes mediante recombinacin homologa en clulas de le
vadura. Se crearon esferoplastos mediante el tratamiento de las clulas de levadura de manera que la pared celular se desprenda, lo que tom a las clu
las ms accesibles a fusin celular. Vase Mndez y cois. (1997) para detalles ms amplios del procedimiento para construir estos ratones.
es isognica con el DNA genmico de la clula husped. Aun en

este caso la frecuencia de acontecimientos genuinos de recombina
cin homologa es muy baja y puede ser difcil identificarla contra
un fondo mensurable de integraciones aleatorias. La estrategia que
se sigue para identificar las clulas en que el envo dirigido de ge
nes se efectu depende del diseo del constructo (fig. 20-7). Hay
dos tipos de constructos:
Los vectores de insercin, que se dirigen al locus de inters
mediante un acontecimiento aislado de recombinacin rec
proca, que causa la insercin del vector completo (fig. 20-7A).
Los vectores de reemplazo, que estn diseados para reempla
zar parte de la secuencia del gen cromosmico con una secuen
cia homologa del DNA introducido (fig. 20-7B). Esto puede
ocurrir como resultado de una recombinacin recproca doble
o por conversin gnica.
En ambas estrategias un segmento grande de DNA vector que con
tiene el gen marcador neo se introduce en el locus blanco, lo que
produce una alteracin y la generacin de un alelo nulo (k nock out
gnico). Sin embargo, esto quiz no siempre sea deseable. Si se re
quiere una mutacin ms sutil pueden usarse varias tcnicas de re
combinacin en dos pasos. La figura 20-8 muestra la estra tegia d e
g o lp e a r y c o r r e r que se aplica a vectores de insercin y la estra
teg ia d e m a rca r e in terca m b ia r que se emplea con vectores de
reemplazo.
Es posible producir animales modificados genticamente

mediante el envo dirigido de genes en clulas ME o
somticas utilizadas como donadores para transferencia
nuclear
El envo dirigido de genes mediante recombinacin homologa se lo
gr por primera vez en clulas somticas hbridas humano/ratn
cultivadas (Smithies y cois., 1985) y desde entonces se demostr en
clulas somticas de diversos mamferos. Sin embargo, la aplicacin
ms importante del envo dirigido de genes incluye las clulas ME
de ratn, que son en particular accesibles a la tcnica porque expe
rimentan recombinacin homologa a una frecuencia comparativa
mente alta (aunque mucho ms baja an que la frecuencia de
integracin aleatoria). La combinacin poco usual y muy benfica
de tres caractersticas -facilidad de cultivo y transfeccin, propen
sin a la recombinacin homologa y pluripotencia- significa que es
muy directo usar clulas ME para producir ratones que contienen
la misma modificacin gentica en cada clula (Capecchi, 1989;
Melton, 1994). Una vez que se dispone de clulas ME blanco, el
mtodo general que se sigue para obtener ratones es el mismo que
se muestra en la figura 20-3. Estos ratones se describen como mo
dificados genticamente o de envo dirigido en lugar de transg
nicos porque no siempre contienen algn DNA exgeno. De hecho
es posible producir ratones de envo dirigido que contienen una mu
tacin de punto aislada en una posicin definida con antelacin.
20.2 1 PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GNICA j 591
A)
B)
P un to d e
linearizacin con
regin ho m o lo ga
b j c
M arcador tk no inco rp o rad o

m ed ian te reco m b inacin ho m o lo ga
neo
d J---------
P un to d e
linearizacin fuera
d e la regin
ho m o lo ga
e__ f
Fig. 20-7. El envo dirigido de genes medante recombinacin homologa puede activar genes en un locus predeterminado dentro de una clula intacta.
A) M todo de insercin de vector. El DNA vector introducido (rojo) se corta en un sitio nico dentro de una secuencia casi idntica o relacionada de
manera cercana a parte del gen endgeno blanco (azul). Puede ocurrir recombinacin homologa (X) si toda la secuencia del vector (inclusive el gen
marcador neo, que confiere resistencia al antibitico G418) se inserta dentro del locus blanco. Sin embargo, los acontecimientos de envo dirigido
genuinos sern raros y en la mayor parte de las clulas resistentes a G418 el vector se habr integrado al azar. Debe utilizarse una valoracin de PCR
para diferenciar entre los acontecimientos de envo dirigido de genes y de integracin aleatoria, con cebadores diseados para asociarse estratgicamente
en el vector y el gen blanco. B) M todo de reem plazo de vector. En este caso el gen neo est contenido dentro de la secuencia homologa del gen
endgeno y el vector se corta en un sitio nico fuera de la regin de homologa. Puede resultar una recombinacin doble o un acontecimiento de
conversin gnica (XX) en sustitucin de secuencias internas dentro del gen blanco mediante secuencias homologas del vector, inclusive neo. Una vez
ms ios acontecimientos de integracin aleatoria son ms frecuentes pero el mtodo de reemplazo del vector facilita una estrategia de seleccin doble
ms complicada en la que un segundo marcador, un marcador contraseleccionable, tk (que confiere sensibilidad al ga nciclovir), se coloca fuera de la
regin de homologa. El segundo marcador se incorporar en el genoma por integracin aleatoria pero no por recombinacin homologa. Por tanto es
probable que las clulas que son resistentes tanto a G418 como a ganciclovir se aborden (blanco) en forma correcta. Las letras indican el orden lineal
dentro del gen y no representan exones.
Aunque por lo general el procedimiento de envo dirigido de

genes en clulas somticas tiene una eficiencia muy baja, hace po
co tiempo se emplearon fibroblastos fetales con modificaciones por
envo dirigido como donadores para transferencia nuclear (seccin
20.2.2). Esto dio lugar a la creacin de una gama de mamferos
modificados genticamente. El informe inicial describi ovejas con
un nuevo gen introducido en el locus COL 1 A l (McCreath y cois.,
2000) y en fecha ms reciente dos grupos informaron la produc
cin de cerdos con alteraciones por envo dirigido en el gen para
o-l,3-galactosiltransferasa (Dai y cois., 2002; Lai y cois., 2002). Es
ta enzima decora protenas con grupos carbohidrato que no se en
cuentran en primates y constituye uno de los principales factores
que originan el rechazo de rganos en trasplantes de rganos de
cerdo a humanos.
20.2.6 La recombinacin especfica de sitio posibilita la

inactivacin gnica condicional y la ingeniera
cromosmica
Varios bacterifagos y tambin bacterias y levaduras muestran
sistemas de recombinacin especfica de sitio. Cada sistema com
prende un mnimo de dos componentes: una secuencia de recono
cimiento especfica corta en la que la recombinacin ocurre y una
enzima recombinasa que reconoce la secuencia y efecta la reaccin
de recombinacin cuando se encuentran dos copias de la secuen
cia. La potencia de la recombinacin especfica de sitio radica en
que los sitios de reconocimiento pueden modificarse con facilidad
mediante ingeniera dentro de transgenes o vectores de envo diri
gido y las enzimas recombinasa proporcionarse condicionalmente

porque los genes que codifican estas enzimas pueden expresarse ba
jo el control de promotores regulados o inducibles. A la fecha se
utiliza ms el sistema de recombinacin Cre/orP del bacterifago
P l, en particular en ratones modificados genticamente. La fun
cin natural de la recombinasa Cre (causa recombinacin) es me
diar la recombinacin entre dos secuencias loxV, que tienen 34 pb
de largo y comprenden dos repeticiones invertidas de 13 pb sepa
radas por un espaciador central asimtrico de 8 pb (fig. 20-9). Si los
dos sitios loxP se hallan en la misma orientacin, la secuencia inter
media se corta a continuacin. Cuando se encuentran en orienta
ciones opuestas, la secuencia intermedia se invierte. Por tanto el
sistema Cre-/arP se aplica en varias formas, que comprenden inte
gracin de transgenes especfica de sitio, activacin e inactivacin
condicional de transgenes y delecin de genes marcadores indesea
bles. Sin embargo, las aplicaciones ms importantes tal vez sean la
inactivacin gnica condicional y la ingeniera cromosmica, que se
comentan ms adelante (vase Lobe y Nagy, 1998).
Inactivacin gnica condicional

Algunos genes son crticos en etapas tempranas del desarrollo y los
experimentos simples de knockout no suelen ser tiles porque la
muerte sobreviene pronto durante la etapa embrionaria. A fin de
abordar este problema se desarrollaron mtodos para inactivar el
gen blanco slo en clulas predeterminadas, seleccionadas, del ani
mal o en una etapa particular del desarrollo. En consecuencia el
animal puede sobrevivir y el efecto de la mutacin k nock out con-
592
CAPTULO VEINTE i MANIPULACIN GENTICA DE CLULAS Y ANIMALES
C neo
S e g u n d a ron da
d e tran sc o lo c ac i n
b
c*
d~l----- M utacin
la
i
d
e*
f 1
Fig. 20-8. Introduccin de mutaciones sutiles mediante envo dirigido de genes.

A) En la estrategia de golpear y c o rre r que se utiliza con vectores de insercin la mutacin sutil se encuentra en el primer constructo blanco y la re
combinacin intracromosmica conduce a la eliminacin del gen marcador y la estructura bsica del vector. B) En la estrategia de m a rca r e in te r
c a m b ia r" que se aplica a vectores de reemplazo se emplea un segundo constructo blanco para reemplazar la mutacin introducida por el primero. El
segundo constructo incorpora un marcador contraseleccionable fuera de la regin de homologa para evitar la integracin aleatoria.
dicional estudiarse en un tejido o tipo celular de inters. Un ejem

plo inicial de este mtodo lo publicaron Gu y colaboradores (1994)
e implic el knockout condicional de polimerasa (3 de DNA, una
enzima esencial para el desarrollo embrionario. El procedimiento
de envo dirigido de genes reemplaz un exn esencial del gen en
dgeno con un segmento gnico homlogo flanqueado por secuen
cias loxP. Despus los ratones portadores de esta mutacin de envo
dirigido se aparearon con una cepa de ratones que llevaba un gen
transgnico Cre bajo control de un promotor especfico de linfocitos T. La descendencia de la cruza que contena ambos transgenes
se identific y sobrevivi hasta la vida adulta. El producto Cre s
lo se expres en clulas T y elimin el exn esencial e inactiv el
gen (vase el mtodo en la fig. 20-10). Una ventaja general de este
procedimiento es que pueden utilizarse ratones transgnicos Cre
una y otra vez para diferentes experimentos. Sin importar el gen en
dgeno que es flanqueado por sitios loxP, los ratones transgnicos
Cre descritos puede emplearse para alterar ese gen en las clulas T.
De igual forma se generaron transgnicos Cre con muchas aplica
ciones en los que es factible inducir la expresin Cre mediante te
traciclina y en los que Cre se expresa de manera constitutiva como
una fusin con el receptor de estrgeno y se activa a nivel de la pro
teina mediante tamoxifeno (seccin 20.2.3; Fiel y cois., 1996).
rigido aprovecha el pareamiento de cromosomas homlogos que

ocurre de manera natural durante la meiosis en la primera divisin
celular. Se disea un transgen para que exprese recombinasa Cre
bajo control de un promotor Sycp 1 (el gen Sycp 1 codifica parte
del complejo sinaptonemal que facilita el cruzamiento). Como re
sultado, se produce recombinasa Cre en espermatocitos del macho
durante las etapas cigotena a paquitena cuando el pareamiento
cromosomico ocurre.
20.2.7 Las estrategias transgnicas pueden usarse

para inhibir la funcin de genes endgenos
Si bien es indudable que el envo dirigido de genes constituye el
medio ms directo y preciso para manipular la actividad gnica en
clulas y animales transgnicos, una limitacin importante radica
en que este mtodo slo puede aplicarse en forma rutinaria a rato
nes y moscas de la fruta. Por consiguiente se crearon otros mtodos
de inhibicin gnica que tienen una aplicacin ms general (cuadro
20-2). Estos mtodos son diversos, pero se consideran en conjunto
porque todos interfieren en alguna forma con la expresin o la fun
cin gnicas sin alterar la secuencia de DNA d el gen blanco. En oca
siones se describen como procedimientos de k nock out funcional
porque generan fenocopias del genotipo mutante correspondiente.
Ingeniera cromosmica
Otro adelanto reciente importante es una estrategia de ingeniera
cromosmica en clulas ME que se basa en el envo dirigido de ge
nes secuencial y la recombinacin Cre-/oxP. El envo gnico dirigido
se usa para integrar sitios loxP en las localizaciones cromosmicas
deseadas y despus se recurre a la expresin pasajera de la recombinasa Cre para mediar un reordenamiento cromosomico selecciona
do (Ramrez-Sols y cois., 1995; Smith y cois., 1995; fig. 20-11). Las
estrategias de ingeniera cromosmica de este tipo ofrecen la posibi
lidad excitante de crear lneas nuevas de ratones con anormalidades
cromosmicas especficas para estudios genticos. El envo dirigido
de genes mltiple y los pasos de seleccin en clulas ME que se uti
lizan en los mtodos de ingeniera cromosmica anteriores pueden
evitarse por medio del procedimiento nuevo de Herault y colabora
dores (1998). Este mtodo de recombinacin meitica por envo di
Es posible inhibir la expresin gnica dirigindose a mRNA

especficos para destruccin
Puesto que el RNA es el puente entre genes y protenas, la destruc
cin o la inactivacin selectiva de transcritos de genes especficos
ATAACTTCGTATA > GCATACAT< TATACGAAGTTAT
Fig. 20-9. Estructura de la secuencia de reconocimiento lo x R

Obsrvese que la secuencia central de 8 pb que est flanqueada por las
repeticiones invertidas de 13 pb es asimtrica y confiere orientacin.
20.2 i PRINCIPIOS DE LA TRANSFERENCIA GNICA
593
A)
Envo dirigido d e
g e n e s en clulas ME
loxP
R atn con locu s blanco

flan q u ead o p o r sitio s loxP
R atn tran sg n ic o co n gen

e n la za d o a un pro m oto r
e sp ecfico d e clula, P
Cre
M lox P
E xpresin d e Cre
e sp ec fica d e tejido /clula
i
S eleccio n ar clu las ME

tipo 1
lox P
Delecin especfica de tejido o clula de A en el locus blanco
Fig. 20-10. El envi dirigido de genes puede usarse con el sistema de recombinacin Cre-/oxP a fin de inactivar un gen en un tipo de clula deseado.
A) Ilustracin de un mtodo de recombinacin homologa estndar con clulas ME de ratn, en las que se introducen tres sitios loxP junto con un
marcador M en un locus A blanco (por lo general un gen pequeo o un exn interno cuya eliminacin podra causar una mutacin de cambio de marco).
La transfeccin subsecuente de un gen de recombinasa Cre y la expresin pasajera de este gen dan por resultado recombinacin entre los sitios loxP
introducidos para proporcionar diferentes productos. Los recombinantes tipo 1 se emplean para generar ratones en los que el locus est flanqueado por
sitios loxR Estos ratones pueden aparearse con ratones transgnicos desarrollados con anterioridad B) que llevan un constructo integrado que consiste
en el gen de recombinasa Cre enlazado a un promotor especfico de tejido. La descendencia que contiene tanto el locus blanco flanqueado por loxP
como el gen Cre expresa el gen Cre en el tipo de clula deseado y la recombinacin resultante entre los sitios toxP en estas clulas ocasiona la
inactivacin del locus A blanco especfica de tejido.
deben permitir producir knockouts funcionales. Varias maneras per

miten dirigirse a mRNA especficos para inactivacin y al parecer
todas incluyen la formacin de una molcula de mRNA que es de
doble cadena cuando menos en parte. Ciertos genes son regulados
por RNA antisentido endgenos que se conocen como RNA tem
porales pequeos (stRNA, vase seccin 9.2.3). Al parecer stos
actan enlazndose al transcrito e inhibiendo el procesamiento de
mRNA o la sntesis de protenas. Por tanto una estrategia de inhi
bicin gnica inicial fue la introduccin de RNA antisentido o de
oligonucletidos antisentido en las clulas. Los efectos inhibido
res pasajeros se observan despus de la introduccin directa de es
tas molculas pero es posible lograr una inhibicin permanente
mediante la transformacin de clulas, o animales, con un trans
gen antisentido que sintetiza en forma constitutiva RNA antisen

tido. Este hecho lo demostraron por primera vez Katsuki y colabo
radores (1988) en ratones, quienes tuvieron xito en la reduccin
del valor de protena bsica de mielina a 20% del normal por me
dio de la expresin de un cDNA antisentido contra el gen de pro
tena de mielina y la produccin consecuente de una fenocopia del
mutante shiverer. El RNA antisentido tambin suele expresarse con
el uso de un promotor inducible a fin de regular el crecimiento de
clulas en cultivo (Sklar y cois., 1991).
Al inicio se supuso que el efecto del RNA antisentido era estoiquiomtrico (es decir, se requiere una molcula antisentido pa
ra bloquear la traduccin de un transcrito y despus se destruyen
ambos). Por consiguiente debe ser posible una inhibicin ms po-
594 | CAPTULO VEINTE i MANIPULACIN GENTICA DE CLULAS Y ANIMALES
A ) 1. Uso d e envo dirigido d e genes secuencial para

introducir el sitio loxP ( ) m s un gen m arcad or [m] )
dentro d e dos localizaciones d esead as en diferentes
crom osom as
CEN
TEL
TEL = Q
M i!
12
CEN
TEL-
2. E x p o n e r los c ro m o s o m a s q u e c o n tie n e n lo x P
a re c o m b in a s a C re
B) 1. U so d e l e n vo d irig id o d e g e n e s s e c u e n c ia l
p a ra in tro d u cir el sitio lo x P m s un g e n m a rc a d o r
d e n tro d e d o s lo c a liza c io n e s d e s e a d a s q u e fla n q u e a n
la regin c ro m o s m ic a a elim in a r ( v w )
CEN
TEL
2. P e rm itir q u e o c u rra re c o m b in a c i n
in tra c ro m o s m ic a en p re s e n c ia d e
re c o m b in a s a C re
CEN
=@2 =
CEN
=W
+
TEL
CEN
12
TEL
15
m-
TEL
12/15
TEL
* 1 5 /1 2
TEL
Fig. 20-11. La ingeniera cromosmica puede realizarse por medio de sistemas Cre-/oxR
A) Uso de insercin dirigida de sitios loxP para facilitar una translocacin cromosmica. Vase Smith y colaboradores (1995) para un ejemplo prctico.
B) Uso de la insercin dirigida de sitios loxP para permitir el modelado de una microdelecin mediante recombinacin intracromosmica. Vase RamrezSols y colaboradores (1995) para un ejemplo prctico y otros ejemplos de recombinaciones intracromosmicas.
tente si la molcula inhibidora se recicla, de manera que muchos

transcritos se destruyan antes que se degrade por s misma. sta
es una ventaja percibida de las ribozimas, enzimas de RNA que
segmentan catalticamente molculas de RNA (seccin 21.6). Se
disearon constructos en los que se incorpora un centro catalti
co de ribozima dentro de un transgen antisentido para facilitar la
destruccin de transcritos especficos. Estos constructos se utili
zan mucho en lneas celulares, en especial para estudiar la inhibi
cin de oncogenes y combatir la infeccin por HIV (vase Welch
y cois., 1998), pero slo se expresan de manera infrecuente en ra
tones transgnicos. Un ejemplo til es la inhibicin dirigida de
glucocinasa de mRNA especficamente en clulas (3 pancreticas
mediante la expresin de un transgen de ribozima de glucocinasa
antisentido controlado por el promotor de insulina, lo que crea
un modelo de diabetes (Efrat y cois., 1994). En fecha reciente se
desarrollaron ribozimas cuya actividad puede controlarse por mo
dulacin alostrica (llamadas maxizimas) y se usaron para inhibir
de modo condicional la expresin gnica (Kuwabara y cois., 2000;

Famulok y Verma, 2002).
Como hecho sorprendente, al parecer en la mayor parte de los ca
sos los constructos de ribozima no se desempean mejor que los
RNA antisentido correspondientes que carecen del centro cataltico
ribozima, lo que sugiere que el RNA antisentido puede tener un
efecto ms potente de lo que cabra predecir slo por el enlace estoiquiomtrico. Un indicio respecto a la base de este fenmeno es la ca
pacidad, en algunos casos, del RNA en sentido que se expresa en
clulas de mamferos para inhibir la expresin de un gen endgeno
correspondiente, un fenmeno que se conoce como cosupresin
(Bahramian y Zabl, 1999). La cosupresin est bien documentada
en plantas y parece que incluye la formacin de especies aberrantes
de RNA que son parcialmente de doble cadena. Las investigaciones de
la capacidad del RNA antisentido y el RNA en sentido para silen
ciar genes en el nematodo C. elegans condujeron a descubrir un fe
nmeno nuevo denominado interferencia por RNA en la que la
Cuadro 2 0 -2 . Resumen de mtodos para interferir con la expresin gnica endgena sin mutacin del gen blanco
Interferencia a nivel del RNA
Interferencia a nivel de la protena
RNA antisentido
Dominantes negativos
Oligonucletidos antisentido
Anticuerpos, intracuerpos
Ribozimas o maxizimas
Aptmeros, intrmeros
Desoxirribozimas
RNA en sentido (cosupresin)
dsRNA (interferencia por RNA)
siRNA (interferencia por RNA)
20.3 i USO DE LA TRANSFERENCIA GNICA PARA ESTUDIAR IA EXPRESIN Y LA FUNCIN GNICAS i 595
introduccin simultnea de RNA en sentido y antisentido corres

pondiente a un gen particular condujo a un silenciamiento genico po
tente, de larga duracin y muy especfico (Fire y cois., 1998). La
interferencia por RNA es un mecanismo de defensa celular muy
conservado, que tambin se observa en clulas de mamferos (los hu
manos entre ellos). Se estimula por la presencia de RNA de doble
cadena (dsRNA) y origina la degradacin de mRNA de cadena
nica que tiene la misma secuencia que la molcula inductora.
El mecanismo de interferencia por RNA es complejo y com
prende la degradacin de la molcula de dsRNA en dplex cortos,
de unos 2 1 a 2 5 p b d e largo, mediante una endonucleasa especfi
ca de dsRNA llamada Dicer (fig. 20-12). Los dplex cortos se co
nocen como RNA de interferencia pequeo (siRNA). Estas
molculas se enlazan con el mRNA correspondiente y ensamblan
una endonucleasa de RNA especfica de secuencia denominada
complejo silenciador inducido por RNA (CSIR) que muestra
una eficacia extraordinaria y reduce el mRNA de la mayor parte de
los genes a valores no detectables. Cabe destacar que se sabe que la
misma enzima Dicer procesa los RNA temporales pequeos antes
comentados que interfieren con la expresin de genes endgenos.
En la actualidad se identifican molculas de RNA similares, que se
supone que tienen funciones reguladoras endgenas, en muchos
otros organismos, aun en los humanos, y se describen como microRNA (mi RNA, vase seccin 9.2.3). Se cree que las diferentes ac
tividades de los micro-RNA (bloqueo de la traduccin) y los RNA
de interferencia pequeos (degradacin cataltica) pueden reflejar
la estructura de sus precursores y las enzimas que los procesan an
tes de Dicer. Los micro-RNA son de cadena nica y derivan de d
plex imperfectos que abultan y forman asas, en tanto que los
siRNA son de doble cadena y suelen derivarse de dplex perfectos
(Pasquinelli, 2002, Voinet, 2002). Es posible que ocurra cierta in
teraccin entre estas vas (fig. 20-12).
El RNA de interferencia puede emplearse tanto en clulas como
en embriones porque es un fenmeno sistmico -al parecer los siRNA
son capaces de moverse entre clulas de manera que el dsRNA que
se introduce en una parte del embrin puede ocasionar silencia
miento en la totalidad del mismo. Del mismo modo que se in
troduce dsRNA directamente en clulas (mediante transfeccin) o
embriones (por inyeccin u otros mtodos), es posible expresar
transgenes dobles para los RNA en sentido y antisentido o un
constructo de repeticin invertida que genera RNA en horquilla
que acta como sustratos para Dicer.
La introduccin o expresin de molculas largas de dsRNA es
adecuada para el silenciamiento gnico en la mayor parte de los
mmales, en embriones de mamferos y en lneas celulares embrio- arias. Sin embargo, la respuesta de interfern, que es una resruesta general (no especfica de secuencia) a molculas de dsRNA
unos 30 pb de largo, oculta los resultados de la interferencia por
RNA en clulas de mamferos adultos. Este problema suele evitar
se mediante la administracin directa de siRNA sintetizados en for; qumica o enzimtica, o por la expresin de minitransgenes, por
: general basada en genes endgenos que producen RNA peque
ro? p. ej., el gen U6 snRNA). Durante los tres ltimos aos la injcrferencia por RNA emergi de una oscuridad relativa para
invertirse en el medio disponible ms prometedor para el anlisis
-;onal de alto rendimiento en clulas y animales (vase ms adez-ii , y en la actualidad promete formar la base de una nueva cla* completa de agentes teraputicos (seccin 21.6). Tuschl y
: --j-.i.-ct '2002) presentan una revisin general til de la interfepor RNA y sus aplicaciones.
La funcin gnica tambin puede bloquearse a nivel de

protenas
Aun si un transcrito sobrevive y se traduce, es posible bloquear la
funcin gnica a nivel de las protenas y el resultado es una fenoco
pia de prdida de funcin. Si el producto del gen endgeno blanco
funciona como un multmero, quiz sea factible producir una ver
sin mutante dominante negativa del gen que puede expresarse a
valores altos en la clula o en animales transgnicos. En este caso las
copias funcionales de la protena se secuestrarn dentro de comple
jos inactivos. Este mtodo se aplica de manera amplia para blo
quear funciones de receptores porque muchos de ellos funcionan
como dmeros (p. ej., Amaya y cois., 1991).
De otro modo puede ser posible expresar un anticuerpo que re
conoce la protena blanco y la neutraliza. La inactivacin funcional
puede lograrse mediante la introduccin directa de anticuerpos en
la clula o el animal, o por expresin del anticuerpo de un transgn, en cuyo caso suele denominarse intracuerpo (Richardson y
Marasco, 1995). Tambin pueden enlazarse oligonuclotidos de
DNA o RNA a protenas e inhibir su actividad en una forma espe
cfica. Estas se conocen como aptmeros, o si se expresan dentro
de la clula, intrmeros (Famulok y cois., 2001).
20.3
Uso de la tran sferen cia gnica

para estudiar la expresin y la
funcin gnicas
20.3.1 La expresin y la regulacin gnicas pueden

investigarse por medio de genes rastreadores
Uno de los primeros usos de las lneas de clulas transformadas y de
organismos transgnicos fue el anlisis de la regulacin gnica,
que es la identificacin de las secuencias necesarias para atributos
especficos de la expresin gnica. La regulacin gnica puede in
vestigarse mediante el estudio de la forma en que la delecin de di
ferentes segmentos de DNA corriente arriba del gen, o en ocasiones
en el primer intrn, afecta su expresin. Es claro que el sistema ms
apropiado para estudiar la expresin de genes humanos son las c
lulas de humanos, y una forma lgica de proceder es la introduc
cin de constructos que contienen diferentes cantidades de
secuencias de DNA de flanqueo seguida del anlisis de la expresin
gnica. Sin embargo, esto deja el problema de la manera de seguir
la expresin del gen humano introducido en presencia de un ho
mlogo endgeno que quiz se exprese en la misma clula. A fin de
abordar este problema las posibles secuencias reguladoras se clonan
en un vector comente arriba de un gen rastreador, un gen que pro
duce una protena que puede detectarse y cuantificarse con una va
loracin simple (recuadro 20-4).
La figura 20-13 muestra el mtodo general paia mapear elemen
tos reguladores en lneas celulares. El empleo de diferentes lneas celu
lares, algunas de las cuales expresan el gen endgeno correspondiente,
puede aportar evidencias de elementos promotores que posibilitan la
expresin gnica en lneas celulares permisivas y la impiden en lneas
celulares no permisivas. Asimismo es posible localizar elementos para
expresin gnica inducible valorando diferentes constructos promoto
res en la misma lnea celular en presencia o ausencia de induccin. El
estudio de los patrones de expresin del rastreador en animales trans
gnicos permite realizar un anlisis ms refinado de la expresin gni
ca especfica de clulas ya que identifica elementos que controlan la
596
CAPTULO VEINTE
B)
A)
I I II IIII II III III II III

iii
i i i i iiI Ii j
.........
1
< rd e -
Dicer
Dicer
5 '-p l l l l l l l O H -3'
stRNA/miRNA
5 ' p i n r n r 0 H "3
3 '-H 0 111: - LL P-5' siRNA

I
3 '-H O tt \ / m m p-5 '
i i i i 11 i i i i 11 i 11 i i i i i i i i i i i
mRNA
pjm
1-------y------ 1
3'UTR
Sitio co m p lem en tario
An
Inhibicin d e
trad u cc i n
te s
5 ' - p T r m ^ O H -3'
3'-H O 1 1 I I LLL P -5'
OH-3'
..........i i i i i ..........................................
.1.11
AAA...An
mRNA
.................I I I I I I I I I I I
ULLLLL
C o rte endon ucleoltico

Fig. 20-12. Comparacin de las vas stRNA (miRNA) y siRNA en C. elegans.
Mediante el reconocimiento de tipos especficos de RNA precursores, las protenas relacionadas com o ALG-1/ALG-2 y RDE-1 pueden influir parcialmen
te en el procesamiento por medio de DICER. A) Se piensa que el stRNA (miRNA), que es de cadena nica, forma pares de bases de manera imperfecta
con la UTR 3 ' del mRNA, lo que reprime el inicio de la traduccin. B) El siRNA, que es de doble cadena y tiene un extremo saliente 3 ' de dos nucletdos, se incorpora dentro del complejo de silenciamiento inducido por RNA (CSIR). El siRNA sirve como gua para CSIR y, en el pareamiento de bases
perfecto, el mRNA blanco se corta en la parte media del dplex formado con el siRNA. Es posible que los miRNA que se parearon en forma perfecta
con su blanco se incorporen en el CSIR. Modificado de Voinet (2000) con autorizacin de Elsevier Science.
expresin gnica en tipos de clulas o etapas del desarrollo particula

res. Sin embargo, deben obtenerse resultados similares con varias l
neas transgnicas derivadas de manera independiente a fin de evitar la
interpretacin errnea de patrones de expresin causados por efectos
de posicin (vase seccin 20.2.3).
20.3.2 La funcin gnica puede investigarse generando

mutaciones con prdida de funcin y ganancia
de funcin, y fenocopias
Las funciones gnicas no siempre se establecen mediante
la alteracin o la inhibicin debida a redundancia gentica
Cuando es posible realizar estudios a nivel celular, la interferencia
por RNA se considera el mtodo de eleccin para generar efectos de
prdida de funcin (seccin 20.2.6). Las funciones de varios genes
ya se establecieron mediante interferencia por RNA en cultivos de
clulas de mamferos, entre ellos el gen que codifica la protena
de seleccin vacuolar TsglOl, que se demostr que es esencial para
la gemacin del HIV (Garrus y cois., 2001). Tuschl y Borkhardt
(2002) citan muchos otros ejemplos, inclusive el anlisis de genes
que participan en la divisin celular, la mediacin del DNA, el se
alamiento de clulas y el paso a travs de la membrana. El medio

ms directo para estudiar la funcin de un gen en el contexto de un
organismo completo es el envo dirigido de genes (seccin 20.2.4).
En muchos casos estas mutaciones son en extremo informativas y
pueden revelar muchos datos de la funcin gnica. En la actualidad
se efectan tantos experimentos de knockout gnico en ratones, que se
establecieron bases de datos en Internet para catalogar todos los re
sultados con base en el fenotipo (cuadro 20-3). No obstante, en un
nmero sorprendentemente grande de casos las mutaciones knoc
kout parecen tener muy poco efecto fenotpico. Lo anterior puede
deberse a re d u n d an cia gentica, que es la presencia de otro gen ca
paz de desempear la funcin del gen inactivado. Como resultado,
en ocasiones se requieren knockouts de dos o aun tres genes para de
terminar las funciones precisas de algunos genes.
Un ejemplo informativo se refiere a los genes MyoD y Myf-'j,
que se expresan temprano en el desarrollo del ratn. Los cDNA
clonados correspondientes a estos dos genes tienen una gran capa
cidad para inducir la expresin de protenas especficas de msculo
en muchas lneas celulares distintas. Como ambos genes codifican
factores de transcripcin, al parecer son candidatos excelentes para
reguladores miognicos. Sin embargo, result sorprendente que
cuando se produjeron mutaciones knockout, en ninguno de los ca
sos se observ un fenotipo notable. Al parecer el desarrollo muscu-
20.3
USO DE LA TRANSFERENCIA GNICA PARA ESTUDIAR IA EXPRESIN Y LA FUNCIN GNICAS I 597
Recuadro 20-4. Genes rastreadores para clulas animales

Los genes rastreadores codifican protenas que pueden detectarse y
cuantificarse mediante valoraciones simples y no costosas. Es posible
emplearlos para observar y medir la eficiencia de la transferencia y la ex
presin gnicas, e investigar la localizacin de protenas intracelulares.
Varios genes rastreadores se usan en animales.
El gen cat del transposn coli Tn9 codifica la enzima acetiltransferasa de cloranfenicol, que transfiere grupos acetilo de acetil-CoA al anti
bitico cloranfenicol. Se utiliza un formato de valoracin estndar in vitro
(Gorman y cois., 1982). Se mezclan lisados celulares con cloranfenicol
marcado con 14C, se incuban y luego se separan mediante cromatografa
de capa delgada. La actividad de CAT se determina midiendo las cantida
des relativas de cloranfenicol acetilado y sin acetilar con un contador fosforimager o de centelleo.
El gen lacZ de E. coli codifica la enzima galactosidasa (3, que descom
pone lactosa y compuestos relacionados. Se dispone de varios sustratos
derivativos especializados que incluyen ONPG, que origina un producto
amarillo soluble y se usa para valoraciones colorimtricas in vitro, y X-gal,
que da lugar a un precipitado azul y se emplea en valoraciones in situ
(Hall y cois., 1983). Este gen se utiliza con mayor amplitud con X-gal co
mo un marcador histolgico para mostrar patrones de expresin gnica
en animales transgnicos. El gen gusA de E. coli, que codifica la enzima
glucuronidasa (3, puede emplearse de manera similar.
El gen luc de la mosca de fuego americana (Photinus pyralis) codifica
la enzima luciferasa, que cataliza la oxidacin de luciferina en una reac
cin que requiere oxgeno, ATP y iones magnesio (de Wet y cois., 1987).
La reaccin libera un destello luminoso cuya intensidad es proporcional
lar fue normal en ratones knockout MyoD y se retras un poco en

ratones knockoutMyf-b (Rudnicki y cois., 1992). Tiempo despus se
demostr que los genes tienen funciones equivalentes y cada uno
puede compensar por completo la ausencia del otro. De hecho en
ratones normales los dos factores de transcripcin reprimen mutua
m ente los genes, de manera que el knockout de un gen ocasiona un
incremento compensador en la expresin del otro. El fenotipo me
nor de ratones knockout m y fb refleja el inicio un poco ms tempra
no de la expresin. Los knockout dobles muestran una ausencia
catastrfica de desarrollo muscular y los ratones mutantes mueren
justo despus de nacer a causa de asfixia.
Las funciones gnicas pueden establecerse mediante

experimentos de ganancia de funcin si la dosis, la
actividad o la distribucin del producto gnico son crticas
Cuando las mutaciones con prdida de funcin o fenocopias no
son informativas, pueden ser tiles clulas transformadas y anima
les transgnicos que muestran ganancias de funcin que afectan el
mismo gen. Los genes MyoD y Myf-'b constituyen un caso pertinen
te. Se saba que estos genes codificaban reguladores importantes del
desarrollo muscular por sus efectos en clulas cultivadas. De igual
forma se identificaron muchos oncogenes y se les asignaron funcio
nes con base en que pueden ocasionar la proliferacin incontrola
ble de clulas cultivadas. La ganancia de funcin puede generarse
mediante la expresin excesiva de un producto gnico normal o la
expresin de una versin mutante del gen hiperactiva. En animales
transgnicos tambin pueden ser tiles los experimentos de ganan
cia de funcin. Un ejemplo clsico se refiere al gen Sry, que se de
mostr de manera concluyente que es un determinante mayor del
al valor de actividad de la enzima. Esto puede detectarse con un luminmetro o un contador de centelleo y la valoracin es ms de 100
veces ms sensible que las valoraciones convencionales con CAT, ga
lactosidasa (3 o glucuronidasa 3 . Puesto que la seal luminosa emitida
tambin disminuye con rapidez, la luciferasa puede ser til para vigilar
los cambios rpidos en los valores de expresin gnica. En contraste,
CAT, galactosidasa |3 y glucuronidasa (3 son protenas muy estables, de
manera que pueden determinar con eficiencia cundo se enciende un
gen, pero persisten despus que se apaga. Los genes de luciferasa de
otros organismos tienen actividades un poco diferentes y las reaccio
nes liberan luz a distintas longitudes de onda, lo que permite la vigilan
cia simultnea de varios genes.
El gen glp de la medusa Aequoria victoria codifica la protena verde
fluorescente (PVF), un marcador bioluminescente que emite una fluo
rescencia verde brillante cuando se expone a luz azul o ultravioleta
(Ikawa y cois., 1999). La actividad de PVF se mide cuantificando la emi
sin de luz, pero a diferencia de la luciferasa, la protena no requiere
un sustrato y puede emplearse para valorar los procesos celulares en un
tiempo real. Las protenas de fusin de PVF se utilizan mucho para es
tudiar la localizacin de protenas en la clula y el trnsito de protenas
al interior de las clulas y entre las mismas. Una gama de variedades
de PVF es til para el marcado doble y tambin se dispone de prote
nas fluorescentes de otros colores. Una protena fluorescentes mutante que cambia de fluorescencia verde a roja con el tiempo puede
aplicarse a la caracterizacin de la expresin gnica temporal (Terskikh
y cois., 2000).
desarrollo masculino por su expresin en ratones transgnicos con

dos cromosomas X. Estos ratones, que la naturaleza pretende que
sean hembras, resultaron varones (Koopman y cois., 1991). Otro ti
po de ganancia de funcin es la expresin ectpica, en la que un
transgn se expresa fuera de los dominios espacial o temporal nor
males del gen endgeno correspondiente. Existen muchos ejemplos
tiles de este mtodo que incluyen genes del desarrollo. Por ejem
plo, los genes Hox que se expresan fuera de sus dominios normales
alteran la formacin normal de patrones del embrin y generan de
fectos en las extremidades y el esqueleto (Burke, 2000).
Los experimentos de expresin ectpica tambin pueden ser
tiles para demostrar redundancia gentica. Por ejemplo, los genes
engrailed En-1 y En-2 del ratn son genes contenedores de homeobox que al parecer desempean funciones cruciales en la formacin
del cerebro. El mutante knockout En-1 mostr anormalidades cere
brales importantes como se esperaba, pero de manera sorprenden
te, los knockout En-2 slo tuvieron defectos menores. La expresin
En-1 inicia 8 a 10 h antes que la de En-2, lo que sugiere que la pro
teina En-1 compensa la falta de En-2 en knockouts En-2. A fin de
valorar la posibilidad de redundancia funcional, Hanks y colabora
dores (1995) emplearon una variante del procedimiento knockout
que se conoce como knock-in gnico, en el que el constructo blan
co contena el gen En-2 dentro de una regin de homologa de En-1
(inclusive los elementos reguladores normales En-1). El objetivo
fue reemplazar la secuencia de codificacin En-1 endgena con la de
En-2 para producir ratones con dos genes En-2, uno expresado en la
misma forma que En-1 en embriones normales (vase fig. 20-14).
Puesto que el ratn knockout En-1 resultante tuvo un fenotipo nor
mal, se demostr que el gen En-2 knocked-in desempeaba funcio
nes equivalentes a las de En-1 (Hanks y cois., 1995).
598
CAPTULO VEINTE
-170
+11 (A
( ATG)
+
(*
SR Q PO
NM
I HG F E D
B A
A ctivida d relativa de luciferasa (%)
-211
-9
H n
= 6
-1 0 5 - 9 n
H JA 7 = 3
-2 7 9
-2 7 9
-6 4
-1 4 4
--E
H n =4
--O
-2 7 9 -2 0 2
-------1n = 5
-4 ] n = 4
P ro m o to r m e n o r
| n = 12
Fig. 20-13. Anlisis de delecin de la regin promotora del gen del factor VIII humano.
Si todos los elementos necesarios para la expresin del gen humano estn presentes, habr una expresin de alto nivel del gen rastreador cuando el
constructo se transfecta en un tipo apropiado de clula humana cultivada. A continuacin puede elaborarse una serie de constructos de delecin progre
sivos mediante enzimas de restriccin o la enzima exonucleasa III de E. cot que digiere desde el extremo 3' del DNA de doble cadena. De otro modo
puede disearse una serie de productos de amplificacin de PCR cubriendo las regiones de inters y luego clonados en un vector de expresin apropia
do. Las barras de la izquierda indican secuencias de tamao variable corriente arriba del gen del factor VIII humano (F8). Los cuadros de la parte supe
rior sealan secuencias corriente arriba que se piensa que son sitios de unin de protenas. Los cuadros de la derecha indican el nivel de actividad de
luciferasa en relacin con la secuencia Intacta, con base en n experimentos de replicacin. A partir de la actividad de luciferasa observada en las dife
rentes clonas de expresin, el mapa de delecin muestra que todos los elementos necesarios para la actividad mxima del promotor se localizan en la
regin de -2 7 9 a - 6 4 , que incluye sitios de enlace de protenas B, C y D. Reproducido de Figueiredo y Brownlee (1995) con autorizacin de The Ame
rican Society for Biochemistry and Molecular Biology.
20.3.3 Los anlisis de la funcin gnica a gran escala

por mutagnesis insercional e interferencia
sistemtica del RNA son partes fundamentales
de la genmica funcional
Los experimentos descritos se disearon para investigar la expresin
y la funcin gnicas en forma individual. Sin embargo, como se co
menta en el captulo 19, la inmensa cantidad de informacin de se
cuencias y la lista al parecer interminable de genes no caracterizados
que result de los proyectos del genoma determinan que hoy en da
sea necesario estudiar las funciones de los genes a escala de la exten
sin d el genoma. La mutagnesis de saturacin se us para anlisis
funcional durante muchos aos y estos estudios se basaron en el
empleo de radiacin o mutgenos qumicos potentes, como la etilnitrosourea (ENU) y el etilmetanosulfonato (EMS), para generar
poblaciones de mutantes que representaban cada gen en el genoma.
Hasta fecha reciente era usual dirigirse a aspectos bioqumicos, fisio
lgicos o del desarrollo especficos de la especie en investigacin y la
mayor parte de los mutantes se descartaba. Sin embargo, en los l

timos aos el cambio de enfoque de estudios de genes individuales
a la genmica funcional modific el concepto fundamental y en la
actualidad se realizan programas de mutagnesis en toda la exten
sin del genoma con el fin de reunir tantos mutantes que afectan
tantos procesos biolgicos como sea posible. El objetivo final es en
samblar una genoteca de mutantes amplia como un recurso central
para todos los investigadores. Por ejemplo, los primeros programas
de mutagnesis con ENU en toda la extensin del genoma en rato
nes comprendieron la seleccin de una cifra pasmosa de 40 000 l
neas de ratones para fenotipos con importancia mdica, inclusive
bioqumica clnica, alrgica, inmunolgica, respuesta a estmulos fi
siolgicos, defectos del desarrollo y la conducta (Hrabe de Angelis y
Balling, 1998; Hrabe y Angelis y cois., 2000; Nolan y cois., 2000).
Estos programas se encuentran en curso y los resultados se actualizan
con regularidad en los sitios de red que se listan en el cuadro 20-3.
Los mutgenos qumicos y la radiacin tienden a inducir muta
ciones de punto. Si bien stas pueden ser realistas porque repre
20.3 j USO DE LA TRANSFERENCIA GNICA PARA ESTUDIAR LA EXPRESIN Y LA FUNCIN GNICAS
599
Cuadro 2 0 -3 . Recursos en Internet para transgnesis y mutagnesis de mamferos, y trampas gnicas en animales y selecciones
de RNAi a gran escala
Recurso
URL
Ratones transgnicos y recursos de mutagnesis dirigida

Jackson Laboratory, base de datos de ratones mutantes por envo dirigido de genes
http://jaxmice.jax.org/index.shtml
TBASE, base de datos de ratones mutantes transgnicos y por envo dirigido

de genes, conservados por el Jackson Laboratory
http://tbase.jax.org
Base de datos de knockout gnico Frontiers en Science
http://www.bioscience.org/knockout/knochome.htm
Base de datos de knockout del ratn BioMedNet
http://biomednet.com/db/mkmd
Recursos de mutagnesis con ENU en ratones

Mutagnesis con ENU en el proyecto de genoma humano alemn
http://www.gsf.de/ieg/groups/enu-mouse.html
Base de datos de mutagnesis con ENU, MRC mutabase
http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/mutabase
Recursos de trampas gnicas (para ratn y Drosophila,)

German Gene Trap Consortion
http:/tikus.gsf.de
Lexicon Genetics
http://www.lexgen.com/omnibank/omnibank.htm
Proyecto Berkeley del genoma de Drosophila
http://www.fruitfly.0rg/p disrupt/index.html
Recursos de interferencia por RNA en C. eiegans

Informacin generai
http://www.wormbase.org
RNAi
http://www.rnai.org
sentan los tipos de mutaciones que causan muchas enfermedades

en humanos, un problema importante es que la identificacin de
los cambios estructurales precisos en el DNA de un animal mutante aislado suele requerir un mtodo de clonacin posicional labo
rioso. La alternativa consiste en utilizar la transferencia gnica
como un mtodo de mutagnesis. En este caso el mutgeno es una
secuencia de DNA insercional, un transgen por cualquiera otro
nombre, que ocasionalmente se integra en un gen preexistente y lo
altera. Esta estrategia tiene una ventaja importante sobre la mutagnesis por radiacin y la qumica: deja un marcador de secuencia
en el locus que se muta. Como resultado, es posible la caracteriza
cin molecular rpida del locus mutado (recuadro 20-5). En Dro
sophila se utilizan elementos P como mutgenos insercionales y se
introducen de modo directo en la lnea germinal (seccin 20.2.2).
La clulas ME proveen un medio para introducir estas mutaciones
en el ratn, ya que puede emplearse la integracin aleatoria de se
cuencias de DNA a fin de recuperar inserciones en cualquier n
mero de genes. No obstante, como slo alrededor de 3% del
genoma del ratn est representado por genes, la mayor parte de los
acontecimientos de insercin aleatorios no causa alteracin gnica.
El mtodo de atrapamiento gnico se dise para incrementar
la posibilidad de recuperar inserciones en genes (Evans y cois.,
1997). El principio bsico es que el transgen contiene un gen ras
treador defectuoso o un marcador seleccionable que slo se expre
sa si el constructo se inserta dentro de un gen. Por ejemplo, el
transgen puede comprender un gen rastreador con un sitio aceptor
de empalme corriente arriba. Si ste se integra dentro de un gen,
se comporta como un exn adicional. Cuando el gen interrumpido se
transcribe, el gen rastreador transcrito se empalma a los exones co
rriente arriba y, cuando se traduce, debe conservar su actividad ras
treadora. La ventaja de este mtodo es que el gen rastreador se

expresa en el mismo patrn que el gen interrumpido, aun en el es
tado heterocigoto, de modo que puede obtenerse informacin res
pecto al gen (su perfil de expresin) aun si la interrupcin es letal
en s misma en el estado homocigoto. Una desventaja radica en que
la expresin del rastreador se basa en la expresin del gen interrum
pido, por lo que si el gen no se expresa tampoco el rastreador lo
hace. Este problema se abord mediante la expresin del gen ras
treador a partir de su promotor (constitutivo), pero haciendo que
la poliadenilacin dependa del gen circundante (vase fig. 20-15).
Tal enfoque se aplic a gran escala y un informe reciente describe
la alteracin y la identificacin de secuencias de 2 000 genes en c
lulas madre embrionarias de ratn (Zambrowicz y cois., 1998). Se
encuentran en curso dos iniciativas importantes en ratones, una or
ganizada por el Germn Gene Trap Consortium, cuyo fin es produ
cir y caracterizar 20 000 lneas de genes atrapados (Wiles y cois.,
2000), y otra establecida por la compaa estadounidense Lexicn
Genetics. En ambos casos se mantienen bases de datos de secuencias
de flanqueo insertadas. Pueden consultarlas los investigadores que
deseen identificar un gen interesante en sus experimentos si desean
obtener lneas de ratones en las que ese gen se inactivo. Tambin se
encuentra en curso un programa de atrapamiento gnico en Drosophila (Berkeley Drosophila Genome Project, vase Spradling y cois.,
1995, 1999), que no slo considera la alteracin gnica mediada
por elemento P, sino tambin la activacin gnica mediada por ele
mento P. El ltimo mtodo (marcado de activacin, recuadro 20-5)
comprende el uso de elementos P que incorporan un promotor po
tente dirigido que ve hacia afuera. Una vez integrados, estos constructos activarn cualquier gen endgeno adyacente. Esto permite
utilizar la mutagnesis insercional para generar mutaciones tanto
600 i CAPTULO VEINTE I MANIPULACIN GENTICA DE CLULAS Y ANIMALES
T ran scrip ci n
PA
n*
-j
loxP
|---------i-------/ w w w \ G en En-1
's
endgeno
lxP
-) neo M
Z 3 -------------b-------------
V e c to r
knock-in
E n-2
T ran scrip ci n
-----------*
loxP
pA
loxP
K > C Z >
1 .
_ /W v N ^ v V \
P ro m o to r
En-1
Fig. 20-14. El mtodo knock-in gnico reemplaza la actividad de un gen cromosmico por la de un gen introducido.
El gen En-1 que se muestra en la parte superior tiene dos exones y las secuencias de codificacin se muestran con cuadros llenos. Tambin se sea
lan su sitios promotor (P) y de polladenilacin (pA). El vector del gen blanco (vector knock-in ) contiene secuencias del gen En-1 clonado que com
prenden una secuencia corriente arriba a que alberga el promotor En-1 y un segmento interno b que abarca el extremo 3' del exn 1, el intrn nico y
la secuencia de codificacin 5' del exn 2. La secuencia de codificacin del gen En-2 separa estas dos secuencias. Dos casetes marcadores incluyen
un gen de cinasa de timidlna (tk) y un gen de resistencia a neomicina (neo), ambos impulsados por un promotor de cinasa de fosfoglicerato (que se
elige porque la cinasa de fosfoglicerato se expresa en clulas ME). El gen neo est flanqueado por secuencias loxP. El resultado del procedimiento diri
gido al blanco es el reemplazo de las secuencias endgenas a y b pero la secuencia de codificacin 5 ' del gen En-1 se elimina. El gen En-2 knockedin es controlado porel promotor En-1 (Hanks y cois., 1995). Ntese que el trmino knock-in" tambin se aplica a cualquier procedimiento en el que
un gen endgeno se inactiva por insercin de un nuevo gen que despus se expresa, aun si el ltimo tiene como fin servir como un gen rastreador co
mo iacZ.
Recuadro 20-5. Vectores complicados utilizados para mutagnesis insercional

Cualquier secuencia de DNA puede usarse como un vector de insercin y
en tanto la secuencia no se encuentre ya en el genoma husped, emplear
se como marcador para identificar el gen interrumpido en hibridacin sim
ple o en valoraciones basadas en reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Sin embargo, la inclusin de ciertas caractersticas adicionales
puede aadir funcionalidad a los vectores de insercin y revelar Informa
cin adicional respecto al gen interrumpido y su producto, o inclusive ayu
da a clonar secuencias de flanqueo que rodean el inserto.
Atrapamiento gnico. El vector de insercin incluye un gen rastreador
como IacZ corriente abajo de un sitio aceptor de empalme, de manera
que el gen rastreador slo se expresa si el vector se integra dentro de
un gen. Una variante del atrapamiento gnico, tambin llamada atrapa
miento de promotor, comprende un gen rastreador virgen sin un promo
tor. ste slo se activa si se inserta corriente abajo de un promotor
activo (Evans y cois., 1997). En ambos casos la expresin del gen ras
treador depende del gen interrumpido. La ventaja es que el gen rastrea
dor (que puede aportar informacin funcional) simula el patrn de
expresin del gen interrumpido pero la desventaja consiste en que los
genes no expresados no tienen expresin de rastreador. Esta restriccin
puede eliminarse expresando el gen rastreador de un promotor consti
tutivo pero tornando la poliadenilacin dependiente del gen interrumpi
do (Zambrowicz y cois., 1998).
Atrapadores intensificadores. El vector de insercin incluye un gen ras
treador como IacZ corriente abajo de un promotor mnimo (por lo general
una caja TATA) que slo apoya la transcripcin de fondo propia. Cuando
el constructo se integra dentro de la influencia de un intensifcador end
geno, el gen rastreador simula la expresin del gen controlado por ese ntensificador (OKane y Gehring, 1987). Por la distancia larga en que los
intensificadores pueden actuar, esta estrategia rara vez es til para iden
tificar genes, pero los intensificadores especficos de clulas pueden
aprovecharse para otros propsitos, como el control de la expresin Cre
(vase seccin 20.2.5) o la activacin de un marcador seleccionable ne
gativo para ablacin celular (recuadro 20-2).
Marcadores de activacin. El vector de insercin contiene un promotor
potente que ve hacia afuera. Si el elemento se integra adyacente a un gen,
ese gen ser activado por el promotor, lo que tal vez genere un fenotipo
de ganancia de funcin a travs de expresin tpica o excesiva (Rorth y
cois., 1998).
Rescate de plsmido. El vector de insercin contiene el origen de replicacin y el marcador de resistencia a antibiticos de un plsmido bacte
riano. Esto significa que si el DNA genmico de la lnea de insercin
transgnica se digiere con una enzima de restriccin, se diluye y circula
por medio de ligasa de DNA, el inserto y sus secuencias de flanqueo in
mediatas formarn un plsmido funcional. Si todo el conjunto de crculos
de DNA genmico en masa se utiliza a fin de transformar bacterias, slo
las clulas que contienen el plsmido sobrevivirn. sta es una forma r
pida de clonar e identificar las secuencias gnicas que rodean el sitio de
insercin (Perucho y cois., 1980).
20.4 j CREACIN DE MODELOS DE ENFERMEDAD MEDIANTE TRANSFERENCIA GNICA Y TECNOLOGA.. . I 601
de ganancia como de prdida de funcin. El cuadro 20-3 presenta

las fuentes de Internet para todos los programas anteriores.
La interferencia por RNA (seccin 20.2.6) es otro mtodo
que puede ser til para la anotacin funcional de alto rendimien
to. Hasta ahora este mtodo de k n ock -dow n gnico slo se apli
c a escala global en el nematodo C. elegans, pero mostr un gran
potencial en clulas de mamferos y quiz sea el nico adecuado
para la anotacin rpida y directa de genes humanos, cuando
menos aquellos cuyas funciones pueden determinarse a nivel ce
lular. Se llevaron a cabo varios experimentos a gran escala en C.
elegans que comprendieron la sntesis de miles de molculas de
dsRNA y su administracin sistemtica a gusanos por microinyeccin, remojamiento o alimentacin (Gonczy y cois., 2000;
Maeda y cois., 2001; Fraser y cois., 2000). En fecha ms reciente se
realiz una seleccin heroica en la que se generaron casi 17 000
cepas bacterianas, que expresaba cada una un dsRNA diferente,
lo que representa 86% de los genes del genoma de C. elegans
(Kamath y cois., 2003). Ms de 10% de esos gusanos mostr
fenocopias letales reproducibles de infertilidad, crecimiento o
desarrollo.
20.4
C reacin de m odelos
de enferm edad m ediante
tran s fe re n c ia gnica y tecnologa
de envo dirigido de genes
Los modelos de enfermedades en humanos tienen importancia cru

cial en la investigacin mdica. En particular los modelos animales
permiten realizar el examen detallado de la base fisiolgica de la en
fermedad y ofrecen un sistema de evidencias de primera lnea para es
tudiar la eficacia de tratamientos novedosos antes de efectuar pruebas
clnicas en humanos. Los cultivos celulares constituyen un recurso al
ternativo aunque ms limitado para el modelado de enfermedades,
sobre todo en trminos de investigar los efectos bioqumicos de la en
fermedad y la respuesta a frmacos. Aunque para muchos trastornos
individuales en humanos no se cuenta con un buen modelo animal,
se dispone de algunos modelos animales representativos de todas las
clases principales de afecciones en humanos: enfermedades determi
nadas genticamente, afecciones causadas por agentes infecciosos,
cnceres espordicos y padecimientos autoinmunitarios (vanse Lei-
T ran scrip ci n
pA
E1
E2
E3
H
P r o m o to r
P o lia d e n ila c i n +
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__________ / V v V W S A
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P ro m o to r+
P o lia d e n ila c i n -
In te g ra c i n del tra n s g e n
y e x p re s i n d e m R N A
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... 8
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E3 E4
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l A A A A A A ...A n
S e le c c i n p o r a c tiv id a d d e l g en ra s tre a d o r
S e le c c i n m e d ia n te el g en m a rc a d o r
Fig. 20-15. El atrapamiento gnico usa un transgen de expresin defectuosa para seleccionar acontecimientos de integracin cromosmica que
ocurren dentro de un gen o cerca del mismo.
Se muestra un gen de un espcimen de clula husped con los cuatro exones (E1 a E4) en la parte superior junto con su promotor (P) y la seal de poliadenilacin (pA). Tambin se muestran dos posibilidades para un vector de atrapamiento clnico. El transgen 1 incluye un gen rastreador que carece de
un promotor. Tiene dos secuencias exnicas a y b, una seal de poliadenilacin (pA) y una secuencia corriente arriba que contiene una secuencia
aceptora de empalme (AE). En este ejemplo el transgen 1 se integra en el intrn 1 del gen de la clula husped. Durante la transcripcin del promotor
endgeno la secuencia aceptora de empalme ayudar a que los exones del transgn se empalmen con la secuencia del primer exn del gen endgeno,
lo que produce un transcrito de fusin. La seleccin se basa en que este transcrito tiene una actividad funcional rastreadora (vase Evans y cois., 1997).
El transgen 2 tiene un gen marcador (resistencia a frmacos, p. ej., /V-acetiltransferasa de puromicina) aunado a un promotor que funciona en clulas
madre embrionarias (ME) (casi siempre un promotor de cinasa de fosfoglicerato) y una secuencia donadora de empalme corriente abajo, pero carece
de una seal de poliadenilacin. De nuevo la integracin tiene como fin permitir la expresin pero en esta ocasin del promotor del transgen, y la se
cuencia donadora de empalme ayuda a que el transcrito de RNA se empalme a exones huspedes corriente abajo.
602
CAPTULO VEINTE
terycols., 1987; Darling y Abbott, 1992; Clarke 1994; Bedell y cois.,

1997). Algunos modelos animales de enfermedades en humanos se
originaron en forma espontnea; otros se produjeron de manera arti
ficial por diversas vas (cuadro 20-4). hasta hace poco tiempo la ma
yor parte de modelos de enfermedades en animales disponibles la
constituan los que surgieron de modo espontneo o que se indujeron
en forma artificial mediante mutagnesis aleatorias. En fecha ms re
ciente las tecnologas de envo dirigido de genes y transgnicas pro
porcionaron medios directos para obtener modelos de enfermedades
en animales y celulares, y las mutaciones dirigidas en el ratn son par
ticularmente valiosas. Es de inters que cada vez sea ms claro que los
fenotipos de enfermedad debidos a mutaciones comparables en hu
manos y ortlogos de ratn con frecuencia muestran diferencias con
siderables (seccin 20.4.6).
20.4.1 Modelado de la patognesis de enfermedades y

tratamiento farmacolgico en cultivos de clulas
Muchos aspectos de la patognesis de una enfermedad tienen un
componente celular que puede estudiarse con efectividad ex vivo.
Los ejemplos abarcan los defectos de reparacin del DNA de la xerodermia pigmentosa y la anemia de Fanconi, las caractersticas de
envejecimiento celular prematuro del sndrome de Werner, la desor
ganizacin citoesqueltica que se observa en la neurofibromatosis y,
por supuesto, la proliferacin incontrolable del cncer. Cuando estos
fenotipos estn presentes, es ms fcil desarrollar modelos celulares
que animales porque los defectos de ganancia de funcin pueden mo
delarse mediante la simple transferencia de un transgn dominante
que causa la enfermedad dentro del tipo de clula apropiado, en tan
to que los modelos de prdida de funcin hoy da pueden desarro
llarse con eficiencia mediante interferencia por RNA. Los modelos
celulares pueden basarse en lneas de clulas humanas y en muchos ca
sos no se requiere un modelo artificial porque es posible aislar clulas
de individuos con la enfermedad correspondiente. Desde luego los
animales son ms apropiados porque proporcionan un contexto de
organismo completo, necesario para estudiar las enfermedades sin fe
notipo celular apreciable (p. ej., temblor esencial). Sin embargo, para
muchas enfermedades pueden utilizarse modelos celulares como una
primera lnea de investigacin que permite seleccionar muchos com

puestos bsico e identificar frmacos candidatos prometedores que se
estudian en modelos animales en una etapa posterior.
20.4.2 Puede ser difcil identificar modelos de

enfermedad en animales generados de manera
espontnea o inducidos por mutagnesis
aleatoria
Modelos espontneos de enfermedad en animales
Los fenotipos humanos mutantes, en especial los que se relacionan
con sntomas de enfermedad obvios, se sujetan a un escrutinio in
tenso: casi todos los individuos que sufren un trastorno que re
quiere asesora mdica. Si presentan un fenotipo no descrito con
anterioridad su caso bien puede referirse a expertos que a menudo
documentarn el fenotipo en la bibliografa mdica. Con base en la
motivacin de los individuos afectados y sus familias, los mdicos
y los investigadores mdicos interesados, y el tamao grande de la
poblacin para seleccin (la poblacin global total actual es de ms
de 6 000 millones de individuos), el proceso de seleccin es nota
blemente eficaz para fenotipos humanos mutantes. En contraste,
muchos fenotipos de enfermedades en animales no se registran. S
lo un porcentaje pequeo de la poblacin animal es cautiva y el re
gistro de fenotipos mutantes espontneos depende en gran parte
del examen de colonias de animales desarrolladas con fines de in
vestigacin y, en menor grado, poblaciones de ganado y mascotas.
Slo es probable que destaquen mutantes con anomalas externas
obvias. A pesar de la dificultad para identificar mutantes espont
neas en animales, varios fenotipos animales se describieron como
probables modelos de enfermedades humanas (vase cuadro 20-5
para algunos ejemplos). En algunos casos el fenotipo mutante ani
mal es bastante similar al fenotipo clnico correspondiente, pero
otros muestran una divergencia considerable a causa de las diferen
cias de especie en las vas bioqumicas del desarrollo (vase Erickson,
1996; Wynshaw-Boris, 1996). Adems las diferencias fenotpicas
pueden dar por resultado diferentes clases de mutacin en locus or
tlogos.
Cuadro 2 0 -4 . Clases de modelos animales de enfermedad

Proceso
Ejemplos
A) Espontneo
Mutacin de lnea germinal -> trastorno hereditario

Mutacin somtica - cncer
B) Intervencin artificial o
generada artificialmente
Apareamiento selectivo para obtener cepas

genticamente susceptibles a enfermedad
Comentarios
Infectar cepas de animales con el patgeno

microbiano importante
Manipular el ambiente para inducir enfermedad sin
causar mutacin
Por ejemplo, la inyeccin de pristane, un aceite

coadyuvante sinttico, en la dermis de ratas produce
un modelo de artritis
Mutagnesis in vivo con un mutgeno potente como rayos X

o mutgenos qumicos potentes como etilnitrosourea (ENU)
Se establecieron programas de mutagnesis qumica

grandes para producir ratones mutantes y peces
cebra (seccin 20.4.2)
Modificacin gentica de clulas en huevos fecundados o

clulas de embrin temprano y apareamiento subsecuente de
animales (tecnologas transgnica y de envo dirigido de genes)
Secciones 20.1 a 20.3
20.4 j CREACIN DE MODELOS DE ENFERMEDAD MEDIANTE TRANSFERENCIA GNICA Y TECNOLOGA.. .
603
Cuadro 20-5. Ejemplos de mutantes espontneas en animales

Mutante en animales
Caractersticas fenotpicas y patognesis molecular
Ratn N0D
Diabtico, pero sin obesidad. Simula la diabetes mellitus dependiente de insulina humana
Ratn mdx
Distrofia muscular ligada a X debida a mutaciones en el gen de distrofina del ratn.

El mutante original mdx tiene una mutacin sin sentido pero el fenotipo es mucho ms
leve que el de la distrofia muscular de Duchenne (DMD)
Perro hemoflico
La mutacin en sentido errneo en el gen canino del factor IX causa prdida completa de
funcin. El homlogo humano es la hemofilia B
Conejo hiperlipidmico hereditario de Watanabe (WHHL)
Hiperlipidmico como resultado de la delecin de cuatro codones del gen de receptor de

lipoprotena de baja densidad (LDLR)\ el homlogo humano es la hipercolesterolemia
familiar
Cerdos ateroesclerticos
Hipercolesterolemia notable. Actividad de receptor de LDL normal pero apolipoprotenas

variantes, inclusive apolipoprotena B
Ratn Splotch
Pigmentacin anormal; la superposicin fenotpica con el sndrome de Waardenburg

sugiere que es un modelo animal para esta enfermedad, lo que se confirm medante la
identificacin de mutaciones en genes homlogos humano y murino PAX
Pez damisela NF
Neurofibromas extensos sugieren que pudo ser un homlogo de la neurofibromatosis

tipo 1 en humanos
Mutagnesis aleatoria por sustancias qumicas y radiacin

Los mtodos clsicos para producir mutantes en animales incluye
ron exposicin controlada a sustancias qumicas mutgenas o a do
sis altas de rayos X. Con estos mtodos se obtuvieron grandes
cantidades de Drosophila y ratones y, como se coment, se llevaron
a cabo selecciones mutgenas eficientes a gran escala tanto en rato
nes como en peces cebra (que ofrecen ciertas ventajas como un
modelo animal; vase recuadro 20-6). Sin embargo, un problema
importante de las mutaciones inducidas por sustancias qumicas o
radiacin es que en esencia se generan en forma aleatoria. Para
identificar un fenotipo mutante de inters es necesario realizar una
seleccin laboriosa para mutantes mediante el examen cercano de
los fenotipos despus de la mutagnesis. Los fenotipos mutantes
descritos en estos estudios, lo mismo que las mutantes espontneas,
muestran una predisposicin clara a fenotipos con anormalidades
externas obvias, que se atribuye a la facilidad para identificarlos. No
obstante, el empleo de estos mtodos permiti crear varios mode
los importantes de enfermedades humanas.
20.4.3 Los ratones tienen una gran utilidad como

modelos animales de enfermedades humanas en
gran parte porque pueden crearse mutaciones
especficas en un locus predeterminado
Se describen fenotipos de enfermedades producidas de manera es
pontnea y artificial en una gama amplia de especies animales con di
ferentes potenciales para modelar enfermedades en humanos. Los
invertebrados, como Drosophila y C. elegans, y aun las clulas de le
vadura, pueden proporcionar ciertos modelos de enfermedad tiles,
que reflejan la existencia de algunas protenas y vas muy conservadas
durante toda la evolucin (vase seccin 3.9.2). Vertebrados distan
tes en trminos evolutivos como el pez cebra ofrecen tambin ciertas
ventajas como organismos modelo y se usan para modelar ciertas en
fermedades en humanos (recuadro 20-6). Aunque cabra esperar que
los mamferos proveyeran mejores modelos de enfermedades, por
una diversidad de razones, los que se relacionan ms de cerca con el

hombre, los grandes monos, no son muy tiles para constituir mo
delos de enfermedades. En su lugar, otros mamferos, en especial los
ratones, se emplean con amplitud a fin de modelar enfermedades de
humanos (recuadro 20-6). En los modelos de enfermedades en ani
males que se inducen de manera artificial por exposicin a sustancias
qumicas mutgenas o radiacin, o que se originan de manera espon
tnea, no existe un control artificial, o es muy pequeo, sobre el
fenotipo resultante y a menudo la identificacin de un modelo de en
fermedad en animales es casual. La gran ventaja de los modelos de
enfermedades en ratones transgnicos/envo dirigido de genes consis
te en que pueden desarrollarse a voluntad modelos de enfermedades es
pecficas. A condicin de que se disponga de las clonas gnicas
importantes, que incluyen genes mutantes en algunos casos, pueden
producirse ratones con una alteracin deseada en un gen blanco se
leccionado. De esta manera es posible modelar todas las principales
clases de enfermedades, trastornos hereditarios, cnceres, trastornos
infecciosos y afecciones autoinmunitarios (cuadro 20-6; Smithies,
1993; Clarke, 1994; Bedell y cois., 1997). En casi todos los casos se
recurre a mtodos transgnicos/envo dirigido de genes para modelar
trastornos gnicos nicos pero cada vez ms se intenta producir
modelos de ratones con enfermedades genticas complejas, como la
enfermedad de Alzheimer, la ateroesclerosis y los efectos de la hiper
tensin esencial (Petters y Sommer, 2000).
20.4.4 Es posible modelar mutaciones con prdida de

funcin mediante envo dirigido de genes y
mutaciones con ganancia de funcin por
expresin de genes mutantes dominantes
Modelado de mutaciones de prdida de funcin en ratones
mediante envo dirigido de genes
Se piensa que muchos fenotipos de enfermedades, en esencia todos
los trastornos que se heredan en forma recesiva y muchos de heren
604
CAPTULO VEINTE
Cuadro 20-6. Ejemplos de modelos de enfermedades humanas en ratones transgnicos o de envo dirigido de genes
Enfermedad humana o fenotipo anormal
Gen
Mtodo para construir el modelo
Fibrosis qustica
CFTR
inactivacin insercional mediante envo dirigido de genes
Talasemia
HBB (globina-)
Inactivacin insercional mediante envi dirigido de genes
Hpercolesterolemia y ateroesclerosis
Genes de apolipoprotena,
por ejemplo, APOE
Inactivacin insercional mediante envo dirigido de genes
Enfermedad de Gaucher
GBA
Sndrome de X frgil
FMR1
Sndrome de Gerstmann-StrusslerScheinker (GSS)
Gen de proteina prin (PRNP)
Integracin del gen prin de ratn mutante
Ataxia espinocerebelosa tipo 1 (AEC1)
SCA1 (ataxina)
Integracin del gen de ataxina humana mutante con repeticin de

tripletos expandida
Enfermedad de Alzheimer
APP (protena precursora

de amiloide-)
Integracin de cDNA de APP mutante de longitud completa bajo

control de un promotor de factor de crecimiento derivado de plaquetas
cia dominante, se deben a prdida de funcin gnica. El medio ms

sencillo para modelar una enfermedad por trastornos gnicos ni
cos de este tipo es preparar un ratn knockout. El primer paso con
siste en aislar el gen ortlogo del ratn y utilizar un segmento del
mismo para knockout el gen endgeno en clulas ME de ratn me
diante el envo dirigido de genes (seccin 20.2.4). Despus de in
yectar las clulas ME modificadas genticamente en el blastocisto
de una madre adoptiva, a fin de continuar el desarrollo, se obtienen
ratones fundadores con la mutacin dirigida en una proporcin
mensurable de sus clulas germinales. Estos ratones pueden apa
rearse entre s y la descendencia seleccionarse en cuanto a la presen
cia de la mutacin deseada y la existencia del alelo de tipo silvestre
por medio de valoraciones de PCR de clulas obtenidas de hemo
rragias de la cola. El fenmeno de envo dirigido de genes preten
de crear un alelo nulo (que carece por completo de expresin
gnica), pero en ocasiones el resultado puede ser una m u ta cin co n
fu g a y el alelo mutante conserva cierta expresin gnica. Por ejem
plo, algunos de los productos gnicos normales pueden obtenerse
mediante empalme aberrante que brinca el segmento de DNA in
sertado. Esto explicara las diferencias en la gravedad de los modelos
de ratn de fibrosis qustica descritos por Snouwaert y colabo
radores (1992), y Dorin y colaboradores (1992). Asimismo pueden
ocurrir variaciones en el fenotipo a causa de genes modificadores por
el uso de distintas cepas de ratones (vase seccin 20.4.6).
Modelado de mutaciones de ganancia de funcin mediante

la expresin de un gen mutante dominante
Este diseo experimental general se utiliza con frecuencia aunado a
la tcnica de microinyeccin pronuclear de transferencia gnica. La
enfermedad a modelar debe ser alguna en la que la presencia de un
DNA introducido sea suficiente por s misma para inducir patog
nesis y puede incluir mutaciones de ganancia de funcin heredita
rias y cnceres espordicos causados por oncogenes. Para modelar
estos trastornos es necesario clonar un gen mutante o disear uno
mediante mutagnesis in vitro si se requiere. Luego el gen mutante
se inserta como un transgen, por ejemplo, por microinyeccin en
oocitos fecundados. Como no es necesario que el gen mutante in
troducido se integre en una localizacin especfica, son suficientes
genes mutantes humanos aunque en algunos casos se emplean ge

nes mutantes de ratn. Los dos ejemplos siguientes ilustran este
mtodo.
Un ejemplo inicial tuvo como fin valorar si la sustitucin de una
leucina que se encuentra en el codn 102 en un gen de prote
na prin en un paciente con sndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) era patgena. Se dise por medios
artificiales una mutacin equivalente en un gen de protena
prin de ratn clonado y el gen mutante se inyect despus en
oocitos fecundados con objeto de producir ratones transgnicos. Estos ltimos mostraron neurodegeneracin espontnea,
que simulaba la que se observa en el sndrome humano (Hsiao
y cois., 1990). Una variedad de otros experimentos en los que se
usaron transgenes de protena prin han sido muy tiles para
comprender los priones (Gabizon y Taraboulos, 1997).
Las repeticiones de tripletos expandidas que causan trastornos
neurodegenerativos (vase seccin 16.6.4) constituyen otro
tipo de mutacin con ganancia de funcin. La ataxia espinocerebelosa tipo 1 (AEC, en ingls SCA1) es un trastorno de
herencia dominante que resulta de la expansin inestable de una
repeticin del tripleto CAG en el gen de ataxina. Se caracteriza
por degeneracin de las clulas de Purkinje del cerebelo, las
vas espinocerebelosas y algunas neuronas del tallo enceflico.
Se produjeron ratones transgnicos mediante la introduccin
de uno de dos transgenes derivados de un promotor especfi
co de clulas de Purkinje: el gen de ataxina humano normal
(SCA1) y un gen de ataxina mutante que contena una repe
ticin CAG expandida. Aunque los dos tipos de transgn se
expresaron, slo los ratones con el alelo expandido desarrolla
ron ataxia y degeneracin de clulas de Purkinje, lo que con
firm la hiptesis de ganancia de funcin (Burright y cois.,
1995).
Modelado de cnceres humanos en ratones

Tambin se dedican grandes esfuerzos a construir modelos de cn
ceres en ratones (vase Ghebranious y Donehower, 1998; Macleod
yjacks, 1999).
20.4 1 CREACIN DE MODELOS DE ENFERMEDAD MEDIANTE TRANSFERENCIA GNICA Y TECNOLOGA.. .
605
Recuadro 20-6. Potencial de animales para el modelado de enfermedades en humanos

Los primates deben proporcionar ios mejores modelos animales de enfer
medades humanas porque se relacionan de manera muy cercana con el
hombre (vase seccin 12.4.2). Los humanos y los grandes monos mues
tran similitudes de desarrollo, anatmicas, bioqumicas y fisiolgicas exten
sas. Sin embargo, es costoso crear primates y el tamao de las poblaciones
en cautiverio es muy pequeo. Tambin influye la sensibilidad pblica. Si
bien en principio algunos se oponen a toda experimentacin en animales,
quienes piensan que se justifica en inters de la investigacin mdica sue
len sentirse ms cmodos con la experimentacin en animales de laborato
rio pequeos como ratones y ratas. Ms importante an, los primates no
son muy adecuados para la experimentacin; tienen una vida comparativa
mente larga y son menos fecundos que los roedores, y por consiguiente es
ms difcil organizar experimentos de crianza. Con base en el rpido desa
rrollo de mtodos teraputicos novedosos para una gama de trastornos
humanos (vase cap. 21), el retraso prolongado necesario para realizar ex
perimentos de pruebas entre primates promovi el estudio de modelos alter
nativos.
Los ratones son los modelos animales de enfermedad humana que ms
se utilizan. Son pequeos y pueden mantenerse en colonias de crianza
hasta cierto punto baratas. Tienen un periodo de vida corto (-2 a 3
aos), un tiempo de generacin breve (-3 meses) y son prolficos (una
hembra promedio producir cuatro a seis camadas de seis a ocho
cras). Puesto que se aparean con facilidad, es posible arreglar proble
mas de apareamiento complejos para producir cepas endogmicas recombinantes y cepas congnicas (Taylor, 1989; vase recuadro 14-2),
y su tiempo de generacin y periodo de vida cortos significan que los
efectos de la transmisin de una mutacin patgena pueden vigilarse
con cierta facilidad a travs de varias generaciones. Como resultado, la
gentica de un ratn de laboratorio se estudi de manera extensa duran
te decenios y se registraron los fenotipos de muchas mutantes (Lyon y
Searle, 1989). La mayor parte de estas mutantes se origin de modo es
pontneo dentro de colonias de crianza. Unas cuantas tambin se pro
dujeron en forma artificial, al inicio mediante mutagnesis con rayos X o
sustancias qumicas pero cada vez ms por mutagnesis de envo diri
gido de genes e insercional. El mapeo con cruzamiento retrgrado interespecifico (Avner y cois., 1988; vase recuadro 14-2) y la disponibilidad
de numerosos marcadores polim rficos (se mapearon alrededor de
- 9 000 marcadores de repeticin de dinucletidos) facilitan el mapeo
de las mutantes de ratn. Puesto que las regiones sintnicas de los genomas del ratn y humano estn bien documentadas (vase fig. 12-11), es
ta informacin es til para identificar trastornos genuinamente homlogos
por gen nico en el ratn y el hombre.
Las ratas son comparativamente grandes y ms accesibles para expe
rimentos fisiolgicos, farmacolgicos y conductuales, en especial en
estudios cardiovasculares y neuropsiquitricos. Tienen un tiempo de ge
neracin ms prolongado (11 semanas) y las colonias de crianza son
ms costosas. Algunas clases de trastornos humanos (p. ej., hiperten
sin y trastornos conductuales) no tienen buenos modelos en ratones y
por tanto se basan en modelos en ratas. Se construyeron mapas genti
cos y fsicos densos del genoma de la rata y en fecha muy reciente se
obtuvo la secuencia del genoma (vase seccin 8.4.4).
Ganancia de funcin. La enfermedad se debe a la activacin

inapropiada de un protooncogn y puede modelarse mediante
el desarrollo de un ratn transgnico. El oncogn apropiado se
introduce en el genoma del ratn por integracin transgnica
simple.
Prdida de funcin. La enfermedad se debe a la inactivacin
de un gen supresor de tumor y puede modelarse mediante la
El pez cebra constituye el modelo ideal del desarrollo de vertebrados ya

que se desarrolla en forma externa, tiene embriones robustos como las
ranas y un intervalo de generacin similar al de los ratones pero produce
40 veces ms descendencia en el mismo periodo, y los embriones son
transparentes como los de Drosophila y C. elegans. La gentica del pez
cebra muestra avances: desde mediados del decenio de 1990 se efectua
ron selecciones de mutantes a gran escala, la tecnologa de transferencia
gnica es rutinaria y en la actualidad se cuenta con mapas genticos y f
sicos densos adems de recursos de marcador de secuencia expresado
(MSE). Los genomas del pez cebra y del hombre muestran un grado mo
derado de sintenia. Muchos de los fenotipos mutantes identificados en
selecciones genticas del pez cebra semejan estados patolgicos huma
nos y proporcionan modelos de enfermedad tiles sobre todo en las
reas de trastornos hemopoyticos, enfermedades cardiovasculares y
afecciones renales. Por ejemplo, el gen sauternes es el ortlogo del pez
cebra del ALAS2 humano, que codifica sintasa de aminolevulinato 8, la
primera enzima en la biosintesis de hem. El mutante del pez cebra prove
y el primer modelo animal de anemia sideroblstlca congnita, que es
causada por la prdida de funcin de ALAS2 (Brownlie y cois., 1998). De
forma similar el gen drcula es el ortlogo del pez cebra del FECH huma
no, que codifica ferroquelatasa, la ltima enzima de la biosintesis de hem.
La mutacin proporciona un modelo para la protoporfiria eritropoytica
(Childs y cois., 2000). En fecha reciente se revisaron otros modelos (Dooley y Zan, 2000). Los genomas del pez cebra y humano muestran ciertas
similitudes aunque, a causa de la divergencia evolutiva considerable en
tre humanos y peces cebra, cabe esperar que la importancia de las mu
tantes del pez cebra para enfermedades en el hombre se limite a
trastornos que afectan vas que estn muy conservadas. Se produjeron
varios mutantes de pez cebra que son buenos modelos de enfermedades
humanas y por consiguiente pueden usarse para estudiar frmacos can
didatos, inclusive modelos de enfermedad de Alzheimer, trastornos de la
biosintesis de hem, cardiopatas congnitas, enfermedad poliqustica del
rin y cncer.
Aunque los invertebrados y las levaduras estn separados de los hu
manos por millones de aos de evolucin, an se conserva un ncleo
de genes y vas esenciales. Por consiguiente los organismos simples
como la levadura Saccharomyces cerevisiae y el nematodo Caenorhabditis elegans constituyen modelos tiles de algunas enfermedades,
cuando menos en cuanto a que proporcionan un sistema de prueba pa
ra frmacos, aun si no el fenotipo total no tiene importancia particular.
Por ejemplo, la va de sealamiento de insulina est conservada por
completo entre humanos y nematodos, por lo que estos ltimos pue
den emplearse como modelos para la diabetes. De igual forma es po
sible modelar en levaduras enfermedades que afectan funciones
celulares muy elementales (como los defectos de la helicasa del DNA
en el sndrome de Bloom). Cabe destacar que tanto la levadura como
C. elegans pueden manipularse como microorganismos y en conse
cuencia seleccionarse en lotes con grupos de compuestos bsicos y
frmacos candidatos.
creacin de ratones knockout por envo dirigido de genes. Por

ejemplo, varios modelos se generaron a travs de la activacin
de los homlogos del ratn de los genes TP53 y RB1 pero
los fenotipos slo muestran una similitud amplia con los feno
tipos humanos correspondientes, el sndrome de Li-Fraumeni
y el retinoblastoma respectivamente (vase tambin seccin
20.4.6).
606 [ CAPTULO VEINTE MANIPULACIN GENTICA DE CLULAS Y ANIMALES
20.4.5 La atencin se dirige cada vez ms al uso de

animales transgnicos para modelar trastornos
complejos
Modelado de trastornos cromosmicos
Se cuenta con pocos modelos de ratn de trastornos cromosmicos
humanos. En algunos casos esto se debe a la conservacin insufi
ciente de sintenia entre las dos especies. Con base en el ejemplo del
sndrome de Down (trisomla 21), el cromosoma 21 humano com
parte una regin sintnica grande con el cromosoma 16 del ratn
(vase fig. 12.11), pero los ratones con trisoma 16 no son mode
los adecuados del sndrome de Down porque mueren in tero. De
hecho no cabra esperar que el ratn con trisoma 16 fuera un buen
modelo de trisoma 21 humana porque los dos cromosomas no son
por completo equivalentes. Los genes en las 2 a 3 Mb distales del
cromosoma 21 humano tienen ortlogos en los cromosomas 17 y
10 del ratn, y algunos genes en el cromosoma 16 del ratn tienen
ortlogos en cromosomas distintos del cromosoma 21 humano. Pa
ra producir un modelo ms adecuado de sndrome de Down en el
ratn la atencin se dirigi a la regin crtica del sndrome de
Down en 21q21.3-q22.2 (que se dedujo de la observacin de los
fenotipos de pacientes con sndromes de Down raro con trisoma
21 parcial). Dentro de esta regin, el gen del m inicerebro humano
en 21q22.2 puede ser un locus que contribuye de manera impor
tante a los defectos de aprendizaje relacionados. Los ratones trans
gnicos en los que un YAC de 180 kb contiene el gen de
m inicerebro humano de 100 kb pero aparentemente ningn otro
gen desarrollan defectos del aprendizaje (Smith y cois., 1997). Reeves y colaboradores (1995) mostraron que un ratn con trisoma 16
segmentaria, Ts65Dn, obtenida mediante los mtodos estndar de
ratones radiados present dficit de aprendizaje y conducta. Kola y
Hertzog (1998) discuten otros modelos producidos en fecha ms
reciente. Cabe esperar que los esfuerzos futuros para modelar tras
tornos cromosmicos aprovechen el envo dirigido de genes utili
zando Cre-ZoxP. Como se describe en la seccin 20.2.5, este sistema
ofrece un gran potencial para la ingeniera del genoma y puede
usarse a fin de preparar translocaciones cromosmicas en posi
ciones definidas o en cromosomas preseleccionados. Tambin cabe
esperar que los YAC transgnicos sean importantes en la investiga
cin de la expresin excesiva de genes en otros trastornos cromos
micos y en afecciones que se deben a dosis gnicas aberrantes en
regiones grandes, como la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth
tipo 1A, causada por expresin excesiva como resultado de una
duplicacin de 1.5 Mb en la regin del gen PMP22 (vase fig.
16-8).
Modelado de enfermedades complejas

El enfoque en gentica humana se desplaza cada vez ms a la com
prensin de la patognesis de enfermedades genticas complejas co
mo ateroesclerosis, hipertensin esencial y diabetes. Estos trastornos
tienen una causa compleja con mltiples componentes genticos y
ambientales. Aunque ya se obtuvieron ciertos modelos valiosos de
animales para algunos de estos trastornos, se espera que en el futuro
los mtodos de envo dirigido de genes proporcionen modelos adi
cionales que se requieren con urgencia (Smithies y Maeda, 1995).
En tanto se identifiquen genes adecuadamente prometedores que
participan en la patognesis, entonces pueden utilizarse experimen
tos de endogamia para obtener distintas combinaciones de genes de
enfermedad entre s y puede valorarse el efecto de los diferentes

fondos genticos en distintas cepas de ratones y de diferentes fac
tores ambientales. Es posible que este mtodo no sea tan atemo
rizante como parece porque se considera cada vez ms que
muchos fenotipos de enfermedades complejas se deben sobre to
do a la combinacin de unos cuantos genes de susceptibilidad
mayor. Por ejemplo, un modelo dignico de espina bfida oculta
se gener de manera casual en la descendencia obtenida de la cru
za de un ratn heterocigoto para la mutacin Patch (Pdgfrb-, recep
tor de factor de crecimiento derivado de plaquetas) con un ratn
homocigoto para la mutacin ondulada (Pax-1) (vase Helwig y
cois., 1995). En otros casos estos modelos dignicos pueden sugerir
posibles tratamientos. Por ejemplo, el cruzamiento de ratones mu
tantes rds (que muestran degeneracin retiniana) con ratones trans
gnicos que expresan Bcl-2 (que protege las clulas de la apoptosis)
condujo a una disminucin de la degeneracin de la retina (Nir y
cois., 1000).
20.4.6 Una variedad de diferencias entre el humano y

el ratn puede dificultar la construccin de
modelos de enfermedades humanas en ratones
No es raro que los modelos de enfermedad en ratones espont
neas o generadas de manera artificial muestren fenotipos que son
muy distintos a los trastornos humanos correspondientes. Por
ejemplo, el envo dirigido de genes para inactivar varios genes supresores de tumor en ratones a menudo produce modelos decep
cionantes en ratones como en los knockout de TP53 y RB1
(retinoblastoma). Suelen presentarse problemas para lograr el
tipo de mutacin deseada, por ejemplo, por la posibilidad de ex
presin con fu ga en knockouts antes comentada, o quiz la expre
sin de un transgen se afecte por diversos factores como los
efectos de la posicin que se sealan en la seccin 20.2.3 que cau
san un fenotipo inesperado. Sin considerar estas posibilidades,
existen varias reas en las que cabra esperar que las diferencias en
tre ratones y humanos resultaran en fenotipos de enfermedad di
vergentes para mutaciones en genes ortlogos (Erickson 1989,
1996: Wynshaw-Boris, 1996).
D iferen cia s en las vas bioq u m icas. Aunque por lo general
las vas bioqumicas en mamferos se conservan bien, se cono
cen algunas diferencias entre las vas de humanos y ratones. Al
parecer la retina humana depende mucho de la funcin preci
sa del producto del gen RB1, pero no las retinas de otros verte
brados. Como resultado, no se describen mutantes espontneas
de retinoblastoma en ratones y esta afeccin no es una caracte
rstica de ratones knockout R bl. Sin embargo, en fecha recien
te se demostr que R bl es necesario para el desarrollo normal
de la placenta en el ratn. Los ratones knockout muestran una
proliferacin excesiva de clulas trofoblsticas y una alteracin
importante de la arquitectura normal del laberinto placentario
que origina disminucin de la vascularizacin y transporte pla
centario reducido (Wu y cois., 2003). Otro ejemplo lo propor
cionaran las vas de degradacin de ganglisido. En tanto que
las mutaciones en el gen humano HEXA, que codifica hexosaminidasa, producen el trastorno de depsito lisosmico grave,
enfermedad de Tay-Sachs, la inactivacin de Hexa ortlogo del
ratn causa la acumulacin anormal de ganglisido en neuro
nas sin los dficit de neuronas motoras o del aprendizaje que se
observan en humanos (Wynshaw-Boris, 1996).
I BIBLIOGRAFA [ 607
D iferen cia s en la s va s d e l d esa rrollo. Las diferencias en las

vas del desarrollo de humanos y ratones no se comprenden
bien pero cabe esperar que sean importantes para algunos sis
temas orgnicos, como el cerebro.
T iem po absolu to. Es posible que la enorme diferencia entre los
periodos de vida promedio de ratones y humanos dificulte mu
cho modelar en ratones ciertos trastornos del hombre en los
que la enfermedad tiene un inicio tardo.
D iferen cia s en e l fo n d o gen tico . Esto refleja la importancia de
los genes modificadores. Casi todas las poblaciones humanas son
exogmicas. Sin embargo, las cepas de laboratorio de ratones
son muy endogmicas. Con frecuencia un fenotipo particular
puede variar de manera notable en diferentes cepas de ratones
por las diferencias en sus alelos en otros locus (genes modifica
dores), que pueden interactuar con el locus de inters. Un
ejemplo til de la importancia del fondo gentico es el ratn
M in neoplasia intestinal mltiple,) que se gener mediante
mutagnesis de ENU y dio por resultado mutaciones en el gen
del ratn Apc. Las mutaciones en el gen humano ortlogo,
APC, causan poliposis adenomatosa del colon y cnceres col-
nicos relacionados, y se considera que el ratn Min es un mode

lo adecuado para estos trastornos. No obstante, el fondo gen
tico modifica notablemente el fenotipo del ratn Min. Por
ejemplo, el nmero de plipos en el colon en ratones que por
tan APCMm depende mucho de la cepa de ratn. Se observa una
variabilidad fenotpica similar en familias humanas en las que
diferentes miembros de la misma familia pueden tener fenoti
pos de tumor muy distintos aunque posean mutaciones idnti
cas en el gen APC. Aunque parte de la variabilidad podra
deberse a factores ambientales, la participacin de genes modi
ficadores se sospecha con firmeza. El ratn Min proporciona un
sistema gentico bien definido para mapear e identificar genes
modificadores (Dietrich y cois., 1993; MacPhee y cois., 1995).
La reciente conclusin de las secuencias del genoma del ratn y la
rata identific varios genes humanos que al parecer no tienen co
rrespondientes en roedores. Los ejemplos incluyen el gen seudoautosmico SHO X (cuyas deficiencias sustentan el sndrome de
Leri-Weill y pueden contribuir en forma significativa al sndrome
de Turner; vase Clement-Jones y cois., 2000) y el gen del sndro
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CAPTULO
VEINTIUNO
Nuevas conductas para

el tratam iento de enferm edades
21.1
El tratam iento de una enfermedad gentica y la teraputica

gentica de una afeccin no son lo mismo
612
21.2
Tratamiento de anormalidades genticas
612
21.3
Uso del conocimiento gentico para mejorar los tratamientos

existentes y desarrollar nuevas teraputicas convencionales
612
21.4
618
21.5
Mtodos para insertar y expresar un gen en una clula

o tejido blanco
619
21.6
Mtodos para reparar o inactivar un gen patgeno

en una clula o tejido
627
21.7
Algunos ejemplos de intentos de teraputica gnica humana
628
Recuadro 21-1 Informe del Panel de los NIH de 1995 sobre teraputica gnica
(informe Orkin-Motulsky)
Recuadro 1 de tica tica de la clonacin humana

Recuadro 2 de tica Teraputica con lnea germinal y tratamiento gnico somtico
Recuadro 3 de tica Diseo de nios
621
616
619
62 2
612
2 1. 1
CAPTULO VEINTIUNO
NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
El tra ta m ie n to de una enferm edad

gentica y la te ra p u tic a gentica
de una afeccin no son lo m ism o
Al llegar al final de este libro, un captulo sobre el tratamiento de

be considerar de forma razonable dos temas bastante diferentes:
Tratamiento de una enfermedad gentica
Teraputica gentica de una afeccin
Esta ltima tiene a su vez varias facetas:
Genotipificacin de individuos para predecir su patrn de res
puestas favorables y adversas a los tratamientos farmacolgicos.
Uso del conocimiento de la gentica y la biologa celular para
reconocer nuevos blancos para el desarrollo de frmacos.
Empleo del conocimiento sobre gentica y biologa celular pa
ra desarrollar teraputicas basadas en clulas.
Uso de tcnicas genticas para producir frmacos, vacunas y
otros agentes para el tratamiento de enfermedades.
Empleo directo de las tcnicas genticas para el tratamiento de
la enfermedad.
Estos temas representan la mayor parte de la investigacin mdica
del siglo XXI. Se requeriran varios libros, escritos por grupos de ex
pertos, para hacer justicia a esta rea tan inmensa; as pues, slo se
proporcionan revisiones muy sucintas de los primeros temas de la
lista, antes de concentrarse en el ltimo: el uso de las tcnicas ge
nticas para el tratamiento de una enfermedad. En los recuadros de
tica se comentan de forma breve algunos asuntos ticos relevantes
suscitados por estos adelantos.
21.2
Tratam ien to de anorm alidades

genticas
Se ha difundido de forma errnea la idea de que si una enfermedad

es gentica su tratamiento es imposible. En realidad, no existe en lo
absoluto alguna conexin entre la causa y la posibilidad de tratar
una afeccin. Un nio profundamente sordo debe recibir los auxi
liares para la audicin o un implante coclear con base en sus snto
mas y la situacin de la familia, sin importar si la prdida de la
audicin es gentica o no. La teraputica mdica ortodoxa dirigida
a aliviar los sntomas de la anormalidad es tan aplicable a enferme
dades genticas como a cualquiera otra.
Sin embargo, es cierto que para muchos padecimientos genti
cos los tratamientos existentes no son satisfactorios. En una encues
ta realizada hace 20 aos (Costa y cois., 1983) se estim que la
teraputica mejor la capacidad de reproduccin slo en 11% de
los trastornos mendelianos, la adaptacin social en 6% y slo en
15% prolong el periodo de vida al normal (de quienes tenan una
longevidad reducida). Sin duda, las cifras seran mucho mejores en
la actualidad, pero no de manera notable.
Los errores innatos del metabolismo son el mejor subgrupo
candidato de enfermedades mendelianas para terapia convencional.
El conocimiento bioqumico detallado proporciona muchos posi
bles puntos de ingreso para intervenir, entre ellos los siguientes:
Limitacin de sustrato. Todas las personas conocen el xito de

los tratamientos dietticos con la fenilcetonuria (aunque inclu
so en pacientes tratados de modo satisfactorio, el desarrollo cog
noscitivo es en promedio la mitad de una desviacin estndar
abajo del normal). Otros errores innatos ms responden igual
de bien a la teraputica diettica.
Restitucin de un producto deficiente, como la hormona ti
roidea para lactantes con hipotiroidismo congnito.
Uso de vas alternativas para eliminar metabolitos txicos.
Los tratamientos son variables, desde la hemorragia simple co
mo una teraputica muy eficaz para la hemacromatosis hasta al
uso del benzoato para incrementar la excrecin de nitrgeno en
pacientes con trastornos del ciclo de la urea.
Utilizacin de inhibidores metablicos, como el frmaco
NTBS que bloquea la va de la tirosina y mejora en gran medi
da el pronstico de la tirosinemia tipo 1 (Lindstedt y cois.,
1992).
Treacy, Valle y Scriver comentan de forma detallada estos ejemplos
y muchos otros ms y su captulo se recomienda a los lectores inte
resados en esta rea (vase las lecturas adicionales). An es cierto
que a pesar de muchos trabajos, relativamente pocas anomalas ge
nticas tienen tratamientos del todo satisfactorios y de ah el nfa
sis en las conductas novedosas que se describen ms adelante, que
se aplican por igual a todas las enfermedades, genticas o no.
21.3
Uso del conocim iento gentico

para m ejorar los tratam ien to s
existentes y desarrollar nuevas
te ra p u tic as convencionales
21.3.1 La farmacogentica promete incrementar la

efectividad de los medicamentos y reducir
los efectos secundarios peligrosos
Rara vez los frmacos son eficaces en la totalidad de los pacientes a
quienes se prescriben. Por ejemplo, entre las clases de medicamen
tos indicados ms a menudo:
15 a 35% de los individuos no reacciona a los bloqueadores be
ta o slo de forma inadecuada.
7 a 28% de los enfermos no muestra respuesta, o es inapropia
da, a los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina.
9 a 23% de los individuos responde de manera inadecuada a los
inhibidores selectivos de la recaptacin de serotonina.
20 a 50% de las personas reacciona de modo inadecuado a los
antidepresivos tricclicos.
En algunos casos (en especial en enfermedades psiquitricas), los
pacientes con el mismo diagnstico clnico pueden tener en reali
dad distintos trastornos, de los cuales slo uno responde a un agen
te determinado. Sin embargo, en la mayor parte de estas personas
las fluctuaciones de la respuesta dependen de diferencias en la ab
sorcin, distribucin, metabolismo y eliminacin de los medica
mentos y la variabilidad de los receptores blanco.
21.3 | USO DEL CONOCIMIENTO GENTICO PARA MEJORAR LOS TRATAMIENTOS EXISTENTES.
Estas variaciones individuales dependen en buena medida de

combinaciones de polimorfismos comunes en un nmero limitado
de genes. Comparada con los problemas de hallar factores genti
cos de susceptibilidad en anormalidades comunes (cap. 15), la
identificacin de las variedades subyacentes de las reacciones indi
viduales a medicamentos es un problema mucho ms fcil de tra
tar. La investigacin puede enfocarse en un rea definible de la
bioqumica y es factible revisar in vitro muchas hiptesis. Por con
siguiente, parecera factible la quimrica prescripcin especfica para
individuos. Se utilizara cierto tipo de equipo basado en chips en el
consultorio clnico para genotipificar al sujeto para unos cuantos
cientos de polimorfismos comunes. Los resultados determinaran
los medicamentos que seran seguros y eficaces en su caso. Los pe
simistas aduciran que a las compaas farmacolgicas no les inte
resa asegurar que sus medicamentos slo se indiquen en los casos
en que pueden actuar (aunque tienen un inters muy notorio en
evitar que se prescriban cuando pueden causar un efecto secunda
rio peligroso). En promedio, cuestan unos 800 millones de dlares
y se requieren 10 a 15 aos para desarrollar un compuesto desde el
indicio inicial hasta colocar el frmaco en el mercado, adems de
que muchos agentes prometedores fracasan despus en el proceso
por reacciones adversas en una minora de individuos.
Se conocen algunos ejemplos de variantes genticas que afec
tan las reacciones a los medicamentos (cuadro 21-1). Estos efectos
pueden tener una importancia clnica real. Las dosis de isoniacida
apropiadas para acetiladores rpidos tienen el riesgo de causar una
neuropata perifrica en acetiladores lentos. Los pacientes con las
variantes R144C o I359L del gen CYP2C9 pueden sufrir anticoa
613
gulacin excesiva y hemorragia si reciben la dosis estndar de sos

tn de warfarina. Un metabolizador deficiente CYP2D6 tal vez
no obtenga beneficio con analgsicos que contienen codena, pero
si se prescribe nortriptilina quiz requiera una dosis diaria de slo
10 a 20 mg, en tanto que un metabolizador ultrarrpido podra
necesitar 500 mg al da. Wolf y colaboradores (2000) notificaron
que en los individuos sometidos a medicamentos psiquitricos,
que son sustratos de CYP2D6, se observan reacciones farmacol
gicas adversas en los enfermos con mutaciones que inactivan el gen
CYP2D6.
21.3.2 Las compaas farmacuticas realizan grandes

inversiones en genmica para identificar nuevos
blancos farmacolgicos
Se afirma que la enorme diversidad de medicamentos en el merca
do slo acta hoy en da a travs de unos 400 blancos. La investi
gacin genmica expandi en inmensa proporcin el nmero de
posibles blancos disponibles para investigar por compaas farma
cuticas; desde unos cuantos cientos hasta hace 10 aos tal vez
50 000 en la actualidad. De hecho, la superabundancia de posibles
blancos es casi una perturbacin para las compaas de biotecno
loga. Puede utilizarse la interferencia por RNA (seccin 20.2.6)
para identificar genes en los que un medicamento inhibidor pro
ducira un efecto til, antes de investigar la seleccin a gran esca
la tal vez necesaria para reconocer posibles inhibidores. A largo
trmino se tiene la esperanza de que surjan de este esfuerzo clases
de frmacos por completo nuevos.
Cuadro 21-1. Ejemplos de variaciones genticas que afectan la respuesta a medicamentos

Vase Wolf y colaboradores (2000) para ms detalles.
Frecuencia en
la poblacin
Ejemplos de
frmacos afectados
60% (europea caucsica)

20% (oriental)
Isoniacida, procainamida, sulfonamidas
Actividad baja
(baja)
6-mercaptopurina, azatioprina
Actividad baja (inactiva mutaciones)
1% (oriental)
Falta de activacin:
codena
Actividad ultraelevada
(amplificacin gnica en tndem)
2-7% (europeos caucsicos)
Inactivacin lenta:
frmacos psiquitricos, como nortriptilina,
clozapina, haloperidol, imipramina, mianserina;
frmacos cardiovasculares, como propranolol.
Citocromo P-450 CYP2C9
Actividad baja
0.2% ?
Ibuprofeno, warfarina, tolbutamida
Citocromo P-450 CYP2C19
Actividad baja
23% (oriental)
Mefenitoina, proguanilo
Receptor adrenrgico (3 ADRB2
Varios PNU (an no es claro cules

son Importantes)
ND
Reacciones variables al albuterol en asma
Receptor ERBB2
Aumentado en algunos cnceres

de mama
---
Herceptina (es eficaz slo cuando est

aumentado ERBB2)
Enzima/protena
Variante
Transferasa de N-acetilo
Acetiladores lentos
Metiltransferasa de tiopurina
Citocromo P-450 CYP2D6
ND, datos no disponibles.
614 | CAPTULO VEINTIUNO ! NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
Tambin son importantes los estudios genmicos o protemicos de microorganismos patgenos como guas para el desarrollo de
nuevas vacunas o tratamientos. Los patgenos microbianos figuran
en particular en la lista de prioridades para secuenciaciones del genoma (vase recuadro 8-8) y de ellos un notable estudio reciente es
el del parsito del paludismo Plasmodium falciparum (Gardner y
cols., 2002). Se analizan secuencias para identificar enzimas espec
ficas del patgeno, no del husped, que podran ser blancos para
inhibidores o enzimas faltantes que tornan al parsito vulnerable a
la interferencia con el aporte de un nutrimento esencial. Las pro
tenas de virulencia o los productos gnicos que se expresan tem
prano en una infeccin son blancos prometedores para frmacos.
Pueden identificarse mediante estudios de ordenamiento de expre
sin y por comparacin del contenido de genes o la expresin gnica en cepas virulentas y no virulentas. Se utilizan medidas
protemicas (como MALDI-TOF MS; vase recuadro 19-4) para
reconocer protenas en la superficie de clulas patgenas que po
dran ser blancos para vacunas.
21.3.3 Los tratamientos basados en clulas prometen

transformar el potencial de los trasplantes
Los tratamientos basados en clulas pueden considerarse como ex
tensiones naturales de los mtodos vigentes de trasplante, pero los
adelantos en el conocimiento de las clulas madre ofrecen la espe
ranza de extender de forma radical la gama actual de opciones. En

teora, las posibilidades son interminables -cualquier tejido u rga
no daado o gastado podra renovarse o crearse de nueva cuenta
con clulas madre apropiadas y stas podran someterse a cualquier
clase de manipulacin gentica por adelantado-. Daley (2002) pro
porciona una valoracin juiciosa de la forma en que pueden con
cretarse estas esperanzas a mediano plazo.
Las clulas madre pueden definirse como clulas que se autorrenuevan y adems dan lugar a una progenie diferenciada (vase sec
cin 3.3). Es probable que se encuentren en todas las etapas del
desarrollo y todos los tejidos. Existe un gradiente de clulas madre
embrionarias (clulas ME), que tienen el potencial de producir to
da la lnea germinal y de clulas somticas de un organismo, hasta
las clulas madre multipotenciales pero restringidas a tejidos (fig.
21-1). Desde hace muchos aos se estudian las clulas ME de ra
tn, pero el aislamiento de clulas ME humanas que efectuaron
Thomson y colaboradores en 1998 impuls la teraputica con c
lulas madre en la investigacin mdica y tambin en el debate ti
co. Este ltimo deriva del mtodo de produccin de las clulas ME,
que de modo inevitable comprende la destruccin de un embrin
humano temprano. Para conocer diversos argumentos, vase la se
rie de cartas publicada en el New England Journal o f M edicine
(2002;346:1619-1622), que cobraron relevancia tras la revisin de
Weissman (2002). Quienes se oponen al uso de clulas ME suelen
sugerir que no es necesario emplearlas, dado que las clulas madre
Clulas musculares diferenciadas
Clulas diferenciadas del

sistema hematopoytico
Clulas neurales diferenciadas
Clulas de la lnea germen
Clulas ME
pluripotentes
Clulas madre multipotentes

especficas de tejido
Clulas diferenciadas de forma

terminal
Fig. 21-1. Clulas madre.

Todas las clulas madre pueden renovarse por s mismas y dar lugar a una progenie ms diferenciada. Las clulas madre embrionarias (ME) pueden
producir todos los tipos de clulas somticas y de la lnea germinal del organismo; las clulas madre restringidas a tejidos tienen un potencial ms
limitado. En la actualidad, existen controversias en cuanto a que las clulas madre restringidas a tejidos puedan transdiferenciarse en una clula caracterstica
de un tejido diferente y en qu grado.
21.3
USO DEL CONOCIMIENTO GENTICO PARA MEJORAR LOS TRATAMIENTOS EXISTENTES. . .
adultas restringidas a tejidos pueden funcionar igual de bien. Otros

arguyen que pocas de las lneas de clulas madre adultas disponi
bles estn bien caracterizadas y que su potencial de crecimiento y
diferenciacin es muy limitado para que constituyan un sustituto
adecuado de las clulas madre embrionarias (ME).
Las lneas actuales varan de manera considerable en cuanto a la
proporcin de crecimiento en cultivo y la gama de clulas diferen
ciadas que pueden producir. Cabe preguntarse hasta qu grado
pueden transdiferenciarse las clulas madre restringidas a tejidos si
se hace migrar un tejido diferente y se adquieren las propiedades de
las clulas madre de dicho tejido. Existen muchas afirmaciones, pe
ro pocas se han formulado con rigor. Como herramientas de inves
tigacin, son muy importantes las clulas madre de todas las clases.
Pueden permitir la identificacin de los factores que controlan la
posible diferenciacin y la forma de llevarla a cabo. Si eso conduce
a una capacidad de controlar y canalizar la diferenciacin, podran
emplearse clulas madre para una gama casi ilimitada de ingeniera
tisular y reparacin de tejidos.
El uso de clulas madre obtenidas de un donador an deja el
problema del rechazo del trasplante. Este inconveniente podra so
lucionarse con el uso de la tecnologa de trasplante nuclear que pro
dujo a Dolly la oveja. Se reemplazara el ncleo de un oocito por
otro del receptor del trasplante y clulas ME aisladas del blastocisto resultante (fig. 21-2). En teora, sera factible utilizar estas clu
las para producir clulas madre, tejidos o incluso rganos
completos para trasplante sin ningn riesgo de rechazo. Este proce
dimiento se denomina clonacin teraputica y es el tema de una aca
lorada controversia tica y poltica (vase el recuadro 1 de tica).
615
21.3.4 Protenas recombinantes y vacunas

Es posible producir protenas recombinantes mediante
clonacin de expresin en microorganismos o ganado
transgnico
Muchas protenas teraputicas que se extraan con anterioridad de
fuentes animales o humanas pueden elaborarse como protenas recombinantes mediante clonacin de expresin (Russell y Clarke,
1999). En la seccin 5.6 se describen las tcnicas y problemas de la
clonacin de expresin. La insulina humana recombinante se ex
pendi por primera vez en 1982 y en el cuadro 21-2 se incluyen va
rios ejemplos subsecuentes. El uso de protenas recombinantes
evita muchos de los problemas de seguridad de los productos ex
trados en forma natural. Muchos hemoflicos contrajeron sida por
factor VIII humano contaminado con HIV y algunos nios murie
ron por enfermedad de Creutzfeldt-Jakob despus de inyecciones
de hormona del crecimiento extrada de glndulas hipfisis de ca
dveres humanos.
Las bacterias son los huspedes ms simples para clonacin de
expresin. Es posible desarrollar grandes volmenes de cultivos y
pueden definirse y controlarse los medios para evitar la contamina
cin. Sin embargo, los polipptidos que se producen en bacterias
no son idnticos a las protenas humanas naturales. Casi todas las
protenas humanas teraputicas estn glucosiladas y las bacterias no
reproducen los patrones humanos de glucosilacin. Por esta razn
hay un inters creciente en los sistemas de expresin de mamferos.
stos pueden ser cultivos celulares, pero una alternativa atractiva la
representan los animales transgnicos. Por ejemplo, podra fusio-
Clula somtica de donador
C lo n a c i n re p ro d u c to ra
O o c ito
B la s to c is to
C lu la s d ife re n c ia d a s
p a ra tra s p la n te
C lo n a c i n te ra p u tic a
Fig. 21-2. Clonaciones reproductora y teraputica.

En ambos procedimientos se trasplanta el ncleo de una clula somtica del donador a un oocito enucleado, que a continuacin se estimula para desa
rrollarse hasta la etapa de blastocisto. Para la clonacin reproductora se implanta el blastocisto en un tero con la esperanza de que se desarrolle hasta
un nio. La clonacin reproductora humana est prohibida en la mayor parte de los pases. Para la clonacin teraputica se extraen clulas ME de la
masa celular interna del blastocisto, que a continuacin se destruye. Las clulas ME se utilizan como una fuente de clulas donadoras clonadas o, en
potencia, de tejidos u rganos. Hay controversias sobre la clonacin teraputica humana porque incluye la destruccin de un embrin humano. El em
brin podra ser alguno sobrante de una clnica de fecundacin in vitro (FIV) o crearse de manera especial para este propsito.
616
CAPTULO VEINTIUNO
narse un gen humano clonado con un gen de oveja, cabra o cerdo

que exprese una protena para la leche e insertarse en la lnea ger
minal del animal. Esto lleva a la idea del pharming. Se conservaran
rebaos de animales transgnicos que producen una protena hu
mana deseada a un valor alto en su leche (Velander y cois., 1997).
De manera alternativa, podra inducirse que pollos transgnicos
pusieran huevos ricos en un producto deseado.
Asimismo son cada vez ms comunes las plantas transgnicas.
Las plantas no replican patrones de glucosilacin especficos de se
res humanos, pero tienen muchas ventajas para clonacin de expre
sin en trminos de costo y seguridad. Por ejemplo, hay un enorme
inters en producir cepas de arroz mediante ingeniera para contra
rrestar la deficiencia de vitamina A, que es un problema de salud
pblica importante cuando menos en 26 pases de frica, Asia y
Amrica Latina (Ye y cois., 2000).
Anticuerpos elaborados de forma gentica por ingeniera

Los reordenamientos gnicos complicados de los linfocitos B (sec
cin 10.6) proporcionan a todas las personas un repertorio enorme
de diferentes anticuerpos como un sistema de defensa contra innu
merables antgenos extraos. Las molculas de anticuerpo actan
como adaptadores: tienen sitios de enlace para antgeno extrao en
el extremo variable (V) y sitios de enlace para molculas efectoras
en el extremo constante (C). El enlace de un anticuerpo puede ser
suficiente por s mismo para neutralizar ciertas toxinas y virus, pe

ro ms a menudo el anticuerpo enlazado desencadena al sistema de
complemento y la destruccin mediada por clulas.
Los anticuerpos teraputicos que se producen de modo artifi
cial estn diseados para ser monoespecficos. Por tradicin, stos
eran anticuerpos m onoclonales (Acm) secretados por hibridomas,
clulas inmortalizadas producidas mediante la fusin de linfoci
tos B que liberan anticuerpo de un ratn o una rata inmunizados
con clulas de un tumor inmortal de linfocitos B de un ratn. Los
hibridomas se propagan como clonas individuales, cada una de las
cuales puede proporcionar una fuente permanente y estable de un
Acm nico. Infortunadamente, el potencial teraputico de los Acm
que se producen en esta forma es limitado. Aunque es posible pro
ducir Acm de roedores contra patgenos y clulas humanas, tienen
una vida media corta en el suero humano y pueden activar la pro
duccin de anticuerpos humanos antirroedor. Adems, slo algu
nas de las diferentes clases pueden estimular funciones efectoras
humanas.
Estos problemas pueden tratarse mediante ingeniera de anti
cuerpo. Diferentes exones de los genes de inmunoglobulina codifican
distintos dominios de la molcula de anticuerpo. Por consiguiente,
el mezclado de exones a nivel del DNA permite construir anticuer
pos con combinaciones novedosas de dominios protenicos. Las
aplicaciones iniciales de la ingeniera de anticuerpos produjeron
anticuerpos humanizados (fig. 21-3) en los que se reemplaza una
R ecu ad ro i ck tic a . Etica de ia clonacion humana
Los argumentos sobre la tica de la clonacin humana deben diferenciar la clo

nacin reproductora de la teraputica, incluso si la decisin final es que ambos
tipos no son ticos. Las legislaciones en muchos pases han considerado
proyectos que buscan suprimir todo tipo de clonacin, o bien establecer una
diferencia entre clonacin reproductora (proscrita) y teraputica (permitida).
La clonacin reproductora se dirige a producir un nio clonado. Las ob
jeciones para la clonacin reproductora se basan en tres hechos: uno
prctico, uno de principios y otro mal concebido.
El argumento prctico destaca la baja tasa de xito de todos los ex
perimentos de clonacin de mamferos y, por consiguiente, el hecho
de que muchos animales clonados que nacen tendrn anormalidades de
importancia, tal vez porque los procedimientos actuales no reprograman con seguridad las modificaciones epigenticas de la clula
donadora (Dean y cois., 2001). ste es un hecho simple y, desde lue
go, cualquier intento de clonacin reproductora humana en el estado
actual de conocimientos sera notablemente inmoral. Los adelantos
posteriores del conocimiento podran eliminar esta objecin, aunque
an no se aclara de qu forma podria saberse sin llevar a cabo los ex
perimentos no ticos.
El argumento de principios seala que los seres humanos deben va
luarse por s mismos y no tratarse como instrumentos para lograr un
propsito. Se acepta del todo este argumento, pero cabra preguntar
por qu no se aplica en la misma medida a padres ambiciosos que
deciden que su nio de tres aos se convierta en un campen de te
nis o un violinista virtuoso.
El argumento mal concebido considera las clonas como slo indivi
duales en parcial medida o tal vez no del todo humanas. Gran parte
de la ansiedad - y asimismo del irona- sobre la clonacin reproduc

tora se debe a idear un cuadro de clonas como cierta clase de zombis programables. Es muy extrao, ya que todos conocen las clonas
y saben perfectamente que son por entero humanas e individuales.
Las clonas con ingeniera serian incluso menos idnticas que los ge
melos MZ, ya que es muy probable que el donador seria un multimi
llonario de edad avanzada obsesionado por lograr una falsa
inmortalidad, en tanto que la clona sera 60 aos ms joven y nace
ra en un ambiente por completo diferente. Para citar un ejemplo tri
llado: incluso si alguien tuviera xito para clonar a Hitler, no hay nada
que lleve a imaginar una clona para exterminar judos.
Los argumentos en favor de la clonacin reproductora se basan en los casos
en los que slo hay una opcin para que una pareja tenga nios -por ejem
plo, si una mujer tuvo un trastorno mitocondrial grave podria embarazarse
con un oocito donado (que proporcionada las mitocondrias) dentro del que
se transplant el ncleo de una de las clulas somticas del compaero-.
La clonacin teraputica (fig. 21-2) comprende la produccin de clulas
madre embrionarias en las que el ncleo procede de una clula somtica de
donador. Esto se lleva a cabo para proporcionar al donador una fuente de c
lulas, tejidos u rganos trasplantares compatibles. En este caso, el debate
tico es ms complicado. Muchas personas objetan la idea de crear un em
brin especfico para este propsito o incluso utilizar embriones sobrantes
de las clnicas de fecundacin in vitro. Otras personas que se oponen se re
fieren a una pendiente deslizable : s se permite la clonacin teraputica,
quiz ser imposible evitar que operadores inescrupulosos llevaran los em
briones clonados a programas de clonacin reproductora. Quienes propo
nen lo contrario, arguyen que si la clonacin teraputica es la nica forma
de curar enfermedades devastadoras seria inmoral no proceder.
21.3 [ USO DEL CONOCIMIENTO GENTICO PARA MEJORAR LOS TRATAMIENTOS EXISTENTES... j 617
Cuadro 21-2. Ejemplos de productos farmacuticos obtenidos mediante clonacin de expresin

Producto
Tratamiento de
Insulina
Diabetes
Hormona del crecimiento
Deficiencia de hormona del crecimiento
Factor VIII de coagulacin sangunea
Hemofilia A
Factor IX de coagulacin sangunea
Hemofilia B
Interfern a
Leucemia de clulas piliformes; hepatitis crnica
Inferfern p
Esclerosis mltiple
Interfern y
Infecciones en pacientes con enfermedad granulomatosa crnica
Glucocerebrosidasa
Enfermedad de Gaucher
Activador del plasmingeno tisular
Trastornos trombticos
Hormona estimulante de granulocitos y macrfagos
Neutropenia consecutiva a quimioterapia
Leptina
Obesidad
Eritropoyetina
Anemia
parte mayor o menor del Acm del roedor por el equivalente hu

mano. Por ltimo, se elaboraron anticuerpos que slo llevan las re
giones determ inantes d e com plem entaridad (RDQ del Acm del
roedor -son las secuencias hipervariables del sitio de unin de antgeno (fig. 21-3B)-. Adelantos ms recientes evitaron la produc
cin de hibridomas mediante la tecnologa de exhibicin de fago
(Hoogenboom y cois., 1998; seccin 5.6.2). Estos sistemas permi
ten elaborar combinaciones innovadoras de dominios de anticuer
po. Una clase muy prometedora de derivados de anticuerpos es la
de los fragm entos variables de cadena nica (Fvcu; fig. 21-3Q. s
tos tienen casi toda la especificidad de enlace de un Acm, pero en
un polipptido no glucosilado nico que puede elaborarse a gran
escala en clulas bacterianas, de levadura o incluso de plantas (St-
ger y cois., 2000). Hudson (1999) revis muchas de las molculas

promisorias por ingeniera relacionadas con anticuerpos que han
comenzado a valorarse en estudios clnicos.
Los adelantos relacionados se encaminan a simular la especifi
cidad de enlace de anticuerpos en diferentes contextos. Pueden
emplearse genes de anticuerpo con ingeniera para producir anti
cuerpos intracelulares no secretados (intracuerpos) con el fin de
enlazar molculas especficas dentro de una clula (Marasco,
1997). Los intracuerpos pueden ser tiles si el mero acto de enla
ce inhibe el blanco. Ello puede ser una propiedad en extremo til
ya que, a diferencia de las molculas pequeas, los intracuerpos no
se limitan a dirigirse a clases de protenas especficas (cinasas, cana
les de iones, etc.). Ms an, los intracuerpos pueden usarse para
P p tid o e n la z a d o r
C)
A n tic u e rp o d e fra g m e n to
v a ria b le d e c a d e n a n ic a (Fvcu)
Fig. 21-3. ingeniera de anticuerpos.

A) Los anticuerpos monoclonaies (Acm) comunes son anticuerpos monoespecificos de roedores sintetizados mediante hibridomas y que se preparan
tras fusionar clulas B de ratones o ratas inmunizadas con clulas de un tumor inmortal de linfocitos B de ratn. Los seres humanos pueden producir
anticuerpos antirroedores que neutralizan a los Acm. B) Este problema puede minimizarse mediante ingeniera del Acm de tal manera que toda la mo
lcula sea de origen humano excepto las regiones hipervariables determinantes de la complementaridad (RDC) que determinan la especificidad. C)
Fvcu son cadenas polipptidas nicas modificadas por ingeniera. Segn sea la longitud del enlazador, conectan su blanco como monmeros :
.
trmeros. Los multmeros enlazan su blanco con mayor potencia que los monmeros.
618 i CAPTULO VEINTIUNO NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
transportar molculas efectoras que pueden activar funciones es

pecficas cuando ocurre el enlace de antgeno. Es probable que el
mejor ejemplo de lo anterior sea la fusin de la caspasa 3 a intracuerpos (Tse y Rabbits, 2000). Se prepararon intracuerpos conju
gados con caspasa 3 contra cada molcula protenica separada de
una enfermedad acompaada de protena de fusin como bcr-abl.
En clulas cancerosas, ambos intracuerpos enlazan la protena de
fusin, lo cual hace posible que se dimerice la caspasa 3 y por con
siguiente desencadena apoptosis selectiva de clulas que contienen
la protena de fusin.
Una alternativa de los anticuerpos recombinantes es el uso de
pptidos cortos como compaeros de enlace para protenas blanco
especficas (Hoppe-Seyler y Butz, 2000). De hecho, pueden aban
donarse por completo las interacciones de proteina con protena en
favor de molculas de DNA o RNA (aptmeros). Las ventajas fun
damentales del empleo de DNA o RNA son la capacidad para am
plificar DNA y producir la molcula deseada a gran escala. A partir
de un fondo comn grande de oligonucletidos aleatorios, se utili
zan rondas repetidas de seleccin y amplificacin para aislar molcu
las que enlazan e inhiben una protena blanco con afinidad similar a
anticuerpos convencionales (White y cois., 2000).
Vacunas modificadas de modo gentico mediante ingeniera

Puede aplicarse la tecnologa de DNA recombinante a antgenos y
anticuerpos. Es posible incapacitar microorganismos patgenos
mediante modificacin gentica de tal manera que pueda emplear
se con seguridad una vacuna viva atenuada. Podran usarse plan
tas modificadas de modo gentico para producir vacunas
comestibles. Es posible llevar a cabo cambios para que un antge
no mejore su visibilidad para el sistema inmunitario, de tal forma
que produzca una respuesta mayor. En la actualidad se encuentran
en estudios clnicos muchas vacunas de DNA o RNA. De manera
caracterstica, son plsmidos diseados para expresar un antge
no de un patgeno o un tumor a una concentracin alta despus
de administrarse por inyeccin intramuscular (Reyes-Sandoval y
Erti, 2001).
En esta seccin se proporcion una revisin general y breve
de la muy amplia gama de aplicaciones del conocimiento y las
tcnicas genticas en investigacin mdica y farmacutica; a con
tinuacin se comentan con mayor detalle las posibilidades de in
tervenciones genticas directas en procesos patolgicos mediante
teraputica gnica.
21.4
El tratamiento gnico incluye la modificacin gentica directa de

clulas del paciente para lograr un objetivo teraputico. Hay distin
ciones bsicas en los tipos de clulas modificadas y la variedad de la
modificacin efectuada.
La teraputica gnica de linea germinal produce una modifica
cin transmisible permanente. Esto podra lograrse si se modifica
ra un gameto, un cigoto o un embrin temprano. El tratamiento
de lnea germinal se suprimi en muchos pases por razones ticas
(vase el recuadro 2 de tica).
La teraputica gnica de clulas somticas se enfoca en mo

dificar clulas o tejidos especficos del paciente en una forma li
mitada al propio enfermo. Todos los estudios clnicos y
protocolos sobre terapia gnica actuales se basan en la terapu
tica de clula somtica.
Las clulas somticas podran modificarse en varias formas dife
rentes (fig. 21-4).
La suplementacin gnica (llamada asimismo aumento gni
co) se dirige a proporcionar una copia funcional de un gen de
fectuoso. Es posible utilizar esta modalidad para el tratamiento
de padecimientos con prdida de funcin (seccin 16.4) en los
que el proceso patolgico resulta de la falta de funcin actual de
un gen. La fibrosis qustica sera un candidato tpico. No es ade
cuada para padecimientos con prdida de funcin en los que ya
se llev a cabo un dao irreversible, por ejemplo a travs de cier
ta falla en el desarrollo embrionario. La teraputica del cncer
incluira la suplementacin gnica para incrementar la reaccin
inmunitaria contra un tumor o reemplazar un gen supresor de
tumor defectuoso.
La restitucin gnica es ms ambiciosa: el objetivo es reempla
zar un gen mutante por una copia que funciona de modo co
rrecto o corregir una mutacin in situ. Se requiere el reemplazo
gnico para enfermedades con ganancia de funcin en las que el
gen mutante residente efecta una funcin errnea.
La inhibicin dirigida de expresin gnica es en particular im
portante en enfermedades infecciosas en las que las funciones
esenciales del patgeno son los objetivos. Puede usarse tambin
para silenciar oncogenes activados en el cncer, amortiguar res
puestas indeseables en afecciones autoinmunitarias y tal vez silen
ciar un alelo mutante con ganancia de funcin en un trastorno
hereditario.
La destruccin dirigida de clulas especficas es una aplica
cin particular para el tratamiento del cncer.
Las expectativas sobre la teraputica gnica siguieron un curso
fluttuante durante los ltimos 15 aos ya que a ciclos de optimis
mo excesivo le siguieron brotes de pesimismo desbordado. Un im
portante informe de los US National Institutes of Health de 1995
intent inyectar bases reales (recuadro 21-1). Desde entonces se
observ un crecimiento optimista (que slo se alter por la muerte
de Jesse Gelsinger) suscitado de nueva cuenta por el tratamiento
con xito de nios con inmunodeficiencia combinada grave y ate
nuado una vez ms por las noticias de un primer nio y a continua
cin un segundo que desarrollaron leucemia, casi con certeza como
resultado del tratamiento (ms adelante se describen ms detalles
de todos estos acontecimientos). Tal vez una causa de dichas reac
ciones exageradas es la confusin sobre las escalas de tiempo natu
rales de este trabajo. Debido a que muchas veces pueden iniciarse
pruebas diagnsticas en el transcurso de semanas tras clonarse un
gen, tal vez las personas esperan que el tratamiento no se retrase de
masiado, en tanto que en realidad el desarrollo de un frmaco sigue
un lapso de dcadas.
Desarrollar la teraputica gnica prctica es un proceso que lle
var mucho tiempo; de manera adicional, informes del xito del
21.5 I MTODOS PARA INSERTARY EXPRESAR UN GEN EN UNA CLULA O TEJIDO BLANCO I 6 19
progreso desencadenan preocupaciones ticas centradas alrededor

de la idea de disear nios (vase el recuadro 3 de tica). No obs
tante, muchos laboratorios acadmicos y comerciales trabajan ar
duamente en esta rea y se han aprobado ms de 600 protocolos de
estudios clnicos relacionados con teraputica gnica. En la figura
21-5 se muestran estadsticas de la base de datos de estudios clni
cos conservada en www.wiley.co.ulc/genetherapy/clinical. El libro
de Templeton y Lasic (lecturas adicionales) comenta ms a fondo
muchos de los temas que se exponen en el resto de este captulo.
21.5
Mtodos para insertar y expresar un

gen en una clula o tejido blanco
21.5.1 Es posible transferir genes a clulas receptoras

en el laboratorio (ex vivo) o dentro del cuerpo
del paciente (in vivo)
La transferencia gnica ex vivo comprende la transferencia de genes
clonados al interior de clulas desarrolladas en cultivo. Se seleccionan
las clulas que se transformaron de forma satisfactoria, se expanden

mediante cultivo celular in vitro y a continuacin se restiruven al pa
ciente. Para evitar el rechazo por el sistema inmunitario. siempre que
es posible se utilizan las clulas del enfermo (clulas autlogasy fig.
21-6). Este mtodo se emplea en clulas que son accesibles para ex
traccin inicial y que pueden inducirse para injertarse v sobrevivir
por un tiempo prolongado despus de la restitucin. Los ejemplos
incluyen clulas del sistema hemopoytico, clulas de la piel, etc.
La transferencia gnica in vivo es la nica opcin en tejidos en
los que no es posible cultivar clulas del receptor in vitro en canti
dades suficientes (p. ej., clulas cerebrales) o en los casos en que no
es posible implantar otra vez con eficiencia en los pacientes clulas
cultivadas. El blanco tisular es una consideracin importante. El
vector de la transferencia gnica puede colocarse de forma directa
dentro del tejido blanco o inyectarse en la circulacin general y di
searse de tal manera que slo lo capte el tipo de clula deseado.
Debido a que no existe una forma de seleccionar y amplificar clu
las que captaron y expresaron el gen extrao, el xito de este mto
do depende de la eficiencia general de la transferencia y expresin
gnicas.
l t tH
La teraputica gnica con linea germinal supone llevar a cabo un cambio
gentico que pueda transmitirse a travs de las generaciones. Con toda
probabilidad, esto se hara mediante la manipulacin gentica de un em
brin antes de la implantacin, pero podra ocurrir como un producto ac
cesorio de un tratamiento dirigido a clulas somticas que afect de forma
incidental las clulas germinales del individuo. La teraputica con clulas
somticas trata slo ciertas clulas del cuerpo del sujeto sin tener efecto
alguno en la lnea germinal. Por razones slo tcnicas, en la actualidad la
teraputica con lnea germinal no es una opcin real e incluso habr pro
blemas ticos cuando se resuelvan los problemas tcnicos y en muchos
pases la ley prohbe la manipulacin gentica de la lnea germinal.
2pq:tf, en la que q es la frecuencia del alelo de enfermedad y p = 1 -q .

Puesto que cada portador tiene una copia del alelo de enfermedad en
tanto que cada persona afectada posee dos, la proporcin de alelos de
enfermedad que se encuentran en la persona afectada es 2qz/(2pq +
2q2) que se simplifica a q. Por consiguiente, para una enfermedad rece
siva que afecta a una persona en 10 000 (qr2 = 1/10 0000, q = 0.01),
slo 1% de los alelos de la enfermedad se halla en la persona afectada.
Evitar o no que un sujeto afectado transmita sus genes patolgicos
(mediante teraputica de lnea germinal o por la opcin ms drstica
de la esterilizacin como precio del tratamiento) tiene muy poco efec
to en la frecuencia de la afeccin en generaciones futuras.
En favor de la teraputica de lnea germinal se argumenta que resuel

ve el problema en un solo paso y para siempre. Por qu dejar en los
descendientes de la persona el riesgo de una enfermedad si podra
eliminarse tambin ste?
En trastornos dominantes de penetrancia completa, todos los alelos

de la enfermedad los lleva la persona afectada y para los recesivos li
gados a X la proporcin es 1/3. Pero el sueo de eliminar estas en
fermedades de una vez y para siempre de la poblacin fracasa debido
a las ecuaciones del recuadro 4-7, que muestran que la mayor parte
de las enfermedades dominantes o ligadas a X importantes se con
serva en la poblacin en gran parte por mutacin recurrente.
El principal argumento contra la teraputica de lnea germinal seala

que estos tratamientos slo son experimentales. No es posible prever
todas las consecuencias y el riesgo se reduce al mnimo al asegurar
que sus efectos se limitan al paciente tratado. Esto implicara que una
vez que se cuente con experiencia suficiente en teraputica somtica,
ser tico proceder a la teraputica con lnea germinal. Sin embargo,
por fortuna, el tratamiento inicial se lleva a cabo con el consentimien
to informado, pero las generaciones ulteriores no tienen eleccin. Es
to conduce a la responsabilidad de no imponer ideas o productos
personales en generaciones futuras de tal manera que, con base en
este argumento, la teraputica de lnea germinal nunca ser tica.
El argumento en favor debe formularse contra el fondo gentico de la po
blacin. Las ecuaciones que se establecen en la seccin 4.5 son muy im
portantes en este caso; adems, existe un argumento prctico slido que
seala que no se requiere la teraputica de lnea germinal.
En padecimientos recesivos la persona afectada lleva slo una propor
cin muy pequea de los genes enfermos; la gran mayoria se encuen
tra en heterocgotos sanos. La ecuacin de Hardy-Weinberg proporciona
la relacin de portadores y afectados en una poblacin como sigue:
Una tercera objecin, y convincente, es que la teraputica de lnea germi

nal no es necesaria. Es muy probable que las parejas canddatas tuvieran
trastornos mendelianos dominantes o recesivos (riesgo de recurrencia de
50 y 25%, respectivamente). Si estuvieran disponibles seis embriones
de fecundacin in vfro (FIV) de la pareja, parecera una locura seleccionar
a los afectados y someterlos a un procedimiento incierto, en lugar de tan
slo seleccionar el 50 o 75% de los no afectados para reimplantarios.
El argumento que seala que la teraputica somtica implica menos ries
gos que la terapia de lnea germinal parece incontrovertible. En particular,
en la teraputica de linea germinal no podran utilizarse los vectores no in
tegrantes ms seguros. Convence menos el argumento general de que no
es tico imponer las elecciones personales a generaciones futuras. Tal
vez sea cierto, pero en verdad esto siempre se lleva a cabo. Seria ms f
cil considerar este argumento con seriedad si los gobiernos mostraran la
misma preocupacin para no imponer un cambio de clima o sobrepoblacin masiva en generaciones futuras.
620 I CAPTULO VEINTIUNO NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
A)
Teraputica de au m ento gnico
Gen X
rv /\B B - A _ rv
^
Clulas enfermas
B)
Fenotipo normal
(aumento del producto gnico X)
C orreccin dirigida de la m utacin gnica

Gen X
-'"x/xBB/vrv
Clulas enfermas
(gen X mutante)
E
m
C)
Fenotipo normal
(mutacin gnica
corregida para restablecer
el gen funcional)
Gen
corregido
Inhibicin dirigida de la expresin gnica

m
e je
Ollgonucletido
antisentldo, siRNA,
ribozima,
Clulas enfermas
/
'w r-A A A A
etc.
que contienen el gen Inhibicin -o mutante o
'f '
perjudicial m
NI
IC
I I
D)
,'
)
'
(
Bloqueo de la
expresin del gen
patgeno
Destruccin directa d e clulas enferm as
Toxina gnica
Clulas enfermas
Gen profrmaco
Clulas destruidas por toxina expresada
AAÂA.
* ^
Clulas enfermas
Frmaco
Fig. 21-4. Procedimientos de teraputica gnica.

Vase el texto para ms detalles. siRNA, RNA pequeo de Interferencia, vase seccin 21.6.
O o o
Clulas destruidas
por el frm aco
21.5 | MTODOS PARA INSERTARY EXPRESAR UN GEN EN UNA CLULA O TEJIDO BLANCO j 621
21.5.2 Pueden disearse vectores para integrarse

en los cromosomas de la clula husped o
permanecer como episomas
Para lograr la expresin gnica por tiempo prolongado, sera acon
sejable al parecer integrar el gen extrao dentro de un cromosoma
de la clula husped -de preferencia una clula madre-. A conti
nuacin se replica el vector siempre que se divide la clula hus
ped o sus hijas. Sin embargo, la integracin conlleva ciertos
problemas y riesgos. La integracin de la mayor parte de los vec
tores ocurre en sitios aleatorios y es diferente en distintas clulas
del individuo. El ambiente cromosmico local puede tener efectos
impredecibles en la expresin del vector -tal vez nunca se exprese,
lo haga a un nivel indeseablemente bajo o se exprese por un tiempo
corto y a continuacin se silencie de modo irreversible. Peor an,
la integracin puede alterar la expresin de genes endgenos. El
punto de insercin podra ocurrir en la secuencia de un gen end
geno, que conducira a la inactivacin insercional de dicho gen. La
mayor preocupacin es que la insercin de un vector muy expresa
do puede activar a un oncogen adyacente, algo similar a la activa
cin de M YC en el linfoma de Burkitt (fig. 17-4S); en realidad,
esto es lo que al parecer sucedi en dos de los nios tratados con
xito de inmunodeficiencia combinada grave (Check, 2002,
2003). En apariencia, cuando menos en una de las 10 clulas T
modificadas en cada uno de los dos nios, una insercin retroviral
aleatoria activ al oncogn LM02. Poco tiempo despus del trata
miento haba 50 diferentes sitios de insercin entre las clulas T
del paciente, pero al final esta clona nica super a todas las otras
y condujo a una forma nueva de leucemia de clula T. A menos
que esto sea el resultado de algn aspecto evitable del vector o el
protocolo utilizado en estos casos particulares, es probable que es
ta experiencia conduzca a un rechazo general de vectores que se in
tegran de forma aleatoria como medios para la teraputica gnica.
Como se muestra en la figura 21-55, eso sera un inconveniente
notorio para todo el campo.
Por todas estas razones, parece probable que los vectores que
permanecen como episomas extracromosmicos se constituyan en
los medios principales para la terapia gnica. Su desventaja es la li

mitada duracin de la expresin gnica. Si se dividen de forma ac
tiva las clulas blanco, los episomas tienden a diluirse a medida que
crece la poblacin celular. Por consiguiente, no existe la posibilidad
de lograr una curacin permanente y quiz se requieran tratamien
tos repetidos. Para algunos propsitos, por ejemplo destruir clulas
de cncer o combatir una infeccin aguda, ello no es un problema
porque no se requiere expresin a largo plazo. Ms an, si algo an
da mal, un gen no insertado es autolimitante en una forma en que
no lo es el gen insertado en un cromosoma.
21.5.3 Los virus son los vectores utilizados con ms

frecuencia para la teraputica gnica
Ningn sistema de transferencia gnica es ideal; todos tienen sus li
mitaciones y ventajas. Sin embargo, los vectores para transferencia
gnica empleados de manera ms regular son los virus de mamfe
ros por su gran eficiencia de transduccin a clulas humanas. La fi
gura 21-5-8 muestra que casi en 70% de los protocolos aprobados
se usan vectores virales. Se han desarrollado varios sistemas virales
diferentes (vase la revisin de Kay y cois., 2001).
Vectores oncorretrovirales
Los retrovirus son virus RNA que poseen una transcriptasa inversa
que les permite sintetizar una copia de cDNA de su genoma. Los
retrovirus llevan un complejo nucleoprotenico (complejo de preintegracin) al interior del citoplasma de las clulas infectadas. Este
complejo transcribe de modo inverso el genoma viral RNA y en se
guida integra el cDNA resultante en un sitio aleatorio nico en un
cromosoma de la clula husped. La integracin requiere que el
cDNA retroviral tenga acceso a los cromosomas del husped y s
lo es capaz de llevarlo a cabo cuando se disuelve la membrana nu
clear durante la divisin celular. Por esta razn, estos retrovirus slo
pueden infectar clulas en divisin. Eso limita las posibles clulas
blanco; algunas clulas blanco; importantes, como las neuronas ma
duras, nunca se dividen. Sin embargo, la propiedad de transducir
Recuadro 21-1. Informe del Panel de los NIH de 1995 sobre teraputica gnica (informe Orkin-Motulsky)
Los NIH convocaron a una reunin para valorar el estado actual y promi
sorio de la teraputica gnica y emitir recomendaciones sobre la investi
gacin futura patrocinada por los NIH en esta rea. El informe se notific
en diciembre de 1995 (www4.od.nih.gov/oba/rac/panelrep.htm). Entre
los hallazgos cabe sealar los siguientes:
An existen problemas de consideracin en todos los aspectos bsi

cos de la teraputica gnica. Las principales dificultades a nivel bsi
co incluyen escasez en todos los vectores de transferencia gnica
actuales y un conocimiento inadecuado de la interaccin biolgica de
estos vectores con el husped.
La teraputica gnica somtica es un progreso lgico y natural de la apli

cacin de la ciencia biomdica fundamental de la medicina y ofrece un
potencial extraordinario, a largo plazo, para el tratamiento y correccin
de enfermedades humanas, incluidos los trastornos hereditarios y ad
quiridos, cncer, sida, etctera.
Conceder demasiado valor a los resultados de laboratorio y estudios

clinicos por investigadores y sus patrocinadores -sean acadmicos,
federales o industriales- condujo al error y la amplia percepcin de
que la teraputica gnica tiene ms xito y est ms desarrollada
de lo que en realidad est. Esos cuadros imprecisos amenazan la con
fianza en la integridad del campo y pueden obstaculizar el progreso
a la aplicacin exitosa de la teraputica gnica para enfermedades
humanas.
Si bien las expectativas y promesas de la teraputica gnica son

considerables, en la actualidad an no se demuestra de modo defi
nitivo la eficacia clnica en ningn protocolo de teraputica gnica, a
pesar de afirmaciones anecdticas de xitos teraputicos y el inicio
de ms de 100 protocolos aprobados.
Casi todas las observaciones son pertinentes en la actualidad, aunque te

habido una curacin definitiva (vase seccin 21.7.1).
622 | CAPTULO VEINTIUNO NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
Recuadro 3 de tica. Diseo de nios

La frase publicitaria diseo de nios incluye dos grupos de preocupa
ciones:
Las personas utilizarn la fecundacin in vitro y el diagnstico preimplantacin para seleccionar embriones con ciertas cualidades desea
das y rechazar el reslo aun si son normales. Esto contrasta con el uso
del mismo procedimiento para evitar el nacimiento de un nio con
una enfermedad grave.
Las personas usarn las tecnologas teraputicas que se describen
en este captulo, no para el tratamiento de enfermedades sino para el
mejoramiento gentico, es decir, dotar a personas normales desde
el punto de vista gentico de cualidades superiores.
El primer caso ya existe en forma de seleccin del sexo antes de la implan
tacin y unos cuantos casos de gran publicidad en los que una pareja bus
c asegurar que su siguiente nio pudiera proporcionar un trasplante
compatible para salvar la vida de un nio enfermo. Los casos actuales in
cluyen un trasplante de clulas madre de sangre del cordn. Esto no perjudicaria al nio (seria diferente si se propusiera donar un rin). A menudo
se sugiere que estos casos son el inicio de una pendiente en deslizamien
to que conducir inevitablemente a demandas para especificacin ms ex
tensa del genotipo del nio -com o lo resume la frase diseador de nios .
Esto es errneo. Seleccionar para fines de compatibilidad HLA significa ele
gir slo uno de cada cuatro embriones. Casi todos los procedimientos de
fecundacin in vitro (F1V) producen slo un puado de embriones y por lo
general se implantan dos a tres para maximizar la posibilidad de xito. La

seleccin en mltiples criterios no es consistente con contar con suficien
tes embriones para implantar. De manera ms general, la naturaleza dot a
la humanidad de un mtodo simple y muy aceptable de hacer nios, algo
muy eficaz para la gran mayoria de las parejas, y es difcil imaginar que la
mayor parte de las personas lo abandone en favor de un procedimiento len
to y prolongado, desagradable e invasivo que cuesta una fortuna y tiene
una tasa de xito baja.
El mejoramiento gentico es un problema difcil o as ser una vez que se
tenga alguna idea de los genes mejorables. Por una parte, se presupone
que los padres hacen todo lo que pueden para proporcionar a sus nios un
buen inicio en la vida; por la otra, las opciones disponibles slo para los in
dividuos ricos se consideran como la compra de una ventaja injusta,
cuando menos en Gran Bretaa. Tal vez, por fortuna, an parece lejano el
momento de identificar los genes adecuados, incluso si se dispusiera de las
tcnicas. Los intentos para producir animales mejorados en sentido gen
tico no han sido un xito y en algunos casos se han observado fracasos
espectaculares (vase Gordon, 1999). A largo plazo, las posibilidades de
ben ser Inmensas y con toda seguridad habr muchos problemas ticos di
fciles de afrontar. Un signo de que las personas an no piensan en forma
realista sobre ello es que siempre colocan a la inteligencia en la parte su
perior de su lista de atributos deseables: estas personas nunca han com
parado los estilos de vida de los profesores y los jugadores de ftbol?
A ) P ro to c o lo s p o r e n fe rm e d a d
i C n c e r (n = 4 0 3 ), 6 3 .4 %
IM
E n fe rm e d a d e s m o n o g n ic a s (n = 78), 1 2 .3 %
f
I
I
l
E 3
I
I
E n fe rm e d a d e s in fe c c io s a s (n = 41), 6 .4 %
E n fe rm e d a d e s v a s c u la re s (n = 51), 8 .0 %
O tra s e n fe rm e d a d e s (n = 12), 1 .9 %
M a rc a d o g n ic o (n = 49 ), 7 .7 %
V o lu n tario s sa n o s (n = 2), 0 .3 %
B) P ro to c o lo s p o r v e c to r
E l
im
g g
1 1
R e tro v iru s (n = 21 7), 34.1 %

A d e n o v iru s (n = 1 7 1 ), 2 6 .9 %
L ip o fe c c i n (n = 77), 12.1 %
D N A d e s n u d o /p l s m id o (n = 70 ), 1 1 .0 %
V irus p o x (n = 39), 6.1 %
V irus a d e n o rre la c io n a d o s (n = 15), 2 .4 %
R N A d e tra n s fe re n c ia (n = 6), 0 .9 %
V irus del h e rp e s s im p le (n = 5), 0 .8 %
O tro s (n = 11), 1 .7 %
N /C (n = 25), 3 .9 %
Fig. 21-5. Estudios clnicos de teraputica gnica.

A) Distribucin por enfermedad. B) Distribucin por vector. Las figuras incluyen todos los protocolos aprobados para estudios clnicos terminados, e n .
curso o pendientes, incluidos en la lista de diciembre del 2002. Reproducido con autorizacin a partir de www.wiley.co.uk/genetherapy/clinical.
21.5 | MTODOS PARA INSERTAR Y EXPRESAR UN GEN EN UNA CLULA O TEJIDO BLANCO
623
Gen X
clonado
Fig. 21-6. Teraputica gnica in vivo y ex vivo.

Siempre que es posible, se extraen clulas del paciente, se modifican en el laboratorio y se devuelven al enfermo (teraputica gnica ex vivo; flechas
verdes). Esto permite tratar slo las clulas apropiadas y pueden revisarse estas ltimas antes de restituirse para comprobar que se logr el cambio
deseado. En muchos tejidos no es posible y es necesario modificar las clulas dentro del cuerpo del paciente (teraputica gnica in vivo\ flecha azul).
slo clulas en divisin puede resultar una ventaja en el tratamiento del

cncer. Las clulas cancerosas que se dividen de manera activa en un te
jido que habitualmente no se divide, como el cerebral, pueden infec
tarse en forma selectiva y destruirse sin un riesgo mayor para las clulas
normales.
Dada la capacidad de los retrovirus nativos para transformar c
lulas, es crucial tratar mediante ingeniera los vectores de la tera
putica gnica de tal manera que se elimine esta posibilidad. Se ha
puesto un gran ingenio en el diseo de sistemas que pueden pro
ducir slo virus incapacitados de manera permanente. En condicio
nes normales, los retrovirus tienen tres unidades de transcripcin,
gag, p o ly env y un elemento psi RNA de accin cis reconocido por
protenas virales que empacan el RNA en partculas infecciosas. En
el vector se reemplazan gag, p o l y en v por el gen teraputico, con
una capacidad mxima de clonacin de 8 kb. Este vector se empa
ca en una clula especial que puede contribuir a las funciones gag,
p o l y env necesarias, pero que no contiene un genoma retroviral in
tacto (fig. 21-7).
Los retrovirus son muy eficientes para transferir DNA al inte
rior de las clulas y en casi todos los estudios clnicos iniciales de
teraputica gnica se usaron vectores retrovirales. Sin embargo, la
preocupacin cada vez mayor sobre el riesgo de mutagnesis insercional ha desplazando el nfasis principal hacia vectores no inte
grantes.
Vectores adenovirales
Los adenovirus son virus DNA que causan infecciones benignas
de las vas respiratorias superiores en seres humanos. Pueden
producirse en ttulos altos (mucho mayores que los retrovirus) y

transducirse de forma eficiente a clulas en divisin y las que no
se dividen. El genoma lineal del DNA de doble cadena perma
nece sin integrarse como un episoma dentro del ncleo celular.
Como se explic, esto tiene ventajas en la seguridad y desventa
jas en la expresin obtenida a corto plazo. Al igual que en los
vectores retrovirales, los adenovirales estn incapacitados y slo
confan en el empacamiento celular para proporcionar funciones
vitales. El genoma de adenovirus es relativamente grande y los
diferentes vectores tienen secciones variables de delecin del ge
noma (Yeh y Perricaudet, 1997). Todos los vectores sin intesti
no eliminaron genes virales y pueden acomodar hasta 35 kb de
DNA teraputico.
El gran problema con los vectores adenovirales es su inmunogenicidad (Kafri y cois., 1998). Aunque se ha administrado con se
guridad una vacuna viva de adenovirus de replicacin competente
a varios millones de reclutas del ejrcito estadounidense durante
varias dcadas (para proteccin contra infecciones adenovirales na
turales), en varios estudios clnicos de teraputica gnica constitu
yeron un problema las reacciones inmunitarias indeseables. Jesse
Gelsinger muri en septiembre de 1999, dos das despus de reci
bir 6 X 1013 partculas adenovirales recombinantes por inyeccin
intraheptica en un estudio clnico de fase I de teraputica gnica
para deficiencia de transcarbamilasa de ornitina. Los pacientes en
otros estudios clnicos sufrieron reacciones inflamatorias menores
pero de consideracin. Ms an, debido a que estos vectores no se
integran, la expresin gnica es de corto trmino. Los adenovirus
recombinantes de primera generacin empleados en estudios cl
nicos de teraputica gnica de fibrosis qustica mostraron que la
624
CAPTULO VEINTIUNO
A) G e n o m a retroviral
5 'h
gag
B) G e n o m a d e l v e c to r
pol
5 ' |--------- li------------------ P
env
" I -------- 1 3 '

G en te ra p u tic o
C ) C lu la d e e m p a c a m ie n to M
G e n o m a s d e l v e c to r
P ro ten as
g a g /p o l
A ^ A ^
N c le o
P ro te n a s en v
Fig. 21-7. Preparacin y empacamiento de un vector retroviral de teraputica gnica.

Se eliminan los genes gag, pol y env del genoma retroviral y se reemplazan por el gen teraputico. Se conserva la secuencia psi; sta la reconocen pro
tenas virales para ensamble de RNA en una partcula viral. Las clulas empacadas proporcionan las funciones de gag, pol y env, pero los genes se en
cuentran en molculas separadas y no hay secuencia psi. Esto se lleva a cabo para reducir al mnimo el riesgo de producir virus de replicacin
competentes. Los genomas virales recombinantes se empacan en partculas virales infecciosas, pero de replicacin deficiente, que brotan de la clula y
se recuperan del sobrenadante. Reimpreso con autorizacin de Somia y Verma (2000), Nature Review Genetics, 2000 Macmillan Magazines Ltd.
expresin transgnica declin despus de unas dos semanas y fue

insignificante alrededor de cuatro semanas despus. Sera necesa
rio repetir la administracin para sostener la expresin, que slo
podra exacerbar la reaccin inmunitaria. Es posible que los vecto
res adenovirales encuentren su principal aplicacin en los casos en
que se requiere un valor alto de expresin pero transitorio, por
ejemplo para destruir clulas cancerosas.
Virus vectores adenorrelacionados

Los virus adenorrelacionados (AAV) son virus DNA de cadena ni
ca no patgenos que dependen de la coinfeccin por un virus cola
borador adeno o herpes para replicarse. El AAV humano no modi

ficado se integra en el DNA cromosmico en un sitio especfico en
19ql3.3-qter. sta es una propiedad muy conveniente que propor
ciona la ventaja de expresin a largo plazo sin el riesgo de mutagnesis insercional que es un gran problema con los retrovirus.
Infortunadamente, la especificidad de integracin la proporciona la
protena viral rep y el gen rep se elimina en los vectores utilizados
para transferencia gnica. Como en otros sistemas, las funciones
necesarias para producir partculas virales (incluido rep) las sumi
nistra una clula de empacamiento. Se ha observado delecin del
96% del genoma de AAV en vectores basados en AAV. Esto propor
ciona un grado elevado de seguridad porque los vectores recombi-
21.5
MTODOS PARA INSERTAR Y EXPRESAR UN GEN EN UNA CLUIA O TEJIDO BIANCO | 625
nantes no contienen genes virales. Sin embargo, el genoma AAV es

muy pequeo e incluso estos vectores con deleciones muy altas s
lo pueden incluir insertos hasta de 4.5 kb.
Lentivirus
Son retrovirus especializados que tienen el til atributo de infec
tar clulas que no se dividen (Vigna y Naldini, 2000). Al igual
que otros retrovirus, se integran en los cromosomas del husped
en forma aleatoria y permiten la posibilidad de expresin gnica
a largo plazo pero con todas las implicaciones de seguridad que
conlleva la integracin. El HIV humano es la base de la mayor
parte de los vectores lentivirales y, de manera comprensible, cau
sa nerviosismo por el riesgo de generar de manera inadvertida la
replicacin del virus competente. El genoma de HIV es ms com
plejo que el gag, p o ly env de los retrovirus estndar (vase fig. 2113) y se dedic mucho trabajo a eliminar genes innecesarios y
generar lneas de empacamiento en tanto se conserva la capacidad
de infectar clulas que no se dividen. Los vectores que se autoinactivan proporcionan un elemento adicional de seguridad (Miyoshi y cois., 1998).
Virus del herpes simple como vectores

Los vectores HSV son trpicos para el sistema nervioso central
(SNC). Son virus complejos con un genoma de DNA de doble ca
dena de 152 kb que contiene cuando menos 80 genes. Pueden es
tablecer infecciones latentes durante toda la vida en ganglios
sensoriales en los que existen como elementos extracromosmicos
no integrados. Podra aprovecharse el mecanismo de latencia para
A)
permitir la expresin a largo plazo de los genes transferidos, que se

diseminaran por fortuna a travs de una red sinptica. Sus princi
pales aplicaciones seran el aporte de genes al interior de neuronas
para el tratamiento de enfermedades como la de Parkinson y tumo
res del sistema nervioso central. La capacidad del inserto es cuando
menos de 30 kb. Los vectores prcticos se encuentran an en una
etapa inicial de desarrollo (Fink y Glorioso, 1997).
21.5.4 Los sistemas vectores no virales evitan muchos

de los problemas de inseguridad de los virus
recombinantes, pero las tasas de transferencia
gnica son casi siempre bajas
En el laboratorio es relativamente fcil llevar DNA extrao al inte
rior de las clulas y algunos de los mtodos tienen posibilidades en
terapia gnica si se demuestra que no es posible resolver los proble
mas de seguridad de los sistemas virales. Sin embargo, en la actua
lidad todos adolecen de una tasa baja de transferencia gnica y
duracin de la expresin corta.
Liposomas
Los liposomas son vesculas sintticas que se forman de manera es
pontnea cuando se mezclan ciertos lpidos en solucin acuosa. Por
ejemplo, los fosfolpidos pueden formar vesculas de doble capa que
simulan la estructura de membranas biolgicas, con los grupos fos
fato hidroflicos en la parte exterior y las colas lipdicas hidrofbicas
en la interior. El DNA por transferir se empaca in vitro con los lipo
somas y se utilizan de modo directo para transferencia gnica a un
tejido blanco in vivo (fig. 21-8). Los liposomas catinicos tienen
Lpido
A gua
C)
T ran sferir
C lu la b la n co
N cleo
Fig. 21-8. Uso de liposomas para el aporte de genes in vivo.

A) Los liposomas son vesculas sintticas que se forman de manera espontnea en solucin acuosa cuando se mezclan ciertos lpidos. Pueden llevar
una carga de superficie positiva (catinica) o negativa (aninica), segn sea la qumica de los lpidos utilizados. B) Se transporta el cargamento de DNA
dentro de liposomas aninicos o se une a la superficie de liposomas catinicos. C) El transporte de DNA ocurre cuando se fusiona un liposoma con la
membrana plasmtica de una clula.
626 I CAPTULO VEINTIUNO ! NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
una carga de superficie positiva y enlazan DNA en el exterior; los liposomas amnicos poseen una carga de superficie negativa y se for
man con el DNA en el interior. La cubierta lipdica permite que
sobreviva el DNA in vivo, se enlace a clulas y se endocite en el in
terior de stas. Los liposomas catinicos son los empleados ms a
menudo en experimentos de transferencia gnica (vase Huang y Li,
1997, para referencias). A diferencia de los vectores virales, es fcil
preparar los complejos de DNA y lpido y no hay lmite en cuanto
al tamao del DNA que se transfiere. Sin embargo, la eficiencia de
transferencia gnica es baja y el DNA introducido no est diseado
para integrarse en el DNA cromosmico. Como resultado, cual
quier expresin de los genes insertados es transitoria.
Inyeccin directa o bombardeo de partculas

En algunos casos es posible inyectar de manera directa DNA con
una jeringa y aguja dentro de un tejido blanco, como el msculo.
Por ejemplo, este mtodo se consider para la distrofia muscular de
Duchenne. En los estudios iniciales se investig la inyeccin intra
muscular de un gen de distrofina en un modelo de ratn, mdx (Acsadi y cois., 1991). Debido al enorme tamao del gen de distrofina
natural, se us un minign que comprenda el cDNA de la distro
fina ajustado con secuencias reguladoras para asegurar una expre
sin de alto nivel, como un promotor viral potente. En un mtodo
alternativo de inyeccin directa se utilizan tcnicas de bombardeo
de partculas (biolstica o pistola de genes): se recubren con DNA
pelotitas de metal y se disparan con una pistola especial dentro de
las clulas. Con este mtodo simple y seguro en trminos compa
rativos, se tuvo xito en la transferencia gnica a varios tejidos dife
rentes. Sin embargo, con cualquiera de estos mtodos de inyeccin
directa es muy mala la eficiencia de la transferencia gnica y no se

integra de forma estable el DNA inyectado. Esto puede implicar
menos problemas en tejidos como el msculo, que no prolifera con
regularidad y en el cual puede continuar la expresin del DNA in
yectado durante varios meses.
Endocitosis mediada por receptor

En este mtodo se acopla el DNA por transferir a una molcula
blanco que puede enlazarse a un receptor de superficie celular espe
cfico, lo cual induce endocitosis y transferencia del DNA al interior
de la clula. Por ejemplo, los hepatocitos depuran asialoglucoprotenas del suero mediante receptores en su superficie celular. Una
asialoglucoprotena que se enlaza de manera covalente a polilisina enlaza de modo reversible DNA por una interaccin electros
ttica entre la polilisina de carga positiva y el DNA de carga
negativa. Si se administra el complejo en el hgado por infusin a
travs de las vas biliares o del lecho vascular, los hepatocitos lo
captan de forma selectiva. En un mtodo ms general se utiliza el
receptor de transferrina que se expresa en muchos tipos de clu
las, pero es relativamente abundante en clulas en proliferacin y
hematopoyticas (fig. 21-9).
En condiciones normales, las sustancias que se internalizan en
esta forma se llevan a lisosomas y es necesario proporcionar cierto
mecanismo de escape para que el DNA llegue al ncleo celular.
Una posibilidad es transferir de manera concurrente adenovirus o
protenas de stos, que alteran de modo especfico el endosoma
temprano y permiten que escape el contenido. La eficiencia de la
transferencia gnica puede ser alta, pero el mtodo no est disea
do para permitir la integracin de los genes transferidos.
Fig. 21-9. Transferencia gnica a travs de endocitosis mediada por receptor.

Despus de enlazar el ligando, se invagina la membrana plasmtica y a continuacin se pellizca, con lo cual deja el complejo de receptor-ligando en una
vescula intracelular, el endosoma. El ligando podra ser un adenovirus que lleva un gen teraputico, como se muestra en este caso, o DNA teraputico
enlazado a alguna otra molcula para la que la clula blanco posee un receptor especfico. En condiciones normales, los endosomas se dirigen a lisoso
mas para degradacin. Para expresarse, el DNA extrao debe escapar de alguna manera del endosoma, antes que suceda lo anterior, y llegar al ncleo.
Los adenovirus alteran de manera especfica los endosomas y permiten un escape eficiente.
21.6
21.6
MTODOS PARA REPARAR O INACTIVAR UN GEN PATGENO EN UNA CLULA O TEJIDO
Mtodos para re p arar o in activar

un gen patgeno en una clula
o tejido
Los mtodos que se describieron en la ltima seccin tienen co

mo fin, de una manera u otra, insertar un gen deseado dentro de
una clula o tejido blanco y hacer que se exprese a un nivel y por
algn tiempo apropiados para el problema clnico particular. No
obstante, algunos problemas requieren una conducta diferente.
Los padecimientos originados por ganancia d e fu n ci n de un gen
(seccin 16.5) o un efecto dom inante negativo (seccin 16.4.3) no
se benefician de esta forma de tratamiento. Si el problema es un
gen residente que acta de un modo perjudicial, la nica solucin
es eliminar o inactivar el gen agresor. Los ejemplos tpicos son pa
decimientos mendelianos dominantes (adems de los secundarios
a haploinsuficiencia, seccin 16.4.2), oncogenes activados en clu
las cancerosas y reacciones inmunitarias inapropiadas en enferme
dades autoinmunitarias. Tambin sera factible tratar enfermedades
infecciosas al inhibir un gen o un producto gnico especfico del
patgeno.
Para lograr lo anterior se intentan varias medidas. Puede des
truirse el gen agresor o prevenir su expresin mediante disminucin
de la transcripcin, destruccin del transcrito o inhibicin del pro
ducto protenico. Cualquiera que sea el mtodo empleado, debe lle
varse al interior de la clula blanco alguna clase de agente o vector y
hacer que funcione ah. A este respecto, los problemas del aporte y
expresin eficientes son similares a los descritos en la seccin ante
rior. En afecciones dominantes u oncogenes activados existe el pro
blema adicional de disear un agente que ataque de manera selectiva
el alelo mutante sin afectar el alelo normal. Esta rea se considera la
segunda onda de la teraputica gnica. Los estudios actuales a este
respecto se dirigen a demostrar el principio siguiente: es probable
que los tratamientos prcticos slo se desarrollen una vez que se ob
serve que funcionan de modo satisfactorio las teraputicas de au
mento de genes.
21.6.1 Reparacin de un alelo mutante mediante

recombinacin homologa
En muchas tcnicas de ingeniera gentica estndar en organismos
inferiores se utiliza la recombinacin homologa para reemplazar
una secuencia por otra, de tal manera que es natural considerar su
uso para reparar un gen mutante patgeno. En la recombinacin
homologa de fragmento pequeo se usa uno de los mtodos estn
dar para llevar un dplex de DNA de 400 a 800 pb, que contiene
la secuencia de tipo silvestre dentro de la clula blanco (Goncz y
cois., 2001). Se han publicado pruebas del principio, pero ha resul
tado difcil lograrlo con la eficiencia suficiente para que sea til des
de el punto de vista teraputico.
21.6.2 Inhibicin de la traduccin mediante

oligonucletidos antisentido
Los oligonucletidos antisentido (de manera caracterstica de 12 a
30 nucletidos de largo) pueden inhibir la traduccin de mRNA
62^
complementario mediante la formacin de un dsRNA o una h

lice doble de DNA-RNA (Galderisi y cois., 1999). En algunos or
ganismos, como el nematodo C. elegans, se convierte con eficiencia
el dsRNA en molculas de RNA de interferencia pequeas (siRNA), que inactivan transcritos homlogos por el mecanismo mal
comprendido pero muy eficiente de iRNA (vase ms adelante).
En los seres humanos no sucede al parecer lo anterior. Las clu
las humanas no tienen, o en escasa medida, la enzima Dicer ne
cesaria para elaborar siRNA. En lugar de ello, el dsRNA o el
DNA-RNA se descomponen mediante RNA-asa de H. Esta en
zima degrada el RNA pero no la cadena de DNA de un dplex
RNA-DNA, lo cual permite en consecuencia que las molculas
de DNA antisentido se comporten en forma semicataltica. La
molcula antisentido suele modificarse de forma qumica para
tornarla ms resistente a nucleasas celulares. Enlaces fosforotioato sustituyen enlaces fosfodister o se emplean cidos nucleicos
pptidos cuando se reemplaza la totalidad de la estructura bsica
de azcar fosfato con un marco estructural pptido sinttico re
sistente a la nucleasa. Esto conlleva la desventaja de toxicidad
inespecfica y asimismo el vector antisentido debe sintetizarse en
forma qumica y exgena, en tanto que los oligos antisentido no
modificados pueden producirse en el interior de la clula de un
plsmido apropiado. Los oligos antisentido tienen efectos bas
tante impredecibles. En algunos casos se silencia con eficiencia y
de manera especfica el gen blanco, pero con frecuencia hay po
co efecto o acciones inespecficas. Los dsRNA mayores de unos
30 pb de largo suelen inducir la produccin de interfern, que
conduce a una supresin general de la traduccin. En 1998, el
primer medicamento antisentido que lleg al mercado fue el vivatreno, un DNA modificado por fosforotioato para el trata
miento de infecciones por citomegalovirus en pacientes con sida.
21.6.3 Destruccin o reparacin selectiva de mRNA

por una ribozima
En el transcurso de los aos se descubri un nmero cada vez mayor
de casos en que las molculas de RNA funcionan como enzimas (nbozimas, vase Doudna y Cech, 2002). Por ejemplo, participan RNA
catalticos en telomerasas (que actan en el DNA), en el empalme intrn-exn (por accin en el RNA) y como la transferasa de peptidilo
de ribosomas (acta en polipptidos). Las molculas de RNA tienen
muchas propiedades que las tornan aptas para actuar como enzimas.
Forman una diversidad de estructuras tridimensionales por virtud de
las cuales pueden enlazarse de forma especfica a DNA, RNA o mo
lculas protenicas y tienen muchos grupos hidroxilo y amino poten
cialmente reactivos.
Los terapeutas gnicos se interesan sobre todo en las ribozimas
que cortan RNA blanco en una forma especfica de secuencia. En la
naturaleza, los RNA de autocorte generan cadenas de la longitud del
genoma mediante el corte especfico de sitio de concatmeros en vi
rus RNA que se replican mediante un mecanismo circular en enro
llamiento. Los ejemplos naturales incluyen las ribozimas en cabeza de
martillo (40 nt), horquilla (70 nt), HDV (virus delta humano, 90 nt
y VS (satlite Varkud; 160 nt) (Doudna y Cech, 2002). Las ribozi
mas en cabeza de martillo pueden convertirse mediante ingeniera
gentica en enzimas de corte trans muy verstiles, cuya secuencia de
628
CAPTULO VEINTIUNO
RNA blanco puede especificarse al ajustar la ribozima en secuen

cias complementarias (fig. 21-10). Tal y como ocurre con los oligonucletidos antisentido (vase antes), la ribozima puede tornarse
resistente a nucleasas en la clula mediante modificacin qumica,
pero a continuacin debe suministrarse de modo exgeno en lugar
de producirse por transcripcin natural dentro de una clula blan
co transfectada. Los primeros estudios clnicos de fase I de ribozimas se iniciaron en 1998 y se encuentran en curso estudios clnicos
de fase II en los que se utilizan ribozimas dirigidas al mRNA del re
ceptor VEGF para inhibir la angiognesis en tumores de mama y
colorrectales (Sullenger y Gilboa, 2002).
Debido a que la especificidad de las secuencias de las ribozimas
est controlada por pareamientos de bases que se comprenden bien,
pueden disearse con facilidad para degradar de manera especfica
un mRNA mutante en una enfermedad dominante, en tanto dejan
intacto el transcrito de tipo silvestre. De manera ms ambiciosa, se
disearon ribozimas para reparar transcritos mutantes mediante
reacciones de transempalme en las que se corta una secuencia mutanre predeterminada del mRNA y se reemplaza por la secuencia de
tipo silvestre (Sullenger y Gilboa, 2002). Se ha demostrado que to
das estas ideas actan en sistemas experimentales, pero an es ne
cesario determinar si pueden desarrollarse teraputicas prcticas.
21.6.4 Inhibicin selectiva del alelo mutante mediante

interferencia por RNA (iRNA)
sta es la tcnica que ha suscitado mayor atencin en la actualidad.
Como se describe en la seccin 20.2.6, es posible inhibir de mane
ra especfica y muy eficiente la expresin gnica en una gran varie
dad de organismos mediante RNA de interferencia pequeos
(siRNA). Son RNA de doble cadena de 21 a 23 nt con terminales
5 fosforiladas y extremos salientes 3' 2-nt. En muchos organismos
se cortan con eficiencia dsRNA ms largos en siRNA mediante la
enzima Dicer. Esto no acta en clulas humanas, pero es posible
5 '---------- X XX XX XX X XX X iG U C l x x x x x x x x x x x x
3' YYYYYYYYYYYCA
qc
- AAAAAAAA 3'
YYYYYYYYYYYY 5'
.gV
ga
A* U Gu
G 'C
G *C
A G
GU
Componente
cataltico
Fig. 21-10. Empleo de una ribozima en cabeza de martillo de corte

trans para destruir un mRNA mutante.
Las ribozimas en cabeza de martillo naturales son autocortantes. Para
los propsitos de la teraputica gnica, se separa la cadena que con
tiene el sitio por cortar (blanco) de la cadena cataltica (la ribozima por
ingeniera). Al disear la ribozima con la secuencia (YYYY..) comple
mentaria del blanco (XXXX...) es posible dirigirse de modo especfico a
cualquier RNA deseado.
generar siRNA en estas ltimas mediante la transcripcin de vecto

res de DNA adecuados. Se disean los transcritos de tal manera que
puedan retroceder para formar horquillas en asa con vstago. El
vastago es de 19 a 29 pb y est diseado para ajustarse al blanco y
el asa es de 6 a 9 nt. En la actualidad, el iRNA es un medio de la
boratorio muy eficiente para crear fenotipos con prdida de fun
cin. Menos claro es si resulta factible desarrollarlo para un medio
prctico de tratamiento, aunque la posibilidad es estimulante.
21.7
Algunos ejem plos de intentos

de te ra p u tic a gnica hum ana
En la figura 21-5^4 se muestran los 600 protocolos de teraputica g

nica aprobados, 63% para el cncer y slo 12% para trastornos monognicos. Otro 6 % corresponde a enfermedades infecciosas y 8 %
a padecimientos vasculares. A continuacin se proporcionan revisio
nes generales breves y algunas referencias sobre el progreso de la te
raputica gnica en varias reas importantes. A pesar del limitado
nmero de estudios clnicos, las enfermedades monognicas siempre
ocupan un sitio primordial en la agenda de la teraputica gnica y el
primer xito definitivo se logr en esa rea.
21.7.1 El primer xito definitivo: curacin d.e la

inmunodeficiencia combinada grave ligada a X
Desde la dcada de 1990, muchas publicaciones notificaron el in
tento exitoso para tratar la inmunodeficiencia combinada grave
(IDCG) autosmica recesiva. Se transfectaron ex vivo linfocitos T
de un nio afectado con deficiencia de desaminasa de adenosina
con un vector retroviral que contena un gen ADA funcional, se
expandieron en cultivo y se restituyeron al paciente. Ms adelan
te, otros enfermos recibieron un tratamiento similar, hasta con 10
a 12 teraputicas por individuo. Varios sujetos refirieron mejoras
clnicas notables. Sin embargo, ninguno de los pacientes dej de
recibir tratamiento con un preparado enzimtico, lo que determi
n que sea incierta la magnitud de la mejora atribuida a la tera
putica gnica.
El primer xito indudable se consigui en un padecimiento
relacionado, IDCG ligada a X (Cavazzana-Calvo y cois., 2000;
vase fig. 21-11). Una vez ms, el tratamiento fue ex vivo con el
uso de un vector retroviral que codificaba la cadena 7 c del gen re
ceptor de citocina IL2R. Se incubaron durante tres das clulas de
mdula sea que expresaban CD34, un marcador de clulas ma
dre hematopoyticas, con el vector retroviral, con lo cual aumen
t en este lapso cinco a ocho veces de nmero y a continuacin
se regresaron al paciente (fig. 21-11). Nueve de los 11 enfermos
tratados se curaron y pudieron llevar una vida normal (HaceinBey-Abini y cois., 2002). No obstante, como se mencion, dos de
ellos desarrollaron despus leucemia, casi con certeza como resul
tado de la activacin insercional del oncogn LM 02 (Check,
2002, 2003). Se suspendieron en poco tiempo a nivel mundial
todos los estudios clnicos que incluan transduccin retroviral de
grandes fondos comunes de linfocitos, mientras no se compren
dieran del todo estos acontecimientos trgicos; al momento de es-
21.7
ALGUNOS EJEMPLOS DE INTENTOS DE TERAPUTICA GNICA HUMANA
C lu la s m a d re C D 3 4 + e n riq u e c id a s m e d ia n te
a n tic u e rp o co n c u e n ta s m a g n tic a s
A s p ira c i n d e 3 0 -1 5 0 mi
d e m d u la s e a b a jo
a n e s te s ia g e n eral
Infusin d e 1 4 -3 8 m illo n e s
d e c lu la s p o r kg d e p e so
co rp o ral
629
V e c to r retroviral q u e lle va el
g en re c e p to r d e c ito c in a yc
T ra n s d u c ir c lu la s en b o ls a d e p l stic o
d u ra n te tre s das; las c lu la s se
m u ltip lic an c in co a o c h o v e ce s.
Fig. 21-11. Teraputica gnica de la enfermedad por inmunodeficiencia combinada grave ligada a X (IDCG-X).
ste es el primer xito claro de la teraputica gnica. De 11 nios de uno a 11 meses de edad que se trataron en el Necker-Enfants Malades Hospital,
Pars, nueve se curaron. Vase Hacein-Bey-Abini y colaboradores (2002). Infortunadamente, dos de los nueve desarrollaron con posterioridad una for
ma de leucemia, casi con seguridad como resultado de la activacin del oncogen LM02 por la insercin cercana del vector retroviral.
cribir este libro, an no es posible precisar cuntos de ellos se su

perarn alguna vez.
21.7.2 Intentos de teraputica gnica para la fibrosis

qustica
Entre las enfermedades mendelianas, la fibrosis qustica debera ser
una de las ms susceptibles a la teraputica gnica. El problema se
debe a la falta del canal de cloruro codificado por CFTR, sobre to
do en el epitelio de las vas respiratorias. Estudios de pacientes con
alelos CFRT parcialmente activos sugieren que sera suficiente 5 a
10% de la cantidad normal para producir una buena respuesta cl
nica. Esto evitara cuando menos la progresin de la enfermedad y
revertira algunos efectos secundarios. El aporte gnico especfico
de tejido podra llevarse a cabo mediante un inhalador en aerosol.
Se han publicado cuando menos 18 estudios clnicos de teraputi
ca gnica para fibrosis qustica (FQ) (Davies y cois., 2001). En los
estudios clnicos iniciales se usaron adenovirus, que infectan de ma
nera natural clulas pulmonares que no se dividen. A dosis altas, es
tos virus indujeron en ocasiones reacciones inflamatorias y, en
especial despus de la muerte de Jesse Gelsinger consecutiva a ade

novirus (vase antes), en la actualidad se consideran con cierta cau
tela. En cuatro de los cinco estudios clnicos ms recientes se
emplearon liposomas o virus adenorrelacionados (AAV). Varios es
tudios clnicos demostraron transferencia gnica y expresin por
tiempo breve, pero es claro que todos estos estudios se encuentran
bastante lejos de la posibilidad de aplicacin clnica.
Un problema de consideracin es la barrera fsica de moco y
glucoclix que cubre las clulas epiteliales de las vas respiratorias,
en particular en los pulmones infectados de pacientes con fibrosis
qustica. Pueden llevarse agentes de teraputica gnica al interior de
las vas respiratorias, pero se necesitan vehculos ms complicados
para permitir la transduccin eficiente de clulas epiteliales. Asi
mismo, un problema es la transfeccin de las clulas correctas. Los
adenovirus tienden a infectar clulas basales del epitelio, en tanto
que los grados ms altos de expresin natural de CFTR se observan
en glndulas submucosas. Como ideal, deben enviarse clulas ma
dre porque las clulas epiteliales de superficie tienen un periodo de
vida de slo 120 das, de tal manera que sera necesario repetir la
administracin repetida con todos los problemas consiguientes de
la reaccin inmunitaria.
630
CAPTULO VEINTIUNO i NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
21.7.3 Intentos de teraputica gnica para la distrofia

muscular de Ouchenne
Estudios de mujeres portadoras de la distrofia muscular de Duchenne (DMD) y pacientes con la distrofia muscular de Becker, menos
grave, mostraron que en enfermos con DMD sera benfico restituir
alrededor de 20% de la expresin normal del gen de la distrofina. Sin
embargo, la teraputica gnica para DMD afronta el doble problema
del enorme tamao del gen de la distrofina (2.4 Mb) y de llevarlo a
las clulas de los msculos esqueltico y cardiaco. Vase Chamberlain
(2002) para una revisin del progreso. Incluso el cDNA es muy gran
de, de 14 kb, para muchos vectores. Con base en la observacin de
un sujeto que experiment una delecin de los exones 17 a 48 del
gen de la distrofina (46% de la secuencia de codificacin), pero que
slo sufra distrofia de Becker leve, se prepar un minigen de 6.3 kb
que pudo ajustarse en vectores adenovirales y retrovirales. Es impor
tante no desencadenar reacciones inmunitarias de mediacin celular;
el uso de un promotor especfico de msculo para llevar el transgen
ayuda a minimizar este problema. Los virus adenorrelacionados mos
traron una buena persistencia en el msculo, cuando menos en rato
nes sanos, y tambin los plsmidos son vehculos prometedores. Pa

ra el xito del tratamiento es preciso llevar los vectores no slo al in
terior del msculo esqueltico, sino tambin al corazn y el
diafragma y hasta la fecha an no se resuelve este problema. Un m
todo alternativo consiste en incrementar la expresin de utrofina
(MIM 128240), una molcula parecida a la distrofina que en condi
ciones normales enlaza el complejo de actomiosina a la membrana de
la clula muscular justo en la unin neuromuscular. Un locus autosmico separado codifica la utrofina y permanece intacto en nios
con distrofia muscular de Duchenne.
Tambin se intent en la DMD la teraputica celular median
te el trasplante de mioblastos en msculos de nios afectados. En
algunos estudios el paciente ocasional mostr ciertas fibras muscu
lares positivas a distrofina, pero en ningn enfermo se observ me
jora clnica. Se afirma que las clulas madre administradas mediante
trasplante de mdula sea pueden ser capaces de migrar a los ms
culos y actuar como clulas madre musculares (Ferrari y cois., 1998).
Si se confirma, ello ofrece una esperanza real de tratamiento de la
DMD mediante los mtodos que curaron la inmunodeficiencia
combinada grave.
Cuadro 2 1 -3 . Ejemplos de estudios clnicos de teraputica gnica para el cncer

Se trata sobre todo de estudios de fase 1 (seguridad bsica); en esta etapa del desarrollo, casi ninguno de los estudios clnicos tiene como fin beneficiar en
trminos clnicos a los pacientes. Vase la base de datos de estudios clnicos de los NIH (www4.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltrial.htm) para un examen amplio.
Trastorno
Clulas alteradas
Medidas de teraputica gnica
Cncer de ovario
Clulas tumorales
Inyeccin intraperitoneal de retrovirus o adenovirus que codifican p53 de longitud completa o cDNA de
BRCA1, con la esperanza de restablecer el control del ciclo celular
Cncer de ovario
Clulas tumorales
Inyeccin de adenovirus que codifica un anticuerpo scFv a ErbB2; se espera inactivar una seal de
crecimiento
Melanoma maligno
Linfocitos que
infiltran el tumor
Extraer LIT del tumor extirpado y expandirlos en cultivo; infectar los LIT ex vivo con un vector retroviral que
expresa el factor de necrosis tumofal a e introducirlos en el paciente. Se espera que los LIT se dirijan a
las clulas tumorales restantes y el TNF a las destruya. Vase la figura 21- 4 f para el principio
Diversos tumores
Clulas tumorales
Transfectar clulas tumorales con un retrovirus que expresa un antgeno de superficie celular, por ejemplo
HLA-B7, o una citocina, como IL-12, IL-4, GM-CSF o IFN -y. Se espera que esto incremente la
inmunogenicidad del tumor, de tal manera que lo destruya el sistema inmunitario del husped. Con
frecuencia se efecta ex vivo mediante clulas tumorales radiadas en proporcin letal. Vase la figura
21- 4 f para el principio
Cncer de prstata
Clulas dendrticas
Tratar clulas dendrticas autlogas con un antgeno tumoral o cDNA que expresa el antgeno para cebarlas
e inducir una mejor reaccin inmunitaria a las clulas tumorales. Vase la figura 21-4 f para el principio
Glioma maligno
(tumor cerebral)
Clulas tumorales
Inyectar un retrovirus que expresa cnasa de timidina (TK) o desaminasa de citosina (CDA) en el tumor.
Slo se infectan las clulas tumorales en divisin, no las clulas cerebrales circundantes que no se
dividen. A continuacin, tratar con ganciclovir (las clulas positivas a TK lo convierten en fosfato de gcv
txico) o 5-fluorocitosina (las clulas positivas a CDA lo convierten en 5-fluoruracilo). Se destruyen de
forma selectiva clulas infectadas con virus (en divisin). Vase la figura 21-12
Tumores de cabeza
y cuello
Clulas tumorales
Inyeccin de adenovirus 0NYX-015 mediante ingeniera en el tumor. El virus slo puede replicarse en
clulas con deficiencia de p53, de tal manera que lisa de manera selectiva clulas tumorales. Este
tratamiento fue eficaz cuando se combin con quimioterapia sistmica.
LIT, M ocitos infiltrantes de tumor; TNF, factor de necrosis tumoral; IL, interleucna; GM-CSF, factor estimulante de granulocitos y macrfagos; IFN, interfern.
21,7 ALGUNOS EJEMPLOS DE INTENTOS DE TERAPUTICA GN1CA HUMANA ! 631
21.7.4 Teraputica gnica para el cncer

Ms de 60% de todos los protocolos de estudios clnicos de tera
putica gnica aprobados se enfoca en el cncer (fig. 21-5). En el
cuadro 21-3 se incluye una lista de varios ejemplos, que se eligie
ron para ilustrar la gama de mtodos. Pueden mencionarse los si
guientes:
Suplementacin gnica para restaurar la funcin de genes supresores de tumor.
Inactivacin gnica para prevenir la expresin de un oncogen
activado.
Manipulacin gentica de clulas tumorales para desencadenar
apoptosis.
Im plantacin estereo tctica guiada por resonancia

de clulas productoras d e vector (CPV) en
tum ores del S N C in situ
Modificacin de clulas tumorales para tornarlas ms antignicas, de tal manera que el sistema inmunitario destruya el tumor.
Modificacin de clulas dendrticas para incrementar una reac
cin inmunitaria especfica de tumor.
B)
Uso de virus oncolticos manipulados por ingeniera para des

truir de modo selectivo clulas tumorales.
Modificacin gentica de clulas cancerosas para que stas, pe
ro no las clulas no tumorales circundantes, conviertan un pro
frmaco no txico en un compuesto txico que las destruya (fig.
21- 12).
Clulas productoras d e ve cto r dentro del tum or
21.7.5 Teraputica gnica para las enfermedades

infecciosas: HIV
H IV-l, como el patgeno viral ms importante en seres huma
nos, es el blanco de enormes esfuerzos de investigacin en toda
rama importante de la ciencia mdica. Ha sido relevante la ma
nipulacin gentica en dos reas. Gran parte del trabajo se cen
tra en intentos para desarrollar vacunas modificadas de forma
gentica por ingeniera; adems, muchos investigadores consi
deran la manipulacin gentica de las clulas husped para tor
narlas resistente al HIV. En la base de datos de los NIH de
estudios clnicos (www4.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltrial.htm)
se halla una lista de casi 40 protocolos de estudios clnicos que
incluyen transferencia gnica y que se enviaron entre 1992 y
2001. Casi todos son similares en principio al mtodo que cur
la IDCG-X. Se transfectan clulas madre hematopoyticas con
un gen del que se tiene la esperanza de que inhiba la replicacin
de HIV, por lo general en un vector retroviral, y se devuelven las
clulas tratadas al paciente. Debido a que la principal anomala
del Sida es la infeccin y destruccin de linfocitos, ste es un
medio natural para tratar de impedir que evolucione la infec
cin por HIV a sida.
El HIV es un retrovirus. La partcula viral madura consiste en
dos copias idnticas del genoma RNA de cadena nica, aunadas a
algunas protenas de centro, incluidas en una envoltura de glucoprotenas virales y lpidos captados de la membrana de la clula
husped cuando germina el virus (fig. 21-13). Al igual que los ge
nes g a g ,p o ly en v que comparten todos los retrovirus, la replicacin
de HIV requiere las protenas reguladoras Tat y Rev. Estas ltimas,
y las secuencias de RNA viral a las que se enlazan (TAR y RRE),
Clulas tum orales infectadas con retrovirus,

pero no las clulas norm ales
D)
El ganciclovir destruye las clulas infectadas
Fig. 21-12. Teraputica gnica in vivo para tumores cerebrales.

Se modifica por ingeniera un retrovirus para producir la cinasa de timidina
del virus del herpes simple (HSV-TK). Se inyectan las clulas productoras
del vector (CPV; azul) en el tumor cerebral. Debido a que los retrovirus in
fectan clulas en divisin, infectan las clulas tumorales (rosa) pero no el
tejido cerebral normal circundante (verde). Se administra por va intraveno
sa el profrmaco no txico ganciclovir (gcv). En las clulas TK+ se convier
te el gcv en trifosfato de gcv muy txico y se destruyen las clulas.
632 CAPTULO VEINTIUNO ! NUEVAS CONDUCTAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
Fig. 21-13. Ciclo de vida del virus HIV-1. ste es un retrovirus con un genoma RNA.
Al igual que otros retrovirus, son genes gag, pol y env. Una transcriptasa inversa hace una copia de DNA que se integra como un provirus dentro de los
cromosomas del husped. Se empacan mRNa y protenas virales en partculas de virus que brotan de la membrana de la clula husped. A diferencia
de los retrovirus simples, el HIV-1 codifica dos protenas reguladoras, Tat y Rev, que enlazan las secuencias TAR y RRE, respectivamente, en el genoma
viral y son esenciales para la replicacin del virus. stos son los principales blancos de la teraputica gnica de HIV.
son los blancos de eleccin para muchos de los intentos de tornar

resistentes los linfocitos a HIV. Las medidas incluyen las siguientes:
Uso de RNA antisentido. Se han elaborado retrovirus que co
difican RNA antisentido a TAR, mRNA tat y rev superpuestos
y mRNA p o l y env.
Empleo de RNA decodificante. Un retrovirus que se dirige a
la expresin de alto nivel de un transcrito que contiene la se
cuencia RRE podra secuestrar toda la protena Rev y evitar la
replicacin de HIV.
Utilizacin de mutantes dominantes negativos. Algunos vec
tores retrovirales codifican una protena Rev mutante, RevMIO.
sta enlaza el RRE pero no ensambla despus los complejos
multiprotenicos necesarios para que salga el RNA del ncleo.
Uso de ribozimas. Varios grupos prepararon retrovirus que co
difican ribozimas. RRz2 es una ribozima en cabeza de martillo
dirigida contra la regin reguladora tat, tambin se emplea otro
tipo, la ribozima en horquilla, para cortar el genoma de HIV.
Empleo de intracuerpos. Se han usado retrovirus que codifi

can anticuerpos intracelulares scFv (vase seccin 21.3.4) para
intentar inactivar las protenas reguladoras Tat o Rev o la glucoprotena de recubrimiento gpl60.
En las etapas iniciales de la infeccin por HIV se observa un recam
bio masivo de linfocitos, a medida que el sistema inmunitario lu
cha por destruir las clulas infectadas. Si la reaccin inmunitaria
fuera bastante ms eficaz, tal vez podra contenerse a los virus en
esa etapa. Adems de los esfuerzos para desarrollar vacunas, tam
bin existen trabajos dedicados a modificar las clulas T de tal mo
do que destruyan clulas infectadas con mayor eficiencia. Se han
diseado retrovirus para que las clulas T CD8+expresen un recep
tor de clula T quimrico que dirija su respuesta citotxica a clu
las infectadas por HIV.
Pueden consultarse pormenores de estos mtodos en la base de
datos de los NIH incluida en la seccin enfermedades infecciosas
(iclick en Scientific Abstract para cualquier protocolo de inters). In
BIBLIOGRAFA
vitro, las clulas manipuladas muestran con frecuencia una gran re

sistencia a la infeccin por HIV in vivo se demostraron injertos de
mdula sea a largo plazo (varios meses o hasta uno a dos aos) en
unos cuantos estudios clnicos. Hay que preguntar si es posible que
ocurra el injerto a un grado suficiente para proporcionar un fondo
633
comn de linfocitos resistentes a HIV de utilidad clnica. El injer

to de alto grado podra lograrse tras destruir primero la mdula
existente del paciente con sustancias qumicas citotxicas y radia
cin, si bien llevarlo a cabo en un sujeto con sida sera una medida
desesperada.
Base de datos de los NIH de estudios clnicos de teraputica
gnica: www4.od.nih.gov/oba/rac/clinicaltriai.htm
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G losario
Nota: adems de este glosario general, tambin hay cuatro glosarios especializados:
Glosario de mtodos de PCR, recuadro 5-1, pg. 124
Glosario de genmica, recuadro 8-1, pg. 209
Glosario de hibridacin de cido nucleico,

recuadro 6-3, pg. 168
Glosario de grupos filogenticos metazoarios,

recuadro 12-5, pg. 386
Siempre que es posible, se hace referencia a una figura, recuadro o seccin del texto que ilustra o aclara el tema. Las palabras en itlicas se
refieren a entradas adicionales en el glosario o referencias de figuras y recuadros.
Accin Cis (de un factor regulador): control de la actividad del
gen slo cuando es parte de la misma molcula de DNA o del
cromosoma como el factor regulador. Comprense factores regu
ladores d e accin trans que pueden controlar sus secuencias
blanco prescindiendo de su localizacin en el cromosoma.
A ccin trans: (de un factor regulador) afecta la expresin de todas
las copias del gen blanco, prescindiendo de la localizacin cromosmica. Los factores reguladores de accin trans suelen ser
protenas que pueden difundirse a sus sitios blanco.
Alelo nulo: alelo mutante que no produce productos.
Alelos: formas alternativas del mismo gen.
Amnios: una de las cuatro membranas extraembrionarias de
mamferos. Vase recuadro 3-8.
Amplificacin del genoma total: mtodo de PCR que utiliza
cebadores altamente degenerados que pueden amplificar un
nmero muy grande de secuencias aleatorias diseminadas a
travs del genoma. Puede utilizarse para permitir pruebas
repetidas de DNA de una clula, por ejemplo, en la tipificacin
de un espermatozoo aislado (seccin 11.5.4).
Anlisis de par de hermanos: vase Anlisis d e p a r d e hermanos
afectados.
Anlisis de par de hermanos afectados (PHA): forma de anlisis
de enlace no param trico basado en la medicin de haplotipos que
comparten hermanos que padecen la misma enfermedad. Vase
figura 15-3.
Anlisis de segregacin: metodologa estadstica para inferir mo
dos de herencia.
Aneuploida: constitucin cromosmica con uno o ms cromoso
mas extra o ausencia de un grupo euploide completo.
Animal transgnico: un animal en el cual el DNA extrao (un
transgn) introducido artificialmente se incorpora de manera
estable dentro de la lnea germinal. Vanse figuras 20-2, 20-3.
Anneal: vase recuadro 6-3.
Anticipacin: tendencia al incremento de la gravedad de un
padecimiento en generaciones sucesivas. Suele deberse a sesgo de
valoracin (vase seccin 4.3.3), pero se ve realmente con m uta
ciones dinm icas (seccin 16.6.4).
Anticodn: secuencia de tres bases en una molcula de tRNA que
forma pares de bases con el codn de mRNA. Vanse figuras 17B y 1-20.
Anticuerpo monoclonal (Acm): anticuerpos puros con especifici
dad nica, producidos mediante tecnologa de hibridoma, a
diferencia de los anticuerpos policlonales que se producen por
inmunizacin. Vase recuadro 7-4.
Antimorfo: alelo con un efecto negativo dominante.
Apoptosis: muerte clular programada.

Aptitud (a): en poblaciones genticas, una medida del xito en la
transmisin de genotipos a la generacin siguiente. Llamada
asimismo aptitud biolgica o aptitud reproductiva, siempre se
encuentra entre 0 y 1.
Archaea: procariotas de clula nica que se asemejan superficial
mente a las bacterias, pero con caractersticas moleculares que
indican un tercer reino de vida. Vase recuadro 12-4.
ARMS (Sistema de amplificacin de mutacin resistente): PCR
especfica de alelo. Vanse figu ra 5-4 y 18-10.
Asociacin: tendencia de dos caracteres (enfermedades, alelos mar
cadores, etc.) a ocurrir juntos en frecuencias no aleatorias. La
Asociacin es una observacin estadstica simple, no un fen
meno gentico, pero en ocasiones puede ser causado por dese
quilibrio de enlace. Vase seccin 15.4.
Asociacin allica: vase Desequilibrio d e enlace.
Atrapamiento de exn: tcnica para detectar secuencias dentro de
un DNA genmico clonado que son capaces de empalmarse a
exones dentro de un vector especializado. Vase figu ra 7-10.
Autocigosidad: en una persona endogmica, hom ocigosidad para
alelos idnticos por descendencia.
Autosoma: cualquier cromosoma aparte de los cromosomas del
sexo, X y Y.
BAC (cromosoma bacteriano artificial): plsmido recombinante
en el que pueden propagarse insertos hasta de 300 kb de largo
en clulas bacterianas. Vase seccin 5.4.3.
Biomtrica: estudio estadstico de caracteres cuantitativos.
Bivalente: la estructura de cuatro filamentos que se observa en la
profase I de la meiosis, que comprende dos cromosomas
homlogos en sinapsis. Vase figu ra 2-11.
BLAST: familia de programas que buscan bases de datos de
secuencia para compatibilidades con una secuencia problema.
Vase recuadro 7-3.
Blastocisto: etapa muy temprana del desarrollo embrionario en la
que el embrin consiste en una pelota hueca de clulas con un
compartimiento interno lleno de lquido, el blastocele.
Bloqueo de haplotipo: variante particular de un segmento
polimorfico extendido de DNA cromosomico (tpicamente 10100 kb) que se encuentra en muchos miembros de una
poblacin y se supone que representa una variante ancestral.
Vanse recuadro 12-6 y seccin 15.4.3.
Bootstrapping: mtodo estadstico diseado para revisar la pre
cisin de un rbol evolutivo construido a partir del anlisis de
secuencia comparativa. El mtodo incluye numerosos ciclos de
636 1 GLOSARIO
reemplazo de algunos de los datos de secuencia original por

submuestras aleatorias obtenidas de los datos originales y calcu
lando nuevamente en cada ciclo la posibilidad de que el rbol
original sea correcto. Vase figu ra 12-18.
Buscador del genoma: programa que proporciona una interfaz
grfica para interrogar bases de datos del genoma. Vase seccin
8.3.6.
Calificacin lod (z): medida de la posibilidad de enlace gentico
entre locus. El log (base 10) de las posibilidades de que se enla
cen los locus (con la fraccin recombinante 0) en lugar de que
no estn enlazados. Para caracteres mendelianos una califi
cacin lod mayor de + 3 indica enlace; uno menor de -2 es una
prueba contra enlace. Vanse recuadro 13-3, figu ra 13-7.
Caminata de cromosoma: aislamiento de secuencias adyacentes a
una clona en el cromosoma caracterizado mediante genotecas
genmicas de seleccin para clonas que se superponen parcial
mente.
Cap: grupo qumico especializado que aaden las clulas para blo
quear el extremo 5 del mRNA. Vase figu ra 1-17.
Carcter dicotmico: una caracterstica como la polidactilia que
tienen algunas personas y otras no -en comparacin con una
caracterstica continua, por ejemplo, el peso, que tienen todas las
personas, pero en diferente grado-.
Caracterstica continua: una caracterstica, como el peso, que
tienen todas las personas, pero en un grado diferente -en com
paracin con un carcter dicotm ico como la polidactilia, que
tienen algunas personas y otras no-.
Cariotipo: estrictamente, significa un resumen de la constitucin
cromosomica de una clula o una persona, como 46, XY. Sin
embargo, con frecuencia el trmino se utiliza laxamente para
indicar una imagen que muestra los cromosomas de una clula
seleccionados en orden y dispuestos en pares, como en la fig u
ra 2-14.
cDNA (DNA complementario): DNA sintetizado por la enzima
transcriptasa inversa utilizando mRNA como una plantilla, sea
experimentalmente (vanse figuras 4-8 y 6-5) o in vivo (vanse
figuras 7-13 y 14-18).
Cebador: oligonucletido corto, con frecuencia de 15 a 25 bases
de largo, con pares de bases especficamente para una secuencia
blanco a fin de permitir que una polimerasa inicie la sntesis de
un filamento complementario.
Clula madre: clula que puede actuar como un precursor para
diferenciar clulas, pero que retiene la capacidad de autorrenovarse. Vase seccin 3.4.3.
Clula somtica: cualquier clula del cuerpo, excepto los gametos.
Clulas germinales (o gametos): las clulas espermatozoo y
vulo.
Clulas germinales primordiales: clulas en el embrin y el feto
que dan lugar finalmente a las clulas de la lnea germinal.
Clulas madre embrionarias: vase Clulas ME.
Clulas ME (madre embrionarias): clulas pluripotenciales
indiferenciadas derivadas del embrin. Un instrumento clave
para manipulacin gentica. Vanse Seccin 3.4.5, figuras 211, 20-3.
CentiMorgan (cM): unidad de distancia gentica. Los locus sepa
rados 1 cM tienen una probabilidad de recombinacin del 1%
durante la meiosis. Vase la figu ra 13-4 para la relacin entre
distancias genticas y fsicas.
centiRay (cR): vase recuadro 8-1.
Centrmero: la constriccin primaria de un cromosoma que sepa

ra el brazo corto del brazo largo, y el punto en el que se unen
fibras en huso para tirar de las cromtides a fin de separarlas
durante la divisin celular. Vase seccin 2.3.2.
Chip de DNA: vase M icroordenacin.
Cigoto: vulo fecundado.
Citoesqueleto: andamiaje interno de filamentos de protenas que
existe dentro de las clulas, con funciones crucialmente impor
tantes en la regulacin de la forma celular, el movimiento de la
clula y el transporte celular. Vase recuadro 3-2.
Clona: vase recuadro 8-1.
Clonacin de sustraccin: mtodo de clonacin de secuencias de
DNA que se encuentran en una muestra de DNA y no existen
en una segunda muestra, por lo general similar. Se utiliza para
seleccionar cDNA especfico de tejido mediante sustraccin
contra una genoteca de cDNA expresados ubicuamente, o para
clonar un gen eliminado (delecin) en un paciente con una
enfermedad mediante sustraccin contra DNA normal.
Clonacin posicional: clonacin de un gen del que slo se conoce
su localizacin cromosmica.
Clonacin teraputica: mtodo propuesto para el tratamiento de
una enfermedad utilizando clulas desarrolladas mediante el
trasplante de ncleos de clulas del paciente en clulas ME
humanas. Vase figu ra 21-2.
Codn: un tripleto nucletido (estrictamente en el mRNA pero,
por extensin, en el DNA genmico de codificacin) que
especifica un aminocido o una seal de detencin de traduc
cin.
Codn de terminacin: codn UAG (mbarj, UAA (ocre) o UGA
(palo) en un mRNA (y por extensin, en un gen) que seala
el extremo de un polipptido.
Coeficiente de seleccin: posibilidad de fracaso de la reproduc
cin para un cierto genotipo en relacin con el genotipo de
mayor xito. Vase seccin 4.5.2.
Compensacin de dosis: cualquier sistema que iguala la cantidad
de producto elaborado por genes que se encuentran en diferentes
nmeros. En mamferos, describe el mecanismo de activacin de
X que asegura cantidades iguales de productos gnicos codifica
dos por X en clulas XX y XY. Vase figu ra 10-26.
Complejidad: complejidad de un genoma es la longitud total o la
proporcin de secuencias nicas. En un genoma o una muestra
se encuentran muchas veces secuencias de complejidad baja.
Complementacin: dos alelos se complementan si combinados
restablecen el fenotipo de tipo silvestre (vase recuadro 4-2).
Normalmente, los alelos slo se complementan si se encuentran
en locus diferentes, aunque ocurren algunos casos de com ple
mentacin interallica.
Complementariedad de bases: vase recuadro 6-3.
Conservacin de sintenia: cuando se comparan mapas genticos
de dos organismos, se conserva la sintenia si dos o ms locus
que estn localizados en el mismo cromosoma en un organismo
se encuentran juntos en un cromosoma en el otro.
Constitucional: genotipo, anormalidad o mutacin que se encon
traba en el vulo fecundado, y por consiguiente se encuentra en
todas las clulas de una persona, distinto a un cambio somtico.
Contig: lista o diagrama que muestra una disposicin ordenada de
fragmentos clonados superpuestos que contienen en conjunto
la secuencia de un filamento de DNA originalmente continuo.
Conversin gnica: intercambio gentico sin reciprocidad que
ocurre de manera natural, en el que se altera una secuencia de
GLOSARIO [ 637
un filamento del DNA de tal manera que se torna idntico a la

secuencia de otro filamento de DNA. Vase figu ra 11-10.
Cordado: vase recuadro 12.5.
Corion: una de las cuatro membranas extraembrionarias de los
mamferos. Vase recuadro 3-8.
Cortador raro: nucleasa de restriccin que corta DNA con poca
frecuencia porque la secuencia que reconoce es grande, contiene
uno o ms CpGs, o ambos. Los ejemplos son NoA, SacII y
BssHll. Vase cuadro 4-1.
Cresta neural: grupo altamente verstil de clulas que dan lugar a
parte del sistema nervioso perifrico, los melanocitos, cierto
hueso y msculo, la retina y otras estructuras. Las clulas de la
cresta neural se forman durante la neurulacin como una
poblacin especfica de clulas que surgen a lo largo de los mr
genes laterales de los pliegues neurales y a continuacin se
desprenden de la placa neural y migran a muchos sitios espec
ficos en todo el cuerpo. Vase figu ra 3-16A.
Cromtide: desde el extremo de la fase S del ciclo celular (fig. 2-1)
hasta la anafase de la divisin celular, los cromosomas consisten
en dos cromtides hermanas. Cada una contiene una doble
hlice completa y las dos son copias exactas una de la otra.
Cromtide hermana: dos cromtides que se encuentran dentro de
un cromosoma aislado y unidas por un centrmero. Las crom
tides que no son hermanas se encuentran en cromosomas dife
rentes pero homlogos.
Cromosoma marcador: cromosoma anormal extra sin origen
identificado.
Cruzamiento desigual (CDI): recombinacin entre secuencias no
allicas en cromtides que no son hermanas de cromosomas
homlogos. Vase Figura 11-7.
Dedo de cinc: elemento polipptido que se estabiliza por la unin
de un tomo de cinc y confiere a las protenas capacidad para
unirse especficamente a secuencias de DNA. Se encuentra
comnmente en factores de transcripcin. Vase figu ra 10-8.
Descomposicin de mRNA mediada sin sentido: mecanismo
celular que degrada molculas de mRNA que contienen un
codn de terminacin prematuro (> 50 nt corriente arriba de
la ltima unin de empalme). Vase seccin 11.4.4.
Desequilibrio de enlace: asociacin estadstica entre alelos particu
lares en locus separados pero enlazados, que resulta normal
mente de un haplotipo ancestral particular comn en la
poblacin estudiada. Un medio importante para mapeo de alta
resolucin. Vanse figuras 13-10, 15-6y recuadro 15-2.
Deslizamiento de replicacin: error en la replicacin de una
secuencia de DNA repetida en tndem que da por resultado
que el filamento nuevo sintetizado tenga unidades repetidas
extra o menos comparado con la plantilla. Vase figu ra 11-5.
Desnaturalizacin: disociacin de filamentos complementarios
para proporcionar DNA, RNA, o ambos, de filamento nico.
Deuterostomas: vase recuadro 12-5.
DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante):
mtodo para detectar mutaciones mediante electroforesis de
productos de la PCR a travs de geles que contienen un gradi
ente de un desnaturalizante. Vase figu ra 18-3B.
dHPLC (cromatografa lquida desnaturalizante de alta ejecu
cin): mtodo para detectar mutaciones basado en las
propiedades de heterodplex, capaz de alta sensibilidad y
rendimiento. Vase figu ra 18-4.
Diferenciacin: proceso por el cual las clulas se especializan v se

comprometen a formar finalmente tipos especficos de clulas
maduras.
Digestin parcial: digestin, por lo general de DNA, mediante
una enzima de restriccin, que se detiene antes que se havan
cortado todas las secuencias blanco. El objeto es producir frag
mentos superpuestos. Vase figu ra 5-9.
DILAM: desorcin/ionizacin lser asistida por matriz. Mtodo
espectromtrico de masa que se utiliza comnmente para iden
tificar DNA o molculas protenicas. Vase recuadro 19-4.
Dinucletido CpG: la secuencia 5 'CG 3' dentro de una molcu
la de DNA ms larga. Los dinucletidos CpG son blancos para
un sistema especfico de metilacin d el DNA en mamferos que
es importante para controlar la expresin gnica.
Diploide: que tiene dos copias de cada tipo de cromosoma, la cons
titucin normal de la mayor parte de las clulas somticas hu
manas.
Dirigido a genes: modificacin dirigida de un gen en una clula o
un organismo. Vanse figuras 20-7, 20-8, 20-10.
Disoma uniparental: clula u organismo en el cual las dos copias
de un par de cromosomas particular derivan de un padre. Segn
el cromosoma relacionado, puede ser patognica o no. Vanse
seccin 2.5.4., recuadro 16-6.
Distal (de cromosomas): colocados comparativamente distantes
del centrmero.
Distancia gentica: distancia en un mapa gentico, definida por
fracciones de recombinacin y la fu n cin de mapeo, y que se
mide en centiMorgans. Vase seccin 13.1.
Distribucin Hardy-Weinberg: la relacin ms simple entre fre
cuencias gnicas y frecuencias de genotipo que se encuentra en
una poblacin bajo ciertas condiciones. Vase seccin 4.5.
DNA codificante: DNA que codifica la secuencia de aminocidos
de un polipptido (o en ocasiones un RNA maduro funcional
que no especifica un polipptido).
DNA minisatlite: un ordenamiento de tamao intermedio (tpi
camente 0.1-20 kb de largo) de secuencias de DNA cortas
repetidas en forma de tndem. Vase recuadro 7-2. El DNA
minisatlite hipervariable es la base de la huella digital d e DNA
y muchos marcadores VNTR.
DNA recombinante: hbrido de DNA construido artificialmente
que contiene secuencias enlazadas de manera covalente con or
genes diferentes, por ejemplo, un vector con un inserto.
DNA repetitivo: secuencia de DNA que se encuentra en muchas
copias idnticas o similares en el genoma. Las copias pueden
repetirse o dispersarse en tndem.
DNA satlite: originalmente describa una fraccin de DNA que
forma bandas menores separadas en la centrifugacin de gradi
ente de densidad por su composicin poco comn de bases. El
DNA est compuesto de ordenamientos muy largos de secuen
cias de DNA repetidas en tndem. Vase seccin. 9.4.1.
Dominante: en gentica humana, cualquier carcter que se expre
sa en un heterocigoto. Vase asimismo semidominante.
Duplicacin segmentaria: existencia de bloques de secuencia de
DNA muy altamente relacionados en diferentes cromosomas o
en ms de un sitio en un cromosoma. Vase figuras 12-12, 12-13Ectodermo: una de las tres capas germinativas del embrin. Se for
ma durante la gastrulacin en las clulas del epiblasto (vase fig.
3-15) y origina el sistema nervioso y los epitelios externos (vase
recuadro 3-5).
638
GLOSARIO
Edicin de RNA: proceso natural en el cual ocurren cambios

especficos postranscripcionalmente en la secuencia de bases de
una molcula de RNA. Rara vez se observa en genes humanos.
Vasefigu ra 8-16.
Efecto fundador: frecuencia alta de un alelo particular en una
poblacin porque esta ltima deriva de un nmero pequeo de
fundadores, uno o ms de los cuales llevaba ese alelo.
Electroporacin: mtodo de transferencia de DNA a clulas in
vitro, utilizando un pulso breve de alto voltaje.
Elementos de respuesta: secuencia localizada por lo general a una
distancia corta corriente arriba de promotores que hacen que la
expresin gnica responda a ciertas sustancias qumicas en el
ambiente celular. En el cuadro 10-4 se encuentra una lista de
varios ejemplos.
Elementos lmite: secuencias que definen los lmites de dominios
de cromatina regulados coordenadamente en cromosomas.
Vase recuadro 8-2.
Empalme (sp licin gh normalmente em palme d e RNA en el cual se
eliminan las secuencias de RNA transcritas de intrones de un
transcrito primario y se empalman entre s los transcritos de
exones en el mismo orden lineal que los exones (vanse figuras
1-14, 1-16). Es importante una forma de em palme d e DNA para
ensamblar inmunoglobulina productiva y genes receptores de
clulas T en linfocitos B y T, respectivamente (vanse figuras
10-28, 10-29).
Empalme (sp licin g) alternativo: uso natural de diferentes grupos
de secuencias de unin de empalme para formar ms de un
producto a partir de un gen aislado. Vase seccin 10.3.2,
recuadro 10-4.
Empalme de RNA: vase Empalme.
Endodermo: una de las tres capas germinativas del embrin. Se
forma durante la gastrulacin a partir de clulas que migran
fuera de la capa del epiblasto (fig. 3-15). Vase el recuadro 3-5
para derivados del endodermo embrionario.
Endogamia: matrimonio con un familiar sanguneo. El trmino es
comparativo, ya que finalmente todas las personas estn rela
cionadas. El coeficiente de endogam ia es la proporcin de genes
de una persona que son idnticos p o r descendencia.
ENEC (elemento nuclear entremezclado corto): clase de familias
de secuencias de DNA moderada a altamente repetidas, de la
cual la que se conoce mejor en humanos es la familia repetida
Alu. Vanse cuadro 9-15 y figuras 9-7, 9-8.
ENEL: demento nuclear entremezclado irgo. Clase de secuencias
de DNA repetidas que constituyen alrededor de 20% del geno
ma humano (cuadro 9-15). Algunos son elementos transposables activos. Vanse figuras 9-17, 9-18.
Enlace: tendencia de caracteres (fenotipos, alelos marcadores, etc.)
a cosegregarse en una genealoga porque sus determinantes se
encuentran juntos entre s en un cromosoma particular.
Epiblasto: capa de clulas del embrin en etapa previa a la gastru
lacin que dar lugar a las tres capas germinativas del embrin
propiamente dicho, aunado al ectodermo y el mesodermo
extraembrionarios. Comprese con hipoblasto.
Epigentico: heredable (de la clula madre a la clula hija, o en
ocasiones del padre al hijo), pero no producido por un cambio
en la secuencia del DNA. La m etilacin d el DNA es el mecanis
mo epigentico mejor comprendido.
Episoma: cualquier secuencia de DNA que puede existir en forma
extracromosmica autnoma en la clula. Suele utilizarse para
describir formas de DNA autorreplicantes y extracromosmicas.
Epitopo: parte de un antgeno con el cual reacciona un anticuerpo

particular.
Especificidad: en pruebas, una medida del desempeo de una
prueba. Especificidad = (1 - tasa de positivas falsas), vase fig u
ra 18-17.
Espliceosoma: complejo ribonucleoprotenico que se utiliza en el
em palme (splicing) de RNA.
EST (marcado de secuencia expresada): vase recuadro 8-1.
Estadsticas bayesianas: rama de la estadstica que forma la base
de estimacin de mucho riesgo gentico. Vase recuadro 18-4,
figu ra 18-15.
Estratificacin: existencia de grupos diferenciados genticamente
dentro de una poblacin que se supone es homognea.
Estructura secundaria: regiones de un cido nucleico o una pro
tena de filamento nico/una molcula polipptida en las que
ocurre la unin qumica entre nucletidos o aminocidos espa
ciados distantemente que da por resultado estructuras comple
jas. Con frecuencia, la estructura secundaria se debe a la unin
de hidrgeno intrafilamentaria (figuras 1-7, 1-24).
Eucromatina: fraccin del genoma nuclear que contiene DNA
activo transcripcionalmente y que, a diferencia de la heterocromatina, adopta una conformacin relativamente extendida.
Eugnica: mejoramiento de una poblacin mediante el
apareamiento selectivo de los mejores tipos (eugnica positi
va), o la prevencin de tipos indeseables por apareamiento
(eugnica negativa).
Euploida: estado de poseer uno o ms grupos completos de cro
mosomas con ninguno extra o faltante; el opuesto de aneuploida.
Exclusin allica: mecanismo por el cual se expresa slo uno de los
dos alelos de la inmunoglobulina en linfocitos B, o alelos de
receptor de clula T en linfocitos T. En forma ms general,
cualquier mecanismo que ocurre de manera natural que causa
la expresin de un alelo solamente. Vase recuadro 10-4.
Exhibicin de fago: mtodo de expresin de clonacin en el que
se insertan genes extraos en un vector fago y se expresan para
dar polipptidos que se exhiben en la superficie (cubierta protenica) del fago.
Exhibicin diferencial: vase recuadro 5-1.
Exn: segmento de un gen representado en el producto del DNA
maduro. Los exones individuales pueden contener DNA de
codificacin, DNA no codificante (secuencias no traducidas), o
ambos, vanse figuras 1-14, 1-19.
Expresin constitutiva: estado en el cual un gen es activo en for
ma permanente. Las mutaciones que dan por resultado una
expresin constitutiva inapropiada suelen ser patgenas.
Expresin monoallica: expresin de slo una de las dos copias de
un gen en una clula, por inactivacin de X, impresin u otro
cambio epigentico, o debido al reordenamiento gnico que se
lleva a cabo con los genes de inmunoglobulina y del receptor de
clula T. Vase recuadro 10-4, para ejemplo.
Expresin variable: extensin o intensidad variable de signos
fenotpicos en personas con un genotipo determinado. Vase,
por ejemplo, la figu ra 4-5C.
Extremo romo: fragmento de DNA que no tiene extensiones de
filamento nico.
Extremos adherentes (terminales cohesivas): proyecciones cortas
de filamento nico de una molcula de DNA de doble filamen
to que se forman tpicamente por digestin de ciertas enzimas
de restriccin. Pueden asociarse molculas Can con extremos
GLOSARIO
adherentes complementarios y a continuacin unirse de manera

covalente utilizando ligasa d e DNA para formar molculas de
DNA recombinante. Vanse figuras 4-3, 4-4.
Familia multignica: grupo de locus relacionados evolutivamente
dentro de un genoma, cuando menos uno de los cuales puede
codificar un producto funcional. Vase seccin 9.3.
Familias CEPH: grupo de familias reunido por el Centre d Etude
du Polymorphisme Humain (Centro de estudio de polimorfismo
humano) en Pars para ayudar en la produccin de mapas
estructurales marcador-marcador.
Farmacogentica: estudio de la influencia de genes alelos indivi
duales en el metabolismo o la funcin de frmacos.
Farmacogenmica: uso de recursos del genoma (secuencias del
genoma, perfiles de expresin, etc.) a fin de identificar blancos
para nuevos frmacos.
Fase (de marcadores enlazados): relacin (acoplamiento o recha
zo) entre alelos en dos locus enlazados. Si el alelo A l se encuen
tra en el mismo cromosoma fsico que el alelo B l, estn en
acoplamiento; si se encuentran en diferentes homlogos
parentales, estn en rechazo. Vase figu ra 13-6.
Fase (del ciclo celular): las fases G l, S, G2, M y Go (vasefig . 2-1).
Fase (de un intrn): trmino utilizado para clasificar intrones en
secuencias de codificacin segn la posicin en la que inte
rrumpen el mensaje (vase recuadro 12-2).
Fenotipo: caractersticas observables de una clula o un organismo,
incluyendo el resultado de cualquier estudio que no sea una
prueba directa del genotipo.
Fibra de cromatina: arrollamiento de 30 mm de DNA e histonas
que se piensa representa la conformacin bsica de la cromati
na. Vast figu ra 2-3.
Filamento antisentido (filamento plantilla): filamento de DNA
de un gen que utiliza la polimerasa de RNA como una planti
lla para la sntesis de mRNA, durante la transcripcin. Vase
figura 1-12.
Filamento gua: en la replicacin del DNA, el filamento que se
sintetiza en forma continua {vase figu ra 1-9).
Filamento plantilla: en la transcripcin, el filamento de DNA que
forma pares de bases con el transcrito de RNA naciente. Vase
figu ra 1-12.
Filamento retardado: en la replicacin del DNA, el filamento que
se sintetiza como fragmentos Okazaki (vase figu ra 1-9).
Filamento de sentido: filamento de DNA de un gen cuya secuen
cia es complementaria al filamento de la plantilla (antisentido)
e idntico a la secuencia de RNA transcrita (excepto que el
DNA contiene T en tanto que el RNA contiene U). Las
secuencias gnicas mencionadas siempre son del filamento de
sentido en la direccin 5'~* 3. Vase figu ra 1-12.
Filamentos complementarios: se dice que dos filamentos de ci
do nucleico son complementarios en secuencia si pueden for
mar suficientes pares de bases para generar una estructura de
doble filamento estable.
Filogenia: clasificacin de organismos segn la relacin evolutiva
percibida. Vanse figuras 12-22 a 12-24.
Fraccin de recombinacin: para un par de locus determinado, la
proporcin de meiosis en que estn separados por recombi
nacin. Suele indicarse como 0. Los valores 0 varan entre 0 y
0.5. Vase seccin 13.1.
Frecuencia gnica: proporcin de todos los alelos en un locus que
son el alelo en cuestin. Vase la seccin 4.5. Realmente sig
639
nifica frecuencia de alelos, pero en la actualidad est muy bien

establecido el uso de frecuencia gnica para poder cambiarse.
Fusin cntrica: vase Fusin robertsoniana.
Fusin robertsoniana: reordenamiento cromosmico que con
vierte dos cromosomas acrocntricos en uno metacntrico o
submetacntrico. Vase figu ra 2-21. En ocasiones llamada
fusin cntrica, aunque el punto de intercambio se encuentra en
realidad en el brazo corto prxima! y no en el centrmero.
Gastrulacin: proceso altamente dinmico que comprende la con
versin del embrin de dos capas anterior a la gastrulacin (que
consiste en epiblasto ms hipoblasto) en otro que incluye las tres
capas germinativas: ectodermo, mesodermo y endodermo.
Gen candidato: en clonacin posicional, un gen de localizacin
cromosmica apropiada que se sospecha es el gen originario de
una enfermedad. La sospecha se estudiara buscando muta
ciones en pacientes.
Gen de fusin (hbrido): gen que contiene la secuencia de codifi
cacin de dos genes diferentes, por lo general creado mediante
cruzamiento desigual (fig. 9-17) o translocaciones cromosmicas (fig. 18-7A).
Gen modificador: gen cuya expresin puede influir un fenotipo y
que resulta de la mutacin en otro locus. Vase seccin 16.6.3.
Gen reportero: gen que se utiliza para estudiar la capacidad de una
secuencia corriente arriba unida a l para causar su expresin.
Las posibles secuencias reguladoras de accin cis pueden
acoplarse a un gen reportero y transfectarse a clulas adecuadas
para estudiar su funcin. Alternativamente, los animales transgnicos (y otros organismos) se preparan con frecuencia con un
gen reportero no promotor integrado aleatoriamente en los cro
mosomas, de tal manera que la expresin del reportero marca la
presencia de un promotor eficiente. Vase recuadro 20-4.
Gen supresor de tumor (GST): gen cuya funcin normal es
inhibir o controlar la divisin celular. Tpicamente, en tumores
estn inactivados los GST. Vase seccin 17.4.
Genes hox: subgrupo de genes homeobox que estn organizados
en racimos y tienen funciones importantes en la paternidad
anterior y posterior. Vanse figuras 3-10 y 3-12.
Genoma: grupo total de diferentes molculas de DNA de un
organelo, una clula o un organismo. El genoma humano con
siste en 25 molculas de DNA distintas, la molcula de DNA
mitocondrial, aunada a 24 diferentes molculas cromosmicas
de DNA. Cf, transcriptoma, proteoma.
Genmica funcional: anlisis de la funcin gnica a gran escala,
llevando a cabo anlisis paralelos de expresin/funcin gnicas
para grandes nmeros de genes, incluso todos los de un genoma.
Genoteca de DNA: vase recuadro 8-1.
Genoteca de expresin: genoteca de cDNA clonados en un vector
que les permite expresarse. Vase seccin 5.6.
Genotipo: constitucin gentica de un individuo, sea en su totali
dad o en un locus especfico.
Grupo de clulas hbridas: conjunto de clulas hbridas somticas
o hbridas p o r radiacin que se utiliza para mapeo fsico.
Haploide: describe una clula (tpicamente un gameto) que slo
tiene una copia aislada de cada cromosoma (p. ej., los cromo
somas 23 en espermatozoos y vulos humanos).
Haploinsuficiencia: un locus muestra haploinsuficiencia si la pro
duccin de un fenotipo normal requiere ms producto gnico
que la cantidad que produce una copia aislada. Vanse seccin
16.4.2, cuadro 16-2.
640 | GLOSARIO
Haplotipo: serie de alelos que se encuentran en locus enlazados en

un mismo cromosoma.
Hemicigoto: que slo tiene una copia de un gen o una secuencia
de DNA en clulas diploides. Los varones son hemicigotos para
la mayor parte de los genes en los cromosomas sexuales. Las
deleciones que ocurren en un autosoma producen hemicigosidad en varones y mujeres.
Herencia: proporcin de la razn de una caracterstica que se debe
a causas genticas. Vase recuadro 4-4.
Herencia matrilineal: transmisin solamente por la madre, pero a
los nios de cualquier sexo; patrn de herencia mitocondrial.
Vase figu ra 4-4.
Hermanos: hermanos o hermanas.
Heterocigosidad media: de un marcador, la posibilidad de que
una persona seleccionada aleatoriamente sea heterocigota. Una
medida de la utilidad del marcador para anlisis de enlace (vase
seccin 11.2.2).
Heterocigoto: individuo que tiene dos alelos diferentes en un
locus particular.
Heterocigoto compuesto: personas con dos alelos mutantes dife
rentes en un locus.
Heterocromatina: regin cromosmica que permanece altamente
condensada durante todo el ciclo celular y no muestra pruebas,
o muy pocas, de expresin gnica activa. La heterocromatina
constitutiva se encuentra en los centrmeros y algunas otras
regiones (para lo cual vase fig. 2-15).
Heterodplex: DNA de doble filamento en el cual hay cierta
desigualdad entre los dos filamentos. Importante en la detec
cin de mutaciones -vase seccin 18.3-.
Heterogeneidad allica: existencia de muchos alelos que causan
diferentes enfermedades en un locus. La situacin es la pre
dominante en casos de enfermedades causadas por prdida de
funcin de un gen -vase, por ejem ^ o , figura 16-1-.
Heterogeneidad de locus: determinacin de la misma enfermedad
o fenotipo por mutaciones en locus diferentes. Un problema
comn en mapeo de enfermedades genticas. Vanse secciones
4.2.4, 16.7.2.
Heteroplasmia: mosaicismo, por lo general dentro de una clula
aislada, para variantes mitocondriales de DNA. Vanse sec
ciones 4.2.5, 11.4.2.
Hibridacin de fluorescencia in situ (FISH): hibridacin in situ
utilizando una sonda de DNA o RNA marcada con fluorescen
cia. Una tcnica fundamental en gentica molecular moderna
-vanse figuras 2-17, 2-18-.
Hibridacin genmica comparativa (HGC): uso de hibridacin
de fluorescencia in situ competitiva para detectar regiones cromosmicas que estn amplificadas o eliminadas, especialmente
en tumores. Vase figu ra 17-3.
Hibridacin in situ : forma de hibridacin molecular en la que el
cido nucleico blanco (DNA) est desnaturalizado dentro de las
preparaciones cromosmicas (hibridacin cromosmica in situ) o
inmovilizado el RNA dentro de las clulas de cortes de tejidos
en un portaobjetos para microscopio (hibridacin tisular in situ
-crase fig. 6-15) o dentro de la totalidad de los embriones (hi
bridacin in situ d e m ontaje total -vase fig. 7-15).
Hibridacin in situ de montaje total: vase Hibridacin in situ.
Hbrido de clula somtica: clula construida artificialmente for
mada por la fusin de dos tipos diferentes de clulas somticas,
en especial clulas de distintas especies. Los clulas hbridas
humano-roedor han resultado medios valiosos para mapeo.
Vase recuadro 8-4.
Hbrido por radiacin: en mapeo fsico humano, una clula de

roedor que contiene mltiples fragmentos pequeos de cromo
somas humanos. Producido mediante fusin con una clula
humana radiada letalmente. Los grupos hbridos por radiacin
muestran un mapeo muy rpido de SSM. Vase figu ra 10-4).
Hipermorfo: alelo que produce una cantidad o actividad mayor de
producto.
Hipoblasto: capa de clulas embrionarias antes de la gastrulacin
que da lugar al endodermo extraembrionario.
Hipomorfo: alelo que produce una cantidad o actividad reducida
de producto.
Hiptesis de dos golpes: teora de Knudson indicativa de que los
cnceres hereditarios requieren dos mutaciones sucesivas para
afectar una clula aislada. Vase figu ra 18-5.
Hiptesis de un gen-una enzima: hiptesis planteada por Beadle
y Tatum, en 1941, que indica que la principal accin de cada
gen era especificar la estructura de una enzima. Muy impor
tante histricamente, pero hoy en da slo se considera como
parte de la gama de funciones de los genes.
Homocigoto: individuo que tiene dos alelos idnticos en un locus
particular. Con propsitos clnicos, una persona suele describirse
como homocigoto AA si tiene dos alelos que funcionan nor
malmente, u homocigoto aa cuando presenta dos alelos patogni
cos en un locus, prescindiendo de que los alelos sean de hecho
completamente idnticos a nivel de la secuencia de DNA. La
homocigosidad para alelos idnticos p o r descendencia se denomi
na autocigosidad.
Homologa de secuencia: medicin de la similitud de las secuen
cias de dos cidos nucleicos o dos polipptidos.
Homlogos (cromosomas): las dos copias de un cromosoma en
una clula diploide. A diferencia de las cromtides hermanas,
los cromosomas homlogos no son copias entre s; uno se
hered del padre y el otro de la madre.
Homlogos (genes): dos genes o ms cuyas secuencias estn rela
cionadas significativamente por una relacin evolutiva cercana,
sea entre especies (ortlogos) o dentro de una especia (parlogos).
Homoplasmia: clula u organismo que tiene todas las copias del
DNA mitocondrial idnticas. Cf. heteroplasmia.
Huella digital de DNA: mtodo actualmente obsoleto para iden
tificar a una persona con propsitos legales o forenses basado en
sondeos Southern blot con una sonda minisatlite hipervariable. Vase figu ra 18-19.
Identidad por descendiente (IPD): alelos en un individuo o en
dos personas que se sabe son idnticos porque ambos se
heredaron de un ancestro comn demostrable.
Identidad por estado (IPE): alelos que parecen idnticos, pero
pueden ser o no idnticos p o r descendiente porque no hay una
fuente comn demostrable. Vase figu ra 15-2.
Impresin (impronta): determinacin de la expresin de un gen
por su origen parental. Vanse seccin 10.5.4. y recuadro 16-6.
Inactivacin de X (lionizacin): inactivacin de uno de los dos
cromosomas X en las clulas de mamferos hembra por una for
ma especializada de impronta gentica.. Vase Seccin 10.5.6.
Inestabilidad microsatlite: fenmeno caracterstico de ciertas
clulas tumorales en el cual, durante la replicacin del DNA, el
nmero de copias repetidas de microsatlites est sometido a
cambios aleatorios. Se abrevia INM, IMS o ERR (error de repli
cacin). Vase figu ra 17-7.
Intensificacin gentica: posible aplicacin de tecnologas de
gentica molecular para modificar un fenotipo humano normal
GLOSARIO I 641
en cierta forma que se considere benfica. Vase recuadro d e ti

ca 3, en el captulo 21.
Intensificador: grupo de elementos de secuencia corta que estimu
lan la transcripcin de un gen y cuya funcin no depende
crticamente de su posicin u orientacin precisa. Vase
recuadro 10-2.
Intensificador de empalme: secuencia (que puede ser exnica o
intrnica) que incrementa la posibilidad de que un sitio poten
cial de empalme cercano se utilice realmente. Vanse secciones
11.4.3 y 16.4.1.
Intercambio de cromtide hermana (ICH): acontecimiento de
recombinacin que incluye cromtides hermanas. Debido a que
estas ltimas son duplicados una de la otra, estos intercambios
no deben tener ningn efecto a menos que sean desiguales. Sin
embargo, un incremento de la frecuencia de ICH indica dao
del DNA.
Intercambio desigual de cromtides hermanas (IDCH): recom
binacin entre secuencias no allicas en cromtides hermanas
de un cromosoma aislado. Vase Figura 11-7.
Interfase: todo el tiempo del ciclo celular en el que no se est divi
diendo una clula.
Interferencia: en meiosis, tendencia de un cruzamiento a inhibir
un cruzamiento adicional dentro de la misma regin de los cro
mosomas. Vase seccin 13.1.3.
Intrn: DNA no codificante que separa exones vecinos en un gen.
Durante la expresin gnica, se transcriben intrones al RNA,
pero a continuacin se eliminan las secuencias del intrn del
pre-mRNA mediante empalme (splicing). Vase figu ra 1-14.
Puede clasificarse segn el mecanismo de empalme (vase
recuadro 12-1) o, si se separan secuencias de codificacin del
DNA, por su localizacin precisa dentro de codones. (Vase
recuadro 12-2).
Inversin paracntrica: inversin de un segmento cromosomico
que no incluye el centrmero. Vase figu ra 2-20.
Inversin pericntrica: inversin de un segmento cromosomico
que incluye el centrmero. Vase figu ra 2-20.
Isla CpG: tira corta de DNA, con frecuencia < 1 kb, que contiene
dinucletidos CpG n o mediados frecuentes. Las islas CpG tienden
a marcar los extremos 5 de los genes. Vase recuadro 9-3.
Isocromosoma: cromosoma simtricamente anormal, que consiste
en dos brazos idnticos, que normalmente son el brazo corto o
el brazo largo de un cromosoma normal.
Isoformas/isozimas: formas alternas de una protena o una enzima.
Isognico: dos o ms organismos o clulas que tienen genotipos idn
ticos. Por ejemplo, diferentes ratones que pertenecen a una cepa
endogmica particular, por ejemplo, C57B10/J, son isognicos.
Knock-down: inhibicin dirigida de la expresin de un gen medi
ante, por ejemplo, el uso de RNA antisentido o si RNA para
unirse a transcritos de RNA.
Knock-out condicional: mutante por ingeniera que causa prdi
da de la funcin de un gen bajo ciertas circunstancias (p. ej.,
aumento de la temperatura), o en algunas clulas, pero no en
otras. Vase seccin 20.2.6.
Lectura de pruebas: mecanismo enzimtico por el cual se identi
fican y corrigen los errores de replicacin del DNA.
Ligadura: formacin de un enlace 3'- 5' fosfodister entre nucletidos en los extremos de dos molculas (ligadura intermolecular)
o los dos extremos de la misma molcula (ligadura intramolecu
lar, ciclizacin).
Linaje: serie de clulas que se origina de una clula progenitora.

Lnea germinal: las clulas germinales y las clulas que les dan
lugar; otras clulas del cuerpo constituyen el soma.
Liposoma: vescula lpida sinttica que se utiliza para transportar una
molcula de inters al interior de una clula. Vase figu ra 21-8.
Locus: localizacin cromosmica nica que define la posicin de
un gen individual o la secuencia de DNA.
Locus de carcter cuantitativo (LCC): locus importante para
determinar el fenotipo de un carcter continuo. En la seccin
15.6.8 se comenta la investigacin sobre el LCC subyacente a la
obesidad humana.
Manifestacin de heterocigoto: portador femenino de un padeci
miento recesivo enlazado a X que muestra algunos sntomas
clnicos, posiblemente por inactivacin de X sesgada. Vase sec
cin 4.2.2.
Mapa gentico: vase recuadro 8-1.
Mapeo de autocigosidad: para trastornos autosmicos recesivos
incluye la bsqueda de grandes genealogas endogmicas para
locus en los que todos los individuos afectados son autocigotos
para el mismo alelo. Vase figu ra 13-8.
Mapeo de exclusin: mapeo gentico con resultados negativos,
demostrativo de que el locus en cuestin no se mapea en una
localizacin particular. Especialmente til para excluir un posi
ble gen candidato sin la labor de seleccin de mutacin.
Mapeo de (uncin: ecuacin matemtica que describe la relacin
entre la fraccin de recombinacin y la distancia gentica. El
mapeo de funcin depende de la extensin a la cual la interferencia impide recombinantes dobles cercanos. Vase seccin 13.1.3.
MAPH: hibridizacin multiplex con sonda amplificable: mtodo
para detectar deleciones o duplicaciones de exones. Vase
recuadro 18-1.
Marcador (cromosoma): cromosoma extra de origen no identifi
cado.
Marcador (gentico): cualquier carcter m endeliano polimrfico
que puede utilizarse para seguir un segmento cromosmico a
travs de una genealoga. Los marcadores genticos suelen ser
polimorfismos de DNA. Vase recuadro 13-1.
Marcador de DNA: vase M arcador (gentico).
Marcadores polimrficos: vase recuadro 8-1.
Marco de lectura: durante la traduccin, la forma en que se lee la
secuencia continua del mRNA como una serie de codones
tripletos. Para cualquier mRNA hay tres posibles marcos de
lectura y el marco de lectura correcto se establece por el
reconocimiento correcto del codn de inicio AUG.
Marco de lectura abierto (MLA): secuencia de DNA significati
vamente larga en la que no hay codones de terminacin, cuan
do menos en uno de los posibles marcos de lectura. Son
factibles seis marcos de lectura para un DNA dplex porque
cada filamento puede tener tres marcos de lectura.
Masa celular interna: grupo de clulas localizado dentro del blastocisto que dar lugar al embrin propiamente dicho. Vase
figura 3-13.
Matriz extracelular: sustancia parecida a un retculo que se
encuentra dentro del espacio extracelular y se asocia con la
membrana basal de la superficie celular. Proporciona un
andamiaje al cual se adhieren las clulas y sirve para promover
la proliferacin celular.
Meiosis informativa: en anlisis de enlace, una meiosis es infor
mativa si los genotipos en la genealoga permiten decidir si es
642
GLOSARIO
recombinante o no (para un par de locus determinado). Vase

recuadro 13-2.
Mendeliano: de un patrn de genealoga, que se ajusta a uno de los
patrones arquetpicos que se muestran en la figu ra 4-2. Un
carcter dar un patrn de genealoga mendeliana si est deter
minado en la localizacin de un cromosoma, prescindiendo de
que el determinante sea o no un gen en el sentido de los genetis
tas moleculares.
Mesodermo: una de las tres capas germinativas del embrin. Se
forma durante la gastrulacin por clulas que migran fuera del
epiblasto. Vanse figu ra 3-15 y recuadro 3-5 para derivados del
mesodermo embrionario.
Metafase: etapa de la divisin celular (mitosis o meiosis) en la que
los cromosomas estn contrados al mximo y alineados en el
plano ecuatorial (placa de metafase) de una clula. Vanse fig u
ras 2-10, 2-11, 2-15.
Metazoarios: animales multicelulares en oposicin a protozoarios
unicelulares.
Mediacin de DNA: en el contexto del DNA humano, casi siem
pre significa conversin de citosina (por lo general en un dinucletido CpG) en una 5-metilcitosina.
Microdelecin: delecin cromosomica muy pequea para obser
varse al microscopio (tpicamente < 3 Mb).
Microordenacin: una ordenacin miniatura de diferentes secuen
cias de DNA u oligonucletidos en una superficie de vidrio que
se pretende utilizar en una valoracin de hibridacin. La secuen
cia pueden ser molculas de DNA preformadas que se deposi
taron utilizando automatizacin o secuencias de oligonucletidos
que se sintetiza in situ para hacer un chip de DNA.
Micro-RNA (miRNA): molculas cortas (22 nt) de RNA codifi
cadas dentro de genomas normales que tienen un sitio en la regu
lacin de la expresin gnica y tambin pueden ser de
estructura cromatnica. En ocasiones, se denominan RNA tem
poral pequeo (stRNA, del ingls, tem poral pequeo, RNA).
Vanse figuras 9-6, 20-12.
Microsatlite: tramo pequeo (por lo general menos de 0.1 kb) de
repeticiones tndem de una secuencia de DNA muy simple, por
lo general 1.4 bp, por ejemplo (CA)n. Con frecuencia polimor
fica, proporcion el medio principal para el mapeo gentico
durante la dcada de 1990. En ocasiones tambin se describe
como polimorfismo RTS (repeticin tndem simple) o RSS
(repeticin de secuencia simple). Vanse figuras 7-7, 7-8.
Microtbulos: cilindros huecos largos constituidos por polmeros de
tubulina que forman parte del citoesqueleto (vase recuadro 3-2).
Minisecuenciacin: mtodo para detectar variantes de secuencia
en una posicin predefinida mediante la secuenciacin de tan
slo uno o dos nucletidos corriente abajo de un cebador. Se
utiliza con frecuencia en un formato de microordenamiento.
Veassfigu ra 18-9B.
Molcula reportera: molcula cuya presencia se detecta fcilmente
(p. ej., una molcula fluorescente) que est unida a una secuencia
de DNA que se desea vigilar. Vase, por ejemplo, la figura 6-7.
Mosaico: individuo que tiene dos o ms lneas de clulas gentica
mente diferentes derivadas de un solo cigoto. Las diferencias
pueden ser mutaciones de punto, cambios cromosmicos, etc.
Vast figu ra 4-10.
Mosaico germinal (gonadal o gonosmico): individuo con un
subgrupo de clulas de la lnea germinal que llevan una
mutacin que no se encuentra en otras clulas de dicha lnea.
Vase figu ra 4-9.
Multifactorial: una caracterstica determinada por alguna combi

nacin no especificada de factores genticos y ambientales. Cf,
polignica.
Mutacin de cambio de estructura: mutacin que altera el mar
co de lectura traduccional normal de un mRNA aadiendo o
eliminando varias bases que no son mltiplos de tres.
Mutacin dinmica: repeticin expandida inestable que cambia
de tamao entre el padre y el hijo. Vase seccin 16.6.4.
Mutacin knock-in: mutacin dirigida que reemplaza la actividad
de un gen por la de un gen introducido (por lo general un ale
lo). Vase figu ra 20-14.
Mutacin knock-out: inactivacin dirigida de un gen dentro de
una clula intacta.
Mutacin de punto: mutacin que causa una alteracin pequea
en la secuencia de DNA en un locus. El significado es un poco
impreciso: cuando se compara con las mutaciones cromosmicas, el trmino mutacin de punto podra utilizarse para
incluir cambios muy grandes (pero submicroscpicos) dentro
de un gen aislado, en tanto que cuando se discuten mutaciones
en un locus aislado, normalmente las mutaciones de punto sig
nifican sustitucin, insercin o delecin slo de un nucletido
aislado.
Mutacin de sentido errneo: sustitucin de un nucletido que
da por resultado el cambio de un aminocido. Vase recuadro
11-3.
Mutacin sin sentido: mutacin que ocurre dentro de un codn
y que lo cambia a un codn de detencin. Vase recuadro 11-3.
Mutacin silenciosa (sinnimo): mutacin que cambia un codn
pero no altera el aminocido codificado. Vase recuadro 11-3.
Estas mutaciones pueden tener an efectos en el empalme o la
estabilidad del mRNA.
Mutagnesis dirigida por sitio: produccin de un cambio espec
fico predeterminado en una secuencia de DNA. Puede hacerse
in vitro en DNA clonado (secciones 5.5.2 y 5.5.3) o in vivo
mediante recombinacin homologa (seccin 20.2.6).
Mutagnesis insercional: mutacin (por lo general abolicin de la
funcin) de un gen por insercin dentro del mismo de una
secuencia de DNA no relacionada.
Negativo dominante (antimorfo): gen mutante cuyo producto
puede inhibir la funcin del producto del gen tipo silvestre en
heterocigotos. Vase, por ejemplo, figu ra 16-4.
Neomorfo: alelo con actividad o producto nuevo.
No disyuncin: falta de separacin (desunin) de cromosomas
(cromtides hermanas en la mitosis o la meiosis II; homlogos
en par en la meiosis I) en la anafase. La principal causa de anor
malidades cromosmicas numricas. Vase seccin 2.5.2.
No paramtrico: en anlisis de enlace, un mtodo que no depende
de un modelo gentico especfico, como el anlisis de pares de
hermanos afectados.
No penetrancia: situacin en la que una persona que lleva un ale
lo que normalmente causa un fenotipo dominante no muestra
ese fenotipo. Un efecto de otros locus genticos o del ambiente.
Un error en la asesora gentica. La figu ra 4-5B muestra un
ejemplo.
Northern blot: molculas de membrana que llevan RNA que se
fraccionaron de tamao mediante electroforesis en gel y se uti
lizan como blanco para la valoracin de hibridacin. Se utiliza
para detectar los tamaos de transcritos de un gen de inters en
un conjunto de tejidos adultos o fetales. Vase figura 5-13.
643
Notocordio: estructura flexible parecida a un bastn que forma el

eje de apoyo del cuerpo en cordados y vertebrados simples y en
embriones de vertebrados ms complejos.
Nucleosoma: unidad estructural de cromatina. "Vase figu ra 2-3.
Nmero MIM: nmero en el catlogo de un gen o carcter
mendeliano, en la lista de la base de datos OMIM.
Oligognico: carcter determinado por un nmero pequeo de
genes que actan juntos.
Oligonucletido enlazador (adaptador): oligonucletido de
doble filamento que puede ligarse a una molcula de DNA de
inters, diseado para contener alguna caracterstica deseable,
por ejemplo, un sitio de restriccin favorable.
Oligonucletido especfico de alelo (OEA): oligonucletido sin
ttico, tpicamente ca. 20 nt de largo, cuya hibridacin a su
secuencia blanco puede alterarse por una incompatibilidad de
un par de bases aislado bajo condiciones adecuadas. Los OEA
se utilizan como sondas de hibridacin especficas de alelo
(vase fig. 6-11), o como cebadores especficos de alelo en la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Vase ARMS.
Oligonucletidos degenerados: serie de oligonucletidos sinteti
zados en paralelo que proporcionan la flexibilidad del nucletido en ciertas posiciones de ste. Cuando se utilizan como
sondas de hibridacin o fragmentos precursores de PCR
pueden hibridar a una familia de secuencias o amplificarla.
OMIM: (del ingls, Qn-line Afendelian /nheritance in Afn).
Herencia mendeliana en el hombre en lnea, la base de datos
central de genes humanos y caracteres mendelianos (http:
//www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim/. Los nmeros M IM son los
nmeros ndice para entradas en OMIM.
Oncogen: gen relacionado con el control de la proliferacin celu
lar que cuando se activa en exceso puede ayudar a transformar
una clula normal en otra tumoral. Vase cuadro 17-1.
Originalmente, se utiliz la palabra slo para las formas acti
vadas del gen y el gen celular normal se denomin protooncogen, pero esta distincin no se reconoce ampliamente en la
actualidad.
Ortlogo: uno de un grupo de genes homlogos en diferentes
especies (p. ej., PAX3 en humanos y Pax3 en ratones). Vase
recuadro 12-3.
Palndrome: una secuencia de DNA como ATCGAT que es igual
cuando se lee en la direccin 5,* 3' en cada filamento. Por
ejemplo, el reconocimiento DNA-protena mediante enzimas de
restriccin se basa con frecuencia en secuencias palindrmicas.
Par errneo de filamento deslizado: vase Deslizamiento de replicacin.
Paradoja de valor C: falta de una relacin directa entre el con
tenido de DNA en las clulas de un organismo (el valor C) y la
complejidad del mismo.
Parlogo: uno de un grupo de genes homlogos dentro de una
misma especie. Vase recuadro 12-3.
Parmetrico: en anlisis de enlace, un mtodo como un anlisis de
calificacin lod estndar, que requiere un modelo gentico
estrechamente especificado.
Pareo: matrimonio entre personas de fenotipo o genotipo similar
(p. ej., las personas altas tienden a casarse con personas altas, los
individuos sordos tienden a casarse con individuos sordos;
algunas personas prefieren casarse con familiares). El pareo
puede producir una distribucin que no se corresponde con la
de Hardy-Weinberg de genotipos en una poblacin.
PCR de tiempo real: vase recuadro 5-1.

PCR-Alu: vase recuadro 5-1.
PCR-TI (PCR de transcriptasa inversa): vase recuadro 5-1.
Penetrancia: frecuencia con la cual se manifiesta un genotipo en s
mismo en un fenotipo determinado.
Prdida de heterocigosidad (PeH]: homocigosidad o hemicigosidad en un tumor u otra clula somtica cuando el genotipo cons
titu cion al es heterocigoto. Prueba del cambio gentico
somtico. Vase figu ra 17-6, 17-7.
Perfil de DNA: uso de genotipos en una serie de locus polimrficos para reconocer a una persona, por lo general con propsitos
legales o forenses. Vase seccin 18.7.
Perfil de expresin: obtencin de un cuadro amplio del genoma
de niveles de mRNA, normalmente mediante anlisis de microordenacin del cDNA celular total (fig. 17-18, 19-8). Vase
asimismo SAGE.
Pintado cromosmico: marcado de un cromosoma completo con
fluorescencia mediante un procedimiento de PISH en el que la
sonda es una combinacin de muchas secuencias diferentes de
DNA de un cromosoma aislado.
Plasticidad: vase Transdiferenciacin.
Pliegues: mdulos de estructuras protenicas tridimensionales.
Casi todas las estructuras protenicas estn formadas por un
repertorio limitado de pliegues que se comparten entre muchas
protenas. Vase seccin 19.4.4.
Pluripotente: estrictamente, significa la capacidad para dar lugar a
muchos tipos de clulas diferentes, pero no a todos los que
puede originar el cigoto. Se dice que el cigoto y las clulas
inmediatas que origina son totipotenciales, pero la diferen
ciacin por la etapa de blastocisto significa que las clulas de la
masa celular interna son pluripotenciales en lugar de totipoten
ciales.
PNU (polimorfismo de nucletido nico): cualquier variacin
polimrfica en un nucletido aislado. Los PNU incluyen RFLP,
pero tambin otros polimorfismos que no alteran ningn sitio
de restriccin. Aunque menos informativos que los
microsatlites, los PNU son ms factibles de calificacin automa
tizada a gran escala.
Poliadenilacin: adicin de residuos tpicamente 200 A al extremo
3 de un mRNA. La cola poli (A) es importante para estabilizar
mRNA. Vase figu ra 1-18.
Polignico: carcter determinado por la accin combinada de va
rios locus genticos. La teora polignica matemtica (vase sec
cin 4.4) asume que hay demasiados locus, cada uno con un
efecto pequeo.
Polimorfismo: estrictamente, existencia de dos o ms variantes
(alelos, fenotipos, variantes de secuencia, variantes de estructura
cromosmica) a frecuencias importantes en la poblacin. Los
usos ms laxos entre genetistas moleculares incluyen 1)
cualquier variante de secuencia que se encuentra a una frecuen
cia > 1% en una poblacin, 2) cualquier variante de secuencia
no patognica, prescindiendo de la frecuencia.
Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccin
(RFLP): marcador gentico que consiste en tamaos variables
de fragmentos de restriccin allica que resultan de un polimor
fismo de secuencia de DNA. Vase recuadro 7-2. Los RFLP se
valoraron originalmente mediante Southern blotting (fig. 7-5A),
pero en la actualidad por lo general con PCR (fig. 7-6).
Polimorfismo de repeticin tndem de nmero variable
(VNTR): microsatlites, minisatlites y DNA satlite son orde-
namientos de secuencias repetidas en tndem que con frecuen

cia varan entre las personas en el nmero de unidades repeti
das. Vase recuadro 7-2. El trmino VNTR se utiliza con
frecuencia para indicar especficamente minisatlites.
Polimorfismo repetido de secuencia simple: vase Microsatlite.
Polimorfismo TCR (polimorfismo tndem corto repetido):
vase Microsatlite.
Poliploide: que tiene mltiples grupos de cromosomas como resul
tado de un acontecimiento gentico anormal (p. ej., triploida
constitucional o en mosaico, tetraploida, etc.) o programado
(como algunas plantas y ciertas clulas del cuerpo humano son
naturalmente poliploides).
Promotor: combinacin de elementos de secuencia corta, normal
mente justo corriente arriba de un gen, a la que se une la
polimerasa de RNA a fin de iniciar la transcripcin del gen.
"Vase figu ra 1-13.
Promotor inducible: un prom otor cuya actividad puede cambiar
para que acte o se suprima por un agente externo. Vase fig u
ra 20-5A.
Prosecuenciacin: mtodo de patente para revisar secuencias muy
cercanas a un punto de inicio definido previamente. Vase
recuadro 18-2.
Protena de fusin: producto del gen de fusin natural o por inge
niera: una cadena polipptida aislada que contiene secuencias
de aminocidos que normalmente son parte de dos o ms
polipptidos separados. Vase recuadro 20-2.
Proteoma: grupo total de diferentes protenas en una clula, tejido
u organismo. Cf, genom a, transcriptoma.
Protooncogen: vase Oncogen.
Protostomas: vase recuadro 12-5.
Proximal (de cromosomas): colocado comparativamente cerca del
centrmero.
Prueba de desequilibrio de transmisin (PDT): prueba estads
tica de asociacin allica. Vase Recuadro 15-3.
Prueba de truncacin de protenas (PTP): mtodo de seleccin
para mutaciones de cadena terminal expresando artificialmente
un alelo mutante en un sistema acoplado de transcripcin-tra
duccin. Vase figu ra 17-9, figu ra 18-5.
Punto caliente: secuencia asociada con una frecuencia anormal
mente alta de recombinacin o mutacin.
Quiasma: manifestacin fsica de recombinacin meitica como se
observa al microscopio. Vase figu ra 13-3.
Quimera: organismo derivado de ms de un cigoto. Vase figura
4-10.
RACE-AREC: vase recuadro 5-1.
Rastreo gnico: prediccin de genotipos dentro de genealogas uti
lizando marcadores de enlace a fin de rastrear un segmento cro
mosomico. En ocasiones se denomina Prueba indirecta. Vase
recuadro 18-3.
Recesivo: un carcter es recesivo si slo se manifiesta en homocigotos.
Recombinacin no homologa: recombinacin entre secuencias
que no tienen homologa o con homologa local limitada. Una
causa mayor de inserciones y deleciones a nivel gentico o cro
mosomico. Vanse, por ejemplo, figuras 11-7, 16-2.
Recombinante (anlisis de enlace): persona que hereda de un
padre una combinacin de alelos que resulta de un cruzamien
to durante la meiosis. Vase figu ra 13-1.
Redundancia gentica: ejecucin de la misma funcin en parale

lo por genes en ms de un locus, de tal manera que la prdida
de mutaciones funcionales en un locus no causa una prdida
total de la funcin.
Regin de control de locus (RCL): extensin de DNA que con
tiene elementos reguladores que controlan la expresin gnica
en un grupo de genes que puede estar localizado decenas de
kilobases lejos. Vase figura 10-23.
Regin nucleolar organizadora (RNO): los tallos satlite de los
cromosomas humanos 13, 14, 15, 21 y 22. Las RNO contienen
ordenamientos de genes de DNA ribosmico y pueden teirse
selectivamente con plata. Cada RNO forma un nucleolo en la
telofase de la divisin celular; los nuclolos se fusionan en la
interfase.
Regiones no traducidas (RNT 5, RNT 3) : regiones en el extre
mo 5' del mRNA antes del codn de inicio de traduccin de
AUG, o en el extremo 3' despus del codn de detencin UAG,
UAA o UGA. Vase figu ra 1-19.
Regiones seudoautosmicas: regiones en cada punta de los cro
mosomas X y Y que contienen genes homlogos X-Y. Debido a
la recombinacin X-Y, los alelos en estas regiones muestran un
modo de herencia aparentemente autosmico. Vase figura 1215.
Relacin de segregacin: proporcin de la descendencia que here
da un gen o carcter determinado de un padre.
Remplazo genico: teraputica gnica que consiste en reemplazar
un gen endgeno defectuoso con una versin que funciona de
manera correcta. Vase figu ra 21-4.
Reparacin incompatible: proceso enzimtico natural que reem
plaza un nucletido de par errneo en un dplex de DNA (ms
probablemente se encuentra por un error en la replicacin del
DNA) a fin de obtener un par de bases de Watson-Crick per
fecto.
Repeticin Alu: secuencia de DNA no codificante altamente
repetitiva que se encuentra en genomas de primates.
Replicn: cualquier cido nucleico que es capaz de autorreplicarse.
Muchos vectores de clonacin utilizan replicones extracromosmicos (como en el caso de plsmidos). Oros emplean
replicones cromosmicos, sea de manera directa (p. ej., en los
vectores cromosmicos de levadura artificial), o indirecta, per
mitiendo la integracin en el DNA cromosomico.
Rescate de trisoma: sobrevivencia de un embrin inicialmente
trismico porque una falta de disyuncin mittica al azar pro
duce una clula dismica que se constituye en el progenitor de
la totalidad del feto. Puede dar por resultado disomia uniparental.
Retrotransposn (retroposn): un elemento de DNA transposable que se transpone mediante un intermedio de RNA. Los
retroposones codifican una transcriptasa inversa que acta en el
transcrito de RNA para hacer una copia de cDNA, que a con
tinuacin se integra en el DNA cromosomico en un sitio dife
rente. Vase recuadro 7-4, figuras 7-17, 7-18.
Retrovirus: virus RNA con funcin de transcriptasa inversa, que
permite copiar el genoma de RNA del cDNA antes de inte
grarse en los cromosomas de una clula husped.
RFLP: vase Polimorfismo de longitud d e fragm entos de restriccin.
Ribozima: molcula RNA catlitica natural o sinttica. Vase fig u
ra 21-10.
Riesgos empricos: riesgos calculados a partir de datos de encues
tas y no de la teora gentica. La asesora gentica en la mayor
645
parte de los padecimientos no mendelianos se basa en riesgos

empricos. Vase seccin 4.4.4.
RNA antisentido: transcrito complementario de un mRNA nor
mal, formado utilizando el filamento que no es modelo (planti
lla) de un gen. Los RNA antisentido que ocurren naturalmente
son reguladores importantes de la expresin gnica.
RNAi (RNA de interferencia): uso de siRNA para knock down
(pero rara vez abolir completamente) la expresin de genes
especficos. Un medio potente para estudiar la funcin de los
genes.
siRNA (RNA de interferencia pequeo); RNA de doble filamen
to de 21 a 23 nt que suprime especficamente la funcin de su
mRNA homlogo. Vanse seccin 20.2.7 y figu ra 20-2.
tRNA supresor: molcula de RNA de transferencia mutante con
sustitucin de un nucletido en el anticodn. Muestra una
especificidad de codificacin alterada y es capaz de trasladar un
codn sin sentido (o de sentido errneo). Vase recuadro 5-3.
SAGE (anlisis seriado de expresin gnica): mtodo de p erfil de
expresin basado en secuenciacin. Vase figu ra 19-5
Satlite (en el cromosoma): proyeccin pedunculada que se
encuentra variablemente en los brazos cortos de cromosomas
acrocntricos humanos (13,14,15,21,22).
Secuencia de seal (secuencia gua): secuencia de unos 20
aminocidos en la terminal N de un polipptido que controla
su destino dentro o fuera de la clula. Vase seccin 1.5.4.
Secuenciacin de bisulfito: mtodo para detectar patrones de
metilacin de DNA. Vase seccin 18.3.6.
Secuenciacin en escopetazo: secuenciacin de fragmentos de
DNA que se han generado aleatoriamente de una clona grande
o un genoma completo. Vase figu ra 8-3.
Segmentacin qumica de incompatibilidades (CCM): mtodo
de exploracin de fragmentos de DNA de tamao kilobase para
mutaciones. Vase cuadro 18-2, figu ra 18-4B.
Seleccin de cDNA: mtodo basado en hibridacin para recupe
rar clonas genmicas que tienen contrapartes en una genoteca
de cDNA. Vase figu ra 7-11.
Semidominante: un alelo que, en el heterocigoto, produce un
fenotipo intermedio (pero no necesariamente a la mitad) entre
el tipo silvestre y el homocigoto. Un trmino que se utiliza
ampliamente en gentica de ratones pero que es mejor evitar,
cuando menos en gentica humanan, ya que dominancia es una
propiedad de un carcter y no de un alelo.
Sensibilidad de dosis: propiedad de un gen en la que un cambio
en el nmero de copias produce un fenotipo anormal.
Sesgo de valoracin: proporciones deformadas de fenotipos en un
grupo de datos causado por la forma en que se renen los casos.
Vase seccin 15.2.1.
Seudogen: secuencia de DNA que muestra un grado alto de
homologa de secuencia con un gen funcional no allico pero
que no es funcional en s mismo.
Silenciador: combinacin de elementos de secuencia de DNA
cortos que suprimen la transcripcin de un gen. Vase recuadro
10- 2 .
Sincitio: clula que contiene mltiples ncleos como resultado de

ciclos de replicacin del DNA sin divisin celular o por fusin
de mltiples clulas (como en el caso de las clulas de fibra
muscular).
Sndrome de aneuploida (o aneusoma) segmentaria: vase
Sndrome de gen contiguo.
Sndrome de gen contiguo (aneuploida segmentaria): sndrome

causado por delecin de un grupo contiguo de genes, varios de
los cuales, o la totalidad de ellos, contribuyen al fenotipo. Vase
seccin 16.8.1.
Sintenia: presencia de locus en el mismo cromosoma (sintnicos).
Los locus sintnicos no necesariamente estn enlazados: locus
suficientemente separados en el cromosoma se seleccionan alea
toriamente, con 50% de recombinantes.
Sistema Cre-lox: tcnica para generar deleciones cromosmicas
predefinidas. Cre es un gen bacterifago P1 cuyo producto
facilita la recombinacin entre secuencias loxP. Se denomina as
porque crea ^combinacin. Vanse figuras 20-10, 20-11.
Sistema de dos hbridos: vase Sistema de levadura de dos hbridos.
Sistema de levadura de dos hbridos: un sistema importante para
identificar y purificar protenas que se unen a una protena de
inters. Vase figu ra 19-18.
Sitio aceptor de empalme (splice)-. la unin entre el extremo 3 de
un intrn y el inicio del exn siguiente. Secuencia de consenso
ynnyagR (y = pirimidina, R = purina; caso de arriba = exn).
Vase figu ra 1-15.
Sitio donador de empalme: unin entre el extremo de un exn y
el inicio (extremo 5) del intrn corriente abajo. Secuencia de
consenso (C/A)ACgragt (r = purina; caso de arriba = exn).
Vase figu ra 1-15.
Sitio de empalme (splice) crptico: secuencia en el pre-mRNA
con cierta hemologa a un sitio de empalme. Los sitios de
empalme crpticos pueden utilizarse como sitios de empalme
cuando est alterado ste o despus de una mutacin de susti
tucin de bases que aumenta la semejanza con un sitio de
empalme normal. Vanse figuras 11-12, 11-13.
Sitio de rama: en el procesamiento del mRNA, una secuencia bas
tante mal definida (consenso CTRAY; R = purina, Y = pirimi
dina) localizada 10 a 50 bases corriente arriba del aceptor de
empalme que contiene la adenosina en la cual se forma el inter
mediario de empalme lazo. Vase figu ra 1-15.
Sitio de secuencia /arcado (SSM): cualquier pieza nica de DNA
para la cual se ha diseado una valoracin de PCR especfica, de
tal manera que es posible estudiar fcilmente la presencia o
ausencia de cualquier muestra de DNA. Vase recuadro 10-3.
Sitios de hipersensibilidad de DNAsa I: regiones de la cromatina
que son digeridos rpidamente por la DNAsa I. Se piensa que
son secuencias de control de largo alcance importantes. Vase
seccin 10.5.2.
Sobredominante: fenotipos que muestran ventaja de heterocigoto.
Un trmino que se utiliza en gentica de poblacin.
Somitas: bloques discretos de mesodermo segmentario que estable
cern la organizacin segmentaria del cuerpo originando la
mayor parte del esqueleto axil (incluyendo la columna verte
bral), los msculos voluntarios y parte de la dermis de la piel.
Sonda: fragmento de DNA o RNA conocido (o un conjunto de
diferentes fragmentos conocidos) que se utiliza en una valo
racin de hibridacin a fin de identificar secuencias de DNA o
RNA relacionadas muy de cerca dentro de una mezcla comple
ja de cidos nucleicos, que se comprende muy poco. En las valo
raciones de hibridacin estndar se marca la sonda, pero en las
valoraciones de hibridacin inversa se marca el blanco (vase
recuadro 6-4).
Southern blot: transferencia de fragmentos de DNA de un gel
electrofortico a una membrana de nylon o nitrocelulosa (fil
tro), en preparacin para una valoracin de hibridacin. Vase
figu ra 5-12.
SSCP o SSCA: polimorfismo o anlisis de conformacin de fila

mento nico, un mtodo que se utiliza comnmente para la
seleccin de mutaciones de punto. Vase figu ra 18-3 A.
STS: vcase recuadro 8-1.
Suplementacin gnica (o aumento): teraputica gnica en la que
se introduce un gen funcional en las clulas del paciente sin
manipular ninguno de los genes endgenos. Adecuado para
corregir la prdida de fenotipos funcionales. Vase figura 21-4.
Sustitucin conservadora: mutacin que causa el reemplazo de
un codn por otro codn que especifica un aminocido dife
rente, pero que est relacionado en las propiedades qumicas
con el aminocido original.
Sustitucin sinnima (silenciosa): sustitucin que reemplaza un
codn por otro que codifica el mismo aminocido. Vase
Recuadro 9-2.
Translocacin: transferencia de regiones cromosmicas entre cro

mosomas que no son homlogos. Vase figura 2-21.
Transposicin duplicativa (o copia o replicativa): transposicin
de la copia de una secuencia de DNA, en tanto permanece en
su sitio la original.
Transposn: elemento gentico mvil vase figu ra 9-17.
Transversin: sustitucin de un nucletido de purina por pirimidina o viceversa.
Triploida: de una clula, tener tres copias del genoma; de un
organismo, estar constituido por clulas triploides.
Trisoma: presencia de tres copias de un cromosoma particular, por
ejemplo, trisoma 21.
Trofoblasto (= trofoectodermo): capa externa de clulas polari
zadas en el blastocisto (vase fig. 3-13) que evolucionar para
formar el corion, el componente embrionario de la placenta.
Telmero: estructura especializada en las puntas de los cromoso

mas. Consiste en una ordenamiento de repeticiones tndem
cortas (TTAGGG)n en humanos, que forman un asa cerrada y
protegen el extremo del cromosoma.
Temperatura de fusin (Tf): vase recuadro 6-3.
Tiempo de coalescencia: en gentica de poblacin, el nmero de
generaciones anteriores al ancestro comn ms reciente. Vase
recuadro 12-6.
Trampa gnica: mtodo para seleccionar las inserciones transgnicas que han ocurrido en un gen.
Trampa intensificadora: tcnica para identificar genes que se
expresan con fuerza en un organismo.
Transcriptasa inversa: enzima que puede formar un filamento de
DNA utilizando una plantilla de RNA. Se utiliza para hacer
genotecas de cDNA (fig. 4-8) y para PCR-TI (seccin 20.2.4).
La transcripcin inversa es una parte esencial del ciclo de vida
retroviral (fig. 18-2) pero, hasta donde se sabe, no del metabo
lismo celular normal.
Transcriptoma: grupo total de transcritos de RNA diferentes en
una clula o tejido. Cf. genom a, proteoma.
Transdiferenciacin: (o plasticidad): posible capacidad de las
clulas que parecen estar comprometidas a un tipo particular de
diferenciacin para derivarse hacia otra va de diferenciacin.
Transduccin: transferencia gnica mediada por virus. Vanse
Recuadro 19-1 y Recuadro d e tica 1 en el captulo 21.
Transfeccin: captacin de DNA por clulas eucariotas (el equiva
lente de transformacin en bacterias, pero esta palabra tiene un
significado diferente para clulas eucariotas. Vase asimismo
captacin de DNA de plsmido por clulas bacterianas. Vase
Recuadro 19-1.
Transformacin (de una clula): 1, captacin por una clula bac
teriana com petente de DNA de peso molecular alto desnudo del
ambiente; 2, alteracin de las propiedades de crecimiento de
una clula eucariota normal como un paso hacia la evolucin a
una clula tumoral.
Transgn: gen exgeno transfectado al interior de una clula de un
animal o una planta. Puede presentarse en algunos tejidos
(como en las teraputicas gnicas en el hombre) o en todos los
tejidos (p. ej., en ingeniera de lnea germinal, como en el
ratn). Los transgenes introducidos pueden ser epismicos y
expresarse en forma pasajera, o integrarse en los cromosomas de
la clula husped.
Transicin: sustitucin nucletida G <= A (purina por purina) o
C o T (pirimidina por pirimidina).
Unidad de transcripcin: tira de DNA que se transcribe en forma

natural en una operacin aislada para producir un transcrito
primario nico. En los casos directos, una unidad de transcrip
cin es lo mismo que un gen.
Valor p en la extensin del genoma: pruebas para enlace o aso
ciacin, la probabilidad en la hiptesis nula de observar la
estadstica en cuestin en cualquier parte en una seleccin de la
totalidad del genoma (cf valor p en la extensin d e punto). Vase
seccin 15.3.4.
Valor p del punto sensato: en anlisis de enlace, la probabilidad
en la hiptesis nula de exceder el valor observado de la estads
tica en una posicin determinada en el genoma. Cf. valor de p
en la extensin d el genoma. Vase seccin 15.3.4.
Valoracin de ligadura de oligonucletidos (OLA): mtodo para
detectar un cambio de secuencia definido previamente. Vase
figu ra 18-11.
Vector: cido nucleico capaz de replicarse y conservarse por s mis
mo dentro de una clula husped y que puede utilizarse para
conferir propiedades similares en cualquier secuencia enlazada
covalentemente a l.
Ventaja heterocigota: situacin en que la heterocigosidad de una
persona para una mutacin tiene una ventaja en la reproduc
cin sobre ambos homocigotos. Llamada en ocasiones sobredominancia. La ventaja heterocigota es la razn por la que
siguen siendo comunes varias enfermedades recesivas graves.
Vase recuadro 4-8.
Western blotting: proceso en el cual se fracciona el tamao de pro
tenas en un gel de poliacrilamida y a continuacin se trans
fieren a una membrana de nitrocelulosa para sondar con un
anticuerpo. Vase figu ra 20-9.
YAC (cromosoma artificial de levadura): vector capaz de propa
gar insertos de una megabase o ms en clulas de levadura.
Vase figu ra 5-17.
YAC transgnico: ratn transgnico en el cual el transgn es un
YAC completo que permite estudiar los efectos reguladores de
las secuencias que rodean al gen seleccionado. Vase seccin
20.2.3.
Zoo-blot: Southern blot que contiene muestras de DNA de una
gama de diferentes especies. Vase figu ra 7-9.
Indice de enferm edades

Acondrognesis II, 485
Acondrognesis tipo IB, 476
Acondroplasia, 95, 468, 483, 522
Adenoma, 504, 505
ADRPL (atrofia dentadorrbrica
palidoluisiana), 481
Agammaglobulinemia, vase Inmunodefciencia
Alagille, sindrome, 472, 484, 486
Albinismo ocular, 479
Alzheimer, enfermedad, 443, 454, 482, 605
modelo animal, 603
Anemia, sideroblstica, 605
congenita, 605
Angelman, sndrome, 299, 302-3, 342, 343,
473, 476, 486
Aniridia, 95, 299
Apert, sndrome, 328, 483
Aracnodactilia contractural congenita, 424
Artritis, 602
Ataxia telangiectasia, 347, 497, 500
Atelosteognesis, 11,476
Ateroesclerosis, 604
anlisis de microordenacin, 554
Atrofa muscular espinal, 470
Atrofa muscular espinobulbar, 106, 479
tipo 1, 604, 606
tipo 11,481
tipo 17, 481
tipo 6, 481
tipo 7, 481
tipo 8, 481
Batten, enfermedad, 202
Beckwith-Wiedemann, sndrome, 109,
302-3, 473
Bethlem, miopatia de, 96
Bloom, sndrome, 605
Branquio-oto-renal, sndrome, 432
Cncer bucal, 490, 498, 506
Cncer de colon no polipsico, hereditario,
498, 502, 505
Cncer colorrectal, 493, 501, 502, 505, 562
marcadores, 562
Cncer de endometrio, 502
Cncer gstrico, 493
Cncer de mama, 452, 493, 497, 506, 562
BRCA1 en cncer espordico, 495, 506
Cncer medular de la tiroides, 479
Cncer del ovario, 452, 493, 497, 630
Cncer de pulmn, 493, 506
Cncer, teraputica gnica, 629
modelacin en ratones, 604
Cncer de tiroides, 496
Cncer de la vejiga, 493, 506, 562
marcadores, 562
Cardiopatia coronaria, 229
CCNPH, vase Cncer de colon no polipsico
hereditario
Ceguera a los colores, 118
Chagas, enfermedad, 229
Charcot-Marie-Tooth, enfermedad, 105, 474,
479, 480, 522, 606
Cilios inmviles, sndrome, 63

Cockayne, sndrome, 347
Clera, 229
Colestasis intraheptica benigna, 411-412
Colitis seudomembranosa, 229
Colitis ulcerosa, vase Enfermedad inflamatoria
del intestino
Condrodistrofa metafsaria de Jansen, 475
Craneosinostosis coronal de Muencke,
sndrome, 483
Creutzfeldt-Jakob, enfermedad, 479, 482
Crohn, enfermedad, vase, Enfermedad
inflamatoria del intestino
Crouzon, sndrome, 483
Cutis girata (Beare-Stevenson), 484
Darier-White, enfermedad, 422
Defecto del tubo neural, riesgo de recurrencia,
116
Deficiencia de hormona del crecimiento, 617
Denys-Drash, sndrome, 328
Di George, sndrome, vase Velocardiofacial,
sndrome (SVCF)
Di George/VCF, sndrome, 342, 343, 486
Diabetes mellitus, 415
deficiencia de cinasa de glucosa, 543
DIMJ (diabetes de inicio en la madurez del
joven), 457
modelo utilizando ribozimas, 595
mutantes de C. elegans importantes, 547
tipo 1 (dependiente de insulina), 455, 603,
617
tipo 2, 457
Displasia campomlica, 299, 429
Displasia distrfica, 476
Displasia ectodrmica hipohidrtica, 104
Displasia epifisaria mltiple, 476
Displasia espondiloepifsaria, 483, 485
Displasia mesomlica de Langer, 384
Displasia tanatofrica, 109, 484
Distrofa miotnica, 107, 480, 522, 542
Distrofa muscular de la cintura de las
extremidades, 470
Distrofia muscular, clonacin gnica, 420, 427
Duchenne/Becker, 106, 446, 484
estimacin del riesgo, 530
mutaciones nuevas, 109, 118, 529
patologa molecular, 469, 470, 472
pruebas genticas, 515, 518, 519, 520
sndrome de gen contiguo, 484
teraputica gnica, 629
Distrofia muscular farngea, 481
Distrofia muscular fascio-escpulo-humeral, 105
Down, sndrome, 486, 606
Ehlers Danlos, sndrome, 470, 478, 485
Enanismo de Laron, 95
Enfermedad de clula I, vase Mucolipidosis II
Enfermedad granulomatosa crnica, 420, 484
Enfermedad inflamatoria del intestino, 458,
461
Enfermedad poliqustica del rin, 420
Epilepsia, mioclono juvenil, 481
Esclerosis mltiple, 617

Esclerosis tuberosa, 415
Espina bfida, 606
Esquizofrenia, 415, 438, 443, 459
Estenosis artica supravalvular, 472, 486
Estenosis pilrica, 116
Ewing, sarcoma de, 496
Exostosis hereditaria mltiple, 96
Exostosis mltiple, 472
Falciformes, clulas, anemia de, 418, 522
Fanconi, anemia de, 347, 433, 501, 602
Feminizacin testicular, sndrome, vase
Insensibilidad a andrgenos
Fenilcetonuria, 418, 531
tratamiento, 612
Fibrosis qustica, 512, 412, 466, 479, 604
clonacin, 421
deteccin de mutacin, 430
mapeo, 405, 411, 415
modelo de ratn, 604
mutaciones tpicas, 528
patologa molecular, 466, 467
pruebas genticas, 517, 523, 525
riesgo de recurrencia, 116
seleccin de una poblacin, 531
teraputica gnica, 618, 628
ventaja del heterocigoto, 118
Friedreich, ataxia de, 480
Gaucher, enfermedad, 604, 617
Gerstmann-Strussler (GSS), sndrome, 604,
606
Gorlin, sndrome de, 497
Grupo sanguneo O, 106, 108
Hemocromatosis, 612
Hemofilia, 344
Hemofilia A, 344, 470, 617
deteccin de mutacin, 430
como resultado de transposicin, 344
Hemofilia B, 603, 617
Hemoglobinopatas, 462, 466, 469
Hipercolesterolemia, 604
Hiperplasia suprarrenal congnita, 96
Hiperplasia tiroidea, 475
Hipocondroplasia, 483
Hirschsprung, enfermedad, 95, 328, 420, 424,
442, 454, 478, 479
Holt-Oram, sndrome, 95
Hombre puerco espn, 104
Huntington, enfermedad, 102, 107, 109, 476,
521, 522, 542, 544
desequilibrio de enlace, 447
edad de inicio, 118
ganancia de funcin, 468
patologa molecular, 479
pruebas genticas, 521, 527, 531
Incontinencia pigmentaria, 109
Infertilidad, masculina por deleciones grandes,
342
648
NDICE DE ENFERMEDADES
Inmunodeficiencia, 482
combinada grave, 621, 628
Insensibilidad a andrgenos, 479
sndrome, 93
Insomnio familiar mortal, 479
Interferon, respuesta de, 595
Jackson-Weiss, sndrome, 481
Jervell y Lange-Nielsen, sndrome, 477
Kallmann, sndrome, 384, 607
Kennedy, enfermedad, vase Atrofia muscular
espinobulbar
Kniest, sndrome, 483, 485
Langer-Giedon, sndrome, 486
Leber, neuropata ptica hereditaria de, 186, 482
Leishmaniasis, 229
Lepra, 229
Leri-Weill, sndrome, 384
Lesch-Nyhan, sndrome, 478
Leucemia linfoblastoide aguda (LLA), 555
Leucemia, linfoblstica, 496
mielgena aguda, 496
mieloide, 493, 500, 506
mieloide crnica, 476
uso de virus, 491
viral, 492
Leucemia mieloide aguda (LMA), 555
Li-Fraumeni, sndrome, 497, 502, 605
Lime, enfermedad, 229
Linfoma, 491
de Burkitt, 493
Machado-Joseph, enfermedad, 481
Marfan, sndrome, 424, 433
Mastocitosis, 493
Maullido de gato, sndrome, 486
McCune-Albright, sndrome, 475, 476, 479
Melanoma, 493, 497, 504, 630
Metabolismo, errores innatos, 612
Miller-Dieker, sndrome, 486
Modelo de progresin, 504
Mucolipidosis II, 482
Nefronoftisis juvenil familiar, debida a
deleciones grandes, 343
Neoplasia endocrina mltiple, 478, 479
Neuroblastoma, 492
Neurofibromatosis tipo 1, 479, 497, 602
Neurofibromatosis tipo 2, 328, 497, 518
Neuropata tomaculosa, 472, 478, 479

Nijmegen, rotura de, sndrome, 345, 413,
414, 500
Obesidad, 460
Odos pilosos, 104
Osteodistrofia hereditaria de Albright, 479
Osteognesis imperfecta, 476, 478, 483, 484
PAF, vase Poliposis adenomatosa familiar
Paladar hendido, 115
Parlisis peridica, 479
Paramiotona congenita, 476, 479
Parkinson, enfermedad, 482, 625
Pelizaeus-Merzbacher, enfermedad, 328
Prdida de la audicin, 105
DFNB3, 434
DFNB9, 433
mitocondrial, 107
recesiva, 411, 412
Peste, 229
Pfeiffer, sndrome, 483, 484
Piebaldismo, 95
Plipos de colon, 607
Poliposis adenomatosa del colon, vase
Poliposis adenomatosa familiar
Poliposis adenomatosa familiar, 111, 496, 497,
501,505,515
modelo de ratn, 606
Prader-Willi, sndrome, 299, 302-3, 342, 343,
473
Protoporfiria, 606
Pubertad precoz, 475
Rabdomiosarcoma alveolar, 478, 479, 492, 496,
605
Raquitismo, resistente a vitamina D, 428
Retinitis pigmentosa, 432
Retinoblastoma, 494, 497, 605
mecanismo de dos golpes, 494
modelo de ratn, 606
Rett, sndrome, 328
Reversin del sexo, 474
Romano-Ward, sndrome, 477
Rubinstein-Taybi, sndrome, 486
Seudoacondroplasia, 481
Seudohermafroditismo, 96
Sida, teraputica gnica, 631
Simpolidactilia, 481
Smith Magenis, sndrome, 342, 343, 486

Sordera, vase Prdida de la audicin
Sotos, sndrome, 426, 431
Stickler, sndrome, 483, 485
Talasemia, 469, 475, 522, 523
modelo de ratn, 606
mutaciones tpicas, 528
seleccin de poblacin, 533
Tay-Sachs, enfermedad, 522, 523, 606
Teratomas del ovario, 302
por diploida materna, 57
Tirosinemia, 612
Tos ferina, 229
Tracoma, 229
Trastorno de pnico debido a deleciones
grandes, 342
Treacher Collins, sndrome, 431
Trico-rino-farngeo, sndrome, 472
Tripanosomosis, africana, 229
americana, 229
Tuberculosis, 229
Tumores glmicos, 108, 109
Turner, sndrome, 607
Usher, sndrome, 105, 484
tipo II, 96
Velocardiofacial, sndrome (SVCF), 486
Von Hippel-Lindau, enfermedad, 388,
497
Von Recklinghausen, enfermedad, vase
Neurofibromatosis I
WAGR, sndrome, 486
Waardenburg, sndrome, 601
tipo 1, 102, 107, 108, 433, 467,
478, 479
tipo 2,4 11 ,42 0
tipo 4, 420
Werner, sndrome, 96, 546, 548, 602
Williams Beuren, sndrome, 342, 343, 486
Wolf-Hirschhorn , sndrome, 486
X frgil, sndrome, 107, 118, 418, 468, 522,
527, 604
modelo de ratn, 604
patologa molecular, 480
Xerodermia pigmentosa, 345, 501, 602
XYY, sndrome, 102
genetico vase la fig. 1-22 para revisar diversos cdigos mitocondriales):

P rim era base
U
II
uuu
uuc
UUA
UUG
C
Fen
Leu
UCU
UCC
UCA
UCG
S er
O O O O
c c c c
O > o c
SegLoO a Dase
Leu
CCU
CCC
CCA
CCG
Pro
UAU 1
_
UAC/
T 'r
UAASTO P
UAG STO P
CAU
CAC
CAA
CAG
UGU1
Cis
UGC J
QS
UGA STOP
U G G Trp
CGU
CGC
CGA
CGG
His
G in
Arg
AUU
AUC
AUA
AUG
ACU
ACC
ACA
ACG
AAU
AAC
AAA
AAG
AGU
AGC
AGA
AGG
lie
M et
T re
Asn
Lis
S er
Arg
GUU
GUC
GUA
GUG
Val
GCU
GCC
GCA
GCG
A la
GAU
GAC
GAA
GAG
GGU
GGC
GGA
GGG
Asp
Gli
Gli
Cdigos de una letra para aminocidos

A
G
M
S
X
alanina
glicina
metionina
serina
codn de detencin
C
H
N
T
cisterna
histidina
asparagina
treonina
D
I
P
V
cido asprtico
isoleucina
prolina
valina
E cido glutmico
K lisina
Q glutamina
W triptfano
F
L
R
Y
Informacin complementaria
En las pginas indicadas puede encontrarse informacin sobre los temas siguientes.
Bases de datos electrnicas y recursos de URL (vase asimismo Uso inteligente de internet, pg. xxix)
Proyectos del genoma
Pg. 236
Centros de secuencia del genoma
Cuadro 8-4, pg. 235
Organismos modelos
Pg. 236
Base de datos sobre mutacin
Pg. 348
Secuencias de nucletidos y protenas
Cuadro 8-2, pg. 222
Otros proyectos del genoma de metazoarios
Cuadro 8-4, pg. 235
Genes humanos y estadsticas sobre gcnomas
Recuadro 9-5, pg. 255
Nomenclatura en seres humanos

Cromosomas
Anormalidades cromosmicas
Genes y secuencias de DNA
Mutaciones
Smbolos de genealoga

Figura 4-1, pg. 102
Filogenias
Fiiogenia^ticariota
: .jogen; de metazoarios
Filos; :iia de vertebrados
Figura 12-22, pg. 380

Figura 12-24, pg. 382
Figura 12-23, pg. 381
m jo k s
de tejidos de capas germinativas
fenilalanina
leucina
arginina
tirosina
r\
13.3
13.2
13.1
112r
13.1
13.2
13.3
11.2 1
11.3
11.23
\W
11:1
11.2
12
13
23.1
23.2
23.3
22.1
31.1
31.2
31.3
22.3
23.1
22.2
32
33.1
33.2
33.3
34
35.1
35.2
35.3
15.5
15.4
15.3
15.2
15.1
13.3
13.2
12.3
12.2
12.1
11:1
11.2
21.1
21.2
21.3
22.1
21.1
21.2
21.3
22.1
22.2
22.3
22.2
22.3
23.1
23.2
25.1
25.2
25.3
26.1
26.2
26.3
23
24.1
24.2
24.31 ,
24.32 \
24.33
10
11
ii.i
ii.i
11.2
26.1
26.2
26.3
12
15
11.3
11.2
11:1
11.21
11.22
11.23
16
Patrones de bandeo de cromosomas humanos
C lave:
^ C entrm ero
- rD N A
E3 H etero crom atina
no centrom rica
a gentica molecular humana se revis y actualiz a la luz de los descubrimientos

consecutivos del Proyecto del Genoma Humano. A medida que entramos en la era
posgenoma, este libro proporciona un enlace entre los textos elementales y la bibliografa
sobre investigacin, de tal manera que las personas sin demasiadas bases sobre el tema
pueden apreciar y leer las ltimas investigaciones.
La primera seccin incluye material bsico sobre la estructura y funcin del DNA,
cromosomas, clulas y desarrollo, anlisis de genealoga y tcnicas bsicas utilizadas
en un laboratorio.
La segunda com enta los diversos proyectos de secuenciacin del genoma y las
informaciones que proporcionan sobre la organizacin, expresin, variacin y evolucin
del genoma humano.
La tercera se enfoca en el mapeo, identificacin y diagnstico de causas genticas de
enfermedades mendelianas, complejas y oncolgicas.
En la cuarta parte se analizan los horizontes ms amplios de la genmica funcional,
protemica, bioinformtica, modelos animales y teraputica.
Se incluye un glosario extenso.
Se organizaron por completo las secciones sobre enfermedades complejas y el captulo
de proyectos del genoma. Destaca tambin una nueva seccin sobre filogentica molecular
y la introduccin de recuadros de tica para comentar algunas de las implicaciones del
nuevo conocimiento. El presente libro permite explicar los principios y no proporcionar
gran nmero de hechos. Es fcil consultar los acontecimientos relevantes, sobre todo
a travs de internet, y se proporcionan referencias necesarias. Las bibliografas al final
de cada captulo tienen un propsito ms didctico; con frecuencia se citan revisiones
en lugar del primer artculo sobre un tema y se han elegido referencias de revistas de
fcil acceso. Antes que todo, la obra refleja la sensacin de una investigacin de rpido
movimiento que lleva a continuar la travesa del descubrimiento hacia nuestro genoma.
Me McGraw-Hill
Hifw Interamericana
The M c G ra w -H ill Companies
V isite nuestra pgina WEB
www.mcgraw-hill-educacion.coni

Tom Stracham. Genetica Humana 3ra Ed - VISION MEDICA

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GENETICA

Dr. Jorge Orizaga Samperio

Dr. Ismael Vzquez Moctezuma

Auxiliares didcticos suplementarios

Antes de empezar: uso inteligente de internet

Estructura del DNA y expresin gnica

Formacin de bloques y enlaces qumicos en DNA, RNA y polipptidos

Estructura y replicacin del DNA

Recuadro 1-1. Ejemplos de la importancia del enlace de hidrgeno en cidos nucleicos

La replicacin del DNA es semiconservadora y la sntesis de cadenas de DNA semidiscontinua

Recuadro 1-2. Principales clases de protenas que se utilizan en la maquinaria

Transcripcin del RNA y expresin genica

Procesamiento del RNA

Traduccin, procesamiento postraduccional y estructura de las protenas

Estructura y funcin de los cromosomas

Ploida y ciclo celular

Estructura y funcin de los cromosomas

Cromosomas como organelos funcionales: sitio central del centromero

Recuadro 2-1. Huso mittico y componentes

Cromosomas como organelos funcionales: orgenes de la replicacin

Tipos de divisin celular: mitosis y nieiosis

Estudio de los cromosomas humanos

Recuadro 2-2. Bandeo cromosomico

Citogentica molecular: hibridacin fluorescente in situ (HFIS) cromosomica

Recuadro 2-3. Nomenclatura del cromosoma humano

Pintado cromosomico, cariotipificacin molecular e hibridacin comparativa del genoma

Anormalidades de los cromosomas

Recuadro 2-4. Nomenclatura de anormalidades cromosmicas

Las anormalidades cromosmicas estructurales resultan de la reparacin errnea de roturas

Estructura y diversidad de clulas

Recuadro 3-1. Organizacin intracelular de las clulas animales

Recuadro 3-2. Citoesqueleto: elemento fundamental para el movimiento y la forma celulares,

Generalidades del desarrollo

Especializacin de las clulas durante el desarrollo

Recuadro 3-3. Modelos animales del desarrollo

La eleccin entre destinos alternativos puede depender del linaje o la posicin

Recuadro 3-4. Gemelacin en embriones humanos

Recuadro 3-6. Diversidad de clulas humanas

Formacin del patrn en el desarrollo

Recuadro 3-7. Polarizacin del embrin de mamferos: seales y productos gnicos

La proliferacin celular y la muerte programada de las clulas (apoptosis) son mecanismos

Desarrollo humano inicial: fecundacin a gastrulacin

El sistema nervioso se desarrolla despus que el mesodermo subyacente induce al ectodermo a

Conservacin de las vas del desarrollo

Genes en genealogas y poblaciones

Herencia monognica comparada con multifactorial

Recuadro 4-1. Caractersticas de los patrones de herencia mendelianos

Complicaciones de los patrones de genealoga mendelianos bsicos

La letalidad masculina puede complicar genealogas ligadas a X

Amplificacin del DNA: clonacin de DNA por PCR y basada en clulas

Importancia de la clonacin del DNA

Hibridacin de cido nucleico: principios y aplicaciones

Preparacin de sondas de cido nucleico

Recuadro 6-1. Principios de la autorradiografa

Principios de la hibridacin de cido nucleico

Recuadro 6-2. Sistemas de marcado y deteccin con fluorescencia

Las cinticas de reasociacin de DNA se definen mediante el producto de la concentracin de DNA

Recuadro 6-3. Glosario de hibridacin de cido nucleico

Es posible utilizar una gran variedad de valoraciones de hibridacin de cido nucleico

Valoraciones de hibridacin de cido nucleico mediante sondas de DNA clonado para

Recuadro 6-4. Valoraciones de hibridacin de cido nucleico estndar e inversa

Anlisis del DNA y estructura, variacin y expresin gnicas

Secuenciacin y genotipificacin de DNA