UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

INSTITUTO DE FARMACOLOGA Y MORFOFISIOLOGA

EFECTO DE LA SOBRECARGA AGUDA DE OLIGOFRUCTOSA SOBRE LAS

CONCENTRACIONES PLASMTICAS Y RUMINALES DE CIDO L Y D-LCTICO
EN VAQUILLAS

Memoria de Ttulo presentada como parte

de los requisitos para optar al TTULO DE
MDICO VETERINARIO

JAVIER ALEJANDRO MENZEL ROSAS

VALDIVIA CHILE
2013

PROFESOR PATROCINANTE

PROFESORES INFORMANTES

Rafael Burgos A.

Rubn Pulido F.

Ananda Mller P.

FECHA DE APROBACIN: 13 de junio de 2013

NDICE

Captulos

Pgina

1. RESUMEN. 1
2. SUMMARY. 2
3. INTRODUCCIN. 3
4. MATERIAL Y MTODOS 9
5. RESULTADOS... 14
6. DISCUSIN... 17
7. REFERENCIAS.. 21
8. ANEXOS 24

1. RESUMEN

En los sistemas agrcolas modernos se ha buscado aumentar los niveles productivos tanto en
bovinos destinados para carne como aquellos destinados para leche. Por esto se han modificado
las dietas para entregar componentes de mayor valor energtico y fcil fermentacin. Esto ha
trado como consecuencia alteraciones en los procesos fermentativos a nivel ruminal, lo que se
expresa en la enfermedad metablica conocida como acidosis ruminal. Se ha determinado que el
cido lctico aumenta en cuadros de acidosis ruminal tanto en sangre como en rumen.
Es por esto que toma importancia conocer el comportamiento de los diferentes componentes que
intervienen en los procesos fermentativos. En este estudio se utiliz un modelo de induccin de
acidosis por sobrecarga aguda de oligofructosa para determinar las alteraciones clnicas producidas
y medir las variaciones tanto a nivel plasmtico como ruminal de los ismeros del cido lctico.
Para esto se utilizaron 4 vaquillas de la raza Frisn negro a las cuales se les administr una
sobrecarga aguda de 13 g/kg de peso vivo de oligofructosa va sonda ororeticular. Se midi la
frecuencia cardaca, respiratoria, ruminal y la temperatura a la hora: 0, 1, 3, 6 y 9 posterior a la
sobrecarga aguda de oligofructosa. Se tomaron muestras de lquido ruminal por ruminocentesis a
la hora: 0, 3 y 9 a las cuales se les determino el pH. Se obtuvieron muestras de sangre por
venopuncin yugular a la hora: 0, 0,5, 1, 3, 6 y 9 posterior al tratamiento con oligofructosa. Para el
anlisis de las muestras de sangre y lquido ruminal se utiliz la cromatografa lquida de alta
eficacia (HPLC), utilizando una columna Astec CLC-D para separacin de compuestos quirales.
Las 4 vaquillas utilizadas en el estudio presentaron un desenso del pH ruminal desde 7,0 a 4,54 a
las 9 horas de iniciado el estudio, encontrandose todas con acidosis ruminal aguda. Tambin se
presentaron alteraciones clnicas reflejadas en un aumento de las frecuencias ruminal, cardaca,
respiratoria y temperatura. Se observ un incremento en las concentraciones de acido D-lactico
en plasma de 0,0231 mM a 0,1815 mM y en rumen de 0,0126 mM a 1,904 mM a las 9 horas
posteriores a la sobrecarga de oligofructosa, mientras que las concentraciones de cido L-lctico
se mantuvieron constantes en plasma y rumen, siendo esta sercanas a 0,445 mM y 1,785 mM,
respectivamente.
En conclusin, los resultados sugieren que la sobrecarga aguda de 13 g/kg de oligofructosa
produjo en bovinos un cuadro de acidosis ruminal aguda, con alteraciones de parmetros clnicos.
Esto est asociado a un incremento importante tanto a nivel plasmtico como ruminal del
ismero D-lctico.

Palabras clave: vaquillas, acidosis ruminal, cido D- lctico, cido L- lctico.

El presente estudio fue financiado por el proyecto FONDECYT regular 1120718.
1

2. SUMMARY

CONCENTRATIONS OF D-LACTIC ACID IN RUMEN FLUID AND PLASMA OF

HEIFERS WITH ACUTE RUMINAL ACIDOSIS INDUCED BY OLIGOFRUCTOSE
In modern agricultural systems, it is a constant to try to find an increase in beef and dairy cattle
productivity. To achieve this, the animals diet has been modified to give energetic and easily
fermentable food. This diet induces alterations in their fermentative processes in rumen,
manifested as a metabolic sickness known as ruminal acidosis. Lactic acid levels in cattles increase
in blood and ruminal liquid when cattle present ruminal acidosis.
For this reason is key to understand the role of the different factors involved in the fermentative
processes. In this research, acidosis model by induced acute oligofructose overload, and clinical
changes and lactic acid isomer in plasma and ruminal fluid were measured.
This research was made by using 4 Black Freisian heifers, which were given an acute oligofructose
overdose of 13 g/kg orally. The cardiac, respiratory and ruminal frequencies, as well as the
temperature were measured at hours: 0, 1, 3, 6 and 9 after the acute oligofructose overdose.
Samples of ruminal liquid were obtained by ruminocentesis and immediately determine pH at: 0, 3
and 9 hours post oligofructose load. Blood samples were obtained by jugular venipuncture at: 0,
0.5, 1, 3, 6 and 9 hours after oligofructose treatment. To analyze the samples, high-performance
liquid chromatography or HPLC, with a column Astec CLC-D for separation of chiral
compounds method was used.
The four heifer used in the study have shown a peaking of their ruminal pH from 7 to 4,54 after 9
hours since the study had started and all of them where with acute ruminal acidosis. Also, an
increase in cardiac, respiratory and ruminal frequencies, as well as the temperatures were
observed. . It was also observed an increase in the concentration of D-lactic acid from 0.0231 mM
to 0.1815 mM in plasma and an increase of the concentration of D-lactic from 0,0126mM
to 1,904 mM in rumen, both after 9 hours since the oligofrutose overload. The concentration of
L-lactic acid remained constant in both plasma and rumen, being them close to 0.445 mM and
1.785 mM respectively.
In conclusion, the results suggest that 13g/kg body weight of oligofructose induces acute ruminal
acidosis in bovine with clinical signs. This was associated to a significant increase in the D-lactic
isomer concentrations in ruminal liquor and plasma.

Key words: heifers, ruminal acidosis, D-lactic acid, L-lactic acid.

2

3. INTRODUCCIN

3.1 CIDO LCTICO

El cido lctico o el cido 2-hidroxi-propanoico fue reportado por primera vez en el ao 1780 por
el sueco qumico Scheele, quien lo aisl de la leche agria. Este cido existe de forma natural como
dos enantimeros (ismeros ptico o estereoismero) debido a la asimetra del tomo C2 (
radical hidroxi). Siendo por esto el cido hidroxicarboxlico ms sencillo que se encuentra en
forma de dos enantimeros (Ewaschuk y col 2002).
Cuando una molcula tiene un tomo hbridado (SP3) con cuatro fracciones qumicas unidas
diferentes, se denomina una molcula quiral. Esta consta de dos formas moleculares no
superponibles o imgenes especulares, similar a lo que ocurre al colocar las manos una sobre otra,
y nombradas como ismeros pticos. Los ismeros tienen la capacidad de rotar la luz en
diferentes direcciones, la rotacin a favor de las agujas del reloj se conoce como dextrgiro (D, -,
R) y de forma anti horaria como levgiro (L, +, S). Es por esto que los enantimeros de cido
lctico se conoce como L (+, S) y D (-, R) respectivamente. Ambos enantimeros presentan
propiedades fsicas y qumicas similares siendo incoloros, inodoros, extremadamente
higroscpicos y solubles en agua con un pKa de 3,86, siendo a pH fisiolgico (7,4) casi
completamente disociados en ismeros de lactato y protones (Ewaschuk y col 2005).
El cido L-lctico es la forma ms comn siendo este producido endgenamente por los tejidos
del cuerpo en condiciones de hipoxia o por fermentacin bacteriana en el cuerpo, tracto
gastrointestinal, vagina u otros tejidos infectados. La forma D proviene principalmente de fuentes
exgenas, ya sea ingerido o producido por ciertas bacterias en el tracto gastrointestinal, vagina o
de otros sitios de infeccin (Connolly y col 2005).
3.1.1 Metabolismo del cido Lctico
El cido lctico presente en los rumiantes puede tener un origen endgeno o exgeno. La forma
endgena consiste en la conversin del piruvato a lactato. Si hay suficiente suministro de oxgeno,
el cido pirvico es descarboxilado en la matriz de la mitocondria por el complejo enzimtico
piruvato deshidrogenasa dando como resultado CO2 y acetil coenzima A que es el inicio de una
serie de reacciones llamada ciclo de Krebs, seguida de la fosforilacin oxidativa. Si no hay
suficiente cantidad de oxgeno disponible, particularmente bajo condiciones de hipoxia
secundarias a la mala perfusin tisular o si el organismo es incapaz de continuar con el proceso
oxidativo, el piruvato sigue una ruta anaerbica, la fermentacin. En esta va, el piruvato se
reduce, permitiendo regenerar las molculas de NAD+ consumidas en los procesos anteriores.
Esta reaccin es catalizada por la enzima L-lactato deshidrogenasa teniendo como cofactor a
NADH dando como resultado cido lctico. Esto ocurre en una variedad de tejidos, incluyendo
3

los msculos y eritrocitos generando NAD y permitir que contine la gluclisis. Este tipo de
produccin endgena es exclusivamente para L-lactato (Abeysekara 2009).
En clulas de mamferos el cido D-lactato tambin puede ser formado a travs del sistema
glyoxalase. Esta es una reaccin presente en todo el organismo, sin embargo produce cantidades
fisiolgicas insignificantes de cido D-lctico. Por otra parte la produccin endgena de D-lactato
a partir del piruvato en mamferos an no es bien entendida (Flick y Konieczny 2002).
La produccin exgena de cido lctico resulta de la fermentacin lctica, el cual es un proceso
celular anaerbico donde se utiliza glucosa para obtener energa y donde el producto de desecho
es el cido lctico. Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lcticas), hongos
y algunos protozoos. Tanto el cido D- y L-lctico se encuentran en muchos productos de
fermentacin como encurtidos, cervezas, vinos y yogur (Abeysekara 2009). En los mamferos la
fermentacin bacteriana ocurre en el tracto gastrointestinal, siendo para animales no rumiantes
principalmente en el colon y en rumiantes en el rumen. Existe una gran variedad de especies de
lactobacilos como L. acidophilus, L. buchneriy L. Fermenti y Escherichia coli capaces de producir cido
D-lctico (Ewaschuk y col 2005).
En rumiantes tambin se describen 2 vas metablicas capaces de producir cido lctico. La
primera a travs de la va metablica alternativa lactato-acrilato con dietas ricas en azcares y/o
almidn, y la segunda a partir de propionato transformado en la pared ruminal (aproximadamente
30% del total) (Anrique 2010).
3.1.2 Absorcin Ruminal del cido Lctico
Existe controversia en cuanto a la capacidad del rumen para absorber lactato. Tanto estudios in
vitro como in vivo indican que el rumen es capaz de absorber altas concentraciones de D- y Llactato. Esto debido a que tanto el epitelio basal como apical del rumen expresan MCT-1 (monotransporters-1) la cual es una va protn dependiente que elimina el lactato y protones del rumen
al citosol y sangre. Se describe tambin que el cido lctico atravesara la pared del rumen por
medio de difusin simple, es decir, siempre que el gradiente de concentracin sea favorable para
ello, aquellos que no son absorbidos a este nivel pasan al omaso y abomaso en donde tambin hay
absorcin (Mller y col 2002).
3.1.3 Eliminacin del cido Lctico
La absorcin de grandes cantidades de D-lactato puede producir una crisis en un individuo sano,
ya que los mamferos no estn biolgicamente equipados con un mecanismo eficiente para su
eliminacin. El metabolismo de D-lactato requiere de la enzima D-2 ()-hidroxi cido
deshidrogenasa (D- LDH), que convierte el D-lactato a piruvato, siendo este proceso ms lento
que el de conversin de L- lctico en piruvato por L-lactato-deshidrogenasa (L- LDH). Esto
debido a que la enzima encargada del metabolismo del ismero L se encuentra en el citosol de los
tejidos animales, en cambio el D-lactato, que no es producido por los tejidos mamferos, tiene que
atravesar primero la membrana mitocondrial antes de poder ser oxidado por la enzima D- LDH.
Esta enzima adems, es inhibida por el aumento de las concentraciones de piruvato y oxalacetato,

por lo tanto el D-lactato se degrada ms lentamente y, consecuentemente, se considera ms txico

(Owens y col 1998). Por otra parte D- LDH no se encuentra en cantidades tan altas como LLDH en clulas de mamfero, contribuyendo an ms a su acumulacin. Otro factor que puede
poseer un rol en la acumulacin del cido D-lctico se debera a que D- LDH es una
flavoprotena no especfica y es activo durante un intervalo de pH limitado (Cammack 1969).
La principal va de eliminacin de D-lactato desde el cuerpo de los mamferos es la excrecin
urinaria siendo esta aparentemente similar para L-lactato. El transporte para el cido D-lctico
ocurre en los tbulos renales por difusin y excrecin por la va del transportador MCT-1
(Ewaschuk y col 2005).
3.2 ACIDOSIS RUMINAL
La acidosis ruminal se define como una disminucin en el lcali (base) en relacin al contenido de
cido (iones hidrgeno), en un primer lugar en el rumen y, en estado ms avanzado, en los
distintos fludos corporales. Esta alteracin tiene su origen en la alimentacin y puede afectar
tanto animales en engorda como vacas de lechera (Owens y col 1998). Este proceso deriva de una
acumulacin excesiva de cidos grasos voltiles (AGV) en el rumen y su posterior absorcin hacia
el torrente sanguneo. Como consecuencia de este trastorno alimentario puede observarse la
disminucin en la grasa de la leche, lesiones en la mucosa del rumen, trastornos metablicos, as
como daos en hgado, pezua y otros rganos. Tomando real importancia para la salud y
bienestar del animal, como para los intereses econmicos y productivos de los ganaderos.
(Abeysekara 2009).
La acumulacin de AGV puede deberse a diversos factores los cuales se pueden agrupar en 3
categoras: una ingesta excesiva de carbohidratos no fibrosos, un aporte insuficiente de sustancias
tamponantes en el rumen y una inadecuada adaptacin a dietas altamente fermentables. La ingesta
excesiva de carbohidratos no fibrosos es una de las causas ms evidentes de la acidosis ruminal y
deriva del inters que tienen los actuales sistemas productivos de alcanzar mayores niveles
productivos. Para conseguirlo, es necesario aumentar los niveles de energa en forma de
carbohidratos que a menudo van acompaados por deficiencia en el contenido de fibra efectiva
en la dieta (Oetzel 2003).
El aumento de carbohidratos de rpida fermentacin en la dieta de los rumiantes favorece el
crecimiento bacteriano en el rumen, lo que produce un incremento en la produccin de AGV por
parte de estas bacterias llevando a un descenso en el pH ruminal. Este ambiente favorece el
crecimiento de la bacteria productora de lactato Streptococcus bovis, gracias a su capacidad de digerir
almidn y su tolerancia a condiciones cidas, asimismo los protozoos ciliados pueden producir
ms lactato y menos butirato o acetato cuando hay cantidades altas de carbohidratos de rpida
fermentacin. La acumulacin de lactato provoca un descenso importante del pH ruminal (< 5,0)
debido al bajo pKa de este (3,9) comparado con el pKa de los AGV (4,74,9). Adems, S. bovis es
relativamente cido- resistente y puede proliferar y continuar produciendo lactato a pH bajos,
contribuyendo a la cada del pH (Marounek y Bartos 1987), pudiendo llegar a la situacin de
acidosis ruminal. Al disminuir el pH, se produce un cambio paulatino de las bacterias gram
negativas predominantes en un rumen a pH fisiolgico a las bacterias gram positivas S. bovis y

Lactobacilli. Finalmente, cuando se produce una mayor reduccin del pH se inhibe tambin el
crecimiento de S. bovis pasando a ser un monocultivo de lactobacilos (Nocek 1997).
Streptococcus bovis es una bacteria que normalmente se encuentra en bajo nmero en el rumen, pero
su nmero puede aumentar rpidamente si se cambia bruscamente la dieta del animal de forraje a
concentrado. Esta bacteria tiene una actividad amilasa muy elevada, crece rpidamente y puede
desplazar al resto de bacterias cuando la dieta es rica en almidn. Adems, S. bovis produce
acetato, formato y etanol cuando las concentraciones de carbohidratos en la dieta son bajas, pero
cuando la disponibilidad de hidratos de carbono altamente fermentables es elevada, tiene una
fermentacin homolctica, debido a la inhibicin de la piruvato formato liasa a pH cidos
(Mantovani y Russell 2001).
Por otra parte, las especies utilizadoras de lactato, como pueden ser Megasphaera elsdenii o
Selenomonas ruminantium spp. lactilytica, pueden reducir el riesgo de acidosis convirtiendo parte del
lactato a acetato y propionato. M. elsdenii es una bacteria gram negativa que se encuentra
principalmente en el rumen de animales jvenes y en animales que reciben raciones altas en
concentrado, en los que la produccin de lactato asume particular importancia. Esta bacteria
contribuye en un 74% a la fermentacin del lactato, aunque est influenciada por el tipo de dieta
administrada y por el animal. Adems, su actividad no est sujeta a la represin por parte de la
glucosa o maltosa, y su contribucin al catabolismo del lactato incrementa como respuesta a la
administracin de carbohidratos solubles, los cuales reprimen la funcin de S. ruminantium y otras
bacterias utilizadoras de lactato (Counotte y col 1981). Sin embargo, el crecimiento de M. elsdenii
es ms lento que el de S. bovis. Por lo tanto, en las primeras fases de un cambio de dieta de forraje
a concentrado existe un riesgo de acidosis por un desequilibrio de nmero entre ambas. Adems,
M. elsdenii y S. ruminantium no crecen bien a pH inferiores a 5,6, por lo que en situaciones ms
extremas de acidosis desaparecen, y permiten la acumulacin de lactato y la reduccin del pH
(Blanch 2009).
Los Lactobacilli ruminales son ms resistentes a un pH bajo en comparacin con el S. bovis, lo cual
explica porque se vuelven dominantes en un rumen cido (pH <5,6). El aumento significativo en
la poblacin de Lactobacilli ruminal es una caracterstica comn de la acidosis aguda y subaguda
(Nagarajay Miller 1989). El rumen tiene Lactobacilli homofermentadores (ismeros L y D) y
heterofermentadores (lactato y acetato o etanol), y debido a las numerosas especies que existen,
los aislamientos del rumen no se identifican normalmente a nivel de especie, sino ms bien
frecuentemente se describen como Lactobacillus sp.. Dos especies predominantes de Lactobacilli
que se han identificado y caracterizado bien, particularmente en animales adaptados a granos,
incluyen el Lactobacillus ruminis y el Lactobacillus vitulinus. La primera especie produce principalmente
cido lctico L y la ltima produce solamente el ismero D (AlJassim y Rowe 1999).
Normalmente el pH en el ambiente ruminal vara durante el da, debido al comportamiento
ingestivo de los rumiantes, a las variaciones diarias en la composicin de la pradera y al manejo
diettico a que los animales son sometidos. Dichas variaciones suceden, normalmente, dentro de
un rango considerado fisiolgico (pH 5,6 7,0) acorde al tipo de dieta que el animal recibe y del
tiempo posterior a la ingesta de la racin. A su vez, en determinadas situaciones el pH del lquido
ruminal sobrepasa el rango fisiolgico y genera acidosis (Noro 2010). La acidosis ruminal

representa varios grados de acidez en el rumen, por lo tanto, la acumulacin total de cido
orgnico (AGV y cido lctico) determinar el grado de acidosis ruminal. El pH ruminal de 5,6 o
ms bajo se considera generalmente lo tpico en la acidosis ruminal, un rango de pH de 5,0 a 5,5
se considera como acidosis subaguda, y un pH por debajo del 5,0, acercndose al 4,5 o por
debajo, es considerado acidosis aguda (Owens y col 1998). La acidosis subaguda, es producto de
la acumulacin de AGV, resultado de una combinacin de la sobreproduccin (mayor cantidad de
sustrato) y posiblemente una disminucin en su absorcin. La concentracin total de AGV
generalmente aumenta al inicio de la acidosis, pero con la progresin de la acidosis, las
concentraciones de AGV declinan de forma dramtica debido a la destruccin de la flora
bacteriana normal y a la dilucin ruminal, como resultado de una afluencia de fludos para
compensar el aumento de osmolaridad (Therior y col 1982). La acidosis aguda, se origina por la
acumulacin de cido lctico, la que es el resultado de un aumento en su produccin y una
disminucin de su fermentacin.
3.2.2 Acidosis Lctica
Si la acumulacin de lactato es muy elevada, los animales pueden morir por deshidratacin y
acidosis metablica, a consecuencia del desplazamiento del agua del torrente sanguneo al rumen
para compensar el equilibrio inico. El diagnstico de la acidosis clnica tiene lugar cuando se
determina un pH sanguneo inferior a 7,35, aunque muchas veces se utilizan como rutina otros
sntomas clnicos indicadores de acidosis en un animal (Owens y col 1998). La severidad de los
signos clnicos depende de la cantidad de alimento ingerido. Generalmente los animales poco
tiempo despus de la ingestin del alimento se muestran anorxicos, deprimidos, atxicos y en el
transcurso de horas pueden estar altamente deshidratados y debilitados al punto de permanecer en
decbito. En casos graves el animal no se reincorpora y presenta polipnea como consecuencia de
la acidosis metablica resultante, el ritmo cardaco se incremente y el grado de deshidratacin
empeora con la aparicin de diarrea. Un pulso mayor a 100 ciclos por minuto y un pH ruminal
menor a 4,5 indican un mal pronstico. Los animales que se recuperan pueden tener una
convalecencia prolongada debido a ruminitis crnica y pueden tener secuelas como la formacin
de abscesos hepticos por el desplazamiento de bacterias ruminales como Fusobacterium necrophorum
y Arcanobacterium pyogenes por la vena porta como resultado de la disminucin de la funcin de
barrera de la mucosa ruminal (Kleen y col 2003).
3.3 Modelo de induccin de acidosis
Se han desarrollado diferentes mtodos de induccin de acidosis en bovino. Este mtodo fue
descrito por Thoefner y col (2004) quienes mediante la administracin oral de una sobrecarga
aguda de oligofructosa buscaron inducir laminitis en vaquillas a travs de un cuadro de acidosis
ruminal. La oligofructosa es un hidrato de carbono que pertenece al grupo de los fructanos. Se
compone de unidades de fructosa unidas unas con otras por el enlace (2 a 1). Los fructanos son
polisacridos de almacenamiento importantes que se encuentran en frutas, vegetales comunes y
gramneas. En este modelo experimental, todas las vaquillas aumentaron el consumo de agua en
grandes cantidades, presentando diarrea depresin y anorexia. Tambin se aprecio un descenso
del pH ruminal, un incremento en el porcentaje de glbulos rojos en sangre y el desarrollo de
acidosis metablica. Adems todas las vaquillas presentaron un incremento en su frecuencia
cardaca, un descenso o detencin completa de la frecuencia ruminal y episodios de fiebre. Este
7

modelo logr inducir acidosis ruminal en todos los individuos, sin embargo no se determinaron
los diferentes componentes que intervienen a nivel plasmtico como ruminal. Uno de estos
componentes es el cido lctico. Se ha determinado que el cido lctico aumenta en cuadros de
acidosis ruminal tanto en sangre como en rumen, desconocindose las concentraciones que
pueden estar presentando en ste modelo.
3.4. HIPTESIS
La administracin de 13 g/kg de peso vivo de oligofructosa va oral produce un aumento en los
niveles plasmticos y ruminales de cido L y D- lctico.
3.5. OBJETIVOS
3.5.1 Objetivos Generales
Determinar los niveles plasmticos y ruminales de cido L y D-lctico posterior a una sobrecarga
aguda de oligofructosa.
3.5.2 Objetivos especficos

Adaptar la metodologa analtica para detectar los ismeros de cido lctico en rumen y
plasma.

Determinar los niveles plasmticos y ruminales de cido L y D-lctico posterior a una

sobrecarga aguda con oligofructosa.

Determinar las alteraciones clnicas producidas posterior a una sobrecarga aguda de

oligofructosa.

4. MATERIAL Y MTODOS

4.1. MATERIAL
4.1.1 Material Biolgico
Se utilizaron cuatro vaquillas no preadas de la raza Frisn negro, las cuales se encontraban
clnicamente sanas, con un peso promedio de 300 kilos. Estas fueron mantenidas estabuladas en
dependencias del Pabelln de Rumiante del Hospital Veterinario de la Universidad Austral de
Chile en cubculos techados, con superficie de cemento y cubiertos con viruta de madera. Los
animales reciban como alimentacin 7 kilos de alfalfa al da, dndose la mitad de la racin a las
8:00 am y la otra mitad a las 5:00 pm, teniendo acceso al agua ad libitum. La utilizacin de estos
animales fue aprobada por el comit de Uso de animales en la investigacin de la Universidad
Austral de Chile.
4.1.2 Materiales y equipos
Equipo cromatogrfico HPLC LaChrom Elite de VWR-Hitachi; columna HPLC Astec CLC-D
Chiral, tamao de partculas 5 m, dimensiones 15 cm x 4,6 mm; centrfuga Heraeus Megafuge
11R Thermo Scientific; centrfuga Hettich EBA12; balanza analtica Shimadzu AUW2200;
agitador WiseMix VM-10; Vacutainer para plasma; tubos de 15 ml y 50 ml tipo Falcn ;
jeringas de 5 ml y 50 ml, tubos para microcentrfuga de 2 ml; puntas para micropipeta; filtros
Rephile 0,22 m; pH metro porttil (pHep - Hanna Instruments); freezer ThermoForma 86C ULT; aguja de 14 cm y 14 g, matrz de 10 ml, vaso precipitado de 250 ml y 5 lts.
4.1.3 Reactivos
cido metafosfrico1; hidrxido de calcio1; sulfato cprico1; acido D- lctico2; acido L- lctico2.
4.2. METODOLOGA
4.2.1.1. Administracin de oligofructosa
Las 4 vaquillas recibieron un 5 % de la dosis total de oligofructosa, 24 horas antes de la
sobrecarga para lograr una mejor adaptacin de la flora ruminal. Para la sobrecarga aguda los
animales recibieron 13 g/kg de peso vivo (PV) de oligofructosa disuelta en agua potable, la cual
fue administrada mediante sonda oro-reticular. Esto se realiz a las 9:00 am considerndose esta
la hora 0 del estudio.
_________________________
1 Laboratorio
2 Laboratorio

Merck, Alemania.
Sigma Chemical, EEUU.

4.2.1.2 Diseo experimental

En este estudio se determinaron las alteraciones clnicas de las 4 vaquillas y se midieron sus
temperaturas, frecuencias cardacas, respiratorias y ruminales. Se tomaron muestras de sangre y
lquido ruminal para analizar la concentracin de cido D-lctico y L-lctico. Para la toma de
muestras y mediciones se trabaj segn lo sealado en la Figura 1. El estudio inicio a las 9:00 am,
realizndose el ltimo muestreo a las 6:00 pm del mismo da. Las frecuencias y temperatura se
determinaron al inicio del estudio (hora 0) y a la hora 1, 3, 6 y 9 posterior a la administracin de
oligofructosa. Para las muestras de plasma se colectaron 6 muestras seriadas a las 0, 0,5, 1, 3, 6 y 9
horas posteriores a la sobrecarga de oligofructosa. Para el licor ruminal se tomaron 3 muestreos
seriados a las 0, 3 y 9 horas. Se concidero la hora 0 como control para las dems muestras (Figura
1).
Muestra de plasma
y lquido ruminal.
Alteraciones
clnicas, frecuencias
y constante.

Muestra de
plasma.
Alteraciones
clnicas, frecuencias
y constante.

Muestra de plasma
y lquido ruminal.
Alteraciones
clnicas, frecuencias
y constante.

Muestra de
plasma.
Alteraciones
clnicas, frecuencias
y constante.

Muestra de plasma
y lquido ruminal.
Alteraciones
clnicas, frecuencias
y constante.

9
Horas

0,5
Muestra
de plasma

Figura 1. Diseo experimental utilizado para el estudio del efecto de la sobrecarga de

oligofructosa sobre parmetros clnicos y concentracin plasmtica y ruminal de cido D y L
lctico.
4.2.1.3. Determinacin de frecuencias y constantes
La frecuencia cardaca se midi con un fonendoscopio auscultando entre el tercer y quinto
espacio intercostal del lado izquierdo, considerndose un rango fisiolgico entre 40 a 70 latidos
por minuto (lpm). La frecuencia respiratoria se determin auscultando la trquea con un
fonendoscopio y se consider como normal un rango de 18 a 28 ciclos por minuto (cpm) para la
especie. La frecuencia ruminal se midi palpando la fosa del ijar izquierda siendo esta de 2 a 3
movimientos por 2 minutos. La temperatura se midi va rectal y se consider un rango
fisiolgico de 38 a 39 C.
4.2.1.4. Obtencin de muestras
El mtodo de obtencin de sangre fue a travs de venopuncin yugular con tubos Vacutainer ,
utilizndose tubos con heparina de litio pulverizada para la obtencin de plasma. Las muestras de
licor ruminal se colectaron mediante puncin de la ventana paraesternal izquierda con una aguja

10

de 14 cm y 14 g y una jeringa de 50 ml. Una vez obtenida la muestra de licor ruminal se determin
inmediatamente su pH (pH metro porttil), permitiendo evaluar el nivel de acidosis ruminal para
cada animal.
Terminado el muestreo y en bsqueda del bienestar animal, se administraron 300 g de
bicarbonato por va oral a cada vaquilla, segn el mtodo descrito por Thoefner y col (2004), con
el objetivo de evitar la produccin de un cuadro agudo de acidosis.
4.2.1.5. Preparacin de soluciones.
Para el procesamiento de las muestras se prepararon las siguientes soluciones:

Solucin de hidrxido de calcio (3,56 M) para ello se pesaron 52,9 g de Ca (OH)2 en un

vaso precipitado de 250 ml a los cuales se les agreg 200 ml de agua ultra purificada.

Solucin de sulfato cprico (0,78 M) - Se pesaron 50 g de CuSO4 - 5H20 en un vaso

precipitado de 500 ml a los cuales se les agreg 400 ml de agua ultra purificada.

Solucin de cido metafosfrico al 25% - Se pesaron 25 g de HPO3 en un vaso

precipitado de 250 ml a los cuales se les agreg 100 ml de agua ultra purificada.

4.2.1.6. Procesamiento de las muestras.

Las muestras de sangre fueron centrifugadas a 1000 x g por 20 minutos a 20 C, traspasndose el
plasma a tubos Falcn de 15 ml el cual fue congelado a -80C. Las muestras de lquido ruminal
fueron transferidas a tubos Falcn de 50 ml a los cuales se les agrego la solucin de cido
metafosfrico (25%) en una relacin licor ruminal: cido metafosfrico de 3:1. Luego se
congelaron las muestras a -80C hasta que fueron requeridas
Posteriormente las muestras de plasma se descongelaron, y se agreg una solucin de cido
metafosfrico (25%) en una relacin plasma: cido metafosfrico de 3:1. Tanto el plasma y
lquido ruminal, fueron procesadas de la misma manera para la deteccin de cido D y L-lctico.
Se transfirieron 800 l de la muestra de plasma o lquido ruminal a un tubo para microcentrfuga
de 2 ml, el cual se centrifug a 12.000 x g por 20 minutos. Se traspasaron 600 l del sobrenadante
a un nuevo tubo al cual se le agregaron 600 l de la solucin de hidrxido de calcio y 300 l de la
solucin de sulfato cprico. Se agit utilizando un vortex (WiseMix ) y se centrifug por 10
minutos. El sobrenadante fue filtrado utilizando para ello filtros de 0,22 m (Rephile ) y luego
este fue transferido a viales de HPLC para ser analizado.
4.2.2. Procedimiento analtico
Para el anlisis tanto de plasma como lquido ruminal se utiliz la tcnica conocida como
cromatografa liquida de alta eficacia. El proceso cromatogrfico consisti en la separacin de los
componentes de la muestra utilizndose para esto una columna de HPLC. Para ello la muestra fue
11

disuelta en una fase mvil e impulsada a travs de la columna donde se encuentra la fase
estacionaria con la cual interacciona. Esta interaccin produce que los distintos componentes de
la muestra atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se vayan separando, lo que se
conoce como tiempo de retencin. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase
estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que depender de la
concentracin y del tipo de compuesto. Esta seal es registrada por un software computacional
que genera un cromatograma, que corresponde a una representacin grfica de los elementos
analizados en la muestra (Figura 2). De esta forma los peak graficados nos permitirn determinar
el tiempo de retencin a la que eluyen a travs de la columna de HPLC los diferentes
componentes, como as tambin el rea bajo la curva que relaciona la concentracin de los
analitos.

Figura 2. Cromatograma de estndar de cido L- lctico.

Para el anlisis cromatogrfico se utiliz el equipo LaChrom Elite de VWR-Hitachi, que cuenta
con un detector Hitachi L-2455 con detecto de arreglo de diodos (DAD) e inyector automtico, y
como fase estacionaria para la separacin de los ismeros de cido lctico, la columna Astec CLCD Chiral.
4.2.2.1. Condiciones cromatogrficas
La fase mvil utilizada fue de 5 mM de CuSO4 disuelto en agua ultra purificada con una tasa de
flujo de 1ml/minuto. La cromatografa fue de 15 minutos utilizndose para la inyeccin 30 l de
la muestra. El equipo se utiliz a una longitud de onda de 250 nm. Se determin el tiempo de
retencin para cido L-lctico en el minuto 4,7 y para cido D-lctico en el minuto 7,4.

12

4.2.2.2. Preparacin de curva de calibracin HPLC

La curva de calibracin es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin
de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin
conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible
(rea bajo la curva) y la variable a determinar (la concentracin del cido). Para ello, se efectan
diluciones de muestras con concentraciones conocidas del analito y se registran su lectura y se
establece la funcin matemtica que relacione ambas. Despus se lee la muestra problema y
mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de
est. En este caso se prepararon 2 curvas de calibracin a partir de soluciones seriadas de cido Dlctico y L-lctico. Los puntos de la curva de calibracin a preparar fueron de 10mM, 1mM,
0,7mM, 0,5mM, 0,3mM, 0,1mM, 0,01mM y 0,001mM.
4.2.2.3. Determinacin de concentraciones
Para determinar la concentracin del cido D-lctico y L-lctico se utilizaron las reas bajo la
curva de cada peak. Estos valores fueron sustituidos en la ecuacin obtenida de la curva de
calibracin (GraphPad Prism 5.01), utilizndose un modelo de regresin lineal. De esta forma se
pudo determinar la concentracin de cido en la muestra.
4.2.2.4. Anlisis estadstico
Para el anlisis de los datos se utilizo el software estadstico GraphPad Prism 5.01. Posterior a la
comprobacin de la distribucin normal y homocedasticidad de los datos (Shapiro-Wilk y Bartlett,
respectivamente), estos fueron normalizados y sometidos a transformacin logartmica (Zar
2010). Se les aplic anlisis de varianza (ANOVA) y el test de comparaciones mltiples de
Dunnet, considerandoce un nivel de significancia de p<0,05. Todos los resultados fueron
expresados como media aritmtica error estndar (EE).

13

5. RESULTADOS

5.1 EFECTOS DE LA SOBRECARGA AGUDA DE OLIGOFRUCTOSA SOBRE LA

TEMPERATURA
Y
LAS
FRECUENCIAS
CARDIACA,
RUMINAL
Y
RESPIRATORIA.
Las 4 vaquillas utilizadas en este estudio fueron sometidas a examen clnico general a la hora 0,
encontrndose todas clnicamente sanas. Sin embargo, todos los individuos a las 9 horas posterior
a la administracin de oligofructosa presentaron decbito, depresin, anorexia y diarrea profusa.
La temperatura promedio entre las cuatro vaquillas al inicio de este estudio fue de 38,05C, la cual
aument durante las siguientes mediciones alcanzando a las 9 horas un promedio de 39,8C
(Cuadro 1). Este aumento de temperatura corporal fue significativo (P<0,001) desde las 6 horas
posterior a la aplicacin de la sobrecarga con oligofructosa, encontrndose fuera del rango
fisiolgico, incluso uno de los individuos alcanz una temperatura de 39,7C a las 3 horas de
iniciado el experimento.
En cuanto a la frecuencia cardaca se observ un promedio de 62 lpm al inicio del ensayo,
llegando a un total de 78 lpm a las 9 horas posterior a la sobrecarga con oligofructosa, aumento
que fue estadsticamente significativo (P<0,01). Se registr un valor mnimo de frecuencia
cardaca de 60 lpm, al inicio del estudio, y el valor mximo de 84 lpm se registr en un animal a
las 3 horas posterior a la sobrecarga con oligofructosa.
Para la frecuencia respiratoria al comienzo del estudio se obtuvo un valor promedio de 24,25 cpm
llegando a 31,25 cpm a las 9 horas posterior al tratamiento con oligofructosa. Se observ como
valor mnimo una frecuencia de 16 cpm en la primera hora de iniciado el estudio y como mximo
de 36 cpm a la hora 9 posterior a la induccin de acidosis con oligofructosa. Los individuos se
mantuvieron dentro de los rangos fisiolgicos en las primeras 3 horas de estudio, sobrepasando
esto en la hora 6 y 9. A pesar de lo anterior, no se encontraron diferencias estadsticas
significativas (Cuadro 1).
La frecuencia ruminal inicial fue en promedio de 2 contracciones en 2 minutos, aumentando de
manera significativa (P<0,01) a 3,75 contracciones por minuto a las 9 horas posterior a la
administracin de oligofructosa (Cuadro 1).

14

Cuadro 1. Promedio e intervalo inferior como superior de la frecuencia cardaca, respiratoria,

ruminal y temperatura corporal de 4 vaquillas sometidas a sobrecarga aguda con 13 g/kg PV de
oligofructosa.
Hrs
0
1
3
6
9
Media
Cardaca
622,82
66,54,43 7010,58
67,252,21
783,65**
EE
(lpm)
Intervalo
60-66
62-72
60-84
64-69
74-82
Respiratoria
Media
24,253,09 214,16
234,76
301,63
31,253,77
(cpm)
EE
Intervalo
20-27
16-26
18-28
28-32
27-36
Temperatura
Media
38,050,34 38,20,29 38,780,62 39,550,45*** 39,80,43***
(C)
EE
Intervalo 37,6-38,4
37,9-38,5 38,3-39,7
39,2-40,2
39,4-40,4
Ruminal
Media
2
1,5 0,57
2 0,81
2,75 0,50
3,75 0,50**
(contraccin
EE
en 2)
**
P<0,01, ***P<0,001
EE: error estndar
5.2 EFECTOS DE LA SOBRECARGA AGUDA DE OLIGOFRUCTOSA SOBRE EL
pH Y CONCENTRACIN DE CIDO D-LCTICO Y L-LCTICO EN LICOR
RUMINAL.
Al comienzo de este estudio todas las vaquillas se encontraron con un pH ruminal dentro de los
mrgenes descritos para la especie, siendo este en promedio 7,0. En el segundo muestreo
realizado a las 3 horas el pH descendi a un promedio de 6,0, observndose como mximo un pH
de 6,95 y como mnimo de 5,3. En el ltimo muestreo el pH ruminal alcanz un valor de 4,54. El
descenso del pH, tanto en la hora 3 como 9 posterior a la administracin de oligofructosa, fue
estadsticamente significativo con respecto a la hora 0 (Figura 3).
7.5

pH ruminal

7.0
6.5

***

6.0
5.5
5.0
4.5
4.0

3
Horas

Figura 3. Respuesta del pH ruminal a la sobrecarga aguda de oligofructosa en vaquillas. Cada

barra representa la media aritmtica error estndar (EE), n=4, * P<0,05, ***P<0,001 comparado
con el control (hora cero)

15

Acido L-Lactico (mmol/L)

a)

b)

4
3
2
1
0

3
Horas

Acido D-Lactico (mmol/L)

La concentracin del cido L-lctico se mantuvo sin cambios significativos hasta la hora 9
posterior al tratamiento con oligofructosa. Para el cido D-lctico se observ un aumento
significativo a la hora 3 y 9 posterior a la sobrecarga con oligofructosa.

***

2.5
2.0

***

1.5
1.0
0.5
0.0

3
Horas

Figura 4. Respuesta de la concentracin ruminal de cido (a) L-lctico y (b) D-lctico a la

sobrecarga aguda de oligofructosa en vaquillas Cada barra representa la media aritmtica error
estndar (EE), n=4, ***P<0,001 comparado con el control (hora cero)
5.3 EFECTOS DE LA SOBRECARGA AGUDA DE OLIGOFRUCTOSA SOBRE LA
CONCENTRACIN DE CIDO L-LCTICO Y D-LCTICO EN PLASMA.
Se observ que el cido L-lctico presento concentraciones similares entre la muestra control y la
hora 0,5 y 1, presentndose un aumento moderado de la concentracin en la hora 3 y 6,
terminando con un leve descenso a la hora 9. Sin embargo estas variaciones no fueron
estadsticamente significativas. Para la concentracin plasmtica de cido D-lctico, se observ un
aumento continuo durante los muestreos, siendo significativo a partir de las horas 3, 6 y 9.
b)

1.0

Acido D-Lactico (mmol/L)

Acido L-Lactico (mmol/L)

a)

0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

0,5

3
Horas

0.30

***

0.25
0.20
0.15

* **

0.10
0.05
0.00

0,5

1
3
Horas

Figura 5. Respuesta de la concentracin plasmtica de cido (a) L-lctico y (b) D-lctico a la

sobrecarga aguda de oligofructosa en vaquillas. Cada barra representa la media aritmtica error
estndar (EE), n=4, *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 comparado con el control (hora cero).

16

6. DISCUSON

En la presente memoria de ttulo se investig el efecto de la sobrecarga aguda de oligofructosa

sobre los niveles plasmticos y ruminales de cido D-lctico. Conjunto a esto se determinaron las
alteraciones en las frecuencias y constante fisiolgicas y las variaciones en la concentracin del
cido L-lctico en plasma y rumen.
6.1 ANLISIS DE LAS ALTERACIONES CLNICAS DE LAS FRECUENCIAS Y
CONSTANTES
Las 4 vaquillas fueron evaluadas al inicio del estudio, no encontrndose alteraciones clnicas y
presentando sus temperaturas, frecuencias respiratorias, cardiacas y ruminales dentro de los
rangos descritos para la especie. Posterior a la administracin de 13 g/kg de oligofructosa por va
oral, las frecuencias cardiaca, respiratoria, ruminal y temperatura corporal, incrementaron
progresivamente alcanzando valores sobre los rangos fisiolgicos. Estas alteraciones en las
frecuencias y temperatura de las vaquillas podran ser consecuencia del proceso patolgico de
acidosis ruminal aguda.
Todas las vaquillas manifestaron decbito, depresin, anorexia y diarrea profusa en la ltima
evaluacin a la hora 9. Esto es similar a lo observado por Thoefner y col (2004), quienes
administraron a 3 grupos de vaquillas una sobrecarga aguda de 13, 17 y 21 g/kg PV de
oligofructosa va oral, respectivamente. Estas alteraciones se presentaron a las 9 horas, siendo ms
notorias en el grupo de mayor dosis. Dansher y col (2009), quienes administraron 17 g/kg PV de
oligofructosa por va oral a 2 grupos de vaquillas compuesto por 3 vaquillas de un peso aprox. de
425 kilos y el otro de 5 vaquillas de un peso aprox. de 338 kilos, observaron para ambos grupos
alteraciones de parmetros clnicos a las 6 horas posterior a la sobrecarga de oligofructosa.
El descenso o variacin del pH ruminal produce la destruccin de bacterias gram negativas
liberando as concentraciones significativas de endotoxina, las cuales pueden atravesar las
paredes del rumen. Las endotoxinas son capaces de estimular la respuesta inmune produciendo el
aumento en la temperatura corporal (Nagaraja y Lechtenberg 2007). En las vaquillas se determin
un incremento desde 38C a las 0 horas hasta 39,8C a las 9 horas. Thoefner y col (2004)
observaron un aumento de la temperatura corporal, siendo a las 9 horas para la dosis de 13 gr/kg
y 21 g/kg PV de 38,7C aproximadamente y para el de 17 g/kg PV cercana a los 39,5C.
En el presente trabajo se observ una tendencia a incrementar la frecuencia respiratoria en el
grupo en estudio desde 24 a 31 cpm. Un aumento en la frecuencia respiratoria se podra atribuir a
que el lactato absorbido, producira acidosis metablica. Esto produce un incremento en la PaCO2
estimulando los centros respiratorios (Radostits 2007). Es posible que la menor dosis utilizada en
la presente investigacin y la capacidad del bicarbonato en el plasma pudiese amortiguar el
potencial aumento de protones en la sangre. Thoefner y col (2004), observaron una profunda
acidosis metablica a las 9 horas en todos los animales en estudio siendo para el grupo de mayor

17

dosis ms notoria, siendo esto similar a lo encontrado por Dansher y col (2009) a las 12 horas
posteriores al tratamiento, sin embargo en estos estudios no se registr la frecuencia respiratoria.
En las 4 vaquillas se observ un incremento en la frecuencia cardaca siendo esta de 62 a 78 lpm.
El secuestro de lquido en rumen debido a la acumulacin de cido lctico, produce la cada del
volumen plasmtico, una depresin progresiva del sistema cardiovascular, con cada de la presin
arterial y el aumento en la frecuencia cardaca (Radostits 2007). En el estudio realizado por
Thoefner y col (2004) se encontr en los animales tratados con 13 g/kg PV y 17 g/kg PV un
aumento cercano a 80 lpm a las 9 horas, alcanzando el grupo tratado con 21 g/kg PV una
frecuencia de 110 lpm. Dansher y col (2009) observaron un incremento cercano a 80 lpm en
vaquillas de 338 kg y 125 lpm en vaquillas de 425 kg con dosis de 17 g/kg PV.
El aumento de la motilidad ruminal es un hallazgo poco frecuente en clnica, sin embargo se
puede presentar en fenmenos irritativos de la mucosa del rumen o retculo que producen
inflamacin de la mucosa. Siendo ms comn la hipomotilidad ruminal la cual se observa en
enfermedad o manejo que produzca estrs o por la acumulacin de gas dentro del rumen que
produce sobre distensin de las paredes del rumen (Radostits 2007). La administracin de 13 g/kg
de oligofructosa produjo un aumento en la frecuencia ruminal desde 1 a 3,75 contracciones por
minuto. Thoefner y col (2004) determinaron que la frecuencia ruminal presento un aumento solo
en el grupo de 13 gr/kg siendo esta de 2,8 contracciones en 2 minutos , presentndose en los
otros 2 grupos un descenso, siendo este mayor para el grupo de 21 gr/Kg con un valor cercano a
1,6 en 2 minutos a las 9 horas. Dansher y col (2009) determin un descenso en la frecuencia
ruminal cercano a 0,8 contracciones en 2 minutos a las 12 horas, siendo el grupo de 425 kg ms
afectada.
6.2. ANLISIS DEL PH RUMINAL
Las 4 vaquillas utilizadas en este estudio presentaron un marcado descenso del pH ruminal,
,alcanz un valor de 4,54, considerandose esto como acidosis ruminal aguda (figura 3). Estos
valores son similares a los obtenidos por Thoefner y col (2004) al inducir acidosis con dosis de
13, 17 y 21 g/kg PV de oligofructosa va oral respectivamente. El estudio mostro en los 3
tratamientos un marcado descenso del pH, desde un rango entre 7,5-6,5 en la hora 0 hasta
alcanzar un pH entre 5,5-4,5 a la hora 9, presentndose una relacin directa entre la cantidad de
dosis administrada y el aumento en la acidosis ruminal. En un estudio realizado por Dansher y col
(2009) quienes administraron a 8 vaquillas una dosis de 17 g/kg PV de oligofructosa va oral,
obtuvieron valores de pH cercanos a 4,3 a las 12 horas de iniciado el estudio. En un modelo
diferente de induccin de acidosis utilizado por Harmon y col (1985), en el cual se administr una
dosis de 12 g/kg PV de glucosa intraruminal a 5 novillos, se observ un descenso del pH del
grupo desde 7,0 a 5,0 a las 10 horas de iniciado el estudio. Un estudio similar realizado por
Nagaraja y col (1982), en el cual se administr 12,5 g/kg PV de glucosa intraruminal a vacas
lecheras se observo a las 4 horas un pH de 5,34, alcanzando a las 12 horas un pH de 4,21.

18

6.3 ANLISIS DEL CIDO LCTICO RUMINAL Y PLASMTICO

La concentracin normal de lactato en plasma es de 1-2 mM, siendo casi en su totalidad producto
del isomero L, mientras que la forma D-lactato presenta concentraciones en el rango nanomolar y
es producto de la va metilglioxal (Ewaschuk y col 2005). En este estudio el cido L- lctico no
presento variaciones estadsticas con respecto al control en plasma, teniendo valores cercanos a
0,45 mM. Para D-lctico los valores iniciales en la concentracin fueron cercanos a 0,02 mM
observndose un aumento sostenido en las siguientes mediciones llegando a 0,18mM a las 9
horas. En un estudio realizado por Harmon y col (1985) se administr 12 g/kg PV de glucosa
intraruminal a 5 novillos. Se determin que la concentracin plasmtica al inicio para cido Llctico se encontraba cercana a los 0,6 mM observndose un incremento de la concentracin a
valores cercanos a 1 mM a la hora 2, 4 y 6 aumentando en la hora 8 a un valor cercano a 1,6 mM.
Harmon y col (1985) demostraron que las concentraciones de cido D-lctico al inicio del estudio
estuvieron cercanas a 0, incrementando constantemente hasta alcanzar valores aproximados de
0,2 mM.
Por otro lado, la concentracin ruminal normal de cido lctico en el lquido ruminal no
sobrepasa 1 mM, predominando la forma L sobre la forma D, en proporcin 5:1,
respectivamente. En animales con acidosis grave esta razn puede disminuir en 1:1 (Noro 2010).
En este estudio el cido L- lctico ruminal no presento variaciones estadsticas con respecto al
control presentando valores cercanos a 2 mM. Para D-lctico los valores iniciales en la
concentracin fueron cercanos a 0,12 mM, observndose un aumento continuo alcanzando un
valor de 2 mM a las 9 horas. Harmon y col (1985) quienes administraron 12g/kg PV de glucosa
intraruminal, determinaron una concentracin ruminal de L-lctico cercano a 0 mM al inicio del
estudio, aumentando a 4 mM de manera sostenida a las 2, 4 y 6 horas posteriores, presentando un
valor cercano a 20 mM en la hora 8. Para D-lctico estos autores encontraron valores cercanos a 0
mM al inicio del estudio y aument continuamente a valores cercanos a 6 mM luego de 8 horas
de aplicado el tratamiento.
En otro estudio realizado por Gentile y col (2004) se indujo acidosis ruminal en nueve terneros
con la aplicacin de leche entera intraruminal. En todos los terneros se mostr un aumento rpido
y significativo en la concentracin de D-lactato. Por el contrario, L-lactato nunca se desvi de los
niveles fisiolgicos.
Estas observaciones confirmaron que, en terneros jvenes como en los bovinos adultos, la
acidosis ruminal puede llevar a una acidosis metablica D-lctica con sus consecuentes
manifestaciones clnicas. Siendo una dosis de 13 g/kg PV de oligofructosa por va oral suficiente
para inducir un cuadro de acidosis ruminal aguda en bovino y que el aumento de las
concentraciones de D-lctico en lquido ruminal y plasma podran contribuir a los cambios en los
parmetros fisiolgicos e inmunolgicos observado en estos animales. Alarcn y col (2011)
concluyeron que el cido D-lctico poda interferir con las funciones de neutrfilos inducidos por
el factor de activacin plaquetaria, que conduce a la reduccin de la respuesta inmune innata
durante infecciones bacterianas. Tambin observaron un aumento en la liberacin de la
metaloproteina-9 y en la expresin de la integrina CD11b inducida por cido D-lctico a
concentraciones de 10 mM, esto podra promover una reaccin inflamatoria no especfica
dependiente de neutrfilos en cuadros de acidosis ruminal aguda. Munakata y col (2010)
19

determinaron que el D-lactato es un agente neurotxico potente. En este sentido, se observ en

terneros con acidosis ruminal, en donde la mayora de los trastornos neurolgicos como ataxia y
depresin del SNC, estaban relacionados con la acumulacin de D-lactato en el lquido
cefalorraqudeo. Esta acumulacin de D-lactato podra ser responsable de la mayora de los signos
clnicos de depresin observados en las vaquillas tratadas con oligofructosa. Ms an, existen una
variedad de enfermedades, incluyendo la diarrea neonatal de terneros y sndromes humanos que
se caracteriza por la acidosis D-lctica y depresin del SNC.
La investigacin sobre el efecto de D-lactato en salud animal no est claramente determinada
debido a que las tcnicas de anlisis presentan dificultad para determinar las isoformas L y D o
son de alto costo. Las dos tcnicas para la medicin del lactato se basan en ensayos de
espectrofotometra o mtodos enzimticos (lactato oxidasa) y por lo general expresan los valores
totales en milimoles por litro (mmol/L) de sangre. Los mtodos enzimticos presentan
inconvenientes al presentar potenciales interferencias por compuestos que pueden estar en las
matrices de anlisis, incluyendo fluoruro de sodio, acetaminofeno y oxalato de potasio. Los
sistemas de HPLC por otra parte son ms exactos, precisos, repetibles, y presentan una
interferencia insignificante con los contaminantes (Omole y col 1999). Sin embargo el alto costo
de las columnas de separacin de compuestos quirales, hace menos accesible este ensayo como
mtodo de rutina diagnostica.
Debido a que la tcnica de medicin de cido lctico mediante columna HPLC Astec CLC-D de
separacin quiral demostr ser sensible, podra ayudar en el estudio de las variaciones de la
funcin ruminal y metablica, asociada a problemas de salud en rebaos, siendo tambin
potencialmente aplicable a una variedad de muestras biolgicas.
6.4. CONCLUSIONES
Segn los resultados obtenidos bajo las condiciones experimentales de este estudio se pudo
determinar:

La administracin de una sobrecarga aguda de 13 g/kg PV de oligofructosa va oral fue

capaz de producir acidosis ruminal aguda en las 4 vaquillas pertenecientes a este estudio.

Las 4 vaquillas presentaron alteraciones en sus frecuencias y constantes caractersticas de

un cuadro clnico de acidosis ruminal aguda.

La acidosis ruminal inducida por oligofructosa increment los niveles plasmticos y

ruminales del ismero D-Lctico, sin presentar cambios significativos en los niveles de
cido L-lctico.

20

7. REFERENCIAS

Abeysekara S. 2009. D-Lactic Acid Metabolism and Control of Acidosis. Doctoral Thesis, College of
Pharmacy and Nutrition, University of Saskatchewan, Saskatoon, Canada.
Alarcn P, I Conejeros, M Carretta, C Concha, E Jara, N Tadich, M Hidalgo, R Burgos. 2011. DLactic acid interferes with the effects of platelet activating factor on bovine neutrophils.
Vet Immunol Immunopathol 144, 68-78.
Anrique R. 2010. Metabolismo ruminal de los hidratos de carbono. En: Contreras P, M Noro
(eds). Rumen: morfofisiologa, trastornos y modulacin de la actividad fermentativa, 3 Edicin,
Valdivia, Chile, Pp. 25-36.
Al Jassim R, J Rowe. 1999. Better understanding of acidosis and is control. Rec Adv An 12, 91-97.
Blanch M. 2009. Estudio de la acidosis ruminal y nuevas estrategias de prevencin. Tesis Doctoral,
Departament de Cincia Animal i dels Aliments, Universidad Autnoma de Barcelona,
Espaa.
Cammack R. 1969. Assay, purification and properties of mammalian D-2-hydroxy acid
dehydrogenase. Biochem J 115, 55-64.
Connolly E, T Abrahamsson, B Bjrksten. 2005. Safety of D-lactic acid producing bacteria in the
human infant. J Pediatr Gastr Nutr 41, 489-492.
Counotte G, R Prins, R Janssen, M DeBie. 1981. Role of Megasphaera elsdenii in the
fermentation of DL-[2-13C] lactate in the rumen of dairy cattle. Appl Environ Microb 42,
649-655.

Danscher A, J Enemark, E Telezhenko, N Capion, C Ekstrom, M Thoefner. 2009. Oligofructose

overload induces lameness in cattle. J Dairy Sci 92, 607-616.
Ewaschuk J, G Zello, J Naylor, D Brocks. 2002. Metabolic acidosis: Separation methods and
biological relevance of organic acids and lactic enantiomers. J Chromatogr 781, 39-56.
Ewaschuk J, J Naylor, G Zello. 2005. D-lactate in human and ruminant metabolism. J Nutr 135,
1619-1625.
Flick M, S Konieczny. 2002. Identification of putative mammalian D-lactate dehydrogenase
enzymes. Biochem Bioph Res Co 295, 910-916.

21

Gentile A, S Sconza, I Lorenz, G Otranto, G Rademacher , P Famigli-Bergamini , W Klee. 2004.

D-Lactic acidosis in calves as a consequence of experimentally induced ruminal acidosis. J
Vet Med A Physiol Pathol Clin Med 51, 64-70.
Harmon D, R Britton, R Prior, R Stock. 1985. Net portal absorption of lactate and volatile fatty
acids in steers experiencing glucose-induced acidosis or fed a 70% concentrate diet ad
libitum. J Anim Sci, 60, 560-569.
Kleen J, G Hooijer, J Rehage, J Noordhuizen. 2003. Subacuteruminal acidosis (SARA): a review. J
vet med A Physiol pathol clin med 50, 406-414.
Mantovani H, J Russell. 2001. Nisin resistance of Streptococcus bovis. Appl Environ Microb 67, 808813.
Marounek M, S Bartos. 1987. Interactions between rumen amylolytic and lactate utilizing bacteria
in growth on starch. J Appl Bacteriol 63, 233-238.
Munakata S, C Arakawa, R Kohira, Y Fujita, T Fuchigami, H Mugishima. 2010. A case of D-lactic
acid encephalopathy associated with use of probiotics. Brain Dev 32, 691-694.
Mller F, K Huber, H Pfannkuche, J Aschenbach, G Breves, G Gbel. 2002. Transport of ketone
bodies and lactate in the sheep ruminal epithelium by monocarboxylate transporter 1. Am
J Physiol-Gastr L 283, 1139-1146.
Nagaraja T, T Avery, E Bartley, S Roof, ADayton. 1982. Effect of Lasalocid, Monensin or
Thiopeptin on Lactic Acidosis in Cattle. J Anim Sci, 54:649-658.
NagarajaT, G Miller. 1989. Rumenmicrobialchangesinionophoreantibiotictreatedsteers
withexperimentallyinducedacidosis. Austral J Anim 2, 465-468.
NagarajaT, Lechtenberg K. 2007. Acidosis in Feedlot Cattle. Vet Clin N Am-Food A 23, 333-350.
Nocek J. 1997. Bovine acidosis: implications on laminitis. J Dairy Sci 8780, 1005-1028.
Noro M. 2010. Acidosis y alcalosis ruminal. En: Contreras P, M Noro (eds). Rumen: morfofisiologa,
trastornos y modulacin de la actividad fermentativa, 3 Edicin, Valdivia, Chile, Pp. 81-93.
Omole O, D Brocks, G Nappert, J Naylor, G Zello. 1999. High-performance liquid
chromatographic assay of ()-lactic acid and its enantiomers in calf serum. J Chromatogr
727, 23-29.
Oetzel G. 2003. Nutritional management and subacute ruminal acidosis in dairy herds. In: 36th
Annual Conference of American Association of Bovine Practitioners. Columbus, Ohio,
USA.

22

Owens F, D Secrist, W Hill, D Gill. 1998. Acidosis in cattle: a review. J Anim Sci 76, 275-286.
Radostits O. 2007. In: Radostits O, Gay C, Hinchcliff K, ConstableP (eds).Veterinary Medicine: A
textbook of the diseases of cattle, horses, sheep, pigs and goats.10th Edition.Saunders Ltd, USA.
Therion J, A Kistner, J Kornelius. 1982. Effect of pH on growth rates of rumen amylolytic and
lactilytic bacteria. Appl Environ Microb 44, 428-434.
Thoefner M, C Pollitt, A van Eps, G Milinovich, D Trott, O Wattle, P Andersen. 2004. Acute
bovine laminitis: A new induction model using alimentary oligofructose overload. J Dairy
Sci 87, 2932-2940.
Zar J. 2010. The logarithmic transformation, Section 13.1. In: Biostatistical Analysis. 5th Edition.
Pearson Prentice Hall, New Jersey, USA. Pp 287-291.

23

8. ANEXOS

Anexo 1.Promedio e intervalo inferior como superior del pH y concentracin de cido D y L

lctico en rumen de 4 vaquillas sometidas a sobrecarga aguda con 13 g/kg PV de oligofructosa.
Horas

Acido D-Lctico
(mM)

MediaEE

0,01263 0,00145

1,198 0,248***

1,904 0,171***

Intervalo

0,01181- 0,01481

0,9839-1,449

1,7004-2,1146

Acido L-Lctico
(mM)

MediaEE

1,785 0,9295

1,643 0,2073

2,711 1,222

Intervalo

0,6530-2,888

1,3897-1,8795

1,550597-4,034455

MediaEE

7,035 0,1406

6,005 0,8104*

4,548 0,04113***

Intervalo

7,17-6,84

5,3-6,95

4,5-4,6

pH Ruminal
*

***

P<0,05, P<0,001
EE: error estndar
Anexo 2. Promedio e intervalo inferior como superior de la concentracin plasmtica de cido D
y L lctico en rumen de 4 vaquillas sometidas a sobrecarga aguda con 13 g/kg PV de
oligofructosa.
Horas

0,0231
0,0035
0,0201Intervalo
0,028
Media
0,4455
Acido LEE
0,1323
Lctico
0,3417(mM)
Intervalo
0,6307
*
**
***
P<0,05, P<0,01, P<0,001
EE: error estndar
Acido DLctico
(mM)

Media
EE

0,5

0,0357
0,0227
0,01910,0693
0,4091
0,1292
0,25910,5739

0,0398
0,0235
0,02680,075
0,4109
0,1696
0,27530,6296

0,0603
0,0202*
0,04920,0906
0,7411
0,2905
0,45671,1303

0,0733
0,0166***
0,05650,0931
0,6552
0,1426
0,44850,7734

0,1815
0,0843***
0,13110,3074
0,466
0,1849
0,31380,7352

24