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Genexpression Decker & Blsi

Fragenausarbeitung SS 2013

Aslan & Prll

Diese Ausarbeitung wurde von Mustafa Aslan und Alina Prll vorbereitet.
Nachdem wir in Internet nur uralte Fragenausarbeitungen gefunden
haben, haben wir entschieden eine neue Ausarbeitung zu machen. Diese
Fragenausarbeitung beinhaltet alle fragen, die auf der stv forum stehen
aus 2002-2013. Die Fragen, die doppelt vorkommen wurde nur einmal
geantwortet. Auerdem haben wir am Ende die Krze beschreibung von
der verschiedenen molekularbiologischen Methoden aus der Decker Teil
hingeschrieben.
Fr die Beantwortung der Fragen haben wir Skript von Sonnbert aus 2008,
das Skript fr den Decker Teil (Fast wrtliche Audiomitschrift), alte
Fragenausarbeitungen von Andergassen & Wenzel und von P. Wittman,
Folien aus der Genexpression, Molekulare entwicklungsbiologie,
Epigenetics, Research topics in Molecular Microbiology, Microbial Ecology
and Immunobiology, Wikipedia, publizierte Papers aus der Nature
Reviews, der National Center for Biotechnology Information und
ScienceDirect benutzt.
Benutzung nur fr Privat zwecke!

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Fragenausarbeitung SS 2013

Aslan & Prll

5.Juli 2002
Decker
1) Isolieren eines Promotors aus Sugerzelle und Analyse desselben (notwendige Schritte in
Stichworten
Isolierung des Promotors wird durch genomische Klonierung durch Rekombinierung durchgefhrt.
(Siehe Bild) und fr die Analyse wird reporter gene assay benutzt. Promotor wird mit
Reportergene fusioniert mit der methode von transiente transfektion. Reporter gene befindet
sich nicht in der WT Zelle. Funktioniert der Promotor reportergen produziert Produkt und kann
beobachter werden(z.b.) Durch floureszieren. Zelle lysieren quantitative Bestimmung des Gel
Produkts. Beispiele : Luciferase, Chloramphenicol- Acetyltransferase, Green Flourescent Protein.

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Aslan & Prll

2) Regulation des Schilddrsenhormons TR: Struktur der DNA Bindedomne/Struktur des


TR/Dimerisierung/Mechanismus der Genaktivierung und -repression?
Struktur der Dna bindende domaene: direct repeats binden Heterodimer eines Rezeptors (z.B.
TR)
Struktur der TR :

ber den mechanismen habe ich nix in decker folien gefunden.


Blsi
3) Autoregulation von mRNA Bsp.: Transkription von rRNA/Translation von ribosomalen Proteinen
(in E. coli im Kontext mit Komponenten des Translationsapparates; Zeichnung)?

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Translationale Repressoren dienen hufig der Reglation von akzessorischen Elementen. Bsp: Gen
32 des Phagen T4 codiert fr ein Einzelstrangprotein. Dieses Gen ist auf mRNAEbene
autoreguliert. Wurden ausreichend Protein 32 Monomere erzeugt, binden diese an sogenannte
Pseudoknoten (speziell gefaltete RNA-Strukturen). Nach der Bindung an den Pseudoknoten
knnen weitere Monomere binden, bis die SD Sequenz erreicht wurde, dadurch das Ribosom
nicht mehr binden kann und die Translation inhibiert wird.

Liegt S15 in hherer Konzentration als die


der 16S rRNA vor, inhibiert es seine eigene
Translation.

4) Wirkungsweise von sRNA als translationalem Aktivator Bsp: Experiment fr Nachweis in


vitro/Nachweis in vivo?
An exogenously introduced or naturally occurring saRNA/agRNA is loaded into an Ago protein
(e.g. Ago2) where the passenger strand is cleaved and discarded, resulting in an active Ago-RNA
complex. This complex gains access to the nuclear compartment by either passive transport when
the nuclear envelope disappears during mitosis or active transport mechanisms. The complex may
then bind to (A) complementary DNA sequences or (B) nascent cognate transcripts in promoters
or 3 flanking regions and further recruit histone modifiers, leading to an open chromatin
structure and active transcription.

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In vivo: Reporter gen assay


In vtro: CHIP(?) oder Toeprinting (+RNA Ribosom bindet toeprinting signal, -RNA extension)

25.Okt 2002
Decker
5) Welche spezifischen Fragestellungen beantwortern Sie mit folgender Methodik: Nuclear run on
assay/Real time RT PCR/Southern blot/Primer extension/DNase I footprint/Hefe 2 Hybrid system
-Liegt Transkriptionskontrolle vor? Nuclear Run on Assay
-Real Time Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction kann man Analyse der
Genexpression unter verschiedenen Umwelteinflssen durchfhren und die Produkt Menge
echzeitig quantitativ bestimmen ( RNA wird in DNA umgeschreiben und danach Amplifiziert)- Wie
beinflusst die externale Faktoren die mRna produktion in der Zelle?
-Southern Blot: Sie ermglicht den Nachweis einer Gensequenz in einem komplexen DNAGemisch. Liegt ein bestimmes Gensequenz vor?
- DNA Footprinting: Wo binden die Transkriptionsfaktoren?

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-Hefe 2 Hybrid system: Gibt es eine Interaktion zwischen zwei Proteine ? (z.b. TF mit einer
anderen Protein)
6) Welche Mechanismen zum Abschalten eines Gens auf Ebene der Transkription kennen Sie in
pro- und eukaryoten Organismen? (in Stichworten beantworten und Beispiele nennen)

a. Repressor bindet an den Operator.(LacI)


b. Repressor verhindert die initiation durch RNApolymerase (Spx)
c. Repressor bindet an die Activator verhindert damit die Aktivitaet von Aktivator (WNT signal ketteGSK3 zu -Catenin )
d. Rekrutierung der Histon Deacetylases Repression der Genexpression (in Eukaryotische Genome)
e. Histon Methylierungen durch Histon Methyltransferases Repression der Genexpression (Auf H3
K9, H3 K27, H4 K20 von Eukaryoten)
Blsi
7) Welche Parameter beeinflussen die Stabilitt von mRNA in Prokaryoten? Wie knnen Sie
nachweisen, ob ein Transkript in Bakterien vom 5 bzw. vom 3 Ende her abgebaut wird?
stem-loop am 3Ende erhht Stabilitt
je lnger der Poly-ASchwanz desto leichter wird mRNA abgebaut
Stabilitt steigt
mit der Translationsrate
wenn Ribosomen lnger an mRNA gebunden sind steigt Stabilitt

Es werden mRNAs mit einer Mindestlnge von 2knt bentigt, da krzere mRNAs zu
schnell abgebaut werden.
Es werden Sonden synthetisiert, die entweder an das 3' oder das 5' Ende einer mRNA
binden, bevor diese abgebaut werden.
Um eine Aussage ber den Abbau von mRNA zu machen, muss die Transkription
vollstndig gestoppt werden, damit keine neue mRNA mehr produziert wird. Zu diesem
Zweck wird Rifampicin verwendet.
Zu Zeitpunkt 0 wird Rifampicin hinzugefgt
Zu spteren Zeitpunkten (t=0, t=1, t=2, etc) wird die Gesamt-mRNA extrahiert und auf
ein gemeinsames Gel in verschiedenen Banden aufgetragen. Mittels Sonden die an den
Enden der mRNA binden sieht man, dass die Menge der mRNA mit fortschreitender Zeit
abnimmt.
Fgt man einer Probe Sonden dazu die entweder nur am 3' oder nur am 5' Ende binden,
sollte man nach einiger Zeit das Signal nicht mehr erhalten, von dem Ende her die mRNA
abgebaut wird, da diese Enden schlicht und ergreifend (schluchz) bereits abgebaut
wurden.
8) Wie wrden Sie nachweisen, ob ein Protein, das Sie augereinigt haben, als RNA Chaperone
fungiert?
Das Toeprint-Signal sollte immer geringer, je mehr Protein hinzugefgt wird dh.: Protein das RNAChaperon hindert Ribosomen bei der Bindung an die mRNA (wenn es funktionell ist).
Es sind 2 Mglichkeiten denkbar:
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a) Protein besetzt RBS


b) Protein verndert Konformation der mRNA
- Zunchst wird ein Toeprint Assay mit der mRNA durchgefhrt, indem der mRNA radioaktiv
markierte Primer und reverse Transkriptase hinzugefgt werden. Man erhlt ein Toeprint Signal,
das die Bindung der 30S UE an die mRNA wiederspiegelt.
- Weiters wird die mRNA mit dem Protein (Hfq) versetzt. Hfq wird anschlieend mittels Proteinase
K wieder abgebaut und in Folge ein Toeprint Assay durchgefhrt. Das Signal unterscheidet sich
vom ersten Versuch, die 30S UE konnte trotz Abbau von Hfq nicht an die mRNA binden, demnach
verndert Hfq dauerhaft die Konformation der mRNA.
- Um diese Erkenntnis abzusichern, wird eine durch Hfq in ihrer Konformation vernderte mRNA
erhitzt (80) und langsam abgekhlt, wodurch mgliche Sekundrstrukturen aufgelst werden. Im
Anschluss wird wieder ein Toeprint Assay durchgefhrt. Das Signal ergibt, das die 30S UE an
mRNA binden kann. Damit steht fest, dass Hfq die Struktur von mRNA verndert und nicht durch
Bindung an die mRNA Translation verhindert.

3.Okt 2003
Decker
9) Erklren sie die begriffe positive und negative regulation der transkription & nennen sie je ein
beispiel!
Negative Regulation bedeutet, dass ein Gen im Normalzustand (by default) angeschaltet ist,
d.h. um es abzuschalten muss man die Transkription aktiv verhindern. Die RNA-Polymerase kann
also ungehindert an den Promoter dieses Gens binden, um das zu verhindern muss ein Protein
gebildet werden, das als Repressor wirkt. So ein transkriptioneller Repressor verhindert, dass die
RNA-Polymerase dieses Gen transkribieren kann. Z.b. Lac Operon

Bei der positiven Regulation ist es umgekehrt, d.h. das Gen wird im Normalzustand nicht
transkribiert, wenn man es anschalten mochte muss ein transkriptioneller Aktivator gebildet
werden. Z.b. Transkriptionfaktor MerR bei der Anwesenheit der Quecksilber wirkt als Aktivator
fr das Gen merT

10) Inwiefern unterscheiden sie die drei eukaryontischen rna-polymerasen (struktur,


biochemische funktion, promoterstrukturen...)
Aufbau:
Die Domaene,die in allen 3 eukaryotischen Polymerasen gefunden wurden, sind bei den grosen
Untereinheiten L und L' (L large). Die L'-Untereinheit der RNA-Polymerase II hat eine zusatzliche
Struktur, die als carboxyterminale Domane bezeichnet wird, ist aber trotzdem mit den anderen
verwandt.Es gibt in Eukaryoten-Polymerasen auserdem auch -ahnliche Untereinheiten.
Zusatzlich zu diesen 4 Untereinheiten, die denen der E. coli-Polymerase homolog sind, besitzen
alle3 eukaryotischen RNA-Polymerasen die gleichen 6 Untereinheiten plus eine variable Anzahl
unterschiedlicher individueller Enzym-spezifischer Untereinheiten (Pol I: +5, Pol II: +4, Pol III:+7),
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durch die sich die 3 Polymerasen unterscheiden. Diese Gemeinsamkeiten und Unterschiede
wurden durch elektrophoretische Auftrennung der Untereinheiten festgestellt. Abgesehen davon
lassen sich die Polymerasen aber auch aufgrund ihrer Lokalisation identifizieren (Pol I: Nucleolus,
Pol II & III: Nucleoplasma; im Nucleolus befinden sich die Gene, die fur dieribosomale RNA
codieren). Auserdem unterscheiden sie sich in ihrer Sensitivitat gegenuber dem Gift des
Knollenblatterpilzes, -Amanitin, das eukaryotische RNA-Polymerasen inhibiert. Diese wird als
der IC50-Wert ing/mL angegeben. Der IC50-Wert (IC inhibitory concentration; IC50 halfmaximalinhibitory concentration) ist jene Konzentration, bei der die Polymerase-Aktivitat, also
dieFahigkeit zu transkribieren, zu 50% inhibiert wird (Pol I: >1000 g/mL, Pol II: 0,01-0,05
g/mL,Pol III: 10-25 g/mL).
Ein weiteres Mittel zur Unterscheidung der 3 Polymerasen ist der Bedarf zweiwertiger positiver
Ionen wie Mn2+ oder Mg2+. Es wurde festgestellt, dass die Polymerase II im Gegensatz zu Pol I
und III ein relativ hohes Mangan-zu-Magnesium-Verhaltnis bevorzugt. Im Molekulkomplex finden
sich grundsatzlich die gleichen Strukturelemente wie in der E. coli-Polymerase.
Die RNA-Polymerase funktioniert nicht ohne zweiwertige Ionen, im katalytischen Zentrum ist vor
allem Mg2+ gebunden, wo es fur die Bindung der Ribonucleotidtriphosphate gebraucht wird, an
anderer Stelle werden Zn2+-Ionen benotigt, wobei der Grund dafur noch nicht bekannt ist, es
scheint aber essentiell zu sein, da die Polymerase ohne Zink nicht funktioniert.
Promotoren:
Fur die RNA-Polymerase I, die vor allem die ribosomalen RNAs synthetisiert, enthalt derPromoter
einen sogenannten Core-Promoter, der die Bindungsstelle fur die Polymerase enthalt, undeine
einzige Upstream Regulatory Sequence (URS). Es handelt sich also um einen relativ
einfachstrukturierten Promoter.
Fur die RNA-Polymerase II, enthalt der Promoter neben der Polymerase-Bindungsstelle
einigeproximale und distale regulatorische Sequenzen. Diese weit vom Transkriptionsstart
entferntendistalen regulatorischen Sequenzen werden auch als Enhancer der Transkription
bezeichnet. Die Promotor enthaelt ein TATA- BOX.
Die RNA-Polymerase III hat nicht nur einen, sondern drei unterschiedliche Promotoren. Dabei gibt
es welche, die sehr ahnlich aussehen wie die der Polymerase II, die also auch distale EnhancerElemente und proximale Bindungsstellen fur Regulatoren neben dem Transkriptionsstart selbst
enthalten. In vielen Fallen enthalten sie wie die Promotoren der Pol II auch eine TATA-Box, die
war nicht wie bei Prokaryoten im -10-Bereich des Transkriptionsstarts, aber durchaus in dessen
Nahe liegen.

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Aslan & Prll

Blsi
11) a) Erklren sie die funktionen von ncRNAs (non coding RNAs) bei Pro- und Eukaryonten und
nennen sie beispiele !
Quelle: Nature reviews about genetics !
siRNAs(translational repression),saRNAs(translational aktivation),miRNAs(meistens Translational
repression mRNA destabilization),casiRNAs(Target mrna cleavage),tasiRNAs (Target mrna
cleavage),natsiRNAs( Target mrna cleavage),casiRNAs(histon modifications)
Funktionen :
Stimulation of translation
Endonucleolytic cleavage
Deadenylation and degradation
Inhibition of translation initiation
Inhibition after translation initiation
DNA methylation(casiRNAs are the most abundant endogenously produced siRNAs in plants)

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Histone modification at homologous loci (casiRNAs are the most abundant endogenously produced siRNAs

in

plants)

b) erklren sie, wie sie nachweisen knnen, ob eine ncRNA als translationaler repressor dient?
Reporter gene assay mehr ncRNA weniger endprodukt
28. Nov. 2003
Decker
12) Wie fhrt man eine Chromatin Immunoprzipitation (ChIP) durch? Welche Frage versucht
man mit einem ChIP Experiment zu beantworten?
Man beantwortet die Frage -Wie kann man feststellen, welches Chromatin an welcher Stelle wie
modifiziert ist?
Die Chromatin-Immunprazipitation (ChIP), die es erlaubt, dieInteraktion von Proteinen mit
Chromatin und die Modifikation von Proteinen, die Teile des Chromatins sind, also z.B. die
Histone, zu analysieren.
Der erste Schritt dabei ist die mechanische Zerkleinerung des isolierten Chromatins, damit es
experimentell handhabbar wird. Das wird meist dadurch erreicht, dass das Chromatin in ein
Ultraschallbad gegeben wird, wo es durch den Ultraschall mechanisch in Stucke zerkleinert wird,
die je nach Behandlung einige 100 bp gros sind.
Damit sich die Histone nicht von der DNAlosen konnen, wird im Vorfeld Crosslinking
durchgefuhrt, also eine chemische Quervernetzung eingebracht.
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Als nachstes wird ein Antikorper benotigt, der in der Lage ist, die gesuchte Modifikation am
untersuchten Histon zu erkennen. Ist die gesuchte Modifikation vorhanden, bindet der Antikorper
und man kann den Antikorper samt dem daran gebundenen Chromatinfragment
immunprazipitieren. Das bedeutet, dass man den Antikorper an kleine Sepharose-Stuckchen, also
an eine relativ schwere Matrix, so dass man dann diesen Komplex aus Sepharose-Kugelchen,
Antikorper und Chromatinfragment einfach abzentrifugieren kann. So konnen die
Chromatinfragmente, wo die gesuchte Modifikation vorhanden ist, von denen, wo dies nicht der
Fall ist,
getrennt
werden.
Der
nachste
Schritt ist
die

Reversion des Crosslinkings, die chemische Bindung, die die DNA an das Histon koppelt, wird also
aufgelost, so dass man die DNA erhalt, die mit dem modifizierten Chromatin assoziiert war. Nun
kann man mithilfe von PCR den Nachweis durchfuhren, ob z.B. ein bestimmter Bereich der DNA in
diesem modifizierten Chromatin vorlag. Dieses Verfahren kann mit Antikorpern durchgefuhrt
werden, die die verschiedensten Histon-Modifikationen erkennen.

13) Skizzieren Sie den Mechanismus der Aktivierung des Enzyms Adenylatcyclase durch GProteingekoppelte Hormonrezeptoren.Welche weiteren Proteine und Mechanismen fhren zur
nderung der Genexpression durch die Aktivitt der Adenylatcyclase?
Ich habe die antworten zu dieser Fragen nicht in lern dokumente gefunden.

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14) Wie knnen Sie Interaktionen zwischen den verschiedenen eukaryontischen


Initiationsfaktoren nachweisen? (2 Methoden / Skizze)

- Yeast-Two-Hybrid Technology
Zu der untersuchende Transkriptionsfaktor wird als Bait Domane eingestezt und die wird mit
GAL4-DBD fusioniert. GAL4-TAD domaene wird mit einem Protein(als Fish domaene) fusioniert,
dass eine Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor eingehen kann fusioniert. Kommt es danach
zur expression des Histidin gens in der Hefe Zellen, gab es eine Interaktion zwischen den beiden
Proteinen.
Kennt man nicht das Protein, das mit dem transkriptionsfaktor interagiert, verwendet man als Fish
Domane eine ganze bibliothek von cDNAs. Wir haben immer das gleiche Bait Hybrid protein
aber unterschiedliche Fish hybrid Protein. Es wachst nur wenn die Fish und Bait domaene
miteinader interagieren. Fish Protein kann ber sequenz analyse identifiziert werden.

- Immunprzipitation (AK gegen zB. die 11 Proteine des eIF3 zu Zellextrakten geben, durch
Kgelchen die gebundenen Proteine przipitieren und am Gel auftrennen, danach die Stcke
ausschneiden und durch Massenspektrometrie analysieren)

15) Skizzieren Sie die Unterschiede zwischen dem Typ I und dem Typ II Protein-Exportsystem bei
Gram-negativen Bakterien!
ber diese Systeme wird in der Genexpression nicht mehr gefragt. Der Antwort steht auf der
Sonnbert skript Seite 208 !

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19.Mrz 2004
Decker
16) Beschreiben Sie kurz den Aufbau eines Nukleosoms (Skizze!)
- Beschreiben Sie die Aktivitt des chromatin remodelling complexes
- Was hat die (De-)Acetylierung der Histone zur Folge?
Nucleosomen bestehen aus einem Histonoctamer also
aus 8 Histonen, wovon je zwei immer gleich sind, es
besteht also aus 4 unterschiedlichen Histonen, die alle
zweimal vorkommen. Die Histone sind miteinander
verwandt und haben eine Struktur, die als Histone Fold
bezeichnet wird. Die Grundstruktur der Histone ist also
immer gleich, sie unterscheiden sich voneinander durch
ihre langen, relativ unstrukturierten N-Termini, die sehr
wichtig fur Histonmodifikationen sind. Das Histonoctamer
besteht eigentlich aus einem H3/H4-Tetramer, die zweite
Grundstruktur ist ein H2A/H2B-Dimer. 2 dieser Dimere
und 1 dieser Tetramere bilden das Histonoctamer, was in
einem regulierten Vorgang geschieht. Zunachst werden
das Tetramer und die beiden Dimere gebildet, dann wird
zuerst das Tetramer in die DNA eingelagert, die sich schon
darum wickelt, und schlieslich kommen die beiden Dimere
dazu und das Nucleosom ist vollstandig assembliert.H1
korreliert damit, dass eine kompaktere nucleosomale
Struktur gebildet wird. Deactylierung der Histone bewirkt
fr die negativer Genregulation.
Man hat zunachst eine nucleosomale DNA, an die der
Remodeler gebracht wird und kann jetzt Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen durch
Repositioning (Sliding), Nucleosome Ejection oder Unwrapping freilegen. Bei Nucleosome
Ejection wird tatsachlich ein Nucleosom vollstandig entfernt, beim Unwrapping wird die DNA ein
wenig vom Nucleosom weggedreht, so dass sie fur Transkriptionsfaktoren zuganglich wird
(Rotational Positioning). Es gibt aber auch noch die Moglichkeit, variante Histone einzubringen,
die oft andere Eigenschaften haben, es handelt sich dabei also um einen
Regulationsmechanismus. Auserdem konnen Dimere aus einem Histonoctamer herausgenommen
werden, so dass das Octamer auf diese Weise nicht ganz zerstrt wird. Fr Chromatin Remodiling

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wird ATP als Energiequelle benutzt.

17) Skizzieren Sie den kompletten Initiationskomplex bei Transkription durch RNA Polymerase II!
Welche dieser Proteine assoziieren mit DNA-bindenden Faktoren?
Das erste, das stattfinden muss, ist die Bindung
von TFIIDan den Initiationsstart, dabei ist die
TATA-Box nur eine von mehreren Moglichkeiten
TFIID an de Promoter zu bringen. Wenn TFIID an
die TATA-Box bindet, tut er dies mithilfe seiner
Untereinheit TBP. Das nachste, das gebunden
werden muss, ist das TFIIA, das die Bindung von
TFIID an die DNA stabilisiert, dann folgt TFIIB, der
sozusagen die Brcke zur RNAPolymerase
schlagt, da er auf der einen Seite mit TFIID und
auf der anderen Seite mit der RNA-Pol
interagieren kann. An die RNA-Polymerase ist
ein weiterer genereller Transkriptionsfaktor
permanent assoziiert, namlich das TFIIF. Wenn
das gebunden ist, binden TFIIE und TFIIH, was
den Initiationskomplex komplettiert.

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2. Juli 2004
Decker
18) Yeast 2 Hybrid System
a) am Beispiel c-Fos---c-Jun skizzieren, wie schauen die Fusionsgene aus?
b) Kann man mit Y2H Interaktion von STATS nachweisen + Begruendung?
a)Bait: cFos
Prey: Cjun

b)Nein: Die Konsequenz der Tyrosin-Phosphorylierung ist in diesem

Fall keine Anderung des transaktivierenden Potentials dieser Transkriptionsfaktoren,


sondern die Dimerisierung und damit die Fahigkeit in den Zellkern zu gelangen.
19) a) Wie bzw von welchem Co-Faktor wird CREB aktiviert + von welchem Pathway stammt das
Signal?
b) welcher Co-Aktivator ist erforderlich + wie wirkt dieser?
a)Katalythische Untereinheiten von PKA phophoryliert CREB und damit aktiviert es, das signal
stammt aus G Protein cAMP pathway
b)CBP/p300 ist der co Aktivator. Bei diesen Coaktivatoren handelt es sich um HistonAcetyltransferasen (HATs), die dann ber Histon-Modifikation und eventuell auch andere
Aktivitten fr das Transkriptionsereignis sorgen

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Blsi
20) Wie kann man Interaktion zwischen SD und anti-SD nachweisen?
a) genetischer Ansatz
b) biochemischer Ansatz
Genetischer Nachweis durch komplementre Mutationen
Zum Nachweis der direkten Interaktion von SD und Anti-SD wurde eine komplementre Mutation
in vitro durchgefhrt. Es wurde das rru-Operon auf ein Plasmid kloniert. Dabei wurde die Anti-SD
Sequenz der 16S rRNA zu einer SD Sequenz verndert. E.coli besitzt sieben Operons fr die
Transkription von rRNA, es sollen aber nur die durch das Plasmid eingebrachten rRNA Transkripte
funktionsfhig sein. Zu diesem Zweck wurde ein weiterer Basenaustausch auf der 16S rRNA des
Plasmids vorgenommen (Mutation C U an Position 1192). Dieser vermittelt eine Resistenz
gegen Spectinomycin. Abschlieend wurde dem Plasmid ein Reportergen (hGH, menschliches
Wachstumshormon) mit einer eine Anti-SD Sequenz hinzugefgt.
Wurden Reportergen mit Anti-SD Startsequenz und 16S rRNA mit SD Sequenz und
Basenaustausch wt E.coli eingebracht und diese auf Medium mit Spectinomycin gezchtet, so
erhielt man das Hormon. Durch das Spectinomycin waren nur die eingebrachten Ribosomen
funktionsfhig, weiters konnte die SD Sequenz auf der 16S rRNA mit der Anti-SD Sequenz des
Reportergens interagieren und Translation
stattfinden

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Biochemischer Nachweis durch chemical Probing


Ausreichender Menge mRNA und 30S UE vermischt, es bilden sich Komplexe durch Bindung der
SD+ Anti-SD Sequenzen auf 30S UE und mRNA. Anschlieend werden Reagenzien hinzugefgt, die
nur ungepaarte Nucleotide modifizieren knnen Modifizierung: DMS A, CMTC U, Kethocal G
.An der Stelle an der mRNA und 30S einen Komplex bilden kann die mRNA nicht modifiziert
werden.
Werden anschlieend die Komplexe getrennt und zur mRNA Primer und Reverse Transkriptase
hinzugefgt, erhlt man je nachdem wo die Transkriptase durch eine zufllige Basenmodifikation
abbrechen muss, unterschiedlich lange Stcke cDNA. Wird die cDNA auf einem Gel ausgewertet,
erhlt man durch die unterschiedliche Lnge eine Vielzahl an Banden, allerdings wird sich keine
Bande an der Position der SD Sequenz finden, da hier die Reagenzien niemals modifizieren
konnten und die Reverse Transkriptase daher hier auch niemals abbrechen musste.

21) 2 Experimente skizzieren zum Nachweis dass ein Protein als translationaler Repressor wirkt

1.Methode :Reportergen-Assay : mRNA fusioniert an Reportergen auf Plasmid in die Zelle, Zugabe
von Repressor ( Ligand)Vernderung oder nicht
2.Methode: Durch in-line probing kann man das Umfalten durch die Prsenz des Liganden
nachweisen. RNA hat die Tendenz, ber lngere Zeit hinweg zu degradieren, und zwar in den
unstabileren, einzelstrngigen Bereichen. Markiert man die RNA (zB. radioaktiv), kann man sie
nach einer gewissen Degradationszeit (manchmal Tage) durch Gelelektrophorese trennen und
sieht als Banden jene Bereiche, die ungepaart waren. Gibt man zuvor einen Liganden
(repressor) hinzu, werden sich die Bereiche, in denen der Ligand bindet, ebenfalls nicht auflsen,
man erhlt eine Art Footprint im Gel (dort, wo keine Hydrolyse stattgefunden hat).

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24. Sep 2004


Decker
22) a) Was sind die speziellen Funktionen von TFIIH Komplexen?
b) Welche Proteinkomplexe vermitteln die Interaktion zwischen RNA-Polymerase II und
Transkriptionsfaktoren, die spezifische Bindungsstellen eines Promotors erkennen?
a)Phosphorylierung des CTD von Polymerase TFIIH enthlt also eine enzymatische Aktivitt,
nmlich die einer Proteinkinase, genauer gesagt einer Serin/Threonin-Kinase. TFIIH existiert in
zwei strukturell unterschiedlichen Formen, einer, die fr die Initiation der Transkription bzw. die
Promoter Clearance wichtig ist, und einer, die wichtig fr die DNA Reparaturfunktion ist.
TFIIH ist nicht nur fr die Phosphorylierung der RNAPolymerase, sondern durch seine HelicaseFunktion auch bei der Strangtrennung im Initiationsbereich wichtig. Das Core des Enyzms
beinhaltet also die Helicase-Funktion, die sowohl bei der Promoter Clearance als auch bei der
DNA-Reparatur bentigt wird, bei der Clearance braucht man aber auch die Kinasefunktion, die
spezifisch zum Core hinzukommt. Die Core-Untereinheit assoziiert mit der Kinasefunktion, um den
Clearance-Komplex zu bilden.(Die Kinasefunktion besteht aus den drei Proteinen CDK7, Cyclin H
und MAT1)
Wenn bei der Transkription eine Schdigung der DNA auftritt und die RNA-Polymerase
deshalbpausieren muss, bindet der TFIIH-Reparaturkomplex und hilft bei der Reparatur
b) Mediator Protein komplexe

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23) Welche enzymatischen Aktivitten von Zelloberflchenrezeptoren kennen Sie (Beispiele)? Wie
sind die Signaltransduktionswege beschaffen, die diese enzymatische Aktivitt letztlich in
vernderte Genexpression bertragen (jeweils ein Beispiel in Form einer Skizze!)?
Im prinzip siehe spatere frage ber den Pathways. Die Frage ist in dieser Form zu lang und es ist
unwahrscheinlich, dass die immer noch so gefragt wird.

Blsi
24) Wie wird Selenocystein in die wachsende Proteinkette inseriert? (Skizzen)
Alle Proteine, die Selenocystein beinhalten, haben ein Stop-Codon im Reading-Frame. Das weist
darauf hin, dass der Einbau von Selenocysteine durch eine spezielle tRNA passiert, die ein StopCodon erkennen (und natrlich Selenocystein binden) kann.
Man braucht neben der tRNA auch ein Signal, das der Zelle sagt, dass an dieser Stelle kein StopCodon liegt, sondern ein Selenocystein eingebaut werden soll (sonst wrde statt jedem StopCodon ein Selenocystein eingebaut werden).
Dieses Signal ist ein Selenocysteine-Insertion-Element (SECIS). Dieses wird von SelB (einem GTPbindenden Protein) erkannt, welches dann die tRNA an dranhngt. Diese kann dann ans Ribosom
andocken und Selenocystein ins Protein eingebaut werden.
In Bakterien kommt das Stop-Codon nach dem Element, in Archaea und Sugetieren davor.
SelB homolog zu EF-Tu. Es kann nur die Selenocystein tRNA binden, bindet sich dann ans Ribosom
und interagiert gleichzeitig mit dem Erkennungselement am 3Ende der mRNA.

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19.Nov 2004
Decker
25) a) Welche Phasen lassen sich bei der Initiation der Transkription unterscheiden (in
Stichworten)?
b) Lsst sich das Auffinden eines Promotors durch RNA Polymerase durch freie Diffusion
beschreiben? Welche alternativen Erklrungen kommen in Frage?
c) Wie beeinflusst der Sigma-Faktor die Assoziation der prokaryoten RNA Polymerase mit
Promotoren?
a) Nach der Assemblierung der generellen Transkriptionsfaktoren, der RNAPolymerase und dem
Mediatorkomplex zum (Pr-)Initiationskomplex (Preinitiation Complex, PIC) kommt es zur ffnung
des Promoters (Promoter Melting), also zur Bildung der Transcription Bubble, dann zur Promoter
Clearance und schlielich zur Elongation
b)Die Theorie der direkten Diffusion der Polymerasen an den Promoter ist also falsch und auch die
ursprngliche Vorstellung, dass die RNA-Polymerase, wenn sie an DNA gebunden ist, an dieser
entlangwandert bis sie den nchsten Promoter findet.
Das der Wahrscheinlichkeit am nchsten kommende Modell ist, dass die RNA-Polymerase zuerst
einmal zur DNA hindiffundiert, aber zu irgendeiner DNA, nicht direkt zur Promoter-DNA. Dann
folgt random displacement between DNA, d.h. die RNAPolymerase hpft sozusagen auf der
DNA von Stelle zu Stelle. Das wird mglich, da die DNA in der Zelle ja nicht als linearer langer
Strang vorliegt, sondern fest aufgefaltet ist. Wenn nun durch diese Auffaltung DNA-Bereiche
aneinander kommen, kann die RNAPolymerase das bentzen, um auf den nchsten DNA-Bereich
zu springen. Dies geschieht so lange bis die RNA-Polymerase tatschlich einen Promoter findet.
Mathematisch konnte gezeigt werden, dass mit diesem Modell die Wahrscheinlichkeit gro genug
ist, dass Polymerasen in einem vernnftigen Zeitraum einen Promoter finden.
c) Der -Faktor hat also offensichtlich nichts damit zu tun, ob ein Transkript gebildet werden kann,
aber offensichtlich sehr viel damit, ob ein Promoter gefunden werden kann. Bei Assoziation des Faktors kann eine Polymerase sehr schnell einen Promoter finden bzw. feststellen, ob die DNA, an
die sie durch ihr Herumspringen geraten ist, eine Promoter-Sequenz ist oder nicht. Das
funktioniert nur als Holoenzym.
26) Erklren Sie, wie entfernt von der Initiationsstelle der Transskription bindende
Transkriptionsfaktoren die Bindung der RNA Polymerase beeinflussen knnen.
Enhancer regulieren die Initiation der Transkription, also die Bindung der Polymerase, oder auch
das In-Bewegung-Setzen der Polymerase. Diese Regulatoren knnen nun proximal oder distal
binden, wobei es sich eingebrgert hat die distalen regulatorischen Bindungsstellen als Enhancer
zu bezeichnen, da dort Proteine binden, die auf irgendeine Weise das Transkriptionsereignis
positiv beeinflussen knnen, also positive Regulation darauf ausben. Es handelt sich dabei um
eine historische Bezeichnung, die Effekte der proximal bindenden Transkriptionsfaktoren
unterscheiden sich nicht zwangslufig von denen der an die Enhancer bindenden Faktoren.

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27) Beschreiben Sie 2 experimentelle Anstze, die zur Aufklrung des genetischen Codes gefhrt
haben (1,5P). Durch welche Mechanismen kann es whrend der Translation zu "Recoding"
kommen, d.h. zu einer nicht ko-linearen Translation des genetischen Codes (1,5P).
1. Experiment: Um den Code zu entschlsseln, haben sie knstlich mRNA hergestellt, diese in E.
Coli Cytoplasma mit der notwendigen Translationsmaschinerie gegeben und nachgesehen, welche
Aminosuren gemacht werden.Poly U, bzw. das Triplet UUU war das erste Codon, das identifiziert
worden ist (codiert fr Phenylalanin).
2. Experiment: RNAs bindet nur an Filter, wenn sie an Proteine gebunden sind.
Er hat verschiedene tRNAs isoliert und das Ribosom hinzugegeben. Wenn sie durch den Filter
durchgewaschen werden konnten, hatten sie nicht gebunden. Wenn die Triplets an die mRNA
gebunden hatten, wusste man, dass es sich um ein Codon handelt. Auf diese Weise wurde der
Code aufgeklrt.
Recoding:
nderung des genetischen Codes. Statt des normalen Decodings werden Frame-Shifts
ausgelst, oder auch ber ein Stopp-Codon oder einen Block von noncoding RNA hinweggelesen.
Recoding dient der Regulation von Genprodukten, so kann zB. ein Decoding- und ein RecodingProdukt aus einer Matrize gebildet werden. Z.b. Programmed Frame-Shifting oder leaky
Scanning

21. Jan 2005


Decker

28) Aktivierung von Adenylalcyclatase, welche andere Genexpressionswege werden auch


durch Adenylatcyclatase aktiviert?
Adenylylcyclasen (AC), frher Adenylatcyclasen, zhlen zur Klasse der Lyasen, d. h.
moleklspaltender Enzyme.
Bei hheren Organismen sind sie wichtige Vermittler zwischen Hormonen oder anderen
Botenstoffen, die an der Auenseite der Zellmembran binden, und zellinternen Botenstoffen
(Second Messenger, sekundrer Botenstoff), die innerhalb der Zelle die Wirkung dieser
Hormone weiterleiten.
Beim Vorgang der Signaltransduktion bindet zunchst das Hormon an einen passenden G-Proteingekoppelten Rezeptor. Dieser setzt das entsprechende G-Protein frei, welches seinerseits die
Adenylylcyclase aktiviert. Diese bildet nun im Innern der Zelle den sekundren Botenstoff
cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) aus Adenosintriphosphat (ATP).
z.b. G protein cAMP pathway und Creb TF (siehe Frage 23 darber)

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29) skizze wie translation in eukaryonten von CAP abhngig ist, wie knnen viren dies zerstren?
Usually, in eukaryotes, translation can be initiated only at the 5' end of the mRNA molecule, since
5' cap recognition is required for the assembly of the initiation complex. The protein factors bind
the small ribosomal subunit (also referred to as the 40S subunit), and these initiation factors hold
the mRNA in place. (eIF4A, eIF4E ,eIF4G, eIF4G, eIF4F, eIF3 )

An internal ribosome entry site, abbreviated IRES, is a nucleotide sequence that allows for
translation initiation in the middle of a messenger RNA (mRNA) sequence as part of the greater
process of protein synthesis. IRES are often used by viruses as a means to ensure that viral
translation is active during periods of time when host translation is inhibited. These mechanisms
of host translation inhibition are varied, and can be initiated by both virus and host, depending on
the type of virus in question. However, in the case of most picornaviruses, this is accomplished by
the viral protease cleaving eIF-4G so that it cannot interact with eIF-4E. Interaction between these
two initiation factors is necessary for mRNA 5'cap to 3'poly-A-tail loop formation, which is usually
a necessary event for initiation of translation. The virus may even use the eIF-4G to aid in
initiation of IRES-mediated translation.

13.Mai 2005
Decker
30) DNA Microarray (in Stichworten Ablauf). Was sind die Vorteile gegenber anderen Methoden?
A DNA microarray (also commonly known as DNA chip or biochip) is a collection of microscopic
DNA spots attached to a solid surface. Scientists use DNA microarrays to measure the expression
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levels of large numbers of


genes simultaneously or to
genotype multiple regions of
a genome. Each DNA spot
contains picomoles (1012
moles) of a specific DNA
sequence, known as probes
(or reporters or oligos). These
can be a short section of a
gene or other DNA element
that are used to hybridize
cDNA or cRNA (also called anti-sense RNA) sample (called target) under high-stringency
conditions. Probe-target hybridization is usually detected and quantified by detection of
fluorophore-, silver-, or chemiluminescence-labeled targets to determine relative abundance of
nucleic acid sequences in the target.
Advantages of the DNA Microarray:
Provides data for thousands of genes
One experiment instead of many
Fast and easy to obtain results
Different parts of DNA can be used to study gene expresion
31) 3 verschiedene Mechanismen der positiven Transkriptionskontrolle durch
Transkriptionsfaktoren?
Die generellen Transkriptionsfaktoren sind daran beteiligt, einen Komplex zu bilden, mit dessen
Hilfe man die RNA-Polymerase an einen Promoter binden kann. Die eigentlichen
Transkriptionsfaktoren beeinflussen entweder die Frequenz, mit der dieser Initiationkomplex
gebildet wird, oder sie beeinflussen die Rate, mit der eine bereits gebundene RNA-Polymerase in
der Lage ist, die Transkription tatschlich zu starten.
Detalierter:
Ein Transkriptionsfaktor kann:
Er kann z.B. ganz direkt Kontakt mit Komponenten des Initations Complex aufnehmen und so
die Bindungdes IC frdern oder verhindern.
Er kann auch andere Faktoren, die dann Cofaktoren oder Coaktivatoren genannt werden,oder
auch weitere Transkriptionsfaktoren dazu bentzen, Kontakt herzustellen. In diesem Fall findet
der entscheidende Kontakt mit der Elongations- oder Initiationsmaschinerie nicht durch den
Transkriptionsfaktor selbst statt, sondern ber Cofaktoren oder weitere Transkriptionsfaktoren.
Es kann auch die CTD-Phosphorylierung und damit die Elongation beeinflusst werden.

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Transkriptionsfaktoren knnen auerdem sehr indirekt auf diese Vorgnge Einfluss nehmen, in
dem sie die Chromatinstruktur eines Promoters so verndern, dass dieses Chromatin entweder
transkriptionsfreundlich oder transkriptionsunfreundlich wird.Transkriptionsaktivatoren
regulieren es zur Transkriptionsfreundlichkeit.
20.Jan 2006
Decker
32) Skizzieren Side die Ereignisse die von der Bindung eines Wachstumsfaktors (z.B.: EGF) an
seinen Rezeptor zur Induktion von Genexpression fhren. Benennen Sie Komponenten und
relevante Modifikationen die an der Signaltransduktion beteiligt sind.
Keine antwort dazu gefunden.

33) Worin unterscheiden sich Nucleosomen und Enhancosomen? Welche funktionelle Bedeutung
hat die Bildung des Enhancosoms?
Ein weiterer wichtiger
Begriff im
Zusammenhang mit
Chromatin ist das
sogenannte
Enhanceosom. Ein
Enhanceosom kann man
sich so vorstellen, dass
dabei ein PromoterNucleosom durch einen
sehr komplexen und
umfangreichen Komplex
aus
Transkriptionsfaktoren
ersetzt wird. Ein konkretes Beispiel hierfr ist das Interferon -Gen, das ein immunologisch
wichtiges Gen ist, das in viral infizierten Zellen zur Expression kommen muss, um fr antivirale
Immunitt zu sorgen. Dass es zur Expression kommt hngt damit zusammen, dass an seinem
Promoter ein sogenanntes Enhanceosom gebildet wird.
Beim Enhanceosom erfolgt die Aktivierung des Promoters in einer Reihe von klar
definiertenSchritten. Zunchst wird das Enhanceosom anstelle eines Promoter-Nucleosoms
gebildet. Nun ist die Voraussetzung fr die vollstndige Remodellierung des Promoters gegeben,
der vollstndige Initiationskomplex einschlielich aller basalen Transkriptionsfaktoren kann
gebildet und die Clearance und nachfolgend die Elongation knnen durchgefhrt werden

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34) Wie knnen Sie mit Hilfe einer molekularbiologischen Methoden nachweisen wo der
prokaryotische Initiationsfaktor IF1 an die kleine ribosomale Untereinheit bindet (Zeichnung)?
(2P)
Man sieht, welche Basen in Abhngigkeit von der Zugabe der Initiationsfaktoren modifiziert
werden knnen und welche nicht. Es gibt in der 16S rRNA Basen, die vor Methylierung schtzen.
Sie verhindern, dass andere tRNAs gleichzeitig gebunden werden knnen.
IF1 bindet an die 30S Untereinheit und verhindert, dass andere tRNAs gleichzeitig gebunden
werden knnen Durch chemical probing kann man das feststellen.
35) Skizzieren Sie die 3 Ereignisse im Bereich der Ribosomenbindungsstelle einer prokaryotischen
mRNA, welche die Bindung von Ribosomen verhindern knnen (Zeichnung!) Wie knnen Sie diese
"Mechanismen" mit Hilfe von molekularbiologischen Untersuchungen nachweisen? (4P)
Sekundrstrukturen
Durch mRNA sekundr Strukturen knnen die ribosomalen Bindungsstellen verdeckt werden und
dadurch die Translation inhibitiert werden. Sekundrstrukturen sind hufig fr die Modulation der
translationalen Initiation verantwortlich.
RNA Thermometer
Neisseria erzeugt als Virulenzgen eine Protease, deren SD Sequenz bei 30 in einer
Sekundrstruktur liegt und unter diesen Bedingungen nicht translatiert wird. Wird das Bakterium
beispielsweise in einen Wirt aufgenommen, in dem hhere Temperaturen herrschen, ffnet sich
die Sekundrstruktur, die Protease kann translatiert werden und seine greuliche Wirkung
entfalten.
Translationale Inhibition durch einen Liganden
Wenn der Ligand kommt und irgendwo an die RNA bindet kommt es wieder zu einer
Konformationsnderung (upstream SD und Anti-SD lsen sich und gehen bindung mit der Shine
Dalagarno Sequenz ein) diese formen eine eine stabile Sekundrstruktur, die die Shine Dalgarno
Sequenz maskiert. Nun kann das Ribosom nicht mehr binden. Das wre also die translationale
Ebene der Regulation
Expermint um die Experimente zu bestigen, welche die durch Bildung einer Sekundrstruktur
regulierent auf die translation wirken. Struktur kartieren durch Chemical Probing oder In line
Probing: Man schneidet die mRNA (mit und ohne Ligant) mit einem Enzym, welches nur an
ungepaarte stellen schneiden kann. Wenn sich durch dem ligand eine weitere Sekundrstruktur
ausbildet ist das im Gel ersichtlich.

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7.April 2006
Decker
36) Skizzieren Sie ein prokarytiotisches Zweikomponenten-System. Wie wird der Response
Regulator modifiziert, um sein Gen zu aktivieren?
Der PhoR-Sensor misst die Phosphat-Konzentration im extrazellularen Raum. Ist genugend
Phosphat vorhanden ist der Sensor inaktiv, die fur die Erschliesung von Phosphatquellen
benotigten Gene werden nicht transkribiert. Sinkt aber die Phosphatmenge im periplasmatischen
Raum und es ist nicht mehr genug davon vorhanden, damit der Sensor permanent ein
Phosphat gebunden hat, wird der Sensor aktiv. Dadurch bekommt er eine Kinase-Aktivitat und
kann ein Histidin des Response regulators PhoB phosphorylieren. Das geschieht durch
Ubertragung des -Phosphats eines ATP-Molekuls auf ein Histidin des Response regulators. Die
Phosphorgruppe wird dann vom Histidin auf ein Aspartat ubertragen. In diesem Zustand ist
der Response regulator aktiv, was bedeutet, dass er jetzt ein aktiver Transkriptionsfaktor ist, der
die Transkription einer Reihe von Genen fur die Erschliesung von Phosphatquellen anschaltet.

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37) Wie wrden Sie mit zwei unterschiedlichen Methoden beweisen, dass ein translationaler
Repressor an die Shine-und-Dalgarno-Sequenz der mRNA bindet?
1) Reportergen-Assay:
Der Repressor ist ein Protein:
- 2 Plasmide:
reguliertes Gen + Reportergen auf Plasmid 1
Gen fr mutmalichen Repressor auf Plasmid 2
- beide Plasmide in der Zelle: keine Translation kein Reporter
- nur Plasmid 1 in der Zelle: Translation Reporter ist nachweisbar
- Das untersuchte Protein ist ein Repressor.
2) chemical probing:
- Basenpaart die ncRNA mit der mRNA an der SD Sequenz, erkennt man das durch die fehlenden
Banden im Gel
13. Okt. 2006
Decker
38) Nennen Sie zwei unterschiedliche Mechanismen der epigenetischen Genregulation. Welche
Modifikationen von Proteinen und / oder Nukleinsaeuren spielen hierbei eine Rolle?
DNA Metyhlation through DNA metyltransferases
m5C in mammals on CG-dinucleotides (CpG)
Interference with binding of transcription factors (such as CTCF)
Recruitment of methyl-DNA binding proteins
Recruitment of chromatin-modifying enzymes (histone deacetylases und methyltransferases)
via methyl-DNA binding proteins
Result:
local chromatin condensation and transcriptional repression

Histone Acetylation through Histon Acetyltransferases


Target: Lysine residues (epsilon amino group)
cis-effect: loss of positive charge results in reduced interaction of
histones with negatively charged DNA
Reader proteins with bromo-domains recognize and bind acetylated histones:
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basal transcription factors


Histone acetyltransferases such as p300, Gcn5 or pCAF (positive
feedback and information transfer)
Chromatin remodeling complexes Swi/Snf
= increased accessibility of target genes
15.Dez 2006
Blsi
39) Wie kann man beweisen, dass die Bindungsstelle des ribosomalen Proteins S1 upstream der
Shine- Dalgarno-Sequenz auf der prokaryontischen mRNA liegt?
- Mit einem Mix aus verschiedenen mRNAs u
Komplexe) wurde Cross-linking gemacht (UV-Licht Adduktbildung zwischen Protein und RNA).
- Die ribosomalen Untereinheiten werden chemisch vom Protein getrennt (SDS, Lithiumchlorid).
- Das Protein-mRNA-Gemisch lsst man durch einen Sucrose-Gradienten laufen und entnimmt die
(zuvor markierte) mRNA mit einer Nadel.
- Mittels Affinittschromatographie (Antikrper gegen S1) wird der Komplex dann gereinigt.
- Anschlieend wird die nicht durch S1 geschtzte mRNA abverdaut.
- Der geschtzte Teil wird vom Protein gelst (Harnstoff) und anschlieend sequenziert.
Dieses Experiment ist stellvertretend um zu zeigen, wo ein Protein an eine RNA oder eine DNA
bindet, es kann irgendein Protein sein.
2.Mrz 2007
Decker:
40) Womit interagieren folgende Proteinstrukturen:
a) SH2 Domne
b) Chromodomne
c) Bromodomne
d) Leucin Zipper
a) phosphoriliertes Tyrosin
b)methylierte Histone
c) acetylierte Histone
d)DNA

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41) Geben sie eine Definition fr 'genomic imprinting'. Welche Modifikation ist damit verbunden
und welches Makromolekl wird modifiziert.
Expression von Genen hngt davon ab von welchem Elternteil das Allel stammt. Entweder nur das
vom Vater oder das von der Mutter aktiv. Durch epigenetische Modifikationen der DNA, wird
bereits in der frhen Prgung der Keimzellen geschlechter spezifisch neu etabliert.
Bei dem imprinted Genes H19 und Igf2 ist das Imprinting controll element methyliert kann der
Enhancer nicht auf das H19 Gen wirken, auf Igf2 schon.
Ist ICE nicht methyliert bindet dort CTCF-Protein, Enhancer kann nicht mehr auf Igf2 wirken und
H19 Gen wird aktiviert.

Blsi:
42) Wie knnen sie genetisch und biochemisch nachweisen, dass die Ribosomenbindungsstelle
einer prokaryontischen mRNA durch eine Sekundrstruktur maskiert ist (Zeichungen!)? (3P)
Genetisch:
Kombinatorische Mutationen
Biochemisch:
Footprinting/Hydroxyradikal Footprinting--> Hydroxy Radikale greifen sRNA an und schneiden am
Phosphat-Rckrad nach jeder Base--> wo dsRNA, kann nicht schneiden---> keine Banden am Gel in
diesem Bereich zu sehen.

43) Skizzieren sie den Import von Proteinen in Hefemitochondrien! Welche Komponenten sind
beteiligt, was wirkt als Translokationsmotor fr den Import (Zeichnung!) (3P)
Mitochondrien besitzen eine doppelte Zellmembran zwischen der sich ein Intermembranraum
befindet, es findet sich zur ATP Erzeugung ein elektrisches Potential ber die innere Membran.
Proteine knnen sowohl fr den Intermembranraum alsauch fr das Lumen des Mitochondrions
vorgesehen sein und bentigen dafr unterschiedliche Leadersequenzen. Proteine, die in die
Matrix transportiert werden sollen und dort bleiben sollen haben nur ein Matrix targeting Signal.
Proteine, deren Zielort der Intermembranraum ist haben zu der Matrixsequenz eine zustzliche
Signalsequenz. Beide Proteinarten werden zunchst in die Matrix transportiert und erst
anschlieend an ihren tatschlichen Bestimmungsort weiter transportiert. Sobald ein Protein im
Matrixraum angelangt ist, wird die Leadersequenz fr den Matrixraum abgeschnitten. Findet sich
danach eine weitere Leadersequenz, wird das Protein weitertransportiert.
Um Proteine durch die beiden Membranen zu schleusen, dienen so genannte Tom
(translocase of the outer mitochondrial membran) und Tim Proteine.

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07.Sep. 2007
Decker:
44) Steroid Rezeptoren... unterscheide und wie sie funktionell aufgebaut sind.

Sind Transkriptionsfaktoren, binden an Liganden--> dadurch reguliert.


Liganden sind lipophile Hormone, meistens Steroidhormone
Glucocorticoide ( GR), aber z.B. auch Vitamin D ( VDR) oder Retinsure ( RAR)-->
durch Zellmembran und binden direkt an die Receptors.
Receptors--> Zinkfingerproteine (Homo- oder Heterodimere an die DNA binden)
Interaktion mit Ligand im Cytoplasma--> Rezeptor in den Zellkern--> Kerntranslokation
reguliert.
Meist ist der Rezeptor schon an DNA gebunden--> Bindung an Ligand--->kann
Transkription aktivieren.

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Cholesterol (= Cholesterin), stark lipohil--> Grundstruktur!

45) Posttranslationale modifikationen an TF


K.a Was gemeint ist
31.Mai 2008
Decker
52) Welche DNA Sequenzen sind wichtig fr epigenetische Regulation + kurze Beschreibung
die frage ist mir nicht ganz klar... alles was mit Histonmodifikationen zu tun hat?!
53) Welche Methoden um mRNA quatitativ nachzuweisen kennen Sie? Welche liefern exakte
quantitative Werte? Kann man damit Transkription nachweisen (+Begrndung)?
Northern Blot:
spez. Sonde fr mRNA of interest notwendig, kann radioaktiv markiert werden und die
Hybridisierungssignale knnen erfasst werden.
RT-PCR:
reverse transcriptase PCR, RNA -->DNA, je nachdem wie viel entsteht mit Gelelektrophorese
sichtbar machen. NUR semiquantitativ, kommt zu einer Sttigung und zum Verbrauch der
Primer...
qrt RT-PCR
wrhrernd PCR wir schon fluoreszierender Farbstoff eingelagert--- Fluoreszenz nimmt mit
steigender Produkt Menge zu, Fluoreszenz Signal erst bei Einlagerung sichtbar!
Fluoreszenz ist direkt proportional zur Menge des Produkts.
Gene Microarrays:
Genom muss bekannt sein, zu jedem Gen wird komplementr DNA erzeugt, auf Glaschip
aufgebracht --->jede definierte Stelle am Glaschip entspricht einem Gen---> cDNA aufgebracht,
nur wo hybridiesierung statt gefunden hat fluoreszenzsignal /Aktivitt bestimmbar.

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11.12.10
Decker
57)Beschreiben Sie die CTD der eukaryoten RNA Pol 2. Welche AA werden bei der Initiation der
Transkription phosph.? Was ist die Bedeutung der Phosph.?
Die RNA-Polymerase II, also diejenige, die im Wesentlichen fr die Bildung von mRNAs
verantwortlich ist, an der '-Untereinheit eine sogenannte carboxyterminale Domne (CTD), die
aus dem Molekl herausragt. Diese ist wenig strukturiert und bildet wahrscheinlich eine lang
ausgedehnte Struktureinheit, die relativ leicht von auen zugnglich ist. Betrachtet man die
Aminosuresequenz dieser carboxyterminalen Domne, fllt auf, dass sie aus Wiederholungen
einer immer gleichen Aminosuresequenz besteht. Diese Sequenz besteht aus 7 Aminosuren, die
sich also immer wieder wiederholen, bei Mensch und Maus besteht die CTD aus insgesamt 52
Wiederholungen dieser kurzen Sequenz aus 7 Aminosuren, man spricht von einem Heptad
Repeat. Die Sequenz lautet Y S P T S P S, sie besteht also zu einem groen Teil (5/7) aus den 3
Aminosuren, die phosphorylierbare Hydroxylgruppen tragen. Von diesen 5 phosphorylierbaren
Aminosuren werden zwei tatschlich phosphoryliert, nmlich das Serin an Position 2 und das
Serin an Position 5.

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58)Welches Prot. muss stabilisiert werden, damit Signaltransduktion durch Wnt Liganden zu einer
transkriptionellen Antwort fhrt? Nach welchem Mechanismus erfolgt die Stabilisierung?
Ein anderer Signaltransduktionsweg, der vor allem fur Zellwachstum und Entwicklung wichtig
ist,ist der sogenannte Wnt-Pathway. Hier geht es darum , dass eine Familie von Rezeptoren, die
als Frizzle bezeichnet werden und die sogenannten Wnt-Liganden binden, letztlich den
Transkriptionsfaktor-Komplex TCF (T-cell Factor) aktivieren. Um TCF aktivieren zu knnen,
bentigt man ein Protein, das in diesem Signaltransduktionsweg eine zentrale Rolle spielt,
namlich das -Catenin. Dieses -Catenin ist inharent, wenn der Pathway abgedreht ist, was
bedeutet, dass es zwar gebildet, aber sofort wieder zerstort wird. Zum Zerstoren wird die
Proteinkinase GSK3 benotigt, die als Komplex mit mehreren anderen Proteinen vorliegt. GSK3 ist
normalerweise aktiv und phosphoryliert - Catenin, das daraufhin ubiquitiniert und in weiterer
Folge durch das Proteasom abgebaut wird.
Sobald Frizzle seinen Liganden bindet, wird ein Komplex aktiviert, der das Protein Dishevelled
(Dsh) enthalt. Dieser Dsh-Komplex bindet an den GSK3-Komplex und inaktiviert ihn, wodurch Catenin nicht mehr phosphoryliert wird, sondern stabil bleibt und im Zellkern an einen Komplex,
der den Transkriptionsfaktor TCF enthalt, bindet.

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59)Wie knnen Sie biochem. nachweisen an welche Bereiche der 16S rRNA der
Translationsinitiationsfaktor 3 bindet? (Skizze)
Chemical probing
Man sieht, welche Basen in Abhngigkeit von der Zugabe der Initiationsfaktoren modifiziert
werden knnen und welche nicht. In der Sekundrstruktur, in der man auch die Stem Loops
charakterisieren kann, gibt es Abschnitte, an die Primer gebunden werden knnen, wodurch man
mit Reverser Transkriptase cDNA machen kann. Das kann jedoch nur in den einzelstrngigen
Bereichen passieren, nicht aber dort, wo die rRNA mit IF3 verbunden ist
Wenn man nun modifizierende Agenzien hinzugibt (CMTC, DMS, Kethoxal), kann die Reverse
Transkriptase den Strang nur so weit synthetisieren, bis sie auf ein modifiziertes Nukleotid trifft.
Das kann nur in Einzelstrangbereichen, nicht aber dort wo der IF3 gebunden ist.
Bei der Zeichnung fehlt die IF3 !

60)Wie knnen Sie experimentell nachweisen, dass ein bakt. Gen durch einen Riboswitch reguliert
wird (2 experimentelle Anstze!)?
Durch in-line probing kann man das Umfalten durch die Prsenz des Liganden nachweisen.
RNA hat die Tendenz, ber lngere Zeit hinweg zu degradieren, und zwar in den unstabileren,
einzelstrngigen Bereichen. Markiert man die RNA (zB. radioaktiv), kann man sie nach einer
gewissen Degradationszeit (manchmal Tage) durch Gelelektrophorese trennen und sieht als
Banden jene Bereiche, die ungepaart, also nicht in Sekundrstrukturen waren. Gibt man zuvor
einen Liganden hinzu, werden sich die Bereiche, in denen der Ligand bindet, ebenfalls nicht
auflsen, man erhlt eine Art Footprint im Gel (dort, wo keine Hydrolyse stattgefunden hat).(?)
Zweiter Versuch:
- Reportergen-Assay (mRNA fusioniert an Reportergen auf Plasmid in die Zelle, Zugabe von Ligand

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1.Juli 2011:
Decker
61) Writers/ Readers und ihre Wirkungsweise!
Histon Code und seine Modifikationsmuster erzeugen und interpretieren.
Writers: Schreiber des Histon -Codes --> Histon-Acetyltransferasen, die Proteinkinasen, die
Arginin-Methyltransferasen und die Lysin-Methyltransferasen
Readers: Interpretierer des Histon-Codes --> Proteine, die z.B. Bromo- oder Chromodomnen
enthalten und damit die jeweiligen Modifikationen erkennen knnen.

W und R mssen nicht getrennt sein, knnen im gleichen Proteinkomplex sein. Crosstalk->Komplex fhrt seine Modifikation nur ein, wenn eine andere, die er durch seine Reader-Domne
erkennt, schon vorhanden ist.

Blsi
62)Anstze um zu zeigen dass ein Gen durch Riboswitches reguliert wird!
Riboswitches sind komplexe RNA Kontroll Elemente, agieren als Rezeptoren fr spez. Metabolite
und knnen durch Liganden Bindung Gen Expression regulieren.
Mit Inline-Probing kann man charakteristische sekundr Strukturen und Liganden Bindung von
Riboswitches nachweisen.
RNA wird radioaktiv markiert und ohne Ligand, nach einer Degradationszeit auf ein Gel
aufgetragen. sRNA wird schneller hydrolisiert als dsRNA und am Gel sieht man diese RNA Stcke.
Wird RNA radioaktiv markiert und ein Ligand kommt dazu, kann man nach einer gewissen
Degradationszeit, das RNA-Extrakt auf ein Gel auftragen. Im Bereich wo der Ligand die
Konformationsnderung der RNA hervorgerufen hat sind keine Banden zu sehen.

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Ein zweiter Ansatz wre ein Reporter Gene Assay- Ligand Abwesend kein Genprodukt, Ligand
anwesend, Konformationsnderung--> Produkt.

63)Vergleich Proteinexport ber die Cytoplasma Membran bei Bakterien und dem ER
Proteinimport:
Proteinexport:
Typ 1-Typ4 Sekretion:
Typ1:
Sec- unabhngig, 3 Proteinuntereinheiten die wichtig sind: ABC-Protein in der IN, ein
Membranfusionsprotein und ein OM Protein.
Typ2:
Protein durch SEC in IN transportiert, wird im periplasmatischen Raum modifiziert und durch
Porenformende Proteine durch die OM sekretiert.
Typ3:
Direkter Kontakt Wirtszelle und Bakterium, Rezeptor auf Wirtszelle erkennt Proteine auf
Membran von Bakterium--> Polymerasen, Phosphatasen--> eingreifen in Signaltransduktionsweg->Apoptose der Wirtszelle.
Typ4:
T-DNA kann in den Kern der Wirtszelle durch Sec-Pathway oder durch Tunnelbildung inserieren.

Proteinimport:
SEC- Pathway
SecB (Protein Chaperon),bindet das nascent Protein und transferiert es zu SecA , ein peripheres
Protein, dass an die internen Membranproteine SecE und SecY gebunden ist. Die Translokation
des Proteins erfolgt ber Hydrolyse von ATP und Proton-motive force. Nachdem das Protein die
Membran durchquert hat, wird die Leadersequenz durch eine dem Komplex gebundene
Leaderpeptidase vom Zielprotein abgespalten.

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SRP-Pathway (signal recognition particle pathway) im ER


Proteine mssen fr Modifizierung in ER. Synthese von Protein mit einer Sequenz (15-30AS)
versehen und kann von SRP erkannt und gebunden werden.
Translation gestoppt--> Transport zu ER
Ribosomen sitzen direkt an Membran von ER--> Cotranslationaler Transport! --> SRP Rezeptor auf
der Membran erkennt SRP + Protein.
Rezeptor mit Pore verbunden und unfertiges Protein wird eingefgt.Die Signalsequenz auf dem
Peptid wird abgeschnitten, sobald sie im Inneren des ER ankommt. Zur Freisetzung von des SRP
vom SRP Rezeptor ist Hydrolyse von GTP notwendig. Die Translation wird dann wieder
aufgenommen.

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08. Okt 2011


Decker:
64)Proteinkomplexe die bei epigenetischer Modifikation eine Rolle spielen + Hintergrund dazu

65)Nonsense Mediated Decay (inkl. Skizze)


Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD) ist ein Kontrollmechanismus in Euk. Soll vorzeitige
Stopcodons in mRNA erkennen und Expression von daraus resultierenden verkrzten Proteinen
verhindern.
Beim Splicen der INTRONS entstehen Exon junctions, Exon/Exon Grenzen werden mittels
Proteinkomplexe, Exonjunctioncomplex, markiert. Diese werden entfernt und die Translation
kann bis zum STOP Codon weiter verlaufen. Tritt ein vorzeitiges Stop-Codon auf, durch Mutation
etc., wird die Translation schon an dieser Stelle gestoppt, obwohl sich nach dem Stop-codon
noch Exonjunctions befinden. Terminationsfaktoren knnen mit diesen interagieren und ein
Decaping-Enzym aktivieren, das die 5' Cap der mRNA abbaut--> schnellerer Abbau der mRNA
durch 5'-3' Exonucleasen.

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26.11.2011
Blsi
66)Experiment: 2 Beweise fr die negative Regulation von trans regulatorischen RNA auf mRNA
Ebene! SKIZZE
Trans regulatorische RNA ist nicht genetisch zu ihrer Ziel mRNA verlinkt. Durch alternative
Basenpaarung knnen sie mit verschiedenen Ziel mRNAs interagieren, sie formen jedoch keine
100% Duplexe.
Sie knnen z.B. durch inline Probing bewiesen werden (siehe oben)
oder
durch 2 Plasmide in einer Zelle:
P1 trgt reguliertes Gen
P2 trgt das Gen, das fr die trans-regulatorische RNA codiert.
beide Plasmide in der Zelle--> keine reguliertes Gen-Produkt
nur P1--> Gen wird translatiert
negative Regulation von trans-regulatorischer RNA

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13.1.2012
Blsi
67)Funktion von IF3 ? In vivo & in vitro Nachweise!
IF3 ist ein fidelity factor, macht proofreading und monitoring---> richtige tRNA gebunden?!
berprfen der Codon-Anticodon Interaktion--> verhindert Assoziation der 30S und 50S
Untereinheit-->diskriminiert gegen alle Start-Codons auer AUG!
In Vivo:
Reportergene Assay--> Produkt in groer Mende vorhanden wenn IF3, AUG Start-Codon,
Ribosom, fMetTRNA
wenig bis kaum Produkt--> wenn andere Start-Codons statt AUG
In Vitro:
Toeprint Assay---> Toeprint Signal bis zum Ende, keine Bindung,
nur mRNA+ fMettRNA und Ribosom----> Signal bei Bindung des Komplexes
mRNA+ fMettRNA, Ribosom und andere tRNAs bekommt man viele Signale, bindet fter.
mRNA+ fMEttRNA, Ribosom und IF3 --> nur Signal bei AUG
Affinittschromatographie--> Antigene gegen IF3 auf der Sule

68)In Stichworten beschreiben: Aufbau und Funktion von TFIID, TFIIH und Mediatorkomplex
TFIID--> basaler Transkriptionsfaktor, aus TATAAT binding protein und TBP associated factor
(TAFs)
TFIIH--> hat Kinase und Helicaseaktivitt (phosphorilieren die CTD von PolII), bilden
Prinitiationskomplex fr die Vorbereitung der Transkription)
Core TFIIH + UE-->Helicase
Holo TFIIH +UE--> Promotor Clearance
Holo TFIIH +UE--> DNA Reperatur
Mediatorkomplex SRB (aus vielen Proteinen)--> stimuliert die Kinaseaktivitt von TFIIH, CTD kann
an Ser5 phosphoriliert werden.

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07.07.2012
Decker:
69)bHLH Proteine knnen als inaktive und aktive Dimer wirken. Erklren Sie die strukturellen und
mechanistischen Hintergrnde!
Nennen Sie ein Beispiel (MyoD)
Proteinen der basic Helix-Loop-Helix (bHLH) Familie.
Die Basic Region ist eine Ansammlung von basischen (+) AS-->Bindung an DNA bHLH fr
Dimerisierung.
Knnen Homodimere und Heterodimere bilden, --> entweder Dimer transkriptionell aktiv oder
nicht.
BSP:Mechanismus mit TF MyoD (Differenzierung von Muskelzellen) darf NUR whrend der
Differenzierung aktiv sein, reguliert durch: aktive Dimere gebildet wenn werden, MyoD mit einem
Protein aus der gleichen Familie interagiert,(E12 oder Ac-S.).
Wichtig dabei ist, dass beide Komponenten des dabei gebildeten Heterodimers sowohl die
HelixLoop-Helix-Struktur fr die Dimerisierung als auch eine Basic Region als DNA
bindendeDomne besitzen(beide Partner knnen zur DNA-Bindung beitragen).
Wenn die Differenzierung abgeschlossen ist, wird in den differenzierten Zellen das Id-Protein
hochreguliert, wobei Id fr Inhibitor of MyoD steht. Id bildet mit MyoD Heterodimere, bei denen
zwar auch beide Partner die Helix-Loop-HelixRegion fr die Dimerisierung besitzen, dem Id fehlt
aber die Basic Region fr die DNA-Bindung. Dadurch wird das Heterodimer inkompetent fr DNABindung, weil diese nur dann mit ausreichender Affinitt erfolgt, wenn beide
Dimerisierungspartner ber eine Basic Region verfgen.

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Blsi:
70) 2 Methoden (mit Skizze) zum Nachweis, dass eine sRNA an die Shine Dalgarno Sequenz bindet
und damit Translation inhibiert:
1. Reportergeneassay und Toeprintassay
P1 hat SD Sequenz und Reportergene
---> in Zelle --> Gen-Produkt
P1 und sRNA in Zelle,
---> kein Genprodukt
Nachweis, dass sRNA gebunden hat, Toeprint Assay--> fehlende Banden am Gel wo sRNA
gebunden hat.
2. Affinittschromatographie
--> aufgereinigte mRNA mit gebundener sRNA verdauen, nur mRNA und sRNA Komplex brig,
auftrennen und Sequenzieren---> sRNA und SD-Sequenz gefunden.
7. Dezember 2012
Blsi
71)Wie kann man Gene Knock-Down in Eukaryoten durchfhren? (+Skizze)
Gen Knockdown --> Translation des Zielgens durch RNAi ausschalten.

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Unter Gen Knockdown versteht man den Vorgang, die Translation des Zielgens durch RNAi auszuschalten.
Dazu bringt man DNA in den Organismus ein, dessen Transkript RNA einerseits einen Teil der mRNA des
Zielgens enthlt und andererseits soweit mit sich selbst bindet (Antisense RNA), dass dadurch eine
scheinbare dsRNA entsteht, die durch RNAi erkannt, geschnitten und verwendet wird, um die mRNA des
Zielgens zu zerschneiden.

Decker
72)Die Bedeutung von sigma-Faktoren erklren und wie wrden Sie nachweisen, dass ein Gen von
sigma70 reguliert wird.
Der Sigma Faktor wird vom rpoD Gen codiert. Er vervollstndigt das Core-enzym mit den und
Untereinheiten zum Holoenzym. Der Sigma Faktor erkennt Promotoren und lsst das Corenzym
an der Promotorsequenz besser binden. Im Fall vom Sigma-70 Faktor ist das die -10 Region
(TATAAT)- TATA Box und die -35 Region. Der Sigma-Faktor wir in 4 Subdomnen aufgeteilt, die
wiederum in Strukturmotive (1.1; 1.2 etc.) unterteilt werden.
Domne 4 ist verantwortlich fr die Erkennung der -35 Bereichs
Domne 3 ist verantwortlich fr die -10, bzew. -10 extended Bereichs.
Domne 2 ist fr das Melting im Bereich der Transcription Bubble verantwortlich, beide DNAStrnge mssen voneinander getrennt werden bevor eine RNA polymerisiert werden kann.
Beginnt eine Polymerase zu transkribieren, wandert der Sigma-Faktor wieder ab und kann fr
weitere Polymerasen Promotor Regionen erkennen.
Reportergene assay wre eine Mglichkeit um die spezifische Genregulation zu sehen. Wird ein
Reportergen nach dem Promotor der von Sigma 70 erkannt wird, eingefgt, wird nur ein

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Genprodukt im hohenausma vorhanden sein wenn der Faktor den Promotor ekennt und die
Polymerase dort hin fhrt um Transkription zu starten.

25.01.2013
Decker
Decker
73)Definieren Sie die positive und negative Kontrolle der Genexpression. Geben sie diesbezgl.
Beispiele und Skizzen eubakterieller Operone.
Negative Regulation: Es gibt den Fall, dass es einen aktiven Repressor gibt, der durch einen
Inducer inaktiviert wird
(z.B. lac-Operon), aber
auch den, dass der
Repressor von Haus
aus inaktiv ist und erst
durch einen
Korepressor aktiviert
werden muss (z.B. trpOperon).Positive
Regulation: Hier gibt es
den Fall, dass ein
inaktiver Aktivator erst
durch einen Inducer
aktiviert werden muss
(CAP: Inducer = cAMP),
aber auch den, dass
der Aktivator von Haus
aus aktiv ist und durch
einen Korepressor
inaktiviert werden
muss.

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Blsi
74)Mit welchen 1) biochemischen und 2) genetischen Methoden knnen Sie zeigen, dass IF3
gegen alle Startcodons auer AUG diskriminiert? (mit Skizzen)
Es wird ein Plasmid mit LacZ-Gen mit AUG als Startcodon in einen WT eingebracht, dadurch wird
-Galaktosidase erzeugt. Bringt man das Plasmid in eine IF3-Mutante ein, wird ebenfalls Galaktosidase erzeugt. ndert man das Startcodon des LacZ Gens von AUG auf AUU und bringt es
ein: Im WT findet so gut wie keine Translation des LacZ Gens statt. In der IF3 Mutante findet sich
etwa ein Drittel so viel Translation wie mit dem ursprnglichen AUG Startcodon. IF3 diskriminiert
also gegen alle Startcodons auer AUG - in der IF3 Mutante mit AUU Startcodon findet man aus
dem Grund weniger -Galaktosidase, weil IF3 im WT eine Konformationsnderung durchfhrt,
durch die AUG viel stabiler gebunden wird. Findet die Konformationsnderung nicht statt, kann
AUU zwar binden und die Translation initiieren, allerdings nie so effektiv wie AUG im WT.
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Biochemisch
Fhrt man einen Toeprint-Assay mit 30S UE und einem tRNA-Mix durch, so erhlt man viele
unterschiedlich lange cDNA-Stcke durch die Reverse Transkriptase, da die 30S UE mit jeweils
verschiedenen tRNAs irgendwo auf der mRNA an den den tRNAs passenden Codons einen
Komplex bildet. Fgt man zu 30S UE und tRNAs zustzlich IF3 in ausreichender Konzentration
hinzu, erhlt man fast ausschlielich gleich lange cDNA Stcke, da IF3 fr fMet-tRNA diskriminiert
und sich der ternre Komplex daher nur ber dem AUG Startcodon der mRNA bilden wird. Mit
Hilfe dieses Tests kann auch auf andere in trans agierende Proteine in Bezug auf translationale
Initiation getestet werden. Das abgebildete Experiment zeigt, dass IF3 auch gegen AUGs ohne SD
Sequenz diskriminiert und somit tatschlich nur AUGs als Startcodon zulsst
22.03.2013
Decker
79)Welche der folgenden Antworten ist richtig (ankreuzen).
Der Initiationskomplex der Transkription besteht aus Polymerase-associated factors (PAFs)
Die Reihenfolge mit de generelle (basale) Transkriptionsfaktoren an einen Promoter binden
wurde im electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ermittelt.
Aktivierte Promotoren enthalten Nukleosomen mit K4-trimethyliertem H3
Histonacetylierung inhibiert die Bindung von transkriptionellen Repressoren
TAFs sind Bestandteile des TFIID
TFIIH enthlt eine Histonacetyltransferase
TBP reguliert Promotoren fr alle 3 eukaryoten RNA Polymerasen
TFIIB verbindet TFIID und RNA Polymerase
TFIIB erleichtert die Strangtrennung bei der Bildung eines offenen Promoterkomplexes
Phosphorylierung der Polymerase II CTD ist fr die mRNA capping Reaktion wichtig

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Blsi:
80)Beschreiben Sie den Vorgang der Trans-Translation in Bakterien (Skizzen; 1,5 Pkt.)!

Die proteine werden mittes RNAse footprinting nachgewiesen. Skizze !


81)Welche Unterschiede und Gemeinsamkeiten bestehen bei der miRNA vermittelten
Genregulation in Pflanzen, Tieren und Hefen (Skizzen; 3 Pkt.)?

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12.07.2013:
Decker
75)Wie bewirkt die Phosphorylierung die Aktivierung eines Transkriptionsfaktors im NFB-, wntund Stat- Signaling Pathway?
STAT
1)Cytokin bindet an cytokin rezeptor + JAKs
2) Tyrosin phophorilierung an Cytokin Rezeptor
3)Binden von STAT( mit SH2 Domain) an Komplex
4) Phosphorilierung von Stat durch JAKs
5)Dimer Ausbildung von Stat und wandert in den Zellkern - Gen aktivierung

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WNT
1) Gsk3 ist in default phosphoryliert und akkumiliert frei und macht Catenin Phosphorylierung,
welche zum Degration von -Catenin nach seine Ubiqitinierung fhrt
2) Wnt bindet an Frizzled. Dishevelled + Gsk3 komplex bindet dazu
3) Nach dem Komplex bildung von Gsk3 und phosphorylierung vom Komplex kann Gsk3 nicht mehr
frei akkumulieren und -Catenin abbauen
4) -Catenin kommt in den Zellkern und kann die Gen Aktierung durchfhren

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NFkB
1)
2)
3)
4)

Tnf bindet an Tnf receptor und dadurch wird IKK phosphoriliert unter ATP verbrauch
Phophorylierte IKK kann IkB, welche in default die NFkB komplex inhibert, phosphorilieren.
Nach Phophorylierung von IkB kann es nach ubiqutinilierung durch Proteosom abgebaut werden
NFkB wandert in zellkern durch nuclear localization signal und aktviert die gene

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76) Nennen Sie 2 Chromatin-remodellierende Komplexe. Beschreiben Sie die biochemischen


Mechanismen von Chromatin-remodellierenden Komplexen. Woraus beziehen sie die dafr
ntige Energie?
Chromatin structure remodeling (RSC) complex
SWI/SNF (SWItch/Sucrose NonFermentable] is a nucleosome remodeling complex

Chromatin remodling wird durch ATP verbrauch durchgefhrt.


Nucleosome Sliding
Bindungsstellen fr Transkriptionsfaktoren sind in nucleosomaler DNA in der Regel dem
Nucleosom so zugewandt, dass sie unzugnglich sind. Durch das Nucleosome Sliding wird das
Nucleosom ein Stck an der DNA entlang verschoben und DNA, die vorher nucleosomal war, wird
zur Linker-DNA, wodurch die Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen zugnglich werden.
Nucleosome Transfer
Eine Alternative hierzu wre, ein Nucleosom von einem Stck DNA auf ein anderes zu bertragen
(Nucleosome Transfer?). Das konnte aber bisher nur im Reagenzglas beobachtet werden und es
ist deshalb nach wie vor ungeklrt, ob das in Zellen berhaupt stattfindet
Nucleosome Unwrapping
Die dritte Mglichkeit stellt Nucleosome Unwrapping, was bedeutet, dass die DNA nur so weit
verndert wird, dass eine Rotation relativ zum Nucleosom stattfindet, so dass eine
Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle, die zunchst zum Nucleosom hingewandt ist, dann vom
Nucleosom abgewandt wird und deshalb fr Transkriptionsfaktoren zugnglich ist.
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Blsi:
77)Vergleichen Sie translationale Introns in Prokaryonten mit dem "Leaky-Scanning" in
Eukaryonten. Wie kann man experimentell den jeweiligen Mechanismus nachweisen?
Unter translationalen Introns versteht man mRNA-Bereiche, die vom Ribosom whrend einer
laufenden Translation bersprungen werden. Dabei kann das Ribosom im Leserahmen bleiben
d.h. ganze Codons berlesen oder in einen anderen Leserahmen wechseln.
Vermutet man ein Translationales Intron, fhrt man im Leserahmen ein Stopcodon in diese
Intronsequenz ein. Handelt es sich tatschlich um ein Intron, wird die Translation nicht
unterbrochen, man erhlt trotz eingefhrtem Stopcodon ein Produkt, da das Intron vom Ribosom
bersprungen wird.
Leaky scanning is a technique commonly employed by viruses to express multiple proteins from a
single sequence of RNA. When RNA is translated in eukaryotes, the 40s ribosomal RNA (40s rRNA)
will scan from the 5' end of the RNA until it reaches the first AUG codon where it will begin
translation from that open reading frame. This is problematic for intracellular viruses that need to
express proteins from alternate open reading frames, so they utilise leaky scanning to overcome
this. Leaky scanning occurs when the AUG start codon is not surrounded by an optimal sequence
of nucleotides, causing this start codon to be occasionally skipped (the frequency of this occurring
depends on the particular surrounding sequence). This causes the 40s rRNA to continue to the
next start codon - which may or may not be out of frame where it will form the full ribosomal
complex and begin synthesising a protein.
Nachweis methode Reporter gen assay fr beide promotoren und danach die produkte
vergleichen
78)Vergleichen Sie sRNAs in Prokaryonten und miRNAs in Sugern. Wie kann man experimentell
nachweisen, dass bei diesen Mechanismen eine Basenpaarung an der mRNA erfolgt?
Function of both species is regulation of gene expression.
Difference is in where they originate.
siRNA originates with dsRNA.
siRNA is most commonly a response to foreign RNA (usually viral) and is often 100%
complementary to the target.
miRNA originates with ssRNAthat forms a hairpin secondary structure.
miRNA regulates post-transcriptional gene expression and is often not 100%
complementary to the target.
Wir knnen das nachweisen mit RNA Toeprinting assay ! (?)

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Methoden Aus der Decker teil

1 A- Dna Microarray wird gemacht um das gesamte Transkriptom einer Zelle zu bestimmen.
Auserdem kann man auch Analyse der Genexpression unter verschiedenen Umwelteinflssen
durchfhren. Die Methode funktioniert so:
Auf 2x2 cm groes Traegermaterial sind in regelmaesigen Muster verschiedene Sonden aufgebracht,
die zu allen im untersuchten Organismus vorkommenden Genen komplementar sind. An jeder Stelle
kann mRNA des Organismus hybridisiert werden. Dadurch wird die mRNA festgehalten. Um
festzustellen, ob RNA hybridisiert hat, kann man diese mit Fluorescenz Farbstoffen ( unterschiedlich)
markieren. Diese signale knne qualitativ ( ob diese gene existiren ) oder quantitativ ( Korrelation der
Intensitaet der Fluorescenz mit der mRNA.
1 B- Northern Blot- Die menge der mRna herauszufinden und auserdem kann man auch Analyse der
Genexpression unter verschiedenen Umwelteinflssen durchfhren.:
Der Northern Blot ist eine Methode zur bertragung (Blotten) der in der Gelelektrophorese
aufgetrennten RNA auf eine Membran (Nitrocellulose meistens). Auf der Membran ist die spezifische
Markierung von RNA-Sequenzen durch die Hybridisierung mit komplementren Gensonden mglich.
Die Gensonden bestehen aus komplementare Nkleinsauren.Diese Gensonden knnen radioaktiv
markiert werden und danach wird der Abdruck auf der Autoradiodiagraphie sichtbar gemacht. Die
methode ist quantativ je mehr Hybridisierte Rna desto mehr Schwaerzung.
1 C- Reverse Transkriptase Polymerase Chain Reaction kann man auch Analyse der Genexpression
unter verschiedenen Umwelteinflssen durchfhren und RNA nachzuweisen:

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Die RT-PCR ist ein in der Regel zweistufiger Prozess: Zunchst wird die RNA in DNA umgeschrieben,
dann Teile der DNA spezifisch vermehrt. Um die Transkription eines Genes, des Transkriptoms, eines
Ribozym, von Ribonucleoproteinen oder das Genom von RNA-Viren nachzuweisen, muss die RNA
untersucht werden. Daher wird zuerst eine Reverse Transkriptase (RT) eingesetzt, eine RNAabhngige DNA-Polymerase, mit deren Hilfe RNA in cDNA umgeschrieben werden kann. Bei einer
anschlieenden Amplifikation von DNA durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden
spezifische thermostabile DNA-Polymerasen verwendet, die DNA-abhngig sind, d. h. sie sind nicht in
der Lage, RNA zu amplifizieren. Die cDNA kann im Anschluss als Ausgangsmaterial in einer PCR
verwendet werden, um spezifische Sequenzen aus dieser zu amplifizieren. Dabei denaturiert die
reverse Transkriptase.
Dabei wird ungefahr ab 30 cyclen eine saturierung stattfinden. Um dieses Problem umzugehen
macht man
1-D- quantative real-time RT-PCR. Da wird gleich beim ampfizieren der DNA das signal mit der Hilfe
von einem Computer gemessen.

2- Nuclear Run on Assay wird gemacht um zu bestimmen ob die Transkriptionskontrolle vorliegt.


Das ist die quantitativste Methode um Transkriptionskontrolle zu bestimmen. Zellkern der
untersuchenden Zelle wird isoliert und auf Eis gelegt. Transkription der Polymerasen wird gestoppt.
Danach wird zur Zellkernen radioaktiv markiertes Nucleotide 32P Markiertes UTP dazu gegeben und
wieder aufgetaut. Polymerasen transkrieben mit der radioaktiven Nucleotiden weiter. Je mehr
radioaktives UTP desto hher war die Transkriptionsrate. Dazu wird wieder ein
Hybridisierungsverfahren mit immobilisierten Sonden ( Macroarray) und im Anschluss
Autoradioraphie durchgefhrt.
3-A- Transiente Transfektion
Als Transfektion wird in der Zellbiologie das Einbringen von Fremd-DNA oder RNA in tierische und
teilweise auch andere eukaryotische Zellen bezeichnet.Bei der Transfektion unterscheidet man
zwischen dem nur vorbergehend Einbringen des Plasmids in die Wirtszelle (transiente Transfektion)
und dem dauerhaften Einbau in das Genom (stabile Transfektion).
-Calcium-Phosphat Kopraezipitation: Plasmid mit der DNA + Calciumhaltige puffer =
Calciumphosphate Kristalle Endocytose + Calciumphosphate kristalle = Happy end DNA in der zelle
-Elektorporation -> physiologische puffer + zelle + Elektrisches Feld= Geffnete poren -> Dna wird
aufgenommen
-Lipofektion -> Kationische Lipide + Dna ++++ Zelmembran = Dna nach innen gestpelt
-Microenjektion -> Micropipette + nanoliterweise Dna wird zur Zelle injiziert.
-Infektion mit Viren -> Dna+ viraler Vektor ++++++++sssss++++++ Zelle = DNA in der zelle nach
infektion

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3-C- Reporter Gene Assay um Promotor Aktivitaet zu berprfen: Promotor wird mit Reportergene
fusioniert mit der methode von transiente transfektion. Reporter gene befindet sich nicht in der WT
Zelle. Funktioniert der Promotor reportergen produziert Produkt. Zelle lysieren quantitative
Bestimmung des Gel Produkts. Beispiel : Luciferase, Chloramphenicol- Acetyltransferase, Green
Flourescent Protein.
4A - Promotor Bashing welche Teile des Promotors vorhanden sein mssen fr seine Aktivitat
(=Deletionskartierung): Der Promotor wird durch Restriktions Enyzme in Stckemit unterschiedlichen
Gren geschnitten. Diese Teile werden zusammen mit einem Reportergen, in ein Plasmid
eingebracht und in Ecoli vermehrt. Durch transiente Transfektion in neuer Zelle gebracht und
Promotoraktivitaet wird analysiert. Die einzelnen unterschiedlichen Plasmide werden einen
Reportergen Assay unterzogen, somit kann man feststellen, welche Teile des Promotors vorhanden
sein mssen fr seine Aktivitat.
4-B- S1 Nuclease Mapping Um zu erfahren wo der Transkriptions start liegt: Fragment der
klonierten DNA (enthaelt vermutlich transkriptionsstart) isolieren, denaturieren, mit der
entsprechende Rna der Zelle hybridisieren. Daraus folgt ein Hybrid aus S1 Probe und mRna der Zelle.
Um zu erfahren wo der Transkriptions start liegt, werden die einzel strangigen Enden durch S1
Endonuclease abgebaut. Es bleibt ein doppelstrangiger bereich. Ist genau die Lange von Anfang des
Dna Fragments bis zum Transkriptions start. Die Kontrolle, dass Transkriptionsstart innerhalb der
kloniertes Fragment liegen:
Fragment raioaktiv markieren, Elektrophorase durchfhren und danach Autoradioraphie. Man
enthaelt, die Laenge des Fragments. ( Von radioaktiven Markierung bis zur Transkriptionstart.)
4-C- DNA Footprinting gemacht, um herauszufinden wo die Transkriptionsfaktoren bindet: Erster
Ansatz: Dna Fragmente isolieren, radioaktiv markieren mit einer limitierten DNAse verdauen. Jedes
fragment wird dadurch einmal geschnitten. Es ensteht leiter von Dna Fragmenten, wo die nur durch
ein Nukleotid unterscheiden. Zweiter Ansatz: Hier wird DNA vorher mit Kernextract gemischt, welche
die wichtigsten Transkriptionsfaktoren enhalt. Diese Transkriptionsfaktoren binden auf der
Promotorsequenzen und dann kann DNAse diese Dna stcke nicht schneiden. Dort wo bindungsstelle
ist, steht bei der Elektrophorase Lcher in den Banden.
4-D- Elektrophoretic Mobilitiy Shift Assay(EMSA),ob der Transkriptionsfaktor in einer bestimmenten
Situation in der Zelle vorhanden ist und wie viel davon vorhanden ist(skriptum seite 35 : Man muss
die genaue Bindestelle des Transkriptionsfaktor wissen fr diese Methode. Hierbei werden Proteine
mit einem DNA-Fragment bekannter Sequenz inkubiert. Bei der DNA-Sequenz handelt es sich meist
um einen regulatorischen Bereich eines Gens (beispielsweise eines Promotors oder Enhancers). Die
Probe wird auf ein Polyacrylamid-Gel aufgetragen und mittels eines elektrischen Feldes werden die
Komplexe aus Protein, DNA und eventuell ein Antikrper entsprechend ihrer Gre aufgetrennt. Im
Vergleich zur reinen Protein- oder DNA-Bande tritt bei der Gelelektrophorese eine
Laufweitenverschiebung (engl. band shift) auf, abhngig von Ladung, Konformation und Gre des
Proteinligandenkomplexes. DNA-Protein-Antikrper-Komplexe wandern langsamer als DNA-Protein-

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Komplexe, welche langsamer als ungebundene DNA wandern, ungebundene Proteine wandern am
schnellsten. Durch Verdnnungsreihen lassen sich Ks-Werte ermitteln.
Durch Markierung der DNA (beispielsweise mit einem Radionuklid, per Digoxygenin-Markierung oder
mittels eines Fluoreszenzfarbstoffs) knnen die Banden im Gel sichtbar gemacht werden. Je weniger
ein Komplex im Gel gewandert ist, desto grer ist seine molare Masse. Hierbei dient zur
Spezifizierung der Banden nicht nur die DNA und der Antikrper, sondern es kann auch nichtmarkierte DNA in unterschiedlicher Menge zum Blockieren aber auch mutierte DNA zum
Herausfiltern eines spezifischen Signals eingesetzt werden.
Enthlt die Affinitselektrophorese neben der DNA und einem interagierenden Protein noch einen
Antikrper gegen das Protein, wird der Assay als Supershift Assay bezeichnet.
5-A- DNA Affinitaetschromotographie, macht man damit, ob ein Transkriptionsfaktor auf ein DNA
bindet oder nicht und wie gut er darauf bindet: Die Affinittschromatographie, eine
Sulenchromatographie, dient der Isolierung und Anreicherung von Proteinen oder Nucleinsuren
aus komplexen Gemischen. Ihr Prinzip beruht auf biospezifischen Wechselwirkungen zwischen zwei
zueinandergehrigen Reaktionspartnern, bei unserem Fall zwischen DNA und Transkriptionsfaktoren.
Stationare Phase : Nucleinsaueren Mobile Phase: Transkriptionsfaktoren Bei guter Bindung kommt
die Transkriptionsfaktor ganz langsam oder berhaupt nicht aus der Saeule(IDEAL FALL). Schlechte
Bindung es kommt ganz schnell aus der Saeule.
5-B- cDNA Klonierung fr die identifikation von Transkriptionsfaktoren:
mRNA aus der Zelle, die transkriptionsfaktor enthaelt, wird in cDNA umgeschreiben und in einer
Lamda Phagen genbank kloniert. E coli wird mit dieser lamda Phagen infiziert. Entstehende plaques
enthalten cDNA fr die entsprechenden Transkriptionsfaktor. Fr die Identifikation des Plaques
bentigt man spezifische Antikrper(durch antiserum aus der versuchtieren gewonnen) gegen den
Transkriptionsfaktor. Isolierung der Phagen mit cDNA Transkriptionsfaktors, danach vermehren
cDNA extrahieren und sequenzieren.
5-C- Saturierende Mutagenese Bindungstellen der einzelne basen der Promotoren untersuchen :
Einzelne Basen werden mutiert, durch Reportengen Assay wird getestet ob die noch aktiv sind oder
nicht. Man bekommt information ber Nukleotide, die fr die Bindung von Transkriptionsfaktoren
wichtig sind oder nicht.
6-A-Kotransfektion mit gekoppelten Reportergen Assay ob der Promotor von dem ausgereinigten
Transkriptionsfaktor reguliert wird oder nicht: Reportergen und ein Expression Plasmid, das den
gereinigte Transkriptionsfaktor codiert wird zu einer Zelle gleichzeitig eingebracht. Der
Expressionplasmid ist in der Lage, mRNA des enthaltenen Proteins X zu stimulieren. Bringt man beide
Plasmide zusammen, ist Protein X in der Lage synthetischen Promotor zu stimulieren. Kriegt man von
dem Reportergene dan Genprodukt.
7-A- Yeast 2 Hybrid System( Hefe 2 Hybrid System) um Protein-Protein aktivitaten zu herausfinden:
Zu der untersuchende Transkriptionsfaktor wird als Bait Domane eingestezt und die wird mit GAL4DBD fusioniert. GAL4-TAD domaene wird mit einem Protein(als Fish domaene) fusioniert, dass eine
Interaktion mit dem Transkriptionsfaktor eingehen kann fusioniert. Kommt es danach zur expression
des Histidin gens in der Hefe Zellen, gab es eine Interaktion zwischen den beiden Proteinen.

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Kennt man nicht das Protein, das mit dem transkriptionsfaktor interagiert, verwendet man als Fish
Domane eine ganze bibliothek von cDNAs. Wir haben immer das gleiche Bait Hybrid protein aber
unterschiedliche Fish hybrid Protein. Es wachst nur wenn die Fish und Bait domaene miteinader
interagieren. Fish Protein kann ber sequenz analyse identifiziert werden.
7-B- Proteomischer Ansatz Transkriptionsfaktor protein interaktion : Proteinkomplex der
Transkriptionsfaktor enthalt wird aufgereinigt durch Anhaengen eines Tags ( Aminosauresequenz) die
an eine bestimmte Domaene binden kann. Die markierte Transkriptionsfaktors wird durch diese Tags
mit seiner verbundeten Proteinen aufgereinigt. Diese Komplexe wird mit zweidimensionale
Gelelektropherese aufgetrennt. Einerseits isoelektrische fokusieren andererseits die Sds Page

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3-B- Genomische Klonierung um die Promotor zu isolieren:

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