INSTITUTO POLITCNICO

NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE
CIENCIAS BIOLGICAS
LABORATORIO DE MTODOS DE
ANLISIS
PRCTICA:
DETERMINACIN DE LA ACTIVIAD DE
ENZIMS PROTEOLTICAS. MTODO DE
KUNITZ
Alumno: Amaro Beatriz Uriel
Grupo: 5QM1
Seccin: 1
Profesor que evala:
Benitez Ibarra Rogelio

Fecha de entrega: 22/09/2016

FUNDAMENTO DEL MTODO DE KUNITZ

El mtodo se fundamenta en el cambio de solubilidad de una protena en cido
tricloroactico (ATC) cuando est sujeta a la accin de una enzima proteolitica. 2
Mide la cantidad de pptidos y/o aminocidos que sean solubles durante la
hidrlisis. Dichos compuestos, o al menos algunos, absorbern a 280 nm.
OBJETIVOS

Establecer una curva de actividad enzimtica estndar.

Determinar la actividad enzimtica de la bromelana y la papana (enzimas
proteolticas) a partir de una curva estndar de actividad enzimtica de la
Tripsina.
Determinar cul de las enzimas empleadas tienen mayor actividad
enzimtica sobre el mismo sustrato.

RESULTADOS
Tabla 1. Datos para la curva de Actividad enzimtica de la Tripsina y de los Problemas de
las enzimas a determinar su actividad.
Tubo
T1
T2
T3
T4
T5

y
y
y
y
y

1
2
3
4
5

TI y I
TII y II
Tlll y lll
TlV y IV

Conc. de
Tripsina
(mg/mL)
0.04
0.08
0.12
0.16
0.2

A280
Problem
Testigo
a
0.221
0.049
0.367
0.051
0.455
0.059
0.549
0.054
0.588
0.067
Problemas
Bromelana
0.727
0.44
1:10
Bromelana
0.417
0.269
1:20
Papana 1:2
1.147
0.331
Papana 1:4
0.681
0.216

A280
corregid
a

0.172
0.316
0.396
0.495
0.521
0.287
0.148
0.818
0.465

12
10
8

A280 corregida

6
4
2
0
0.02 0.04f(x)
0.06
=0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0.18 0.2 0.22
R = 0

Concentracin de Tripsina (mg/mL)

Grfica 1. Curva de Actividad enzimtica de la Tripsina. Se tomaron en cuenta

nicamente los datos de absorbancia corregida de los tubos T1 y 1 al T4 y 4. (Ver
discusin).

Unidades Trpticas: Pendiente de la recta = 2.6225 = 0.1311 UT/mg

20 min.
20 min.
Tabla 2. Datos para la Curva de actividad enzimtica especfica para la digestin de
casena por tripsina.

Tubo

Unidades
Trpticas.

1
2
3
4

0.005245
0.01049
0.015735
0.02098

A280
corregid
a
0.172
0.316
0.396
0.495

0.6
0.5
0.4

f(x) = 20x + 0.08

R = 0.98

A280 corregida 0.3

0.2
0.1
0
0

0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.02

Unidades Tripticas

Grfica 2. Curva de actividad enzimtica especfica. Se tomaron en cuenta

nicamente los datos de los tubos T1 y 1 al T4 y 4. (Ver discusin).

Tabla 3. UT/g de muestra en pia y papaya (bromelana y papana, respectivamente)

Bromelana
1:10
Bromelana
1:20
Papana 1:2
Papana 1:4

UT

UT/g de
muestra:

0.010225

0.12679

0.003275

0.08122

0.036775
0.019125

0.064724
0.06732

Clculos:
Absorbancia corregida: A280 problema - A280 testigo 0.221 0.049 = 0.172
Unidades trpticas: 2.6225/20 min. = 0.1311 UT/mg de tripsina
1 mg de tripsina 0.131 UT
0.4 mg tripsina 0.0052 UT
A partir de la ecuacin e la recta de la curva de actividad enzimtica especfica,
obtenemos:
y = 20x + 0.0825
Para obtener las UT de muestra despejamos x de la ecuacin anterior:
x = y 0.0825/20 donde y es la A280 corregida de las diluciones de bromelana y
papana, entonces, por ejemplo para el tubo con solucin de papana 1:2:
x = 0.818-0.0825/20 = 0.036 UT

Despus, para los UT/g muestra:

Considerando el valor anterior de UT, el factor de dilucin, el volumen del extracto y el

peso de la muestra:
UT/g muestra: [UT] (Factor de dil.) (Vol. De extracto) = [0.036](2)(22mL) = 0.0647 UT/g muestra:
Gramos de muestra
25 g.

DISCUSIONES

El uso de los tubos testigos es principalmente el de tener tubos sin actividad

enzimtica para poder comparar pero adems nos pueden ayudar a detectar la
presencia de sustancias que absorban a 280 nm y que se encuentren presentes
antes y despus de la hidrlisis de la casena. Dichas sustancias afectan la lectura
de absorbancia, debido a que despus de realizar la hidrlisis en los tubos
problema, la solucin absorber como si sta tuviera una cantidad de protena
mayor a la que pusimos. Por lo tanto debe obtenerse una absorbancia corregida,
siendo esta la diferencia entre la absorbancia del problema y la absorbancia del
testigo, lo anterior se hace con la finalidad de obtener resultados experimentales
ms confiables.
A travs de una curva de actividad enzimtica realizada con tripsina sobre casena
se puede utilizar para conocer la actividad proteoltica de otras enzimas como la
papana y bromelana, puesto que los datos de dicha curva son independientes de
la enzima proteoltca utilizada sobre el sustrato (en este caso casena) siempre y
cuando se mantengan las mismas condiciones para la determinacin (pH = 7.6, T
= 35C).
Para la elaboracin de las curva de actividad enzimtica y act. Enzimtica
especfica no se tom en cuenta la absorbancia de los tubos T5 y 5, pues al
graficarlo se observaba que ese dato ya no cumpla con la tendencia lneal que
nosotros requeramos para elaborar la curva tipo.
Comparando los valores de UT de la tripsina con los de las enzimas que
estudiamos, observamos que stas tienen una mayor actividad proteoltica
(hidrolizan ms a la casena), puesto que el valor de UT calculados son mayores a
los obtenidos para la tripsina. Aunque hay que considerar que los valores de UT
para la papana y bromelana las obtuvimos por gramo de muestra. Observamos
adems que por tener una mayor actividad proteoltica las enzimas trabajadas, las
concentraciones de UT no entran dentro de la curva de actividad especfica.
Comparando la actividad enzimtica de la papana y la bromelana, obtuvimos que
sta ltima tiene mayor actividad enzimtica puesto que tiene valores ms altos de
UT/g de muestra. Lo anterior podra relacionarse con que stas 2 enzimas son
utilizadas en algunos lugares como ablandadores de carne, y se ha visto que la
eficiencia de la papana en este particular aspecto es bastante menor que la
eficiencia de la bromelina.3

El nmero de UT/g muestra para la papana es muy similar independientemente

de la dilucin, pudiendo sugerir que la actividad enzimtica de la papana sera
similar a pasar de estar en menos concentracin. Sin embargo el ltimo tubo al
que se le aadi enzima fue justamente el tubo de papana 1:4, y puede que haya
transcurrido ms tiempo de accin de la enzima y por eso haya una actividad
enzimtica similar a la del tubo menos diluido (1:2).
El grado de maduracin de los frutos pudiera ser un factor importante tambin,
puesto que si es ms maduro el fruto mayor ser el contenido de enzimas
hidrolticas que ste contiene. La pia de la cual hizo el extracto estaba muy
madura, ms que la papaya, lo cual podra explicar tambin por qu es mayor la
actividad enzimtica en este caso de la bromelana.
CONCLUSIONES
-Se puede obtener una curva de actividad enzimtica estndar que sea
independiente de la enzima proteoltica siempre y cuando se utilice el mismo
sustrato y las mismas condiciones experimentales (pH, Temperaura, etc.)
-Se obtuvo una actividad enzimtica para tripsina de: 0.1311 UT/mg
-Se obtuvo una actividad enzimtica para bromelana de: 0.126 y 0.081 UT/g mta.
(respectivamente para dilucin 1:10 y 1:20).
-Se obtuvo una actividad enzimtica para papana de: 0.064 y 0.067 UT/g mta.
(respectivamente para dilucin 1:2 y 1:4).

PREGUNTAS ADICIONALES
a)Defina:
Actividad enzimtica: Capacidad de la enzima para inducir una reaccin qumica
determinada.1
Actividad enzimtica especfica: Relacin de la actividad enzimtica y la cantidad
de protena en la mezcla.1

b) Clasificacin de las proteasas en funcin de su mecanismo de accin y diga en qu

grupo se ubican las determinadas en la prctica.

La papana y la bromelana pertenecen al grupo de las cisten proteasas.

c) Para qu se aade cistena en las muestras de pia y papaya?
El mecanismo cataltico de las cisten-proteasas involucra la formacin de un
intermediario enzimtico acilado. El ataque nucleoflico se realiza a travs de in grupo tiol
reactivo de una cistena presente en el sitio activo. El tiol se transforma en un nucleofilo al
desprotonarse gracias a un residuo de His ayacente. Tienen actividad proteoltica debido
a que bromelina y papana que se activan por la cistena, tiosulfato y glutatin.3
d) Cul es la especificidad de enlace de la tripsina?
La tripsina rompe el enlace peptdico despus de residuos con largas cadenas laterales
cargadas positivamente, a saber, arginina y lisina.
BIBLIOGRAFA:
1. Styer, L. Bioqumica. 6 edicin. Revert. Barcelona. 2008. Pp. 67.
2. Ramrez, K. et al. ENZIMATICA S DE ACTIVIDADES PROTEOLITICAS DE
PRODUCTOS UTILIZANDO LATEX DE PAPAYA (Carica Papaya) PARA LOGRAR EL
ABLANDAMIENTO DE LA CARNE. (En lnea) Departamento de Graduados e
Investigacin en Alimentos. ENCB-IPN. Consulta: 18/09/2016. Disponible en:
[http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/morelia07/TRABAJOS/Area_III/Carteles/CIII-8.pdf ]
3. Clavijo, Diego; Portilla Martinez, Maghdiel Cecilia; Quijano Parra, Alfonso Cintica
de la bromelina obtenida a partir de la pia perolera (Ananas Comosus) de
Lebrija-Santander Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Bsicas, vol. 10,
nm. 2, 2012, pp. 41-49