Sie sind auf Seite 1von 7

Anteriormente, la produccin piocianina se llev a cabo usando medio de King

(20 g de peptona, 1,4 g de cloruro de magnesio, 10 g de sulfato de potasio, 15


g de agar en 1 l de agua destilada, pH 7,0 0,2, 25? C) como se describe por
King et al . en 1954. Sobre la base de mediano del Rey, Pseudomonas medio de
agar se formul que se recomienda para piocianina prodcution por especies de
Pseudomonas. Este medio mejora la elaboracin de piocianina pero inhibe la
formacin de otros pigmentos. Hay muchos informes que determinaron las
caractersticas y condiciones culturales que favorecen la produccin de
piocianina (Burton et al 1948;. Karpagam et al 2013;.. Sudhakar et al 2013).
Combinacin de aminocidos, en particular alanina y leucina, en el medio de
cultivo dio como resultado una produccin ms eficaz del pigmento. Hubo
varios trabajos sobre el diseo del medio para la produccin de pigmentos.
formulaciones de medios que producen niveles ptimos de piocianina
contienen glicerol, alanina, azufre y hierro. La presencia de alanina y glicerol
como sustratos conjuntas fue altamente eficaz y actu como un precursor para
piocianina produccin. Este medio sustrato conjunta es el medio Frank y De
Moss, recomendado para el diagnstico rpido de P. aeruginosa y demostracin
de piocianina (Frank y De Musgo 1958; Wahba y Darrel 1965; Subramaniam y
Shriniwas 1985). Una formulacin modificada del Medio del Rey para la
produccin piocianina fue desarrollado que contena glicerol. La adicin de
cido nalidxico a este mediano, con disminucin de la concentracin de
cetrimida, inhibi flora contaminante y por lo tanto permiti una mejor
recuperacin de P. aeruginosa con un incremento concomitante en la
produccin de piocianina
Recientemente hubo un informe sobre la produccin de piocianina de cien
cepas de P. aeruginosa aisladas de muestras clnicas utilizando diversos medios
modificada (Sheeba 2007). Siete medios lquidos [Medio de Frank (FM)? 1% de
extracto de levadura, FM? 0,5% de triptona, FM? 0,1% KNO3, FM? 1% Bactopeptona, FM? 0,1% de glucosa, peptona, caldo nutriente] y seis medios slidos
(agar de levadura glucosa triptona, medio diferencial del vendedor, agar de
nutrientes, medio FNA, cetrimida agar y Pseudomonas agar) se utilizaron para
la produccin de pigmento. medio [FM] de Frank? 1% de extracto de levadura
mostr mayor produccin de piocianina que los otros medios lquidos. Entre los
seis medio slido utilizado, agar cetrimida mostr una produccin mxima de
piocianina. La produccin de pigmento bacteriana hace su identificacin ms
rpida de muestras clnicas debido a la actividad antibitica del pigmento.
Hay algunos factores que influyen en la produccin de pigmentos utilizando
diversos medios de comunicacin. Se investig la produccin de piocianina de
tipo salvaje y cepas mutantes Pseudomonas, y a partir del estudio se concluy
que el agotamiento del fosfato en el medio de cultivo aumenta la produccin
de pigmento (Ingledew y Campbell 1969; Byng et al 1979;. Porter 2009). En
otro informe, existe evidencia de que el agotamiento de hierro en los favores
medianas piocianina produccin (Cox, 1986). Dependiendo de la densidad de
las clulas, el organismo produce pigmento y cuando hay un agotamiento de
algunos nutrientes, hay ms produccin. Se ha informado de que un

rendimiento satisfactorio de piocianina depende principalmente de la


composicin de los medios

Anteriormente, se utiliz medio de glicerol-peptona-fosfato lquido para mejorar


la produccin de piocianina de P. aeruginosa. El pigmento piocianina que es
difusible en el medio puede ser extradas con disolventes de cloroformo. Los
extractos se purificaron usando una columna de xido de aluminio con elucin
mezcla de disolventes de cloroformo-etanol y se cristalizan (El-Samerraie et al.
1997). Ms tarde, en otro informe, el pigmento se aisl por varios perfiles
bioqumicos y el pptido se purific por precipitacin con sulfato de amonio,
filtracin en gel y cromatografa de intercambio inico (Fontoura et al. 2009).
O'Malley et al. (2003) extrae piocianina usando clorhidrato 10 mM seguido de
agua neutral en lugar de cloroformo y esto fue 1160 Mundial J Microbiol
Biotechnol (2014) 30: 1159 hasta 1168123.
Anteriormente, se utiliz medio de glicerol-peptona-fosfato lquido para mejorar
la produccin de piocianina de P. aeruginosa. El pigmento piocianina que es
difusible en el medio puede ser extradas con disolventes de cloroformo. Los
extractos se purificaron usando una columna de xido de aluminio con elucin
mezcla de disolventes de cloroformo-etanol y se cristalizan (El-Samerraie et al.
1997). Ms tarde, en otro informe, el pigmento se aisl por varios perfiles
bioqumicos y el pptido se purific por precipitacin con sulfato de amonio,
filtracin en gel y cromatografa de intercambio inico (Fontoura et al. 2009).
O'Malley et al. (2003) extrae piocianina usando clorhidrato 10 mM seguido de
agua neutral en lugar de cloroformo y esto fue confirmado por la alta presin
cromatografa lquida (HPLC). Hay un informe sobre la extraccin del pigmento
piocianina utilizando nueve diferentes disolventes y entre ellos, cloroformo
mostr la mayor capacidad de extraccin del pigmento. La pureza del
pigmento extrado se comprob mediante cromatografa en capa fina. En este
estudio, piocianina se extrajo con 3 ml de cloroformo y se re-extrajo con 1 ml
de HCl 0,2 N (Hassanein et al 2009;. Raoof y Latif 2010). Saosoong et al. (2009)
informaron de la produccin piocianina de P. aeruginosa. El pigmento se
purific haciendo pasar el sobrenadante en la columna de resina Amberlite
XAD-4 y concentrar el pigmento con una columna de gel de slice. Se resometi a cromatografa por HPLC y la pureza se comprob por tanto
espectroscopia UV / visible e IR. Porter (2009) tambin inform de la
produccin de piocianina de P. aeruginosa y se extrajo utilizando cloroformo. Se
encontr que el pigmento a ser producido por la parte interior de las clulas
que se lisaron mediante la adicin de cloroformo. La pureza fue confirmada por
paso de la solucin acuosa en una columna de Sephadex G-10.

El carcinoma hepatocelular (HCC) es uno de los tumores malignos ms


frecuentes en todo el mundo y se asocia con una alta tasa de metstasis
(Parkin et al. 2001). El tratamiento para el HCC es raramente curativa, aunque
se han utilizado manejo quirrgico y modalidades teraputicas no quirrgicas,
tanto por separado como en combinacin. Piocianina (N-metil-1hydroxyphenazine, PCN) es un redox-activo factor de virulencia azul-verde
secretada por Pseudomonas aeruginosa, un patgeno nosocomial comn que
puede causar infecciones agudas y crnicas en pacientes
inmunocomprometidos. Adems, este patgeno desempea un papel
importante en las patologas asociadas con infecciones recurrentes del pulmn
en la fibrosis qustica (CF), bronquiectasias (Muller 2006) y varias heridas
agudas y crnicas, incluyendo las lesiones por quemaduras (Gjdsbl et al
2006;.. James et al 2008 ). Tras la secrecin por P. aeruginosa, piocianina est
regulada por la percepcin de qurum para inducir la generacin de especies
reactivas de oxgeno (ROS), que resulta en un aumento del estrs oxidativo.
ROS son esenciales para las funciones biolgicas que regulan diversas vas de
transduccin de seales mediante la reaccin directamente con y modificar las
estructuras de las protenas, factores de transcripcin y genes, modulando de
esta manera las funciones de estos objetivos. Las clulas normales preservar la
homeostasis redox controlando estrechamente el equilibrio entre la generacin
de ROS y eliminacin, manteniendo basales de ROS en niveles bajos. Por otra
parte, los altos niveles de ROS pueden ser incompatibles con la supervivencia
celular y ROS pueden ejercer efectos citotxicos, promoviendo as la muerte
celular y la supresin de la progresin del cncer.

Debido piocianina es un bajo peso molecular (210 Da) zwitterion, que


fcilmente se difunde a travs e impregna las membranas celulares, donde se
genera ROS y causa el estrs oxidativo (Muller 2002; O'Malley et al., 2003). A la
entrada en las clulas, se somete a reduccin piocianina no enzimtica por
NAD (P) H y, posteriormente, reduce el oxgeno molecular para superxido O? 2
(Gardner 1996), y por dismutacin, perxido de hidrgeno (H2O2) (O'Malley et
al. 2004). A travs de estos mecanismos, piocianina puede inhibir el
crecimiento de bacterias (Baron y Rowe 1981), hongos (Kerr et al 1999;. Khare
y Arora 2011;. Rella et al 2012) y clulas de mamfero (Sorensen et al 1991;.

McDermott et al . 2012). En este estudio, hemos tratado de examinar y aclarar


los efectos de piocianina en clulas de hepatoma humano HepG2.

Se midi la proliferacin de clulas HepG2 en presencia de 10 ml lg piocianina.


Los datos demostraron que 9-da piocianina tratamiento result en una
reduccin de aproximadamente 67% en el nmero de clulas en comparacin
con el control (Fig. 1a). Adems, en las clulas tratadas con 0? 2 lg ml
piocianina durante 9 das, 10? 1? Se observaron 0? 3 duplicaciones de
poblacin acumulativos (CPD), en comparacin con el 9? 2? 0? 3 CPD para los
controles. Las clulas expuestas a 2 lg ml piocianina se sometieron a 6? 8? 0?
5, CPD, mientras que los tratados con 10 ml lg piocianina se sometieron a 4? 7?
0? 6 CPD (Fig. 1b) despus de 9 das. lesin inducida por piocianina en las
clulas HepG2 se midi mediante la determinacin de los niveles de estrs
oxidativo. Las clulas pretratadas con el antioxidante N-acetil-L-cistena (NAC)
se utilizaron para probar si esta toxicidad fue causalmente ligada al estrs
oxidativo. La concentracin de NAC se mantuvo a 5 mmol l (Gloyne et al. 2011)
para proteger las clulas contra el dao piocianina inducida. Como se muestra
en la Fig. 2a, en comparacin con las clulas de control, las clulas tratadas
exhibieron un aumento rpido y sostenido en la fluorescencia, lo que sugiere
que piocianina caus la produccin de ROS. A continuacin, se determin si el
aumento de ROS fue acompaado por un aumento en las actividades de las
enzimas antioxidantes de proteccin catalasa (CAT) y la superxido dismutasa
SOD. Como se muestra en la Fig. 2b, actividades c, CAT y SOD tambin
aument significativamente con el aumento de la concentracin piocianina. El
glutatin (GSH) es el antioxidante ms fisiolgicamente relevante, y la
reduccin de la relacin GSH / oxidado GSH (GSSG) es un indicador de estado
de estrs oxidativo y el dao del ADN (Asensi et al. 1999). La exposicin de
clulas HepG2 a piocianina result en la formacin de GSH y GSSG de una
manera dependiente de la concentracin (Fig. 2d, e). La relacin GSH / GSSH
disminuy a medida que la concentracin piocianina aumento (Fig. 2f). Las
clulas pretratadas con NAC mostraron casi la misma tendencia que los
tratados con piocianina.

dao celular causado por ROS no slo depende de la concentracin intracelular


de ROS pero tambin depende del equilibrio entre ROS y especies
antioxidantes endgenos. Nuestros resultados demuestran que la muerte
celular inducida por piocianina fue acompaado por un aumento de los niveles
de ROS y el agotamiento de GSH. Por otra parte, el aumento de las actividades
de las enzimas antioxidantes, tales como SOD y CAT, tambin se observaron.
Sin embargo, las clulas tratadas aparentemente perdi la capacidad de
mantener ROS / equilibrio antioxidante, y ROS se mantuvo alta en comparacin
con la de las clulas de control. La disminucin en la relacin GSH / GSSG en
concentraciones ms altas de piocianina tambin demostr que la exposicin a
pyocyanininduced estrs oxidativo.

El estrs oxidativo en las clulas puede alterar y daar un gran nmero de


molculas intracelulares, incluyendo ADN, ARN, lpidos y protenas (Veskoukis
et al. 2012), trayendo como consecuencia la senescencia celular acelerado y la
muerte o apoptosis. El fenotipo senescente se demostr mediante la expresin
de la actividad de SA-b-gal, que se considera un marcador de senescencia. La
exposicin de clulas HepG2 a piocianina dio lugar a la expresin de la
actividad SA-b-gal. Control de las clulas expresan la actividad baja de SA-bgal, mientras que las clulas tratadas con piocianina (2-40 ml lg1) exhibi una
mayor actividad SA-b-gal de una manera dependiente de la concentracin
(datos no mostrados). Por lo tanto, nuestros resultados indicaron que la
expresin de la actividad SA-b-gal se ha mejorado por el aumento de las
concentraciones de piocianina.

En los ltimos aos, la participacin de ROS en la apoptosis de clulas


cancerosas inducida por el frmaco ha sido objeto de un nmero creciente de
estudios (Lemari e et al 2004;?. Tang et al., 2005). La apoptosis es una forma
importante de la muerte celular y se ha demostrado que es un proceso
altamente regulado. Este evento celular importante tambin juega un papel
clave en la patognesis y el tratamiento teraputico de muchas enfermedades.
cambios morfolgicos apoptticos tpicos, incluyendo el encogimiento celular,
la condensacin de la cromatina y la formacin de cuerpos apoptticos, se
pueden observar con AO / EB doble tincin por microscopa de fluorescencia
(Liu et al. 2013), que discrimina las clulas vivas de las clulas muertas en la
base de la integridad de la membrana . Nuestros resultados obtenidos de la
tincin AO / EB se presentan en la Fig. 3. Se observaron clulas vivas
uniformemente verdes con morfologa normal en el control, mientras que las
clulas verdes temprana de apoptosis con marginacin nuclear y condensacin
de la cromatina ocurrieron en el grupo experimental despus del tratamiento
con piocianina (IC50, 16 ml lg
? 1) durante 24 h.

Se observaron cantidades mayores de clulas apoptticas tarde de color


naranja con la cromatina fragmentada y cuerpos apoptticos despus del
tratamiento de 48 h. Cuando las clulas fueron pretratadas con NAC, dao
piocianina inducida de las clulas HepG2 se redujo significativamente. Estos
resultados sugieren que piocianina fue capaz de inducir apoptosis en las
clulas HepG2.
Adems, la apoptosis inducida por piocianina tambin fue confirmado por
caspasas-3 y el ensayo del cometa. La apoptosis es tpicamente acompaado
por la activacin de una clase de protenas llamadas caspasas (Nicholson y
Thornberry 1997; Lakhani et al., 2006). Caspasa-3 es la ms comnmente
caspasa activado y puede mediar en la proteolisis limitada de otras caspasas,
adems de la inactivacin de factor de fragmentacin de ADN por los

acontecimientos de escisin especficos (Enari et al. 1998). La caspasa-3 se ha


demostrado que desempean un papel fundamental en la fase de ejecucin de
la apoptosis inducida por diversos estmulos (Lockshin 2005). Como se muestra
en la Fig. 4, piocianina tratamiento indujo un aumento de la actividad de la
caspasa-3 en una forma dependiente de la concentracin. La activacin de
caspasa-3 exhibi una significativa, aumento de cinco veces despus del
tratamiento con 40 ml lg piocianina, en comparacin con el control, lo que
confirma la activacin de la va apopttica. En las clulas tratadas previamente
con NAC, la activacin de caspasa-3 aument a medida que la concentracin
de piocianina aumentado, aunque no en la misma escala. Nuestros datos
demostraron que piocianina tratamiento indujo un aumento significativo en la
actividad de caspasa-3 de una manera dependiente de la concentracin.

ensayo del cometa, proporcionan informacin sobre el dao del ADN mediante
la medicin de roturas de la cadena de ADN y se consideran un mtodo
relativamente sensible y altamente eficaz para la deteccin de roturas de la
cadena de ADN en las clulas individuales. dao del ADN inducido por
piocianina en las clulas HepG2 se evalu mediante el anlisis de los siguientes
parmetros:% de ADN de la cola, momento de la cola y momento de la cola de
oliva. Los aumentos en la cola de ADN% a partir del 1? 78? 0? 54 a 57? 46? 4?
61 (P <0? 001), momento de la cola del 0? 32? 0? 12 a 93? 83? 12? 25 (P <0?
001) y el momento de la cola de oliva de 0? 70? 0? 20 a 59? 52? se observaron
8? 08 (P <0? 001), despus del tratamiento de clulas HepG2 con las
diferentes concentraciones de piocianina (Fig. 5). Estos aumentos sugieren la
presencia de dao en el ADN inducido por piocianina. Por lo tanto, los
resultados del presente estudio demostraron que piocianina fue muy eficaz en
las clulas HepG2, segn lo sugerido por la disminucin de los parmetros
anteriormente mencionados en las clulas pyocyanintreated. Por otra parte, en
conjunto, los resultados de AO / EB
doble tincin, la medicin de la caspasa-3 y ensayo del cometa, indican que la
muerte celular inducida por piocianina era apopttica en vez de necrtico.
Los resultados de este estudio demostraron que el estrs oxidativo fue
causalmente implicado en la citotoxicidad piocianina inducida en clulas
HepG2. Piocianina inducida por la senescencia celular y la apoptosis puede
desempear un papel importante en la supresin de la proliferacin de las
clulas HepG2.

Pseudomonas aeruginosa M14808 se cultiv en 1000 ml de caldo de LB


durante 48 horas a 28 C. A continuacin, el caldo de fermentacin se
centrifug para eliminar la masa de clulas, y el sobrenadante se extrajo con
un volumen igual de cloroformo. La purificacin adicional se realiz de acuerdo
con

el mtodo de Rane et al. (2008). El anlisis por HPLC-MS mostr que el


componente piocianina no contena otros metabolitos. Piocianina se concentr
por evaporacin rotatoria y se almacen a? 20 C.

clulas HepG2 (suministrados por la Universidad de Medicina Wenzhou) se


cultivaron en RPMI-1640 (Hyclone, Logan, UT) suplementado con inactivado por
calor 10% de suero de ternera bovino neonatal (Sijiqing, Hangzhou, China) y
1% penicillinstreptomycin solucin (Hyclone). Las clulas se incubaron
a 37 C en una atmsfera humidificada con 5% de CO2 y se dividieron
regularmente en la relacin de 1: 4 cuando alcanzaron la confluencia.

Muchos estudios han llegado a la conclusin de que piocianina tiene un efecto


derogatorio en la fibrosis qustica, que permite a P. aeruginosa persistir en los
pulmones de las personas que padecen esta enfermedad. Adems, la apoptosis de
neutrfilos, la liberacin de inmunoglobulina a partir de linfocitos B y liberacin de
interleucina IL-8 se deteriora por accin de la piocianina haciendo que el sistema
inmune del pulmn que se debilite.