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Ao 2010
SERVICIO ENTEROBACTERIAS
DEPARTAMENTO BACTERIOLOGIA
INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES INFEFCCIOSAS
ANLIS CARLOS G. MALBRAN
INDICE
I) FUNDAMENTOS Y VARIABLES DE LA REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)____________________________________________________________________3
___43
V) BIOSEGURIDAD_______________________________________________________53
sintticos
diseados
especialmente
que
se
unen
secuencias
disminuye
el
rendimiento
de
la
reaccin
altas
ADN blanco, la secuencia a amplificar debe contener desde < 0.1 a unas pocas
kilobases. La cantidad total de ADN usado normalmente es de 0.05 a 1.0 g.
Lo que es realmente importante es la concentracin molar del ADN, por lo que
la cantidad a agregar depende del tamao de las molculas en el templado.
Control negativo: se utiliza un tubo de reaccin solo con reactivos, sin templado.
En lo posible cada rea debe tener dos entradas, circulacin de aire para
recontaminacin de aerosoles y lmparas de luz UV. El movimiento de las muestras y
del personal tiene que ser de un rea libre de amplicones hacia reas contaminadas
con ellos y nunca en sentido contrario. Es necesario que los reactivos se almacenen
en reas libres de contaminacin, fraccionados en pequeas alcuotas, y
preferentemente que sean reactivos grado Biologa Molecular. Hay que utilizar material
nuevo y descartable, y prevenir la contaminacin por aerosoles usando tips con filtro.
Por las mismas razones es importante asignar los juegos de pipetas para cada rea,
como tambin descontaminar frecuentemente las mesadas, pipetas y equipos.
VARIANTES DE LA PCR
microbiana,
cuando
el
enriquecimiento
no
es
posible
para
el
Purificacin del ADN con resinas o reactivos que tienen afinidad por el ADN o
los componentes contaminantes: columnas de slica, sephadex, sepharosa,
resinas chelex, CTAB y otras alternativas comerciales.
10
citotoxinas (RTX) y toxina termoestable (ST) entre otros. Por lo tanto el estudio de la
distribucin de los distintos genes asociados a virulencia en cepas de V. cholerae
permite evaluar el potencial patognico de las mismas. La toxina ST acta estimulando
la actividad de guanilato ciclasa, promoviendo la secrecin de Cl- y/o inhibiendo la
absorcin de Na+ y agua (Forte et al., 1992, Vicente A., 1997).
Emergencia de nuevas cepas toxignicas
A nivel molecular, los principales genes patognicos de V. cholerae se encuentran en
regiones del cromosoma en forma de clusters o islas de patogenicidad, teniendo la
capacidad de ser propagados horizontalmente (Karaolis et al. 1998, Heidelberg 2000).
Esto sugiere que cepas ambientales pueden volverse ms virulentas para el hombre a
travs de la adquisicin de genes de patogenicidad.
caracterizacin
de
Vibrio
cholerae
(http://www.panalimentos.org/salmsurv).
A modo de resumen, se presentan en las figuras 1 y 2 los esquemas para el
aislamiento del microorganismo a partir de muestras de materia fecal y de agua y, en
las Tablas 1 y 2, las pruebas bioqumicas para la identificacin de V. cholerae y su
diferenciacin con respecto a otras especies del gnero Vibrio spp.
11
APA: 6-8
6-8 hs
hs 37
37 C
APA:
C
AgarTCBS
TCBS//TSA:
TSA:18hs
18hs37C
37C
Agar
Colonia aislada:
Colonias
aisladas
repique
en
TSA en TSA
Kligler-LIA-Indolde Triptofano-Estra
Triptofano-EstraTSA
TSA
Kligler-LIA-Indol
Extraccin
Extraccin
deADN
ADN
de
24-36 hs
PCR
Tor
V.cholerae/ctxA/tcpA
cholerae/ctxA/tcpAElElTor
PCR V.
Oxidasa,Pruebas
Pruebasbioqumicas
bioqumicascomplementarias
complementarias
Oxidasa,
SerotipificacinO1
O1yyO139
O139
Serotipificacin
PCRO1
O1yyO139
O139
PCR
48-72 hs
V. cholerae O1, O139 o no-O1 no-O139
ctxA, tcpA El Tor (PCR)
Filtros+ +
Filtros
5050
mlml
APA
Fitrado
3 lts
um
s 0.22
Filtrado
lts
3 a travs
0.22um
Extraccin
nde
Extracci
de ADN
ADNa apartir
partirdedelos
los
filtros
Incubar
C x
x18
C
Incubar36631
6-8hs
hs
TCBS
TCBS
--T1N1--Oxidasa
ExtraccinADN
de
Extraccin
por hervido
fi
PCR
PCR V.cholerae
V.
cholerae
ctxA/tcpA/El Tor
ctxA/tcpAEl Tor
O1/O139
O1/O139
Identificacin bioqumica y
serotipificacin
12
Porcentaje de
Positividad
100
100
0
7
99
99
99
0
99
75
100
100
53
1
0
13
Caracterizar
rpidamente aislamientos
para: confirmar
especie, determinar
14
En este punto las muestras se pueden congelar o se comienza con la lisis celular:
Agregar 360 l de lisozima 5 mg/ml, e incubar 45 min en bao a 37C con agitacin.
Separar fase acuosa en un tubo de vidrio pequeo y precipitar el ADN con 0.6
volmenes de isopropanol. Homogenizar levemente para formar un precipitado de
ADN y transferir (si es visible) utilizando un capilar de vidrio a un tubo microtubo. Si
no es posible visualizar el ADN, se recomienda centrifugar la solucin a mxima
velocidad durante 20 min en un microtubo de 2 ml.
15
Una vez que los tubos estn secos se resuspende el ADN con agua tridestilada, con
un volumen que depende del pellet obtenido entre 25-100ul.
Para medir la concentracin y calidad del ADN se hace una lectura a 260, 280 y 320
nm. Se realiza con una dilucin 1/100 de la muestra obtenida. La lectura a 260 nm
me indica la concentracin de ADN, la lectura a 280 nm refleja la concentracin de
protenas. Se calcula la relacin A260/A280, que debe dar entre 1 y 2 para indicar
que la purificacin del ADN fue eficiente. La 320 nm puede indicar una
contaminacin con cidos hmicos, que por un lado interfiere con la lectura a 260 nm,
pero tambin son inhibidores de la Taq polimerasa.
VCO1-R2
5 - TATCTTCTGATACTTTTCTAC - 3
VCO139-F2
5- TTACCAGTCTACATTGCC - 3
VCO139-R2
5- CGTTTCGGTAGTTTTTCTGG - 3
pVC-F2
5- TTAAGCSTTTTCRCTGAGAATG - 3
pVCm-R1
5- AGTCACTTAACCATACAACCCG - 3
CT 94F
5- CGCGCAGATTCTAGACCTCCTG - 3
CT 614R
5- CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC - 3
TCP 72F
5- CACGATAAGAAAACCGGTCAAGAG - 3
TCP 477R
5- CGAAAGCACCTTCTTTCACGTTG - 3
tcpI132-F
tcpI951-R
5- TAGCCTTAGTTCTCAGCAGGCA -3
5- GGCAATAGTGTCGAGCTCGTTA -3
Amplicon
(pb)
647 ( O1 )
741 (O139 )
O1/O139
(Multiplex- PCR
Rivera et al, 2003)
300
VC16S-23SrRNA
(Chun et al, 1999)
564
451
ctxAtcpA El Tor
(Rivera et al, 2003)
862
tcpI
(Rivera et al, 2001)
16
Volumen ( l )
Concentracin
H2O
9,25
2,5
1X
Cl2Mg 50mM
2 mM
0.2mM
0.8 M
0.8 M
0.4 M
primer CT 614-R 10 M
0.4 M
0.4 M
0.4 M
0,25
1.25 U
25
Condiciones de ciclado
Etapa 1
94C
2 min
Etapa 2
94C
45 seg
Etapa 3
60C
45 seg
Etapa 4
72C
45 seg
Etapa 5
72C
10 min
Etapa 6
14 C
30 ciclos
Gel de agarosa al 2 %
Tamao de fragmento
300 pb
Vc-m (16S-23S)
Esperado
451 pb
tcpA ElTor
564 pb
ctxA
17
ctxA
tcpA El Tor
V. cholerae
2.1.2 - PCR Multiplex para identificacin de los genes que codifican los antgenos de V.
cholerae O1 y O139 (serogrupos epidmicos).
La biosntesis del antgeno O en V. cholerae es controlado por los genes del locus rfb, de
22 kb para O1 y 35 kb para O139. La diferencia de secuencia de ADN entre los serogrupos
est dada por una regin especfica para O139 de 13 kb., tal que con el uso de primers
especficos se pueden definir claramente los diferentes serogrupos. Se implement la
reaccin de PCR-multiplex para la determinacin de los serogrupos O1 y O139 (Rivera et al,
2003). En la Tabla 5 se presentan los componentes de la mezcla de reaccin, condiciones
de ciclado y tamao de los fragmentos de ADN amplificados
Tabla 5. PCR- Multiplex O1/O139
Reactivos
Volumen ( l )
H2O dest.
13,6
Buffer Tris-HCl-10X
2,5
1X
Cl2Mg 50mM
0,75
1.5 mM
0.2mM
0.4 M
0.4 M
0.4 M
primer VCO139-R210M
0.4 M
0,15
0.75 U
25
Concentracin
Condiciones de ciclado
Etapa 1
94C
2 min
Etapa 2
94C
1 min
Etapa 3
52C
1 min
Etapa 4
72C
90 seg
Etapa 5
72C
10 min
Etapa 6
14 C
30 ciclos
18
Gel de agarosa al 2 %
Tamao de fragmento
647 pb
O1
esperado
741 pb
O139
O139
O1
Volumen ( l )
H2O dest.
13,63
Buffer Tris-HCl-10X
2,5
1X
Cl2Mg 50mM
0,75
1.5 mM
0.2mM
0.8 M
0.8 M
0,125
0.6U
ADN
25
Concentracin
Condiciones de ciclado
Etapa 1
94C
2 min
Etapa 2
94C
1 min
Etapa 3
60C
1 min
Etapa 4
72C
2 min
Etapa 5
72C
10 min
Etapa 6
14 C
30 ciclos
862pb
tcpI
19
tcpI
20
Volumen (ul)
Concentracin
8.8
BSA 10 mg/ml
Cl2Mg 25 mM
1*
2.5 mM final
0.2 mM
1.5
0.6 M
1.5
0.6 M
0.2
1U
ADN
25
400 ng/ul
94C
2 min
Etapa 2
94C
1 min
Etapa 3
55C
1 min
Etapa 4
72C
1 min
Etapa 5
72C
10 min
Etapa 6
14 C
35ciclos
300pb
Vc
V. cholerae
V. cholerae
300bp
Marcador de
PM
IAC 500bp
bp
Control
negativo
21
Volumen (ul)
H2O dest.
Concentracin
8.8
BSA 5mg/ml
Cl 2Mg 25mM*
2.5 mM final
0.2 mM
1.5
0.6 M
1.5
0.6 M
0.2
1U
22
400 ng/ul
Condiciones de ciclado
Etapa 1
94C
2 min
Etapa 2
94C
1 min
Etapa 3
50C
1 min
Etapa 4
72C
1 min
Etapa 5
72C
10 min
Etapa 6
14 C
35ciclos
647 pb
O1
*slo se agrega 1 ul de Cl2Mg debido a que el buffer comercializado con la enzima Go Taq ya tiene
entre sus componentes Cl2Mg
O1
22
2.2.3 - PCR para identificacin de ctxA (toxina CT)/ y tcpA (TCP) a partir de muestras
de agua
En la Tabla 9 se presentan los componentes de la mezcla de reaccin, condiciones de
ciclado y tamao de los fragmentos de ADN amplificados para la deteccin de estos genes
asociados a virulencia en muestras de agua.
Tabla 9. PCR- Multiplex ctxA / tcpA con Go Taq
Reactivos
Volumen (l)
H2O dest.
7.8
BSA 5mg/ml
400 ng/ul
Taq)
1X
Cl2Mg 25 mM*
2.5 mM
0.2mM
0.4 M
primer CT 614-R 10 uM
0.4 M
0.4 M
0.4 M
0,2
1U
ADN
25
Concentracin
Condiciones de ciclado
Etapa 1
94C
2 min
Etapa 2
94C
1 min
Etapa 3
60C
1 min
Etapa 4
72C
1 min
Etapa 5
72C
10 min
Etapa 6
14 C
35 ciclos
Gel de agarosa al 2 %
Tamao de fragmento
451 pb
tcpA El Tor
esperado
564 pb
ctxA
ctxA
tcpA El Tor
23
Gel de Agarosa
Para preparar el gel, se pesa la agarosa segn el porcentaje y el tamao del gel que se
desea preparar, se agrega el volumen de buffer TAE 1X correspondiente y se funde en el
horno microondas a 40% de potencia. La concentracin de agarosa (0.7-2%) se calcula en
funcin del tamao de los fragmentos, tal que para fragmentos de bajo peso molecular se
emplear la mayor concentracin y viceversa. (En las tablas 4 a 9 se especifica la
concentracin adecuada para cada corrida electrofortica). La agarosa fundida se coloca en
el soporte armado con su peine, que es retirado una vez solidificado el gel.
Electroforesis
Una vez solidificado el gel, se coloca en la cuba electrofortica que contiene suficiente
cantidad de buffer TAE 1X de tal modo que el gel quede cubierto. Se mezcla el buffer de
siembra con la muestra en una proporcin de 1 parte y 5 partes respectivamente, y se
cargan 10-20l de cada dilucin por pocillo. Se siembra tambin el marcador de peso
molecular. A la par de las muestras, se siembran el control positivo y el control negativo. Se
conecta la cuba a la fuente de poder teniendo la precaucin de que la lnea de siembra se
encuentre en el polo negativo ya que las molculas de ADN migran hacia el polo positivo.
Las condiciones de la corrida electrofortica recomendadas para los protocolos de PCR
descriptos son 100 voltios durante 30 minutos.
24
REFERENCIAS
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Vicente A., Cohelo A and Salles C. Detection of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus
heat-stable toxin gene sequence by PCR.
26
ANEXO I V. cholerae
Soluciones
27
ANEXO II V. cholerae
INSUMOS NECESARIOS PARA EXTRACCIONES DE ADN Y PCR
Material y equipamiento para extraccin de ADN a partir de un aislamiento
bacteriano
Reactivos
Agar tripticasa soja
Agua Calidad Biologa Molecular estril
Insumos descartables
Placas de Petri
Cubetas para espectrofotmetro
Tips estriles (200 y 1000 l)
Microtubos nuevos y estriles de 1.5 ml
Hisopos, escarbadientes o ansas plsticas estriles.
Guantes de ltex
Equipos
Micropipetas de 1000l
Estufa de 37C
Espectrofotmetro
Bloque Trmico o bao a 100C
Microcentrfuga
Pipetas para 100ul y 1000ul (comn de la mesada)
Mechero
Reactivos
Agua Calidad Biologa Molecular estril
Buffer SET
Lisozima
SDS 10%
Proteinasa K 20 mg/ml
NaCl 5M
CTAB-NaCl 10%
Fenol-Cloroformo-Isoamlico
Cloroformo
Alcohol Isoamlico
Isopropanol
Etanol 70%
Insumos descartables
Congeladora con hielo
Tips amarillos y azules estriles
Tubos falcon 15 ml de polipropileno con tapa a rosca
Tubos de vidrio 13x100 para precipitar DNA
Microtubos de 2 ml (resistentes) estriles para centrfuga
Pipetas Pasteur estriles 3ml
Papel absorbente
Guantes de ltex
28
Equipos
Centrfuga refrigerada para tubos de 15 ml
Microcentrfuga
Pipetas 0.5-10, 5-40 40-200 y P1000
Homogenizadores (1)
Gradilla para homogenizadores
Gradillas
2 Baos con agitacin (37C y 65C)
Vortex
Cmara de extraccin de qumicos
Cmara de vaco/ desecador
Espectrofotmetro
Cubeta de cuarzo
Heladera y freezer
Pipetas de vidrio de 10ml (varias) y 2 de 25ml estriles
Recipientes de vidrio para descartar pipetas
Insumos descartables
Microtubos nuevos y estriles de 1.5 ml.
Tubos para reaccin de PCR de 0.2 ml nuevos, libres de DNasas.
Tips de barrera ART (aerosol resistant tips)
Bloque trmico refrigerado o hielo
Guantes de ltex
Equipos
Termociclador
Cabina de bioseguridad (rea limpia)
Micropipetas (10 l, 100l, 200l y 1000l)
Pipeta para cargar ADN 10 ul
29
Insumos descartables
Probetas de 50 y 1000 ml
Erlenmeyers
Tips
Equipos
Micropipetas de 20l
Balanza
Horno microondas o equivalente
Cubas electroforticas y accesorios
Fuente de poder
Transiluminador UV
Cmara fotogrfica
Reactivos
Agarosa
Buffer TAE 1 X
Buffer de siembra 6X (xilene-cyanol o azul de bromofenol)
Marcador de peso molecular de 100pb.
Bromuro de etidio
Agua destilada
30
El control de los alimentos es una necesidad imperiosa tanto en el alimento terminado como
en cada uno de los ingredientes que forman parte del alimento final. El control estricto de la
calidad de los alimentos ha hecho que la incidencia de la salmonellosis disminuyera, pero
los brotes todava son frecuentes. Esto llev a la necesidad de conocer en forma rpida la
probable contaminacin de los alimentos por este microorganismo.
Salmonella spp. es un organismo con algunas caractersticas particulares; no es resistente
al calor y no crece a baja temperatura, pero sorprendentemente no se elimina por
congelamiento. Puede sobrevivir en alimentos cidos y resiste la deshidratacin. Por lo tanto
a pesar que no se puede multiplicar en muchos alimentos procesados, cuando la
contaminacin est presente, es muy difcil de erradicar. Por ejemplo, los alimentos grasos
pueden proteger a las clulas de tratamientos trmicos severos haciendo que la
pasteurizacin no sea efectiva.
El estudio epidemiolgico de los brotes mas importantes indica que los alimentos ms
frecuentemente involucrados son los productos son carne, huevos y alimentos lcteos. Otros
alimentos e ingredientes que requieren anlisis de rutina son confituras con chocolate,
hierbas y especias, ensaladas crudas, frutas, frutas secas, harina y productos marinos.
Tambin se pueden analizar carcasas de animales en el matadero. Las muestras a analizar
se deben refrigerar si no se pueden enviar inmediatamente para su anlisis.
Algunos alimentos deshidratados, especialmente hierbas y especias contienen compuestos
que pueden inhibir el desarrollo de Salmonella spp. en los medios de enriquecimiento. Estos
compuestos se deben neutralizar ya sea por el agregado de un agente neutralizante
apropiado o por diluciones sucesivas.
Los mtodos tradicionales reconocidos por los organismos oficiales para la identificacin de
Salmonella spp., tienen alta sensibilidad pero demandan una gran cantidad de tiempo hasta
llegar al diagnstico porque requieren el aislamiento de colonias sospechosas y su
confirmacin por pruebas bioqumicas y de serotipificacin. En los procesos de produccin y
control de alimentos, la duracin del procedimiento del diagnstico constituye un factor
31
En los ltimos aos se han desarrollado una gran cantidad de mtodos rpidos de deteccin,
como pruebas de screening o tamizaje, que permiten obtener un resultado presuntivo
sobre la presencia de Salmonella spp. y otros patgenos en 24-48 horas. Muchos de estos
mtodos estn disponibles comercialmente y algunos de ellos han sido validados por AOAC
y/o AFNOR. La base de datos mtodos testeados de AOAC contiene ms de 20 productos
para la deteccin rpida de Salmonella.
Los tests rpidos para detectar el microorganismo y los kits de screening utilizan diferentes
tecnologas: nuevas tcnicas de cultivo, separacin inmunomagntica, ensayos basados en
EIA y ELISA, incorporando la deteccin fluorescente o colorimtrica, ensayos de flujo lateral
incorporando la tecnologa inmunocromatogrfica y tcnicas moleculares como hibridizacin
de ADN y ensayos basados en la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). La mayora
de los protocolos, incluyen un paso de enriquecimiento selectivo y luego se usa la tcnica de
deteccin rpida que reemplaza al cultivo en medios selectivos y la posterior confirmacin
por prueba bioqumicas. La mayora de los mtodos pueden dar un resultado en
aproximadamente 48 horas o menos, dependiendo del protocolo de enriquecimiento.
como tamizaje, se
tradicionales, que
Por otra parte, la
realizar estudios
serotipificacin y
32
Para la deteccin de Salmonella en alimentos, la norma ISO 6579: 2002 fue modificada en
2007 para incluir el anlisis de muestras de heces de animales y de muestras ambientales
en la produccin primaria. Otros organismos internacionales han publicado mtodos
estndar similares, por ejemplo en el Bacteriological Analytical Manual (BAM) de United
States Food and Drug Administration (FDA).
De acuerdo a los lineamientos de la norma ISO 6579:2002 (Fig. 1), el primer paso para la
deteccin de Salmonella spp. en la mayora de los alimentos es un enriquecimiento de la
muestra de alimento en un medio lquido no selectivo, agua peptonada buffereada, a 37oC
por 18 horas; aunque el medio utilizado en este paso puede variar de acuerdo al tipo de
alimento. El cultivo enriquecido en medio no selectivo se subcultiva posteriormente en dos
medios de enriquecimiento selectivos diferentes, caldo Rappaport Vasiliadis Soja (RVS) y
caldo Muller-Kauffmann Tetrationato-Novobiocina (MKTTn), que son incubados por 24 horas
ms a 41.5oC (RVS) o 37oC (MKTTn). Seguidamente, el aislamiento en medio slido se
lleva a cabo inoculando una alcuota del cultivo preenriquecido, a partir de los medios RVS y
MKTTn en por lo menos dos medios slidos selectivos, que son incubados posteriormente a
37oC por 24 horas. El mtodo ISO especifica el agar XLD y un medio selectivo opcional. Hay
disponible una variedad de alternativas incluyendo agar Bismuto Sulfito, agar verde Brillante
y agar Entrico Hektoen. Tambin hay disponibles comercialmente, medios slidos
cromognicos especficamente diseados para la diferenciacin de colonias de Salmonella.
Las colonias tpicas de Salmonella en medios selectivos se subcultivan en medios no
selectivos antes de realizar los estudios de identificacin por pruebas bioqumicas.
Hay procedimientos bien establecidos para la confirmacin e identificacin de Salmonella
spp. La identificacin preliminar basada en el aspecto de la colonia en medios cromognicos
y otros medios selectivos se confirma mediante pruebas de bioqumica clsica y
serotipificacin. Los ensayos bioqumicos clave son la fermentacin de glucosa, reaccin de
ureasa negativa, lisina decarboxilasa positiva, test de indol negativo, produccin de H2S y
fermentacin de dulcitol. Los ensayos serolgicos de confirmacin usan sueros polivalentes
para antgenos somticos (O) y flagelares (H). Aislamientos con un perfil bioqumico tpico,
que aglutinan con los antisueros O y H se identifican como Salmonella spp. Cuando los
resultados no son concluyentes es necesario realizar ensayos bioqumicos adicionales.
33
34
Caldo de PreEnriquecimiento
APT
(dil 1/10)
Incubacin 18 hs 2h a 37 C1 C
1 ml
Enriquecimiento
Selectivo
1ml de caldo
+
10 ml de caldo MKTTn
Extraccin de ADN
con Tritn 1x TE
0,1 ml de caldo
+
10 ml de caldo RVS
PCR invA
Incubacin por 24 hs 3h
a 41,5 C 1C
Incubacin por 24 h 3h
a 37 C 1 C
Agar XLD y
2do agar de eleccin (BS, etc)
Incubacin por 24 h 3h
a 37 C 1 C
Agar Nutritivo
Incubacin por 24 h
3h a 37 C 1 C
Confirmacin
bioqumica
Confirmacin
Serolgica
EXPRESION DE
RESULTADOS
35
36
A partir del caldo RVS post-18hs a 37C, tomar 1ml y centrifugar 15 min a 12000 rpm.
Descartar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de solucin fisiolgica, a fin de eliminar
componentes del medio de cultivo que pueden interferir en la PCR, y centrifugar 15 min a
12000 rpm. Resuspender en 150 ul de Triton al 1% en TE1x.
Para lisar las clulas bacterianas, colocar los tubos con las suspensiones en buffer Tritn
1%-TE1X a 100C durante 10 min. Enfriar y centrifugar 1 min a 12000 rpm y luego pasar 200
ul del sobrenadante a un tubo limpio. Este sobrenadante se puede utilizar como templado
de la PCR inmediatamente o puede conservarse a -20C para su uso posterior.
37
programado los ciclos con sus respectivas temperaturas (Tabla 2). Es importante mantener
los tubos en hielo hasta el momento de introducirlos en el ciclador.
Tabla 1. Mezcla de reaccin para PCR invA
Volumen para 1
Reactivos
muestra (l)
Concentracin
H2O
11.0
Buffer 10X
2,5
1X
Cl2Mg (50mM)
0,75
1.5 mM
dNTPs (2.5mM)
2
0.2mM
BSA 10 mg/ml
0.5
200 ng/ul
Primer invA 139 (10 mM)
1
0.4 uM
Primer invA 141 (10 mM)
1
0.4 uM
Taq (5UI/ul)
0,25
1.25 U/ensayo
DNA templado
1
25
95C
95C
64C
72C
72C
1 min
30 seg
30 seg
30 seg
4 min
38 ciclos
284 pb ( invA)
157 bp (CIA)
Gel de Agarosa
Para preparar el gel, se pesa la agarosa segn el tamao del gel que se desea preparar, se
agrega el volumen de buffer TAE 1X correspondiente para lograr una concentracin de
azarosa 2% y se funde en el horno microondas a 40% de potencia. La agarosa fundida se
coloca en el soporte armado con su peine, que es retirado una vez solidificado el gel.
Electroforesis
Una vez solidificado el gel, se coloca en la cuba electrofortica que contiene suficiente
cantidad de buffer TAE 1X de tal modo que el gel quede cubierto. Se mezcla el buffer de
siembra con la muestra en una proporcin de 1 parte y 5 partes respectivamente, y se
cargan 10-20l de cada dilucin por pocillo. Se siembra tambin el marcador de peso
molecular. A la par de las muestras, se siembran el control positivo y el control negativo. Se
conecta la cuba a la fuente de poder teniendo la precaucin de que la lnea de siembra se
encuentre en el polo negativo ya que las molculas de ADN migran hacia el polo positivo.
Las condiciones de la corrida electrofortica recomendadas son 100 voltios durante 30
minutos.
38
3 4
5 6
284 bp invA
157 bp CI
BIBLIOGRAFA
Malorny B., Hoorfar J., Bunge C., Helmuth R. Multicenter validation of the analytical accuracy
of Salmonella PCR: towards an international standard. Appl. Environmen. Microbiol. 2003;
69: 290-296.
Persing D., Smith T., Tenover F. and White T. En Diagnostic Molecular Microbiology.
Principles and Applications. Ed., 1993. Part I; 51-104.
Rahn K., De Grandis S.A., Clarke R.C., McEwen S.A., Galn J.E., Ginocchio C., Curtis III R.,
Gyles C.L. Amplification of an invA gene sequence of Salmonella Typhimurium by
polymerase chain reaction as a specific method of detection of Salmonella. Mol. Cell. Probes
1992; 6: 271-279.
39
Buffer de Siembra 6X
Xileno cianol Azul de bromofenol 0.25% (P/V)
Glicerol 30% (V/V)
Agua destilada estril. Conservar a 4C
40
Reactivos
Agar tripticasa soja
Agua Calidad Biologa Molecular estril
Buffer TE 1X Tritn 1%
Insumos descartables
Placas de Petri
Tips estriles (200 y 1000 l)
Microtubos nuevos y estriles de 1.5 ml
Hisopos, escarbadientes o ansas plsticas estriles.
Guantes de ltex
Equipos
Micropipetas de 1000l
Estufa de 37C
Bloque Trmico o bao a 100C
Microcentrfuga
Pipetas para 100ul y 1000ul (comn de la mesada)
Mechero
Insumos descartables
Microtubos nuevos y estriles de 1.5 ml.
Tubos para reaccin de PCR de 0.2 ml nuevos, libres de DNasas.
Tips de barrera ART (aerosol resistant tips)
Bloque trmico refrigerado o hielo
Guantes de ltex
Equipos
Termociclador
Cabina de bioseguridad (rea limpia)
Micropipetas (10 l, 100l, 200l y 1000l)
Pipeta para cargar ADN 10 ul
41
Insumos descartables
Probetas de 50 y 1000 ml
Erlenmeyers
Tips
Equipos
Micropipetas de 20l
Balanza
Horno microondas o equivalente
Cubas electroforticas y accesorios
Fuente de poder
Transiluminador UV
Cmara fotogrfica
Reactivos
Agarosa
Buffer TAE 1 X
Buffer de siembra 6X (xilene-cyanol o azul de bromofenol)
Marcador de peso molecular de 100pb.
Bromuro de etidio
Agua destilada
42
Salmonella spp.
por
aproximadamente 2000 unidades de flagelina repetidas que se polimerizan para formar los
filamentos flagelares.
Cepas monofsicas: unas pocas serovariedades presentan una sola fase flagelar,
por ejemplo:
Cepas difsicas: que constituyen la gran mayora de las serovariedades tienen dos
especificidades en su antgeno flagelar, por ejemplo:
Las cepas difsicas, exhiben una u otra especificidad antignica flagelar, expresando
alternativamente dos genes: fliC para la fase 1 y fljB para la fase 2. Estos genes
se
43
El promotor para el opern fljBA est localizado dentro de un segmento de ADN reversible.
En un sentido, el opern fljBA se expresa y se produce la flagelina FljB junto con FljA, que
acta como represor del gen fliC, que codifica la flagelina FliC (de fase 1). En el sentido
opuesto, el gen fljB no se expresa, ni tampoco el represor FljA, por lo tanto se transcribe el
gen fliC, apareciendo la protena FliC (de fase 2) (ver Figura 1).
FljB
ON
FljA
PROMOTOR
fljB
fljA
fljB
fljA
P fliC
fliC
OFF
Inversin
de DNA
OFF
PROMOTOR
fliC
fliC
ON
FljC
Tomando como ejemplo S. Typhimurium, (1, 4, 5, 12: i: 1,2), puede sintetizar flagelos de
especificidad H: i o de H: 1,2; un cultivo de S. Typhimurium, es una mezcla de clulas
bacterianas, con flagelos de especificidad H: i y de especificidad H: 1, 2.
Si la poblacin est balanceada, un cultivo puede aglutinar con los antisueros contra las
fases H: i y H:1,2.
Si la gran mayora de la poblacin tiene flagelos con especificidad H: i, el cultivo no va a
aglutinar con el antisuero H:1,2.
44
En agar semislido adicionado del antisuero H: i, las clulas bacterianas que poseen
flagelos de esta especificidad sern inmovilizadas y se expresarn las que poseen los
flagelos de la otra fase. Estas clulas se movilizarn a travs del medio de cultivo y se
producir una aglutinacin con el antisuero H: 1,2.
La inversin de fase se puede realizar de dos maneras:
a) Placa movilidad: en placa de Petri de 60 mmm de dimetro con agar movilidad. El
microorganismo se siembra en un extremo de la placa y luego de la incubacin se recoge
material del extremo opuesto al punto de siembra (Fig. 2)
b) Tubo de Craigie: un tubo de vidrio abierto en ambos extremos se coloca dentro de un
tubo de ensayo (13 mm x 160 mm) y se agrega agar movilidad. El microorganismo se
siembre dentro del tubo interior y luego de la incubacin se observa donde hay desarrollo
bacteriano. Las bacterias no mviles permanecern dentro del tubo interior en el sitio de
inoculacin, mientras que las bacterias mviles pueden moverse fuera del tubo y crecer en
el medio circundante (Fig. 3)
PROCEDIMIENTOS
PLACA DE AGAR MOVILIDAD
(SWARM AGAR)
TEORA / COMENTARIOS
45
LECTURA E INTERPRETACIN DE
RESULTADOS
Registrar el grado de aglutinacin de la
siguiente manera:
4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es un
lquido claro
3+: 75% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un lquido ligeramente
turbio
2+: 50% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un lquido
moderamente turbio
1+: menos de 25% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es turbio
Negativo:
ausencia
caracterizada
por
de
aglutinacin,
una
suspensin
homognea.
46
TEORA / COMENTARIOS
deteccin.
47
LECTURA E INTERPRETACIN DE
RESULTADOS
Registrar el grado de aglutinacin de la
siguiente manera:
4+: 75 a 100% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es un
lquido claro
3+: 75% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un lquido ligeramente
turbio
2+: 50% aproximadamente de
microorganismos aglutinados y el
sobrenadante es un lquido
moderamente turbio
1+: menos de 25% de microorganismos
aglutinados y el sobrenadante es turbio
Registrar los resultados negativos
opositivos para los antgenos H
estudiados, en Registro de Resultados Serotipificacin Flagelar de Salmonella
spp.
48
BIBLIOGRAFA
1. Caffer, M.I, Terragno, R., Binsztein, N. 2008. Manual de procedimientos Diagnstico
y caracterizacin de Salmonella spp. WHO Global Salm-Surv OMS/OPS
Ministerio de Salud de la Nacin. I.N.E.I. A.N.L.I.S. Dr. Carlos G. Malbrn.
2. Bonifield, H.R. and Hughes, K.T. 2003. Flagellar phase variation in Salmonella
enterica is mediated by posttranscriptional control mechanism. J. Bacteriol. 185:35673574.
49
Fecha:
Nombre:
Muestra: __________
HSA
HSB
HSC
HS1
Control
HSA
z10
Z29
HSB
e,h
e,n,x
e,n,z15
f.g
g,m
g,p
m,t
HSC
l,v
l,w
z4,z23
HS1
1,2
1,5
1,6
1,7
z6
HSA
HSB
HSC
HSD
HS1
HSA
z10
z29
HSB
e,h
e,n,x
e,n,z1
5
f.g
g,m
g,p
m,t
HSC
l,v
l,w
z4,z23
HS1
1,2
1,5
1,6
1,7
z6
Control
50
Estufa de cultivo a 37 C
Heladera a 4 C
Bao de agua a 50 C
Ansas
Tubos de ensayo
Tubos de 13x100 mm con tapa a rosca
Tubos de Craigie
Cajas de Petri de 60 mm
Lminas de vidrio de 20x20 cm
Portaobjetos
Pipetas de 5 ml
Gradillas
Mecheros
Lmparas para leer aglutinaciones
Palillos de madera
MEDIOS
REACTIVOS Y SOLUCIONES
Antisueros flagelares H
Antisueros para inversin de fase H
Solucin fisiolgica formolada al 1%
Solucin fisiolgica
CEPAS BACTERIANAS
Cepas de Salmonella spp. en agar TSA o caldo TSB, cultivos de 18-24 horas a 37C
Esquema de Kauffmann-White (Grimont,P.A.D., & Weill F-X. 2007. Antigenic formulae of
the Salmonella serovars 9 Ed, WHO Centre for Reference and Research on Salmonella,
Instituto Pasteur, Pars, Francia).
51
SOLUCIN FISIOLGICA
Se disuelve 8.5 g de cloruro de sodio en 1000 ml de agua destilada, ajustar a pH 7.0 y
autoclavar a 121C por 20 minutos.
SOLUCIN FISIOLGICA FORMULADA
Los componentes del medio son: cloruro de sodio 8,5 gr; formalina (37-40%), 10,0 ml; agua
destilada c.s.p. 1000 ml.
52
V) BIOSEGURIDAD
Los microorganismos con los que se trabajar durante el curso son patgenos humanos,
pueden causar infecciones o enfermedad, pero existen medidas teraputicas eficaces y su
propagacin es limitada. Siempre se deben utilizar prcticas de bioseguridad de nivel 2,
disponer de barreras de contencin secundarias: equipo de proteccin personal
(guardapolvos, guantes); piletas para lavado de manos; gabinetes de bioseguridad; e
instalaciones de descontaminacin de desechos. Extremar las medidas de precaucin al
manipular y transferir gran nmero de clulas.
53
12) Notificar a las personas responsables del rea o instructores de trabajos prcticos
cuando se produzcan derrames de productos qumicos o biolgicos, quienes
tomarn las medidas adecuadas segn del caso.
13) Descartar el material de vidrio roto de la siguiente forma:
Envolver los vidrios con papel, colocarlo en bolsa plstica y finalmente en un
recipiente resistente y rotulado con claridad vidrios rotos. En caso de ser material
contaminado se debe informar inmediatamente a los instructores de trabajos
prcticos.
CENTROS PARA REQUERIR AYUDA (Buenos Aires, Argentina)
1) EMERGENCIAS: S.A.M.E., telfono: 107
2) QUEMADURAS: Hospital de Quemados, telfono 4923-4082/3022
3) OFTALMOLOGIA: Hospital Santa Luca, telfono 4941-7077
4) INTOXICACIONES: Hospital Dr. P. Elizalde, Toxicologa, telfono 4300-2115
5) BOMBEROS: Servicio de Emergencias, telfono 100, Cuartel Barracas: telfono
4301-4549
El laboratorio cuenta con un botiqun de primeros auxilios con los elementos indispensables
para atender casos de emergencia. Ante cualquier duda, consulte a los instructores de
trabajos prcticos.
REFERENCIAS
Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, 3ra edicin, Organizacin Panamericana de la
Salud-OMS.
www.who.int/entity/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf
54