UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE MICROBIOLOGIA
ORIENTACION EN MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

Investigacin Microbiologa Industrial

(MB- 380)

Deteccin molecular de cepas de E. coli O157:H7

Presentado por:
Kellyn Yolibeth Escobar Baquedano 20122300067

Asesoras del proyecto:

Dra. Lourdez Enrriquez Midence
Dra: Anabelle Ferrera

Ciudad Universitaria 29 de abril, ao 2016

Tegucigalpa, Francisco Morazn

CONTENIDO
RESUMEN............................................................................................................ 3
INTRODUCCION................................................................................................... 4
ANTECEDENTES.................................................................................................. 5
Evaluacin de Resistencia a Antibiticos :..........................................................7
METODOLOGIA.................................................................................................... 8
Lugar de trabajo:............................................................................................... 8
Muestras:.......................................................................................................... 8
Reactivacin de cepas....................................................................................... 9
Extraccin de cidos Nucleicos por el Mtodo de BOON....................................9
Reaccin en Cadena de la Polimerasa Multiplex..................................................9
Electroforesis.................................................................................................. 10
Evaluacin de Resistencia a Antibiticos.........................................................10
Obtencin y Conservacin de Replicas............................................................10
RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................... 11
Caracterizacin Molecular................................................................................ 11
Evaluacin de Resistencia a Antibiticos.........................................................13
CONCLUSION.................................................................................................... 14
BIBLIOGRAFIA................................................................................................... 15
AGRADECIMIENTOS........................................................................................... 16
ANEXOS............................................................................................................ 17

RESUMEN
Escherichia

coli

es

una

especie

dentro

de

la

familia

de

bacterias

enterobacteriaceae, es un bacilo Gram-negativo, que puede ser inmvil o usar

flagelos

pertricos

quimiorganotrficos,

para
capaces

la

movilidad.
de

crecer

Son
con

anaerobios

metabolismo

facultativos,
respiratorio

fermentativo. Esta especie forma parte de la microbiota intestinal de los humanos

y de los animales de sangre caliente por lo que normalmente es inofensiva, Sin
embargo, desde principios del siglo XX se conoce la naturaleza patognica de
determinados serotipos de E. coli.
En los ltimos aos, E. coli 0157: H7 y otras cepas productoras de toxina similar a
Shiga se han transmitido a travs de los alimentos causando enfermedades que
van desde diarrea con sangre, y en casos ms graves, como el sndrome urmico
hemoltico.
Este estudio se realiz con la finalidad de caracterizar molecularmente 17 cepas
de Escherichia coli que fueron aisladas de quesos artesanales y lechuga y cuyas
caractersticas fenotpicas indicaban la posible presencia de Escherichia coli
O157:H7. Para corroborar esta hiptesis se realiz la tcnica de PCR multiplex
para la identificacin de las toxinas Shiga 1 y 2. Los resultados obtenidos no
fueron los esperados ya que para ninguna de las cepas fue posible la
amplificacin de las secuencias genticas que codifican para la produccin de
estas toxinas

INTRODUCCION
Las infecciones e intoxicaciones asociadas al consumo de alimentos suponen una
preocupacin creciente a nivel mundial. Los datos aportados sugieren que en los
ltimos aos se ha producido un ligero incremento en los casos de toxiinfecciones
asociadas

al

consumo

de

alimentos.

Generalmente,

las

toxiinfecciones

alimentarias se asocian a alimentos de origen animal o derivados como productos

crnicos, huevos, productos lcteos.
El cambio de hbitos producido en la sociedad actual que incluye comer de forma
regular fuera de casa o la creciente demanda de comidas preparadas y alimentos
mnimamente procesados, ha repercutido de forma notable en el aumento del
nmero de brotes de toxiinfecciones alimentarias.
Entre los patgenos que habitualmente se investigan en alimentos debido a su
gran impacto en la salud pblica destaca E. coli 0157:H7 que ha sido catalogado
como responsable de grandes brotes ocurridos a lo largo de la historia. El
desarrollo y la automatizacin de los mtodos de PCR abren una gran oportunidad
para su aplicacin como herramientas analticas en microbiologa y control de
calidad de los alimentos, debido a su rapidez, alta sensibilidad y eficiencia para la
deteccin temprana de los patgenos. De ese modo, contribuirn notablemente a
la prevencin tanto de ETA como de sus consecuencias.
El PCR se basa en la replicacin celular, en la que actan varias protenas para
sintetizar dos nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona como molde, lo
que da a la tcnica total especificidad. (Barcenas, 2009)
En el presente estudio esta ser la herramienta utilizada para la identificacin
definitiva de cepas cuyas caractersticas fenotpicas sugieren que pudiera tratarse
de

E. coli O157:H7, estas cepas fueron

procedentes de quesos artesanales y lechugas.

obtenidas a partir de muestras

ANTECEDENTES
Escherichia coli es una especie dentro de la familia de bacterias conocida como
Enterobacteriaceae. , es un bacilo Gram-negativo, que puede ser inmvil o usar
flagelos

pertricos

quimiorganotrficos,

para

la

capaces

movilidad.
de

crecer

Son
con

anaerbicos
metabolismo

facultativos,
respiratorio

fermentativo. E. coli tiene una funcin til en el cuerpo inhibiendo el crecimiento de

especies de bacterias patgenas y sintetizando cantidades apreciables de
vitaminas. Esta especie forma parte de la microbiota intestinal de los humanos y
de los animales de sangre caliente por lo que normalmente es inofensiva, Sin
embargo, desde principios del siglo XX se conoce la naturaleza patognica de
determinados serotipos de E. coli.
E. coli O157:H7, del grupo filognico E, es una cepa enterohemorrgica (EHEC)
que produce grandes cantidades de una o ms potentes toxinas estrechamente
relacionadas con las producidas por Shiguella dysenteriae. La enfermedad aguda
causada por la bacteria es llamada colitis hemorrgica y es caracterizada por
severos clicos y diarrea. Adicionalmente, la infeccin por E. coli O157:H7 puede
causar el sndrome urmico hemoltico (SUH), una enfermedad severa
caracterizada por hemlisis y fallas renales. (Calvo, 2011)
E. coli enterohemorrgica O157:H7 (EHEC): Su nombre se origina del antgeno
somtico [O] 157 y el sptimo antgeno flagelar [H]. El antgeno [O] se deriva de la
pared celular y el [H] del flagelo; este ltimo se encuentra solo en especies
motiles. Las toxinas Shiga-like (Stx) son el principal factor de patogenicidad de E.
coli O157:H7. (Calvo, 2011)
En los ltimos aos, E. coli 0157: H7 y otras cepas productoras de toxina similar a
Shiga se han transmitido a travs de los alimentos causando enfermedades que
van desde diarrea con sangre, y en casos ms graves, como el sndrome urmico
hemoltico.

(Riemann, 2008) . El principal reservorio de E. coli O157: H7 son

animales rumiantes (por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, ciervos). Las infecciones
se adquieren por el consumo de agua o alimentos (especialmente carne)

contaminados con materia fecal, a travs de la transmisin de persona a persona,

y por el contacto con los animales colonizados y sus entornos. (Laidler, 2013).
La transmisin ha sido habitualmente asociada al consumo de carne de vacuno
cocida inadecuadamente y leche no pasteurizada. Asimismo, se ha relacionado
con el consumo de frutas y hortalizas fertilizadas con estircol de rumiantes o
contaminadas durante su cosecha o procesamiento, y al contacto directo con
animales o personas infectadas. (Rivera, 2013)
La deteccin y cuantificacin de microorganismos patgenos en alimentos es uno
de los grandes retos a los que se enfrenta la industria alimentaria actualmente. La
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) es un mtodo selectivo y sensible que
amplifica regiones especficas de un gen. Para minimizar tiempo y materiales, los
cebadores o primers pueden ser combinados en una reaccin nica (PCR
mltiple) que puede detectar varios genes en una sola muestra. Se puede realizar
en menor tiempo y adaptar el anlisis de grandes nmeros de muestras. Mediante
esta tcnica se detectan secuencias de los genes que codifican los antgenos
somtico O157 y flagelar H7 y con otra los genes de las verotoxinas VT1, VT2 y
(gen de la intimina) de O157:H7. (Morales, 2008)
Ms de 100 serotipos de E. coli pueden producir toxinas Shiga. Varios casos
espordicos, grandes brotes y enfermedades en todo el mundo se han asociado
con organismos STEC, principalmente la E. coli O157: H7. La toxina Shiga
producida se considera la principal caracterstica de virulencia responsable de
enfermedades graves asociadas con este organismo. Por lo tanto, la presencia de
estas citotoxinas o sus genes (stx1 y stx2) es el foco de muchos ensayos para
organismos STEC.

Debido a la predominancia del serotipo O157: H7 STEC

asociado con enfermedades en humanos, muchos mtodos tambin se centran

en la deteccin e identificacin de este serogrupo. La deteccin de los genes stx1
y stx2 son la base de la amplificacin del PCR multiplex. (Jinneman, 2003)
Se realiz el anlisis de 17 cepas de Escherichia coli aisladas a partir de muestras
de quesos artesanales y lechuga que haban sido conservadas en periodos

anteriores y cuyas caractersticas fenotpicas (No fermentan sorbitol) sugeran la

posible presencia de Eschirichia coli O157:H7.
Evaluacin de Resistencia a Antibiticos La difusin salvaje de la resistencia
antimicrobiana entre las poblaciones bacterianas es un problema creciente en todo
el

mundo.

Desde

el

descubrimiento

de

los

primeros

antibiticos,

los

microorganismos han sido capaces de evadir su accin. (PONCE, 2015). La

evaluacin de la resistencia a antibiticos para las 14 cepas aisladas de quesos
artesanales fue evaluada anteriormente, obtenindose los siguientes resultados:
. De
Cepa

Amika Tetraci Ampic

cina
clina
ilina
30mcg 30mcg 10mcg

IL-001
O157
IL-019

21mm
(S)
23mm
(s)
22mm
(S)
24mm
(s)

28mm
(S)
27mm
(s)
29mm
(S)
30mm
(s)

30mm
(S)
23mm
(s)
25mm
(S)
26mm
(s)

cido Ceftria
Noladi zona
xico
30mcg
30mcg
31mm 36mm
(S)
(S)
29mm 34mm
(s)
(s)
29mm 32mm
(S)
(S)
29mm 33mm
(s)
(s)

20mm
(s)
22mm
(s)
20mm
(s)
20mm
(s)
22mm
(S)
24mm
(s)
15mm
(i)
20mm
(s)
19mm
(s)
25mm

21mm
(s)
30mm
(s)
15mm
(s)
24mm
(s)
26mm
(S)
30mm
(s)
19mm
(s)
22mm
(s)
19 mm
(s)
30mm

16mm
(I)
25mm
(s)
24mm
(s)
25mm
(s)
29mm
(S)
26mm
(s)
19mm
(s)
19mm
(s)
16mm
(I)
27mm

20mm
(s)
29mm
(s)
24mm
(s)
25mm
(s)
24mm
(S)
32mm(
s)
19mm
(s)
20mm
(s)
18mm
(I)
24mm

IL-021
IL-024

IL-029
IL-030
IL-032
IL-036
IL-046
IL-047
IL-048
IL-053
IL-055
IL-057

27mm
(s)
32mm
(s)
30mm
(s)
29mm
(s)
30mm
(S)
36mm
(s)
26mm
(s)
30mm
(s)
25mm
(s)
32mm

Trimetr
opinSulfa
25mcg
28mm
(S)
28mm
(s)
25mm
(S)
22mm
(s)

Cloranf
enicol
30mcg

Genta
micina
10mcg

35mm
(S)
31mm
(s)
33mm
(S)
33mm
(s)

25mm
(S)
22mm
(s)
25mm
(S)
25mm
(s)

27mm
(s)
24mm
(s)
28mm
(s)
28mm
(s)
30mm
(S)
21mm
(s)
23mm
(s)
26mm
(s)
25mm
(s)
31mm

26mm
(s)
30mm
(s)
29mm
(s)
28mm
(s)
27mm
(S)
25mm
(s)
21mm
(s)
29mm
(s)
21mm
(s)
30mm

22mm
(s)
23mm
(s)
20mm
(s)
22mm
(s)
23mm
(S)
20mm
(s)
16mm
(s)
19mm
(s)
18mm
(s)
28mm

(s)

(s)

(s)

(s)

(s)

(s)

(s)

(s)

METODOLOGIA
Lugar de trabajo:
- Laboratorio Teasdale Corti Maestra en enfermedades infecciosas y
zoonticas (MEIZ), ubicado en la escuela de Microbiologa de la Universidad
-

Nacional Autnoma de Honduras (UNAH)

Laboratorio de biologa molecular, primer piso, edificio J1 de la Universidad
Nacional de Honduras.

Materiales
Tubos de ensayo
Gradillas
Placas Petri
Algodn
Esptula
Platos para balanza
Beaker
Probetas
Papel toalla
Cinta indicadora
Masking tape
Tijeras
Viales
Papel parafilm
Marcador
Puntas para micropipetas
Perillas
Discos de antibiticos
Escala de McFarland

Equipos (Instrumental)
Balanza analtica
Cmara de flujo laminar
Autoclave
Planchas
Incubadora
ErlenMayer
Pipetas
Micropipetas
Bortex
Camara de electroforesis
Refrigeradora
Termociclador
Cronometro
Centrifuga
Plancha de agitacin
Incinerador
Azas bacteriolgicas
Transiluminador
Agitador
Plato trmico
Cmara

Muestras:
En este proyecto se trabaj con 17 cepas que fueron aisladas en periodos
anteriores a partir de quesos artesanales de distinta procedencia (14) y otras que
se aislaron de lechuga (3), estas fueron conservadas por el mtodo de
congelacin y reactivadas para realizar esta investigacin. Adems se trabajaron 2

controles de cepas de referencia: ATCC 25922 como control positivo y la ATCC

933 como cepa control negativo.
Reactivacin de cepas
- Recepcin de un total de 19 cepas para realizacin del proyecto investigativo
incluyendo controles negativos y positivos.
- Inoculacin de cepas en caldo Infusin Cerebro Corazn para comprobar la
viabilidad de las cepas.
- Inoculacin de cepas provenientes del caldo Infusin Cerebro Corazn en agar
Mc Conkey para evaluar pureza de las cepas.
Extraccin de cidos Nucleicos por el Mtodo de BOON
- Inoculacin de caldos HBI para tener cultivos jvenes listos para extraccin
- tratamiento de las cepas con los tampones de lisis (L6) y lavado (L2) y dems
soluciones como el etanol, acetona y agua que hacen posible la extraccin y
purificacin de los cidos nucleicos.
Reaccin en Cadena de la Polimerasa Multiplex
Preparacin de la Muestra: EHEC
Ingrediente
Buffer
dNTPs
Primer 1 (stx 1 F)
Primer 2 (stx 1 R)
Primer 3 (stx 1 F)
Primer 4 (stx 2 R)
MgCl2
DdH2O
Taq
Vol. Mezcla
Vol. Muestra
Vol. Total

Descripcin
10x
1.25 Nm
25 uM
25 uM
25 uM
25 uM
25uM

Concentracin
1X
0.1 Mm
0.5 uM
0.5 uM
0.5 uM
0.5 uM
2.5 uM

5U/uL

1.2U/uL

l/Tubo
2.5
2
0.5
0.5
0.5
0.5
2.5
13.755
0.25
23
2
25

Parmetros de Amplificacin:
Termociclador
Paso

Temp. (C)

Tiempo

Desnaturalizacin Inicial

94

10 min.

Desnaturalizacin
Hibridacin
Extensin
Extensin Final
Temperatura Final

94
58
72
72
4

30 seg.
30 seg.
30 seg.
3 min.

No. de
ciclos
1

30
1

Electroforesis
Para la visualizacin de los productos de la amplificacin del PCR multiplex se
realiz la electroforesis en geles de agarosa al 2%.
Evaluacin de Resistencia a Antibiticos
Se evalu la resistencia a antibiticos de las cepa IL-15B, IL-19A y 19B, por el
mtodo de Kirby-Bauer en agar Mueller himton. Los antibiticos evaluados fueron:
ampicilina,

gentamicina, eritromicina, tetraciclina, ceftriaxone, cido noladixico y

cloranfenicol.
Obtencin y Conservacin de Replicas
A partir de cada una de las cepas en estudio reactivadas, tomar un volumen de
200 l de cada una de ellas y transferir a 3 ml de caldo Infusin Cerebro Corazn,
pasadas 24 horas tomar 1000 l ms 200 l de glicerol al 20%, mezclar y llevar a
congelacin.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Caracterizacin Molecular
La reactivacin se logr con la inoculacin de las cepas en el caldo Infusin
Cerebro Corazn, comprobndose la viabilidad del total de cepas inoculadas. Para
la evaluacin de pureza se inocularon las cepas por la tcnica de frobisher en
agar McConkey, verificndose la pureza de las cepas en estudio.
Para verificar los resultados que se haban proporcionado de las cepas aisladas
de lechuga se inocularon las cepas en agar McConkey sorbitol, adems de un
control positivo (EDL-933) y un control negativo (ATCC 25922), obtenindose los
siguientes resultados:
No. de Cepa

Resultado
Fermenta

IL-19 A
IL-19 B
IL-15 B
ATCC-25922
EDL -933

No
Fermenta
X
X

X
X
X

El agar McConkey sorbitol es un medio de diferenciacin parcialmente selectivo

para el aislamiento de E. coli O157:H7 a partir de muestras clnicas, veterinarias,
alimentarias y medioambientales. Habitualmente, las cepas O157 son diferentes
de las cepas normales de E. coli por dar resultado negativo a sorbitol y betaglucuronidasa (-gluc). Por tanto, se pueden diferenciar de E. coli normal
mediante pruebas bioqumicas, cuando se incluyen los sustratos adecuados en los
medios bacteriolgicos. La mayora de las cepas hemorrgicas de E. coli no
fermentan

D-sorbitol y producen colonias incoloras en agar MacConkey Sorbitol

(BD, 2003)
Para la caracterizacin molecular se realiz la extraccin de ADN por el mtodo
de BOOM, se utiliz la tcnica de PCR multiplex para la deteccin de la toxina

Shiga 1 y toxina Shiga 2 para las 17 cepas en estudio, obtenindose los siguientes
resultados:

No. de Cepa

Toxina Shiga 1
Amplifico

IL-001
O157
IL-019
IL-021
IL-024
IL-029
IL-030
IL-032
IL-036
IL-046
IL-047
IL-048
IL-053
IL-055
IL-057
IL-19A
IL-19B
IL-15B
ATCC-25922
EDL 933

No amplifico

Toxina Shiga 2
Amplifico

No amplifico

X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X

X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X

Los resultados obtenidos no son los esperados, ya que unas de las caractersticas
que se utilizan para hacer la identificacin presuntiva de Escherichia coli O157:H7
es la incapacidad que estas tienen para fermentar el sorbitol. Por razones
desconocidas, las cepas investigadas en este estudio perdieron su capacidad de
fermentacin de sorbitol, pudiendo ser una casa el nivel de estrs de las cepas o
alguna mutacin gentica. Son muchos los casos donde se dan los aislados
menos comunes de E. coli 0157: H (no mviles), que fermentan sorbitol y son
positivos a betaglucoronidasa y no se identificarn por aislamiento en los medios
selectivos escogidos por estas caractersticas bioqumicas (Cueva, 2009). La no
fermentacin

de sorbitol no tiene un significado mayor que el de ser una

caracterstica de las cepas de E. coli O157:H7, esto no es una prueba

confirmatoria, solo se usa para poder orientar la identificacin hacia este grupo.
Para hacer una identificacin definitiva se debe proceder a la cerotipificacion de
estas cepas es decir hacer la identificacin de los antgenos flagelar (H) y
somtico (O), adems de identificarse la produccin de las toxinas responsables
de la patogenicidad de las cepas.
Evaluacin de Resistencia a Antibiticos
Se evalu la resistencia a antibiticos de las cepas IL-15B, IL-19A y la IL-19B con
los siguientes resultados:
No. de
cepa

Ampici
lina
10mcg

IL-15B

20mm
(S)
21mm
(S)
19mm
(S)

IL-19A
IL-19B

Gentami Eritromicina
cina
30mcg
15 mcg

24mm
(S)
25mm
(S)
19mm
(S)

19mm
(S)
20mm
(S)
16mm
(S)

Tetraci
clina
30mcg

Ceftriaxone
30 mcg

cido
Noladixico
30mcg

Cloranfe
ni-col
30mcg

24mm
(S)
24mm
(S)
27mm
(S)

33mm
(S)
25mm
(S)
30mm
(S)

22mm
(S)
24mm
(S)
25mm
(S)

30mm
30mm
30mm

La susceptibilidad de Escherichia coli a las familias de las penicilinas, fenicoles,

quinolonas, aminoglucocidos y cefalosporinas fue evidenciada en este estudio,
solo se observ susceptibilidad parcial o intermedia a eritromicina posiblemente
por una exposicin previa de la cepa a este macrolido que le confiri cierta
resistencia.

Escherichia coli posee muchos mecanismos de resistencia a

antibiticos pero no siempre puede expresarlos por ejemplo se puede destacar la

expresin en E. coli de su betalactamasa de clase C (tipo Amp-C). El gen que
codifica para esta enzima capaz de romper distintos antibiticos betalactmicos
(ver ms adelante) se encuentra naturalmente codificado en el cromosoma de
dicha bacteria, sin embargo la expresin de esta enzima es mnima debido a que
este microorganismo carece del promotor natural (Amp-R). De este modo, si bien
E. coli posee un gen capaz de producir un efectivo mecanismo de resistencia, su

escasa expresin hace que el microorganismo pueda comportarse como sensible

a ampicilina.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En base a los resultados
circulacin comprobada

obtenidos podemos

concluir que no hay

de cepas de Escherichia coli O157:H7 ,

cabe

mencionar que el queso y la lechuga son solo dos de los muchos alimentos
que se ven involucrados en la transmisin de este patgeno por lo que no
es posible descartar la posibilidad de su presencia en nuestro medio.
La no fermentacin del sorbitol es una caracterstica fenotpica que nos
ayuda a orientar nuestro diagnostico la identificacin de Escherichia coli
O157:H7 pero no es una caracterstica que sea usada como criterio
definitivo de identificacin.
Se debe hacer la confirmacin del serotipo de estas cepas e implementar
pruebas moleculares para identificar la presencia de factores de virulencia
caractersticos de dichos organismos.
En cuanto la evaluacin de la resistencia a antibiticos todas la cepas
evaluadas mostraron susceptibilidad a los antibiticos con los cuales se
confrontaron, solo se observ una susceptibilidad intermedia a la exposicin
a eritromicina posiblemente porque la pared de las bacterias Gram
negativas presenta cierta impermeabilidad a los macrolidos.

BIBLIOGRAFIA
Barcenas, P. E. (14 de abril de 2009). Universisdad de Valencia . Obtenido de
http://mobiroderic.uv.es/bitstream/handle/10550/38154/AAIU607776.pdf
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BD. (15 de Junio de 2003). INSTRUCCIONES DE USO- MEDIOS EN PLACA LISTOS
PARA USAR. Obtenido de
https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/HB/CE/PA/ES-PA254455.pdf
Calvo, J. C. (19 de julio de 2011). unilibrebaq. Obtenido de
http://www.unilibrebaq.edu.co/unilibrebaq/revistas2/index.php/biociencia
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Jinneman, K. C. (31 de julio de 2003). Multiplex Real-Time PCR Method To
Identify Shiga Toxin Genes stx1. aem.org, 7.
Laidler, M. R. (08 de Junio de 2013). OsfordJorunals. Obtenido de
https://cid.oxfordjournals.org/content/57/8/1129.full
Morales, A. (2008). DETECCIN MEDIANTE PCR-MULTIPLEX DE Escherichia coli
O157:H7 EN. Inifap , 167.
PONCE, L. J. (2015). Evaluacion de la Resisencia a Antibioticos de Escherichia
coli. Tegucigalpa, Honduras: desconocida .
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http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0749072015302784
Rivera, F. P. (MARZO de 2013). FIHU. Obtenido de http://www.fihudiagnostico.org.pe/revista/numeros/2013/ene-mar/23-26.html#pie

AGRADECIMIENTOS
A Dios todo poderoso por darme la

sabidura, determinacin y las fuerzas

necesarias para llevar a cabo este proyecto. A la Dra. Loudes Enriquez de Madrid
por la oportunidad que me dio de participar en este proyecto que es una nueva
experiencia en mi formacin profesional. A la Doctora Anabelle Ferrera por la
orientacin dada, a la Doctora Yessy Matamoros por la colaboracin, la paciencia
y los conocimientos compartidos durante el desarrollo de este proyecto. A mis
compaeras por la colaboracin prestada en estos ltimos meses.

ANEXOS
Evaluacin de viabilidad y pureza de cepas en agar McConkey
IL-019

IL-021

Imagen muestra la pureza de cepas aisladas de quesos y control positivo.

Evaluacin de la fermentacin del sorbitol en agar McConkey sorbitol:

Imagen muestra la fermentacin de sorbitol para la cepa IL-15B y la no
fermentacin de sorbitol para la cepa IL-19B

Resultados de fermentacin para las cepas control negativo ATCC 25922(1) y la

25922(2) cepa control positivo EDL-933 y las tres cepas aisladas de lechuga (IL15B, IL-19A, IL-19B)

Resultados del PCR

1. Imagen muestra los resultados negativos para muestra IL-001 e IL-019,

adems de los resultados de control positivo y control negativo.

2. Se observan resultados negativos para cepas evaluadas, y el resultado

positivo del control que nos valida la corrida.

3- La siguiente imagen muestra los resultados de la ltima corrida, donde tampoco

se obtuvo amplificacin para las cepas en estudio.

Evaluacin de resistencia a antibiticos:

Imagen muestra la susceptibilidad de la cepa IL-19A al cido noladixico,
gentamicina y resistencia a la eritromicina.

Imagen muestra la susceptibilidad de la cepa IL-15B al cloranfenicol, ampicilina,

tetraciclina y ceftriaxone.

Imagen muestra la susceptibilidad de la cepa IL-19B al cloranfenicol, ampicilina,

tetraciclina y ceftriaxone.