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FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

LABORATORIO DE BIOQUIMCA PRACTICA FOSFATASA ALCALINA I Y II

INTRODUCCION
La fosfatasa alcalina (Ortofosfrico monoster fosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1) es una
enzima que se encuentra en casi todos los tejidos del cuerpo, pero es mayor su
presencia en huesos, hgado, placenta, intestinos y rin. 1
Son metaloenzimas que cataliza la hidrlisis del enlace ster fosfrico entre un
grupo orgnico y un grupo fosforilo a un pH alcalino (entre 8 - 11) lo que libera
fosfato al medio.2
Para que una fosfatasa alcalina (FA) pueda ser activada, se necesita de cationes
divalentes como son el Mg2+, Zn2+, Mn2+, Ca2+ y Co2+. A nivel celular, la FA
necesita de los iones Mg2+, Zn2+, Mn2+, cuando su actividad se da en el
citoplasma y a los dems iones se les ha involucrado en la actividad de FA de
membranas. A mayor concentracin disponible de estos iones, mayor es la
actividad de la enzima.2
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son
catalizadas por las enzimas. La ecuacin de Michaelis-Menten (V = Vmax S / (KM
+ S)) define el comportamiento cintico de estas enzimas. La constante de
Michaelis KM se define como la concentracin de sustrato a la que la velocidad
de la reaccin enzimtica es la mitad de la Vmax. El valor de KM no slo es
variable en funcin de la naturaleza de la enzima y del sustrato, sino que tambin
depende de las condiciones de temperatura y pH de la reaccin. 3
La inhibicin enzimtica se define como la disminucin de la velocidad de la
reaccin catalizada por una enzima debido a la presencia de un inhibidor. Los
inhibidores pueden actuar alterando los parmetros cinticos (KM y Vmax).
Atendiendo al modo de unin a la enzima, los inhibidores se clasifican en dos
grupos: irreversibles (se unen a la enzima covalentemente y la inhiben
permanentemente) o reversibles (se unen a la enzima mediante enlaces no
covalentes), que pueden ser: competitivos, no competitivos o acompetitivos.
Inhibidores competitivos: poseen una estructura semejante al sustrato, y son
reconocidos por el centro activo de la enzima. Aumenta el Km de la enzima por su
sustrato, sin modificar la Vmax de la reaccin.
Inhibidores no competitivos: se unen a sitios especficos en la molcula de
enzima. Provoca una disminucin de la Vmax, sin alterar el Km.
Inhibidores a competitivos: se unen al complejo enzima - sustrato. El valor de
Km es menor y la Vmax tambin.3

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

METODOLOGIA
Reactivos

Buffer glicina= 0.05 M , Ph10.5


Solucin de Fosfato sodio =0,5 M
Solucin de PNP = 10-4 M
Solucin ZnCl2 = 6x10-4 M
Solucin enzimtica : suero sanguneo diluido con buffer de glicina
Solucin acuosa de PNPP = 5x 10-3 M
Solucin acuosa de Na2HPO4 = 5.0x 10-3 M

Equipos
Espectrofotmetro
Tubos de ensayo
Celdillas
Frasco lavador
Pipeta volumtrica
Bao Mara
Diluciones (seccin experimental)
TUBO
BLANC
O
DILUCION INDICADA PARA
2 ml de
CADA PROCEDIMIENTO
GLICINA
REPSECTIVAMENTE

1/1

1/2

1/4

1/8

1/16

RESULTADOS
Construccin curva calibracin (fosfatasa alcalina I)
Clculos de las concentraciones del PNP en cada tubo

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

Tubo1= 0,0001
0,0001
=M 0,00005
Tubo 2 =
2

Tubo 3 =

0,00005 M
=0,000025 M
2

Tubo 4 =

0.000025 M
=0.0000125 M
2

Tubo 5=

0.0000125
=0.00000625 M
2

TUBO

BLANCO

DILUCION PNP
x10-3 M
VOLUMEN FINAL
2 ml

2 ml de
GLICINA

1/1

1/2

1/4

1/8

1/16

FOSFATO
SODIO 0.5 M

DE

SOLUCION
ZnCl2 x 10-4 M

DE

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

1.004

0.347

0,172

0.086

0.059

5X10-5 M

2.5X1
0-5M

ABSORBANCIA

CONCENTRACION
PNP

1X10-4
M

1.25X1 6.25X106
0-5M
M

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

ABSORVANCIA VS CONCENTRACION (PNP)


1.2
1
f(x) = 10126.24x - 0.06
R = 0.97

0.8
absorbancia

0.6

Linear ()

0.4
0.2
0
0

concentracion (mol/L)

Grafica de fosfatasas alcalina I

INFLUENCIA DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO SOBRE LA


VELOCIDAD DE UNA REACCIN ENZIMTICA: DETERMINACIN DE LOS
PARMETROS CINTICOS KM Y VM (FOSFATASA ALCALINA II)

RESULTADOS
Clculos para la hallar la concentracin de PNPP en cada tubo

Tubo1= 0,005 M
0,005 M
=0,0025 M
Tubo 2 =
2

Tubo 3 =

0,0025 M
=0,00125 M
2

Tubo 4 =

0,00125 M
=0,000625 M
2

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

Tubo 5=

0,000625 M
=0,0003125 M
2

TUBO

BLANCO

DILUCION PNPP
x10-3 M
VOLUMEN FINAL
2 ml

2 ml de
GLICINA

1/1

1/2

1/4

1/8

1/16

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.3

0.3

0.3

0.3

0.3

0.414

1.634

1.519

1.130

0.658

6.25x104
M

3.125x10
-4
M

SOLUCION
DE
-4
ZnCl2 x 10 M
SOLUCION
ENZIMATICA(suero
fetal bovino)
ABSORBANCIA

5x10-3
M

CONCENTRACION
PNPP

2.5x10- 1.25x103
3
M
M

Para hallar la cantidad de PNP producido interpolamos las absorbancias en la


curva de calibracin obtenida en la prctica anterior
Y = 10126x - 0,0588

tubo 1 x=

0,414+0,0588
=4.66 x 105 M
10126

tubo 2 x=

1,634+0,0588
=1.67 x 104 M
10126

tubo 3 x=

1.519+0,0588
=1,55 x 104 M
10126
tubo 4 x=

1.130+ 0,0588
=1.17 x 104 M
10126

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

tubo5 x=

0,658+0.0588
=7.07 x 105 M
10126

Tubo

[PNPP]

Absorbancia

[PNP]

5 X10-3 M

0,414

2.5 X10-3
M
1.25 X103
M
6.25 X104
M
3.125
X10-4 M

1,634

3
4
5

1,519
1,130
0,658

V0=[PNP]/min

1/[PNPP]

1/ V0

4.66 x 10 M

3.11 x 10-6

200

1.67 x 104 M

1.11 x 10-5

321543,408
4
90090.0900
9
97087,3786
4
128205.128
2
212314.225
1

400

1.03 x 10-5

7.8 x 10-6

4.71 x 10-6

1.55 x 10 M
1.17 x 10 M
7.07 x 10 M

800
1,600
3,200

Concentracin, absorbancia e inversos de PNPP y PNP en la prctica de fosfatasa


alcalina II

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

1/Vo vs 1/(PNNP)
250000
200000

f(x) = 44.93x + 64523.85


R = 0.98

150000
1/Vo

Linear ()

100000
50000
0
0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1/(PNPP)

DETERMINACION DEL Km y Vm
LineweaverBurk

1
Km
1
=
+
V Vmax [ S ] Vmax

Segn la grfica el intercepto con

(0, Y )=

1
Vmax

y la pendiente

m=

Km
Vmax

y = 44,934x + 64524
Vmax=

1
1
5
=
por lotanto Vmax=1,55 10 M / min
Intercepto 64524

4 mol / L
Km=Vmax m=( 1,55 10 ) 44,934 por lotanto Km=6,96 10
5

DETERMINACION DEL TIPO DE INHIBICION


TUBO
DILUCION PNPP

BLANCO

2 ml de

1/1

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

x10-3 M
VOLUMEN FINAL
2 ml

GLICINA

SOLUCION DE ZnCl2 x
10-4 M
Inhib. O,5 x 10-2 M

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

ABSORBANCIA

0,640

0,470

0,352

0,271

0,223

0,163

CONCENTRACION

5x10-3

2,5x1
0-3

1,25x
10-3

6,25x
10-4

3,125x
10-4

1,5625
x10-4

Para hallar la cantidad de PNP producido interpolamos las absorbancia en la curva


de calibracin obtenida anteriormente: Y = 10126x - 0,0588
tubo 1 x=

0,640+0,0588
=6.90 x 105 M
10126

tubo 2 x=

0,470+0,0588
=5,22 x 105 M
10126

tubo 3 x=

0,352+0,0588
=4,O 5 x 105 M
10126

tubo 4 x=

0,271+ 0,0588
5
=3,25 x 10 M
10126

tubo 5 x=

0,223+0,0588
5
=2,78 x 10 M
10126

tubo 6 x=

0,163+0,0588
5
=2,19 x 10 M
10126

Tubo

[PNPP]

Absorbancia

[PNP]

Vo=
[PNP]/min

1/[PNPP]

1/Vo

5 X10-3 M

0,640

6.90 x 105 M

4,6 x 10-6

200

217391,3
043

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

2.5 X10-3 M

0,470

5,22 x 105 M

3,48 x 10-6

400

287356,3
218

1.25 X10-3 M

0,352

4, O5 x 105 M

2,7 x 10-6

800

370370,3
704

6.25 X10-4 M

0,271

3,25 x 105 M

2,17 x 10-6

1600

460829,4
931

3.125 X10-4 M

0,223

2,78 x 105 M

1,85 x 10-6

3200

540540,5
405

1.5625 X10-4 M

0,163

2,19 x 105 M

1,46 x 10-6

6400

684931,5
068

INHIBIDOR
600000
f(x) = 84.71x + 287714.19
R = 0.91

500000
400000
1/Vo

300000

Linear ()

200000

Linear ()

100000
0
0

500

1000

1500

2000

1/(PNPP)

2500

3000

3500

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

con inhibidor y sin inhibidor


600000
f(x) = 84.71x + 287714.19
R = 0.91

500000
400000
1/ Vo

Linear ()

300000
200000

Linear ()

f(x) = 44.93x + 64523.85


R = 0.98

100000
0
0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

1/(PNPP)

Fosfatasa Alcalina. Determinacin de los parmetros K m y Vm


y = 84,707x + 287714
1
1
Vmax= =
por lotanto Vmax=3,47 x 106 M /min
b 287714
Km=Vmax m=( 3,47 106 ) 84707 por lo tanto Km=2,93 104 mol /L

ANALISIS DE RESULTADOS
La ecuacin de la curva se us ms adelante para hallar la concentracin de pNitrofenol (x) a partir de la absorbancia (y) en los siguientes experimentos, lo que
es equivalente a una lectura directa a travs de la grfica de tendencia lineal, ya
que esta ecuacin es su equivalente. (y = 10126x - 0,0588).
La segunda prctica pretende la medicin de la influencia de la concentracin de
sustrato sobre la velocidad de la reaccin de la Fosfatasa Alcalina para la
determinacin de los parmetros cinticos k m y vm. Las condiciones experimentales
fueron tales que cada tubo de ensayo fue provisto de una cantidad diferente y
conocida de sustrato. Para aumentar la cintica de la reaccin todas las sustancia
fueron sometidas a calentamiento (la misma cantidad de tiempo y a la misma
temperatura) y para garantizar que la reaccin se detuviera justo en el momento
deseado, se hizo uso del inhibidor Na2HPO4 0.5M.

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

Para la determinacin del Km y Vm no fue tomado en cuenta el primer (1) tubo


pues no se obtuvo una absorbancia coherente frente a las dems consideramos
que se debe que este tubo estaba ms concentrado estando en 1:1 no
conteniendo buffer de glicina.
Como ya hemos visto en la teora el Km es la concentracin de sustrato para la
cual velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima, adems el valor de
Km da idea sobre la afinidad de la enzima por el sustrato.
La velocidad mxima (Vmax) se obtiene cuando la velocidad de reaccin se hace
independiente de la concentracin de sustrato, cuando esto ocurre la velocidad
alcanza un valor mximo. Este valor depende de la cantidad de enzima que
tengamos.
Para determinar el tipo de inhibicin que el Na 2HPO4 ejerce sobre la Fosfatasa
Alcalina, se prepararon las soluciones correspondientes. Igual que antes, se
aumenta la cintica de la reaccin con la ayuda de una aumento de temperatura
hasta los 37C, sin embargo los tubos se sumergiendo en el bao mara, al mismo
tiempo de manera que al completar 15min la reaccin se detuvo con el inhibidor
Na2HPO4, esta vez a una mayor concentracin.

CONCLUSIONES

La reaccin tiene que estar perfectamente cronometrada y pudimos


comprobar que si es lineal con respecto al tiempo, ya que existe una
relacin entre el tiempo en que transcurre la reaccin con la aparicin de
producto, o lo que es lo mismo con la desaparicin de sustrato.

La actividad de una enzima, es decir, la velocidad con que cataliza la


transformacin del sustrato, es directamente proporcional a su
concentracin.

La determinacin de fosfatasa alcalina se lleva a cabo mediante el mtodo


del p-nitrofenil-fosfato: la fosfatasa alcalina cataliza la hidrlisis del ster
fosfrico, liberando p-nitrofenol. Este ltimo compuesto presenta
absorbancia a = 410 nm (color amarillo), por lo que el aumento de la
absorbancia del p-nitrofenol en funcin del tiempo es un indicador de la
actividad enzimtica.

La velocidad de una reaccin enzimtica, al igual que cualquier


reaccin qumica, aumenta con el incremento de temperatura. Sin embargo,
debido a la naturaleza proteica de las enzimas, stas son sensibles a la
desnaturalizacin por calor. Es importante, entonces, determinar para cada
condicin de pH y tiempo la temperatura ms adecuada para la reaccin
enzimtica.

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

La inhibicin entre el fosfato y la fosfatasa alcalina es no competitiva,


debido a que este inhibidor disminuye la velocidad de reaccin.

Al ser un no competitivo quiere decir que el fosfato 0.5M se une a la


fosfatasa alcalina y por lo tanto se disminuye la velocidad de reaccin,

El fosfato no se une al sitio activo de la enzima

ANEXOS
PREGUNTAS
Cul es la importancia clnica de la fosfatasa alcalina?
La importancia clnica de la fosfatasa alcalina es que es una enzima que est
presente en casi todos los tejidos del organismo, se produce en el hgado y en los
huesos y se libera en la sangre. Su importancia clnica radica en la disminucin o
aumento de la concentracin de dicha enzima presente en el plasma. El rango
normal es de 44 a 147 UI/L (Unidades internacionales por litro). El examen de
sangre para fosfatasa alcalina se emplea para:

diagnosticar enfermedades del hgado o del hueso.


verificar si los tratamientos para dichas enfermedades estn funcionando.
Como parte de las pruebas de la funcin heptica de rutina.

Los niveles de fosfatasa alcalina anormales pueden deberse a las siguientes


afecciones:
AUMENTO:
Obstruccin biliar
Afecciones seas
Tumores seos osteoblsticos, osteomalacia, consolidacin de una fractura
Enfermedad heptica o hepatitis
Ingerir una comida grasosa si usted tiene el tipo de sangre O o B
Hiperparatiroidismo
Leucemia
Linfoma
Enfermedad de Paget
Raquitismo
Sarcoidosis
DISMINUCIN:
Hipofosfatasia
Desnutricin

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

Deficiencia de protena
Enfermedad de Wilson

OTRAS AFECCIONES:
Enfermedad heptica alcohlica (hepatitis/cirrosis)
Alcoholismo
Estenosis biliar
Clculos biliares
Arteritis de clulas gigantes (temporal, craneal)
Neoplasia endocrina mltiple (NEM) II
Pancreatitis
Carcinoma de clulas renales
Cuando el resultado del examen de fosfatasa alcalina (FA) es alto, puede ser
necesario que se someta a un examen de isoenzimas de la fosfatasa alcalina.
Este examen ayuda a determinar qu parte del cuerpo est causando niveles ms
altos de FA .El valor normal es 20 a 140 UI/L (unidades internacionales por litro).
Este examen se puede utilizar para diagnosticar o vigilar

Osteopata
Enfermedad heptica, de la vescula biliar o de los conductos biliares
Dolor en el abdomen
Enfermedad de la glndula paratiroidea
Deficiencia de vitamina D
Tambin se puede hacer para revisar la actividad heptica y para ver cmo
pueden afectar al hgado los medicamentos.

En este caso, se puede considerar el fosfato como un inhibidor por


producto?
El fosfato si se podra considerar como un inhibidor de producto, porque el fosfato
Producto de la reaccin inhibe la actividad de la fosfatasa alcalina, que es a
menudo una caracterstica reguladora en el metabolismo y puede ser una forma
de retroalimentacin negativa.
Sera posible revertir la inhibicin provocada por el fosfato aumentando la
concentracin de PNPP?
No sera posible, porque la inhibicin provocada por fosfato es de tipo no
competitiva y esta no puede ser superada aumentando la concentracin del
sustrato, debido a que este acta disminuyendo la velocidad de la reaccin y el
nmero de recambio del enzima.

FOSFATASAS ALCALINAS I Y II

BIBLIOGRAFIA
Spinreact. Determinacin cuantitativa de fosfatasa alcalina (FAL) IVD. Mxico.
http://www.spinreact.com.mx/public/_pdf/41242.pdf (ltimo acceso 03 Abril 2016).
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Emilia Martnez Galisteo, Jess Dez Dapena. Caracterizacin cintica de la fosfatasa
alcalina. Crdoba. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf (ltimo acceso 03 Abril 2016).
JP selecta S.A. determinacin de las constantes cinticas de la fosfatasa cida de
germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad. http://www.gruposelecta.com/notasdeaplicaciones/determinacion-de-las-constantes-cineticas-de-lafosfatasa/determinacion-de-las-constantes-cineticas-de-la-fosfatasa-acida-de-germende-trigo-y-efecto-del-ph-sobre-su-actividad/ (ltimo acceso 03 Abril 2016).
Medline Plus. Examen de sangre para fosfatasa alcalina.
https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003470.htm (ltimo acceso
03 Abril 2016).
Medline Plus. Examen de isoenzimas de la fosfatasa alcalina.
https://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/003497.htm (ltimo acceso
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M. K. Campbell and S. O. Farrell, Bioqumica, Mxico: Thomson, 2003.