Ingeniera Bioqumica!

Durante la confeccin textil, el tejido es

sometido a un estrs mecnico y qumico sustancial.
Para evitar la rotura de los hilos, stos son casi siempre
reforzados o aprestados (sizing, en ingls). El apresto se
puede realizar mediante tratamiento con diversos
materiales, los ms utilizados son la gelatina, la goma
guar, el alcohol polivinlico, el metacrilato, derivados de
celulosa solubles, y por ltimo, pero no menos
importante, el almidn. El requisito esencial de un
agente de apresto es que tenga una buena adhesin a los
hilos y que posteriormente se pueda retirar fcilmente.
A pesar de las muchas ventajas de los agentes de
apresto sintticos, el almidn es la mejor eleccin a
causa de su bajo coste. En Europa, el almidn
procedente de la patata es el ms utilizado, en EE.U el
procedente del maz, y en el Este asitico el de arroz.
El recubrimiento de la fibra con un agente de
apresto impide tratamientos ulteriores como tincin,
blanqueado o acabado, debido a lo cual el agente de
apresto debe de ser retirado.
El apresto de la fibra textil con almidn debe de
realizarse de tal manera que ste sea soluble en agua. La
eliminacin del almidn se puede realizar inyectando
vapores calientes con hidrxido sdico o con otros
agentes oxidantes, sin embargo ambos tratamientos
atacan de una forma muy agresiva a las fibras de
celulosa y, adems, contribuyen a la contaminacin de
las aguas residuales.
La forma ms segura y respetable con el medio
ambiente de eliminar el almidn del apresto es
utilizando un tratamiento enzimtico con -amilasas,
enzimas que hidrolizan los enlaces O-glicosdicos del
polmero de glucosa del que esta compuesto el almidn.
Un esquema de tal proceso en continuo se muestra en la
siguiente figura.

curso 2015/2016

hidrxido sdico a baja concentracin y un enjuague

con agua fra concluyen el proceso.
El departamento de investigacin y desarrollo
de la empresa textil en la que trabajis est estudiando
el uso de una -amilasa termoestable procedente de la
bacteria termoflica Pyrococcus woesei. El uso de esta
enzima permitira realizar el tratamiento con -amilasa
a temperaturas de entre 90-105C, reduciendo el tiempo
total del proceso a 2 minutos.
Para determinar la estabilidad trmica de ambas
enzimas se realiza un experimento de medida de la vida
media, o tiempo que tarda en desnaturalizarse el 50% de
las protenas en una disolucin, a una temperatura
determinada.
Las enzimas, al igual que el resto de protenas, slo se
encuentran en dos estados: activo, (Ea), e inactivo (Ei),
que reflejan las conformaciones nativa y
desnaturalizada: EaEi. La velocidad de desactivacin
es de primer orden con respecto a la concentracin de
enzima activa:

rd = kd Ea
donde rd es la constante volumtrica de desactivacin,
y kd es la constante de velocidad de desactivacin. La
velocidad de desaparicin de enzima activa se puede
expresar:

-dEa/dt = rd = kd Ea
La integracin de esta ecuacin da lugar a la expresin:

Ea = Ea0 e-kdt
donde Ea0 es la concentracin de enzima a tiempo cero.
El grado de estabilidad de las enzimas en unas
condiciones determinadas se expresa normalmente
como vida media, la cual se define como el tiempo
necesario para que se pierda la mitad de la actividad
enzimtica, y en el que la concentracin de enzima
activa es igual a Ea0/2.
En el caso de desactivacin trmica, kd se puede
expresar mediante la ecuacin de Arrhenius:

kd = A e-Ed/RT
El proceso requiere de unos 30 minutos. Tras un
prelavado y remojo de la fibra con una disolucin que
contiene -amilasa de la bacteria Bacillus
amyloliquefaciens, la hidrlisis del almidn tiene lugar
en caliente en un tanque en J, lo que permite un buen
control de permanencia y temperaturas de entre
70-80C. posteriormente, en una cmara de vapor tiene
lugar el proceso de degradacin del almidn.
Finalmente, un lavado vigoroso con agua caliente con

donde A es la constante de Arrhenius, Ed es la energa

de activacin del proceso de desnaturalizacin
enzimtica, R la constante de los gases ideales (8,314
JK-1mol-1) y T la temperatura absoluta. Ed representa
la energa que absorbe la enzima al pasar del estado
nativo al desnaturalizado.
En la tabla de abajo se puede ver el resultado de un
experimento en el que se ha medido la actividad de la amilasa de la bacteria Bacillus amyloliquefaciens y de

(Bonisch et al., 1996).

The double mutant K18G/R82E of BacTrx (Alicyclobacillus acidocaldarius
thioredoxin) had reduced heat resistance compared to the thermostable wildtype protein.
Protein dynamics analysis shows that both the mutant and wildtype protein were
!
! curso
2015/2016
globally
as rigid as the mesophilic thioredoxins! at room
temperature,
but the wildtype

Protones
no intercambiados
(%)
Unexchanged
protons (%)

Pyrococcus woesei a distintos tiempos sometida a una

temperatura de 80C.
Se ha asumido que la medida de actividad es un reflejo
de la cantidad de enzima nativa, y por lo tanto se puede
sustituir la concentracin de enzima (E) por el de su
actividad.
1) Calcula mediante regresin lineal la vida media de
ambas enzimas a dicha temperatura bajo qu
condiciones de trabajo en la industria textil utilizaras
las enzimas de P. woesei y B. amyloliquefaciens? qu
razonamiento te ha llevado a decidirlo?
Actividad enzimtica
(mol ml-1 min-1)
B. amyloliquefaciens
P. woesei

0,86

0,45

0,79

0,44

0,70

0,43

0,65

0,43

15

0,58

0,41

20

0,46

0,40

25

0,41

0,39

30

0,38

40

0,37

40

30
20
10

0
20

40

60

100

Fig. 1. Hydrogendeuterium exchange in S. acidocaldarius and porcine muscle cytosol adenylate kinases during
a temperature
Fractions
of unexchanged
protons
as a function of de
temperature were calculated
4) gradient
En la experiment.
grfica de
abajo
se muestra
la velocidad
from the normalized amide II intensities at 1546 (S. acidocaldarius enzyme) and 1542 cm!1 (porcine enzyme).
inactivacin de la protena subtilisina a 60C en funcin de
From Bonisch et al., 1996.

2) En la figura se muestra el incremento de energa libre

de estabilizacin (Gstab=H-TS) de diferentes
protenas: una mesoflica y tres termoflicas.
Qu representan los mnimos (puntos redondos
huecos) de los perfiles?
Podras indicar qu representan los puntos de corte con
el eje de las temperaturas?
Qu protena/s son meso y termoflicas?
Qu conclusiones generales se pueden extraer acerca
de los parmetros Tm, y T de mxima estabilidad y 184
Gstab en las protenas meso y termoflicas?
reviews
Justifica todas tus respuestas razonadamente.

la concentracin de Ca cmo afecta el Ca a la estabilidad

trmica de la subtilisina? cmo puedes explicar este
efecto?

[Ca] (mM)

5) Mediante calorimetra se ha medido la capacidad calorfica

(cp) de las protenas Ribonucleasa (RNase) y Mioglobina
(Mb) a diferentes pH. Segn los resultados mostrados en la
grfica de abajo, cmo afecta el pH a la estabilidad trmica
de ambas protenas? Da una explicacin justificada de ese
efecto.

16,18). The differences

in AGstab values between
mesozymes and thermozymes
can be explained by the
1
accumulation
in thermozymes
of only a few additional
hydrogen bonds, salt-bridges,
or hydrophobic
interactions. Owing
to the complexity
of protein structures, the immense
number
of mutational
combinations for a single protein prevents the definition
of
universal protein
stabilization
mechanisms.
All the
rules for proposed amino acid substitutions
between
mesozymes and thermozymes
(defined by statistical
analysesi) have been contradicted
by at least one
Figure 1
thermozyme
sequence*0z21. As is shown below, each
Comparison of theoretical mesozyme and thermozyme free energy of stabilization
thermozyme
is stabilized by a unique combination
of
(AG,,,) curves. (a)Theoretical AGStabcurve for a mesozyme with a temperature of
different mechanisms.
stability (J,; open circle)
20C and
a melting
temperature
Most molecular
mechanisms
involved
in protein
3) Enmaximal
un experimento
se ofsita
una
protena
en (J,;
unaopen
square) of 50C. (b-d) Theoretical AG,,,, curves for a thermozyme with a J, of 100C:
stabilization
have
been
based
on
mesozyme
stability
disolucin
que contiene agua deuterada a distintas
fb) the thermozyme has the same J, as the mesozyme -the thermozymes curve is
studies. Because enough thermozymes
have now been
shifted
downward;
(c)
the
thermozyme
and
mesozyme
have
different
J,
temperaturas. Transcurrido un determinado tiempo se crystallized, comparing mesozyme and thermozyme
values, but the same AG,,,, at their respective J, - the thermozymes curve is shifted
structures validates the stabilization
mechanisms proextrae
la protena y se determina la proporcin de
towards higher temperatures; (d) the thermozyme and mesozyme with the same J,
posed by earlier studies. In this review, we use these
deuterio
que
incorporado
a los grupos
values and
the ha
samesido
AG stabvalues
at J, -the thermozymes
AG,,,, curveamida
is flatter. de
structural comparisons
to illustrate our description
of
AG,,, valuesCmo
are usually compared
at 25C.
If one of thelos
enzymes
has a J, far from
la protena
podras
explicar
resultados
de laprotein stabilization mechanisms.
25C [e.g. enzyme (c)l, a comparison of their AGstabvalues at 25C is meaningless.
grfica
de abajo
seJ,estn
ensayando
Athorough
comparisonsabiendo
should include que
the J, and
of each enzyme,
and their AG,una
What makes thermozymes stable?
values atmeso
their respective
J,. termoflica?
Data accumulated on Jhermus
thermophilus phosphoprotena
y otra
Identifcalas.
Thermozymesare more rigid
glycerate kinase and cytochrome c-552 indicate that the dependence of the AG,,,
Because thermozymes
are optimally
active under
on temperature is unique to each thermozyme, and that it involves one or more of
more severely denaturing
conditions
than mesozymes,
the mechanisms shown aboveW4.
they need to be more rigid than mesozymes. This
increased
rigidity
is essential for preserving
their
The free energy of stabilization
(AGstab) of globular
catalytic active structure, and it protects them from
mesozymes is typically 5-15 kcalmolli
at 25C (Ref.
unfolding.
Such rigidity
is demonstrated
by lower
12). Most thermozymes
studied originate from therhydrogen-exchange
rates and by lower susceptibility
mophiles, but the AC&, values of only a few thermoto proteolytic
degradation
and chemical or thermal
zymes have been determined:
at 25C
the AC&
denaturant
unfolding**-24.
Although
no systematic
AG slab

80

Temperature (C)

Velocidad de inactivacin

tiempo
(min)

Adenylate kinase from

S. acidocaldarius
porcine cytosol

50

(min-1)

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