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DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA ALFA

AMILASA VEGETAL
La -amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y
cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal.
El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la
amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por
cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces - C1-C4, mientras que la
amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6,
formando cadenas ramificadas. La -amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la
amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas
(oligosacridos) como productos.
Cataliza la hidrlisis al azar de los enlaces-1,4 glucosdicos de la regin central
de la cadena de amilosa y amilopeptina exceptuando las molculascercanas a
la ramificacin, obteniendo como resultado maltosa y oligosacridos de varios
tamaos. La actividad de la enzima se determinacualitativamente mediante la
disminucin de la capacidad de la solucin dealmidn para formar el color azul
caractersticos con el yodo o midiendo ladisminucin de la viscosidad de la
suspensin de almidn.
La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y laramificada
(amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores(endoamilasa) para
formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conocecomo enzima
dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,acrodextrina y
maltodextrina) con poca produccin de maltosa.
El almidn es un polmero semicristalino de glucosa de gran abundancia enla
naturaleza. La cantidad de almidn contenido en el grano de cereal varia,pero
generalmente oscila entre el 60 y 75 % del peso del grano. El almidnpresente
en los granos es el ms importante de los carbohidratos para finesindustriales
resultando preciso degradarlo enzimticamente con unagelatinizacin previa
por accin de calor o sometindolo a un intensotrabajo mecnico. El almidn
consta de dos fracciones: amilosa yamilopectina
El objetivo de esta prctica fue determinar la activad especfica de la amilasa
vegetal y la actividad enzimtica de una amilasa, extrada de trigo perminado,
luego dosandolo almidn residual.

II. MATERIALES Y MTODOS:


Se procedi a machacar las races del trigo y de la cebada con
10 ml de buffer + cloruro de calcio hasta obtener la cantidad
del sustrato suficiente para nuestra realizacin de nuestra
prctica.
Luego de machacar las races se procedi a colarla en el
embudo y con ayuda de una gasa a filtrar.
Luego se procedi a filtrar en un embudo con ayuda de una
gasa.

III. RESULTADOS:
6.1. PARA LA DEMOSTRACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
Se cogieron 4 tubos de ensayo y se prepar el sistema con las enzimas y los
reactivos como se muestra en la tabla N 01.
TABLA N1: Se arm el siguiente sistema.

N TUBOS
SUSTRATO

II

III

IV

1
incubador
a

30
0.1

51'
0.2

0.3

incubador
a

30

15'

1
Reparar
9.9
0.5

1
5'
9.8
0.5

9.7
0,5

9.6
0.5

Enzimas
cido
clorhdrico
H20
Lugol

Se llev a cabo en la incubadora del espectrofotmetro a 620 nm, obteniendo


los resultados como se muestra en la tabla N02.
TABLA N 2: La actividad enzimtica en el espectrofotmetro a 620 nm

N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

ABSROBANCIA
TRIGO
0.277
0.018
0.020
0.019
0.0835

ABSORBANCIA
CEBADA
0.237
0.018
0.040
0.069
0.091

Los resultados obtenidos no fueron de forma ascendente como se


espera los resultados, esto se debe a que tal vez en el proceso en armar
el sistema enzimtico, la cantidad enzimtica quiz no fue lo suficiente.

6.1.1. Determinacin de la concentracin del almidn (mg/ml), multiplicando


absorbancia por factor de calibracin.
Concentracin
Concentracin
TABLA A
(mg/ml)
(mg/ml)
N TUBO
TRIGO
CEBADA
I
2.77
2.37
II
0.18
0.18
III
0.2
0.4
IV
0.19
0.69
Promedio
0.835
0.91

6.1.2. Clculo de las unidades de enzima (U):

TABLA B
N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

Unidad
enzimtica
(mg/mn)
TRIGO

Unidad
enzimtica
(mg/mn)
CEBADA

0.185
0.012
0.013
0.0127
0.055675

0.158
0.012
0.027
0.046
0.06075

6.1.3. Determinar mg de protena/ml = Absorbancia X Factor:

TABLA C
N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

Protena
(mg/mn)
TRIGO

Protena
(mg/mn)
CEBADA

2.77
0.18
0.2
0.19
0.835

2.37
0.18
0.4
0.69
0.91

6.1.4. Determinacin de la Actividad Especfica (AE):

TABLA D
N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

Actividad
Actividad
Especfica (AE) Especfica (AE
TRIGO
CEBADA
0.066787
0.06666667
0.065
0.06684211
0.06632394

0.06666667
0.06666667
0.0675
0.06666667
0.066875

6.2. PARA LA DE DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECIFIVA.


Se cogieron 4 tubos de ensayos y se procedi a preparar la actividad
enzimtica aplicando el reactivo de biuret como se muestra en la
tabla N 03.
Se realiz el procedimiento tal cual muestra la tabla N 04 y se
agreg al final el reactivo de lugol para luego ser llevada al
espectrofotmetro.
TABLA N 3:

Se prepar para la determinacin de la actividad especfica

N TUBOS (ml)
Preparado
enzimtico

Agua destilada
Reactivo de
biuret

II

III

IV

0.2

0.1

0.05

0.8

0.9

0.95

4
4
4
4
Luego se llev a la incubadora del espectrofotmetro a 540 nm, obteniendo los
resultados como se muestra en la tabla N04.

TABLA N 4: La actividad especfica con

N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

espectrofotmetro a 540 nm
ABSORBANCIA
ABSORBANCIA
TRIGO
CEBADA
0.049
0.074
0.057
0.056
0.059

0.044
0.080
0.058
0.050
0.043

En este caso tambin obtuvimos un resultado no esperado. Lo cual nos


arrojaba de forma dispareja y no ascendente.
6.2.1. Determinacin de la concentracin del almidn (mg/ml), multiplicando
absorbancia por factor de calibracin.
Concentracin
Concentracin
TABLA A
(mg/ml)
(mg/ml)
N TUBO
TRIGO
CEBADA
I
0.49
0.44
II
0.74
0.8
III
0.57
0.58
IV
0.56
0.5
Promedio
0.59
0.58

6.2.2. Clculo de las unidades de enzima (U):

TABLA B
N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

Unidad
enzimtica
(mg/mn)
TRIGO

Unidad
enzimtica
(mg/mn)
CEBADA

0.327
0.0493
0.038
0.0373
0.1129

0.293
0.053
0.039
0.033
0.1045

6.2.3. Determinar mg de protena/ml = Absorbancia X Factor


Protena
Protena
TABLA C
(mg/ml)
(mg/ml)
N TUBO
TRIGO
CEBADA
I
0.49
0.44
II
0.74
0.8
III
0.57
0.58
IV
0.56
0.5
Promedio
0.59
0.58
6.2.4. Determinacin de la Actividad Especfica (AE):

TABLA D
N TUBO
I
II
III
IV
Promedio

Actividad
Especfica
(AE)
TRIGO

Actividad
Especfica
(AE)
CEBADA

0.66734694
0.06662162
0.06666667
0.06660714
0.21681059

0.66590909
0.06625
0.06724138
0.066
0.21635012

IV. CONCLUSION

Logramos determinar la actividad enzimtica en las dos experiencias


realizadas con semillas germinadas de trigo y cebada, en los cuatro
tubos pudimos notar la formacin de anillos y tambin la formacin de
precipitado en pequeas y grandes cantidades.

Identificamos y obtuvimos de los ndices de absorbancia con la ayuda


del espectrofotmetro y los datos nos indican un comportamiento similar
de la actividad enzimtica en ambas semillas.
Logramos determinar la actividad especfica del preparado enzimtico
del trigo, y esto lo pudimos notarlo por la formacin de anillos de color
anaranjado oscuro y de color azul fuerte que se present en el primer
tubo. Aprendimos el procedimiento que se debe utilizar para extraer la
amilasa de vegetales, en nuestro caso fue con las semillas de trigo y
cebada, donde utilizamos las races de las semillas adicionadas con
reactivos que permitieron obtener el preparado enzimtico.

V. DISCUSION
La amilasa es una de las enzimas ms estudiadas debido a su rol de
degradacin del almidn, ya que permite una germinacin de las semillas, el
cual es degradado por los enlaces 1-4 del interior (endoamilasa) en diferentes
dextrinas, que debido a su disminucin en tamao puede ser hidrolizada por la
B-amilasa, sin embargo la -amilasa es una enzima que se encuentra regulada
tanto por hormonas, o diferentes factores, tales como la temperatura y el pH,
adems posee un peso molecular de 50 Kda aproximadamente .La
germinacin se lleva con la hidratacin y posterior liberacin de giberelinas, las
cuales inducen la sntesis de las enzimas hidrolticas, que hidrolizan el almidn
que se encuentra el endosperma, produciendo glucosa que es transportada por
difusin, para generar energa.
El alfa-amilasa se encuentra ampliamente distribuida en el reino vegetal,
particularmente en las semillas con reservas de hidratos de carbono como el
trigo, la cebada, de donde ha sido posible aislarla en forma pura. Su peso
molecular es alrededor de 60.000, esta se secreta al endospermo amilceo de
las semillas de cereales por dos tejidos, el cotiledn y la capa de aleurona,
degradando las macromolculas de amilosa y amilopectina en pequeos
fragmentos de 6 a 7 unidades de glucosa.
La amilosa se colorea de azul en presencia de yodo, debido a la absorcin o
fijacin del yodo en la superficie de la molcula de amilosa, lo cual solo ocurre
en frio. Es conveniente aclarar que este proceso no es una reaccin qumica,
ya que no se producen sustancias nuevas, como reactivo para identificar el
almidn se usa una solucin denominad lugol.
La prueba del Lugol se realiza para identificar la presencia de polisacridos, si
despus de aadir los digeridos a los tubos de lugol se observa que tiene un
color azul, eso significa que hay presencia de almidn por lo tanto la reaccin
no tuvo lugar, por otro lado si la reaccin da un color amarillo intenso, eso
quiere decir que no hay presencia de almidn por lo tanto, hay si tuvo lugar la
actividad de la enzima

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:


Braverman, J.B. 1980. Introduccin a la Bioqumica de los alimentos. El
manual moderno. Mxico.

Villavicencio, M. 1993. Bioqumica. Tomo I. Consejo Nacional de


Ciencia y Tecnologa. Lima Per.

Horna, E. 1988. Enzimas. Mdulo 03 de Bioqumica. Universidad


Nacional del Santa. Chimbote Per.
Metzler, E.D. 1981. Bioqumica, Omega. Barcelona.